OA10362A - Protéines obèses (ob) recombinantes - Google Patents

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OA10362A
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Rene Devos
Yves Guisez
Pascal Sebastian Bailon
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Hoffmann La Roche
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Description

1 010362 L'obésité est considérée comme étant le désordre nutritionnel le plus habituel dans les occidentales [Zhang, Y. et al., Nature 371, seciétés , 425-452 (1 994)]. Plus de trois parmi dix adultes américainsprésentent un excès pondéral d'au moins 10% par rapport à leur poids idéal [Zhang, Y. et al., ci-dessus] . Un poids corporel accru est un problème de santé oubli:qu'il est associé avec un taux de mortalité ; du fait médicale important, tel que celui dû au diabète mellitus de type II (c'est-à-dire un diabète mellitus non déc:l'insuline), l'hypertension et 1'hyperlipidémieS.M. et Earnett, Disease-a-Mouth 36, 645-696 andant de : [Grur.dy, 990 ]. il est évident que le poids du corps est physiologiquement régulé et que l'obésité (ainsi que ses états eu maladies apparentés) sont dus en partie aux désordresrégulation [Zhancj Y. et al., ci-dessus]. de cette
Chez les rongeurs, on a décrit sept mutations degènes uniques, qui se traduisent par un phénotype ccèse,cinq d'entre elles sont présentes chez la souris. Parmices sept modèles de rongeurs, un des plus intensivementétudié est la mutation du gène obèse (ob) chez la souris,identifié en 1950 [ingalls, A.M. et al., J. Hered. il,317-318 (1950)]. Les souris -homozygotes peur cettemutation du gène obèse sont profondément obèses,développent un diabète mellitus de type II, et sonthyperphagiques et hypométaboliques, en tant que partied'un syndrome ressemblant à l'obésité morbide chez l'homme [Friedman J.M. et al., Genomics 11,(1991)]. Ce gène ob est situé sur le chromosome '054-"062 proximal 6 de la souris et encode une protéine (c'est-â L-dire la proteine obj exprimée dans le tissu adipeux [Zhang, Y. et al. ci-dessus]. Les souris homozigotes pour la mutation du gène ob pré.sentent peu de production smon i. îucune de cette protéine ob, et, en conséquence, ont une r< épuration 010362 défectueuse du poids corporel, ce qui conduit à1 ' obésité.
Les protéines ob murines ou humaines peuvent êtreadministrées à des patients souffrant dé défauts ou demutations dans leur gène obèse (ob) correspondant, cesdéfauts ou mutations évitant ou interférant avec laproduction et/ou la fonction des protéines cb dans lamodulation du poids corporel. Ces protéines peuvent êtredonc utilisées en tant que substances de type hormonalpour le contrôle, la prévention ou le traitement del'obésité ainsi que de ces maladies et états apparentéschez l'homme et les animaux.
Afin d'utiliser les protéines ob murines ouhumaines, de cette manière, ces protéines peuvent êtreadministrées par injection par une diversité de voies,telles qu'intrapéritonéale, intraveineuse, intramus-culaire ou sous-cutanée, selon des dosages fréquents.Etant donné qu’elle est administrée fréquemment parinjection, il est important que les protéines murines ouhumaines soient purifiées, de préférence jusqu'àl'homogénéité, soient libres de produits protéiniquescontaminants et soient exprimés, de façon recombinantesous une forme soluble et biologiquement active. Il est,en règle générale, connu des praticiens dans ce domaineque les agents contaminants présents dans une médicationinjectable puissent conduire souvent à des effetssecondaires toxiques ou à des réponses immunologiquescontraires.
Tandis que la séquence du gène ob du murin estdécrit dans Zhang, Y. et al. ci-dessus, aucune techniqued'expression de la protéine ob murine ou de sa contre-partie humaine n'a été décrite, en préparant beaucoupmoins ces protéines dans un état biologiquement actif etsoluble à partir duquel les protéines peuvent êtrepurifiées jusqu'à l'homogénéité. En conséquence, il est 010362 important et cela constitue un ob^et de cette inventiond’exprimer et de produire les protéines ob murines euhumaines dans un état homogène, soluble et biologiquementactif. 5 On a découvert que les protéines recomb mantes cb humaines et murines peuvent être exprimées sous une fermebiologiquement actives et solubles, et, par la suite.purifiées jusqu'à une homogénéité appropriée pourl'injection à des patients afin de traiter, de prévenir 10 ou de contrôler et l'obésité et ces états et maladiesapparentées tels que le diabète mellitus de type II,l'hypertension, 1'hyperlipidémie et analogues.
Selon cette invention, les protéines ob humaines etmurines peuvent être préparées de façon recombinante sous 15 une forme biologiquement active puis purifiées jusqu'àl'homogénéité en construisant d'abord de nouveauxvecteurs d'expression pour Eschepichia coli (E. ccll).Ces vecteurs d'expression renferment un promoteur et uneséquence d'ADN, cette séquence ADN encodant une protéine 20 de fusion comportant deux parties: le peptide signal dela protéine A de la membrane externe de E. coli (c'est-à-dire sOmpA) et la protéine ob humaine ou murine. Seloncette invention, la prochaine é-tape pour la préparationd'une forme recombinante biologiquement active des 25 protéines ob du murin et de l'être humain consiste àinsérer ce lecteur d'expression dans un hôte E. coli defaçon que soit obtenue une expression et unetranslocation efficace de la protéine de fusion dansl'espace péri-plasmique (c'est-à-dire entre les membranes 30 cellulaires internes et externes du micro-orga.nisme E.coli), moment auquel le peptide signal est excisé de laprotéine ob en quittant cette dernière sous une fermesoluble biologiquement active. Ensuite, les protéines cbsont secrétées de façon efficace sous forme soluble et 35 biologiquement active dans un milieu exempt de cellules, 010362 suivi d 1 un traitement des cellules hôtes E. coli impliquant un choc osmotique à froid, point auquel les protéines ob11 utilisation humaines etbiologiquement sont purifiées jusqu'à l'homogénéité parséquentielle d'une chromatographie paréchange d'anions, d'une chromatographie de colonne parinteraction hydrophobe et de filtration sur gel, mises enoeuvre dans cet ordre.
La présente invention vise également 1 ) un vecteurd'expression renfermant de l'ADN encodant une protéine defusion comportant un peptide signal sOmpA et une protéineob humaine ou murine; 2) un organisme hôte transfecté outransformé par un tel vecteur d'expression; 3) uneséquence ADN encodant la protéine ob humaine et 4} desconjugués de polyéthylène de polypropylène glycol de laprotéine ob.
La présente invention se rapporte en outre à desprocédés pour exprimer des protéines recombinantes obmurines sous une forme soluble etactive, et pour préparer ces protéines sous une forme homogène purifiée, appropriées pour uneadministration aux animaux et aux êtres humains.
Le procédé pour exprimer et préparer la protéine obmurine selon cette invention est réalisé en utilisant legène ob murin comme rapporté par Zhang Y. et al.; voirci-dessus, la séquence pour ce gène étant une séquence denucléotide à paire de base 702 (pb) , identifiée icr entant que 3EQ ID N°1 . Cette séquence de gène ob murincomporte une séquence codante 501 pb ou un cadre ouvertde lecture (ORF) débutant avec un codon d'initiation auniveau du nucléotide 36 et se terminant par un codonarrêt au niveau du nucléotide 537, et présentant desséquences non-traduites à la fois au niveau desextrémités 3' et 5'. Le ORF renferme une séquence designal 63 bp à partir du nucléotide 36 jusqu'à 98. 5 010362
Cette séquence de gène ob murin (SEQ ID N°1) encodela protéine ob murin (plus sa séquence de signal), dontla séquence acide aminée présente une longueur de 167acides aminés et est identifiée en tant que SEQ ID 2.
Dans cette protéine de SEQ ID N° : 2, les 21 premiers acides aminés représentent la séquence de signal de laprotéine ob murin. La protéine mature ob du murin (sanssa séquence de signal) s'étend de l’acide aminé 22 (Val.jusqu'à l'acide aminé 167 (Cys) et est représentée parSEQ ID N°: 3.
La technique pour exprimer et préparer la protéineob humaine selon cette invention est réalisée enutilisant le gène ob humain, la séquence pour ce gèneétant une séquence nucléotide 690 pb, identifiée ici entant que SEQ ID N°: 4.
Zhang Y. et al. ci-dessus, font état du gène obhumain en tant que fortement homologue au gène ob murin,et décrivent une technique classique mettant en oeuvredes sondes oligonucléotides dirigées vers le gène obmurin, qui peuvent être utilisées pour 1) cribler unebanque ADiJc de clones dérivés d'un tissu humain dipeux, 2) identifier ces clones présentant le gène ob humain et 3) isoler et séquencer la séquence du gène ob humain.Lorsqu'elle est séquencée par des moyens classiques,cette séquence de gène ob humain est considérée commepossédant la séquence nucléotide SEQ ID N°: 4.
Comme pour le gène ob murin, le gène ob humaincomporte une séquence codante 501 pb ou un cadre delecture ouvert (ORF) en partant d'un codon d'initiacicnau niveau du nucléotide 37 et en finissant par un ccdcnarrêt au niveau du nucléotide 538, et possédant desséquences non traduites à la fois au niveau desextrémités 3' et 5'. L'ORF renferme une séquence designal 63 pb à partir du nucléotide 37 jusqu'à 99. 6 010362
Cette séquence de gène ob humain (SEQ ID N°: 4)encode une protéine ob humaine plus sa séquence de signaldont la séquence acides aminés présentant une longueur de167 acides aminés est identifiée en tant que SEQ ID N° : 5. Les 21 premiers acides aminés de cette protéine de 167acides aminés de longueur représentent la séquence designal. La protéine ob humaine, mature (sans sa séquencede signal) s'étend de l'acide aminé 22 (Val) jusqu'àl'acide aminé 167 (Cys) et est représentée par SEQ ID N°: 6.
Zhang, Y. et al., ci-dessus, font état de 84%d'identité entre les protéines ob murines et humaines.Zhang Y. et al., ci-dessus, rapportent également que desvariantes de protéines murines et humaines existent, unede ces variantes étant caractérisée dans les deux espècespar une délétion de la glutamine 49. Approximativement30% des clones d'ADNc dans les banques dérivées du tissuadipeux de la souris et du tissu adipeux humainprésentent une absence du codon 49 (Zhang, Y. et al., ci-dessus) .
Les expressions suivantes correspondront auxdéfinitions spécifiées ci-dessous:
Protéine ob murine (mob) se rapporte à la protéinede SEQ ID N°: 3, dont les propriétés biologiquesconcernent le traitement, le contrôle ou la prévention del'obésité ou de ses maladies et états associés. De façonspécifique, une protéine ob murine est définie pourcomporter n'importe quelle protéine ou polypeptideprésentant une séquence acides aminés qui estpratiquement homologue de la séquence acides aminés SEQID N° : 3, et en outre ayant les activités biologiquessuivantes. 1 ) Lorsque la protéine ou le polypeptide estadministré par injection intracerébroventriculaire (ICV)à des souris ob/ob obèses matures, ayant jeûné de 16 à 18 010362 heures, et qui présentent un poids corporel d'au moins 30g pour une dose de 20 pg ou moins, en utilisant lestechniques de Haley et McCormick, Brit, J. Pharnacol. 12,12-15 (1957), la protéine ou le polypeptide: (a) réduisent la prise de nourriture pendant un testd'alimentation de 5 heures de 50% par comparaison avecles souris témoins auxquelles on a injecté un véhicule(ED^q) afin de réduire l'accroissement de poidscorporel); et (b) réduisent 1'accroissement de poids corporelpendant les 24 heures suivant l'injection par voieintraveineuse d'au moins 50% par comparaison avec lessouris témoins auxquelles on a injecté le véhicule (ΞΟςθpour la réduction de l'accroissement de poids corporel). 2) Lorsque la protéine ou le polypepside estadministré par voie intrapéritonéale (IP) à des sourisob/ob mature n'ayant pas jeûné, qui présentent un poidscorporel d'au moins 30 g, deux fois par jour au débuc dujour et à nouveau 3 heures après le crépuscule, pendantune semaine, selon une dose totale journalière de 23 pgou moins, la protéine ou le polypeptide; (a) réduit la prise de nourriture pendant 5 e: 24heures d'au moins 20% par comparaison avec des souristémoins auxquelles on a injecté un véhicule (E~20diminuer la prise de nourriture) ; et (b) réduit l'accroissement de poids corporel pendantles 24 heures suivant la première injection péritonéaled'au moins 20% par comparaison avec les souris témoinsauxquelles on a injecté le véhicule (ED20 pour laréduction de l'accroissement de poids corporel).
Tel qu'utilisé ici, l'expression "protéine obmurine" englobe de telles protéines modifiéesdélibérément telles que par exemple, par mutagénèsedirigée sur un site ou bien par mutations, de façonaccidentelle. 8 010362
Protéine ob humaine (hob) se rapporte à la protéinede SED ID N° : 6 dont les propriétés biologiques serapportent au traitement, au contrôle ou à la préventionde l'obésité ou de ses maladies et états associés. Defaçon spécifique, une protéine ob humaine est définiecomme englobant n'importe quelle protéine ou polypeptideprésentant une séquence acides aminés, qui estpratiquement homologue de la séquence acides aminés SEQID N°: 6, et ayant en outre les activités biologiquessuivantes : 1 ) Lorsque la protéine ou le polypeptide estadministré par voie intraveineuse à des souris ob/obobèses matures, ayant jeûné pendant de 16 à 18 heures, etqui présentent un poids corporel d'au moins 30 g pour unedo.se de 20 pg ou moins, en utilisant les techniques deHaley et McCormick, Brit, ci-dessus, la protéine ou lepolypeptide : (a) réduisent la prise de nourriture pendant un testd'alimentation de 5 heures de 50% par comparaison avecdes souris témoins, auxquelles on a injecté un véhicule(ED5Q afin de réduire l'accroissement de poids corporel);et (b) réduisent l'accroissement de poids corporelpendant les 24 heures suivant l'injection par voieintraveineuse d'au moins 50% par comparaison avec lessouris témoins auxquelles on a injecté le véhicule (ED50pour la réduction de 1 ' accroissement de poids corporel) . 2) Lorsque la protéine ou le polypeptide estadministré par voie intrapéritonéale (IP) à des sourisob/ob mature n'ayant pas jeûnées, qui présentent un poidscorporel d'au moins 30 g, deux fois par jour au début dujour et à nouveau 3 heures après le crépuscule, pendantune semaine, selon une dose totale journalière de 20 ugou moins, la protéine ou le polypeptide; 10 20 i. -, .3*. jR Λ. 010362 (b pendant de poids corporelpremière injection (a) réduisent la prise de nourriture pendant 5 et 24heures d'au moins 20% par comparaison aux souris témoins,auxquelles on a injecté un véhicule (ED2G peur diminuerla prise de nourriture); et réduisent l'accroissementles 24 heures suivant la intrapéritonéale d'au moins 20% par comparaison avec dessouris témoins, auxquelles on a injecté le véhicule (ED20pour la réduction de l'accroissement de poids corporel).
Telle qu'utilisée ici, l'expression "protéine obhumaine" englobe des protéines modifiées de façondélibérée, tel que par exemple, par mutaçénèse dirigéesur le site ou par l'intermédiaire de mutations, de façonaccidentelle. L'expression "pratiquement homologue" qui peut serapporter à la fois aux séquences acides nucléiques etsignifie qu'une séquence parciculière acides aminés,impliquée, par exemple est une sequence mutante,différente d'une séquence de référence par une ou plusd'une substitution, délétion ou addition, donc i‘effetglobal ne se traduit par une dissimilarité fonctionnellecontraire entre les séquences de référence et objets.Pour les buts de la présente invention, les séquencesayant une homologie supérieure de 95%, des propriétésbiologiques équivalentes et des caractéristiquesd'expression équivalentes sont considérées pratiquementhomologues. Dans le but de déterminer l'homologie, en nedoit pas tenir compte de la troncature de la séquencemature. Des séquences présentant des degrés moindresd'homologie, de bioactivité d'expression équivalents en générale, des séquences homologues d'ADN peuvent êtreidentifiées par hybridation croisée sous des conditionsd'hybridation normalisée de stringence modérée. caractéristiquesconsidérées des et desont1 règle 30 comparaole équivalent e pratique. Ξ .j;:, 010362 10
La dénomination "fragment" de protéine ob humaine oumurine signifie n'importe quelle protéine ou polypeptideayant la séquence acides aminés d'une partie ou fragmentd'une protéine ob humaine ou murine, et qui présentel'activité biologique des protéines ob humaines oumurines, respectivement. Les fragments englobent lesprotéines ou les polypeptides préparés par dégradationprotéolytique des protéines humaines ou murines ou bienpréparés par synthèse chimique par des techniquesordinaires dans ce domaine.
Une protéine ob ou un fragment de celle-ci sont"biologiquement actif" lorsque l'administration de laprotéine ou du fragment à un mammifère, y compris l'hommeréduit la prise de nourriture et réduit le tauxd’accroissement pondéral chez le mammifère. Ladétermination d'une telle activité biologique de laprotéine ob humaine ou murine peut être mise en oeuvrepar des essais classiques bien connus, utilisés dans detels buts sur une ou plus d'une espèce de mammifère, enparticulier la souris ob/ob obèse. Plusieurs de cestests, qui peuvent être utilisés pour démontrer une telleactivité biologique, sont décrits ici. Afin de déterminerl'activité biologique selon l'essai par voieintraveineuse chez les souris ob/ob tel que décrit ici,la protéine ob humaine ou murine présente, de préférence,un ED^q pour la réduction de la prise de nourriture de 20pg moins un ED50 pour la réduction de poids corporel de20 pg ou moins. En variante, dans la détermination del'activité biologique de la protéine ob humaine oumurine, selon l'essai par voie intrapéritonéale chez dessouris ob/ob telles que décrites ici, la protéine obhumaine ou du murine présente, de préférence, un ED20pour la réduction de la prise de nourriture de 20 pg oumoins ou un ED20 pour la réduction de l'accroissement depoids corporel de 20 pg ou moins. En règle générale, des „ 010362 fragments qui présentent l'activité biologique mentionnéeci-dessus, sont préférés.
