BRPI0111731B1

BRPI0111731B1 - suporte sólido de imunoensaio, métodos de detecção de infecção pelo vírus da hepatite c (hcv) em uma amostra biológica, e de produção de um suporte sólido de imunoensaio, e, kit de teste de imunodiagnóstico

Info

Publication number: BRPI0111731B1
Application number: BRPI0111731A
Authority: BR
Inventors: Angelica Medina-Selby; Carlos George-Nascimento; David Y Chien; Doris Coit; Laura Tandeske; Phillip Arcangel
Original assignee: Chiron Corp; Grifols Worldwide Operations Ltd; Novartis Vaccines & Diagnostic
Priority date: 2000-06-15
Filing date: 2001-06-14
Publication date: 2016-07-05
Also published as: JP2011125350A; SK17772002A3; SK287694B6; EP1354204A2; CZ304185B6; DE60129598D1; US20040096822A1; CN1256591C; PL365599A1; US7241879B2; CZ20024058A3; EP1354204B2; US20040265801A1; DE60125240T3; BR0111731A; DK1354204T4; MXPA02012401A; CN1660913A; BR0111682A; NO20025878D0

Abstract

"ensaio de combinação de anticorpo/antígeno do hcv". ensaio de combinação de antígeno de núcleo de hvc anticorpo ns3/4a que pode detectar tanto antígenos de hcv quanto anticorpos presentes em uma amostra usando uma matriz sólida única, que é fornecida, bem como, suportes sólidos de imunoensaio para uso no ensaio.

Description

SUPORTE SÓLIDO DE IMUNOENSAIO, MÉTODOS DE DETECÇÃO DE INFECÇÃO PELO VÍRUS DA HEPATITE C (HCV) EM UMA AMOSTRA BIOLÓGICA, E DE PRODUÇÃO DE UM SUPORTE SÓLIDO DE IMUNOENSAIO, E, KIT DE TESTE DE IMUNODIAGNÓSTICO

Campo Técnico A presente invenção se refere de modo geral a diagnósticos virais. Em particular, a invenção se refere a um ensaio de combinação de anticorpo/antigeno para diagnosticar acuradamente a infecção do virus da hepatite C.

Fundamentos da Invenção O virus da hepatite C (HCV) é a principal causa de hepatite não A, não B parenteral (NANBH) que é transmitida amplamente através de transfusão de sangue e contato sexual. O virus está presente em 0,4 a 2,0% dos doadores. A hepatite crônica se desenvolve em cerca de 50% de infecções e desses, aproximadamente 20% de indivíduos infectados que desenvolvem cirrose no fígado que algumas vezes leva a carcinoma hepatocelular. Desse modo, o estudo e controle da doença é de importância médica. O HCV foi primeiro identificado e caracterizado como uma causa de NANBH por Houghten et al. A seqüência genômica viral de HCV é conhecida, como são os métodos para obtenção da seqüência. Veja, e.g.r Publicação Internacional Nos. WO 89/04669; WO 90/11089; e WO 90/14436. O HCV tem um genoma de RNA de filamento único, de sentido positivo de 9,5 kb e é um membro da família Flaviridae de vírus. Pelo menos seis genótipos distintos, porém relacionados, do HCV, baseado na análise filogenética, foram identificados (Simmonds et al., J. Gen. Virol. (1993) 74: 2391-2399) . O vírus codifica uma única poliproteína tendo mais do que 3000 resíduos de amino ácido (Choo et al. , Science (1989) 244: 359-362; Choo et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA (1991) 88: 2451-2455; Han et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1991) 88: 1711-1715). A poliproteina é processada com co- e pós-tradução em ambas as proteínas estruturais e não estruturais (NS).

Em particular, como mostrado na Figura, várias proteínas são codificadas pelo genoma do HCV. A ordem e nomenclatura dos produtos de divagem da poliproteina do HCV é como se segue: NH2-C-El-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-C00H. Clivagem inicial da poliproteina é catalisada por proteases de hospedeiro que libera três proteínas estruturais, a proteína neocapsida com N terminal (denominada "núcleo") e duas glicoproteinas envelope, "E"' (também conhecida como E) e "E2" (também conhecida como E2/NS1), assim como proteínas não estruturais (NS) que contêm as enzimas virais. AS regiões NS são denominadas NS2, NS3, NS4 e NS5. NS2 é uma proteína de membrana integral com atividade proteolítica. NS2, tanto sozinha quanto em combinação com NS3, cliva a ligação sisle NS2-NS3 que por sua vez gera o N terminal de NS3 e libera um poliproteina grande que inclui atividades de protease de serina e helicase de RNA. Protease NS3 serve para processar a poliproteina proteína remanescentes. Término da maturação da poliproteina é iniciada por clivagem autocatalítíca na junção NS3-NS4a, catalisada pela protease de serina de NS3. Clivagens mediadas por NS3 subsequentes da poliproteina do HCV parecem envolver o reconhecimento das junções de clivagem de 1 poliproteina por uma molécula de NS3 de um outro polipeptídeo. Nessas reações, NS3 libera um cofator NS3 (NS4a), duas proteínas (NS4b e NS5a), e uma polimerase de RNA dependente de RNA (NS5b). Vários polipeptídeos gerais e específicos úteis como reagentes imunológicos e diagnósticos para HCV, derivados da poliproteina do HCV, foram descritos. Veja, e.g., Houghton et al. , Publicação Européia Nos. 318.216 e 388.232; Choo et al., Science (1989) 244: 359-362; Kuo et al., Science (1989) 244: 362-364; Houghton et al., Hepatology (1991) 14: 381-388; Chien et al. , Proc. Natl.

Acad. Sei. USA (1992) 89: 10011-10015; Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8: S33-39; Chien et al., Publicação Internacional No. WO 98/00365; Chien, D. Y., Publicação Internacional No. WO 94/01778. Essas publicações fornecem um fundamente extenso sobre HCV de modo geral, assim como sobre a manufatura e usos de reagentes imunológicos de polipeptideo do HCV. Métodos específicos e sensível para seleção e identificação de veículos do HCV e produtos de sangue ou sangue contaminado com HCV forneceríam um avanço importante na medicina. Hepatite pós transfusão (PTH) ocorre aproximadamente em 10% dos pacientes submetidos a transfusão, e o HCV soma até 90% desses casos. Cuidado com paciente assim como prevenção e transmissão do HCV por produtos de sangue e sangue ou por contato pessoal íntimo requerem ferramentas de prognóstico e diagnóstico. Desse modo, vários ensaios foram desenvolvidos para a serodiagnose da infecção por HIV. Veja, e.g., Choo et al., Science (1989) 244: 359-362; Kuo et al., Science (1989) 244: 362-364; Choo et al., Br. Med. Bull. (19990) 46: 423-441; Ebeling et al. , Lancet (1990) 335: 982-983; van der Poel et al., Lancet (1990) 335: 558-560; van der Poel et al., Lancet (1991) 337: 317-319; Chien, D. Y. , Publicação Internacional No. WO 94/01778; Valenzuela et al., Publicação Internacional No. WO 97/44469; e Kashiwakuma et al., Patente US No. 5.871.904.

Um problema significante encontrado com alguns ensaios à base de soro é que existe um intervalo grande entre a infecção e detecção do vírus, freqüentemente 80 dias. Esse intervalo de ensaio cria grande risco para recipientes de transfusão de sangue. Para superar este problema, testes à base de anticorpo (NAT) que detectam RNA viral diretamente, e testes de antigeno de núcleo do HCV daquele ensaio de antigeno viral ao invés de resposta ao anticorpo, foram desenvolvidos. Veja, e.g., Kashiwakuma et al., Patente US No. 5.871.904; Beld et al. , Transfusion (2000) 40: 575-579.

Entretanto, permanece uma necessidade por ferramentas de prognósticos e diagnóstico acuradas e sensíveis a fim de fornecer cuidado adequado ao paciente assim como prevenir a transmissão de HCV pelo sangue e produtos com sangue ou por contato pessoal íntimo.

Descrição Resumida Invenção A presente invenção está baseada em parte, na verificação de que anticorpos de soroconversão do HCV são tipicamente anti-núcleo e anti-NS3 (helicase). Desse modo, a invenção fornece um ensaio de combinação de anticorpo de NS3 e antigeno de núcleo que pode detectar tanto antígenos do HCV quanto anticorpos presentes em uma amostra usando uma matriz sólida única.

Assim, em uma realização, a invenção é direcionada a um suporte sólido de imunoensaio compreendendo pelo menos um anticorpo anti-núcleo do HCV e pelo menos um epítope NS3/4a do HCV isolado ligado ao mesmo. O anticorpo e epitope NS3/4a pode ser qualquer das moléculas descritas aqui. Adicionalmente, o suporte sólido pode incluir qualquer dos antigenos de fusão de epitope descritos aqui, tal como anticorpo de fusão de epitope múltiplo compreendendo a seqüência de amino ácido descrita nas Figuras 7A-7F.

Em certas realizações, o suporte sólido compreende pelo menos dois anticorpos anti-núcleo do HCV ligado ao mesmo. Além do mais, o anticorpo anti-núcleo pode ser um anticorpo monoclonal. Adicionalmente, o epitope NS3/4a pode ser um epitope conformacional, tal como um epitope NS3/4a conformacional compreendendo a seqüência de amino ácido descritas nas Figuras 4A-4D.

Em uma outra realização, a invenção é direcionada a um suporte sólido de iraunoensaio compreendendo pelo menos dois anticorpos monoclonais anti-núcleo do HCV e pelo menos um epitope conformacional NS3/4a compreendendo a seqüência de amino ácido descrita nas Figura 4A-4D, ligadas ao mesmo.

Ainda em uma outra realização, a invenção é direcionada a um método de detecção de infecção por HIV em uma amostra biológica. O método compreende: (a) fornecimento de um suporte sólido de imunoensaio como descrito acima; (b) combinação de uma amostra biológica com o suporte sólido sob condições que permitem que antigenos e anticorpos do HCV, quando presentes na amostra biológica, se aglutinem a pelo menos um anticorpo anti-núcleo e ao epitope NS3/4a, respectivamente; (c) adição ao suporte sólido da etapa (b) sob condições de formação de complexo de (i) um primeiro anticorpo detectavelmente marcado, em que dito primeiro anticorpo detectavelmente marcado é um anticorpo anti-núcleo do HCV detectavelmente marcado, em que dito anticorpo anti-núcleo marcado é direcionado contra um epitope de núcleo do HCV diferente do que pelo menos um anticorpo anti-núcleo ligado ao suporte sólido; (ii) um antigeno que reage com um anticorpo do HCV da amostra biológica reativa com dito epitope NS3/4a; e (iii) um segundo anticorpo detectavelmente marcado, em que dito segundo anticorpo detectavelmente marcado é reativo com o antigeno de (ii); e (d) detecção de complexos formados entre os anticorpos e antigenos, se houver, como uma indicação de infecção por HIV na amostra biológica. 0 epitope de NS3/4a pode ser um epitope conformacional, tal como um epitope conformacional tendo a seqüência NS3/4a descrita nas Figuras 4A-4D.

Ainda em uma outra realização, a invenção se refere a um método de detecção de infecção por HCV em uma amostra biológica. O método compreende: (a) fornecimento de um suporte sólido de imunoensaio com pelo menos dois anticorpos anti-núcleo do HCV ligados ao mesmo, como descrito acima; (b) combinação de uma amostra biológica com dito suporte sólido sob condições que permitem que anticorpos e antigenos do HCV, quando presentes na amostra biológica, se aglutinem ao dito pelo menos dois anticorpos anti-núcleo e dito epitope NS3/4a, respectivamente; (c) adição do suporte sólido da etapa (b) sob condições de formação de complexo (i) um primeiro anticorpo detectavelmente marcado, em que dito primeiro anticorpo detectavelmente marcado é um anticorpo anti-núcleo do HCV detectavelmente marcado, em que dito anticorpo anti-núcleo marcado é direcionado contra um epitope de núcleo do HCV diferente do que os pelo menos dois anticorpos anti-núcleo ligado ao suporte sólido; (ii) um epitope da região c33c da poliproteina do HCV fundida a uma seqüência de amino ácido de hSOD; e (iii) um segundo anticorpo detectavelmente marcado, em que dito segundo anticorpo detectavelmente marcado é reativo com a seqüência de amino ácido de hSOD; (d) detecção de complexos formados entre os anticorpos e antígenos, se houver, como uma indicação de infecção por HIV na amostra biológica. O epitope NS3/4a pode ser um epitope conformacional, tal como um epitope conformacional tendo a seqüência NS3/4a descrita nas Figura 4A-4D.

Em qualquer uma das realizações acima, o anticorpo anti-núcleo pode ser direcionado contra uma região com N terminal do antigeno núcleo do HCV, tal como contra os amino ácidos 10-53 do HCV, numerados em relação a seqüência de poliproteina de HCV1 e dito anticorpo anti-núcleo do HCV detectavelmente marcado é direcionado contra a região com C terminal do anticorpo núcleo do HCV, tal como os amino ácidos 120-130 do HCV, numerados em relação a seqüência de poliproteina do HCV1. Além do mais, o anticorpo que reage com um anticorpo do HCV da amostra biológica pode ser da região NS3, tal como um epitope da região c33c da poliproteina do HCV e pode ser fundido a uma seqüência de amino ácido de superóxido dismutase humana (hSOD). Neste realização, o segundo anticorpo detectavelmente marcado é reativo com a seqüência de amino ácido de hSOD.

Em uma outra realização, a invenção é direcionada a um método de detecção de infecção por HCV em uma amostra biológica. O método compreende: (a) fornecimento de um suporte sólido de imunoensaio incluindo dois anticorpos monoclonais anti-núcleo do HCV e um epitope conformacional compreendendo a seqüência de amino ácido descrita nas Figuras 4A-4D; (b) combinação de uma amostra biológica com dito suporte sólido sob condições que permitem que anticorpos e antigenos do HCV, quando presentes na amostra biológica, se aglutinem aos ditos pelo menos dois anticorpos anti-núcleo e dito epitope conformacional NS3/4a, respectivamente; (c) adição ao suporte sólido da etapa (b) sob condições de formação de complexo de (i) um primeiro anticorpo detectavelmente marcado, em que dito primeiro anticorpo detectavelmente marcado é um anticorpo anti-núcleo do HCV detectavelmente marcado, em que dito anticorpo anti-núcleo marcado é direcionado contra um epitope de núcleo do HCV diferente do que os pelo menos dois anticorpos anti-núcleo ligados ao suporte sólido; (ii) um epitope da região c33c da poliproteína do HCV fundida a uma seqüência de amino ácido de hSOD; e (iii) de um segundo anticorpo detectavelmente marcado, em que dito segundo anticorpo detectavelmente marcado é reativo com a seqüência de amino ácido de hSOD; (d) detecção de complexos formados entre os anticorpos e antigenos, se houver, como uma indicação de infecção por HIV na amostra biológica.

Em certas realizações, os pelo menos dois anticorpos anti-núcleo são direcionados contra uma região com N terminal do anticorpo de núcleo do HCV, tal como contra os amino ácidos 10-53 do HCV, numerados em relação à poliproteína do HCV1, e o anticorpo anti-núcleo do HCV detectavelmente marcado é direcionado contra uma região com C terminal do antígeno núcleo do HCV, tal como contra os amino ácidos 120-130 do HCV, numerados em relação à seqüência de poliproteina do HCVl.

Em uma outra realização, a invenção é direcionada a um método de detecção de infecção do HCV em uma amostra biológica. O método compreende: (a) fornecimento de um suporte sólido de imunoensaio que inclui um antigeno de fusão de epitope múltiplo; (b) combinação de uma amostra biológica com dito suporte sólido sob condições que permitem que anticorpos e antigenos do HCV, quando presentes na amostra biológica, se aglutinem ao dito pelo menos um anticorpo anti-núcleo e dito epitope NS3/4a, e o antigeno de fusão do epitope múltiplo; (c) adição ao suporte sólido da etapa (b) sob condições de formação de complexo de (i) um primeiro anticorpo detectavelmente marcado, em que dito primeiro anticorpo detectavelmente marcado é um anticorpo anti-núcleo do HCV detectavelmente marcado, em que dito anticorpo anti-núcleo marcado é direcionado contra um epitope de núcleo do HCV diferente do que pelo menos um anticorpo anti-núcleo ligado ao suporte sólido; (ii) primeiro e segundo antigenos que reagem com um anticorpo do HCV da amostra biológica reativa com dito epitope NS3/4a e dito antigeno de fusão do epitope múltiplo, respectivamente; e (iii) um segundo anticorpo detectavelmente marcado, em que dito segundo anticorpo detectavelmente marcado é reativo com os antigenos de (ii); (d) detecção de complexos formados entre os anticorpos e antigenos, se houver, como uma indicação de infecção por HCV na amostra biológica. O anticorpo anti-núcleo pode ser direcionado contra uma região com N terminal do anticorpo núcleo do HCV e dito primeiro anticorpo do HCV detectavelmente marcado pode ser direcionado contra uma região com C terminal do anticorpo núcleo do HCV, como descrito acima. Além do mais, o primeiro antigeno que reage com um anticorpo do HCV da amostra biológica pode compreender um epitope da região c33c da poliproteina do HCV, e pode ser fundida com uma seqüência de amino ácido de hSOD. Neste contexto, o segundo anticorpo detectavelmente marcado é reativo com a seqüência de amino ácido de hSOD. Adicionalmente, o segundo anticorpo que reage com um anticorpo do HCV da amostra biológica pode compreender um epitope da região c22 da poliproteina do HCV, tal como um epitope compreendendo os amino ácidos Lysio a Sergg da poliproteina do HCV, com uma deleção da Arg 47 e uma substituição de Leu por Trp na posição 44, numerada em relação à seqüência de poliproteina do HCV1. 0 epitope pode ser fundido com uma seqüência de amino ácido de hSOD. Se for assim, o seguindo anticorpo detectavelmente marcado é reativo com a seqüência de amino ácido do hSOD. O antigeno de fusão do epitope múltiplo pode compreender a seqüência de amino ácido descrita nas Figuras 7A-7F.

