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Mercapto tétracyclines,
La présente invention concerne des tétracyclines nouvelles et utiles et leur utilisation dans la prépara- tion d'autres tétraoyclines. L'invention ooncerne plus
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particulièrement diverses marcaptotétracyclinesp les pro- duits -d'oxydation de celles-ci, et leurs sels, et un nou- veau procédé permettant la conversion de ces antibiotiques
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en 6-épi-eésoxytétraoyolines ayant des propriétés pré- cieuses.
Il s'est avéré que l'addition des thiols aux 6-désoxy-6-déméthyl-6 méthylènetétracyolines conduit à la
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formation des précieuses mercapto-tétraoyolines ayant la structure ci-après.
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où. A est l'un des membres du groupe hydrogène et hydro- xyle, et R est choisi dans le groupe comprenant les al- coyles primaires et secondaires comportant un à douze chaînons carbonés, R"CO où R" est un alcoyle contenant de un à trois atomes de carbone, un radical phényle, phényle monosubstitué ou bisubstitué, benzoyle, trifluorométhyle et R'CH2- ; où R' est choisi dans le groupe comprenant les radicaux alcoyles inférieurs mono- et bi-substitués, oarboxyle, carbalcoxyles inférieurs halogéno, phényle, phényle mono- et bi-substitué et furfuryle.
Chaque substituant desdits alcoyles inférieurs mono-et bi-substitués étant choisis dans le grqupe des . radicaux hydroxyle, alcoxyles inférieurs, oarboxyle, carbalcoxyles inférieurs, halogéno et amino, à condition que, dans le cas où deux des substituants sont accrochés au même atome de carbone, l'un au moins soit un carboxyle ou un oarbalcoxyle inférieur.
Chaque substituant desdits phényles mono-et bi-substitués étant choisi dans le groupe qui comprend les radicaux alcoyles inférieurs, hydroxyle, alcoxyles inférieurs, carboxyle, carbalcoxydes inférieurs, nitro et amino.
Ces nouvelles tétracyclines possèdent une acti- vité antimiorobienne intéressante contre un grand nombre de microorganismes, tout particulièrement contre les bac- téries gram- positives et les souches de staphylocoques qui résistent aux antibiotiques, et ils sont désignés par l'appellation générale appropriée de 6-désoxy-13- (meroap- tosubstitué)- tétracycline, étant'donné que l'atome de
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carbone exo cyclique en position 6 du noyau tétracyclini- que est désigné 0-13 .
Ainsi que cela sera expliqué ultérieurement, les nouvelles 6-désoxy-13 (mercaptosubstitué)-tétracycli- nes peuvent être converties en d'autres antibiotiques utiles comprenant les 6-désoxy-13-mercaptotétracyclines.
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et les 6-désoxy-13 (mercaptosubstitué) tétracycline- , suif oxydas. !
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où A et R répondent aux définitions précédentes.
Les 6-désoxy-13 (mercaptosubstitué) tétracycline- sulfoxydes sont eux-mêmes des intermédiaires intéressants pour d'autres dérivés nouveaux de la tétracycline, notam- ment la 7,13-épithio-6-désoxytétracycline.
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et 11 a, 13répithio-6-désoxytétracyolïne
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Chacune de ces nouvelles classes de tétracycline soufrée étant elle-même intéressante comme intermédiaire dans la préparation des 6-épi-6-désoxytétracyclines, ' antibiotiques qui seront décrits de façon plus précise ci-après. Il s'est avéré que le traitement des tétracy- clines soufrées mentionnées ci-dessus avec du nickel de
R'aney offre une voie particulièrement avantageuse et inattendue vers les 6-épi-6-désoxytétracyclines.
Les principales suites de réaction, selon la présente invention, peuvent être résumées comme suit :
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dans lesquelles A et R répondent aux définitions précé- dentés.
Dans la succession de réactions ci-dessus:
IV # I est une réaction d'addition de thiol,
I # III est une réaction d'oxydation, # II est l'hydrolyse des composés de structure I dans le cas où. R est un acyle ; # '/ représentent des désulfurations par
II # V / ) le nickel de Raney.
III # V
La demande de brevet française déposée le 23 Mai
1961 pour : Procédé de préparation des 6-désoxy-tétracy- clines et nouveaux produitainsi obtenus, divulguait un procédé de préparation des 6-désoxy-6-méthylène-tétraoy-. clines, appelées par abréviation 6-méthylène-tétracyclines, qui sont les composés de départ employés pour les séquences de réactions selon la présente invention. Comme cela a été décrit dans la demande précitée et sera illustré à nouveau ' dans les.exemples ci-après, les 6-méthylène-tétracyclines sont préparées selon la succession de réactions ci-après.
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où A est un hydrogène ou un hydroxyle, et X est un holo- gène, de préférence du chlore ou du fluor.
La réaction VI # VII correspond à l'halogé- nation d'un composé de tétracycline tel que la tétracy- cline elle-même ou la 5-oxy-tétracybline, au moyen d'un agent.d'halogénation, en solvant inerte à la réaction,
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afin de constituer un 11 ô -halotétracycline-6,12-hémicétal.
La réaction VII # VIII correspond au traite- . ment de l'hémicétal avec un acide fort du type deshydra- tant, comme l'acide fluorhydrique liquide pour constituer
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une 11-X -halo-6-méthylbne-tétracycline.
La réaction VIII # IV représente la 11 [alpha]- déhalogénation des composés de structure VIII, opération qui est effeotuée le plus rationnellement par hydrogéno- lyse catalytique, avec un catalyseur constitué par du palladium, du rhodium ou d'autres métaux nobles; ou aussi par réduction chimique, par exemple par traitement avec un hydrosulfite d'un métal alcalin ou avec une combinaison active d'un métal et d'un acide minéral, par exemple du zinc, et de l'acide chlorhydrique.
Ainsi que cela est décrit de façon plus détaillée dans les demandes antérieures de brevet mentionnées plus haut, d'autres 6-méthylène-tétracyclinessont préparées par des réactions de substitution aromatique appliquée
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aux intermédiaires, par exemple, aux 11 ci. -halotétracycline- 6,12-hémicétals, ou aux 11Q\-halo -6-néthylène-tétracycli- nes.
On obtient de cette manière des produits substitués en 7 et/ou en 9 des 6-méthylène-tétracyclines dans les- quels les substituants peuvent être un halogène, un radi- cal nitro, amino, ou alcanoylamino, La réaction avec un
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i-
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agent d'halogénation, par exemple, un agent de chlorura- tion, de bromuration ou d'ioduration, donne la 7-halo- tétracycline correspondante comme produit principal, avec éventuellement le dérivé halogéné en 9 correspondant. La t nitration, par exemple avec de l'acide nitrique dans l' acide acétique ou dans l'acide fluorhydrique liquide, donne en général.un mélange de dérivés nitro-substitués en 7 et 9, quand ces deux positions n'étaient pas anté- rieurement substituées, le produit'principal de ce mélange étant le composé 9-nitro.
Les mélanges obtenus de cette manière peuvent être séparés par des procédés comme la chromatographie en colonne, avec le système toluène- pyridine-eau, ou un système de solvants analogue. Les groupes nitro-aromatiques peuvent être réduits en groupes amino pendant la déhalogénation en 11[alpha] et les groupes amino peuvent être convertis en alcanoylamino, par exemple par acylation avec l'anhydride d'acide approprié.
Les 6-méthylène-tétracyclines substituées en 7 et/ou en 9 que l'on peut réaliser par les procédés décrits ci-dessus peuvent également être employés comme composés de départ pour les réactions de la présente invention.
Toutefois la mise en réaction de thiols avec les 7-halo-
6-méthylène-tétracyclines, et plus particulièrement avec les 7-halo-6-méthylène-5-oxytétracyclines est quelquefois difficile à opérer. On préférera tout particulièrement
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les 6-méthylène -tlt-racycline s répondant à la structure IV, comme composés de départ pour la succession de réaction selon l'invention, cela par suite de leur réaction aisée avec les thiols, ainsi que pour les propriétés précieuses des produits obtenus.
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- On dispose d'une large gamme de thiols pouvant être utilisés pour réagir avec les 6-méthylène-tétracycli- nes, en vue de préparer les nouveaux composés de la struo- . ture I. Parmi ceux-ci on peut citer un certain nombre de , thiols hétérocycliques, comme les [alpha] et /3 mercaptopyridi- nes et leur N-oxydes. Toutefois, les thiols de la formule RSH, où R répond aux définitions données antérieurement, sont tout particulièrement préférés, étant donné la faci- lité de se les procurer, leur bonne aptitude à réagir et le grand intérêt des produits qu'ils donnent. Le large choix possible de thiols permet de déterminer la polarité de l'antibiotique en fonction de tel ou tel besoin théra- peutique particulier.
On doit utiliser au moins une mole de thiol pour chaque mole de 6-méthylène-tétracycline.
Toutefois, il n'y a pas d'inconvénient à utiliser du thiol en excédent et cette manière de faire sera en général pré- férée afin d'avoir la certitude que la totalité de la tétracycline de départ a été effectivement convertie dans le produit recherché. Bien souvent, ce thiol en excès pourra remplir correctement le rôle supplémentaire de solvant.
On peut encore ajouter un solvant inerte pour la réaction, ou bien un solvant ne réagissant pas d'une façon intempestive avec les composés de départ-ou avec le produit ; recherché. Le choix du solvant n'est pas particulièrement critique. Des solvants comme le méthanol, le butanol, l' éthylène, le glycol et l'eau appartiennent à ceux qui con- viennent bien. Il est clair que l'on choisira en général un solvant qui bout à la température de réaction ou au- dessus afin d'éviter l'inconvénient d'une réaction en sur- pression.
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La gamme des températures de réaction possibles est étendue, on opérera entre 0 et 130 C et de préférence entre 25 et 100 C. En dessous de 0 C la réaction peut être exagérément lente alors que les températures dépassant notablement 130 C comportent le risque d'une perte de ren- dement, par suite d'une décomposition partielle de composés de départ ou du produit de la réaction.
L'usage d'un catalyseur pour la réaction d'addi- tion du thiol constitue un expédient utile, mais nullement essentiel, pour accélérer la vitesse de réaction. Les agents qui fournissent des radicaux libres conviennent bien comme catalyseurs, par exemple, des peroxydes organi- ques, l'eau oxygénée, l'oxygène, l'air et la lumière. Un catalyseur particulièrement intéressant est l'[alpha], [alpha]'-azo- diisobutyronitrille (appelé aussi plus communément [alpha], [alpha]'- azodibutyron'.trile) lequel est exempt de la tendance, quel- quefois manifestée par les peroxydes, de produire des pro- duits d'addition de thiol contenant des traces du sulfo- xyde correspondant.
Les pourcentages des catalyseurs à employer sont compris entre 0,1 et quelque 10 %, ou même plus, rapportés au poids de la tétracycline.
Un procédé rationnel pour déterminer l'achèvement de la.réaction consiste à prélever périodiquement des échantillons aux fins d'analyse. C'est ainsi, qu'un tel échantillon peu être dilué avec du méthanol à la concen- tration d'environ 1 mg/ml et être soumis à la chromatogra- phie sur papier. Lorsque le composé de départ s'est avéré avoir disparu la réaction peut être considérée comme ter- minée. Le temps nécessairé dépendra évidemment des corps particuliers en réaction, des proportions de ceux-ci et
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des conditions de la réaction, à savoir la température, le catalyseur (s'il y en a un) et la concentration de ce dernier.
C'est ainsi que les réactions partant des 6-méthy- lène-5-oxy-tétracyclines sont souvent plus lentes que celles qui intéressent les 6-méthylène-tétracyclines, la même remarque étant valable pour les alkyl-mercaptans secondaires par comparaison avec les primaires. Des temps de réaction allant de 10 mn à environ 8 heures apparaîtront en général adéquats, mais aux basses températures plusieurs jours pourront parfois s'avérer nécessaires.
