BG100558A - Рекомбинантни протеини на затлъстяването - Google Patents
Рекомбинантни протеини на затлъстяването Download PDFInfo
- Publication number
- BG100558A BG100558A BG100558A BG10055896A BG100558A BG 100558 A BG100558 A BG 100558A BG 100558 A BG100558 A BG 100558A BG 10055896 A BG10055896 A BG 10055896A BG 100558 A BG100558 A BG 100558A
- Authority
- BG
- Bulgaria
- Prior art keywords
- protein
- human
- mouse
- seq
- obesity
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 259
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 207
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 title claims abstract description 33
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 title claims abstract description 32
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 37
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 200
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 74
- 102000016267 Leptin Human genes 0.000 claims description 64
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 50
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 claims description 49
- 101001063991 Homo sapiens Leptin Proteins 0.000 claims description 43
- 108090000143 Mouse Proteins Proteins 0.000 claims description 43
- 102000049953 human LEP Human genes 0.000 claims description 43
- 108010092277 Leptin Proteins 0.000 claims description 42
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 42
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 40
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 34
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 34
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 claims description 31
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 31
- 230000037406 food intake Effects 0.000 claims description 30
- 235000012631 food intake Nutrition 0.000 claims description 30
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 claims description 30
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 claims description 30
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 claims description 28
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 28
- 101100181592 Mus musculus Lep gene Proteins 0.000 claims description 26
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 25
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 25
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 24
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 24
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims description 23
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 23
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 22
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 claims description 22
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 22
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 19
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 18
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 18
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 18
- 230000035939 shock Effects 0.000 claims description 18
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 17
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 15
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 claims description 9
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims description 9
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 8
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 6
- 108010079246 OMPA outer membrane proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 125000003827 glycol group Chemical group 0.000 claims description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 6
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 claims description 5
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 claims description 5
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 4
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 claims description 4
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims description 3
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 claims description 2
- 241001025319 Etheostoma collis Species 0.000 claims 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 abstract description 29
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 7
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 abstract description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 71
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 68
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 50
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 43
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 42
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 40
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 40
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 34
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 33
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 29
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 26
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 26
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 20
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 20
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 20
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol Natural products OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 17
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 16
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 15
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 15
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 15
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 15
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 15
- 208000016261 weight loss Diseases 0.000 description 14
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 13
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 13
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 13
- 239000000463 material Substances 0.000 description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 11
- 230000008859 change Effects 0.000 description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 11
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 11
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 9
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 9
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 8
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 8
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 7
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- 101100028951 Homo sapiens PDIA2 gene Proteins 0.000 description 6
- 102100036351 Protein disulfide-isomerase A2 Human genes 0.000 description 6
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- -1 diethyl- (2-hydroxypropyl) aminoethyl Chemical group 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 6
- 238000000185 intracerebroventricular administration Methods 0.000 description 6
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 6
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 6
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 5
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 4
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 4
- 239000012619 Butyl Sepharose® Substances 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 4
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 4
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 235000021316 daily nutritional intake Nutrition 0.000 description 4
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 4
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 4
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 4
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 4
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 4
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 3
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 3
- 241001288713 Escherichia coli MC1061 Species 0.000 description 3
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 3
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 3
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 3
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 3
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 3
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 3
- 238000003359 percent control normalization Methods 0.000 description 3
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 3
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 3
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 3
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 3
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 3
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DYWCIVBBDWZOCL-UHFFFAOYSA-M 4-ethenyl-1-methylpyridin-1-ium;iodide Chemical compound [I-].C[N+]1=CC=C(C=C)C=C1 DYWCIVBBDWZOCL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- MFBYPDKTAJXHNI-VKHMYHEASA-N Gly-Cys Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@@H](CS)C([O-])=O MFBYPDKTAJXHNI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 208000031226 Hyperlipidaemia Diseases 0.000 description 2
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100102907 Mus musculus Wdtc1 gene Proteins 0.000 description 2
- 206010033307 Overweight Diseases 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150117115 V gene Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000006583 body weight regulation Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 2
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 2
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 2
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CXISPYVYMQWFLE-VKHMYHEASA-N Ala-Gly Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)NCC([O-])=O CXISPYVYMQWFLE-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001573881 Corolla Species 0.000 description 1
- 241000218691 Cupressaceae Species 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016155 Disulphide isomerases Human genes 0.000 description 1
- 108050004627 Disulphide isomerases Proteins 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N Ethane Chemical class CC OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- BBBXWRGITSUJPB-YUMQZZPRSA-N Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O BBBXWRGITSUJPB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 1
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710151321 Melanostatin Proteins 0.000 description 1
- 102400000064 Neuropeptide Y Human genes 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000009658 Peptidylprolyl Isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108010020062 Peptidylprolyl Isomerase Proteins 0.000 description 1
- 241001415846 Procellariidae Species 0.000 description 1
- 101710199886 Protein 0.5 Proteins 0.000 description 1
- 102000006010 Protein Disulfide-Isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108090000244 Rat Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101001072192 Rattus norvegicus Protein disulfide-isomerase Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 101150105184 Selenos gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 101000865057 Thermococcus litoralis DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- RYYVLZVUVIJVGH-UHFFFAOYSA-N caffeine Chemical compound CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1N=CN2C RYYVLZVUVIJVGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 235000021051 daily weight gain Nutrition 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 239000003479 dental cement Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003631 expected effect Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 235000021050 feed intake Nutrition 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 230000010006 flight Effects 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000003304 gavage Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003166 hypermetabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001127 hyperphagic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006303 immediate early viral mRNA transcription Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- URPYMXQQVHTUDU-OFGSCBOVSA-N nucleopeptide y Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 URPYMXQQVHTUDU-OFGSCBOVSA-N 0.000 description 1
- 208000019180 nutritional disease Diseases 0.000 description 1
- 238000013116 obese mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000002966 oligonucleotide array Methods 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011368 organic material Substances 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 1
- 235000019271 petrolatum Nutrition 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 108020003519 protein disulfide isomerase Proteins 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 231100000272 reduced body weight Toxicity 0.000 description 1
- 235000018770 reduced food intake Nutrition 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000011808 rodent model Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 101150105992 vimp gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 239000013585 weight reducing agent Substances 0.000 description 1
- 101150069452 z gene Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/5759—Products of obesity genes, e.g. leptin, obese (OB), tub, fat
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Public Health (AREA)
- Obesity (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Hematology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Child & Adolescent Psychology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Изобретението се отнася до протеини, които модулират телесното тегло на животни и хора и се прилагат за лечение, профилактика и контрол на затлъстяването и свързаните с него заболявания. Изобретението се отнася и до рекомбинантното експресиране на тези биологично активни протеини в пречистена и хомогенна форма.
Description
РЕКОМБИНАНТНИ ПРОТЕИНИ НА ЗАТЛЪСТЯВАНЕТО
Известно е, че затлъстяването е най-обикновеното хранително заболяване в западното общество (zhang, Y. et al.,Nature 372,425432 (1894). Повече от три на всеки десет възрастни американци имат поне 20% наднормено тегло (zhang, Y. et al.) Наднорменото телесно тегло е обществен здравен проблем, защото е свързан с голям брой медицински заболявания като диабетен мелитус тип II, или неинсулинов зависим диабетен мелитус, хипертония и хиперлипидемия. ( Grundy, S.M. u Barnett, Disease-a-Mouth 36, 645-696 (1990). Очевидно е, че телесното тегло се регулира по физиологичен начин, и затлъстяването поради това в свързаните с него условия или заболявания се дължат отчасти на увреждания в това регулиране, (zhang, Y.,et al. aupra).
При гризачи са описани седем единични генни мутации, които водят до получаване на фенотип на затлъстяването, пет мутации от които се намират при мивки. От тези седем модела при гризачи най-добре е узучена мутацията на гена на затлъстяването /об гена/ при мивки, който е идентифициран през 1950 г.(ingalls, А.м. et al. J. Hared. 41, 3178318 (1950¼ Хомозиготните мивки по тази об генна мутация са силно затлъстели, с развит диабетен мелитус тм тип II и са хиперфагични и хиперметаболитни, като част от синдрома, приличащ на заболяването затлъстяване при човека (Friedman J.M.,et al, Genomics 11, 1054-1062 (1991).
Този ген на затлъстяването /об ген/ се разпределя при мивия проксимален хромозом 6 и кодира протеин, например об протеин,
- 2 който е експресиран в адипозна тъцан.С Zhang, Y. et al.)Хомозиготните мивки по об генната мутация слабо или въобще не продуцират този об протеин и съответно имат нарувено регулиране на телесното тегло, което води до затлъстяване.
Мишите или човевки об протеини могат да се прилагат на болни, страдащи от увреждания или изменения в техния съответен ген на затлъстяването ( об ген), които увреждания или изменения предпазват или влизат във взаимодействие при продуцирането и/или функцията на об протеините при модулираното на телесното тегло. При това тези протеини могат да се използват като хормоноподобни вещаства за контрол, профилактика или лечение на затлъстяването и свързаните с него състояния при хора и животни.
За да се използват по този начин мишите или човевки об протеини могат да бъдат прилагани инжекционно интраперитонеално, интравенозно, интрамускуларно или подкожно в многократни дозировки. Тъй като се прилагат чрез многократни инжекции, важно е мижите или човешки об протеини да бъдат пречистени, за предпочитане до хомогенност, за да са свободни от онечистващи протеинови продукти и да бъдат рекомбинантно акспррсирани в разтворима и биологичноQ активна форма. За специалистите в областта е известно, че онечиса тващите вещества, присъстващи в инжекционната лекарствена форма, могат често да причинят странични токсични ефекти или неблагоприятен имунологичен отговор.
Докато последователността на мивия об ген е описана от
Zhang, Y. et al., то не са съобщени никакви матоди за експресиране на мивия протеин на затлъстяването ( об протеин), или на съответстващия на него об протеин, но изолиран от човек, още по-малко са известни методи за продуцирането на тези протеини
.. I........
в биологично-активна и разтворима форма, от която протеините магат да бъдат пречистени до хомогенност. Следователно това е важно и един от обектите та това изобретение е да се експресират и продуцират об протеините от мивки и хора в хомогенна, разтворима и биологически активна форма.
Установено е, че рекомбинантните човешки и мини об протеини могат да бъдат експресирани в биологически активна и разтворима форма и след това да се пречистят до хомогенност, подходяща за инжектиране на болни за лечение, профилактика или контрол на затлъстяването и свързаните с него състояние и заболявания като диабетен мелитус тип II, хипертония, хиперлипидемия и други.
Съгласно настоящето изобретение човешките и миши об протеини могат да бъдат продуцирани рекомбинантно в биологически активна форма и пречистени до хомогенност чрез изграждане най-напред на нови експресионни вектори за Escherichia coll ( Е. coll).
Тези експресионни вектори съдържат промотор и ДНК последователност, която ДНК последователност кодира слят протеин, който С се състои от две части: сигналният пептид на външния мембранен протеин А на Е. coll, например sOmpA, и човешкият или миши об протеин. Съгласно изобретението следващият етап за продуцирането на биологически актишва рекомбинантна форма на човешките и мизи об протеини е да се включи този експресионен вектор в Е· coli гостоприемник, докато се получи ефикасно експресиране и транслокация на слятия протеин в периплазматичното пространство, например между вътрешните и външните клетъчни мембрани на микроорганизма Е. соИдо момента, в който сигналният пептид се отрязва от об протеина, като по този начин освобождава об рротеина в разтворима и биологически активна форма. След това об протеините ефикасно се отделят в разтворима и биологически активна форма в среда, несъдържаща клетки,с последващо третиране на клетките на гостоприемника Е. coll в студен осмотичен шок, дотогава, докато об протеините се пречистят до хомогенност чрез поелвдавателно използване на анйонно-обменна хроматография, хидрофобна интерактивна колонна хроматография и гел филтрация, проведени в този ред.
Изобретението се отнася също до: 1) експресионен вектор, който съдържа ДНК, кодираща слят протеин, който се състои от жОпрА сигнален пептид и човешки или мини об протеин;
2) до организъм·*гостоприемник, трансфектиран или трансформиран чрез такъв експресионен вектор; 3) до последователността на ДНК, кодираща човешкия об протеин, и 4) до полиетилен или полипропиленгликолови конюгати на об протеина.
Изобретението се отнася също и до методи за експресиране на рекомбинантни човешки и миши об протеини в биологически активна и разтворима форма, и до методи за продуциране на тези протеини в пречистена хомогенна форма, подходяща за прилагане на животни и хора.
Методът за експресиране иа продуциране на протеина на затлъстяването /об протеина/ от мишки, съгласно това изобретение се осъществява като се използва мишият об ген, описан от Zhang, Y. wt al. , като този ген има нуклеотидна последователност със 702 базови двойки /бд/, която е идентифицирана тук като seq ID N0: 1 . Тази миши об генна последователност съдържа коди раща последователност от 501 бд или отворена рамка на разчитане (ОРР), която започна с начален кодон при нуклеотид 36 и завършва
със стопкодон при нуклеотид 537 ,и имаща нетранслирани последователности при 3» и 5* краищата. Отворената рамка на разчитане /ОРР/ съдържа сигнална последователност с 63 бд при нуклеотид от 36 до 98.
Тази миша об генна последователност представлява и кодира мишия об протеин и неговата сигнална последователност, чиято аминокиселинна последователност има 167 аминокисебини по държината и е идентифицирана като SEQ ID NO: 2.
В този протеин с SEQ 1D N0:2 първите 21 аминокиселини представляват сигналната последователност на мишия об протеин. Зрелият миши об протеин без неговата сигнална последователност продължава от аминокиселина 22 (Val) до аминокиселина 167 ( Сув)и е представен като SEQ ID N0, 3.
Методът за експресиране и продуциране на човешки об протеин съгласно настоящето изобретение се осъществява като се използва човешки об ген, който има нуклеотидна последователност с 690 бд, и който ген е идентифициран като SEQ ID N0: 4.
В цитираната вече литература Zhang, Y.et al. описват гена на затлъстяването /об гена/ като високо хомоложен на мишия об ген и разкриват подходящ метод, използващ олигонуклеотидни матрици, които са ориентирани към мишия об ген, и който метод може да бъде използван за 1) скриниране на сДНК библиотека от клонове, получени от човешка адипозна тъкан, 2) за идентифициране на тези клонове, имащи човешщия об ген, и 8) за да се изолира и секвенира последователността на човешкия ген на затлъстяването /об ген/, Когато се секвенира по конвенционални методи, тази последователност на човешкия об ген се определя, че има нуклеотидната последователност SEQ ID N0: 4.
— 6 —
Както мишият об ген, така и човешкият об ген съдържа кодираща последователност с 501 бд или отворена рамка на разчитане (ОРР), стартираща с начален кодон при нуклеотид 37, и завършваща със стопкодон при нуклеотид 538 и имаща нетранслирани последователности при 3’ и 5’ краищата. Отворената рамка на разчитане съдържа 63 бд сигнална последователност от нуклеотид 37 до 99.
Тази чивешка об генна последователност SEQ IB NO: 4 кодира човешки об протеин и неговата сигнална последователност, чиято аминокиселинна последователност от 167 аминокиселини в дължина е идентифицирана като SEQ ID N0: 5.
Първите 21 аминокиселини от този протеин със 167 аминокиселини в дължина представляват сигналната последователност. Зрелият човешки об протеин, без неговата сигнална последователност, се простира от аминокиселина 22 (Vai) до аминокиселина 167 (Суз) и е представена като SEQ ID N0» 6.
Посочените вече автори zhang, Y. et al. съобщават, че е установена 84% идентичност между мишия и човешки об протеини. Те също са установили, че съществуват варианти на мишия и
С човешкия протеини, като един такъв вариант е охарактеризиран в двата вида чрез заличаване на грутамина. Приблизително 30% от сДНК клоновете в библиотеките, получени от адипозна тъкан на мишки и човешка адипозна тъкан, имат липсващ водон 49.
По-долу са представени дефинициите на използваните в описанието термини:
Миши об протеин ( mob) означава протеин със seq ID N0: 3 чиито биологични свойства имат отнощение към лечението, контрола или профилактиката на затлъстяването или свързаните с него състояния и заболявания. По-специално мишият об протеин се дефинира като включващ всеки протеин субстанили полипептид с аминокиселинна последователност, която е принционно хомоложна с ципно аналогично на аминокиселинната секвенция SEQ ID NO: з, и освен това има следните биологични активности:
1) когато протеинът или полипептидът се прилага чрез интрацеребровентрикуларна (ИЦВ) инжекция на възрастна затлъстяла об/об мишка, обездвижена за 16—18 часа и имаща телесно тегло поне 30 грама с доза от най-малко 20 MB, като се използват методите на Haley u McComick, Brit. J. Pharmacol. 12, 12-15 (1957), при това протеинът или полипептидът: а)) редуцира усвояването на храната за период от 5 часа хранителен тест с 50% в сравнение с контролна мишка, на която е инжектиран вехикул ( което показва ed5O за редуциране усвояването на храна)7 и б) редуцира повишаването на телесното тегло през следващите 24 часа след ИЦВ инжекция най-малко с 50 % в сравнение с контрилна мишка, на която е инжектиран вехикул ( EDso за редуциране повишаването на телесното тегло).
2) Когато протеинът или полипептвдът се прилага интраперитонеално (ИП) на необездвижена възрастна об/об мишка с тегло най-малко 30 грама два пъти дневно в началото на деня и после на 3-ия час след стъмване, в продъление на една седмица, с оДща дневна доза 20 И8г или по-малко, при това протеинът или полипептидът: а) редуцира 5 и 24 часовото усвояване на храната с поне 20% в сравнение с контролна мишка, инжектирана с вехикул (което е ed20 за редуциране усвояването на храна); и б) редуцира увеличаването на телесното тегло през следващите 24 часа след първата интраперитонеална инжекция поне с 20% в сравнение с контролна мишка, инжектирана с вехикул ( което представлява ED2o за редуциране повишаването на телесното тегло).
