BR9715219B1 - vetor recombinante de expressço, e cÉlula hospedeira procariàtica. - Google Patents

Description

"VETOR RECOMBINANTE DE EXPRESSÃO, E CÉLULAHOSPEDEIRA PROCARIÓTICA"

Dividido do PI 9707379-2, depositado em10/02/1997.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

O fator α de necrose tumoral (TNFa) é uma citocinaproduzida por numerosos tipos de células, incluindo osmonócitos e os macrófagos, que foram originalmenteidentificadas em sua capacidade de induzir a necrose decertos tumores de camundongós (ver, por exemplo, Old, L.(1985) Science 230: 630-632). Subseqüentemente, um fatordenominado caquectina, associado com caquexia, foiapresentado como sendo a mesma molécula TNFa. A TNFa foiimplicada em medir o choque (ver, por exemplo, Beutler, B. eCerami, A. (1988) Annu. Rev. Biochem. 57: 505-518; Beutler,B. e Cerami, A. (1989) Annu. Rev. Immunol. 7: 625-655). Alémdisso, a TNFa tem sido implicada na fisiopatologia de umavariedade de outras doenças e distúrbios dos seres humanos,incluindo sépsis, infecções, doenças autoimunes, rejeição detransplantes e doença do enxerto versus hospedeiro (ver, porexemplo,' Moeller, A. et al., (1990) Cytokine 2: 162-169;Patente U.S. 5.231.024 para Moeller et al.; Publicação daPatente Européia 260 610 BI, por Moeller, A. et al.rVasilli, P. (1992) Annu. Rev. Immunol. 10: 411^452; Tracey,K. J. e Cerami, A. (1994) Annu. Rev. Med. 45: 491-503)

Por causa do papel prejudicial do TNFa humano(hTNFa) em uma variedade de distúrbios dos seres humanos,estratégias terapêuticas têm sido intentadas para inibir ouatuar contra a atividade do hTNFa. Em particular, osanticorpos que se ligam a, e neutralizam o, hTNFa têm sidoprocurados como um meio para inibir a atividade do hTNFa.Alguns dos mais antigos de tais anticorpos foram osanticorpos monoclonais de camundongos (mAbs), secretados porhibridomas preparados dos linfócitos de camundongosimunizados com hTNFa (ver, por exemplo, Hahn, T. et a/., (1985) Proc. Natl.Acad Sei. USA 82: 3814-3818; Liang, C-M, et al (1986) Biochem. Biophys.Res. Commun. 137: 847-854; Hirai, M. et al. (1987) J. Immunol. Methods 96:57-62; Fendly, Β. M; et al. (1987) Hybridoma 6: 359-370; Moeller, A. et al.(1990) Cytokine 2: 162-169; Patente U.S. 5.231.024 para Moeller et al;Publicação da Patente Européia 186 833 Bl por Wallach, D.; Publicação doPedido de Patente Européia 218 868 Al por Old et al; Publicação da PatenteEuropéia 260 610 Bl por Moeller, A., et al). Embora estes anticorpos anti-hTNFa de camundongos freqüentemente apresentassem elevada afinidadequanto ao hTNFa (por exemplo Kd < IO"9 M) e fossem capasses de neutralizara atividade do hTNFa, seu uso in vivo pôde ser limitado pelos problemasassociados com a administração de anticorpos de camundongos a sereshumanos, tais como a curta meia vida do soro, uma incapacidade de dispararcertas funções efetoras humanas e eliciação de uma resposta imune indesejávelcontra o anticorpo de camundongos em um ser humano [a reação do "anticorpohumano anticamundongo" (HAMA)].

Em uma tentativa de superar os problemas associados com ouso de anticorpos inteiramente de murinos em seres humanos, os anticorposanti-hTNFa de murinos foram geneticamente construídos para serem mais"semelhantes aos humanos". Por exemplo, os anticorpos quiméricos, em que asregiões variáveis das cadeias de anticorpos são derivadas de murino, e asregiões constantes das cadeias de anticorpos são derivadas de seres humanos,foram preparados (Knight, D. M. et al (1993) Mol. Immunol 30: 1443-1453;Publicação PCT WO 92/16553 por Daddona, Ρ. E. et al). Adicionalmente, osanticorpos humanizados, em que os domínios hipervariáveis das regiõesvariáveis dos anticorpos são derivados de murinos, mas o remanescente dasregiões variáveis e as regiões constantes de anticorpos, são derivados de sereshumanos, foram preparados (Publicação PCT WO 92/11383 por Adair, J. R., etal.). No entanto, tendo em vista que estes anticorpos quiméricos e humanizadosainda retêm algumas seqüências de murinos, eles ainda elidam uma reaçãoimune indesejável, a reação do anticorpo antiquimérico humano (HACA),especialmente quando administrados por períodos prolongados, por exemplo,para indicações crônicas, tais como artrite reumatóide (ver, por exemplo,Elliott5 M. J., et al. (1994) Lancet 344: 1125-1127; Elliott, M. J. et ai. (1994)Lancet 344: 1105-1110). Um agente inibitório de hTNFa preferido para mAbsde murinos ou seus derivados (por exemplo, anticorpos quiméricos ouhumanizados) deve ser um anticorpo anti-hTNFa inteiramente humano, umavez que um tal agente não deve eliciar a reação HAMA, mesmo que usado porperíodos prolongados. Os auto-anticorpos monoclonais humanos contrahTNFa têm sido preparados usando-se técnicas de hibridoma humano (Boyle,P. et al. (1993) Cell Immunol. 152: 556-568; (Boyle, P. et al (1993) CellImmunol 152: 569-581; Publicação do Pedido de Patente Européia 614 984A2 por Boyle et al.). No entanto, estes auto-anticorpos monoclonais derivadosde hibridoma foram divulgados como tendo uma afinidade quanto a hTNFa,que foi demasiado baixa para se calcular por processos convencionais, foramincapazes de ligar os hTNFa solúveis e foram incapazes de neutralizar acitotoxicidade induzida por hTNFa (ver Boyle et al, acima). Além do mais, osucesso da técnica do hibridoma humano depende da presença natural nosangue periférico humano de linfócitos produtores de auto-anticorposespecíficos para hTNFa. Certos estudos detectaram auto-anticorpos do sorocontra hTNFa em indivíduos humanos (Fomsgaard, A. et al (1989) Scand.J.Immunol. 30: 219-223; Bendtzen, K., et al. (1990) Prog. Leukocyte Biol.10B: 447-452, enquanto outros não o fizeram (Leusch, H-G., et al. (1991) J.Immunol. Methods 139: 145-147).

Alternativa para os anticorpos humanos anti-hTNFa deocorrência natural deve ser um anticorpo recombinante de hTNFa. Anticorposrecombinantes humanos que ligam o hTNFa com afinidade relativamentebaixa (isto é, Kd ~ 10" M) e um índice muito rápido (isto é, Koff-IO" seg") foidescrito (Griffiths, A. D., et ai. (1993) EMBO J. 12: 725-734). No entendo, porcausa de sua cinética de dissociação relativamente rápida, estes anticorpos nãopodem ser adequados para uso terapêutico. Adicionalmente, um anti-hTNFarecombinante humano foi descrito, que não neutraliza a atividade hTNFa, mas,ao invés, intensifica a ligação de hTNFa à superfície de células e intensifica ainternalização de hTNFa (Lidbury, A., et al. (1994) Biotechnol. Ther. 5:Publicação PCT WO 92/03145 por Aston, R. et al.)

Consequentemente, os anticorpos humanos, tais como osanticorpos recombinantes humanos, que ligam o hTNFa solúvel com altaafinidade e cinética de dissociação lenta, e que têm a capacidade de neutralizara atividade do hTNFa, incluindo a citotoxicidade induzida por hTNFa (in vitroe in vivo) e ativação celular induzida por hTNFa, são ainda necessários.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Esta invenção proporciona anticorpos humanos,preferivelmente anticorpos recombinantes humanos, que especificamente seligam a TNFa humano. Os anticorpos da invenção são caracterizados pelaligação a hTNFa com cinética de elevada afinidade e dissociação lenta, e porneutralização da atividade do hTNFa, incluindo a citotoxicidade induzida porhTNFa (in vitro e in vivo) e ativação celular induzida por hTNFa. Osanticorpos da invenção ainda são caracterizados por ligarem-se ao hTNFa, masnão ao hTNFp (Iinfotoxina) e por terem a capacidade de ligarem-se a outrosTNFas primatas e TNFas não primatas, além do TNFa humano.

Os anticorpos da invenção podem ser de comprimentocompleto (por exemplo um anticorpo IgGl ou IgG4) ou pode compreenderapenas uma porção de ligação a antígeno (por exemplo, um fragmento Fab,F(ab')2 ou scFv). O anticorpo recombinante mais preferido da invenção,denominado D2E7, tem um domínio CDR3 de cadeia leve, compreendendo aseqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 3 e um domínio CDR3 de cadeiapesada, compreendendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 4.Preferivelmente, o anticorpo D2E7 tem uma região variável de cadeia leve(LCVR) compreendendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: I e umaregião variável de cadeia pesada (HCVR) compreendendo a seqüência deaminoácido da SEQID NO: 2.

Em uma modalidade, a invenção proporciona um anticorpohumano isolado, ou uma porção deste de ligação a antígeno, que dissocia doTNFa humano com um Kd de 1 χ IO"8 M ou menos, e um índice Kofrconstantede 1 χ IO"3 s'1 ou menos, ambos determinados por ressonância de plásmonsuperficial, e neutraliza a citotoxicidade de TNFa humano em um ensaiopadrão L929 in vitro com um IC50 de 1 χ IO"7 M ou menos. Maispreferivelmente, o anticorpo humano isolado, ou suas porções de ligação aantígeno, se dissocia do TNFa humano com um Koff de 5 χ IO"4 s"1 ou menos, omesmo mais preferivelmente, com um Koff de 1 χ IO"4 s"1 ou menos. Maispreferivelmente, o anticorpo humano isolado, ou sua porção de ligação aantígeno, neutraliza a citotoxicidade do TNFa humano em um ensaio padrãoL929 in vitro com um IC50 de 1 χ IO"8 M ou menos, mesmo maispreferivelmente com um IC50 de 1 χ IO"9 M ou menos, e ainda maispreferivelmente com um IC50 de 5 χ IO"10 M ou menos.

Em outra modalidade, a invenção provê um anticorpo humano,ou sua porção de ligação a antígeno, com as seguintes características:

a) dissocia-se do TNFa humano com um Koff de 1 χ IO"3 s"1 oumenos, como determinado por ressonância de plásmon superficial;

b) tem um domínio CDR3 de cadeia leve compreendendo aseqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 3, ou modificado da SEQ ID NO: 3por uma substituição única de alanina na posição 1, 4, 5, 7 ou 8, ou por um acinco substituições conservativas de aminoácido 1, 3,4,6, 7, 8 e/ou-9;

c) tem um domínio CDR3 de cadeia pesada compreendendo aseqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 4, ou modificado da SEQ ID NO: 4por uma substituição única de alanina na posição 2, 3,4, 5, 6, 8,9, 10 ou 11 oupor uma a cinco substituições conservativas de aminoácido nas posições 2, 3,4, 5,6, 8,9,10,11 e/ou 12.

Mais preferivelmente, o anticorpo, ou sua porção de ligação aantígeno, se dissocia do TNFa humano com um Koff de 5 χ IO"4 s*1 ou menos.

Ainda mais preferivelmente, o anticorpo, ou sua porção de ligação a antígeno,se dissocia do TNFa humano com um Koff de 1 χ IO"4 s"1 ou menos.

Em ainda outra modalidade, a invenção provê um anticorpohumano, ou uma sua porção de ligação a antígeno, com uma LCVR tendo odomínio CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 3,ou modificado da SEQ ID NO: 3 por uma substituição única de alanina naposição 1, 4, 5, 7 ou 8, e com um HCVR tendo um domínio CDR3compreendendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 4, ou modificadoda SEQ ID NO: 4 por uma substituição única de alanina na posição 2, 3, 4, 5,6, 8, 9, 10 ou 11. Mais preferivelmente, o LCVR ainda tem um domínio CDR2compreendendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 5 e o HCVR aindatem um domínio de CDR2 compreendendo a seqüência de aminoácido da SEQID NO: 6. Ainda mais preferível, o LCVR ainda tem domínio CDRlcompreendendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 7 e o HCVR temum domínio CDRl compreendendo a seqüência de aminoácido da SEQ IDNO: 8.

Em ainda outra modalidade, a invenção provê um anticorpohumano isolado, ou uma sua porção de ligação a antígeno, com uma LCVRcompreendendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO:l e um HCVRcompreendendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2. Em certasmodalidades, o anticorpo tem uma região constante de cadeia pesada IgGl ouuma região constante de cadeia pesada IgG4. Em ainda outras modalidades, oanticorpo é um fragmento Fab, um fragmento F(ab')2 ou um fragmento Fv decadeia única.

Em ainda outras modalidades, a invenção provê anticorpos, ousuas porções de ligação a antígeno, com uma LCVR tendo domínio CDR3compreendendo uma seqüência de aminoácido selecionada do grupoconsistindo das SEQID NO: 3, SEQ ID NO: 11, SEQID NO: 12, SEQID NO:13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO:22, SEQID NO: 23, SEQID NO: 24, SEQID NO: 25, SEQID NO: 26 ou comum HCVR tendo um domínio CDR3 compreendendo uma seqüência deaminoácidos selecionados do grupo consistindo de SEQ ID NO: 4, SEQ IDNO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31,SEQID NO: 32, SEQID NO: 33, SEQID NO: 34 e SEQID NO: 35.

Em ainda outra modalidade, a invenção provê um anticorpohumano isolado, ou uma sua porção de ligação a antígeno, que neutraliza aatividade do TNFa humano, porém não o TNFp humano (linfotoxina). Emuma modalidade preferida, o anticorpo humano, ou sua porção de ligação aantígeno, neutraliza a atividade do TNFa humano, TNFa de chimpanzé e, pelomenos, um TNFa adicional de primata, selecionados do grupo consistindo deTNFa de cynomolgus e TNFa do macaco reso (rhesus). Preferivelmente, oanticorpo também neutraliza a atividade de pelo menos um TNFa não primata.Por exemplo, em uma submodalidade, o anticorpo isolado humano, ou suaporção de ligação a antígeno, também neutraliza a atividade do TNFa canino.

Em outra submodalidade, o anticorpo humano isolado, ou sua porção deligação a antígeno, também neutraliza a atividade do TNFa de porco. Em aindaoutra submodalidade, o anticorpo humano isolado, ou sua porção de ligação aantígeno, também neutraliza a atividade do TNFa de camundongo.

Outro aspecto da invenção diz respeito a moléculas de ácidonucleico codificando os anticorpos, ou porções de ligação a antígeno, dainvenção. Um ácido nucleico preferido da invenção, codificando uma LCVRD2E7, tem a seqüência de nucleotídeos apresentada na Figura 7 e na SEQ IDNO: 36. Outro ácido nucleico preferido da invenção, codificando um HCVRD2E7, tem a seqüência de nucleotídeos apresentada na Figura 8 e na SEQ IDNO: 37. Os vetores recombinantes de expressão transportando os ácidosnucleicos codificando o anticorpo da invenção, e as células hospedeiras dentrodas quais tais vetores foram introduzidos, também são englobados pelainvenção, uma vez que são processos de produção de anticorpos da invençãomediante cultura das células hospedeiras da invenção.

Ainda outro aspecto da invenção diz respeito a processos parainibir a atividade de TNFa humano usando-se um anticorpo, ou duas porção deligação a antígeno, da invenção. Em uma modalidade, o processo compreendeo contato do TNFa humano com o anticorpo da invenção, ou sua porção deligação a antígeno, de tal modo que a atividade do TNFa humano seja inibida.

Em outra modalidade, o processo compreende administrar um anticorpo dainvenção, ou sua porção de ligação a antígeno, a um indivíduo humanosofrendo de um distúrbio em que a atividade do TNFa é prejudicial, de formatal que a atividade do TNFa humano no indivíduo humano seja inibida. Odistúrbio pode ser, por exemplo, sépsis, uma doença auto-imune (por exemploartrite reumatóide, alergia, esclerose múltipla, diabete auto-imune, uveíte auto-imune e síndrome nefrótica), uma doença infecciosa, uma malignidade, umarejeição de transplante ou a doença do enxerto versus hospedeiro, um distúrbiopulmonar, um distúrbio dos ossos, um distúrbio intestinal ou um distúrbiocardíaco.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

As Figuras IA e IB apresentam as seqüências de aminoácidoda região variável de cadeia leve de D2E7 (D2E7 VL; também mostrada naSEQ ID NO: 1), mutantes de cintilografia da alanina de D2E7 VL(LD2E7*.A1, LD2E7*A3, D2E7*A4, D2E7*.A5, LD2E7*.A7 e LD2E7*.A8),a região variável de cadeia leve do anticorpo 2SD4 relacionado a D2E7 (2SD4VL; também apresentado na SEQ ID NO: 9) e outras regiões variáveis decadeia leve relacionadas a D2E7 (EP B 12, VL10E4, VL100A9, VL100D2,VL10F4, L0E5, VLLOF9, VLLOF10, VLLOG7, VLLOG9, VLLOHl5VLLOH10, VL1B7, VL1C1, VL1C7, VL0.1F4, VL0.1H8, LOE7, LOE7.A eLOE7.T). A Figura IA apresenta os domínios FRl, CDRl, FR2 e CDR2. AFigura IB apresente os domínios FR3, CDR3 e FR4. Os domínios de cadeialeve CDRl ("CDR LI"), CDR2 ("CDR L2") e CDR3 ("CDR L3"), são emcaixa.

As Figuras 2A e 2B apresenta as seqüências de aminoácido daregião variável de cadeia pesada de D2E7 (D2E7 VH; também apresentada naSEQ ID NO: 2), mutantes de cintilografia da alanina de D2E7 VH(HD2E7*.A1, HD2E7*.A3, HD2E7*.A4, HD2E7*.A5, HD2E7*.A6,HD2E7*.A7, HD2E7*.A8 e HD2E7*.A9), a região variável de cadeia pesadado anticorpo 2SD4 relacionado a D2E7 (2SD4 VH; também apresentada naSEQ ID NO: 10) e outras regiões variáveis de cadeia pesada relacionada aD2E7 (VH1B11, VH1D8, VHlAl 1, VH1B12, VH1-D2, VH1E4, VH1F6,VH1G1, 3C-H2, VH1-D2.N e VH1-D2.Y). A Figura 2A mostra os domíniosFRl5 CDRl, FR2 e CDR2. A Figura 2B mostra os domínios FR3, CDR3 eFR4. Os domínios CDRl de cadeia pesada ("CDR Hl"), CDR2 ("CDR H2") eCDR3 ("CDR H3") são em caixa.

A Figura 3 é um gráfico apresentando a inibição dacitotoxicidade L929 induzida por TNFa pelo anticorpo D2E7 anti-hTNFahumano, em comparação com o anticorpo MAK 195 anti-hTNFa de murinos.

A Figura 4 é um gráfico apresentando a inibição de ligaçãorhTNFa aos receptores de hTNFa nas células U-937 pelo anticorpo D2E7 anti-hTNFa humano, em comparação com o anticorpo MAK 195 anti-hTNFa demurinos.

A Figura 5 é um gráfico apresentando a inibição da expressãoELAM-I induzida por TNFa em HUVEC pelo anticorpo D2E7 anti-hTNFahumano, em comparação com o anticorpo MAK 195 anti-hTNFa de murinos.

A Figura 6 é um gráfico de barras apresentando a proteção daletalidade induzida por TNFa em camundongos sensibilizados por D-galactosamina, mediante administração do anticorpo D2E7 anti-hTNFahumano (barras pretas), em comparação com o anticorpo MAK 195 anti-hTNFa de murinos (barras hachuradas).

A Figura 7 apresenta a seqüência de nucleotídeos da regiãovariável de cadeia leve de D2E7, com a seqüência de aminoácidos mencionadaabaixo da seqüência de nucleotídeos. As regiões CDR LI, CDR L2 e CDR L3estão sublinhadas.

A Figura 8 apresenta a seqüência de nucleotídeos da regiãovariável de cadeia pesada de D2E7, com a seqüência de aminoácidosmencionada abaixo da seqüência de nucleotídeos. As regiões CDR Hl, CDRH2 e CDR H3 estão sublinhadas.

A Figura 9 é um gráfico apresentando o efeito do tratamento doanticorpo D2E7 na dimensão articulada média dos camundongos transgênicosTg 197, como um modelo de poliartrite.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Esta invenção diz respeito a anticorpos humanos isolados, ousuas porções de ligação a antígeno, que se ligam a TNFa humanos comelevada afinidade, um índice muito lento e capacidade eletada de neutralização.

Vários aspectos da invenção dizem respeito a anticorpos e fragmentos deanticorpos, e a suas composições farmacêuticas, bem como a ácidos nucleicos,vetores recombinantes de expressão, e células hospedeiras para produzir taisanticorpos e fragmentos. Processos para usar os anticorpos da invenção paradetectar TNFa humano ou para inibir a atividade do TNFa humano, quer invitro, quer in vivo, também são englobados pela invenção.

De modo que a presente invenção possa ser mais facilmenteentendida, certos termos são primeiro definidos.

O termo "TNFa humano" (abreviado aqui como hTNFa, ousimplesmente hTNF), como aqui usado, refere-se a uma citocina humana queexiste como uma forma secretada 17 kD e uma membrana 26 kD associada,cuja forma biologicamente ativa é composta de um trímero de moléculas 17 kDnão covalentemente limitadas. A estrutura do hTNFa é descrita ainda em, porexemplo, Pennica, D., et ai. (1984) Nature 312: 724-729; Davis, J. M. et ai(1987) Biochemistry 26: 1322-1326; e Jones, Ε. Y. et al. (1989) Nature 338:225-228. O termo TNFa humano intenta incluir o TNFa recombinantehumano (rhTNFa), que pode ser preparado por processos de expressãorecombinante padrão ou comprados comercialmente (R & D Systems, Catálogons 210-TA, Minneapolis, MN).

