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Publication number: BE632574A
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Description


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  *y<Mtt POUR objet te NOUVELLE OOt1'OSX!':totf A BA8S D3 ï'$'lM'19 o 0  0 

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La présente invention est relative à de nouvelle compositions pharmaceutiques contenant de la protamine. 



   Le terme "protamine" est un terme générique utilisé pour désigner une catégorie de protéines à bas poids   moléou'-   laire dérivant principalement de sperme et de laitances de   poissions*   son poids moléculaire est omcpris entre 2000 et 8000 et on a   trouvé   que cette substnce posédait une   pro-   portion inhaibuellemtn   élevée   de restes   arginine   qui, com- portant un groupe guanidine libre,   font   que la protéine eet fortement basique.Otent ainsi que, par exemple, dans la salmine du saumon, plus de 80% de sa teneur en azote se trou- ve Mous form d'arginine, et que la clupéine du hareng   poses-   de dralment u pourcentage élevé d'arginine.

   Parmi les au- tres protmaines il faut citer   l'iridine,   la truttine, la for ane,   la     laoustrine   et la   aturine,   dont les sources natilles et les   propriétés   sont décrites dans une étude de   K.   Félix (Advanoos in Protein Chmeistry   1960,   15 1-56) La base libre est une huile qui est peu soluble dans l'eau et ses sels, tels que le sulfate par exemple, sont également peu   solublos,   bien que la présence d'acide augmente leur solu- bilité, à pH 30 par exemple.

   Telle qu'isolée du sperme de   foison,   la protamine base se trouve généralement sous forme d'une huile contenant environ 50% d'eau, substance qu'on dé- signe généralement par l'expression "huile de protamine" 
La protamine possède des propriétés anticoagulantes douces mais est surtout précieuse comme antidote de l'héparine qui est un composé puissamment anticoagulant.D'une façon générale, on l'administre lorsqu'on a donné une dose trop 

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 élevée d'héparine, et on   l'injecte   habituellement par vole intraveineuse   sous   forme de solution aqueuse à 1-2% A   cause   de la solubilité difficile des sels de   protamine,     Ion   solu tions de ces sels, à pH neutre,

   sont   instables   et ont tendance à se séparer par   précipitation.   En conséquence,   les     solution*   de sulfate de protamine utilisées pour injection sont à pH 3,0 ("injection   Protaminae   Sulphatis b.P.C") Naturellemet ces solutions acides provoquent une forte douleur si on les   injecte   par voie   intramusculaire   ou   sous-cutanée$   et leur administration est virtuellement limitée à la voie   intravei-   neuse. 



   La   demander.!..   a maintenant trouvé qu'il était possible de préparer des solutions niables à activité pre mini que à des pH bien supérieurs à 3,0 4 des valeurs de 5,0 par exemple, ou môme plus   élevées,     s'il   y a présence complexe   formaldéhyde-bisulfite     u   sulfoxylate dans la sola tien. A des concentrations relativement faibles,à 5% par exemple, ces solutions sont stables (c'est-à-drie que la   'pro.   tamine n'a pas tendance à se séparer de la solution)   Même   à pH neutre ou alcalin, mais à des concentrations plus   élevas   de 10 à   20   par exemple, il est préférable que le pH soit de 5,0 environ.

   Toutefois, la protamine ne semble pas   subir   une formation de composé avec le complexe de formaldéhyde* Ces compositions sont nettement plue appropriées à 1'injec- tion que les solutions acides   précédemment     utilisées   
La demanderesse a également trouvé qu'on pouvait obtenir des solutions encore plus stables, contenant de la protamine, si on chauffe   les solutions   protamine/forsmdéhyde de/bisulfite ou sulfoxatle à un pH alcalin.