Le "réplicon" est un élément génétique (par exempleun plasmide, un chromosome, un virus) qui fonctionne entant que motif autonome de la réplication de l'ADN invivo, c'est-à-dire, susceptible de réplication sous sonpropre contrôle. "Vecteur d'expression" est un réplicon, tel qu'unplasmide, un phage ou un cosmide auquel un autre segmentd'ADN peut être fixé de façon à réaliser la réplicationdu segment fixé. Il comporte un motif transcriptionnelcomportant un assemblage de (1) un élément génétique ondes éléments génétiques présentant un rôle régulateurdans l'expression des gènes, par exemple des promoteursou des agents favorisant, (2) une séquence structurelleou codante, qui est transcrite dans 1 ' AF.Nm puistranslatée dans la protéine et (3) des séquencesd'initiation et de terminaison appropriées auxtranscriptions.
La dénomination "clone" est un groupe de moléculesd'ADN dérivées d'une longueur originelle de séquence ADNet préparées par des techniques de génie génétiquemettant en oeuvre une bactérie-ou un virus, impliquantsouvent des plasmides.
La "séquence signal" est une séquence d'acidesnucléiques située au début (extrémité 5') de la séquencecodante d'une protéine devant être exprimée. Cetteséquence signal encode un peptide de signal, N-termmalpour la protéine nouvellement synthétisée, qui amène lacellule hôte à transférer la protéine vers ou à traversla membrane de la cellule hôte, ce peptide signal étanthabituellement excisé pendant un tel transfert.
Le "codon d'initiation" est un codon habituellementATG situé dans la séquence codante d'une protéine, et 12 010362 habituellement au niveau de l'extrémité 5', et signale lepremier acide aminé dans une séquence de protéine.
Le "codon d'arrêt" est un codon non-sens situé danset habituellement au niveau de l'extrémité 3' d'uneséquence codante d'une protéine, et signale l'extrémitéd'une chaîne polypeptidique croissante.
Le "cadre de lecture ouvert" (ORF) est une rangéelinéaire de triplets de codons dans une ADN à doublebrin, encodant une séquence d'acides aminés dans unecellule in vitro ou in vivo, lorsqu'elle est placée sousle contrôle de séquences régulatoires appropriées. Leslimites de 1 ' ORF sont déterminées par un codond’initiation à l'extrémité 5' et par un codon d'arrêt àl'extrémité 3'. Il peut être également désigné en tantque "séquence codante".
La "séquence promotrice" est une zone régulatoire del'ADN, susceptible de lier une polymérase d'ARN dans unecellule et de faire débuter la transcription d'un cadrede lecture ouvert en aval (direction 3') d'un ou de plusd'un gène structurel. La séquence promotrice esthabituellement située au niveau de l'extrémité 5' de laséquence signal ou du cadre de lecture ouvert et s'étenden amont dans la direction 5' afin d'englober le nombreminimum de bases ou d'éléments nécessaires pour débuterla transcription du polypeptide à un niveau détectableau-dessus de l'arrière-plan.
Une séquence codante ou ORF est sous le contrôled'une séquence promotrice lorsque la polymérase d'ARNtranscrit la séquence codante en ARNm.
Une composition comportant A (où A est un simplepolypeptide) est homogène pour A lorsqu'il n'existeaucune quantité susceptible d'être détectée de protéinescontaminantes ou d'autres produits endogènes, tels quedétectés par des moyens classiques, par exemple, lacoloration de gel en polyacrylamide. Pour les buts de 13 10 010362 ce t t eà u:polypde lecet te mvencicn, la aenoromatton r.omcger.s se rapporter; coûipcsittcr. comportant une protéine eu u;ptice unique, lorsqu'au moins 95% au moins en poïc;comcosition est constituée car ce colmceotide c proteine unique,des étapes suivantes mettent en exergue le;techniques pour l'expression, de façon recombinante de;protéines ob de l'être humain et d; mu une :crm- leiiules, soluble et biologiquement active etexempte d'autres protéines de mammifères, à partir delaquelle les protéines ob peuvent être ensuite purifiéesjusqu'à i’homogénéité. Ces étapes sont exemplifiées eudetails dans Les exemples. ) Obtenf-ien de cènes et de la semis et humain.L’ADNc (SEQ 1D \’"1 ) encodant la protéine ob murin plus lasequence signal naturelle est publié·? dans Zhancj Y. etal. ci-dessus. Cet ADNc de murine a été isolée etamplifiée par une technique PCR en utilisant des amorces exemr a o·; d oligodésoxynucléotide ADN par desclassiques. Ces amorces d'ADN et; les techn?obtenir sont décrites dans Zhang, Y. et al. ci-dessus. L'ADNc (SEQ LD N°;4) encodant la protéine cb humaineplus sa séquence signai naturelle esr. obtenu en utilisantles mêmes amorces d'oligodésoxynucléotide d'ADN tel criemises en oeuvre dans Zhang Y. et al., ci-dessus, afind'obtenir Le gène ob murin. En utilisant une techniqueclassique, cet ADNc humaine a été isolée à partir d'unemanque d'ADNc de péage lambda, réalisée à partir d'un ARNdérivé d'un tissu constitué d'adipocytes humains. L ' ADNc ob humain ou de la souris peut être obtenunon seulement à partir de banaues d'ADNc, mais sa?u'autres moyen;; classiques, t echnique; mes oour le; banques d ADNc,car exemnle car mimique ou pat' clonage d'ADN génomique ou. de de celle-ci, purifiée à partir de la cellule appropriéeCes techniques sont décrites car Sambrook et al., dan; 14 010362 "DNA Cloning: A Practical Approach", vol. I et II, D.N.Glover, éd. 1985, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K,, 3entcn et Davis, Science 196, 180-182 (1977); et Grunstein et
Kogness, Proc. Nat. Acad. Soi. 72, 396Ί-39Τ5 (1975). Afin 5 d'obtenir les ADNc cb humains ou de la souris à partirdes banques d'ADNc, ces dernières sont criblées par destechniques d'hybridation d'ADN classiques par lesprocédés de Benton et Davis, ci-dessus, ou de Grunsteir.et Hogness, ci-dessus en utilisant les amorces préparées 10 par transcription inverse d'ARN poly-adé.ny lé, isolées àpartir de cellules adipeuses murines, qui renferment legène ob du murin. Des clones qui s'hybrîdisent en amorcessont analysés par clivage au moyen d'une endonucléase derestriction, électrophorèse sur gel d'agarcse et les 15 expérimentations d'hybridation supplémentaires ("Southernblots") impliquant des amorces ayant subi un traitementpar électrophorèse. Après avoir isolé plusieurs clonesqui s'hybridisent aux sondes d'ADNc murin, le segmenthybridisant d'un clone est sous-cloné puis séquencé par 20 des techniques classiques.
Des clones dérivés d'un ADN génomique peuvent renfermer des régions d'ADN réçulatoires et mtrcn, outreles régions codantes; des clones dérivés d'ADNc nerenfermeront pas de séquences intron. Dans le clonage 25 moléculaire du gène provenant de 1 ' ADN génomique, desfragments d'ADN sont produits, dont certains encoderontie gène souhaité. L ' ADN peut être clivé au niveau decites spécifiques en utilisant différents enzymes derestriction. En variante, on peut utiliser des ADN en 50 présence de manganèse pour fragmenter l'ADN, ou bieni 1 ADN peut être découpé par voie physique, tel que parexemple par sonication. Les fragments linéaires d'ADNpeuvent être ensuite séparés en fonction. de leursdimensions par des techniques normalisées, y compris, 35 sans que cela soit une limitation, une électrophorèse sur 010382 gel d'açarcse et gelchrc~atooraohie de colonne. crviamiae murer, ce vecteur technucue ;oit iacloné,cou que 1 r' <-· ΤΊ utilisé. ?a; connues aansdisponible dansexemple, ource, _e gen.e oc nunair. oucar voie moléculaire, dans unla propagation uu gène par desce domaine. un vecteurle commerce peut être 1'ADNc de la souris peut êtreinséré dans un vecteur pcADM3, 1'ADNc peut être inséré10 dans un vecteur pDleuscriptSF-. Des vecteur:; appropriéspour être utilisés avec des hôtes bactériens son: décritspar Pouwels et a!.., dans "Clcninçi Vectors: A LaboratcrvManual", 1985, id<-.pvipr. u v
Elsovier, N. Y. ?Jn tant gu ' exemc représentatif mai:·, non limitatif des vectou; de elenaue bactérienne peuventorigine bactérienne, utilisables pour l'utilisationcomporter un marqueur et unesusceptibles d'être choisis, de réplication dérivée deplasmides, disponibles dans le commerce, qui sont à Leurtour dérivés de vecteurs de clonage bien connus pE?.33.7(ATC 3701 7) . De Lois vecteurs, du commerce comprennent,par exemple, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, L’ppsaia,Suède) et pGEMl (Promega Siotec, Madison, Wi.sc. USA) .
Les séquences nucléotides du gène ob humain oumurin, insérées dans ces vecteurs disponibles dans lecommerce, peuvent être vérifiées par des techniques car.:·ce domaine, par des techniques de séquençage normaliséesdes nucléotides. D'autres acides nucléiques qui codent les protéine?ob d'espèces autres que humaine ou murine peuvent êtreutilisés ici. En conséquence, étant donné que 1'ADNspécifique a été cloné et séquencé par rapport au gène obhumain et de la souris, n'importe quel adipocyte animalpeut être utilisé potentiellement en tant que sourceci' acide nuciéiaue de la protéine ob. 16 1Ώ±2 Γ"1 τη ι
nn H 010362 imctio.n d'un vecteur d'expression pC'ir et. ir.urir.e. Les gènes ob humains eu murins, cloné selon les techniques décrûtes ci-dessussont utilisés pour construire les vecteurs d'expression pour les protéinesrespectivement.
Pour l'exoression de
OD humaines et murines, la protéine cb biologiquementactive, humaine et murine, par une cellule transfectée eutransrormée d'un hôte E. colu ou pour la sécrétion de laprotéine ob dans le périplasme, un nouveau vecteurd'expression peut être utilisé. Ce vecteur d’expressioncomporte un promoteur et une séquence d’ADN encodant uneprotéine de fusion. La protéine de fusion est constituéede deux parties: la première partie étant un peptidesignal pour la protéine de membrane extérieure A de E.coli (sOmpA) et la seconde partie de la protéine defusion étant la protéine ob humaine ou murine (moinsleurs propres séquences naturelles de signaux). Laséquence d'ADN encodant cette protéine de fusion estéqalement constituée de deux parties: une première partieencode le peptide sOmpA et une seconde partie qui qu humaine (moins leurs encode la protéine ob murine ou séquences naturelles de signaux). La première partie dela séquence ADN qui encode le peptide sOmpA et laséquence signal décrite par De Sutter, K. et al., Gene1 41 , 1 6 3—170 (1 994) est présente la séquence denucléotide de SED ID N°:7. La seconde partie de laséquence d'ADN en deux parties encode les protéines obmurines et humaines et présente une séquence nucléotidede SEQ ZD 11° : 1 ou SEQ ID N° : 4, respectivement moins la portion de la séquence de nucléotide qui encode lesséquences signal naturelles respectives.
Le peptide signal encodé par la sequer.ee signalsOmpA de SEQ ID N°: 7 possède la séquence d'acides aminés 10 ;o 17 SEQ Σ3 N°: 8 comme rapporté ôessus.
Le nouveau vecteur d'expression deest réalisé en insérant les séquences prc encoa; roteme ce ;ar De Sucrer, rusion dans d'expression classique, appropriée pour protéines coli.
Pour 010362 a_. , ci- inventicn :es e: ADN,le vecteur expression ce recombinautes dans les cellules vecteui )tes c expressionprom.oteurcontrôler construire ce nouveauselon la présente invention, n'importe quepeut être utilisé pour autant qu'il soit acrela transcription de la protéine de fusion comportant lepeptide sOmpA et la protéine ob dans la cellule hôte E.coli. Lorsque le sOmpA est utilisé en tant que peptidesignal, il est préférable d'utiliser à la fois lepromoteur de lac-opérateur (EOpac) et Le prcr.oteur delipoprotéine (l’ipp) · D'autres promoteurs intéressantspour une telle expression dans E. coli comprennent lepromoteur de polymérase T7 ARN décrit par Studier et al.,J. Mol. Biol. 189, 1 1 3-1 30 ( 1 986), le promoteur lacs décrit par Lauer, J. Mol. Appl. Genet. 1, 129-147 ('981) et disponible partir e American - Ype eu*tu:
Collection (ATCC) en tant que ATCC 3712’, le prcmc· tac décritLaboratorydisponible phosphatase alcaline par Maniatis,Manual", Colden tant que<. pho A ) dans "iMolecuiar Clcnmç;Spring Harbor 1982, et ATCC 37138, le promoteuret le promoteur trp décrit, 4j5”-40''2 ouverts et par Goedel et al. Nucleic Acids Research(1980). D'autres promoteurs ont été d utilisés dans E. col;séquences nucléotides et des détails concernant airs habile de es ier de •ecteur d'expression de permettant à un collaborateurfaçon fonctionnelle à 1 'intérieur cette invent publiés (Siebenlist et al. Cell 20, 269-28' 18 10 30 35 010362
De façon spécifique, un vecteur d'expressioncomporte : a) une séquence promoteur, et b) une séquence d'ADN, encodang une protéine defusion, cette protéine de fusion comportant la protéinecb murine de SEQ ID N°: 3 ou la protéine ob humaine deSEQ IC N°: 6, et le peptide signal pour la protéine A demembrane extérieure de E. coli.
Dans ce qui suit, le procédé pour construire cenouveau vecteur d'expression est décrit. Ce procédé esten outre décrit en détails dans les exemples etreprésenté sur les figures 2 et 3. D'abord, la séquencecodante du gène ob de l'être humain et de la souris(moins sa séquence signal naturelle) est incorporée dansun plasmide renfermant la séquence signal sOmpA, telleque le plasmide pT1OsOmpArPDï. Ce plasmide p1OsOmpArPDïainsi que sa construction et sa préparation sont décritspar De Sutter K. et al., ci-dessus. Une fois incorporédans ce plasmide, le gène ob humain ou de souris estfusionné à ce gène sOmpA afin de créer une "séquence degène hybride" dans ce plasmide. Le qène sOmpA doit setrouver en amont de la région 5' de la séquence codantedu gène ob. Par la suite, les promoteurs tels qu'énumérésci-dessus, et de préférence le promoteur de lipoprotéine(?lpp) et le lac-promoteur-opérateur (POgac), sentincorporés dans ce plasmide renfermant la séquence degène hybride afin de créer les vecteurs d'expression decette invention. Deux formes de réalisation devecteurs d'expression sont identifiées en tant p.LPPsOmpA mob et pLPPsOmpA nob1 et sont représentées surles figures 2 et 3, respectivement. N'importe quel procédé ou technique, connus dans cedomaine, destinés à la construction d'un tel plasmidepeuvent êsre utilisés. En outre, l'ordre selon lequel ces eue un fusionne le sOmpA et les séquences de gène or 19 Ο 1 0362 incorpore les séquences de gène dans un plasmideapproprié et incorpore le promoteur de façon à atteindrele vecteur d’expression de cette invention, n'est pascritique. Par exemple, la séquence de gène sOmpA peut 5 être initialement fusionnée à la séquence de gène cbmurin ou humain, afin de créer directement une séquencede gène hybride, et ensuite, cette séquence hybride estinsérée dans un plasmide dans lequel sont déjà incorporésles promoteurs appropriés. Il est toutefois nécessaire 10 que la séquence de gène sOmpA se trouve en amont del'extrémité 5' de la séquence de gène ob murin ou humain.On a découvert qu'en utilisant un tel nouveau vecteurd'expression et en particulier, en utilisant la séquencefinale encodant le sOmpA, les protéines cb humaines ou 15 murines peuvent être transférées vers l'espacepériplasmique, ou le peptide signal est clivé, de façonappropriée en laissant intactes les protéines ob humainesou murines, qui s'y trouvent, sous une forme soluble etbiologiquement active. Une fois dans cet espace 20 périplasmique, les protéines ob sont sécrétées, de façonefficace, vers l'environnement libre de cellules, exemptde protéines d'autres mammifères, après avoir soumisesles cellules hôtes à un choc osmotique, moment auquel lesprotéines cb peuvent être purifiées jusqu'à l'homogénéité 25 sous une forme biologiquement active. 3) Expression des protéines ob humaines ou murinesdans des cellules transformées E. coli
Par la suite, les vecteurs d'expressicn construitsselon les techniques décrites ci-dessus sont insérés dans 50 une cellule hôte E. coli afin de transformer cettedernière. Une souche quelconque de E. colr peut êtreutilisée, telle que la souche 294 de E. coli K-12, telleque décrite dans la publication du brevet britanniqueîî°2055382 A (ATCC N°31 446). D'autres souches utilisables 55 selon cette invention comprennent E. coli MC106' [ 20 010362
Casadaban et Cohen, J.. Mol. Biol. 1 38, 179-2G7 (1980) J, E. coli B, E. coli X 1776 (ATTC N°31537) et E. coli W3110 (ATCC N°27325) ou bien d'autres souches, denombreuses parmi celles-ci étant déposées et disponibleschez les institutions reconnues pour le dépôt des micro-organismes .
Les cellules transformées E. coli sont cultivéesjusqu'à une densité appropriée des cellules et cultivéespar des techniques normalisées. En faisant croître et encultivant ainsi les hôtes transformés E. coli, lesvecteurs d'expression de cette invention permettent, defaçon efficace et effective, l'expression des protéinesob murines ou humaines et le transfert de ces mêmesprotéines dans le périplasme des cellules-hôtes E. colisous une forme soluble et biologiquement active. Lepeptide signal sOmpA (c'est-à-dire la partie 1 de laprotéine de fusion) est clivé pendant le transfert de laprotéine de fusion dans le périplasme pour fournir laprotéine ob biologiquement active, exempte d'autresprotéines ou polypeptides de mammifères. De façonspécifique, la technique pour préparer une protéine obbiologiquement active et recombinante humaine ou murine,exempte d'autres protéines de mammifères, comprend lesétapes de: a) construire un vecteur d'expression ayant une séquence promoteur et une séquence ADN encodant uneprotéine de fusion, cette protéine de fusion comportantSEQ ID N°: 3 ou SEQ ID N° : 6, et le peptide signal pour la protéine de la membrane externe A de E. coli ; b) insérer le vecteur d’expression dans une cellulehôte de E. coli afin de transformer la cellule hôte E.coli ; c) exprimer la protéine de fusion dans la cellulehôte E. coli; et 21 010362 d) traiter la cellule hôte coli avec un tampcn de libérer la protéined'autres prctéines designal. froid de choc osmotique afinhumaine ou murine, exemptemammifères et exempte du peptide
Les protéines ob humaines ou murines, préparées parvoie recombinante, sous une forme soluble biologiquementactive, dans le périplasme des cellules E. coiipurifiées par transformées sont purifiées par la1'homogénéité.
