BE884545A - Interferon de fibroblastes humains sous la forme d'une proteine homogene et sa preparation - Google Patents

Description

  INTERFERON DE FIBROBLASTES HUMAINS

SOUS LA FORME D'UNE PROTEINE HOMOGENE;

ET SA PREPARATION 

  
La présente invention concerne l'interféron de fibroblastes humains sous la forme d'une protéine homogène et un procédé pour sa production en combinant la chromatographie d'affinité et la chromatographie

  
en phase liquide à haute pression (HPLC).

  
Depuis sa découverte initiale par Isaacs et

  
 <EMI ID=1.1> 

  
forme des leucocytes ou des fibroblastes, a résisté aux tentatives des chercheurs dans les institutions de l'ensemble du inonde, au cours de deux décennies, en vue de son isolement sous la forme d'un peptide homogène

  
 <EMI ID=2.1> 

  
sation et l'identification de ses propriétés biologiques et chimiques particulières. Bien que plusieurs auteurs affirment avoir purifié des interférons de souris ou humains à un état homogène, ils n'ont donné aucune des preuves classiques d'homogénéité des matières protéiques et n'ont décrit non plus aucune  des propriétés des composés purs qu'ils prétendent avoir obtenus. 

  
L'utilisation de chromatographie en phase liquide à hautes performances pour la purification de protéines est connue d'une manière générale dans la technique. Les références décrivent spécifiquement des colonnes des types à échange d'ions et à exclusion de grosseurs dans la purification de protéines (par exemple Régnier et Noël, J. Chromatog. Sci. 14, 316 [1976J et Chang et autres, Anal. Biochem. 48, 1839

  
[1976] et l'utilisation de Lichrosorb RP-18 (colonne de microparticules de silice liée à des groupes octadécyle) dans une chromatographie de partage à phase inverse a été employée efficacement pour purifier des peptides tels que la (3-endorphine (Rubinstein et autres, <EMI ID=3.1>  Il est connu dans la technique d'utiliser la <EMI ID=4.1>  la purification de l'interfère:! de fibroblastes humains. Ainsi, Davey et autres, J. Biol. Chem. 251, 7620 (1976), décrivent l'utilisation d'une chromatcgraphie d'affini- <EMI ID=5.1>  <EMI ID=6.1>  <EMI ID=7.1>  même but un système Blue Dextran-Sepharose. Enfin, selon le brevet des E.U.A.

   N[deg.] 4 172 071 (de Maeyer et autres), la purification de diverses solutions brutes d'interféron de leucocytes et de fibroblastes est effectuée par chromatographie d'affinité sur une colonne de Blue Dextran-Sepharose donnant des préparations qui ont une activité spécifique comprise entre 1 et 5 x 108 Unités Internationales d'interféron. Aucune étape de purification supplémentaire n'est décrite et les prérarations d'interféron obtenues sont indiquées comme ayant une haute teneur en produits présentant une activité du type interféron, dépouillés dans une mesure majeure des protéines polluantes. <EMI ID=8.1>  vention utilise une combinaison d'étapes de chromatographie d'affinité et de chromatographie en phase liquide à haute pression pour effectuer une purification efficace de l'interféron de fibroblastes humains.

   Plus particulièrement, le procédé selon la présente invention comprend les étapes suivantes en combinaison :  A. On fait passer une solution aqueuse d'interféron de fibroblastes humains dans un état impur à travers une colonne à chromatographie d'affinité de ma-nière à adsorber l'interféron sur la colonne,et ensuite on élue l'interféron de la colonne et on obtient l'interféron dans des fractions choisies de l'éluat dans un état de pureté accrue; et B.

   On fait passer les fractions choisies d'interféron obtenues dans l'étape A à travers une ou plusieurs colonnes de matrice de silice liée à des groupes d'hydrocarbure équilibrées par un tampon dans des conditions de chromatographie en phase liquide à haute pression, les groupes d'hydrocarbure étant choisis parmi les groupes cyclohexyle, phényle, diphényle, octyle, octadécyle et cyanopropyle, de manière à absorber l'interféron sur la colonne, et ensuite on élue l'interféron de cette colonne au moyen d'un gradient d'un mélange acide aqueux tamponné de solvants misci- <EMI ID=9.1>  forme d'un pic distinct unique dans des fractions choisies de l'éluat à l'état d'une protéine homogène.

   Dans l'opération de chromatographie d'affinité selon la présente invention, on peut utiliser un <EMI ID=10.1>  Sepharbse, l'utilisation de ce dernier étant préférée en raison du fait que l'on obtient avec lui des rendement s sensiblement plus élevés qu'avec le système Concanavalin A-Sepharose 4B et on obtient aussi un produit plus stable. Avec le système Concanavalin A-Sepharose 4B, on peut utiliser le mode opératoire suivant :
(a) 20 à 30 volumes de colonne d'interféron de fibroblastes humains (activité spécifique environ
10 unités/mg) dans du milieu essentiel minimal d'Eagle contenant 5 % de sérum foetal de veau sont refoulés sur une colonne de Concanavalin A-Sepharose 4B à un débit de 30 à 60 cm&#65533;/h ; <EMI ID=11.1>  phosphate (PBS), pH 7,2 ;
(c) on lave avec PBS-0,1M a-méthyl mannoside <EMI ID=12.1>  <EMI ID=13.1>  d'éthylèneglycol.