O termo "anticorpo", como aqui empregado, pretende referir-sea moléculas de imunoglobulina, constituídas de quatro cadeias depolipeptídeos, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L)interconectadas por ligações de dissulfeto. Cada cadeia pesada é constituída deuma região variável de cadeia pesada (abreviada aqui como HCVR ou VH) euma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada écompreendida de três domínios, CHI, CH2 e CH3. Cada cadeia leve écompreendida de uma região variável de cadeia leve (aqui abreviada comoLCVR ou VL e uma região constante de cadeia leve. A região constante decadeia leve é compreendida de um domínio, CL. As regiões VH e VL podemser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiõesde determinação da complementaridade (CDR), entremeadas com regiões quesão mais conservadas, denominadas regiões de estrutura (FR). Cada VH e VL écomposto de três CDRs e quatro FRs, arranjados do término amino ao términocarbóxi na seguinte ordem: FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

A expressão "porção de ligação a antígeno" e3 um anticorpo(ou simplesmente "porção de anticorpo"), como aqui empregada, se refere aum ou mais fragmentos de um anticorpo que retém a capacidade paraespecificamente ligar-se a um antígeno (por exemplo, hTNFa). Foi observadoque a função de ligação a antígeno de um anticorpo pode ser realizada porfragmentos de um anticorpo de comprimento completo. Exemplos defragmentos de ligação englobados dentro da expressão "porção de ligação aantígeno" de um anticorpo inclui (i) um fragmento Fab, um fragmentomonovalente consistindo dos domínios VL5 VH5 CL e CHI; (ii) um fragmentoF(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligadospor uma ponte dissulfeto na região da dobradiça; (iii) um fragmento Fdconsistindo dos domínios VH e CHI; (iv) um fragmento Fv consistindo dosdomínios VL e VH de um braço único de um anticorpo, (v) um fragmento dAb(Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), que consiste de um domínio VH; e(vi) uma região isolada de determinação da complementaridade (CDR). Alémdisso, não obstante os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejamcodificados por genes separados, eles podem ser unidos usando-se processosrecombinantes, por um ligador sintético que permite que eles sejam produzidoscomo uma cadeia de proteína única, em que as regiões VL e VH se unem paraformarem moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia única(scFv); ver, por exemplo, Bird et al (1988) Science 242: 423-426; e Huston etal (1988) Proc. Natl. Acad. Scl USA 85: 5879-5883). Tais anticorpos decadeia única também são destinados a serem englobados dentro da expressão"porção de ligação a antígeno" de um anticorpo. Outras formas de anticorposde cadeia única, tais como os dianticorpos, são também abrangidos. Osdianticorpos são bivalentes, anticorpos bi-específicos em que os domínios deVH e VL são expressos em uma cadeia de polipeptídeo única, mas usando umligador que é muito curto para permitir a união entre os dois domínios namesma cadeia, dessa forma forçando os domínios a unirem-se com os domínioscomplementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação a antígeno (ver,por exemplo, Holliger, P. et ai (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J. et al (1994) Structure 2: 1121-1123).

Ainda mais, um anticorpo ou sua porção de ligação a antígenopode ser parte de moléculas maiores de imunoadesão, formadas por associaçãocovalente ou não covalente do anticorpo ou da porção do anticorpo, com umaou mais de outras proteínas ou peptídeos. Exemplos de tais moléculas deimunoadesão incluem o uso da região do núcleo da estreptavidina paraproduzir uma molécula tetramérica scFv (Kipriyanov, S. M. et al (1995)Human Antibodies and Hybridomas 6:93 -101) e uso de um resíduo de cisteína,um peptídeo marcador e um marcador de poli-histidina C-terminal, paraproduzir moléculas ScFv bivalentes e biotiniladas (Kipriyanov, S. M. et al.(1994) Mol Immunol 31: 1047-1058). As porções dos anticorpos, tais como osfragmentos Fab e F(ab')2, podem ser preparadas da totalidade dos anticorposusando-se técnicas convencionais, tais como a digestão de papaína ou pepsina,respectivamente, da totalidade dos anticorpos. Além disso, os anticorpos, asporções dos anticorpos e as moléculas de imunoadesão, podem ser obtidasusando-se técnicas padrão de DNA recombinante, como aqui descritas.

A expressão "anticorpo humano", como aqui usada, intentaincluir anticorpos tendo regiões variáveis e constantes derivadas dasseqüências de imunoglobulina da linha germinativa humana. Os anticorposhumanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificadospor seqüências de imunoglobulina da linha germinativa humana (por exemplo,mutações introduzidas por mutagênese in vitro aleatória ou específica do sítioou por mutação somática in vivo), por exemplo nos CDRs e, em particular, noCDR3. No entanto, a expressão "anticorpo humano", como aqui usada, nãotenciona incluir os anticorpos em que as seqüências de CDR derivadas da linhagerminativà de outras espécies de mamíferos, tais como de um camundongo,tenham sido enxertadas nas seqüências da estrutura humana.

A expressão "anticorpo recombinante humano", como aquiempregada, pretende incluir todos os anticorpos humanos que são preparados,expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como osanticorpos expressos usando-se um vetor de expressão recombinantetransfectado em uma célula hospedeira (descrito ainda na Seção II, abaixo),anticorpos isolados de uma coleção de anticorpos humanos recombinantescombinatórios (descritos ainda na Seção III, abaixo), anticorpos isolados de umanimal (por exemplo um camundongo), que são transgênicos para os genes daimunoglobulina humana (ver, por exemplo, Taylor, L. D. et ai. (1992) Nucl.

Acids Res. 20: 6287-6295), ou anticorpos preparados, expressos, criados ouisolados por qualquer outro meio que envolva a fixação das seqüências dosgenes da imunoglobulina a outras seqüências de DNA. Tais anticorposrecombinantes humanos têm regiões variáveis e constantes derivadas dasseqüências de imunoglobulina da linha germinativa humana. Em certasmodalidades, no entanto, tais anticorpos recombinantes humanos estão sujeitosa mutagênese in vitro (ou, quando um animal transgênico para as seqüências deIg humano for usado, mutagênese somática in vivo), e assim as seqüências deaminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes sãoseqüências que, enquanto derivadas de, e relacionadas a, seqüências VH e VLde uma linha germinativa humana, podem não existir naturalmente dentro dorepertório in vivo da linha germinativa de anticorpos humanos.

Um "anticorpo isolado", como aqui empregado, pretendereferir-se a um anticorpo que seja substancialmente livre de outros anticorpostendo especificidades antigênicas diferentes (por exemplo, um anticorpoisolado que especificamente se ligue a hTNFa é substancialmente livre deanticorpos que especificamente se ligue a antígenos outros que não o hTNFa).

Um anticorpo isolado que especificamente se liga ao hTNFa pode, no entanto,ter uma reatividade cruzada a outros antígenos, tais como as moléculas deTNFa de outras espécies (discutidas em mais detalhes abaixo). Além do mais,um anticorpo isolado pode ser substancialmente livre de outro material celulare/ou produtos químicos.

Um "anticorpo de neutralização", como aqui empregado (ou um"anticorpo que neutralizou a atividade de hTNFa"), tenciona referir-se a umanticorpo cuja ligação ao hTNFa resulta em inibição da atividade biológica dehTNFa. Este inibição da atividade biológica de hTNFa pode ser avaliadamediante medição de um ou mais indicadores da atividade biológica dohTNFa, tal como a citotoxicidade induzida por hTNFa (ou in vitro, ou invivo), ativação celular induzida por hTNFa e ligação de hTNFa a receptoresde hTNFa. Estes indicadores da atividade biológica de hTNFa podem seravaliados por um ou mais dos vários ensaios padrão in vitro ou in vivoconhecidos na ciência (ver Exemplo 4). Preferivelmente, a capacidade de umanticorpo neutralizar a atividade do hTNFa é avaliada mediante inibição dacitoxicidade induzida por hTNFa das células L929. Como um parâmetroadicional ou alternativo da atividade de hTNFa, a capacidade de um anticorpode inibir a expressão induzida por hTNFa de ELAM-I sobre HUVEC, comouma medida da ativação celular induzida por hTNFa, pode ser avaliada.

A expressão "ressonância de plásmon superficial", como aquiempregada, se refere a um fenômeno ótico que permite quanto à análise deinterações bioespecíficas em tempo real, por detecção das alterações emconcentrações proteínicas dentro de uma matriz biossensora, por exemplousando-se o sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suécia, ePiscataway NJ). Para outras descrições, ver Exemplo 1 e Jõnsson, U. et al.(1993) Ann. Biol Clin. 51: 19-26; Jõnsson, U. et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson5 B. et al. (1995) J. Mol Recognit. 8: 125-131; e Johnsson,B. et al (1991) Anal Biochem. 198: 268-277.

O termo "Koff", como aqui usado, se refere à constante do índicede dissociação quanto à dissociação de um anticorpo do complexoanticorpo/antígeno.

O termo "Kd" como aqui empregado, intenta referir-se àconstante de dissociação de uma interação particular anticorpo-antígeno.

A expressão "molécula de ácido nucleico", como aqui usada,inclui as moléculas de DNA e as moléculas de RNA. Uma molécula de ácidonucleico pode ser de filamento único ou de filamento duplo, maspreferivelmente é de DNA de filamento duplo.

A expressão "molécula isolada de ácido nucleico", como aquiempregada com referência a ácidos nucleicos codificando anticorpos ouporções de anticorpos (por exemplo, VH, VL, CDR3) que se ligam a hTNFa,refere-se a uma molécula de ácido nucleico em que as seqüências denucleotídeos codificando o anticorpo ou uma porção do anticorpo são livres deoutras seqüências de nucleotídeos codificando anticorpos ou porções deanticorpo que ligam antígenos outros que não o hTNFa, cujas outrasseqüências podem naturalmente flanquear o ácido nucleico em DNA genômicohumano. Assim, por exemplo, um ácido nucleico isolado da invençãocodificando uma região de VH de um anticorpo anti- TNFa não contémqualquer outra seqüência codificando outras regiões de VH que ligamantígenos outros que não o TNFa.

O termo "vetor", como aqui empregado, se refere a umamolécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qualela se tenha ligado, Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que se refere a umaalça de DNA circular de duplo filamento em que os segmentos de DNAadicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que ossegmentos adicionais de DNA podem ser ligados no genoma viral. Certosvetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira em queeles são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origembacteriana de replicação e vetores epissômicos de mamíferos. Outros vetores(por exemplo, vetores não epissômicos de mamíferos) podem ser integrados nogenoma de uma célula hospedeira após introdução na célula hospedeira, edessa forma são replicados juntamente com o genoma hospedeiro. Além disso,certos vetores são capazes de direcionar a expressão dos genes a que eles seacham operativamente ligados. Tais vetores são referidos aqui como "vetoresrecombinantes de expressão" (ou simplesmente "vetores de expressão"). Emgeral, os vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinantesão freqüentemente na forma de plasmídeos. No presente Relatório Descritivo,"plasmídeo" e "vetor" podem ser usados intercambiavelmente, uma vez que oplasmídeo é a forma mais comumente empregada de vetor. No entanto, ainvenção intenta incluir essas outras formas de vetores de expressão, tais comoos vetores virais (por exemplo, retrovírus, adenovírus e vírus associados aadeno, defeituosos, de replicação), que servem a funções equivalentes.

A expressão "célula hospedeira recombinante" (ousimplesmente "célula hospedeira"), como aqui empregada, refere-se a umacélula em que um vetor recombinante de expressão foi introduzido. Deve-seentender que tais termos intentam referir-se não apenas à célula objeto emparticular, mas à progênie de uma tal célula. Tendo em vista que certasmodificações podem ocorrer em gerações sucessivas, ou devido à influência damutação ou do meio ambiente, tal progênie não pode, de fato, ser idêntica àcélula mãe, mas é ainda incluída dentro da expressão "célula hospedeira",como aqui empregada.

Vários aspectos da invenção são descritos em mais detalhes nasseguintes subseções.

I. Anticorpos humanos que se ligam ao TNFa humano

Esta invenção provê anticorpos humanos isolados, ou suasporções de ligação a antígenos, que se ligam a TNFa humano com altaafinidade, um índice de dissociação baixo e uma capacidade de neutralizaçãoelevada. De preferência, os anticorpos humanos da invenção são anticorposhumanos antihTNFa recombinantes de neutralização. O anticorporecombinante de neutralização mais preferido da invenção é aqui referido comoD2E7 e possui seqüências VL e VH conforme mostrado nas Figuras IA, IB enas Figuras 2A e 2B, respectivamente (a seqüência de aminoácidos da regiãoD2E7 VL também é mostrada na SEQ ID NO: 1; a seqüência de aminoácidosda região D2E7 também é mostrada na SEQ ID NO: 2). As propriedades deligação de D2E7, em comparação com o anti-hTNFa MAK 195 mAb, queapresenta alta afinidade e cinética lenta de dissociação, e outro anticorpo anti-hTNFa humano relacionado na seqüência como D2E7, 2SD4, são resumidasabaixo:

<table>table see original document page 19</column></row><table>

O anticorpo D2E7, e os anticorpos relacionados, tambémapresentam uma forte capacidade para neutralizar a atividade do hTNFa, comoavaliado por vários ensaios in vitro e in vivo (ver Exemplo 4). Por exemplo,estes anticorpos neutralizam a citotoxicidade induzida por hTNFa de célulasL929 com valores de IC50 na faixa de cerca de IO"7 M a cerca de IO"10 M.D2E7, quando expresso como um anticorpo IgGl de comprimento completo,neutraliza a citoxicidade induzida por hTNFa de células L929 com IC50 decerca de 1,25 χ IO"10 Μ. Além disso, a capacidade de neutralização de D2E7 émantida quando o anticorpo é expresso como um fragmento Fab, F(ab')2 ouscFv. O D2E7 também inibe a ativação celular induzida por TNFa, conformemedido por expressão ELAM-I induzida por hTNFa em HUVEC (IC50 = cercade 1,85 χ IO"10 M), e ligação de hTNFa a receptores de hTNFa em células U-937 (IC50 = cerca de 1,56 χ IO"10 Μ). Com referência ao último, o D2E7 inibe aligação de hTNFa a ambos os receptores hTNFa p55 e p75. Além disso, oanticorpo inibe a letalidade induzida por hTNFa in vivo em camundongos(ED50 = 1 a 2,5 μg/camundongo).

Com respeito à especificidade da ligação de D2E7, esteanticorpo se liga ao TNFa humano de várias formas, incluindo o hTNFasolúvel, a transmembrana hTNFa e a ligação do hTNFa a receptores celulares.

O D2E7 não se liga especificamente a outras citocinas, tais como a linfotoxina(TNFP), IL-Ια, IL-Iβ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IFNgama e TGFβ. No entanto, oD2E7 apresenta reatividade cruzada a fatores de necrose tumoral de outrasespécies. Por exemplo, o anticorpo neutraliza a atividade de pelo menos cincoTNFas de primatas (chimpanzé, babuíno, saguí, cynomolgus e reso) comvalores de IC50 aproximadamente equivalentes como para a neutralização dehTNFa (ver Exemplo 4, subseção Ε). O D2E7 também neutraliza a atividadedo TNFa de camundongos, não obstante aproximadamente 1000 vezes menosbem do que o TNFa humano (ver Exemplo 4, subseção Ε). O D2E7 também seliga a TNFa canino e porcino.

Em outro aspecto, a invenção diz respeito a anticorpos D2E7 eporções de anticorpo, anticorpos e porções de anticorpos relacionados a D2E7,e outros anticorpos e porções de anticorpos de humanos, com propriedadesequivalentes a D2E7, tais como a ligação de elevada afinidade a hTNFa combaixas cinéticas de dissociação e elevada capacidade de neutralização. Em umamodalidade, a invenção provê um anticorpo humano isolado, ou uma suaporção de ligação a antígenos, que dissocia do TNFa humano com um Kd de 1χ 10'8 M ou menos e uma constante do índice Koff de IxlO"3 ou menos, ambosdeterminados por ressonância de plásmon superficial, e neutraliza acitotoxicidade do TNFa humano em um ensaio padrão L929 in vitro com umIC50 de 1 χ 10"7 M ou menos. Mais preferivelmente, o anticorpo humanoisolado, ou sua porção de ligação a antígeno, se dissocia do TNFa humanocom um Koff de 5 χ 10"4 s"1 ou menos, ou mesmo, mais preferivelmente, comum Koff de I x 10"4 s"1 ou menos. Mais preferivelmente, o anticorpo humanoisolado, ou sua porção de ligação a antígeno, neutraliza a citotoxicidade doTNFa humano em um ensaio padrão L929 in vitro com um IC5o de 1 χ 10" Mou menos, mesmo mais preferivelmente com um IC50 de 1 χ 10"9 M ou menos,e ainda mais preferível com um IC50 de 5 χ 10"10 M ou menos. Em umamodalidade preferida, o anticorpo é um anticorpo recombinante humanoisolado, ou uma sua porção de ligação a antígeno. Em outra modalidadepreferida, o anticorpo também neutraliza a ativação celular induzida por TNFa,como avaliado usando-se um ensaio padrão in vitro para a expressão ELAM-Iinduzida por TNFa ou células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC).

A análise de ressonância de plásmon superficial paradeterminar Kd e Koff pode ser realizada como descrito no Exemplo 1. Umensaio padrão L929 in vitro para determinar os valores de IC5o é descrito noExemplo 4, subseção A. Um ensaio padrão in vitro para a expressão ELAM-Iinduzida por TNFa em células endoteliais da veia umbilical de humanos(HUVEC) é descrito no Exemplo 4, subseção C. Exemplos de anticorposrecombinantes humanos que reúnem, ou são ditos reunirem, a cinética acimamencionada e os critérios de neutralização, incluem anticorpos tendo osseguintes duplas [VHArL], cujas seqüências são mostradas nas Figuras IA, 1B,2A e 2B (ver também os Exemplos 2, 3 e 4 quanto às análises de cinética e deneutralização): [D2E7 VH/D2E7 VL], [HD2E7*.A1/D2E7 VL],[HD2E7*.A2/D2E7 VL], [HD2E7*.A3/D2E7 VL], [HD2E7*.A4/D2E7 VL],[HD2E7*.A5/D2E7 VL], [HD2E7*.A6/D2E7 VL], [HD2E7*.A7/D2E7 VL],[HD2E7*.A8/D2E7 VL], [HD2E7*.A9/D2E7 VL], [D2E7 VH/LD2E7*.A1],[D2E7 VH/LD2E7*.A4], [D2E7 VH/LD2E7*.A5], [D2E7 VH/LD2E7*.A7],[D2E7 VH/LD2E7*.A8], [HD2E7*.A9/LD2E7*.A1], [VH1-D2/LOE7], [VH1-D2.N/LOE7.T], [VH1-D2.Y/L0E7.A],[VH1-D2.N/L0E7.A], [VH1-D2/EPB12] e [3C-H2/LOE7].

É bem conhecido na arte que os domínios CDR3 de cadeiapesada e leve de anticorpos, desempenham um papel importante naespecificidade/afinidade da ligação de um anticorpo a um antígeno.Consequentemente, em outro aspecto, a invenção diz respeito a anticorposhumanos que possuem cinética de dissociação lenta para associação comhTNFa e que possuem domínios CDR3 de cadeia leve e pesada queestruturalmente são idênticos ou relacionados àqueles do D2E7. Conformedemonstrado no Exemplo 3, a posição 9 do CDR3 D2E7 VL pode ser ocupadapor Ala ou Thr, sem substancialmente afetar o Koff. Em conseqüência, ummotivo de consenso para o CDR3 D2E7 VL compreende a seqüência deaminoácido: Q-R-Y-N-R-A-P-Y-(T/A) (SEQ ID NO: 3). Adicionalmente, aposição 12 do CDR3 D2E7 VH pode ser ocupada por Tyr ou Asn, semsubstancialmente afetar o Koff. Consequentemente, um motivo de consensopara o CDR3 D2E7 VH compreende a seqüência de aminoácidos: V-S-Y-L-S-T-A-S-S-L-D-(Y/N) (SEQ ID NO: 4). Além disso, como demonstrado noExemplo 2, o domínio do CDR3 das cadeias pesada e leve de D2E7 é acessívelà substituição por um resíduo único de alanina (nas posições 1, 4, 5, 7 ou 8dentro do CDR3 VL, ou nas posições 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 ou 11, dentro doCDR3 VH), sem substancialmente afetar o Koff. Mais ainda, o técnicoexperiente observará que, dada a acessibilidade dos domínios D2E7 VL e doCDR3 VH a substituições por alanina, a substituição de outros aminoácidosdentro dos domínios CDR3 pode ser possível, enquanto ainda retém aconstante do índice de dissociação baixo do anticorpo, em particularsubstituições com aminoácidos conservativos. Uma "substituição conservativade aminoácidos", como aqui usada, é uma em que um resíduo de aminoácido ésubstituído por outro resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral similar.Famílias de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais similares foram têmsido definidas na arte, incluindo cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina,arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácidoglutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina,asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais nãopolares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina,metionina, triptofano), cadeias laterais β-ramificadas (por exemplo treonina,valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina,fenilalanina, triptofano, histidina). De preferência, não mais do que uma acinco substituições de aminoácido conservativo são feitas dentro dos domíniosD2E7 VL e/ou CDR3 VH. Mais preferivelmente, não mais do que uma a trêssubstituições conservativas de aminoácido são feitas dentro dos domíniosD2E7 VL e/ou CDR3 VH. Adicionalmente, as substituições de aminoácidoconservativo não devem ser feitas nas posições de aminoácido críticas paraligação ao hTNFa. Como mostrado no Exemplo 3, as posições 2 e 5 do CDR3D2E7 VL5 e as posições 1 e 7 do CDR3 D2E7 VH parecem ser críticas parainteração com o hTNFa e, assim, as substituições de aminoácido conservativopreferivelmente não são feitas nestas posições (não obstante uma substituiçãoda alanina na posição 5 do CDR3 D2E7 VL é aceitável, como acima descrito).

Consequentemente, em outra modalidade, a invenção provê umanticorpo humano isolado, ou uma sua porção de ligação a antígeno, com asseguintes características:

a) dissocia do TNFa humano com uma constante do índice Koffde 1 χ IO"3 s"1 ou menos, como determinado por ressonância de plásmonsuperficial;

b) tem um domínio CDR3 de cadeia leve compreendendo aseqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 3, ou modificado da SEQ ID NO: 3por uma substituição única de alanina nas posições 1, 4, 5, 7 ou 8, ou por um acinco substituições de aminoácido conservativo nas posições 1, 3, 4, 6, 7, 8e/ou 9;

c) tem um domínio CDR3 de cadeia pesada compreendendo aseqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 4, ou modificado da SEQ ID NO: 4por uma substituição única de alanina nas posições 2, 3,4, 5, 6, 8, 9,10 ou 11,ou por uma a cinco substituições de aminoácido conservativo nas posições 2, 3,4,5,6, 8, 9, 10,11 e/ou 12.

Mais preferivelmente, o anticorpo, ou sua porção de ligação aantígeno, se dissocia do TNFa humano com um Koff de 5 χ IO"4 s"1 ou menos.Mesmo mais preferivelmente, o anticorpo, ou sua porção de ligação a antígeno,se dissocia do TNFa humano com um Koff de 1 χ IO"4 s"1 ou menos.