Les protéines ob recombinantes humaines et murines,transférées vers le périplasme cellulaire selon lestechniques décrites ici peuvent être sécrétées de façonefficace, à l'extérieur de la cellule en soumettant lescellules hôtes à un choc osmotique techniques connues dans ce domaineKoshland D. et Botstein, D., Cell 20, 749-760 (5 980). L'utilisation d'un choc osmotique à froid libère le E.coli des protéines ob sous leur forme biologiquementactive, exempte de protéines ou de polypeptides d'autresmammifères.
Les protéines ob humaines ou murines, situées dansle fluide osmotique à la suite du choc osmotique à froiddes cellules transformées E. coli, selon la techniquedécrite ci-dessus, sont biologiquement actives e: peuventêtre purifiées jusqu'à l'homogénéité en utilisant unecombinaison entre une chromatographie de colonneéchange d'anions, une chromatographie de colonnes suite yusqu à froid par deset décrites car par par
Les interaction hydrophobe et une filtration sur gelchromatographies par échange d’anions et par interactionhydrophobe peuvent être mises en oeuvre dans n'importequel ordre, l'utilisation de l'une ou l'autre doittoutefois précéder la filtration sur gel.
L'étape d'échange d'anions peut être mise en oeuvrepar des moyens classiques. La colonne préférée pour unechromatographie par échange anionique est une colonne Q î , j&amp;Ai ϊήΛί^-* 22 010362 exemple,humaines avec un groupes
Sepharose Fast Flow. Des anions appropriés pourchromatographie par échange anionique englobentdifférentes matrices insolubles comportant des groupesdiéthylaminoéthyle (DEAE) ou diéthyl-(2-hydroxypropyl)aminoéthyle (QAE). Les matrices peuvent être à based1acrylamide, d'agarose, de dextrane, de cellulose oud'autres types habituellement utilisés dans lapurification des protéines. Un produit particulièrementutilisable pour la chromatographie par échange anioniqueest le DEAE-Sephacel (Pharmacia, Uppsala, Suède;. Lorsquedes milieux renfermant des groupes DEAE sont utilisés,les extraits qui renferment des protéines ob murines ouhumaines sont appliqués à un pH faiblement acide, parpH 8,1. Les protéines liées ob murines oupeuvent être éluées sous une forme plus fortement purifiée par application d'un gradient salindans un tampon approprié tel que le tris-HCl. En règlegénéral, les caractéristiques du gradient peuvent êtredéterminées par des expérimentations préliminairesd'élution, mettant en oeuvre une petite quantité deprotéines recombinantes.
Le produit renfermant la protéine ob de l'homme oudu murin, obtenu en mettant en oeuvre une chromatographiepar échange d'anions, lorsqu'une telle technique estutilisée comme premier stade de purification, est par lasuite soumise à une chromatographie par interactionhydrophobe. Ce type de technique est une technique deséparation dans laquelle les substances sont séparées surla base de différentes forces d'interaction hydrophobematériau de lit non chargé, qui renferment deshydrophobes. De façon typique, la colonne d'interaction hydrophobe est d'abord équilibrée sous desconditions favorables à la liaison hydrophobe, parexemple, une force ionique élevée. Un gradient salin 23 01036 décroissant peut être mis en oeuvre pour éiuer1'échantillon. N'importe quelle colonne d'interaction hydrophobepeut être utilisée. Une colonne hydrophobe avantageuse 5 est en phényl Sepharose, toutefois, du butyi Sepharosepeut être également utilisé. Selon l'invention, lematériau renfermant la protéine ob recombinante murrne euhumaine, qui a été éluée à partir de la colonneanionique, est chargé sur une colonne renfermant un gel 10 hydrophobe relativement fort, tel qu'une phényl
Sepharose. Afin de favoriser l'interaction hydrophobeavec le gel hydrophobe, on utilise un solvant qui renferme, par exemple, une quantité plus élevée que ouégale à 0,4 M de sulfate d'ammonium, cette dernière 15 molarité étant préférée. Ainsi, la colonne et l'échantillon sont ajustés avec du sulfate d'ammonium 0,4M dons un tampon tris-50 mM et l'échantillon est appliquésur la colonne. La colonne est lavée avec un tampon ausulfate d'ammonium 0,4 M. La protéine ob est ensuite 20 éluée avec des solvants qui atténuent les interactionshydrophobes, telles que par exemple, des gradients salinsdécroissants, de l'éthylène ou du propylène giycol oubien de l'urée. Une forme de réalisation préféréeimplique de laver la colonne en séquence avec le tampon 25 tris et du tampon tris renfermant 20% d'éthvlène giycol.La protéine ob est éluée par la suite à partir de lacolonne avec un gradient de concentration décroissante ensulfate d'ammonium et une concentration croissante enéthylène giycol dans le tampon tris. La mise en oeuvre 30 collective et séquentielle d'une chromatographie par échange anionique et d'une chromatographie de colonne par interaction hydrophobe, dans n'importe quel ordre, fournit, de façon routinière, une protéine ob humaine ou murine, avec une pureté estimée de 90%. 24 010362 L'étape de chromatographie par filtration de gelsuit les étapes de chromatographie par échange d'anionset de chromatographie sur colonne par interactionhydrophobe spécifiée ci-dessus, et peut être mise en 5 oeuvre par une technique classique de filtration sur gel.La protéine ob éluée à partir de la colonne d'interactionhydrophobe ou de la colonne d’échange anionique, quelleque soit la colonne utilisée en dernier, peut êtreconcentrée puis dialysée jusqu'à un faible volume en 10 mettant en oeuvre une membrane présentant un poidsmoléculaire déterminé de 10 000 (membrane AMICON-YM10).Le produit concentré peut être ensuite chargé sur unecolonne renfermant des milieux de filtration du type geltels que le G100-Sephadex (Pharmacia, Uppsala, Suède) . La 15 protéine ob peut être ensuite séparée des autres agentscontaminants sur la base de son poids moléculaire par destechniques normalisées en mettant en oeuvre du SDS-PAGE.
Le séquençage de l'acide aminé N terminal de laprotéine ob murine ou humaine peut être mis en oeuvre par 20 des procédés connus dans ce domaine, par exemple parélectrotransfert selon les techniques de Laemli, U.K,Nature 227, 680-685 (1970) ou bien par les techniques décrites par Matsudaira, P,, J.· Biol. Chem. 262, 1CO35- 1 0038 (1 987) . Le séquençage interne peut être également 25 réalisé par des techniques connues dans ce domaine parexemple, les fragments de peptides peuvent être produitspar digestion de la bande M (sur de la nitrocellulose)avec une endoprotéinase lysine C après quoi ils sontséparés par un système HPLC. 30 L'activité biologique des protéines ob purifiées humaines et murines, selon cette invention, est tellequ'une administration fréquente de cette protéine parinjection à des patients humains ou à des souris setraduit par une prise d'aliments diminuée et un taux 35 diminué d'accroissement de poids par comparaison avec des ' : Λ - » ί ι- / , ; >ί.λ.'ώχ-si.&amp;.*- / k«wL>?îbA iïfeie» 25 01 0362 sujets des groupes . témoins ou n'ayant pas subid'in}ection.
Les activités biologiques des protéines ob humainesou murines, ou bien de fragments de celles-ci obtenus et 5 purifiés selon cette invention peuvent être testées pardes techniques de routine, par exemple, par injectionintracérébroventriculaire unique ou répétée chez dessouris ob/ob selon les techniques de Haley, T.J. et al.,ci-dessus, comme décrit en détails dans les exemples 13 10 et 16. En se basant sur ce test ICV, le ED50 pour laréduction de la prise de nourriture et le ED50 pour ladiminution de l'accroissement de poids corporel peuventêtre déterminés. En outre, l'activité biologique desprotéines ob purifiées de l’homme et du murin ou bien des 15 fragments ’ de celles-ci peut être déterminée parl'injection intrapéritonéale répétée chez des sourisob/ob comme spécifié en détails dans l'exemple 15. Er. sebasant sur le test IP, le ED20 pour la réduction de laprise de nourriture et le ED20 pour la diminution de 20 l'accroissement de poids corporel peuvent êtredéterminés. L'activité biologique des protéines ob humaines etmurines, ou bien des fragments de ceux-ci, qui sontobtenus puis purifiés selon la présente invention, peut 25 être également déterminée chez les êtres humains par destechniques connues dans ce domaine, par exemple enmesurant la réduction de la prise d'aliments selonl'essai, à la suite de l'administration IV de la protéineob à des sujets obèses selon l'essai sur l'homme, par 30 comparaison à l'administration IV de témoins à base desolutions salines, selon les techniques de Muurahainer.,ÎÎ.E. et al., Am. J. Physiol. 260, 672-680 (1 991), etcomme décrit en détails dans les exemples 14-17. Envariante, la capacité des protéines ob purifiées murines 35 et humaines, selon la présente invention, pour réduire le . « ’ ·Ϋ » ν<'ίΑ·, ί 26 010362 taux d’accroissement pondéral (par exemple la perte depoids induite) peut être déterminée par l’administrationIV répétée aux sujets obèses de l’essai sur l’homme selonles techniques de Drent, M.L. et al., Int. J. Obesity 19,221-226 (1995), comme décrit en détails dans l’exemple18.
Les protéines ob murines et humaines, selon laprésente invention, lorsqu'elles sont purifiées seloncette invention, présentent une activité biologique dufait que: 1) lorsqu'elles sont administrées par injectionintracérébro-ventriculaire (ICV) à des souris ob/obobèses, matures, ayant jeûné pendant de 16 à 18 heures,et qui présentent un poids corporel d'au moins 30 g,selon une dose de 20 g g ou moins, en mettant en oeuvreles techniques de Haley et McCormick, voir ci-dessus, laprotéine ou le polypeptide: (a) réduisent la prise de nourriture pendant un testd'alimentation de 5 heures de 50% par comparaison auxsouris témoins, auxquelles fut injecté un véhicule (ED50pour la réduction de la prise de nourriture). (b) réduisent l’accroissement de poids pendant les24 heures suivant l'injection -ICV d’au moins 50% parcomparaison aux souris témoins auxquelles fut injecté unvéhicule (ED50 pour la réduction de l'accroissement dupoids corporel); et 2) lorsqu'ils sont administrés par voieintrapéritonéale (IP) à des souris ob/ob matures n'ayantpas jeûné qui présentent un poids corporel d’au moins30 g, deux fois par jour au début du jour et à nouveautrois heures après le crépuscule, pendant une semaine,selon une dose totale journalière de 20 qg ou moins, laprotéine ou le polypeptide: ,Λ .¾¾¾ 27 010362 (a) réduisent la prise de nourriture pendant 5 et 24heures d'au moins 20% par comparaison aux souris témoins,auxquelles fut injecté un véhicule (ED20, peur laréduction de prise de nourriture; et 5 (b) réduisent l'accroissement de poids ccrporel pendant les 24 heures suivant la première injection parvoie intrapéritonéale d'au moins 20%, par comparaison auxsouris témoins auxquelles fut injecté un véhicule ÎED2C)pour la réduction de l'accroissement du poids corporel). H) En outre, cette réduction de poids corporel et de prise de nourriture se produit même pour des dosesinférieures à 20 pg ou moins, même pour un niveau dedosage administré par ICV de 1 pg ou moins spécialementlorsque ces protéines sont purifiées jusqu'à 15 l'homogénéité.
Les essais biologiques décrits ci-dessus et endétails dans les exemples destinés à déterminerl'activité biologique des protéines ob humaines et/oumurines peuvent être utilisés pour déterminer l'activité 20 biologique de fragments de ces protéines, que cesfragments soient préparés par dégradation protéolytiquedes protéines ob, par synthèse chimique au moyen d'uneexpression recombinante des protéines d'une séquence deportion d'ADN pour les protéines ob ou par un autre moyen 25 quelconque connu de l'homme de l'art.
Selon une autre forme de réalisation de cette invention, les protéines ob murines et humaines, selonl'invention, peuvent être conjuguées avec deshomopolymères de polyéthylène glycol ou de polypropylène 30 glycol, qui peuvent être non substitués ou substitués paréthérification de l'un des groupes hydroxy au niveau de 1. ' une de ses extrémités par un groupe alkvle inférieur.Ces conjugués fournissent la protéine ob sous fermestabLe et améliore la demi-vie de ces protéines. En 35 outre, l'utilisation de ces conjugués formés à partir 28 010362 d1homopolymères de polyéthylène glycol ou d'homopolymèresde propylène glycol procurent des moyens pour accroîtrela demi-vie de l'activité de la protéine ob dans lecorps. En outre, ces conjugués se sont avérés procurerdes avantages supplémentaires, tels qu'un accroissementde la stabilité et du temps de circulation de la protéineob thérapeutique dans le corps, tout en diminuantégalement l'immunogénicité de la protéine ob. Cesprotéines ob pégylées peuvent être également facilementadsorbées dans le corps humain et procurent une priseaccrue dans le système sanguin.
Les homopolymères de polyéthylène ou de polypropylène glycol préférés, qui sont conjugués à laprotéine ob, ont des poids moléculaires d'environ 15 à 60kDa, afin d'obtenir une protéine qui peut être mono- oupoly-pégylée avec des molécules de polyéthylène ou depolypropylène glycol. Dans le cas préféré, la protéine obest soit mono- ou di-pégylée afin d'obtenir un conjuguéavec les motifs polyéthylène ou polypropylène glycol, cesmotifs dans le conjugué présentant un poids moléculairetotal de 15 à 60 kDa, plus avantageusement de 35 à 45kDa. En règle générale, les conjugués sont préparés sousla forme de mélanges (composition) de conjugués depolyéthylène glycol et de polypropylène glycol, étantdonné que les produits de départ à base de ces composéssous forme de mélanges de différentsprésentant des poids moléculaires différents. Le poids moléculaire spécifié ci-dessus estun poids moléculaire moyen du mélange de conjugués obainsi préparé. Ces mélanges peuvent être préparés enconjugués individuels, si on le souhaite, par des moyensclassiques tels que par chromatographie de colonne, ycompris par HPLC. Toutefois pour le traitement, ceconjugué est, en règle générale, utilisé sous forme demélange. sont vendushomopolymères 29 010362 quelconquedisponibles. Leglycol peuvent1’intermédiaireprotéine, ainsi
Les polymères de polyéthylène glycol eu cepolypropylène glycol [PEG] peuvent être fixés à laprotéine ob par l'intermédiaire de l'acide aminé N-terminal de la protéine pour former le conjugué par unmoyen classique quelconque. Des procédés peur la fixationdu polyéthylène glycol ou du propylène glycol pour formerle conjugué avec la protéine ob peuvent erre l'unedes nombreuses techniques connues,polyéthylène glycol ou le propylèneêtre liés de façon covalente parde l'acide aminé N-terminal de laqu'également par 1 ' intermédiaire de différents résidus de lysine sur la protéine ob.
En outre, les homopolymères de polyéthylène glycolou de polypropylène glycol peuvent être conjugués à laprotéine ob par des groupes de liaison bi- ou poly-la préparation des conjuguésmono-polyéthylène glycol ou de fonctionnels. Dan:d'homopolymères depolypropylène glycol, des agent:fonctionnelsà un groupe de liaison du- sont utilisés et 1'homopolymère est conjuguefonctionnel de cet agent de liaison. Despolymères de tri- ou poly- [polyéthylène ou polypropylèneglycol], qui sont conjugués avec la protéine ob, sontformés en mettant en oeuvre un agent de liaison tri-fonctionnel ou poly-fonctionnel. L'homopolymère peut êtreconjugué à deux ou plus de deux parmi ces groupesfonctionnels. Un groupe fonctionnel restant de l'agent deliaison étant fixé à la protéine ob. Parmi ces agents deliaison, se trouvent des agents de liaison poly-fonctionnels qui présentent des groupes fonctionnelsamine et carboxy. Les groupes amines peuvent se conjugueravec le groupe hydroxy fonctionnalisé du polyéthylènegl.ycol ou du polypropylène glycol afin de former uneliaison amide. Des groupes carboxy peuvent se conjugueravec les groupes amino sur la protéine ob afin de former 010362 30 une liaison amide . et avec le groupe hydroxyfonctionnalisé sur le glycol afin de former un ester.Parmi les nombreux types de groupes de liaison quipeuvent être utilisés pour former le conjugué entre la 5 protéine ob et le PEG, on peut citer ceux décrits dansles brevets U.S. N°4 902 502, 5 034 514, 4 609 546, 5 122614 et 4 847 325.
Selon une forme de réalisation spécialement préféréede la présente invention, on peut citer les conjugués 10 correspondant aux formules: 15
R’OCH2CH2(OCH2CH2)^-O-C--NH (CH2)4 20
I-A
CH
ROCH2CH2(OCH2CH2)n-—O-C-NH 30 et RO(CH2CH2O)nCH2CH2 -C -nh-
Ç-NH- P
I-B 0 35 31 010362 dans lesquelles P est.la protéine ob murine ou humaine,décrite ici; et n et n' sont des nombres entiers donc lasomme se situe de 300 à 1 200 de sorte que le poidsmoléculaire moyen de tous les motifs PEG se situe dans lagamme de 15 à 60 kDa et le poids moléculaire total duconjugué se situe dans la gamme de 30 kDa à 80 kDa; et Pet R' sont un alkyle inférieur.
