BRPI0010989B1 - métodos para produção de uma planta transgênica com rendimento aumentado, que sintetiza alfa-1,4-glucanos alfa-1,6 ramificados com um grau de ramificação modificado na posição o-6 e/ou que sintetiza um amido modificado, bem como uso de moléculas de ácido nucléico que codificam uma amilossacarase e uma enzima de ramificação - Google Patents

Abstract

patente de invenção: "plantas e células de plantas geneticamente modificadas com uma atividade aumentada de uma proteína de amilossacarase e uma enzima de ramificação". são providas plantas e células de plantas transgênicas com uma atividade aumentada de uma proteína de amilossacarase e uma atividade aumentada de uma enzima de ramificação. tais plantas e células de plantas sintetizam um amido modificado e/ou sintetizam alfa-1,4-glucanos alfa-1,6 ramificados com um grau de ramificação modificado na posição o-6 e/ou dão um rendimento mais alto em comparação com plantas de tipo selvagem geneticamente não modificadas correspondentes (células de plantas).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS PARA PRODUÇÃO DE UMA PLANTA TRANSGÊNICA COM RENDIMENTO AUMENTADO, QUE SINTETIZA ALFA-1,4-GLUCANOS ALFA-1,6 RAMIFICADOS COM UM GRAU DE RAMIFICAÇÃO MODIFICADO NA POSIÇÃO 0-6 E/OU QUE SINTETIZA UM AMIDO MODIFICADO, BEM COMO USO DE MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLÉICO QUE CODIFICAM UMA AMILOSSACARASE E UMA ENZIMA DE RAMIFICAÇÃO". A presente invenção refere-se a plantas e células de plantas transgênicas com uma atividade aumentada de uma proteína de amilossacarase e uma atividade aumentada de uma enzima de ramificação. Tais plantas e células de plantas sintetizam um amido modificado e/ou sintetizam alfa-1,4-glucanos alfa-1,6 ramificados com um grau de ramificação modificado na posição 0-6 e/ou dão um rendimento mais alto com plantas de tipo selvagem geneticamente não modificadas correspondentes (células de plantas).

Na área da agricultura e sivilcultura era um esforço permanente para produzir plantas com rendimento aumentado, em particular, a fim de se assegurar o alimento para a população continuamente crescente do mundo e para garantir o fornecimento de matérias primas regenerantes. Tradicionalmente, tentativas foram feitas para se obter plantas produtivas por reprodução. Para cada espécie de planta de interesse um programa de reprodução correspondente tem de ser realizado. Isto é, no entanto, consome muito tempo e trabalho. Progresso foi feito, parcialmente por manipulação genética de plantas, isto é, por introdução e expressão intencional de moléculas de aminoácido recombinantes em plantas. Tais abordagens têm a vantagem que, em geral, elas não estão sendo limitadas a uma espécie de planta mas podem ser transferidas para outras espécies de planta. Portanto, parece, desejável prover plantas e células de planta que dão rendimentos aumentados bem como para oferecer métodos para a produção de tais células de plantas e plantas.

Com referência à importância crescente que estava ligada a Segue-se folha 1a substâncias vegetais como uma fonte de regeneração de matéria prima recentemente, uma das tarefas na pesquisa biotecnológica é esforçar-se para ajustar estas matérias primas vegetais para as necessidades da indústria de produção. A fim de facilitar o uso de matérias primas regenerantes em tan- tas áreas de aplicação quanto possível além do mais é essencial para se conseguir uma grande variedade de substâncias. Além do mais. é necessário aumentar o rendimento destas substâncias vegetais a fim de aumentar a eficiência da produção de fontes de matérias primas regenerantes. Apesar de óleos, gorduras e proteínas, polissacarídeos são as mais importantes matérias primas vegetais regenerantes. Apesar da celulose, amido desempenha um papel vital com os polissacarídeos como ele é uma das mais importantes substâncias de reserva em plantas superiores.

Apesar de seu uso em alimentos, o amido de polissacarídeo é também amplamente usado como matéria prima regenerante para a produção de produtos industriais. O amido de polissacarídeo é constituído de componentes básicos quimicamente uniformes, as moléculas de glicose, mas forma uma mistura complexa de várias moléculas que têm graus de ramificação e polimeri-zação diferentes e portanto diferem substancial mente em suas propriedades físicas e químicas.

Uma diferenciação é feita entre amido de amilose, um polímero basicamente não ramificado de unidades de glicose alfa-1,4-glicosidicamen-te ligadas, e o amido de amilopectina, um polímero ramificado em que a ramificação é causada pela ocorrência de ligações alfa-1,6-glicosídica adicionais. De acordo com a literatura Voet e Voet, Biochemistry, John Wiley & Sons, 1990) ligações alfa-1,6-glicosídicas ocorrem em média a cada 24° a cada 30° resíduo de glicose. Isto corresponde a um grau de ramificação de cerca de 3% - 4%. Detalhes do grau de ramificação são variáveis e dependem da fonte (por exemplo, espécie de planta, variedade de planta, etc.) do amido individual. Plantas tipicamente usadas para a produção industrial de amido variam em seu teor de amilose do teor de amido total entre 10 e 25%. A fim de facilitar um uso muito amplo de polissacarídeos tal como, por exemplo, amido parece desejável prover plantas que são modificadas em sua composição de polissacarídeo e, por exemplo, são capazes de sintetizar amido modificado e/ou alfa-1,6-alfa-1,4-glucanos altamente ramificados que são particularmente adequados para vários usos. Uma pos- sibilidade para produzir tais plantas é - apesar da forma de métodos de reprodução - a modificação intecional do metabolismo de amido em plantas de produção de amido por métodos de engenheiramento genético. Um pré-requisito até aqui, no entanto, é a identificação e caracterização das enzimas desempenhando um papel na modificação e/ou síntese de amido bem como o isolamento das moléculas de DNA correspondentes que codificam estas enzimas.

As trajetórias de síntese química que levam à formação de amido são essencialmente conhecidas. A síntese de amido em células de planta ocorre nos plastídios. Em tecidos fotossinteticamente ativos estes são os cloroplastos, em tecidos de armazenagem de amido fotossinteticamente inativos o amioplastos.

As enzimas mais importantes que participam na síntese de amido são as sintases de amido (cf., por exemplo, o pedido de patente WO 96/15248), a enzima R1 (cf., por exemplo, WO 97/11188) bem como as enzimas de ramificação (cf., WO 92/14827). O papel exato de outras enzimas tais como, por exemplo, os fosforilases de amido (cfM por exemplo, WO 98/40503) durante a biossíntese de amido não é conhecida. A fim de prover possibilidades ulteriores para modificar quaisquer plantas em tais modo que elas sintetizam amido modificado, é também possível introduzir moléculas de ãcido nucléico estranhas, como, por exemplo, bacterianas ou fúngicas, que não estão presentes em plantas de tipo selvagem e que codificam proteínas que participam na síntese de polissaca-rídeos. Poderia ser mostrado, por exemplo, a síntese de assim chamado "Amylofructan" è possível por expressão amiloplastídico de frutosiltransfera-ses bacterianas em amiloplastos (Smeekens, Trends in Plant Science vol. 2 NQ 8 (1997), 286-288). A expressão heteróloga de uma sintase de glicogênio bacteria-na em plantas de batata leva a um leve diminuição do teor de amilose, um aumento do grau de ramificação e uma mudança no padrão de ramificação da amilopectina em comparação com plantas de tipo selvagem (Shewmaker e outros, Plant Physiol. 104 (1994), 1159-1166).

Além do mais, a expressão de uma enzima de ramificação bac-teriana em plantas de batata em mutantes de batata livre de amilose (amf) (Jacobsen e outros, Euphytica, 44 (1989), 43-48) leva a moléculas de ami-lopectina tendo 25% de mais pontos de ramificação (Kortstee e outros, The Plant Journal, 10(1), (1996), 83-90) do que as moléculas de controle (amf). O aumento em pontos de ramificação foi devido a uma modificação da distribuição do comprimento de cadeia de cadeias laterais mais longas em favor de cadeias laterais mais curtas. A redução do comprimento de cadeia médio e a redução do Xmax depois do manchamento com iodo também são uma indicação para uma estrutura ramificada mais alta da amilopectina em plantas transformadas em comparação com plantas não transformadas (Kortstee e outros, ver acima). O grau de ramificação de glicogênio de cerca de 10% podería, no entanto, não ser conseguido via esta abordagem. Glicogênio, um polissacarídeo, que é encontrado principalmente em animais e bactérias, contém alfa-1,6-alfa-1,4-glucanos altamente ramificados. Glicogênio difere de amido também no comprimento médio das cadeias laterais e no grau de polimerização. De acordo com a literatura (Voet e Voet, Bioche-mistry, John Wiley & Sons, 1990) contém um ponto de alfa-1,6-ramificação em cada 8o ou 12° resíduo de glicose em média. Isto corresponde a um grau de ramificação de cerca de 8% a 12%. Há várias figuras, para o peso molecular de glicogênio que variam entre 1 milhão e mais do que 1000 milhões (D. J. Manners em: Advances in Carbohydrate Chemistry, Ed. M. L. Wol-from, Academic Press, New York (1957). 261-298; Geddes e outros, Carbo-hydr. Res., 261 (1994), 78-89). Estas cifras, também, dependem a muito no organismo de fonte correspondente, seu estado nutricional bem como a espécie de isolamento de glicogênio. Usualmente é obtido por métodos dispendiosos e de consumo de tempo a partir de mexilhões (por exemplo, Myti-llus edulis), a partir de músculos de fígados de mamíferos (por exemplo, coelhos, ratos) (Bell e outros, Biochem. J. 28(1934), 882; Bueding and Orrel, J. Biol. Chem. 236 (1961), 2854). Além do mais, em plantas encontra-se, por exemplo, o mutante de sul de milho o assim chamado fitoglicogênio que tem um grau de ramificação de cerca de 10% e que mostra, em comparação com amilopectina uma distribuição de cadeia lateral ramificada (Yun and Matheson, Carbohydrate Research 243, (1993), 307-321) e um comportamento de solubilidade diferente. Tais plantas de acúmulo de fitoglicogênio, no entanto, mostram uma redução no teor de amido de até 90% (Zeeman e outros, Plant Cell 10, (1998), 1699-1711).

Além do mais, um método in vitro usando-se amilossacarase e uma enzima de ramificação para a síntese de alfa-1,4-glucanos alfa-1,6-ramificados são descritas que entre outras permite a produção de glucanos altamente ramificados (similar a glicogênio) (pedido de patente alemão DE 19346635.8). A produção de tais glucanos em plantas, no entanto, não é descrita ali.

Portanto parece desejável prover meio alternativo que permite a produção razoavelmente estimada de amidos modificados e/ou de alfa-1,6-alfa-1,4-glicanos com um grau de ramificação modificado na posição 0-6 em comparação com plantas de tipo selvagem em plantas.

Assim, o problema técnico subjacente a presente invenção é para prover células de plantas e plantas que, em comparação com células de plantas de tipo selvagem não modificadas e plantas de tipo selvagem correspondentes, contêm uma composição modificada dos polissacarídeos contidos nas células de plantas e plantas e, se possível, também mostram um rendimento mais alto.

Este problema foi resolvido por prover as concretizações caracterizadas nas reivindicações.

Portanto, a presente invenção refere-se a células de plantas transgênicas que são geneticamente modificadas em que a modificação genética é a introdução de uma molécula de ácido nucléico estranha ou várias moléculas de ácido nucléico estranhas a presença ou a ausência das quais leva a uma atividade aumentada de uma proteína de amilossacarase e uma atividade aumentada de uma proteína de enzima de ramificação em comparação com células de plantas geneticamente não modificadas de plantas de tipo selvagem. A modificação genética pode ser qualquer modificação que leva a um aumento na atividade de amilossacarase e a um aumento na atividade de enzima de ramificação.

Em uma concretização preferida a modificação genética consiste na introdução de uma molécula de ácido nucléico estranha que codifica uma proteína de amilossacarase e uma enzima de ramificação no geno-ma de uma célula de planta.

Esta molécula de ácido nucléico estranha pode, por exemplo, ser chamada de "construto duplo" que é um vetor simples para a transformação de planta que contém a informação genética que codifica tanto para uma proteína de amilossacarase quanto para uma enzima de ramificação.

As moléculas de ácido nucléico que codificam a enzima de amilossacarase e a enzima de ramificação que são ambas contidas na "molécula de ácido nucléico estranha" podem ou, independentemente entre si, estar sob controle de um promotor cada ou elas podem, depois da fusão como unidade tradicional, estar sob controle do mesmo promotor.

Em uma outra concretização preferida várias moléculas de ácido nucléico estranhas são introduzidas para dentro do genoma da célula de planta em que uma molécula de ácido nucléico estranha codifica uma proteína de amilossacarase e uma outra molécula de ácido nucléico estranha codifica uma enzima de ramificação.

