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MÉI\'10IRE DESCRIPTIF DÉPOSÉ A L'APPUI D'UNE DEMANOE DE
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BREVET D'INVENTION
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FORME PAR GENEX CORPOKATION. pour Synthèse d'oligonucléoLides en phase. solide.
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Demande de brevet aux Etats-Unis d'A6rlque nO 409. 935 du 20 août 1982 en aveur de K. AYARAMAN.
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La présente invention concerne ur. procede pour synthétiser des désoxynbo-oligonuclectices et r lr, -., -rJ11gonucléotldes sur un support SC : l. jr nbo-' ! igonucléotides sur un support srid..
Au c.'. urs-'=. derni & res ann e, ls scientifiques ont m) s au po\n de procèdes pour synthétiser des oi\nonuclROt. ; des correspondant a des séquences définie eu ; contiennent cr.'jr manipuler l'Z'X et l'AF'.
Par e\eTDle, des fraqn. eni ? synthétiques c'AD*'. d'uhe dimer. sjn de 10 à nes peuvent être ssemolés 10 è,, re s-semrlés
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les uns aux autres suivant des techniques enzymatiques spécifiques pour former des gènes entiers ou bien peuvent servir de sondespour l'identification d'une séquence d'ADN intéressante. Des chaînes d'oligonucléotides synthétiques peuvent servir de liens pour aider à unir ensemble des fragments d'ADN ou pour construire des mo- lécul 's d'ADN recombinant.
Des oligonucléotides ont été synthétisés pour la première fois pai Khorana et al. à l'aide d'une svn- thèse de dies@r, J. mo-c Biol. 72 : 251 (1972). Narang et a'., J. Biolcgical Chemistry 250 : 4592 (1975) ont développé ce procédé en mettant au point la synthèse de @. Ces procédés anciens sont difficiles et très
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] t-r. ts. Il faut beaucoup de temps pour assembler avec su'c-. o. s nucléotides les uns aux autres pour prépat7' rer !-s réactifs nécessaires à la condensation et pour L"j'i :' : f'-r les produits après chaque stdde de condensation, de même que pour isoler et purifier la séquence finale @ nucléotides.
Letsinger et al., J. Am. Chem. Society ont pelfectionné les procédés de synthèse des oligonucléo- tedes en découvrant le procédé des triesters phospho- reux. Cette voie par les triesters phosphoreux a été uliérieurement étandue à la synthèse des oligonucléoti- @ en phase solide. Les procédés de synthèse en phase
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F. r] id ou sur"support polymère"sont avantageux parce e lls facalitent la séraration et Ja purlfication. qui cet un colloïde rigide non gon- !...' :''' L : fréquemment ut : ljsé comme support. Dans le ;.'rc.."é-iL en-phase snc-, un nucléo] c protégé est mis un réagir a ver un ager ce phosphitylatic. r. comme la médE '¯11- tan : es, lorophosphinc-.
Lr phosphomc'nochlorjdi'e de prot-nucj sjdc résujtant es ! alors miS à réaoïr avec un second nucléosice protégé fixé sur un support. Une oxydâticr ménagée ultérieure au moyen d'iode dans le tetra-
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hydrofuranne, la lutidine et l'eau convertit le phos- phitc en phosphate. Bien que ce procède soit beaucoup plu rapide que ceax quil'ont précédé, sen inconvénient est qu'il se forme une quantité considérable de l'isomère 3'-3', même lorsque la réaction est exécutée à -78 C et lorsque le rapport entre le nucléoside et l'agent de phosphitylation est étroitement ajusté. Un autre inconvénient est la qrande sensibilité des intermédiaires
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réactifs à l'hydrolyse et à l'oxydation par l'air.
Caruthers et al., J. Am. Chem. Soc. 103 : 3185-3191 (1981) ont modifié ce mode opératoire en in- , roduisant un traduisant un"tétrazolld"dérivé d'un phosphite de nu- cléoside. Néanmoins. cet intermédiaire n'est pas très stable et la préparation du dérivé introduit une opte- ration supplémentaire qui doit être exécutée à -78 C.