Em ainda outra modalidade, a invenção provê um anticorpohumano isolado, ou uma sua porção de ligação a antígeno, com uma regiãovariável de cadeia leve (LCVR) tendo um domínio CDR3 compreendendo aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 3, ou modificado da SEQ ID NO: 3por uma substituição única de alanina nas posições 1, 4, 5, 7 ou 8, e por umaregião variável de cadeia pesada (HCVR) tendo um domínio CDR3compreendendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 4, ou modificadoda SEQ ID NO: 4 por uma substituição única de alanina nas posições 2, 3, 4, 5,6, 8, 9, 10 ou 11. Preferivelmente5 a LCVR ainda tem um domínio CDR2compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 5 (isto é, o CDR2D2E7 VL) e o HCVR ainda tem um domínio CDR2 compreendendo aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 6 (isto é, o CDR2 D2E7 VH).Mesmo mais preferivelmente, a LCVR ainda tem um domínio CDRlcompreendendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 7 (isto é, o CDRlD2E7 VL) e a HCVR tem um domínio CDRl compreendendo a seqüência deaminoácido da SEQ ID NO: 8 (isto é, o CDRl D2E7 VH). As regiões daestrutura quanto ao VL preferivelmente são da família da linha germinativahumana VkI, mais preferivelmente do gene Vk da linha germinativa humanaA20 e, o mais preferível, das seqüência da estrutura D2E7 VL apresentadas nasFiguras IA e 1B. As regiões da estrutura quanto a VH preferivelmente são dafamília da linha germinativa humana VH3, mais preferivelmente do gene VH dalinha germinativa humana DP-31 e, o mais preferível, das seqüências daestrutura D2E7 VH mostradas nas Figuras 2A e 2B.

Em ainda outra modalidade, a invenção provê um anticorpohumano isolado ou uma sua porção de ligação a antígeno, com uma regiãovariável de cadeia leve (LCVR) compreendendo a seqüência de aminoácido daSEQ ID NO: 1 (isto é, o D2E7 VL) e uma região variável de cadeia pesada(HCVR) compreendendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 (isto é,o D2E7 VH). Em certas modalidades, o anticorpo compreende uma regiãoconstante de cadeia pesada, tal como uma região constante IgGl, IgG2, IgG3,IgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD. Preferivelmente, a região constante de cadeiapesada é uma região constante de cadeia pesada IgGl ou uma região constantede cadeia pesada IgG4. Além disso, o anticorpo pode compreender uma regiãoconstante de cadeia leve, ou uma região constante de cadeia leve capa, ou umaregião constante de cadeia leve lambda. Preferivelmente, o anticorpocompreende uma região constante de cadeia leve capa. Alternativamente, aporção do anticorpo pode ser, por exemplo, um fragmento Fab ou umfragmento Fv de cadeia única.

Em outras modalidades ainda, a invenção provê um anticorpohumano isolado, ou suas porções de ligação a antígeno, tendo os domíniosCDR3 VL e VH relacionados a D2E7, por exemplo, os anticorpos, ou suasporções de ligação a antígeno, com uma região variável de cadeia leve (LCVR)tendo um domínio CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidoselecionada do grupo consistindo das SEQID NO: 3, SEQID NO: 11, SEQIDNO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 16,SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ IDNO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 eSEQ ID NO: 26, ou com uma região variável de cadeia pesada (HCVR) tendoum domínio CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidosselecionada do grupo consistindo das SEQID NO: 4, SEQ ID NO: 27, SEQIDNO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32,SEQID NO: 33, SEQID NO: 34 e SEQID NO: 35.

Em outra modalidade ainda, a invenção provê um anticorporecombinante humano, ou sua porção de ligação a antígeno, que neutraliza aatividade do TNFa humano, mas não do TNFP humano. Preferivelmente, oanticorpo, ou sua porção de ligação a antígeno, também neutraliza a atividadedo TNFa de chimpanzé e pelo menos um TNFa de primatas adicionalselecionado do grupo consistindo de TNFa de babuínos, TNFa de sagüis,TNFa de cynomolgus e TNFa de reso. Preferivelmente, o anticorpo, ou suaporção de ligação a antígeno, neutraliza o TNFa de seres humanos, dechimpazé e/ou adicional de primatas, em um ensaio L929 padrão in vitro comum IC50 de 1 χ 10'8 M ou menos, mais preferivelmente de 1 χ IO"9 M ou menos,e mesmo mais preferivelmente de 5 χ IO"10 ou menos. Em uma submodalidade,o anticorpo também neutraliza a atividade do TNFa canino, preferivelmenteem um ensaio L929 padrão in vitro com um IC50 de 1 χ IO'7 M ou menos, maispreferivelmente de 1 χ IO"8 M ou menos, e mesmo mais preferivelmente de 5 χIO"9 ou menos. Em uma outra submodalidade, o anticorpo também neutraliza aatividade do TNFa de porcos, preferivelmente com um IC50 de 1 χ IO"5 M oumenos, mais preferivelmente de 1 χ IO"6 M ou menos, e mesmo maispreferivelmente de 5 χ IO"7 ou menos. Em ainda outra modalidade, o anticorpotambém neutraliza a atividade do TNFa de camundongos, preferivelmente comum IC50 de 1 χ IO"4 M ou menos, mais preferivelmente de 1 χ IO"5 M ou menos,e mesmo mais preferivelmente de 5 χ IO"6 ou menos.

Um anticorpo ou porção de anticorpo da invenção podem serderivados ou ligados a outra molécula funcional (por exemplo, outro peptídeoou proteína). Consequentemente, os anticorpos e as porções de anticorpos dainvenção intentam incluir formas derivadas e de outro modo modificadas dosanticorpos anti_hTNFa humanos, aqui descritos, incluindo moléculas deimunoadesão. Por exemplo, um anticorpo ou porção de anticorpo da invençãopodem ser funcionalmente ligados (por acoplamento químico, fusão genética,associação não covalente, ou de outra forma) a um ou mais outras entidadesmoleculares, tais como outro anticorpo (por exemplo, um anticorpo bi-específico ou um di-anticorpo), um agente detectável, um agente citotóxico,um agente farmacêutico e/ou uma proteína ou peptídeo que possam mediariaassociação do anticorpo ou da porção de anticorpo com outra molécula (talcomo uma região do núcleo da estreptavidina ou um marcador de poli-histidina).

Um tipo de anticorpo derivado é produzido por reticulação dedois ou mais anticorpos (do mesmo tipo ou de tipos diferentes, por exemplopara criar anticorpos bi-especificos). Reticuladores adequados incluem aquelesque são heterobifiincionais, tendo dois grupos distintamente reativos separadospor um espaçador apropriado (por exemplo, éster m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) ou homobifundional (por exemplo, suberato de di-succinimidila). Tais ligadores são disponíveis da Pierce Chemical Company,Rockford, IL.

Agentes detectáveis úteis, com o qual um anticorpo ou porçãodo anticorpo da invenção podem ser derivados, incluem os compostosfluorescentes. Exemplos de agentes fluorescentes detectáveis incluem afluoresceína, o isotiocianato de fluoresceína, a rodamina, o cloreto de 5-dimetilamina-l-naftaleno sulfonila, a ficoeritrina, e outros. Um anticorpo podetambém ser derivado com enzimas detectáveis, tais como a fosfatase alcalina, aperoxidase da raiz forte, a glicose oxidase e outras. Quando um anticorpo éderivado com uma enzima detectável, ele é detectado mediante adição dereagentes adicionais que a enzima utiliza para produzir um produto detectávelde reação. Por exemplo, quando o agente detectável peroxidase da raiz forteestá presente, a adição de peróxido de hidrogênio e diaminobenzidina conduz aum produto de reação colorido, que é detectável. Um anticorpo também podeser derivado com biotina, e detectado através de medição indireto da avidina ouda ligação da estreptavidina.

II. Expressão de anticorpos

Um anticorpo, ou porção de anticorpo, da invenção, podem serpreparados por expressão recombinante dos genes de imunoglobulina de cadeialeve e pesada em uma célula hospedeira. Para expressar um anticorporecombinantemente, uma célula hospedeira é transfectada com um ou maisvetores recombinantes de expressão transportando fragmentos de DNAcodificando as cadeias de imunoglobulina de cadeias leve e pesada doanticorpo, tal que as cadeias leves e pesadas sejam expressas na célulahospedeira e, preferivelmente, secretadas no meio em que as célulashospedeiras estão cultivadas, de cujo meio os anticorpos podem serrecuperados. Metodologias padrão de DNA recombinante são usadas paraobter os genes de anticorpos de cadeia pesada e leve, incorporar estes genesnos vetores recombinantes de expressão e introduzir os vetores nas célulashospedeiras, tais como aquelas descritas em Sambrook, Fritsch e Maniatis(eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, ColdSpring Harbor, NY, (1989), Ausubel, F. M. et al (eds.) Current Protocols inMolecular Biology, Greene Publishing Associates (1989) e na Patente U.S.4.816.397 por Boss et al.

Para expressar D2E7 ou um anticorpo relacionado a D2E7, osfragmentos de DNA codificando as regiões de cadeia leve e pesada sãoprimeiramente obtidos. Estes DNAs podem ser obtidos por ampliação emodificação de seqüências variáveis de cadeia leve e pesada de linhagerminativa, usando uma reação em cadeia de polimerase (PCR)./ Asseqüências de DNA de linha germinativa quanto aos genes da região variávelde cadeia pesada e leve, são conhecidas nesta ciência (ver, por exemplo, osciados de base da seqüência de linha germinativa humana "Vbase"; ver tambémKabat, E. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services (DepartamentoAmericano de Serviços de Saúde e Humanos), NIH Publication n° 91-3242;Tomlinson, I. M. et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VhSequences Reveals about Fifty Groups of Vh Segments with DifferentHypervariable Loops" J. Mol Biol. 227: 776-798; e Cox, J. P. L. et al (1994)"A Directory of Human Germ-Iine Vk Segments Reveals a Strong Bias in theirUsage" Eur. J. Immunol. 24: 827-836; os conteúdos dos quais são aquiexpressamente incorporados por referência). Para obter um fragmento de DNAcodificando a região variável de cadeia pesada de D2E7, ou um anticorporelacionado a D2E7, um membro da família VH3 de genes VH da linhagerminativa humana é ampliado por PCR padrão. Mais preferivelmente, aseqüência da linha germinativa VH DP-31 é ampliada. Para obter umfragmento de DNA codificando a região variável da cadeia leve de D2E7, ouum anticorpo relacionado a D2E7, um membro da família VkI de genes VL dalinha germinativa humana é ampliado por PCR padrão. Mais preferivelmente, aseqüência da linha germinativa VL A20 é ampliado. Os iniciadores de PCRadequados para uso na ampliação das seqüências VL da linha germinativa VHe A20 da linha germinativa DP-31, podem ser designados com base nasseqüências de nucleotídeos apresentadas nas referências citadas acima, usando-se processos padrão.

Uma vez os fragmentos VH e VL da linha germinativa sejamobtidos, estas seqüências podem ser modificadas para codificar as seqüênciasde aminoácidos do D2E7 ou relacionadas a D2E7 aqui apresentadas. Asseqüências de aminoácidos codificadas pelas seqüências de DNA VH e VL dalinha germinativa, são primeiro comparadas às seqüências de aminoácidos VHe VL do D2E7 ou relacionadas ao D2E7, para identificar os resíduos deaminoácidos na seqüência do D2E7 ou relacionada ao D2E7 que difere dalinha germinativa. Então, os nucleotídeos apropriados das seqüências do DNAda linha germinativa são transformados de tal modo que a seqüência da linhagerminativa transformada codifique a seqüência de aminoácidos do D2E7 ourelacionados ao D2E7, usando-se o código genético para determinar quais asmodificações de nucleotídeos que devem ser feitas. A mutagênese dasseqüências da linha germinativa é realizada por processos padrão, tais como amutagênese mediada por PCR (em que os nucleotídeos transformados sãoincorporados nos iniciadores de PCR, tal que o produto de PCR contenha asmutações) ou a mutagênese dirigida ao sítio.

Além disso, deve ser observado que, de as seqüências da "linhagerminativa" obtidas por ampliação do PCR codifica as diferenças deaminoácidos nas regiões da estrutura, da configuração da verdadeira linhagerminativa (isto é, diferenças na seqüência ampliada em comparação com averdadeira seqüência da linha germinativa, por exemplo como resultado demutação somática), pode ser desejável modificar estas diferenças deaminoácidos de volta às seqüências da verdadeira linha germinativa (isto é,"mutação retrógrada" dos resíduos da estrutura para a configuração da linhagerminativa).

Uma vez sejam obtidos os fragmentos de DNA codificando ossegmentos VH e VL do D2E7 ou relacionados ao D2E7 (por ampliação emutagênese dos genes VH e VL da linha germinativa, como descrito acima),estes fragmentos de DNA pode ainda ser manipulados por técnicas padrão deDNA recombinante, por exemplo para converter os genes da região variável agenes de cadeia de anticorpos de comprimento completo, a genes defragmentos Fab ou a um gene scFv. Nestas manipulações, um fragmento deDNA codificando VL ou VH é operativamente ligado a outro fragmento deDNA codificando outra proteína, tal como uma região constante de anticorposou um ligador flexível. A expressão "operativamente ligado", como empregadaneste contexto, deve ser entendida como significando que os dois fragmentosde DNA são unidos de tal modo que as seqüências de aminoácidos codificadaspelos dois fragmentos de DNA permaneçam na estrutura.

O DNA isolado codificando a região VH pode ser convertidoem um gene de cadeia pesada de comprimento completo, ligandooperativamente o DNA codificando VH a outra molécula de DNA codificandoas regiões constantes de cadeia pesada (CHI, CH2 e CH3). As seqüências dosgenes humanos da região constante de cadeia pesada são conhecidos na arte(ver, por exemplo, Kabat, E. A. et ai. (1991) Sequences of Proteins ofImmunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and HumanServices, NIH PUblication n° 91-3242) e os fragmentos de DNA incluindoestas regiões podem ser obtidos por ampliação padrão do PCR. A regiãoconstante de cadeia pesada pode ser uma região constante IgGl, IgG2, IgG3,IgA, IgE, IgM ou IgD, mas a mais preferível é uma região constante IgGl ouIgG4. Para um gene de cadeia pesada do fragmento Fab5 o DNA codificandoVH pode ser operativamente ligado a outra molécula codificando apenas aregião constante CHl de cadeia pesada.

O DNA isolado codificando a região VL pode ser convertidoem um gene da cadeia leve de comprimento completo (bem como um gene decadeia leve Fab), operativamente ligando o DNA codificando VL a outramolécula de DNA codificando a região constante de cadeia leve, CL. Asseqüências de genes humanos da região constante de cadeia leve sãoconhecidos na ciência (ver, por exemplo, Kabat, E. A. et al. (1991) Sequencesof Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department ofHealth and Human Services, NIH Publication n° 91-3242), e os fragmentos deDNA incluindo estas regiões podem ser obtidos por ampliação padrão do PCR.A região constante de cadeia leve pode ser uma região constante capa oulambda, mas a mais preferível é uma região constante capa.

Para criar um gene scFv, os fragmentos de DNA codificandoVH e VL são operativamente ligados a outro fragmento codificando um ligadorflexível, por exemplo, codificando a seqüência de aminoácido (Gly4-Ser)3, talque as seqüências VH e VL podem ser expressas como uma proteína contíguade cadeia única, com as regiões VL e VH unidas pelo ligador flexível (ver, porexemplo, Bird et ai. (1988) Science 242: 423-426; Huston et ai (1988) Proc.Natl. Acad. Scl USA 85: 5879-5883; McCafferty at ai, Nature (1990) 348:552-554).

Para expressar os anticorpos, ou porções dos anticorpos dainvenção, os DNAs codificando as cadeias leves e pesadas parciais ou decomprimento completo, obtidos como descrito acima, são interseridos nosvetores de expressão, de tal modo que os genes sejam operativamente ligados aseqüências de controle transcricional e translacional. Neste contexto, aexpressão "operativamente ligados" deve significar que um gene de anticorpo éligado em um vetor, de modo tal que as seqüências de controle transcricional etranslacional dentro do vetor servem à sua função de destino, de regular atranscrição e a translação do gene do anticorpo. O vetor de expressão e asseqüências de controle da expressão são escolhidas para serem compatíveiscom a célula hospedeira de expressão usada. O gene de cadeia leve doanticorpo e o gene de cadeia pesada do anticorpo, podem ser inseridos emvetores separado ou, mais tipicamente, ambos os genes são inseridos no mesmovetor de expressão. Os genes do anticorpo são interseridos no vetor deexpressão por processos padrão (por exemplo, ligação de sítios de restriçãocomplementar no fragmento e vetor do gene do anticorpo, ou ligação terminalembotada, se nenhum sítio de restrição estiver presente). Antes da inserção dasseqüências de cadeia leve ou pesada do D2E7 ou relacionada ao D2E7, o vetorde expressão já pode transportar seqüências da região constante de anticorpos.

Por exemplo, uma abordagem para converter as seqüências VH e VL do D2E7e relacionadas a D2E7 em genes de anticorpos de comprimento completo, éinseri-los nos vetores de expressão já codificando as regiões constantes decadeia pesada e constantes de cadeia leve, respectivamente, de tal forma que osegmento VH seja operativamente ligado ao(s) segmento(s) CH dentro dovetor, e o segmento VL seja operativamente ligado ao segmento CL dentro dovetor. Adicional ou alternativamente, o vetor recombinante de expressão podecodificar um peptídeo de sinal que facilita a secreção da cadeia do anticorpo dacélula hospedeira. O gene da cadeia do anticorpo pode ser clonado dentro dovetor, de maneira que o peptídeo de sinal seja ligado na estrutura ao terminalamino do gene da cadeia do anticorpo. O peptídeo de sinal pode ser umpeptídeo de sinal de imunoglobulina ou um peptídeo de sinal heterólogo (istoé, um peptídeo de sinal de uma proteína não imunoglobulina).

Além dos genes da cadeia dos anticorpos, os vetoresrecombinantes de expressão da invenção transportam seqüências regulatóriasque controlam a expressão dos genes da cadeia dos anticorpos em uma célulahospedeira. A expressão "seqüência regulatória" pretende incluir promotores,intensificadores e outros elementos de controle da expressão (por exemplo,sinais de poliadenilação), que controlam a transcrição ou a translação dosgenes da cadeia de anticorpos. Essas seqüências regulatórias são descritas, porexemplo, em Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Será observado por aquelesexperientes nesta ciência que o projeto do vetor de expressão, incluindo aseleção de seqüências regulatórias, pode depender de fatores tais como aescolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão daproteína desejada, etc. As seqüências regulatórias preferidas para expressão dacélula hospedeira de mamíferos incluem os elementos virais que dirigem osníveis elevados da expressão proteínica em células de mamíferos, tais comopromotores e/ou intensificadores derivados de citomegalovírus (CMV) (taiscomo o promotor/intensificador de CMV), Vírus Símio 40 (SV40) (tal como opromotor/intensificador de SV40), o promotor principal tardio de adenovírus(AdMLP) e polioma. Para outra descrição dos elementos virais regulatórios, ede suas seqüências, ver, por exemplo, a Patente U.S. ne 5.168.062 por Stinski, aPatente U.S. n° 4.510.245 por Bell et ai. e a Patente U.S. ns 4.968.615 porSchaffiier et ai.

Além dos genes da cadeia de anticorpos e seqüênciasregulatórias, os vetores recombinantes de expressão da invenção podemtransportar seqüências adicionais, tais como seqüências que regulam areplicação do vetor em células hospedeiras (por exemplo, origens dereplicação) e genes marcadores selecionáveis. O gene marcador selecionávelfacilita a seleção de células hospedeiras, em que o vetor tenha sido introduzido(ver, por exemplo, as Patentes U.S. n- 4.399.216, 4.634.665 e 5.179.017, todaspor Axel et ai). Por exemplo, tipicamente o gene marcador selecionávelconfere resistência a medicamentos, tais como G418, higromicina oumetotrexato, em uma célula hospedeira dentro da qual o vetor tenha sidointroduzido. Os genes marcadores selecionáveis preferidos incluem o gene dadiidrofolato redutase (DHFR) (para uso em células hospedeiras dhfr* comseleção/ampliação de metotrexato) e o gene neo (para a seleção G418).

Para expressão das cadeias leves e pesadas, o(s) vetor(es) deexpressão codificando as cadeias pesadas e leves, é(são) transfectado(s) dentrode uma célula hospedeira por técnicas padrão. As várias formas do termo"transfecção" se destinam a incluir uma ampla variedade de técnicascomumente usadas para a introdução de DNA exógeno em uma célulahospedeira procariótica ou eucariótica, por exemplo a eletroporação, aprecipitação de cálcio-fosfato, a transfecção DEAE-dextrana, e outras. Nãoobstante seja teoricamente possível expressar os anticorpos da invenção, ou emcélulas procarióticas, ou eucarióticas, a expressão dos anticorpos em célulaseucarióticas, e mais preferivelmente células hospedeiras de mamíferos, é a maispreferida, porque tais células eucarióticas, e em particular as células demamíferos, são mais prováveis dò que as células procarióticas de se agrupareme de secretarem um anticorpo propriamente desdobrado e imunologicamenteativo. A expressão procariótica dos genes dos anticorpos tem sido relatadacomo ineficaz para a produção de elevados níveis de anticorpo ativo (Boss, M.A. e Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6: 12-13).

As células hospedeiras de mamíferos preferidas para expressaros anticorpos recombinantes da invenção incluem o Ovário de Criceto(hamster) Chinês (células CHO), incluindo as células CHO dhfr-, descritas emUrlaub e Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 4216-4220, usadascom um marcador selecionável DHFR, por exemplo como descrito em R. J.Kaufman e P. A. Sharp (1982) Mol Bio. 159: 601-621), células de mielomasNSO, células COS e células SP2. Quando os vetores recombinantes deexpressão codificando os genes de anticorpos são introduzidos nas célulashospedeiras de mamíferos, os anticorpos são produzidos por cultivo das célulashospedeiras por um período de tempo suficiente para permitir a expressão doanticorpo nas células hospedeiras ou, mais preferivelmente, a secreção doanticorpo no meio de cultura em que as células hospedeiras são cultivadas. Osanticorpos podem ser recuperados do meio de cultura usando-se processospadrão de purificação de proteína.

As células hospedeiras também podem ser usadas paraproduzirem porções de anticorpos intactos, tais como os fragmentos Fab ou asmoléculas scFv. Será entendido que variações no procedimento acima seacham dentro do escopo da presente invenção. Por exemplo, pode ser desejáveltransfectar uma célula hospedeira com o DNA codificando, ou a cadeia leve,ou a cadeia pesada (mas não ambas) de um anticorpo desta invenção. Atecnologia do DNA também pode ser usada para remover algum ou todo oDNA codificando qualquer ou ambas as cadeias leve ou pesada que não sejamnecessárias para ligação ao hTNFa. As moléculas expressas de tais moléculasde DNA truncadas também são abrangidas pelos anticorpos da invenção. Alémdisso, podem ser produzidos anticorpos bifuncionais em que uma cadeiapesada e uma leve são um anticorpo da invenção, e a outra cadeia leve e pesadasão específicas para um antígeno diferente do hTNFa, mediante reticulação deum anticorpo da invenção em um segundo anticorpo, por processos padrão dereticulação química.