-,.Une fois que la réaction est achevée le produit peut être récupéré par les procédés habituels. C'est ainsi qu'il peut être précipité par l'addition d'un non solvant, comme l'éther diéthylène, l'eau et l'acétone. Le produit précipité peut être encore purifié par recristallisation, de préférence à partir d'une solution dans des alcools tels que le méthanol, l'éthanol, l'isopropanol et autres pro- duits du même genre. La recristallisation peut être con- duite en présence'd'acides formateurs de sels, comme l' . acide paratoluène-sulfonique, l'acide sulfosalicylique, l'acide chlorhydrique, l'acide naphtalène-sulfonique et autres acides analogues, afin d'obtenir le produit recris- tallisé sous la forme d'un sel d'addition à un acide.
On peut aussi effectuer la purification par chromatographie en colonne, avec des systèmes de solvants, comme l'acétate d'éthyle et l'eau, sur poudre de cellulose.
Les composés de structure'I peuvent être encore transformés en des sulfoxydes intéressants de structure III par traitement à l'eau oxygénée en proportions molaires.
Cette réaction est en général effectuée dans un solvant
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inerte à la réaction, par exemple le méthanol, à la tempé- rature ambiante. Des temps de réaction allant jusqu'à 24 heures, conviennent en général pour cette conversion.
Toutefois, il est clair que le temps optimal de réaction pour une réaction donnée est aisément déterminé par l'ana- lyse périodique des prélèvements par chromatographie sur papier, comme indiqué antérieurement. On a vu précédemment que l'eau oxygénée est un bon catalyseur de la réaction d'addition du thiol, aussi les suif oxydes peuvent-ils être
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préparés sans isoler les mercaptotétracyclines. Si l'on s'en tient à cette manière de procéder il sera en général souhaitable d'introduire le peroxyde par fractions succes- sives, au lieu d'incorporel . totalité de la dose molaire dès le début de la réaction. Les suif oxydes peuvent être purifiés efficacement par cristallisation, par exemple sous leur forme de sels d'addition à un acide, à partir de sys- tèmes de solvants comme l'acétone et l'eau.
Le traitement des composés de la structure I avec deux moles d'eau oxygénée dans des conditions plus brutales est nécessaire pour préparer les sulfones corres- pondants.
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Les 6-désoxy-13-marcaptotétracyclines de struc- ture II peuvent être obtenus aisément par hydrolyse des- produits de structure I dans lesquels R est un acyle, par exemple à partir de la 6-désoxy-13-acétyl-mercaptotétracy- cline. Cela peut être obtenu par traitement, pendant un temps allant jusqu'à cinq jours, à l'acide chlorhydrique concentré, à la température ambiante. A la fin de la réac- tion le produit peut être récupéré en déversant le mélange de réaction dans de l'eau, puis, par mise en solution et
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extraction, par exemple au butanol, et enfin cristallisa- tion.
Toutefois, lorsque ce dernier procédé est appli- qué aux sulfoxydes de structure III, dans lesquels R est un phényle ordinaire ou substitué, l'on n'obtient pas les mercaptotétracyelines de structure II. Bien au contraire, on obtient le S-épimère du composé de départ. D'ailleurs ces produits sont également des antibiotiques ayant des propriétés antimicrobiennes intéressantes.
Lorsque l'on a appliqué le procédé ci-dessus aux
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suif oxydes de la 6-désoxy-13-benzyl-mercaptotétracycline, on a cru tout d'abord que le produit actif était la 6-désoxy- 13-mercaptotétracycline. Toutefois, entre temps il s'est avéré que ce produit est un mélange séparable de deux anti- biotiques nouveaux, à savoir la 7,13-épithio-6-désoxyté- tracycline (IX) et la 11 [alpha], 13-épithio-6-désoxytétracycli- ne (X). Leur préparation est obtenue en dissolvant le sulfoxyde de benzyl-mercaptotétracycline dans un acide minéral, de préférence l'acide chlorhydrique de 6 à 12N ou l'acide sulfurique de 6 à 24N. La température de réac- tion doit être comprise entre 0 et 100 C, de préférence entre 20 et 50 C et la température ambiante sera en géné- ral satisfaisante.
Le temps nécessaire pour assurer la conversion variera en fonction de la température adoptée, du genre d'acide et de sa concentration et il est recom- . mandé de déterminer le temps optimal de réaction, dans des conditions données, par analyse chromatographique sur papier d'échantillons du mélange de réaction prélevés périodiquement. Des temps de réaction compris entre 12 heures et 10 jours conviennent en général. Lorsque la
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réaction est achevée, le produit mixte de réaction peut être récupéré en diluant le mélange avec de l'eau et de la glace, en procédant à l'extraction avec un solvant organi- que comme le butanol et en faisant évaporer la phase d'ex- trac+ion. Le résidu obtenu contient les composés 7,13- épithio et 11 a, 13-épithio.
Si on le désire les deux com- posés peuvent être séparés par cristallisation fractionnée, par exemple dans des alcanols inférieurs. C'est air.si, que le chlorure de la#11a, 13-épithio 6-désoxytétracycline est moins soluble dans le méthanol que le composé 7,13-épithio, correspondant. Il est donc possible de le faire cristalli- ser en premier, le 7,13-épithio-composé étant alors extrait à son tour par cristallisation de la liqueur mère.
Tout comme les composés de structure I, II et III les composés épithio ont ixne activité intéressante contre des micro- organismes très divers comme cela sera indiqué dans les exemples ci-apnexés. La 7,13-épithio 6-désoxytétracycline peut être convertie en un sulfoxyde bioactifpar traitement à l'eau oxygénée dans les conditions déjà décrites plus @aut pour la conversion des composés I en composes III.
Les tétracyclines soufrées répondant aux struc- tures I, II, III, IX et X ont une activité-antibactérienne intéressante mise en évidence par les.données des tableaux I et II et dans les exemples ultérieurs qui résument l'ac- tivité in vitro de certains de ces nouveaux composés pris ici à titre d'exemple, sur de nombreux micro-organismes pathogènes et notamment sur de nombreuses souches résis- tantes aux antibiotiques. La concentration inhibitrice minimale est déterminée par la technique bien connue des dilutions progressives.
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T A B L E A U - I -
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r=# =:#=# ==# =# s=# =r# =# =:#
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<tb> Micro-organisme <SEP> Concentration <SEP> inhibitrice <SEP> minimale <SEP> (mcg/ml)
<tb> A <SEP> B <SEP> C <SEP> D <SEP> E <SEP> F <SEP> G <SEP> H
<tb>
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####################-## # ##- -##### ---.### .#.-## ##.##- .#--#- ##### :M.,pyogenes var.aureus 3,12: 0.78 3,12 n 78: 1,56 50 12,5 , :S. pyogenes .......:..........: 0.09 0,78; 50 0.19 039: , .6.3 0,19: 0,19: :S.faecalis 6,3 > 100 - 1,56: - - 1,56: :D.pneumoniae ................. 0,78: 1,56-; l00 v,39 1,56 1,56 0.78 .E.rhusiopathiae ..............: - - - 0,19: 1,56: 1,56: 0,19: 0,78:
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<tb> C. <SEP> diphtheriae <SEP> ................: <SEP> - <SEP> 1,56: <SEP> 100 <SEP> 0,78; <SEP> -
<tb> :L.monocytogenes <SEP> - <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 100 <SEP> - <SEP> 1,56:
<SEP> -
<tb>
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:B.subtilis ................... - 0 7g 100 - o,7g? ,.. - :E.coli ....................... : >100 :' 100 zoo - 12,5 : 50- '100 ;S.typhosa ....................:> 100 50 50 - 100 12,5 : . 50 : 7 100 . :K.pneumoniae >100 25 50 fol - - - :7100 ¯ .gonorrhoeae ................ - Os78; .
P,78; - :H. inf lùenzae .................. 0,78: 0.78 1,56: - 3,12:; :S.sonnei ..................... - 25 12,5 - 50 - - :B.bronchiseptica >100 3,12: 25 - 12,5 : - - -
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<tb> V. <SEP> comma <SEP> ......................: <SEP> - <SEP> 100 <SEP> 50- <SEP> 3
<tb> :P.multocida <SEP> 0,78: <SEP> 0,78: <SEP> 0,78: <SEP> - <SEP> 3-
<tb>
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:Mycobacterium 607 - ; > 100 1, 56 ; - ; . - : ¯ :S.agalactiae - 0,78: ;>100 1,56: - - - -
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<tb>
<tb>
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TABLEAU- I - (suite)
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<tb> Micro-organisme <SEP> Concentration <SEP> inhibitrice <SEP> minimale <SEP> (mcg/ml)
<tb>
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AB CDEF GH # H ## PM --#.###-####-## -------- ----- - -------- -------- -------- -------- 'M.pyogenes var.aureus 3760 .....
LI 56 > 100 \ > 100 - 0,78; 00 : M . pyogene var.aureus I 00 .... : 3, 12 bzz >>' 100 0,78: 3,12 : > î00 100 : 100 ;M.pyogenes var.aureus K2.....: - " 3,12: - - :M.pyogenes var.aureus K3..... : 0,78: - - -s 3,12' - M.pyogenes var.aureus K.....: 1,56; - . ' . ' ; " - '" , - :M.pyogenes var.aureus Mi ...... 0,78: - - 6,25: - - - M.pyogenes var.aureus Mg0.....! 1,56* - ------ :M.pyogenes var.aureus M12 .... 0,78: - -s -i -: - # - # - Streptococcus98............. - 0,7$; > 100 - 0,39 - 1.56 Staph.209P - 0,78 1,56 - 1.56 - - - : # Souches résitantes aux , : i # * # # -# # # # # # *. i ## antibiotiques. s 1¯ ! z .
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T A BLE AU:.. 11- ##### . Activité in vitro des 6-désoxêtraéylines surextrait de cerveau et de coeur additionné de sérum humai"
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Micro-organisme Concentration inhibitrice minimale (mcg/ml) A D G H . M.pyogenes var.aureus ..,....# 12,5 1,56 : 3,12 : 1,56 12,5 12,5 ; Streptoeoccus pyogenes 3,12 0,78 : 50 0,78 :
Streptococcus 98 ............: - DI78 : - : - : - : -
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Les composés dont les résultats sont donnés aux tableaux I et II sont identifiés de la façon suivante :
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<tb> Composé <SEP> A <SEP> X <SEP> = <SEP> CH3CH2CH2CH2S- <SEP> et <SEP> Y <SEP> = <SEP> H
<tb>
<tb>
<tb> Composé <SEP> B <SEP> : <SEP> X <SEP> = <SEP> HOCH2CH2S- <SEP> et <SEP> Y <SEP> = <SEP> H
<tb>
<tb>
<tb> Composé <SEP> C <SEP> : <SEP> X <SEP> = <SEP> HOCH2CH2S- <SEP> et <SEP> Y <SEP> = <SEP> H
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Composé <SEP> D <SEP> : <SEP> X <SEP> = <SEP> C6H5S <SEP> - <SEP> et <SEP> Y <SEP> = <SEP> H
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Composé <SEP> E <SEP> : <SEP> X <SEP> = <SEP> C6H5CH2S- <SEP> et <SEP> Y <SEP> = <SEP> H
<tb>
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Composé.F :
X =HOCH2CH2S (-,\ 0)- et Y = H
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<tb> Composé <SEP> G <SEP> : <SEP> X <SEP> = <SEP> C6H5S <SEP> (# <SEP> 0)- <SEP> et <SEP> Y <SEP> = <SEP> H
<tb> Composé <SEP> H <SEP> : <SEP> X <SEP> = <SEP> C6H5CH2S <SEP> (#0)- <SEP> et' <SEP> Y <SEP> = <SEP> H
<tb>
Ces nouveaux produits ont dans certains cas une activité in vivo quelque peu réduite par rapport à celle des 6-méthylène-tétracycline:, à partir desquelles ils ont été préparés. Néanmoins leur activité exceptionnelle ir. vitro contre une large gamme de micro-organismes les rend particulièrement intéressants pour le traitement topique de certaines infections cher les animaux, y compris l'hom- me.
Ils sont également utiles comme antiseptiques et désin- fectants en pratique vétérinaire et en agriculture.