Както е използван тук терминът модулиращ теглото (об) протеин от мишка включва специално модифицирани протеини като
- 8 модифицирани ияв№ например чрез определено насочена мутагенеза илиТслучайно“ чрез мутация.
Човешки об протеин (hob) представлява протеин с seq id no:6, чиито биологични свойства се отнасят до лечението, профилактиката или контррлираввето на затлъстяването и свързаните с него състояния и заболявания. По-специално човешки об протеин е дефиниран като включващ всеки протеин или полипептид с аминокиселинна секвенция, която е субстанциално хомоложна на аминокиселинната секвенция SEQ id N0:6 , и освен това има следните биологически С активности:
1) Когато протеинът или полипептидът се прилага ИЦВ на обездвижена възрастна об/об мишка, обездвижена за 16-18 часа и имаща телесно тегло поне 30 г с доза от най-малко 20 pgr, като се използват методите на Haley и McCormick ,протеинът ИЛИ ПОЛИПбПТИДЪТ с 501
а) редуциращусвояването на храната за период от 5 часа хранителен тест в сравнение с контролна мишка, на която е инжектиран вехикул ( което представлява ed50 за редуциране усвояването на храна),
б) редуцира поне с 50Х повишаването на телесното тегло през следващите 24 часа след ИЦВ инжектиране в сравнение с контролна мишка, на която е инжектиран вехикул ( което представлява ed50 за редуциране повишаването на телесното тегло).
2). Когато протеинът или полипептвдът се прилагат интраперитонеално (ИП) на необездвижена възрастна об/об мишка с тегло най-малко 30 г два пъти дневно в началото на деня и после на
3-ия час след стъмване, в продължение на една седмица, с обща дневна доза от 20 цг или по-малко, при това протеинът или полипептидът: а)редуцира 5 и 24 часовото усвояване на храната поне с 20Х в сравнение с контролна мишка, инжектирана с вехикул (което представлява ed20 за редуциране усвояването на храна), и б) редуцира увеличаването на телесното тегло през следващите 24 часа след първото интраперитонеално инжектиране поне с 20% в сравнение с контролна мивка» инжектирана с вехикул ( което представлява В>20 за редуциране повишаването на телесното тегло).
Както е използван тук терминът човешки об протеин включва такива специално модифицирани протеини като например чррз определено насочена мутагенеза или случайно чрез мутация. Субстанционно хомоложен. който може да се отнася до секвенция от последователност нуклеинови киселини, също и до аминокиселинна секвенция, означава, че една специфична производна свквенция, например мутантна секвенция, се различава от указаната секвенция с една или повече субституции, заличавания или добавяния, окончателният ефект от които не води до неблагоприятно функционално различие между указаната и мутантната секвенция. За цевите на настоящето изобретение, последоввяяяяоета, имащи повече от 95% хомоложност, еквивалентни биологически жвойства и еквивалентни експресионни характеристики се смятат за субстанционно хомоложни. За определянето на хомоложността, съкращаването на зрялдта последователследва да бъде игнорирана. Секвенции, имащи по-ниска степен на хомоложност, сравнима биоактивност и еквивалентни експресионни характеристики, се считат като субстанционно еквивалентни. По принцип хомоложни ателности
ДНК последов могат да бъдат идентифицирани чрез кръстосана хибридизация при стандартни хибридизационни условия на умррен недостиг.
фрагмент от об протеин от мишка или от човек означава всеки протеин или полипептид, имащ аминокиселинната последователност на част или на фрагмент от об протеин от мишка или от човек, и който има биологичната активност на об протеин от мишка или от човек, респективно. Фрагментите включват протеини или полипептиди, продуцирани чрез протеолитично разпадане на об протеини от мишка или от човек, или продуцирани чрез известни от нивото на техниката
- 10 методи на химически синтез.
Един об протеин или негов фрагмент е биологически активен, когато прилагането на протеина или на фрагмента му при бозайници включително и хора, редуцира усвояването на храната и намалява степента на напълняване при бозайниците. Определянето на тази биологическа активност на об протеин от мивка или човек може да
се проведе чрез конвенционални, добре известни тестове, използвани за тази цел върху един или повече видове бозайници, по-специално върху възрастна об/об мивка. Някои от тези тестове, които могат да бъдат използвани за демонстриране на такава биологична активност са описани тук. При определяне на биологичната активност в съответствие с ИЦВ теста при об/об мицка, както е описан тук, об протеинът от мивка или от човек за предпочитане има за редуциране усвояването ана храна от 20 Лг или по-малко, йИ ed5q за редуциране повишаването на телесното тегло от
и по-малко.
Съответно при определяне биологичната активност на об протеин от
мивка или от човек в съответствие с ИП тест при об/об мишка,както е описано тук, об протеинът от мивка или от човек за предпочитане има ев20 аа редуциране напълняването вт 20уиг или по-малко и ED2o за Редуциране усвояването аа храна от 20 и по-малко. По принцип се предпочитат фрагменти, които проявяват гореспоменатата биологична активност.
Репликон е всеки генетичен елемент / като плазмид, хромозом, вирус/ който функционира като автономна единица от ДНК репликацията in vivo 9 например, способен на репликация при неговия собствен котрол.
Експресионен вектор е репликон, като плазмид, фаг или козмид, към който може да бъде прикачен друг ДНК сегмент, вака че да способства за репликацията на прикачения сегмент. Той се състои от транскрипционна единица, съдържаща комплекс от (1) генетичен елемент или
- 11 елементи с регулаторна роля в генната експресия като промотври или усилватели, уокеритоли, (2) структурална или кодираща секвенция, която е транскрибирана в ЖРНК, и транслирана в протеин, и (3) подходяща транскрипционна и термМйационна секвенции.
Клон е група от ДНК молекули, получени от една оригинална дължина на ДНК секвеиции, и продуциранв чрез бактериум или вирус, като се използват техники на генното инженерство, често включващи плазмиди.
Сигнална секвенция е последователност от нуклеинови киселини, локализирана в началото ( 5' края) на кодиращата секвенция на протеин, който трябва да бъде експресиран. Тази сигнална секвенция кодира сигнален пввтид, N-терминален към новосинтезирания протеин, който теина който направлява клетката на гостоприемника да транслокира про към или през мембраната на клетката на гостоприемника, и сигнален пептид обикновено се скъсва .. по време на такава транслокация
Стартиращ кодон е кодон, обикновено АУГ локализиран в кодиращата секвенция на протеин, и обикновено при 5' в последователността на аминокиселина протеиновата секвенция.J локализиран
Стоп кодон е безсмислен кодон в 3* края на кодиращата секвенция на растящата полипептидна верига, разчитане Отворена ШМЙЗа Верига е линейно края и сигнализира първата протеина.
на протеина и подреждане на и обикновено сигнализира края кодонови триплети в двойно-ивична ДНК кодираща аминокиселинна последователност в клетка in vitr0 или in vivo» когато е под контрола на подходянйамка на разчитане щи регулаторни секвенции. Границите на отворената четяща верига cf края определят от стартиращ кодон при 5’ терминала и от стоп кодона Λ края при 3» терминала. Той също може да бъде обяснен като кодираща секвенция.
Промотарна секвенция е регулаторна област от ДНК, способна да свързва РНК полимераза в клетка и инициираща транскрипция ИЬ
- 12 рамка на разчитане на иасо«ввадярй38*дярвяция) отворена четяща ворига-на един или повече структурални гени. Промотерната секвенция обикновено е локализирана рамка на разчитане при 5’ края на сигналната секвенция или отворената Ч1!иящд~морп1 а и разширява четекете в 5’ дарвкцията за да включи минималенЯ?рой от бази или елементи, необходими да инициират транскрипция на полипептида в степен превишаваща горния бекграунд.
Кодираща секвенция или отворена четяща верига в под контрол на промотерна секвенция, когато РНК полимеразатятранскрибира кодиращата секвенция в гаРНК.
Състав, съдържащ А ( където А е единичен поуипептид) е хомогенен за А, когато няма значително количество от контаминиращи протеини или други ендогенни материали, както може да се установи чрез конвенционални начини, например чрез оцветяване на полиакриламидни гелове. Да целите на това изобретение терминът хомогенен ще означава композиция, съдържаща единичен протеин или полипептид, когато поне 95% от теглото на състава е този единичен протеин или полипептид.
Следващите етапи описват методите за рекомбинантно експресиране на об протеини от мишки и човик в биологически активно състояочисние и кщдхфврмжхиж разтворимо свободно от клетки състояние, свотени бодни от други протеини от бозайници , от които об протеините могат после да бъдат пречистени до хомогенност. Тези етани са описани подробно в примерите.
1) Получаване на об гени от мишки и човек. сДНК с (seq id N0:1) > кодираща об протеинаот мишк! плюс неговата естествена сигнална секвенция е описана от zhang, Y. et al. Тази сДНК от мишка е била изолирана и οίι& чрзз PCR техника, като се използват олигодеоксинуклеотидни ДНК праймери чрез конвенциални техники. Тези ДНК праймери и методите за тяхното получаване са описани ОТ Zhang, Y. et al.
- 13 сДНК ( SEQ ID N0:4 ) кодираща човеики об протеин плюс него вата естествена сигнална секвенция се получава като се използват същите олигодеоксинуклеотидни ДНК праймери, както се използвани от Zhang,Y. et al., за получаването аа об ген от мишка. Като се използва конвенционална техника, тази човишка сДНК е била изолирана от ламбда фа?асДНК библиотека,получена от РНК дериват от човешка адипоцитна тъкан.
Човешка об сДНК или от мишки може да бъде получена не само от сДНК библиотеки, но и чрез други известни начини, например чрез химивввки синтез, или чрез клониране на геномна ДНК, или нейни фрагменти, пречистена от желаните клетки. Тези процедури са описани ОТ Sambrook et al. В DNA Cloning: A Practical Approach Vol.I u II, D.N.Glover, 1985, MRL Press,(1977)j u Grunstein
Hogness, Proc. Nat. Acad. Sci.,72, 3961-3965 (1975). За да се получи об сДНК от човек или от мишка от сДНК библиотеки,същите се скринират чрез конвенционални ДНК хибридвзационни техники по методите на Benton И Davis , или Grunstein и Hogness пак там> като се използват праймери, приготвени чрез обратима транскрипция на полиаденилирана РНК, изолирана от адипозни клетки на мишка, ове, съдържащи об ген от мишка. Клони, които хибридизират в праймерите, се анализират чрез рестриктивно ендонуклеазно разцепване, агарозна гел електрофореза и допълнителни хибридизационни експерименти (Southern blots ) включващи електрофорезните праймери. След ове изолирането на няколко клони, които хибридизират до сДНК матрици от вишка, 7^7 хибридизиращв^Р сегмент на един клон е субклониран и секвемциран чрез изввстни техники.
0Β6ΤΘ
Клони,, получени от геномна ДНК, могат да съдържат регулаторни и интронни ДНК области в добавка към кодиращите области: клон1Р,вете деривати от сДНК няма да съдържат интронни секвенции. В молекулярното клониране на гена от геномна ДНК, ДНК фрагменти са генерализирани
- 14 някои от които ще кодират желания ген. ДНК може да бъде разкъсана при специални участъци като се използват различни рестрикционни ензими. Съответно може да се използва ДНК-аза в присъствие на манган за фрагментиране на ДНК, или ДНК може да бъде физически срязана, напримерч чрез соникация. Линейните ДНК фрагменти после могат да бъдат разделени в зависимост от размерите чрез стандартни техники,влючително, но не и ограничаващо като агарозаа и полиакриламидна гел електрофореза и колонна хроматография.
В зависимост от източника, об генът от човек или от мишка може да бъде молекулярно клониран в подходящ вектор за пропагацията на гена чрез известни от нивото на техниката методи. Може да бъде използван всеки търговски достъпен вектор. Например сДНК от мивка воже да бъде въведен в рсДНКЗ вектор и човешката сДНК може да бъде въведена в f>BluescriptSK вектор. Подходящи вектори за използване с бактериални гостоприемници са описани от Pouwele et al·, “Cloning Vectors: A Laboratory Manual”, 1985, Elsevier,
N.Y. Като избрани примери, използващи клониращи вектори за бактериална употреба могат да съдържат селектируем маркер и да има< бактериален произход на репликация, получени от търговски достъпни плазмиди, които са получени от добре известен клониращ вектор рви322 (АТСС 37017). Такива търговски вектори включват РКК223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala,Sweden) u pGEMl (Promega Biotec, Madison, Wise., USA).
Нуклеотидните секвенции на об ген от човек или от мишка, включени в тези търговски достъпни вектори мс^да бъда· проверена чрез известни от нивото на техниката методи и чрез стандартни нуклеотидни секвенционни техники.
Могат да бъдат използвани и други нуклеинови киселини, които кодират об протеини от видове, различни от човек или мишки.съответно, когато дадена ДНК е била клониране и секвенирана във връзка с
- 15 об ген от човек и от мивка, потенциално всеки животински адипоцит
може да бъде използван като източник на нуклеинова киселина за
протеина. Образуване на експресионен вектор за об π ρ ο т е и н от мивка или човек . Човевки об протеин или от мивка ,клониранив съответствие с методите, описани по-горе, оа използвани за да се образуват експресионни вектори за об протеини от човек или мивка, съответно.
За експресия на биологически активен об протеин от човек или от мишка чрез трасфектиранаили трансформирана клетка от гостоприемник Е.coll и за секретирането на об протеина в периплазмата, може да бъде използван нов експресионен вектор. Този експреесионеж вектор включва промотор и ДНК секвенция, кодираща слят протеин. -Слятият протеин се състои от две части: първата част е сигнален пептид за външния мембранен протеин А на Е.cofl·1· ( вОярд ) и втората част на фежтия протеин е об протеин от човек или от мишка (без техните собствени естествени сигнални секвенции). ДНК секвенцията, кодираща този ( :олят протеин също се състои от две части: първа част, който кодира пептида «ОтрА | и втора част, който кодира об протеина от човек или от мишка (без техните естествени сигнални секвенции). Пррвата част на ДНК секвенцията, която кодира пептида sOmpA е сигналната секвенция, описана от De Sutter,к.
(1994) et al., Gene, 141,163-170 и има нуклеотидната секвенция
SEQ ID N0s7. Втората част на състоящата се от две части ДНК секвенция, кодира об протеините от кора и мишки и има нуклеотидна последователност SEQ ID NOtl или SEQ ID NO:4съответно, без тази част от нуклеотидната последователност, която кодира съответните естествени сигнални секвенции.
Сигналният пептид, кодиращ от sOmpA сигнална секвенция с SEQ ID ΝΟ»7 има аминокиселинната последователност SEQ ID както е описано от De Sutter,K.et al., пак трм.
- 16 Новият експресианен вектор съгласно изобретението се получава чрез включване промотбра и ДНК секвенцията, кодираща Л елят протеин към конвенционален експресионен вектор, подходящ за експресиране на рекомбинантни протеини в клетки на гостоприемник Е. coll.
При изграждането на този нов експресионен вектор съгласно това изобретение, всеки прояотер може да бъде използва· толкова продължително, колкото е смособен да контролира транскрипцията на Солятия * протеин, съдържащ 8°®pA пептид и об протеина в клетката на гостоприемника Е. coli . Когато sOmpl се използва като сигнален пептид, за предпочитане е да се използват лщк-операторен проморйр (POiac ) и липопротеиновият промот®р (Р^рр). Други удобни промот#ри за такава експресия в Е. coli включва Т7 РНК полимеразен промотор, описан ОТ Studier et al,, J. Mol. Biol, 189, 113-130 (1986) лекз-промотбрите, описани ОТ Lauer, J.Mol. Genet, 1, 139-147 (1981) и налични от American Type Culture Collection (ATCC) като
ATCC 37121, так-проиотврът, описан от Maniatis, в Molecular Cloningι A Laboratory Manual, Cold Spring Harbord 1982 И достъпен като ATCC 37138, промотор на алкална фосфатаза (рНоА ) и промотор trp, описан ОТ Goeddel et al., Nucleic Acids Research 8, 4057-4075 C 81980) Други промотори са открити и използвани в Е. coli и детайли, отнасящи се до техните нуклеотидни последователности, което дава възможност на специалиста в областта да направи тяхното функционално лигиране с експресионния вектор от това изобретение, и те са публикувани ОТ Siebenlist et al., Cell 2C, 269-281 (1980).
Експресионният вектор съдържа по-точно:
а) промоторна последователност, и
б) ДНК последоважелност, която кодира слят протеин, който слят протеин се състои от мием об протеин със SEQ ID N0:3 или човешки об протеин със SEQ ID N0:6, и сигналният пептид за външната мембрана на протеин А от Е. coli.
Освен това за изграждането на този нов експресионен вектор е описании друг метод, който по-детайлно е представен в примерите и изобразен на фигури 2 и 3. Най-напред кодиращата последователност на об протеина от хори или мивки (без тяхната естествена сигнална секвенция) се инкорпорира в паазмид, съдържащ sOmpA сигналната секвенция, такъв като плазмида pTIOsOmpArPDl . Този плазмид и неговата конструкция и получаване се описани от De Sutter,K.et al, пак там,.Веднъж инкорпориран в този плазмид, об генът от хора или мишки се слива с този sOmpA ген, за да създаде хибридна генна последователност в този плазмид. Генът sOmpA трябва да бъде в посока на 5* областта на об генната кодираща последователност.
След това някои от описаните вече промотори, за предпочитане липопротеиновият промотор (Р?Ие>
се инкорпорират в този плазмид.
съдържащ хибридната генна последователност, за да се създаде експресионният вектор на това изобретение. Два варианта на тези експресионни вектори са идентифицирани като pLPPsOmpA mob и pLPPsOmpA ho bl и са изобразени съответно на фигури 2 и 3.
Може да бъде използван всеки известен от нивото метод за създаване на такъв плазмид. Освен това редът, в който се сливат sOmpA и об генните последователности, инкорпорират се гениите последователности в подходящ плазмид и се инкорпорира промоторът за да се достигне до експермсионния вектор от това изобретение не е критичен. Например sOmpA генната последователност може първоначално да се слее с .последователността начовбшкия или миши об гадде от миг за да създаде хибридна генна последователвключва ност, и после тази хибридна последователност се в плазмид, имащ вече инкорпориран в него подходящи промотори. Все пак е необходимо sOmpA генната последователност да бъде в посока на 5’ края на мишата или об генна последователност.