  
L'interféron purifié résultant obtenu après l'étape (d) présente une activité spécifique d'environ

  
 <EMI ID=14.1> 

  
ron.

  
Un mode opératoire approprié pour l'utilisation de Blue Dextran-Sepharose dans l'étape de chromatographie d'affinité est le suivant : 
(a) 10 à 40 volumes de colonne du liquide surna- <EMI ID=15.1> 

  
d'une solution saturée de NaCl et ensuite refoulés sur la colonne à une vitesse linéaire d'écoulement de
20-40 cm/h ;
(b) on lave la colonne avec 5-15 volumes de co- <EMI ID=16.1>  phosphate contenant 50 % (v/v) d'éthylène-glycol (pH 7,2).

  
 <EMI ID=17.1> 

  
fique d'environ 3 x 10[deg.] unités/mg et peut être obtenu

  
 <EMI ID=18.1> 

  
Le Blue Dextran-Sephar&#65533;se utilisé dans l'étape de chromatographie d'affinité ci-dessus peut être préparé commodément par copulation de Blue Dextran
(produit de couplage de Cibacron Blue F3GA et de Dextran) avec un Sepharose 4B activé par le bromure

  
 <EMI ID=19.1> 

  
L'opération de copulation ci-dessus, ainsi que le lavage et le vieillissement de la résine, le mode opératoire pour le chargement de la colonne et pour l'élution sont importants pour l'obtention du rendement maximal et du plus haut degré de pureté du produit interféron de fibroblastes humains.

  
Dans les cas où l'échantillon d'interféron est récolté à partir d'un milieu exempt de sérum, la purification à un état homogène est effectuée par un seul ou deux passages à travers une colonne de Blue Sepharose-4B en éluant avec une solution aqueuse tamponnée à 30-&#65533;0 % (v/v) d'éthylène-glycol (pH 7,2).

  
Pour obtenir une purification supplémentaire de l'interféron produit dans l'étape de chromatographie par affinité, on traite l'interféron par une ou plusieurs étapes de chromatographie en phase liquide à haute pression avec une haute résolution et un rendement élevé à une échelle de préparation. L'opération de chromatographie en phase liquide utilise des colonnes contenant une matrice de silice poreuse à laquelle sont liés des groupes cyclohexyle, octyle, octadécyle, phényle, diphényle ou cyanopropyle. Ces colonnes, qui peuvent être utilisées successivement

  
et dans des conditions variables de pH et de gradient de solvant organique, peuvent purifier l'interféron

  
de fibroblastes humains jusqu'à un état homogène comme déterminé par l'obtention d'une seule bande lors d'une électrophorèse sur gel de polyacrylamide au dodécyl-

  
 <EMI ID=20.1> 

  
constante et d'un seul pic en HPLC avec l'activité et les niveaux de protéine superposables.

  
Les colonnes de microparticules de silice totalement poreuses, de forme irrégulière (grosseur des particules 10 microns environ et une grosseur de pores

  
o

  
ie 1CO A environ) ayant des groupes cyclohexyle, oc-

  
 <EMI ID=21.1>  sées dans la mise en oeuvre de l'invention sont des articles du commerce.

  
Un système commode de chromatographie en phase liquide à haute pression utilisable dans les colonnes indiquées ci-dessus est décrit dans le brevet des

  
 <EMI ID=22.1> 

  
Dans la aise en oeuvre du présent procédé, la solution d'interféron de fibroblastes humains purifiée par chromatographie d'affinité dans un tampon aqueux de pH 4-8 est passée à travers une colonne de matrice de silice. Un tampon préféré pour les buts de la présente invention est un tampon pyridine/acide formique/ eau (8:8:84, v/v). Habituellement, on met en oeuvre

  
le procédé sous pression, de préférence une pression comprise entre environ 3,4 et environ 540 atm. L'interféron est absorbé sur la colonne et on l'élue ensuite d'une manière sélective en utilisant un gradient d'un tampon aqueux plus des quantités variables d'un solvant miscible avec l'eau. Des solvants miscibles avec l'eau utilisables à cet effet sont, par exemple, des alca-

  
 <EMI ID=23.1> 

  
le tert-butanol, l'éthanol, le méthanol, etc. On préfère particulièrement pour l'élution d'interféron de fibroblastes humains un mélange de propanol et de butanol.

  
On effectue le fractionnement de l'éluat en

  
 <EMI ID=24.1> 

  
en elle-même connue avec contrôle concomitant de la teneur en protéine de chaque fraction par des contr8leurs de peptides fonctionnant avec une grande sensibilité. Un système utilisable à cet effet est décrit

  
 <EMI ID=25.1> 

  
On notera aussi le brevet des E.U.A. n[deg.] 3 876 881.