Ainsi que cela a été indiqué antérieurement, on 's'est maintenant aperçu que les nouvelles tétracyclines de structure I, II, III, IX et X, y compris leurs sels, cons- tituent des intermédiaires précieux pour la préparation des 6-épi-6-désoxytétracyclines décrites de façon plus détaillée dans la demande de brevet précitée. Ainsi que cela
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est divulgué dans cette demande, les 6-épi-6-désoxy-tétra- < cyclines sont ainsi appelées pour la raison que la configu- ration stérique du groupe 6-méthyle est à l'opposé de celle observée dans les 6-désoxytétracyclines connues. La nomen- clature "6-épi" suit donc fidèlement la nomenclature
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acceptée pour les 4-épitétracyclines antérieurement con- nues.
Ainsi que cela est indiqué dans la demande de brevet signalée plus haut, ces produits, y compris la 6-épi-6-
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désoxytétracycline et la 6-épi-6-désoxy-5-oxytétracycline sont intéressants du fait de leur activité intense contre une large gamme de micro-organismes, à la fois in vivo et in vitro, Toutefois le procédé antérieurement divulgué pour la préparation de ces composés aboutit à un mélange de la 6-épi-6-désoxytétracycline et de la 6-désoxytétra- cycline antérieurement connue, ce qui implique une opéra- tion supplémentaire de séparation et une baisse du rende- ment en produit 6-épi. Un nouveau procédé a maintenant été mis au point pour la préparation des 6-épi-6-désoxytétra- cyclines qui ne produit as simultanément les 6-désoxyté- tracyclines correspondantes antérieurement connues.
Le problème' de récupération s'en/prouve simplifié et le rende- ment est amélioré dans une mesure appréciable.
Avec le nouveau procédé, n'importe lesquelles des tétracyclines soufrées de structure I, II, III, IX et X sont mises en contact, dans un solvant inerte, avec un poids au moins égal de nickel de Raney, à une température comprise entre 20 et 130 C, afin d'effectuer la conversion souhaitée.
La méthode de préparation du nickel de Raney est indiquée dans l'ouvrage Organic Syntheses, Collective Volume 3, pp. 176-183 (1955) et dans beaucoup d'autres publications. Si le poids du nickel de Raney est en géné- ral au moins égal au poids de la tétracycline soufrée, on peut cependant utiliser des concentrations plus faibles avec succès. Cela comporte toutefois le risque d'une
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réaction incomplète aussi évitera-t-on en général une telle manière de faire. On peut aussi recourir à des proportions beaucoup plus importantes de nickel de Raney. Toutefois on ne gagnera plus rien a en utiliser plus de dix fois environ le poids de la tétracycline.
Ce nouveau procédé est conduit dans un solvant ' inerte pour la réaction, dont le choix n'est pas critique.
Il est particulièrement favorable de choisir un solvant pour le composé de départ qui possède un point d'ébullition : à la pression atmosphérique approximativement égal à la température de réaction souhaitée et c'est pour cette raison que l'on choisit souvent des solvants comme le méthanol et l'éthanol.
La température de réaction ne constitue pas un facteur critique et l'on obtient des vitesses raisonnables de réaction, sans risque appréciable de décomposition, en se cantonnant entre 20 et 130 C et de préférence entre 60 et @0 C. A ces températures il suffira d'un temps compris entre une et quarante-huit heures pour assurer la conver- sion souhaitée.
Lorsque la réaction est achevée, on sépare le nickel de Raney, de préférence par centrifugation et l'on récupère le produit par évaporation de la solution de réaction. Pour éviter le risque d'une certaine perte de produit par adsorption sur le nickel de Raney, il est bon de laver soigneusement le catalyseur avec un solvant, par exemple du. méthanol, de l'éthanol, de l'acide acétique ou similaires et de joindre les eaux de lavage à la solution, avant l'évaporation. Le produit obtenu, à savoir une 6-épi-
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6-désoxytétracycline ou une 6-épi-6-désoxy-5-oxytétracyoline,'
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selon 1' identité du substituant A dans le composé de départ, peut être encore purifié, si on le désire, par les procédés habituels, en vue de le séparer du composé de départ n'ayant pas'ré agi.
C'est ainsi que le produit peut être soumis à l'extraction dans des systèmes comme le butanol-HCl aqueux à 0,01 N ou à une cristallisation dans des solvants comme les alcools sous forme de sel d' addition à un acide ou de base libre. Le nouveau procédé offre une voie intéressante vers les composés 6-épi, obte- nus avec de bons rendements et exempts des 6-désoxytétra- cyclines de structure habituelle.
Comme les autres 6-désoxytétracyclines, les produits d'addition thiolés selon la présente invention conviennent pour des réactions de substitution. aromatique du genre antérieurement indiqué, par exemple une halogé- nation conduisant aux dérivés correspondants d a -halo, ou 7,11 a -dihalo, ou encore 9,11 a-dihalo, ou aux uns et aux autres, tous produits qui sont encore susceptibles d'une 11 a-déhalogénation par les procédés indiqués précé- demment lesquels sont également décrits d'une façon plus détaillée dans la demande de brevet aux Etats-Unis N 31.236 antérieurement mentionnée. On obtient ainsi une autre voie vers les précieux analogues substitués sur le noyau D des nouveaux produits selon l'invention.
Les nouveaux produits se prêtent également à de nombreuses autres transformations chimiques conduisant à d'autres dérivés nouveaux et utiles. C'est ainsi que la chloruration des 6-désoxy-13-mercaptotétracyclines ou du composé 5-hydroxy correspondant offre une voie pour la préparation de la 6-désoxy-13- (S-chloromercapto)
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tétracy--cline.
Si A est un hydroxyle le traitement de ce dérivé par une base donne à son tour un nouveau dérivé pentacy- clique qui répond à la formule ci-après :
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Si A est un. hydrogène et si le composé S-chloromercapto est soumis aux conditions de @a réaction de Friedel-Crafts on fait la synthèse d'un autre nouveau dérivé pentacycli- .que, à savoir, le 7,13-épi-thio-composé de la structure IX antérieurement indiquée qui répond à la formule ci-après :
EMI20.2
En outre, la 6-désoxy-13-(S-chloromercapto) tétracycline constitue un composé de départ intéressant
EMI20.3
pour obtenir les nouvelles qdésoxy-13-(alooxymercapto)- tétracyclines et 6-désoxy-13-(aryloxy-mercaptotétracycli- nes).
Les sulfoxydes 13-phényl-mercapto et leurs pro- duits de substitution sur le phényle, selon l'invention,
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constituent également des composés de départ favorables pour aboutir à la 6-désoxy-6-déméthyl-6-formyl-tétracy- cline et -oxytétracycline,, par exemple par traitement avec de l'acide sulfurique, à température élevée. Ces aldéhydes peuvent encore être soumis à diverses transformations ultérieures caractéristiques du groupe formyle.
Les dérivés 13-acylmercapto-sulfoxydes selon l'invention peuvent également être traités aux acides pour donner les aldéhydes indiqués.ci-dessus, ou être hydrolysés en les dérivés 13-sulfino correspondants. Un substituant acyloxy, par exemple R"COO où R" répond à la définition donnée plus haut, ou un substituant benzoyl-oxy peut être introduit en C-13dans les produits d'addition thiolés de structure I par traiteme. avec l'ester t.butylique du peracide approprié, par exemple le peracétate de t.butyle ou le perbenzoate de t. butyl, ainsi que cela est décrit dans le Journal of Organic Chemistry, volume 26, page 281 (1961).
Ces réactions peuvent par exemple être appliquées au produit d'addition de benzène-thiolé, afin d'obtenir une 6-désoxy-13-Phényl-mercapto, '13-acyloxy- ou benzoyl- oxy-tétracycline, qui peut être hydrolysée en 6-désoxy-6- déméthyle-6-formyl-tétracycline. De même, le traitement du
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produit d'addition ol -toluènethiolé avec du peracétate ou perbenzoate de -butyle, fournit une 6-désoxy-13-benzyl- mercapto, 13-acyloxy- ou benzoyloxy-tétracycline qui peut
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être hydrolysée en 6-désoxy-13-mercapto-tétracycline.
Les composés soufrés selon l'invention de struc- ture I, II, III, IX et X peuvent être incorporés à diver- ses compositions de façon analogue aux tétracyclines dont ils sont issus. Pour une application'topique ils peuvent
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être incorporés dans les excipients habituels, y compris le pétrolatum et autres produits du même genre, à des con- centrations en poids comprises antre 0,1 et 10 %. Qes pro- duits présentent un intérêt thérapeutique comme adjuvants fourragers ou stimulants de la croissance, en pratique vétérinaire et en agriculture.
La présente invention vise tous les sels, y com- pris les sels d'addition à des acides et les sels métalli- ques, des nouveaux antibiotiques amphotères. Les procédés bien connus pour la préparation des sels des composés des tétracyclines sont applicables dans ce cas et sont illus- trés par les exemples cités ultérieurement. On peut former de tels sels indifféremment avec les acides et les métaux acceptables ou inacceptables en pharmacopée. Par accepta- bles en pharmacopée on entend des acides et métaux forma- teurs de sels qui n'accroissent pas notablement la toxicité de l'agent antimicrobien amphotère. Les sels préférés sont le? tels par addition d'acide et les sels métalliques acceptables en pharmacopée.
Les sels d'acide acceptables en pharmacopée sont particulièrement intéressants en thérapeutique. Parmi ceux- ci, on citera des sels d'acides minéraux, comme les acides chlorhydrique, iodhydrique, bromhydrique, phosphorique, métaphosphorique, nitrique et sulfurique, ainsi que les sels des acides organiques comme les acides tartrique, acétique, citrique, malique, benzoïque, glycolique, gluco- nique, gulonique, succinique, arylsulfonique, par exemple p-toluène-sulfonique, et autres acides du même genre.
Les sels par addition d'acide non acceptés en pharmacopée ne sont certes pas utiles en thérapeutique, mais ils peuvent
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rendre des services pour les opérations d'isolement, d' interconversion et de purification des nouveaux antibioti- ques, ainsi que pour la conversion en 6-épi-6-désoxytétra- cyclines par traitement au nickel de Raney. Ils Gant encore utiles pour la préparation de sels acceptables en pharma- copée. Parmi les sels non acceptables les plus communs sont ceux qui sont formés au moyen dès acides fluorhydri- que et perchlorique.
Les sels obtenus à partir de l'acide fluorhydrique conviennent particulièrement bien pour la préparation de sels acceptables en pharmacopée, par exempts pour préparer les chlorures, par mise en.solution dans l' acide chlorhydrique et cristallisation du chlorure. Les sels de l'acide'perchlorique rendent des services dans la purification et la cristallisation des nouveaux antibioti- ques.
Si tous les sels métalliques peuvent être pré- , parés et peuvent être utiles à telle ou telle fin, les sels métalliques acceptables en pharmacopée sont particu- lièrement précieux, étant donnée leur utilité en thérapeu- tique. Les métaux acceptables en pharmacopée les plus cou- rants sont le sodium, le potassium et les métaux alcaline- terreux de nombre atomique allant jusqu'à 20, y compris, par exemple le magnésium et le calcium, ainsi que l'alumi- nium, le zinc, le fer et le manganèse pour n'en citer que quelques-uns. Il est clair que les sels métalliques com- prennent des sels complexes, par exemple des chélates, qui sont bien connus dans le cas des tétracyclines.
Les sels métalliques inacceptables en pharmacopée les plus courants sont les sels de lithium et les sels des métaux alcalino- terreux dont le numéro atomique est supérieur à 20, par
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exemple le baryum et le strontium; ces sels sont utiles pour l'isolement et la purification des antibiotiques, 'Comme les nouveaux antibiotiques sont amphotères ils for- ment aussi des sels avec des amines pour peu que la basi- cité de celles-ci soit suffisante.
Il est bien clair que les sels d'acides et métal- liques acceptables en pharmacopée peuvent comporter, outre leur'intérêt thérapeutique, un intérêt pour l'isolement et la purification.
Une grande partie des mercaptans utilisés dans la présente invention peut être trouvée dans le commerce et les autres sercnt ai.sément préparés par les procédés standards bien connus ae tous ceux qui sont familiarisés avec les techniques en cause.
Comme on l'a déjà indiqué précédemment, les temps optimaux de réaction dans les différents cas décrits ci-dessus peuvent être aisément déterminés par prélèvement périodique d'échantillons et analyse de ceux-ci par chro- matographie sur papier, autrement dit par des techniques bien connues. Parmi les nombreux systèmes chromatographi- ques bien connus à cette fin, un système d'emploi particu- lièrement souple contient en proportion de 20 à 3 (en volu- mes) d'une part du toluène et d'autre part de la pyridine saturée d'un tampon aqueux à pH 4,2, en tant que phase mobile, avec un papier chromatographique saturé avec le , tampon aqueux à pH 4,2.