Намерено е, че при използване на такъв нов експресионен век
- 18 тор , и в частност чрез използване на сигналната последователност кодираща sOmpA , об протеините от хора или мишки могат да бъдат транслокирани до периплазм®ТИЧНО®)странство, където сигналният незасегнати пептид по подходящ начин се разкъсва отделяйкиУоб протеините от хора или мишки в разтворима и биологичевии активна тично форма. Установени веднъж в това периплаз» аЛ пространство, об протеините ефикасно се секретират към свободню-клетъчнотопространство което .не/съдържа други животински протеини, при подлагането на клетките на гостоприемника на студен осмотичен шок, през която време об протеините могат да бъдат пречистени до хомогенност в биологично активна форма.
3..Експресиране на об протеини от хора или мишки в трансформирани Е.......fipU—клетки............
След това, експресионните вектори, приготвени съгласно клетката на гореописаните процедури се включва вУгостоприемника E.coli се за да^трансформира Е. coli клетката. Може да бъде използван щам от Е. colJ,такъв като Е. coli К-12 щам 294, както е описано в английска патентна заявка 2055382 A (ATCC 1₽ 31446). Други щамове, които могат да бъдат използвани съгласно това изобретение включват Е. coli МС1061 |Casadaban u Cohen, J. Mol. Biol,,138, 179-207 (1980)|, E. coli X 1776 (ATCC No. 31537) u E.coli W 3110 (ATCC No. 27325) или други щамове, много от които са депозирани и налични в признати депозитни институти за микроорганизми.
Трансформираните Е. coli клетки се култивират до необходимата клетъчна плътност и се размножават чрез стандартни методи. При това развиване и култивиране на трансформираните Е. coli гостоприемници експерсионният вектор от изобретението ефикасно и ефективно позволяват експресиране на об протеините от хора или мишки и транслокация на тези същите протеини в пйрИплазмата на клетките на E.coli гостоприемника в разтворима и биологично активна форма.
Сигналният пептид sOmpA «например част 1 от слятия протеин, отцепва се [прилепва)по време на транслокацията на слятия протеин/към) От
V ' несъдържащ периплазмата, като дава биологично активен об протеин,fopобеден от други животински протеини или полипептиди. По-точно методът за продуциране на биологично активен рекомбинантен протеин на затлъстяването от хора или мивки, свободен от други животински протеини съдрщжа стадиите:
а) конструиране на експресионен вектор с промоторна последователност и ДНК последователност, кодираща слят протеин, който представлява seq id NOt3 или seq id not6 и сигналният нретеин пептид за вънвната мембрана на протеин А от Е. coll.
¢) въвеждане на експресионният вектор в клетка на гостоприемник от Е. coll за да се трансформира клетката на гостоприемника Е, coll,
в) експесиране на слятия протеин в клетката на гостоприеиника от Е. coll , И
г) третиране на клетката на гостоприемника от Е. coll с охладен осмотичен шоков буфер до освобождаване на евеЗеяни^е об протеини от мишки или хора други животински протеини и сбободн. сигнален пептид.
Яекомбинантно получените об протеини от хора или мишки в разот творима биологично активно състояние(в)периплазмата на трансформирани Е. coli клетки след това се пречистват до хомогенност.
Яекомбинаштните об протеини от хора или мишки, транслокирани в клетъчната периплазма съгласно описаните тук процедури, могат ефективно да бъдат секретирани въш от клемата чрез подлагане клетките на гостоприемника на студен осмотичен шок чрез известни ОТ нивото методи И описани ОТ Koshland, D. u Botstein, D., Cell 20, 749-760 (1980). Използването на студен осмотичен шок освобождава от бактериите Е. toll об протеините в тяхното биологично активно състояние, свободни от други животински протеини или
- 20 полипептиди.
Об протеините от хора или мишки, намиращи се в осмотичната течност след студения осмотичен шок на трансформираните Е. еоН влетки, съгласно описаните горе процедури, са биологично активни и могат да бъдат пречистени до хомогенност като се използва комбинация от анионно-обменна колонна хроматография, колонна хроматография с хидрофобно взаимодействие и гел филтрация. Анионнообменната и хидрофобно взаимодействащата хроматография могат да се проведат във всякакъв ред, само, че използването на една от тях трябва да предшества гел филтрацията.
Стадият на анионен обмен може да се проведе по известни начини. Предпочитана колона за анионно-обменна хроматография е Q Sepharose Fast Flow колона. ПОДХОДЯЩИ -среди за анионно-обменна хроматография включват различни неразтворими матрици, съдържащи диетиламиноетил (ДЕАЕ) или диетил-(2-хидроксипропил)аминоетил ( QAE ) групи. Матриците могат да бъдат от акриламид, агароза, декстран, целулоза или други видове, които обикновено се използват за пречистването на протеини. Особено предпочитан материал за анионно-обменна хроматография е ДЕАЕСефацел ( Pharmacia, Uppsala, Sweden ). Когато се използват среди, съдържащи ДЕАЕ групи, прилагат се екстракти, съдържащи об протеини от хора или мишки при слабо основно pH като pH 8.1. Свързаните об протеини от хора или мишки могат да бъдат елуирани в по-високо пречистена форма чрез прилагане на соли като градиенти в подходящ буфер като трис-HCI. По принцип характеристиките на градиента могат да бъдат определени чрез експерименти на предварително елуиране, включващи малко количество от рекомбинантен протеин.
Материалът, съдържащ об протеин от хора или мишки, получен чрез използване на анионно-обменна хроматография, когато тя е
- 21 използвана като първи етап на пречистване, след това се подлага на хроматография чрез хидрофобно взаимодействие. Хроматографията с хидрофобно взаимодействие е техника на разделяне, при която веществата се разделят на базата на различни сили на хидрофобно взаимодействие с ненатоварен пласт от материал, съдържащ хидрофобни групи. Типично колоната с хидрофобно взаимодействие най-напред се екилибрира при условия, благоприятни за хидрофобното свързване например висока йонна сила. За елуиране на пробата може да бъде използвана сол като низходящ градиент.
Може да бъде използвана всяка колона с ходрофобно взаимодействие. Предпочитана хидрофобна колона е фенил Сефароза, но бутил Сефароза също може да бъде използвана. Съгласно изобретението материалът, носещ /въдържащ/ рекомбинантния об протеин от хора или мишки, който се елуира от анийонната колона се зарежда в колона, съдържаща относително силен хидрофобен гел като фенилсефароза. За да се подобри хидрофобното взаимодействие с хидрофобния гел, се използва разтворител, който съдържа например амониев сулфат, който е 0.4 М за предпочитане. Така колоната и пробата се нагласяват до 0.4 М амониев сулфат в 50щН трис-буфир и пробата се зарежда в колоната. Колоната се промива с 0.4М буфер оа амониев сулфат. После об протеинът се елуира с разтворители, които намаляват хидрофобното взаимодействие, например низходящи градиенти от соли, етилен или пропилен гликол или карбамид. Предпочитан вариант включва промиване след това на колоната с трисбуфер и трис-буферът, съдържащ 20% етилен гликол. След това об протеинът се елуира от колоната с градиент от амониев сулфат с намаляваща концентрация и с повишаваща концентрация на етилен гликол в трис-буфера. Общата и последователна употреба на анионно обменна хроматография и колонна хроматография с хидрофобно взаимодействие, във всякакъв ред, води до получаване на об протеин
- 22 от хора или мивки по рутинен начин при установена чистота 90Х. стадиите на Стадийт на гел филтрационна хроматография следва анионнообменната хроматография и колонната хроматография с хидрофобно взаимодействие посочени по-горе, и може да бъде проведен чрез всяка конвенционална процедура на гел филтрация. Елуираният об протеин от колоната с хидрофобно взаимодействие иили анионно-обменната колона, тази колона, която е използвана на края, може да се концентрира и диализира до до малък обем като се изповзва мембрана с изолирано молекулно тегло от 10 000 / amicon-υμιο мембрана/. Конц центрираният материал може после да бъде зареден в колона, съдържаща среда за гел филтрация като G100-Sephadex,(Phar«acla, Uppaala, Swedwa). Полученият об протеин после може да бъде разделен от други примеси на базата на тяхното молекулно тегло чрез стандартни техники, като се използва sds-page.
Общото и последователно използване на анионно-обменна хроматография, колонна хроматография с хидрофобно взаимодействие и гел филтрацията обикновено дават добив от об протеин от хора или мивки с 95Х чистота.
N-терминалното аминокиселинно секвениране на пречистения об протеин от хора или мивки може да се осъществи по известни от нивото на техниката методи, като електротрансфер съгласно методите на Laemli, U.K.,Nature 227, 680-685 (1970) или чрез процедурите, описани ОТ Mataudaira. Р., J.Biol. Chee. 262, 10035-10038 (1987). Вътревно секвериране също може да бъде проведено чрез известни от нивото на техниката методи. Например пептидни фрагменти могат да бъдат генерирани чрез асимиларане на М ивица (върху нитроцелулоза) с ендопротеиназа лизин С и после разделяне чрез HPLC система.
Биологичната активност на пречистените об протеини от хора или мивки от настоящето изобретение са такива, чието многократно прилагане на об протеините по инжекционен начин на хора или мивки има
- 23 за резултат понижаване усвояването на храна и понижаване степента на повивавваеана теглото в сравнение с неиижектирани контролни групи от обекти.
Биологичната активност на об протеини от хора или мивки, или техни фрагменти, получени и пречистени съгласно това изобретение, могат да бъде тестирани чрез рутинни методи като повтарящи се или единични интрацеребровентрикуларни (ИЦВ) инжекции на об/об мивки според процедурите на Kd.ey T.J., et al.пак там, както е описано подробно в примери 13 и 16. На базата на този ИЦВ тест могат да бъдат определени ed50 за редуциране поемането на храна и ed50 за редуциране увеличаването на телесното тегло. Освен това биологичната активност на об протеините от хора или мишки или техни фрагменти могат да бъдат определени чрез многократни ИП инжекции на об/об мишки, както е описано детайлно в пример 15. На базата на ИП тест могат да бъдат определени ео2О за редудиране поемането на храна и ed20 за редуциране повишаването на телесното тегло.
Биологичната активност на об протеините от хора или мишки, или техни фрагменти, получени и пречистени съгласно това изобретение, могат също да бъдат определени при хора чрез известни от нивото на техниката методи като измерване редукцията на теста поемане на храна, последвано от ИВ администриране на об протеин на тест-субекти от затлъстели хора, в сравнение с ИВ прилагане на контрола с физиологичен разтвор, съгласно методите на 8uurahainen,N.E. et al·,Am.J. Physiol. 260, 672-680 (1991) и както е описано в детайли в примери 14 и 17. Алтернативно способността на пречистените об протеини от мишки и хора според това изобретение да редуцират степента на напълняване / или да индуцират загубата на тегло/, могат да бъдат определени чрез многократно ИВ прилагане на тестувани субекти от затлъстели хора
- 24 ПО методите описани ОТ Brent, M.L., et al., Int. J. Obesity,19, 1218226 ^както е описано подробно в пример 18.
Човешки и миши об протеини, когато са пречистени, както е описано в изобретението, имат биологична активност, проявяваща се в това, че:
1) когато те се прилагат чрез интрацерейровентрикуларна инжекция (ИЦВ) на обездвижена за 16-18 часа затлъдтяла об/об мишка с телесно тегло поне 30 г в доза от 20 г или по-малко, като се използват методите на Haley и McCormick, пак там, протеинът или полипептидът :а) редуцира поемането на храна по време на часов хранителен тест с 50% в сравнение с контролна мишка, на която е инжектиран вехикул ( ed50 за редуциране поемането на храна, и б) редуцира повишаването на телесното тегло през следващите 24 часа след ИЦВ инжекция поне с 50% в сравнение с контролна мишка, на която е инжектиран вехикул ( ED5Q за редуциране повишаването на телесното тегло)! и
2) Когато те се прилагат интраперитонеално /ИП/ на необездвижена зряла об/об мишка с телесно тегло пове 30 г двукратно на ден в началото на деня и после 3 часа преди стъмване за една седмица, с тотална дневна доза от 20 г или по-малко, протеинът или полипетддът: а) редуцира 5 и 24 часовото поемане на храна поне с 29% в сравнение с контролна мишка, на която е инжектиран вехикул ( ED20 за редуциране поемането на храна), и б) редуцира увеличаванешо на телесното тегло през 24 часа, следващи първата ИП инжекция с поне 20% в сравнение с контролна мишка, на която е инжектиран вехикул ( което представлява ed20 за редуциране на увеличаването телесното тегло).
Освен това редуцирането на телесното тегло и поемането на храната често се проявява в дози под 20 г или по-ниски, дори в степен на дозиране, администрирана ИЦВ от 1 г или по-малко,
- 25 особено когато протеините са пречистени до хомогенност.
Биологичните изследвания, посочени по-горе и описани детайлно в примерите за определяне на биологичната активности на об протеини от хора и/или мивки моаат да бъдет използвани за определяне биологичната активност на фрагменти от тези протеини, когато тези фрагменти са продуциране чрез протеолитично разпадане на об протеините, по химически синтез чрез рекомбинантна протеинова експресия на частична ДНК последователност за об протеините или чрез всеки друг метод, известен на специалиста в областта.
Съгласно друг вариант на изобретението об протеините от хора или мишки .получени по изобретението могат да бъдат свързани с полиетиленови или полипропиленгликолови хомополимери, които могат да бъдат незаместени или заместени чрез естерификация на една от хидрокси -групите при един от техните краища с нисша алкилна група. Тези конюгати дават протеина в стабилна форма и подобряват полуживота на тези протеини. Освен това, използването на тези конюгати, образувани от полиетиленгликол или полипроактивдмя^— пиленгликолови хомополимери, предоставя начин за повишаванеуполуживотГна аитяжютте шеоб протеините в тялото. Също така е намерено, че тези конюгати имат допълнителни предимства като повишаване стабилността и времето на циркулация на терапевтичните об протеини в организма, докато също се намалява имуногенността на об протеина. Тези пегилирани Об протеини могат също лесно да бъдат адсорбирани в човешкия организъм и осигуряват вовишено възприемане в кръвоносната система.
Предпочитаните полиетиленови или полипропиленеви гликолови хомополимери, които се свързват с об протеините имат молекулно тегло приблизително 15 до 60 10а за получаване на протеин, който може да бъде моно- или поли-пегициран с полиетилен или полипропиленгликолови молекули. В предпочитания случай, об протеинът е
- 26 моно- или ди-пегилиран, за да образува конюгат с полиетилен или полипропилен гликолови единици, които в конюгата имат тотално молекулно тегло от 15 до 60 kDa ,за предпочитане от 35 до 46kDa По принцип конюгатите се получават като смеси 9композиции) на полиетилен и полипропиленгликолови конюгати, тъй като полиетилени полипропиленгликоловите изходни материали се продават като смес от различни хомополимери с различни молекулни тегла. Посоченото преди това молекулно тегло е средно молекулно тегло на сместа от така получените об конюгати. Тези смеси могат да бъдат разделени по желание на индивидуални конюгати по известни начини като колонна хроматография, която включва HPLC. Обаче по принцип за лечение тези конюгати се използват като смеси.
Полиетиленгликоловите или полипропиленгликоловите полимери /ПЕГ/ могат да бъдат прикачени към об протеина чрез свободната N-терминалната аминокиселина на протеина до образуването на конюгат по кой да е известеж метод. Методите за прикачване на полиетилен или полипропиленгликол за образуване на конюгати с об протеина могат да бъдат кои да са от известните достъпни. Полиетилен или полипропиленгликол може да бъде ковалентно свързан чрез N-терминалната аминокиселина на протеина, както и през различни лизинови остатъци на протеина.
Също така полиетилен или полипропилен гликоловите хомополимери могат да бъдат конюгирани към об протеина чрез би- шби полифункционални свързващи групи. При получаването на монополиетилен или полипропиленгликолови хомополимерни конюгати, се използват бифункционални линкери и хомополимерът е конюгиран към една функционална група от този линкер, докато N-терминалната аминокиселина както и лизиновата група на об протеина може да бъде конюгирана към друга функционална група на този лижкер. Три- или поли-|полиетилен или полипропиленгликол! полимери^ конюгати с об протеина се обра
- 27 зуват чрзз използване на три- или поли-функционални линкери. Хомополимерът може да бъде конюгиран към два или повече такива функционални групи, като една остатъчна функционална група от линкера се прикачва към об протеина. Между тези линкери са и тези полифункционални линкери, които имат амино- и карбоксифункционални групи. Аминогрупите могат да конюгират с функционализирана хидроксигрупа на полиетилен или полипропиленгликола до образуване на амино връзка. Карбоксигрупи могат да конюгират с аминогрупите на об протеина до образуване на амидна връзка, и с функционализираната хидроксигрупа на гликола до образуване на естер. Известни са различни видове свързващи групи, които могат да се използват за образуване на конюгати между об рротеина и ПЕГ, и които са описани в патенти САЩ 4 902 502, САЩ 5 0S4 514, САЩ 4 609 546, САЩ 5 122 614 и ВАЩ 4 847 325.
Особено предпочитан вариант на изобретението представляват конюгатите, които имат следните формули:
I
R»OCH2CH2(OCH2CH2)n -----0 ---- С -------NH
ЙОСН2СН2(ОСН2СН2)П (сн2)4
I-A
ЙО(СН2СН2О)ПСН2СН2
-----NH
I -в където Р е описаният тук об протеин от хора или мишки;
- 28 и п и η* са числа, чиято сума е от 300 до 1200, така ча средното молекулно тегло на всички ПЕГ единици да е от 15 до 60 М>« и общото молекулно тегло на конюгата е от 30 kDa до 80 W« , а 1 и R* са нисв алкил.
Съединенията с формула Ι-А и Ι-В могат да бъдат получени от известни полимерни материали.