Em um sistema preferido para expressão recombinante de umanticorpo, ou sua porção de ligação a antígeno, da invenção, um vetorrecombinante de expressão codificando tanto a cadeia pesada do anticorpo,quanto a cadeia leve do anticorpo, é introduzido nas células CHO dhfr-mediante transfecção mediada por fosfato de cálcio. Dentro do vetorrecombinante de expressão, os genes de cadeia pesada e leve do anticorpo são,cada um, operativamente ligados aos elementos regulatóriosintensificador/promotor (por exemplo, derivado de SV40, CMV, adenovírus eoutros, tais como um elemento regulatório do intensificador CMV/promotorAdMLP ou um elemento regulatório do intensivicador SV40/promotorAdMLP), para conduzir altos níveis de transcrição dos genes. O vetorrecombinante de expressão também conduz um gene DHFR9 que leva em contaa seleção de células de CHO que tenham sido transfectadas com o vetor,usando-se seleção/ampliação de metotrexato. As células hospedeirastransformantes selecionadas são cultivadas tomando em consideração aexpressão das cadeias de anticorpos pesada e leve e o anticorpo intacto érecuperado do meio de cultura. As técnicas padrão de biologia molecular sãoempregadas para preparar o vetor recombinante de expressão, transfectar ascélulas hospedeiras, selecionar quanto aos transformantes, cultivar as célulashospedeiras e recuperar o anticorpo do meio de cultura.

Em vista do acima, outro aspecto da invenção diz respeito acomposições de ácido nucleico. vetor e células hospedeiras, que podem serusados para expressão recombinante dos anticorpos e porções dos anticorposda invenção. A seqüência de nucleotídeos codificando a região variável decadeia leve D2E7 é apresentada na Figura 7 e na SEQ ID NO: 36. O domínioCDRI do LCVrR encerra os nucleotídeos 70 a 102, o domínio CDR2 encena osnucleotídeos 148 a 168, e o domínio CDR3 encerra os nucleotídeos 265 a 291.A seqüência de nucleotídeos codificando a região variável de cadeia pesadaD2E7 é mostrada na Figura 8 e na SEQ ID NO: 37. O domínio CERl doHCVR encerra os nucleotídeos de 91 a 105, o domínio CDR2 encerra osnucleotídeos 148 a 190, e o domínio CDR3 encerra os nucleotídeos 295-330.Será observado pelos técnicos experientes que as seqüências de nucleotídeoscodificando os anticorpos relacionados com D2E7, ou porções destes (porexemplo, um domínio de CDR, tal como um domínio de CDR3), podem serderivadas das seqüências de nucleotídeos codificando as LCVR e HCVR doD2E7, usando-se o código genético e as técnicas padrão de biologia molecular.

Em uma modalidade, a invenção provê um ácido nucleicoisolado codificando um domínio de CDR3 de cadeia leve compreendendo aseqüência de aminoácidos· da SEQ ID NO; 3 (isto é, o CDR3 VL do D2E7), oumodificado da SEQ ID NO: 3 por uma substituição única de alanína nasposições 1, 4, 5, 7 ou 8, ou por um a cinco substituições conservativas deaminoácidos nas posições 1, 3, 4, 6, 7, 8 e/ou 9. Este ácido nucleico podecodificar apenas a região do CDR3 ou, mais preferivelmente, codifica umaregião variável inteira de cadeia leve de anticorpos (LCVR). Por exemplo, oácido nucleico pode codificar uma LCVR tendo um domínio CDR2compreendendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 5 (isto é, o CDR2VL do D2E7) e um domínio CDRl compreendendo a seqüência deaminoácidos da SEQID NO: 7 (isto é, o CDRl VL do D2E7).

Em outra modalidade, a invenção provê um ácido nucleicoisolado codificando um domínio CDR3 de cadeia pesada, compreendendo aseqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4 (isto é, o CDR3 VH do D2E7), oumodificado da SEQ ID NO: 4 por uma substituição única de alanina nasposições 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 ou 11, ou por de um a cinco substituições deaminoácidos conservativos nas posições 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 e/ou 12. Esteácido nucleico pode codificar apenas a região CDR3 ou, mais preferivelmente,codifica uma região inteira variável de cadeia pesada do anticorpo (HCVR).Por exemplo, o ácido nucleico pode codificar uma HCVR tendo um domínioCDR2 compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6 (isto é, oCDR2 VH do D2E7) e um domínio CDRl compreendendo a seqüência deaminoácidos da SEQID NO: 8 (isto é, o CDRl VH do D2E7).

Em ainda outra modalidade, a invenção provê ácidos nucleicosisolados codificando um domínio CDR3 relacionado a D2E7, por exemplocompreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupoconsistindo de: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 e SEQID NO: 35.

Em ainda outra modalidade, a invenção provê um ácidonucleico isolado codificando uma região variável de cadeia leve de anticorpos,compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQID NO: 1 (isto é, a LCVRdo D2E7). Preferivelmente, este ácido nucleico compreende a seqüência denucleotídeos da SEQ ID NO: 36, não obstante o técnico versado observe que,devido à degeneração do código genético, outras seqüências de nucleotídeospodem codificar a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. O ácidonucleico pode codificar apenas a LCVR ou pode também codificar uma regiãoconstante de cadeia leve de anticorpos, operativamente ligada à LCVR. Emuma modalidade, este ácido nucleico está em um vetor recombinante deexpressão.

Em ainda outra modalidade, a invenção provê um ácidonucleico isolado codificando uma região variável de cadeia pesada deanticorpos, compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQID NO: 2 (istoé, a HCVR do D2E7). Preferivelmente, este ácido nucleico compreende aseqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 37, embora os técnicos versadosobservem que, devido à degeneração do código genético, outras seqüências denucleotídeos podem codificar a seqüência de aminoácidos da SEQID NO: 2. Oácido nucleico pode codificar apenas a HCVR ou pode também codificar umaregião constante de cadeia pesada, operativamente ligada à HCVR. Porexemplo, o ácido nucleico pode compreender uma região constante IgGl ouIgG4. Em uma modalidade, este ácido nucleico está em um vetor recombinantede expressão.

A expressão ainda provê vetores recombinantes de expressão,codificando tanto uma cadeia pesada de anticorpos, quanto uma cadeia leve deanticorpos. Por exemplo, em uma modalidade, a invenção provê um vetorrecombinante de expressão codificando:

a) uma cadeia leve de anticorpos tendo uma região variávelcompreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ED NO: 1 (isto é, a LCVRdo D2E7); e

b) uma cadeia pesada de anticorpos tendo uma região variávelcompreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQID NO: 2 (isto é, a HCVRdo D2E7).

A invenção também provê células hospedeiras em que um oumais dos vetores recombinantes de expressão da invenção tenha sidointroduzido. De preferência, a célula hospedeira é uma célula hospedeira demamífero, mais preferivelmente a célula hospedeira é uma célula CHO, umacélula NSO ou uma célula COS.

Ainda mais, a invenção provê um processo de sintetização deum anticorpo recombinante humano da invenção, mediante cultivo de umacélula hospedeira da invenção em um meio de cultura adequado, até que umanticorpo recombinante humano da invenção seja sintetizado. O processo podeainda compreender o isolamento do anticorpo recombinante humano do meiode cultura.

III. Seleção de anticorpos recombinantes humanos

Os anticorpos recombinantes de humanos da invenção, alémdos anticorpos D2E7 ou relacionados com D2E7 aqui apresentados, podem serisolados mediante exame de uma coleção de anticorpos recombinantescombinatórios, preferivelmente uma coleção de apresentação de fago scFv,preparada usando-se cDNAs VL e VH humanos preparados do mRNAderivado de linfócitos humanos. As metodologias para se preparar e examinastais coleções são conhecidas na técnica. Além de comercialmente disponíveisos kits para gerar coleções de apresentação de fago (por exemplo, oRecombinant Phage Antibody System da Pharmacia, catálogo n° 27-9400-01; eo kit de apresentação de fago SurfZAP® da Stratagene, catálogo n° 240612),exemplos de processos e reagentes particularmente acessíveis para uso nageração e no exame de coleções de apresentação de anticorpos podem serencontrados, por exemplo, em Ladner et al, Patente U.S. n2 5.233.409; Kang etal. Publicação PCT WO 92/18619; Dower et al. Publicação PCT WO91/17271; Winter et al. Publicação PCT WO 92/20791; Karkland et al.,Publicação PCT WO 92/15679; Breitling et al. Publicação PCT WO 93/01288;

McCafferty et al. Publicação PCT WO 92/01047; Garrard et al. et al.Publicação PCT WO 92/09690; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay et al. (1992) Hum AntibodHybridomas 3: 81-85; Huse et al. (1989)Science 246: 1275-1281; McCafferty et al., Nature (1990) 348: 552-554;Griffiths et al (1993) EMBO J12: 725-734; Hawkins et al. (1992) JMol Biol226: 889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628; Gram et al (1992)PNAS 89: 3576-3580; Garrad et al (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377;Hoogenboom et al. (1991) NucAcidRes 19: 4133-4137; e Barbas et al. (1991)PNAS 88: 7978-7982.

Em uma modalidade preferida, para isolar anticorpos humanoscom alta afinidade e uma constante baixa do índice de dissociação parahTNFa, um anticorpo anti-hTNFa de murinos, tendo alta afinidade e umabaixa constante do índice de dissociação para hTNFa (por exemplo MAK 195,o hibridoma cujo número de depósito é ECACC 87 050801), é primeiro usadopara selecionar seqüências de cadeia pesada e leve de humanos, tendoatividade de ligação semelhante próxima a hTNFa, usando impressão deepítopo ou seleção guiada, processos descritos em Hoogenboom et al,Publicação PCT WO 93/06213. As coleções de anticorpos usadas nesteprocesso são de preferência coleções de scFv preparadas e tríadas conformedescrito em McCafferty et al. Publicação PCT WO 92/01047, McCafferty etal., Nature (1990) 348: 552-554; e Griffiths et al, (1993) EMBO J 12: 725-734. As coleções de anticorpos de scFv preferivelmente são tríadas usando-seTNFa recombinante humano como o antígeno.

Uma vez os segmentos iniciais VL e VH humanos sejamselecionados, as experiências de "mistura e união", em que diferentes pares dossegmentos VL e VH inicialmente selecionados são triados quanto à ligação dehTNFa, são realizadas para selecionar as combinações de pares VLAOpreferidas. Adicionalmente, para ainda melhorar a afinidade e/ou reduzir aconstante do índice de dissociação para a ligação de hTNFa, os segmentos VLe VH do(s) par(es) VL/VH preferido(s) podem ser aleatoriamente modificados,preferivelmente dentro da região do CDR3 de VH e/ou VL, em um processoanálogo ao processo de mutação somática in vivo responsável quanto amaturação da afinidade dos anticorpos durante uma natural resposta imune.

Esta maturação da afinidade in vitro pode ser realizada mediante ampliação dasregiões VH e VL usando-se os iniciadores do PCR complementar ao CDR3VH ou CDR3 VL, respectivamente, cujos iniciadores foram "reforçados" comuma mistura aleatória das quatro bases de nucleotídeos em certas posições tais,que os produtos de PCR resultantes codificam os segmentos VH e VL em queas mutações aleatórias foram introduzidas nas regiões CDR3 VH e/ou VL.Estes segmentos VH e VL aleatoriamente modificados podem ser re-examinados quanto à ligação a hTNFa e seqüências que apresentam altaafinidade e um baixo índice de dissociação, para que a ligação hTNFa possaser selecionada.

As seqüências de aminoácidos das cadeias pesadas e levesselecionadas dos anticorpos podem ser comparadas a seqüências deaminoácidos de cadeia pesada e leve da linha germinativa. Em casos ondecertos resíduos da estrutura das cadeias selecionadas de VL e/ou VH difiram daconfiguração da linha germinativa (por exemplo como um resultado damutação somática dos genes de imunoglobulina usados para preparar a coleçãode fago), pode ser desejável "reverter a mutação" dos resíduos alterados daestrutura dos anticorpos selecionados, à configuração da linha germinativa (istoé, modificar as seqüências de aminoácidos da estrutura dos anticorposselecionados, de modo que eles sejam os mesmos das seqüências da linhagerminativa de aminoácidos da estrutura). Tal "reversão da mutação" (ou"linhagem de germinação") dos resíduos da estrutura pode ser realizada porprocessos padrão da biologia molecular, mediante introdução de mutaçõesespecíficas (por exemplo, mutagênese dirigida ao sítio; mutagênese mediadapor PCR, e outras).

Em seguida à triagem e isolamento de um anticorpo anti-hTNFa da invenção a partir de uma coleção de apresentação daimunoglobulina recombinante, o ácido nucleico codificando o anticorposelecionado pode ser recuperado do pacote de apresentação (por exemplo, dogenoma do fago) e subclonado dentro de outros vetores de expressão mediantetécnicas padrão de DNA recombinante. Se desejável, o ácido nucleico pode serainda manipulado para criar outras formas de anticorpos da invenção (porexemplo, ligadas a ácido nucleico codificando domínios adicionais deimunoglobulina, tais como regiões constantes adicionais). Para expressar umanticorpo humano recombinante isolado por triagem de uma coleçãocombinatória, o DNA codificando o anticorpo é clonado dentro de um vetorrecombinante de expressão e introduzido em células de um hospedeiromamífero, como descrito em mais detalhes na Seção II acima.IV Composições farmacêuticas e administração farmacêutica

Os anticorpos e as porções de anticorpos da invenção podemser incorporados nas composições farmacêuticas adequadas para administraçãoa um indivíduo. Tipicamente, a composição farmacêutica compreende umanticorpo ou porção do anticorpo da invenção, e um portadorfarmaceuticamente aceitável. Como aqui empregado, "portadorfarmaceuticamente aceitável" inclui qualquer e todos os solventes, meios dedispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifüngicos, agentesisotônicos e de retardamento da absorção, e outros que sejam fisiologicamentecompatíveis. Exemplos de portadores farmaceuticamente aceitáveis incluemum ou mais dentre água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato,dextrose, glicerol, etanol e outros, bem como as combinações destes. Emmuitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo açúcares,poliálcoois como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio, na composição.Portadores farmaceuticamente aceitáveis podem ainda compreenderquantidades secundárias de substâncias auxiliares, tais como agentesumectantes ou emulsificantes, preservativos ou tampões, que intensifiquem avida de prateleira ou a eficácia do anticorpo ou da porção de anticorpo.

As composições desta invenção podem estar em uma variedadede formas. Estas incluem, por exemplo, formas de dosagem líquida, semi-sólida e sólida, tais como soluções líquidas (por exemplo, soluções injetáveis einfiisíveis), dispersões ou suspensões, tabletes, pílulas, pós, lipossomas esupositórios. A forma preferida depende da modalidade pretendida deadministração e da aplicação terapêutica. Composições típicas preferidas sãona forma de soluções injetáveis e infusíveis, tais como composiçõessemelhantes àquelas usadas para imunização passiva de seres humanos comoutros anticorpos. A modalidade preferida de administração é a parenteral (porexemplo, intravenosa, subcutânea, intraperitoneal, intramuscular). Em umamodalidade preferida, o anticorpo é administrado por infusão ou injeçãointravenosa. Em outra modalidade preferida, o anticorpo é administrado porinjeção intramuscular ou subcutânea.

As composições terapêuticas tipicamente devem ser estéreis eestáveis sob as condições de fabricação e de armazenagem. A composição podeser formulada como uma solução, microemulsão, dispersão, lipossoma, oucomo outra estrutura regular adequada em alta concentração do medicamento.

As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas por incorporação docomposto ativo (isto é, o anticorpo ou a porção do anticorpo) na quantidaderequerida em um solvente apropriado com um ingrediente ou uma combinaçãode ingredientes, enumerados acima, conforme necessário, seguido poresterilização por filtragem. Em geral, as dispersões são preparadas porincorporação do composto ativo em um veículo estéril que contenha um meiobásico de dispersão e os outros ingredientes requeridos daqueles enumeradosacima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveisestéreis, os processos preferidos de preparação são a secagem a vácuo e asecagem por congelamento, que produz um pó do ingrediente ativo maisqualquer ingrediente adicional desejável de uma sua solução previamenteesterilizado por filtragem. A fluidez apropriada de uma solução pode sermantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pelamanutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão, e pelouso de tensoativos. A absorção prolongada de composições injetáveis pode serrealizada por inclusão na composição de um agente que retarde a absorção, porexemplo sais de monoestearato e gelatina.

Os anticorpos e as porções de anticorpos da presente invençãopodem ser administrados por uma variedade de processos conhecidos da arte,não obstante, para muitas aplicações terapêuticas, a via/modalidade preferidasde administração sejam a injeção intravenosa ou a infusão. Como seráobservado pelo técnico experiente, a via e/ou modalidade de administraçãovariará na dependência dos resultados desejados. Em certas modalidades, ocomposto ativo pode ser preparado com um portador que o proteja contra arápida liberação, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindoimplantes, emplastros transdérmicos e sistemas microencapsulados deliberação. Polímeros biodegradáveis e biocompatíveis podem ser usados, taiscomo acetato vinílico de etileno, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno,poliortoésteres e ácido polilático. Muitos processos para a preparação de taisformulações são patenteados ou em geral conhecidos daqueles experientesnesta ciência. Ver, por exemplo, Sustained and Contolled Release DrugDelivery Systems, J. R. Robinson, ed., Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, 1978.

Em certas modalidades, um anticorpo ou porção de anticorpoda invenção podem ser oralmente administrados, por exemplo com um diluenteinerte ou um portador assimilável pela alimentação. O composto (e outrosingredientes, se desejável) pode também ser incluído em uma cápsula degelatina de cobertura externa dura ou macia, comprimido em tabletes ouincorporado diretamente na dieta do indivíduo. Para administração oral, oscompostos podem ser incorporados com excipientes e usados na forma detabletes deglutíveis, tabletes bucais, pastilhas, cápsulas, elixires, suspensões,xaropes, hóstias, e outros. Para administrar um composto da invenção poradministração diferente da parenteral, pode ser necessário revesti-lo, ou co-administrá-lo, com um material para evitar sua inativação.

Os compostos suplementares ativos também podem serincorporados nas composições. Em certas modalidades, um anticorpo ouporção do anticorpo da invenção são co-formulados e/ou co-administrados comum ou mais agentes terapêuticos adicionais, que sejam úteis para tratar osdistúrbios em que a atividade do TNFa seja prejudicial. Por exemplo, umanticorpo ou porção de anticorpo da invenção, anti-hTNFa, podem ser co-formulados e/ou co-administrados com um ou mais anticorpos adicionais quese liguem a outros alvos (por exemplo, anticorpos que ligam outras citocinasou que ligam moléculas superficiais das células), uma ou mais citocinas,receptor de TNFa solúvel (ver, por exemplo, a Publicação PCT WO 94/06476)e/ou um ou mais agentes químicos que inibam a produção ou a atividade dohTNFa (tais como derivados de cicloexano-ilideno, como descrito naPublicação PCT WO 93/19751). Além do mais, um ou mais anticorpos dainvenção podem ser usados em combinação com dois ou mais dos agentesterapêuticos acima citados. Tais terapias de combinação pode vantajosamenteutilizar menores dosagens dos agentes terapêuticos administrados, assimevitando possíveis toxicidades ou complicações associadas com as váriasmonoterapias.

Exemplos não limitativos dos agentes terapêuticos para artritereumatóide, com os quais um anticorpo ou porção de anticorpo da invençãopodem ser combinados, incluem os seguintes: medicamento(s)antiinflamatório(s) não esteróide(s) (NSAIDs); medicamento(s) anti-inflamatório(s) supressivo(s) de citocina (CSAIDs); CDP-571/BAY-10-3356(anticorpo humanizado anti-TNFoc; Celltech/Bayer); cA2 (anticorpo quiméricoanti-TNFoc; Centocor); 75 kgTNFR-IgG (receptor TNF de 75 kD-proteína defusão IgG; Immunex; ver, por exemplo, Arthritis & Rheumatism (1994) Vol.37, S295; J. Invest. Med (1996) Vol. 44, 235A); 55 kdTNFR-IgG (receptorTNF de 55 kD-proteína de fusão IgG; Hoffinann-LaRoche); IDEC-CE9,1/SB210396 (anticorpo anti-CD4 primatizado não depletivo; IDEC/SmithKline; ver,por exemplo, Arthritis & Rheumatism (1995) Vol. 38, S185); DAB 486-IL-2e/ou DAB 389-IL-2 (proteínas de fusão IL-2; Seragen; ver, por exemplo,Arthritis & Rheumatism (1993) Vol. 36, 1223); Anti-Tac (anti-IL-2Rahumanizado; Laboratórios de Modelos de Proteínas/Roche); IL-4 (citocinaantiinflamatória; DNAX/Schering); IL-10 (SCH 52000; IL-10 recombinante,citocina antiinflamatória; DNAX/Schering); agonistas IL-4; IL-10 e/ou IL4(por exemplo, anticorpos agonistas); IL-IRA (antagonista receptor IL-1;Synergen/Amgen); TNF-bp/s-TNFR (proteína de ligação de TNF solúvel; ver,por exemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, N0 9 (suplemento),S284); Amer. J. PhysioL - Heart and Circulatory Physiology (1995) Vol. 268,pp. 37-42); R973401 (inibidor de fosfodiesterase tipo IV; ver, por exemplo,Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, Ns 9 (suplemento) S282); MK-966(Inibidor COX-2; ver, por exemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, N29 (suplemento) S81); Iloprost (ver, por exemplo, Arthritis & Rheumatism(1996) Vol. 39, Ns 9 (suplemento), S82); metotrexato; talidomida (ver, porexemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, N2 9 (suplemento), S282) emedicamentos relacionados com talidomida (por exemplo Celgen);leflunomida (antiinflamatório e inibidor de citocina; ver, por exemplo, Arthritis& Rheumatism (1996) Vol. 39, N2 9 (suplemento), S131; InflammationResearch (1996) Vol. 45, pp. 103-107); ácido tranexâmico (inibidor daativação plaminogênica; ver, por exemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol.39, Ns 9 (suplemento), S284); T-614 (inibidor de citocina; ver, por exemplo,Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, Ne 9 (suplemento, S282);prostaglandina El (ver, por exemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39,Ns 9 (suplemento), S282); Tenidap (medicamento antiinflamatório nãoesteróide; ver, por exemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, Ns 9(suplemento), S280); Naproxeno (medicamento antiinflamatório não esteróide;ver, por exemplo, Neuro Report (1996) Vol. 7, pp. 1209-1213); Meloxicam(medicamento antiinflamatório não esteróide); Ibuprofeno (medicamentoantiinflamatório não esteróide); Piroxicam (medicamento antiinflamatório nãoesteróide); Diclofenac (medicamento antiinflamatório não esteróide);Indometacina (medicamento antiinflamatório não esteróide); Sulfassalazina(ver, por exemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, Ns 9 (suplemento),S281); Azatioprina (ver, por exemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39,Ns 9 (suplemento), S281); inibidor ICE (inibidor da enzima de conversão daenzima interleucina-1-β); zap-70 e/ou inibidor Ick (inibidor da tirosina cinasezap-70 ou lck); inibidor VEGF e/ou inibidor VEGF-R (inibidor do fator decrescimento da célula endotelial vascular ou receptor do fator de crescimentoda célula endotelial vascular; inibidores de angiogênese); medicamentosantiinflamatórios corticosteróides (por exemplo, SB203580); inibidores TNF-convertase; anticorpos anti-IL-12; interleucina-11 (ver, por exemplo, Arthritis& Rheumatism (1996) Vol. 39, N- 9 (suplemento), S296); interleucina-13 (ver,por exemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, Ns 9 (suplemento),S308); inibidores de interleucina-17 (ver, por exemplo, Arthritis &Rheumatism (1996) Vol. 39, N2 9 (suplemento), S120); ouro; penicilamina;cloroquina; hidroxicloroquina; clorambucil; ciclofosfamida; cicloesporina;irradiação linfóide total; globulina anti-timócito; anticorpos anti-CD4; toxinasCD5; peptídeos e colágeno administrados oralmente; dissódio lobenzarit;Agentes de Regulação da Citocina (CRAs) HP228 e HP466 (HoughtenPharmaceuticals, Inc.); oligodeoxinucleotídeos de fosforotioato anti-sentidoICAM-I (ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals5 Inc.); receptor 1 de complementosolúvel (TP10; T Cell Sciences, Inc.); predinisona; orgoteína; polissulfato deglicosaminoglicano; minociclina; anticorpos anti-IL2R; lipídeos marinhos ebotânicos (ácidos graxos de peixes e de sementes de plantas; ver, por exemplo,DeLuca et al. (1995) Rheum. Dis. Clin. North Am. 21: 759-777); auranofina;fenilbutazona; ácido meclofenâmico; ácido flufenâmico; globulina imuneintravenosa; zileuton, ácido micofenólico (RS-61443); tacrolimus (FK-506);sirolimus (rapamicina); amiprilose (terafectina); cladribina (2-clorodeoxiadenosina); e azaribina.