Il est bien entendu que la présente invention ne concerne les nouveaux composés décrits que lorsqu'ils sont utilisés comme produits chimiques intermédiaires pour la fabrication d'autres tétracyclines ou encore lorsqu'ils
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sont utilisés comme désinfectants ou produits pour l'agri- culture, mais aucunement lorsqu'ils sont employés en thérapeutique.
Les exemples ci-après sont fournis à titre pure- ment illustratif et ne sauraient en aucun cas être inter- prêtés dans le sens d'une limitation de l'invention, de nombreuses variantes'étant possibles, sans pour autant sortir du cadre de l'invention.
Exemple 1
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6-désoxy-13 ( f3-hydroxyéth.ylmerca to ) tétr.arc'! ir.e.
Procédé A - On chauffe 1 g de chlorhydrate de 6-méthylène- tétracycline dans 10 ml de 2-mercaptoéthanol au bain de vapeur pendant deux heures. On laisse refroidir la solu- tion obtenue et on la traite avec 90 ml d'éther diéthyli- que, en agitant. Le précipité obtenu est récupéré, puis cristallisé dans l'éthanol à 95 % avec adjonction d'une quantité suffisante de triéthylamine pour neutraliser l' acide chlorhydrique.
Procédé B - Le procédé A est repris avec adjonction de
0,2 ml d'eau oxygénée à 30 %, avant chauffage, ce qui ' ramené le temps de réaction à 10 mn., Le produit est récu- péré comme précédemment et il est purifié par chromato- graphie en colonne dans un système acétate d'éthyle-eau, sur de la cellulose en poudre, afin de le débarrasser du sulfoxyde.
Procédé C - On reprend le procédé A en ajoutant 100 mg
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d' 0< ,<X '-azo-di-isobutyronitrile avant chauffage, et le temps de réaction est ramené à 10 mn. Le produit est récu- péré comme dans le procédé A.
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Procédé D - On reprend le procédé A, mais, cette fois-ci, le récipient de réaction est placé à proximité immédiate d'une lampe à incandescence ordinaire de 100 W, le temps de réaction est ainsi réduit à 10 mn. Le produit est récupéré comme précédemment.
En administration à des souris, en une dose unique par voie sous-cutanée, 30 mn après infection avec le staphylocoque doré, on constate une DP50 (dose protec- trice pour 50 % des animaux) égale à 2,77 mg/kg.
Exemple 2 6-désoxy-13-(phénylmercapto) tétracycline.
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<tb>
Chlorhydrate <SEP> de <SEP> 6-méthylène-tétracycline <SEP> 5,o <SEP> g
<tb>
<tb> Benzène-thiol <SEP> 50 <SEP> ml
<tb>
<tb> Butanol <SEP> 50 <SEP> ml <SEP>
<tb>
<tb> Ethylène <SEP> glycol <SEP> 25 <SEP> ml
<tb>
Les composants indiqués ci-dessus sont brassés, afin de mettre en solution les matières solides et chauf- fés u bain de vapeur pendant 70 mn. Le mélange de réac- tion est alors refroidi jusqu'à la température ambiante et traité avec 250 ml d'éthylène-glycol et d'éther di- méthylique avec agitation. Deux litres d'éther sont alors ajoutés et le mélange est laissé à reposer jusqu'au lende- main.Le précipité obtenu est recueilli par filtration rincé à l'éther. On obtient 4,586 g de produit cristallisé.
Pour parfaire la purification, on dissout 500 g dans 4,0 ml de méthanol à la température ambiante, on filtre et rince le filtre au méthanol. Les 7 ml de filtrat obtenus sont traités avec 400 ml d'acide paratoluène- sulfonique, puis ensemencés et laissés à reposer à la température ambiante. Le produit de cristallisation est
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Dans le bromure de potassium on observe des maximums d'absorption dans l'infrarouge pour les longueurs d'onde suivantes: 6,0; 6,25; 6,34 ; 6,63 ; 6,69 ; 6,89; 7,5;
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7,7; 8,07; 8,2; 8,7; 8,9; 9,7 et 9,9 fI'.
En ultraviolet on a les maximums suivants: à 267 m.. (E1 em ' 255) et 308 mkt(large7E'e" = 190) dans le HCl méthanolique 0,01 N.
Exemple 4
EMI27.2
6-désoxy-13-(butylmercapto) tétracycline.
Ce produit est préparé par le procédé de l'exem- ple 2, le benzènethiol étant remplacé par du n-butanethiol.
Exemple 5
EMI27.3
6-désox.y-13-(carboxymétnylmèrcapto) tétracycline.
Procédé A - 100 mg de chlorhydrate de 6-méthylène-tétracy- cline sont combinés avec 1 ml d'acide mercaptoaoétique, 0,03 ml d'eau oxygénée aqueuse à 30 % étant ajoutés. Le mélange réactionnel est chauifé pendant 15 mn au bain de vapeur, puis refroidi. Le produit est alors précipite par addition de 30 ml d'éther diéthylique avec brassage.
Procédé B - On combine 1 g de chlorhydrate de 6-méthylène- tétracycline avec 10 ml d'acide mercaptoacétique et 100 mg
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d'tf , o*1 '-azo-di-isobutyronitrile. Les produits en réaction sont chauffés pendant deux heures au bain de vapeur, puis refroidis. Le produit est alors précipité à 1'acétone-éther et récupéré par filtration.
Exemple 6
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6-désoxy-13-(carbéthoxyméthylmeroUto) tétracycline.
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<tb>
Chlorhydrate <SEP> de <SEP> 6-méthylène-tétracycline <SEP> 1 <SEP> g
<tb>
<tb> Mercaptoacétate <SEP> d'éthyle <SEP> 10 <SEP> ml
<tb>
<tb> Ethylène-glycol <SEP> 5 <SEP> ml
<tb>
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récupéré par filtration, puis séché sous vide à la tempé- rature de 85 C.
Pour la formule brute C28H28O7N2S. C7Ha03S l'analyse élémentaire calculée donne : C : 59,5 %; H : 5,14 %; N : 3,96 %; S ; 9,06 %;
On trouve en fait : C : 58,78 %; H : 5,17 %; N :3,73 %; S : 9,40 %.
L'absorption dans l'ultraviolet présente des maximums à 257 m et 356 m (dans le HCl méthanolique 0,01 N), 255 et 386 m (dans le NaOH méthanolique 0,01 N) et 248 et 369 m (dans le MgCl2 méthanolique 0,01 N).
Le produit est soluble dans le méthanol, à raison de 10 mg/ml.
Exemple 3
6-désoxy-13-(benzylmercapto) tétracycline.
Ce produit est préparé par le procédé de l'exem- ple 2, le benzène-thiol étant remplacé par du toluène- thiol (benzylmercaptan). Le produit est cristallisé dans l'éthanol à 95 % sous forme de sel de l'acide paratoluène- sulfonique.
Le toluène-sulfonate peut être recristallisé en faisant dissoudre 1 g dans un mélange de 25 ml d'acé- tone et de 0,7 ml d'acide sulfurique concentré. Lorsque l'on ajoute 70 ml d'eau, le toluène-sulfonate cristallise.
Pour une formule brute C29H30O7N2S. C7H803S on devrait trouver à l'analyse élémentaire les propor- tions suivantes : 0 : 59,7 %; H : 5,3 %; N :3,9 %; S : 8,9 %;
En fait on trouve : C : 59,8 %; H : 5,5 %; N : 3,5 %; S : 8,9 %.
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0( , 0( ' # -azo-di-isotiutyronitrile 100 mg
Les ingrédients indiqués ci-dessus sont mélangés et chauffés au bain de vapeur ; lemélange est alors refroi- di et le produit de la réaction est précipité à l'éther.
Il est encore purifié par cristallisation dans l'alcool isopropylique sous forme de paratoluène-sulfonate.
Exemple 7 6-désoxy-13-(furane-méthylmercapto) tétracycline.
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<tb> Chlorhydrate <SEP> de <SEP> 6-méthylène-tétracycline <SEP> 100 <SEP> mg
<tb>
<tb> 2-furane-méthanethiol <SEP> 1 <SEP> ml
<tb>
<tb> Butanol <SEP> 1 <SEP> ml
<tb>
<tb> Ethylène <SEP> glycol <SEP> 0,5 <SEP> ml
<tb>
Le mélange de réaction est chauffé pendant 25 heures au bain de vapeur puis refroidi, et le produit est précipité par addition d'éther d'éthylique.
Exemple 8
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6-désoxy-13-( (3 -carboxy- f3 -aminoéthylmeroa'Oto) tétra- cycline.
Procédé A :
EMI29.4
Chlorhydrate de 6-mé-fchylène -tétracy clique 'tao g
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<tb> Cystéine <SEP> base <SEP> 1,0 <SEP> g
<tb>
<tb> Eau <SEP> 20 <SEP> ml
<tb>
On ajoute aux substances ci-dessus 100 mg d'[alpha] , [alpha]'- azo-di-isobutyronitrile en dissolution dans 0,5 ml de di- méthylformamide et le tout est chauffé sous atmosphère d' azote, au bain de vapeur, avec agitation. Au bout d'une heure, de deux heures et de trois heures on ajoute chaque
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fois une nouvelle dose comprenant 100 mg, d', ot'-azo-.di.- isobutyronitrile dans 0,5 ml de diméthylformamide. Après quatre heures le mélange est refroidi et additionné d'eau,
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le produit étant récupéré par filtration.
Procédé B :
EMI30.1
Chlorhydrate de 6-méthylène-tétracycliq.tie 4PO g
EMI30.2
<tb> Butanol <SEP> 40,o <SEP> ml
<tb>
<tb> Ethylène <SEP> glycol <SEP> 20,o <SEP> ml
<tb>
<tb> Chlorhydrate <SEP> de <SEP> cystéine <SEP> monohydraté <SEP> 7,o <SEP> g
<tb>
<tb> [alpha], <SEP> [alpha]'-azo-di-isobutyronitrile <SEP> 400 <SEP> mg
<tb>
Les substances ci-dessus sont ajoutées dans l'or- dre indiqué et le mélange est chauffé, toutes les matières solides se dissolvant pour donner une solution de couleur combre. Le mélange de réaction est alors chauffé à la tem- pérature de 100 à 105 C, sous atmosphère d'azote pendant une heure, puis refroidi. Il est déversé dans 600 ml d' acétone, sous brassage intense et un précipité jaune est obtenu. On ajoute 300 ml d'acétone au dépôt avant de procé- der à la filtration.
Le produit solide de filtration'est encore lavé quatre fois à l'acétone et séché. Etant donné qu'il présente une certaine tendance à s'agglomérer, il est mis en suspension dans l'isopropanol, filtré, puis lavé à nouveau à l'isopropanol et à l'acétone. Il est ensuite séché sous vide.
Procédé 0 :
EMI30.3
Chlorhydrate de 6-méthyléne-tètracycline 4,o g
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<tb> Butanol <SEP> 40,o <SEP> ml
<tb>
<tb> Ethylène <SEP> glycol <SEP> 20,o <SEP> ml
<tb>
<tb>
<tb> Chlorhydrate <SEP> de <SEP> l'ester <SEP> éthylique <SEP> de <SEP> la
<tb>
<tb>
<tb> L-cystéine <SEP> 7,o <SEP> g
<tb>
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ol el-azo-di-isobutyronitrile 600 mg
Les substances sont ajoutées dans l'ordre indiqué ci-dessus, et agitées pendant une heure et demie à une
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température de 100 à 105 C sous atmosphère d'azote. Le mélange en réaction refroidi est alors déversé dans un mélange comprenant 600 ml d'isopropanol et 300 ml d'éther.
Le précipité jaune est récupéré par filtration et lavé à l'éther. Etant donné qu'il est plut8t hygroscopique, le produit solide est séché soigneusement en l'absence d'air'
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pour donner 1,9 g de 6-désoxy-13-( -carbéthoxy, -amino- éthylmercapto) tétracycline. Par addition d'une quantité supplémentaire d'éther au filtrat, on peut faire précipi- ter et récupérer une quantité supplémentaire de produit, soit 1,4 g ayant la même pureté.