В*О<Я2С82(ОСН2С1^)|| •о
-Л
10СН2СН2(ОСН2СН2) 0··.
КО(СН2СН2О)ПСН2СН2
П-В чрез кондензирането им с об протеин от хора или мивки, описан в това изобретение. Всеки конвенционален метод на реакция на активиран естер с амин до образуване на амид може да бъде използван. В посочената по-горе реакция илюстрираният сукцаиимидилов естер е отделящата се група, която обуславя образуването на амид. Когато се използва съединение с формула П-В за получаването на съединение с формула Ι-В, реакцията с мивия или чивевки об протеин се осъществява по същия начин, описан във връзка с превръщането на съединението с формула П-А в съединението с формула Ι-А. Такива сук- 29 цинимидилови естери като съединенията с формула П-А, които продуцират конюгати с протеини са описани от Monfardini at al., Bioconjugate Chen., 6, 62-69 (1995).
При съединението c формула I-А сумата от n и η’ е от 300 до 1500, така, че да се получи конюгат общо със средно молекулно тегло на ПЕГ единиците от 15 до 60 kDa и за предпочитане от 35 до 45 kDa . В предпочитания вариант на формула Ι-А сумата от п и е от около 860 до 1000 със средна сума на η и от 850 до 1000. Обикновено предпочитаното съотношение на η към п* в съединенията с формула Ι-А и П-А е от 0.5 до 1.5, като най-предпочитано е от
0.8 до 1.2. В случая на съединението с формула Ι-В е за предпочитане между 300 и 1500 за получаването на съединение, имащо от 300 до 1500 ПЕГ единици с общо молекулно тегло от 15 до 60 kDa ,за предпочитане от 35 до 45 kDa . в предпочитания вариант η е от около 850 до 1000.
Човешките или миши об протеини, получени съгласно изобретен нието, могат да бъдат изготвени във фармацевтични състави, подходящи за инжекции, със съвместими фармацевтични приемливи носители или вехикули по известни от нивото на техниката методи. Носителите могат да бъдат органични или неорганични материали, подходящи за ентералне, перкутанно или парентерално приложение. Подходящите носители включват вода, желатин, гума арабика, лактоза, нишесте, магнезиев стеарат, талк, растителни масла, полиалкиленови гликоли, петролево желе и други. Освен това фармацевтичните състави могат да съдържат и други фармацевтично-активни агенти. Могат да бъдат прибавяни и добавки като оцветители, консерванти, стабилизатори, емулгиращи агенти, буфери и други в съответствие с приетата практика зао създаване на фармацевтични форми. Между предпочитаните носители за формулиране на хомогенни об протеини от изобретението са човешки серумен албумин, човешки плазмени протеини и др.
- 30 Прилагането на рекомбинантен хомогенен об протеин, като може да бъде от хора или от мивки или негова комбинация,води до понижаване усвояването на храна и загубата на тегло при затлъстели хора и животни. При това прилагането на об протеина възстановява този протеин, който е важен за регулацията на телесното тегло. Фармацевтични композиции, съдържащи човешки или миш8бпротеини могат да бъдат приготвени с трайна ефективност за прилагане по различни начини на яора или животни, на които се експериментират ненормални колебания в телесното тегло, или самостоятелно, или като част от неблагоприятно медицинско условие или заболяване, каквото е тип II диабетен мелитус. Могат да бъдат използвани различни техники на инжекционно прилагаше като подкожно, интравенозно и интраперитенвални инжекции. Средното количество от об протеин може да варира, и в частност би трябвало да се базира на препоръките и предписанията на квалифициран лекар или ветеринар.
Представените примери илюстрират изобретението без да го ограничават по някакъв начин. КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ЧЕРТЕЙИТЕ.
Фигура 1.е схема на два клонове за човешки об протеин, например hob ell и hob с12 , които схематично очертават разположението и типовете на ограничителните места, локализилани при 5^ и 3’ краищата на об сДНК последователност при хора.
Фигура 2 е схематично изображение на структурата на pLPPsOmpA mob експресионния вектор.
Фигура 3 е схематично изображение на структурата на pLPPsOmpA mohobl експресионния вектор.
ПРИМЕР 1. Получаване на човешка об сДНК.
Човешка об сДНК се получава чрез скриниране на търговски налична ламбда фаг сДНК библиотека (ciontheah )» получена ов РНК, де
- SI дериват ов човеика адипоцитна тъкан. От тази библиотека, две^ лабдни фапь всеки.съдържащ приблизително 2.5 килобаза фрагмент, съответстващ на човешката об сДНК последователност, са получени чрез хибридизация на лайбда фагни библиотеки. Чрез тези две техники са идентифицирани два клонове: hobl сДНК и hob2 сДНК.Човешкият об ген се субклонира до плазмиден вектор ДНК pBluescriptSk, търговски наличен от stratagene . Получените вектори, съдържащи тези човешки об генни последователности се наричат pBluescrlptSk* hobl И pBluescriptSlhob2.
Човешката об генна последователност в тези pBluescrlptSk“hobl и pBluescriptSK*hob2 се проверява чрез нуклеотидно секвериране. Аминокиселинната последователност на протеина, извлечен ов нуклеотидното секвениране, съответства на човешкия об протеин, кодиран с SEQ id N0:4 и както е публикуван ов Zhang, Y.et al., там.
' I * pBluescriptSk hobl има Т-С мутация след стоп кодона на hobl сДНК. Тази мутация води до загубата на Stul рестрикцивй MQCrO което би трябвало да се намира пат· страна, г л в нуклеотидната последввателност на hobl както следва:
hobl
...GGG.TGG.TgA GGCCT TGA...
Gly Cys stop pBluescriptSk^-hobl
...GGG.TGC.TGA 66CCC TGA...
Gly Cys stop рВ1ие8Сг1р€5к“-Ьо1>2
...GGG.TGC.TCA GGCCT TGA
Gly Gys spop
Тъй: като тази мутация в pBluescrlptSk’hobi се локализира след стоп кодона на човешката об сДНК последователност, т$ не води до промяна в аминокиселинната последователност на човешкия
- 32 об протеин, както е описано от ghang Y. а» al.
Относно нуклеотидната последователност на сДНК, присъстваща в pBluescriptSK“hob2 , чрез рестрикционен ензимен анализ е показано, че този плазмид има Stui рестрикционна област, локализирана след стопкодона на последователността на човевка об сДНК.
В допълнение към факта, че pBluescriptSk*hobl има мутация в Stui рестрикционната област, следваща стопкодона, pBluescript pBluescriptSk“hobl има също и едно EcoRl рестрикционно място след отворената рамка ва разчитане (ОРР) в hobl сДНК, което отсъства в hob2 сДНК./виж Фигура 1/.
ПРИМЕР.,2. Конструиране на плазмид за мини об протеин (mob) сДНК от мивка, имаща SEQ id NOjl , се получава по метода, описан от Zhang Y. et al. . и след това се включва в pCDNA3 вектора, достъпен търговски от *an Diego, California, OSA. Така полученият миви об ген се използва за конструиране на експресионния вектор pLPPsOmpA-mob за вкспресирането на об протеина от мивка ( mob). Този експресионен веатор и неговата структура са дадени подробно на фигура 2.
Първият стадий от конструирането се състои в осъществяване на сливането на еигнално-кодиращата последователност на е®»рА гена със зрялата кодираща област на мивия об ген, например без неговата естествена сигнална последователност. Фрагментът на ДНК с 501 бд, кодиращ зрелия миши об протеин, включен в pCDNA3 вектора, се амплифищира от вектора чрез полимеразна верижна реакция (POP) като се използва Vent ДНК полимераза от Nev England Biolabs t уреден праймер (праймер 1), започващ с първия нуклеотид от кодона,кодиращ варин, който е първата аминокиселина в зрелия (Zhang, Y. et al) и реверсивен праймер (праймер 2), съответстващ на mob областта, съдържаща стопкодона на moh Праймерът 2 съдържа също и последователност, съответстваща на Rindin рестрикционнота място.
- 33 Праймер 1| 5» GTG ССТ ATC CAG AAA GTC 3»
Vai Pro Ila Glu Lys Vai
Праймер 2: 5’ tcccaagctt tcagcattcagggctaac 3»
Hindlll stop
Амплифицираният ДНК фрагмент c 501 бд се пречиства чрез агарозна гел електрофореза и се фосфорилира с Т4 полинуклеотидна киназа от Бьорингер, и после се смила с рестрикционния ензим Hindlll, за да се създаде 5' леплив край на мястото на праймера 2. Полученият фрагмент има тъп край, съответстващ на първия нуклеотид от сДНК, кодираща зрял mob , и 5’ леплив край, съответстващ на разкъсаната Hindlll област.
След това sOmpA плазмидът pTIOsOmpArDi , получен по методите на De Sutter К* et al., се слива с mob гена до създаване на плазмид pTIOsOmpA-mob , За осъществяването на това mob фрагментът се клонира чрез лигиране с 94 лигаза ( New England Biolabs ) към pTIOsOmpArPDI векторната ДНК, която предварително е асимилирана с рестрикционните ензими Neel и Hindlll чрез известни от нивото на техниката методи ( Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989). Този pTIOsOmpArPDI плазмид се получава от плазмида p714. ( Parker и Wiley, Gene, 83, 117-134 (1989)|. Този плазмид съдържа сДНК, кодираща сДНК на зряла протеинова дисулфидна изомераза от плъх (зПДИП), която сДНК е слята с sOmpA последователността.
Това сливане на последния кодон на sOmpA (аланин) с първия кодон на сДНК на зрялата ПДИП (глицин) създава Mael рестрикционната област, която след разкъсване с Mael освобождава като тъпи краища последния кодон на sOmpA последователността и първия кодон на сДНК, кодираща последователността на протеиновата дисулфидна изомераза от плъх (ПДИП).
| 5».... | Nael ......GCC | / GGC .··..··. | |
| Ala | Gly |
яОшрА сДНК / сДНК на зряла протеинова дисулфидна изомераза от плъх ( ПДИП)
Участъкът Hindlll съществува в края на кодиращата сДНК на ПДИП. След това смилането на този плазмид с Hindlll освобождава основната част на сДНК на ПДИП и създава 5*леплив край, съвместим с един от краищата на фрагмента на полимеразната фермана реакция. Полученият плазмид, в който сДНК, кодираща протеиновата дисулфидна кодираща изомераза от плъх (ПДИП) е заменена отубДНК на възрастна об мивка, е наименован pTlOsOmpAmob и е изобразен на фигура 2.
Лигираната ДНК се включва в щам МС1061 на Е.соИкато се използва стандартна електропорация и получените колонии се скринират чрез рестрикционен ензимен анализ за наличието на зрял об ДНК фрагмент. Клонът pTlOsOmpAmob има последователността, кодираща зрелия об протеин от мивка, слята с последователността, кодираща sOmpA,
После експресирането на mob на E.coli в този pTlOsOmpAmob се поставя под контрола на липопротеинов промотор (Ρχρρ) и на лак-промоторния оператор (₽0χβ(1 )· За да се осъществи това хибридната гевна sOmpA-mob последователност се трансферира от плазмида pTIOsOmpA-mob към плазмидния вектор pLPPsOmpArPDI чрез стандартни процедури, описани от pe Sutter et al. * Както вече беве споменато плазмидът pLPPsOmpArPDI е дериват от плазмида p714|(parker и Wiley, Gene 83, 117-134 (1989)|. За осъществяване този стадий ДНК на плазмида pTlOsOmpAmob се разкъсва с рестрикционните ензими xbal иHindlll . Фрагментът, съдържащ кодиращата ДНК на sOmpA-mob ,после се лигира до плазмида pLPPdOmpArPDi »от който кодиращата ДНК на зОтрА -ПДИП предварително се отделя чрез разкъсване с DecTDHKUHOHHMTe ензими Xbal u Hindlll. Полученият
- 35 плазмид се наименова pLPPsOmpAmob.
ПРИМЕР 3. Експресиране на миши об протеин в Е.coli (МС1061)
Експресиране на мишия об протеин в Е.coli се постига по следния начин. Плазмидът pLPPsOmpAmob създаден съгласно пример 2, се въвежда чрез електропорация в щам МС1061 на E^coli. .Клетките Е.coli МС1061, които приемат плазмида pLPPsOmpAmob, растат цяла нощ при 28°С в среда Luria-Bertania (Difco Laboratories),захранена с антибиотика карбеницилин
Beecham) . Тази култура
после се използва като инокулат (при разреждане 100 пъти) за култура 30 мл цяла нощ при 28°С в същата среда. Тази култура после се разрежда 100 кратно в 3 литра (например 6 х 0.5 л в 1 литър ерленмайерови колби) в горната среда и се разбърква при 28°С във въздушен шейкър New Brunswick ( 300 об/мин) за около 4 часа, докато се постигне плътност Αθθθ от 0.3 до 0.5. В това време лакпромоторът се индицира чрез прибавяне на 2 мМ крайна концентрация от изопропил-^-п-тиогалактопиранозид (ИПТГ), Boeringer , както е описано от De Sutter et a1.,supra. Клетките след това се инкубират при 28°С за около 5 часа, докато клетъчната плътност достигне Αθθθ от 1.3 до 1.5. После клетките се събират чрез центрофугиране в ро тор JA1O (Бекман центрофуги, модели J2-21 или J2-21M ) за 6 ми нути при 6750 об/мин (8000 х 8 ) при 4°С* Супернатантната течност се отделя и клетъчните пелети бързо се ресуспендират в 250 мл леденостуден осмотичен шоков буфер (100 мМ трис-HCI, pH 7.4, съдържащ 20% сукроза ЮмМ ЕДТА) и се инкубират върху лед за 10 до 20 мищути, както е вписано от Koshland u Botstein, supra.
След това суспенсията се пренася в пластиасови центрофужни епруветки и клетките се събират чрез центрофугиране при 8200 об/мин (8000 х g ) за 5 минути при 4°С в ротор JA2°. Супернатантата се отделя и клетъчните пелети бързо се ресуспендират в 120 мл ледена вода при енергично разбъркване и се инкубират върху лед за още минути. Суспенсията после се центрофугира в ротора JA20 за 6 минути при 4°С при 11 500 об/минута (16 000 х g ) и супернатантата, съответстваща на периплазмичната фракция (осмотична шокова фракция) се събира -около 120 мл. Прибавят се натриев азид и трис-HCI ( (pH 7.5 ) до крайна концентрация съответно 0,05% и 50 мМ. Осмотичната шокова течност, съдържаща мишия об протеин се съхранява при -20°С до следваща употреба.
ПРИМЕР 4. Експресиране на миши об протеин в E.coli (МС1061)
Експресиране на миши об протеин се осъществява съгласно процедурата, описана в пример 3, с разлика, че се използва антибиотикът триацилин (100 g/®l) в добавка към средата Luria-Bertaria (по-често от карбеницилин).
ПРИМЕР 5. Пречистване на миши об протеин от E.coli осмотичната течност.
Мишият об протеин, поставен в 120 мл замразена осмотична шокова течност съгласно пример 4, се пречиства по следния начин. Осмотичната шокова течност 120 мл, съдържаща мишия об протеин, се размразява и центпофугира при 42С за 20 минути при 16000 сб/мин. в ротор JA20 за отделяне на неразтворимите онечиствания. Супернатантата после се зарежда директно в колона, съдържаща 30 мл обем пласт от Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia), предварително буферир ран с 50 мл трис-HCI (pH 7.5 ) буфер. След промиване с 50 мл трисHCI ( pH 7.5 ) буфер mob протеинът се елуира с 50 мл трис-HCI ( pH 7,5 ) буфер, съдържащ 0.1 И MaCI.
След това се прибавя твърд (nh4)2SO4 към елуирания материал от колоната, съдържаща Q-Sepharose Fast Flow с крайна концентрация 1.0 М , и сместа се зарежда в колона, съдържаща 7*5 мл пласт от бутил-сефароза Fast Flow (Pharmacia), предварително буферирана с 50 мл трис-HCI ( pH 7.5 ) буфер, съдържащ 1.0М (nh4)2SO4 След промиване с трив-HCI (pH 7,5 ) буфер, съдържащ 1.0М (nh4)2SO4
- 37 протеинът nob се елуира чрез прилагане на градиент от 1.0 ММ (NH^)2SO4 в 50мМ трис-HCI (pH 7.5 ) буфер към 20% етилен гликол във вода. Протеинът ΥΠ”елуира от бутил-сефароза Fast Flow колона в самия край на градиента, докато повечето онечиствания елуират много по-рано. Чистотата на mob протеина на този етап е 90%, което се установява чрез съдържаща сребърно покритие полиакриламидна гел електрофореза (PAGE).
Протеинът mob в материала, елуиран от бутил-цефароза Fast
Flow, съдържащата колона, после се пречиства чред гел филтрад ционна хроматография. За провеждането иа това мишият ob протеин се кноцентрира при 4°С до обем 1 мл на мембрана УМ10 (Amlcon) като се използват 8МС концентрираща единица (Amlcon) и се прилага на колона ( 1.0 км х 50 см), съдържаща 39 мл Г109 -Цефадекс (Pharmacia) ,предварително буферираиа във фосфатен буферен разтвор.
Фракциите, съдържащи mob протеина, се изливат и протеинът се концентрира на мембрана УМ10. На този етап mob протеинът има повече от 95% чистота, установено чрез page
SDS-page проявява единична протеинова ивица при Мг 15000.
ПРИМЕР 6 .Анализ за последователностина миши об протеин.
N-терминална аминокисеиинна последователност на мишия об протеин, получен и пречистен по процедурите от примери 2, 3, 4 и
5, се провежда по метода на Laemli, U.K. . След електротрансфер на протеините, подложени на електрофореза в поли(4-винил N-метилпиридиниев йодид) обвити слоеве от стъклени фибри, описано от Bauw, G. et al., J.Biol. Chem., 7,194-196(1988), ивицата на протеи на c Mr 15 000 се изрязва от мембраната и N-терминалната амино- киселинна последователност се определя чрез Едманово разпадане на 470А газов секвенатор, снабден с 120А онлайн фенилтиохидантоин аминокиселинен анализатор (Applied Blosysterns). Н-Терминалната аминокиселинна последователност на мишия об протеин,се получава
- 38 чрез гореописаните процедури е Val-Pro-ile-Gln , съответстваща на зрелия миши об протеин от SEQ ID Ν0ι3.