  
Le choix des types particuliers de résines à utiliser dans les étapes de chromatographie en phase liquide à haute pression dépend de la source et de la pureté de la matière de départ interféron de fibroblastes humains qu'on utilise pour cette étape. Ainsi, la matière produite par chromatographie d'affinité

  
sur uno colonne de Concanavalin A-Sepharose est purifiée commodément jusqu'à un état homogène en utilisant une chromatographie en phase liquide à haute pression sur une colonne de silice à groupes cyclohexyle liés

  
et ensuite sur une colonne de silice à groupes octyle liés. Par ailleurs, quand on utilise une colonne de Blue Dextran dans l'étape de chromatographie d'affinité, la purification à un état homogène peut être effectuée par un ou plusieurs passages à travers une colonne de silice à groupes octyle liés ou en variante par passage à travers la colonne de silice à groupes octyle liés suivie d'un passage à travers une colonne de silice à groupes cyanopropyle liés et ensuite, si nécessaire,

  
à travers une colonne de silice à groupes diphényle liés. Quand on utilise une colonne de Blue Sepharose-4B et une préparation exempte de sérum, un seul passage à travers une colonne de silice à groupes octyle liés donnera une préparation homogène.

  
En raison de la sensibilité de l'activité de l'interféron de fibroblastes humains en présence de solvants organiques, par exemple en présence des propanols, du butanol ou du 2-méthoxy-éthanol à un pH neutre,

  
 <EMI ID=26.1> 

  
l'interféron de fibroblastes humains a une nature plus hydrophobe que l'interféron de leucocytes et comme il y a d'autres protéines plus hydrophobes présentes dans les préparations d'interféron de fibroblastes partiel-

  
 <EMI ID=27.1> 

  
et de butanol constitue le solvant préféré pour l'élution des colonnes à phase inverse, plutôt que le n-propanol. L'utilisation d'un tel solvant sert à liai-ter la concentration d&#65533;olvant organique nécessaire pour l'élution complète de toutes les protéines absorbées et réduit ainsi les produits artificiels se formant à une haute charge en raison de la solubilité plus faible des protéines.

  
L'interféron de fibroblastes humains obtenu dans un état homogène selon la présente invention est dérivé d'un pic unique dans la dernière colonne de chromatographie en phase liquide à hautes performances et donne une seule bande étroite lors d'une électrophorèse sur gel de NaDodS04 polyacrylamide en présence de 2-mercaptoéthanol. L'extraction du gel donne un seul pic d'activité antivirale coïncidant avec la

  
 <EMI ID=28.1> 

  
porte quelle détermination antivirale classique pour l'activité de l'interféron de fibroblastes humains.

  
La masse moléculaire de l'interféron de fibroblastes humains homogène telle que déterminée par la méthode au gel de polyamide a été de 20 500 environ. L'activité spécifique de cette matière purifiée était

  
 <EMI ID=29.1> 

  
l'extrémité côté azote obtenue sur un échantillon d'interféron de fibroblastes humains homogène a été

  
 <EMI ID=30.1> 

  
Les interférons ont présenté une activité antivirale, anti-tumeurs, d'inhibition de croissance et d'immunosuppression. Ces activités ont été obtenues

  
 <EMI ID=31.1> 

  
par jour avec des préparations relativement brutes,

  
 <EMI ID=32.1> 

  
féron de fibroblastes- humains purifié homogène selon la présente invention peut être utilisé de la même manière que les préparations brutes utilisées antérieurement avec ajustement des doses de manière à donner le niveau équivalent désiré d'unités d'interféron. 

  
Les aspects procédé et produit de la présente invention sont encore illustrés par référence aux exemples suivants. Tous les titres des interférons sont

  
 <EMI ID=33.1> 

  
par mg par comparaison avec un étalon de référence pour l'interféron de leucocytes humains (G023-901-527) fourni par The National Institutes of Health des E.U.A.

Exemple 1

  
 <EMI ID=34.1> 

  
 <EMI ID=35.1> 

  
équipée d'un disque de polyéthylène fritté, on intro-

  
 <EMI ID=36.1> 

  
 <EMI ID=37.1> 

  
On la charge à un débit de 180 cm&#65533;/h (35,5 cm/h) de

  
 <EMI ID=38.1> 

  
 <EMI ID=39.1> 

  
féron est finalement élue avec le tampon ci-dessus contenant 50 % (v/v) d'éthylène-glycol. Le rendement

  
 <EMI ID=40.1> 

  
 <EMI ID=41.1> 

  
plus large comprenant des fractions supplémentaires

  
 <EMI ID=42.1> 

  
Un/total de 120 cm<3> d'éluat de la colonne de Concanavalin A-Sepharose 4B (2,5 x 10[deg.] unités; environ 2-4 x 10[deg.] unités/mg) est appliqué directement à une

  
 <EMI ID=43.1> 

  
 <EMI ID=44.1> 

  
 <EMI ID=45.1> 

  
male au-dessous de 306 atm. Le système utilisé pour  <EMI ID=46.1> 

  
 <EMI ID=47.1> 

  
Le gradient suivant depuis le' tampon A de mise en équilibre jusqu'à un tampon B final (pyridine/acide