Pela presente, as moléculas de ácido nucléico estranhas podem ser introduzidas para dentro do genoma da célula de planta ao mesmo tempo ou consecutivamente. No primeiro caso é chamada uma "co-transforma-ção", no último uma "supertransformação". O termo "transgênico" portanto significa que a célula de planta da invenção contém pelo menos uma de preferência duas moléculas de ácido nucléico estranhas estavelmente integradas no genoma, de preferência uma ou duas moléculas de ácido nucléico estranhas que codificam uma proteína de amilossacarase em uma enzima de ramificação. O termo "molécula de ácido nucléico estranha" de preferência significa uma molécula de ácido nucléico que codifica uma proteína com atividade de amilossacarase e uma proteína com atividade de enzima de ramificação e que ou não ocorre nas plantas correspondentes naturalmente ou que não ocorre naturalmente na ordem espacial real nas plantas ou que está localizada em um lugar no genoma da planta onde não ocorre naturalmente. De preferência, a molécula de ácido nucléico estranha é uma molécula recombinante que consiste em vários elementos a combinação ou a ordem espacial específica da qual não ocorre naturalmente em plantas. As plantas da invenção contêm pelo menos uma molécula de ácido nucléico que codifica uma proteína com atividade de amilossacarase e uma proteína com atividade de enzima de ramificação de preferência ligada com elementos de DNA reguladores que garantem a transcrição em plantas, em particular com um promotor. O termo "várias moléculas de ácido nucléico estranhas" de preferência significa duas moléculas de ácido nucléico em que uma molécula de ácido nucléico estranha codifica uma proteína de amilossacarase e a segunda molécula de ácido nucléico estranha codifica uma enzima de ramificação.

Em princípio, a(s) molécula(s) de ácido nucléico estranha(s) po-deím) ser qualquer (quaisquer) molécula(s) de ácido nucléico que codifa(m) uma proteína de amilossacarase e uma enzima de ramificação.

Dentro da presente invenção uma proteína de amilossacarase (sacarose; 1,4-alfa-D-glucano 4-alfa-glicotransferase, E.C.2.4.1.4) refere-se a uma enzima que, de preferência in vitro, catalisa a conversão de sacarose em frutose e alfa-1,4-glucanos insolúveis em água. O seguinte esquema de reação é sugerido para esta enzima Sacarose+(alfa-1,4-D-glucano)n D-frutose+(alfa-1,4-glucano)m.i Este é uma reação de transglicosilação. Os produtos desta reação in vitro são frutose e alfa-1,4-glucanos insolúveis em água.

Co-fatores ou açúcares ativados por nucleotídeo não são necessários para esta reação. A enzima, no entanto, é estimulada in vitro pela presença de aceitantes de grupo de glicosila (ou iniciadores), como, por exemplo, sacarídeo de maltooligo, dextrina ou glicogênio sobre os quais o resíduo de glicosila da sacarose é transferido de acordo com o esquema de reação acima com extensão de cadeia de alfa-1,4-glucano concomitante (Remaud-Simeon e outros, Em S. B. Peterson, B. Svenson and S. Pedersen (Eds.), Carbohydrate bioengineering,. 313-320 (1995); Elsevier Science B. V., Amsterdam, Países Baixos).

Dentro da presente invenção, em princípio, todas as amilossa-carases são adequadas que catalisam a síntese de alfa-1,4-glucanos lineares a partir de sacarose.

Amilossacarases até agora apenas foram conhecidas de espécie bacteriana, em particular principalmente da espécie Neisseria (MacKenzie e outros, Can. J. Microbiol. 24 (1978) 357-362).

Portanto, uma amilossacarose de origem procariótica é de preferência usada. Amilossacarases são conhecidas, por exemplo, da Neisseria perflava (Okada e Hehre, J. Biol. Chem. 249 (1974), 126-135; Mackenzie e outros. Can. J. Microbiol. 23 (1977), 1303-1307) ou Neisseria canis, Neisseria cinerea, Neisseria denitrificans, Neisseria sicca e Neisseria subflava (MacKenzie e outros, Can. J, Microbiol. 24 (1978), 357-362). Além do mais, a WO 95/31553 e o PCT/EP 98/05573 descrevem uma amilossacarase oriunda de Neisseria polysaccharea.

Em uma concretização preferida da invenção a molécula de ácido nucléico codifica uma amilossacarase oriunda de uma bactéria do gênero Neisseria.

Em uma concretização particularmente preferida da invenção a molécula de ácido nucléico estranha codifica uma amilossacarase oriunda de Neisseria polysaccharea, mais de preferência uma amilossacarase com a sequência de aminoácidos ou ácidos nucléicos como revelada no pedido de patente internacional PCT/EP 98/05573. A enzima que é expressa em Neisseria polysaccharea é extra-mamente estável, esta ligada firmemente aos produtos de polimerização e é competitivamente inibida pela frutose de produto de reação (MacKenzie e outros, Can. J. Microbiol. 23 (1977) 1303-1307). Com a espécie de Neisseria Neisseria polysaccharea a amilossacarase é secretada (Riou e outros, Can. J. Microbiol. 32 (1986), 909-911), enquanto que com outra espécie de Neisseria permanece na célula.

Uma enzima de ramificação (alfa-1,4-glucano; alfa-1,4-glucano 6-glicosiltransferase, E.C.2.41.18) é uma proteína que catalisa uma reação de transglicolisaçãc» em que ligações de alfa-1,4 de um doador de alfa-1,4-glucano são hidrolisadas e as cadeias de alfa-1,4-glucano estabelecidas livres neste processo são transferidas sobre uma cadeia aceitante de alfa-1,4-glucano e desse modo transformadas em ligações de alfa-1,6.

Em ligação com a presente invenção, em principio, todas as enzimas de ramificação de qualquer origem bacteriana (bacteriano, fungico, planta, animal) são adequadas, por exemplo, enzimas de ramificação oriundas de milho (ver, por exemplo, Baba et al., Biochem. Biophys. Res. Com-mun. 181 (1991), 8794; Genbank Acc. N2 AF072724, AF072725), oriundas de batata (Kossmann et al., Mol. Gen. Genet. 203 (1991), 237-244; Jobling et al„ Genbank Acc. N2 AJ011885), oriundas de arroz (Mizuno et al., J. Biochem. 112 (1992), 643-651; Kawasaki et al., Mol Gen. Genet. 237 (1993), 10-16; Mizuno et al., J. Biol. Chem. 268 (1993), 190844-19091; Nakamura and Yamanouchi, Plant Physiol, 99 (1992), 1265-1266), oriundas de trigo (Baga et al., Plant Mol. Biol. 40 (1999), 1019-1030; Rahman et al,. Theor. Appi. Genet. 98 (1999), 156-163 and Genbank Acc. N-' Y12320), oriundas de cevada (Genbank Acc. N9 AF064561), oriundas Synechocystis (Genbank Acc. N9 D63999), oriundas de E.coli (Baecker et al., J. Biol. Chem. 261 (1986), 8738-8743; Genbank Acc. Nc-‘ M13751), oriundas de Bacillus stea-rothermophilus (Genbank Acc. No M35039), Streptomyces aureofaciens (Genbank Acc. N9 L11647), Bacillus caldolyticus (Genbank Acc. N2 Z14057), Synechococcus PCC6301 (Genbank Acc. N2 M31544), Synechococcus sp. PCC7942 (Kiel et al., Gene 78 (1989), 9-17) e oriundas de Agrobacterium tumefaciens (Genbank Acc. N9 AF033856). O isolamento dos genes correspondentes é possível para a pessoa versada na técnica por meio de procedimentos padrão biológicos moleculares, como descritos, isto é, por Sambrook et al. (Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor La- boratory Press, NY, USA (1989)).

Em uma concretização preferida da invenção a molécula de ácido nucléico estranha codifica uma enzima de ramificação oriunda de um procariote, de preferência oriunda de uma bactéria do gênero Neisseria, com particular preferência oriunda de Neisseria denitrificans e ainda mais de preferência preferida para uma enzima de ramificação com uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID N° 1 ou com a seqüência de ami-noácidos mostrada em SEQ ID NQ 2.

Em uma outra concretização preferida a molécula de ácido nucléico estranha codifica uma enzima de ramificação de planta. Há uma variedade de técnicas para a introdução de DNA para dentro de uma célula de hospedeiro de planta. Estas técnicas compreendem a transformação de células de planta com T-DNA usando-se Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes como agente de transformação, a fusão de protoplastos. a injeção, a eletroporação de DNA, a introdução de DNA com a abordagem biolística bem como outras possibilidades. O uso da transformação medida por Agrobacterium de células de planta foi examinado intensivamente e foi descrito suficientemente em EP 0 120516; Hoekema, IN: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), capítulo V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sei. 4, 1-46 e An et al. EMBO J. 4, (1985). 277-287. Para a transformação de batata, ver por exemplo, Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8, (1989), 2933). A transformação de plantas monocotiledôneas por meio de vetores com base em Agrobacterium foi descrita (Chan et al., Plant Mol. Biol. 22, (1993), 491-506; Hiei et al., Plant J. 6, (1994) 271-282; Deng et al., Science in China 33, (1990), 28-34; Wilmink et al., Plant Cell Reports 11, (1992), 7680; May et al., Bio/Technology 13, (1995), 486-492; Connor and Domisse, Int. J. Plant Sei. 153 (1992), 550-555; Ritchie et al., Trangenic Res. 2, (1993), 252-265). Um sistema alternativo para a transformação de plantas monocotiledôneas é a transformação com a abordagem biolística (Wan and Lemaux, Plant Physiol. 104, (1994), 37-48; Vasil et al., Bio/Technology 11 (1993), 1553-1558; Ritala et al., Plant Mol. Biol. 24, (1994), 317-325; Spen- cer et al., Theor. Appl. Genet. 79, (1990), 625-631), a transformação de protoplasto, a eletroporação das células parcialmente permeabilizadas, a introdução de DNA via fibras de vidro. A transformação de milho, em particular, foi descrito na literatura repetidamente (cf. por exemplo, WO 95/06128, EP 0513849, EP 0465875, EP 0 292435; Fromm et al., Biotechnology 8, (1990), 833-844; Gordon-Kamm et al., Plant Celi 2, (1990), 603618; Koziel et al., Biotechnology 11 (1993), 194-200; Moroc et al., Thear. Appl. Genet. 80, (1990), 721-726). A transformação bem sucedida de outra espécie de grão, demasiadamente, já foi descrita, por exemplo, para cevada (Wan and Lernaux, ver acima; Ritala et al., ver acima; Krens et al., Nature 296, (1982), 72-74) e para trigo (Nehra et al., Plant J. 5, (1994), 285-297).

Em geral qualquer promotor ativo em células de plantas pode ser usado para a expressão da molécula de ácido nucléico estranha (moléculas de ácido nucléico estranhas). O promotor pode ser escolhido em tal modo que a expressão nas plantas da invenção ocorre constitutivamente ou apenas em um tecido certo, em um certo ponto no tempo do desenvolvimento da planta ou em um tempo determinado por fatores que excercem influência externa. Com referência à planta o promotor pode ser homólogo ou heterólogo.

Promotores apropriados são, por exemplo, o promotor de RNA 35S do Vírus de Mosaico de Couve-Flor e o promotor de ubiquitina de milho para uma expressão constitutiva, o promotor de gene de patatina B33 (Ro-cha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) para uma expressão específica de tubérculo em batatas ou um promotor o qual garante uma expressão apenas em tecido fotossinteticamente ativo, por exemplo, o promotor de ST-LS1 promoter (Stockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987), 79437947; Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445-2451), o promotor de Ca/b (ver, por exemplo, a patente U.S. Ng 5656496, a patente U.S. Ns 5639952, Bansai et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, (1992), 3654-3658) e o promotor de Rubisco SSU (ver, por exemplo, a patente U.S. N-' 5034322, a patente U.S. N9 4962028) ou o promotor de glutelina para uma expressão específica de endoesperma (Leisy et al., Plant Mol. Biol. 14, (1990), 41-50; Zheng et al., Plant J. 4, (1993). 357-366; Yoshihara et al.. FEBS Lett. 383, (1996), 213-218), o promtor de shrunken-1 (Werr et al., EMBO J. 4, (1985), 13731380), o promotor de HMG de trigo, o promotor de USP, o promotor de fa-seolina ou promotores de genes de zeína de milho (Pedersen et al,, Cell 29, (1982), 1015-1026; Quatroccio et al.. Plant Mol. Biol. 15(1990).81-93). A expressão da molécula de ácido nucléico estranha (as moléculas de ácido nucléico estranhas) é particularmente vantajosa naqueles órgãos da planta que têm um teor de sacarose aumentada ou que armazena sacarose. Tais órgãos são, por exemplo, o nabo da beterraba ou o tronco da cana-de-açúcar ou de painço de açúcar. Portanto de preferência promotores usados são aqueles que mediam a expressão nestes órgãos. Outros promotores, no entanto, podem também ser usados, isto é, aqueles que são apenas ativos em um ponto no tempo determinado por fatores que excercem influência externa (cf. por exemplo, a WO 9307279). Aqui, promotores de proteína de choque térmico podem ser de interesse especial como eles permitem uma indução simples. Além do mais, promotores específicos de semente tal como, por exemplo, o promotor de USP oriundo de Vicia faba, que garante uma expressão específica de semente em Vicia faba e outras plantas, podem ser usados (Fiedler et al., Plant Mol. Biol. 22, (1993), 669679; Bâumlein et al., Mol. Gen. Genet. 225, (1991). 459-467). Além do mais, promotores específicos de fruta podem ser usados, como descritos, por exemplo, na WO 91/01373, WO 99/16879, em em van Haaren and Houck (Plant Mol. Biol. 21 (1993), 625-640).

Além disso, uma seqüência de determinação pode estar presente que é útil para a terminação correta de transcrição bem como para a adição de extremidade de poli-A ao transcrito que é atribuído uma função na estabilização dos transcritos. Tais elementos foram descritos na literatura (cf., por exemplo, Gielen e outros, EMBO J. 8 (1989), 23-29 e são arbitaria-mente intercambeável.