Exemplos não limitativos de agentes terapêuticos para doençainflamatória do intestino, com os quais um anticorpo, ou porção do anticorpo,da invenção podem ser combinados, incluem os seguintes: budenosida; fator decrescimento epdérmico; corticosteróides; ciclosporina, sulfassalazina;aminosalicilatos; 6-mercaptopurina; azatioprina; metronidazol; inibidores delipoxigenase; mesalamina; olsalazina; balsalazida; antioxidantes; inibidores detromboxano; antagonistas receptores IL-1; anticoφos monoclonais anti-IL-1-β;3ηίΪ0θφθ8 monoclonais anti-IL-6; fatores de crescimento; inibidores deelastase; compostos de piridinil-imidazol; CDP-571/BAY-10-3356 (anticorpoanti-TNFa humanizado; Celltech/Bayer); cA2 ^ηύΰοφο quimérico anti-TNFa; Centocor); 75 kdTNFR-IgG (receptor TNF 75 kD-proteína de fusãoIgG; Immunex; ver por exemplo, Arthritis & Rheumatism (1994) Vol. 37,S295; J. Invest. Med. (1996) Vol. 44, 235A); 55 kdTNFR-IgG (receptor TNF55 kD-proteína de fusão IgG; Hoffmann-LaRoche); interleucina-10 (SCH52000; Schering Plough); agonistas IL-4; IL-10 e/ou IL-4 (por exemplo,anticorpos agonistas); interleucina-11; pró-medicamentos de prednisolona,dexametasona ou budesonida conjugados com glicuronídeo ou dextrana;oligodeoxinucleotídeos de fosforotioato antissentido ICAM-I (ISIS 2302; IsisPharmaceuticals, Inc.); receptor 1 de complemento solúvel (TP 10; T CellSciences, Inc.); mesalazina de liberação lenta; metotrexato; antagonistas doFator de Ativação de Plaquetas (PAF); ciprofloxacina; e lignocaína.

Exemplos não limitativos de agentes terapêuticos para esclerosemúltipla, com os quais um anticorpo, ou porção de anticorpos, da invençãopodem ser combinados, incluem os seguintes: çorticosteróides; prednisolona;metilprednisolona; azatioprina; ciclofosfamida; cicloesporina; metotrexato; 4-aminopiridina; tizanidina; interferon-β Ia (Avonex™; Biogen); interferon-β Ib(pseron ; Chiron/Berlex); copolímero 1 (Cop-1; Copaxone ; TevaPharmaceutical Industries, Inc.); oxigênio hiperbárico; imunoglobulinaintravenosa; clabribina; CDP-5 71/BAY-10-3356 (anticorpo anti-TNFahumanizado; Celltech/Bayer); cA2 (anticorpo quimérico anti-TNFa;Centocor); 75 kdTNFR-IgG (receptor TNF 75 kD-proteína de fusão IgG;Immunex; ver, por exemplo, Arthritis & Rheumatism (1994) Vol. 37, S295); J.Invest Med. (1996) Vol. 44, 235A); 55 kdTNFR-IgG (receptor TNF 55 kD-proteína de fusão IgG; Hoffmann-LaRoche); agonistas IL-10; IL-4; e IL-IOe/ou IL-4 (por exemplo, anticorpos agonistas).

Exemplos não limitativos de agentes terapêuticos para a sépsis,com os quais um anticorpo, ou porção de anticorpo, da invenção, podem sercombinados, incluem os seguintes: soluções salinas hipertônicas; antibióticos;gamaglobulina intravenosa; hemofiltração contínua; carbapenemas (porexemplo, meropenama); antagonistas de citocinas, tais como TNFa, IL-I-β,IL-6 e/ou IL-8; CDP-571/BAY-10-3356 (anticorpo anti-TNFa humanizado;Celltech/Bayer); cA2 (anticorpo quimérico anti-TNFa; Centocor); 75kdTNFR-IgG (receptor TNF 75 kD-proteína de fusão IgG; Immunex; ver, porexemplo, Arthritis & Rheumatism (1994) Vol. 37, S295); J. Invest. Med.(1996) Vol. 44, 235A); 55 kdTNFR-IgG (receptor TNF 55 kD-proteína defusão IgG; Hoffmann-LaRoche); Agentes de regulação da citocina (CRAs)HP228 e HP466 (Houghten Pharmaceuticals, Inc.); SK&F 107647 (peptídeo demolecular baixo; SmithKline Beecham); guanil-hidrazona CNI-1493 (PicowerInstitute); Inibidor da via do fator tecido (TFPI; Chiron); PHP (hemoglobinaquimicamente modificada; APEX Bioscience); quelantes e quelatos de ferro,incluindo o complexo ácido dietilenotriamina pentaacético - ferro (III) (DTPAferro (ΙΠ); Molichem Medicines); lisofilina (metilxantina sintética de moléculapequena; Cell Therapeutics5 Inc.); PGG-glicano (p-l,3-glicano; Alpha-βTechnology); apolipoproteína A-I reconstituída com lipídeos; ácidos quiraishidroxâmicos (antibacterianos sintéticos que inibem a biossíntese do lipídeoA); anticorpos anti-endotoxinas; E5531 (antagonista sintético do lipídeo A;Eisai America, Inc.); rBPI2i (fragmento recombinante N-terminal debactericida/proteína de aumento da permeabilidade humano); e peptídeossintéticos anti-endotoxinas (SAEP; BiosYnth Research Laboratories);

Exemplos não limitativos de agentes terapêuticos para asíndrome da angústia respiratória do adulto (ARDS), com os quais umanticorpo, ou porção de anticorpo, da invenção, podem ser combinados,incluem os seguintes: anticorpos anti-IL-8; terapia de substituição dotensoativo; CDP-571/BAY-10-33 56 (anticorpo anti-TNFa humanizado;Celltech/Bayer); cA2 (anticorpo quimérico anti-TNFa; Centocor); 75kdTNFR-IgG (receptor TNF 75 kD-proteína de fusão IgG; Immunex; ver, porexemplo, Arthritis & Rheumatism (1994) Vol. 37, S295); J. Invest. Med.(1996) Vol. 44, 235A); e 55 kdTNFR-IgG (receptor TNF 55 kD-proteína defusão IgG; Hoffmann-LaRoche).

O uso dos anticorpos, ou porções de anticorpos, da invenção,em combinação com outros agentes terapêuticos, ainda é discutido na subseçãoIV.

As composições farmacêuticas da invenção podem incluir uma"quantidade terapeuticamente eficaz" ou uma "quantidade profilaticamenteeficaz" de um anticorpo ou porção de anticorpo da invenção. Uma "quantidadeterapeuticamente eficaz" se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens e porperíodos de tempo necessários, para se obter o desejado resultado terapêutico.Uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou porção de anticorpopode variar de acordo com fatores tais como o estado da doença, a idade, osexo e o peso do indivíduo, e a capacidade do anticorpo ou porção de anticorpode eliciar uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidadeterapeuticamente eficaz também é aquela em que quaisquer efeitos tóxicos ouprejudiciais do anticorpo ou porção do anticorpo são excedidos em importânciapelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma "quantidade profilaticamenteeficaz" se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos detempo necessários, para se obter o desejado resultado profilático. Tipicamente,uma vez que uma dose profilática seja usada em indivíduos antes ou em umestagio precoce da doença, a quantidade profilaticamente eficaz será menor doque a quantidade terapeuticamente eficaz.

Os regimes de dosagem podem ser ajustados para prover aresposta ótima desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica ou profilática).Por exemplo, um bolo único pode ser administrado, várias doses divididaspodem ser administradas através do tempo ou a dose pode serproporcionalmente reduzida ou aumentada, conforme indicado pelasexigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formularcomposições parenterais na forma unitária de dosagem para facilidade deadministração e uniformidade da dosagem. A forma unitária de dosagem, comoaqui usada, se refere a unidades fisicamente discretas adequadas comodosagens unitárias para os indivíduos mamíferos a serem tratados, cadaunidade contendo uma quantidade predeterminada do composto ativocalculada para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com oportador farmacêutico requerido. A especificação quanto às formas unitárias dedosagem da invenção é ditada pelas, e diretamente dependente das (a)características únicas do composto ativo e do efeito específico terapêutico ouprofilático a ser obtido, e (b) limitações inerentes na arte para compor um talcomposto ativo para o tratamento da sensibilidade nos indivíduos.

Um exemplo de faixa não limitativa para uma quantidadeterapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um anticorpo ou porção deanticorpo da invenção, é de 0,1 a 20 mg/kg, mais preferivelmente de 1 a 10mg/kg. Deve-se observar que os valores da dosagem podem variar com o tipo egravidade das condições a serem aliviadas. Deve ficar ainda entendido que,para qualquer indivíduo particular, os regimes específicos de dosagem devemser ajustados através do tempo, de acordo com a necessidade individual e como julgamento profissional da pessoa que estiver administrando ousupervisionando a administração das composições, e que as faixas de dosagemaqui apresentadas são apenas exemplos, e não se pretende limitar o escopo ou aprática da composição reivindicada.

IV. Usos dos anticorpos da invenção

Dada sua capacidade para ligar-se a hTNFa, os anticorpos anti-hTNFa, ou suas porções, da invenção, podem ser usados para detectar hTNFa(por exemplo, em uma amostra biológica, tal como soro ou plasma), usando-seum imunoensaio convencional, tal como uma análise imunoabsorvente ligado àenzima (ELISA), uma radioimunoanálise (RIA) ou imunoistoquímica emtecidos. A invenção provê um processo para detectar hTNFa em uma amostrabiológica compreendendo colocar em contato uma amostra biológica com umanticorpo, ou porção de anticorpo, da invenção, e detectar, ou o anticorpo (ouporção de anticorpo) fixado a hTNFa, ou o anticorpo (ou porção de anticorpo)não fixado, para dessa forma detectar o hTNFa na amostra biológica. Oanticorpo é direta ou indiretamente rotulado com uma substância detectável,para facilitar a detecção ou o anticorpo fixado ou não fixado. Substânciasdetectáveis adequadas incluem várias enzimas, grupos prostéticos, materiaisfluorescentes, materiais luminescentes e materiais radioativos. Exemplos deenzimas adequadas incluem a peroxidase da raiz forte, a fosfatase alcalina, a β-galactosidase, ou a acetilcolinesterase; exemplos de complexos de gruposprostéticos adequados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina;exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem a umbeliferona, afluoresceína, o isotiocianato de fluoresceína, a rodamina, a fluoresceínadiclorotriazimlamina, o cloreto de dansil ou a ficoeritrina; um exemplo de ummaterial luminescente inclui o luminol; e exemplos de material radioativoadequado incluem 125I5131I5 35S ou 3H.

Alternativa para rotular o anticorpo, o hTNFa pode serensaiado em fluidos biológicos por um imunoensaio de competição, utilizandopadrões de rhTNFa rotulados com uma substância detectável e um anticorpoanti-hTNFa não rotulado. Neste ensaio, a amostra biológica, os padrões derhTNFa rotulados e o anticorpo anti-hTNFa são combinados e a quantidade depadrão rhTNFa rotulado fixada ao anticorpo não rotulado é determinada. Aquantidade de hTNFa na amostra biológica é inversamente proporcional àquantidade do padrão de rhTNFa rotulado fixado ao anticorpo anti-hTNFa.

Um anticorpo D2E7 da invenção também pode ser usado paradetectar TNFa's de outras espécies que não os seres humanos, em particularTNFa's de primatas (por exemplo chimpanzé, babuíno, sagüi, cynomolgus ereso), de porco e de camundongo, uma vez que o D2E7 pode ligar-se a cadaum destes TNFa's (ainda discutido no Exemplo 4, subseção E).

Os anticorpos e porções de anticorpos da invenção são capazesde neutralizar a atividade do hTNFa, tanto in vitro quanto in vivo (verExemplo 4). Além disso, pelo menos alguns dos anticorpos da invenção, taiscomo o D2E7, podem neutralizar a atividade do TNFa de outras espécies.Consequentemente, os anticorpos e porções de anticorpos da invenção podemser usados para inibir a atividade do TNFa, por exemplo em uma culturacelular contendo hTNFa, em indivíduos humanos ou em outros indivíduosmamíferos tendo TNFa's com os quais um anticorpo da invenção reaja porcruzamento (por exemplo chimpanzé, babuíno, sagüi, cynomolgus e reso, porcoou camundongo). Em uma modalidade, a invenção provê um processo parainibir a atividade do TNFa, compreendendo fazer contato do TNFa com umanticorpo ou porção de anticorpo da invenção, de modo tal que a atividade doTNFa seja inibida. De preferência, o TNFa é TNFa humano. Por exemplo, emuma cultura celular contendo, ou que se suspeite conter, hTNFa, um anticorpoou porção de anticorpo da invenção pode ser adicionado ao meio de cultura,para inibir a atividade do hTNFa na cultura.

Em outra modalidade, a invenção provê um processo para inibira atividade do TNFa em um indivíduo sofrendo de um distúrbio em que aatividade do TNFa seja prejudicial. O TNFa tem sido implicado nafisiopatologia de uma ampla variedade de distúrbios (ver, por exemplo,Moeller, A. et ai. (1990) Cytokine 2: 162-169; Patente U.S. 5.231.024 aMoeller et al.\ Publicação da Patente Européia 260 610 Bl por Moeller, Α.). Ainvenção provê processos quanto à atividade em um indivíduo sofrendo de umtal distúrbio, os quais compreendem a administração ao indivíduo de umanticorpo ou porção de anticorpo da invenção, de tal forma que a atividade doTNFa no indivíduo seja inibida. De preferência, o TNFa é TNFa humano, e oindivíduo é um ser humano. Alternativamente, o indivíduo pode ser ummamífero expressando um TNFa com o qual o anticorpo da invenção tenhareação cruzada. Ainda mais, o indivíduo pode ser um mamífero em que tenhasido introduzido hTNFa (por exemplo, por administração de hTNFa ou porexpressão de um transgene de hTNFa). Um anticorpo da invenção pode seradministrado a um ser humano com propósitos terapêuticos (ainda discutidoabaixo). Além disso, um anticorpo da invenção pode ser administrado a ummamífero não humano expressando um TNFa com o qual o anticorpo tenhareação cruzada (por exemplo, um primata, um porco ou um camundongo) parafinalidades veterinárias ou como um modelo animal de doença humana. Comreferência a este último, tais modelos animais podem ser utilizados paraavaliação da eficácia terapêutica dos anticorpos da invenção (por exemplo,teste de dosagens e cursos de tempo de administração).

Como aqui empregada, a expressão "um distúrbio em que aatividade do TNFa seja prejudicial" deve ser entendida incluindo doenças eoutros distúrbios em que a presença de TNFa5 em um indivíduo sofrendo dodistúrbio, se tenha apresentado, ou que se suspeite seja, ou o responsável pelafisiopatologia do distúrbio, ou um fator que contribua para uma piora dodistúrbio. Consequentemente, um distúrbio em que a atividade do TNFa sejaprejudicial, é um distúrbio em que a inibição da atividade do TNFa sejaesperada para aliviar os sintomas e/ou a progressão do distúrbio. Taisdistúrbios podem ser evidenciados, por exemplo, por um aumenta naconcentração de TNFa em um fluido biológico de um indivíduo sofrendo dodistúrbio (por exemplo, um aumento na concentração de TNFa no soro, noplasma, no fluido sinovial, etc. do indivíduo), que pode ser detectado, porexemplo, usando-se um anticorpo anti-TNFa, como descrito acima. Existemnumerosos exemplos de distúrbios em que a atividade do TNFa é prejudicial.O uso dos anticorpos e porções de anticorpo da invenção no tratamento dedistúrbios específicos, é discutido mais abaixo:

A. SÉPSIS

O fatos de necrose tumoral tem um papel estabelecido nafisiopatologia do sépsis, com efeitos biológicos que incluem a hipotensão, asupressão miocárdica, a síndrome do derrame vascular, a necrose de órgão,estímulo da liberação de mediadores tóxicos secundários e ativação da série decoagulação (ver, por exemplo, Moeller, A. et ai. (1990) Cytokine 2: 162-269;Patente U.S. 5.231.024 a Moeller et al.; Publicação da Patente Européia 260610 Bl por Moeller, A.; Tracey, K. J. e Cerami A. (1994) Annu. Rev. Med. 45:491-503; Russell, D. e Thompson, R. C. (1993) Curr. Opin. Biotech. 4: 714-721). Consequentemente, os anticorpos humanos, e as porções de anticorpos,da invenção, podem ser usados para tratar da sépsis em qualquer de seuscenários clínicos, incluindo o choque séptico, o choque endotóxico, a sépsisgram-negativa e a síndrome ü . soque tóxico.

Além disso, para tratar a sépsis, um anticorpo anti-hTNFa, ouporção do anticorpo, da invenção, podem ser co-administrados com um oumais agentes terapêuticos adicionais, que podem ainda aliviar a sépsis, talcomo um inibidor de interleucina-1 (como aquele descrito nas PublicaçõesPCT WO 92/16221 e WO 92/17583), a interleucina-6 de citocina (ver, porexemplo, a Publicação PCR WO 93/11793) ou um antagonista do fator deativação de plaquetas (ver, por exemplo, a Publicação do Pedido de PatenteEuropéia EP 374 510). Outras terapias de combinação para o tratamento dasépsis são discutidas ainda na subseção III.

Adicionalmente, em uma modalidade preferida, um anticorpoanti-TNFa ou porção de anticorpo da invenção, é administrada a um indivíduohumano dentro de um subgrupo de pacientes de sépsis, tendo umaconcentração de soro ou plasma de IL-6 acima de 500 pg/ml e, maispreferivelmente, 1000 pg/ml, no tempo do tratamento (ver Publicação PCTWO 95/20978 por Daum, L. et al).

B. DOENÇAS AUTOIMUNES

O fator de necrose tumoral tem sido implicado comodesempenhando um papel na fisiopatologia de uma variedade de doençasautoimune. Por exemplo, o TNTFa tem sido implicado na ativação dainflamação dos tecidos, causando a destruição das juntas em artrite reumatóide(ver, por exemplo, Moeller, A et al. (1990) Cytokine 2: 162-169; Patente U.S.5.231.024 para Moeller et al.·, Publicação da Patente Européia 260 610 Bl porMoeller, A.; Tracey e Cerami, acima; Arend, W. P. e Dayer, J-M. (1995) Arth.Rheum. 38: 151-160; Fava, R. A. et al. (1993) Clin. Exp. Immunol 94: 261-266). O TNFa também tem sido implicado na promoção da morte de célulasdas ilhotas e na mediação da resistência à insulina no diabete (ver, porexemplo, Tracey e Cerami, acima; Publicação PCT WO 94/08609). O TNFatambém tem sido implicado em mediar a citotoxicidade a oligodendrócitos eindução de placas inflamatórias em esclerose múltipla (ver, por exemplo,Tracey e Cerami, supra). Os anticorpos ãnti-hTNFa de murinos quiméricos ehumanizados, têm sido submetidos a teste clínico para tratamento da artritereumatóide (ver, por exemplo, Elliott5 M. J., et ai. (1994) Lancet 344: 1125-1127/ Elliot, M. J. et ai (1994) Lancet 344: 1105-1110; Rankin, E. C. et ai.(1995) Br. J. Rheumatol 34: 334-342).

Os anticorpos humanos, e as porções de anticorpos, dainvenção, podem ser usados para tratar de doenças autoimunes, em particularaqueles associadas com inflamação, incluindo a artrite reumatóide, aespondilite reumatóide, a osteoartrite e a artrite gotosa, a alergia, a esclerosemúltipla, o diabete autoimune, a uveíte autoimune e a sindrome nefrótica.Tipicamente, o anticorpo, ou porção do anticorpo, é administradosistematicamente, não obstante para certos distúrbios a administração local doanticorpo ou porção do anticorpo em um sítio de inflamação possa ser benéfica(por exemplo, a administração local nas juntas na artrite reumatóide ou aaplicação tópica em úlceras diabéticas, sozinha ou em combinação com umderivado ciclo-hexano-ilideno, como descrito na Publicação PCT WO93/19751). Um anticorpo, ou porção de anticorpo, da invenção também podemser administrados com um ou mais agentes terapêuticos adicionais úteis notratamento de doenças autoimunes, como ainda discutido na subseção III.

