JPS6020000B2 - 新抗生物質ｙ−１６４８２物質およびその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は抗生物質Ｙ−１６４８２Ｑ物質またはＹ−１６
４８２８物質ならびにその製造法に関するものである。

本発明者らは、シュードモナス属に属する特定菌株の培
養物中に、グラム隈性、グラム陰性細菌に強力な発育阻
止作用を示し、抗腫場活性を示す物質が存在することを
見出し、培養物中から有効成分を採取したところ、２成
分の混合物であることが判った。この混合物の有効成分
をＹ−１鼠８２と命名し、後述する精製法で分離し、一
方をＱ成分、他方をＢ成分とし、それぞれの有効成分を
Ｙ−１６４８２Ｑ物質、Ｙ−１６４８２８物質と命名し
、本発明を完成した。

本発明の抗生物質Ｙ−１私８２Ｑ物質の塩酸塩での理イ
ヒ学的性質は次の通りである。

‘１１外観：淡黄色粉末 ■ 融点：２１９０から炭化いまじめ、２６び０で液化
がはじまる。

‘３１ 元素分析値：Ｃ ５５．１０％、日 ６．６１
％、Ｎ８斑％、ＣＩ−１１．４０％‘４’溶解性：水、
メタノールに溶け、酢酸エチル、クロロホルム、エーテ
ル、ベンゼンにほとんど溶けない。

【５１ 比旋光度：〔Ｑ〕各１一１０６（Ｃ＝０，５，
メタ／−ル）‘６１ 紫外部吸収スペクトル：第１図に
示す通りである。

入幕釜Ｈ＝２７印ｍ（Ｂ手※＝１４５） ‘７｝ 赤外部吸収スペクトル：第２図に示す通りであ
る。

｛８１ 薄層クロマトグラフィー（シリカゲル）：Ｒｆ
＝０．６（トルエン：クロロホルム：メタ／−ル：・：
３：２）Ｒｆ＝０．４５（ｎーブタノール：酢酸：水＝
４：・：・）■ 呈色反応：ニンヒドリン、ドラーゲン
ドルフ、塩化第２鉄反応に陽・性を示す。

００ 塩基性・酸性・中性の区別：両性化合物また、抗
生物質Ｙ−１６４８２８物質の塩酸塩での理化学的性質
は、次の通りである。

【１｝ 外観：淡黄色粉末 ■ 融点：２３０つＣから炭化しはじめ、液化温度は３
００ｑｏ以上‘３；元素分析値：Ｃ ５４．８３％、日
６．５４％、Ｎ９．０１％、ＣＩ‐１１．９９％■
分子式：Ｃ２８日３６Ｎ４０６・２ＨＣ１・日２０‘５
｝ 溶解性：水、メタノールに溶け、酢酸エチル、クロ
ロホルム、エー．テル、ベンゼンにほとんど溶けない。

‘６１ 比旋光度：〔Ｑ〕色１−１４４（Ｃ＝０，５，
メタノール）【７’紫外部吸収スペクトル：第３図に示
す通りである。

＾益留日＝２７１ｎｍ（Ｅ手鉢＝１６２）‘８） 赤外
部吸収スペクトル：第４図に示す通りである。

‘９｝ 簿層クロマトグラフィー（シリカゲル）：Ｒｆ
＝０．５（トルエン：クロロホルム：メタノール＝・：
３：２）Ｒｆ＝０．４（ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４
：・：・）ＯＱ 星色反応：ニンヒドリン、ドラーゲン
ドルフ、塩化第２鉄反応に腸性を示す。

（１１）塩基性・酸性・中性の区別：両性化合物これら
の理化学的性質および核磁気共鳴スペクトル、Ｘ線解析
などに基づいて、本発明者らはＹ−１６４８２Ｑの構造
式をと、さらに、Ｙ−１畝８２８の構造式を と決定した。

これら本発明の抗生物質Ｙ−１６４８２Ｑ物質およびＹ
−１私８２８物質は、次に示す通り、グラム腸性菌、グ
ラム陰性菌を問わず、細菌類に対して抗菌力を有してい
る。

また、抗腫場活性も有するため、抗菌剤、制ガン剤とし
て用いられる。‘１’抗菌力については、たとえば日本
化学療法学会標準法に準じて測定した最小発育阻止濃度
を第１表に示す。