100 mg de l'ester éthylique obtenu comme décrit ci-dessus sont hydrolysés.par dissolution dans 1,5 ml d' acide chlorhydrique concentra et laissés à reposer à la température ambiante pendant 3 jours. Le mélange de réac- tion est alors dilué avec 2 volumes d'eau et le produit est récupéré par extraction au butanol, puis évaporation du butanol.
Exemple 9
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6-désoxy-13-(acétylmercapto, tétracycline.
On mélange 10 g de chlorhydrate de 6-méthylène- tétracycline avec 100 ml d'acide thiolacétique et 1 g
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d ol , 4 ' -azo-di-isobutyron.trile. Le mélange est chauffé à la température de 70 C peridant deux heures puis refroi- di' à la température ambiante. On ajoute un nouveau gramme de butyronitrile et le mélange est à nouveau chauffé à 70 C pendant deux heures, puis refroidi. On obtient finalement 12,3 g de produit précipite en déversant le mélange de réaction dans 500 ml d'éther avec brassage énergique.
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3,0 g du produit non raffiné obtenu par le pro- cédé ci-dessus sont dissous dans 30 ml de méthane], et les insolubles sont éliminés par filtration. On ajoute à la solution filtrée une solution de 6,0 g d'aoide para- toluène-sulfonique dans 10 ml de méthanol. 1,70 g de pro- duit purifié cristallise sous forme de paratoluène-sulfo- nate et sont récupérés par filtration. Le produit purifié présente un maximum d'absorption dans l'infrarouge à 5,94 et des maximums d'absorption dans l'ultraviolet à 267 et 355 m (HCl méthanolique 0,01 N) et à 248 et 385 m (NaOH méthanolique 0,01 N).
Il est'soluble à raison de.10 mg/ml dans un mélange comportant, en volumes, trois parties de diméthyl- formamine et une partie d'acide chlorhydrique dilué dans l'eau à 5 %. Le produit a in vitro sur le K pneumoniae une activité représentant 620 unités d'oxytétracycline par mg.
Exemple 10 ne
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6-désoxy-13 (3 -hydroxyéthylmercapto)-5-oxytétracycli/ Chlorhydrate de 6-méthylne-5-oxytétracycline 20 g Mercaptoéthanol 200 ml
Eau oxygénée aqueuse 4 ml
Les substances ci-dessus sont mélangées et chauf- fées pendant une heure et demie au bain de vapeur, puis refroidies à la température ambiante. On ajoute 1,5 ml d' eau oxygénée à 30 % et le cycle précédent de refroidisse- ment est répété. Le produit est alors précipité à partir du mélange de réaction refroidi, par addition, sous bras- sage énergique, à 2 litres d'éthanol. Il est encore purifié par cristallisation sous forme de paratoluène-sulfonate
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dans un mélange d'eau et d'éthanol..
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Pour la formule brute C31H26012H2$2' HOp, l'ana-. lyse élémentaire théorique est : C : 52,37 ; H : 5,39 r; 0 : 29 , 26 ' r N : : 3,94 ; S ':9,02 ; H20 :2,53
Résultat trouvé effectivement :
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C : 52,46 ; H : 5,19 %; 0 : 29,37 %; N : 3,82 %; S: 9,03 îî; H20 : 2,29
Dans le bromure de potassium le produit présente des maximums d'absorption dans l'infrarouge à 5,96-6,20, 6,32 et 6,89 . Les maximums d'absorption dans l'ultra-
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violet sont a. 220, 264 et 346 m/v (HC1 méthanolique 0,01 A') et à 222,348 et 373 m (NaOH méthanolique 0,01 N).
Exemple 11
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6-désoxy-13-(phényimerca-pto)-5-oxytétracmeline.
Procédé A :
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<tb> Chlorhydrate <SEP> de <SEP> 6-méthylène-5-oxytétracycline <SEP> 100 <SEP> mg
<tb>
<tb> Benzène-thiol <SEP> 1 <SEP> ml
<tb>
<tb> Butanol <SEP> 1 <SEP> ml
<tb>
<tb> Ethylène <SEP> glycol <SEP> 0,5 <SEP> ml
<tb>
<tb> Eau <SEP> oxygénée <SEP> à <SEP> 30 <SEP> % <SEP> 0,025 <SEP> ml
<tb>
Les produits ci-dessus sont chauffés au bain de vapeur pendant une heure et le butanol est éliminé, en même temps que le benzène-thiol en excès, par distillation.
Le produit est récupéré dans le résidu de distillation, par précipitation sous forme de sel de l'acide ss -naphta-
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lène,sulfonique, puis est séché suus vide poussé.
Procédé B :
Chlorhydrate de 6-méthylène-5-oxytétracycline 1 g
Benzène-thiol 10 ml
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Butanol 10 ml
Ethylène glycol 5 ml
Les substances ci-dessus sont traitées avec 100 mg d'[alpha] , [alpha] '-azo-di-isobutyronitrile et chauffées sous atmosphère d'azote avec brassage permanent pendent deux heures au bain de vapeur. Le butanol et le benzène-thiol en excès sont alors éliminés par distillation à la vapeur comme dans le cas précédent et le résidu est filtré pour séparer une trace d'impureté de couleur sombre. Le pH de la solution, filtrée'est ajusté à la valeur de 4,5, et le produit précipite alors sous forme de la base libre.
Il subit une purification supplémentaire par cristallisation dans le mélange chlorure de méthylène-benzène. Le produit purifié a une activité biologique sur le K pneumoniae qui vaut 135 unités d'oxytétracycline par mg.
Exemple 12
EMI34.1
6-désoxy-13-(benzylmercapto..5-oxytétragyline.
EMI34.2
<tb> .'Chlorhydrate <SEP> de <SEP> 6-méthylène-5-oxytétracycline <SEP> 1,0 <SEP> g
<tb>
<tb> 0-toluène-thiol <SEP> 10 <SEP> ml
<tb>
<tb> Butanol <SEP> 10 <SEP> ml
<tb>
<tb> Ethylène <SEP> glycol <SEP> 10 <SEP> ml
<tb>
EMI34.3
oi , oct '-azo-di-isobutyronitrile 100 mg
Les substances ci-dessus sont mélangées et chauf- fées sous atmosphère.d'azote au bain de vapeur pendant .deux heures. Le-butanol et le toluène-thiol en excès sont éliminés par distillation à la vapeur et le résidu est re- froidi et filtré. Le produit est-isolé en tant que sel de l'acide -naphtalène-sulfonique.
Il 'peut aussi être isolé en tant que base libre, en réglant le pH à la valeur de 5,0 et il est alors purifié par cristallisation dans
<Desc/Clms Page number 35>
un mélange de benzène et de butanol.
Exemple 13
EMI35.1
6-désoxy-13-(carboxy;hSrlmercapta)-5-oxéraeyc2ine .
EMI35.2
Chlorhydrate de 6-méthylène-5-oxytétracycllne 1 g
EMI35.3
<tb> Acide <SEP> mercaptoacétique <SEP> 10 <SEP> ml
<tb>
<tb> Eau <SEP> oxygénée <SEP> à <SEP> 30 <SEP> % <SEP> 0,025ml
<tb>
Les substances ci-dessus sont chauffées pendant trois heures et demie au bain de vapeur. Le mélange de réaction est alors refroidi et le produit est précipité par addition d'éther puis récupéré par filtration.
Exemple 14
EMI35.4
6-désoxy-13-(acét,vlmercato-5-ox5tétracYClino.
EMI35.5
<tb> Ethanolate <SEP> de <SEP> chlorhydrate <SEP> de <SEP> 6-méthy-
<tb>
EMI35.6
lne-5-oxytétra lîne 25,0 g
EMI35.7
<tb> Acide <SEP> thiolacétique <SEP> 250 <SEP> ml
<tb>
<tb> Méthanol <SEP> 62,5 <SEP> ml
<tb>
<tb> Eau <SEP> 62, <SEP> 5 <SEP> ni <SEP>
<tb>
<tb> [alpha], <SEP> [alpha]'-azo-di-isobutyronitrile <SEP> 2,5 <SEP> g
<tb>
Les composés de départ sont mélangés et donnent une solution claire qui est chauffée sous atmosphère d' azote à la température de reflux pendant deux heures. Le mélange est alors refroidi et l'on ajoute 2,5g du cataly- seur. Le cycle chauffage-refroidissement ci-dessus est répété et la solution refroidie est déversée lentement dans 3 litres d'éther en brassant rapidement.
On obtient une gomme orange dont l'éther est séparé par décantation.
La gomme est solidifiée par malaxage dans l'éther frais et séparé par filtration. La matière solide jaune-orangé est lavée à l'éther', puis séchée sous vide. On obtient ainsi .29,5 g' de produit.
<Desc/Clms Page number 36>
Le produit subit une purification additionnelle par mise en solution dans un mélange contenant 88,5 ml de méthanol et 88,5 ml d'eau. La solution résultante est traitée avec 29,5 g d'acide sulfosalicyclique, puis 177 ml d'eau. La solution trouble obtenue est ensemencée et bras- sée pour produire la cristallisation. Le produit cristal- lin est séparé par filtration, lavé deux fois au méthanol et séché sous vide. On obtient ainsi 14,0 g de produit purifié, ayant dans l'infrarouge un maximum d'absorption, caractéristique du carbonyléthioacétylique, à 5,94 . Les maximums dans l'ultraviolet sont observés à 267, 316 et.
348 m (HCl méthanolique 0,01 N) et à 238 et 373 m (NaOH méthanolique 0,01 N).
L'activité in vitro sur le K pneumoniae corres- pondant à 420-480 unités d'oxytétracycline par mg.
Exemple 15
EMI36.1
6-désoxv-13 (s-butylmercapto) tétracycline.
EMI36.2
<tb> Chlorhydrate <SEP> de <SEP> 6-méthylène-tétracycline <SEP> 1,0 <SEP> g
<tb>
<tb> s-butane-thiol <SEP> 10 <SEP> ml
<tb>
<tb> Butanol <SEP> 10 <SEP> ml
<tb>
<tb> Ethylène <SEP> glyool <SEP> 5 <SEP> ml
<tb>
EMI36.3
1 d 1-azo-di-isobu,4uyronitrile 100 mg
Les produits sont chauffés au bain de vapeur -pendant huit heures au total, avec refroidissement inter- médiaire et addition de catalyseur frais au bout de deux, quatre et six heures. La récupération du produit a lieu par le procédé décrit à l'exemple 2.
Exemple 16
EMI36.4
6-désoxy-13-(Ci-aminoéthylmerca-pto) tétracycline.
Ce produit est préparé selon le procédé C (1er
<Desc/Clms Page number 37>
paragraphe) de l'exemple 8 en remplaçant l'ester de cys- téine par une quantité égale de chlorhydrate de ss -amino- éthylmercaptan.
Exemple 17
EMI37.1
6-désoxv-13-(méthvlmereapta)- #feétrac.yeline.
Ce produit est préparé par le procédé de l'exem- ple 11, le benzène-thiol étant toutefois remplacé par le même poids de méthylmercaptan, et la réaction étant con- duite à 95 C dans une bombe.
Le composé 5-hydroxy correspondant est préparé de la façon suivante : 50 ml de méthylmercaptan sont con- densés dans un flacon refroidi et on leur ajoute 5 g de 6-méthylène-5-oxytétracycline, 50 ml d'éthylène-glycol et
EMI37.2
2e5 g r;X, 0( '-azo-di-isobutyronitrile. Finalement 100 ml de 1 , 2-diméthoxyéthane et 28 ml d'eau sont encore ajoutés.
Le mélange est enfermé dans une enceinte sous pression, brassé pour effectuer la mise en solution et laissé au re- pos pendant 7 Jours à la température ambiante. Le mélange de réaction est alors concentré sous pression réduite, dilué avec de l'eau, acidifié jusqu'à pH = 1 avec de l' acide chlorhydrique, puis extrait au butanol. La phase butanolique est alors concentrée sous vide et le résidu est mis en suspension dans l'éther. Le produit final qui est un chlorhydrate, est séparé de l'éther par filtration, lavé à l'éther, puis séché.