Les composés de formule I-A et I-B peuvent êtrepréparés à partir de produits polymères connus:
O
ROCH2CH2(OCH2CH,)--O-C-NH (CH-p,
en les condensant avec la protéine ob murine ou humaine,selon la présente invention. Un procédé classiquequelconque susceptible de faire réagir un ester activéavec une amine pour former un amide peut être utilisé.Dans la réaction illustrée ci-dessus, l'esrersuccinimidylique exemplifié est un groupe partant, quiprovoque la formation d'un amide. Si le composé deformule II-B est utilisé pour préparer le composé deformule I-B, la réaction avec la protéine ob murine ouhumaine, selon la présente invention, est mise en oeuvre ·2£ι«ί-£ά·..· Î- VtI hi*^·A —'fri^/f1 ji· ^ιΛ --*^ a»·.·**^.* 32 010362 de la même manière que décrite en relation avec laconversion du composé de formule II-A en composés deformule I-A. Ces esters succinimidyliques, tels que lecomposé de formule II-A destiné à préparer des conjugués 5 avec des protéines sont décrits dans Monfardini et al.Bioconjugate Chem. 6, 62-69 (1995).
Dans le cas du composé de formule I-A, la somme de net n' se situe de 300 à 1 500 de façon à obtenir unconjugué présentant un poids moléculaire moyen total des 10 motifs PEG se situant dans la gamme de 15 à 60 kDa, depréférence de 35 à 45 kDa. Dans la forme de réalisationpréférée de la formule I-A, la somme de n et n’ se situed'environ 800 à 1 200, la somme moyenne de n et n' étantde 850 a 1000. En règle générale, le rapport préféré de n 15 à n' dans les composés de formule I-A et II-A se situedans la gamme de 0,5 à 1,5, de 0,8 à 1,2 étant préféré.Dans le cas du composé de formule I-B, n se situe depréférence entre 300 et 1500 afin d'obtenir un composéayant de 300 à 1 500 motifs PEG avec un poids moléculaire 20 total de 15 à 60 kDa, et, de préférence, de 35 à 45 kDa.Dans la forme de réalisation préférée, n se situe entreenviron 850 et 1000.
Les protéines' ob humaines ou murines, qui sontpréparées selon la présente invention, peuvent être 25 conditionnées sous forme de compositions pharmaceutiquesappropriées pour l'injection avec un véhicule ou unsupport pharmaceutiquement acceptable par des techniquesconnues dans ce domaine. Un produit support classiquequelconque peut être utilisé. Le produit support peut 30 être un composé organique ou inorganique, approprié pourune administration entérale, percutanée ou parentérale.Des supports appropriés comprennent l'eau, la gélatine,la gomme arabique, le lactose, l'amidon, le stéarate demagnésium, le talc, les huiles végétales, les 35 polyalkylène glycols, le pétrolatum et analogues. En 33 010362 outre, les préparations pharmaceutiques peuvent renfermerd'autres agents pharmaceutiquement actifs. Les actifssupplémentaires tels que des agents de sapidité, desagents conservateurs, des agents stabilisants, des agentsémulsifiants, des tampons et analogues peuvent êtreajoutés selon les pratiques acceptées pour leconditionnement pharmaceutique. Parmi les supportspréférés pour la formulation de protéines ob homogènesselon l'invention, on peut citer la séroalbumine humaine,les protéines du plasma humain etc. L'administration d'une protéine ob homogènerecombinante, qu'elle soit humaine ou murine ou bien unecombinaison des deux, se traduit par des prises denourriture réduites et une perte de poids chez les êtreshumains et les animaux obèses. En conséquence,l'administration de la protéine ob réapprovisionne encette protéine qui est importante dans la régulation dupoids corporel. Les compositions pharmaceutiques, quirenferment les protéines ob humaines ou murines, peuventêtre formulées selon un dosage efficace pour êtreadministrées par différents moyens à un patient humain ouanimal présentant des fluctuations anormales de poidscorporel, soit seul, soit en relation partielle avec unétat ou une maladie médicale miscible, telle que lediabète mellitus de type II. Un certain nombre detechniques d'administration par injection peuvent êtreutilisées, inj estions parmi ces dernières, on peutsous-cutanées, intraveineuses et intrapéri-tonéales. Des quantités moyennes de protéines ob peuventvarier et en particulier devant être basées sur lesrecommandations et les prescriptions d'un médecin ou d'unvétérinaire qualifié. citer es
Les protéines ob humaines ou murines, qui sentpréparées selon la présente invention, peuvent êtreégalement utilisées dans des techniques de criblage peur 34 010362 l'identification d'un, (de)· récepteur(s) de la protéineob.
Les exemples donnés ci-dessous ne sont pas destinésà limiter l'invention en aucune façon. D.escription. succincte .dea.-des.sins
La figure 1 est une vue schématique de deux clonespour la protéine ob humaine, c'est-à-dire hob c11 et hobcl 2, ce schéma illustrant le positionnement et les typesde sites de restriction se trouvant aux extrémités 5' et3' d'une séquence d'ADNc ob humaine.
La figure 2 est une représentation schématique de laconstruction d'un vecteur d'expression pLPPsOmpA.
La figure 3 est une vue schématique de laconstruction du vecteur d'expression pLPPsOmpA.
Exemple 1
Obtention d'un ADNc ob humain L'ADNc ob humain est obtenu en criblant une banqued'ADNc de phage lambda disponible dans le commerce("Clontech") réalisé à partir d'un ARN dérivé d'un tissuadipeux humain. A partir de cette banque, deux phageslambda renfermant chacun approximativement un fragment de 2,5 kilobase correspondant à la séquence ADNc ob, sontobtenus par l'intermédiaire d'une hybridation des banquesde phage lambda. Par cette technique, deux clones sontidentifiés, c'est-à-dire ADNc hobl et ADNc hob2. Le gèneob humain est sous-cloné dans le vecteur plasmide ADNpBleuscriptSK-, disponible dans le commerce chezStratagène. Les vecteurs résultants renfermant cesséquences de gène ob humain sont appelés pBleuscriptSk-hobl et pBleuscriptSK- hob2.
La séquence de gène ob humain dans cespBleuscriptSk- et pBluescriptSK- nob2 sont vérifiés parséquençage de nucléotides. Les séquences d'acrdes aminésde la protéine sont déduites du séquençage nucléotidecorrespondant à la protéine humaine ob encodée par SEQ -i* ju.:. 010362 35 ID. N°: 4 et tel que. publié par Zhang, Y. ec al-, ci- dessus. Le pBluescriptSk" hob1 présente une muraticn T-Caprès le codon arrêt de l'ADNc hobl. Cette mutatron setraduit par la perte du site de restriction StuI par 5 ailleurs prévu comme étant présent dans la séquence denucléotide de hobl de la manière suivante:iiohl -..GGG.TCG.TGA GGCCT TGA...pElcnncr ip t Sk-hnhl 10 ...GGG.TGC.TGA GGCCC TGA...
Gly Cys arrêt
pEluescriptSk-hQbZ...GGG.TGC.TGA GGCCT TGA
Gly Cys arrêt 15 Etant donné que cette mutation en pBleuscripcSk- hob1 est située après le codon arrêt de la séquence del'ADNc ob humaine, elle ne conduit pas à une modificationde la séquence acides aminés de la protéine ob humainecomme publié par Zhang, Y. et al. ci-dessus. 20 Pour autant que la séquence nucléotide de l'ADNc présent dans pBleuscriptSk- hob2 est concernée, on adémontré par analyse d’enzyme de restriction que ceplasmide présente le site de restriction StuI, positionnéaprès le codon arrêt de la séquence ADNc ob humaine. 25 Outre le fait que le pBleuscriptSk" hobl possède une mutation dans le site de restriction StuI, suivant lecodon arrêt, le pBleuscriptSk" hobl présente également unsite de restriction EcoRI après le ORF dans l'ADNc hcb’qui est absent dans l'ADNc hob2 (voir figure 1). 30 Exemple 2
Construction du plasmide pour la protéine ob murine (mcnl L'ADNc ob murin de SEQ ID N° : T est obtenu par latechnique de Zhang Y. et al., ci-dessus, et ensurceinséré dans le vecteur pCADN3 disponible dans le commerce 35 chez Invitrogen (San Diego, Californie, USA) . Le gène co 36 010362 murin ainsi obtenu est. utilisé pour construire le vecteurd'expression pLPPsOmpA-mob destiné à l'expression de laprotéine ob murine (mob). Ce vecteur d'expression et saconstruction sont illustrés en détails sur la figure 2.
La première étape de construction consiste àréaliser la fusion de la séquence codant le signal àpartir du gène sOmpA vers la région mature codante dugène ob murin, c'est-à-dire sans sa séquence de signalnaturelle. Le fragment d'ADN de 501 pb encodant laprotéine ob mature murine, inséré dans le vecteur pCADN3est amplifié à partir du vecteur par la réaction depolymérase en chaîne (PCR) en utilisant une polymérased'ADN Vent (New England Biolabs), une amorce antérieure(amorce 1 ) débutant avec le premier nucléotide de lavaline encodant le codon (qui est le premier amino-acidedans le mob mature) (Zhang, Y. et al., ci-dessus) et uneamorce inverse (amorce 2) correspondant à la région dumob renfermant le codon arrêt de mob. L'amorce 2 renfermeégalement une séquence correspondant à un site derestriction Hind III.
Amorce 1:5' GTG CCT ATC CAG AAA GTC 3'
Val Pro Ile Glu Lys Val
Amorce 2: 5' TCCCAAGCTT 1CAGCATTCAGGGCTAAC 3'
HindlII arrêt
Le fragment 501 pb d'ADN, amplifié, est purifié parélectrophorèse sur gel d'agarose puis phosphorylé enutilisant la T4 polynucléotide kinase ("Boehringer") etensuite digérée avec l'enzyme de restriction HindlII.afin de créer une extrémité en relief 5' au niveau de laposition de l'amorce 2. Le fragment obtenu présente uneextrémité franche correspondant au premier nucléotide de1’ADxNc encodant le mob mature, et une extrémité en relief5' correspondant à un site clivé HindlII.
Par la suite, le plasmide sOmpA, pT1OsOmpArPDIobtenu par les techniques de De Sutter K. et al., ci- 37 Oî 0362
dessus, est fusionné, au gène mob afin de créer unplasmide pT1 OsOmpAmob. Afin de réaliser ceci, le fragmentmob est cloné par ligation en utilisant de la ligase T4("New England-Biolabs") dans le vecteur pT'OsCnArPÛI 5 d1 ADN qui est digéré au préalable avec des enzyrr.es derestriction Nael et HindlII par des techniques connuesdans ce domaine [Sambrook, J. et al., dans "MolecuiarClonir.g: A Laboratory Manual" Seconde édition, Ccld
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New 10 York, 1 989], Ce plasmide pTlOsOmpArPDI est dérivé duplasmide p714 [Parker et Wiley, Gene 83, 117-134 (193?’]-
Ce plasmide renferme 1’ADNc encodant la protéine de ratmature. L’isomérase disulfure (rPDI) ADNc est fusionné àla séquence sOmpA. 13 Cette fusion du dernier codon dans sOmpA (alanine) au premier codon dans l'ADNc du rPDI mature .glycine)crée un site de restriction Nael, qui, après clivage avecNael, libère le dernier codon dans la séquence sOmpA etle premier codon dans 1 'ADNc encodant la séquence r?Ci, 20 sous forme d'extrémités franches.
Nael 5 ’ .......GCC / GGC ........ 3 '
Ala Gly sOmpA ADNc / rPDI ADNc mature 25 Un site HindlII existe à l'extrémité de l'ADNo encodant le rPDI. En conséquence, une digestion supplémentaire de ce plasmide avec HindlII libère la majeure partie de 1 ' ADNc rPDI et crée une extrémité en relief 51, qui est compatible avec une des extrémités du30 fragment PCR. Le plasmide résultant ou 1'ADNc encodant lerPDI est remplacé par 1'ADNc encodant la protéine chmature de la souris est appelé pT1OsOmpAmob et es: illustré sur la figure 2. L ' ADN ligaturé est introduit dans une souche MCI 0 5‘35 d'E. coli en utilisant une électroporation normalisée «. ·— 38 010362 après quoi les colonies obtenues sont criblées pour lamise en évidence du fragment d'ADN ob murin par analysed'enzyme de restriction. Le clone pT1OsOmpAmob possède laséquence encodant la protéine ob mature murine, fusionnéeà la séquence encodant sOmpA.
Ensuite, l'expression du mob dans E. coli dans cettepTIOsOmpAmob est placée sous le contrôle à la fois dupromoteur lipoprotéinique (plpp) et du promoteur-opérateur lac (POj_ac) . Pour ce faire, la séquence sOmpA-mob du gène hybride est transférée du plasmidepLPPsOmpAmob vers le vecteur pLPPsOmpArPDI par destechniques normalisées décrites par De Sutter et al., ci-dessus. Le plasmide pLPPsOmpArPDI est dérivé, comme déjàmentionné ci-dessus, du plasmide p714 [Parker et Wiley,Gene 83, 117-134 (1989)]. Pour cette étape, le plasmidepT1 OsOmpAmob ADN est clivé avec les enzymes derestriction Xbal et HindlII. Le fragment renfermant l’ADNencodant sOmpA-mob est ensuite ligaturé dans le plasmidepLPPsOmpArPDI à partir duquel 1'ADN encodant sOmpA-rPDIest éliminé au préalable par clivage avec les enzymes derestriction Xbal et HindlII. Le plasmide résultant estappelé pLPPsOmpAmob.
Exemple 3
Expression de la protéine ob murine dans E. .coli (XC1061) L'expression de la protéine ob murine dans E. coliest réalisée de la manière suivante. Le plasmidepLPPsOmpAmob construit selon l'exemple 2 est inséré parélectrophoration dans une souche MC1061 d'E. coli. Lescellules E. coli (MC1061) hébergeant le plasmidepLPPsOmpAmob sont cultivées toute une nuit à 28°C dans unmilieu de type Luria-Bertania ("Difco Laboratorres"),alimenté avec l'antibiotique carbénicilline (100 pg/mi,"Beecham"). Cette culture est ensuite utilisée en tantqu’inoculum (à une dilution de 100 fois) pour une culturede 30 ml toute une nuit à 28°C dans le même milieu. Cette 010362 39 culture est ensuite diluée 100 fois dans 3 litres (parexemple 6 x 0,5 1 dans des fioles Erlenmeyer de 1 litre;dans le milieu ci-dessus puis agitée à 28°C dans unagitateur pneumatique New Brunswick (300 tpm) pendantenviron 4 heures jusqu'à ce qu'une densité de 0,3 à 0,5AgQQ soit atteinte. A ce moment, le promoteur lac estinduit par addition d'une concentration finale 2 ml·:d ' isopropyl-(3-D-thiogalactopyranoside (IPTG, "Boehringer") comme décrit par De Sutter et al., ci-dessus. Les cellules sont en outre incubées à 28°Cpendant environ 5 heures jusqu'à ce que la densité decellule atteigne un Aggo de 1,3 à 1,5. Par la suite, lescellules sont recueillies par centrifugation dans unrotor JA10 (modèle de centrifugeuse Beckman J2-21 ou J2-21M) pendant 6 minutes à 6750 tpm (8000 x g) à 4°C. Laphase surnageante est éliminée et le gâteau de cellulesest remis en suspension rapidement dans 250 ml de tamponrefroidi à la glace pour choc osmotique (100 mM de Tris-HCl, pH 7,4, renfermant 20% de saccharose, EDTA 10 ml·!)puis incubée sur de la glace pendant 10 à 20 minutescomme décris par Koshland et Botstein, ci-dessus.
Par la suite, la suspension est transférée dans destubes en plastique centrifugeuse et les cellulesrecueillies par centrifugation à 8200 t/mn (8000 x g)pendant 5 minutes à 4°C dans un rotor JA20. La phasesurnageante est éliminée et le gâteau de cellules estrapidement remis en suspension dans 120 ml d'eau glacéesous agitation vigoureuse puis incuber sur de la glacependant encore 10 minutes. La suspension est ensuitecentrifugée dans le rotor JA20 pendant 6 minutes à 4°C àraison de 11 500 tpm (16 000 x g) et la phase surnageantequi correspond à la fraction périplasmique (fluide dechoc osmotique) est recueillie (environ 120 ml) . Del'azoture de sodium et du tris-HCl (pH 7,5) sont ajoutésjusqu'à une concentration finale de 0,05% et 50' mM, - ν'* 4' *·, \ 40 010362 respectivement. Le fluide de choc osmotique, qui renfermela protéine ob murine, est stocké à 20° C jusqu’àutilisation ultérieure.
Exemple ...4
Expression de la protéine ob murine dans E. colr (MCI 061^ L'expression de la protéine ob murine est réaliséeselon la technique décrite dans l'exemple 3, sauf que latriacilline (Ί00 pg/ml) constitue l'antibiotique utiliséepour alimenter le milieu Luria-Bertaria (plutôt que lacarbénicilline).
Exsmpl^__S
Euriflcati.on.de la protéine ob murine à par..tir_du. fluide osmotioue d'E. coli
La protéine ob murine, qui se trouve dans les 120 mlde fluide réfrigéré pour choc osmotique selon l'exemple4, est purifiée de la manière suivante. Les 120 ml defluide pour choc osmotique, qui renferme la protéine obmurine, sont dégelés puis centrifugés à 4°C pendant 20minutes à 1 6 000 tpm dans un rotor JA20 afin d’éliminerles débris insolubles. La phase surnageante est ensuitechargée directement sur une colonne renfermant 30 ml d'unsubstrat volumique de Q-Sepharose Fast Flow ("Pharmacia")prééquilibré avec 50 mM d'un tampon Tris-HCl (pH 7,5).Après lavage avec les 50 mM de tampon Tris-HCl (pH 7,5),la protéine mob est éluée avec 50 mM d'un tampon Tris-HCl(pH 7,5) qui renferme 0,1 M de NaCl.