第１表 （培地は、トリブトソィ寒天を用い※を付したものは、
１０％血液涼め。

トリプトソィ寒天を用いた。 ）■ 抗腫傷活性試験例
１ マウス白血病細胞Ｌ１２１０を腹腔内移植後、翌日より
、連続４日間Ｙ−１６４８２８腹腔内投与した時の平均
生存日数および延命率は、以下に示す通りであり、２５
の９／ｋ９／日で効果がみられた。

試験例 ２マウス乳癌ＩＭＣを腹腔内移植後、翌日より
４日間Ｙ−１６４８２夕を腹腔内投与した時の平均生存
日数および延命率は、以下の通りであり、５〜２５の９
／ｋ９／日で効果がみられた。

本発明の抗生物質を医薬として用いる場合には薬理上許
容されうる担体、餓形剤、希釈剤などと混合し、錠剤、
散剤、カプセル剤、注射剤などの形で投与されうる。

投与量は、症状、投与法などにより異なるが、通常成人
１日あたり経口投与で５〜１０仇ｏ／ｋ９／体重が適当
である。以上の理化学的、生物学的性状を有する抗生物
質Ｙ−１６４８２Ｑ物質およびＹ−１６４８２３物質の
新規性については、公開および公告特許公報、抗生物質
上、下、補遺ｎ（住木諭介著）、インデックス・オプ・
アンテイビオテイクス・フロム・アクチノマイセテス（
Ｉｎｄｅｘｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｆｒｏｍＡ
ｃｔｉｎｏｍｙｃｅにｓ）（梅沢浜夫著）、ケミカル・
アブストラクッ（ＣｈｅｍｉｃａｌＡｂｓｔｒａｃｔｓ
）などを参照し検討したが、本物質に該当するものは見
当らなかった。

したがって、本発明の抗生物質は新規物質である。抗生
物質Ｙ−１６４８２生産菌はシュードモナス属に属し、
抗生物質Ｙ−１６４８２ＱまたはＹ−１６４８２６を生
産する能力を有するものであれば如何なる微生物でもよ
い。

たとえば、本発明者らが福岡県田川都添田町にある英彦
山山麓から分離したシュ−ドモナス・フルオレスセンス
Ａ２一２株（以後Ａ２−２株と略称することもある。）
があげられる。このＡ２一２株の細菌学的性質は、次の
通りである。｛１１ 形態 肉汁および肉汁寒天塔地に生育した細胞は以下の形態を
示す。

■ 両端錨円な梓菌で、菌体は特に湾曲していない。

大きさは０．８×２〜３ｒであり、配列は不規則で連鎖
を作らないｏ多くの細胞は孤在するが２個連接している
ものもある。

■ 多形成なし。

■ 運動性あり。

ライフゾン鞭毛染色法により極多毛鞭毛を認める。■
胞子形成なし。

■ ３０℃、２蝿時間培養菌のグラム染色標本では、グ
ラム陰性樺菌のみが認められる。

■ 抗酸性なし。

【２ー 各種培地における生育状態 ■ 肉汁寒天塔地 ３０００、２岬時間培養の集落は微４・で、４期時間培
養の集落は直径１〜１．５肋円形で、辺縁正、表面猪か
で淡黄色半透明で、湿潤し、少し光沢あり。

水溶性色素なし。■ 肉汁寒天斜面 ３ぴ○、２独特間培養の菌苔は、糸状に生育し、淡黄色
、半透明、湿潤し、鈍い光沢あり。

■ 肉汁液体培養 ３０ｑｏ、２独時間培養では、液は均等に混濁している
。

日数の経過とともに試験管底に沈澱を生ずるが、菌膜は
形成されない。■ 肉汁ゼラチン ２０〜２１００で培養すると培地表層および穿刺線上部
で増殖し、培養３日目まではロート状の液化が生じ、そ
れ以後、徐々に層状に増強する。

■リトマスミルク べプトン化が起り、弱酸性になる。

３生理洋、 １７−○Ｆ培地での糖からの 酸件牛 （４）その他の性状 以上の培養所見に基づいて、パージイーズ・マニュアル
・オブ・デイターミネイテイブ・バクテリ オ ロ ジ
イ ー （ Ｂｅｒｇｅ＄ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ戊ｔ
ｅｍｉｎａｔｉｖｅ舷ｃｔｅｒｊｏｌｏ期）第８版（１
９７仏王発行）を参考にして、Ａ２−２株の近綾菌種を
検討すると、シユードモナス・フルオレスセンス（Ｐｓ
ｅＭｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）があげられ
る。