ПРИМЕР ?. Създаване на експресионен вектор за човешки об протеинДюб/ Човешкият об протеин, получен по процедурите от пример 1 се използва за създаване на експресионен вектор pLPPsOmpAhobi за експресиране на човешки об протеин. Това конструиране е подобно на конструирането на pLPPsOmpAmob «описано в пример 2, и детайлирано ва фигура 3. Изисква се три-фрагментно лиг< .иране за да се запълни ДНК фрагментът, съдържащ пълната зряла човешка об ** кодираща последователност.
В първия стадий на конструирането hob нуклеотидната последователност, започваща с първия нуклеотид на кодона, кодиращ първаша амино киселина от зрелия човешки об протеин фЬалин) се слива със сигналната кодираща последователност от OmpA (sOmpA) , така че sOmpA последователността е по посока на 5’ края на hob нуклеотидната кодираща последователност. Този ДНК фрагмент се получава чрез л . на смес на полимеразна· верижна реакция,съдържаща плазмида pBluescriptSK*hobl , Vent ДНК полимераза и два праймера. Предният праймер (праймер 1) започва с първия нуклеотид на кодона, С кодиращ първата аиинокиселФиа на зрелия човешки об протеин, и противоположният праймер (праймер 2) съдържа последователността на адайфикация човешката сДНК, съдържаща стоп кодона. йеакцията на уголемяване ' води до получаване на ДНК фрагмент от 601 бд съдържащ последователността, кодираща зрелия човешки об протеин. Краят 5* на този ДНК фрагмент после се фосфорилира с Т4 полинуклеотидна киназа и асимилира с рестрикционния ензим HindiII , като се получава 353 бд ДНК фрагмент, имащ тъп край, съответстващ на първия нуклеотид от сДНК, кодираща зрелия hob {^позиция,съответстваща на праймера 1), и ί» леплив край, съответстващ на разцепената Hindlll област. Този 3S3 б^ДНК фрагмент се пречиства чрез агарозна гел електрофореза и се клонира в плазмида pTlOeOmpArPDi който предварително е бил предварително асимилиран с рестрикционните ензими Нле1 и Hindlll . Полученият плазмид pTlOeOmpAhobl /частично/ има ДНК фрагмента, кодиращ част от зрелия човеики об протеин (амино-терминална част), слят с последователността, кодираща sOmpA.
Праймер 11 5» GTGCCCATCCAAAAAGTC 3*
Праймер 2: 5’ ТСССААбСТТТСАбСАСССАбббСТСАб 3» стоп
Във втория стадий ДНК последователността, кодираща карбокси терминалната част на човеакия об протеин, например фрагмевт 2, е лигатиран към ДНК фрагмента, кодиращ амино-терминалната част на зрелия hob, и полученият фрагмент, кодиращ цялата зряла hob последователност, слята с eOmpA, се трансферира до плазмид pLPPsOmpArPDi за провеждането експресирането на зрял човижки об протеин в Е. coli под контрола на липопротеинов промотор и лакпромоторен оператор. За осъществяване на това плазмадът pTlOeOmpAhobl /частично/ се асимилира С Xbal И Hindlll и ДНК фрагментът 1 с Й00 б&от hob се изолира чрез агарозна гел електрофореза /фрагмент 1/. След това плазмидът pBlueecriptSK’hobi се разцепва с Hindlll и EcoRIh се изолират 450 б^чрез агарозна гел електрофореза /фрагмент 2/. Накрая плазмидът pLPPsOmpArPDi се разцепва с Xbal и EcoRI и векторният фрагмент, изолиран с агарозна гел електрофореза /фрагмент 3/. ДНК фрагментите 1,2 и 3 след това се лигатират до един друг и лигатурната смес се въвежда в Е. coll щам МС1061. Колонията, съдържаща крайнвят конструиран плазмид pLPPsOmpAhobl се използва зе експресиране и секретиране на зфя& човеики об протеин.
ПРИМЕР 8. Експресиране на човевки об протеин в Е.coli (ЙС1061)
Създаденият плазмид pLPPsOmpAhobl, съгласно пример 7, се използва да трансформира Е.coli щам МС1061 за експресиране на
човешки об протеин в разтворима биологично-активна форма в периU Иойри w мол плазмата на клетките на гостоприемника Е.coll . Въвоида!гето на плазмида в тези клетки на гостоприемника Е. colice осъществява чрез електропорация. Клетките на Е.coll (МС1061),които приютяаа*плазмида pLPPsOmpAhobl се развиват при 28®С в среда Luria-Bertania (Difco Laboratories) ,допълнена о антибиотика карбеницилин (100 y4g/ml,Beecham ) до съответната плътност, след което лакпромоторът се индуцира чрез прибавяне на 2мМ крайна концентрация от изопропил-|-0-тиогалактопиранозид ( ИПТГ, Boehringer ),както е описано от De Sutter et al., . След това клетките растат докато клетъчната плътност достигне 1.3 Αθθθ. После клетките се събират чрез центрофугиране ( 8000 х g при 4®С) и клетъчните пелети бързо се ресуспендират в леденостудена осмотичен шоков буфер ( 100 мМ трис-HCI, pH 7.4, съдържащ 20% оукроза и ЮмМ ЕДТА), и се инкубир<*върху лед за 10 минути както е описано от Koshland и Botstein, supra.
След това плетките отново се събират чрез центрофугиране както по-горе и клетъчните пелети се ресуспендират в ледена вода и се инкубират на лед за 10 минути. Суспензията после се центрофугира за 5 минути при 16 000 хай супернатантата (осмотична шокова течност) се събира. Прибавят се натриев азид и трис-HCI ( pH 7.6 № до крайна концентрация 0.05% и 50 мМ,съответно. Осмотичната шокова течност, съдържаща човешкия об протеин се съхранява при -20°С до следваща употреба.
ПРИМЕР 9. Експресиране на човешки об протеин в El coll (МС1061) Експресиране на човешки об протеин се провежда като се използва процедурата от пример 8, с разлика, че като антибиотик се използва триацилин ( 100 g/ml ) вместо карбеницилин за допълване на средата Luria-Bertaria.
- 41 ПРИМЕР 10. Пречистване на човешки об протеин от оомотична течност на Е. coll
За пречистване на човешки об протеин в осмотичната шокова течност от пример 9 се прибавя
KaCI към течността до крайна течността се зарежда директно в концентрация 0.1 М и след това колона, съдържаща 30 мл обем подложка от Q-цефароза Фаст Флоу , к балансирана (Pharmacia) предварително буфериран с 50 мМ трис-HCI буфер с pH 7.5.
След това се прибавя твърд (nh4)2SO4 вимп изтичащия материал, елуиран от колоната, съдържаща -цефароза Фаст Флоу до крайна концентрация 1.0 М и сместа се зарежда в корона, съдържаща 7.5 мл пласт от бутил- Sepharosw Fast Flow ( Pharmacia) предварително буфериран с 50 мМ трис-HCI буфер с pH 7.5, съдържащ 1.0 М (NH4)2SO4 . След промиване с трис-HCI с pH 7.5 буфер, съдържащ 1.0 М (ин4)2§О4 , hob протеинът се елуира чрез използване на градиент от 1.0 М (NH4)2SO4 в 50 мМ трис-HCI буфер с pH 7.5 към 20% етилен гликол във вода. Човешкият об рротеин, елуиран от колоната, съдържаща бутил-цефароза Fast Flow в самия край иа градиента, докато повечето онечиствания елуират много по-рано. Чистотата на hob протеина на този етап е 90%, установено чрез полиакриламидна гел електрофореза. ( PAGE). / със сребърно оцветяване#
Човешкият об протеин в материала, елуиран от колоната, съдържаща бутил-цефароза Fast Flow след това се пречиства чрез гел филтрационна хроматография. За целта човешкият об протеин се концентрира при 4®С що обем 1 мл върху мембрана УМ10 (Amicon) , като се използват 8МС концентрационни единица (Amicon) и се зарежда на колона ( 1.0 см х 50 см ), съдържаща 39 мл G-100 Sephadex (Pharmacia) предварително бу^е^фй^във фосфатен буферен разтвор. Фракцията, съдържаща hob протеина има чистота
- 42 повече от 95%, установено чрез page и сребърно оцветяване.
Анализът sds PAGE на елуата разкрива единична протеинова ивица при Мг 15 000.
ПРИМЕР 11. Пречистване на човешки об протеин от оснотична течност на Е. coll.
За пречистване на човеяки протеин в осмотичната шокова течност от пример 9 се използва процедурата от пример 10 със следните изменения: преди да се прибави твърд (mh^)2so4 към изтичащия продукт, се осъществяват следващите стадии, които са свързани с осмотичната течност от пример 9.
Човешкият об протеин в осмотичната шокова течност от пример 9 се зарежда директяо в колона, съдържаща 30 мл подложка от q цефароза Fast Flow ( Pharmacia ) , предварително буферирана с 50 мл трис-HCI (pH 7.5 ) буфер. След промиване с 50 мл буфера от трис-HCI (pH 7.5 ) hob протеинът се елуира с 50 мл буфер трис-HCI ( pH 7.5 ), съдържащ 0.1 М ISaCI.
ПРИМЕР 12. Анализиране последователността на човешки об протеин.
N-Терминалната аминокиселинна последователност иа човеяки об протеин, пречистен и получен по процедурите, описани в примери 7 - 11, се осъществява съгласно метода на Laemli, ϋ. к.supra. След електротрансфер на протеините, подложени на електрофореза върху слой от ятъклени фибри, обвит с поли(4-винил-И-метилпиридиниев йодид), както е описано от Bauw et al., ивицата на протеин с Мг·15 000 се изрязва от мембраната и после N-терминалната аминокиселинна последователност после се определя чрез Едманово разпадане върху 470А газово-фазов секвенатор, екипиран със 120 А онлайн фенилтиохидантоин аминокиселинен анализатор
Н-Терминалната аминокиселинна последователност на hob протеина, получен по гореописаните процедури е Val-Pro-Ile-Gln .съответстваща на зрелия човешки об протеин seq id no:6.
- 43 ПРИМЕР 13. Биологична активност на об протеин от мивка: интрацеребровентрикуларно /ИЦВ/ инжектиране на об/об мивка.
Биологичната активност на зрял миши об протеин, пречистен според пример 5, се определя като се използва ИЦВ метод, по следния начин. Инфузия канула се имплавтира на латералната кухина на мозъка на анестезирана женска затлъстяла об/об мивка ( на възраст от 6-13 седмици), като се използват следните размери: 2 мм латерално от средната линия, 0.6 мм от вевовете, 2 мм отдолу), съгласно методите на Haley и McCormick . Краят на канулата се наглася на черепа ,използвайки бижутерски винт и зъболекарски цимент. Мивките са поставени поотделно в пластмасови клетки със свободен достъп до храна ( с изключение на нощта, преди ИЦВ инжекция), и вода. Следващо възстановяване от хирургическата намеса чрез преценка на ежедневното усвояване на храна и повишаването на телесното тегло мишките се изследват в няколко момента, след ИЦВ инжекция от 1 ил с един от следващите тестови разтвори:
1) изкуствена церебро-спинална течност /ЦСТ/;
2) бактериален контролен разтвор,
3) об протеин ( 0.6 до 1 μ g/мишка), или
4) без инфузия.
Инжектирането на един от горните тестови разтвори ивтрацеребровентрикуларно на всяка мишка е последвано от 1 мл изкуствена церебро-спинална течност/ЦСТ/,за да се избистри канулата.
За целите на този експеривент бактериалният контролен разтвор е образец, идентично процидиран и получен съгласно методите, изложени в примери 2-4, с разликата, че плазмидът, вжд5м'в Е. coil бактериа ве съдържа МИщИ об ген.
Мишките се обездвижват за 18 часа /цяла нощ/ преди ИЦВ инжекция. Мишките са слабо задържани и 10 ц!л Хамилтонова спринцовка, пригодена с парче от ррекалибрирана полветиленова (РЕ) тръба (РЕ20),
- 44 се използва за инжектиране на 1 μΐ от изпитвания разтвор в канилата, поставена в латералната кухина. След това мивките веднага се поставят в опитна клетка с блюдо с храна, съдържащо предварително претеглено количество храна за мивки под формата на пелети и бутилка с вода. Мивките се наблюдават визуално и се измерва поемането на храна през следващите седем часа. Измерванията на поемането на храна се отчитат на 0.5, 1, 2, 3, 4, 6 и 7 часа след интрацеребровентрикуларната /ИЦВ/ инжекция. За всяко животно се измерва телесното тегло преди ИЦВ инжекция и 24 часа след това. Успешното поставяне на канюлата се доказва чрез повишаване на двучасовото усвояване на храната след ИЦВ инжекция на 10 mg невропептид У при мишка, обездвижена за 2 часа, по метода на Morley, J.b. et al., American J. Physiol., 253, 516-522 (1987).
Резултатите от ИЦВ изпитване, описано по-горе, са следните:
A. Редуциране поемането на храна
По време на първите 30 минути след ИЦВ инжекция почти всички мишки ядат с кратка латентност и консумират приблизително 0.5 г. Мишките, които не са третирани с инжекция или с церебро-спинална течност /ЦСТ/, продължават да ядат през следващите 6.5 часа и достигат кумулативно 7-часово усвояване от 3.2 грама./Таблица 1/. Обратно, мишките, третирани ИЦВ с об протеин, спират да ядат след първите 30 минути и после не се хранят. Така тяхното кумулативно усвояване на храна остава редуцирано през следващите 6.5 часа на около 0.5 грама./Таблица 1/. Мишките, третирани ИЦВ с контролен разтвор на вехикул, също спират да ядат след 30 минути, и започват да ядат отново едва след 6 и 7 часа.
B. Редуциране повишаването на телесното тегло.
Изменението за 24 часа в телесното тегло на мишките, инжектирани ссконтролен вехикул, е слабо редуцирано в сравнение с това на мишки, третирани с изкуствена ЦСТ, или на неинжектирани мишки./Табл.1/
- 45 Обаче процентното изменение в телесното тегло на мишките, инжектирани с об протеин е приВлизително нула и е значително редуцира» но в сравнение с мишки, инжектирани с контролен вехикул/Таблица 1ί. В. Заключение
Наблюдаваният ефект на директно прилагане на рекомбинантен миши об протеин ( 1.1 Mg/мишка в 1 Мл в мозъка) ое изразява в продължително и значително редуциране на усвояването на храна и увеличаването на телесното тегло на женска об/об мишка. Това показва, че об протеинът може да действа директно върху мозъка и е съвместим с ефекта на об протеина, когато се инжектира интраперитонеално. Този пример също потвърждава биологичната активност на бактериално експресиран рекомбинантен миши об протеин при женска затлъстяла об/об мишка, съгласно това изобретение.
ТАБЛИЦА 1
| Третирания | Поемане на храна ( 0.7 часа ) | Увеличаване телесното тегло ( 0- 24 часа) | |
| g | %♦♦ | g % | |
| Изкуствена цереброспинална течност | 3.2 i 0.2 | 100% | 3.8 - 0.3 100% |
| Контролен вехикул | 0.9 i 0.3 | 28.1% | 2.9 ί 0.2 76% |
| об протеин | 0.5 i 0.1* | 15.6% 0.3 ί 0.5* 8% | |
| ( 1 μ 8/мишка) |
* показва значителни различия между об протеин и изкуствена щеребро-спинална течност /ЦСТ/ групи с р <0.05 ** показва проценти на контрола
ПРИМЕР 14. Биологична активност на миви об протеин ,приложен интравенозно /ИВ/ при об/об мивки.
Биологичната активност на миши об протеин, получен и пречистен според примери 2, 3, 4 и 5 се изпитва чрез интравенозно инжектиране при затлъстели об/об мишки по следния начин:
Мъжки и женски затлъстели об/об мишки (на възраст 6-13 седмици) се имплантират с хроничен югуларни канули под анестезия с певтобарбитал ( 80 мг/кг телесно тегло) по метода на Mokhtarian,
A., et al., Physiol. Behav. 54, 895-898 (1993)*.
Мишките се пазят поотделно в пластмасови клетки при постоянни условия с цикъл от 12 часа тъмнина и 12 часа осветление. Телесното тегло се измерва при смесване през деня и очевидността на канулите се проверява и поддържа всеки следващ ден чрез инфузия на < 0.1 мл стерилен хепарин/физиологичен разтвор ( 50 ц/mi в 0.9% физиологичен разтвор). След пълно възстановяване от хирургичната намеса, което се преценява от повишаването телесното тегло, мишките се обездввжват 16-18 часа Вцяла нощ/. Следващата сутрин мишките се премерват и се поставят в експерименталната клетка за 45 минути за аклиматизиране првди опита. Непрекъснато са заредени с вода. Интравенозно се инжектира 3 pg в 0.1 мл миви об протеин или еквивалентен абем от контролен вехикул или 0.9% ржжхвшрхка физиологичен разтвор. Раздвижените мишки леко се ограничават и се използва 0.5 мл инсулинови спринцовки за инжектиране 0.1 мл от опитния разтвор, последвано от 0.®5мял хепарин/ физиолочен разтвор. Опитвее са разделени през три дни. След това мишките бързо се поставят отново в опитната кретка с предварително претеглено петри с храна, съдържащо пелети от миша храна. Мишките са наблюдават и се измерва приемането на храна за следващите седем дни на 0.5, 1, 2, 3, 4, 6 и 7 часа след ИВ жнжекция. Телесното тегло се измерва преди ИВ инжекция и отново 24 часа след това.
- 47 Две отделни групи канулирани мишки ( 11 об/об и 12 мършави) се използват в пет индивидуални опита. Поиечето мишки получават об протеин и една или две контролни инжекции в противовесен ред. В този опит се използват два отделни препарата на миши об протеин. Представените тук данни са комбинация от резултатите от тези индивидуални репликации.