  
 <EMI ID=48.1> 

  
fractions 26 à 29 (2 x 10[deg.] unités) au centre du pic

  
 <EMI ID=49.1> 

  
fornique. On applique cette solution au moyen de la

  
 <EMI ID=50.1> 

  
octyle (4,6 x 300 mm). les conditions d'élution sont les mêmes que pour la colonne à groupes cyclohexyle ci-dessus. L'activité spécifique dans le centre du pic

  
 <EMI ID=51.1> 

  
production totale d'interféron de fibroblastes humains

  
 <EMI ID=52.1> 

  
Il y a lieu de noter que la position d'élution de l'interféron sur les colonnes tant à groupes cyclohexyle qu'à groupes octyle est très proche du pic central principal quand l'interféron purifié sur Concana-

  
 <EMI ID=53.1> 

  
une colonne à groupes octyle, l'interféron est élue juste avant le pic central principal, tandis qu'il est élue immédiatement après ce pic dans les mêmes conditions de chromato&#65533;raphie sur la colonne à groupes cyclohexyle.

  
Des échantillons d'interféron de fibroblaste humain purifié par HPLC sont passés sur des gels de

  
 <EMI ID=54.1> 

  
Après électrophorèse, cn obtient une seule bande par coloration au bleu de Coomassie. Un échantillon de la mène matière est passé dans un gel en parallèle et on coupe le gel en tranches pour des déterminations anti-

  
 <EMI ID=55.1> 

  
avec le centre de la bande colorée. On détermine une masse moléculaire d'environ 20 500 en utilisant de l'albumine de sérum bovin, de la chymotrypsine, du cytochrome C et de la ribonucléase comme étalons. La mobilité relative de l'interféron de fibroblastes humains est la même qu'il y ait du mercaptoéthanol dans l'échantillon ou qu'il n'y en ait pas.

Exemple 2

  
Préparation de la résine Blue Dextran-Sepharose 4B

  
50 grammes de Sepharose 4B dans un état tassé sont lavés avec 1 litre d'eau et recis en suspension

  
 <EMI ID=56.1> 

  
bromure de cyanogène finement divisé à la solution agitée lentement et le pH est immédiatement réglé et maintenu à 11 &#65533; 0,2 par addition goutte à goutte de

  
 <EMI ID=57.1> 

  
de petites additions de glace pilée. Quand la réaction se calme (15-20 min) on ajoute environ 1 volume d'eau glacée, on transfère la solution dans un entonnoir de Buchner et on la lave de nuaveau avec 5 volumes de 0,C1N HC1.

  
La résine activée est immédiatement mise en

  
 <EMI ID=58.1> 

  
et on la fait tourner toute une nuit dans un ballon à fond rond. On lave ensuite la résine avec 10 volumes

  
 <EMI ID=59.1>   <EMI ID=60.1> 

  
nouveaux lavages avec 3 volumes de solution aqueuse à
80 % d'éthylène-glycol contenant 1M NaCl et ensuite

  
 <EMI ID=61.1> 

  
 <EMI ID=62.1> 

  
ti on.

  
 <EMI ID=63.1> 

  
On mélange 1,5 litre d'interféron de fibro-

  
 <EMI ID=64.1> 

  
activité spécifique 2 x 104 unités/mg protéine) avec 0,27 volume de solution saturée de NaCl (environ 6,3M).

  
 <EMI ID=65.1> 

  
Dextran-Sepharose tassés dans une colonne de poly-

  
 <EMI ID=66.1> 

  
 <EMI ID=67.1> 

  
 <EMI ID=68.1> 

  
 <EMI ID=69.1> 

  
 <EMI ID=70.1> 

  
NaCl contenant du phosphate de sodium 0,C5M (pH 7,2)

  
 <EMI ID=71.1> 

  
 <EMI ID=72.1> 

  
 <EMI ID=73.1>  <EMI ID=74.1>  élué de la colonne de Blue Dextran-Sepharose 4B

  
 <EMI ID=75.1> 

  
col. Immédiatement après l'application de l'échantillon, on refoule sur la colonne du tampon A (pyridine/acide

  
 <EMI ID=76.1> 

  
que l'activité d'interféron coïncide essentiellement avec un seul pic de protéine présent dans les fractions

  
 <EMI ID=77.1> 

  
(B) Quand on applique à la même colonne environ un quart de la charge de l'essai (A) ci-dessus et  on utilise les conditions d'élution utilisées pour la colonne à groupes cyclohexyle dans l'exemple 1, on trouve que l'activité d'interféron coïncide avec un pic de protéine présent dans les fractions 24 à 26.
(C) En utilisant la même charge, le même programme échelonné et la même vitesse linéaire d'écoulement que dans (A) et en utilisant les tampons A et B <EMI ID=78.1> 

  
de Chromagabond à groupes octyle, ce qui donne donc environ 1/9ème de la charge par volume de colonne, on obtient une meilleure qualité de la séparation.

