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La présente invention est relative à de nouveaux composés chimi- ques apparentés à la novobiocine et à la dihydronovobiocine, à des procé- dés de préparation de ces composés et à des procédés pour convertir ces composés en antibiotiques de valeur. Plus particulièrement, elle concerne
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la 7%tétrah¯ydro-34-dihydroxy-5-méthoxy-6,6-diméthyl-pyrn-2-yloxy -4- hydroxy-3-/4-hydroxy-3-(3-méthyl-2-butényl)-benzamido7 -8-méthylcoumarine9 ainsi que le dérivé dihydrogéné correspondant, dans lequel le substituant 3-méthyl-2-butényle a été remplacé par un groupe 3-méthylbutyle.
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La novobiocine ou 7-rtétrahydro-3-hydroxy..°-carbamyl-5-mêthoxy- 6,6-diméthyl-pyran-2-yloxy7-4-hydroxy-3 f4-hydroxy-3-4-hydroxy-3-(3-méthyi- 2-butényl)-benzamido7-8-méthyl-coumarine, qui peut être représentée par la formule de structure suivante :
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et la dihydronovobiocine, qui possède une structure similaire à celle de la novobiocine, mais comporte un groupe 3-méthylbutyle au lieu du groupe 3-méthyl-2-butényle dans la novobiocine constituent de nouveaux antibioti- ques précieux, qui sont actifs en ce sens qu'ils inhibent surtout la crois- sance de microorganismes à gram positif, bien qu'ils révèlent aussi une certaine activité vis-à-vis des microorganismes à gram négatif.
Les nouveaux composés suivant l'invention, à savoir la 7-tétra-
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hydro-34-dihydroxy-5-méthoxy-66-diméthylpyran-2-yloy-.-hydroxy-3-%4- hydroxy-3-(3-méthyl-2-butényl)-benzamidc 7 -8-méthylcoûmarine et le dérivé dihydrogéné correspondant, dans lequel le goupe 3-méthyl-2-butényle est rem- placé par un groupe 3-méthylbutyle diffèrent respectivement de la novobio- cine et de la dihydronovobiocine par l'absence d'un groupe carbamyle. A cau- se de cette parenté étroite avec ces composés, les nouveaux composés sont désignés ci-après sous l'appellation de "descarbamylnovobiocine" et "des- carbamyldihydronovobiocine" respectivement.
Il a été constaté à présent que la descarbamylnovobiocine se pré- sente dans certaines préparations de novobiocine. La présence de ce compo- sé dans les préparations de novobiocine a été découverte, lorsque ces pré- parations ont été soumises à une analyse chromatographique sur papier.
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Subséquemment, il a été découvert que la descarbamylnovobiocîne se formait dans des solutions alcalines de novobiocine et qu'elle peut être avantageu- sement préparée à partir de novobiocine par traitement soigné avec un al- cali dilué. Ainsi, lorsqu'une solution de novobiocine dans de l'hydroxyde de sodium 0,1N est laissée au repos à température ambiante pendant environ 4 jours, la majeure partie de la novobiocine est convertie en descarbamylnovobiocine.
De même, on a constaté qu'il y a de la descarbamyldihydronovobio- cine dans les préparations de dihydronovobiocine et la présence de ce com- posé dans ces préparations a été observée lors de l'analyse chromatographi-
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que sur papier de la dihydronovobiocine. La descar'bamyldihydronovobiocine peut être similairement préparée en soumettant de la dihydronovobiocine à
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l'action d'un alcali dilué.
Suivant une autre forme d'exécution de la présente invention, on a constaté à présent que la descarbamylnovobiocine et la descarbamyldihy- dronovobiocine peuvent être converties en novobiocine et dihydronovobiocine actives comme antibiotiques, par réaction avec des agents de carbamylation appropriés. Ainsi, lorsqu'on met de la descarbamylnovobiocine ou de la des- carbamyldihydronovobiocine en contact intime avec du chlorure de carbamyle en présence d'une base organique appropriée, il se forme respectivement de la novobiocine ou de la dihydronovobiocine, qui peut être aisément isolée et récupérée sous forme pure.