Par la suite, du (NHz})2SO4 solide est ajouté auproduit élue provenant de la colonne renfermant du Q-Sepharose Fast Flow jusqu'à une concentration finale de1,0 M après quoi le mélange est chargé sur une colonnerenfermant 7,5 ml de substrat volumique de butyi-Sepharose Fast Flow ("Pharmacia”) prééquilibré avec untampon tris-HCl 50 mM (pH 7,5) qui renferme du (NrZ4)?SO41,0 M. Après lavage avec le tampon tris HCl (pH 7,5) quirenferme du (UH4)2SQ4 1,0 M, la protéine mob est éluée en 010362 41 appliquant un gradient, de (NH4)2SC>4 1,0 M dans le tamponTris-HCl 50 mM (pH 7,5} jusqu'à 20% d'éthylène glycoidans l'eau. La protéine mob est éluée de la colonne debutyl-Sepharose Fast Flow à la fin même du gradient,tandis que la plupart des agents contaminants sont éluésbeaucoup plus tôt. La pureté de la protéine mcb à cetteétape est de 90%, telle qu'estimée par électrophorèse surgel de polyacrylamide, colorée à l'argent (PAGE).
La protéine mob dans le produit élué provenant de lacolonne renfermant du butyl-Sepharose Fast Flow estensuite purifiée ultérieurement par chromatographie defiltration sur gel. Pour ce faire, la protéine ob de lasouris est concentrée à 4°C jusqu'à un volume de 1 ml surune membrane YM10 ("Amicon") en utilisant une unité deconcentration 8MC ("Amicon"), puis elle est appliquée surune colonne (1,0 cm x 50 cm) renfermant 39 ml de G100-Sephadex ("Pharmacia") prééquilibrés dans une solutionsaline tamponnée au phosphate. Les fractions renfermantla protéine mob sont ensuite rassemblées et la protéineest concentrée sur une membrane YM10. A ce moment, laprotéine mob est pure au-delà de 95%, comme estimée parPAGE et coloration à l'argent. Un SDS-PAGE a révélé unebande unique de protéine à Mr 15- 000.
Exemple. 1
Analyse séquentielle de la protéine ob murine
La séquence acides aminés N-terminale de la protéineob murine, qui est obtenue puis purifiée par lestechniques des exemples 2, 3, 4 et 5 décrits ci-dessus,est réalisée selon la technique de Laemli, U.K., cr-dessus. Après l'électrotransfert des protéines soumises àune électrophorèse, vers une feuille en fibre de verrerevêtue de poly(4-vinyl-iodure de N-méthylpyridinium),comme décrit par Bauw, G. et al., J. Biol. Chem. 7, 194-1 96 (1 988) , la bande de protéine au niveau Mr 1 5 000 es:excisée de la membrane et la séquence acides aminés N- 42 — é Λλ-LJ ifc.îu>ù3tjfr£. Λΐ-ι1.ιΓ<ίίί»ί^-«'e. 010362 terminale est déterminée par une dégradation de Edman surun séparateur de séquence en phase gazeuse 470A, équipéed'un analyseur d'acides phénylthiohydantoïne aminés 120A,sur circuit ("Biosystèmes appliqués"). La séquenced'acides aminés N-terminale de la protéine ob murine, quiest obtenue par des techniques décrites ci-dessus, estVal-Pro-Ile-Gln correspondant à la protéine ob naturemurine de SEQ ID N°: 3.
Exemple...!
Construction du vecteur d'expression pour une protéine.ob humaine (hob)
Le gène ob humain, obtenu selon les techniques del'exemple 1, est utilisé pour construire ur. vecteurd'expression pLPPsOmpAhobl destiné à 1'expression de laprotéine ob humaine. Cette construction est similaire àla construction de pLPPsOmpAmob décrite dans l'exemple 2,et est explicitée en détail sur la figure 3. Une ligationà trois fragments est nécessaire pour terminer lefragment d'ADN renfermant la séquence codante ob mature,humaine, en totalité.
Dans la première phase de la construction, uneséquence nucléotide hob, débutant avec le premiernucléotide du codon encodant le premier acide aminé de laprotéine ob, mature, humaine (valine) est fusionnée à laséquence codant le signal de OmpA (sOmpA), de sorte quela séquence sOmpA se trouve en amont de l'extrémité 5' dela séquence codante du nucléotide hob. Le fragment d'ADNest obtenu par amplification d’un mélange PCR renfermantle plasmide pBluescriptSK-hobl, la polymérase d'ADN Vent,et deux amorces. L'amorce antérieure (amorce 1) débuteavec le premier nucléotide du codon encodant le premieracides aminés de la protéine ob mature, humaine, etl'amorce inverse (amorce 2) renferme la séquence d’ADNchumaine, renfermant le codon arrêt. La réactiond'amplification fournit un fragment d’ADN de Ξ01 pb 43 010362 renfermant la séquence encodant la protéine cb mature, humaine. L'extrémité 5' du fragment d'ADN est ensuite phosphorylée avec une T4digérée avec l'enzyme de polynucléotide kinase puisrestriction HindlII, pour 5 obtenir un fragment 353 pb ADN présentant une extrémitéfranche correspondant au premier nucléotide de 1' ADNcencodant la protéine ob mature (position correspondant àl'amorce 1), et une extrémité en relief 5' correspondantà un site clivé HindlII. Ce fragment 353 pb d'ADN est 10 purifié par électrophorèse sur gel d ' agarose et clonédans le plasmide pTI OsOmpArPDI qui a été digéré aupréalable avec les enzymes de restriction Nael etHindlII. Le plasmide résultant pT1OsOmpAhcb 1 (partiel)possède le fragment d'ADN encodant une partie de la 15 protéine ob mature, humaine (partie amino-terminale)fusionnée à la séquence encodant sOmpA.
Amorce 1 : 5' GTGCCCATCCAAAAAGTC 3'
Amorce 2: 5' TCCCAAGCTTTCAGCACCCAGGGCTGAG 3' arrêt 20 Dans une seconde étape, la séquence ADN encodant la partie terminale carboxy de la protéine ob humaine,c'est-à-dire le fragment 2, est ligaturée au fragment ADNencodant la partie amino-terminale de la protéine hobmature, et le fragment résultant encodant la séquence hob 25 mature en totalité, fusionné à sOmpA est transféré auplasmide pLPPsOmpArPDI pour réaliser l'expression de laprotéine ob humaine mature dans E. coli sous le contrôledu promoteur lipoprotéiniaue et de l'opérateur-promoteurlac. Pour ce faire, le plasmide pTIOsOmpAhobl (partiel) 30 est digéré avec Xbal et HindlII et le fragment ADN 400 obi de hob est isolé par électrophorèse sur gel d'agarcse(fragment 1) . Par la suite, le plasmide p3leuscnptSH_hobl est clivé avec HindlII et EcoRI, et le 450 pb estisolé par électrophorèse sur gel d'agarose (fragment 2). 35 Finalement, le plasmide pLPPsOmpArPDI est clivé avec Xbal 44 010362 et EcoRI, tandis que .le fragment vecteur est isolé parélectrophorèse sur gel d'agarose (fragment 3). Lesfragments d'ADN 1, 2 et 3 sont ensuite ligaturés les unsaux autres, et le mélange de ligation est introduit dansune souche MCI 061 d'E. coli. La colonie renfermant et leproduit d'assemblage du plasmide final pLPPsOmpAhobl estutilisée pour l'expression et la sécrétion d'une protéineob mature, humaine.
Exemple 8
Expression_de_le_protéine ob humaine_dans E. coli 1MC106.1 )
Le pLPPsOmpAhobl, assemblé selon l'exemple 7 estutilisé pour transformer la souche MC1061 d'E. colidestinée à l'expression de la protéine ob humaine sousune forme soluble, biologiquement active, dans lepériplasme des cellules hôtes E. coli. L'insertion duplasmide dans ces cellules hôtes E. coli est réalisée parélectroporation. Les cellules E. coli (MC1061) hébergeantle plasmide pLPPsOmpAhobl sont cultivées à 23°C dans unmilieu de Luria-Bertania ("Difco Laboratories")alimentées avec l'antibiotique carbencilline (100 pg/ml,"Beecham") jusqu'à la densité appropriée après quoi lepromoteur lac est induit par addition d'une concentrationfinale 2 mM d'isopropyl-p-D-thiogalactopyranoside (IPTG,"Boehringer " ) comme décrit par De Sutter et al., ci-dessus. Les cellules sont en outre développées jusqu'à ceque la densité de cellule atteigne 1,3 A^qq. Par lasuite, les cellules sont recueillies par centrifugation(8000 x g à 4°C) et le gâteau cellulaire est remisrapidement en suspension dans un tampon réfrigéré pourchoc osmotique (tris-HCl 100 mM, pH 7,4 renfermant 20% desaccharose et 10 mM d'EDTA) puis incubées sur de la glacependant 10 minutes comme décrit par Koshland et Borstein,ci-dessus. 45 010362
Par la suite, . les cellules sont à nouveaurecueillies par centrifugation comme ci-dessus et legâteau cellulaire est remis en suspension dans de l'eaurefroidie par de la glace puis incubées sur de la glacependant 10 minutes. La suspension est ensuite centrifugéependant 5 minutes, à 16 000 x g et la phase surnageante(fluide de choc osmotique) est recueillie. De l'acoturede sodium et du Tris-HCl (pH 7,5) sont ajoutés jusqu'àune concentration finale de 0,05% et 50 mM,respectivement. Le fluide de choc osmotique, qui renfermela protéine ob humaine, est stocké à 20°C jusqu'àutilisation ultérieure.
Exemple 9,
Expression_de la protéine ob humaine dans Ξ. coli (MC1061) L'expression de la protéine ob humaine est réaliséeen mettant en oeuvre la technique de l'exemple 8, saufque la triacilline (100 ug/ml) est utilisée commeantibiotique pour alimenter le milieu de Luria-3ertariaplutôt que la carbénicilline.
Exemple 10 E-Urification de la protéine ob humaine à partir du fluide
Psmo-Liane de E. col i
Afin de purifier la protéine ob humaine dans lefluide de choc osmotique de l'exemple 9, du chlcrure desodium est ajouté au fluide jusqu'à une concentrationfinale de 0,1 M après quoi le fluide est chargédirectement sur une colonne renfermant un substratvolumique de 30 ml de Q-Sepharose Fast Flow ("Pharmacia")prééquilibré avec un tampon de Tris-HCl 50 mM (pH ~,5) .
Par la suite, du (NH4)2SC>4 solide est ajouté aumatériau en écoulement, élué à partir de la colonnerenfermant du Q-Sepharose Fast Flow jusqu'à uneconcentration de 1 ,0 M et le mélange est charge sur unecolonne renfermant un substrat volumique de 7,5 ml de , 010362 46
butyl-Sepharose Fast Flow ("Pharmacia") prééquilibré avecun tampon de tris-HCl 50 mM (pH 7,5) renfermant du(NH4)2SC>4 1,0 M. Après lavage avec un tampon tris-HCl (pK 7,5) qui renferme du (NH^ySC^ 1,0 M, la protéine hob est
5 éiuée par application d’un gradient de (NH4)23C>4 1,0 M dans un tampon tris-HCl 50 mM (pH 7,5) jusqu'à 20%d'éthylène glycol dans de l'eau. La protéine hob estéluée à partir de la colonne de butyl-Sepharose Fast Flowà l'extrémité même du gradient, tandis que la plupart des 10 agents contaminants ont été élues beaucoup plus tôt. Lapureté de la protéine hob à ce stade est de 90% commeestimé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide,teinté à l'argent (PAGE).
La protéine hob dans le produit élué à partir de la 15 colonne renfermant du butyl-Sepharose Fast Flow estensuite purifiée ultérieurement par chromatographie defiltration sur gel. Pour ce faire, une protéine obhumaine est concentrée à 4°C jusqu'à un volume de 1 mlsur une membrane YM10 ("Amicon") en utilisant une unité 20 de concentration 8MC ("Amicon"), et est appliquée sur unecolonne (1,0 cm x 50 cm) renfermant 39 ml de G100-Sephadex ("Pharmacia") prééquilibrée dans une solutionsaline tamponnée au phosphate. -Les fractions renfermantla protéine ob sont ensuite rassemblées après quoi la 25 protéine est concentrée sur une membrane YM1Û. A cestade, la protéine ob est pure au-delà de 95%, commeestimée par PAGE et coloration à l'argent. Une analyse3DS PAGE de l'éluat révèle la présence d'une bande uniquede protéine pour Mr 15 000. 30 Exemple 1 1
Purification d ' une protéine ob humaine à partir d’un. fluide osmotique E, coll
Afin de purifier la protéine humaine dans le fluidede choc osmotique de l'exemple 9, la technique de 35 l'exemple 10 est utilisée avec l'exception suivante: 47 010362 avant 1'addition du (NH4J2SO4 solide au traduit enécoulement, les étapes suivantes sont mises en oeuvre ence qui concerne le fluide de choc osmotique de l'exemple 9.
La protéine cb humaine dans le fluide de chocosmotique de l'exemple 9 est chargée directement sur unecolonne renfermant un substrat volumique de 30 ml de Q-Sepharose Faut Flow ("Pharmacia") prééquilibré avec untampon tris-MCI 50 mM (pH 7,5) . Après lavage avec untampon Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), la protéine ob est éluéeavec un tampon Tns-HCl 50 mM (pH 7,5) renfermant duchlorure de sodium 0,1 M.
Analyse séquentielle de la protéine ob humaine
La séquence d'acides aminés N-terminale de laprotéine ob humaine purifiée obtenue par les techniquesdes exemples 7 à 11, décrites ci-dessus, est réaliséeselon la technique de Laemli, U.K., ci-dessus. Aprèsélectrotransfert des protéines ayant subi uneélectrophorèse, sur une feuille en fibre de verre revêtuel'un poly(4-vinyl-iodure de il-méthylpyrridinium, commedécrit par Bauw et al., ci-dessus, la blinde protéine pourMr 1 5 000 est excisée de la membrane et la séquenceacides aminés N-terminale est ensuite déterminée pardégradation de Fdman sur un séparateur de séquences enphase gazeuse 470Λ équipé d'un analyseur d'acidespnénylthiohydantoïne aminés 120A sur circuit ("AppliedBiosystems") . La séquence acides aminés N-terminale de laprotéine hob obtenue par les techniques décrites ci-dessus est Val-Pro-Ile-Gln correspondant à la protéine obhumaine mature de SEQ ID N°:6.
Exemple 13
Activité biologique de la protéine murine: j H j θ Ç tl ίΟΏ.ί tl· 27 û C/É 27 ό b 2Γ Ο ~ V Θ Ώ. t 27 2 C Ώ 2.3 2. ï? θ souris ob/ob (iC.V.)cheo des 48 010362 L'activité biologique de la protéine ob mature demurin, purifiée selon l'exemple 5 est déterminée enutilisant la technique ICV de la manière suivante. Descanules d'infusion sont implantées dans le ventriculelatéral du cerveau de souris ob/ob femelles et obèses,anesthésiées (âge 6 à 13 semaines) en utilisant lescoordonnées suivantes, 2 mm latéralement à la lignemédiane; 0,6 mm par rapport au bregma; 2 mm en bas) en sebasant sur les techniques de Haley et McCormick, ci-dessus. L'extrémité de la canule est montée sur la boîtecrânienne en utilisant une vis de bijoutier et du cimentdentaire. Les souris sont logées individuellement dansdes cages en matière plastique avec accès libre à lanourriture (sauf la nuit avant l'injection ICV) et àl'eau. A la suite de la récupération après l’interventionchirurgicale, comme estimée par la prise journalière denourriture et 1'accroissement de poids corporel, lescellules sont étudiées à plusieurs occasions suivantl'injection intracérébro-ventriculaire (ICV) de 1 μΐ del'une des solutions d'essai suivantes: 1) CSF artificiel; 2) solution bactérienne témoin; 3) protéine ob (0,6 à 1 pg/souris); ou 4) pas d'infusion. L'injection de l'une des solutions d'essai ci-dessusICV dans chaque souris est suivie par 1 μΐ de CSFartificiel afin de nettoyer la canule. Pour les buts decette expérimentation, la solution bactérienne témoin estun échantillon traité de façon identique et préparé selonles techniques spécifiées pour les exemples 2 à 4, saufque le plasmide inséré dans la bactérie E. coli estabsent du gène ob murin.
Des souris sont soumises à un jeûne pendant 18heures (toute une nuit) avant une injection ICV. Lessouris sont légèrement retenues et une seringue de 10 μΐ 49 010362
Hamiiton, garnie d'.un élément en un tubage depolyéthylène (PE) et calibré (ΡΞ20) est utilisée pourinjecter 1 pl de la solution d’essai dans la canuleplacée dans le ventricule latéral. Les scuris sontensuite immédiatement placées dans une cage d'essai avecun plat de nourriture renfermant une quantité pré-peséede pâtée compacte pour souris et une bouteille d'eau. Lessouris sont observées à la vue et la prise de nourritureest mesurée pour les 7 prochaines heures. Des mesures deprise de nourriture sont obtenues 0,5, 1, 2, 3, 4, 6 et 7 heures après injection ICV. Le poids corporel de chaqueanimal est mesuré avant l’injection ICV et 24 heures plustard. Un placement de la canule avec succès est établipar un accroissement de la prise de nourriture en deuxheures suivant 1'injection ICV de 10 pg de neuropeptidedans des souris ayant jeûné deux heures selon Morley,J.E. et al., American J. Physiol. 253, 51 6-522 (1987) .
