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La présente invention a pour objet la récupération de la tétracycline à partir d'un mélange en fermentation acidifié contenant de la tétracycline associée à des impuretés de fermentation*
On a éprouvé des difficultés considérables à mettre au point des procédés de raffinage commercialement praticables pour récupérer la tétracycline du mélange de fermentation. Etant donné les analogies de structure entre la chlorotétracycline et la tétracycline, on pourrait supposer que les méthodes de purification satisfaisantes pour le raffinage de la chlorotétracycline, conviennent également pour le raffinage de la tétracycline, Mais contrairement à toute attente, cela n'est pas toujours vérifié.
Quand on récupère la tétracycline par l'une des meilleures méthodes mises au point pour la récupération de la chlorotétracycline, c'est- à-dire le procédé décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 2. 655.535 du 13 outobre 1953, qui consiste à extraire la chlorotétracycline du mélange en fermentation à l'aide de butanol normal à un pH d'environ 1,3, puis à concentrer l'extrait butanolique 'et à en récupérer la chlorotétracycline sous la forme d'un sel d'acide, on a trouvé que l'on obtenait des taux de récupération très faibles, de l'ordre de 20%, et un produit très médiocre.
Apparemment, cela vient du fait que, lorsqu'on récupère la tétracycline à partir de l'extrait butanolique acide, il se produit une dégradation importante de la tétracycline avec formation d'impuretés fortement colorées que l'on récupère en même temps que la tétracycline. Par conséquent, ce procédé ne peut pas servir à raffiner la tétracycline.
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Suivant la présente invention, on fournit un procédé de récupération de la tétracycline à partir d'un mélange en fermentation acidifié, qui consiste : à ajuster la teneur en ions calcium de manière à réduire la concentration en ions calcium, à ajouter au mélange un ou plusieurs composés d'am- monium quaternaires choisis parmi le groupe des halogénures
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dtalkyltriméthylammonium et des halogénures de dialkyldimé- thylammonium, à ajuster le pH de la solution aqueuse entre 8 et 12, à extraire la tétracycline de la solution aqueuse par un solvant organique, puis à isoler la tétracycline de l'extrait au solvant organique.
La tétracycline est dissoute dans la phase solvant organique, et peut en être isolée pour donner des rendements élevés en tétracycline de qualité pharmaceutique.
On réalise de préférence la présente invention en ajustant d'abord le mélange en fermentation à un pH de 0,5-30, et de préférence d'environ 1-2,pour solubiliser la tétracycline, car elle n'est pas entièrement en solution dans le mélange fermenté. On peut utiliser, à cet effet, .n'importe quel acide minéral fort, tel que l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, ou l'acide phosphorique. On filtre alors le,mélange acidifié pour enlever la tétracycline solubilisée. Etant donné qu'une portion considérable de produit actif reste dans le gâteau-filtre, on la récupère en extrayant ce dernier par de l'eau acidifiée à un pH d'environ 2,0. On réunit alors les filtrats pour continuer le trai- tement.
Il est nécessaire d'ajuster la concentration de calcium dans le mélange ou dans le filtrat avant' d'extraire la tétracycline au moyen du solvant organique. On a trouvé que ;La quantité de calcium contenue dans le système à un caractère déterminant assez net. Généralement, il faut éliminer du
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calcium afin d'éviter, au cours de l'étape d'extraction, la. formation d'un précipité abondant de tétracycline qui ne sera pas facilement dissous par le solvant. Par contre, on ne peut pas extraire la tétraycline pure dans le solvant organique si les ions calcium sont absents. Apparemment, il se forme un complexe d'ion calcium, de tétracycline et de composé d'ammonium quaternaire, qui s'extrait facilement dans la phase solvant-.
Heureusement, on a découvert que l'on pouvait éliminer du système les quantités de calcium en excès en les préci- pitant sous forme d'oxalate de calcium, sans toutefois enleva! trop de calcium. Apparemment, la solubilité de l'oxalate de calcium dans les conditions du procédé est telle qu'il reste assez de calcium en solution pour former le complexe soluble dans le solvant organique, et que l'on obtient une extraction bien meilleure que si tout le calcium était éliminé. On élimine l'excès de calcium en ajoutant de l'acide oxalique ou de l'oxalate d'ammonium, soit directement au mélange, soit au filtrat du mélange ou à la solution aqueuse à partir de laquelle on désire extraire la tétracycline.