   Les solutions ainsi obtenues sont stables à pH neutre ou môme alcalin, al u'à pH   acide,   même à   les     concentrations   en protamine aussi élevées que   20   et lorsqu'on chauffe à 37 C par   exemple,   on 

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 peut obtenir des concentrations de l'ordre de 40% 
Bien que   1'invention   ne doive pas être   limitée   par des considérations d'ordre théorique, la demanderesse pense que le complexe de formaldéhyde réagit avec des groupes amino libres présents dans les groupes guanidine pour former 
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 des dérives de sulfite de zdmthy,éne ou de sulfoxylate de n...m6thyln.,

   les produits   protaminés   obtenue par le stade de chauffage décrit ci-dessus possèdent des propriétés qui va rient légèrement selon le degré auquel on a fait réagir le complexe de formaldéhyde avec les groupes   amlno   libres. D'une   façon   générale, ils sont beaucoup moins toxiques que les pro   tamines   ou leurs sels, des essais sur sourie indiquant une 
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 DL 50 de l'ordre de 2 g/kg de poids corporel. ln vitro ils présentent peu de l'activité des protamines mais, il vvt semblent régénérer la protéine libre car leur   activité   est tout aussi élevée.

   Toutefois, la vitesse de régénération est lente et les nouvelles substances selon l'invention semblent servir de préparations-dépôts de protamine, 
L'invention a pour objet des solutions injectables aqueuses à   activité   protaminique, à stabilité améliorée, comprenant de la protamine et/ou l'un de ses sels   physiologie   
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 quement aoceptablao formés prtr addition avec dos acides, en association ou en combinaison avec un complexe formaldéhyde'- bisulfite et/ou formaldéhyde-sulfoxylate< Parmi les sels de protamine on citera, par exemple', les halohydrates, le brorahydrate, le phosphate, le nitrate, lia citrate, le turtrate et le plus courant, le sulfate* A titre d'exemples de bisulfites ou de sulfoxylate présents dans les complexes de formaldéhyde précités,

   on peut citer les bisulfites ou les sulfoxylate de métaux jazz câline, par exemple les sels de sodium ou de potasaiua!< On 

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 peut également utiliser des mélanges de bisulfite ét de sul   foxylate.   



   La concentration en protamine des solutions simples selon   l'invention,   contenant de la protamine non combina peut être supérieure à 3% en poids, et est limitée par la solubilité à une concentration inférieure à 20% environ. Des solutions contenant   de 5 à   10% sont particulièrement utile* lorsqu'il faut injecter de fortes doses de potmine Le rapport   entre   complexe de formaldéhyde, et protamine, dana ces solutions simples, est avantageusement supérieur à 1/1 et, de préférence, égal à 3/2 ou plus, des rapporte plus fai bles ayant tendance à produire une stabilisation incomplète, tandis que des rapports sensiblement plus élevés   nécessitent   une concentration inutilement élevée en complexe de formaldéhy de.

   four une solution de protamine à 10% il y a   avantageu-   sèment présence d'au moins 15% environ de complexe de formai-   déhyde.   Les concentrations et quantités de protmaine idi quées dans la présente demande sont   exprimées   en quantité équivalente de protamine   base,   que la protamine soit ou non sous forme de sel ou en combinaison avec le complexe de for   maldéhyde *   
Les solutions   simplet   haute concentration, comme indiqué ci-dessuss sont, de préférence, à   pH   5,0 environ et,   d'une   façon   générale,   le pH de la solution est compris entre 5,0 et 8.0 Si on le désire, il peut y avoir présence de sels physiologiquement acceptables tels que le chlorure de sodium,

     etc.*.   



   Dans les solutions selon l'invention qui oontien- nent la protamine et le complexe de formaldéhyde sous forme combinée, le rapport entre complexe de formaldéhyde et prota- mine peut être aussi faible que   1/1,5   mais, de préférence, est plus élevé, de 1/1,25 par exemple. 



