BRPI0206809B1 - cepas de leveduras que produzem esteróides de modo autônomo e processo de produção de um esteroide - Google Patents

Abstract

"cepas de leveduras que produzem esteróides de modo autônomo". a presente invenção refere-se a cepas de leveduras geneticamente modificadas e que produzem de maneira autônoma, a partir de uma fonte de carbono simples, esteróides. a invenção também refere-se a um processo de produção de esteróides a partir de tais cepas de levedura.

Description

(54) Título: CEPAS DE LEVEDURAS QUE PRODUZEM ESTERÓIDES DE MODO AUTÔNOMO E PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UM ESTEROIDE (51) Int.CI.: C12P 33/00; C12P 33/08; C12P 33/18.

(52) CPC: C12Y 114/15004; C12P 33/005; C12P 33/08; C12P 33/18; C12Y 114/15006; (...).

(30) Prioridade Unionista: 31/01/2001 FR 01 01294.

(73) Titular(es): AVENTIS PHARMA S.A.

(72) Inventor(es): ROBERTO SPAGNOLI; TILMAN ACHSTETTER; GILLES CAUET; ERIC DEGRYSE; BRUNO DUMAS; DENIS POMPON; JACQUES WINTER.

(86) Pedido PCT: PCT FR2002000348 de 29/01/2002 (87) Publicação PCT: WO 2002/061109 de 08/08/2002 (85) Data do Início da Fase Nacional: 29/07/2003 (57) Resumo: CEPAS DE LEVEDURAS QUE PRODUZEM ESTERÓIDES DE MODO AUTÔNOMO. A presente invenção refere-se a cepas de leveduras geneticamente modificadas e que produzem de maneira autônoma, a partir de uma fonte de carbono simples, esteróides. A invenção também refere-se a um processo de produção de esteróides a partir de tais cepas de levedura.

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Relatório Descritivo da Patente de Invenção para CEPAS DE LEVEDURAS QUE PRODUZEM ESTERÓIDES DE MODO AUTÔNOMO E PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UM ESTEROIDE.

[001] A presente invenção refere-se à produção de esteróides nos microorganismos, notadamente as cepas de leveduras.

[002] Os esteróides, notadamente os esteróides derivados do colesterol, estão implicados em numerosos processos fisiológicos dentre os quais podem ser citados a regulação das taxas de glicídios e colesterol na circulação sanguínea, a manutenção e o desenvolvimento da massa muscular, o desenvolvimento do sistema nervoso central.

[003] Dentre os inconvenientes observados em caso de desregulação das taxas de esteróides circulantes, podem ser citados o aparecimento de doenças auto-imunes, tais como o lúpus, de certos cânceres, por exemplo o câncer de mama, de doenças cardiovasculares, por exemplo a arteriosclerose. Problemas de regulação de esteróides também são suspeitos no caso do aparecimento de certas doenças neurológicas tais como as doenças de Parkinson ou de Alzheimer.

[004] Os esteróides, notadamente a hidrocortisona, podem ser utilizados como agentes terapêuticos como tal ou como complementos em outros tratamentos. Assim, os derivados de síntese dos glicocorticóides são utilizados por suas ações antiinflamatórias e, em grandes doses, imunossupressoras.

[005] A obtenção dos esteróides está atualmente ligada a processos de extração ou de síntese custosos. John Warcup Cornforth foi o primeiro a realizar a síntese total de um esteróide, o colesterol, por um método enzimático. No entanto, é importante dispor de um método que permite obter os esteróides de interesse, notadamente os derivados do colesterol, a um preço abordável.

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2/65 [006] Um certo número de proteínas implicadas na biossíntese dos esteróides foram expressas na levedura. Assim, a patente EP 360 361 demonstra a atividade das proteínas P450 17a e P450c21 na levedura Kluyveromyces lactis. Do mesmo modo, foi descrita a possibilidade de conversão in vivo de 11 deoxicortisol em hidrocortisona em uma levedura geneticamente modificada que expressa a P450c11 (Dumas et al., 1996), assim como a produção de 17a-hidroxiprogesterona a partir de pregnenolona na levedura (Degryse et al., 1999). Além disso, Duport et al., (Duport et al., 1998) descreveram a síntese de pregnenolona e de progesterona em uma levedura geneticamente modificada. Também foi descrito no pedido de patente WO 99/40203 que a inativação do gene ATF2 em uma cepa de levedura permite evitar a acetilação dos esteróides produzidos por essa cepa.