しかしながら、前記した培養知見を比較すると、■麦芽
糖、ショ糖、ラムノースからの酸産生で、Ａ２−２株は
公知のシュードモナス・フルオレセンスと異なること、
■公知のシュードモナス・フルオレセンスはホフアター
ゼ活性を有しないが、Ａ２一２株は有すること、および
■Ａ２一２株は抗生物質Ｙ−１私８２物質を生産するこ
となどの点を相違している。以上のことから、Ａ２−２
株は、相違点はあるものの基本的には、シュードモナス
・フルオレスセンス（ＰｓｅｕｄｏｍｏＭｓｆｌｕｏｒ
ｅｓｃｅｎｓ）と一致するので、シユードモナス・フル
オレスセンスＡ２一２株（ＰｓｅＭｏｍｏｎａｓｆｌｕ
ｏｒｅｓｃｅｎｓＡ２−２株）と命名した。

この菌は、工業技術院微生物工業技術研究所に徴工研条
寄第１４号（ＰＥＲＭ−ＢＰ１４）として受託されてい
る。

本菌においては、抗生物質Ｙ−１６４８２Ｑ物質、Ｙ−
１鼠８２３物質を生産する性質を失わない限り、他の生
理学的生化学的性状が変異しても本発明は使用すること
ができる。

もちろん、それらの変異株が自然の原因に由来するもの
であっても、人工的に行われるものであってもさしつか
えない。本発明の方法においては、上記のようなＡ２−
２株が培養される。

Ａ２−２株は、適当な培養条件下で発育させると、抗生
物質Ｙ−１６４８２ＱとＹ−１畝８２８を生産する。培
地には本菌が同化しうる炭素源、消化しうる窒素源およ
び無機塩など含有させることができる。

また、必要に応じて微童栄養素促進物質、前駆物質など
の微童有効物質を培地に添加してもよい。Ａ２−２株が
、同化しうる炭素源としては、グルコース、マンニトー
ル、グリセロール、フルクトースなどがあり、消化しう
る窒素源としては、肉エキス、ベプトン、カゼイン、コ
ーンスチープリカ−、大豆粉、乾燥酵母などの有機窒素
化合物や硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウムなどの無機
窒素化合物があり、それらはいずれも有効に利用される
。

培養を行う場合、Ａ２一２株を適切な培地に接種し、好
気的条件下で培養する。

培地は中性付近が良く、培養時の温度は・４〜３５℃で
生育可能であるが、２０〜２７０に保つのがよい。培養
は２８ないし４日で終了する。培養物から本抗生物質Ｙ
−１６４８２Ｑ物質、Ｙ−１Ｍ８２８物質を採取する方
法としては、微生物の生産する代謝産物を採取するのに
通常用いられる手段を適宜に利用すればよい。すなわち
、炉過、濃縮、イオン交換体による交換クロマトグラフ
ィー、活性炭、シリカゲル、アルミナおよび合成吸着剤
（アンバーライトＸＡＤ一２、ダイヤイオンＨＰ−２０
など）などによる吸着クロマトグラフィー、各種溶剤に
よる転落、沈澱、不純物の除去、あるいは透析、乾燥、
再結晶などの手段が単独または、組合わせて利用される
。なお、本物質は両性化合物であり、また弱アルカリ性
側で酢酸エチルなどの有機溶剤に転落するため、精製に
際してはそれらの理イｂ学的性質が利用される。

さらに、強アルカリ性側で不安定であるため、処理中の
溶液は弱アルカリ性ないいま酸性に保つのが有利である
。

培養液の処理法の一例を示すと、培養液の上燈液を中性
（ｐＨ＝７）、または弱酸性（斑＝５）とし、合成吸着
剤（アンバーライトＸＡＤ−２、ダイヤイオンＨＰ−２
０など）に吸着させることにより、培養液から濃縮する
ことができる。