On mélange alors le filtrat acide décalcifié avec une quantité appropriée d'un composé d'ammonium quaternaire, à savoir un halogénure d'alkyltriméthylammonium ou un halogénure de dialkyldiméthylam- monium, et un solvant organique tel que le butanol normal, ou de préférence la méthylisobutylcétone, et on rajuste le pH du filtrat entre 8 et 12, et de préférence entre 9 et 10, par addition de soude. La tétracycline passe de la phase aqueuse dans la phase solvant. La distribution de la tétracycline est fortement en faveur du solvant organique, de sorte Que, pour avoir un transfert complet, il suffit d'un petit volume de solvant relativement au volume aqueux.
De façon générale, on a trouvé que l'on pouvait obtenir de bons résultats avec une quantité de solvant organique comprise entre @
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5 et 50% préférence, on en utilise de 10 à enwicon.De environ, mais la limite supérieure est dictée seulement par des considérations de prix de revient. On sépare alors la phase solvant contenant la tétracycline, dtavec la phase aqueu. se contenant les impuretés de fermentation, par des moyens courants
On peut utiliser divers solvants organiques dans l'étape d'extraction.
Des solvants préférentiels sont notam" ment les alcools aliphatiques inférieurs qui ne sont pas miscibles à l'eau, par exemple le butanol, l'alcool amylique etc...., ou bien on peut utiliser des solvants tels que le chloroforme. De façon générale, les solvants préférentiels sont organiques, polaires et non miscibles à l'eau. La 20% isobutylbétone est un solvant particulièrement préférable, car on a trouvé qu'elle était extrêmement sélective en ce qui concerne sa faculté d'extraire la tétracycline du filtrat acide aqueux et de laisser les impuretés dans la phase aqueuse.
On a trouvé que les composés d'ammonium quaternai- m@thyl- connus sous le nom d're$"arquands" sont des véhiculesparticulièrement efficaces pour le procédé d'extraction par solvant décrit ici, Comme on l'a indiqué plus haut, ces composés sont des chlorures d'alkyltriméthylammonium ou des chlorures de dialkyldiméthylammonium et peuvent être représentés par la formule R¯N(CH3)3CI ou R,R'-N(CH3)2CI, dans lesquelles R est un groupe à longue chaîne d'au moins 8 atomes de carbone.
R' peut être un groupe alkyle de 2 à 20 atomes de carbone.
Ces composés d'ammonium quaternaire particuliers sont vendus par Armour And Company sous la marque commerciale "Arquad". On trouve divers composés de cette classe, qui varient quant à la longueur et au nombre des groupes alkyle à longue chaîne rattachés à l'atome d'azote.
On indLque cidessous quelques "Arquads" typiques, qui se trouvent dans le
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commerce et qui peuvent avantageusement servir à réaliser la présente invention : ARQUADS - COMPOSITION MOYENNE DES INGREDIENTS ACTIFS.-¯¯¯¯
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Groupes ' Longueur Arquad Arquad Arquad Arquad ] Arquad Arquad Ar-
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<tb> substituants <SEP> de <SEP> la <SEP> 12 <SEP> 16 <SEP> 18 <SEP> C <SEP> S <SEP> 2C <SEP> quad
<tb>
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chaîne l6 l8 f S 2G 2HT
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<tb> de
<tb> carbone
<tb> Octyle <SEP> 8 <SEP> 8% <SEP> - <SEP> 8%
<tb> Décyle <SEP> 10 <SEP> 9% <SEP> - <SEP> 9%
<tb>
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Dodécyle 12 90% - - 47% - 47% Tétradécyle 14 9% - lôfo - 10% Hexadécyle 16 - 90% 6% 8% 10% 0% 30% Octadécyle 18 - 6%
93% bzz 10% 10 70% Octadécényle le 1% 4% 1% 5% 35%
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<tb>
<tb> Octadécadiényle <SEP> 18 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 45%
<tb>
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() Les "Arquads" 2C et 2HT sont des chlorures de diallcyldïméthylammonium.