C. DOENÇAS INFECCIOSAS

O fator de necrose tumoral em sido implicado na mediação dosefeitos biológicos observados em uma variedade de doenças infecciosas. Porexemplo, o TNFa tem sido implicado em mediar a inflamação do cérebro e natrombose capilar e na infartação na malária. O TNFa também tem sidoimplicado em mediar a inflamação do cérebro, induzindo a colapso da barreirahematoencefálica, deflagrando a sindrome do choque séptico e ativando ainfartação venosa na meningite. O TNFa também tem sido implicado eminduzir a caquexia, estimulando a proliferação viral e mediando a lesão dosistema nervoso central na sindrome da imunodeficiência adquirida (AIDS).Consequentemente, os anticorpos, e as porções de anticorpos, da invenção,podem ser usados no tratamento de doenças infecciosas, incluindo a meningitebacteriana (ver, por exemplo, a Publicação do Pedido de Patente Européia EP585 705), a malária cerebral, a AIDS e o complexo relacionado com a AIDS(ARC) (ver, por exemplo, a Publicação do Pedido de Patente Européia EP 230574), bem como a infecção por citomegalovírus secundária a transplantes (ver,por exemplo, Fietze, E., et al. (1994) Transplantation 58: 675-680). Osanticorpos, e as porções de anticorpos, da invenção, também podem ser usadospara aliviar os sintomas associados com doenças infecciosas, incluindo a febree mialgias devidas a infecção (tais como a influenza) e caquexia secundária ainfecção (por exemplo, secundária a AIDS ou a ARC).

D. TRANSPLANTE

O fator de necrose tumoral tem sido implicado como ummediador chave da rejeição de aloenxerto e enxerto versus doença hospedeira(GVHD), e em mediar uma reação adversa que foi observado quando oanticorpo OKT3 de rato, dirigido contra o complexo CD3 receptor celular T,foi usado para inibir a rejeição de transplantes renais (ver, por exemplo, Eason,J. D., et al. (1995) Transplantation 59: 300-305; Suthanthiran, M. e Strom, T.B. (1994) New Engl. J. Med. 331: 365-375). Em conseqüência, os anticorpos, eas porções de anticorpos, da invenção, podem ser usados para inibir a rejeiçãode transplantes, incluindo rejeições de aloenxertos e xenoenxertos, e para inibirGVHD. Embora o anticorpo ou porção de anticorpo possam ser usadossozinhos, mais preferivelmente ele é usado em combinação com um ou mais deoutros agentes que inibem a resposta imune contra o aloenxerto ou inibemGVHD. Por exemplo, em uma modalidade, um anticorpo ou porção deanticorpo da invenção são usados em combinação com OKT3 para inibir asreações induzidas por OKT3. Em outra modalidade, um anticorpo ou porção deanticoipo da invenção são usados em combinação com um ou mais anticorposdirecionados a outros alvos envolvidos em regular as respostas imune, taiscomo as moléculas CD25 de superfície celular (receptor-α interleucina-2),CDlla (LFA-1), CD54 (ICAM-1), CD4, CD45, CD28/CTLA4, CD80/(B7-1)e/ou CD86 (B7-2). Em outra modalidade ainda, um anticorpo ou porção deanticorpo da invenção são ousados em combinação com um ou mais agentesimunossupressivos gerais, tais como ciclosporina A ou FK506.

E. MALIGNIDADE

O fator de necrose tumoral tem sido implicado em induzir acaquexia, estimulando o crescimento tumoral, intensificando o potencialmetastático e mediando a citotoxicidade nas malignidades. Em conseqüência,os anticorpos, e porções de anticorpo, da invenção, podem ser usados notratamento de malignidades, para inibir o crescimento tumoral ou a metástasee/ou para aliviar a caquexia secundária à malignidade. O anticorpo, ou porçãode anticorpo, pode ser administrado sistêmica ou localmente ao sítio do tumor.

F. DISTÚRBIOS PULMONARES

O fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologiada síndrome da angústia respiratória do adulto (ARDS), incluindo o estímuloda ativação de leucócitos endoteliais, dirigindo a citotoxicidade a pneumócitose induzindo à síndrome do derrame vascular. Consequentemente, osanticorpos, e as porções de anticorpos, da invenção, podem ser usados paratratar de vários distúrbios pulmonares, incluindo a síndrome da angústiarespiratória do adulto (ver, por exemplo, a Publicação PCT WO 91/04054),pulmão de choque, doença inflamatória pulmonar crônica, sarcoidosepulmonar, fibrose e silicose pulmonares. O anticorpo, ou porção de anticorpo,pode ser administrado sistêmica ou localmente à superfície dos pulmões, porexemplo como um aerossol. Um anticorpo, ou porção do anticorpo, dainvenção, também pode ser administrado com um ou mais agentes terapêuticosadicionais úteis no tratamento de distúrbios pulmonares, como ainda discutidona subseção III.

G. DISTÚRBIOS INTESTINAIS

O fator da necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologiade distúrbios inflamatórios dos intestinos (ver, por exemplo, Tracy, K. J. et al.(1986) Science 234: 470-474; Sun, X-M. et al. (1988) J. Clin. Invest. 81: 1328-1331; MacDonald, Τ. T. et al. (1990) Clin. Exp. Immunol 81: 301-305). Osanticorpos quiméricos anti-hTNFa de murinos têm sido submetidos a testesclínicos para tratamento da doença de Crohn (van Dull emen, Η. M. et al.(1995) Gastroenterology 109: 129-135). Os anticorpos humanos, e porções deanticorpos, da invenção, também podem ser usados para tratar distúrbiosintestinais, tais como doença idiopática inflamatória dos intestinos, que incluiduas síndromes, a doença de Crohn e a colite ulcerativa. Um anticorpo, ouporção de anticorpo, da invenção, também pode ser administrado com um oumais agentes terapêuticos adicionais úteis no tratamento de distúrbiosintestinais, como examinado ainda na subseção III.

H. DISTÚRBIOS CARDÍACOS

Os anticorpos, e porções de anticorpos, da invenção, tambémpodem ser usados para tratar vários distúrbios cardíacos, incluindo a isquemiado coração (ver, por exemplo, a Publicação do Pedido de Patente Européia EP453 898) e a insuficiência cardíaca (fraqueza do músculo cardíaco) (ver, porexemplo, a Publicação PCT WO 94/20139).

I. OUTROS

Os anticorpos, e as porções de anticorpos, da invenção, tambémpodem ser usados para tratar de vários outros distúrbios, em que a atividade doTNFa é prejudicial. Exemplos de outras doenças e distúrbios, em que aatividade do TNFa tem sido implicada na fisiopatologia, e que deste modopodem ser tratadas usando-se um anticorpo, ou porção de anticorpo, dainvenção, incluem os distúrbios inflamatórios dos ossos e a doença dereabsorção óssea (ver, por exemplo, Bertolini, D. R. et al. (1986) Nature 319:516-518; Konig, A. et al. (1988)/. BoneMiner. Res. 3: 621-627; Lerner, U. H.e Ohlin, A. (1993) J. BoneMiner. Res. 8: 147-155; e Shankar, G. e Stern, Ρ. H.(1993) Bone 14: 871-876), hepatite, incluindo hepatite alcoólica (ver, porexemplo, McClain, C. J. e Cohen, D. A. (1989) Hepatology 9: 349-351; Felver,Μ. Ε. et al (1990) Alcohol. Clin. Εχρ. Res. 14: 255-259; e Hansen5 J. et al(1994) Hepatology 20: 461-474), hepatite viral (Sheron5 N. et al. (1991) J.Hepatol 12: 241-245; e Hussain5 M. J. et al. (1994)/. Clin. Pathol 47: 1112-1115), e hepatite fulminante; distúrbios de coagulação (ver, por exemplo, vander Poli, T. et al (1990) N. Engl J. Med. 322: 1622-1627; e van der Poli, T. etal (1991) Prog. Clin. Biol. Res. 367: 55-60), queimaduras (ver, por exemplo,Giroir5 Β. P. et al (1994) Am. J. Physiol. 267: Hl 18-124; e Liu5 X. S. et al(1994) Burns 20: 40-44), lesão por reperfusão (ver, por exemplo, Scales, W. E.et al (1994) Am. J. Physiol. 267: Gl 122-1127; Serrick, C. et al (1994)Transplantation 58: 1158-1162; e Yao, Υ. M. et al (1995) Resuscitation 29:157-168), formação de quelóides (ver, por exemplo, McCauley, R. L. et al.(1992) J. Clin. Immunol 12: 300-308), formação do tecido de cicatrizes;pirexia; doença periodontal; obesidade e toxicidade da radiação.

Esta invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos, quenão devem ser interpretados como limitativos. Os conteúdos de todas asreferências, patentes e pedidos de patentes publicados citados na totalidadedeste relatório descritivo, são aqui incorporados por referência.

EXEMPLO 1: ANÁLISE CINÉTICA DA LIGAÇÃO DE ANTICORPOSHUMANOSAhTNFa

A interações de ligação de tempo real entre o ligando (TNFarecombinante biotinilado humano (rhTNFa) imobilizado em uma matrizbiossensora) e o analisado (anticorpos em solução), foram medidas porressonância de plásmon superficial (SPR), usando-se o sistema BIAcore(Pharmacia Biosensor5 Piscataway, NJ). O sistema utiliza as propriedadesóticas do SPR para detectar alterações em concentrações proteínicas dentro deuma matriz biossensora de dextrana. As proteínas são covalentemente fixadas àmatriz de dextrana, em concentrações conhecidas. Os anticorpos são injetadosatravés da matriz de dextrana, e a ligação específica entre os anticorposinjetados e ligando imobilizado, resulta em uma concentração proteínica damatriz aumentada e na modificação resultante no sinal da SPR. Estasmodificações no sinal da SPR são registradas como unidades de ressonância(RU) e são apresentadas com respeito a tempo ao longo do eixo dos y de umsensorgrama.

Para facilitar a imobilização do rhTNFa biotinilado na matrizbiossensora, a estreptavidina é covalentemente ligada através de grupos deamina livre à matriz de dextrana, mediante primeiramente ativação dos gruposcarboxílicos na matriz com N-hidroxissuccinimida (NHS) 100 mM e cloridretode N-etil-N'-(3-dietilaminopropil) carbodiimida (EDC). A seguir, aestreptavidina é injetada através da matriz ativada. Trinta e cinco microlitros deestreptavidina (25 μg/ml), diluídos em acetato de sódio, pH 4,5, são injetadosatravés do biossensor ativado e as aminas livres na proteína são fixadasdiretamente aos grupos carboxílicos ativados. Os ésteres EDC da matriz nãoreacionada são desativados por uma injeção de etanolamina 1 M. Pedaços dobiossensor acoplados à estreptavidina também são comercialmente disponíveis(Pharmacia BR-1000-16, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ).

O rhTNF biotinilado foi preparado primeiramente dissolvendo-se 5,0 mg de éster N-hidroxissuccinimida de ácido (D-biotinil-e-aminocapróicode biotina; Boehringer Mannheim Cat. 1008 960) em 500 μΐ dedimetilsulfóxido, para produzir 10 mg/ml de uma solução. Dez microlitros debiotina foram adicionados por mililitro de rhTNFa (em 2,65 mg/ml), para umarelação molar de biotina para rhTNFa de 2:1. A reação foi misturadabrandamente e incubada por duas horas em temperatura ambiente no escuro.Uma coluna PD-10, Sephadex G-25M (Pharmacia Catálogo 17-0851-01) foiequilibrada com 25 ml de PBS frio e carregada com 2 ml de rhTNFa-biotinapor coluna. A coluna foi eluída com 10 χ 1 ml de PBS frio. As frações foramcoletadas e interpretadas em OD280 (1,0 OD = 1,25 mg/ml). As fraçõesapropriadas foram reunidas e armazenadas a -80°C até o uso. O rhTNFabiotinilado também é comercialmente disponível (R & D Systems, CatálogoFTAOO5 Minneapolis5 MN).

O rhTNFa biotinilado a ser imobilizado na matriz através daestreptavidina foi diluído em tampão fluente de PBS (Gibco Cat. 14190-144,Gibco BRL5 Grand Island5 NY), suplementado com tensoativo P20 0,05%(BIAcore) (Pharmacia BR-1000-54, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ).Para determinar a capacidade dos anticorpos específicos do rhTNFa, de seligarem a rhTNFa imobilizado, um ensaio de ligação foi conduzido comosegue. Alíquotas de rhTNFa biotinilado (25 nM; alíquotas de 10 μΐ) foraminjetadas através da matriz de dextrana acoplada com estreptavidina em umíndice de fluxo de 5 μΐ/min. Antes da injeção da proteína e imediatamenteapós, o tampão de PBS sozinho fluiu através de cada célula de fluxo. Adiferença líquida no sinal entre a linha de base e aproximadamente 30segundos após a conclusão da injeção de rhTNFa biotinilado foi tomada pararepresentar o valor da ligação (aproximadamente 500 RU). A ligação direta doanticorpo específico para rhTNFa, para o rhTNFa biotinilado imobilizado, foimedida. Os anticorpos (20 μπι/ml) foram diluídos em tampão fluente de PBS e25 μl de alíquotas, foram injetados através das matrizes de proteínaimobilizadas em um índice de fluxo de 5 μΙ/minuto. Antes da injeção doanticorpo, e imediatamente após, o tampão de PBS sozinho fluiu através decada célula de fluxo. A diferença líquida em sinal da linha de base e o sinalapós a conclusão da injeção do anticorpo foi tomada para representar o valor daligação da amostra particular. As matrizes biossensoras foram regeneradasusando-se HCl 100 mM antes da injeção da amostra seguinte. Para determinaras constantes do índice de dissociação (Kofr), sobre o índice (Kon), índice deassociação (Ka) e o índice de dissociação (Kd), foi usado o software (versão2.1) de avaliação cinética BIAcore.

Os resultados representativos da ligação do D2E7 (anticorpo decomprimento completo IgG4) ao rhTNFa biotinilado, em comparação com oMAK 195 mAb de camundongos (fragmento F(ab')2), são apresentados abaixona Tabela 1.

TABELA 1: LIGAÇÃO DO IgG4 OU MAK 195 DO D2E7 AO rhTNFa

BIOTINILADO

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Em uma segunda série de experiências, as interações cinéticasmoleculares entre uma forma de comprimento completo de IgGl do D2E7 e orhTNF biotinilado, foram quantitativamente analisadas usando-se a tecnologiaBIAcore, como descrita acima, e as constantes dos índices cinéticos foramderivadas, resumidas abaixo nas Tabelas 2, 3 e 4.

TABELA 2: CONSTANTES DO ÍNDICE DE DISSOCIAÇÃO APARENTEDA INTERAÇÃO ENTRE O D2E7 E O rhTNF BIOTINILADO

<table>table see original document page 64</column></row><table>TABELA 3: CONSTANTES DO ÍNDICE DE ASSOCIAÇÃO APARENTEDA INTERAÇÃO ENTRE D2E7 E O rhTNF BIOTINILADO

<table>table see original document page 65</column></row><table>

TABELA 4: ÍNDICE CINÉTICO APARENTE E CONSTANTES DEAFINIDADE DE D2E7 E rhTNF BIOTINILADO

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As constantes dos índices de dissociação e de associação foramcalculadas mediante análise das regiões de dissociação e de associação dossensorgramas por software de análise ΒΙΑ. As cinéticas de reação químicaconvencional foram admitidas para a interação entre D2E7 e a molécula derhTNF biotinilado: cinéticas de uma dissociação de ordem zero e umaassociação de primeira ordem. Por causa da análise, a interação apenas entreum braço do anticorpo bivalente D2E7 e uma unidade do rhTNF biotiniladotrimérico, foi considerada na escolha dos modelos moleculares para a análisedos dados cinéticos. Três experiências independentes foram realizadas e osresultados foram analisados separadamente. A constante (Icd) média do índicede dissociação aparente da interação entre D2E7 e o rhTNF biotinilado, foi de8,81 + 1,06 χ IO"5 s"1, e a constante ka média do índice de associação aparentefoi de 1,91 + 1,26 χ IO5 M"1 s'\ A constante (Kd) de dissociação intrínsecaaparente foi então calculada pela fórmula: Kd = IcdZka. Assim, a média Kd doanticorpo D2E7 para rhTNF derivada dos parâmetros cinéticos, foi de 6,09 ±3,42 χ IO"10 M. Diferenças secundárias nos valores cinéticos para a forma IgGlde D2E7 (apresentados nas Tabelas 2, 3 e 4) e a forma IgG4 do D2E7(apresentada na Tabela 1 e nos Exemplos 2 e 3), não são consideradas comosendo diferenças verdadeiras resultantes da presença, de regiões constantes, oude um IgGl5 ou de um IgG4, mas, ao invés, são consideradas como sendoatribuíveis a medições de concentração de anticorpos mais acuradas, usadaspara a análise cinética do IgGl. Consequentemente, os valores cinéticos para aforma IgGl do D2E7 aqui apresentado, são considerados como sendo osparâmetros cinéticos mais precisos para o anticorpo D2E7.

EXEMPLO 2: MUTAGÊNESE DE CINTILOGRAFIA DA ALANINA DOSDOMÍNIOS CDR3 DE D2E7

Uma série de mutações únicas de alanina foi introduzida porprocessos padrão juntamente com o domínio CDR3 das regiões VL D2E7 eVH D2E7. As mutações de cadeia leve são ilustradas na Figura IB(LD2E7*.A1, LD2E7*.A3, LD2E7*.A4, LD2E7*.A5, LD2E7*.A7 eLD2E7*.A8, tendo uma mutação de alanina nas posições 1, 3, 4, 5, 7 ou 8,respectivamente, do domínio CDR3 VL D2E7). As mutações de cadeia pesadasão ilustradas na Figura 2B (HD2E7*.A1, HD2E7*.A2, HD2E7*.A3,HD2E7*.A4, HD2E7*.A5, HD2E7*.A6, HD2E7*.A7, HD2E7*.A8 eHD2E7*.A9, tendo uma mutação de alanina nas posições 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10ou 11, respectivamente, do domínio CDR3 VH D2E7). As cinéticas deinteração de rhTNFa com um anticorpo composto de VL e VH D2E7 do tiposelvagem, foram comparadas àquelas dos anticorpos compostos de 1) um VLD2E7 do tipo selvagem unido com um VH D2E7 substituído por alanina; 2)um VH D2E7 do tipo selvagem unido com um VL D2E7 substituído poralanina; ou 3) um VL D2E7 substituído por alanina unido com um VH D2E7substituído por alanina. Todos os anticorpos foram testados como moléculasIgG4 de comprimento completo.

A cinética de interação dos anticorpos com rhTNF foideterminada por ressonância de plásmon superficial, como descrito noExemplo 1. Os índices Koff quanto aos diferentes pares VtWL acham-seresumidos abaixo na Tabela 5:TABELA 5: LIGAÇÃO DE MUTANTES DE CINTILOGRAFIA DEALANINA DE D2E7, A rhTNFoc BIOTINILADO

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Estes resultados demonstram que a maioria das posições dosdomínios CDR3 da região VL e região VH de D2E7, são sensíveis asubstituição por um resíduo único de alanina. A substituição de uma únicaalanina nas posições 1, 4, 5 ou 7 do domínio CDR3 VL D2E7, ou nas posições2, 5, 6, 8, 9 ou 10 do domínio CDR3 VH C2C7, não afeta significativamente oíndice de dissociação da ligação de hTNFa, em comparação com o anticorpoparenteral D2E7 do tipo selvagem. A substituição de alanina na posição 8 doCDR3 VL D2E7, ou na posição 3 do CDR3 VH D2E7, dá um Koff quatro vezesmais rápido, e uma substituição de alanina nas posições 4 ou 11 de CDR3 VHD2E7, dá um Kofr 8 vezes mais rápido, indicando que estas posições são maiscríticas para ligação ao hTNFa. No entanto, uma substituição de alanina únicanas posições 1, 4, 5, 7 ou 8 do domínio CDR3 VL D2E7, ou nas posições 2, 3,4, 5, 6, 8, 9, 10 ou 11 do domínio CDR3 VH D2E7 ainda resulta em umanticorpo anti-hTNFa tendo um Koff de 1x10" seg" ou menos.

EXEMPLO 3: ANÁLISE DE LIGAÇÃO DOS ANTICORPOSRELACIONADOS A D2E7

Uma série de anticorpos relacionados na seqüência a D2E7 foianalisada quanto à sua ligação a rhTNFoc, em comparação com o D2E7,mediante ressonância de plásmon superficial, conforme descrito no Exemplo 1.As seqüências de aminoácidos das regiões VL analisadas são mostradas nasFiguras IA e 1B. As seqüências de aminoácidos das regiões VH analisadas sãomostradas nas Figuras 2A e 2B. Os índices KoffPara os vários pares de VH/VL(no formato indicado, quer como um anticorpo IgGl de comprimentocompleto, ou como um IgG4, ou como um scFv), acham-se resumidos abaixona Tabela 6:TABELA 6: LIGAÇÃO DE ANTICORPOS RELACIONADOS AO D2E7, ArhTNFoc BIOTINILADO

<table>table see original document page 69</column></row><table>

Os índices de dissociação lenta (isto é, Kofr^ 1 χ IO"4 seg"1) paraos anticorpos de comprimento completo (isto é, formato IgG), tendo um VLselecionado de D2E7, LOE7, LOE7.T e LOE7.A, que têm, ou uma treonina, ouuma alanina na posição 9, indicam que a posição 9 do CDR3 VL D2E7 podeser ocupada por qualquer um destes dois resíduos sem substancialmente afetaro Koff. Em conseqüência, um motivo de consenso para o CDR3 VL D2E7compreende a seqüência de aminoácidos: Q-R-Y-N-R-A-P-Y-(T/A) (SEQ IDNO: 3). Além do mais, os índices de dissociação lenta (isto é, Koff < 1 χ IO"4seg"1) para anticorpos tendo um VH selecionado de D2E7, VH1-D2.N e VHl-D2.Y, que têm, ou uma tirosina, ou uma asparagina, na posição 12, indicamque a posição 12 do CDR3 VH D2E7 pode ser ocupada por qualquer um destesdois resíduos, sem substancialmente afetar o Koff. Consequentemente, ummotivo de consenso para o CDR3 VH D2E7 compreende a seqüência deaminoácidos: V-S-Y-L-S-T-A-S-S-L-D-(Y/N) (SEQ ID NO: 4).