As células de plantas da invenção podem ser diferenciadas de células de plantas de ocorrência natural entre outras pelo fato de que elas contêm uma ou mais molécula(s) de ácido nucléico estranha(s) que não naturalmente ocorre(m) nestas células ou que tal (a) molécula(s) é(são) encontrada^) integrada(s) em tal lugar no genoma das plantas onde ela(elas) não ocorre(m) normalmente, isto é, em uma outra adjacência genômica. Além do mais, tais células de plantas transgênicas da invenção podem ser diferenciadas das células de plantas de ocorrência natural quando elas contêm pelo menos uma cópia da molécula de ácido nucléico estranha (moléculas de ácido nucléico estranhas) estavelmente integradas em seu genoma, possivelmente além das cópias de tal molécula que ocorrem naturalmente nas células de planta. Se a(s) molécula(s) de ácido nucléico que é(são) introduzida(s) na célula é(são) uma cópia(s) adicional(ais) de moléculas que ocorrem naturalmente nas plantas então as células de planta da invenção podem ser diferenciadas de células de plantas de ocorrência natural particularmente pelo fato de que esta(estas) cópia(s) adicional(ais) está(estão) localizada(s) nos lugares no genoma onde ela(elas) não ocorrem naturalmente. Isto pode ser testado, por exemplo, por análise de Southern Blot.

Além do mais, as células de plantas da invenção podem ser diferenciadas de células de plantas de ocorrência natural de preferência por uma das seguintes características: se a(s) molécula(s) de ácido nucléico introduzida(s) for(em) heteróloga com referência à planta, as células de planta transgênicas mostram transcritos das moléculas de ácido nucléico introduzidas. Estas podem ser detectadas, por exemplo, na análise de Northern Blot. De preferência, as células de planta da invenção contêm proteínas que são codificadas pela(s) molécula(s) de ácido nucléico estranha(s). Isto pode ser testado, por exemplo, por métodos imunológicos, em particular por análise de Western Blot.

Se a molécula introduzida for homóloga com referência à planta, as células de plantas transgênicas da invenção podem ser diferenciadas de células de plantas de ocorrência natural, por exemplo, devido à expressão adicional das moléculas de ácido nucléico estranhas introduzidas. As células de plantas transgênicas de preferência contêm mais transcritos das mo- léculas de ácido nucléico estranhas. Isto pode ser testado, por exemplo, por análise de Northern Blot. O termo "geneticamente modificado" significa que a célula de planta é modificada em sua informação genética por introdução de uma molécula de ácido nucléico estranha ou várias moléculas de ácido nucléico estranhas e que a presença ou a expressão de molécula(s) de ácido nucléico estranha(s) leva(m) a uma mudança fenotípica. Desse modo mudança fenotípica de preferência significa uma mudança mensurável de uma ou mais funções das plantas (células de plantas). As células de plantas da invenção, por exemplo, mostram uma atividade aumentada de uma proteína com amilossacarase e de uma proteína com atividade de enzima de ramificação devido à presença ou à expressão da molécula de ácido nucléico introduzida.

No quadro da presente invenção o termo "atividade aumentada" significa uma expressão aumentada da molécula de ácido nucléico (várias moléculas de ácido nucléico) que codifica uma proteína com atividade de amilossacarase e uma proteína com atividade de enzima de ramificação ou um aumento na atividade de uma proteína com atividade de amilossacarase e de uma proteína com atividade de enzima de ramificação nas plantas.

Um aumento da expressão pode ser determinado, por exemplo, por medição da quantidade de transcritos que codificam tais proteínas, por exemplo, por análise de Northern Blot. Ali, uma aumento de preferência significa um aumento na quantidade de transcritos em comparação com células de plantas geneticamente não modificadas correspondentes por pelo menos 10%, de preferência por pelo menos 20%, com particular preferência por pelo menos 50% e com especial preferência por pelo menos 75%. O aumento na quantidade de proteína com atividade de amilossacarase ou com atividade de enzima de ramificação pode ser determinado, por exemplo, por análise de Western Blot. Um aumento de preferência significa um aumento na quantidade de proteína com atividade de amilossacarase ou com atividade de enzima de ramificação e/ou um aumento na atividade de amilossacarase ou na atividade de enzima de ramificação em comparação com células geneticamente não modificadas correspondentes por pelo menos 10%, de preferência por pelo menos 20%, com particular preferência por pelo menos 50% e com especial preferência por pelo menos 75%. A atividade da proteína de amilossacarase e da enzima de ramificação podem, por exemplo, serem testadas como descritas nos exemplos. Além do mais, a atividade de uma enzima de ramificação pode ser determinada como descrita em Lloyd eta; (Biochem. J. 338 (1999), 515-521). A atividade de amilossacarase pode também ser determinada como descrita abaixo na seção "Materiais e Métodos ..." seção 3.

Surpreendentemente, descobriu-se, que plantas contendo tais células de plantas com atividade aumentada de uma amilossacarase e de uma síntese de enzima de ramificação alfa-1,4-glucanos alfa-1,6 ramificados com um grau de ramificação modificado na posição 0-6 que não são sintetizadas por células de plantas de tipo selvagem geneticamente não modificadas correspondentes.

Em uma concretização da invenção as células de plantas da invenção contêm alfa-1,4-glucanos alfa-1,6-ramificados com um grau de ramificação na posição 0-6 de pelo menos 2%, de preferência de pelo menos 4%. Em uma outra concretização o grau de ramificação é pelo menos 6%, de preferência pelo menos 8'%, com particular preferência pelo menos 10% e com especial preferência pelo menos 12%.

Dentro do quadro da presente invenção "grau de ramificação" significa o número médio de ramificações na posição 0-6 em comparação com todas as unidades de glicose ligadas de um modo diferente. O grau de ramificação pode ser determinado via uma análise de metilação, como, por exemplo, descrito mais abaixo. Informação geral sobre este método pode também ser encontrada, por exemplo, em "Analysis of Carbohydrates by GLC e MS" (Biermann, C. J. e McGinnis, G. D (eds) CRC Press (1989) capítulo 9 por Carpita, N. C. e Shea, E. M., 157-216) ou em Biõrndal H. e outros (Angew. Chem., 82, (1970), 643-652; Int. Ed. Engl. 9, (1970), 610-619).

Em uma outra concretização da invenção as células de plantas da invenção sintetizam amidos modificados que diferem de amidos de células de plantas de tipo selvagem correspondentes em suas propriedades fisi-co-químicas, em particular a razão de amilose/amilopectina, o grau de ramificação, o comprimento médio de cadeia, o teor de fosfato, as propriedades de formação de pasta, o tamanho e/ou a forma do grânulo de amido. Em particular, tal amido pode ser modificado com referência a viscosidade e/ou a capacidade de formação de gel de pastas de amido em comparação com amido de tipo selvagem.

Em uma outra concretização da invenção plantas que contêm as células de plantas da invenção têm uma rendimento mais alto em comparação com plantas de tipo selvagem geneticamente não modificadas correspondentes.

Dentro da presente invenção, o termo "planta de tipo selvagem" significa que as plantas serviram como materiais de partida para a produção das plantas da invenção, isto é, cuja informação genética, além da modificação genética introduzida, corresponde àquela de uma planta da invenção.

Aqui, o termo "rendimento aumentado" significa um aumento do rendimento por pelo menos 5%, de preferência por pelo menos 10%, com particular preferencia por pelo menos 20% e com especial preferência por pelo menos 30%. O termo "rendimento aumentado" significa de preferência um aumento na produção de substâncias e/ou biomassas, em particular quando medido com base no peso fresco por planta.

Tal aumento no redimento de preferência refere-se a partes de planta que podem ser coletadas tais como sementes, fruta, raízes de armazenagem, raízes, tubérculos, flor, botão, broto, troncos ou madeira.

De acordo com a invenção o aumento em rendimento é pelo menos 3% com referência às substâncias de biomassa e/ou teor em comparação com plantas não transformadas correspondentes do mesmo tipo de genoma se cultivadas sob as mesmas condições, de preferência pelo menos 10%, com particular preferência pelo menos 20% e com especial preferência pelo menos 30% ou ainda 40% em comparação com plantas de tipo sei- vagem.

Em uma outra concretização da presente invenção as células de plantas da invenção têm um valor calórico aumentado em comparação com células de plantas de tipo selvagem não geneticamente modificadas correspondentes. O termo "valor calórico" é definido como a quantidade de energia (dada em calorias ou joule) o corpo consegue com a digestão de alimento e que é usada para cobrir necessidades de energia. O termo "valor calórico aumentado" significa um aumento no valor calórico por pelo menos 5%, de preferência por pelo menos 10%, com particular preferência por pelo menos 20% e com especial preferência por pelo menos 30%..

Plantas com valores calõricos altos são de interesse para as indústrias alimentícias, em particular para a dieta de pessoas com necessidade alta de energia, tais como, por exemplo, pessoas doentes ou idosas, de crianças ou de atletas competitivos.

Em uma concretização preferida a seqüència de nucleotídeos que codifica uma enzima de amilossacarase e uma enzima de ramificação compreendem uma seqüència de sinal de direcionamento de proteína que assegura a localização em um compartimento celular específico, tal como o vacúolo ou os plastídios. Em uma concretização particularmente preferida as seqüências de nucleotídeos que codificam as duas enzimas compreendem uma seqüència de sinal de direcionamento de proteína que assegura que ambas as enzimas estão localizadas no mesmo compartimento celular. Neste contexto, a molécula de ácido nucléico estranha pode compreender uma ou mais seqüência(s) de sinal de direcionamento de proteína que as-segura(m) a localização da enzima de amilossacarase e a enzima de ramificação no mesmo compartimento celular. É em particular possível que cada região de codificação que codifica a amilossacarase ou a enzima de ramificação compreeda mais do que uma seqüència de combinação ou uma combinação de seqüências de sinal diferentes.

Em uma outra concretização da invenção a molécula de ácido nucléico estranha tem uma ou mais seqüência(s) de sinal de direcionamento de proteína que media(m) uma localização vacuolar da proteína de amilos-sacarase e da enzima de ramificação.

As moléculas de ácido nucléico que codificam a enzima de amilossacarase e a enzima de ramificação que estão ambas contidas na 'molécula de ácido nucléico estranha" podem ou estar sob o controle de uma ou de várias seqüência(s) de sinal de direcionamento de proteína independentemente entre si ou elas podem estar sob o controle de uma ou de várias seqüência(s) de sinal de direcionamento de proteína juntas depois da fusão como unidade traducional.

Em uma concretização da invenção as moléculas de ácido nucléico estranhas têm uma, cada ou várias seqüência(s) de sinal de direcionamento de proteína cada uma mediando uma localização vacuolar da proteína de amilossacarase e da enzima de ramificação.

Nesta concretização várias moléculas de ácido nucléico estranhas são introduzidas para dentro do genoma da célula de planta em que uma molécula de ácido nucléico estranha codifica uma proteína de amilossacarase e uma outra molécula de ácido nucléico codifica uma enzima de ramificação. Como mencionado anteriormente, as moléculas de ácido nucléico estranhas podem ser introduzidas para dentro do genoma da célula de planta simultaneamente ou consecutivamente.

Cada uma das moléculas de ácido nucléico estranhas contém uma ou mais seqüência(s) de sinal de direcionamento de proteína que me-dia(m) uma localização vacuolar de cada proteína de amilossacarase e a enzima de ramificação em que as seqüências de sinal de direcionamento de proteína podem ser idênticas ou podem ser diferentes entre si. A seqüência N-terminal (146 aminoácidos) da proteína de pata-tina, por exemplo, pode ser usada como uma seqüência de direcionamento vacuolar (Sonnewald e outros, Plant J. 1, (1998), 95-106). Em uma concretização preferida a seqüência de sinal descrita em SEQ ID NO: 7 é usada. Além do mais, as seguintes seqüências de sinal podem ser usadas como seqüências de direcionamento vacuolar: a seqüência de sinal N-terminal da invertase de ácido de tomate (Genbank Acc. N9 LMS1081) ou de batata (Genbank Acc. N2 L29099), a seqüência de sinal N-terminal daesporamina de batata doce (Koide et al., Plant Physiol. 114 (1997), 863-870), a seqüência de sinal N-terminal da aleuraina de cevada (Vitale and Raikhel, Trends in Plant Science 4 (1999), 149-155), a seqüência de sinal N-terminal do inibidor de proteinase da batata (Genbank Acc. NQ X04118) em combinação com o peptídeo de sinal de direcionamento vacuolar C-terminal de lectina de cevada (Vitale and Raikhel, loc. cit.), Outras seqüèncias de sinal vacuolar são descritas, por exemplo, Matsuoka and Neuhaus, Journal of Experimental Botany 50, (1999), 165174; Chrispeel and Raikel, Cell 68 (1992), 613-616; Matsuoka and Nakamu-ra, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88, (1991), 834-838; Bednarek and Raikhel, Plant Cell 3, (1991), 1195-1206; Nakamura and Matsuoka, Plant Phys. 101, (1993), 1-5. Em geral, uma combinação pode ser usada compreendendo uma seqüência de sinal N-terminal, que assegura o transporte da proteína respectiva para dentro do retículo endoplásmico, e a seqüência de direcionamento vacuolar C-terminal. Uma visão geral sobre as seqüèncias de direcionamento vacuolar pode ser encontrada em Chrispeels and Raikhel (Cell 68(1992), 613-616).