Tous les autres sont des chlorures d'alkyltriméthylanmoni- um
La composition utilisée préférentiellement et avec laquelle on a obtenu les meilleurs résultats est l' "Arquad
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16ruz qui est un chlorure de monoa1ky1trimét:;hylalilJtlonium dont les groupes alkyle comprennent 90% de groupes hexàdécyle, 6% de groupes octadécyle et 4% de groupes octadécényle. Pour une raison qui n'est pas connue, ce composé quaternaire particulier semble être particulièrement sélectif en donnant un produit de tétracycline plus pure. La quantité utile de composés d'ammonium quaternaire précédents dans le processus d'extraction par solvant décrit plus haut, varie de 1/2 mole à 3 moles environ de composé quaternaire pour une mole de
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tétracycline.
La méthode d'extraction sur support que l'on a décrite amène une excellente séparation de tétracycline du mélange de fermentation. Bien que la chose ne soit pas ab- solument certaine, il est probable qu'en fait la tétracycli- ne est présente dans la phase solvant sous forme d'un com- plexe ion calcium/tétracycline/"Arquad", car, comme on l'a dit plus haut, une quantité définie d'ion calcium est néces- saire pour que l'extraction ait lieu, et 1' "Arquad" agit de façon à fixer la tétracycline d'une certaine façon inconnue, ce qui permet de la transférer plus facilement de la phase aqueuse à la phase solvant.
A la suite du processus d'extraction, ou peut trai- ter l'extrait de plusieurs façons pour en isoler la tétracy- cline. L'une de ces méthodes consiste à faire cristalliser directement le chlorhydrate de tétracycline en ajoutant un alkanol inférieur, ou un alkanol inférieur à substitution alkoxy inférieur, par exemple le 2-éthoxyéthanol, puis en aci- difiant par l'acide chlorhydrique. Outre le 2-éthoxyéthanol, on peut utiliser dans ce processus d'autres solvants organi- ques tels que le 2-propanol, le butano-, etc....
Si on le désire, on peut isoler la tétracycline neutre de l'extrait de solvant, en ajoutant de l'eau et en ajustant le pH entre 3 et 7. Le volume d'eau n'est pas un facteur déterminant, mais une proportion de 5 à 50% par rap- port au volume de solvant sera satisfaisante.
Un procédé particulièrement préférable pour isoler la tétracycline de l'extrait de solvant consiste à séparer la tétracycline de l'extrait au solvant sous forme d'un composé tétracycline-urée, par addition d'une solution aqueuse d'urées
On agite le mélange et on ajuste le pH entre 2,5 et 6,0, par
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addition d'un acide approprié, Le composé tétracycline-urée précipite, et on peut alors le traiter de diverses manières afin de récupérer la tétracycline.
Les cristaux d'antibiotique obtenus par les procédés d'isolement ci-dessus sont généralement formés de tétra- cycline neutre pure à 97-100%; on peut les convertir en chlorhydrate de tétracycline de qualité pharmaceutique par un procédé simple à une seule étape qui consiste à délayer la tétracycline neutre dans du butanol, du 2-éthoxyéthanol et de l'acide chlorhydrique-' On décrira l'invention plus en détail à propos des exemples précis qui suivent.
EXEMPLE 1. - @
On prend 2 litres de mélange de fermentation de té- tracycline titrant 5100 gammas ' par cm3, et on acidifie avec de l'acide sulfurique à 25% jusqu'au pH 1,8, on agite pendant
40 minutes et on filtre à l'aide de 200 g de terre d'infu- soires. On délaie les solides dans 1,5 litre d'eau à 45 C, on ajuste le pH à 1,85 avec 2,5 cm3 d'acide sulfurique à 25%, on agite pendant 40 minutes et on filtre. On réunit les filtrats, on lestraite par 88,2 gr d'oxalate d'ammonium, on agite pendant 30 minutes à la température ambiante, on conser- ve à 4 C pendant 2 heures et on filtre. On lave le gâteau filtre avec 50 cm3 d'eau pour assurer la récupération complè- te de produit actif.
Aux 2,97 litres d'extrait aaueux, on ajoute 300 cm3 de méthyliaobutylcétone et 15 cm3 de chlorure de cétyltriméthylammonium à 50% ( "Arquad 16"), et on ajuste le pH du mélange à 8,1; en le traitant par 23 cm3 de NaOH 18 N.