     L'invention   vise également des compositions destinées 

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 à être dissoutes dans l'oau pour forcer des solutions stables à activité   protaminique,   comprenant de la protamine et/ou un de ses   Héla   phsioqiemetn acceptables en association ou en combinaison avec un complexe formaldéhyde/bisulfite et/ou formaldéhydes/slufoalte Dans   oea   compositions, le rapport entre complexe et protamine doit) de préférence, être situé dans les limites spécifiées ci-dessus. Le composé formé entre la protamine et le complexe peut être isolé soue forme soldie à   pitrtir   des soultions   décrites   ci-dessus, par   précipi-   tation par exemple, et constitue encore une caractéristique de l'invention.

   Une telle substance n'a pas été précédemment décrite dans la littérature et sa toxicité très réduite ainsi que, son absence d'activité in   vtro   indiquent   clairement   qu'il y a formation d'un   composé   vrai bien que, la protamine dont elle provient ayant elle-même uno composition variable,la nouvelle su   'tance   ne   soit   pas bien   caractérisée   physiquement . 



   L'invention vise également un procédé de prépara tion des solutions selon l'invention, procédé selon lequel or deissout dans de l'eau de la protamine   et/ou   un de ses   mêle   physiologiquement acceptables formés par addition aveo des acides et un complexe formaldéhyde-'bisulfite ou formaldéhyde- sulfoxylate, pour obtenir, soit directement, soit par   chauf-   fage   à   un   pH   alcalin, une solution à activité protaminique ayant une stabilité perfectionnée*Les rapports entre con stituants sont, de préférence, ceux prescrits ci-dessus. 



   Lorsqu'on chauffe les solutions pour former le com posé indiqué entre la protamine et le complexe de formaldéhy- de, il est préférable que la température de réaction soit supérieure à 40 C et, avantageusement, de   90 à     100 0,.   De pré-   férence,   le pH est supérieur à 2,5 et, meux encore, supérieur à 10,5 bien qu'à des   pH   supérieurs à 13 il puisse se produire une certaine destruction de substance et qu'on préfère des 

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 pH inférieure z 12. le temps de réaction sote de prdtdtenoup compris entre 1 et 20 heures et, pour des résultat  opt1ml. on trouve qu'il varie avec le pH et avec le rapport entre complexe de fovmlddhyde et protamine.

   D'une façon générale, le temps de réaction nécessaire pour donner de bons résul- fats est d'autant plus court que le pH ou ledit rapport sont plus   élevée*   
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 Les propriétés du produit de r6aot1on varient lege*. rement selon le degré de la réaction, ofeut-à-dîre) selon le degré d'incorporation de groupes contenant du soufre dans la   moléoule;

     d'une façon générale, l'augmentation du rapport entre complexe de   formalddhyde   et protéine, du temps do rés 
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 tion, de la température et du pH ont toutes tonlanos à fui augmenter la teneur en soufre du produi" [j.1 " et, par ocn* quent, la stabilité des solutions injectables ainsi obtenu- La solution résultante ".eut être préparée aux fir-s d'injection par stérilisation, par exemple par filtration pour éliminer les bactéries,   etc.,,   ou par traitement à la chaleur, dans un autoclave par exemple. On peut ajuster le pH entre les valeurs de 5 et 8 par exemple par addition d'un acide, par exemple d'un acide minéral tel que l'acide ohlor- hydrique, l'acide sulfurique,   etc...   



   On peut recueillir le composé à partir des solu- tions aqueuses, par exemple par précipitation, par addition d'un solvant organique miscible à l'eau tel qu'un alcool 
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 comme l'l6thanol. Les exemples suivants sont donnés à titre d' 111u8- tration de   'invention.   
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  On dissout 500 g de sulfate de protamine du oommer- oe, provenant du oaumon, dans 5 litres de sérum isotonique. On amène le milieu rdactionnel 4 pH 10,0 à l'aide de soude 

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 caustique, puis on -chauffe la solution   à   70 C on filtre le précipité brun qui   s'est     force,   On traite le filtrat par l'acide chlorhydrique dilué   jusqu'à     pH   7,6, puis on le   filtre   à nouveau. Une huile se   empare   au bout de 4-5 jours de repos à une température de 4 C On déoante le liquide surnageant. et on le jette.