Ainda em uma outra realização, a invenção se refere a um método de detecção de HCV em uma amostra biológica, dito método compreendendo: (a) fornecimento de um suporte sólido de imunoensaio que compreende pelo menos dois anticorpos monoclonais anti-núcleo do HCV, um epitope conformacional NS3/4a do HCV compreendendo a seqüência de amino ácido descrita nas Figuras 4A-4D, e um antigeno de fusão de epitope múltiplo compreendendo a seqüência de amino ácido descrita nas Figuras 7A-7F, ligadas ao mesmo; (b) combinação de uma amostra biológica com dito suporte sólido sob condições que permitem que anticorpos e antigenos do HCV, quando presentes na amostra biológica, se aglutinem aos ditos pelo menos dois anticorpos anti-núcleo e dito epitope conformacional NS3/4a, e dito antigeno de fusão do epitope múltiplo, respectivamente; (c) adição ao suporte sólido da etapa (b) sob condições de formação de complexo de (i) um primeiro anticorpo detectavelmente marcado, em que dito primeiro anticorpo detectavelmente marcado é um anticorpo anti-núcleo do HCV detectavelmente marcado, em que dito anticorpo anti-núcleo marcado é direcionado contra um epitope de núcleo do HCV diferente do que os pelo menos dois anticorpos anti-núcleo ligados ao suporte sólido; (ii) um epitope da região c33c da poliproteína do HCV fundida a uma seqüência de araino ácido de hSOD e um epitope da região c22 da poliproteína do HCV fundida a uma seqüência de araino ácido de hSOD; e (iii) um segundo anticorpo detectavelmente marcado, em que dito segundo anticorpo detectavelmente marcado é reativo com ditas seqüências de amino ácidos de hSOD; (d) detecção de complexos formados entre os anticorpos e antígenos, se houver, como uma indicação de infecção por HIV na amostra biológica.

Nesta realização, os pelo menos dois antígenos anti-núcleo podem ser direcionados contra uma região com N terminal do anticorpo de núcleo do HCV, tal como contra os amino ácidos 10-53 do HCV, numerados em relação à poliproteína do HCV1, e o anticorpo anti-núcleo do HCV detectavelmente marcado é direcionado contra uma região com C terminal do antigeno núcleo do HCV, tal como contra os amino ácidos 120-130 do HCV, numerados em relação à seqüência de poliproteína do HCV1. Além do mais, o epitope da região c22 pode compreender amino ácidos Lysio a Ser99 da poliproteína do HCV, com a deleção da Arg47 e uma substituição de Leu por Trp na posição 44, numerados em relação à seqüência de poliproteína do HCV1.

Em outra realização, a invenção é direcionada a kits de teste imunodiagnóstico compreendendo o suporte sólido de imunoensaio descrito acima, e instruções para condução do teste de imunodiagnóstico.

Ainda em realizações adicionais, a invenção é direcionada a métodos de produção de um suporte sólido de imunoensaio, compreendendo: (a) fornecimento de um suporte sólido; e (b) aglutinação de pelo menos um anticorpo anti-núcleo do vírus da hepatite C (HCV), tal como um ou dois ou mais, e pelo menos um epítope NS3/4a do HCV isolado ao mesmo, e opcionalmente, um antígeno de fusão do epitope múltiplo ao mesmo. Os anticorpos anti-núcleo, epitopes NS3/4a e antígenos de fusão de epítopo múltiplo são como descrito acima.

Em realizações adicionais, a invenção é direcionada a um antígeno de fusão de epítope múltiplo compreendendo a seqüência de amino ácido descrita nas Figura 7A-7F, ou uma seqüência de amino ácido com pelo menos 80% de identidade de seqüência, tal como 90% ou mais de identidade com a seqüência, a qual rege especificamente com anticorpos anti-HCV presentes em uma amostra biológica de um indivíduo infectado com HCV. Em certas realizações, o antígeno de fusão de epítope múltiplo consiste na seqüência de amino ácido descrita nas Figuras 5A-5F.

Em realizações adicionais, a invenção é direcionada a um poliproteína compreendendo uma seqüência codificadora para o anticorpo de fusão de epítope múltiplo acima, um vetor recombinante compreendendo os polinucleotídeos, células hospedeiras transformadas com os vetores recombinantes, e métodos de produção de um antigeno fusão de epítope múltiplo recombinante compreendendo: (a) fornecimento de uma população de células hospedeiras conforme definido acima; e (b) cultura da dita população de célula sob condições por meio das quais o antigeno de fusão de epitope múltiplo codificado pela seqüência codificadora presente no dito vetor recombinante é expresso.

Esses e outros aspectos da presente invenção se tornarão evidentes em referência à seguinte descrição detalhada e desenhos em anexo.

Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 é uma representação diagramática do genoma do HCV, mostrando as várias regiões da poliproteina da qual os presentes reagentes de ensaio (proteínas e anticorpos) são derivados. A Figura 2 é um desenho esquemático de um ensaio de combinação de anticorpo/antígeno representativo segundo a invenção. A Figura 3 mostra a seqüência de amino ácido de um antigeno conformacional NS3/4a representativo para uso no presente ensaio. A alanina dobrada na posição 182 é substituída pela serina nativa normalmente presente nesta posição.

As Figuras 4A até 4D mostram o DNA e a seqüência de amino ácido correspondente de um outro antigeno conformacional NS3/4a representativo para uso nos presentes ensaios. Os amino ácidos nas posições 403 e 404 das Figura 4A a 4D representam substituições de Pro por Thr, e Ile por Ser, da seqüência de amino ácido nativa de HCV-1. A Figura 5 é um diagrama da construção de pd.HCVla.ns3ns4aPI.

A Figura 6 é uma representação diagramática de MEFA 12 .

As Figuras 7A-7F mostram o DNA e seqüência de amino ácido correspondente de MEFA 12. A Figura 8 é um desenho esquemático de um imunoensaio segundo a invenção, usando MEFA 12.

Descrição Detalhada da Invenção A prática da presente invenção irá empregar, a menos que de outro modo indicado, métodos convencionais de química, bioquímica, técnicas de DNA recombinantes e imunologia, conhecidos do estado da técnica. Tais técnicas são explicadas completamente na literatura. Veja, e.g., Fundamental Virology, 2nd edição, vol I e II (B. N. Field and D. M. Knipe, eds.) ; Handbook of Experimental Immunology, vols. I-IV (D.M. Weir and C. C. Blackwell eds., Blackwell Scietific Publications); T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current adition); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods in Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.).

Deve ser notado que, como usado neste relatório descritivo e reivindicações, as formas singulares "um(a)" e "o(a)" incluem correspondentes no plural a menos que o teor indique claramente de modo diferente. Assim, por exemplo, referência a "um antígeno" inclui uma mistura de dois ou mais antígenos, e similares.

As seguintes abreviações de amino ácido são usadas por todo o texto: Alanina: Ala(A) Arginina: Arg (R) Asparagina: Asn(N) Ácido aspártico: Asp (D) Cisterna: Cys (C) Glutamina: Gin (Q) Ácido glutâmico: Glu (E) Glicina: Gly (G) Histidina: His (H) Isoleucina: Ile (I) Leucina: Leu (L) Lisina: Lys (K) Metionina: Met (M) Fenilalanina: Phe (F) Prolina: Pro (P) Serina: Ser (S) Treonina: Thr (T) Triptofano: Trp (W) Tirosina: Tys (Y) Valina: Vai (V) I. Definições Na descrição da presente invenção, os seguintes termos serão empregados, e são destinados a serem definidos como indicadp abaixo.

Os termos "polipeptideo" e "proteína" se referem a um polimero de residuos de amino ácido e não são limitados a um comprimento mínimo do produto. Assim, peptídeos, oligopeptídeos, dímeros, multimeros, e similares, são incluídos dentro da definição. Tanto proteínas de comprimento completo quanto fragmentos das mesmas estão englobados pela definição. Os termos também incluem modificações de pós-expressão do polipeptídeo, por exemplo, glicosilação, acetilação, fosforilação e similares. Além do mais, para propósitos da presente invenção, um "polipeptídeo" se refere a uma proteína que inclui modificações, tais como deleções, adições e substituições (geralmente conservadoras de natureza, à seqüência nativa, a fim da proteína manter a atividade desejada. Essas modificações podem ser liberadas, como através de mutagênese direcionada a sítio, ou podem ser acidentais, tais como através de mutações de hospedeiros que produzem as proteínas ou erros devido à amplificação de PCR.

Um polipeptídeo do HCV é um polipeptídeo, como definido acima, derivado da poliproteína do HCV. O polipeptídeo necessita não ser fisicamente derivado do HCV, mas pode ser sinteticamente ou recombinantemente produzido. Além do mais, o polipeptídeo pode ser produzido a partir de quaisquer das várias linhagens do HCV, tais como de linhagens 1, 2, 3 ou 4 do HCV. Várias regiões variáveis e conservadas são conhecidas entre essas linhagens e, em geral, as seqüência se amino ácido de epítopes derivados dessas regiões terão um alto grau de homologia de seqüência, e.g., uma homologia de seqüência de amino ácido de mais do que 30%, preferencialmente mais do que 40%, quando as duas seqüências são alinhadas. Assim, por exemplo, o termo polipeptídeo "NS3/4a" se refere a NS3/4a nativo de qualquer das várias linhagens do HCV, assim como análogos NS3/4a, muteínas e fragmentos imunogênicos, como definido adicionalmente abaixo. Os genótipos completos de muitos dessas linhagens são conhecidos. Veja, e.g., Patente US No. 6.150.087 e GenBank Nos. de acesso AJ238800 e AJ238799.

Os termos "análogo" e "muteína" se referem a derivados biologicamente ativos da molécula referência, ou fragmentos de tais derivados, que retêm atividade desejada, tal como imunoreatividade nos ensaios descritos aqui. Em geral, o termo "análogo" se refere a compostos tendo uma seqüência de polipeptideo e estrutura com uma ou mais adições, substituições (geralmente conservantes de natureza) e/ou deleções de amino ácidos, em relação à molécula nativa, a fim das modificações não destruírem a atividade imunogênica. O termo "muteína" se refere a peptídeos tendo uma ou mais cópias de peptídeo ("peptóides"), tais como aqueles descritos na Publicação Internacional No. WO 91/04282. Preferencialmente, o análogo ou muteína tem pelo menos a mesma imunoreatividade que a molécula nativa. Método para fazer análogos de polipeptideo e mutepinas são conhecidos na técnica e são descritos adicionalmente abaixo.

Análogos particularmente preferido incluem substituições que são consecutivas na natureza, i.e., aquelas substituições que ocorrem dentro de uma família de amino ácidos que são relacionadas em suas cadeias laterais. Especificamente, amino ácidos são geralmente divididos em quatro famílias: (1) ácido - aspartato e glutamato; (2) básico - lisina, arginina, histidina; (3) não polar alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; e (4) polar não carregada - glicina, asparagina, glutamina, cisteína, treonina serina, tirosina. Fenilalanina, triptofano, e tirosina são às vezes classificados como amino ácidos aromáticos. Por exemplo, é razoavelmente predito que uma substituição isolada de leucina por isoleucina ou valina, um aspartato com um glutamato, uma treonina com uma serina, ou uma substituição conservadora similar de um amino ácido com um amino ácido relacionado estruturalmente, não terá um efeito maior na atividade biológica. Por exemplo, o polipeptideo de interesse inclui até cerca de 5-10 substituições de amino ácido não conservante, ou mesmo até cerca de 15-25 substituições de amino ácido não conservantes ou conservantes, ou qualquer inteiro entre 5-25, a fim da função desejada da molécula permanece intacta. Um técnico no assunto pode prontamente determinar regiões da molécula de interesse que pode tolerar variação por referência a Hopp/Woods e Kyte-Doolittle plots, bem conhecidos na técnica.

Por "fragmento" entende-se um polipeptideo consistindo em somente uma parte da seqüência e estrutura de polipeptideo de comprimento completo. O fragmento pode incluir uma deleção de C terminal e/ou deleção de N terminal do polipeptideo nativo. Um "fragmento imunogênico" de uma proteína de HCV particular incluirá geralmente pelo menos cerca de 5-10 resíduos de amino ácido contíguo da molécula de comprimento completo, preferencialmente pelo menos cerca de 15-25 resíduos de amino ácidos da molécula de comprimento completo, e mais preferencialmente a pelo menos cerca de 20-50 ou mais resíduos de amino ácido contíguos da molécula de comprimento completo, que definem um epítope, ou qualquer inteiro entre 5 amino ácidos e seqüência de comprimento completo, desde que o fragmento em questão retenha imunoreatividade nos ensaios descritos aqui. Por exemplo, fragmentos imunogênicos preferidos, incluem mas não estão limitados a fragmentos do núcleo do HCV que compreende, e.g., os amino ácidos 10-45, 10-53, 67-88, e 120-130 da poliproteína, epítope 5-1-1 (na região NS3 do genoma viral) assim como epítopes definidos de regiões de El, E2, c33c (NS3), clOO (NS4), NS3/4a e NS5 da poliproteína, assim como de qualquer outros vários epítopes identificados da poliproteína do HCV. Veja, e.g., Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1992) 89: 10011-10015; Chien et al. , J. Gastroent. Hepatol. 91993) 8 : S33-39; Chien et al., Publicação Internacional No. WO 93/00365; Chien, D. Y., International Publication No. WO 94/01778; Patente US No. 6.150.087 e 6.121.020. O termo "epítope" como aqui usado se refere a uma seqüência de pelo menos cerca de 3 a 5, preferencialmente cerca de 5 a 10 ou 15, e não mais do que cerca de 1000 amino ácidos (ou qualquer inteiro entre eles), que definem uma seqüência por ela mesma ou como parte de uma seqüência maior, se aglutina a um anticorpo gerado em resposta a tal seqüência. Não existe nenhum limite crítico do comprimento do fragmento, que pode compreender próximo do comprimento completo da seqüência de proteína, ou mesmo uma proteína de fusão compreendendo dois ou mais epítopes da poliproteína do HCV. Um epítope para uso na invenção não está limitado a um polipeptídeo tendo a seqüência exata da porção da proteína de origem da qual é derivada. Na verdade, genomas virais estão em um estado de constante fluxo e contêm vários domínios que apresentam graus relativamente altos de variabilidade entre isolados. Assim o termo "epitope" engloba seqüências idênticas à seqüência nativa, assim como modificações à seqüência nativa, tais como deleções, adições e substituições (geralmente conservadoras de natureza).

Regiões de um dado polipeptídeo que incluem um epítope podem ser identificados usando qualquer número de técnicas de mapeamento de epítope, bem conhecidos na técnica. Veja, e.g.r Epítope Mapping Protocols em Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed. , 1996) Humana Press, Totwa, NJ. Por exemplo, epítopes lineares podem ser determinados por e.g., síntese concorrente de grandes números de peptídeos em suportes sólidos, os peptídeos correspondendo a porções da molécula de proteína, e reagindo os peptídeos com anticorpos enquanto os peptídeos são ainda ligados aos suportes. Tais técnicas são conhecidas na arte e descritas em, e.g., Patente US No. 4.708.871; Geysen et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sei USA 81: 3998-4002; Geysen et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei USA 82: 178-182; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23: 709-715. Usando tais técnicas, vários epítopes de HCV foram identificados. Veja, e.g., Chien et al., Viral Hepatitis and Liver Disease (1994) pp. 320-324, e adicionalmente abaixo. Similarmente, epítopes conformacionais são prontamente identificados determinando conformação espacial de amino ácidos tal como por, e.g., cristalografia de raio X e ressonância magnética nuclear de 2 dimensões. Veja, e.g., Epítome Mapping Protocols, supra. Regiões antigênicas de proteina podem também ser identificadas usando antigenicidade padrão e hidropatia, tais como aqueles calculados usando, e.g., o programa software versão 1.0 Omiga disponível junto a Oxford Molecular Group. Este programa de computador emprega o método Hopp/Woods, Hoop et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA (1981) 78: 3824-3828 para determinar perfis de antigenicidade, e as técnicas de Kyte-Doolittle, Kyte et al., J. Mol. Biol. (1982) 157: 105-132 para mapas de hidropatia.

Como aqui usado, o termo "epitope 'conformacional" se refere a uma porção de uma proteína de comprimento completo, ou um análogo ou mutepina do mesmo, tendo características estruturais nativas á seqüência de amino ácido codificando o epitope dentro da proteína natural de comprimento completo. Características estruturais nativas incluem, mas não estão limitadas a, glicosilação e estrutura tridimensional. O comprimento da seqüência que define o epitope pode ser submetido a váriações desses epítopes, que acredita-se que sejam formados, por forma tridimensional do antígeno (e.g., dobramento). Assim, amino ácidos definido epitope podem ser relativamente poucos em número, mas amplamente dispersos ao longo do comprimento da molécula (ou mesmo em diferentes moléculas no caso de dímeros, etc.) sendo trazidos na conformação de epitope correta via dobramento. As porções do antígeno entre os resíduos definido o epitope podem não ser crípticas para a estrutura conformacional do epitope. Por exemplo, deleção ou substituição dessa seqüências de intervenção podem não afetar o epitope conformacional que forneceu seqüências críticas a conformação do epitope que são mantidas (e.g., cisteinas envolvidas na ligação de dissulfeto, sítios de glicolsilação, etc.).