  
 <EMI ID=79.1> 

  
lonne à groupes cyanopropyle en utilisant un système pyridine/acide formique/eau (8:8:84, v/v) et un gra-

  
 <EMI ID=80.1> 

  
cm&#65533;/min, pour donner un pic principal symétrique.

  
 <EMI ID=81.1> 

  
L'électrophorèse effectuée comme décrit dans l'exemple 1 avec des échantillons des produits des opérations (A), (B) et CC) ci-dessus présente comme bande

  
 <EMI ID=82.1>  coupés en tranches et soumis à la détermination, coincide avec le centre du pic d'activité. La bande la plus

  
 <EMI ID=83.1> 

  
comme estimé d'après l'intensité de coloration) varie d'un échantillon à un. autre et n'a pas d'activité antivirale. Si les échantillons ne sont pas traités au

  
 <EMI ID=84.1> 

  
qui ne sont pas distinguables, tandis que l'analyse de

  
 <EMI ID=85.1> 

  
L'électrophorèse d'un échantillon obtenu en
(D) ci-dessus donne une seule bande qui a une masse <EMI ID=86.1> 

  
 <EMI ID=87.1> 

  
ce peptide homogène effectuée sur un hydrolysat de

  
 <EMI ID=88.1> 

  
tats suivants par rapport à la leucine prise arbitrairement comme 25,0 :

  

 <EMI ID=89.1> 


  
* valeur non corrigée 

  
 <EMI ID=90.1> 
(a) Cinq litres du liquide surnageant d'une culture contenant 19 400 unités/cm&#65533; d'interféron de <EMI ID=91.1> 

  
et ensuite appliqués à une colonne contenant un volume

  
 <EMI ID=92.1> 

  
le liquide surnageant à 1,25&#65533; NaCl par l'addition de  <EMI ID=93.1> 

  
Environ 4-6 % de l'interféron passe à travers la colonne dans la fraction passant directement qui n'est pas retenue par la colonne.

  
(b) Cn lave ensuita la colonne avec 1300 car d'une solution aqueuse contenant 15 % (v/v) d'éthylène- <EMI ID=94.1> 

  
appliqué à la colonne est élue.

  
(c) On élue ensuite l'interféron avec une solution aqueuse contenant 50% (v/v) d'éthylène-glycol, <EMI ID=95.1> 

  
bit de 420 cm<3>/h. Peu d'interféron est élue avec les

  
 <EMI ID=96.1> 

  
l'interféron appliqué à la colonne est éluée avec les

  
 <EMI ID=97.1> 

  
bleau suivant :

  

 <EMI ID=98.1> 


  
Le rendement total en interféron recueilli

  
 <EMI ID=99.1> 

  
riabilité de la détermination).

  
"

  
 <EMI ID=100.1>   <EMI ID=101.1> 

  
 <EMI ID=102.1> 

  
 <EMI ID=103.1> 

  
silice à groupes octyle liés à un débit de 4 cm&#65533;/min.

  
 <EMI ID=104.1> 

  
n-butanol/eau, 8/8/20/2,5/61,5, v/v) est refoulé à travers la colonne à un débit de 2 cm<3>/min pendant

  
12 minutes. Ensuite, on applique un gradient d'élution comme suit pour arriver au tampon B (pyridine/acide

  
 <EMI ID=105.1> 

  
à un débit de 1,25 cm<3>/min . 0-20 % B, 18 minutes;

  
 <EMI ID=106.1> 

  
 <EMI ID=107.1> 

  
L'activité d'interféron sort dans la région isocratique du gradient et est éluée en même temps qu'un pic détecté avec un système de contrôle à la

  
 <EMI ID=108.1> 

  
ron (rendement 35 %) et une activité spécifique de

  
2 x 108 unités/mg est obtenue pour l'ensemble (50 cm<3>). Après deux mois de stockage à -20[deg.]C dans des flacons de polypropylène bouchés, l'activité tombe à 10 % de la valeur après l'étape HPLC. Il n'y a pas du tout de protéine perdue.

  
Le total des 50 en* provenant de la colonne de

  
 <EMI ID=109.1> 

  
unités/mg) est mélangé avec 1 cm<3> de thiodiglycol et
20 cm<3> de n-propanol. On trouve un total de 4.26 x 106 unités dans la détermination pour ce mélange. Cn y

  
 <EMI ID=110.1> 

  
libre avec un mélange de pyridine/acide formique/eau
(8:8:84, v/v, tampon A), à un débit de 1,5 cm'/h pendant 30 minutes. On applique le gradient suivant pour passer au tampon B, pyridine/acide formique/n-propanol/eau

  
 <EMI ID=111.1> 

  
 <EMI ID=112.1> 

  
féron émerge en même temps que le seul pic observé. On recueille 4,2 x 106 unités (82 %) en trois fractions de 1 cm' . 

  
L'ensemble ci-dessus représentant 69 % de la protéine totale appliquée sur la première colonne à

  
 <EMI ID=113.1> 

  
0,1 % et le mélange est refoulé sur la même colonne à groupes cyano qu'utilisée ci-dessus. On applique le même gradient que ci-dessus avec une durée totale réduite de moitié. Toute l'activité (11,75 x 10[deg.] unités;

  
 <EMI ID=114.1> 

  
seul pic. 