Les exemples suivants sont présentés à titre de formes d'exécution illustratives de procédés spécifiques de préparation de descarbamylnovobio-' aine et de descarbamyldihydronovobiocine et de conversion de ces substances en novobiocine et dihydronovobiocine respectivement.
EXEMPLE 1
100 g de novobiocine obtenue de la manière décrit e plus loin ont été dissous dans 300 cc d'un mélange de benzène et de méthanol (1:2) et le pH de la solution résultante a été ajusté à environ 7,4 avec une solution à 10% de méthoxyde de sodium dans du méthanol. La solution résultante a ensuite été diluée avec environ 700 cc de benzène. Par repos, le sel sodi- que de novobiocine a cristallisé dans la solution résultante et a été ré- cupéré par filtration. Le filtrat résultant a été extrait à deux reprises avec environ 1/10 de son volume d'eau et les extraits aqueux ont été con- centrés sous pression réduite jusqu'à la moitié du volume originel.
Au con- centrat on a ajouté environ 15 g d'un auxiliaire de filtration à diatomées et suffisamment d'acide chlorhydrique dilué pour ajuster le pH de la solu- tion à environ 3. Le produit précipité résultant ainsi que l'auxiliaire de filtration ont été récupérés par filtration et séchés. Le produit ainsi ob- tenu contenait environ 25% en poids de descarbamylnovobiocine. Il a été dis- sous dans 100 dcc d'acétone anhydre et filtré pour séparer l'auxiliaire de filtration. La solution résultante contenant la matière brute, consistant en environ 50% de descarbamylnovobiocine, a été chromatographiée sur 450 g d'alumine activé dans une colonne de 2 pouces de diamètre.
La colonne a en- suite été développée avec de l'acétone anhydre et 8 fractions de 300 cc chacune ont été recueillies et analysées par chromatographie sur papier. De la descarbamylnovobiocine purifiée a été obtenue en concentrant les quatre premières sections découpées jusqu'à siccité. Le produit ainsi obtenu pesait environ 6,3 g et contenait environ 80% de descarbamylnovobiobine. Ce produit fondait à 135 - 145 C.
La novobiocine employée dans le procédé décrit ci-dessus a été obtenue comme suit:
Un bouillon de fermentation contenant de la novobiocine a été chauffé à 60 C pendant 20 minutes à un pH de 7,5 - 8,0 et après refroidis- sement il a été filtré.,Le bouillon filtré a été ajusté à un pH d'environ 6,5 et extrait avec 1/5 de son volume d'acétate d'amyle dans un appareil d'extraction à contre-courant à deux étages. Les extraits à l'acétate d'amyle ont été extraits avec environ 1/3 de volume d'eau contenant suffisamment d'ammoniac pour que le pH final de l'extrait aqueux soit de 9,7 - 10,5, en utilisant un appareil d'extraction à contre-courant à deux étages.
Le même processus d'extraction par de l'acétate d'amyle et-de l'ammoniac a été répété et la solution aqueuse finale a été diluée avec du méthanol jusqu'à un rapport de solvants de 35% de méthanol et 65% d'eau et le mélange a été acidifié. Au repos, la novobiocine a cristallisé dans la solution résultante.
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EXEMPLE 2
On a dissous de la novobiocine dans de l'hydroxyde de sodium 0,1N, de façon à obtenir une solution à 2%, La solution a été laissée au repos à température ambiante pendant 96 heures. A ce moment, l'analyse chromato- graphique sur papier indiquait que plus de 75% de la novobiocine avait été
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transformée en descarbamylnovobiocine. La solution a été acidifiée jusqu'à pH 3 en agitant. Le précipité floculé de descarbamylnovobiocine brute a été filtré et séché. La purification a été effectuée en dissolvant le produit brut dans de l'acétone de façon à former une solution à 30% de matières so- lides, en séparant par filtration l'acide novobiocinique éventuel qui cris-
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tallise et en précipitant la descar'bamylnovobiocine par addition d'éther de pétrole. Le produit récupéré fondait à 130 -140 C.