Epitopes conformacionais presentes na região NS3/4a são prontamente identificadas usando métodos discutidos acima. Além do mais, a presença ou ausência de um epítope conformacional pode ser prontamente determinado através da seleção do antígeno de interesse com um anticorpo (soro policlonal ou monoclonal ao epítope conformacional) e comparando sua reatividade àquela de uma versão desnaturada do antígeno que retém somente epitopes lineares (se houver). Em tal seleção usando anticorpos policlonais, pode ser vantajoso absorver o soro policlonal primeiro com o antígeno desnaturado e ver se ele retém anticorpos ao antígeno de interesse. Adicionalmente, no caso de NS3/4a, uma molécula que preserva a conformação nativa também terá protease e, opcionalmente, atividades enzimáticas de helicase. Tais atividades podem ser detectadas usando ensaios enzimáticos, como descrito adicionalmente abaixo.

Preferencialmente, um epítope conformacional é produzido recombinantemente e é expresso em uma célula que é extrapivel sob condições que preservam suas características de estrutura desejada, e.g. sem desnaturação do epítope. Tais células incluem bactéria, levedura, inseto, e células de mamíferos. Expressão e isolamento de epítope epitopes conformacionais recombinantes da poliproteína do HCV são descritos em e.g. Publicação Internacional Nos. WO 96/04301, WO 94/01778, WO 95/33053, WO 92/08734. Alternativamente, é possível expressar os antígenos e ainda renaturar a proteína após recuperação. É também entendido que síntese química pode também fornecer mimitopes de antigeno conformacional que reagem por cruzamento com epitope conformacional de antigeno "nativo". O termo "antigeno de fusão de epitope múltiplo" ou "MEFA" como aqui usado destina-se a um polipeptideo em que antigenos do HCV múltiplos são pártes de uma única cadeia continua de amino ácidos, cuja cadeia não ocorre na natureza. Os antigenos do HCV podem ser conectados diretamente um ao outro por ligações de peptideo ou podem ser separados por intervenção de seqüências de amino ácido. Os antigenos de fusão podem também conter seqüências exógenas a poliproteina do HCV. Além do mais, as seqüências do HCV presentes podem ser de múltiplos genótipos e/ou isolados do HCV. Exemplos de MEFAs particulares para uso nos presentes imunoensaios são detalhados em, e.g., Publicação Internacional No. WO 97/44469, e são descritos abaixo.

Um "anticorpo" destina-se a uma molécula que, através de meio quimico ou físico, se aglutina especificamente a um polipeptideo de interesse. Assim, um anticorpo de núcleo do HCV é uma molécula que especificamente se aglutina a proteina núcleo do HCV. 0 termo "anticorpo" como aqui usado inclui anticorpos obtidos de preparações monoclonais e policlonais, assim como os seguintes: moléculas de anticorpo híbridas (quiméricas) (veja, por exemplo, Winter et al., (1991) Nature 349: 293-299; e Patente US No. 4.816.567); fragmentos F(ab')2 e F(ab); moléculas Fv (heterodímeros não covalentes, veja, por exemplo, Inbar et al. (1972) Proc Natl Acad Sei USA 69: 2659-2662; e Ehrlich et al. (1980) Biochem 19: 4091-4096); moléculas de Fv de cadeia únicxa (sFv) (veja, por exemplo, Huston et al., (1988) Proc Natl Sei USA 85: 5879-5883); construções de fragmento de anticorpo dimérico e trimérico minicorpos (veja, e.g., Pack et al. (1992) Biochem 31: 1579-1584;

Cumber et al. (1992) J Immunology 149B: 120-126); moléculas de anticorpo humanizadas (veja, por exemplo, Riechmann et al. (1988) nature 332 : 323-327; Verhoeyan et al. , (1988) Science 239: 1534-1536; e Publicação de Patente No. GB 2.276.169, publicada em 21 de setembro de 1994); e, quaisquer fragmentos funcionais obtidos de tais moléculas, em que tais fragmentos retêm propriedades de aglutinação imunológicas da molécula de anticorpo de origem.

Conforme aqui usado, o termo "anticorpo monoclonal" se refere a uma composição de anticorpo tendo uma população de anticorpo homogênea. O termo não está limitado com relação às espécies ou fonte do anticorpo, nem é destinado a ser limitado pela maneira na qual é feita. Assim, o termo engloba anticorpos obtidos junto a hibridomas de murino, assim como anticorpos monoclonais humanos obtidos usando preferencialmente hibridomas de murino. Veja, e.g., Cote, et al. Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, 1985, p. 77.

Uma proteína "recombinante" é uma proteína que retém a atividade desejada e que foi preparada por técnicas de DNA recombinante como descrito aqui. Em geral, o gene de interesse é clonado e depois expressado em organismos, como descrito adicionalmente abaixo. O organismo hospedeiro expressa o gene exógeno para produzir a proteína sob condições de expressão.

Por "isolado" entende-se, quando referindo-se a um polipeptideo, que a molécula indicada é separada e diferente do organismo como um todo com o qual a molécula é encontrada na natureza ou está presente na ausência substancial de outras macromoléculas biológicas do mesmo tipo. O termo "isolado" com relação a um polinucleotideo é uma dita molécula de ácido nucléico, no todo ou em parte, de seqüências normalmente associadas com ela na natureza; ou uma seqüência, como ela existe na natureza, mas tendo seqüências heterólogas em associação com elas; ou uma molécula dissociada do cromossomo.

Por "determinante antigênico equivalente" entende-se um determinante antigênico de subespécies ou linhagens diferentes do HCV, tais como linhagens 1, 2, ou 3 do HCV. Mais especificamente, epitopes são conhecidos, tal como 5-1-1, e tais epitopes variam entre as linhagens 1, 2 e 3. Assim, o epitope 5-1-1 das três linhagens diferentes são determinantes antigênicos equivalentes e assim são "cópias" embora suas seqüências não sejam idênticas. Em geral, as seqüências de amino ácido de determinantes antigênicos equivalentes terão um alto grau de homologia de seqüência, e.g. homologia de seqüência de amino ácido de mais do que 30%, preferencialmente mais do que 40%, quando as duas seqüências são alinhadas. "Homologia" se refere ao percentual de similaridade entre dois polinucleotideos ou duas porções de polipeptideo. Dois DNA, ou duas seqüências de polipeptideo são "substancialmente homólogas" entre si quando as seqüências apresentam pelo menos cerca de 50%, preferencialmente pelo menos cerca de 75%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 80-85%, preferencialmente pelo menos cerca de 90%, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 95-98% de similaridade da seqüência sobre um comprimento definido das moléculas. Como aqui usado, substancialmente homólogos também se refere a seqüências mostrando completa identidade ao DNA especificado ou seqüência de polipeptideo.

Em geral, "identidade" se refere a uma correspondência nucleotideo a nucleotideo ou amino ácido a amino ácido exata de dois polinucleotideos ou seqüências de polipeptideo, respectivamente. Percentual de identidade pode ser determinado por uma comparação direta da informação da seqüência entre duas moléculas por alinhamento das seqüências, contando o número exato de encaixes entre as duas seqüências alinhadas, dividindo pelo comprimento da seqüência mais curta, e multiplicando o resultado por 100.

Programas de computador prontamente disponíveis podem ser usados para auxiliar na análise de similaridade e identidade, tal como ALIGH, Dayhoff, M.O. em Astlas of Protein Sequence and Strcture M.O. Dayhoff ed. , Suppl. 3: 353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC, que adapta o algoritmo de homologia local de Smith and Waterman Advances in Appl. Math. 2: 482-489, 1981 para análise peptídeo. Programas para determinar similaridade e identidade de seqüência de nucleotideo estão disponíveis em Wisconsin Sequence Analysis Package, Version8 (disponível junto a Genetics Computer Group, Madison, WI) por exemplo, os programas BESTFIT, FASTA e GAP, que também se baseiam no algoritmo de Smith e Waterman. Esses programas são prontamente utilizados com os parâmetros de default recomendados pelo fabricante e descritos em Wisconsin Sequence Analysis Package referidos acima. Por exemplo, porcentagem de similaridade de uma seqüência de nucleotideo particular a uma seqüência referencia pode ser determinada usando o algoritmo de homologia de Smith e Waterman com uma tabela de classificação default e uma penalidade de intervalo de seis posições de nucleotideo.

Um outro método de estabelecimento de percentual de similaridade no contexto da presente invenção é para usar o pacote de programas MPSRCH da University Edinburgh, desenvolvido por John F. Collins e Shane S. Sturrok, e distribuído por Intelli Genetics, Inc. (Mountain View, CA). Deste conjunto de pacotes o algoritmo de Smith-Waterman pode ser empregado onde parâmetros de default são usados para a tabela de classificação (por exemplo, penalidade de aberta de intervalo de 12, penalidade de extensão de intervalo de um, e um intervalo de seis). Dos dados grados de valor "Match" reflete a "similaridade de seqüência". Outros programas adequados para calcular a porcentagem de identidade ou similaridade entre seqüências são geralmente conhecidas na técnica, por exemplo, um outro programa de alinhamento é BLAST, usado com parâmetros default. Por exemplo, BLASTN e BLASTP podem ser usados usando os parâmetros default: código genético = padrão; filtro = nenhum; linhagem - ambas; corte =60; esperado = 10; matriz = BLOSUM62; descrições = 50 seqüências; variação de = alta classificação; bases de dados = não redundante, Genbanlk + EMBL + DDBJ + PBD + Gen Bank traduções CDS + proteína Swiss + Spupdate + PIR. Detalhes desse programas podem ser encontrados nos seguintes endereços: http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST.

Alternativamente, a homologia pode ser determinada por hibridização de polinucleotideos sob condições que formam duplexes estáveis entre regiões homólogas, seguido por digestão com nuclease(s) especificas de filamento único, e determinação de tamanho dos fragmentos digeridos. Seqüências de DNA que são substancialmente homólogas podem ser identificadas em um experimento de hibridização Southern sob, por exemplo, condições severas, como definido para aqueles sistema particular. Definição de condições de hibridização apropriadas é do conhecimento do técnico no assunto. Veja, e.g., Sambrook et al. , supra; DNA Cloning, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.

Uma "sequência codificadora" ou uma que "codifica" um polipeptideo selecionado, é uma molécula de ácido nucléico que é transcrita (no caso de DNA) e traduzida (no caso de mRNA) em um polipeptideo in vitro ou in vivo quando colocada sob o controle de seqüências reguladoras apropriadas. AS vizinhanças da seqüência codificadora são determinadas por um códon de partida no 5'amino terminal e um códon de parada de tradução no 3'carbóxi terminal. Uma seqüência de terminação de transcrição pode ser localizado 3'à seqüência codificadora. "Operacionalmente ligado" se refere a uma disposição de elementos em que os componentes assim descritos são configurados a fim de realizar sua função desejada. Assim, um dado promotor operacionalmente ligado a uma seqüência codificadora' é capaz de realizar a expressão da seqüência codificadora quando fatores de transcrição próprios, etc., estão presentes. O promotor não necessita ser contíguo com a seqüência codificadora, a fim de que sua função direcione a expressão do mesmo. Assim, por exemplo, intervenção de seqüências transcritas ainda não traduzidas pode estar presente entre as seqüências de promotor e a seqüência codificadora, como pode íntrons transcritos, e a seqüência de promotor pode ainda ser considerada "operacionalmente ligado" à seqüência codificadora.

Um "elemento de controle" se refere a uma seqüência de polinucleotídeo que auxilia na expressão de uma seqüência codif icadora a qual ele está ligado. O termo inclui promotores, seqüências de terminação de transcrição, domínios reguladores da parte superior, sinais de poliadenilação, regiões não traduzidas, incluindo 5'-UTRs e 3'-UTRs e quando apropriado, seqüências líder e melhoradores, que coletivamente fornecem a transcrição e tradução de uma seqüência codificadora em uma célula hospedeira.

Um "promotor" como aqui usado é uma região reguladora de DNA capaz de aglutinar RNA polimerase em uma célula hospedeira e iniciar transcrição de uma seqüência codificadora da parte inferior (direção 3') e operacionalemnete ligada. Para fins da presente invenção, uma seqüência de promotor inclui um número mínimo de bases ou elementos necessários para iniciar a transcrição de um gene de interesse a níveis detectáveis acima dos conhecidos. Dentro da seqüência de promotor está um sítio de iniciação de transcrição, assim como domínios de aglutinação de proteína (seqüências de consenso) responsáveis para a aglutinação de RNA polimerase.

Promotores eucarióticos freqüentemente, mas não sempre, conterão caixas "TATA" e caixas "CAT".

Uma seqüência de controle "direciona a transcrição" de uma seqüência codificadora em uma célula quando a RNA polimerase se aglutinará à seqüência de promotor e transcreverá a seqüência codificadora em mRNA, que é depois traduzida no polipeptideo codificado pela seqüência codificadora. "Cassete de expressão" ou "construção de expressão" se refere a uma montagem que é capaz de direcionar a expressão da(s) seqüência(s) ou gene(s) de interesse. O cassete de expressão inclui elementos de controle, como descrito acima, tal como um promotor que é operacionalmente ligado a (para a transcrição direta da seqüência(s) ou gene(s) de interesse, e freqüentemente inclui uma seqüência de poliadenilação também. Dentro de certas realizações da invenção, o cassete de expressão descrito aqui pode estar contido dentro de uma construção de plasmidio. Além dos componentes do cassete de expressão, a construção de plasmidio pode também incluir, um ou mais marcadores selecionáveis, um sinal que permite a construção de plasmidio existir como DNA de filamento único (e.g., uma origem de M13 de replicação) , pelo menos um sitio de clonagem múltiplo, e uma origem de mamífero de replicação (e.g., uma origem de adenovírus ou SV40 de replicação)> "Transformação", como aqui usado, se refere à inserção de um polinucleotídeo em uma célula hospedeira, respectiva do método usado para inserção: por exemplo, transformação por apreensão direta, transfecção, infecção e similares. Por métodos particulares de transfecção, veja abaixo. O polinucleotideo exógeno pode ser mantido como um vetor não integrado, por exemplo, um epissoma, ou alternativamente, pode ser integrado no genoma hospedeiro.

Uma "célula hospedeira" é uma célula que foi transformada, ou é capaz de transformação, por uma seqüência de DNA exógena. "Suporte sólido comum" destina-se a uma matriz sólida única a qual os polipeptideos do HCV usados nos imunoensaios são ligadas covalentemente ou por meios não covalentes tal como adsorção hidrofóbica. "Imunologicamente reativo" significa que o antigeno em questão irá reagir especificamente com anticorpos anti-HCV presentes em uma amostra biológica de um indivíduo infectado com HCV. "Complexo imune" destina-se a combinação formada quando o anticorpo se aglutina a um epitope em um antigeno.

Como aqui usado, uma "amostra biológica" se refere a uma amostra de tecido ou fluido isolado de um indivíduo, incluindo mas não limitado a, por exemplo, sangue, plasma, soro, matéria fecal, urina, medula óssea, fluido espinhal, fluido linfático, amostras da pele, secreções externas da pele, tratos respiratório, intestinal e genitourinário, salivam lágrima, leite, células do sangue, órgãos, biopsia e também amostras de constituintes de cultura de célula in vitro incluindo mas não limitado a meio condicionado resultante do crescimento de células e tecidos em meio de cultura, e.g., células recombinantes, e componentes de célula.

Como aqui usado, os termo "marcação" e "detectavelmente marcada" se referem a um molécula capaz de detecção, incluindo, mas não limitado a, isótopos radioativos, fluorescentes, quimioluminescentes, cromoforos, enzimas, substratos de enzima, cofatores de enzima, inibidores de enzima, cromoforos, corantes, ions metálicos, sóis de matl, ligantes (e.gc, biotina, estreptavidina ou haptens) e similares. O termo "fluorescente" se refere a uma substância ou uma porção da mesma que é capaz de apresentar fluorescência na faixa detectável. Exemplos particulares de marcações que podem ser usadas sob a invenção incluem, mas não estão limitados a, rábano peroxidase (HRP), fluoresceina, PITC, rodamina, dansila, umbeliferona, éster de acridinio de dimetila (DMAE), vermelho Texas, luminol, NADPH e α-β-galactosidase. II. Modos de Realização da Invenção Antes de descrever a presente invenção em detalhes, entende-se que esta invenção não está limitada a formulações particulares ou parâmetros de processo tal como podem, é claro, variar. Deve também ser entendido que a terminologia usada aqui é para o fim de descrever realizações particulares da invenção somente, e não está destinada a ser limitante.

Embora várias composições e métodos similares ou equivalente daquelas descritos aqui posam ser usados na prática da presente invenção, os materiais e métodos preferidos são descritos aqui.

Como notado acima, a presente invenção está baseada na descoberta de novos métodos de diagnóstico para detecção acurada de infecção com HCV anterior. Os métodos se baseiam na identificação e uso de anticorpos do HCV altamente imunogênico e antigenos que são presentes durante os estágios anteriores de soroconversão do HCV, aumentando desse modo a acurácia da detecção e redução da incidência de resultados falsos. Os métodos podem ser convenientemente praticados em um único formato de ensaio.