Caruthers et al., Tetr2hedron Letters 2 ?, 1859-
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1852 -"ondamentai 1852 (1981) ont également modifié le procédé fondamental de manière que la méthoxydichlorophosphine, qui est l'agent de phosphitylai0n, soit convertie en un dérivé N,N'-dialcoylaminé qui donne naissance à un "phosphite
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de nucléoside"relativerent stable lors de la réac : ti,.. avec un nucléoside. Le produit est ensuite traité au
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moyen de qel de sjJi e portant u. i nucléosije, en présence di7. t !-a*., Ole- : o, 10-, Cl-Li, - C E ! rr") d ep 6-r ,-, r,--r, r () c',) r & u de t '. ra : ole. Rien que ce f. ode opérât -re procure un ir.'. ermediaire d'une puF grande srab'. litr' eue précédem- 5 ment, c-L avjint. iqc es compense p,r la er. teur de prt is e-tir, i Il est donc re.'-.
Ce' intëreppa'de metrr. 'j p''. r. r'-ocede pr . rheiser ur, o] ; : r. u-'le -'i. iF r > > -oCt Jé r,, > , < S. r, t-; t 1S. Iir..]], t'i-, U sl t > < t l H. ; r j. i support scidf q. i. soit 'elatt'.'-. er. t s : c'le cL [, a 1 r. ver, I e U coj ri execuLC ;' et ui évite es ir, co ! T.'er'e :'. tp ; rdi- ..-''F c.-de . Lri :''eser'. !. e ir vent. or.- ;...-. rp r' :' . ;'t' < : :'). Tje u pon''ur : procède s\"'\-en ph. jse solide des cli-jonucléûtides qu ; puisse cirr execu' tii.-' ; erf ! ef'. t et ec-' :'.'. Tiueerit et q'..''e j ;. cxt Ct nr. t ^t t ueim, ent es
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produit stable.
La Demanderesse a en effet découvert que des
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ol 1, ollgonucléotides peuvent être synthétisés sur un support solide de façon aisée par un procédé suivant lequel on fait réagir le support solide un aqent de phosphi- tylation et ensuite avec le nucléoside. Ceci fait la différence avec les procédés exis ants suivant lesquels on fait réaqir le nucléoside avec l'aqent de phosphi- tylation et ensuite avec le support.
La présente invention a pour objet un procédé pour synthétiser des oliqonucléotides sur un support en phase solide, principalement le gel de silice. Un nu- cléoside est condensé sur le support en phase solide par son radical 3'-hydroxyle. Le radical S'-hydroxyle du nucléoside est protégé par un radical protecteur.
Le radical protecteur est éliminé et le radical 5'-hydroxyle libre est mis à réagir avec un agent de phosphi- tylation bifonctionnel. Le support est ensuite mis à réagir avec un nucléoside protégé. Les radicaux phosphite sont oxydés en radicaux phosphates et le radical protégeant le radical S'-hydroxyle est éliminé du second nucléoside. L'extension de chaîne est alors exécutée suivant le même cycle de réactions : réaction avec l'agent de phpsphitylation, réaction avec un autre nucléoside et oxydation, Au terme de la synthèse, l'oliqonucléoside est détaché du support, débarrassé des radicaux
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ac : ?] r. c'' : c et purifié.
Ct procédé permet de synthétiser des oligo- '. uc)''-c. 7jj-s des tempéra mres modérées. La synthèse 1-, modérées- [, a peut 'tte ffctuée dans un récipient un. j'jc et s? préte innune conduiteautomatisée.plus, les 'éactifs p uvent trc utilisés en qrand excès et être récupérés tjisémc-nt après la réaction.
Suivant l'invention, des cllgonucléotides peuvent être synthétisés sur un support en phase solide.
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Aux fins de l'invention, par "oligonucléotides", il convient d'entendre tant les ribo-olioonucléotides que les désoxyribo-oligonucléotides.
Au premier stade du procédé de l'invention, un nucléoside est condensé sur un support solide. En rèqle générale, un support solide qui peut s'imprégner par diffusion libre des molécules et qui n'absorbe pas irréversiblement les réactifs convient comme support pour le procédé de l'invention. Un support préféré est le qel de silice.