この吸着物を水および含水落剤（メタノール、アセトン
など）で洗えばさらに不純物を除去することができる。
活性成分は溶出剤として、有機溶剤（メタノール、アセ
トンなど）と水とのその混合比を変えつつ用いるか、ま
たは斑を７〜１（塩酸水など）まで変えつつ水を用いる
ことにより、より純度よく分画溶出することができる。
実施例 １ 柵７．０に調整したグルコース２％、マンニトール４％
、乾燥酵母２％、硫酸アンモニウム１．０％、リン酸ニ
カリウム０．０２％、塩化カリウム０．４％および炭酸
カルシウム（沈降性）０．８％からなる培地の４００の
‘を、２そ客の坂口フラスコに分注し、１２１℃、２０
分間、高圧蒸気滅菌、放冷後、Ａ２−２株（徴工研条寄
第１４号）を一白金耳接種し、２４〜２６００で毎分１
８の主復、７肌振幅で振盤培養する。

培養４日後、６本のフラスコ培養液を合せて、２夕の培
養液を得る。

最終培養液のｐＨ‘ま、７．５〜８．０でブドウ球菌を
検定菌としてペーパーディスク法で、８〜１寅希釈単位
／肌‘の活性を示した。

得られた培養液２夕を遠心分離により菌体除去をした後
、水酸化ナトリウム溶液（５規定）でｐＨ９．０に調整
し、等量の酢酸エチルにて３回抽出する。

この抽出液をｐＨＩの塩酸水５００の【で活性成分を転
綾させる。この抽出液を、さらに水酸化ナトリウム水溶
液で柵９に調整し、等量の酢酸エチルで３回抽出し、抽
出液を合せ、２００の‘の蒸留水で１回洗浄する。この
酢酸ヱチル液に無水硫酸ナトリウムを加え、乾燥、淀過
し、減圧下に酢酸エチルを蟹去する（３０℃以下）。得
られた黄色粉末（約２０のｃ）をトルヱン、クロロホル
ムおよびメタ／ール（１：３：０．４）混合溶剤に溶か
し、シリカゲルカラム（プレパツクカラム・サイズＡ、
メルク社）にて、前記と同じ混合溶剤を展開溶媒として
単機精製を行う。活性フラクションを集め、減圧乾固す
ると、黄色粉末のＹ−１６４８２Ｑ物質が塩基として約
４の９、および黄色粉末のＹ−ＩＭ８２８物質が塩基と
して約５地が得られる。これらの物質は常法により塩酸
塩などの対応する酸付加塩にすることができる。

実施例 ２ 軸７．０に調整したグルコース２％、マンニトール４％
、乾燥酵母２０％、硫酸アンモニウム１．０％、リン酸
ニカリウム０．０２％、塩化カリウム０．４％および炭
酸カルシウム（沈降性）０．８％からなる培地の２０と
を、３０そのジャーファーメンターに入れ、滅菌後、Ａ
２−２株（徴工研条寄第１４号）の種培養液を２％接種
し、２４〜２６℃にて、７２時間、通気額梓培養を行う
（通気量１５夕／分、櫨梓３００副転／分）。

培養液の最終ｐＨは、７．５〜７．７でブドウ球菌を検
定菌としたペーパーディスク法で、８〜１申希釈単位／
泌の活性を示した。

得られた培養液２０そを遠○分離により菌体除去をした
後、塩酸でｐＨ６とし、合成吸着剤（ダイヤイオンＨＰ
−２０）２そを充填した塔に通し活性成分を吸着させる
。

塔を６その水で洗った後、８０％メタノール−ｐＨ２塩
酸水溶液５夕にて活性成分を溶出させる。溶出液を塩酸
にてｐＨ３．０に調整し、メタノールを減圧蟹去後、得
られた水溶液１そを、等量の酢酸エチルにて３回洗い、
不純物を除去する。水層を水酸化ナトリウム水溶液にて
ｐＨ９．０に調整し、等量の酢酸エチルにて３回抽出分
離を行う。この酢酸エチル層をｐＨＩの塩酸水１〆で転
溶させる。この抽出液を、さらに水酸化ナトリウム水溶
液でｐＨ９．０に調整し、等量の酢酸エチルで３回抽出
し、抽出液を合せ、１その蒸留水で１回洗浄する。この
酢酸エチル液に無水硫酸ナトリウムを加え乾燥、炉過し
、減圧下に酢酸エチルを蟹去する（３０ｑｏ以下）。得
られた黄色粉末（約１８０の３）を、トルェン、クロロ
ホルムおよびメタノール（１：３：０．４）の混合溶剤
に溶かし、シリカゲルカラム（プレパックドカラム・サ
イズＢ、メルク社）にて、前記同一混合溶剤の展開溶媒
で単機精製する。活性フラクションを集めて減圧乾固す
ると、黄色粉末のＹ−１私８２Ｑ物質が塩基として約６
０のｃ、黄色粉末のＹ−１６４８２Ｑ物質が塩基として
約５帆のミ得られる。実施例 ３ ｐＨ７．０に調整したグルコース２％、マンニトール４
％、乾燥酵母２．０％、硫酸アンモニウム１．０％、リ
ン酸ニカリウム０．０２％、塩化カリウム０．４％およ
び炭酸カルシウム（沈降性）０．８％からなる培地ｌｏ
ｏ０そを容量１７００その発酵タンクに入れ、滅菌後、
Ａ２−２株（徴工研条寄第１４号）の種培養液を２％接
種し、２４〜２がＣにて、７勿寿間、通気縄梓培養を行
う。