А. РЕЗУЛТАТИ
Резултатите от горния експеримент са следните:
По време на първите 10 минути след ИВ инжекция повечето затлъстели и мършави мишки ядат с кратка ватентност и консумират приблизително 0.3 - 0.5 грама. Усвояването на храна при затлъстели мишки, инжектирани с физиологичен разтвор и контролен вехикул се увеличава по време на експеримента. Кумулативното усвояване на храна от затлъстели об/об мишки, инжектирани с контролен вехикул, не е различно от усвояването на храна на подобно обездвижени мишки, които са инжектирани с физиологичен разтвор. Напротив, усвояването на храна от затлъстели об/об мишки, инжектирани с рекомбинантен об протеин е значително редуцирано и остава понижено на 57% от коятролата (таблица 2). Не се наблюдават други ефекти на поведение при групите с контролен вехикул и об протеин през 7-часовия период на наблюдение. Както се очаква, 24-часовия» повишаване на теглото след инжекцията не е различно в третираните групи (таблица 2), което се дължи на ограничената продължителност на действие на единичен ИВ болус от миши об протеин.
Б. ЗАКЛЮЧЕНИЯ.
Тези резултати показват, че рекомбинантен миши об протеин значително редуцира кумулативното 7-часово усвояване на храна след ИВ прилагане ( 3 pg /мишка ) при затлъстели об/об мишки. Способността на рекомбинантния миши об протеин да редуцира усвояването на храна при затлъстели об/об мишки съвпада с резултатите за усвоя
- 48 ване храната, получени след неколкократни ИП инжекции на об протеин на затлъстели об/об мивки. Този пример също потвърждава, биологичната активност на бактериално експресиран рекомбинантен миши об протеин при женски затлъстели об/об мивки.
ТАБЛИЦА 2: Интравенозно приложение на миши об протеин при об/об мишки.
| Третирания | Усвояване на храна (0-7 часа) | Увеличаване телесното тегло (0-24 часа) | ||
| g | %** | g | % | |
| Физиологичен | ||||
| разтвор (пп · 4) | 1.8 * 0.2 | 2.9 * | 0.3 | |
| Контролен вехикул (п - 7) | 1.4 ί 0.3 | 100 | 2.2 - | 0.6 100 |
| об протеин ( 1 pg /мишка ( п· 8) | 0.8 i 0.2* | 67 | 1.4 ± | 0.6 64 |
Данните са осреднени - яет η = показва броя на индивидуалните мишки, sem означава стандартна грешка на стойността! * показва значителни различия между групите об протеин и изкуствена церебро-спинална течност с р < 0.05.
** показва процентите на контролата.
ПРИМЕР 15. Биологична активност на мишия об протеин: неколкократни ивжекции при об/об вишки.
Биологичната активност на мишия об протеин, получен и пречистен съгласно примери 2-5 е изпитан чрез неколкократно интраперитонеално инжектиране при затлъстели об/об мишки както следва.
Три групи от шест женски затлъстели об/об мивки се изучават. Мивките се държат в пластмасови клетки ( по три в клетка) при постоянни условия на околната среда при 12 часа тъмнина и 12 часа светлина. Двадесет и четири часовото усвояване на храна и повишаването на телесното тегло се измерват всеки ден. След един жджяхящияхшм период ши на адаптация към околната среда и всекидневно третиране и инжектиране мишките се изваждат в три групи на третиране. Всяка мишка получава две интраперитонеални инжекции при всяко дневно третиране ( малко преди началото на киххлж тъмната фаза от цикъла тъмнина/светлина и три часа по време на тъмната фаза) с 0.1 мл от следващите тестови разтвори:
1. физиологичен разтвор 0.9%;
2. бактериален контролен разтвор, или
3. миши об протеин ( 3 μδ/θ·1 ml)
Бактериалният контролен разтвор е образец, идентично процидиран и получен в съответствие с процедурите от примери 2 -4 за получаване и пречистване на миши об протеин, с изключение на това, че плазмидът, въведен в Е. coli бактериите не съдържа миши об ген. Мишките се третират два пъти дневно за пет дни и после не се третират в продължение на два дни. Във всяка клетка се измерва поемането на храна на 2, 3, 5 и 24 часа след първата ИП инжекция във всеки ден на третиране.
А. Резултати
Редуциране усвояването на храна./приемането на храна/ Приемането на храна не е различно при мишки, инжектирани с физиологичен разтвор или бактериален контрол в дните на третиране и нвтретиране в продължение на една седмица експеримент/Таблица 3/ Все пак приемането на храна се редуцира при шесте мишки, инжектирани с 6 pg об протеин в дните на третиране по време на експеримента. Редуцирането на поемането на храна се наблюдава на 2, 3, и 24 часа след първата инжекция в дните на третиране при мивки, получаващи об протеин в сравнение с групите с бактериално контрол
но и фвнтролно третиране с физиологичен разтвор.
Редуциране увеличаването телесното тегло
Кумулативното увеличаване на телесното тегло за петте дни на третиране на групата с об протеин е -3.3 +/-0.7 грама в сравнение с-0.9 + /- 0.2 грама в групите с физиологичен разтвор и -0.7 +/ - 19.4 грама в бактериалната контролна група./Таблица 3/ ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Този пример показва, че двудневно ИП инжектиране на бактериално експресиран рекомбинантен об протеин ( 6 pg /мишка/ден) има за резултат значително забавено редуциране на усвояването на храна и значително понижаване степента на увеличаване на теглото при третирана женски об/об мишки в сравнение с третирани с физиологичен разтвор и бактериален контролен разтвор об/об мишки. Тези резултати показват, че бактериалният експресиран миши об протеин е биологически активен и притежава очакваното действие срещу затлъстяване при генетично затлъстели об/об мивки съгласно това изобретениет В таблица 3 резултатите от 2 и 5 часа представляват средното двевно усвояване на храна, докато резултатите за 24 часа представляват 5-дневното кумулативно усвояване на храна.
ТАБЛИЦА 3. Неколкократно прилагане интраперитонеално на миши об протеин при об/об мивки.
| Третиране | Усвояване на храната (грамове/ 3 мивки) | Повишаване на телесното тегло | |||||
| ? 2 часа | 5 часа | 24 часа | грамове | ||||
| г | контр | г | X конт | > г | 1 конти | ||
| Без инжекция | 5.5 * 0.5 | 14.5 ίο.5 | 44.3 *3.5 | 0*9*0* 2 | |||
| Контрол | 7.0* 0.5 | 100 | 16.5*0.5 | 100 | 49.5* 6.1 | 100 | -0.7*0.4 |
| об протеин | 3.5 * 0.5 | 50 | 5.5 * 1.θ’ 1 | * 33 L— | 25.5*4.6* | 52 | -3.3+0.7* |
X контрола
Данните са осреднени * ее» за вест об/об мивки във всяка група. Усвояването на храна е средното кумулативно усвояване за клетките с три мивки по време на петте дни с третипане на 2, 5 и 24 часа след първата ИП инжекция. Повиваването на телесното тегло е кумулативното изменение в телесното тегло по време на петте дни на третиране. * показва значителните разлики между об протеин и вехикулните групи с р <0.05.
ПРИМЕР 16. Биологична активност на човевки об протеин: интрацеребровентрикуларно инжектиране /ИЦВ/ при об/обб мивки.
Използваните методи за определяне биологичната активност на човевки об протеин чрез интрацеребровентрикуларна /ИЦВ/ инжекция при об/об мишки са същите, както в првмер 13,, с тази разлика, че тестовите разтвори са:
- рекомбинантен човешки об протеин, получен в пример 11 (0.05 Pg) във фосфатен буферен физиологичен разтвор /ФБФР/,съдържащ 0.1% миши серумен албумин, и
- 52 - фосфатен буферен физиологичен разтвор /ФВФР/, съдържащ 0.1% (т/об) мини сурумен албумин (албуминов контрол) като вехикулния контролен разтвор.
A. Редуциране на приемането на храна
През първите 30 минути след ИЦВ инжекция пвчти всички мивки ядат с кратка латентност и консумират приблизително 0.5 грама. Мивките, които не са инжектирани продължават да ядат през следващ щите 6.5 часа и достигат 7 часа приемане на 1.8 грама/Таблица 4/. Мивките, които получават ИЦВ албуминов контролен разтвор също спират да ядат след 30 минути и отново започват да ядат едва между 3 и 7 часа. Напротив, мивките, третиране с човешки об протеин ИЦВ ядат значително по-малко в първите 30 минути /0.2 грама/ и ядат мнаго малки количества през следващите 6.5 часа. Така техното кумулативно приемане на храна остава понижено през следващите 6.5 часа при приблизително 0.4 грама./Таблица 4/.
Б. Редуциране увеличаването на телесното тегло часовото изменение на телесното тегло на мивки, инжектирани с контролен вехикул е малко по-ниско от това на инжектирани с изкуствена церебро-спинална течност /ЦСТ/ или неинжектирани мишки. /Тблица 4/. Все пак процентното извенение в телесното тегло на мишките, инжектирани с човевки об протеин е около нула/Таблица 4/
B. Заключение
Наблюдаваният ефект на директно прилагане на рекомбинантен човешки об протеин ( 0.05 pg /мишка)в ΐμΐ ) в мозъка за получаване на забавено и значително редуциране в усвояването на храна и увеличаването на телесното тегло на женски об/об мишки показва, че об протеинът може да действа директно на мозъка и е съвместим с ефекта на об протеина, когато се инжектира ИП. Този пример потвърждава също биологичната активност на бактериално експресиран
- S3 рекомбинантен човешки об протеин при женски затлъстели об/об мишки.
ТАБЛИЦА 4. ИЦВ прилагане на човешки об протеин при об/об мишки
| Третирания | Приемане на храна ( 0.7 часа) | Ввеличаване телесното тегло ( 0 -24 часа) | |||
| г | %** | г | %♦* | ||
| без инжектиране | 1.8 t 0.2 | 3.1 | t 0.4 | ||
| ( П - 3) | |||||
| албумин контрол ( « 3) | 1.0 t 0.4 | 100 | 1.7 | i 0.6 | 100 |
| ЧОВЕШКИ об протеин ( 1 pg/ мишка ( П - 5 ) | 0,4 ί 0.2* | 40 | 0 t | 0.8 | 0 |
| Данните са | осреднени - eem | . II | = показва броя | на отделните |
мишиии * показва значителни разлики между човешкия об протеин и изкуствената церебро-спинална течност групи с р < 0.05.
** показва проценти на контролата.
ПРИМЕР 17. Биологиииа активност на об протеин при затлъстели хора: редуциране поемането на опитна храна след ИВ прилагане.
Биологичната активност на мишия и човешки об протеини, получ чени и пречистени съгласно примери 7-11 съответно, се определя чрез определяне поемането на опитна храна след ИВ прилагане при хора по следния начин.
Слаби и затлъстели хора доброволци са представени с опитна храна с фиксирано калорично съдържание в лаборатория по хранене на два пъти като се използва метода на Muurahainen, N. Е. et al. Най-малко един час преди поднасяне на храната ИВ катетер се поставя в антекубиталната вена или вената на ръката и
- 54 се държи отворен с хепаринов лок.
Визуални анало гични данни за глад се получават 15 минути преди, 15 минути след поднасяне на храна и при приключване на тестовото хранене. След това се инфузира ИВ миши вли човешки об протеин или физиологичен разтвор 20 минути преди поднасянето на храната. Всеки доброволец се инструктира да яде толкова от опитната храна, колкото желае докато се почуства заситен. Количеството от тестова храна, погълната от всеки доброволец се измерва. После всеки от тях получава инфузия от 0.5 мг/кг телесно тегло човешки об протеин, или 0.5 мг/кг телесно тегло миши или човешки протеин или фиизиоло гичен разтвор и разликата в количеството на погълнатата тестова храна мри тези условия се изчислява. В групата с човешки или миши об протеин се наблюдава намалено количество на консумирана храна поне с 20%.
ПРИМЕР 18. Биологична активност на об протеин при затлъстели хора: предизвикване на отслабване чрез
Биологичната активност на миши и
I*“·· неколкократно ИВ прилагане човешки об протеини, получени и пречистени съгласно примери 7 -
11,съответно^ се определя чрез измерване загубата на тегло след неколкократноУприлагане на об протеин по следния метод.
Осъществено е плацебо контролирано, двойно сляпо изследване загубата на тегло, като се използват методите на
Затлъстели пациенти с индекс на телесната маса /ИТМ/ по-висок от
27, се премерват и се поставят на диета с 1500 ккал за 2-4 седмичен са загубили поне 1 кг телесно тегло се разделят в две третирани групи, съответно на загубата на тегло до края на периода. Пациентите получават дневно ИВ администриране на 0.5 мг/кг/ден човешки или миши об протеин или плацебо /физиологичен разтвор/ поне за период. В края на този период всички затлъстели пациенти, които седмици. Телесното тегло се записва седмично. Пациентите, получили човешки или миши об протеин показват значително намаляване на телесното тегло в сравнение с плацебо групата след 6 седмици на третиране.
ПРИМЕР 19
Получаване на полиетвявнгликол конюгиран об протеин от Клетки на
Е. coli г клетъчни полети от Е. coli,получени както е описано в пример 8, преди да бъдат ресуспендирани, се суспендират с 11 от 50 мМ трис-HCI (pH 8.5), съдържащ 5 мМ ЕДТА. Суспенсията се инкубира 15 минути при 37°С, разрежда се с допълнително още 11 от 50мМ трис-HCI (pH 8.5), съдържащ 5 мМ ЕДТА. След това суспенсията се хояогенизира чрез хомогенизатор за 15 минути при 50% иинсталационна мощност. Сусненсията се избистря чрез центрофугиране при 8000 об/м при 4°C за 1 час» Отпадъчните пелети се изхвърлят. Супернатантата се разрежда с вода до проводимост 1.8 mS и директно се зарежда в колона, снабдена с 200 мл Q-сефароза Fast Flow ( силно анионва йонообменна смола), буферирана с 50 мМ трис-HCI (pH 8.5 ). След балансирания промиване с уравновесения буфер адсорбираният об протеин се елуира от колоната със същия уравновесен буфвр, който допълнително съдържа 100 мМ HaCI. Полученият елуат след третиране на колоната с балансирания уравновесения буфер, съдържащ натриев хлорид се наименова Q сефароза елуат.
Към Q-сефароза елуата се прибавя твърд натриев хлорид до постигане на крайна проводимост до 82 mS. След това елуатът се зарежда в хидрофобна интерактивна колона /ХИК/ запълнена с 200 мл бутил-сефароза Fast Flow , пребуферирана с 50 мМ трис-HCI (pH 8*5 ),съдържащ IM HaCI. Неадсорбираните материали се промиват балансиранияя с уравновесен буфер и адсорбираният об протеин се елуира с 50 мМ амониев ацетат (pH 6.9 ) до получаване на HCI елуат. Определено е,
- 56 чрез реверсивно-фазова hplc , че об протеинът в HCI елуата е с чистота 95%. Пречистеният об протеин се концентрира до 3.7 мг/яЛ като се използва калибрирана мембрана УМ-10. Калибрираната мембрана е мембрана, която задържа молекули с 10 000 далтона и повече. След този етап на концентриране чрез калибрирана мембрана об протеинът се диафилтрира през 100 мМ боратен буфер (pH 8.0), който се използва като об запасен разтвор.
Б. Пегилация на об протеин.
п се използва
При провеждане на тази реакция на пегилация, реагентът peg2-nhs с формула П-А, където R е CHg, сборът от η и η* е от 820 до 1040, като средната сума е около 930 и има средно молекулно тегло ОТ 40 kDa КОЙТО се набавя ОЯ Shearwater Polymers, Huntsville, Alabama , Това е смес от реагенти PEG2-nhs q формула II-А, където съотношението п към п* е приблизително 1.0 и сумата η и п* в тази смес е от 820 до 1040 единици, със средно молекулно тегло на peg-веригата в тази смес да е приблизително 20 kDa ,така че средното молекулно тегло на реагента да е около 40 kDa със средна сума на «и Γι’ в тази смес около 930. Към * оТ rag или 0.54 ral от 3.7 rag/ml пречистения човешки об запасен разтвор, получен в параграф A Q125 пга об протеин} се прибавят 250 пга на споменатия разтвор Ha*geareHT| PEG2-NHS . Този разтвор съдържа 10 rag или 0.1 ral отУразтвора на реагента peg2-NHS в 1 мМ HCI. Общата реакционна смес се наглася до 0.67 ml чрез прибавяне на 100 мМ борат с pH 5.0. Финалното молекулно съотношение на протеин към реагент е 1:2. Тази смес се разбърква при 4°С за 4 часа и реакцията се спира чрез прибавяне на 1 μΐ ледена оцетна киселина до получаване на крайно pH 4.5. Получената реакционна смес от 0.67 ml се разрежда с вода до образуване на 27 ml разтвор, който се зарежда в колона, съдържаща 1.7ml карбоксиметилирана катионно-обменна смола ( Perseptives, Framingham, «?**
В - 57 Massachusetts). Колоната се буферира с 3.3 μΜ HEPES/MES/ натриев ацетатен буфер с pH 5.0. Разредената реакционна смес се рарежда в колона и неадсорбирания PEG2-NHS реагент се измива от колоната. Адсорбирани»® пегилирании немодифицирани об протеини се елуират със степенни солеви градиенти (15 колонни обема всеки) от 80, 150 и 500 мМ IlaCI. От тези елуати 2 мл се събират отделно на порции и проба от всяка фракция се подлага на SDS-PAGE анализ. След този анализ елуатите се класифицират като високо пегилираяи конюгати, желани разклонени моно- PEG-об ( PEG2-o6) и немодифицирани об протеини. Всяка от тези фракции се поставя в посочените горе клаввфикации и вторият резервоар, съдържащ желания разклонен моно- PEG2-o6 протеин. Този желан протеин има структурата на въединение с формула Ι-А, където сумата от η и п» е приблизително 820 - 1040 или средно около 930, η и η» са СНд и средното молекулно тегло на всяка PEG-верига е около 20 килодалтона. Пегилираният продукт има средно молекулно тегло около 56 kDa . Резервоарът, съдържащ PEG2-o6 се концентрира до 3.7 mg/ml с мембрана УМ 10. Това е калибрирана мембрана, задържаща молекулите с тегло от 10 000 далтона или по-високо. След стадия на калибриране кноцентрираният материал се диафилтрира през фосфатен буферен разтвор с pH 7.3 и се съхранява цамразен при -20®С. Този складиран продукт е пегилираният об протеин с формула Ι-А, където сумата от η и п» е приблизително 820 до 1040 и средното молекулно тегло и приблизително 20 kDa . χχ ...