Os resultados apresentados na Tabela 6 demonstram que, noformato ScFv, os anticorpos contendo a região CDR3 VL ou VH do 2SD4,apresentam um Koff mais rápido (isto é, Koff > 1 χ IO"3 seg"1) em comparaçãocom os anticorpos contendo a região CDR3 VL ou VH de D2E7. Dentro doCDR3 VL, o 2SD4 difere do D2E7 nas posições 2, 5 e 9. Conforme discutidoacima, no entanto, a posição 9 pode ser ocupada por Ala (como em 2SD4) ouThr (como em D2E7), sem substancialmente efetar o Koff. Assim, porcomparação de 2SD4 e D2E7, as posições 2 e 5 do CDR3 VL D2E7, ambasargininas, podem ser identificadas como sendo críticas para a associação doanticorpo com o hTNFa. Estes resíduos podem ser diretamente envolvidoscomo resíduos de contato no sítio de ligação do anticorpo, ou podem contribuircriticamente para manter a arquitetura de andaime da molécula do anticorponesta região. Relativamente à importância da posição 2, a substituição de Arg(em LOE7, que tem o mesmo CDR3 VL que o D2E7) por Lys (em EP B12),acelera o índice de dissociação mediante um fator de dois. Com respeito àimportância da posição 5, a substituição de Arg (em D2E7) por Ala (emLD2E7*.A5), como descrito no Exemplo 2, também acelera o índice dedissociação por duas vezes. Além disso, sem qualquer Arg nas posições 2 e 5(em 2SD4), o índice de dissociação é cinco vezes mais rápido. No entanto,deve ser observado que, não obstante a posição 5 seja importante para melhorara ligação a hTNFa, uma modificação nesta posição pode ser anulada pormodificações em outras posições, como observado em VLLOE4, VLLOHl ouVLO5IH8.

Dentro do CDR3 VH, o 2SD4 difere do D2E7 nas posições 1, 7e 12. Como examinado acima, no entanto, a posição 12 pode ser ocupada porAsn (como em 2SD4) ou Tyr (como em D2E7), sem afetar substancialmente oKoff. Assim, por comparação do 2SD4 com o D2E7, as posições 1 e 7 do CDR3VH D2E7 podem ser identificadas como sendo críticas quanto à ligação aohTNFa. Como examinado acima, estes resíduos podem ser diretamenteenvolvidos como resíduos de contato no sítio de ligação do anticorpo, oupodem contribuir criticamente para manter a arquitetura de andaime damolécula do anticorpo nesta região. Ambas as posições são importantes paraligação ao hTNFa, uma vez que, quando o CDR3 VH 3C-H2 (que tem umamodificação de valina para alanina na posição 1, com respeito ao CDR3 VHD2E7) é usado, o scFv tem um índice 3 vezes mais rápido de dissociação, doque quando o CDR3 VH D2E7 é usado, mas este índice de dissociação ainda équatro vezes mais lento do que quando o CDR3 VH 2SD4 é usado (o qual temmodificações em ambas as posições 1 e 7, em relação ao CDR3 VH D2E7).

EXEMPLO 4: ATIVIDADE FUNCIONAL DO D2E7

Para examinar a atividade funcional do D2E7, o anticorpo foiusado em vários ensaios, que mediram a capacidade do anticorpo de inibir aatividade do hTNFa, quer in vitro, quer in vivo.

A. NEUTRALIZAÇÃO DA CITOTOXICIDADE INDUZIDA POR TNFaEM CÉLULAS L929

O TNFa recombinante humano (rhTNFa) provoca acitotoxicidade celular em células L929 de murinos após um período deincubação de 18 a 24 horas. Os anticorpos humanos anti-hTNFa foramavaliados em ensaios L929 por co-incubação de anticorpos com rhTNFa e ascélulas, como segue. Uma placa de microtitulação de 96 reservatórios,contendo 100 μl de Abs anti-hTNFa, foi diluída em série 1/3 colocado naplaca em duplicatas usando-se o meio RPMI contendo 10% de soro bovinofetal (FBS). Cinqüenta microlitros de rhTNFa foram adicionados para umaconcentração final de 500 pg/ml em cada reservatório de amostras. As placasforam então incubadas por 30 minutos em temperatura ambiente. A seguir, 50μl de células de fibroblastos L929 de camundongos sensíveis a TNFa foramadicionadas, para uma concentração final de 5 χ IO4 células por reservatório,incluindo 1 μg/ml de Actinomicina-D. Os controles incluíam o meio mais ascélulas e o rhTNFa mais as células. Estes controles, e uma curva padrão deTNFa, variando de 2 ng/ml a 8,2 pg/ml, foram usados para determinar aqualidade do ensaio e prover uma janela de neutralização. As placas foramentão incubadas durante a noite (18 a 24 horas) a 37°C em CO2 5%.

Cem microlitros de meio foram removidos de cada reservatório,e foram adicionados 50 μΐ de 5 mg/ml de brometo de 3(4,4-dimetiltiazol-2-il)2,5-difenil tetrazólio (MTT; comercialmente disponível da Sigma ChemicalCo., St. Louis, MO) em PBS. As placas foram então incubadas por 4 horas a37°C. Cinqüenta microlitros de sulfato dodecílico de sódio 20% (SDS) foramentão adicionados a cada reservatório, e as placas foram incubadas durante anoite a 37°C. A densidade ótica em 570/630 nm foi medida, as curvas foramrepresentadas graficamente para cada amostra e os IC50 foram determinados porprocessos padrão.

Os resultados representativos para os anticorpos humanos tendovários pares VL e VH, em comparação com o mAb MAK 195 de murinos, sãoapresentados na Figura 3 e na Tabela 7 abaixo.

TABELA 7: NEUTRALIZAÇÃO DA CITOXICIDADE L929 INDUZIDAPOR TNFa<table>table see original document page 73</column></row><table>

Os resultados da Figura 3 e da Tabela 7 demonstram que oanticorpo anti-hTNFa humano D2E7, e os vários anticorpos relacionados aD2E7, neutralizam a citotoxicidade L929 induzida por TNFa com umacapacidade aproximadamente equivalente àquela do mAb MAK 195 anti-hTNFa de murinos.

Em outra série de experiências, a capacidade da forma do IgG 1de D2E7 para neutralizar a citotoxicidade L929 induzida por TNFa foiexaminada como descrito acima. Os resultados das três experiênciasindependentes, e a sua média, estão resumidos abaixo na Tabela 8:

TABELA 8: NEUTRALIZAÇÃO DA CITOTOXICIDADE L929 INDUZIDAPOR TNFa, POR IgG 1 D2E7

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Esta série de experiências confirmou que D2E7, na forma IgGlde comprimento completo, neutraliza a citotoxicidade L929 induzida porTNFa, com um IC50 médio [M] de 1,25 ± 0,01 χ IO"10.Β. INIBICÂO DA LIGAÇÃO DO TNFa A RECEPTORES DE TNFa EMCÉLULAS U-937

A capacidade dos anticorpos anti-hTNFa humanos, de inibir aligação de hTNFa aos receptores de hTNFa na superfície de células, foiexaminada usando-se a linhagem celular U-937 (ATCC n2 CRL 1593), umalinhagem celular histiocítica humana que expressa os receptores de hTNFa. Ascélulas U-937 foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com sorobovino fetal 10% (Hyclone A-1111, Hyclone Laboratories, Logan, UT),glutamina-L (4 nM), solução tampão HEPES (10 mM), penicilina (100 μg/ml)e estreptomicina (100 μg/ml). Para examinar a atividade de anticorpos IgG decomprimento completo, as células U0937 foram pré-incubadas com PBSsuplementado com 1 mg/ml de IgG humano (Sigma 1-4506, Sigma ChemicalCo., St. Louis, MO) durante 45 minutos sobre gelo, e depois as células foramlavadas por três vezes com tampão de ligação. Quanto ao ensaio de ligação doreceptor, as células U-937 (5 χ IO6 células/reservatório) foram incubadas emum tampão de ligação (PBS suplementado com albumina de soro bovino 0,2%)em placas de microtitulação de 95 reservatórios (Costar 3799, Costar Corp.,Cambridge, MA), juntamente com rhTNFa rotulado 125I (3 χ IO"10 Μ; 25μΟί/ηύ; obtido da NEN Research Products, Wilmington, DE), com ou semanticorpos anti-hTNFa, em um volume total de 0,2 ml. As placas foramincubadas sobre gelo por 1,5 horas. Depois, 75 μΐ de cada amostra foramtransferidos para tubos de teste de 1,0 ml (Sarstedt 72.700, Sarstedt Corp.,Princeton, NJ) contendo dibutilftalato (Sigma D-2270, Sigma Chemical Co.,St. Louis, MO) e dinonilftalato (ICN 210733, ICN, Irvine, CA). Os tubos deteste continham 300 μΐ de uma mistura de dibutilftalato e dinonilftalato,relação em volume de 2:1, respectivamente. O rhTNFa livre (isto é, nãofixado) rotulado I foi removido por microcentrifugação durante cincominutos. Depois, a extremidade de cada tubo de teste contendo uma pelotacelular foi cortada com o auxílio de uma tesoura de microtubo (Bel-Art210180001, Bel-Art Products, Pequannock5 NJ). A pelota celular contémrhTNFa rotulado 125I fixado ao receptor de TNFa p60 ou p80, enquanto a faseaquosa acima da mistura de óleo contém excedente de rhTNFa livre rotulado125I. Todas as pelotas celulares foram coletadas em um tubo de contagem(Falcon 2052, Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ), e contadas emum contador de cintilação.

Os resultados representativos são apresentados na Figura 4. Ovalor do IC50 quanto à inibição D2E7 da ligação do hTNFa aos receptoreshTNFa nas células U-937, é aproximadamente de 3 χ IO"10 M nestasexperiências. Estes resultados demonstram que o anticorpo anti-hTNFahumano D2E7 inibe a ligação do rhTNFa aos receptores de hTNFa nas célulasU-937 em concentrações aproximadamente equivalentes àquelas do mAbMAK 195 de anti-hTNFa de murinos.

Em outra série de experiências, a capacidade da forma IgGl deD2E7 para inibir a ligação de rhTNFa a receptores hTNFa em células U-937,foi examinada como descrito acima. Os resultados das três experiênciasindependentes, e a sua média, acham-se resumidos abaixo na Tabela 9:

TABELA 9: INIBIÇÃO DA LIGAÇÃO DO RECEPTOR DE TNF EMCÉLULAS U-937 POR IgGl DE D2E7

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Esta série de experiências confirmou que o D2E7, na formaIgGl de comprimento completo, inibe a ligação do receptor TNF em células U-937, comum IC50médio [M] de 1,56 ± 0,12 χ IO"10.

Para pesquisar a potência inibitória de D2E7 na ligação de I-rhTNF ligando aos receptores individuais p55 e p75, um radioimunoensaio defase sólida foi realizado. Para medir os valores de IC50 de D2E7 para receptoresde TNF separados, concentrações variáveis do anticorpo foram incubadas comconcentração de 3 χ ΙΟ-10 de 125I-rhTNF. A mistura foi então ensaiada emplacas separadas contendo, ou os receptores p55, ou os receptores p75 em umamaneira dependente da dose. Os resultados acham-se resumidos abaixo naTabela 10:

TABELA 10: INIBIÇÃO DA LIGAÇÃO DO RECEPTOR TNF AO TNFRp55 E p75 POR IgGl DE D2E7.

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A inibição da ligação 125LrhTNF aos receptores TNF p55 e p75em células U937 por D2E7, seguiu uma curva sigmóide simples, indicandovalores de IC50 similares para cada receptor. Nos experiências deradioimunoensaio de fase sólida (RIA) com os receptores TNF recombinantes,os valores de IC50 para inibição da ligação I-rhTNF aos receptores p55 e p75por D2E7, foram calculados como 1,47 χ IO"9 e 1,26 χ IO"9 Μ, respectivamente.O decréscimo em valores do IC50 na fase sólida foi provavelmente devido àdensidade mais elevada dos receptores no formato RIA, tendo em vista que orhTNF não rotulado também se inibiu com valores similares de IC50. Osvalores de IC50 para a inibição da ligação de 125LrhTNF aos receptores p55 ep75 por rhTNF não rotulado foram de 2,31 χ IO"9 e 2,70 χ IO"9 Μ,respectivamente.

C. INIBIÇÃO DA EXPRESSÃO DE ELAM-I SOBRE AS HUVEC

As células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC)podem ser induzidas a expressar a molécula 1 de aderência dos leucócitoscelulares endoteliais (ELAM-I) em sua superfície celular, mediante tratamentocom rhTNFa, a qual pode ser detectada mediante reação das HUVEC tratadascom rhTNFa com um anticorpo ELAM-I de camundongo anti-humano. Acapacidade dos anticorpos humanos anti-hTNFa de inibirem esta expressãoinduzida por TNFa de ELAM-I nas HUVEC, foi examinada como segue: AsHUVEC (ATCC ns CRL 1730) foram colocadas em placa de 96 reservatórios(5 χ IO4 células/reservatório) e incubadas durante a noite a 37°C. No diaseguinte, diluições em série de anticorpo humano anti-hTNFa (1:10) forampreparadas em placas de microtitulação, começando-se com 20 a 100 μ^πιΐ deanticorpo. Uma solução de estoque de rhTNFa foi preparada em 4,5 ng/ml,alíquotas de rhTNFa foram adicionadas a cara reservatório contendo anticorpo,e os conteúdos foram bem misturados. Os controles incluíam meio sozinho,meio mais anticorpo anti-hTNFa e meio mais rhTNFa. As placas das HUVECforam removidas da sua incubação de durante a noite a 37°C, e o meio foisuavemente aspirado de cada reservatório. Duzentos microlitros da misturaanticorpo-rhTNFa foram transferidos para cada reservatório das placas dasHUVEC. As placas das HUVEC foram então ainda incubadas a 37°C durante 4horas. A seguir, um estoque de anticorpo anti-ELAM-1 de murinos foi diluídoa 1:1000 em RPMI. O meio em cada reservatório da placa das HUVEC foisuavemente aspirado, 50 μΐ/reservatório da solução anti-ELAM-1 - anticorpoforam adicionados e as placas das HUVEC foram incubadas por 60 minutos emtemperatura ambiente. Uma solução de anticorpo Ig anticamundongo rotulada125I foi preparada em RPMI (aproximadamente 50.000 cpm em 50 μΐ). O meioem cada reservatório das placas das HUVEC foi suavemente aspirado, osreservatórios foram lavados por duas vezes com RPMI e 50 μΐ da solução Iganticamundongo rotulada I foram adicionados a cada reservatório. As placasforam incubadas por uma hora em temperatura ambiente e, depois, cadareservatório foi lavado por três vezes com RPMI. Cento e oitenta microlitros deSDS 5% foram adicionados a cada reservatório, para lisar as células. O lisadocelular de cada reservatório foi então transferido para um tubo e contado emum contador de cintilação (cintiloscópio).

Resultados representativos são apresentados na Figura 5. Ovalor do IC50 para a inibição do D2E7 da expressão induzida por hTNFa deELAM-I nas HUVEC, é de aproximadamente 6 χ IO"11 M nestas experiências.Estes resultados demonstram que o anticorpo anti-hTNFa humano D2E7 inibea expressão induzida por hTNFa de ELAM-I nas HUVEC em concentraçõesaproximadamente equivalentes àquelas dos mAb MAK 195 anti-hTNFa demurinos.

Em outra série de experiências, a capacidade da forma IgGl doD2E7 de inibir a expressão induzida por hTNFa, de ELAM-I nas HUVEC, foiexaminada como descrito acima. Os resultados das três experiênciasindependentes, e sua média, acham-se resumidos abaixo na Tabela 11:

TABELA 11: INIBIÇÃO DA EXPRESSÃO DO ELAM-I INDUZIDO PORTNFot, PELO RECEPTOR IgGl DO D2E7

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Esta série de experiências confirmou que o D2E7, na forma deIgGl de comprimento completo, inibe a expressão de ELAM-I induzida porTNFa nas HUVEC com um IC50 médio [M] de 1,85 ± 0,14 χ IO"10.

A potência de neutralização do IgGl do D2E7 também foiexaminada quanto à expressão induzida por rhTNF das duas outras moléculasde aderência, ICAM-1 e VCAM-1. Uma vez que a curva de titulação do rhTNFpara a expressão de ICAM-I em 16 horas foi muito semelhante à curva daexpressão do ELAM-1, a mesma concentração de rhTNF foi usada nasexperiências de neutralização do anticorpo. As HUVEC foram incubadas comrhTNF na presença de concentrações variáveis de D2E7 em um incubador deCO2 a 37°C durante 16 horas, e a expressão de ICAM-I foi medida poranticorpo anti-ICAM-1 de camundongos, seguido por anticorpoanticamundongos de carneiro rotulado I. Duas experiências independentesforam realizadas e os valores do IC50 foram calculados. Um anticorpo IgGlhumano não relacionado não inibiu a expressão de ICAM-I.

O procedimento experimental para testar a inibição da1, exceto que mAb anti-VCAM-1 foi usado, ao invés de mAb anti-ELAM-1.Três experiências independentes foram realizadas e os valores do IC50 foramcalculados. Um anticorpo IgGl humano não relacionado não inibiu a expressãode VCAM-I.

Os resultados acham-se resumidos abaixo na Tabela 12:TABELA 12: INIBIÇÃO DA EXPRESSÃO DE ICAM-I E VCAM-I PORIgGl DO D2E7

<table>table see original document page 79</column></row><table>

Estas experiências demonstram que o tratamento das célulasendoteliais primárias da veia umbilical humana com o rhTNF levado aexpressão ótima de moléculas de aderência: ELAM-I e VCAM-I em quatrohoras, e a expressão máxima supra-regulada de ICAM-I em 16 horas. O D2E7foi capaz de inibir a expressão das três moléculas de aderência em uma maneiradependente da dose. Os valores de IC50 para inibição de ELAM-I5ICAM-I eVCAM-I foram de 1,85 χ IO"10, 2,17 χ IO"10 e 1,01 χ IO-10 Μ, respectivamente.

Estes valores são muito similares, indicando necessidades similares quanto àdose do sinal de ativação de rhTNF para induzir a expressão de ELAM-1,ICAM-I e VCAM-1. De forma interessante, o D2E7 foi similarmente eficaz noensaio de inibição mais longo da expressão de ICAM-1. O ensaio de inibiçãodo ICAM-I requereu 16 horas de co-incubação de rhTNF e D2E7 comHUVEC, em oposição às 4 horas requeridas para os ensaios de inibição doELAM- I e do VCAM-1. Tendo em vista que o D2E7 tem um índice lento dedissociação para o rhTNF, é concebível que, durante as 16 horas do período deco-incubação, não havia nenhuma competição significativa pelos receptores deTNF nas HUVEC.

D. NEUTRALIZAÇÃO DE hTNFoc IN VIVOTrês diferentes sistemas in vivo foram empregados parademonstrar que o D2E7 é eficaz na inibição da atividade do hTNFa in vivo.

I. Inibição da letalidade induzida por tnf em camundongos sensibilizadospor D-galactosamina

A injeção de TNFa (rhTNFa) recombinante humano acamundongos sensibilizados por D-galactosamina, causa letalidade dentro deum período de tempo de 24 horas. Tem sido observado que os agentes deneutralização do TNFa evitam a letalidade neste modelo. Para examinar acapacidade de anticorpos anti-hTNFa humanos neutralizarem hTNFa in vivoneste modelo, camundongos C57B1/6 foram injetados com concentraçõesvariáveis de IgGl de D2E7, ou uma proteína de controle, em PBS5intraperitonealmente (i.p.). Os camundongos foram provados 30 minutos maistarde com 1 μg de rhTNFa e 20 mg de D-galactosamina em PBS i.p., eobservados 24 horas mais tarde. Estas quantidades de rhTNFa e D-galactosamina foram previamente determinadas para se obter 80 a 90% deletalidade nestes camundongos.

Resultados representativos, apresentados como um gráfico debarras de % de sobrevivência versus concentração de anticorpos, sãoapresentados na Figura 6. As barras pretas representam o D2E7, ao passo queas barras hachuradas representam MAK 195. A injeção de 2,5 a 25 μg deanticorpo de D2E7 por camundongo, protegeu os animais da letalidadeinduzida por TNFa. O valor de ED50 é de aproximadamente 1 a 2,5μg/camundongo. O anticorpo positivo de controle, MAK 195, foi similar emsua capacidade protetora. A injeção de D2E7 na ausência de rhTNFa não tevequalquer efeito prejudicial nos camundongos. A injeção de um anticorpo IgGlnão específico humano não ofereceu qualquer proteção contra a letalidadeinduzida por TNFa.

Em uma segunda experiência, quarenta e nove camundongosforam divididos em 7 grupos iguais. Cada grupo recebeu doses variáveis deD2E7 trinta minutos antes de receber uma dose LD80 da mistura rhTNF/D-galactosamina (1,0 de rhTNF e 20 mg de D-galactosamina porcamundongo). O grupo 7 de controle recebeu o anticorpo capa IgGl humanonormal em dose de 25 μg/camundongo. Os camundongos foram examinados24 horas mais tarde. A sobrevivência para cada grupo está resumida abaixo na

Tabela 13.

TABELA 13: SOBREVIVÊNCIA 24 HORAS APÓS O TRATAMENTOGOM D2E7

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II. Inibição da pirexia do coelho induzida por TNF

A eficácia do D2E7 em inibir a resposta à pirexia induzida porrhTNF em coelhos, foi examinada. Grupos destes coelhos fêmeas NZWpesando aproximadamente 2,5 kg cada, foram injetados intravenosamente comD2E7, rhTNF e complexos imunes de D2E7 e rhTNF. As temperaturas retaisforam verificadas por sondas termístor em um registrador térmico Kaye, a cadaminuto, por aproximadamente 4 horas. O TNF recombinante humano emsolução salina, injetado em 5 μg/kg, ,eliciou uma elevação na temperaturamaior do que 0,4°C em aproximadamente 45 minutos após a injeção. Apreparação do anticorpo por si, em solução salina em uma dose de 138 μg/kg,não eliciou um aumento de temperatura nos coelhos até 140 minutos após aadministração. Em todas as outras experiências, D2E7 ou reagentes de controle(IgGl humano ou um veículo salino) foram injetados i.v. nos coelhos, o que,15 minutos mais tarde, foi seguido por uma injeção de rhTNF em soluçãosalina a 5 μg/kg i.v. Os resultados representativos das várias experiênciasacham-se resumidos abaixo na Tabela 14:TABELA 14: INIBIÇÃO DA PIREXIA INDUZIDA POR rhTNF COMD2E7, EM COELHOS.

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= temperatura de pico

= % de inibição = (!-{aumento de temperatura com rhTNF &D2E7/aumento da temperatura com rhTNF sozinho}) χ 100.

O pré-tratamento intravenoso com D2E7 em uma dose de 14μ g/kg, parcialmente inibiu a resposta pirogênica, em comparação com oscoelhos pré-tratados com solução salina apenas. O D2E7 administrado em 137μg/kg suprimiu totalmente a resposta pirogênica do rhTNF na mesmaexperiência. Em uma segunda experiência, o D2E7 administrado em 24 μg/kgtambém suprimiu parcialmente a resposta pirogênica, em comparação com oscoelhos pré-tratados com solução salina apenas. A relação molar do D2E7 pararhTNF foi de 1/6:1 nesta experiência. Em uma terceira experiência, o D2E7injetado i.v. em 48 μg/kg (relação molar D2E7:rhTNF = 3,3:1) suprimiutotalmente a resposta pirogênica, em comparação com os coelhos pré-tratadoscom o IgGl humano de controle em solução salina a 30 μg/kg. Na experiênciafinal, os coelhos pré-tratados com D2E7 (792 μg/kg) em uma relação molarmuito elevada para rhTNF (55:1) não desenvolveram qualquer elevação natemperatura, a qualquer tempo, até 4 horas de observação. O tratamento doscoelhos com complexos imune gerados de uma mistura de D2E7 e rhTNFincubado a 37°C por 1 horas, em uma relação molar de 55:1, sem subsequenteadministração de rhTNF, também não eliciaram qualquer elevação natemperatura na mesma experiência.

