IT8367877A1

IT8367877A1 - Procedimento per la sintesi di oligonucleotidi su di un sopporto solido

Info

Publication number: IT8367877A1
Application number: ITTO1983A067877A
Authority: IT
Original assignee: Genex Corp
Priority date: 1982-08-20
Filing date: 1983-08-19
Publication date: 1985-02-19
Also published as: AU1694583A; FR2531963A1; IT8367877A0; JPS5953500A; IT1162935B; NL8302921A; BE897562A; IL69196A0; GB8322519D0; GB2125798A; DE3326366A1

Description

DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo:

"Procedimento per la sintesi di oligonucleotidi su diun sopporto solido"

RIASSUNTO

E' descritto un procedimento per la sintesi di deso ssiribooligonucleotidi e di ribooligonucleotidi su un sopporto solido.

CAMPO TECNICO

La presente invenzione si riferisce ad un procedimento per la sintesi di desossiribooligonucleotidi e di ribooligonucleotidi su un sopporto solido.

TECNICA DI SFONDO

In anni recenti gli scienziati hanno sviluppato procedimenti per sintetizzare oligonucleotidi di sequenze definite, che possono essere usati per manipolare DNA e RNA. Ad esempio, pezzi sintetici di DNA delle dimensioni di 10 a 14 unit? possono essere uniti insieme mediante tecniche enzimatiche specifiche per formare geni completi oppure possono servire come sonde per contribuire alla identificazione di una sequenza di DNA desiderata. Catene di oligonucleotidi sintetici possono servire'come collegamenti per aiutare ad unire insieme pezzi di DNA oppure a costruire molecole di DNA ricombinanti.

Gli oligonucleotidi sono stati per la prima volta preparati sinteticamente da Xhorana et al. per mezzo di una sintesi di diestere, J. Molec. Biol. 72:251 (1972). Narang et al., J. Biological Chem.istry 250:4532 (1975), hanno ampliato questa procedura con lo sviluppo di una sintesi di triestere. Questi primi procedimenti erano difficili e molto lunghi. Era necessario molto tempo per unire insieme con successo dei nucleotidi, preparare reagenti per la condensazione e purificare i prodotti dopo ogni stadio di condensazione ed isolare e purificare la sequenza finale di nucleotidi.

Letsinger et al., J. Am. Chem. Society 97:3278-79 (1975), hanno migliorato i procedimenti per la sintesi di olinucleotidi con la scoperta della procedura del "triestere fosfito". Questa via attraverso il triestere fosfito ? stata in seguito estesa alla sintesi di oligonucleotidi in fase solida. I procedimenti di sintesi in fase solida o "sopporto polimerico" sono vantaggiosi in quanto facilitano gli stadi di separazione e purificazione. Come sopporto .? spesso impiegato gel di silice, un colloide rigido, non rigonfiabile. Nella procedura in fase solida un nucleoside protetto viene fatto reagire con un agente di fosfitilazione quale metossidiclorofosfina. Il risultante nucleoside-fosfomonocloridito viene poi fatto reagire con un secondo nucleoside protetto fissato ad un sopporto. Successiva.T.ente una blanda ossidazione con l'impiego di iodio in tetraidrofurano, lutidina ed acqua converte il fosfito a fosfato. Sebbene questo procedimento sia molto pi? rapido di quelli che lo hanno preceduto, si forma una notevole quantit? del 3'-3'-isomero, anche quando la reazione ? effettuata a -78?C ed il rapporto tra nucleoside ed agente di fosfitilazione ? accuratamente controllato. Un altro inconveniente ? costituito dall'instabilit? degli intermedi reattivi, all'idrolisi ed all?ossidazione mediante l'aria.

Caruthers et al., J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191 (1981), hanno modificato questa procedura introducendo un derivato "tetrazolidico1, del nucleoside-fosfito. Questo intermedio, tuttavia, non ? molto stabile e la preparazione del derivato introduce uno stadio supplementare da effettuarsi a -78?C.