Uma vez que vacuolo pode usualmente armazenar grandes quantidades de sacarose que serve como substrato para a amilossacarase, este compartimento é adequado para produzir células de plantas que, devido a uma atividade aumentada de uma proteína de amilossacarase e uma atividade aumentada de uma enzima de ramificação sintetizam alfa-1,4-glucanos alfa-1,6-ramificados no vacúolo. Em uma concretização da invenção estes glucanos na posição 0-6 têm um grau de ramificação de pelo menos 1%, de preferência pelo menos 4%, com particular preferência de pelo menos 7% e com especial preferência de pelo menos 10%.

Em uma outra concretização da invenção o grau de ramificação na posição 0-6 pode ser controlado por seleção de plantas transgênicas que mostra diferentes razões de atividade de enzima de ramificação para atividade de amilossacarase.

Em uma concretização particularmente preferida células de planta de acordo com a invenção em que tanto a amilossacarase quanto a enzima de ramificação estão localizadas no vacúolo, mostram um valor caló-rico aumentado. Para a definição deste termo, ver acima.

Em uma outra concretização da invenção a molécula de ácido nucléico estranha tem uma ou mais seqüência(s) de sinal de direcionamento de proteína que media(m) uma localização plastídica da proteína de amilossacarase e da proteína de enzima de ramificação.

As moléculas de ácido nucléico para. a enzima de amilossacarase e para a enzima de ramificação estão ambas contidas na "molécula de ácido nucléico estranha" podem ou, independentemente entre si, estar sob o controle de uma ou mais seqüência(s) de sinal de direcionamento de proteína cada ou elas podem, depois da fusão como unidade traducional, estar sob o controle de uma ou mais seqüência(s) de sinal de direcionamento de proteína.

Em uma outra concretização da invenção as moléculas de ácido nucléico estranhas tem uma ou mais seqüência(s) de sinal de direcionamento de proteína cada que media(m) uma localização plastídica da proteína de amilossacarase e da proteína de enzima de ramificação.

Nesta concretização várias moléculas de ácido nucléico estranhas são introduzidas para dentro do genoma da célula de planta em que uma molécula de ácido nucléico estranha codifica uma proteína de amilossacarase e uma outra molécula de ácido nucléico estranha codifica uma enzima de ramificação. Como mencionado anteriormente, as moléculas de ácido nucléico estranhas podem ser introduzidas para dentro do genoma da célula de planta simultaneamente ou consecutivamente.

Cada uma das moléculas de ácido nucléico estranhas introduzidas contém uma ou mais seqüência(s) de sinal de direcionamento de proteína que media(m) uma localização plastídica de cada uma da proteína de amilossacarase e da proteína de enzima de ramificação em que as seqüên-cias de sinal de direcionamento de proteína são idênticas ou diferentes entre si. A seqüência de sinal de ferrodoxina:NADP+ oxidorredutase (FNR) de espinafre, por exemplo, pode ser usada como a seqüência de sinal. A seqüência contém a região não traduzida 5’ bem como a seqüência de peptídeo de trânsito de flanqueamento do cDNA da proteína plastídica ferrodoxina:NADP+ oxidorredutase de espinafre (nucleotídeo -171 a +165; Jansen e outros, Current Genetics 13, (1988), 517-522).

Além disso, por exemplo, o peptídeo de trânsito de proteína ce-rosa de milho mais os primeiros 34 aminoácidos da proteína cerosa madura (Klõsgen e outros, Mol. Gen. Get. 217, (1989), 155-161) podem ser usados como a seqüência de sinal.

Outras seqüências de direcionamento plastídico que podem ser usadas são: a seqüência de sinal de subunidade pequena de Rubisco (Wolter e outros, Proc. Nati. Acad. Sei. USA 85 (1988), 846-850; Nawrath e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91 (1994), 12760-12764), a seqüência de sinal da desidrogenase de NADP-maleato (Gallardo e outros, Planta 197 (1995), 324-332) e a seqüência de sinal da redutase de glutation (Creissen e outros, Plant J. 8 (1995), 167-175).

Em uma concretização preferida da invenção o peptídeo de trânsito da proteína cerosa de milho (ver acima) é usado (ver o exemplo 1) sem os primeiros 34 aminoácidos da proteína cerosa madura.

Em uma concretização particularmente preferida a seqüência de sinal plastídica da proteína de R1 oriunda de batata é usada (Lorberth e outros, Nature Biotechnology 16 (1998), 437-477).

Com a expressão amiloplastídica de frutosiltransferase bacteria-na poderia ser demonstrado que os plastídios também contêm sacarose que pode ser transformada em "amilofrutano" pela frutosiltransferase em amilo-plastos (Smeekens, Trends in Plant Science Vol. 2 N- 8 (1997), 286-288). Portanto o compartimento é também adequado para a expressão combinada de um gene de amilossacarase e um gene de enzima de ramificação e permite a síntese de amido modificado que é modificado, por exemplo, em suas propriedades fisico-químicas, particularmente a razão de amilose/amilopec-tína, o grau de ramificação, o comprimento médio de cadeia, o teor de fosfato, as propriedades de formação de pasta, o tamanho e/a forma do grânu- Io de amido em comparação com amido sintetizado em plantas de tipo selvagem.

Portanto, em uma outra concretização da invenção as células de plantas transgênicas da invenção sintetizam amidos modificados.

Em uma concretização preferida da invenção a estabilidade de gel destes amidos é mudada em comparação com amidos extraídos de plantas de tipo selvagem. Em uma concretização particularmente preferida a estabilidade de gel máxima é aumentada por pelo menos 20%, mais de preferência por pelo menos 50%, ainda mais de preferência por pelo menos 100% e com especial preferência por pelo menos 200% em comparação com amidos extraídos de plantas de tipo selvagem. A estabilidade de gel pode ser determinada como descrita no exemplo 9.

Os amidos isolados das células de plantas da invenção podem também ser modificados de acordo com os métodos conhecidos pela pessoa versada na técnica, são adequados tanto em forma modificada quanto não modificada para várias aplicações nos setores alimentícios e não alimentícios.

Em princípio, a área de aplicação do amido pode ser subdividida em duas grandes áreas. Uma área compreende os produtos de hidrólise de amidos, principalmente componentes de glucano e glicose que são obtidos via métodos enzimáticos ou químicos. Eles servem como material de partida para outras modificações e processos químicos, tal como fermentação. Com referência a redução de custos a simplicidade e a condução eficiente de custo de um método de hidrólise pode ser de importância. No momento, ele é principalmente enzimático quando amiloglicoseidase é usada. Seria concebível proteger custos por redução da quantidade de enzimas usadas. Uma modificação da estrutura do amido, por exemplo, extensão de superfície do grão, digestibilidade mais fácil através do grau de ramificação mais baixo ou uma estrutura estérica que limita a acessabilidade para as enzimas usadas podería conseguir aquilo. A outra área em que o amido é usado devido à sua estrutura de polímero com assim chamado amido nativo pode ser dividida em duas ou- tras áreas de aplicação: 1. Indústria alimentícia Amido é um aditivo clássico de vários alimentos, onde essencialmente ele serve a finalidade de ligar aditivos aquosos ou causa viscosidade aumentada ou formação de gel aumentado. Características importantes comportamento de sorção e fluxo, temperatura de entumescimento e de formação de pasta, desempenho de viscosidade e de espessamento, solubi-lidade do amido, estrutura de transparência e de pasta, capacidade de formação de película, resistência a congelamento/descongelamento, digestibi-lidade bem como a capacidade de formação de complexo com, por exemplo, íons orgânicos ou inorgânicos. 2. Industria não alimentícia Nesta vasta área amido pode ser usado como um auxiliar em vários processos de produção ou como um aditivo em produtos técnicos. O principal campo onde amido é usado como um auxiliar é a indústria de papel e papelão. Neste campo onde amido é principalmente usado para retenção (reter sólidos) para a colagem de material de carga e partículas finas, como substância de solidificação e para desidratação. Além disso, as propriedades vantajosas de amido com referência a rigidez, dureza, som, tenacidade, brilho, lisura, resistência a rasgamento bem como as superfícies são usadas. 2.1 Industria de papel e papelão Dentro do processo de produção de papel, uma diferenciação pode ser feita entre quatro campos de aplicação, a saber, superfície, revestimento, massa e borrifamento.

As exigências sobre amido com referência ao tratamento de superfície são essencialmente um alto grau de brilho, viscosidade correspondente, alta estabilidade de viscosidade, boa formação de película bem como pouca formação de poeira. Quando usado em revestimento o teor de sólido, uma viscosidade correspondente, uma alta capacidade de ser ligar bem como uma alta afinidade de pigmento desempenham um papel importante. Como um aditivo para a massa uniforme, rápida, dispersão livre de óleo, alta estabilidade mecânica e retenção completa na polpa de papel são de importância. Quando do uso do amido em borrifamento, teor correspondente de sólidos, alta viscosidade bem como alta capacidade de se ligar são também significativos. 2.2 Indústria de adesivo Um principal campo de aplicação é, por exemplo, na indústria de adesivo, onde o amido e usado em quatro áreas: o uso como cola de amido pura, o uso em colas de amido preparadas com produtos químicos especiais, o uso de amido como um aditivo para resinas sintéticas e dispersões de polímero bem como o uso de amidos como diluentes para adesivos sintéticos. 90% de todos os adesivos à base de amido são usados na produção de papelão corrugado, sacos e bolsas de papel, materiais de compósito para papel e alumínio, caixas e cola de umedecimento para envelopes, selos, etc. 2.3 Indústria têxtil e de cuidado têxtil Um outro possível uso de amido como auxiliar e aditivo é na produção de produtos de cuidado têxtil e têxteis. Dentro da indústria têxtil, uma diferenciação pode ser feita entre os seguintes quatro campos de aplicação: o uso de amido como um agente de colagem, isto é, um auxiliar para alisamento e fortalecimento do comportamento de afinação para a proteção contra agente de forças de tensão em tecelagem bem como para o aumento de resistência a uso durante a tecelagem, como um agente para o aperfeiçoamento têxtil principalmente depois do pré-tratamento deteriorante de qualidade, tais como alvejamento, tingimento. etc., como espessante na produção de pastas de corante para a prevenção de difusão de corante e como um aditivo para os agentes de urdimento para fios de costura. 2.4 Indústria de construção A quarta área de aplicação de amido é seu uso como um aditivo em materiais de construção. Um exemplo é a produção de prancha de emplastro de gesso, em que o amido é misturado nos pastificadores de emplastro fino com a água, difunde na superfície da prancha de gesso e assim liga o papelão à prancha. Outros campos de aplicação são misturados com emplastro e fibras minerais. Em concreto pronto para o uso, amido pode ser usado para a desaceleração do processo de colagem. 2.5 Estabilização do solo Além do mais, o amido é vantajoso para a produção de meio para estabilização de solo usado para a proteção temporária de partículas do solo contra água em deslocamento de terra artificial. De acordo com o conhecimento do estado da técnica, produtos de combinação que consistem em emulsões de polímero e amido podem ser considerados ter os mesmo efeitos de redução de erosão e de encrustação como os produtos usados até agora; no etanto, eles são consideravelmente menos caros. 2.6 Uso de amido em fertilizantes e protetores de plantas Um outro campo de amplicação é o uso de amido em protetores de planta para a modificação das propriedades especificas destas preparações. Por exemplo, amidos são usados para aperfeiçoar o umedecimento de protetores e fertilizantes, para a liberação dosada dos ingredientes ativos, para a conversão de ingredientes ativos de aroma e/ou voláteis, líquidos em substâncias deformáveis, estáveis, microcristalinas, por misturação de composições incompatíveis e para o prolongamento da duração de efeito devido a decomposição mais lenta. 2.7 Indústria de drogas, remédios e de cosméticos Amido pode também ser usado nos campos das drogas, remédios e na indústria de comésticos. Na indústria farmacêutica, o amido pode ser usado como um aglutinante para comprimidos ou para a diluição do aglutinante em cápsulas. Além do mais, amido é adequado como desinte-grante para comprimidos uma vez que, no engolimento, ele absorve fluido e depois de um tempo curto ele incha tanto que o ingrediente ativo é liberado. Por razões qualitativas, pós lubrificantes médicos e pós médicos para ferimentos são à base de amido. No campo de cosméticos, o amido é usado, por exemplo, como veículo de aditivos de pó, tais como perfume e ácido sa-licílico. Um campo relativamente vasto de aplicação para amido é a pasta de dente. 2.8 Amido como um aditivo em carvão e briquetes Amido pode também ser usado como um aditivo em carvão e briquetes. Por adição de amido, o carvão pode ser quantitativamente aglomerado e/ou briquetado em alta qualidade, assim evitando desintegração prematura dos briquetes. Carvão de churrasco contém entre 4 e 6% de amido adicionado, carvão "calorado" entre 0,1 e 0,5%. Além do mais, o amido se torna mais e mais importante como um agente de ligação uma vez que adição dele a carvão e briquete pode consideravelmente reduzir a emissão de substâncias tóxicas. 2.9 Processamento de pasta de carvão e minério Além do mais, o amido pode ser usado como uma agente de floculação no processamento de pasta de carvão e minério. 2.10 Amido como um aditivo em moldaqem Um outro campo de aplicação é o uso de amido como um aditivo para materiais de processo em moldagem. Para vários processos de molda-gem núcleos produzidos a partir de areias misturadas com agentes de ligação são necessários. Hoje em dia. o agente de ligação mais comumente usado é a bentonita misturada com amidos modificados, a maioria das vezes amidos de intumescimento. A finalidade de adição de amido é resistência a fluxo aumentada bem como resistência à ligação aumentada. Além do mais, amidos de intumescimento podem preencher outros pré-requisitos para o processo de produção, tais como dispersabilidade em água fria, reidratabilidade, boa mistu-rabilidade em área e alta capacidade de ligar água. 2.11 Uso de amido na indústria de borracha Na indústria de borracha amido pode ser usado para aperfeiçoar a qualidade técnica e ótica. Razões para isto são brilho de superfície aperfeiçoado, tenacidade e aparência. Para esta finalidade, amido é disperso sobre a superfícies engomadas pegajosas e substância de borracha antes da vulcanização a frio. Ele pode também ser usado para aperfeiçoamento de estampabilidade de borracha. 2.12 Produção de substitutos de couro Um outro campo de aplicação para o amido modificado é a produção de substitutos de couro. 2.13 Amido em polímeros sintéticos No mercado de plásticos os seguintes campos de aplicação estão aparecendo: a integração de produtos derivados de amido no processo de processamento (amido é apenas uma carga, não há ligação direta entre o polímero sintético e o amido) ou, alternativamente, a integração de produtos derivados de amido na produção de polímeros (amido e polímero formam uma ligação estável). O uso do amido como uma carga pura não pode competir com outras substâncias tais como o talco. Aquelas mudanças quando as propriedades de amido específicas se tornam eficazes e o perfil de propriedade dos produtos finais é assim claramente mudados. Um exemplo é o uso de produtos de amido no processamento de materiais termoplásticos, tal como polietileN- Desse modo, amido e o polímero sintético são combinados em uma razão de 1:1 por meio de co-expressão para formar um master batch, a partir do qual vários produtos são produzidos por meio de técnicas comuns usando-se polietileno granulado. A integração de amido em películas de polietileno pode causar uma permeabilidade de substância aumentada em corpos ocos, permeabilidade de vapor de água aperfeiçoada, comportamento antiestático aperfeiçoado, comportamento antiblocos aperfeiçoado bem como estampabilidade aperfeiçoada com corantes aquosos.