Exemple 18
En utilisant les procédés décrits dans les exem- ples précédents on prépare les produits ci-après en par- tant des 6-méthylène-tétraoyolines et des mercaptans ap- propriés :
<Desc/Clms Page number 38>
EMI38.1
6-désoxy-l3-(isotylmercapto)5-oxytétracycline; 6-désoxy-13-(n-dodécylmercapto)-5-oxytétrs.c:y.- cline; 6-désoxy-13-(trifluorométhylmercapto)-5-oxyyté-
EMI38.2
tracycline ;
EMI38.3
ô-désoxy-13-(trixluorométhylmereapto) tétracycline; 6-désoxy-13,(2, 6-dimpthylphénylmercapto)-5--ox.y-
EMI38.4
tétracycline;
EMI38.5
6-désoxy-13-(q.-hydroxyphénylmercapto)tétro.cycline; 6-désoxy-13-(3-éthoxyphénylmercapto)-5-oxytétra-
EMI38.6
cycline ;
EMI38.7
6-désoxy-13-(3-carboxyphénylmercapto)-tétxacycl.r.e;
EMI38.8
6-désoxy-13-(4-carbométhoxyphénylmercapto)-5-
EMI38.9
' oxytétracycline ; 6-désoxy-13-(2-nitrophénylmercapto)tétracycline; 6-désoxy-13-(4-aminophénylmercapto) tétracyclir;e;
EMI38.10
6-désoxy-13-(propionylmercapto) tétracycline;
EMI38.11
6-désoxy-13-(belzoylmercapto)tétracyeline; 6-désoxy-13-(carbobutoxyméthylmercapto)-5-oxy-
EMI38.12
tétracycline ;
EMI38.13
6-désoxy-l 3-(bromomé-thylmeroap'to ) tétracycline; 6-dé s oxy-13- ( 4-;né thylb enzrlme re ap to ) -5-oxyt é tra-
EMI38.14
cycline ; 6-désoxy-13-(2-hydroxybenzylmercapto) tétracycline; 6-désoxy-13-( 2,6-diméthoxybenzylmercapto)-5- oxytétracycline;
EMI38.15
6¯àésoxy-13-(2-carbQxybenzylmercapto)-tétracycline; 6-désoxY-13-(3-carboèthoxybene,ylmercapto) tétra-
EMI38.16
cyeline;
EMI38.17
6-désoxy-13-(3- itro"benzylmercapto)-tétrucycline;
<Desc/Clms Page number 39>
6-désoxy-13-(4-aminobenzylmercapto) tétracycline;
EMI39.1
6-8ésoxy-13-(q.-;.éthoxybutylmercapto)-5-oxytétra- cycline; 6-désoxy-13-( i -tmtoxyéthylmercapto)-5-oxytétra- cyoline;' 6-désoxy-13-((-carboxyéthylmercapto) tétracycline; !
6-désoxy-13-(ss -carbométhoxyéthylmercapto) tétra- oycline;
EMI39.2
6-désoxy-13-(2, 3-dichloropropyl;nercapto )-5-oxy-. , tétracycline;
EMI39.3
6-désoxy-13-( fi -iodoéthylmercapto) tétrcycli2:e 6-désoxy-13-( -aminoéthylmercapto) ttracyclinc; 6-désoxy-l3-(butyrylmercapto)-5-oxytétracycline.
Exemple 19 6-désoxy-13-iEercapto-5-oxytfetracyoline.
8 g de sulfosalicylate de 6-désoxy-13-(acétyl- mercapto)-5-oxytétracycline préparé comme indiqué à l'exem- ple 14 sont dissous dans 400 ml d'acide'chlorhydrique con- centré en agitant vigoureusement à la température ambiante.
Le mélange de réaction est laissé au repos pendant 5 jours et sa couleur passe du vert jaunâtre à l'orange. Il est ensuite versé lentement en agitant dans un récipient de 1. 500 ml rempli de glace avec 500 ml d'eau. Une fois que la solution jaune légèrement louche s'est réchauffée jusqu' à la température ambiante, elle est soumise' à. une extrac- tion avec 500 ml de butanol. On ajoute encore 500 ml d'eau à la phase aqueuse et celle-ci est extraite trois fois de suite avec chaque fois 250 ml de butanol frais. Tous les extraits butanoliques sont rassemblés et évaporés sous vide poussé au bain-marie, afin de donner un corps solide de
<Desc/Clms Page number 40>
couleur jaune. Ce résidu est lavé soigneusement à l'éther et séché.
Il est encore purifié en en dissolvant 6,0 g dans 600 ml de méthanol à la température ambiante et en traitant 'la solution à la température de reflux avec 2,0 g de char- bon activé DARCO G-60, puis en filtrant. Le gâteau de fil- tre est lavé au méthanol et l'ensemble des liqueurs de fil- tration et de lavage est chauffé au bain de vapeur avec addition de 6,0 g d'acide sulfosalicylique. La solution obtenue est concentrée à environ 40 ml et brassée jusqu'au lendemain à la température ambiante. La matière solide cristallisée qui se sépare est récupérée.par filtration, lavée à l'éther et séché'., ce qui donne finalement 3,5 g de produit.
Pour une formule brute C22H2408N2S. C7H8O6S,
EMI40.1
2H20 donnant une analyse élémertbaire théorique : C : 47,6 %; H : 4,7 %; N : 3,8 %; S : 8,8 %.
On trouve : 0 :47,3 %; H : 5,0 %; N :3,7 %; S : 8,7 %.
Les maximums d'absorption dans l'ultraviolet correspondent presque identiquement à ceux qui ont été ob- servés avec le composé de départ, à savoir 267, 315 et 350 m (HCl méthanolique 0,01 N) et 238 et 365 m (NaOH méthanolique 0,01 N). Le spectre infrarouge comporte une faible bande d'absorption à 5,98 mais il est dépourvu de la très forte bande d'absorption à 5,94 qui était ob- servée avec le composé de départ. Le produit a une acti- vité biologique in vitro mise en évidence en boîte de Pétri sur le B. subtilis.
Le produit 5-désoxy correspondant est préparé à
EMI40.2
partir de la 6-àasoxy-13-(acétylmercapto) tétracycline de
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l'exemple 9, suivant le même procédé.
'Exemple 20
EMI41.1
o-âé3ox,y-1 3-(phénylm.ercapto ) tétracycline S-oxyde.
100 mg de 6-désoxy-13-(phénylthio) tétracycline, préparés comme dans l'exemple 2, sont combinés avec 1 ml de méthanol et traités avec un équivalent d'eau oxygénée aqueux à 30 %. Le mélange de réaction est laissé à reposer pendant toute la nuit, à la température 'ambiante, puis il est amène à sec par évaporation. Le produit est ensuite cristallisé sous forme de paratoluène-sulfonate dans un mélange d'acétone et d'eau.
EMI41.2
Pour la formule brute 0281.i2808li2s. a 7H80 3S, l'analyse élémentaire théorique est : C : 58,1 %; H : 5,o ; N ; 3,9 ; S : 8,8 %.
On trouve en fait :
EMI41.3
C : 58,5 5 ô; H ; 4, 9 %; N : 3,7 ô; S : 8,0 %.
Les maximums d'absorption dans l'ultraviolet se trouvent à 257 et 355 m (HCl méthanolique 0,01 N), à 250
EMI41.4
et 384 m. (,NaOH méthanolique 0,01 Tu) et 241, 271 et 368 mi (MgCl2 méthanolique 0,01 N). Activité in vi-*-ro sur K pneumoniae : 350 unités/mg.
Exemple 21
EMI41.5
6-désoxy-13-( drox.yéthylmexcaroto) tétracycline
S-oxyde.
Ce produit est préparé en suivant le procédé de l'exemple20, dans lequel on utilise comme composé de départ
EMI41.6
la 6-désoxy-13- (J -hydroxythylthio ) tétracycline de l'exem- ple 1. Le produit est soluble dans un mélange en parties volumétriques égales d'acétone et de HC1 en solution aqueuse à 5 %.
<Desc/Clms Page number 42>
Exemple 22 '
EMI42.1
6-désoxy-13-(benzylineroapto) tétracycline S-oxyde.
5 g du produit de l'exemple 3, sous forme de toluène-sulfonate, sont dissous dans 500 ml de méthanol à la température ambiante, 1,5 ml d'eau oxygénée aqueux à 30 % étant ajoutés. Après avoir laissé reposer jusqu'au lendemain, le mélange de réaction est évaporé jusqu'à siccité, le résidu est délayé à l'éther et le produit est séparé par filtrage . Il est purifié par cristallisation dans un mélange d'acétone et d'éthanol et l'on aboutit au sulfoxyde souhaité, qui se présente sous forme de toluène- sulfonate avec les résultats- d'analyse élémentaire ci- après.: pour la formule brute C29H3008N2S. C7H803S, l'ana- lyse théorique est :
EMI42.2
C : 58,6%; H : 5,2 ; N . 3,8 ?0;"s : 8,7 #.
En fait on trouve: C ;58,8 %; H : 5,1 %; N : 3,5 %; S : 8,4 %.
On observe des maximums d'absorption dans l'infra- rouge dans le KBr à 6,02, 6,27, 6,37, 6,64, 6,71., 6,92, 7,53, 7,73, 8,09, 8,26, 8,6, 8,75 et 8,94 . Dans l'ultra- violet les maximums d'absorption se trouvent à 267 m
EMI42.3
(E1Cm = 260) et 354 mjJ- (E1m = 202) dans le HC1 méthanoli- que 0,01 N.
Administré à des souris, en doses sous-cutanées uniques, 30 minutes après infection aveo S. aureus ce produit assure un taux de survie de 45 % au dosage de 12,5 mg/kg.
En suivant le procédé de l'exemple 20 tous les produits des exemples 4 à 18 peuvent être convertis en leurs sulfoxydes correspondants. Le temps optimal de réac-
<Desc/Clms Page number 43>
EMI43.1
-tion est déterminé dans chaque cas par chromatographie standard sur papier d'échantillons du mélange de réaction prélevés périodiquement. Les suif oxydes s'avèrent en géné- ral être plus polaires que les composés de départ. Lorsque la tache correspondant au composé de départ a pratiquement disparu, on arrête la réaction et on récupère le produit.
Exemple 23
EMI43.2
13-éuithio-6-dësoxjxtétracJcline et 11a,13-éDit : 6-désar.ytétracycliçua.
500 mg de 6-désoxy-13-(benzylmercapto) tétracy- cline S-oxyde, sont dissous dans 10 ml d'acide chlorhydri- que concentré et sont laissés au repos à la température ambiante pendant 5 jours. Tous les insolubles sont alors éliminés par filtration et 1- filtrat est dilué avec 10 ni d'eau glacée. La solution est extraite au butanol e+ la ; liqueur d'extraction est décolorée au charbon activé DARCO G-60, puis filtrée et enfin évaporée jusqu'à siccité pour donner le mélange voulu. La.réaction est répétée à plus grande échelle, comme suit : 5 g de 6-désoxy-13-(benzyl- mercapto) tétracycline S-oxyde sont dissous dans 150 ml d' acide chlorhydrique concentré. Le mélange de réaction est laissé pendant 8 jours à la température ambiante.
Il est alors dilué avec 500 ml de glace et d'eau et le mélange est extrait au butanol. Les liqueurs d'extraction rassem- blées sont évaporées sous vide jusqu'à déssication, les résidus solides sont délayés avec de l'éther et le mélange cristallin de composé épithio (3g) est récupéré par filtra- tion.
EMI43.3
1 1a, 13-épithio-6-désoxytétracycline 1 g du mé- lange cristallin est dissous dans 20 ml de méthanol et l'on
<Desc/Clms Page number 44>
ajoute 0,5 ml d'acide chlorhydrique concentré. Le composé 11a,13-épithio cristallisé et blanc (265 mg) cristallise dans la solution et il est récupéré par filtration. On garde la liqueur mère.
Résultats de l'analyse élémentaire :
EMI44.1
Pour la formule brute C2xH2Z07N2S. 301 les va- leurs théoriques sont : C : 53,5 %; H : 4, 7 %; N : 5,7 %; S : 6,5%; Cl : 7,1
On trouve effectivement : C : 53,1 %; H : 4,5 %; N : 5,2 %; S : 6, 6 %; Cl : 6,9%.