[007] A presente invenção permite realizar a síntese de esteróides, pela fermentação de cepas de leveduras geneticamente modificadas, em presença de uma fonte de carbono simples. O método proposto pela presente invenção permite portanto que se obtenha uma grande quantidade de esteróides de interessem a baixo custo, visto que o processo emprega a fermentação de leveduras e a adição de uma fonte de carbono simples, facilmente disponível no comércio.

Definições:

[008] Por fonte de carbono simples, de acordo com a presente invenção, entende-se fontes de carbono utilizáveis pelo profissional para o crescimento normal de uma levedura. Entende-se designar notadamente os diferentes açúcares assimiláveis, tais como a glicose, a galactose ou a sacarose, ou os melaços, ou os subprodutos desses açúcares. Uma fonte de carbono simples mais especialmente preferida são o etanol e o glicerol.

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3/65 [009] Por derivado de um esteróide, entende-se designar, de acordo com a presente invenção, um composto que pode ser obtido, notadamente por uma ou duas reações enzimáticas ou químicas, a partir dos ditos esteróides. Entende-se especialmente designar os esteróides acetilados, hidroxilados, ou que portam um substituinte tal como um derivado halogenado (flúor, iodo), ou um grupo metila.

[0010] Os problemas a resolver para que se possa produzir esteróides em um microorganismo são de diferentes tipos:

- é conveniente eliminar as reações parasitas que podem ser observadas em razão da presença de enzimas endógenas no microorganismo escolhido,

- é conveniente introduzir os genes que permitem a modificação dos intermediários de síntese de tal modo para que os níveis de expressão obtidos sejam os mais próximos possíveis dos níveis observados nos mamíferos. Assim, recriar os equilíbrios corretos é uma condição importante do sucesso de um tal projeto,

- é conveniente obter um nível de expressão dos diferentes genes que permite orientar preferencialmente a biossíntese na direção do esteróide escolhido.

[0011] A síntese dos esteróides é uma sequência de reações extremamente complexas, que empregam várias enzimas para obter o cortisol a partir do colesterol.

[0012] É conveniente primeiro produzir o 20,22 diidroxicolesterol, que é então transformado em pregnenolona, ela própria hidroxilada em 17-a hidróxi-pregnenolona. Essa última é então transformada em 17-a hidróxi-progesterona, que dá o desoxicortisol, que leva ao cortisol (hidrocortisona).

[0013] Uma via alternativa consiste na produção de pregnenolona, e depois de progesterona, transformada em 17-a hidróxi-progesterona. [0014] Foi mostrado que é possível produzir pregnenolona na

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4/65 levedura, a partir de uma fonte de carbono simples, (Duport et al., 1998, cujo conteúdo é incorporado como referência no presente pedido). Para fazer isso, foi necessário suprimir uma via endógena (por ruptura do gene A22-esterol-desaturase (ERG5) da via de biossíntese endógena dos ergosteróis), a fim de obter uma acumulação de produtos saturados em C-22. De fato, o ergosterol normalmente fabricado pela levedura difere do colesterol por uma insaturação em C-7(8) do núcleo B, uma insaturação em C-22, e um grupo metila adicional em C-24. Assim, os produtos saturados em C22, e em C-7 no núcleo B podem ser utilizados como substratos pelas enzimas situadas na cadeia de produção do cortisol.

[0015] A presente invenção permite realizar a síntese de esteróides, e notadamente os esteróides situados mais a jusante que a pregnenolona, de modo simples, pela fermentação de cepas de leveduras geneticamente modificadas, na presença de uma fonte de carbono simples. Em um caso especial da invenção, os esteróides sintetizados são excretados no meio de cultura, o que significa a purificação dos mesmos. O método proposto pela presente invenção permite portanto que se obtenha uma grande quantidade de esteróides de interesse, a baixo custo, visto que o processo emprega a fermentação de leveduras e a adição de uma fonte de carbono simples, facilmente disponível no comércio.

[0016] De modo preferido, os esteróides que podem ser produzidos pela cepa de levedura de acordo com a invenção são esteróides compreendidos na via de síntese do cortisol, assim como enunciados acima. Também é possível produzir outros tipos de esteróides, a partir da 17-a hidróxi-pregnenolona, notadamente a diidroepiandrosterona (DHEA), pela ação da enzima 17-a-hidroxilase e liase, e os esteróides derivados (androstenodionas, testosterona...). Esses esteróides podem ser produzidos por introdução das enzimas

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5/65 apropriadas na cepa de levedura, do mesmo modo que para a cepa exemplificada na presente invenção.