Uma outra possibilidade é o uso do amido em espumas de políu-retaN- Devido à adaptação de derivados de amido bem como devido à otimização de técnicas de processamento, é possível controlar especificamente a reação entre polímeros sintéticos e os grupos hidróxi de amido. Os resultados são películas de poliuretano que conseguem os seguintes perfis de propriedade devido ao uso de amido: um coeficiente reduzido de expansão térmica, comportamento de encolhimento diminuído, comportamento de tensão/pressão aperfeiçoado, permeabilidade de vapor de água aumentado sem uma mudança na aceitação de água, densidade de craqueamento e inflamabilidade reduzida, nenhuma queda de peças inflamáveis, nenhum envelhecimento de halogènio ou envelhecimento reduzido. Desvantagens que presentemente ainda existem são resistência a impacto e pressão redu- zida.

Desenvolvimento de produto de película não é mais a única opção. Também produtos plásticos sólidos, tais como potes, pratos e tigelas podem ser produzidos com teor de amido de mais do que 50%. Além do mais, as misturas de amido/polímero oferecem a vantagem de que elas são biodegradáveis em uma extensão maior.

Além do mais, devido a sua extrema capacidade de ligar água, polímeros de enxerto de amido ganharam importância maior. Estes são produtos tendo uma cadeia principal de amido e uma rede lateral de monômero sintético enxertado de acordo com o princípio de mecanismo de cadeia de radical. Os polímeros de enxerto de amido disponíveis hoje em dia são caracterizados por uma ligação aperfeiçoada e retenção de capacidade de até 1000 g de água por g de amido em uma alta viscosidade. Nos últimos anos estes superabsorvedores foram mais amplamente usados - principalmente no campo da higiene, por exemplo, em produtos tais como fraldas e lençóis, bem como no setor de agricultura, por exemplo, em péletes de semente.

Fatores decisivos para o uso do novo amido modificado por técnicas de DNA recombinantes são, por um lado, estrutra, teor de água, teor de proteína, teor de lipídio, teor de fibra, teor de cinzas/fosfato, razão de amilose/amilopectina, distribuição da massa molar relativa, grau de ramificação, tamanho de grânulo e forma bem como cristalização, e por outro lado, as propriedades que resultam nas seguintes características: comportamento de fluxo e sorção, temperatura de formação de pasta, viscosidade, estabilidade de viscosidade em solução salina, desempenho de espessa-mento, solubilidade, transparência e estrutura de pasta, resistência a ácido, cisalhamento e calor, tendência a retrogradação, capacidade de formação de gel, resistência a congelamento/descongelamento, capacidade de formação de complexo, ligação de iodo, formação de película, resistência a adesivo, estabilidade de enzima, digestibilidade e reatividade. A produção de amido modificado por operação genética com uma planta transgênica pode modificar as propriedades de amido obtidas a partir da planta de modo tal que torne outras modificações por meio de mé- todos físicos ou químicos supérfluos. Por outro lado ao amidos modificados por meio de técnicas de DNA recombinantes poderíam ser submetidos a outras modificações químicas, que resultarão em outro aperfeiçoamento de qualidade para certos dos campos descritos acima de aplicação. Estas modificações químicas são principalmente conhecidas pela pessoa versada na técnica. Estas são particularmente modificações por meio de - tratamento térmico - tratamento com ácido - oxidação e - esterificação levando à formação de fosfato, nitrato, sulfato, xantato, acetato e amidos de citrato. Outros ácidos orgânicos podem também ser usados para a esterificação: - formação dos éteres de amido éter de alquila de amido, éter de O-alila, éter de hidroxialquila, éter de O-carboximetila, éteres de amido contendo N, éteres de amido contendo P e éteres de amido contendo S. - formação de amidos ramificados - formação de polímeros de enxerto de amido.

Em uma outra concretização da invenção molécula de ácido nu-cléico estranha tem uma ou mais seqüência(s) de sinal de direcionamento de proteína que media(m) uma localização especifica de parede celular da proteína de amilossacarase e da enzima de ramificação.

As moléculas de ácido nucléico que codificam a enzima de amilossacarase e a enzima de ramificação que são ambas contidas na "molécula de ácido nucléico estranha1' podem ou estar sob o controle de uma ou de várias seqüência(s) de sinal de direcionamento de proteína independentemente entre si ou elas podem estar sob controle de uma ou de várias seqüência(s) de sinal de direcionamento de proteína juntas depois da fusão como uma unidade traducional.

Em uma outra concretização da invenção as moléculas de ácido nucléico estranhas têm uma ou mais seqüência(s) de sinal de direcionamento de proteína cada uma mediando uma localização específica de parede celular da proteína de amilossacarase e da proteína de enzima de ramifi- cação. Nesta concretização várias moléculas de ácido nucléico estranhas são introduzidas para dentro do genoma da célula de planta em que uma molécula de ácido nucléico estranha codifica uma proteína de amilossaca-rase e uma outra molécula de ácido nucléico estranha codifica uma enzima de ramificação. Como mencionado anteriormente, as moléculas de ácido nucléico estranhas podem ser introduzidas para dentro do genoma da célula de planta simultaneamente ou consecutivamente. No primeiro caso é chamada "co-transformação" no último "supertransformação'1.

Cada uma das moléculas de ácido nucléico estranhas introduzidas contém uma ou mais seqüência(s) de sinal de direcionamento de proteína que media(m) uma localização específica de parede celular da proteína de amilossacarase e da proteína de enzima de ramificação cada uma em que as seqüências de sinal de direcionamento de proteína são iguais ou diferentes entre si.

Quando seqüência de sinal aquela do inibidor de proteinase II oriundo de batata pode ser usada (von Schaewen e outros, EMBO J. 9, (1990), 3033-3044; Keil e outros, Nucleic Acid Research 14, (1986), 56415650).

Em uma outra concretização da invenção a(s) molécula(s) de ácido nucléico estranha(s) media(m) uma localização citosólica da proteína de amilossacarase e da enzima de ramificação.

Além do mais, a presente invenção refere-se a plantas transgê-nicas contendo tais células de plantas com atividade aumentada de uma amilossacarase e de uma enzima de ramificação.

As plantas da invenção podem pertencer a qualquer espécie de planta, isto é, elas podem ser plantas monocotiledôneas ou plantas dicotile-dôneas. De preferência, elas são plantas oriundas de plantas úteis de agricultura, isto é, oriundas de plantas que são cultivadas por homem para o uso como alimentos ou para uso técnico, particularmente industrial. A invenção de preferência refere-se a plantas de formação de fibra (por exemplo, linho, cannabis, algodão), plantas de armazenagem de óleo (por exemplo, colza, girassol, soja), plantas de armazenagem de amido (por exemplo, tri- go, cevada, aveia, arroz, batata, milho, arroz, ervilha, aipim), plantas de armazenagem de açúcar (por exemplo, beterraba, cana-de-açúcar, painço de açúcar) e plantas de armazenagem de proteína (por exemplo, plantas legu-minosas).

Em uma outra concretização preferida a invenção refere-se a plantas alimentícias (por exemplo, colheita de forragem e plantas de pastagem (alfafa, trevo etc.)), plantas vegetais (por exemplo, tomates, salada, chicória). Com particular preferências são beterraba, cana-de-açúcar, milho, trigo e arroz. A presente invenção também refere-se a um método para a produção de plantas transgênicas dando um rendimento aumentado com plantas de tipo selvagem em que a) uma célula de planta é geneticamente modificada pela introdução de uma (várias) molécula(s) de ácido nucléico estranha(s) a presença ou a expressão da qual leva(m) a uma atividade aumentada de uma proteína com atividade de amilossacarase e um aumento na atividade de uma proteína com atividade de enzima de ramificação; b) uma planta é regenerada a partir da célula produzida de acordo com a); e c) outras plantas são opcionalmente produzidas a partir da planta produzida de acordo com a etapa b).

Além do mais, a presente invenção refere-se a um método para a produção de uma planta transgênica que sintetiza alfa-1,4-glucanos alfa-1,6-ramificados com um grau de ramificação modificado na posição 0-6 em comparação com plantas de tipo selvagem geneticamente não modificadas em que a) uma célula de planta é geneticamente modificada pela introdução de uma ou mais molécula(s) de ácido nucléico estranha(s) a presença ou a expressão da qual leva(m) a uma atividade aumentada de uma proteína com a atividade de uma amilossacarase e uma atividade aumentada de uma proteína com a atividade de uma enzima de ramificação; a 7 b) uma planta é regenerada a partir da célula produzida de acordo com a); e c) outras plantas são opcionalmente produzidas a partir da planta produzida de acordo com a etapa b).

Uma outra matéria objeto da presente invenção é um método para a produção de uma planta transgênica que sintetiza um amido modificado em comparação com plantas de tipo selvagem geneticamente não modificadas correspondentes em que a) uma célula de planta é geneticamente modificada pela introdução de uma ou mais moiécula(s) de ácido nucléico estranha(s) a presença ou a expressão que !eva(m) a uma atividade aumentada de uma proteína com a atividade de uma amilossacarase e uma atividade aumentada de uma proteína com a atividade de uma enzima de ramificação; b) uma planta é regenerada a partir da célula produzida de acordo com a); e c) outras plantas são opcionalmente produzidas a partir da planta produzida de acordo com a etapa b). A mesma que descrita acima em um outro contexto com referência às plantas da invenção aplica à modificação genética introduzida de acordo com a etapa a). A regeneração de planta de acordo com a etapa b) pode ser realizada de acordo com os métodos conhecidos pela pessoa versada na técnica. A geração de outras plantas de acordo com a etapa c) do método da invenção são conseguidas por exemplo, através de propagação ve-getativa (por exemplo, via mudas, tubérculos ou via cultura de calo e regeneração de plantas inteiras) ou através de reprodução sexual. A reprodução sexual é de preferência realizada sob controle, isto é, plantas selecionadas com certas propriedades são cruzadas entre si e são propagadas. A presente invenção refere-se às plantas obteníveis pelos métodos da invenção. A pessoa versada técnica conhece que ele pode obter as plantas da invenção não apenas através dos métodos acima mencionados da invenção mas também por cruzamento, por exemplo, uma planta geneticamente modificada que tem uma atividade aumentada de uma proteína com atividade de amilossacarase devido a introdução de uma molécula de ácido nucléico estranha com uma planta transgênica que tem uma atividade aumentada de uma proteína com atividade de enzima de ramificação devido à introdução de uma molécula de ácido nucléico estranha. Além do mais, é conhecido pela pessoa versada na técnica que supertransformação descrita acima não devem ser certamente realizada com transformantes primários mas de preferência com plantas transgênicas estáveis que foram selecionadas antes e que, favoravelmente, foram testadas em experiências correspondentes com referência a, por exemplo, fertilidade, expressão estável do gene estranho, hemi- e homozigosidade etc. Portanto, também plantas e células de planta transgênicas são a matéria objeto da presente invenção que são obteníveis pelos métodos acima mencionados e que mostram o fe-nótipo descrito nas concretizações acima. A presente invenção também refere-se o material de propagação das plantas da invenção bem como de plantas transgênicas produzidas de acordo com os métodos da invenção. O termo "material de propagação" compreende aqueles componentes da planta que são adequados para a produção de descendentes em um modo vegetativo e generativo. Para a propagação vegetativa, por exemplo, mudas, culturas de calo, rizomas ou tubérculos são adequados. Outro material de propagação compreende, por exemplo, fruta, sementes, mudas, protoplastos, culturas de célula etc. De preferência, o material de propagação são tubérculos e sementes.