д - ос верига ? -м- .... ; ..Средното молекулно тегло на
PEG протеина в тази протеинова конюгирана смес е 56 kDa.
ПРИМЕР 20. Биологично изследване на пегилиран човешки об рротеин: Единично ИП инжектиране при об/об мишки.
Методи.
Две групи от шест женски затлъстели об/об мишки са изследвани.
- 58 Мишките се държат в пластмасови клетки по три в клетка при постоянна околна среда с цикъл от 12 часа тъмно/12 часа светло. Всеки ден се измерва поемането на храна за 24 часа и телесното тегло. След период на приспособяване към околните условия, дневно третиране и инжекции, мишките се разпределят в две третирани групи. Всяка мишка се инжектира в първия ден от експеримента точно преди началото на тъмната фаза от цикъла тъмно/светло сс една ИП инжекция от 0.1 мл от следните инжекции: 0.9% физиологичен разтвор; 30 мг/0.1 мл съхраняван разтвор на човешки об протеин, приготвен по параграф А на пример 19, и 30 мг/0.1 мл пегилиран контролен разтвор /като идентично получена и пречистена проба без човешки об протеин/, или 30yUr/0.1 мл пегилиран об протеин, получен както е описано в пример 19. Мишките се инжектират само веднъж в първия ден. Дневното поемане на храна в клетката и телесното тегло на всяка мишка се измерва през следващите три дни и после отново на шестия ден.
РЕЗУЛТАТИ.
А. Редуциране поемането на храна.
Дневното поемане на храна не е различно при мишките, инжектирани с физиологичен разтвор и пегилиран контрол при единично третиране за два последователни дни./Таблица 5/. Обаче дневното поемане на храна се редуцира при шестте мишки, инжектирани с 30 jUt човешки об протеин и пегилиран човешки об протеин в деня на третиране ( 5.2, 8.2 срещу 11.9 и 11.4 г) в сравнение с мишките, инжектирани с физиологичен разтвор и пегилиран контролен разтвор. Поемането на храна от мишките, инжектирани с човешки об протеин, отговаря на контролните нива, докато поеманево на храна от мишките, инжектирани с пегилиран човешки об протеин, остава намалено в следващите дни на експеримента. Намабяването на поемане на храна се наблюдава 48 часа след щдиничното инжектиране в групата с
- 59 пегилиран човешки об протеин. Куумулативното поемане на храна за чаоа през трите дни от експеримента е значително редуцирано до 49% от контролното за пегилирания човешки об протеин в сравнен ние с групите, получили физиологичен разтвор и пегилиран контро лен разтвор.
Б. Редуциране увеличаването на телесното тегло.
Изменението в телесното тегло не е различно при мишките, инжектирани с физиологичен разтвор и пегилиран контролен разтвор за единично третиране в два последователни дни /Таблица 6/. Обаче телесното тегло е намалено при шестте мишки, инжектирани с 30 човешки об протеин и пегилиран човешки об протеин в деня на третиране / -0.9, -0.7 срещу 0.1 и 0.3 г/, в сравнение с мишките, ин жектирани с физиологичен рацтвор и пегилиран контролен разтвор. Телесното тегло на мишките, инжектирани с човешки об протеин, съвпада с контролните нива, докато телесното тегло на мишките, инжектирани с пегилиран човешки об протеин продължава да намалява в следващите дни на експеримента. Продължаването на намаляването на телесното тегло се наблюдава 48 часа след единичната инжекция
в групата с пегилиран човешки об протеин. Кумулативното изменение в телесното тегло след шесте дни от експеримента е -1.6 грама, в сравнение с 0.4 грама в групата с об протеин, 0.7 грама в групата с физиологичен разтвор и 1.1 - 0.2 грама в пегилационната контрол на група.
Заключения: Този опит показва, че единична ИП инжекция на ЗОд^Мишка пегилиран човешки об протеин предизвиква значително и постоянно редуциране поемането на храна и значително понижаване в телесното тегло на третиране женски об/об мишки за три дни в сравнение с об/об мишки, третирани с физиологичен разтвор и пегилиран контрол. Тези резултати показват, че пегилираният човешки об протеин има продължи- 60 телна и висока биологична активност и има очаквания ефект против затлъстяване при генетично затлъстели об/об мивки.
ТАБЛИЦА 8: Дневно поемане на храна при об/об мивки с единично ИП прилагане на пегилиран човешки обп протеин.
Третиране Поемане на крана ( 3 мивки/ден)
| ден 1 | ден 2 | ден 3 | ||||
| г | % контрол 1 | г % контр. | г % контрол | |||
| Физиологичен разтвор | 11.9 | 100 | 13.7 | 100 | 13.6 | 100 |
| пегириран контрол | 11.4 | 85.8 | 4.5 | 106 | 13.4 | 99 |
| об протеин | 5.2 | 43.7 | 11.7 | 85.4 | 12.5 | 92 |
| пегилиран об протеин | 8.2 | 68.9 | 6.0 | 43.8 | 4.9 | 36 |
.об/об
Данните са осреднени за шестУмивки от всяка група. Поемането на храна е дневното поемане на храна за клетки с три мивки за всеки ден от експеримента след единичната ИП инжекция в първия ден. Не се наблюдава постоянно редуциране в дневното поемане на храна, освен в групата с пегилиран об протеин.
ТВВ1ИЦА «: Изменение в телесното тегло при об/об мивки с единично ИП прилагане на пегилиран човеики об протеин.
Третиране Изменение в телесното тегло ( г)
| ден 1 | ден 2 | ден 3 | ден 8 |
| физиологичен разтвор 0.1 | 0.6 | 0.01 | -0.01 |
| об протеин -0.9 | 1.1 | 0.2 | нд |
| пегилиран контрол 0.3 | 0.4 | 0.6 | -0.2 |
| проввиран об | |||
| протеин -0.7 | -0.6 | -0.9 | 0.6 |
№
- 61 Данните са осреднени за шест об/об мишки във всяка група.
Мишките получават единична ИП инжекция само в ден 1. Изменение в телесното тегло е изменението в телесното тегло във всеки ден от експеримента. Не се наблюдава постоянно понижаване на теглото само в групата с пегилиран об протеин. НД в таблицата означава неопределен.
Claims (39)
1. Хомогенен биологично-активен човешки протеин на затлъстяването или негов фрагмент, който фрагмент притежава биологичната активност на протеина.
2. Протеин или негов фрагмент, съгласно претенция 1, където биологичната активност на този протеин, или неговия фрагмент се харатеризира чрез намаляване поемането на храна и редуциране степента на повишаване теглото на бозайници.
3. Протеин съгласно претенция 1, съдържащ SEQ ID NOt 6.
4. Рекомбинантен биологично-активен човешки протеин на затлъстяването, свободен от други животински протеини или техни фрагменти, които фрагменти имат биологичната активност на посочения протеин.
5. Протеинът или фрагментът, съгласно претенция 4, чиято биологична активност се характеризира чрез намаляване поемането на храна и редуциране степента на увеличаване теглото на бозайници.
6. Протеин съгласно претенция 4, съдържащ SEQ ID NOi 6.
7. Хомогенен биологично-активен миши протеин на затлъстяването или негов фрагмент, който фрагмент има биологичната активност на посочения протеин.
8. Протеинът или фрагментът съгласно претенция 7, където биологичната активност на този протеин или фрагмент се характеризира чрез намаляване поемането на храна и редуциране степента на повишаване на теглото при бозайници.
9. Протеин съгласно претенция 7, който се състои от SEQ id noi 3
10. Рекомбинантен биологично-активен миши протеин на затлъдтяването, свободен от други животински протеини или шеммфрагменти, който фрагмент има биологичната активност на посочения протеин.
11. Протеин съгласно претенция 10, където биологичната активност на споменатия протеин се характеризира чрез намаляване поемането
- 63 на храна и редуцирана степента на увеличаване теглото при бозайници.
12, η има стойности от 300 до 1500, средното молекулно тегло на полиетиленгликоловите единици в споменатите конюгати на състава за от 15 kDa до 60 kDa , и R е нисш алкил.
12, η и п* са числа, имащи сума от протеин /си\ мн τ il ο съгласно претенции от 1 до
NH — Р
300 до 1500, средното молекулно тегло на полиетиленгликоловите единици в споменатияе коню гати на състава е от
12. Протеин съгласно претенция 12, съдържащ
13. Експресионен вектор, който се състои от:
а) промоторна секвенция, и
б) ДНК последователност, кодираща слят протеин, който слят протеин съдържа мишия об протеин със seq id no: 3, или човешкия об протеин със SEQ id no: $ и сигналният пептид за външния мембранен протеин А на Е. coll ,който експресионен вектор е способен да експресира слятия протеин в клетките на гостоприемника Escherichia coli.
14. Експресионният вектор, съгласно претенция 13, където промоторната секвенция се състои от лак-промоторен оператор и липопротеинов промотор.
15 kDa до
60 kDa , и η и п* са нисш алкил
15. Слят протеин, съдържащ мишия протеин на затлъстяването или човешкия протеин на затлъстяването, и сигналния пептид за външния мембранен протеин А на
16. Слят протеин съгласно претенция 15, където мишият протеин на затлъстяването съдържа seq ID N0,3 и човешкият протеин на затлъстяването съдържа SEQ ID NOj 6
17. ДНК последователност, състояща се от първа и втора част, където:
аО първата част е sOmpA генната последователност с SEQ ID N0j7 кодираща sOmpA пептида, и
б) втората част е нуклеотидната последователност, кодираща мишия об протеин, иби нуклеотидната последователност, кодираща човешкия об протеин.
18. ДНК последователността, съгласно претенция 17, където мишияш об протеин съдържа seq id noi 3
19. ДНК последователността съгласно претенция 17, където човежи кият об протеин сес състои от seq ID Not 6.
20. Организъм гостоприемник от Е. coll , трансформиран с експресионния вектор, съгласно претенция 18.
21. Метод за получаване на биологично-активен рекомбинантен човевки или миши протеин на затлъстяването, свободен от други животине ски протеини, характеризиращ се с това, че се състои от стадии на
а) конструиране експресионен вектор с промоторра последователност, и ДНК последователност, кодираща слят протеин, който слят протеин се състои от SEQ ID N0$ 3 или SEQ ID Not 6 , и сигналния пептид за вънвная мембранен протеин А на Е. coll·
б) инсерциране експресионния вектор в клетките та гоотоприемника Е. coll за трансформиране на клетките на гоотоприемника Е. colli
в) експресиране на слятия протеин в клетките на гоотоприемника Е. coll , и
г) третиране на клетката на гоотоприемника Е. coli със студен осмотичен шоков буфер, за да се освободи мишия или човешки об протеин от други животински протеини и от сигналния пептид.
22. Човешка об генна секвенция, която се състои от SEQ ID ΝΟι 4.
23. Метод за получаване на хомогенен биологично-активен рекомбинантен човешки или миши протеин на затлъстяването, характеризиращ се с това, че осмотичната течност, съдържаща човешкия или мивия об протеин се подлага на комбинация от анионно-обменна колонна храматография, хидрофобна интерактивна колонна хроматография и гел филтрация.
24. Състав, характеризиращ се с това, че съдържа един или повече конюгати на полиетиленгликол и/или полипропиленгликол, свързани с човевки или миши об протеин съгласно претениции от 1 до 12, като средното молекулно тегло на полиетиленгликоловите или полипропиленгликоловите единици в споменатияе конюгати на посоченжва състав е между 15 kDA до 60 kDa·
65 25. Състав, характеризиращ се с това, че съдържа един или повече конюгати с формула:
а »осн2сн2 (осн2сн2 )п>
ни
I (сн2)4
I-A
ROCH2CH2(OCH2CH2)n където Р е човешки или миши об
25, характеризиращ се с това, че сумата на η и а’ е от 800 до
1200 и средното молекулно тегло на полиетиленгликоловите единици в споменатия конюгат на въстава е
ОТ 35 kDa до 15 kDa,
26. Състав съгласно претенция
27. Състав, характеризиращ се с това, че съдържа един или повече конюгати с формула «О(СН2СН2О)ПСН2СН2
NH
I-B където Р е човешки или мини об протеин съгласно претенции от 1 до
28. Състав съгласно претеция 27, характеризираш се с това, че η е около 850 до 1000 и средното молекулно тегло на полиетиленгликоловите единици в споменатите конюгати в посочения състав е от 35 до 45 kDa·
29. Човешки или миши об протеин съгласно претенции от 1 до 12 или състав съгласно претенции от 24 до 28 като терапевтиикоактивни агенти.
30. Човешки или миши об протеин съгласно претенции от 1 до 12 или състави съгласно претенции от 24 до 28 като терапевтичноактивни агенти ва лечение, профилактика и контрол на затлъстяването и свързаните с него заболявания.
31. Фармацевтичен състав, характеризираш се с това, че съдържа човешки или миши об протеин съгласно претенции от 1 до 12 или състави съгласно претенции от 24 до 28 и съвместими фармацевтично приемливи помощни вещества.
32. Употреба на човешки или мижи об протеин съгласно претенции от 1 до 12,или състав съгласно претенции от 24 до 28 за приготвяне на фармацешшични композиции.
33. Впотреба иа човешки или миши об протеин съгласно претенции от 1 до 12, или състав съгласно претенции от 24 до 28 за приготвяне на фармацевтични композиции за лечение, профилактика и контрол на затлъстяването и свързаните с него заборявания.
34. Употреба на човешки или миши об протеин съгласно претенции от 1 до 12 за идентифициране на об протеинов рецептор/и.
35. Употреба на експресионен вектор съгласно претенции 13 и 14 за продуциране на човешки или миши об протеин съгласно претенции от 1 до 12.
36. Употреба на ДНК последователност съгласно претенции от 17 до 19 за продуциране на човешки или миши об протеин съгласно претенции от 1 до 12.
37. Употреба на организъм гостоприемник от Becherichia coll за продуциране на човешки или миши об протеин съгласно претенции от 1 до 12.
38. Хомогенен биологично-активен рекомбинантен човешки или миши об протеин, получен по метод, съгласно претенция 21 или 23.