Caruthers et al., Tetrahedron Letters 22, 1S59-S2 (1981), hanno anche modificato il procedimento base in modo che la metossidiclorofosfina, l'agente di fosfitilazione, viene convertita in un N,N'-dialchilammino-derivat.o, che produce un "nucleoside-fosfito" abbastanza stabile quanto ? trattato con un nucleoside. Il prodotto viene poi trattato con gel di silice portante un nucleoside in presenza di tetrazolo. Sebbene questa procedura provveda un intermedio con maggiore stabilit? che precedentemente, questo vantaggio ? neutralizzato dal procedimento,richiedente molto tempo,di preparazione del materiale di partenza.

Cos?, vi ? continua necessit? di una procedura per sintetizzare un oligonucleotide su un sopporto solido, che sia relativamente semplice e facile da eseguire e che eviti i problemi descritti precedentemente. E', pertanto, uno scopo della presente invenzione di sviluppare un procedimento per la sintesi in fase solida di oligonucleotidi, che possa essere effettuato facilmente ed economicamente e provveda un prodotto stabile.

SOMMARIO DELL'INVENZIONE

E' stato trovato che oligonucleotidi possono essere sintetizzati su un sopporto solido, facilmente, mediante un procedimento che comporta il trattamento del sopporto solido con un agente di fosfitilazione seguito da trattamento con il nucleoside. Ci? ? in contrasto con i. procedimenti in vigore, che comportano il trattamento del nucleoside con l'agente di fosfitilazione seguito da trattamento con il sopporto.

La presente invenzione si riferisce ad un nuovo procedi,mento per la sintesi di oligonucleotidi su un sopporto in fase solida, principalmente gel di silice. Un nucleoside viene accoppiato al sopporto in fase solida in corrispondenza del suo gruppo 3'-ossidrilico. Il gruppo 5'-ossidrilico del nucleoside viene protetto mediante un gruppo protettivo. Il gruppo protettivo viene eliminato ed il S'-ossidrile libero reagisce con un agente di fosfitilazione bifunzionale. Il sopporto viene poi trattato con un nucleoside protetto. I gruppi fosfito vengono ossidati a fosfati ed il gruppo 5'-ossidrilprotettivo viene eliminato dal secondo nucleoside. L'estensione della catena viene poi effettuata mediante lo stesso ciclo di reazioni: trattamento con agente di fosfitilazione, trattamento con un altro nucleoside ed ossidazione. Al termine della sintesi, 1?oligonucleot.ide viene scisso dal sopporto, sbloccato e purificato.

Con questa procedura, gli oligonucleotidi possono essere sintetizzati a temperature moderate. La sintesi pu? avere luogo in un singolo recipiente ed ? facilmente adattabile ad un'automazione. Inoltre, un grande eccesso di materiali reagenti pu? essere usato e facilmente ricuperato dopo la reazione.

DESCRIZIONE PARTICOLAREGGIATA DELL'INVENZIONE

Secondo la presente invenzione, oligonucleotidi possono essere sintetizzati su un sopporto in fase solida.

Quale qui impiegato, il termine oligonucleotide si intende includa tanto i ribooligonucleotidi quanto i desossiribooligonucleotidi.

Mei primi stadi del procedimento secondo la presente invenzione, un nucleoside viene accoppiato ad un sopporto solido. Come regola generale, nel procedimento secondo la presente invenzione, come sopporto pu? essere impiegato un sopporto solido che consenta alle molecole di diffondervisi liberamente e che non assorba i reagenti in modo irreversibile. Un sopporto preferito ? il gel di silice. L'accoppiamento ha luogo tra il gruppo 3'-ossidrilico del nucleoside ed il sopporto; il gruppo 5'-ossidrilico viene protetto mediante un gruppo protettivo quale un gruppo monometossitrifenilmetilico o dimetossitrifenilmetilico, il gruppo dimetossitrifenilmetilico essendo preferito. Questo gruppo protettivo viene eliminato ed il nucleoside viene trattato con un agente di fosfitilazione bifunzionale per formare un nucleoside-fosfomonocloridito fissato al sopporto. Come agente di fosfitilazione pu? essere usato un qualsiasi alchil- od aril-fosfodicloridito, la metossidiclorofosfina essendo preferita.