Les résultats du test ICV décrits ci-dessus sont lessuivants : IL·_Réduction de la prise de nourriture
Pendant les 30 premières minutes suivant l'injection ICV, la presque totalité des souris mangent avec un courttemps de retard et consomment environ 0,5 g. Les sourisqui n'ont rer;u aucune injection ni CSF artificielcontinuent à manger pendant les 6,5 heures suivantes etatteignent une prise cumulative en 7 heures de 3,2 g(tableau 1). Au contraire, les souris qui cnt ététraitées avec la protéine ob par injection ICV arrêtentde manger après les 30 premières minutes et nerecommencent pas à manger. Ainsi, leur prise denourriture cumulative reste stationnaire pendant les 6,5heures suivantes à environ 0,5 g (tableau 1). Les sourisqui reçoivent La solution témoin de véhicule par ICVarrêtent également de manger après 30 minutes, et nerecommencent à manger qu'entre 6 et 7 heures. 50 010362 Ε ^-.Réduction de 1'accroissement de poids corporel
La modification en 24 heures du poids corporel dessouris soumises à une injection d'un véhicule témoin estlégèrement plus réduite que celle des souris n'ayant passubi d'infection ou ayant subi une injection de CSFartificielle (tableau 1). Toutefois, la modification enpourcentage du poids corporel chez les souris qui ontsubi une injection de protéine ob est voisine de zéro etest réduite de façon significative par comparaison auxsouris auxquelles a été injecté le véhicule témoin(tableau 1) . C. Conclusion L'effet observé de l'administration directe d'uneprotéine ob recombinante de la souris (1,1 gg/souris dans1 gl au niveau du cerveau) est une réduction soutenue etsignificative de la prise de nourriture et del'accroissement de poids pondéral de souris femellesob/ob. Ceci démontre que la protéine ob peut agirdirectement sur le cerveau et cela est cohérent avecl'action de la protéine ob lorsqu'elle est injectée parvoie intrapéritonéale. Cet exemple confirme égalementl'activité biologique de la protéine ob murine,recombinante et exprimée par voie bactérienne, chez dessouris femelle ob/ob, obèses, selon l'invention. 010362 51 TABLEAU 1
Traitements Prise de nourriture (0,7 h) Accroissement de poids corporel (0-24 h) g u»» q % CSF artificiel 3,2 + 0,2 100 3,8 + 0,3 100 Véhicule témoin 0,9 + 0,3 28,1 2,9 + 0,2 76 Protéine ob (1pg/souris) 0,5 + 0,1» 15,6 0,3 + 0,5» 8 10 15 20 *indique des différences significatives entre les groupessoumis à la protéine ob et ceux soumis à du liquidecéphélorachidien artificiel (CSF) avec p<0,05. ** indique le pourcentage de témoin.
Exemple 14
Activité_biologique de_la . protéine ob murine par voie intraveineuse (IV) chgz des souris ob/ob L’activité biologique de la protéine ob murine,obtenue et purifiée selon les exemples 2, 3, 4 et 5, esttestée par injection intraveineuse (IV) chez des sourisob/ob obèses de la manière suivante.
Des souris ob/ob obèses, mâles et femelles (âgées de6 à 13 semaines) sont soumises à une implantation decanules jugulaires permanentes sous anesthésie aupentobarbital (80 mg/kg de poids corporel) selon latechnique de Mokhtarian A. et al., Physiol. Behav. 54,895-898 (1993). Les souris sont logées individuellement dans des cages en matière plastique sous des conditionsconstantes d'environnement avec un cycle de 12 heuresdans 1‘obscurité/12 heures à la lumière. Les poidscorporels sont mesurés tous ensembles journellement et lapermanence des canules est vérifiée et maintenue chaquejour suivant par infusion d’une solution stérilehéparine/saline d'au maximum 0,1 ml (50 U/ml dans unesolution saline à 0,9%). Après récupération complète de 25 52 010362 l'intervention chirurgicale, mise en évidence par unaccroissement de poids corporel, on fait jeûner lessouris pendant de 16 à 18 heures (toute une nuit). Lematin suivant, les souris sont pesées et placées dans des 5 cages d'essai pendant 45 minutes pour qu'elless'acclimatent avant l'expérimentation. De l'eau estdisponible en continu. De la protéine ob de la souris (3pg dans 0,1 ml) ou un égal volume d'un véhicule témoin oud'une solution saline (0,9%) sont injectés par voie 10 intraveineuse. Les souris réveillées sont légèrementmaintenues et des seringues de 0,5 ml pour insuline sontutilisées afin d'injecter 0,1 ml de la solution d'essai,suivi par 0,05 ml de la solution saline d'héparine. Lesessais sont séparés par au moins trois jours. Les scuris 15 sont ensuite immédiatement replacées dans la cage d'essaiavec une boîte de Pétri pré-pesée, qui renferme une dosede pâtée pour souris. Les souris sont observées à l'oeilnu et la prise de nourriture est mesurée pendant les 7prochaines heures, 0,5, 1, 2, 3, 4, 6 et 7 heures après 20 l'injection IV. Le poids corporel est mesuré avantl'injection IV et à nouveau 24 heures plus tard. Deuxgroupes séparés de souris portant des canules ('1 ob/cbet 12 témoins) sont utilisés dans cinq essaisindividuels. La plupart des souris reçoivent de la 25 protéine ob de souris et une injection de contrôle ou lesdeux dans un ordre contrebalancé. Deux préparationsséparées de protéine ob de souris sont utilisées danscette expérimentation. Les données apportées ici sont unecombinaison des résultats de ces réplications 30 individuelles. A. Résultats
Les résultats de l'expérimentation ci-dessus sontles suivants:
Pendant les 30 premières minutes suivant 1'injection 35 IV, la plupart des souris obèses et normales présentent 53 010362 une faible perte d'appétit et consomment environ de 0,3 à0,5 g. La prise de nourriture chez les souris obèsesauxquelles on a injecté la solution saline et le véhiculetémoin, s'accroît au cours de l'expérimentation. La prisede nourriture cumulative des souris obèses ob/obauxquelles on a injecté le véhicule témoin n'est pasdifférente de la prise de nourriture des souris obèsesayant jeûné de façon similaire, auxquelles est injectéela solution saline. Au contraire, la prise de nourrituredes souris obèses ob/ob auxquelles fut injectée laprotéine recombinante ob est réduite de façonsignificatrice et reste contenue pour 57% des témoins(tableau 2) . Aucun autre essai de comportement ne futobservé dans le véhicule témoin et les groupes deprotéine ob pendant la période d'observation de 7 heures.Comme on s'y attendait, l'accroissement de poids corporel24 heures après l'infection n'est pas différente pour lesgroupes de traitement (tableau 2) du fait de la duréelimitée d'action d'une simple injection IV de protéine obde souris. £^.,-Conclus ions.
Ces résultats démontrent que la protéine obrecombinante de la souris réduit de façon significativela prise de nourriture cumulative pendant 7 heures aprèsadministration IV (3 pg/souris) chez les souris obèsesob/ob. La capacité de la protéine ob recombinante chez lasouris à réduire la prise de nourriture chez des sourisobèses ob/ob est cohérente avec des résultats de prise denourriture, obtenus à la suite d'injections répétées parvoie intrapéritonéale de la protéine ob chez des sourisobèses ob/ob. Cet exemple confirme également l'activitébiologique de la protéine recombinante ob de la souris,exprimée par voie bactérienne, chez des souris defemelles obèses ob/ob. 54 010362 . TABLEAU 2
Administration IV de protéine ob murine chez des sourisob/ob
Traitements Prise de nourriture Accroissement de poids (0, 7 h) cornorsl '0-24 h) 4 u’ * σ % Solution saline 1,8 + 0,2 2,9 + 0,3 (n-4) Véhicule témoin 1,4 + 0,3 1 00 2,3 + 0,6 100 (n = 7) Protéine ob 0,8 ± 0,2* 57 1,4 + 0,6 64 ( 1ug/souris) (n = 3) 5
Les résultats sont des moyennes ± sem. n = indiquele nombre de souris individuelles, sem signifie "erreurnormalisée de la moyenne", * indique des différencesnotables entre les groupes traités par la protéine ob et 10 du CSF artificiel, p < 0,05. ** indique le pourcentage de témoins.
AxcilpIc. .15,
Activité biologique de la protéine ob murine; injection 15 répétée-.par voie intrapéritonéale chez la. souris ob/ob L’activité biologique de la protéine ob murine,obtenue et purifiée selon les exemples 2 à 5, es: testéepar injection intrapéritoneale répétée (IP) chez dessouris obèses ob/ob de la manière suivante. 20 Trois groupes de souris femelles obèses ob/ob sont étudiés. Les souris sont logées dans des cages en matièreplastique (trois par cage) sous des conditions constantesd'environnement avec un cycle de 12 heures à1'obscurité/12 heures à la lumière. Le poids corporel et 25 la prise de nourriture en vingt-quatre heures (24) sont
— .·.. .J .îàLL 010362 55 mesurés chaque jour. A la suite d'une périoded'adaptation aux conditions d'environnement et demanipulation journalière ainsi que d'injection, lessouris sont assorties en trois groupes de traitement.Chaque souris reçoit deux injections intrapéritonéales(IP) chaque jour de traitement (peu de temps après ledébut de la phase obscure du cycle obscurité/lumière et 3heures pendant la phase obscure) de 0,1 ml des solutionsd'essai suivantes: 1) solution saline (0,9%); 2) solution bactérienne témoin; ou 3) protéine ob murine (3pg/0,1 ml).
La solution bactérienne témoin est un échantillonmis en oeuvre et préparé de façon identique selon lestechniques spécifiées pour les exemples 2 à 4 afind'obtenir et de purifier une protéine ob murine, sauf quele plasmide inséré dans les bactéries E. coli est absentdu gène ob murin. Les souris sont traitées deux fois parjour pendant 5 jours et ensuite ne reçoivent aucuntraitement pendant 2 jours. La prise de nourriture danschaque cage est mesurée 2, 3, 5 et 24 heures suivant la première injection intrapéritonéale chaque jour detraitement. A. Résultats Réduction de la prise de nourriture
La prise de nourriture n'est pas différente chez dessouris ayant subi une injection de solution saline et decontrôle bactérien les jours de traitement et les joursde non-traitement au cours d'une expérimentation d'unesemaine (tableau 3). Toutefois, la prise de nourritureest réduite chez les six souris ayant subi une injectionavec 6 pg de protéine ob les jours de traitement au coursde l'expérimentation. La réduction de prise de nourritureest observée, 2, 3, 5 et 24 heures après la première injection les jours de traitement dans le groupe de 56 010362 souris ayant reçu de la protéine ob, par comparaison auxgroupes témoins ayant reçu une solution bactérienne etles groupes témoins ayant reçu une solution saline.Réduction de l'accroissement de poids corporel L'accroissement cumulatif de poids corporel pendantles cinq jours de traitement du groupe de protéine cb es:de -3,3 + 0,7 g par comparaison avec -0,9 ± 3,2 g dansles groupes à solution saline témoins et -0, ~ ± 3,4 g dans les groupes à solution bactérienne témoins (tableau 3) .
Conclusion
Cet exemple démontre que deux injectionsjournalières IP de protéine recombinante ob murine,exprimées par voie bactérienne, (6 pg/sourisjour ; setraduit par une réduction significative constante de laprise de nourriture et une diminution significative dutaux d1 accroissement pondéral des souris femelles cb/obtraitées, par comparaison avec les souris ob/ob traitéespar une solution témoin saline et bactérienne. Cesrésultats démontrent que la protéine ob murine expriméepar voie bactérienne, est biologiquement active etprésentent les effets anti-obésité attendus sur dessouris ob/ob génétiquement obèses, selon la présenteinvention. Dans le tableau 3, les résultats à 2 et 5heures sont la prise de nourriture moyenne par jour,tandis que les résultats à 24 heures présentés sont laprise de nourriture cumulative pendant 5 jours. 57 010362 TABLEAU 3
Administration répétée IP de protéine ob murine chez dessouris ob/ob
Traitement Prise de nourriture (g/3 souris) Accroissement de poids corporel 2 h 5 h 24 h g g % de témoin g % de témoin g % de témoin Aucune injection 5,5 + 0,5 14,5 + 0,5 44,3 + 3,5 -0,9 + 0,2 Témoin 7,0 + 0,5 100 16,5 + 1,5 100 49,5 + 6,1 100 -0,7 + 0,4 Protéine ob 3,5 + 0,5* 50 5,5 + 1 ,0* 33 25,5 _+ 52 -3,3 ± 0,7*
Les résultats sont des moyennes ± sem pour sixsouris ob/ob dans chaque groupe'. La prise de nourritureest une prise cumulative moyenne pour des cages de trois 10 souris pendant les cinq jours de traitement à 2, 5 et 24 heures après la première injection IP. L'accroissement depoids pondéral est la modification cumulative de poidscorporel pendant les 5 jours de traitement. *indique lesdifférences significatives entre les groupes traités à la 15 protéine ob et au véhicule, p étant inférieur à 0,05.Exemple. 1 6.
Aclivité biologique de la protéine ob humaine; injection intracérébro-yentriculaire (ICV) chez des souris ob/ob
Les techniques utilisées pour déterminer l'activité 20 biologique de la protéine ob humaine par injection 010362 58 intracérébro-ventriculaire (ICV) chez des souris ob/obsont les mêmes que dans l'exemple 13 sauf que lessolutions d'essai sont: ♦protéine ob recombinante humaine, préparée àl'exemple 11 (0,05 pg) dans une solution saline tamponnéeau phosphate (PBS) qui renferme de la sérum albumine desouris à raison de 0,1% et * PBS renfermant 0,1% (p/v) de sérum albumine desouris (albumine témoin) en tant que solution de véhiculetémoin). réduction de la prise de nourriture
Pendant les premières 30 minutes suivant l'injectionICV la presque totalité des souris mangent avec un faibleappétit et consomment environ 0,5 g. Les souris qui nereçoivent aucune injection continuent à manger au coursdes 6,5 heures suivantes et atteignent une prisecumulative en 7 heures de 1,8 g (tableau 4). Des sourisrecevant la solution témoin d'albumine par ICV arrêtentégalement de manger après 30 minutes et recommencentseulement à manger entre 3 et 7 heures. Au contraire, lescellules traitées avec de la protéine ob humaine par ICVmangent, de façon significative, moins dans les 30premières minutes (0,2 g) et mangent de très petitesquantités pendant les 6,5 heures suivantes. Ainsi, leurprise cumulative de nourriture reste plafonnée pendantles 6,5 heures suivantes à environ 0,4 g (tableau 4). B. Réduction d’accroissement de poids corporel
La modification en 24 heures de poids corporel dessouris auxquelles on a injecté un véhicule témoin estlégèrement réduite par rapport à celle de sourisauxquelles on a injecté du CSF artificiel ou qui n'ontpas subi d'injection (tableau 4). Toutefois, lamodification de pourcentage de poids pondéral chez dessouris auxquelles on a injecté de la protéine ob humaineest voisine de zéro (tableau 4) . 59 010362 C. Conclusion L'effet observé de l'administration directe deprotéine ob humaine recombinante (0,05 pg/souris dans1pl) dans le cerveau, pour atteindre une réduction 5 significative et soutenue de la prise de nourriture et del'accroissement de poids corporel de souris femelle ob/obdémontre que la protéine ob peut agir directement sur lecerveau, et est cohérent avec l'effet de la protéine oblorsqu'elle est injectée par voie intrapéritonéale. Cet 10 exemple confirme également l'activité biologique de laprotéine ob humaine recombinante, exprimée par voiebactérienne, chez des souris femelles obèses ob/ob. TABLEAU 4 15 Administration par ICV de protéine ob humaine chez dessouris ob/ob
Traitements Prise de nourriture Accroissement de poids (0,7 h) corporel (0 à 24 h) b Q %’» Pas d'injection 1,8 ± 0,2 3,1 + 0,4 (n=3) Albumine témoin 1,0 + 0,4 100 ' 1,7 + 0,6 100 (n=3) Protéine humaine 0,4 ± 0,2’ 40 0 + 0,8 0 ob (1ug/sourisj (n=5)
Les résultats sont des moyennes ± sem. N = indique20 le nombre de souris individuelles. * indique lesdifférences significatives entre les groupes à protéineob humaine et les groupes artificiels CSF, p étant inférieur à 0,05. ** indique le pourcentage du témoin.* 25 60
Exemple -1,2
Activité biologique de la protéine ob_chez ,z~;.S .sujets
ι . ·ί~» -λ- . AhVtiiÎirfiO J 010362 ohèeee;réduction de la prise d'aliments 1 1 essai
suivant une administration IV L'activité biologique des protéines murines ethumaines, obtenues et purifiées selon les exemples 7 à 1'respectivement, est déterminée en mesurantl'administration IV suivant la prise d'aliments d'essaiaux êtres humains de la manière suivante.
Des volontaires sains et obèses sont nourris avecdes aliments d'essai présentant une teneur caloriquedéterminée dans un laboratoire nutritionnel à deuxoccasions en mettant en oeuvre la technique deMuurahainen, N.E. et al., ci-dessus. Au moins une heureavant la présentation de nourriture, un cathéter posé àdemeure IV est disposé dans la veine antécubitale oul'avant-bras et est maintenu ouvert avec un verrou pourhéparine. Les taux d'appétit sont obtenus 15 minutesavant et 15 minutes après la présentation du repas, et àla fin du repas d'essai. La protéine ob murine ou humaineou bien la solution saline est ensuite infusée par IV 20minutes avant la présentation du repas. On demande àchaque sujet de manger autant de- nourriture d'essai qu'ille désire jusqu'à ce qu'il soit satisfait. La quantité derepas d'essai ingérée par chaque sujet est mesurée.Chaque sujet reçioit ensuite des infusions de protéine obhumaine (0,5 mg/kg de poids corporel), de protéine obmurine (0,5 mg/kg de poids corporel) ou de solutionsaline et la différence de quantités dans l'alimentd’essai ingéré dans ces conditions est calculée. Dans legroupe traité par la protéine ob humaine ou murine, onobserve une quantité réduite d'aliments consommés d'aumoins 20%.
61 010362
Exemple 18
Activité biologique, de . . la... protéine_ob_chez_Les_sujeln humains obèses: induction de perte de poids par
administration· répétée..IY 5 L'activité biologique des protéines ob murines et humaines, obtenues et purifiées selon les exemples 7 à11, respectivement, est déterminée en mesurant la pertede poids à la suite d'une administration répétée IV de laprotéine ob, selon la technique suivante. 10 Une étude de perte de poids, en essai double, contrôlée par placebo en utilisant les techniques Drent, M.L. et al. ci-dessus, est réalisée. D'autres sujetsprésentant un indice de masse corporel (BMI) supérieur à27 sont pesés et ensuite mis à la diète avec 1 500 Kcal 15 pendant une période se déroulant de 2 à 4 semaines. A lafin de cette période, tous les sujets obèses qui perdentau moins 1 kg de poids corporel sont répartis au hasarddans deux groupes de traitement, préparés pour une pertede poids pendant la phase de déroulement. Les sujets 20 reçoivent une administration journalière IV de protéineob humaine ou murine (0,5 mg/kg/jour) ou bien de placebo(solution saline) pendant au moins 6 semaines. Le poidscorporel est enregistré chaque - semaine. Les sujets quireçoivent de la protéine ob humaine ou murine présentent 25 une réduction significative du poids corporel supérieureau groupe placebo après 6 semaines de traitement.