Além do mais, a presente invenção refere-se ao uso de uma molécula(s) de ácido nucléico estranha(s) que codifica(m) uma proteína com a atividade enzimática de uma amilossacarase e uma proteína com atividade enzimática de uma enzima de ramificação para a produção de plantas que dão um rendimento aumentado em comparação com plantas de tipo selvagem e/ou sintetizam amido que é modificado em comparação com ami- do oriundo de plantas de tipo selvagem e/ou sintetizam alfa-1,4-glucanos alfa-1,6-ramificados com um grau de ramificação modificado na posição 0-6 em comparação com plantas de tipo selvagem geneticamente não modificadas correspondentes.

Descrição das figuras: Figura 1: pBinAr com "sítio de clonagem múltiplo" (MCS) modificado Figura 2: mapa de plasmídio pAmsu-wxy-Hyg Figura 3: mapa de plasmídio pAmsu-pat-Hyg Figura 4: mapa de plasmídio pBE-fnr-Km Figura 5: mapa de plasmídio pBE-pat-Km Figura 6: mapa de plasmídio pAmsu-cyt-Km Figura 7: atividade de amilossacarase de gel Figura 8: atividade de enzima de ramificação de gel Figura 11: atividade de gel de um extrato de proteína oriunda de plantas de tabaco transgênicas (variedade Samsung NN) descritas no exemplo 7. Nesta experiência o peptídeo de sinal de FNR (exemplo 6) foi usado. 25 - 32, 33 - 37, 39 e 40: extratos de proteína (75 pg de proteína total) oriundos de linhas de tabaco transgênicos independentes diferentes. K = controle; amilossacarase recombinante purificada produzida em E. coli como descrita no pedido de patente WO 99/67412: 50 ng de proteína Wt: extrato de proteína (75 pg de proteína total) oriundo de planta de tipo selvagem de tabaco (Samsung NN).

Figura 12: atividade de gel de um extrato de proteína oriunda de plantas de tabaco transgênicas (variedade Samsung NN) descritas no exemplo 7. Nesta experiência o peptídeo de sinal R1 (exemplo 6) foi usado. 9 - 16 e 41 - 48: extratos de proteína (75 pg de proteína total) oriundos de linhas de tabaco transgênicas independentes diferentes. K = controle: amilossacarase recombinante purificada produzida em E. coli como descrita no pedido de patente WO 99/67412; 50 ng de proteína Wt: extrato de proteína (75 pg de proteína total) oriundo de planta de tipo selvagem de tabaco (Samsung NN).

Figura 13: atividade de gel de um extrato de proteína oriunda de plantas de batata transgênicas (variedade Desirée) descritas no exemplo 8. 8 a 12, 14, 16, 32 e 35 - 40: extratos de proteína (75 μg de proteína total) oriundos de linhas de batata transgênicas independentes diferentes. K = controle: amilossacarase recombinante purificada produzida em E. coli como descrita no pedido de patente WO 99/67412; 50 ng de proteína Wt: extrato de proteína (75 μg de proteína total) oriundo de planta de tipo selvagem de batata (Desirée). BE: extrato de proteína de uma planta de batata transgênica que expressa a enzima de ramificação oriunda de Neisseria denitrificans nos plastídios (exemplo 5).

Figura 14: perfis de analisador de textura de plantas transgênicas (ver o exemplo 9), controle (plantas transgênicas que expressam a enzima de ramificação oriunda de Neisseria denitrificans como descrito no exemplo 5) e plantas de tipo selvagem.

Comentários das figuras de 11 - 13 Todos os géis de proteína oriundos de plantas que foram analisados pelo teste de atividade de amilossacarase descrito no exemplo 4 mostram uma tira acastanhada exatamente acima da tira que é específica para amilossacarase. Esta tira acastanhada e particularmente visível quando do uso de material de planta verde para a produção de extratos de proteína (ver, por exemplo, a fig. 12, linhas 9, 42 e 43). Esta tira acastanhada existe também em plantas de tipo selvagem. Ela jã é visível como uma tira verde depois da eletroforese. Durante a incubação de gel em um tampão contendo sacarose (exemplo 4) as mudanças de cor verde para acastanhada antes do manchamento com solução de Lugol. A partir destas observa- ções pode ser concluído que esta tira não aparece devido à atividade de amilossacarase.

Em géis oriundos de plantas tendo uma alta expressão de amilossacarase a tira acastanhada não específica é superposta sobre a tira surgindo devido a atividade de amilossacarase.

Materiais e métodos que são importantes em combinação com a descrição e que são usados nos exemplos: 1. Determinação do grau de ramificação por meio de análise de metilação O grau de ramificação dos glucanos obtidos pode ser determinado por meio de uma análise de metilação.

Em geral - metilação de todos os grupos OH livres das amostras de glucanos, determinações duplas cada - hidrólise dos polímeros permetilados, seguido por redução em C-1 e acetilação da mistura de monômero - análise cromatográfica de gás e quantificação dos produtos de reação O exame do grau de ramificação das amostras de glucano foi realizado via uma análise de metilação. Os grupos OH livres dos polímeros são marcados por conversão em metil éter. A degradação em monômeros é realizada por hidrólise de ácido e leva as moléculas de glicose parcialmente metiladas que estão presentes em forma de piranosídeo/furanosídeo bem como alfa- e beta-glicosídeos. Estas variantes são focalizadas no derivado de sorbitol parcialmente metila-do correspondente através da redução com NaBH4 ou NaBD4. A acetilação final de grupos OH livres permite que os produtos de reação sejam analisados via cromatografia de gás.

Parte experimental a) Produção de soluções de DMSO

1% de soluções (p/v) é produzido em DMSO b) Metilação 2 ml da solução de DMSO (isto é, 20 mg de polímero) são transferidos em um frasco de nitrogênio de 50 ml, são adicionados na atmosfera de N2 com 5 equivalentes/OH (eq/OH) de solução dimsila fresca e são agitados por 30 minutos. O conteúdo do frasco é congelado em um banho de gelo, 10 eq/metiliodeto de OH são adicionados e depois congelá-los são agitados por pelo menos duas horas. Metiliodeto em excesso é removido em vácuo antes da segunda etapa de desprotonização e de metilação. Posteriormente, o excesso de metiliodeto foi removido por adição de 50 ml de água e por uma extração com cada 10 ml de diclorometano (5 vezes). Para remover traços de DMSO a partir da fase orgânica foram extraídos por água três vezes. Primeiramente usando-se uma amostra, ela é testada como muitas etapas de metilação são necessárias para a permetilação dos grupos hidroxila. Depois da primeira da metilação metade da preparação é ulterior-mente processada, a outra metade é novamente metilada. Depois da degrar ção de ambas as amostras os resultados das análises de GC são comparados. Uma segunda metilação sempre segue a fim de verificar ramificação possível em C-3 que pode ser simulada por uma submetilação nesta posição. c) Hidrólise 2 mg da amostra metilada são introduzidos pesadamente para dentro de um vidro de pressão de 1 ml, 0,9 ml de ácido trifluor acético a 2 M é adicionado e é agitado por 2,5 horas a 120°C. Depois que o vidro resfriou concentração segue na atmosfera de N2. Para a remoção de traços de ácido toluoleno é adicionado três vezes e é extraído. d) Redução 0,5 ml de solução de NaBD4 alcalina de amònia a 0,5 M é adicionado ao resíduo da etapa de reação antes e é agitada por 1 hora a 60°C. O reagente é cuidadosamente disintegrado com poucas gotas de ácido acético glacial, o borato é removido com trimetil éster de ácido bórico por cinco adições de ácido acético contendo metanol a 15% e é extraído. e) Acetilação 50 μΙ de piridina e 250 μΙ de anidrido de ácido acético são adicionados ao resíduo da etapa de reação antes e são agitados por 2 horas a 95°C. Depois do resfriamento a mistura de reação é gotejada em 10 ml de solução de NaHCC>3 saturada e é extraída com diclorometano cinco vezes. Os produtos de reação na fase orgânica são analisados via cromatografia de gás. f) Cromatografia de gás As análises cromatográficas de gás são realizadas com um instrumento da firma Cario Erba GC 6000 Vega Series 2 com entrada sobre coluna e detector de FID. As separações são realizadas com uma coluna de capilar de sílica fundida Supelco SPB5 (diâmetro interno 0,2 mm, comprimento 30 m) com hidrogênio como gás de veículo e com uma pressão de 80 kPa. O seguinte programa de temperatura é usado: 60 C (1 min)-25 C/min 130 C-4 C/min -> 280 C.

Resultados A avaliação dos cromatogramas de gás é realizada por identificação dos picos, integração das áreas de pico e correção dos dados por meio de conceito de ECR de Sweet e outros (Sweet e outros, Carbohydr. Res. 40 (1975), 217). 2. Purificação de uma amilossacarase oriunda de Neisseria polvsaccharea Para a produção de uma amilossacarase células de E. coli usadas que foram transformadas com uma amilossacarase a partir de Neisseria polysaccharea. Os troncos de DNA oriundos de uma biblioteca genômica de N. polysaccharea e tem uma seqüência de nucleotídeos dada no Pedido de Patente Internacional PCT/EP 98/05573.

Uma cultura de um dia para o outro destas células de E. coli que expressam o gene que codifica a amilossacarase oriunda de Neisseria polysaccharea foi centrifugada e foi ressuspensa em um volume de cerca de 1/20 de tampão de citrato de sódio a 50 mM (pH 6,5), DTT a 10 mM (ditio-treitol), PMSF a 1 mM (fluoreto de sulfonil de fenilmetila). Então as células foram duas vezes desintegrada com uma prensa de French a 112 kg/cm2 (16.000 psi). Depois que MgCI2 a 1 mM foi adicionado ao extrato de célula bem como benzonase (da Merck; 100.000 unidades; 250 unidades μΓ1) em uma concentração final de 12,5 unidades ml'1. Então a preparação foi incubada a 37 C por pelo menos 30 minutos enquanto se agitando levemente. O extrato foi deixado repousar sobre gelo por pelo menos 1,5 horas. Então ele foi centrifugado a 4°C a cerca de 40.000 g por 30 minutos até o sobrena-dante estar relativamente claro.

Uma pré-filtração foi realizada com membrana de PVDF (Millipo-re "Durapore", ou similar) que tinha um diâmetro de poro de 0,45 μητι. O extrato foi deixado repousar de um dia para o outro a 4°C. Antes da cromato-grafia de interação hidrofóbica de Hl foi realizada, NaCI sólido foi adicionado ao extrato e foi ajustado para dar uma concentração de NaCI a 2 M. Então, novamente, foi concentrado a 4°C e cerca de 40.000 g por 30 min.. Depois que o extrato foi liberado a partir do último resíduo de E. coli por filtra-cão, usando-se uma membrana de PVDF (Millipore "Durapore", ou similar) que tinha um diâmetro de poro de 0,22 pm. O extrato de filtrado foi separado por passagem dele sobre uma coluna de coluna 4B de butilsefarose (Pharmacia) (volume da coluna: 93 ml, comprimento: 17,5 cm). Cerca de 50 ml de extrato com uma atividade de amilossacarase de 1 a 5 Unidades μΓ1 foram postos sobre a coluna. Então proteínas de não ligação foram removidas por lavagem a coluna com 150 ml de tampão B (tampão B: citrato de sódio a 50 mM, pH 6,5, NaCI a 2 Μ). A amilossacarase foi finalmente elufda por meio de uma diminuição, gradiente de NaCI linear (de NaCI a 2 M até 0 M em citrato de sódio a 50 mM em um volume de 433 ml em uma taxa de fluxo de 1,5 ml min'1) que foi gerado por meio de um sistema de bomba automático (FPLC, Pharmacia). A eluição da amilossacarase ocorre entre NaCI a 0,7 M e 0,1 M. As frações foram coletadas, dessalgadas sobre uma coluna PD10 Sephadex (Pharmacia), foram estabilizadas com 8,7% de glicerol, foram testadas quanto a atividade de amilossacarase e finalmente foram congeladas em tampão de armazenagem (8,7%. de glicerol, citrato a 50 mM). 3. Determinação da atividade de amilossacarase Proteína purificada ou extrato bruto de proteína em várias diluições é introduzido para dentro de preparações de 1 ml contendo 5%. de sa-carose, 0,1%. de glicogênio e citrato a 100 mM, pH 6,5 e foram incubadas a 37°C. Depois de 5 minutos, 10 min., 15 min., 20 min., 25 min. e 30 min. 10 μΙ em cada hora são tirados desta preparação e a atividade enzimática da amilossacarase é parada por aquecimento imediato para 95 C. No teste fo-tométrico acoplado a proporção do conjunto de frutose livre pela amilossacarase é então determinada. Portanto, 1 μΙ a 10 μΙ da amostra inativada são postos em 1 mi de tampão de imidazol a 50 mM, pH 6,9, MgCI? a 2 mM, ATP a 1 mM, NAD a 0,4 mM e 0,5 U/ml de hexocinase. Depois da adição sequencial de desidrogenase de glicose-6-fosfato (da mesenteróides de Leu-conostoc) e fosfoglicose-isomerase a mudança de absorção é medida a 340 nm. Então a quantidade de conjunto de frutose livre é calculada de acordo com a Lei de Lambert.