Le produit présentait des maxima d'absorption à 3125A, lorsqu'il était dissous dans du NaOH aqueux
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0,1N (El% : enyiron 500), et à ,'50=' lorsqu'il était dissous dans du HC2méthagiiq aqueux 0,1N. (E17 m: environ 440). Le produit est optique- ment actif; a D = -17,7 dans CH3OH.
EXEMPLE 3.
En répétant le procédé de l'exemple 2, mais en utilisant de la dihydronovobiocine comme matière de départ, on a obtenu de la descarbamyl-
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dihyc.ronovobioain.e fondant à 142 - 143 .
EXEMPLE 4
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Environ 500 mg de descarbamyInovobiocine ont été dissous dans 5 00 de dioxane et 0,5 cc d'une solution à 205 de chlorure de carbamyle dans du dioxane a été ajouté. Le mélange a été laissé au repos à température ambi- ante pendant environ 2 heures. La novobiocine résultante a été précipitée par dilution de la solution dioxanique avec 10 volumes d'eau. La novobio- cine ainsi obtenue peut être purifiée davantage par recristallisation selon des méthodes connues dans la technique pour obtenir le produit sous forme pure.
EXEMPLE 5
En répétant le procédé de l'exemple 4 au départ de descarbamyldi-
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hydronovobiooine, on obtient de la dihydronovobiocine.
Dans les exemples décrits plus haut, la descarbamylnovobiocine et la deâcarbamyldihydronovobiooine peuvent être aisément distinguées de la novobiocine et de la dihydronovobiocine respectivement par-analyse chroma- tographique sur papier. Cette analyse peut être exécutée comme suit:
Du pàpierfiltre (Whatman n 1) est imprégné à l'aide d'alcool caprylique par immersion dans un mélange de méthanol et d'alcool caprylique et l'excès de solvant est éliminé au buvard. Une solution contenant environ 40 à 200 microgrammes de la matière à traiter est appliquée au papier, sur lequel un tampon (pH: 8,3 ; phosphate 0,1N) est admis à s'écouler.
La novo-
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biocine et la deecarbamylnovobiocine peuvent être aisément visualisées à l'aide de l'absorbanoe de lumière ultra-violette et la novobiocine est aisé- ment détectée par des méthodes bioautographiques. Avec ce système, la novo-
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biocine a un rf de 0,25 et la descarbamylrlovobiocine a une mobilité d'envi- ron 1,1 fois celle de la novobiocine, tandis que la dihydronovobiocine a une mobilité d'environ 0,6 fois celle de la novobiocine. En pratique, il s'avère avantageux de développer le chromatogramme jusqu'à ce que la novo- biocine ait parcouru environ 8/10e de la longueur de la bande de papier.
Les quantités relatives de descarbamylnovobicoine et de novobiocine ou de descarbamyldihydronovobiocine et de dihydronovobiocine sont déterminées en mesurant l'absorbance comparative du chromatogramme sur bande de papier sous
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la lumière ultra-violette, en utilisant un densitomètre approprié.
Il a été observé qu'une séparation plus grande de la descarbamyl- dihydronovobiocine et de la dihydronovobiocine est obtenue si-.le chromato- gramme sur papier est exécuté en utilisant du papier imprégné de glycérol et en laissant du chloroforme s'écouler sur la feuille.
REVENDICATIONS
1. Composés choisis dans le groupe comprenant la descarbamylno- vobiocine et la descarbamyldihydronovobiocine.
2. Descarbamylnovobiocine.
3. Descarbamyldihydronovobiocine.
4. Procédé dans lequel on fait réagir un composé du groupe com prenant la descarbamylnovobiocine et la descarbamyldihydronovobiocine avec du cholure de carbamyle, de manière à produire l'antibiotique correspondant.
5. Procédé dans lequel on fait réagir de la descarbamylnovobio- cine avec .du chlorure de carbamyle, de manière à produire de la novobiocine.
6. Procédé dans lequel on fait réagir de la descarbamyldihydro- novobiocine avec du chlorure de carbamyle, de manière à produire de la di- hydronovobiocine.
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