Questo agente di fosfitilazione bifunzionale pu? essere aggiunto direttamente al nucleoside oppure pu? 'essere prima modificato mediante conversione in un derivato tetrazolico. Questa modificazione dell'agente di fosfitilazione pu? impedire la possibile formazione di reticolazione 5'-5' tra due catene di oligonucleotide adiacenti. Tale reticolazione non si ritiene sia un problema grave quando l'incorporazione di nucleosidi sul sopporto solido ? moderatamente piccola (circa 30 umoli/g) , ma pu? diventare rilevante quando l'incorporazione di nucleosidi diventa maggiore. La conversione dell'agente di fosfitilazione pu? essere effettuata facendolo reagire direttamente con il tetrazolo prima che venga aggiunto al nucleoside oppure aggiungendo il tetrazolo al nucleoside prima di trattare il nucleoside con l'agente di fosfitilazione.

Il rapporto molare del nucleoside all'agente di fosfitilazione ? generalmente compreso tra circa 1:10 e circa 1:20, preferibilmente circa 1:15. La miscela di reazione pu? essere scossa rapidamente e centrifugata ed il fosfodiclori.dito in eccesso eliminato. Il tempo di reazione totale ? generalmente situato tra circa 2 e circa 10 minuti.

Quando l'agente di fosfitilazione viene modificato con tetrazolo, il rapporto molare dell'agente di fosfitilazione al tetrazolo ? generalmente compreso tra circa 1:2 e circa 1:10, preferibilmente circa 1:3. Le condizioni di reazione per questa forma di attuazione della presente invenzione comprendono generalmente un tempo di reazione totale di circa 15 minuti, ad una temperatura di circa 0?C.

Dopo il trattamento con l'agente di fosfitilazione, il sopporto viene fatto reagire con un eccesso di un secondo nucleoside. La reazione ? generalmente lasciata procedere per circa 10 a 15 minuti, a circa 27?C. Dopo la reazione con il secondo nucleoside, i legami fosfito internucle'otidici vengono ossidati a fosfati secondo le tecniche classiche come, ad es?mpio, con iodio in una soluzione acquosa di tetraidrofurano e lutidina. Un rapporto preferito di tetraidrofurano a lutidina ad acqua ? circa 2:1:1.

Il gruppo protettivo del secondo nucleoside viene poi eliminato. Il dimero pu? essere scisso dal sopporto, sbloccato e purificato, se si desidera. La resa di questa reazione ? tipicamente circa 95%.

L'estensione della catena pu? essere effettuata seguendo lo stesso ciclo di reazioni indicato in quanto precede: trattamento del nucleoside con agente di fosfitilazione, trattamento con un altro nucleoside ed ossidazione dei gruppi fosfito. Al termine della sintesi; l'nligonucleotide viene vantaggiosamente scisso dal sopporto, sbloccato e purificato.

Lo stadio di centrifugazione intermedio per eliminare l'agente di fosfitilaz.ione in eccesso pu? introdurre umidit? nella miscela di reazione. E' stato trovato che la centrifugazione della miscela di reazione contenente la silice e l'agente di fosfitilazione non ? necessaria per assicurare rese elevate dell'oligonucleotide finale desiderato. La procedura pu? essere effettuata come indicato precedentemente, omettendo lo stadio di centrifugazione. Poi, dopo che 1'oligonucleotide ? stato ossidato mediante una tecnica classica di ossidazione, il sopporto pu? essere lavato a fondo pi? volte con solventi organici. In una forma di attuazione preferita, il sopporto viene lavato con tetraidrofurano acquoso al 50%, seguito da tetraidrofurano ed infine con etere. Come precedentemente, la resa del dimero desiderato ? circa 90 a 100%. Queste rese elevate indicano che anche se ? presente un eccesso dell'agente di fosfitilazione, l'accoppiamento desiderato 5'?3' pu? essere ottenuto impiegando un eccesso di nucleoside. Inoltre, l'analisi mediante cromatografia in strato sottile (TLC) dello strato sovrastante ottenuto dalle miscele di reazione, suggerisce che almeno circa 80? del nucleoside aggiunto rimane intatto e, volendo, pu? pertanto essere ricuperato e reimpiegato.

Come indicato precedentemente, vi sono pi? vani-aggi. in questa procedura rispetto a quelle secondo la tecnica anteriore. La procedura non richiede alcun materiale di partenza preformato, pu? essere effettuata a temperature assai pi? moderate di quanto anteriormente possibile e pu? avere luogo in un singolo recipiente. E' facilmente adattabile per l'automazione, liediante questo procedimento possono essere sintetizzati tanto ribooligonucleotidi quanto desossiribooligonucleot.idi. Infine, il nucleoside in eccesso pu? essere ricuperato dopo che la reazione ? stata effettuata, ci? che rende questo procedimento molto economico.