39. Метод за лечения, профилактика или контрол на заВшстяване и свързаните с него заболявания, характеризиращ се с това, че се прилага човешки или миши об протеин съгласно претенции от 1 до 12 и 33, или състав съгласно претенции от 24 до 28.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US43577795A | 1995-05-05 | 1995-05-05 | |
| US48462995A | 1995-06-07 | 1995-06-07 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BG100558A true BG100558A (bg) | 1997-03-31 |
| BG62975B1 BG62975B1 (bg) | 2000-12-29 |
Family
ID=27030682
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BG100558A BG62975B1 (bg) | 1995-05-05 | 1996-05-03 | Рекомбинантни протеини на затлъстяването |
Country Status (35)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6025325A (bg) |
| EP (1) | EP0741187A2 (bg) |
| JP (1) | JP3244627B2 (bg) |
| KR (1) | KR100219970B1 (bg) |
| CN (1) | CN1157290A (bg) |
| AR (1) | AR003087A1 (bg) |
| AU (1) | AU688210B2 (bg) |
| BG (1) | BG62975B1 (bg) |
| BR (1) | BR9602166A (bg) |
| CA (1) | CA2175298A1 (bg) |
| CZ (1) | CZ129796A3 (bg) |
| DE (1) | DE741187T1 (bg) |
| ES (1) | ES2093593T1 (bg) |
| GR (1) | GR960300075T1 (bg) |
| HR (1) | HRP960213A2 (bg) |
| HU (1) | HU220093B (bg) |
| IL (1) | IL118059A0 (bg) |
| IS (1) | IS4343A (bg) |
| MA (1) | MA23856A1 (bg) |
| MY (1) | MY132189A (bg) |
| NO (1) | NO961796L (bg) |
| NZ (1) | NZ286466A (bg) |
| OA (1) | OA10362A (bg) |
| PE (1) | PE50897A1 (bg) |
| PL (1) | PL186568B1 (bg) |
| RO (1) | RO117177B1 (bg) |
| RU (1) | RU96109211A (bg) |
| SG (1) | SG49337A1 (bg) |
| SK (1) | SK56996A3 (bg) |
| SV (1) | SV1996000030A (bg) |
| TN (1) | TNSN96066A1 (bg) |
| TR (1) | TR199600357A2 (bg) |
| TW (1) | TW464655B (bg) |
| UY (1) | UY24219A1 (bg) |
| YU (1) | YU26596A (bg) |
Families Citing this family (63)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6150328A (en) | 1986-07-01 | 2000-11-21 | Genetics Institute, Inc. | BMP products |
| DE69233022T2 (de) | 1991-11-04 | 2004-02-12 | Genetics Institute, LLC, Cambridge | Rekombinante knochenmorphogenetische protein heterodimere, zusammensetzungen und verfahren zur verwendung |
| US6479055B1 (en) * | 1993-06-07 | 2002-11-12 | Trimeris, Inc. | Methods for inhibition of membrane fusion-associated events, including respiratory syncytial virus transmission |
| US6291206B1 (en) | 1993-09-17 | 2001-09-18 | Genetics Institute, Inc. | BMP receptor proteins |
| AU689184B2 (en) | 1993-12-07 | 1998-03-26 | Genetics Institute, Llc | BMP-12, BMP-13 and tendon-inducing compositions thereof |
| US6048837A (en) * | 1994-08-17 | 2000-04-11 | The Rockefeller University | OB polypeptides as modulators of body weight |
| US6124448A (en) * | 1994-08-17 | 2000-09-26 | The Rockfeller University | Nucleic acid primers and probes for the mammalian OB gene |
| US6350730B1 (en) | 1994-08-17 | 2002-02-26 | The Rockefeller University | OB polypeptides and modified forms as modulators of body weight |
| US6471956B1 (en) | 1994-08-17 | 2002-10-29 | The Rockefeller University | Ob polypeptides, modified forms and compositions thereto |
| US6429290B1 (en) | 1994-08-17 | 2002-08-06 | The Rockefeller University | OB polypeptides, modified forms and derivatives |
| US6001968A (en) | 1994-08-17 | 1999-12-14 | The Rockefeller University | OB polypeptides, modified forms and compositions |
| US6309853B1 (en) | 1994-08-17 | 2001-10-30 | The Rockfeller University | Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof |
| US20030040467A1 (en) * | 1998-06-15 | 2003-02-27 | Mary Ann Pelleymounter | Ig/ob fusions and uses thereof. |
| US6936439B2 (en) * | 1995-11-22 | 2005-08-30 | Amgen Inc. | OB fusion protein compositions and methods |
| CA2238307A1 (en) * | 1995-12-27 | 1997-07-10 | Genentech, Inc. | Ob protein derivatives having prolonged half-life |
| AU769250B2 (en) * | 1995-12-27 | 2004-01-22 | Genentech Inc. | OB protein derivatives having prolonged half-life |
| US6620413B1 (en) | 1995-12-27 | 2003-09-16 | Genentech, Inc. | OB protein-polymer chimeras |
| US6541604B1 (en) | 1996-01-08 | 2003-04-01 | Genentech, Inc. | Leptin receptor having a WSX motif |
| US20050019325A1 (en) | 1996-01-08 | 2005-01-27 | Carter Paul J. | WSX receptor agonist antibodies |
| US7074397B1 (en) | 1996-01-08 | 2006-07-11 | Genentech, Inc. | Method for enhancing proliferation or differentiation of a cell using ob protein |
| AU2246097A (en) * | 1996-01-25 | 1997-08-20 | Eli Lilly And Company | Obesity protein analog compounds and formulations thereof |
| US7067472B1 (en) * | 1996-06-04 | 2006-06-27 | The Scripps Research Institute | Diagnostic and therapeutic methods related to regulating energy mobilization with OB protein and OB antibodies |
| US6001816A (en) * | 1996-06-20 | 1999-12-14 | Merck & Co., Inc. | Gene therapy for leptin deficiency |
| US20060205660A1 (en) * | 1996-06-20 | 2006-09-14 | Sauvage Frederic D | OB protein-immunoglobulin chimeras |
| US20030036629A1 (en) * | 1997-12-12 | 2003-02-20 | Barry Foster | Novel tgf-beta protein purification methods |
| US6656906B1 (en) * | 1998-05-20 | 2003-12-02 | Trimeris, Inc. | Hybrid polypeptides with enhanced pharmacokinetic properties |
| US6420339B1 (en) | 1998-10-14 | 2002-07-16 | Amgen Inc. | Site-directed dual pegylation of proteins for improved bioactivity and biocompatibility |
| US6727224B1 (en) | 1999-02-01 | 2004-04-27 | Genetics Institute, Llc. | Methods and compositions for healing and repair of articular cartilage |
| US7169889B1 (en) * | 1999-06-19 | 2007-01-30 | Biocon Limited | Insulin prodrugs hydrolyzable in vivo to yield peglylated insulin |
| CZ299516B6 (cs) * | 1999-07-02 | 2008-08-20 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem |
| JO2291B1 (en) | 1999-07-02 | 2005-09-12 | اف . هوفمان لاروش ايه جي | Erythropoietin derivatives |
| EP2286847A1 (en) | 1999-10-15 | 2011-02-23 | Genetics Institute, LLC | Formulations of hyaluronic acid for delivery of osteogenic proteins |
| EP1290170A2 (en) | 2000-06-16 | 2003-03-12 | Asterion Limited | Binding agents: chimeric ligand/receptor proteins |
| KR20030005204A (ko) * | 2000-12-25 | 2003-01-17 | 가부시키가이샤 시세이도 | 교감신경 활성화 향료 조성물 |
| US6867183B2 (en) * | 2001-02-15 | 2005-03-15 | Nobex Corporation | Pharmaceutical compositions of insulin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith |
| US7060675B2 (en) * | 2001-02-15 | 2006-06-13 | Nobex Corporation | Methods of treating diabetes mellitus |
| EP1234583A1 (en) * | 2001-02-23 | 2002-08-28 | F. Hoffmann-La Roche Ag | PEG-conjugates of HGF-NK4 |
| US7226587B2 (en) | 2001-06-01 | 2007-06-05 | Wyeth | Compositions and methods for systemic administration of sequences encoding bone morphogenetic proteins |
| US6828297B2 (en) | 2001-06-04 | 2004-12-07 | Nobex Corporation | Mixtures of insulin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same |
| US6713452B2 (en) | 2001-06-04 | 2004-03-30 | Nobex Corporation | Mixtures of calcitonin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same |
| US7713932B2 (en) | 2001-06-04 | 2010-05-11 | Biocon Limited | Calcitonin drug-oligomer conjugates, and uses thereof |
| US6835802B2 (en) | 2001-06-04 | 2004-12-28 | Nobex Corporation | Methods of synthesizing substantially monodispersed mixtures of polymers having polyethylene glycol moieties |
| US6828305B2 (en) * | 2001-06-04 | 2004-12-07 | Nobex Corporation | Mixtures of growth hormone drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same |
| TWI267378B (en) | 2001-06-08 | 2006-12-01 | Wyeth Corp | Calcium phosphate delivery vehicles for osteoinductive proteins |
| US6913903B2 (en) * | 2001-09-07 | 2005-07-05 | Nobex Corporation | Methods of synthesizing insulin polypeptide-oligomer conjugates, and proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same |
| US7196059B2 (en) * | 2001-09-07 | 2007-03-27 | Biocon Limited | Pharmaceutical compositions of insulin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith |
| US7312192B2 (en) * | 2001-09-07 | 2007-12-25 | Biocon Limited | Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same |
| US7166571B2 (en) * | 2001-09-07 | 2007-01-23 | Biocon Limited | Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same |
| US7030082B2 (en) * | 2001-09-07 | 2006-04-18 | Nobex Corporation | Pharmaceutical compositions of drug-oligomer conjugates and methods of treating disease therewith |
| US6770625B2 (en) | 2001-09-07 | 2004-08-03 | Nobex Corporation | Pharmaceutical compositions of calcitonin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith |
| AU2002359288B2 (en) | 2001-10-22 | 2008-07-31 | Amgen, Inc. | Use of leptin for treating human lipoatrophy and method of determining predisposition to said treatment |
| WO2003092614A2 (en) * | 2002-05-02 | 2003-11-13 | Hickle Randall S | Lipid removal from the body |
| US7601688B2 (en) | 2002-06-13 | 2009-10-13 | Biocon Limited | Methods of reducing hypoglycemic episodes in the treatment of diabetes mellitus |
| ES2282904T3 (es) | 2003-09-12 | 2007-10-16 | Wyeth | Barras solidas de fosfato calcico inyectables para el suministro de proteinas osteogenicas. |
| MX2007000883A (es) | 2004-07-19 | 2007-04-02 | Biocon Ltd | Conjugados de insulina-oligomero, formulaciones y usos de los mismos. |
| US8227408B2 (en) * | 2005-09-07 | 2012-07-24 | Neurotez, Inc. | Leptin as an anti-amyloidogenic biologic and methods for delaying the onset and reducing Alzheimer's disease-like pathology |
| BRPI0818004B8 (pt) * | 2007-10-16 | 2021-05-25 | Biocon Ltd | composição farmacêutica sólida administrável por via oral e o processo da mesma. |
| WO2009143380A2 (en) * | 2008-05-21 | 2009-11-26 | Neurotez, Inc. | Methods for treating progressive cognitive disorders related to neurofibrillary tangles |
| WO2010054017A1 (en) * | 2008-11-04 | 2010-05-14 | Nikolaos Tezapsidis | Leptin compositions and methods for treating progressive cognitive function disorders resulting from accumulation of neurofibrillary tangles and amlyoid beta |
| EP2416797A4 (en) | 2009-04-10 | 2013-04-24 | Amylin Pharmaceuticals Llc | AMYLINAGONIST COMPOUNDS FOR OXYGEN ANIMAL MICE |
| PT2621515T (pt) | 2010-09-28 | 2017-07-12 | Aegerion Pharmaceuticals Inc | Polipéptido quimérico de leptina de foca-ser humano com solubilidade aumentada |
| MX2013008559A (es) | 2011-01-26 | 2013-08-21 | Novo Nordisk As | Derivados de leptina. |
| US12139555B2 (en) * | 2019-12-03 | 2024-11-12 | Rodan & Fields, Llc | Peptides and compositions for inhibiting hair growth |
Family Cites Families (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4199337A (en) * | 1978-10-06 | 1980-04-22 | International Telephone And Telegraph Corporation | Method of fabricating high strength optical preforms |
| US4666836A (en) * | 1981-01-02 | 1987-05-19 | The Research Foundation Of State University Of New York | Novel cloning vehicles for polypeptide expression in microbial hosts |
| US4609546A (en) * | 1982-06-24 | 1986-09-02 | Japan Chemical Research Co., Ltd. | Long-acting composition |
| US4643969A (en) * | 1983-07-25 | 1987-02-17 | The Research Foundation Of State University Of New York | Novel cloning vehicles for polypeptide expression in microbial hosts |
| US4757013A (en) * | 1983-07-25 | 1988-07-12 | The Research Foundation Of State University Of New York | Cloning vehicles for polypeptide expression in microbial hosts |
| EP0154316B1 (en) * | 1984-03-06 | 1989-09-13 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Chemically modified lymphokine and production thereof |
| US5595732A (en) * | 1991-03-25 | 1997-01-21 | Hoffmann-La Roche Inc. | Polyethylene-protein conjugates |
| US5643575A (en) * | 1993-10-27 | 1997-07-01 | Enzon, Inc. | Non-antigenic branched polymer conjugates |
| AU3329895A (en) * | 1994-08-17 | 1996-03-07 | Rockefeller University, The | Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof |
| US6309853B1 (en) * | 1994-08-17 | 2001-10-30 | The Rockfeller University | Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof |
| US5861485A (en) * | 1994-08-23 | 1999-01-19 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Polypeptides involved in body weight disorders, including obesity |
| US5932462A (en) * | 1995-01-10 | 1999-08-03 | Shearwater Polymers, Inc. | Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces |
| US5827734A (en) * | 1995-01-20 | 1998-10-27 | University Of Washington | Materials and methods for determining ob protein in a biological sample |
| US5569743A (en) * | 1995-01-31 | 1996-10-29 | Eli Lilly And Company | Anti-obesity proteins |
| WO1996023517A1 (en) * | 1995-01-31 | 1996-08-08 | Eli Lilly And Company | Anti-obesity proteins |
| US5594104A (en) * | 1995-01-31 | 1997-01-14 | Eli Lilly And Company | Anti-obesity proteins |
| US5554727A (en) * | 1995-01-31 | 1996-09-10 | Eli Lilly And Company | Anti-obesity proteins |
| US5574133A (en) * | 1995-01-31 | 1996-11-12 | Eli Lilly And Company | Anti-obesity proteins |
| US5567678A (en) * | 1995-01-31 | 1996-10-22 | Eli Lilly And Company | Anti-obesity proteins |
| US5569744A (en) * | 1995-01-31 | 1996-10-29 | Eli Lilly And Company | Anti-obesity proteins |
| US5563243A (en) * | 1995-01-31 | 1996-10-08 | Eli Lilly And Company | Anti-obesity proteins |
| US5559208A (en) * | 1995-01-31 | 1996-09-24 | Eli Lilly And Company | Anti-obesity proteins |
| US5580954A (en) * | 1995-01-31 | 1996-12-03 | Eli Lilly And Company | Anti-obesity proteins |
| US5563244A (en) * | 1995-01-31 | 1996-10-08 | Eli Lilly And Company | Anti-obesity proteins |
| US5563245A (en) * | 1995-01-31 | 1996-10-08 | Eli Lilly And Company | Anti-obesity proteins |
| US5567803A (en) * | 1995-01-31 | 1996-10-22 | Eli Lilly And Company | Anti-obesity proteins |
| AU5539596A (en) * | 1995-04-06 | 1996-10-23 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | Anti-obesity agents |
| CA2223433C (en) * | 1995-06-07 | 2003-11-18 | Amgen Inc. | Ob protein compositions and methods |
| AU1406497A (en) * | 1995-12-06 | 1997-06-27 | Schering Corporation | Mutational variants of mammalian ob gene proteins |
| CA2238307A1 (en) * | 1995-12-27 | 1997-07-10 | Genentech, Inc. | Ob protein derivatives having prolonged half-life |
-
1996
- 1996-04-24 ES ES96106408T patent/ES2093593T1/es active Pending
- 1996-04-24 DE DE0741187T patent/DE741187T1/de active Pending
- 1996-04-24 EP EP96106408A patent/EP0741187A2/en not_active Ceased
- 1996-04-29 NZ NZ286466A patent/NZ286466A/en unknown
- 1996-04-29 CA CA002175298A patent/CA2175298A1/en not_active Abandoned
- 1996-04-29 IL IL11805996A patent/IL118059A0/xx unknown
- 1996-04-29 HU HU9601120A patent/HU220093B/hu not_active IP Right Cessation
- 1996-04-30 RU RU96109211/04A patent/RU96109211A/ru not_active Application Discontinuation
- 1996-04-30 PL PL96314051A patent/PL186568B1/pl unknown
- 1996-04-30 AU AU51978/96A patent/AU688210B2/en not_active Withdrawn - After Issue
- 1996-05-02 AR ARP960102430A patent/AR003087A1/es not_active Application Discontinuation
- 1996-05-02 PE PE1996000300A patent/PE50897A1/es not_active Application Discontinuation
- 1996-05-02 HR HR08/484,629A patent/HRP960213A2/hr not_active Application Discontinuation
- 1996-05-02 SG SG1996009690A patent/SG49337A1/en unknown
- 1996-05-02 MA MA24221A patent/MA23856A1/fr unknown
- 1996-05-03 TR TR96/00357A patent/TR199600357A2/xx unknown
- 1996-05-03 TN TNTNSN96066A patent/TNSN96066A1/fr unknown
- 1996-05-03 CN CN96104497A patent/CN1157290A/zh active Pending
- 1996-05-03 OA OA60824D patent/OA10362A/fr unknown
- 1996-05-03 NO NO961796A patent/NO961796L/no not_active Application Discontinuation
- 1996-05-03 UY UY24219A patent/UY24219A1/es unknown
- 1996-05-03 MY MYPI96001683A patent/MY132189A/en unknown
- 1996-05-03 SV SV1996000030A patent/SV1996000030A/es not_active Application Discontinuation
- 1996-05-03 CZ CZ961297A patent/CZ129796A3/cs unknown
- 1996-05-03 IS IS4343A patent/IS4343A/is unknown
- 1996-05-03 RO RO96-00920A patent/RO117177B1/ro unknown
- 1996-05-03 BG BG100558A patent/BG62975B1/bg unknown
- 1996-05-03 SK SK569-96A patent/SK56996A3/sk unknown
- 1996-05-04 TW TW085105350A patent/TW464655B/zh not_active IP Right Cessation
- 1996-05-04 KR KR1019960014570A patent/KR100219970B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1996-05-06 BR BR9602166A patent/BR9602166A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-05-06 YU YU26596A patent/YU26596A/sh unknown
- 1996-05-07 JP JP11273996A patent/JP3244627B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-05-15 US US08/648,263 patent/US6025325A/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-12-31 GR GR960300075T patent/GR960300075T1/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| BG100558A (bg) | Рекомбинантни протеини на затлъстяването | |
| US5681818A (en) | Therapeutic uses of human somatomedin carrier proteins | |
| KR20230169417A (ko) | Gdf15 융합 단백질 및 이의 용도 | |
| EP0451194B1 (en) | Recombinant dna molecules, hosts, processes and human somatomedin carrier protein-like polypeptides | |
| US6025324A (en) | Pegylated obese (ob) protein compositions | |
| JPH08317789A (ja) | ヒトマンガンスーパーオキシドジスムターゼ類似体及びそれを含む薬剤組成物 | |
| CN110878127A (zh) | 长效重组GLP1-Fc-CD47蛋白及其制备和用途 | |
| JP2003313199A (ja) | コラーゲン誘発血小板凝集抑制剤 | |
| US5968779A (en) | Recombinant obese (ob) proteins | |
| KR20180108510A (ko) | 인슐린 수용체와의 결합력이 감소된 인슐린 아날로그의 결합체 및 이의 용도 | |
| EP1080111B1 (en) | The induction of antiobiotic peptides by lait (scd14) protein | |
| AU2006244080B2 (en) | Use of peptides derived from the growth factor AMP-18 for the treatment of mucositis | |
| KR20070036057A (ko) | 코브라 베놈 인자-유사 기능을 갖는 사람 보체 ｃ3 유도체 | |
| AU728834B3 (en) | Recombinant proteins | |
| AU5358399A (en) | Proteins | |
| HK1013105A (en) | Recombinant obese (ob) proteins | |
| JP2000508908A (ja) | 分泌蛋白およびそれらをコードしているポリヌクレオチド | |
| MXPA96001655A (en) | Proteins (ob) obesas recommend | |
| NZ314957A (en) | A composition comprising a conjugate(s) of peg and/or ppg linked to an obese protein | |
| WO1994019462A1 (fr) | Facteurs de croissance de la famille de l'harp, procede d'obtention et applications | |
| CA2079291A1 (en) | Activities of heparin binding neurite-outgrowth promoting factor | |
| HK1000826B (en) | Recombinant dna molecules, hosts, processes and human somatomedin carrier protein-like polypeptides |