La condensation se fait entre le radical 3'-hydroxyle du nucléoside ec le support tandis que le radical S'-hydroxyle est protégé par un radical protecteur tel qu'un radical monométhoxvtrityle ou diméthoxytrityle, la préférence étant donnée au radical diméthoxytrityle. Ce radical protecteur est éliminé et le nucléoside est mis à réagir avec un agent de phosphitylation bifonctionnel pour la formation d'un phosphomonochloridite de nucléoside fixé sur le support.
Un phosphodichloridite d'alcoyle ou d'aryle quelconque convient comme agent de phosphitylation, la préférence étant donnée à la méthoxydichlorophosphine.
Cet agent de phosphitylation bifonctionnel peut être additionné directement sur le nucléoside ou bien peut être d'abord modifié par conversion en un dérivé de tétrazole. La modification de l'agent je phosphitylation de cette façon peut empêcher la formation possible d'une réticulation 5'-5' entre deux chaînes d'oliqoncléotides voisines.
Cette réaculation n'est pas considérée comme étdnt un inconvénient grave lorsque l'incorporation du nucléoside su'1 support
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solide est modérément fc'iblc- (environ 3 (n is''q', mais peut dveir notable lorsque l'inco r'') ra" : n des nuc Lé,-Ds ides d, 7-@,-i c-ri, pl, i.- ; iti-rt c. :, 1-1 c ) -,, * :. r s 1 ,-1 des nucléosides devient plus iportnto. . i conversion de l'agent de ph0Sphltlall n peut être er"L-C !. uée SOit par réaction de celui-ci directement avec le étrazole
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avant l'addition sur le nucléoside, soit par addition du tétrazole sur le nucléoside avant la réaction du nucléoside avec l'agent de phosphitylation.
Le rapport molaire du nucléoside à l'agent de phosphitylation est généralement d'environ 1 : 10 à environ 1 : 20 et de préférence d'environ 1 : 15. Le mélange de réaction peut être agité vivemen', centri- fugé et débarrassé de l'excès de phosphodichloridite.
La durée totale de réaction s'échelonne généralement d'environ 2 à environ 10 minutes.
Lorsque l'agent de phosphitylation est mo- difié par le tétrazole, le rapport molaire de l'agpnt de phosphitylation au tétrazole est généralement d'en- viron 1 : 2 à environ 1 : 10 et de préférence d'environ
1 : 3. Les conditions de réaction pour cette forme de réalisation de l'invention comprennent généralement une durée de réaction totale d'environ 15 minutes à une température d'environ ooc.
Après le traitement au moyen de l'aient de phosphitylation, le support est mis à réagir avec un excès d'un second nucléoside. La réaction est généra- lement poursuivie pendant environ 10 à 15 minutes à environ 27 C. Après la réaction avec le second nucléo- side. les liaisons phosphite dans le nucléotide sont oxydées en phosphate suivant les techniques habituelles, par exemple au moyen d'iode dans une solution aqueuse de tétrahydrofuranne et de lutldlne. Un rapport préféré du tétrahydrofuranne à 1, :, lutldlne et à l'eau est d'environ 2 : 1 : 1.
Le radical protecteur du second nucléoside est ensuite éliminé. Le dire. ère peut être détaché du support, débarrassé des radicaux de blocoge et purifié si la chose est déstrée. Le rendement de cette réaction est normalement d'env1ron 95.
L'extension de chaîne peut être exécutée sui-
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vant le même cycle de réactions indiqué ci-dessus : réaction de nucléoside avec l'agent de phosphitylation, réacticr. avec un autre nucléoside et oxydation des radicaux phosphite. Au terme de la synthèse, l'oligonucléotide. est avantageusement détaché du support, débarrassé des radicaux de blocage et purifié.
La centrifugation intermédiaire pour éliminer l'excès d'agent de phosphitylation peut introduire de l'humidité dans le mélange de réaction. La Demanderesse a découvert que la centrifugation du mélange de réaction contenant la silice et 1 agent de phosphitylation n'est pas nécessaire pour assurer un rendement élevé en l'oli- gonucléotide final recherché. Le procédé peut être exécuté comme indiqué ci-dessus avec omission de la centrifugation. Ensuite, après que l'oligonucléotide a éé oxydé suivant une technique d'oxydation classique, le support peut être lavé soigneusement à plusieurs reprises
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avec des solvants organiques.