Gli esempi seguenti illustrano .il procedimento secondo la presente invenzione, ma non sono destinati a limitarla.

Esempio 1

Preparazione di dimero mediante trattamento diretto con agente di fosfitilazione Silice (Vydak TP, 100 mg) portante desossitimidina (4 umoli) viene trattata con metossidiclorofosfina (60 unoli) in piridina anidra {0,2 mi) a temperatura ambiente. La miscela di reazione viene scossa rapidamente e centrifugata (il tempo di reazione totale, inclusa la centrifugazione, ? di 2 minuti a temperatura ambiente). Lo strato sovrastante viene eliminato ed alla silice viene aggiunto un eccesso di 10 volte di 5'-dimetossitrifeniImetilcifidina in piridina (0,2 mi). Dopo 10' a temperatura ambiente, la miscela di,reazione viene ossidata con iodio in miscela tetraidrofurano/lutidina/acqua (2:1:1). La resa della reazione, quale valutata mediante eliminazione del gruppo trifenilmetilico e la cromatografia in fase liquida ad alta pressione (HPLC) dopo sbloccaggio, risulta essere 95%

Esempio 2

Preparazione del dimero mediante trattamento diretto con agente di fosfitilazione Silice (Vydak TP, 100 mg) portante desossitimidina (4 umoli) viene trattata con metossidiclorofosfina (60 umoli) in piridina (0,2 mi) per 10' a 0?C oppure per 1-2 minuti a temperatura ambiente. Alla miscela di reazione viene poi aggiunta, senza centrifugazione, 5'-dimetossitrifenilmetilcitid?na (200 umoli) in piridina (0,2 a 0,25 mi). Dopo 10' a temperatura ambiente, viene effettuata l?ossidazione con iodio in tetraidrofurano/lutidina/acqua (2:1:1). La silice viene poi lavata a fondo con tetraidrofurano acquoso al 50%, tetraidrofurano ed infine con etere. La resa viene valutata uguale a 95% mediante l'assorbimento di catione trifenilmetilico a 490 nm. La resa ? ugualmente confermata mediante anal.i.si HPLC di fase inversa dopo sbloccaggio. (12-16 ore a 50?C con idrossido d'ammonio concentrato, seguito da trattamento con acido acetico all?SO/j.) Il picco del dimero viene raccolto durante l'analisi HPLC e lo spettro UV risulta concordare molto bene con lo spettro generato da calcolatore.

Esempio 3

Altri dimeri vengono preparati mediante il procedimento dell'Esempio 2. La resa isolata di ogni dimero ? riportata nella Tabella seguente:

Tabella 1

Composto Resa isolata {%) d-CpC

96 d-GpT

57 d-CpT

95 d-GpG

98 d-CpG

84 d-GpA

81 Esempio 4

Sintesi di dimero C-T impiegando agente di fosfitilazione bifunzionale modificato Silice (Vydac TP, 100 mg), portante N-benzoildesossicitidina (4,2 umoli), e tetrazolo (630 umoli) vengono distillati azeotTopicamente con piridina. La silice ed il tetrazolo vengono trattati con metossidiclorofosfina (63 umoli) in piridina (0,3 mi) per 10 minuti a 0?C. Alla miscela di reazione viene po.i aggiunta 5'-d.imetossitrifeni1-metil-timidina (210 umoli). Dopo 15 minuti a temperatura ambiente, la miscela di reazione viene ossidata con iodio in tetraidrofurano/lutidina/acqua (2:1:1). La sil.i.ce viene lavata a fondo con tetraidrofurano acquoso al 50%, tetraidrofurano ed infine etere. La resa ? valutata uguale a 98% mediante l?assorbimento dei cationi trifenilmetilici a 498 nm.