  
Le volume total de liquide contenant l'activité d'interféron provenant de la deuxième colonne à

  
 <EMI ID=115.1> 

  
4,6 x 250 mm de matrice de silice à groupes diphényle liés, soumise au préalable à un gradient linéaire de 2 heures du tampon A au tampon B (même tampons que pour la colonne à groupes cyano) et mise en équilibre avec le tampon A, à un débit de 1,5 cm<3>/min.

  
On effectue l' élution à gradient suivante à

  
 <EMI ID=116.1> 

  
Le deuxième pic, qui est élue tandis que l'instrument du gradient indique 33 % de tampon B, coïncide avec la courbe d'activité d'interféron. Un total de 2, 6 x 106

  
 <EMI ID=117.1> 

  
pic.

  
La colonne de matrice de silice à groupes diphényle liés est préparée comme suit :

  
Un support de silice (10/u, pores de 10 nm) est trempé dans 6N HCl (1C:1, volume/poids) pendant 24 heures tandis qu'on secoue de temps à autre. On lave le support sur un filtre en verre fritte d'abord avec de l'eau jusqu'à ce que l'eau de lavage soit neutre

  
et ensuite on le lave à l'acétone et au méthanol pour éliminer l'eau. Après séchage sous vide toute une nuit, le support (10 g) est chauffé au reflux dans du toluène

  
 <EMI ID=118.1> 

  
silane pendant 6 heures. Le support lié est séparé de la solution au toluène au moyen d'un filtre en verre

  
 <EMI ID=119.1> 

  
support lié est traité dans un extracteur Soxhlet suc-

  
 <EMI ID=120.1> 

  
méthanol pendant 8 heures chaque fois et est traité en-

  
 <EMI ID=121.1> 

  
opératoires que décrit ci-dessus.

  
Le support lié est tassé dans des colonnes en acier inoxydable de 4,6 x 250 mm à 340 atm en utilisant un mélange de chloroforme (10,7 cm<3>) et de n-butanol

  
 <EMI ID=122.1> 

  
colonnes sont: ensuite lavées à l'éthanol (75 cet).

  
Un échantillon de la fraction centrale du pic d'interféron résultant est analysé en ce qui concerne la composition des amino-acides dans diverses conditions d'hydrolyse. Les résultats sont résumés ci-après:

  
 <EMI ID=123.1> 

  
tubes en verre sous vide lavés à l'acide. On a soustrait les résultats obtenus dans les essais à blanc avec le tampon et HCl . 

  

 <EMI ID=124.1> 


  
 <EMI ID=125.1> 

  
* valeurs non corrigées

  
** valeur arbitraire

  
n. d. pas déterminé

  
 <EMI ID=126.1> 

  
utilisant l'éluant provenant de la fraction du pic central de la colonne à groupes diphényle indique que l'interféron de fibroblastes contient environ 3 rési-

  
 <EMI ID=127.1> 

  
ni de mannosamine.

  
La détermination des groupes terminaux est effectuée avec un échantillon de 90 pmoles de la fraction centrale du pic d'interféron de fibroblaste de

  
i la colonne à groupes diphényle et entraîne la détec-

  
 <EMI ID=128.1> 

  
Des échantillons de 150 pmoles chacun d'interféron de fibroblastes et d'interféron de leucocytes sont soumis à une digestion tryptique. On chromatographie les produits de digestion et on ne trouve aucun fragment de peptide commun aux deux interférons. La détermination de séquence d'une quantité de 1,25 nmole

  
 <EMI ID=129.1> 

  
naison du côté azote et confirme aussi la séquence 3-10

  
 <EMI ID=130.1> 

  
 <EMI ID=131.1> 

  
 <EMI ID=132.1> 

  
 <EMI ID=133.1> 

  
 <EMI ID=134.1> 

Exemple 4

  
On prépare de l'interféron brut à partir de fibroblastes humains (ligne de cellules GM 2504A). La matière brute est mise à la concentration 1M dans du chlorure de sodium par addition d'une solution saturée de chlorure de sodium. Ou fait passer cette matière à travers une colonne de Blue Sepharose-4B

  
 <EMI ID=135.1> 

  
 <EMI ID=136.1> 

  
le chargement. Après le chargement, on lave la colonne avec 250 CET* de la solution suivante (2,5 cm&#65533;/min) .