   On lave l'huile résiduelle, constituée par de la protamine base, avec du sérum isotnique glace,   on   laisse à nouveau précipiter par repos au   froid,   et on re- cueille le précipite* On recommence ce même processus. A l'aide d'une solution aqueuse à 15% de formaldéhyde-bisulfite de sodium, on amène à 250   ml   50 g de la protamine base ainsi obtenue, qui contient un peu d'eau   associée.   On amène le   pH   de la solution à 5,0 pur addition d'une quantité suffisante d'acide chlorhydrique   dilué.   La solution est tout à lait sta ble aux températures ordinaires et on la filtre sur un filtre bactériologique, et on en remplit des ampoules.

   Démette façon, on obtient une solution contenant N total -   2,26%     poids/vol,   correspondant à une solution à 10% de sulfate de protamine Elle est apyrogène chez les lapins à une dose de 20 mg par kilo de poids corporel et sa toxicité, par administration intraveineuse à des sourie correspond à une DL50 de 54 mg de protamine par kilo de poids corporel.

   On trouve que le produit neutralise l'activité anticoagulante de l'héparine; in vitroen utilisant du plasma de mouton   et, à   cet égard) son activité est égale, poids pour poids à celle de sulfate de   protamine   du   commerce    En outre, il neutralise 1'effet de   1 'héparine   sur le temps du coagulation des souris, et  dune ce but, on peut l'administrer par la voie ijntramusculai re montrant ainsi en môme temps qu'il se produit une absorp- tion de la protamine lorsqu'on la donne sous cette forme. 



   EXEMPLE 5 
On dissout 5 g de l'huile de protamine obtenue à 

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 partir de sulfate de protamine du oommer6<t oomme à lt#X#Mpl* 1, dans une quantité suffisante de solution aqueuse à 20% poide/vol de formalddliyde sultoxylate de sodium  pour obtenir un volume final de 25 m1 La solution ainsi obtenue, une fois le pH amené à 5 par addition de quelques gouttes d'acide ohlorhydrique dilue,   reste   stable à température   ambiante    
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 SXBMPIiE..5. . 



  On chauffe 500 g d'huile de protamine provenant de sperme d' saumon (oalînë) avec une solution de 200 g de formalddliyde-bïuulfïte de sodium dans 500 ml d'eau, sur un bain*-marie bouillant g pendant 16 heure   après avoir amend le pH du milieu r6aotionnel h 10," aved de la coude caustique Après refroidissement on neutralise là solution jusqu'à 7#4 par addition dtaaîde Chlorhydrique dilué  on l'amen  à ua volume de 2500 ml à l'aide d'eau distillée  on la clatitle par filtration et on la   stérilise,     après   en avoir rempli dez récipients   appropriée,   à 1'autoclave sous une pression de vapeur d'eau de 0,7   kg/om2,   pendant 30 minutes* A   1' analyse ,

     
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 on trouve que la teneur en azote cet de 2#2e* oe qui corres- pond à une solution de protamine à 1000 De$ échantillons et montrent apyrogènes chez le lapin à une dose équivalent à 20 mg de protamine par kg de poids corporel et, dans des 
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 essais chez des souris, on trouve que la DL 50 est d'environ 2000 mg de protamine par kilo. 



   On traite la solution finale avec deux   parties en   
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 volume d'éthanolp de façon à faire précipiter une gomme qui, après séparation et trituration avec une quantité supplémen- taire d'êthanole donne un produit solide. On le filtre, on le lave à l'éthanol, et on le séche sous vide sur P 2051 et on obtient une substance solide contenant 16p8% de N et 10980 de S 

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 On procède comme à l'exemple 1, avec des rapporta   croissante   entre complexe de formaldéhyde et protamine  et on indique au tableau   ci-dessous   les teneurs en N et en S trouvées à l'analyse des produits ainsi obtenus.