（通気量３００夕／分、蝿梓：２００回転／分）培養液
の最終ｐＨは、７．５〜７．７でブドウ球菌を検定菌と
したべーパ−ディスク法で、８〜１既希釈単位／舷の活
性を示した。

得られた培養液１００夕を遠心分離により菌体除去した
後、塩酸（濃縮酸）で−６とし、合成吸着剤（ダイヤイ
オンＨＰ−２０）１０〆を充填した塔に通し、活性成分
を吸着させる。

塔を２０その水で洗った後、８０％メタノール一ｐＨ２
塩酸水溶液３０〆にて活性成分を熔出させる。溶出溶液
を塩酸にてｐＨ３．０に調整し、メタノールを減圧蟹去
後、得られた水溶液、５〆を等量の酢酸エチルにて３回
洗い不純物を除去する。水層を水酸化ナトリウム水溶液
にて餌９．０に調整し、等量の酢酸エチルにて３回抽出
分離を行う。この酢酸エチル層をｐＨＩの塩酸水３どで
活性成分を転落させる。この抽出液を、さらに水酸化ナ
トリウム水溶液で柵９．０に調整し、等量の酢酸エチル
で３回抽出し、抽出液を合わせ、５その蒸留水で洗浄す
る。この酢酸エチル液に無水硫酸ナトリウムを加え、乾
燥、炉過し、減圧下に酢酸エチルを留夫する（３０℃以
下）。得られた黄色粉末（約１ｇ）をトルェン、クロロ
ホルムおよびメタノール（１：３：０．４）の混合溶剤
に溶かし、シリカゲルカラム（プレパックカラム・サイ
ズＣ、メルク社）にて前記と同じ混合溶剤を展開溶媒と
して、単離精製を行う。

活性フラクションを集め減圧乾固すると、黄色粉末のＹ
−１６４８２Ｑ物質が塩基として約４００のｃ、黄色粉
末のＹ−１６４８２８物質が塩基として約４５０の９が
得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、抗生物質Ｙ−ＩＭ８２Ｑ物質の塩酸塩のメタ
ノール溶液（濃度：２５．４ｍｃｇ／私）中での紫外部
吸収スペクトルを、第２図は、抗生物質Ｙ‐１６４８２
Ｑ物質の塩酸塩の臭化カリウム法での赤外部吸収スペク
トルを、第３図は抗生物質Ｙ−１６４８２８物質の塩酸
塩のメタノール溶液（濃度：２０．８ｈｃｇ／の【）中
での紫外部吸収スペクトルを、第４図は、抗生物質Ｙ−
１６４８２８物質の塩酸塩の臭化カリウム法での赤外部
吸収スペクトルを示す。 図 戊 図 め ＊ 客Ｚ菌 芥４題

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒは水素または水酸基を示す。 ）で表わされる抗生物質またはその酸付加塩。 ２ 式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされる抗生物質Ｙ−１６４８２α物質である特許
   請求の範囲第１項記載の化合物。 ３ 式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされる抗生物質Ｙ−１６４８２β物質である特許
   請求の範囲第１項記載の化合物。 ４ シユードモナスに属する一般式（I） ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒは水素または水酸基を示す。 ）で表わされる抗生物質生産菌を培養し、培養物中に上
   記一般式（I）で表わされる抗生物質を蓄積させ、これ
   を採取することを特徴とする一般式（I）で表わされる
   新抗生物質の製造法。