Quando o valor obtido está relacionado com o tempo de tirar a amostra o número de Unidades (1U = pmol de frutose/min) (por μΙ de extrato de proteína ou pg de proteína purificada), respectivamente, pode ser determinado.

Vetores usados nos exemplos 1. pBinAR-N

No plasmídio pBinAR-N (Hôfgen and Willmitzer, Plant Science 66, (1990), 221-230) o poliligador entre o promotor de 35S e o terminador de OCS foi mudado (fig. 1) usando-se oligonucleotídeos de ácido nucléico via métodos padrão biológicos moleculares (ver, por exemplo, Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory manual, 2o ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA (1989)). Isto é como o plasmídio pBinAR-N foi obtido.

2. pBinAR-Hyq-N O fragmento de EcoRI/HinDIlI oriundo de pBinAR-N contendo o promotor de 35S, o seguinte poliligador e o terminador de OCS foi clonado nos mesmos sítios de restrição do plasmídio pBIB-Hyg (Becker, Nucleic Acids Research 18, (1990), 203) por uso de métodos padrão biológicos moleculares (ver, por exemplo, Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory manual, 2o ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA (1989)). O plasmídio resultante é chamado de pBinAR-Hyg-N. 3. pBinAR-wxv-Hva Para a clonagem das seqüências que codificam o peptídeo de sinal da proteína cerosa oriunda de Zea mays (ver, por exemplo, Klõsgen e outros, Mol. Gen. Genet. 217 (1989), 155-161) as seqüências correspondentes foram ampliadas por meio de PCR usando-se os oligonucleotídeos (ver SEQ ID N^: 3 e 4), partindo do DNA genômico oriundo de Zea mays (Stratagene) como modelo. Os fragmentos de DNA desse modo obtidos foram incubados com as endonucleases de restrição Xbal e Sall e foram clo-nados no vetor pBinAR-Hyg-N foram clivados com Spel e Sall. O plasmídio resultante foi chamado de pBinAR-wxy-Hyg.

Condições para PCR

Tampão e polimerase da Gibco BRL (Alta Polimerase de DNA de Taq de Platina fidelidade N9 11304-011) DNA 0,2 pg 10x tampão 5 μΙ MgS04 (50 mM) 2,0 pl dNTPs (10 nM cada) 1 μΙ Iniciador Sp-wxy-5' 100 nM

Iniciador Sp-wxy-3' 100 nM

Polimerase de Hifi de platina de Taq 1,5 unidades Água dest. ad 50 μΙ Condições para a reação Etapa 1 95CC 2:30 min Etapa 2 95°C 0:30 min Etapa 3 60CC 0:30 min Etapa 4 68°C 0:25 min (mais 1 seg. por ciclo) Etapa 5 68C'C 3:00 min Etapas de 2 a 4 foram repetidas em ciclos 35 vezes 4. pBinAR-pat-Hyg e pBinAR-pat As seqüências que codificam o peptídeo de sinal do gene de patatina oriundo de batata (Rosahl e outros, Mol. Gen. Genet. 203, (1986), 214-220; Sonnewald e outros, Plant J. 1, (1998), 95-106) foram ampliadas a partir de plasmídio pgT5 usando-se os oligonucleotídeos Sp-pat-5’ e Sp-pat-3’ (ver SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6). Os fragmentos obtidos foram digeri- dos com as endonucleases de restrição Xbal e Sal! e foram clonados nos plasmídios pBinAR-N e pBinAR-Hyg, respectivamente, foram clivados com Spel e Sall. Os plasmídios resultantes foram chamados de pBinAR-pat e pBinAR-pat-Hyg, respectivamente. A sequência de ácidos nucléicos contidas nestes plasmídios que codifica o sinal de peptídeo usado da proteína de patatina é ilustrada em SEQ ID NO: 7 como ela se desvia da seqüência de sinal publicada (troca de aminoácidos do terceiro aminoácido).

Condições para o PCR: Tampão e polimerase da Boehringer Mannheim (Polimerase de PWO N° 1644947) DNA 0,2 pg 10x tampão + MgS04 5 pl dNTPs (10 nM cada) 1 μΙ Iniciador Sp-pat-5' 120 nM

Iniciador Sp-pat-3' 120 nM

Polimerase de Pwo 1,0 unidades Água dest. ad 50 μΙ Condições para a reação Etapa 1 95°C 2:30 min Etapa 2 95°C 0:30 min Etapa 3 64°C 0:30 min Etapa 4 72°C 0:30 min (mais 1 seg. por ciclo) Etapa 5 72°C 5:00 min Etapas de 2 a 4 foram repetidas em ciclos 35 vezes 5. Clonagem do peptídeo de sinal de FNR oriundo de espinafre As seqüências oriundas de espinafre que codificam o peptídeo de sinal de FNR foram ampliadas usando-se os iniciadores Sp-fnr-5’ e Sp-fnr-3’ (ver SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9) e plasmídio p6SocFNR-15 como modelo (Jansen e outros, Current Genetics 13, (1988), 517-522). Depois da digestão dos fragmentos obtidos com as endonucleases de restrição Xbal e Sall eles foram clonados no plasmídio pBinAR-N foram clivados com Spel e Sall. O plasmídio resultante foi chamado de pBinAR-fnr-N.

Condições para PCR

Tampão e polimerase da Gibco BRL (Alta Polimerase de DNA de Taq de Platina fidelidade Ns 11304-011) DNA 0,2 pg 10x tampão 5 pl MgS04 2,0 μΙ dNTPs (10 nM cada) 1 μΙ Iniciador Sp-fnr-5' 150 nM

Iniciador Sp-fnr-3' 150 nM

Polimerase de Hifi de platina de Taq 1,5 unidades Água dest. ad 50 μΙ Condições para a reação Etapa 1 95°C 2:00 min Etapa 2 95°C 0:30 min Etapa 3 58°C 0:30 min Etapa 4 68°C 0:20 min (mais 1 seg. por ciclo) Etapa 5 68°C 3:00 min Etapas de 2 a 4 foram repetidas em ciclos 35 vezes 6. pBinAR-R1-Hyg A fim de clonar a seqüência de codificação do peptídeo de sinal da proteína R1 oriunda de Solanum tuberosum (Lorbeth e outros, Nature Biotechnology 16 (1998), 473-477), as seqüências correspondentes foram ampliadas por PCR usando-se o clone de cDNA RL2 como modelo (Lor-berth, PhDthesis, "Charakterisierung von RL1: ein neues Enzym des Stárkemetabolismus" Freie Universitàt Berlin (1996) e os oligonucleotídeos SEQ ID NOs: 14 e 15 como iniciadores. Os fragmentos de DNA resultantes foram digeridos com as endonucleases de restrição Xbal e Sall e foram então clonados no vetor pBinAr-Hyg-N foram clivados com Spel e Sall. O plasmídio resultante foi chamado de pBinAR-R1-Hyg.

Condições para a reação PCR: Tampão e polimerase da Boehringer Mannheim (Polimerase de DNA PWO NQ 1644955) DNA 0,05 pg 10χ tampão 5 μ! dNTPs (10 nM cada) 1 μΙ Iniciador Sp-R1-5' 100 nM

Iniciador Sp-R1 -3' 100 nM

Polimerase de Pwo 1,0 unidades Água dest. ad 50 μΐ Condições para a reação Etapa 1 95°C 2:00 min Etapa 2 95°C 0:30 min Etapa 3 60°C 0:30 min Etapa 4 72°C 0:25 min {mais 1 seg. por ciclo) Etapa 5 72°C 3:00 min Etapas de 2 a 4 foram repetidas em ciclos 30 vezes 7. pBinAR-fnr-Hyg As sequências que codificam o peptídeo de sinal de FNR oriundo de espinafre foram ampliadas por uso do plasmídio p6SocFNR-15 (Jansen e outros, Current Genetics 13 (1988), 517-522) como modelo e os inici-adores Sp-fnr-5’ e Sp-fnr-3’ (SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9). Os fragmentos de DNA resultantes foram digeridos com as endonucleases de restrição Xbal e Sall e foram clonados no vetor pBinAr-Hyg-N foram clivados com Spel e Sall. O plasmídio resultante foi chamado de pBinAR-fnr-Hyg. Condições para a reação de PCR

Tampão e polimerase da Gibco BRL (Alta Polimerase de DNA de Taq de Platina fidelidade NQ 11304-011) DNA 0,2 pg 10x tampão 5 μΙ dNTPs (10 nM cada) 1 μΙ Iniciador Sp-fnr-5' 100 nM

Iniciador Sp-fnr-3' 100 nM

Polimerase de Hifi de platina de Taq 1,0 unidades Água dest. ad 50 μΙ Condições para a reação Etapa 1 95°C 2:30 min Etapa 2 95°C 0:30 min Etapa 3 58°C 0:30 min Etapa 4 72°C 0:30 min (mais 1 seg. por ciclo) Etapa 5 72°C 5:00 min Etapas de 2 a 4 foram repetidas em ciclos 35 vezes Exemplo 1 Produção de cassetes de expressão para a transformação de plantas: expressão vacuolar e plastídica, respectivamente, de uma amilos-sacarase oriunda de Neisseria polysaccharea Usando-se os oligonucleotídeos AS-5’ e AS-3’ (SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 11) as seqüências que codificam amilossacarase foram ampliadas por meio de PCR usando-se o plasmídio pNB2 como modelo (ver pedido de patente internacional WO 95/31553, depositado no "Deutsche Sammlung für Mikrooganismen und Zellkulturen" (DSMZ) em Braunschweig, Alemanha, sob número de acesso DSM 9196). Os seus ampliados obtidos foram digeridos com as endonucleases de restrição Xhol e Pstl e foram clo-nados nos plasmídios pBinAR-wxy-Hyg e pBinAR-pat-Hyg, respectivamente, foram clivados com Sall e Sdal. Os plasmídios resultantes foram chamados de pAmsu-wxy-Hyg (fig. 2) e pAmsu-pat-Hyg (fig. 3), respectivamente. Condições para o PCR: Tampão e polimerase da Boehringer Mannheim (Polimerase de PWO Ne 1644947) DNA 0,2 pg 10x tampão + MgSo4 5 pl dNTPs (10 nM cada) 1 pl Iniciador Sp-AS-5' 100 nM

Iniciador Sp-AS-3' 100 nM

Polimerase de Pwo 1,0 unidades Água dest. ad 50 μΙ Condições para a reação Etapa 1 95°C 2:00 min Etapa 2 95°C 0:30 min Etapa 3 58°C 0:30 min Etapa 4 68°C 2:00 min (mais 1 seg. por cicio) Etapa 5 68°C 5:00 min Etapas de 2 a 4 foram repetidas em ciclos 40 vezes Os plasmídios pAmsu-wxy-Hyg e pAmsu-pat-Hyg, respectivamente, podem ser usados para a transformação de piantas de acordo com os métodos padrão (ver acima).

Exemplo 2 Produção de cassetes de expressão para a transformação de plantas: expressão vacuolar e piastídica. respectivamente, de uma enzima de ramificação oriunda de Neisseria denitrificans Usando-se os oligonucleotídeos BE-5' e BE-3' (SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13) a sequência que codifica a enzima de ramificação oriunda de Neisseria denitrificans foi ampliada por meio de PCR usando-se o pias- _ mídio pBB48 como modelo (depositado no "Deutsche Sammlung für Mikroo-ganismen und Zellkulturen" (DSMZ) em Braunschweig, Alemanha, sob número de acesso DSM 12425). Os seus ampliados obtidos foram digeridos com as endonucleases de restrição Sall e Sdal e foram clonados nos plasmídios pBinAR-fnr e pBinAR-pat, respectivamente, foram clivados com Sall e Sdal. Os plasmídios resultantes foram chamados de pBE-fnr-Km (fig. 4) e pBE-pat-Km (fig. 5), respectivamente.

Condições para o PCR: Tampão e polimerase da Boehringer Mannheim (Polimerase de PWO N- 1644947) DNA 0,2 pg 10x tampão + MgSo4 5 pl dNTPs (10 nM cada) 1 μΙ Iniciador Sp-BE-5' 120 nM

Iniciador Sp-BE-3‘ 120 nM

Polimerase de Pwo 1,0 unidades Água dest. ad 50 μ Condições para a reação Etapa 1 95°C 2:00 min Etapa 2 95°C- 0:30 min Etapa 3 53°C 0:30 min Etapa 4 72°C 2:00 min (mais 1 seg. por ciclo) Etapa 5 72°C 8:00 min Etapas de 2 a 4 foram repetidas em ciclos 40 vezes Os plasmídios pBE-fnr-Km e pBE-pat-Km, respectivamente, podem ser usados para a transformação de plantas de acordo com os métodos padrão (ver acima).

Exemolo 3 Produção de cassetes de expressão para a transformação de plantas: expressão citosólica de uma amilossacarase oriunda de Neisseria polysaccharea Um fragmento que codifica uma amilossacarase oriunda de Neisseria polysaccharea foi isolado com as endonucleases de restrição Xmnl e Eagl oriundas do plasmídio pNB2 (ver acima) e as extremidades do fragmento foram preenchidas com polimerase de DNA de Klenow. Então a clonagem do fragmento no plasmídio pBinAR clivado com Smal seguido (Hõfgen and Willmitzer, Plant Science 66, (1990), 221-230). O plasmídio resultante foi chamado de pAmsu-cyt-Km (fig. 6) e pode ser usado para a transformação de plantas.