   Dans chaque 
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 caa, on chauffe 5 6 d'huile de protaminel pendant deux heu- rets, avec 25 ml d'eau contenant la quantité nécesuaire de ' formaldéhyde-biaulfite de sodium. 
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  !l .bcI1.l.J, 1 L -:11 Huile de Formald6hyde- N0 B$ protntaine b1Iult1te. sodium 1 1. l fl j :1 1 nnn.i nn,l| 5 g <8 11,S 5 g 4g 12, ia,5>( 10,7* 13*su 5 s 5 g lOt7% z.¯¯.. 13,6      On chauffe 5 g   d'huile de   protamine provenant de 
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 opéras ?e saumon  pendant deux heures, dans une solution ' préparée à partir de 2 g de formaldéhyde eulfoxylate de 80- dium dans 20 ml d'eau et amenée à un pH de 1110, Après refrol- dissement, on ajuste le pH de la solution à 'T;4, à l'aide d'acide chlorhydrique dilué, on amène le volume à 25 rai et on filtre la solution. On obtient ainsi le produit sous forme d'une solution stable. 



     On   dissout 500 g de sulfate de   olupéine   dans 4500 ml de sérum physiologique. On amène le pH de la solution à      10,7 à l'aide de soude caustique et, après avoir élevé la 
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 température à 7000p on filtre le liquide pendant qu'il est encore chaud, de façon à séparer un précipité brun. On amène 
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 le pll du filtrat à'7,6 à l'aide d'acide chlorhydrique dilué. 

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   On laisse reposer à 4 C pendant trois   jours,   et il se sépare une   huile.   en   sépare   le liquide surnageant par dé-   cantation,   puis on agite l'huile avec 4,5 litres d'une solu- tion à 1,8% de chlorure de   sodium    puis on   laisse     déganter   au repos à 4 C;

   on dissout 50 g de l'huile ainsi obtenue ( N 12,2%) dans une solution aquese à 15% de   formaldéhyde-bisul''   fite de sodium, de façon à obtenir un volume final de ml On amène le pH de la solution à 5,0 à l'aide d'acide ohlorhy- drique dilué, On remplit aseptiquement des ampoules de 5 ml avec la solution ( N   @     2,10%),   chacune contenant 500 mg de protamine base, la solution ayant des propriétés biologiques sensiblement identiques à celles du produit obtenu à l'exemple 1 ci-dessus. 



   EXEMPLE 7 
On dissout 1000 g de olupéine base aqueuse (N 13,3) dans 4 litres d'eau contenant 400 g de formaldéhyde- bisulfite de sodium. On amène le ph de la solution à 10,15 à l'aide de soude caustique puis on chauffe le mélange à 70*0 pendant 18 heures. Après refroidissement, on abaisse le pH du liquide à 7,35 à l'aide d'acide   ohlorhydrique   dilué, et on amène le volume de la solution à 4560 ml avec de l'eau dis   tillée.   Après filtration   stérile,   on remplit des   ampoules   avec la solution. On chauffe ensuite celles-ci pendant 30 minutes, sous une pression de vapeur d'eau de 0,7 kg cm2 On analyse le produit, et on trouve qu'il contient 2,6y5 de N. 



  On procède à des   casais   de toxicité chez les sourie, ot on trouve que la DL50 du produit   est   de l'ordre de   1500   kg/kg de poids corporel, le dosage étant exprimé en protaine Dans des essais   d'apyrogénioité   sur les lapins, la   substance   est   satisfaisante   à une dose dont la valeur correspond à 20 mg de protamine par kilo de poids corporel. 



   Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux 

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 modes de mise en oeuvre décrite qui n'ont été donnés qu'à titre d'exemples  
REVENCDCIATIONS 
1 Solutions aqueuses injectables à activité pro taminique   &   stabilité améliorée,   caractérisées   en ce qu'elle comprennent de la protamine et/ou un de ses sels physiologie quement acceptables formée par addition   avec   des   acides,   en association ou en combinaison avec un complexe formaldéhyde- bisulfite et/ou   formaldéhyde-sulfoxylate.