Dans une forme de réali-
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sation préférée, le support est lavé avec du tctr'-thydrofuranne aqueux à 50%, puis avec du tétrahydrofur.'. nnf c*. enfin avec de l'éther. Comme précédemmert, le rer-Jement en le dimëre désire est d'environ 90 à 100%. Ces rendements élevés indiquent que même si un excès de l'agent de phosphltylation est présent, la condensation 5'-3' di-sirée peut être assuré au moyen d'un excès ce r-. ucléoside. De plus, l'analyse par chromatographie & r. couche mince du liquide surnageant des mélangea de réac'on suggère que le nucléoside ajouté reste intact pc''- u moins environ 60% et peut donc être récupéré'--''sé unt.-nouvelle fois si la chcse est. désirée.
Comme indiqué ci-dessus, ce procédé. : : :'.. u'' certain nombre d'avantages sui les procédés c'r. : -'.. li n'exige aucun composé de depars f rmé au préalar'.., r-u : être exécuté à une température beaucoup plu modérée qu'il n'était précède, nent possible et peut être,
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tué dans un récipient unique. Il se prête bien à une
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conduite automatisée. Tant les nbo-oligonucléc.tl.des'''- que les désoxyribo-oligonucléotides peuvent être synthétisés de la sorte. Enfin, l'excès de nucléoside peut être récupéré après achèvement de la réaction, ce qui rend le procédé fort économique.
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lustrent nc, n li-nitaLes exemples suivants illustrent non limita- tivemer. l le procédé de l'invention.
EXEMPLE 1Préparation d'un dimère par réaction directe avec un agent de phosphitylation
On fait réagir de la silice (Vydak TP, 100 mg) portant de la désoxythymidine (4 moles) avec de la méthoxydichlorophosphine (60 moles) dans de la pyrldine anhydre (0, 2 mol) a la température ambiante. On agite
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vivement le mélange de réaction et on le centrifuge (la durée toLLe de réaction y compris la centrifuga- 1 tion étant de 2 minutes a la température ambiante). On sépare le liquide surnageant et on ajoute un excès décuple de 5'-diméthoxytritylcytidine dans de la pyri- . vane (0 2 ml) à la silice. Après 10 minutes à la température ambiante, on oxyde le mélange de réaction au moyen d'iode dans un mélange tétrahydrofuranne/lutidine/ eau (2 : 1 : 1).
Le rendement de la réaction, estimé par élimination des radicaux trltyle et par chrcn-dtographie liquide sous haute pression après suppression du hioca. je se révèle être de 95%.
EXEMPLE2-
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'-'r. ration d'un dimère par réaction directe a v ? c u') i t v nu de phosphitviation i o n On ré-io r & agir de la siJicc (Vydnk TP, C mg) sortant de la désoxythymidine ( urrc. j. esi avec de la réthcxydlchlorophosphlne (60/Lmnls) dans la pyridine (0, 2 ml) pendant 10 minutes à ooc ou pendant 1 à 2 minuter à la température ambiante. On ajoute ensuite de
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la 5'-diméthoxytratylcytidine (200 moles) dans de la
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pyridine (0, 2 à 0, 25 ml) au mélange de réaction, sans centrifugation. Après 10 minutes à la température ambiante, on exécute l'oxydatjon au moyen d'iode dans un mélange tétrarydrofuranne/lutidine/eau (2 : l : i).
On lave la silice ensuite soigneusement avec du tétrahy- drofuranne aqueux à 50%, du tétrahydrofuranne et enfin de l'éther. On estime que le rendement est de 95% d'après l'absorption du cation trityle à 498 r. m.
Le rendement est également confirmé par chromatogra- phie liquide sous haute pression avec inversion de
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phase après suppression du blocage (12 à 16 heures 50 C dansai'hydroxyde d'ammonium concentre, puis réac- " tion avec l"cide acétique à 80%). Pendant l'analyse par chromatogrà tie liqulde sous haute pression, on Ill recueillir le pic ddimère dont le spectre UV se révèle " bien concordant avec le spectre tracé par ordinateur.