Esempio V

Sintesi di pentamero impiegando agente di. fosfitilazione modificato

Silice (Vydac TP, 100 mg), portante N-benzoildesossicitidina (4,0 umoli), e tetrazolo (630 umoli) vengono distillati azeotTopicamente con piridina. La silice ed il tetrazolo vengono poi trattati con 15 volte metossidiclorofosfina (63 umoli) in piridina (0,3 mi) per 10 minuti a 0?C. Alla miscela di reazione si aggiunge cinquanta volte 5'-dimetossitrifenilmetiltimidina in piridina (0,3 mi). Dopo 15 minuti a temperatura ambiente, viene effettuata l'ossidazione con iodio in tetraidrofurano/lutidina/acqua (2:1:1). La silice viene poi lavata come nell'esempio 4. Il gruppo trifenilmetilico viene eliminato mediante trattamento con acido tricloroacetico al 5% in cloroformio. La silice viene lavata a fondo con cloroformio.

Questo ciclo viene ripetuto per prolungare la catena fino alla sequenza di pentamero T-T-T-T-C. Il rapporto per i reagenti viene lasciato costante durante tutta quanta la sintesi; il volume di piridina viene aggiustato come necessario.

La resa globale per la sintesi del pentamero T-T-T-T-C ? 53% .

Esempio 6

L'ottamero C-A-A-G-C-T-A-G viene sintetizzato mediante il procedimento dell'esempio 5 con una resa globale di 24%.

Esempio 7

Silice (Vydac TP, 100 mg), portante M-isobutildesossiguanosina (2,9 umoli) e 45 volte tetrazolo (130 umoli) vengono distillati azeotropicamente con piridina. Alla miscela silice-tetrazolo viene aggiunta piridina anidra (0,1 mL) prima di trattare la silice con 15 volte metossidiclorofosfina (43 umoli) per 10' a 0?C. Si aggiunge 5'-dimetossitrifenilmetil-N-benzoildesossiadenosina in 0,2 mL di piridina. Dopo 15' a temperatura ambiente, viene effettuata l'ossidazione con iodio in tetraidrofurano/lutidina/acqua (2:1:1). La silice viene poi lavata con tetraidrofurano acquoso al 50%, tetraidrofurano ed etere. La resa viene valutata uguale a circa 100%, in base all'assorbimento di trifenilmetile del catione trifenilmetilico a 498 nm.

Esempio 8

Silice (Vydac TP, 100 mg), portante ?-isobutirrildesossiguanosina (2,9 umoli), viene trattata con 0,2 mi di piridina contenente metossidiclorofosfina (43,5 umoli) e tetrazolo (130 micromoli) per 15' a 0?C. Alla miscela di reazione si aggiunge 5'-dimetossitrifenilmetil-N-benzoiladenosina in 0,2 mi. Dopo 15' a temperatura ambiente, la miscela di reazione viene ossidata e lavata come per gli esempi precedenti. La resa viene valutata uguale a circa 100%.

Esempio 9

Sintesi di A-T-G-C-A-C-A-C-A-A-G-A-G Silice (Vydak TP, 500 mg), portante N-isobutirrildesossiguanosina (14,5 umoli), viene essiccata mediante lavaggio con piridina anidra (2 x 10 mi) e dietil-etere anidro (10 mi). La silice viene ulteriormente essiccata in un essiccatore a vuoto fino al momento dell'impiego.

Un eccesso di 45 volte di tetrazolo (652 umoli) viene disciolto in 1 mi di piridina a 0?C. Alla soluzione tetrazolo-piridina viene aggiunto un eccesso di 15 volte di metossidiclorofosfina (217 umoli), poi la soluzione viene aggiunta alla silice. Dopo 15 minuti a 0?C, viene aggiunto un eccesso di 50 volte di 5'-0-{dimetossitrifeni.lmetil)-N-benzoildesossiadenosina in 1,0 mi di piridina. La reazione prosegue per 15 minuti a temperatura ambiente, poi la miscela di reazione viene ossidata e lavata mediante il procedimento degli esempi precedenti. La silice viene trattata con acido tricloroacetico al 5% in cloroformio per eliminare il gruppo dimetcssitrifenilmetilico. Dono lavaggio con cloroformio, piridina anidra ed etere anidro, la soluzione ? pronta per l'aggiunta del successivo nucleoside.

I rimanenti 11 nucleosidi vengono aggiunti esattamente come indicato in quanto precede. La quantit? e la concentrazione dei reagenti rimangono le stesse durante tutta quanta la sintesi.