  
 <EMI ID=137.1> 

  
Résultats de détermination typiques :

  
 <EMI ID=138.1> 

  
10 % d'activité dans le liquide du lavage à 30 % 85 % d'activité dans le liquide du lavage à 5C %

  
Les fractions du pic de la prenière colonne de Blue Sepharose sont combinées et diluées à 10 % d'éthylène-glycol avec la solution suivante :

  
 <EMI ID=139.1> 

  
On charge cette matière sur une colonne de

  
 <EMI ID=140.1> 

  
 <EMI ID=141.1> 

  
 <EMI ID=142.1> 

  
7,2) et 30 % d'éthylène-glycol et on l'élue avec une

  
 <EMI ID=143.1> 

  
Résultats de déterminations typiques : 

  
10 % d'activité dans le liquide sortant directement

  
 <EMI ID=144.1> 

  
 <EMI ID=145.1> 

HPLU

  
Echantillon : Le premier échantillon utilisé est la fraction à 50 % d'éthylène-glycol provenant de la colonne de Blue Sepharose. Les autres échantillons sont des échantillons ayant passé deux fois à travers la colonne de Blue Sepharose, auquel cas on a pu utiliser l'interféron dans le liquide à 30 % ou dans ce-

  
 <EMI ID=146.1> 

  
 <EMI ID=147.1> 

  
Lichrosorb RP-8. On lave la colonne d'abord avec de

  
 <EMI ID=148.1> 

  
colonne de Blue Sepharose. On utilise avant la pompe

  
 <EMI ID=149.1> 

  
colonne de HPLC un débit de 22 cm<3>/h avec le gradient échelonné suivant de n-propanol, à un pH constant de

  
 <EMI ID=150.1> 

  
pyridine. 

  

 <EMI ID=151.1> 


  
On lave ensuite la colonne avec 60 % de n-propanol et on la remet en équilibre avec 0 % pour l'essai suivant.

  
L'interféron est élué à la fin de l'étape à
32 % (entre 80 et 90 minutes). Cette matière est homogène, comme déterminé par électrophorèse sur gel

  
 <EMI ID=152.1> 

  
Blue ou en marquant préalablement l'échantillon avec Fluram.

  
On effectue des analyses des amino-acides

  
 <EMI ID=153.1> 

  
sur neuf échantillons séparés comprenant quatre préparations séparées. La composition moyenne des aminoacides est indiquée ci-après avec les valeurs par rapport à la leucine prise arbitrairement comme 22,0. Les résultats sont les suivants :

  

 <EMI ID=154.1> 


  
valeur non corrigée 

  
D'après les divers échantillons préparés par des procédés différents et analysés à différents moments confie décrit ci-dessus dans le présent exemple et dans les exemples précédents, une analyse représen-

  
 <EMI ID=155.1> 

  
fibroblastes homogène en utilisant un hydrolysat de
24 heures dans 6N HCl avec 0,2 % d'acide thioglycolique est la suivante :

  

 <EMI ID=156.1> 


  
* valeur non corrigée 

  
** valeur arbitraire

  
 <EMI ID=157.1> 

  
Forme de dosage uarentérale avec l'interféron de fibroblastes humains

  
On dissout un total de 1,5 mg d'interféron de fibroblastes humains homogène ayant une activité spéci-

  
 <EMI ID=158.1> 

  
 <EMI ID=159.1> 

  
travers un filtre bactériologique et ensuite subdivisée

  
 <EMI ID=160.1> 

  
 <EMI ID=161.1> 

  
ministration parentérale. Les flacons sont de préférence conservés à froid (-2C[deg.]C) avant utilisation. 

- REVENDICATIONS -

  
1 - Interféron de fibroblastes humains sous la forme d'une protéine homogène caractérisé par
(a) une activité spécifique d'environ 4 x 10 unités/mg;
(b) une masse moléculaire apparente d'environ <EMI ID=162.1> 

  
dodécylsulfate de sodium;
(c) la composition suivante en amino-acides <EMI ID=163.1> 

  
 <EMI ID=164.1> 

  

 <EMI ID=165.1> 


  
valeur non corrigée

  
** valeur arbitraire
(d) la séquence partielle suivante d'amino- <EMI ID=166.1>  lécule.

  
2 - Interféron de fibroblastes humains tel

Claims (1)

1. que défini dans la revendication 1 pour le traitement <EMI ID=167.1>

   3 - Un procédé pour la production d'interféron

   <EMI ID=168.1>

   homogène, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes en combinaison :

   A. on fait passer une solution aqueuse d'inter-

   <EMI ID=169.1>

   vers une colonne de chromatographie d'affinité de ma- <EMI ID=170.1>

   on élue l'interféron de la colonne et on obtient cet interféron dans des fractions choisies de l'éluat dans un état de plus grande pureté; et

   B. On fait passer les fractions choisies de l'interféron obtenues dans l'étape A à travers une ou plusieurs colonnes de matrice de silice liée à des groupes d'hydrocarbure dises en équilibre au moyen d'un tampon, dans des conditions de chromatographie en phase

   <EMI ID=171.1>

   étant choisis parmi des groupes cyclohexyle, phényle, diphényle, octyle, octadécyle et. cyanopropyle, de manière à absorber l'interféron sur la colonne et ensuite on élue cet interféron de la colonne avec un gradient d'un mélange acide aqueux tamponné de solvants miscibles avec l'eau et on obtient l'interféron sous la forme d'un pic distinct unique dans des fractions choisies de l'éluat dans l'état d'une protéine homogène.