Mais particularmente, o ensaio é conduzido em um suporte sólido ao qual foi ligado um ou mais anticorpos anti-núcleo do HCV (direcionado contra os mesmos ou diferentes epitopes núcleo do HCV) e um epitope derivado da região de NS3/4a da poliproteina do HCV. Exemplos de anticorpos anti-núcleo particulares úteis na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, moléculas de anticorpo tal como antigenos monoclonais, direcionados contra epitopes na região núcleo encontrada entre os amino ácidos 10-53; amino ácidos 10-45; amino ácidos 67-88; amino ácidos 120-130, ou anticorpos direcionados contra qualquer dos epitopes de núcleo identificados, e.g. , Houghthen et al., Patente US No. 5.350.671; Chien et al. , Proc Natl. Acad. Sei USA (1992) 89: 10011-10015; Chien et al., J. Gastroent. Hepatol 91993) 8: S33-39; Chien et al.

Publicação Internacional No. WO 93/00365; Chien, D.Y., Publicação Internacional No. WO 94/01778; e comumente cedido, Pedido de Patente US No. 08/403.590 e 08/444.818. A região NS3/4a da poliproteina do HCV foi descrita e a seqüência de amino ácido e estrutura global da proteína são descritas em, e.g. Yao et al., Structure (Novembro 1999) 7: 1353-1363; Sali et al., Biochem (1998) 37: 3392- 3401; e Bartenschlager, R. J. Viral Hepat. (1999) 6 165- 181. Veja, também, Dasmahapatra et al. , particularmente 5.843.752. O imunoensaio utiliza pelo menos um epitope conformacional derivado da região NS3/4a que existe na conformação como encontrado na partícula do HCV que ocorre naturalmente ou seu produto efetivo, como evidenciado pela preservação de protease e, opcionalmente, atividades enzimáticas de helicase normalmente mostrada pelo produto de gene NS3/4a e/ou imunoreatividade do antígeno com anticorpos em uma amostra biológica de um indivíduo infectado com HCV, e uma perda da imunoreatividade do epítope quando da desnaturação do antígeno. Por exemplo, o epítope conformacional pode ser desobstruído por calor, variando o pH a extremamente ácido ou básico, ou por adição de desnaturantes orgânicos conhecidos, tal como ditiotreitol (DDT) ou um detergente apropriado. Veja, e.g., Protein Purification Methods, a practical approach (E.L.V. Harris and S. Angal eds, IRL Press) e o produto desnaturado comparado ao produto que não é tratado como acima.

Atividade de protease e helicase pode ser determinada usando ensaios de enzima padrão bem conhecidos na técnica. Por exemplo, atividade de protease pode ser determinada usando ensaios bem conhecidos na técnica. Beja, e.g., Takeshita et al., Anal Blochem. 91997) 247: 242-246; Kakiuchi et al. , J. Biochem. (1997) 122:74 9-7 55; Sali et al. , Biochemistry (1998) 3_7 : 3392-34 01; Cho et al., J.Virol. Meth. (1998) 72: 109-115; Cerretani et al., Anal. Biochem. (1999) 266: 192-197; Zang et al., Anal. Biochem. (1999) 270: 268-275; Kakiuchi et al., J. Virol. Meth. (199) 80: 77-84; Fowler et al·., J. Biomol. Screen. (2000) 5: 153-158; e Kim et al·., Anal. Biochem. (2000) 284: 42-48. Um ensaio particularmente conveniente pata testar a atividade de protease é descrito nos exemplos abaixo.

Similarmente, ensaios de atividade de helicase são bem conhecidos na técnica e atividade de helicase de um epitope pode ser determinado usando, por exemplo, um ensaio ELISA, como descrito em, e.g., Hsu et al., Biochem Blophys. Res. Commun. (1998) 253: 594-599; um sistema de ensaio de proximidade de cintilação, como descrito em Kyono et al., Anal. Biochem. (1998) 257: 120-126; ensaios de seleção como descrito em, e.g., Hicham et al., Antiviral Res. (2000) 46: 181-193 e Kwong et al., Methods Mol. Med. (2000) 24: 97-116; assim como outros métodos de ensaio conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Khu et al. , J. Virol. (2001) 75: 205-214; Utama et al., Virology (2000) 273: 316-324; Paolini et al., J. Gen. Virol. (2000) 81: 1335-1345; Preugschat et al., Biochemistry (2000) 39: 5174-5183; Preugschat et al., Methods Mol. Med. (1998) 19: 353-364; e Hessen et al., Biochemistry (2000) 39: 2619-2625. O comprimento do antigeno é suficiente para manter um epitope conformacional imunoreativo. Freqüentemente, o polipeptideo contendo o antigeno usado será de comprimento quase completo, entretanto, o polipeptideo pode também ser truncado para, por exemplo, aumentar a solubilidade ou para aperfeiçoar a secreção. Geralmente, o epitope conformacional encontrado em NS3/4a é expressado como um polipeptideo recombinante em uma célula e este polipeptideo fornece o epitope em uma forma desejada, como descrito em detalhes abaixo.

Seqüências de amino ácido representativos para polipeptideos de NS3/4a são mostradas na Figura 3 e Figura 4A a 4D. A alanina dobrada ocorrendo na posição 182 da Figura 3 é substituída por uma serina nativa encontrada nesta posição a fim de prevenir a autocatálise da molécula que pode por outro lado ocorrer. A seqüência de amino ácido mostrada nas posições 2-868 das Figuras 4A a 4D corresponde a posições de amino ácido 1027-1711 do HCV-1. Um códon iniciador (ATG) codificando Met, é mostrado na posição 1.

Adicionalmente, o Thr normalmente ocorre na posição 1428 do HCV1 (posição do amino ácido 403 da Figura 4) é mutada a Pro, e a Ser normalmente ocorrendo na posição 1429 do HCV-1 (posição de amino ácido 404 da Figura 4) é mutada a Ile. Entretanto, tanto a seqüência nativa, com ou sem um Met com N terminal, o análogo descrito, com ou sem Met com N terminal, ou outros análogos e fragmentos podem ser usados nos ensaios, a fim de que o epítope seja produzido usando um método que retenha ou restabeleça sua conformação nativa de tal modo que a atividade de protease, e opcionalmente, atividade de helicase seja retida. Dasmahapatra et al., Patente US No. 5.843.752 e Zhang et al., Patente US No. 5.990.276, ambos descrevem os análogos de NS3/4a. A protease NS3 de NS3/4a é encontrada a cerca das posições 1027-1207, numeradas em relação ao HCV-1, posições 2-182 da Figura 4. A estrutura da protease NS3 e sitio ativo são conhecidos. Veja, e.g. , De Francesco et al. , Antivir. Ther. (1998) 3: 99-109; Koch et al·., Biochemistry 92001) 40: 631-640. Variações à seqüência nativa será normalmente tolerada e estará para fora do sitio ativo da molécula. Particularmente, é desejável manter os amino ácidos 1- ou 2-155 da Figura, com poucas ou somente substituições conservantes. Os amino ácidos que ocorrem em torno de 155 irão tolerar variações maiores. Adicionalmente, se fragmentos da seqüência MS3/4a encontrada na fi4são usados, esse fragmentos incluirão geralmente pelo menos os amino ácidos 1- ou 2-155, preferencialmente os amino ácidos 1- ou 2-175, e mais preferencialmente os amino ácidos 1- ou 2-182, com ou sem o Met com N terminal. O domínio de helicase é encontrado a cerca das posições 1193-1657 do HCV-1 (posições 207-632 da Figura 4) . Assim, se a atividade de helicase é desejada, esta porção da molécula será mantida com pouca ou somente variações conservantes. Um técnico no assunto pode prontamente determinar outras regiões que irão tolerar variação baseado na estrutura conhecida do NS3/4a. O suporte sólido pode também compreender outros antigenos. Por exemplo, antigenos de fusão de epitope múltiplos (denominado "MEFAs" ) , como descrito na Publicação Internacional No. Wo 97/44469, pode ser ligada ao suporte sólido para uso nos ensaios, tais MEFAs incluem epitopes múltiplos derivados de dois ou mais das várias regiões virais mostradas na Figura 1 e Tabela 1. Em particular, como mostrado na Figura 1 e Tabela 1, uma poliproteina do HCV, quando da divagem, produz pelo menos dez produtos distintos, na ordem de NH2~núcleo-El-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH. O polipeptídeo núcleo ocorre nas posições 1-191, numeradas em relação ao HCV1 (veja, Choo et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 2451-2455, para o genoma HCVl). Este polipeptídeo é adicionalmente processado para produzir um polipeptídeo de HCV com aproximadamente os amino ácidos 1-173. Os polipeptideos envelope, El e E2, correm na cerca das posições 192-383 e 384-746, respectivamente. O domínio P7 é encontrado a cerca das posições 747-809. NS2 é uma proteína de membrana integral com atividade proteolitica e é encontrada a cerca das posições 810-1026 da poliproteina. NS2, tanto sozinho quanto em combinação com NS3 (encontrado a cerca da posições 1027-1657), cliva a ligação NS2-NS3 que por sua vez gera o N terminal do NS3 e libera uma poliproteina grande que inclui tanto atividades de protease de serina quanto helicase de RNA. A protease de NS3, encontrada a cerca das posições 1027-1207, serve para processar a poliproteina remanescente. A atividade helicase é encontrada a cerca das posições 1193-1657. O término da maturação da poliproteina é iniciada por divagem autocatalítica na junção NS3-NS4a, catalisada pela protease de serina de NS3. Clivagens mediadas por NS3 subsequente da poliproteina do HCV parece envolver reconhecimento junções de divagem de glicoproteina por uma molécula de NS3 de um outro polipeptideo. Nessas reações, NS3 libera um cofator NS3 (NS4a, encontrado a cerca das posições 1658-1711), duas proteínas (NS4b encontrada a cerca das posições 1712-1972, e NS5a encontrada a cerca das posições 1973-2420), e uma polimerase de RNA dependente de RNA (NS5b encontrado a cerca das posições 2421-3011).

Tabela 1 * Numerado em relação ao HCV1. Veja, Choo et al., (1991) proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:2451-2455.

Os antígenos múltiplos são parte de uma única cadeia continua de amino ácidos cuja cadeia não ocorre naturalmente na natureza. Assim, a ordem linear dos epitopes é diferente de sua ordem linear no genoma em que eles ocorrem. A ordem linear das seqüências dos MEFAs para uso aqui é preferencialmente disposta para antigenicidade ótima. Preferencialmente, os epitopes são de mais do que uma linhagem do HCV, fornecendo assim a capacidade adicionada de detectar linhagens múltiplas do HCV em um único ensaio. Assim, os MEFAs para uso aqui podem compreender vários agentes imunogênicos derivados da poliproteina descrita acima. Além do mais, uma proteina resultante de um quadro de deslocamento na região do núcleo da poliproteina, tal como descrito na Publicação Internacional No. VJO 99/63941, pode ser usada no MEFAs. Se desejado, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais epitopes da poliproteina do HCV podem ocorrer na proteina de fusão.

Por exemplo, epitopes derivados de, e.g. região hipervariável do E2; tal como uma região com amino ácidos 384-410 ou 390-410, podem ser incluídos no antígeno MEFA. Um epítope E2 particularmente eficaz é um que inclui uma seqüência de consenso desta região, tal como a seqüência de consenso Gly-Ser-Ala-Ala-Arg-Thr-Thr-Ser-Gly-Phe-Val-Ser-Leu-Phe-Ala-Pro-Gly-Ala-Lys-Gln-Asn, que representa uma seqüência de consenso para os amino ácidos 390-410 do genoma do HCV tipo 1. Um epítope E2 representativo em um MEFA da invenção pode compreender um epitope hibrido nos amino ácidos 390-444. Um tal epitope hibrido E2 pode incluir uma seqüência de consenso representando os amino ácidos 390-410 fundidos à seqüência de amino ácidos nativa para os amino ácidos 411-444 do HCV E2.

Adicionalmente, os antigenos podem ser derivados de várias linhagens de HCV. Linhagens virais múltiplas do HCV são conhecidas, e epitopes derivados de quaisquer dessas linhagens podem ser usadas em uma proteína de fusão. É bem conhecido que qualquer dada espécie de organismo varia de um organismo individual a um outro e ainda que um dado organismo tal como um vírus pode ter várias diferentes linhagens. Por exemplo, como explicado acima, o HCV inclui pelo menos 6 genótipos. cada um desse genótipos inclui determinantes antigênicos equivalentes. Mais especificamente, cada linhagem inclui vários determinantes antigênicos que estão presentes em todas as linhagens do vírus mas são ligeiramente diferentes de uma linhagem viral de uma outra, por exemplo, o HCV inclui o determinante antigênico conhecido como 5-1-1 (veja, Figura 1). Este determinante antigênico particular aparece em três formas nas três linhagens virais diferentes do HCV. Desse modo, em uma realização preferida da invenção todas as três formas do 5-1-1 aparecem no antígeno de fusão de epítope múltiplo usado nos imunoensaios. Similarmente, determinantes antigênicos equivalentes da região do núcleo de diferentes linhagens do HCV podem também estar presentes. Em geral, determinantes antigênicos equivalentes têm um alto grau de homologia em termos de seqüência de amino ácido cujo grau de homologiá é geralmente 30% ou mais, preferencialmente 40% ou mais, quando alinhado. 0 epitope de cópia múltiplo da presente invenção pode também incluir múltiplas cópias que são exatas cópias do mesmo epitope. MEFAs representativos para uso com o presentes ensaios são descritos na Publicação Internacional WO 97/44469. MEFAs representativos adicionais para uso aqui incluem aqueles denominados MEFA 12, MEFA 13, e MEFA 13.1. è para ser entendido que esses MEFAs são meramente representativos e outros epítopes derivados do genoma do HCV também encontrarão uso com os presentes ensaios e podem ser incorporados nesses e em outros MEFAs. A seqüência de DNA e seqüência de amino ácidos correspondente do MEFA 12 é mostrada na Figura 7a a 7F. A fórmula de estrutura geral para MEFA 12 é mostrada na Figura 6 e é como se segue; hSOD-El (tipo 1)-E2 HVR consenso (tipo la)-E2 HVR consenso (tipos 1 e 2)-c33c curta (tipo 1)-5-1-1(tipo 1)-5-1-1-(tipo 3)-5-1-1- (tipo-2)-clOO (tipo 1)-NS5 (tipo 1)-NS5 (tipo 1)-núcleo (tipos 1+2)-núcleo (tipos 1+2). Este epitope de cópia múltipla inclui a seguinte seqüência de amino ácido, numerada em relação ao HCV-1 (a numeração dos amino ácidos descrita abaixo segue a numeração de designação fornecida em Choo et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 2451-2455, em que o amino ácido #1 é a primeira metionina codificada pela seqüência codificadora da região de núcleo): os amino ácidos 1-69 de superóxido dismutase (SOD, usada para melhorar a expressão recombinante da proteína); os amino ácidos 303 a 320 da poliproteína da região El; os amino ácidos 390 a 410 da poliproteina representando uma sequência de consenso para a região hipervariável do HCV-la E2; os amino ácidos 384 a 414 da poliproteina da região E2, representando uma seqüência de consenso para as regiões hipervariáveis E2 do HCV-1 e HCV-2; os amino ácidos 1211-1457 da poliproteina do HCV1 que define a helicase; três cópias de um epitope de 5-1-1, amino ácidos 1689-1735, um de HCV1, um de HCV-3 e um de HCV-2, cujas cópias são determinantes antigênicos equivalentes das três linhagens virais diferentes de HCV; polipeptideo do HCV C100 do HCV1, amino ácidos 1901-1936 da poliproteina; duas cópias exatas de um epitope da região NS5 do HCV1, cada um com amino ácidos 2278 a 2313 da poliproteina do HCV; e duas cópias das três epitopes da região do núcleo, duas do HCV1 e um do HCV1, cujas cópias são determinantes antigênicos equivalentes representados por amino ácidos 9 a 53 e 64-68 do HCV-1 e 67-84 do HCV-2. A tabela 2 mostra as posições dos amino ácidos dos vários epitopes em MEFA 12 com referência às Figuras 7Ά a 7F. A numeração nas tabelas é relativa ao HCV1. Veja, Choo et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88 : 2451-2455. MEFAs 13 e 13.1 também dividem a fórmula geral especificada acima para MEFA12, com modificações como indicado nas Tabelas 3 e 4, respectivamente.

Tabela 2. MEFA 12 * A proteína de SOD é truncada de tal modo que o conjugado de detecção, um anticorpo anti-SOD marcado com HRP não se aglutine ao META. O epítope núcleo é mutado para prevenir os anticorpos ao núcleo do HCV, usado na detecção, da aglutinação ao MEFA.

Tabela 3. MEFA 13 _____________________ ________________ * Os epitopes 5-1-1 são modificados por eliminação de sitios de divagem possíveis (CS ou CA) alvo pela proteína recombinante NS3/4a. Ao invés de CS ou CA, a seqüência foi variada para PI. Adicionalmente, a proteína de SOD é mutada de tal modo que o conjugado de detecção, um anticorpo anti-SOD marcado com HRP não se aglutina a MEFA. O epítope de núcleo é mutado para prevenir os anticorpos ao núcleo do HCV, usado na detecção, da aglutinação ao MEFA.