III. Prevenção da poliartrite em camundongos transgênicos Tg 197O efeito do D2E7 no desenvolvimento da doença foiinvestigado em um modelo de artrite de murinos transgênicos. Oscamundongos transgênicos (Tg 197) foram gerados para que expressem o TNFhumano tipo selvagem (modificado na região 3' além das seqüências decodificação) e estes camundongos desenvolvem a poliartrite crônica com 100%de incidência em 4 a 7 semanas de idade (ver EMBO J (1991) 10: 4025-4031para outra descrição do modelo de poliartrite Tg 197).

Os animais transgênicos foram identificados por PCR em 3 diasde idade. As ninhadas de camundongos transgênicos foram divididas em seisgrupos. Os camundongos transgênicos foram verificados por análise dehibridização slot-blot em 15 dias de idade. Os protocolos de tratamento para osseis grupos foram como segue: Grupo 1 = sem tratamento; Grupo 2 = soluçãosalina (veículo); Grupo 3 = D2E7 a 1,5 μg/g; Grupo 4 = D2E7 a 15 μg/g;Grupo 5 = D2E7 a 30 μg/g; e Grupo 6 = controle do isótipo IgGl a 30 μg/g.

Uma ninhada com camundongos não transgênicos também foi incluída noestudo, para servir de controle (Grupo 7 - não transgênico; sem tratamento).Cada grupo recebeu três injeções i.p. por semana, dos tratamentos indicados.As injeções continuaram por 10 semanas. A cada semana, as modificaçõesmacroscópicas na morfologia das juntas foram registradas para cada animal.

Em 10 semanas, todos os camundongos foram sacrificados e o tecido doscamundongos foi coletado em formalina. O exame microscópico do tecido foirealizado.

O peso dos animais em gramas foi tomado para cadacamundongo no início de cada semana. Ao mesmo tempo, medições dotamanho das juntas (em mm) também foram feitas, como uma medição dagravidade da doença. O tamanho das juntas foi estabelecido como uma médiade três medições no tornozelo direito traseiro, usando-se um micrômetro. Acontagem artrítica foi registrada semanalmente como segue: 0 = sem artrite(aparência e flexão normal); + = artrite suave (distorção das juntas); ++ =artrite moderada (inchação, deformação das juntas) e +++ = artrite grave(ancilose detectada na flexão e movimento gravemente prejudicado). Aclassificação histopatológica com base no manchamento dehematoxilina/eosina das seções das juntas, baseou-se no seguinte: 0 = nenhumadoença detectável; 1 = proliferação da membrana sinovial; 2 = espessamentosinovial intenso; 3 = destruição da cartilagem e erosão do osso.

O efeito do tratamento com D2E7 no tamanho médio da juntados camundongos transgênicos artrí ticos, é mostrado no gráfico da Figura 9. Aclassificação histopatológica e artrítica dos camundongos transgênicos Tg 197,com 11 semanas de idade, está resumida abaixo na Tabela 15:

TABELA 15: EFEITO DO D2E7 NA CLASSIFICAÇÃOHISTOPATOLÓGICA E ARTRÍTICA EM CAMUNDONGOS Tg 197

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Esta experiência demonstrou que o anticorpo D2E7 tem umefeito benéfico definido em camundongos transgênicos expressando o TNFhumano do tipo selvagem (Tg 197) sem qualquer artrite evidente após operíodo de estudo.

E. Neutralização do D2E7 dos TNFa de outras espécies

A especificidade da ligação do D2E7 foi examinada medianteavaliação da sua capacidade de neutralizar os fatores da necrose tumoral devárias espécies de primatas e de camundongo, usando-se um ensaio decitotoxicidade L929 (como descrito no Exemplo 4, subseção A, acima). Osresultados estão resumidos na Tabela 16, abaixo:TABELA 16: CAPACIDADE DO D2E7 DE NEUTRALIZAR 0 TNF DEESPÉCIES DIFERENTES NO ENSAIO L929

<table>table see original document page 85</column></row><table>

Os resultados da Tabela 16 demonstram que o D2E7 podeneutralizar a atividade de cinco TNFa de primatas, aproximadamenteequivalente ao TNFa humano e, além do mais, pode neutralizar a atividade doTNFa canino (cerca de dez vezes pior do que o TNFa humano) e o TNFaporcino e de camundongos (cerca de -1000 vezes pior do que o TNFahumano). Além disso, a ligação do D2E7 ao rhTNFa de fase de solução nãofoi inibida por outras citocinas, tais como a linfotoxina (TNFp), IL-I-a, IL-I-β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IFN-gama e TGF-β, indicando que o D2E7 é muitoespecífico quanto ao seu ligando TNFa.

F. Carência de liberação da citocina pelo sangue humano total incubadocom D2E7

Neste exemplo, a capacidade do D2E7 de induzir, por si, ascélulas sangüíneas humanas normais para secretar citocinas ou derramar asmoléculas celulares superficiais, foi examinada. O D2E7 foi incubado comsangue total diluído de três doadores normais diferentes, em concentraçõesvariáveis, por 24 horas. Um controle positivo de LPS foi realizado ao mesmotempo, em uma concentração previamente determinada para estimular ascélulas sangüíneas imunocompetentes a secretar citocinas. Os sobrenadantesforam colhidos e testados em um painel de dez citocinas solúveis, kits ELISAde molécula receptora e de aderência: IL-I-a, IL-I-β, IL-I antagonistareceptora, IL-6, IL-8, TNFa5 receptor 1 TNF solúvel, receptor II TNF solúvel,ICAM-I solúvel e E-selectina solúvel. Nenhum acréscimo significativo decitocinas ou derrame das moléculas celulares superficiais foram medidos comoresultado da co-incubação do anticorpo D2E7, em concentrações até 343μg/ml. As culturas de controle sem a adição do anticorpo também não produziuqualquer quantidade mensurável de citocinas, enquanto o controle da co-cultura de LPS produziu valores elevados na faixa de elevado picograma ebaixo nanograma. Estes resultados indicam que o D2E7 não induziu as célulasdo sangue total a secretar citocinas ou a derramar proteínas celularessuperficiais acima dos níveis normais em culturas ex vivo.

A parte de formação da presente apresentação é a Listagem deSeqüência anexa, cujo conteúdo é resumido na tabela abaixo:<table>table see original document page 87</column></row><table>EQUIVALENTES

Aqueles versados na arte reconhecerão, ou estarão aptos aaveriguar, usando nada mais do que a experimentação de rotina, muitosequivalentes às modalidades específicas da invenção aqui descrita. Taisequivalentes são entendidos como abarcados pelas reivindicações seguintes.LISTAGEM DAS SEOUENCIAS

(1) INFORMAÇÃO GERAL:

(i) REQUERENTE:

(A) NOME: BASF Aktiengesellschafl

(B) RUA: Carl-Bosch Str. 38

(C) CIDADE: 67056 Ludwigshafen

(D) ESTADO: Rheinland-Pfalz

(E) PAÍS: República Federal da Alemanha

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Anticorpos Humanos que se ligam a TNFaHumano

(iii) NÚMERO DE SEQÜÊNCIAS: 37

(iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA:

(A) DESTINATÁRIO: LAHIVE & COCKFIELD

(B) RUA: 60 State Street, suite 510

(C) CIDADE: Boston

(D) ESTADO: Massachusetts

(E) PAÍS: Estados Unidos

(F) CÓDIGO POSTAL: 02109-1875

(v) FORMA LEGÍVEL DE COMPUTADOR:

(A) TIPO DE MEIO: disco flexível

(B) COMPUTADOR: PC IBM compatível

(C) SISTEMA DE OPERAÇÃO: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: PatentIn Release 1,0, Versão 1:25

(vi) DADOS DO PEDIDO ATUAL:

(A) NÚMERO DO PEDIDO:

(B) DATA DE ARQUIVAMENTO:

(C) CLASSIFICAÇÃO:

(vii) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR:

(A) NÚMERO DO PEDIDO: U.S. 08/599.226(B) DATA DE DEPÓSITO: 09 DE FEVEREIRO DE 1996

(C) CLASSIFICAÇÃO:

(vii) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR:

(A) NÚMERO DO PEDIDO: U.S. 60/031.476

(B) DATA DE DEPÓSITO: 25 DE NOVEMBRO DE 1996

(C) CLASSIFICAÇÃO:

(viii) INFORMAÇÃO DO REPRESENTANTE/AGENTE:

(A) NOME: DeConti, Giulio A., Jr.

(B) NÚMERO DE REGISTRO: 31.503

(C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/CERTIFICADO:BBI-043CPPC

(ix) INFORMAÇÃO DE TELECOMUNICAÇÃO:

(A) TELEFONE: (617) 227-7400

(B) TELEFAX: (617) 227-5941

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 1:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 107 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo

(v) TIPO DE FRAGMENTO: interno

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ. ID. NO: 1:Asp Ile Gln Mer Thr Glr- Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Sei Val Glv1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arc Ala Ser Gln Gly Ile Arc Asr Tv-20 25 3 c"

Leu Ala Trp Tyr Gln Glr. Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile25 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 60

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tvr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lvs Val Glu Ile Lys100 105

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 2:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 121 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo

(v) TIPO DE FRAGMENTO: interno

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ. ID. NO: 2:

txj GlU Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Ara1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ala Ile Thr Trp Asr. Ser Gly Kis lie Asp Tyr

50 55 60

Yt li Asp Ser Cal

Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asr. Se- ' eu Tv-65 70 75

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tvr T-r Cvs85 90 * 95*

Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 3:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

5 (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo(v) TIPO DE FRAGMENTO: interno(ix) ASPECTO:

(A) NOME/CHAVE: sítio modificado10 (B) LOCALIZAÇÃO: 9

(D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /note= "Xaa é Thr ou Ala'(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ. ID. NO: 3:Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Xaa1 5

15 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 4:(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 12 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear

20 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo(v) TIPO DE FRAGMENTO: interno(ix) ASPECTO:

IlC(A) NOME/CHAVE: sítio modificado

(B) LOCALIZAÇÃO: 12

(D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /note= "Xaa é Tyr ou Asn"

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ. ID. NO: 4:

Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Xaa1 5 10

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 5:

(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 7 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo

(v) TIPO DE FRAGMENTO: interno

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ. ID. NO: 5:

Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser1 5

(2) INFORMAÇÃO PARA ^ SEQ ID NO: 6:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 17 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo

(v) TIPO DE FRAGMENTO: interno

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ. ID. NO: 6:

AIa Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asd Tyr Ala Asd Ser Val Glu1 '5 10 ' 15

Gly

(2) INFORMAÇAO PARA A SEQ ID NO: 7:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 11 aminoácidos(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear(ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo(v) TIPO DE FRAGMENTO: interno(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ. ID. NO: 7:Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr Leu Ala1 5 10

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 8:

(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear(ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo(v) TIPO DE FRAGMENTO: interno(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ. ID. NO: 8:Asp Tyr Ala Met His1 5

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 9:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 107 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo(v) TIPO DE FRAGMENTO: interno

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ. ID. NO: 9:

Asp Ile Gln Mer Tiir Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Ile Gly1 S 10 15

Aso Ar= Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr20 25 30.

Leu Ala Tro Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35" 40 45Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gl/50 55 60

Ser Glv Ser Glv Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glr. Pro65 70 75 BO

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asr. Ser Ala Prc Tyr85 90 S5

Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 10:

(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 121 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo(v) TIPO DE FRAGMENTO: interno(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEO. ID. NO: 10:

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arc1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Val35 40 45

Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60

Glu Gly Arg Phe Ala Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ala Leu Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Thr Lys Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Asp Asn Trp Gly100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 11:'10 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear(ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo(v) TIPO DE FRAGMENTO: interno(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ. ID. NO: 11:Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr Ala1 5

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQID NO: 12:

(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo(v) TIPO DE FRAGMENTO: interno(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ. ID. NO: 12:Gln Lys Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Ala1 5

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQID NO; 13:

(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo(v) TIPO DE FRAGMENTO: interno(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ. ID. NO: 13:Gln Lys Tyr Gln Arg Ala Pro Tyr Thr1 5

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 14:(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear(ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo(v) TIPO DE FRAGMENTO: interno(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ. ID. NO: 14:Gln Lys Tyr Ser Ser Ala Pro Tyr Thr1 5

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQID NO: 15:

(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear(ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo(v) TIPO DE FRAGMENTO: interno(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ. ID. NO: 15:Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr Thr1 5

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQID NO: 16:

(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear(ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo(v) TIPO DE FRAGMENTO: interno(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ. ID. NO: 16:Gln Lys Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Thr1 5

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQID NO: 17: '(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear(ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo(v) TIPO DE FRAGMENTO: interno(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ. ID. NO: 16:Gln Lys Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Thr1 5

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 17:

(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear(ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo(v) TIPO DE FRAGMENTO: interno(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ. ID. NO: 17:Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr Tyr1 5

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQID NO: 18:

(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear(ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo(v) TIPO DE FRAGMENTO: interno(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ. ID. NO: 18:Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr Asn1 5

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQID NO: 19:(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo(v) TIPO DE FRAGMENTO: interno

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ. ID. NO: 19:Gln Lys Tyr Thr Ser Ala Pro Tyr Thr1 5

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQID NO: 20:(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo(v) TIPO DE FRAGMENTO: interno

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ. ID. NO: 20:Gln Lys Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Asn1 5

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 21:(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo(v) TIPO DE FRAGMENTO: interno

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ. ID. NO: 21:Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Ala Tyr Ser1 5

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQID NO: 22:(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUENCIA:

(A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo(v) TIPO DE FRAGMENTO: interno(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ. ID. NO: 22:Gln Gln Tyr Asn Ser Ala Pro Asp Thr1 5

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQID NO: 23:(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo(v) TIPO DE FRAGMENTO: interno(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ. ID. NO: 23:Gln Lys Tyr Asn Ser Asp Pro Tyr Thr1 5

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQID NO: 24:(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo(v) TIPO DE FRAGMENTO: interno(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ. ID. NO: 24:Gln Lys Tyr Ile Ser Ala Pro Tyr Thr1 5(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQID NO: 25:

(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo(v) TIPO DE FRAGMENTO: interno(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ. ID. NO: 25:Gln Lys Tyr Asn Arg Pro Pro Tyr Thr1 5

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQID NO: 26:

(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 9 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo(v) TIPO DE FRAGMENTO: interno(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ. ID. NO: 26:Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Ala1 5

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 27:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 12 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo(v) TIPO DE^RAGMENTO: interno

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ. ID. NO: 27:Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Asp Asn1 5 10

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQID NO: 28:

(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 12 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear(ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo(v) TIPO DE FRAGMENTO: interno(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ. ID. NO: 28:Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Asp Lys1 5 10

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQID NO: 29:

(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 12 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear(ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo(v) TIPO DE FRAGMENTO: interno(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ. ID. NO: 29:Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Asp Tyr1 5 10

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 30:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 12 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo(v) TIPO DE FRAGMENTO: interno

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ. ID. NO: 30:Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Asp Asp

1 5 10

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQID NO: 31:

(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 12 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear(ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo(v) TIPO DE FRAGMENTO: interno(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ. ID. NO: 31:Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Phe Ser Leu Asp Tyr1 5 10

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQID NO: 32:

(1) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 12 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear(ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo(v) TIPO DE FRAGMENTO: interno(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ. ID. NO: 32:Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu His Tyr1 5 10

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQID NO: 33:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 12 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo(v) TIPO DE FRAGMENTO: interno(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ. ID. NO: 33:Ala Ser Phe Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Glu Tyr1 5 10

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQID NO: 34:(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 12 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo(v) TIPO DE FRAGMENTO: interno

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ. ID. NO: 34:Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Glu Tyr1 5 10

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQID NO: 35:(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 12 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo(v) TIPO DE FRAGMENTO: interno

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ. ID. NO: 35:Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Asn1 5 10

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQID NO: 36:(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 321 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) FILAMENTO: duplo

(D) TOPOLOGIA: linear(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ. ID. NO: 36:

GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGGGA CAGAGTCACC 6 0

ATCACTTGTC GGGCAAGTCA GGGCATCAGA AATTACTTAG CCTGGTATCA GCAAAAACCA 12 0

GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGCT GCATCCACTT TGCAATCAGG GGTCCCATCT IBO

CGGTTCAGTG GCAGTGGATC TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTACAGCCT 24 0

GAAGATGTTG CAACTTATTA CTGTCAAAGG TATAACCGTG CACCGTATAC TTTTGGCCAG 3 00

GGGACCAAGG TGGAAATCAA A 321

(2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 37:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 363 pares de base

(B) TIPO: ácido nucleico(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ. ID. NO: 37:

GAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CCGGCAGGTC CCTGAGACTC 60

TCCTGTGCGG CCTCTGGATT CACCTTTGAT GATTATGCCA TGCACTGGGT CCGGCAAGCT 120

CCAGGGAAGG G CCTGGAATG GGTCTCAGCT ATCACTTGGA ATAGTGGTCA CATAGACTAT 18 0

GCGGACTCTG TGGAGGGCCG ATTCACCATC TCCAGAGACA ACGCCAAGAA CTCCCTGTAT 24 0

CTGCAAATGA ACAGTCTGAG AGCTGAGGAT ACGGCCGTAT ATTACTGTGC GAAAGTCTCG 3 00

TACCTTAGCA CCGCGTCCTC CCTTGACTAT TGGGGCCAAG GTACCCTGGT CACCGTCTCG 36 0

Claims (19)

1. Vetor recombinante de expressão,CARACTERIZADO pelo fato de compreender um ácido nucléicocompreendendo uma seqüência que codifica um domínio CDR3 decadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácido da SEQID NO: 3, ou modificado da SEQ ID NO: 3 por uma substituiçãoúnica de alanina nas posições 1, 4, 5, 7 ou 8, ou por uma acinco substituições conservativas de aminoácido nas posições-1, 3, 4, 6, 7, 8 e/ou 9, onde o vetor compreende um marcadorselecionável e uma seqüência de controle transcricionaloperativamente ligada ao ácido nucléico.

2. Vetor recombinante de expressão, de acordocom a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende uma região variável de cadeia leve do anticorpo (LCVR).

3. Vetor recombinante de expressão, de acordocom a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que odomínio CDR2 da LCVR do anticorpo compreende a seqüência deaminoácidos de SEQ ID NO:5.

4. Vetor recombinante de expressão, de acordocom a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que odomínio CDRlda LCVR do anticorpo compreende a seqüência deaminoácidos de SEQ ID NO:7.

5. Vetor recombinante de expressão,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um ácido nucléicocompreendendo uma seqüência que codifica um domínio CDR3 decadeia pesada da seqüência de aminoácido da SEQ ID NO:4, oumodificado da SEQ ID NO: 4 por uma substituição única dealanina nas posições 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, ou 11, ou poruma a cinco substituições conservativas de aminoácido nasposições 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 e/ou 12, onde o vetorcompreende um marcador selecionável e uma seqüência decontrole transcricional operativamente ligada ao ácidonucléico.

6. Vetor recombinante de expressão, de acordocom a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende uma região variável de cadeia pesada doanticorpo.

7. Vetor recombinante de expressão, de acordocom a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que odomínio CDR2 do HCVR do anticorpo compreende a seqüência deaminoácidos da SEQ ID NO:6.

8. Vetor recombinante de expressão, de acordocom a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que odomínio CDRl do HCVR do anticorpo compreende a seqüência deaminoácidos de SEQ ID NO:8.

9. Vetor de expressão recombinante,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um ácido nucléicocompreendendo uma seqüência que codifica um domínio CDR3compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada apartir do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4,SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID N0:13, SEQ ID NO:14, SEQID NO:15, SEQ ID N0:16, SEQ ID N0:17, SEQ ID N0:18, SEQ IDNO: 19, SEQ ID N0:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ IDNO: 23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ IDNO: 27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID N0:30, SEQ IDNO: 31, SEQ ID ΝΟ:32, SEQ ID ΝΟ:33 e SEQ ID ΝΟ:34, onde οvetor compreende um marcador selecionável e uma seqüência decontrole transcricional operativamente ligada ao ácidonucléico.

10. Vetor recombinante de expressão,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um ácido nucléicocompreendendo uma seqüência que codifica uma região variávelde cadeia leve do anticorpo compreendendo a seqüência deaminoácidos da SEQ ID NO:l, onde o vetor compreende ummarcador selecionável e uma seqüência de controletranscricional operativamente ligada ao ácido nucléico.

11. Vetor recombinante de expressão, de acordocom a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende a região variável de cadeia leve do anticorpo euma região constante de cadeia leve do anticorpo.

12. Vetor recombinante de expressão,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um ácido nucléicocompreendendo uma seqüência que codifica uma região variávelde cadeia pesada do anticorpo compreendendo a seqüência deaminoácido de SEQ ID NO: 2, onde o vetor compreende ummarcador selecionável e uma seqüência de controletranscricional operativamente ligada ao ácido nucléico.

13. Vetor recombinante de expressão, de acordocom a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende a região variável de cadeia pesada do anticorpo euma região constante de cadeia pesada do anticorpo.

14. Vetor recombinante de expressão, de acordocom a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que aregião constante de cadeia pesada do anticorpo é uma regiãoconstante IgGl.

15. Vetor recombinante de expressão, de acordocom a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que aregião constante de cadeia pesada do anticorpo é uma regiãoconstante IgG4.

16. Vetor recombinante de expressão,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um ácido nucléicocompreendendo uma seqüência que codifica:(a) uma cadeia leve do anticorpo tendo uma regiãovariável compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ IDNO: 1; e(b) uma cadeia pesada do anticorpo tendo umaregião variável compreendendo a seqüência de aminoácidos deSEQ ID NO: 2, onde o vetor compreende um marcadorselecionável e uma seqüência de controle transcricionaloperativamente ligada ao ácido nucléico.

17. Célula hospedeira procariótica, CARACTERIZADApelo fato de que dentro da qual o vetor recombinante deexpressão, conforme definido na reivindicação 16, tenha sidointroduzido.

18. Vetor recombinante de expressão,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um ácido nucléicocompreendendo SEQ ID NO:36, onde o vetor compreende ummarcador selecionável è uma seqüência de controletranscricional operativamente ligada ao ácido nucléico.

19. Vetor recombinante de expressão,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um ácido nucléicocompreendendo SEQ ID NO:37, onde o vetor compreende ummarcador selecionável e uma seqüência de controletranscricional operativamente ligada ao ácido nucléico.