Exemplo 4 Identificação e testagem das plantas de batata transgênicas com atividade de amilossacarase Via análise de Northern Blot plantas de batata transgênicas poderíam ser identificadas que têm o mRNA de uma amilossacarase oriunda de Neisseria polysaccharea. Então poderia ser demonstrado que a amilossacarase em tais plantas é ativa.

Para a detecção da atividade da amilossacarase em plantas estavelmente transformadas material de folha das plantas a ser testado foi congelado em nitrogênio líquido e então foi moído em um almofariz que tinha sido pré-resfriado com nitrogênio líquido. Antes que o material moído descongelasse, tampão de extração (citrato de sódio a 50 mM, pH 6,5, DTT a 4 mM, cloreto de cálcio a 2 mM) foi adicionado. Cerca de 500 μΙ de tampão de extração foram adicionados a cerca de 100 mg de material de planta (peso fresco). Componentes sólidos da suspensão de material de planta desintegrado e tampão de extração foram separadas por meio de centrifu-gação (10.000 x g). Uma alíquota do sobrenadante claro obtido foi misturada com uma quarta parte do volume do extrato tampão de corrente de volume (40% de glicerina, Tris a 250 mM pH 8,8, 0,02% de azul de bromofenoi) e foi separado em gel de poliacrilamida (ver abaixo) em intensidade corrente constante de 20 mA por gei. (Antes que os extratos de proteína fossem aplicados ao gel, uma eletroforese dos géis foi realizada por 20 minutos sob as condições descritas acima). Depois que o agente de coloração azul de bro-mofenol tenha saído do gel a eletroforese foi parada. O gel foi então equilibrado 5 vezes em tampão de lavagem (citrato de sódio a 100 mM, pH 6,5) _ com 5 vezes o volume de gel cada um por 20 min. cada enquanto girando a temperatura ambiente. Então o gel foi incubado em tampão de incubação (citrato de sódio a 100 mM, pH 6,5, 5% de sacarose) com 5 vezes a quantidade do volume de gel a 37 C por 16 h. Depois da decantação do tampão de incubação o glucano produzido pela amilossacarase foi detectável como uma tira azulada acastanhada quando solução de Lugol (diluída 1:5) foi adicionada (fig. 7).

Composição do gel de poliacrilamida a) Separação de gel Tris a 375 mM, pH 8,8 7,5% de poliacrilamida (Biorad NQ EC-890) Para polimerização: 1/2000 de volume de TEMED 1/100 de volume de persulfato de amônio b) Coleta de gel Tris a 125 mM, pH 6,8 4% de poliacrilamida (Biorad Ns EC-890) Para polimerização: 1/2000 de volume de TEMED 1/100 de volume de persulfato de amònio c) Tampão de eletroforese Tris a 375 mM, pH 8,8 glicina a 200 mM

Exemplo 5 Identificação e testaaem de plantas de batata transaênicas com atividade de enzima de ramificação Via análise de Northern Blot plantas de batata transgênicas poderíam ser identificadas que tinham o mRNA de uma enzima de ramificação oriunda de Neisseria denitrificans. Para a detecção da atividade da enzima de ramificação em plantas estavelmente transformadas material de planta das plantas a ser testado foi congelado em nitrogênio líquido e então foi moído em um almofariz que tinha sido resfriado com nitrogênio líquido. Antes que o material moído descongelasse, tampão de extração (citrato de sódio a 50 mM, pH 6,5, DTT a 4 mM, cloreto de cálcio a 2 mM) foi adicionado. Cerca de 200 μ! de tampão de extração foram adicionados a cerca de 100 mg de material de planta (peso fresco). Componentes sólidos da suspensão de material de planta desintegrado e tampão de extração foram separados por meio de centrifugação (10.000 x g). Uma alíquota do sobrenadante claro obtido foi misturado com uma quarta parte do extrato do volume tampão corrente (40% de glicerina, Tris a 250 mM, pH 8,8, 0,02%. de azul de bromofe-nol) e foi separada em gel de poliacrilamida (ver abaixo) em intensidade de corrente constante de 20 mA por gel. (Antes que os extratos de proteína fossem aplicados ao gel, uma eletroforese dos géis foi realizada por 20 minutos sob as condições descritas acima). Depois que o agente de coloração azul de bromofenol presente no tampão corrente tinha saído do gel a eletroforese foi parada. O gel foi então equilibrado 5 vezes em tampão de lavagem (citrato de sódio a 100 mM, pH 6,5) com 5 vezes o volume de gel cada um por 20 min. cada enquanto girando a temperatura ambiente. Então o gel foi incubado em tampão de incubação (citrato de sódio a 100 mM, pH 6,5, 5% de sacarose, 0,625 Unidades de amilossacarase purificada oriunda de Neisseria polysaccharea (purificação da enzima e determinação da atividade ver acima)) com 5 vezes a quantidade do volume de gel a 30 C por 16 hs. Depois da decantação do tampão de incubação o glucano produzido pela amilossacarase em combinação com a enzima de ramificação foi de-tectável como uma tira azulada acastanhada quando solução de Lugol (diluída 1:5) foi adicionada (fig. 8). Todo o gel de poliacrilamida restante se torna azul devido à atividade de amilossacarase presente no tampão de incubação.

Composição do gel de poliacrilamida a) Separação de gel Tris a 375 mM, pH 8,8 7,5% de poliacrilamida (Biorad Nç EC-890) Para polimerização: 1/2000 de volume de TEMED 1/100 de volume de persulfato de amônio d) Coleta de gel Tris a 125 mM, pH 6,8 4% de poliacrilamida (Biorad Ns EC-890) Para polimerização: 1/2000 de volume de TEMED 1/100 de volume de persulfato de amônio e) Tampão de eletroforese Tris a 375 mM, pH 8,8 glicina a 200 mM

Exemplo 6 Construção de um cassete de expressão para plantas: expressão plastídica de uma amilossacarase oriunda de Neisseria polysaccharea Por uso de plasmídio pNB2 (Deutsche Sammlung für Mikrooga-nismen und Zellkulturen (DSMZ) Braunschweig, Alemanha, número do deposto DMS 9196) como um modelo e os oligonucleotídeos AS-5’ e AS-3’ (SEQ ID NOs: 10 e 11) como iniciadores de PCR a região de codificação de amilossacarase oriunda de Neisseria polysaccharea foi ampliada. O produto de PCR foi então digerido pelas enzimas de restrição Xhol e Pstl. O fragmento resultante contendo a região de codificação foi clonado em plasmí-dios digeridos por Sall e Sdal pBinAR-R1-Hyg e pBinAR-fnr-Hyg. Os plas-mídios resultantes foram chamados de pAmsu-R1-Hyg (fig. 9) e pAmsu-fnr-Hyg (fig. 10), respectivamente.

Condições de PCR: Tampão e polimerase Boehringer Mannheim (Polimerase de PWO N- 1644947) DNA 0,2 pg 10x tampão + MgSo4 5 pl dNTPs (10 nM cada) 1 μΙ Iniciador Sp-BE-5' 100 nM

Iniciador Sp-BE-3' 100 nM

Polimerase de Pwo 1,0 unidades Água dest. ad 50 μ Condições para a reação: Etapa 1 95°C 2:00 min Etapa 2 95°C 0:30 min Etapa 3 56°C 0:30 min Etapa 4 72°C 2:00 min (mais 1 seg. por ciclo) Etapa 5 72°C 5:00 min As etapas de 2 a 4 foram repetidas de um modo cíclico.

Os plasmídios pAmsu-R1-Hyg e pAmsu-fnr-Hyg podem ser usados para a transformação de plantas de acordo com os métodos padrão. Exemplo 7 Identificação de plantas de tabaco transgênicas que mostra a atividade de uma amilossacarase Os constructos pAmsu-R1-Hyg (fig. 9) e pAmsu-fnr-Hyg (fig. 10) descritos no exemplo 6 foram usados para transformar plantas de tabaco de acordo com Rosahl e outros (EMBO J. 6 (1987), 1155-1159). Por realização de uma análise de Northern Blot plantas de tabaco transgênicas foram identificadas possuindo o mRNA de uma amilossacarase. Além do mais. aquelas plantas que expressam o gene de amilossacarase nos plastídios também mostram a atividade enzimática de uma amilossacarase (fig. 11 e 12). A atividade enzimática foi testada como descrita no exemplo 4.

Exemplo 8 Produção e identificação de plantas de batata transgênicas que expressam um gene que codifica uma enzima de ramificação oriunda de Neisseria de-nitrificans e um gene que codifica amilossacarase oriunda de Neisseria po-Ivsaccharea Três linhas de plantas de batata transgênicas, que anteriormente foram transformadas com os plasmídios pBE-fnr-Km (exemplo 2) e que mostram a atividade enzimática de uma enzima de ramificação localizada nos plastídios (teste da atividade enzimática foi realizado como descrito no exemplo 5, fig. 8), foram selecionados.

Depois, explantes oriundos de folhas destas plantas foram novamente transformados via agrobacteria com o plasmídio pAmsu-R1-Hyg (exemplo 6). Por uso dos testes de atividade descritos nos exemplos 4 e 5 plantas foram identificadas que mostram em paralelo a atividade de uma proteína de amilossacarase e uma enzima de ramificação (fig. 13) com ambas as enzimas localizadas nos plastídios.

Exemplo 9 Determinação da estabilidade de gel de amidos pelo uso de um analisador de textura 2 g de amido (dw) extraídos de plantas transgênicas como descritas no exemplo 8 foram adicionadas a um volume apropriado de água destilada para produzir uma suspensão contendo concentração final a 8% de amido (p/v). Esta suspensão foi então aquecida em um Analisador Visco Rápido (Newport Scientific Pty Ltd., Investiment Support Group, Warriewood NSW 2102, Austrália) por uso do seguinte perfil de temperatura: Em primeiro lugar, a suspensão foi aquecida de 50 C a 95 C com uma taxa de aumento de temperatura de 12 C por minuto. Então, a temperatura foi mantida por 2,5 minutos a 95°C. Finalmente, a suspensão foi resfriada para 50°0 com uma taxa de 12°C por minuto. A sonda resultante foi armazenada hermética por 24 h a 25 C. As sondas são então fixas em um analisador de textura, modelo TA-XT2, produzidas por Micro Sistemas Estáveis (Haslemere, Inglaterra). Um selo redondo foi usado. A estabilidade de gel foi determinada por ajuste dos parâmetros como se segue: - velocidade de teste 0,5 mm/s - distância 7 mm - área de contato 113 mm2 - força de gatilho 2 g Os perfis resultantes de linhas transgênicas 006 e 035 em comparação com plantas de tipo selvagem e com plantas de controle (plantas transgênicas que expressam a enzima de ramificação oriunda de Neisseria denitrificans como descritas no exemplo 5) são mostradas na figura 14.

Os perfis de analisador de textura (ver a figura 14) dos amidos oriundos de plantas transgênicas mostram diferenças significativas para o perfil de amidos oriundos de plantas de tipo selvagem e plantas de controle.

No caso a "distância" é estabelecida a 7,0 mm o perfil das plantas transgênicas podem ser descritas como "tipo de coroa".

REIVINDICAÇÕES

Claims (4)

1. Método para produção de uma planta transgênica que dá um rendimento aumentado em comparação com uma planta de tipo selvagem geneticamente não modificada correspondente, caracterizado pelo fato de que compreende cruzar plantas geneticamente modificadas pela introdução de uma ou mais molécula(s) de ácido nucléico exógena(s), compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 16 codificando uma proteína amilossacarase ou sequências de nucleotídeos degeneradas da mesma codificando a mesma proteína, e a sequência de SEQ ID NO:1 codificando uma enzima de ramificação ou sequências de nucleotídeos degeneradas da mesma codificando a mesma proteína.

2. Método para produção de uma planta transgênica que sintetiza alfa-1,4-glucanos alfa-1,6 ramificados com um grau de ramificação modificado na posição 0-6 que não são sintetizados por uma planta de tipo selvagem geneticamente não modificada correspondente, caracterizado pelo fato de que compreende cruzar plantas geneticamente modificadas pela introdução de uma ou mais molécula de ácido nucléico exógena(s) compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 16 codificando uma proteína amilossacarase ou sequências de nucleotídeos degeneradas da mesma codificando a mesma proteína, e a sequência de SEQ ID N0:1 codificando uma enzima de ramificação ou sequências de nucleotídeos degeneradas da mesma codificando a mesma proteína.

3. Método para produção de uma planta transgênica que sintetiza um amido modificado em comparação com plantas de tipo selvagem geneticamente não modificadas correspondentes, caracterizado pelo fato de que compreende cruzar plantas geneticamente modificadas pela introdução de uma ou mais molécula(s) de ácido nucléico exógena(s) compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 16 codificando uma proteína amilossacarase ou sequências de nucleotídeos degeneradas da mesma codificando a mesma proteína e a sequência de SEQ ID N0:1 codificando uma enzima de ramificação ou sequências de nucleotídeos degeneradas da mesma codificando a mesma proteína.

4. Uso de uma ou mais molécula(s) de ácido nucléico compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 16 que codifica uma amilossacarase ou sequências de nucleotídeos degeneradas da mesma codificando a mesma proteína, e compreendendo a sequência de SEQ ID NO:1 que codifica uma enzima de ramificação ou sequências de nucleotídeos degeneradas da mesma codificando a mesma proteína, caracterizado pelo fato de ser para a produção de plantas que sintetizam alfa-1,4-glucanos alfa-1,6 ramificados com um grau de ramificação modificado na posição 0-6 em comparação com plantas de tipo selvagem geneticamente não modificadas correspondentes.