EXEMPLE3-
On prépare d'autres dimères par le procédé
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- "de l'exemple 2. Le tableau ci-apr'B-j., ndiqu le rende-
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ment en chaque dimere isolé. TABLEAU
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<tb>
<tb> Composé <SEP> Rendement(%)
<tb> d-CpC <SEP> 96
<tb> d-GpT <SEP> 87
<tb> d-CpT <SEP> 95
<tb> d-GpG <SEP> 98
<tb> d-CpG <SEP> 84
<tb> d-GpA <SEP> 81
<tb>
EXEMPLE4-
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Synthèse du dirrrc C-T au rroyer. a'un agent de pcspirylation bifonclonnel notifié On sourr-t de la sIlIce (Vydac T ?, 100) r. g portar, t de la N-ben7oyldéscxycytidine(4,22-uoles) et du tétrazole (630/Imoles) à la distillation azéotropique
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r. vec de la pyndine. On fait réagir la silice et le tétrazole avec d'1rréthoxydichlorophc.sphi- (63, umoles) dans de la pyndine (0, 3 ml) pendant 10 mlnutes a 0 C.
On ajcute ensulte de la 5'-diméthoxyt :. tylthymidinL' (210 umoles) au mélange de réaction. Après 15 minutes d Ja température amblante, on ox\de le mélange de reaction avec de l'iode dans un mélange tétrahydrofuranne./ ]tldlne/eau (2 : 1 : 1). On lave la silice soigneusement "ce avec du tétrahydrofuranne aqueux à 50, du tétrahydrfuranne et enfin de l'éther. D'après l'absorption des ru calions trityle à 498 nr.), on évalue que le-endemer. t est de 98%.
EXEMPLE 5S\r. ihse d'un pentam. l'aide d'un aent de phosphlI ëi7, erj*, d-pl) csplitylation modifié On soumet de la silice (VyddC TP, 100 mg'' portant de la N-ber. ? oyldésoxycytidine (4, 2, umoles) et du étrazole (630umole) à la distillation a--éotloiplf je avec de la pyi i-. On fait réacir la silice et "r('':razoJeensuite a'. ec une quantité 15 fois supéneu- ; t-ie methoxydlchlorphosphlne (63 moles) dans de a 1 p. ri dîne (0, 3 ml) pendant 10 minutes à O"C. On ajoute au land, de t'éact-on une quantité cinquante fois ui-e Li e5 11-1 f7--c, x 1 t h i-, i 1 n t-d 1-s d t :, 1 b 7..-'"jejre de 5'-dimé'hxyntylthymidine dans de la p ; racine (0, 3 ml).
Apres 15 minutes à la température
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on c-x6-cut E, I'oxydati au d'i ode ia--c ; U rr. r-] F ; nçe tëtrhvr ruranne/luicjne'eau (2 : 1 ;. r. !.'.'.') 7' Je : sic ". su't'' co & cn i'cx=mrl & "Or. c. : : jf-s radic-u :'. ir'. vie- pnr tfc : ; or. n"e-f '-i'"''rclorat] que n 5'-citr. s i cr : ; ; c. f'c']. n-.
. :'.'-'... sic K' : r. 'jse.'* ! er,''L nu r''. l''. ftr. c.
0-. r ;.-t J"vc pour r. r.-. I. r.- :-- ; -j cn- -c ; r a c-,, u L c r i-c e i, n . q ' I < s & quencc :'-r. rrre T-T-'J-J-C. Or r ;,- ; r'. c'r. J rapport des réactif F constant pnd'int to t la s\r't h - e ft on ajuste je vcl ume de pyr] d ; .. :' sui a t s
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nécessités.
Le rendement d'ensemble pour la synthèse du pentamère T-T-T-T-C est de 53%.
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EXEMPLE 6On synthétise l'octamère C-A-A-G-C-T--G suivant le procédé de l'exemple 5 avec un rendement d'ensemble de 24%.
EXEMPLE 7On soumet de la silice (Vydac TP, 100 mg) portant de la N-isobutyldéscxyguanoslne (2, 9/moles) et une quantité 4Sfois supérieure dE tétrazole (130 ùmo- les) à la distillation azéotropique avec de la pyridine.