Tabela 4. MEFA 13.1 * Os epitopes 5-1-1 são modificados por eliminação de sitios de divagem possíveis (CS ou CA) alvo pela proteína recombinante NS3/4a. Ao invés de CS ou CA, a seqüência foi variada para PI. Adicionalmente, a proteína de SOD é mutada de tal modo que o conjugado de detecção, um anticorpo anti-SOD marcado com HRP não se aglutina a MEFA. 0 epítope de núcleo é mutado para prevenir os anticorpos ao núcleo do HCV, usado na detecção, da aglutinação ao MEFA.

Em um formato de ensaio, a amostra é combinada com o suporte sólido como descrito adicionalmente abaixo. Se a amostra é infectada com HCV, antígenos núcleo, assim com anticorpos do HCV aqueles epitopes presentes no suporte sólido, se aglutinará aos componentes do suporte sólido, Um anticorpo anti-núcleo detectavelmente marcado é depois adicionado. O anticorpo anti-núcleo marcado é direcionado contra um epítope diferente do anticorpo anti-núcleo que é ligado ao suporte sólido, Este anticorpo anti-núcleo se aglutina ao anticorpo núcleo capturado pelos anticorpos anti-núcleo no suporte sólido.

Um anticorpo que reage com o anticorpo do HCV capturado da amostra biológica, que capturou o anticorpo do HCV da amostra é reativo com o epitope do NS3/4a, é também adicionado. Este antigeno é preferencialmente um epitope derivado da região NS3 da poliproteina do HCV. Este antigeno se aglutina ao anticorpo do HCV capturado da amostra. Vários antigenos incluindo tais epitopes são conhecidos, incluindo, mas não limitado a, antigenos derivados das regiões c33c e clOO, assim como proteínas de fusão compreendendo um epitope NS3, tal como c25. Esses e outros epitopes são úteis nos presentes ensaios e são conhecidos na técnica e descritos em, e.g., Houghton et al., Patente US No. 5.350.671; Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1992) 89: 10011-10015; Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8: S33-39; Chien et al., Publicação Internacional No. WO 93/00365; Chien, D.Y. Publicação Internacional No. WO 94/01778; e comumente cedida, Patente US No. 08/403.590 e 08/444.818.

Um segundo anticorpo direcionado contra o anticorpo antigeno descrito acima, é adicionado. Este anticorpo pode ser direcionado contra qualquer epitope incluído no antigeno. Por exemplo, o anticorpo pode ser direcionado contra a região NS3 presente no antigeno. Alternativamente, se o antigeno acima é expresso como uma proteína de fusão o segundo anticorpo marcado pode ser direcionado contra a parceiro de fusão, antigenos adicionais e anticorpos podem ser adicionados ao ensaio, particularmente se o suporte sólido inclui um MEFA. Esses formatos de ensaio são explicados adicionalmente abaixo.

Um ensaio representativo segundo a invenção é descrito na Figura 2. Como mostrado na Figura, o suporte sólido inclui dois anticorpos monoclonais anti-núcleo, denominados cll-3 e cll-7. Esses anticorpo são direcionados contra um epitope encontrado na região com N terminal da proteina núcleo nos amino ácidos 10-53, numerado em relação a seqüência de poliproteína do HCV1. O suporte sólido também inclui um epitope para NS3/4a. A amostra biológica é adicionada ao suporte sólido. O antigeno núcleo do HCV, assim como anticorpos direcionados contra o epitope NS3/4a, ambos presentes na amostra, se aglutinarão aos reagentes de captura no suporte sólido.

Anticorpo monoclonal anti-núcleo marcado com HRP de Rábano peroxidasecll-14, direcionado contra a região com C terminal do núcleo encontrado nas posições de amino ácidos 120-130, numerados em relação a seqüência de poliproteína do HCV1, é depois adicionado. Uma proteína de fusão, compreendendo uma seqüência de SOD humano (hSOD) e um epitope da região c33c é adicionado, como é um segundo anticorpo marcado com HRP, direcionado contra a porção do SOD da proteína de fusão. A fusão SOD-c33 se aglutinará ao anticorpo anti-NS3 e o anticorpo SOD irá, por sua vez, se aglutinar a proteína de fusão SOD-c33. Detecção da marca indica a presença da infecção do HCV.

Um outro ensaio representativo segundo a invenção é descrito na Figura 8. A configuração de ensaio do anticorpo é um ensaio de captura em sanduíche antígeno-anticorpo-antígeno usando NS3/4a e MEFA 12. O suporte sólido inclui os dois anticorpos monoclonais descritos acima, um epitope ao NS3/4a, assim como um MEFA, MEFA 12 representativos, que inclui uma versão truncada do SOD humano. Como com o ensaio acima, a amostra biológica é adicionada ao suporte sólido. 0 antigeno do núcleo do HCV, assim como anticorpos direcionados contra o epitope NS3/4a e epitopes do MEFA, presente na amostra, se aglutinará aos reagentes de captura no suporte sólido. Dois antígenos, um reativo com anticorpos da amostra que aglutinam NS3/4a 9como descrito acima) e um reativo com_ant i corpo-s—da—amostra— que—aglutirn-arrt— MEFA 12, são adicionados. Na Figura 8, o antigeno reativo com o complexo do anticorpo da amostra / MEFA 12 é uma fusão entre uma molécula de SOD e c22ks delta47-L44W. O antigeno c22ks é da região do núcleo e inclui os amino ácidos Lysio a Ser99, assim como uma deleção de Arg47 normalmente presente e uma substituição de Leu por Trp na posição 44. O conjugado de detecção do anticorpo é o segundo anticorpo anti-SOD monoclonal marcado com HRP, descrito acima.

Os ensaios de combinação do antigeno/anticorpo descrito acima são particularmente vantajosos tanto no antigeno núcleo do HCV quanto anticorpos a NS3/4a e/ou núcleo podem ser detectados pelo mesmo suporte no mesmo ensaio. Além do mais, como descrito acima, epitopes do HCV adicionais, tal como fundido com SOD a clOO, 5-1-1, antígenos NS5, assim como uma proteína resultante de um quadro de deslocamento na região do núcleo da poliproteína, tal como descrito na Publicação Internacional No. WO 99/63941, podem ser usados no coquetel de combinação para cobrir outros epitopes não estruturais do HCV. A fim de adicionalmente entender a invenção, uma discussão mais detalhada é fornecida abaixo com relação a produção de anticorpos para uso nos imunoensaios; produção de polipeptídeos para uso nos imunoensaios; e métodos de condução dos imunoensaios.

Produção de anticorpos para uso nos imunoensaios com HCV

Como explicado acima, o ensaio utiliza vários anticorpos que são ligados a um suporte sólido (e.g-., um ou mais anticorpos anti^núcle_o_e—que—det-e-ct-am—eorapl-ex&s—de antigeno/anticorpo formados quando a infecção por HCV está presente na amostra. Esses anticorpos podem ser preparações de anticorpos monoclonais ou policlonais, antisoro monoespecifico, anticorpos humanos, ou podem ser anticorpos híbridos ou quiméricos, tal como anticorpos humanizados, anticorpos alterados, fragmentos F(ab')2 e F(ab) e Fv, anticorpos de domínio único, construções de fragmento de anticorpo dimérico ou trimérico, minicorpos, ou fragmentos funcionais dos mesmos que se aglutinam ao antígeno em questão.

Anticorpos são produzidos usando técnicas bem conhecidas daqueles técnicos no assunto e descritos, em, por exemplo, Patente US No. 4.011.308; 4.722.890; 4.016.043; 3.876.504; 3.770.380; 4.372.745. Por exemplo, anticorpos policlonais são gerados por imunização de um animal adequado tal como um camundongo, rato, coelho, carneiro ou cabra, com um antígeno de interesse. A fim de aumentar a imunogenicidade, o antígeno pode ser ligado a um suporte antes da imunização. Tais suportes são bem conhecidos do técnico no assunto. Imunização é geralmente préformada pela mistura ou emulsificação do antígeno na salina, preferencialmente em um adjuvante tal como adjuvantes completo de Freund, e injeção da mistura ou emulsão parenteralmente (geralmente subcutaneamente ou intramuscularmente). O animal é geralmente boosted 2-6 semanas após com uma ou mais injeções do antigeno em salina, preferencialmente usando um adjuvante incompleto de Freund. Anticorpos podem também ser gerados por imunização in vitro, usando métodos conhecidos na técnica. Antisoro policlonal é depois obtido do animal imunizado. Veja, e.g., Houghton et al., Patente US No. 5.350.671, para a descrição da produção de anticorpos policlonais anti-HCV.

Anticorpos monoclonal são geralmente preparados usando o método de Kohler e Milstein (1975) Nature 256: 495-497, ou uma modificação do mesmo. Tipicamente, um camundongo ou rato é imunizado como descrito acima. Entretanto, ao invés de sangramento do animal para extrair soro, o baço (e opcionalmente vários nódulos do linfo grandes) é removido e dissociado em células únicas. Se desejado, as células do baço podem ser selecionadas (após remoção de células aderentes não especificamente) pela aplicação de uma suspensão de célula a uma placa ou cavidade revestida com o antigeno. Células B, expressando imunoglobulina ligada com membrana especifica para o antigeno, irá aglutinar-se à placa, e não serão rinsadas com o resto da suspensão. Células B resultantes, ou todas as células do baço dissociadas, são depois induzidas para fundir com células do mieloma para formar hibridomas, e são cultivadas em um meio seletivo (e.g., meio de hipoxantina, aminopterina, timidina, "HAT"). Os hibridomas resultantes são colocados em placa pela limitação de diluição, e são submetidas a ensaio para a produção de anticorpos que se aglutinam especificamente ao antigeno imunizante (e que não se aglutinam e então se aglutinam a uns não relacionados). Os hibridomas que secretam anticorpo monoclonal selecionados são depois cultivados in vitro (e.g., em garrafas de cultura de tecido ou reatores de fibra oca), ou in vivo (e.g., como áscitos em camundongos). A produção de vários anticorpos monoclonais foram descritos, e.g., Houghton et al., Patente US No. 5.350.671; Chien et al. , Publicação Internacional No. WO 93/00365; comumente cedida, Patente US No. 08/403.590 e 08/444.818.; e Kashiwakuma et al., Patente US No. 5.871.904.

Como explicado acima, fragmentos de anticorpo que retêm a capacidade de reconhecer o antigeno de interesse, irá também encontrar uso no imunoensaio. Vários fragmentos de anticorpo são conhecidos na técnica os quais compreendem sítios de aglutinação de antigeno capazes de apresentar propriedades' de aglutinação imunológica de uma molécula de anticorpo intacta. Por exemplo, fragmentos de anticorpo funcionais podem ser produzidos por divagem de uma região constante, não responsável por aglutinação de antigeno, da molécula de anticorpo, usando e.g., pepsina, para produzir fragmentos F(ab')2. Esses fragmentos conterão dois sítios de aglutinação, mas não terão uma porção da região constante de cada uma das cadeias pesadas. Similarmente, se desejado, fragmentos Fab, compreendendo um único sítio de aglutinação de antigeno, pode ser produzido, e.g., por digestão de anticorpos monoclonais ou policlonais com papaína. Fragmentos funcionais, incluindo somente as regiões variáveis das cadeias leves e pesadas, podem também ser produzidas, usando técnicas padrão tal como produção recombinante ou clivagem proteolítica preferencial de moléculas de imunoglobulina. Esses fragmentos são conhecidos como Fv. Veja, e.g., Inbar et al. (1972) Proc.

Nat. Acad. Sei. USA 69: 2659-2662; Hochman et al. (1976) Biochem 15: 2706-2710; e Ehrlich et al. (1S80) Biochem 19: 4091-4096.

Um polipeptideo de cadeia única Fv ("sFv" ou "scFv") é um heterodimero VH-VL ligado covalentemente que é expresso de uma fusão de gene incluindo genes codificadores de VH e VL ligados por um ligante codificador de peptideo. Histon et al. (198 8) Proc. Nat. Acad. Sei. USA 85: 587 9- 5883. Vários métodos foram descritos para discernir e desenvolver estruturas químicas (ligantes) para converter cadeias de polipeptideo leves e pesadas, naturalmente agregadas, mas quimicamente separadas de uma região de anticorpo V em uma molécula sFv que dobrará em uma estrutura tridimensional substancialmente similar à estrutura de um sítio de aglutinação de antígeno. Veja, Patente US No. 5.091.513, 5.132.405, e 4.946.778. As moléculas de sFv podem ser produzidas usando métodos descritos na técnica. Veja, e.gr., Huston et al., (1988) Proc. Nat. Acad. Sei. USA 85: 5879-5883; Patente US No. 5.091.513, 5.132.405 e 4.946.778. Critério de design incluem determinação do comprimento apropriado para alcançar a distância entre o C terminal de uma cadeia e o N terminal de outro, em que o ligante é geralmente formado de resíduos de amino ácidos pequenos hidrofílicos que não tendem a espiralar ou formar estruturas secundárias. Tais métodos foram descritos na técnica. Veja, Patente US No. 5.091.513, 5.132.405 e 4.946.778. Ligantes adequados geralmente compreendem cadeias de polipeptideo de conjuntos alternados de resíduos de glicina e serina, e podem incluir resíduos de ácido glutâmico e lisina inseridos para aumentar solubilidade. "Mini-anticorpos" ou "minicorpos" encontrarão uso com a presente invenção. Minicorpos são cadeias de polipeptídeo sFv que incluem domínios de oligomerização no seu C terminal, separado do sFv por uma região de dobra. Pack et al. (1992) Biochem 31: 1579-1584. O domínio de oligomerização compreende auto-associação de a-hélices, e.g.r zíperes de leucina, que podem ser adicionalmente estabilizados por ligações dissulfeto adicionais. O domínio de oligomerização é designado por ser compatível com dobra de vetor através de uma membrana, um processo pensado por facilitar a dobra in vivo do polipeptídeo em uma proteína aglutinante funcional. Geralmente, minicorpos são produzidos usando métodos recombinantes bem conhecidos na técnica. Veja, e.g., Pack et al., (1992) Biochem 31: 1579- 1584; Cumber et al. (1992) J Immunology 149B: 120-125.

Produção de antígenos para uso nos imunoensaios do HCV

Como explicado acima, as moléculas da presente invenção são geralmente produzidas recombinantemente.

Assim, polinucleotídeos codificando antígenos do HCV para uso com a presente invenção podem ser feitos usando técnicas padrão de biologia molecular. Por exemplo, seqüências de polinucleotídeo codificando as moléculas descritas acima podem ser obtidas usando métodos recombinantes, tal como por cDNA de seleção e bibliotecas genômicas de células expressando o gene, ou por derivação de um gene de um vetor conhecido para incluir o mesmo. Além do mais, o gene desejado pode ser isolado diretamente de moléculas de ácido nucléico viral, usando técnicas descritas na técnica, tal como em Houghton et al., Patente US No. 5.350.671. O gene de interesse pode também ser produzido sinteticamente, ao invés de clonado. As moléculas podem ser designadas com códons apropriados para a seqüência particular. A seqüência completa é depois montada a partir de sobreposição de oligonucleotideos preparados por métodos padrão e montadas em uma seqüência codificadora completa. Veja, e.g., Edge (1981) Nature 292: 756; Nambair et al. (1984) Science 223: 1299; e Jay et al. (1984) J. Biol. Chem. 259: 6311.

Assim, as seqüências particulares podem ser obtidas de vetores aportando as seqüências desejadas ou complemente sintetizadas ou em parte usando várias técnicas de síntese de oligonucleotídeo conhecidas na técnica, tal como mutagênese direcionada a sítio e reação de cadeia polimerase (PCR) onde apropriado. Veja, e.g., Sambrook, supra. Em particular, um método de obtenção de seqüências de nucleotídeo codificando as seqüências desejadas é por cozimento de conjuntos complementares de oligonucleotideos sintéticos de sobreposição produzidos em um sintetizador convencional, automatizado, seguido por ligação com uma ligase de DNA apropriada e amplificação da seqüência de nucleotídeo ligado via PVR. Veja, e.g., Jayaraman et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 4084-4088. Adicionalmente, síntese direcionada de oligonucleotídeo (Jones et al., (1986) Nature 54: 75-82), mutagênese direcionada de oligonucleotídeo de regiões de nucleotídeo pré-existentes (Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323-327 e Berhoenyen et al. (1988) Science 239: 1534-1536), e carregamento enzimático de oligonucleotideos com intervalo usando polimerase de DNA T4 (Queen et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 10029-10033) podem ser usados segundo a invenção para fornecer moléculas tendo capacidades de aglutinação de antigeno melhoradas ou alteradas, e/ou imunogenicidade reduzida.

Uma vez que seqüências codificadoras tenham sido preparadas ou isoladas, tais seqüências podem ser clonadas em qualquer vetor ou replicon. Numerosos vetores de clonagem são conhecidos pelos técnico no assunto, e a seleção de um vetor de clonagem apropriado é uma matéria de escolha. Vetores adequados incluem, mas não estão limitados a, plasmidios, fagos, tranposons, cosmidios, cromossomos ou vírus que são capazes de replicação quando associados com os próprios elementos de controle. A seqüência codificadora é depois colocada sob o controle de elementos de controle adequados, dependendo do sistema a ser usado para expressão. Assim, a seqüência codificadora pode ser colocada sob o controle de um promotor, sítio de aglutinação de ribossoma (para expressão bacteriana) , e opcionalmente, um operador, de tal modo que a seqüência de DNA de interesse seja transcrito em RNA por um transformante adequado. A seqüência codificadora pode ou pode não conter um peptídeo sinal ou seqüência lider que pode depois ser removida pelo hospedeiro no processamento de pós-tradução. Veja, e.g., Patente US No. 4.431.739, 4.425.437; 4.338.397.