Exemple. .1, 9 A.-Préparation d'une protéine ob conjuguée à ,du polyéthylène glycol à partir de cellules E. coli 30 50 g d'un gâteau de cellules E. coli préparé comme
décrit dans l'exemple 8 avant d'être remis en suspension,est mis en suspension avec 1 litre de Tris-HCl 50 mM (pH 8,5) renfermant de 11 EDTA 5 mM. La suspension est incubéependant 15 minutes à 37°C, diluée avec 1 litre 35 supplémentaire de Tris-HCl 50 mM (pH 8,5) renfermant de
62 010362
1'EDTA 5 mM. Par la suite, la suspension est homogénéiséeen utilisant un homogénéiseur pendant 15 minutes enréglant la puissance à 50%. La suspension est clarifiéepar centrifugation à 8 000 t/mn, 4°C, pendant une heure.Le gâteau est prélevé, la phase surnageante est diluéeavec de l’eau jusqu'à une conductivité d’1,8 mS, puisappliquée directement sur une colonne garnie de 200 ml deQ-Sépharose Fast Flow (résine échangeuse d’ions fortementanionique), prééquilibrée avec du Tris-HCl 50 mM (pH 8,5). Après lavage avec le tampon d'équilibrage, laprotéine ob adsorbée est éluée de la colonne avec le mêmetampon d'équilibrage, qui en outre renferme du chlorurede sodium 100 mM. L'éluat obtenu après traitement de lacolonne avec le tampon d'équilibrage qui renferme duchlorure de sodium est appelé Q-Sepharose Eluate.
Du chlorure de sodium solide est ajouté au Q-Sepharose Eluate afin d'atteindre une conductivité finalejusqu'à 82 mS. Après ceci, l'éluat est appliqué sur unecolonne d'interaction hydrophobe (HIC) garnie de 200 mlbutyl-Sepharose Fast Flow, prééquilibré avec du Tris-HCl50 mM (pH 8,5) renfermant du chlorure de sodium 1M. Lesproduits non-absorbés sont éliminés par lavage avec untampon d'équilibrage après quoi- la protéine ob absorbéeest éluée avec de l'acétate d'ammonium 50 mM, (pH 8,9)afin d'obtenir un éluat HIC. La protéine ob dans l'éluatHIC est déterminée comme étant pure à 95% par HPLC enphase inverse. La protéine ob purifiée est concentréejusqu'à 3,7 mg/ml en utilisant une membrane crible (YM-10). La membrane crible est une membrane qui retient lesmolécules de 10000 daltons ou plus. Après cette étape deconcentration, en utilisant une membrane crible, laprotéine ob est filtrée par dialyse dans un tampon borate100 mM (pH 8,0) qui est utilisée en tant que solution orpréparée à l'avance. 63
010362 B. Pégylation de la protéine ob humaine
Pour réaliser cette réaction de pégylation, le réactif PEG2~NHS de formule Il-A, dans laquelle R estCH3, la somme de n et n' se situant de 820 à 1040, tandisque la somme moyenne est d'environ 930, et ayant un poidsmoléculaire moyen de 40 kDa, ce réactif étantcommercialisé par Shearwater Polymers, Huntsville,Alabama, est utilisé. Celui-ci est un mélange de réactifsPEGy-NHS de formule II-A, dans laquelle le rapport de n àn' est approximativement 1,0 et la somme de n et de n'dans ce mélange se situant de 820 à 1040 unités, poidsmoléculaire moyen de la chaîne PEG dans ce mélange étantd'environ 20 kDa de sorte que le poids moléculaire moyendu réactif est d'environ 40 kDa, tandis que la sommemoyenne de n et n' dans ce mélange est d'environ 930. A 2mg ou 0,54 ml de la solution en stock de protéine obhumaine purifiée, préparée ci-dessus à la rubrique A (125nmoles de protéine ob], on ajoute 250 nmoles de lasolution de réactif PEG2-NHS mentionnée ci-dessus. Cettesolution est constituée de 10 mg ou 0,1 ml de la solutionde réactif PEG2-NHS à raison de 100 mg/ml dans duchlorure de sodium 1 mM. Le mélange de réaction total estamené à 0,67 ml en ajoutant 100 mM de borate (pH 7,5). Lerapport molaire final de la protéine boratif est de 1:2.
Ce mélange est agité à 4°C pendant 4 heures et laréaction est arrêtée par addition de 1 μΐ d'acideacétique glacial afin d'obtenir un pH final de 4,5. Lemélange de réaction résultant (0,67 ml) est dilué avec del'eau pour former 27 ml d’une solution qui est chargéesur une colonne renfermant 1,7 ml d'une résine échangeused'ions cationique, carboxy-méthylée (Perspetives,Framingham, Massachusetts) . La colonne est équilibréeavec 3,3 μΜ d'un tampon HEPES/MES/acétate de sodium, pH5,0. Le mélange de réaction dilué est appliqué sur lacolonne et le réactif PEG2-MHS non absorbé est éliminé 64 010362 par lavage de la colonne. Les protéines ob, pégylées etnon modifiées, adsorbées sont éluées avec des gradientsprogressifs de sel [15 volumes de colonne chacun] de 80,150 et 500 mM de chlorure de sodium. 2 ml de ces éiuats 5 sont recueillis de façon séparée, en séquences et les échantillons de chaque fraction sont soumis à une analyseSDS-PAGE. A partir de cette analyse, les éluants sont classés en tant que conjugués fortement pégylés, mono-PEG-ob (PEG2~ob) ramifiés souhaités et protéine ob non- 10 modifiée. Chacune de ces fractions est recueillie dans les classifications mentionnées ci-dessus, le secondrecueil renfermant le conjugué protéine ob-mono-?EG2ramifié, souhaité. Cette protéine souhaitée présente lastructure du composé de formule I-A dans laquelle la 15 somme de n et n' est d'environ 820 à 1040, la sommemoyenne étant d'environ 930, R et R' sont CH3 et le perdsmoléculaire moyen de chaque PEG est d'environ 20 kDa. leproduit pégylé présente un poids moléculaire moyend'environ 56 kDa. La structure de recueil renfermant
20 PEGy-ob est concentrée jusqu'à 3,7 mg/ml en utilisant unemembrane YM 10. YM 10 est une membrane crible qui retientles molécules présentant un poids moléculaire de 10 C00daltons ou plus. Après l'étape de criblage, le produitconcentré est filtré par dialyse dans un tampon P3S (pH 25 7,3} puis stocké à l'état réfrigéré à -20°C. Ce produit stocké constitue la protéine ob pégylée de formule I-A oùla somme de n et n' est approximativement de 820 à 1040et le poids moléculaire moyen de chaque chaîne ob estapproximativement 20 kDa. Le poids moléculaire de la 30 protéine PEG dans ce mélange de conjugués de protéine cbest de 56 kDa.
Exemple... 211
Enxel_biologique de la .protéine ob humaine.. pégylée1
Injection unique par voie intrapéritonéale chez..la souris. 35 Wloh 65 010362
Deux groupes de six souris ob/ob obèses femellessont étudiés. Les souris sont logées dans des cages enmatière plastique (trois par cage) sous des conditionsconstantes d'environnement selon un cycle de 12 heures à1'obscurité/12 heures à la lumière. La prise denourriture pendant 24 heures et le poids du corps sontmesurés chaque jour. A la suite d'une périoded'adaptation aux conditions d'environnement, à lamanipulation journalière et aux injections, les sourissont assorties en deux groupes de traitement. Chaquesouris reçoit une injection intrapéritonéale (IP) lepremier jour de l'expérimentation (juste avant le débutde la phase d'obscurité du cycle obscurité/lumière) de0,1 ml des solutions suivantes: solution saline (0,9%);solution de protéine ob humaine conditionnée aupréalable, préparée dans la partie A de l'exemple 19 (30pg/0,1 ml); solution témoin pégylée (un échantillontraité et purifié de façon identique sans protéine obhumaine) ou une protéine ob pégylée (30 pg/0,1 ml)préparée comme décrit dans l'exemple 19. Les souris sontsoumises à une injection une fois seulement, le premierjour. La prise de nourriture journalière dans la cage etle poids corporel de chaque souris sont mesurés pendantles trois jours suivants et à nouveau le sixième jour. A) Réduction de la prise de nourriture
La prise journalière de nourriture n'est pas différente chez des souris soumises à une injectiontémoin de pégylation et par solution saline lors d'unsimple traitement les deux jours successifs (tableau 5) .Toutefois, la prise journalière est réduite chez les sixsouris auxquelles furent injectés 30 pg de protéine obhumaine et de protéine ob humaine pégylée le jour detraitement (5,2, 8,2 par rapport à 11,9, 11,4 g) par 1 * 66 ν'*,·!···, ... 0Î0362 comparaison aux souris ayant subi une injection témoinpégylée et par solution saline. La prise de nourrituredes souris ayant subi_ une injection avec de la protéineob humaine revient à des niveaux témoins, tandis que la 5 prise de nourriture des souris ayant subi une injectionavec de la protéine ob humaine pégylée demeure réduiteles jours suivants l'expérimentation. La réduction deprise de nourriture est observée 48 heures aprèsl'injection dans le groupe ayant subi une injection de 10 protéine ob humaine pégylée. La prise de nourriturecumulative pendant 24 heures lors des trois joursd'expérimentation est réduite, de façon significative, à49% du témoin dans la protéine ob humaine pégylée, parcomparaison au groupe ayant subi une injection témoin par 15 pégylation ou solution saline. B) Réduction de 1'accroissement de poids corporel
La modification de poids corporel n'est pasdifférente chez les souris auxquelles furent injectés lestémoins de pégylation et de solution saline dans un 20 traitement unique pendant deux jours successifs (tableau6). Toutefois, le poids corporel est réduit chez les sixsouris auxquelles furent injectés 30 pg de protéine obhumaine et de protéines ob humaines pégylées lors du jourde traitement (-0,9, -0,7 contre 0,1, 0,3 g) par 25 comparaison aux souris auxquelles furent injectées unesolution témoin pégylée et une solution saline. Le poidscorporel des souris soumises à une injection avec laprotéine ob humaine revient à des niveaux témoins, tandisque le poids corporel des souris injectées avec la 30 protéine ob humaine pégylée continue à décroître lesjours suivants pendant l'expérimentation. La réductioncontinue du poids corporel est observée 48 heures aprèsl'injection unique dans le groupe soumis à une _injectionde protéine ob humaine pégylée. La modification 35 cumulative du poids corporel pendant les six jours de 67 010362 l’expérimentation est .de —1,6 g par comparaison à 0,4 gdans le groupe traité par de la protéine ob, 0,7 g dansle cas d'un traitement par solution saline et 1,1 ± 0,2 gdans les groupes témoins traités par pégylation (taJoleau 6) .
Conclusion
Cet exemple démontre qu'une injection unique parvoie intrapéritonéale de protéine ob humaine pégylée (30 réduction soutenue,nourriture et une 10 15 20
Ug/souris) se traduit par unesignificative, de la prise dediminution significative du poids du corps des sourisob/ob femelles traitées pendant les trois jours parcomparaison avec les souris ob/ob traitées par dessolutions témoins de pégylation et des solutions témoinssalines. Ces résultats démontrent que la protéine obhumaine pégylée possède une activité soutenue, etpotentielle, du point de vue biologique et a les effetsantiobésité attendus sur des souris ob/ob génétiquementobèses.
Tableau 5: Prise de nourriture quotidienne après administration unique par voie intrapéritonéale deprotéine ob humaine pégylée chez les souris ob/ob:
Traitement
Prise de nourriture (3 souris/jour)
Jour 1
Jour 2
Jour 3 g % de g % de g % de témoin témoin témoin Solution saline 11,9 100 13,7 100 13,6 100 Protéine ob 5,2 43,7 11,7 85,4 12,5 92 Témoin pégylé 11,4 95,8 4,5 106 13,4 99 Protéine ob pégylée 8,2 68,9 6,0 43,8 4,9 36
Les résultats sont des moyennes pour les six sourzsob/ob de chaque groupe. La prise de nourriture est uneprise de nourriture moyenne quotidienne dans les cages detrois souris chaque jour de l'expérimentation après 25 ‘bvAiLssi* istidiSÎt 68 010362 l'injection unique par voie intrapéritonéale le premierjour. On notera la réduction persistante de la prisequotidienne de nourriture uniquement dans le groupe ayantsubi une injection de protéine ob pégylée.
Tableau 6: Modification du poids corporel après administration unique par voie intrapéritonéale d'uneprotéine ob humaine pégylée chez des souris ob/cb.
Traitement Modification de poids corporel (g) j our 1 jour 2 jour 3 jour ' Solution saline 0,1 0,6 0,01 -0,01 Protéine ob -0,9 1 , 1 0,2 ND Témoin pégylé 0,3 0,4 0,6 -0,2 Protéine ob pégylée -0,7 -0,6 -0,9 0,6 10 15 20
Les résultats sont des moyennes pour six sourisob/ob dans chaque groupe. Les souris reçoivent uneinjection unique par voie intrapéritonéale uniquement lepremier jour. La modification de poids corporel est lamodification de poids corporel chaque jour del'expérimentation. Il est à noter que la perte de poidspersiste uniquement dans le groupe ayant subi uneinjection de protéine ob pégylée. ND dans le tableaun'indique aucune détermination.