On ajoute de la pyrldlne anhydre (CI, 1 ml) au mélange de sill. e et de tétrazole avant de faire régir la silice avec une quantité 15 Cois supérieure de méthoxydichlorophosphine (43 moles) pendant 10 minutes à 0 C. On ajoute de la 5'-diméthoxytrityl-N-benzoyldésoxyadénosine dans 0, 2 ml de pyridine. Après 15 minutes a la température ambiante, on exécute l'oxydation au moyen d'iode dans un mélange tétrahydrofuranne/lutidine/eau (2 : 1 : 1).
On lave la silice ensuite avec du tétrahydrofuranne aqueux à 50%, du tétrahydrofuranns et de l'éther.
Sur base de l'absorption du cation trityle 3 498 nm,
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c, n estime que le rendement est d'environ EXEMPLE 8-
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Or. fait réagir de la silice ydac T 0 mg' de la N--i 2 9 p) r'an de la N-isobutyryldesoxyquanosine'. 2. 9 : :" jes, aveL 0, 2 ml d-pyridin'n : nat de j r. ëhcx'dLcnl' :rophosphj. np 43, 5 : n. l#'p ! e ou rétrzl-3C jl / pendant 15 minutes a 0"". Or. ajc-ure T-s'jte de 1 f''diméthoxs trits l-N-ber. zf."i--, ss ne c-,-e r dine u meln de réac :''".. crs i ;"..'.-s à la t E. m r à l r et on le lave comme dan ? les exemples preedets. Le rendement estime est d'environ 100%.
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EXEMPLE 9Synthèse de A-T-G-C--C-A-C-A-A-G-A-G On sèche de la silice (Vydak TP, 500 mg) portant de la N-isobutyryldésoxyguanosine (14, 5/moles) par lavage avec de la pyridine anhydre (2xlO ml) et de éther diéthylique anhydre (10 ml). On sèche la sil : ce davantage au dessiccateur à vide jusqu'au moment de l'utilisation.
On dissout en un excès de 45 fois du tétrazole (652 moles) dans 1 ml de pyridine à 0 C. On ajoute en un excès de 15 fois de la méthoxydichlorophosphlne (217 moles) à la solution de t8trazole dans la pyridine, puis on ajoute la solution à la silice. Après 15 minutes à oac, on ajoute en un excès de 50 fois de la 5'-O- (diméthoxytrityl)-N-benzoyldésoxyadénosine dans 1,0 ml de pyridine. On poursuit la réaction pendant 15 minutes à la température ambiante, puis on oxyde le mélange de réaction et on le lave comme dans les exemples précédents.
On fait réagir la silice avec de l'acide trichloroacétique à 5% dans du cnloroforme pour éliminer les radicaux diméthoxytrityle. Après lavage au chloroforme, à la pyridine anhydre et à l'éther anhydre, la solution est prêt, pour l'addition du nucléoside suivant.
On ajoute les 11 nucléosides suivants t-"acte- ment do la façon indiquée ci-dessus. On maintient les quantités et concentrations des réactifs aux mêmes valeurs pendar. t toute la synthèse.
On évalue qualitativement le rendement après
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chaoue ciC'ditlon sur base de la colora' : en cranoe induite 'r] e Tr5 : *e-Tem avc l'cte iricnloràcéicue 5%.
.'a'. 5''eus Jes cas, le renae'c'nt rparit exlcnt.
Cn mesure quantitativement le-ren3c-rcr : t en nisant réagir une quantité xoctement psée" :--- silice avec 2% d'acide benzènesu] f (,-r 3'je dans l'acéi'r. trile et en observant les absorptions des cations : r tvle
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à 498 nm. Le rendement d'ensemble des différents stades est indiqué ci-après :
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<tb>
<tb> Longueur <SEP> de <SEP> l'oligonucléotide <SEP> Rendement <SEP> (%)
<tb> 2 <SEP> 100
<tb> 5 <SEP> 90
<tb> 9 <SEP> 78-83
<tb> l3 <SEP> 60-70
<tb>