Dans le bromure do potassium, des maximums d' absorption dans l'infrarouge sont observés à 5,75, 6,87 et 8,07 . Les maximums .l'absorption dans l'ultraviolet se
EMI44.2
présentent à 262 m,;.(Em = 406) et 345 ma,(large,Em=101) dans l'HCl méthanolique 0,01 N; à 258 m (Em = 292), ' @m
EMI44.3
283 my, (E1 cm - 236) et 340 m (E1 cm = 111) dans le MgCl2 ' méthanolique 0,01 N; et à 2Î5 m (E]Jm 378) et 383 mu (E1cm1% = 98) dans le NaOH méthanolique 0,01 N. Le produit présente une activité biologique in vitro de 50 unités/mg sur K pneumoniae (unités normales d'oxytétracycline).
EMI44.4
7, 13-épithio-6-désoxytétracycline : la liqueur mère, gardée à la suite de la cristallisation dans l'acide chlorhydrique méthanolique précédemment décrite, est ré- duite par évaporation à environ 10 ml et un mélange solide de composés épithio cristallisés est séparé par filtration, L'évaporation, ultérieure du filtrat,conduit à la cristal- lisation de 100 mg du composé 7,13-épithio répondant à l' analyse élémentaire ci-après :
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Pour la formule brute C22H22T207s. HC1. H20 les valeurs théoriques sont :
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EMI45.1
C : 51,5 5 r:I.. H : 4,9 4>\ N ; 5,5 5 ri. S : 6,5 5 ,t. Cl : 1:' Q & En fait on trouve : C : 53, 4¯ ; H ; 4/9 %; N : 5, 2 %; S : 6, 2 %; Cl : 7,1 %.
Des maximums d'absorption dans l'infrarouge (dans,K Br) sont observés à 6,05, 6,35,6,84, 7,44,7,64, 7,95,8,24 et 8,87 . Les maximums d'absorption dans l' ultraviolet se trouvent à 252 m (E1cm1% = 473), 336 m
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(E1 - 236) et 420 m)J (E1' ¯ 85) dans le HC1 méthanoli- que 0,01 N; à 247 m (Em = 498), 262 m (Em = 344) et
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360 mjn E1m = 244) dans le MgClg méthanoliflue 0,01 N; et 1 à 248 m..l iE1 cm = 502) et 391 m}l (E1 cm - 299) dans le' NaOH méthanolique 0,01 N.
Activité in vitro sur le K pneumoniae : 1. 290 unités normales d'oxytétracycline par g.
L'activité in itro du composé 7,13-épithie est encore vérifiée sur un certain nombre de microorganismes en culture sur extrait de cerveau et de coeur. Les concen- .traitons inhibitrices minimales sont les suivantes :
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------Q-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-==-=-
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<tb> : <SEP> Concentration <SEP>
<tb>
<tb> Micro-organisme <SEP> inhibitrice
<tb>
<tb> :minimale
<tb>
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###.¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ #Eg.... ! M. pyogenes var.aureus 0,3g S.pyogenes ..,..,.,........,....,....., o"39 ' S,faecalis s 1 .... , . , . , , , . 1 1 . , ... . 1 , o,.,f"'I...
; D:pneumoniae , " , .........,.,.....,.; (/39 E.rhusiopathiae""".""""""",: o''Î9 A.aerogenes ................,.....,...: 12,5 E.coli .......................,....... 6 : P. vulgar 15 ,..........................: / 100 P aeruginosa > 100 ' S.typhosa ...............,............; 6 3
EMI45.7
<tb> : <SEP> K. <SEP> pneumoniae <SEP> 3,12
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> H.influenzae <SEP> 6,3
<tb>
EMI45.8
M, pyogenes var, aureus 376e-. , . " , . " " o ; 1, 5ô M.pyogenes var.aureus 400 .......,. 3,12 Staph.E/R-1.................... : 3 ig Staph.E/3-2..................... 3,1 Staph.E/R-3.................... : ip Streptococcus 98 ...... 0.0 ....... 9 # Souches résistantes aux antibiotiques.
<Desc/Clms Page number 46>
On a également déterminé l'activité in vitro sur extrait de cerveau et de coeur additionné de sérum humain pour le composé 7,13-épithio; les concentrations inhibitrices minimales observées sont respectivement égales à 6,25 et 3,12 mg/ml pour M pyogenes var.aureus et S pyo- genes.
EMI46.1
10 mg de 7,13-épithio-6-désor.ytétracyeline sont mis en solution dans un mélange comprenant 1 ml de métha- nol, 0,3 ml d'acétone et 0,2 ml de 1,2-diméthoxyméthane, 0,04ml d'eau oxygénée aqueuse à 30 % étant ensuite ajouté.
Le mélange de réaction est laissé à reposer jusqu'au len- demain à la température ambiante. Cette solution diluée à 10 ml exerce sur le K pneumoniae une action in vitro cor- respondant à 2. 460 unités normales d'oxytétracycline par ml, cette activité étant attribuée au sulfoxyde du composé de départ.
Exemple24
Le procédé de l'exemple précédent (1er paragra- phe) est appliqué au S-oxyde de la 6-désoxy-13-(phényl- mercapto) tétracycline et l'on obtient ainsi 381 mg d'un produit exerçant une activité in vitro de 820 unités d'oxy- tétracycline sur le K pneumoniae avec des maximums d'ab- sorption dans l'ultraviolet à 268 et 357 m . Tout indique que le produit représente le S-épimère du composé de dé- part. Le spectre infrarouge comporte des maximums d'absorp- tion à 6,02, 6,22,6,33 et 6,90 ,mais il ne comporte pas de bande d'absorption typique du carbonyle entre 5 et 6 .
Le Rf s'avère être égal à 0,95 dans un système qui est
EMI46.2
constitué par du papier chromât o graphique Whatman ? 1 saturé d'un tampon aqueux de pH 3,5, comme phase station-
<Desc/Clms Page number 47>
-naire, etd'un mélange en proportion volumétriques 20:10:3 de nitro-méthane-chloroforme-pyridine, comme phase mobile.
Une tache supplémentaire, qui peut apparemment être attri- buée au 4 épimère, est observée en un point correspondant à un Rf de 0,75. L'application des mêmes conditions de réaction donne un résultat similaire avec le 6-désoxy-13- (phénylmercapto)-5-oxytétracycline S-oxyde.
Exemple 25
EMI47.1
6-épi-6-aésoxy-5-oxytétracycline, Sur 8 g de nickel de Raney yY-4) on déverse une solution comprenant 1 g de 6-désoXY-13benzylmarcapto)-5- oxytétracycline (exemple 12) dans 30 ml de méthanol avec
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suffisamment d'acide chlorhy. : ique pour avoir un pH de 1,5.
La suspension est agitée à la température de reflux pendant 6 heures et le liquide surnageant est séparé par centrifu- gation. Le catalyseur solide est lavé deux fois, avec cha- que fois 30 ml de méthanol, et les trois solutions de méthanol utilisées sont réunies et évaporées jusqu'à sic- cité, sous pression réduite. Le rési.du est constitué par 890 mg du produit recherché.
Il est recristallisé après dissolution dans 20 ml de méthanol contenant 1 g d'acide 5-sulfo-salicylique, traité au charbon activé et filtré. Le filtrat étant laissé au repos à la température ambiante. Les 500 mg de sulfo- salicylate qui se séparent sont filtrés et séchés. L'iden- tité de ce produit est confirmée par comparaison avec un échantillon authentique en chromatographie sur papier. Le produit est exempt du composé de configuration stérique opposée.
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Exemple 26 6-épi-6-désoxytétracycline.
1 g de 6-désoxy-13-(phénylmercapto) tétracycline (exemple 2), est dissout dans 100 ml d'éthanol absolu aveo chauffage et brassage énergique. La solution est refroidie, -traitée avec 3 g de nickel Raney et chauffée pendant 3 heures à la température de reflux. On laisse reposer 3 jours à la température ambiante puis on filtre. Le nickel
Raney est lavé soigneusement à l'éthanol et les filtrats éthanoliques combinés sont évaporés jusqu'à siccité sous vide.
Le produit solide jaune verdâtre résultant est réparti entre une phase butanol et une phase HCl aqueux
0,01 N, le pH étant réglé à 1,5. Après brassage intense, les couches sont séparées et la fraction butanolique est lavée une fois avec de l'acide chlorhydrique dilué 0,01 N (pH 1,5). Les deux couches acides sont maintenant lavées au butanol frais une fois et toutes les fractions butano- liques sont rassemblées, puis soumises à une évaporation sous pression réduite pour donner un solide jaune.
L'expérience est répétée en réduisant la quantité de nickel Raney à 1 g et le temps de réaction à 1 heure, à la température de reflux, les résultats obtenus étant à peu près identiques.
Exemple 27
En utilisant les procédés des exemples 25 et 26 on convertit les produits des exemples 1,3 à 11 et 13 à
23 en les 6-épi-6-désoxytétraoyclines correspondantes. Des températures de réaction comprises entre 40 et 130 0 sont utilisées avec succès, cela avec un choix approprié de
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solvant comprenant le méthanol, l'éthanol, le propanol et le butanol. On peut aussi faire réagir en enceinte fermée, lorsque la température de réaction est supérieure au point i d'ébullition du solvant choisi à la pression atmosphérique.
On juge de l'achèvement de la réaction en observant la disparition du composé de départ par chromatographie sur papier, avec une phase mobile à 20:10:3 de nitrométhane-
EMI49.1
ch1.orofor.mepyridine sur du papier, chromatographique Whatman N 1 saturé d'un tampon aqueux de pH 3,5. La récupération et la purification sont effectuées comme dans les exemples 25 et 26.
Exemple 28
EMI49.2
11a,-ehîoro-5-oxytétr oY line-6,12-hémicétal.
23 g d'oxytétracycline anhydre sont mis en solu- tion dans 250 ml de 1,2-diméthoxyméthane, 8 g de K-chloro- succinimide étant ensuite ajoutés. Le mélange est agité deux minutes, puis déversé dans 1 litre d'eau sous agita- tion. Le produit qui précipite est récupéré par filtration, lavé à l'eau, puis séché. L'analyse du produit aux infra- rouges (dans K Br à la concentration de 1%) ne montre pas les bandes d'absorption typiques du carbonyle entre 5 et 6 ,mais donne les principaux sommets suivants : 6,12, 6,35, 6,66, 6,85,7,22, 7,55, 7,75, 7,92, 8,14, 8,3 6, 8,78, 9,18, 9,43.
Le contrôle de l'activité biologique du produit a révélé une activité de tétracycline de 4 mcg/mg.
Exemple 29
EMI49.3
11a-chloro-6-désoxy-6-déméthYl-6-méthylène-5-oxYté- tracycline.
5 g de lla-chloro-5-oxytétracycline-6,12-hémicétal
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sont ajoutés à 15 ml d'acide fluorhydrique liquide anhy et le mélange est brassé pendant trois heures et demie à la température de la glace fondante. L'acide fluorhydrique est évaporé par chauffage sous un courant d'azote et l'on obtient le produit sous forme de fluorhydrate.
Le fluorhydrate brut est mis en solution dans l'eau, puis de l'acide chlorhydrique concentré ou de l'acide perchlorique (70%) est ajouté goutte à goutte pour préci- piter le chlorhydrate ou le perchlorate respectivement. On précipite un iodhydrate à partir de la solution dans l'acé- tone du fluorhydrate brut, par addition d'acide iodhydrique à 47%.
On peut aussi diluer le mélange initial de réac- tion avec 6 à 7 volumes d'eau et de glace, de l'acide perchlorique ou de l'acide naphtalène sulfonique (acide concentré) étant adjoint afin de précipiter le sel corres- pondant. La dilution à l'acétone du mélange initial de réaction et l'adjonction subséquen+e de HI conduisent à la précipitation du iodhydrate.
Le iodhydrate s'est avéré avoir l'analyse élé- mentaire ci-après: pour la formule brute C22H21N2O8Cl. HI, les valeurs théoriques sont :
EMI50.1
C : 43,7 lu-; H : 3,7%; N : 4,6 ; Cl : 5,8 %.