LISTING DE SEQUENCES (1) INFORMATION GENERALE: (i) DEMANDEUR:
(A) NOM: F. HOFFMANN-LA ROCHE AG (B) RUE: Grenzacherstrasse 124 (C) VILLE: Bâle
(D) ETAT: BS (E) : PAYS: Suisse (F) : CODE POSTAL (ZIP) : CH-4070 (G) TELEPHONE: 061 - 688 42 56 (H) TELEFAX: 061 - 688 13 95 25 69 010362 (I) TELEX: 962292/965542 hir ch (ii) TITRE DE L’INVENTION : Protéines obèses (ob)recombinantes (iii) N0M3RE DE SEQUENCES: 8 (iv) FORME LISIBLE DE L'ORDINATEUR: (A) : TYPE MOYEN: disque souple (B) ORDINATEUR: Apple Macintosh (C) SYSTEME DE FONCTIONNEMENT: Système 7.1 (Macintosh) (D) LOGICIEL: Word 5.0 (2) INFORMATION POUR SEQ ID N° : 1
(i) CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES (A) LONGUEUR: 702 paires de base (B) TYPE: acide nucléique (C) PRESENCE DE BRINS: unique (D) TOPOLOGIE:linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: aucun (iv) NON-SENS: aucun (xi) DESCRIPTION DES SEQUENCES: SEQ IDN°: 1 CAAGGTGCAA G AAG AAG AAG ATCCCAGGGA GGAAAATGTG CTGGAGACCC CTGTGTCGG7 60 TCCTGTGGCT TTGGTCCTAT CTGTCTTATG TTCAAGCAGT GCCTATCCAG AAAGTCCAGG 120 ATGACACCAA AACCCTCATC AAGACCATTG TCACCAGGAT CAATGACATT TCACACACGC 130 AGTCGGTATC CGCCAAGCAG AGGGTCACTG GCTTGGACTT CATTCCTGGG CTTCACCCCA 240 TTCTGAGTTT GTCCAAGATG GACCAGACTC TGGCAGTCTA TCAACAGGTC CTCACCAGCC 300 TGCCTTCCCA AAATGTGCTG CAGATAGCCA ATGACCTGGA GAATCTCCGA GACCTCCTCC 360 ATCTGCTGGC CTTCTCCAAG AGCTGCTCCC TGCCTCAGAC CAGTGGCCTG CAGAAGCCAG 420 i,.i · (. ». ... IA-.X. ,-li 01Ü362 .AGAGGGGGGA GGGGGTGCGG uAAGCCGGAC TCTACGCCAC AGAGGTG'sjTG GGGGT’TGz^Gu.rs. 43» rCGGGAG GACA^ AACAGGGGGA TGTG’àGC'» ». wjC. --.Τ-Λ
. » » rV
GG AGAAGAGAC
kCCACCCAT CCAAAGC CATGTGCACA CATCCATCAT TCATTTCTCT CGGGGCTG7A $ ~ 0 GACTCCACAA TGCTTGACTC AA 122 (2) INFORMATION POUR SEQ ID N° : 2
(i) CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES (A) LONGUEUR: 167 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) PRESENCE DE BRINS: non pertinente (D) TOPOLOC-TE'-non connue (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (iii) HYPOTHETIQUE: aucun (iv) NON-SENS: aucun (xi) DESCRIPTION DES SEQUENCES: SEQ ID N°: 2
Mec Cys Trp Arg Pro Leu Cys Arg Phe Leu Trp Leu Trp Ser Tyr1 5 10 15
Ser Tyr Val Gin Alu Val Pro Ile Glr. Lys Val Gin Asp Asp Thr20
Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Th: 3 5 4 0 25 30
Arg Ile Asr. Asp Ile Ser His4 5
Glr. Ser Val Ser Aia Lys Gin Arg Val Thr Giy Leu Asp Phe Ile Pro 50 50
Gly Leu6 5
His Pro Ile Leu Ser Leu Ser Lys Mac Asp Gin Thr Leu 70 r\-» z ec
Val Tyr Glr. Gin Val Leu Thr35
Leu Pro Ser Gin Asn Val Leu Glr. 90 95 .e Ala Asr. Asp Leu Glu Asn Leu Arg Aso Leu Leu His Leu Le; 100 105 110
Phe Ser Lys Ser Cys1 1
Pro Glr120
Thr Se:
Lvs y Leu Gir. 125 ,
010362
Glu Ser 130 leu Asp G1 y Val Leu 135 Glu Ala Ser Leu Tyr 140 Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser «rg Leu Gin Gly Ser Leu Gin Asp Ile Leu Gin Gin 14 5 150 155 160 Leu Asp Val Ser Pro Glu Cys 165 (2) INFORMATION POUR SEQ ID N° : 3
(i) CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES (A) LONGUEUR: 146 acides aminés (B) TYPE: acides aminés (C) PRESENCE DE BRINS: non pertinente (D) TOPOLOGIEIinconnue (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (iii) HYPOTHETIQUE: aucun (iv) NON-SENS: aucun (xi) DE SCRIPTION DES SEQUEM CES : SE :q id n 0 : 3 Val 1 Pro lie Gin Lys 5 Val Gin Asp Asp yhr 10 Lys Thr Leu Ile Lys 15 Thr lie Val Thr Arg 20 Ile Asn Asp Ile Ser 25 His rni-» v· Gin Ser Val 30 Ser Ala Lys Gin Arg 35 Val Thr Gly Leu Asp 40 Phe Ile ?ro Gly Leu 45 His Pro Ile Leu Sur 50 Leu Ser Lys Met: Asp 55~ Gin Thr Leu Ai a Val 60 Tyr Gin Gin Val Leu 65 Thr Ser Leu Pro Ser 70 Gin Asn Val Leu Gin 7 5 lie Aia Asn Asp Leu 30 Glu Asn Leu Arg Asp 85 Leu Leu His Leu Leu 90 Axe Phe Ser Lys Ser 95 Cys „ <. "·* 1, \ * >- $ 72 01 0362
Se z Leu ?ro 100 Chr Ser Gly leu ·-< 105 Lys ?ro Glu Ser Leu 110 Asp Gly 5 Val Leu Glu 115 Alu Ser Leu Tyr Ser 120 Thr Glu Val Val Ala 125 Leu Ser Arg Leu Gin 130 Gly Ser Leu Gin Asp 135 Ile Leu Gin Gin Leu 140 Asp Val Ser Pro
Glu Cys1<15 10 (2) INFORMATION POUR SEQ ID N° : 4
(i) CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES (A) LONGUEUR: 690 paires de base (B) TYPE: acide nucléique 15 (C) PRESENCE DE BRIN: unique (D) TOPOLOG'IE.'linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: aucun (iv) NON-SENS: aucun 20 (xi) DESCRIPTION DES SEQUENCES: SEQ ID N°: 4 GGTGCAAGGC CCAAGAAGCC GATCCTGGGA AGGAAAATGC ATTGGGGAAC IL· - 50 TTCTTGTGGC TTTGGCCCTA TCTTTTCTAT GTCCAAGCTG TGCCCATCCA ‘AAAAGTCCAA 120 25 GATGACACCA AAACCCTCAT CAAGACAATT GTCACCAGGA TCAATGACAT TTCACACACG ISO CAGTCAGTCT CCTCCAAACA GAAAGTCACC GGTTTGGACT TCATTCCTGG GCTCCACCCC 249 ATCCTGACCT TATCCAAGAT GGACCAGACA CTGGCAGTCT ACCAACAGAT CCTCACCAGT 300 ATGGCTTCCA GAAACGTGAT CCAAATATCC AACGACCTGG AGAACCTCCG GGATCTTCTT 3 50 30 GACGTGCTGG CCTTCTCTAA GAGCTGCCAC TTGCCCTGGG CCAGTGGCCT GGAGACGTTG 423 CACAGCCTGG GGGGTGTCCT GGAAGCTTCA GGCTACTCCA CAGAGGTGGT GGCCCTGAGC 423 35 ../U ΐ* ι, ii :,UXÎi 010362 AGGCTGCAGG GGTCTCTGCA GGACATGCTG TGGCAGCTGG ACCTCAGCCC TGGGTGCTGA 540 GGCCTTGAAG GTCACTCTTC CTGCAAGGAC TACGTTAAGG GAAGGAACTC TGGCTTCCAG 600 GTATCTCCAG GATTGAAGAG CATTGCATGG ACACCCCTTA TCCAGGACTC TGTCAATTTC 660 CCTGACTCCT CTAAGCCACT CTTCCAAAGG 690 (2) INFORMATION POUR SEQ ID N° : 5
(i) CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES (A) LONGUEUR: 167 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) PRESENCE DE BRINS: non pertinente (D) TOPOLOGÎIE·inconnue (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (iii) HYPOTHETIQUE: aucun (iv) NON-SENS: aucun (xi) DESCRIPTION DES SEQUENCES: SEQ ID N° : 5
Met 1 His Trp Gly Thr 5 Leu Cys Gly Phe Leu 10 Trp Leu Trp Pro Tyr 15 Leu Phe Tyr Val Gin 20 Ala Val Pro Ile Gin 25 Lys Val Gin Asp Asp 30 Thr Lys Thr Leu lie 35 Lys Thr Ile Val Thr 40 Arg Ile Asn Asp Ile 45 Ser His Thr Gin Ser 50 Val Ser Ser Lys Gin 55 Lys Val Thr Gly Leu 60 Asp Phe Ile Pro Gly 65 Leu His Pro Ile Leu 70 Thr Leu Ser Lys Met 75 Asp Gin Thr Leu Ala 80 . λ -i-Ί. 010362 74
Val Tyr Gin Gin Ile 35 Leu Thr Ser Mec Pro 90 Ser Arg Asn Val Ile 95 Gin lie Ser Asn Asp 100 Leu Glu Asn Leu Arg 105 Asp Leu Leu His Val 110 Leu Ala Phe Ser Lys 115 Ser Cys His Leu Pro 120 Trp Ala Ser Gly Leu 125 Glu Thr Leu Asp Ser 130 Leu Gly Gly Val Leu 135 Glu Ala Ser Gly Tyr 140 Ser Thr Glu Val Val 145 Ala Leu Ser Arg Leu ISO Gin Gly Ser Leu Gin 155 Asp Mec Leu Trp Gin 160 Leu Asp Leu Ser Pro 165 Gly Cys (2) INFORMATION POUR SEQ ID N° : δ
(i) CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES (A) LONGUEUR: 146 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) PRESENCE DE BRINS: non pertinente (D) TOPOLOGIE;: inconnue (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (iii) HYPOTHETIQUE: aucun (iv) NON-SENS: (xi) DESCRIPTION DE aucun SEQUENCE : SEQ IC i N° : 6 Val Pro Ile Gin Lys Val 1 5 Gin Asp Asp Thr Lys10 Thr Leu Ile Lys Thr15 Ile Val Thr Arg Ile Asn20 Asp Ile Ser25 His Thr Gin Ser Val Ser Ser30 Lys Gin Lys Val Thr Gly35 Leu Asp Phe40 Ile Pro Gly Leu His Pro Ile45 Leu Thr Leu Ser Lys Mec50 Asp Gin Thr55 Leu Ala Val 60 Tyr Gin Gin Ile Leu Thr Ser Mec Pro Ser65 70 Arg Asn Val Ile Gin75 Ile Ser Asn Asp Leu30 Glu Asn Leu Arg Asp Leu85 Leu His Val Leu Ala90 Phe Ser Lys Ser Cys95 ___ 010362 75
His Leu ?ro Trp 100 Ala Ser Gly Leu Glu 105 Thr Leu Asp Val Leu Glu 115 Ala Ser Gly Tyr Ser 120 Thr Glu Val Val Leu Gin 130 Gly Ser Leu Gin Asp 135 Met Leu Trp Gin Leu 140
Ser Leu 110 Gly C-ly Ala Leu Ser Arg 125 Asp Leu Ser Pro
Gly Cys 145 (2) INFORMATION POUR SEQ ID N° : 7
(1) CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES (A) LONGUEUR: 63 paires de base (B) TYPE: acide nucléique (C) PRESENCE DE BRINS: double (D) TOPOLOG'I'Ellinéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: aucun (iv) NON-SENS: aucun (xi) DESCRIPTION DE SEQUENCES: SEQ ID N° : 7 ATGAAAAAGA CAGCTATCGC GATTGCAGTG GCACTGGCTG GTTTCGCTAC CGTAGCGCAG 60 GCC 63 (2) INFORMATION POUR SEQ ID N° : 8
(i) CARACTERISTIQUES DES SEQUENCES (A) LONGUEUR: 21 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) PRESENCE DE BRINS: non pertinente (D) TOPOLOGIE : inconnue (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (iii) HYPOTHETIQUE: aucun (iv) NON-SENS: aucun (xi) DESCRIPTION DE SEQUENCE: SEQ ID N°:8
Mec Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Aia 15 10 15
Thr Val Ala Gin20
Ala

Claims (31)

  1. 010362 76 REVENDICATIONS
    1. Protéine obèse humaine, homogène et biologiquement active oubien un fragment de celle-ci, ce fragment présentant l'activité biologique de 5 ladite protéine.
  2. 2. La protéine ou le fragment de la revendication 1, dans lequell’activité biologique de ladite protéine ou du fragment est caractériséepar une réduction de la prise de nourriture chez les mammifères et uneréduction du taux d'accroissement pondéral chez les mammifères .
  3. 3. La protéine de la revendication 1 comportant le SEQ I D NO : 6.
  4. 4. Protéine obèse humaine, recombinante, biologiquement active,dépourvue d’autres protéines de mammifères, ou fragment de celle-ci, cefragment présentant l’activité biologique de ladite protéine.
  5. 5. La protéine ou le fragment de la revendication 4, dans lequel15 l’activité biologique de ladite protéine est caractérisée par une réduction de la prise de nourriture chez les mammifères et une réduction du tauxd’accroissement pondéral chez les mammifères.
  6. 6. La protéine de la revendication 4, comportant le SEQ ID NO : 6.
  7. 7. Protéine obèse murine homogène, biologiquement active, ou un20 fragment de celle-ci, ce fragment présentant l’activité biologique de ladite protéine.
  8. 8. La protéine ou le fragment de la revendication 7, dans lequell’activité biologique de ladite protéine ou du fragment est caractérisé parune réduction de la prise de nourriture chez les mammifères et une 25 réduction du taux d'accroissement pondéral chez les mammifères .
  9. 9. La protéine de la revendication 7, comportant la SEQ ID NO : 3.
  10. 10. Protéine obèse murine, recombinante et biologiquement active,dépourvue d’autres protéines de mammifère, ou fragment de celle-ci, cefragment présentant l’activité biologique de ladite protéine.
  11. 11. Protéine de la revendication 10, dans laquelle l’activité biologique de ladite protéine est caractérisée par une réduction de prise de nourriturechez les mammifères et une réduction du taux d’accroissement pondéraichez les mammifères.
  12. 12. La protéine de la revendication 10, comportant la SEQ ID N0 : 3.
  13. 13. Un vecteur d’expression comportant : a) une séquence promoteur, et ΊΊ 010362 b) une séquence d’ADN codant pour une protéine de fusioncomportant la protéine ob murine de SEQ ID NO : 3 ou laprotéine ob humaine de SEQ ID NO : 6, et le peptide signal pourla protéine A de la membrane externe de E. coli, 5 ce vecteur d'expression étant capable d'exprimer la protéine de fusion dansles cellules hôtes Escherichia coli.
  14. 14. Le vecteur d'expression de la revendication 13. dans lequel laséquence promoteur est constituée à la fois d'un opérateur promoteur lacet d'un promoteur de lipoprotéine.
  15. 15. Une protéine de fusion, comportant la protéine obèse murine ou la protéine obèse humaine, et le peptide signal pour la protéine A de lamembrane externe de Escherichia coli.
  16. 16. Une protéine de fusion de la revendication 15, dans laquelle laprotéine obèse murine comporte SÉQ ID NO : 3 et dans laquelle la protéine 15 obèse humaine comporte la SEQ ID NO : 6.
  17. 17. Une séquence d'ADN comportant une première et secondepairies, dans laquelle : (a) la première partie est la séquence de gène sOmpA de la SEQ IDNO : 7 codant pour le peptide sOmpA ; et 20 (b) la seconde partie est la séquence nucléotidique codant pour la protéine ob murine ou la séquence nucléotidique codant pour laprotéine ob humaine.
  18. 18. La séquence d'ADN de la revendication 17. dans laquelle laprotéine ob murine comporte la SEQ ID NO : 3.
  19. 19. La séquence d'ADN de la revendication 17, dans laquelle la protéine ob humaine comporte la SEQ ID NO : 6.
  20. 20. Un organisme hôte Escherichia coli, transformé avec le vecteurd'expression de la revendication 13.
  21. 21. Un procédé pour préparer une protéine obèse humaine ou murine 30 recombinante, biologiquement active, dépourvue d'autres protéines de mammifère, comportant les étapes de : a) construire un vecteur d’expression ayant une séquencepromoteur et une séquence d'ADN codant pour une proteine defusion, cette protéine de fusion comportant la SEQ ID N0 : 3 oula SEQ ID N0 : 6, et le peptide signal pour la protéine A de lamembrane externe de E. coli ; 35 010362 10 10 15 15 78 b) insérer le vecteur d'expression dans une cellule hôte E. coli afinde transformer la cellule hôte E. coli. ; c) exprimer la protéine de fusion dans la cellule hôte E. coli ; d) traiter la cellule hôte E. coli avec un tampon de choc osmotiquefroid, pour libérer la protéine ob murine ou humaine, dépourvued'autres protéines de mammifère et dépourvu du peptide signal.
  22. 22. La séquence de gènes humains comportant la SEQ ID NO : 4.
  23. 23. Un procédé pour préparer une protéine obèse humaine ou murinerecombinante homogène, biologiquement active, comportant l'étapeconsistant à soumettre le fluide osmotique renfermant la protéine obèsehumaine ou murine à une combinaison d’une chromatographie de colonnepar échange anionique, une chromatographie de colonne par interactionhydrophobe et une filtration sur gel.
  24. 24. Une composition comportant un ou plus d'un conjugué depolyéthylène-glycol et/ou de polypropylène-glycol lié à une protéine obhumaine ou murine, comme revendiquée dans les revendications 1 à 12, lepoids moléculaire moyen des motifs polyéthylène glycol ou polypropylèneglycol dans lesdits conjugués à l'intérieur de ladite composition se situantdans la gamme de 15 kDa à 60 kDa.
  25. 25. Une composition comportant un ou plus d'un conjugué de laformule : ROCH2CH2(OCH2CH2)p-O-C-NH (CH2)4 I-A ROCH2CH2(OCH2CH2)n-O-C-NH ’Ç-NH- p
    010362 79 dans laquelle P est une protéine ob humaine ou murine telle querevendiquée dans les revendications 1 à 6, n et n'sont des nombres entiersayant une somme de 300 à 1500, le poids moléculaire moyen des motifspolyéthylène glycol dans lesdits conjugués à l'intérieur de ladite 5 composition se situant dans la gamme de 15 kDa à 60 kDa, et R etR’représente chacun un alkyle inférieur.
  26. 26. Une composition de la revendication 25, dans laquelle la sommede n et n’se situe dans la gamme d'environ 800 à 1200, tandis que le poidsmoléculaire moyen des motifs polyéthylène glycol dans ledit conjugué à 10 l'intérieur de la composition se situe dans la gamme de 35 à 45 kDa.
  27. 27. Une composition comportant un ou plus d'un conjugué de laformule : O RO(CH2CH2O)nCH2 CH2 -C -NH- ? 15 dans laquelle P est une protéine ob humaine ou murine telle querevendiquée dans les revendications 1 à 12, n est un nombre entier ayantune somme de 300 à 1500, le poids moléculaire moyen des unitéspolyéthylène glycol dans ledit conjugué à l'intérieur de ladite compositionse situant dans la gamme de 15 kDa à 60 kDa, et R est un alkyle inférieur.
  28. 28. Une composition de la revendication 27, dans laquelle n est d'environ 850 à 1000 tandis que le poids moléculaire moyen des motifspolyéthylène glycol dans ledit conjugué à l'intérieur de ladite compositionse situe dans la gamme de 35 à 45 kDa.
  29. 29. La protéine ob humaine ou murine, telle que revendiquée dans les 25 revendications 1 à 12, ou bien une composition telle que revendiquée dans les revendications 24 à 28 à titre d’agents thérapeutiquement actifs.
  30. 30. La protéine ob humaine ou murine, telle que revendiquée dans lesrevendications 1 à 12, ou bien une composition telle que revendiquée dansles revendications 24 à 28, en tant qu'agents thérapeutiquement actifs, 30 pour le traitement, la prévention ou le contrôle de l'obésité et des maladiesassociées.
  31. 31. Une composition pharmaceutique comportant une protéine obhumaine ou murine telle que revendiquée dans les revendications 1 à 12 ou 1 une composition sell- eue revendiquée sans les revendiezCions 24 à 25 et un mntiri.au support compatible, pharmaceutiquement ΊΟ 15 20 έ. ρ 010362 acceptable. 52. L‘utilisation d'une protéine ob humaine ou mque revendi quée ùuis des revendications 1 à qo ou unecomposition telle 'que revendiquée dans les revendicatià 28 pour la prépara ci on de compositions pharmac eutiqu 55. L'utilisation d'une protéine ob humaine ouque rev ridiquée sans Los revendications 1 à 12, ou d'usition celle que revendiquée dans les revendications 2la préparation de composiCions pharmaceutiques destinérenient, à la prévention et au contrôle de L'obésité et :urine tell?bien d'une.ons 24,es. murine tellne comao— 4- à 23 poures au “rai-des mala- dies as so ci-.-es. 54. L'utilisation l'une protéine ob humaine ou murine tell<que revendiquée dons Les revendications 1 à 12, pour l’identifi-cation ;'au moins un récepteur(s) de protéine ob. 55. L'utilisation l’un vecteur d'expression fcü que reven-diqué dans les revendications 15 ou 14 pour la préparation d'unearot-'ine ob humaine ou murine, relit? que revendi :uée sans les re-vendications 1 1 12. 5u. L'utiii u.ans Les revendesnuTiaine ou murine,1 à 12. ••cion d'une séquence d’ADN relie pue revendiqu-ions 17 à 19 pour la préparation d'une protéine:.i ; j.. sue revendiquée dans les revendications 57. L*utilisation re l’or.maniome hôte ischerichia coli pourLa préparation ''une "rotéine humaine ou .o.urine telle rie reven-'iqu'-e sans les aevss rications 1 à 12. pu. Une pros lin'· ob humaineoioloqi quement active, chaque foissroc'.'dé tel sue reven i sué rang i3 e, nonorencar un ou murine recorsirs qu’elle est préparé revendication ou 50
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