Além das seqüências de controle, pode ser desejável adicionar seqüências reguladoras que permitam a regulação da expressão das seqüências relativas ao crescimento da célula hospedeira. Seqüências reguladoras são conhecidas daqueles técnicos no assunto, e exemplos incluem aqueles que causam a expressão de um gene a ser ligado ou desligado em resposta a um estimulo quimico ou fisico, incluindo a presença de um composto regulador. Outros tipos de elementos reguladores podem estar também presentes no vetor. Por exemplo, elementos amplificadores podem ser usados para aumentar níveis de expressão das construções. Exemplos incluem o amplificador de gene anterior SV40 (Dijikema et al. (1985) EMBO J. 4:761), o amplificador/promotor derivado da repetição terminal comprida (LTR) do vírus Rous Sarcoma (Gorman et al. (1982) Poc. Natl. Acad. Sei. USA 79: 6777) e elementos derivados de CMV humano (Boshart et al., (1985) Cell 41: 521), tais como elementos incluídos na seqüência de íntron A do CMV (Patente US No. 5.688.688). 0 cassete de expressão pode adicionalmente incluir uma origem de replicação para replicação autônoma em uma célula hospedeira adequada, um ou mais marcadores selecionáveis, um ou mais sítios de restrição, um potencial para alto número de cópias e um forte promotor.

Um vetor de expressão é construído de tal modo que a seqüência codificadora particular é localizada no vetor com as seqüências reguladoras apropriadas, o posicionamento e orientação da seqüência codificadora com relação às seqüências de controle sendo de tal modo que a ser codificadora é transcrita sob o "controle" das seqüências de controle (i.e., RNA polimerase que se aglutina à molécula de DNA nas seqüências de controle (i.e., RNA polimerase que se aglutina à molécula de DNA nas seqüências de controle transcreve a seqüência codificadora).

Modificação das seqüências codificadoras da molécula de interesse pode ser desejável para alcançar este fim. Por exemplo, em alguns casos pode ser necessário modificar a seqüência de tal modo que possa ser ligada a seqüências de controle na orientação apropriada, i.e. para manter o quadro de leitura. As seqüências de controle e outras seqüências reguladoras podem ser ligadas à seqüência codificadora antes da inserção no vetor. Alternativamente, a seqüência codificadora pode ser clonada diretamente em um vetor de expressão que já contenha as seqüências de controle e um sitio de restrição apropriado.

Como explicado anteriormente, pode também ser desejável produzir mutantes ou análogos do antigeno de interesse, isto é particularmente verdadeiro com NS3/4a. Métodos para fazê-lo são descritos em, e.g., Dasmahapatra et al., Dasmahapatra et al., Patente US No. 5.843.752 e Zhang et al., Patente US No. 5.990.276. Mutantes ou análogos deste e outras proteínas do HCV para uso nos ensaios podem ser preparados pela deleção de uma porção da seqüência codificadora do polipeptídeo de interesse, pela inserção de uma seqüência, e/ou por substituição de um ou mais nucleotídeos dentro da seqüência. Técnicas para modificar seqüências de nucleotídeo, tal como mutagênese direcionada a sítio, e similares, são bem conhecidos daqueles técnicos no assunto. Veja, e.g., Sambrook et al., supra; Kunkel T.A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1985) 82: 448; Geisselsoder et al. (1987) BioTechniques 5: 786;

Zoller and Smith (1983) Methods Enzymol. 100: 468; Dalbie- McFarland et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79: 6409.

As moléculas podem ser expressas em uma ampla variedade de sistemas, incluindo inseto mamíferos, bactérias, sistemas de expressão viral, e de levedura, todos bem conhecidos na técnica.

Por exemplo, sistemas de expressão de célula de inseto, tais como baculovírus, são conhecidos daqueles técnicos no assunto e descritos em, e.g., Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987). Materiais e métodos para sistemas de expressão de célula de baculovírus e célula de inseto são comercialmente disponíveis na forma de kit, e inter alia, Invitrogen, San Diego CA (kit "maxBac"). Similarmente, sistemas de expressão de mamífero e bacteriano são bem conhecidos na técnica e descritos, em e.g., Sambrook et al., supra. Sistema de expressão de levedura são também conhecidos na técnica e descritos em, e.g., Yeast Genetic Engineering (Barr et al·., eds., 1989) Butterorths, London. Várias células hospedeiras apropriadas para uso com os sistemas acima são também conhecidos. Por exemplo, linhagens de células de mamífero são conhecidas na técnica e incluem linhagens de célula imortalizadas disponíveis junto a American Type Culture Collection (ATCC), tal como, mas não limitado a, ovários de hasmter Chinês, células HeLa, células do rim de hamster filhote (BHK), células de rim embriônico humano, células de carcinoma heptacelular (e.g., Hep (G2), células do rim de bovino Madin-Barby ("MDBK"), assim como outros. Similarmente, hospedeiros bacterianos tais como E. coli, Bacillus subtilis, e Styreoptacoccus spp. Células de levedura úteis na presente invenção incluem inter alia , Saccharomyces cerevisae, Cândida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluveromyces fragilis, Kluveromyces lactisf Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Scharomyces cerevisae e Yarrowia lipojlitica. Células de inseto para uso com vetores de expressão de baculovirus incluem, inter alia, Aedes aegypit, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda, e Trichoplusia ni.

Molécula de ácido nucléico compreendendo seqüências de nucleotídeo de interesse que podem ser estavelmente integrados em um genoma de célula hospedeira ou mantidas em um elemento epissomal estável em uma célula hospedeira usando várias técnicas de liberação de gene bem conhecidas na técnica. Veja, e.g., Patente US No. 5.399.346.

Dependendo do sistema de expressão e hospedeiro selecionados, as moléculas são produzidas pelo crescimento de células hospedeiras transformadas por um vetor de expressão descrito acima sob condições por meio das quais a proteína é expressada. A proteína expressada é depois isolada das células hospedeiras e purificadas. SE o sistema de expressão secreta a proteína no meio de crescimento, o produto pode ser purificado diretamente do meio. Se não é secretado, ele pode ser isolado dos lisatos de células. A seleção das condições de crescimento apropriado e métodos de recuperação estão dentro do estado da técnica.

Produção recombinante de vários antígenos do HCV foram descritos. Veja, e.g., Houghton et al·., Patente US No. 5.350.671; Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8: S33-39; Chien et al. Publicação Internacional No. WO 93/00365; Chien D. Y., Publicação Internacional WO 94/01778.

Ensaios de imunodiagnóstico Uma vez produzidos, anticorpos anti-núcleo e antígenos NS3/4a são colocados em um suporte sólido apropriado para uso nos imunoensaios. Um suporte sólido, para os fins desta invenção, podem ser qualquer material que é uma matriz insolúvel e pode ter uma superfície rígida ou semi-rígida. Suportes sólidos exemplares incluem, mas não estão limitados a, substratos tal como nitrocelulose (e.g., em forma de membrana ou microtítulo); policloreto de vinila (e.g., folhas ou cavidades de microtitulação); látex de poliestireno (e.g., contas ou placa de microtitulação), polifluoreto de vinilideno; papel diazotado, membranas de nylon; contas ativadas, contas de resposta magnética, e similares. Suportes particulares incluem placas, pelotas, discos, capilares, fibras ocas, agulhas, pinos, fibras sólidas, contas de celulose, contas de vidro de núcleo, géis de sílica, contas de poliestireno opcionalmente reticulados com divinilbenzeno, enxertado com contas co-poli, contas de poliacrilamida, contas de látex, contas de dimetilacrilamida opcionalmente reticuladas com N-N'-bis-acriloiletilenodiamina, e partículas de vidro revestidas com um polímero hidrofóbico.

Se desejado, as moléculas a serem adicionadas ao suporte sólido podem prontamente ser funcionalizadas para criar porções de estireno e acrilato, permitindo assim a incorporação das moléculas em poliestireno, poliacrilato ou outros polímeros tais como poliimida, poliacrilamida, polietileno, polivinila, polidiacetileno, polifenileno-vinileno, polipeptídeo, polisacarídeo, polisulfona, polipirrol, poliimidazol, politiofeno, poliéter, epóxidos, vidro de sílica, silica gel, polifosfato, hidrogel, agarose, celulose e similares.

Em um contexto, um suporte sólido é um primeiro reagido com os anticorpos anti-núcleo do HCV e epítope NS3/4a (coletivamente chamado de "componentes de fase sólida" aqui), e opcionalmente um ou mais MEFAs, sob condições aglutinantes adequadas de tal modo que as moléculas sejam suficientemente imobilizadas ao suporte, às vezes, a imobilização para o suporte pode ser amplificada pelo primeiro acoplamento do antigeno e/ou anticorpo a uma proteina com melhores propriedades de aglutinação de fase sólida. Proteínas de acoplamento adequadas incluem, mas não estão limitadas a macromoléculas tal como albuminas do soro incluindo albumina do soro bovino (BSA), hemocianina de lapa, moléculas de imunoglobulina, tiroglobulina, ovalbumina, e outras proteínas bem conhecidas daqueles técnicos no assunto. Outros reagentes que podem ser usados para aglutinar moléculas ao suporte incluem polissacarídeos, ácidos poliláticos, ácidos poliglicólicos, amino ácido poliméricos, copolímeros de amino ácidos e similares. Tais moléculas e métodos de acoplamento dessas moléculas a antigeno, são bem conhecidas dos técnicos no assunto. Veja, e.g., M.A. (1992) Bioconjugate Chem,. 3: 2-13; Hashida et al. (1994) J. Appl. Biochem. 6: 56-63; e Anjaneyulu and Staros (1987) International J. of Peptide and Protein Res. 30: 117-124.

Após reação do suporte sólido com os componentes em fase sólida, quaisquer componentes de fase sólida são removidos do suporte por lavagem, e os componentes ligados com suporte são depois colocados em contato com uma amostra biológica suspeita de conter anticorpos e antigenos do HCV (coletivamente chamados de "moléculas ligantes") sob condições de aglutinação adequadas. Após lavagem para remover quaisquer outras moléculas ligantes, um segundo anticorpo, direcionado contra um epitope diferente daquele anticorpo do núcleo ligado ao suporte, é adicionado sob condições de aglutinação adequadas. 0 anticorpo anti-núcleo adicionado inclui uma marca detectável, como descrito acima, e age para aglutinar qualquer antigeno núcleo que possa estar presente na amostra que tenha reagido com o anticorpo anti-núcleo ligado ao suporte. Também adicionado estão um ou mais antigenos que podem reagir com anticorpos presentes na amostra que tenham, por sua vez, reagido com o epitope NS3/4a. Como explicado acima, o antigeno é tipicamente derivado da região NS3 da poliproteina do HCV, e particularmente da região c33c do HCV. Veja, Houghton et al., Patente US No. 5.350.671; Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (1989) 89: 10011-10015; Publicação Internacional No. WO 93/00365; e comumente cedida e deferida Patente US No. 08/403.590 e 08/444.818, para uma descrição desta regiãó e epitopes derivados dos mesmos. Um anticorpo marcado contra este antigeno é também adicionado. O anticorpo consequentemente se aglutinará ao antigeno, que reagiu com anticorpos anti-NS3 presentes na amostra. Para este fim, o epitope c33c pode ser convenientemente fornecido como uma fusão entre c33c e superóxido de dismutase humana (hSOD), produzido recombinantemente por métodos descritos em Houghton et al·., Patente US No. 5.350.671. As sequências de nucleotideo e amino ácido para I SOD humana são conhecidas e reportadas em Hallewell et al., Patente US No. 5.710.033. Um anticorpo marcado direcionado contra SOD humano pode consequentemente ser usado para detectar a presença de complexos formados entre o epitope NS3/4a, quaisquer anticorpo na amostra que reage com este epitope, e polipeptídeos do HCV que por sua vez se aglutinam ao anticorpo da amostra. SE um MEFA está presente no suporte sólido, um ou mais antigenos, reativos com anticorpos da amostra biológica que são ligados a antigenos presentes no MEFA, podem também ser adicionados ao ensaio. Particularmente útil neste contexto está um antigeno derivado da região do núcleo do HCV, e mais particularmente, do antigeno c22 que inclui amino ácidos de núcleo com N terminal da poliproteina do HCV. Um antigeno particular derivado de c22 é c22ks delta47-L44W que inclui amino ácidos Lysio a Ser99 da poliproteina, assim como a deleção de Arg47 normalmente presente e uma substituição de Leu por Trp na posição 44. Como com o epitope c33c descrito acima, este antigeno pode ser fornecido como uma fusão com hSOD e o mesmo anticorpo marcado, direcionado contra SOD humano, pode ser usado para detectar a presença de complexos formados entre anticorpos presentes na amostra e o epitope NS3/4a e/ou MEFA, cujos complexos são também ligados com os antigenos do HCV (e.g., c33c e c22). mais particularmente, um método ELISA pode ser usado, em que as paredes de uma placa de microtitulo são revestidas com os componentes em fase sólida. Uma amostra biológica contendo ou suspeita de conter moléculas de ligante é depois adicionada às cavidades revestidas. Após um período de incubação insuficiente para deixar molécula ligante aglutinar-se ao componente de fase sólida imobilizado, a placa(s) pode ser lavada para remover porções não ligadas e uma molécula aglutinante secundária detectavelmente marcada (anticorpo anti-núcleo marcado), uma molécula contendo epítope NS3, e um anticorpo direcionado contra a molécula contendo epítope NS3 adicionada. Essas moléculas são deixadas reagir com qualquer anticorpo e antígeno da amostra capturados, a placa lavada e a presença dos anticorpos marcados detectados usando métodos bem conhecidos na técnica.

Os reagentes de ensaios descritos acima, incluindo suporte sólido de imunoensaio com anticorpos e antigenos aglutinados, assim como anticorpos e antigenos a serem reagidos com a amostra capturada, que pode ser fornecida em kits, com instruções adequadas e outros reagentes necessários, a fim de conduzir imunoensaios como descrito acima. 0 kit pode conter, dependendo do imunoensaio usado, marcas adequadas e outros reagentes e materiais embalados (i.e. tampões de lavagem e similares). Imunoensaios padrão, tais como aqueles descritos podem ser conduzidos usando esses kits. III.Experimental Abaixo são exemplos de realizações específicas para realizar a presente invenção. Os exemplos são apresentados para fins ilustrativos somente, e não são destinados a limitar o escopo da presente invenção de modo algum.

Esforços têm sido feitos para assegurar acurácia com relação a números usados (e.g., quantidades, temperaturas, etc.), mas algum erro experimental e desvio devem, é claro, ser considerados.

Exemplo 1 Imunoensaio de Combinação de Anticorpo/Antíqeno do HCV O presente imunoensaio de combinação de anticorpo/antigeno do HCV foi comparado a outros ensaios com HCV para testar os limites de detecção de soroconversão e comparar esses limites aqueles obtidos em outros ensaios comercialmente disponíveis como se segue. A. Materiais e Métodos Amostras de sangue: Painéis de amostras de sangue humano comercialmente disponíveis foram usados. Tais painéis está disponíveis, e.g. , junto a Boston Biomedica, Inc. , West Bridgewater, MA (BBI); Bioclinical Partners, Franklin, MA (BCP); e North American Biologics, Inc., BocoRatan, FL (NABI) . Os dias indicados nas Tabelas 5 e 6 são dias nos quais o sangue foi coletado dos indivíduos.

Anticorpos monoclonais: Anticorpos monoclonais cll-3, cll-7, e cll-14 foram obtidos junto a Ortho Clinicai Diagnostics, Raritan, New Jersey. Os anticorpos cll-3 e cll-7 são direcionados contra uma porção com N terminal do núcleo (amino ácidos 10-53, numerados em relação a poliproteína do HCV1). O anticorpo monoclonal cll-14 é direcionado contra uma porção com C terminal do núcleo (amino ácidos 120-130, numerados em relação a poliproteína do HCV1). O anticorpo cll-14 foi conjugado a rábano-peroxidase (HRP) usando procedimentos padrão.

Anticorpo monoclonal 5A-3 é um anticorpo anti-SOD direcionado contra amino ácidos 1 a 65 de SOD e foi feito usando técnicas padrão. O anticorpo foi conjugado com HRP como descrito acima. B. Antíqenos: O antigeno c33c (266 amino ácidos, amino ácido 1192 a 1457 da poliproteína do HCV1) foi expresso como um polipeptideo de fusão de SOD em E. coli por métodos descritos para a síntese do antigeno 5-1-1 (Choo, et al. , Science, 91989) 244: 359-362). O antigeno recombinante foi purificado como descrito em Chien, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (1989) 89: 10011-10015. Veja, por exemplo, Houghton et al., Patente US No. 5.350.671, para produção de protocolos para SOD-c33c. 0 epítope NS3/4a usado no ensaio é um epítope conformacional tendo a seqüência especificada na Figura 3. C. Formatos do Imunoensaio: O ensaio Abbott PRISM (Abbott Laboratories, Abbott Pari, IL) , está comercialmente disponível e é um ensaio de detecção à base de anticorpo. 0 ensaio foi realizado usando as instruções do fabricante. 0 ORTHO HCV Versão 3.0 ELISA Test System (denominado aqui de ensaio Ortho 3.0, Ortho Clinicai Diagnostics, raritan, New Jersey) é um ensaio de detecção à base de anticorpo. O ensaio foi conduzido usando nas instruções de manufatura. O ensaio Roche Amplicor (Roche, Pleasant, CA) é um ensaio à base de PCR comercialmente disponível. O ensaio foi realizado usando as instruções do fabricante. O ensaio Gen-Probe TMA (San Diego, CA) é um ensaio de amplificação mediada por transcrição comercialmente disponível. O ensaio foi realizado usando as instruções do fabricante. O ensaio de antigeno Ortho (Ortho Clinicai Diagnostics, Raritan, New Jersey) é um ensaio de detecção à base de antigeno. O ensaio foi realizado usando as instruções do fabricante. O imunoensaio de combinação de anticorpo/antigeno do HCV foi realizado como se segue. 4 mg/ml de anticorpos monoclonais purificados Cll-7 e c-11-3 em solução salina tamponada com fosfato lx (PBS), pH 7,4 foram combinados e bem misturados. 90 ng do antigeno recombinante NS3/4a foi adicionado ao mesmo tampão de revestimento. A solução foi misturada 30 minutos antes do revestimento. 200 ml da solução acima foram adicionados por cavidade a placas de microtitulação de aglutinação de meio Costar de 96 cavidades (Corning, Inc.). Placas foram incubadas a 15-30°C por 16-24 horas. Placas foram lavadas duas vezes com dH20, seguida com 300 μΐ/cavidade de tampão de pós revestimento (albumina de soro bovino 1% (BSA) , 1 x PBS) por 1 hora e 300 μΐ/cavidade de tampão de estabilidade (1 x PBS, 1% BSA, manitol, polietileno glicol (PEG), gelatina) por 1 hora. Placas foram aspiradas e secas a 4°C em um liofilizador por 24 horas. Placas foram preenchidas com dessecante.