Claims

2.- Solutions suivant la revendication 1, carac- térisées en ce que le bisulfite ou le sulfoxylate dudit com plexe est un bisulfite ou un sulfoxylate de métal alcalin.

3 Solutions suivant la revendication 2, carac- térisées en ce que ledit bisulfite ou sulfoxylate est le bisulfite ou le sulfoxylate de sodium.

4.- Solutions suivant l'une ou l'autre des reven- dications précédentes, caractérisées en ce que lesdites solu- tions ont un pH compris entre 5 et 8 5.- Solutions suivant l'une ou l'autre des reven- dications précédentes, caractérisées en ce que, lorsque, dans lesdites solutions, ladite protamine ou son sel est présente sous forme non combinée, le rapport dudit complexe de formai- déhyde à la protamine est d'au main. 1/1 en poids* 7 Solutions suivant la revenicatin 5 cargo- térisées en ce que, dans des limites de ?Il de 5 à 7 ledit rapport est d'au moins 3/2 on poids.

7 Solutions suivant l'une ou l'autre des revne dications 5 et 6, caractérisées en ce que ledit rapport n'est pas supérieur à 2/1 en poids.

8.- Solutions suivant l'une ou l'autre des reveni dications précédentes , caractérisées en oe que, lorsque,dans lesdites solutions, ladite protamine ou son sel est présenta sous forme non oombinde, la concentration de la protamine en <Desc/Clms Page number 13> solution, exprimée en concentration équivalente en protamine base, est comprise entre 0,5et 20% en poids.

9 Solutions suivant la revendication 8, carac- térisées en ce que ladite concentration est comprise entre 10 et 20 en poids et le pH ont de 5 à 6, EMI13.1 10<"- Solutions suivant l'une ou l'autre des reven- dioatione 1 à 5, oaract4eïudeo en ose qu'elles comprennent ladite protamine ou son sel en combinaison aveo le complexe de foraaldéhyde, et le rapport entre ledit complexe et ladite protamine est d'au moine 1/1 5 en poids.

11.'- Solutions suivant la revendication 10, oaraa- térisées en ce que le rapport du complexe à la protamine est d'environ 1/1,25 en poids* 12 Solutions suivant l'une ou l'autre des reven- dications 10 et 11, caractérisées en ce que la concentration de protaMine en solution, exprimée en concentration équivalen- EMI13.2 te en protamine base, est comprise entre 0, et 40 en poids* 13.- Solutions suivant l'une ou l'autre des reven- dications précédentes, caractérisées en ce qu'elles oontien- EMI13.3 nent , en outre, un ou plusieurs sels physiologiquement aocepr tables.

EMI13.4 14t'- Solutions aqueuses injectables à activité pro- taminique à stabilité améliorée, en substance, telles que décrites plus haut, notamment dans les exemples 1 à 7.

15 Compositions à dissoudre dans l'eau pour for- mer des solutions stables de protamine, caractérisées en ce qu'elles comprennent do la protamine ou un de ses sels phy- siologiquement acceptables, formés par addition avec des acides en association ou en combinaison aveo un complexe EMI13.5 formaidjhyde-bisulfite et/ou formaldéhyde-sulfoxylabe.

16.- Compositions ouivant la revendication 15 EMI13.6 caractérisées en oe que la protamine est en combinaison avec <Desc/Clms Page number 14> ledit complexe de formaldéhyde, étant sous la forme d'un composé solide capable d'être préparé par chauffage de pro- tamine avec ledit complexe de formaldéhyde à un pH alcalin, EMI14.1 possédant, 1n ,y,y.9.tVme faible activité protaminique ainsi qu'une faible toxicité aiguë par comparaison à la protamine, et parak;3dnnt, la 1 vUs une otivitd protaminique équivalente b oelle de la protamine.

17.- Compositions suivant l'une ou l'autre des re- vendications 15 et 16, caraotdr104es en oe que, lorsque, dans lesdites compositions la protamine ou son sol est en ootsbi" naioon avec ledit complexe de formaldéhyde, le rapport du complexe à la protamine est d'au moins 2/3 en poids.