Après avoir agité pendant 20 minutes, on sépare les deux pha- ses. On traite la pha,se aqueuse par 100 cm3 de méthyliso- butylcétone, 5 cm3 de chlorure de cétyltriméthylammonium ("Arquad 16" ) et 2 cm3 de NaOH 18 N pour ajuster le pH à 8,3,
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On agite le mélange pendant 20 minutes, on sépare, et on extrait la phase aqueuse par une autre portion de 100 cm3 du même solvant. On agite les extraits réunis avec 40 cm3 d'eau et on sépare la liqueur aqueuse de lavage que l'on jette. On fait un deuxième lavage avec 40 cm3 d'eau en utilisant de la soude pour ajuster le pH à 11,5 avant filtration et séparation. On extrait la solution de méthylisobutylcétone lavée à l'eau, au moyen de 125 cm3 d'eau, en utilisant 5 cm3 d'acide chlorhydrique concentré pour ajuster le pH à 1,6.
On conduit deux autres extractions chacune avec 55 cm3 en ajoutant de l'acide pour ajuster le pH à 1,6. On réunit les extraits aqueux, on les lave à deux reprises en les agitant avec 20 cm3 de chloroforme. A l'extrait lavé, on ajoute 3,5 cm3 de butanol, et on traite le mélange par 10 g d'éthylènediamine-tétraacétate de sodium à 80%, pour obtenir un pH de 5,8. Après vieillissement de 6 heures à la température ambiante et de 16 heures à 4 C, on filtre le produit, on le lave à deux reprises avec 9 cm3 d'éthylènediamine-tétraacétate de sodium à 5% ajusté à pH 5,8 par HCl, on lave à deux reprises avec 5 cm3 d'eau, et on sèche sous vide à 40 C.
On obtient un rendement de 6,55 gr de tétracycline neutre titrant 1032 gammas par mg.
EXEMPLE 2. -
On prend 278 litresde mélange de fermentation de tétracycline titrant 4450 gammas/cm3, on ajuste le pH 1,8 par addition d'acide sulfurique concentré, on traite par l'oxa -late d'ammonium à 1,8% (poids/uolume), et on filtre en utilisant un adjuvant (terre d'infusoires). On délaie à nouveau le gâteau filtre dans un volume d'eau à 45 C égal à la moitié du volume de mélange de fermentation, on ajuste à nouveau à pH 1,8 et on filtre. On réunit les filtrats, en les traite
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par 2, 1 équivalents, de chlorure de? cétyltriméthylammonium ("Arquad 16") par rapport à la teneur en tétracycline, et 12% (en volume) de méthylisobutylcétone.
On ajuste le mélange à pH 10 avec une solution de soude à 50% on agite pendant 30 minutes et on laisse reposer pendant 30 minutes, puis on décante la phase solvant, on la filtre et on la lave avec 20% de son volume d'eau à pH 10. Après avoir séparé l'eau. il reste 32 litres d'extrait. A 1 litre d'extrait, on ajoute 300 cm3 de 2-éthoxyéthanol, et 145 cm3 d'acide chlorhydrique concentré pour ajuster le pH à 1,8- On laisse vieillir le mélange résultant, sous agitation, pendant 48 heures à la température ambiante.
On filtre les cristaux de chlorhydrate de tétracycline, on lave avec 0,5% (en volume) de solvant frais de la même composition, que la liqueur mère, puis avec 60 cm3 de 2-propanol et finalement avec60 cm3 d'éther. On sèche le produit sous vide pendant 4 heures à 50 C et l'on obtient 30.9 gr de chlorhydrate de tétracycline brut, titrant.
904 gammas/mg, ce qui représente un rendement de 69,5% du mélange de fermentation.
EXEMPLE 3. - On prend une portion de 200 cm3 de l'extrait à la méthylisobutylcétone et clarifié (préparé comme dans l'exem- ple 1), titrant 40.500 gammas/cm3, et on la traite par 32 cm3 de solution aqueuse saturée d'urée et 32 cm3 d'eau.
On ajoute de l'acide chlorhydrique concentré pour abaisser le pH de 9,0 à 5,5. On place le mélange sur une secoueuse rotative pendant 16 heures, on ajuste .à pH 3,0 par une nouvelle addition d'acide chlorhydrique et on agite pendant 48 heures de plus. On filtre le produit qui s'est précipité, on le lave à l'eau et on le sèche sous vide à 50 C. On obtient un rendement de 7,80 g de composé tétracycline-urée, titrant 938 gammas/mg, ce qui représente 90,3% du rendement calculé.