Una valutazione qualitativa della resa ? ottenuta dopo ogni aggiunta in base alla colorazione arancio risultante dal trattamento con acido tricloroacetico al 5%. In tutti i casi, la resa risulta essere eccellente.

Le valutazioni quantitative della resa vengono ottenute trattanto una quantit? di silice accuratamente pesata con acido benzensolfonico al 2% in acetonitrile ed osservando gli assorbimenti dei cationi trifenilmetilici a 493 nm. La resa complessiva nei vari stadi ? riportata in quanto segue:

Lunghezza dell'oligonucleotide Resa {%)

2 100

5 90

S 78-33

13 60-70

RIVENDICAZIONI

1. Procedimento per la sintesi di un oligonucleotide su un sopporto solido, comprendente gli stadi-di:

(a) fissare un primo nucleoside, il cui gruppo 5'-ossidrilico ? protetto mediante un gruppo protettivo, ad un sopporto in fase solida attraverso il gruppo 3'-ossidrilico di detto primo nucleoside,

(b) eliminare detto gruppo protettivo sul 5'-ossidri le di detto primo'nucleoside,

(c) fare reagire detto gruppo 5?-ossidrilico con un gruppo di fosfitilazione bifunzionale,

(d) fissare un successivo nucleoside, il cui 5'- ossidrile ? protetto mediante un gruppo protettivo, a detto sopporto accoppiando il 3'-ossidrile di detto successivo nucleoside al gruppo 5'-ossidrilico di detto primo nucleoside,

(e) ossidare il legame fosfito formato tra detti nucleosidi,

(f) ripetere i precedenti stadi da (b) a (e) finch? a detto sopporto sia stato aggiunto il numero desiderato di nucleosidi,

(g) scindere detto oligonucleotide da detto sopporto e

(h) sbloccare e purificare detto oligonucleotide.

2. / Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui detto agente di. fosfitilazione bifunzionale dello stadio (c) viene convertito' in un derivato del tetrazolo prima della reazione con detto 5'-ossidrile di detto nucleoside.

3. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui detto nucleoside viene mescolato con tetrazolo prima di essere trattato con detto agente di fosfitilazione bifunzionale.

4. Procedimento secondo le rivendicazioni 1, 2 oppure 3, in?cui detto sopporto solido ? la silice.

5. Procedimento secondo le rivendicazioni 1, 2 oppure 3, in cui detto gruppo protettivo ? il gruppo rr.onometossitrifenilmetilico.

6. Procedimento secondo le rivendicazioni 1, 2 oppure 3, in cui detto gruppo protettivo ? il dimetossitrifenilmetile.

7. Procedimento secondo le rivendicazioni 1, 2 oppure 3, in cu.i detto agente di fosfitilazione bifunzionale ? un alchil- oppure aril-fosfodicloridito.

8. Procedimento secondo le rivendicazioni 1, 2 oppure 3, in cui detto agente di fosfitilazione bifunzionale ? la metossidiclorofosfina.

S. Procedimento secondo le rivendicazioni 1, 2 oppure 3, in cui il rapporto molare di nucleoside ad agente di fosfitilazione ? situato tra circa 1:10 e

Claims

circa 1:20.

10. Procedimento secondo le rivendicazioni 1, 2 oppure 3, in cui il rapporto molare di 'nucleosirie ad agente di fosfitilazione ? circa 1:15.

11. Procedimento secondo le rivendicazioni 2 oppure 3, in cui il rapporto molare di agente di fosfitilazione a tetrazolo ? situato tra circa 1:2 e circa 1:10.

12. Procedimento secondo le rivendicazioni 2 oppure 3, in cui il rapporto molare di agente di fosfitilazione a tetrazolo ? circa 1:3.

13. Procedimento secondo le rivendicazioni 1, 2 oppure 3, in cui le reazioni sono effettuate tra circa 0?C e circa 27?C.

14. Procedimento secondo le rivendicazioni 1, 2 oppure 3, in cui le reazioni sono effettuate a 0?C.

15. Procedimento secondo le rivendicazioni 1, 2 oppure 3, in cui il nucleoside in eccesso pu? essere ricuperato mediante procedure di estrazione e reimpiegato.