   4 - Un procédé pour la production d'interféron de fibroblastes humains sous la forme d'une protéine homogène, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes en combinaison :

   A. on fait passer une solution aqueuse d'interféron de fibroblastes humains dans un état impur à travers une colonne de chromatographie d'affinité de manière à absorber l'interféron sur la colonne et ensuite on élue l'interféron de la colonne et on obtient l'interféron dans des portions choisies de l'éluat dans

   un état de plus grande pureté; et

   B. on fait passer les fractions choisies d'interféron obtenues dans l'étape A à travers une ou plu- sieurs colonnes de matrice de silice liée à des groupes d'hydrocarbure mises en équilibre au moyen d'un tampon, dans des conditions de chromatcgrsphie en phase liquide à haute pression, les groupes d'hydrocarbure étant choisis parmi les groupes cyclohexyle, phényle, octyle, octadécyle et cyanopropyle, de manière à absorber l'interféron sur la colonne et ensuite on élue l'intor-

   <EMI ID=172.1>

   aqueux tamponné de solvants miscibles avec l'eau et on obtient l'interféron sous la forme d'un pic distinct unique dans des fractions choisies de l'éluat dans l'état d'uneprotéine homogène.

   5 - Un procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la colonne de chromatographie d'affinité est une colonne de Concanavalin A-Sepharose;

   la chromatographie en phase liquide à haute pression est conduite sur une colonne de matrice de silice liée à des groupes cyclohexyle en utilisant comme éluant une solution pyridine/acide formique/isopropanol/ n-butanol/eau avec des concentrations croissantes de n-butanol et en faisant passer ensuite les fractions actives combinées à travers une colonne de matrice de silice liée à des groupes octyle en utilisant les mêmes conditions d'élution que pour la colonne à groupes cyclohexyle.

   6 - Un procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la composition initiale de l'éluant dans le système de chromatographie en phase liquide à haute pression est la suivante : pyridi ne/acide formique/isopropanol/eau (8:8:20:64, v/v) et la composition finale de l' éluant est la suivante : pyridine/aci-

   <EMI ID=173.1>

   v/v).

   7 - Un procédé selon la revendication 4, ca-

   <EMI ID=174.1>

   finité est une colonne de Blue Dextran-Sepharose; la chromatographie en phase liquide à haute pression est effectuée sur une colonne de matrice de silice liée à des groupes octyle en utilisant comme éluant une solu- <EMI ID=175.1>

   avec des concentrations croissantes de n-butanol.

   <EMI ID=176.1>

   ractérisé en ce que la composition initiale de l'éluant dans le système de chromatographie en phase liquide à haute pression est la suivante : pyridine/acide formique/isopropanol/n-butanol/eau (8:8:20:3,3:60,7, v/v) et la composition finale de l'éluant est la suivante :

   <EMI ID=177.1>

   (8:8:25:20:39, v/v).

   9 - Un procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que les fractions actives combinées éluées de la colonne de matrice de silice liée à des groupes octyle sont rechromatographiées sur une colonne de matrice de silice liée à des groupes cyanopropyle en

   <EMI ID=178.1>

   mique/n-propanol/eau avec des concentrations croissantes de n-propanol.

   10 - Un procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la composition initiale du tampon est la suivante : pyridine/acide formique/eau (8:8:84, v/v) et la composition finale du tampon est la suivante: pyridine/acide for.nique/n-propanol/eau (8:8:40:44, v/v).

   11 - Un procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la composition initiale du tampon dans l'étape de chromatographie en phase liquide à haute pression est la suivante : pyridine/acide for-

   <EMI ID=179.1>

   tion finale du tampon est la suivante : pyridine/acide fornique/isopropanol/n-butanol/eau (8:8:25:20:39, v/v).

   12 - Un procédé selon la revendication 9, caract&#65533;risé en ce que les fractions actives combinées provenant de la colonne do matrice de silice liée à des groupes cyanopropyle sont passées une deuxième fois à travers cette colonne et les fractions actives combi-nées résultant de ce deuxième passage sont passées à travers une colonne de matrice de silice liée à des groupes diphényle.

   13 - Un procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'interféron de fibroblastes humains est récolté à partir d'une préparation exempte de sérum, la colonne de chromatographie d'affinité

   <EMI ID=180.1>

   chromatographie en phase liquide à haute pression sur uns matrice de silice liée à des groupes octyle en utilisant comme éluant un gradient échelonné de n-propanol dans un mélange constant de pyridine/acide formique/eau.

   14 - Un procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que le gradient échelonné de n-pro-

   <EMI ID=181.1>

   <EMI ID=182.1>

   l'interféron est élué entre 80 et.90 minutes.

   15 - Une préparation utilisable pour administration parentérale pour traitement de maladies virale: et nécplastiques caractérisée en ce qu'elle comprend une quantité mineure efficace d'interféron de fibroblastes humains sous la forme d'une protéine homogène et une quantité majeure d'un véhicule pharmaceutique classique pour administration parentérale.

   16 - L'utilisation d'interféron de fibroblastes humains sous la forme d'une protéine homogène dans le traitement de maladies virales et néoplastiques.

   17 - L'interféron de fibroblastes humains sous la forme d'uns protéine homogène préparé par un procédé selon l'une des revendications 3 à 14 ou par un équivalent chimique évident.