Para conduzir o imunoensaio de combinação de anticorpo/antigeno, 100 μΐ de tampão de lise melhorado (N-lauril sarcosina 1%, NaCl 0,65 M, 50 mg/ml de IgG de camundongo grau técnico (Sigma, St Louis, MO) , BSA 1% modificado com sulfidrila (Bayer), Caseina 0,1%) foram adicionados à placa. 100 ml da amostra foram depois adicionados. Esta foi depois incubada em um agitador a 40°C por 1 hora. As placas foram lavadas seis vezes com 1 x PBS, Tween-20 0,1%, em um Ortho Plate Washer. 200 ml de solução conjugada (diluição 1:75 cll-14-HRP com 250 ng/ensaio de antigeno SOD-c33c mais diluição 1:5000 de ani-SOD-HRP de camundongo em diluente de amostra HCV 3.0 (da ORTHO HCV Version 3.0 ELISA Test System, Ortho Clinicai Diagnostics, Rarita, New Jersey) sem extrato de SOD, todos preparados 30 minutos antes da adição). A solução foi incubada 45 minutos com agitação a 40°C. Esta foi lavada seis vezes, como acima, e 200 ml de solução de substrato (1 OPD tablete/10 ml) foi adicionada. O tablete OPD contém dicloridrato de o-fenilenodiamina e peróxido de hidrogênio para desenvolvimento de cor na reação com rábano peroxidase e está disponível junto a Sigma, St. Louis, MO. Esta foi incubada 30 minutos a 15-30°C no escuro. A reação foi interrompida pela adição de 50 ml de H2SO4 e as placas foram lidas a 4 92 nm, em relação a absorvância a 690 nm como controle. D. Resultados: os resultados dos vários ensaios são mostrados nas Tabelas 5 e 6, que descrevem dois experimentos separados feitos em amostras de sangue expostos a infecção como indicado. Áreas escurecidas indicam detecção de vírus. Como mostrado abaixo, ensaio de antigeno de combinação de Chrion detectou soroconversão em todas as amostras, enquanto todos os outros ensaios à base de antigeno falharam na detecção de soroconversão em pelo menos uma amostra. Em particular, nem os ensaios á base de anticorpo detectar a soroconversão até pelo menos o dia 18 (Tabela 5) . A Tabela 6 mostra que nem os ensaios à base de anticorpo detectaram a presença de infecção com HCV no dia 22. Além do mais, o ensaio à base de antigeno Ortho falhou para detectar a soroconversão dos 85 dias.

Assim, baseado nos resultados acima, é claro que o novo ensaio de antigeno/anticorpo de combinação reduz o número de negativos falsos obtidos usando outros ensaios de antígeno/anticorpo convencionais.

Tabela 5 Soroconversão do HCV

Tabela 6 Soroconversão do HCV

Exemplo 2 Produção de um epitope conformacional NS3/4a com substituições de Thr por Pro e Ser por Ile Um epitope conformacional de NS3/4a foi obtido como se segue. Este epitope tem a seqüência especificada nas Figuras 4A a 4D e difere da seqüência nativa e forneceria um sitio de clonagem 5'HindIII, seguido pela seqüência ACAAAACAAA, o iniciador ATG, e códons para HCVla, começando com o amino ácido 1027 e continuando para um sitio Bg/Ino amino ácido 1046; (b) um fragmento de restrição Bgll-Clal de 683 bp (codificando amino ácidos 1046-1274) de pAcHLTns3ns4aPI; e (c) um vetor pSP72 (Promega, Madison, WI, GenBankl/EMBL Número de Acesso X65332) que foi digerido com HindIII e Ciai, desfosforilado, e purificado com gel. 0 plasmidio pAcHLTns3ns4aPIfoi derivado de pAcHLT, um vetor de expressão de baculovirus comercialmente disponível junto a BD Pharmaingen (San Diego, CA) . Em particular, um vetor de pAcHLY EcoRI-PstI foi preparado, assim como os seguintes fragmentos: EcoRI-Alwnl, 935 bp, correspondendo aos amino ácidos 1027-1336 do genoma do HCV1; Alwnl-SacII, 247 bp, correspondendo aos amino ácidos 1336-1419 do genoma HCV-1; Hinfl-Bgll, 175 bp, correspondendo aos amino ácidos 1449-1509 do genoma do HCV1.; BglI-PstI, 619 bp, correspondendo aos amino ácidos 1510-1711 do genoma do HCV1, mais o códon de terminação de transcrição. Um fragmento sinteticamente gerado SacII-Hinfl de 91 bp, correspondendo aos amino ácidos 1420-1448 do genoma do HCV1 e contendo as mutações de PI (Thr-1428 mutada a Pro, Ser-149 mutada a Ile) , foi ligado com o fragmento Hinfl-Bgll de 17 5 bp e o fragmento BglI-PstI de 619 bp descrito acima e subclonadc em um vetor pGEM-5Zf(+) diferido com SacII e PstI. pGEM-5Zf(+) é um vetor E. coli comercialmente disponivel (Promega, Madison, WI, GenBank/EMBL Número de Acesso X65308). Após a transformação de células HB101 competentes, análise de miniseleção de clones individuais e verificação de seqüência, um fragmento de SacII-PstI de 885 bp de pGEM5.PI clone2 foi purificado com gel. Este fragmento foi ligado com fragmento de EcoRI-Alwnl de 935 bp, o fragmento de Alwnl-SacII de 247 bp e o vetor de Eco-RI-PstI de pAcHLT, descrito acima. A construção resultante foi denominada pAcHLTns34aPI. A mistura de ligação acima foi transformada em células competentes HB 101 e colocada em placa com agar Luria contendo 100 μg/ml de ampicilina. Análise de miniprep de clones individuais levaram à identificação de positivos putativos, dois dos quais foram amplificados. 0 DNA de plasmidio para pSP72 laHC, clones #1 e #2 foram preparados com o kit Oiágen Maxiprep e foram sequenciados. A seguir, os seguintes fragmentos foram ligados juntos: (a) um fragmento HindIII-Clal de 761 bp de pSP721aHC #1(pSP72.laHC foi gerado pela ligação junto do seguinte: pSP72 que foi digerido com HindIII e Ciai, oligonucleotideos sintéticos forneceríam um sítio de clonagem 5'HindIII, seguido pela seqüência ACAAAACAAA, o códon de iniciação ATG, e códons para HCVa, começando com o amino ácido 1027 e continuando para um sítio NglII 1046, e um fragmento de restrição BglII-Clal de 683 bp (codificando os amino ácidos 1046-1274) de pAcHLTns3ns4aPI); (b) um fragmento de Bam-HI-HindIII de 1353 bp para o promotor híbrido de levedura ADH2/GAPDH; (c) um fragmento de Clal-Sall de 1320 bp (codificando um amino ácido de HCVl 1046-1711 com Thr 1428 mutada a Pro e Ser 1429 mutada a Ile) de pAcHLTns3ns4aPI; e (d) o vetor de expressão de levedura de pBS24.1 que foi digerido com BamHI e Sall, desfosforilada e purificada com gel. A mistura de ligação foi transformada em HB101 competente e colocado em placa com agar Luria contendo 100 pg/ml de ampicilina. Análises miniprep de colônias individuais levaram à identificação de clones com a inserção de BamHI-SalI de 3446 bp que estava compreendido do promotor ADH2/GAPDH, o códon iniciador ATG e HCVla NS3/4a dos amino ácidos 1027-1711 (mostrado como os amino ácidos 1-686 das Figura 4A-4D), com Thr 1428 (posição de amino ácido 403 das Figuras 4A-4D) mutada a Pro e Ser 1429 (posição de amino ácido 404 das Figuras 4A-4D) mutada a Ile. A construção foi denominada pd.HCVla.ns3ns4aPI (veja, Figura 5) .

Linhagem de S. cerevisae AD3 foi transformada com pd.HCVla.ns3ns4aPI e transformantes únicos foram verificados para expressão após depleção de glucose no meio. A proteína recombinante foi expressada em níveis altos em levedura, como detectado por coloração com azul Coomasssie e confirmada por análise imunoblot usando um anticorpo policlonal ao domínio helicase de NS3.

Exemplo 3 Purificação de epítope conformacional NS3/4a Um epítope conformacional de NS3/4a foi purificado como se segue. Células S. cerivisae citadas acima, expressando um epítope de NS3/4a foram colocadas em cultura como descrito acima. As células foram suspensas em tampão de lise (Tris 50 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, PMFS 1 mM, pepstatina 0,1 μΜ, leupeptina 1 μΜ) e lisada em um Dyno-Mill (Wab Willy A. Bachofon, Basel, Switzerland) ou parelho equivalente usando contas de vidro, a uma razão de células: tampão: contas de vidro 0,5 mm 1: 1: 1. O lisato foi centrifugado a 30100 x g por 30 min a 4°C e a pelota contendo a fração de proteína insolúvel foi adicionada para lavar tampão (6 ml/g de peso de pelota de célula de partida) e agitadas a temperatura ambiente por 15 min. O tampão de lavagem consistia em NaPCh 50 mM pH 8,0, NaCl 0,3M, β-mercaptoletanol 5 mM, glicerol 10%, glucosida de octila 0,05%, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, pepstatina 0,1 μΜ, leupeptina 1 μΜ. Resíduos de células foram removidos por centrifugação a 30100 x g por 30 min a 4°C. O sobrenadante foi descartado e a pelota retida. A proteína foi extraída da pelota como se segue. 6 mg/ml de tampão de extração foi adicionado e agitado a temperatura ambiente por 15 min. O tampão de extração consistia em Tris 50 mM pH 8,0, NaCl 1M, β-mercaptoetanol 5 mM, glicerol 10%, EDTA 1 mM, PMFS 1 mM, pepstatina 0,1 μΜ, leupeptina 1 μΜ. Este foi centrifugado a 30100 x g por 30 min a 4°C. 0 sobrenadante foi retido e sulfato de amônio adicionado a 17,5%usando a seguinte fórmula / (1 - x% sulfato de amônio) = ml de sulfato de amônio saturado 4,1M para adicionar o sobrenadante. O sulfato de amônio foi adicionado gota a gota enquanto agitava-se em gelo e a solução agitada em gelo por 10 min. A solução foi centrifugada a 17700 x g por 30 min a 4°C e a pelota retida e armazenada a 2°C a 8°C para até 48 h. A pelota foi ressuspensa e testada em uma coluna Poly U (Poly U Sepharose 4B, Amersham Pharmacia) a 4§C como se segue. A pelota foi ressuspensa em 6 ml de tampão de equilíbrio Poly U por grama de peso de pelota. O tampão de equilíbrio consistia em HEPES 25 mM pH 8,0, NaCl 200 mM, DTT 5 mM (adicionado fresco), glicerol 10%, glucosida de octila 1,2. A solução foi agitada a 4°C por 15 min e centrifugada a 31000 x g por 30 min a 4°C.

Uma coluna Poly U (1 ml de resina por grama de peso de pelota de partida) foi preparada, taxa de escoamento linear foi de 60 cm/h e taxa de escoamento de empacotamento foi de 133% de 60 cm/h. A coluna foi equilibrada com tampão de equilíbrio e o sobrenadante da pelota de sulfato de amônio ressuspensa foi carregada sobre a coluna equilibrada. A coluna foi lavada para a linha base com o tampão de equilíbrio e a proteína com uma etapa de eluição no seguinte tampão de eluição Poly U: HEPES 25 mM pH 8,0, NaCl 0,1 M, DTT 5 mM (adicionado fresco), glicerol 10%, glucosida de octila 1,2. O eluado da coluna foi testado em SDS-PAGE (colorido com Coomassie) e alíquotas congeladas e armazenadas a -80°C. A presença do epítope NS3/4a foi confirmado por Western blot, usando um anticorpo policlonal direcionado contra o domínio de protease de NS3e um anticorpo monoclonal contra o epítope 5-1-1 (HCV 4a).

Adicionalmente, a atividade da enzima protease foi monitorada durante a purificação como se segue. Um peptídeo NS4A (KKGSVVIVGRIVLSGKPAIIPKK), e a amostra contendo o epítope conformacional NS3/4a, foram diluídos em 90 μΐ de tampão de reação (Tris 25 mM, pH 7,5, NaCl 0,15M, EDTA 0,5 mM, glicerol 10%, 0,05 n-dodecil B-D-Maltoside, DTT 5 mM) e deixada misturar por 30 minutos a temperatura ambiente. 90 μΐ da mistura foram adicionados a uma placa de microtitulo (Costar, Inc., Corning, NY) e 10 μΐ do substrato HCV (AnaSpec, Inc., San Jose CA) foram adicionados. A placa foi misturada e lida em uma leitora de placa Fluostar. Resultados foram expressos como unidades de fluorescência relativas (RFU) por minuto.

Usando esse métodos, o produto da extração de NaCl 1M continha atividade de 3,7 RFU/min, o precipitado de sulfato de amônio tinha uma atividade de 7,5 RFU/min e o produto da purificação Poly U tinha uma atividade de 18,5 RFU/min.

Exemplo 4 Estudos de competição 0 seguinte estudo de competição foi conduzido a fim de avaliar se o epitope conformacional NS3/4a detectou diferentes anticorpos de outros antigenos de HCV. Em particular, o antigeno NS3/4a foi comparado com o antigeno c200 como se segue. 0,5 pg e 1,0 μς de NS3/4a, produzido como descrito acima, ou c200 (tiepatology (1992) 15: 19-25, disponível no ORTHO HCV Version 3.0 ELISA test System, Ortho Clinicai Diagnostics, Raritan, New Jersey) , foram misturados com 20 μΐ de amostra de PHV914-5 (um sangramento de soroconversão anterior obtido do sangue de um indivíduo infectado) em um volume total de 200 μΐ (1 x PBS) . A mistura foi incubada por 1 hora em microcavidades a 37°C. A mistura foi depois transferida a placas revestidas com NS3/4a e incubadas por 1 hora a 37°C. Placas foram lavadas e avaliadas como se segue.

1 pg de antigeno de c200 foram adicionados a 10 μΐ de amostra PHV914-5 em um volume total de cerca de 220 μΐ. A mistura foi incubada por 1 hora em uma micro cavidade a 37°C e 200 μΐ transferidos a uma placa revestida com NS3/4a (100 ng/ensaio) e incubadas por 1 hora a 37°C. As placas foram lavadas cinco vezes com 1 x PBS, Tween-10 0,1%. 200 μΐ de solução conjugada (descrita acima) foram adicionados, e as placas incubadas e avaliadas. Os controles que consistiam PHV914-5 e 1 x PBS (sem antigeno) foram também tratadas como acima.

Os resultados são mostrados na tabela 7. Resultados de inibição percentual mostrados na coluna 4 são calculados como coluna 3 menos (coluna 2 dividido por coluna 3 vezes 100). Como pode ser visto, os dados mostram que NS3/4a é neutralizado por anticorpos de soroconversão anterior e c200 não. Um sinal forte foi alcançado quando os anticorpos em membros de painel de soroconversão anterior PHV914-5 c33c reagido com a NS34a revestido na placa. O antigeno c200 não foi neutralizado por esses anticorpos. Isto é mostrado no painel de topo da Tabela 7. Quando NS34a foi misturado com a amostra PHV914-5, ele foi neutralizado e consequentemente nenhum anticorpo estava presente na amostra para reagir com NS34a que foi revestido em microplaca. Os dados indicam que NS34a pode ser detectado por uma classe diferente de anticorpos daquela detectada por c200.

Tabela 7. Estudos de competição para mostrar que o antigeno NS34a detecta diferentes anticorpos em painel de soroconversão c33c anterior comparado ao antigeno c200 Exemplo 5 Estudos de estabilidade de epitope conformacional de NS34a Para avaliar a função de estabilidade do epitope NS3/4a para ensaiar o desempenho, o seguinte estudo foi feito para determinar uma imunoreatividade NS3/4a versus tempo a temperatura ambiente. Alíquotas menores de estocagem NS3/4a foram deixadas agitar a temperatura ambiente e depois congeladas a intervalos na Tabela 8. Todos os frascos foram revestidos simultaneamente e testados contra dois painéis de soroconversão NS3 anterior.