18.- Compositions suivant la revendication 17, oa- EMI14.2 raotérisées en ce que ledit rapport est d'environ 1/lg25 en poids. EMI14.3

19.= Compositions à dissoudre dans l'eau pour for- mer des solutions stables de protamine, en substance, telles' ruz ,w,,r:,a plus haut.

20.- Procédé de préparation des solutions suivant l'une ou l'autre des revendications 1 à 15, caractérisé en ce qu'on dissout dans de l'eau de la protamine et/ou un de ses sels physiologiquement acceptables formés par addition EMI14.4 avec des acides, et un complexe formaldéhyde-''bisulfite et/ou formaldéhyde-sulfoxylate de façon à former, soit directement, . soit par chauffage à un pH alcalin, une solution à activité protaminique ayant une stabilité améliorée.

21.- Procédé suivant la revendication 20, carac- térisé en ce que le bisulfite ou le sulfoxylate dudit com plexe est un bisulfite ou un sulfoxylate de métal alcalin.

22.- Procède suivant !.lune ou l'autre dos reven- dications 20 et 21, caractériel en ce que le pH des solutions <Desc/Clms Page number 15> non chauffées est compris entre 5 et 8, 23,. Procédé suivant l'une ou l'autre des rendi cations 20 à 22, caractérisa en ce que le rapport entre ledit complexe de formaldéhyde et ladite protamine est compris en- tre 1/1 et 2/1 en poids.

24. - Procède suivant la revendication 23 carac- térisé en ce que ledit rapport est d'au moine 3/2 on poids 25*- Procédé suivant l'une ou l'autre des reven- dications 20 à 24 caractérisé en ce que la concentration de protamine dans la solution est comprise antre 0,5 et 20% en poids, 26.- Procédé suivant la revendication 20, carac- térisé en ce que, lorsqu'on chauffe la solution à un pH al oalin, le pH est au moins égal à 9.5 27 Procédé suivant la revendication 26 cargo- térisx en ce que le pH des solutions chauffées est d'au me 10.

5 28 Procédé suivant l'une ou l'autre des reven- dications 26 et 27, caractérisé en ce que le ph des solutions chauffées est inférieur à 13 29. - Procédé suivant la revendication 28 carac- térisé en ce que ledit pH des solutions chauffées est infé- rieur à 12 30 Procédé suivant l'une ou l'autre des reven- dications 20 à 26, caractérisé en ce que la température à laquelle on chauffe la solution est supérieure à 40 C 31 Procédé suivant la revendication 30 carac- térisé en ce qu'on chauffe la solution à une température de 90 à 100*0.

32.- Procède suivant l'une ou l'autre des revendi- cations 20 et 26 à 31, caractérisé en ce que le rapport entre le complexe de formaldéhydo et la protamine est d'au moins 2/3 <Desc/Clms Page number 16> 33 Procédé suivant la revendication 32, oarax térisé en ce que ledit rapport est de 1/1,25 environ* 34.- procédé suivant l'une ou l'autre des revendi- cations 20 et 26 à 33, caractérise en ce qu'on recueille en- suite sous forme solide le composé formé entre la protamine et le complexe do formaldéhyde* 35 Procédé suivant la revendication 34 carac- térisé en ce qu'on fait précipiter ledit composé de sa solution aqueuse par addition d'un solvant organique miscible à l'eau.

36 Procédé suivant la revendication 35 oarao. térisé en ce que ledit solvant organique miscible à l'eau est un alcool.

37 Procédé de préparation de solutions aqueuses inejectables à activité protaminque en substance,tel que décrit plus haut, notamment dans les exemples 1 à 7 38 Solutions ,suivant l'une ou l'autre des re vendications 1 à 14 et compositions suivant l'une ou l'au- tre des revendications 15 à 19 obtenues par le procédé sui vant l'une ou l'autre des revendications 20 à 37