On trouve en fait : C : 44 %; H : 4 %; N : 4, 2 %; Cl : 5,5 %.
On a des maximums d'absorption dans l'ultraviolet à 222, 270 et 372 m . En infrarouge les prinxipaux maxi- muns sont à 3,05,3,2, 5,7, 6,02, 6,03, 6,22, 6,4, 6,88, 7,4, 7,8, 8,1, 8,9 et 9,1. Le perchlorate a les maximums suivants d'absorption dans l'ultraviolet: 237,270 et372 m .
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Exemple 30
EMI51.1
6-désoxy.-6-diméthyl-6-méthylène-5-oytétragrcline .
A une solution de. 5 g du produit de l'exemple 29 (sous forme de iodhydrate) dans 125 ml d'acide chlorhydri- que dilué (une partie de HCl concentré pour 55 parties d' eau) à 20 C, on ajoute 2 g de poudre de zinc. Après agita- tion pendant 10 minutes, le zinc est séparé par filtrage, le filtrat est ajusté à pH 0,8, puis extrait du butanol.
L'extrait butanolique est concentré sous pression réduite pour donner un résidu qui est trituré à l'éther. Le résidu insoluble dans l'éther est recristallisé dans un mélange méthanol acétone HC1 concentré-éther pour donner le produit
EMI51.2
final sous la forme de monométhanolate du chlorhydrate. On obtient 2,5 g de produit qui fond à la température de 205 C en se décomposant.
On trouve les maximums suivants pour l'absorption dans l'ultraviolet: dans HC1 0,01 N dans le méthanol :
EMI51.3
252 mf(E1m = 450) et 345 m/J (E 1 e. 302); dans NaOH 0, 01 N dans le méthanol 235 m (E1cm1% = 442), 254 m (E1cm1% = 408) et 385 m (Em 329 ) avec un minimum à 280 m (E1cm1% = 329); dans MgCl2 0,01 N dans le méthanol
EMI51.4
240 (Ecm = 461), 277 m (E1cm - 326) et 351 mu ( E1i.Z 282). Maximums d'absorption dans l'infrarouge à 6,03, 6,2, 6,37 et 6,87 . Analyse élémentaire (valeurs réelles):
EMI51.5
C : 55,o %; H : 5,2 ; N : 5,5%; Cl : 7 ; OCH3 : 3,4 %.
Le produit présente un Rf de 0 et 0,35 dans les deux systèmes ci-dessous, respectivement.
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EMI52.1
<tb>
Phase <SEP> mobile <SEP> Phase <SEP> ' <SEP>
<tb>
<tb> stationnaire
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1. <SEP> 20-3-toluène <SEP> pyridine <SEP> saturé <SEP> avec <SEP> Tampon <SEP> aqueux
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> un <SEP> tampon <SEP> de <SEP> pH <SEP> 4,2. <SEP> de <SEP> pH <SEP> 4,2
<tb>
EMI52.2
2. 20-10-3 nitrométhane-chloroforme- Tampon aqueux
EMI52.3
<tb> pyridine, <SEP> saturé <SEP> avec <SEP> un <SEP> tampon <SEP> de <SEP> pH <SEP> 3,5
<tb> de <SEP> pH <SEP> 3,5
<tb>
Exemple 31
EMI52.4
11a-chlorotétracycline-6,12-hémicétal.
Ce composé est prépare par le procédé de l'exem-- pie 28 en remplaçant l'oxytétracycline par une quantité équivalente de tétracycline.
Exemple 32
EMI52.5
1 1a-chloro-6-désoxy-6-déméth,yl--6--méth,ylène-'té'trac.vcline.
2 g de lla-chloroté-,tacycline-6,12-h6nioétal sont mis en solution dans 15 ml d'acide fluorhydriqae li- quide à 0 C. Le mélange est maintenu pendant-1C à 15 minu- tes à cette température, ce après quoi l'acide fluorhydri- que est évaporé. Le résidu est trituré dans l'éther et 1!on obtient le produit sous forme solide en tant que fluorhydra- te, qui est recristallisé dans le méthanol.
On peut aussi faire dissoudre 10 g de fluorhy- drate brut dans 350 ml d'eau en chauffant et en agitant.
On ajoute un volume égal d'acide chlorhydrique concentré à la solution claire et le produit cristallise sous forme de chlorhydrate. L'analyse élémentaire du chlorhydrate donne les valeurs suivantes : la formule brute
EMI52.6
C22H2207N2C12 les valeurs théoriques sont : C : 53,11%; H : 4,56 %; Cl : 7,13 %; N : 5,63 %.
Et l'on trouve effectivement :
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EMI53.1
.c : 52, 62 ; H : 4, 63 ; Cl : 6,84 #; N : 5, 54 ##
L'analyse spectrale aux infrarouges du chlorhy- drate, dans une pastille de bromure de potassium ( à la concentration de 1 %) donne une bande d'absopption typique du carbonyle à 5,70 ainsi que les maximums significatifs ci-après : 6,1, 6,23,6,36, 6,45 (épaulement), 6,91, 6,85,
8,14, 8,55, 10,22,10,55 et 10,89. L'analyse aux ultra- violets d'une solution dans HCl 0,01 N dans le méthanol révèle des maximums à 376,278 et 242 m . Le Rf est com- pris entre 0,2 et 0,3 dans le système 20-3-toluène-pyridine saturé de tampon de pH 4,2 pour la phase mobile et tampon aqueux de pH 4,2 pour la phase stationnaire.
EMI53.2
L'étude du chromatograu-ne en lumière ultraviolet- te ne révèle pas de forte fluorescence de la tache corres- pondant au produit. Toutefois, après.pulvérisation d'une solution aquease d'hydrosulfite de soude, une forte fluores- cence apparaît.
Dans, ce système, l'épimère C 4 du produit pré- sent comme impureté mineure montre un Rf de 0,1.
Exemple 33 6-désoxy-6-déméthyl-6-méthylène-tétracycline.
5 mg du produit de l'exemple 32 sont dissous dans 3 ml de méthanol e+ l'on ajoute une solution fraîche- ment préparée d'hydrosulfite de soude (20 mg dans 2 ml d'eau). Le mélange est laissé au repos pendant 15 minutes à la température ambiante, puis il est débarrassé du mé- thanol par évaporation et soumis à l'extraction au butanol..
.La phase d'extraction butanolique est concentrée pour don- ner le produit sus indiqué. Ce dernier est ensuite cristal- lisé dans l'eau à laquelle on ajoute de l'acide p-toluène-
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sulfonique, de sorte que le produit final se présente comme un p-toluène-sulfonate. On peut aussi ajouter à l'eau de l'acide chlorhydrique concentré auquel cas on obtient un chlorhydrate.
Dans le système chromatographique déjà décrit à l'exemple 32, le Rf du produit est 0,6 alors qu'il est 0,9 dans le système ci-après :
EMI54.1
<tb> Phase <SEP> mobile <SEP> Phase <SEP> stationnaire
<tb>
<tb>
<tb> 20-10-3 <SEP> nitrométhane-chloroforme <SEP> Tampon <SEP> aqueux <SEP> de
<tb>
<tb> pyridine <SEP> pH <SEP> 3,5
<tb>
L'épimère en C 4'de cette substance a un Rf de 0,4 environ dans le premier système, et d'environ 0,6 dans le second.
Procédé B :
50 g de chlorhydrate de 11a-chloro-6-désoxy-6- déméthyl-6-méthylène-tétracycline sont mis en solution dans 500 ml d'éther monométhylique de l'éthylène glycol puis sont refroidis à 4 C au bain de glace, et la solution agitée rapidement est traitée par 50 g de poudre de zinc ajoutée graduellement en 10 minutes environ. La tempéra- ture remonte à 12 C pendant l'addition. Une fois que la totalité du zinc est adjointe, la température recommence à descendre. Après un temps de réaction total de 15 minutes, le zinc est éliminé par filtration rapide et lavé avec un solvant, 1 litre d'eau est ajouté graduellement au filtrat en 10 minutes environ. On obtient ainsi une boue jaune de complexe de zinc du produit.
Le pH de la solution est alors ajusté à 6,8 par adjonction d'une solution aqueuse de soude à 10 %.
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La boue obtenue est mise à digérer pendant; envi... ron une heure et demie au bain de glace, puis est filtrée.
Le gâteau de filtre humide est alors remis en suspension dans 750 ml d'eau et l'on ajoute goutte à goutte de l'acide chlorhydrique concentré jusqu'à obtention d'une solution claire. Un léger excès d'acide chlorhydrique concentré détermine la cristallisation rapide du chlorhydrate de 6-désoxy-6-déméthyl-6-méthylène-tétracycline, sous forme d'aiguilles brillantes. Après une digestion d'une heure, le produit est filtré et séché. On obtient 37,8 g d'un produit qui fond à une température comprise entre 213,8 et 214, 2 C sans le décomposer.
Exemple 34
Sels obtenus par addition à un acide de la
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6¯désoxy-13-( ft -hydroxyéthyln,l;..rcapto) tétracycline.
De la 6-désoxy-13-(/3-hydroxyéthylmercapto) tétracycline est mise en solution dans du méthanol conte- nant une quantité équimolaire d'acide chlorhydrique. Le chlorhydrate est alors précipité par addition d'éther et il est récupéré par filtration et séché.
De façon analogue, on peut préparer des sels d'addition à des acides de la 6-désoxy-13- P (hydrohyéthyl- mercapto) tétracycline en remplaçant l'acide chlorhydrique par l'un des acides sulfurique , nitrique,' perchlorique, bromhydrique, phosphorique, fluorhydrique, p-toluène sulfonique, iodhydrique, tartrique, acétique, citrique, malique, benzoïque, glycolique, gluconique, gulonique, succinique et sulfosalicylique.
De même les sels d'addition à des acides des produits des exemples précédents peuvent être préparés de
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façon analogue. Ceux de ces sels d'addition qui sont inacceptables en pharmacopée peuvent être mis en jeu, de manière en elle-même habituelle, à des fins de purifica- tion, pour produire soit des composés amphotères, soit des sels par addition d'acide qui soient acceptables en pharmacopée. En outre, les sels par addition d'acide non acceptables en pharmacopée constituent des produits inter- médiaires intéressants conduisant à d'autres produits selon la présente invention.
Exemple 35
Sels métalliques de la 6-désoxy-13-(ss -hydroxy- éthyl-mercapto) tétracycline.
On peut préparer le sel sodique de la 6-désoxy- 13-( -hydroxyéthyl-mercapto) tétracycline en faisant dis- soudre le composé amphotère dans du méthanol contenant une quantité équimolaire de soude et en faisant évaporer sous vide le mélange obtenu. De la même manière, on obtient d'autres sels métalliques, notamment les sels de potassium, de calcium, de baryum, de lithium et de strontium.
Les sels métalliques complexes de la 6-désoxy- 13-( -hydroxyéthyl-mercapto) tétracycline sont préparés en faisant dissoudre cette tétracycline dans un alcool aliphatique inférieur, de préférence le méthanol, et en traitant la solution avec une quantité équimolaire du sel métallique choisi, lequel a été de préférence mis en solu- tion dans l'alcool choisi. Les complexes métalliques inso- lubles peuvent être isolés par simple filtration: toute- fois, en général, la plupart d'entre eux sont solubles dans l'alcool et ils sont récupérés par évaporation du solvant ou addition d'un non solvant, comme l'éther .
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diéthylique.
De cette manière,les sels complexes métalliques de la 6-désoxy-13-(ss -hydroxyéthyl-mercapto) tétracycline qui sont principalement des composés contenant un atome de métal pour une molécule de tétracycline sont préparés à partir des sels métalliques suivants: chlorure de calcium, chlorure de cobalt, sulfate de magnésium, chlorure de magnésium, chlorure de stanneux, chlorure de zinc, chlo- rure de cadmium, chlorure de baryum, nitrate d'argent, nitrate stanneux, nitrate de strontium, acétate do magné- sium, acétate manganeux, chlorure de palladium, chlorure manganeux, chlorure de sérium, chlorure de titane, chlo- rure de platine, chlorure de vanadium, acétate plombeux, bromure stanneux, sulfate de zinc, chlorure de chrome et chlorure de nickel.
On prépare de la même manière les mêmes sels métalliques complexes des composés des exemples précédents.