Como pode ser visto na Tabela 8, a estocagem de NS3/4a não é estável e a imunoreatividade decresce com o tempo. Além disso, mantendo conformação NS3/4a é necessária para imunoreatividade.

Estudos de estabilidade adicionais foram conduzidos como se segue. Dois anticorpos monoclonais conformacionais feitos contra NS3/4a usando procedimentos padrão foram substituídos por painéis de soroconversão anterior anti- HCV. Frascos de NS3/4a de estocagem foram armazenados a temperatura ambiente em intervalos de 3, 6 e 24 horas. O NS3/4a dos frascos congelados foi revestido a 90 ng/ml e submetidos a ensaio usando o procedimento descrito acima. Os resultados sugeriram que os dois monoclonais eram na verdade conformacionais e sua atividade foi sensivel à manipulação de antigeno de NS3/4a a temperatura ambiente. A reatividade de um anticorpo monoclonal de controle positivo não variou.

Tabela 8 Exemplo 6 Imunoreatividade de epítope conformacional NS3/4a versus Ns3/4a desnaturado A imunoreatividade do epítope conformacional NS3/4a, produzido como descrito acima, foi comparado a NS3/4a que tinha sido desnaturado por adição de SDS para preparação de epítope conformacional NS3/4a a uma concentração final de 2%. O NS3/4a e NS3/4a conf ormacional desnatura_dos_ f_o.ram_ revestidos em placas de microtítulo como descrito acima. O antígeno c200 (Hepatology (1992) 15: 19-25, disponível no ORTHO HCV Version 3.0 ELISA Test System, Ortho-Clinical Diagnostics, Raritan, NJ) foi também revestido em placas de microtitulação. O anrc200 foi usado como uma comparação, este sendo presumido por ser não conformacional devido à presença de agente de redução (DTT) e detergente (SDS) em sua formulação. A imunoreatividade foi testada contra dois painéis de soroconversão de HCV, PHV 904 e PHV 914 (amostras de sangue humano comercialmente disponíveis junto a Boston Biomedica, Inc., West Bridgewater, MA). Os resultados são mostrados na Tabela 9. Os dados sugerem que a forma linearizada ou desnaturada de NS3/4a (assim como c200) não detecta painéis de soroconversão anterior tão anterior quanto o epítope conformacional NS3/4a.

Tabela 9 A imunoreatividade do epítope conformacional foi também testada usando anticorpos monoclonais para NS3/4a, feita usando procedimentos padrão. Esses anticorpos monoclonais foram depois testados no formato ELISA contra NS3/4a e NS3/4a desnaturado e antigeno c200. Os dados mostram que os monoclonais anti-NS3/4a reagem para o NS3/4a e NS3/4a desnaturado de forma similar aos painéis de soroconversão mostrados na Tabela 10. Este resultado, também -fornece evidência de que o NS3/4a é conformacional de natureza como anticorpos monoclonais podem ser feitos os quais são similares em reatividade aos painéis de soroconversão c33c anterior.

Tabela 10 Desse modo, novos ensaios de detecção de HCV foram descritos. Da descrição anterior, será apreciado que, embora realizações especificas da invenção tenham sido descritas aqui para fins de ilustração, várias modificações podem ser feitas sem se afastar do espirito e escopo da descrição.

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Suporte sólido de imunoensaio, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um anticorpo anti-núcleo do virus da hepatite C (HCV) e pelo menos um epítopo NS3/4a do HCV isolado ligado ao mesmo, em que o dito epitopo NS3/4a compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID NO. 3, a qual possui atividade de protease, em que o dito pelo menos um anticorpo anti-núcleo é selecionado a partir do grupo consistindo em cll-3, cll-7 e cll-14.

2. Suporte sólido de imunoensaio, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos dois anticorpos anti-núcleo do HCV ligados ao mesmo.

3. Suporte sólido de imunoensaio, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito epitopo NS3/4a é um epitopo conformacional e compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID NO. 3.

4. Suporte sólido de imunoensaio, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um antigeno de fusão de epitopo múltiplo ligado ao mesmo.

5. Suporte sólido de imunoensaio, de acordo com a reivindicação 4, car act e r i z ado pelo fato de que o dito antigeno de fusão de epitopo múltiplo compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID NO. 5.

6. Método de detecção de infecção pelo virus da hepatite C (HCV) em uma amostra biológica, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecimento de um suporte sólido de imunoensaio conforme definido na reivindicação 1; (b) combinação de uma amostra biológica com o dito suporte sólido sob condições que permitem que anticorpos e antígenos do HCV, quando presentes na amostra biológica, se aglutinem ao dito pelo menos um anticorpo anti-núcleo e ao dito epitopo NS3/4a, respectivamente; (c) adição ao suporte sólido da etapa (b) sob condições de formação de complexo de (i) um primeiro anticorpo detectavelmente marcado, em que o primeiro anticorpo detectavelmente marcado é um anticorpo anti-núcleo do HCV detectavelmente marcado, em que o anticorpo anti-núcleo marcado é direcionado contra um epitopo de núcleo do HCV diferente do que pelo menos um anticorpo anti-núcleo ligado ao suporte sólido; (ii) um antigeno que reage com um anticorpo do HCV da amostra biológica reativo com o dito epitopo NS3/4a; e (iii) um segundo anticorpo detectavelmente marcado, em que o dito segundo anticorpo detectavelmente marcado é reativo com o antigeno de (ii); (d) detecção de complexos formados entre os anticorpos e antígenos, se houver, como uma indicação de infecção por HCV na amostra biológica.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o dito pelo menos um anticorpo anti-núcleo é direcionado contra uma região com N terminal do antigeno de núcleo do HCV, que é selecionado a partir do grupo consistindo em Cll-3 e cll-7; e o dito anticorpo anti-núcleo do HCV detectavelmente marcado é direcionado contra uma região com C terminal do antigeno do núcleo do HCV, o qual é cll-4.

8. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o antigeno que reage com um anticorpo do HCV da amostra biológica compreende um epitopo da região c33c da poliproteína do HCV.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o epitopo c33c é fundido com uma sequência de aminoácidos de superóxido dismutase humana (hSOD) e o segundo anticorpo detectavelmente marcado é reativo com a sequência de aminoácidos de hSOD.

10. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o epitopo NS3/4a é um epitopo conformacional e compreende a sequência de aminoácidos da SEQ. ID NO. 3.

11. Método de detecção de infecção com o virus da hepatite C (HCV) em uma amostra biológica, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecimento de um suporte sólido de imunoensaio conforme definido na reivindicação 2; (b) combinação de uma amostra biológica com o suporte sólido sob condições que permitem que anticorpos e antigenos do HCV, quando presentes na amostra biológica, se aglutinem a pelo menos dois anticorpos anti-núcleo e ao dito epitopo NS3/4a, respectivamente; (c) adição do suporte sólido da etapa (b) sob condições de formação de complexo de (i) um primeiro anticorpo detectavelmente marcado, em que o primeiro anticorpo detectavelmente marcado é um anticorpo anti-núcleo do HCV detectavelmente marcado, em que o anticorpo anti-núcleo marcado é direcionado contra um epitopo de núcleo do HCV diferente do que pelo menos dois anticorpos anti-núcleo ligados ao suporte sólido; (ii) um epitopo da região c33c da poliproteina do HCV fundida a uma sequência de aminoácidos de hSOD; e (iii) um segundo anticorpo detectavelmente marcado, em que o segundo anticorpo detectavelmente marcado é reativo com a sequência de aminoácidos de hSOD; (d) detecção de complexos formados entre os anticorpos e antígenos, se houver, como uma indicação de infecção por HCV na amostra biológica.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o dito epitopo NS3/4a é um epitopo conformacional e compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 3.

13. Método de detecção de infecção com o virus da hepatite C (HCV) em uma amostra biológica, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecimento de um suporte sólido de imunoensaio conforme definido na reivindicação 4; (b) combinação de uma amostra biológica com o suporte sólido sob condições que permitem que anticorpos e antigenos do HCV, quando presentes na amostra biológica, se aglutinem a pelo menos um anticorpo anti-núcleo, ao dito epitopo NS3/4a, e ao dito antigeno de fusão do epitopo múltiplo; (c) adição ao suporte sólido da etapa (b) sob condições de formação de complexo de (i) um primeiro anticorpo detectavelmente marcado, em que o primeiro anticorpo detectavelmente marcado é um anticorpo anti-núcleo do HCV detectavelmente marcado, em que o dito anticorpo anti-núcleo marcado é direcionado contra um epitopo de núcleo do HCV diferente do que pelo menos um anticorpo anti-núcleo ligado ao suporte sólido; (ii) primeiro e segundo antigenos que reagem com um anticorpo do HCV da amostra biológica reativa com o epitopo NS3/4a e o dito antigeno de fusão do epitopo múltiplo, respectivamente; e (iii) um segundo anticorpo detectavelmente marcado, em que o dito segundo anticorpo detectavelmente marcado é reativo com os antigenos de (ii); (d) detecção de complexos formados entre os anticorpos e antígenos, se houver, como uma indicação de infecção por HCV na amostra biológica.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o dito pelo menos um anticorpo anti-núcleo é direcionado contra uma região com N terminal do antigeno de núcleo do HCV, o qual é selecionado a partir do grupo consistindo em cll-3 e c-11-7, e o dito primeiro anticorpo anti-núcleo do HCV detectavelmente marcado é direcionado contra uma região com C terminal do antigeno do núcleo do HCV, o qual é cll-4.

15. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o dito primeiro antigeno que reage com um anticorpo do HCV da amostra biológica compreende um epitopo da região c33c da poliproteina do HCV.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o epitopo c33c é fundido com uma sequência de aminoácidos de superóxido dismutase humana (hSOD) e o segundo anticorpo detectavelmente marcado é reativo com a sequência de amino ácido de hSOD.

17. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o dito segundo antigeno que reage com um anticorpo do HCV da amostra biológica compreende um epitopo da região c22 da poliproteina do HCV.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o epitopo da região c22 compreende aminoácidos Lysio a Ser99 da poliproteina do HCV, com uma deleção de Arg47 e uma substituição de Leu por Trp na posição 44, numerada em relação à sequência de poliproteina do HCV1, em que o dito epitopo é fundido com uma sequência de aminoácidos de superóxido dismutase humana (hSOD) e o segundo anticorpo detectavelmente marcado é reativo com a sequência de aminoácidos de hSOD.

19. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o dito antigeno de fusão de epitopo múltiplo compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 5.

20. Kit de teste de imunodiagnóstico, caracteri z ado pelo fato de que compreende o suporte sólido de imunoensaio conforme definido na reivindicação 1, e instruções para condução do teste de imunodiagnóstico.

21. Suporte sólido de imunoensaio, caracterizado pelo fato de que compreende dois anticorpos monoclonais anti-núcleo de virus da hepatite C (HCV) e um epitopo conformacional NS3/4a do HCV compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 3, ligados ao mesmo, em que os ditos anticorpos anti-núcleo são selecionados a partir do grupo consistindo em cll-3, cll-7 e cll-14.

22. Suporte sólido de imunoensaio, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que os ditos dois anticorpos anti-núcleo são direcionados contra uma região com N terminal do antigeno de núcleo do HCV, os quais são selecionados a partir de cll-3 e c-11-7.

23. Método de detecção de infecção com o virus da hepatite C (HCV) em uma amostra biológica, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecimento de um suporte sólido de imunoensaio conforme definido na reivindicação 21; (b) combinação de uma amostra biológica com o suporte sólido sob condições que permitem que anticorpos e antigenos do HCV, quando presentes na amostra biológica, se aglutinem a pelo menos dois anticorpos anti-núcleo e ao dito epitopo NS3/4a conformacional, respectivamente; (c) adição ao suporte sólido da etapa (b) sob condições de formação de complexo de (i) um primeiro anticorpo detectavelmente marcado, em que o dito primeiro anticorpo detectavelmente marcado é um anticorpo anti-núcleo do HCV detectavelmente marcado, em que o dito anticorpo anti-núcleo marcado é direcionado contra um epitopo de núcleo do HCV diferente do que pelo menos dois anticorpos anti-núcleo ligados ao suporte sólido; (ii) um epitopo da região c33c da poliproteína do HCV fundido a uma sequência de aminoácidos de hSOD; e (iii) um segundo anticorpo detectavelmente marcado, em que o segundo anticorpo detectavelmente marcado é reativo com a dita sequência de aminoácidos de hSOD; (d) detecção de complexos formados entre os anticorpos e antigenos, se houver, como uma indicação de infecção por HCV na amostra biológica.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que os ditos pelo menos dois anticorpos anti-núcleo são direcionados contra uma região com N terminal do antigeno de núcleo do HCV, o quais consistem nos anticorpos cll-3 e cll-7; e o dito anticorpo anti-núcleo do HCV detectavelmente marcado é direcionado contra uma região com C terminal do antigeno do núcleo do HCV, o qual é cl 1-4 .

25. Kit de teste de imunodiagnóstico, caracteri z ado pelo fato de que compreende o suporte sólido de imunoensaio conforme definido na reivindicação 21, e instruções para condução do teste de imunodiagnóstico.

26. Suporte sólido de imunoensaio, caracterizado pelo fato de que compreende dois anticorpos monoclonais anti-núcleo de virus da hepatite C (HCV), um epitopo conformacional NS3/4a do HCV compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 3, e um antigeno de fusão de epitopo múltiplo compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 5, ligados ao mesmo, em que os ditos anticorpos anti-núcleo são selecionados a partir do grupo consistindo em cl1-3, cll-7 e cll-14.

27. Método de detecção de infecção com o vírus da hepatite C (HCV) em uma amostra biológica, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecimento de um suporte sólido de imunoensaio conforme definido na reivindicação 26; (b) combinação de uma amostra biológica com o suporte sólido sob condições que permitem que anticorpos e antigenos do HCV, quando presentes na amostra biológica, se aglutinem a pelo menos dois anticorpos anti-núcleos, ao dito epitopo NS3/4a, e ao dito antigeno de fusão do epitopo múltiplo, respectivamente; (c) adição ao suporte sólido da etapa (b) sob condições de formação de complexo de (i) um primeiro anticorpo detectavelmente marcado, em que o dito primeiro anticorpo detectavelmente marcado é um anticorpo anti-núcleo do HCV detectavelmente marcado, em que o dito anticorpo anti-núcleo marcado é direcionado contra um epitopo de núcleo do HCV diferente do que pelo menos dois anticorpos anti-núcleo ligados ao suporte sólido; (ii) um epitopo da região c33c da poliproteina do HCV fundido a uma sequência de aminoácidos de hSOD; e (iii) um segundo anticorpo detectavelmente marcado, em que o dito segundo anticorpo detectavelmente marcado é reativo com as ditas sequências de aminoácidos de hSOD; (d) detecção de complexos formados entre os anticorpos e antigenos, se houver, como uma indicação de infecção por HCV na amostra biológica.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que os ditos pelo menos dois anticorpos anti-núcleos, são direcionados contra uma região com N terminal do antigeno de núcleo do HCV, o quais são os anticorpos cll-3 e cll-7; e o dito anticorpo anti-núcleo do HCV detectavelmente marcado é direcionado contra uma região com C terminal do antigeno do núcleo do HCV, o qual é o anticorpo cll-4.

29. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o epítopo da região c22 da poliproteina do HCV compreende aminoácidos Lysio a Sergg da poliproteina do HCV, com uma deleção de Arg47 e uma substituição de Leu por Trp na posição 44, numerada em relação à sequência de poliproteina do HCVl.

30. Kit de teste de imunodiagnóstico, caracterizado pelo fato de que compreende o suporte sólido de imunoensaio conforme definido na reivindicação 26, e instruções para condução do teste de imunodiagnóstico.

31. Método de produção de um suporte sólido de imunoensaio, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecimento de um suporte sólido; e (b) aglutinação de pelo menos um anticorpo anti-núcleo do virus da hepatite C (HCV) e pelo menos um epitopo conformacional NS3/4a do HCV isolado ao mesmo, em que o dito epitopo NS3/4a compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 3, a qual possui atividade de protease, em que os ditos anticorpos anti-núcleo são selecionados a partir do grupo consistindo em cll-3, cll-7 e cll-14.

32. Método de produção de um suporte sólido de imunoensaio, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecimento de um suporte sólido; e (b) aglutinação de pelo menos dois anticorpos anti-núcleo do virus da hepatite C (HCV) e um epítopo conformacional NS3/4a do HCV isolado ao mesmo, em que o dito epitopo NS3/4a compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 3, a qual possui atividade de protease, em que os ditos anticorpos anti-núcleo são selecionados a partir do grupo consistindo em cll-3, cll-7 e cll-14.

33. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente aglutinação de pelo menos um antigeno de fusão de epitopo múltiplo ao suporte sólido.

34. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente aglutinação de pelo menos um antigeno de fusão de epitopo múltiplo ao suporte sólido.

35. Método de produção de um suporte sólido de imunoensaio, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecimento de um suporte sólido; e (b) aglutinação de dois anticorpos anti-núcleo do virus da hepatite C (HCV), um epitopo conformacional NS3/4a do HCV isolado e um antigeno de fusão de epítopo múltiplo ao mesmo, em que o dito epítopo NS3/4a compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 3, a qual possui atividade de protease em que os ditos anticorpos anti-núcleo são selecionados a partir do grupo consistindo em cll-3, cll-7 e cll-14.