[0017] Para a execução do método de acordo com a invenção, a invenção refere-se também a uma cepa de levedura, geneticamente modificada que produz um esteróide ou um derivado de esteróide, caracterizada pelo fato de que ela permite a produção de maneira autônoma a partir de uma fonte de carbono simples.

[0018] O fato de que a produção seja efetuada de maneira autônoma significa que não há necessidade de acrescentar substratos para obter o esteróide de interesse, mas sim que a levedura pode produzi-lo unicamente a partir da fonte de carbono simples de partida. Também está claro que a cepa pode produzir um esteróide da via metabólica, por utilização de um substrato situado a montante na via metabólica, na medida em que a cepa de levedura de acordo com a presente invenção contém todos os genes necessários para a completação da via metabólica de produção dos esteróides.

[0019] De preferência, a cepa de levedura de acordo com a invenção produz um esteróide ou derivado de esteróide que é um derivado do metabolismo do colesterol, ou melhor que faz parte da cadeia de metabolismo do colesterol. O metabolismo do colesterol é bem conhecido pelo profissional, e está explicitado nas obras de bioquímica e de endocrinologia.

[0020] Assim, de preferência, o dito esteróide ou derivado de esteróide está compreendido notadamente no grupo constituído pela 17a-hidróxi pregnenolona, pelo cortisol, pela cortisona, pela cortexolona, pela 17a-hidróxi progesterona, e pelos derivados desses esteróides.

[0021] Também é possível produzir a pregnenolona e a progesterona com uma cepa de levedura de acordo com a presente invenção.

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6/65 [0022] Assim, a presente invenção tem notadamente como objeto uma cepa de levedura geneticamente modificada que produz, de maneira autônoma a partir de uma fonte de carbono simples, um esteróide ou um derivado de esteróide, derivado do metabolismo do colesterol, caracterizada pelo fato de que o dito esteróide ou derivado de esteróide está compreendido no grupo constituído pela 17a-hidróxi pregnenolona, pela hidrocortisona, pela cortexolona, pela 17a-hidróxi progesterona, e pelos derivados desses esteróides.

[0023] Assim como será visto mais adiante a cepa de levedura de acordo com a presente invenção apresenta pelo menos uma modificação genética escolhida no grupo constituído pela ruptura ou inativação de um gene endógeno, pela modificação do promotor de um gene endógeno, pela duplicação de um gene endógeno, pela introdução de pelo menos um gene heterólogo, em uma ou várias cópias, de modo epissomal ou cromossomal.

[0024] Por outro lado é vantajoso que a cepa de levedura da invenção apresente uma combinação das ditas modificações gênicas.

[0025] Assim como explicitado mais adiante, a cepa de levedura apresenta pelo menos uma ruptura de um gene endógeno escolhido no grupo constituído por ERG5, ATF2, GCY1, YPR1, ARE1, ARE2, ATF1, ADE2, em um primeiro modo de realização.

[0026] Em um modo de realização preferido, a cepa de levedura de acordo com a invenção apresenta uma ruptura dos genes endógenos ERG5, ATF2, GCY1, YPR1. Assim como descrito mais adiante, esses genes codificam para as proteínas que induzem reações parasitas na levedura.

[0027] O gene ADE2 no que lhe diz respeito pode também ser rompido de modo opcional, notadamente para integrar um gene heterólogo na cepa de levedura.

[0028] Em um modo de realização, a cepa de levedura de acordo

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7/65 com a invenção apresenta pelo menos um gene heterólogo integrado no cromossomo, a pelo menos um lócus escolhido entre ADE2, HIS3, TRP1, LEU2, GCY1, ATF2, YPR1, a integração sendo efetuada de maneira intragênica na proximidade imediata com um dos loci.

[0029] Em um modo de realização da invenção, a dita cepa de levedura apresenta pelo menos um gene heterólogo situado em um plasmídeo de cópias múltiplas ou um plasmídeo de pequeno número de cópias, o dito plasmídeo de cópias múltiplas sendo escolhido entre os plasmídeos à base de um replicon 2 mícron de levedura que se replicam em Saccharomyces cerevisiae e o dito plasmídeo de pequeno número de cópias sendo escolhido entre os plasmídeos baseados em uma origem de replicação ARS cromossômica com um centrômero de levedura.

[0030] Para a execução de um modo de realização da invenção, e assim como desenvolvido mais abaixo, a cepa de levedura de acordo com a invenção apresenta pelo menos um gene ou um cDNA heterólogo escolhido no grupo constituído pelo gene da esterol Δ7redutase e pelos cDNA do citocromo P450 SCC, da adrenodoxina, da adrenodoxina redutase, do citocromo b5, da 33-hidroesteróide desidrogenase isomerase, da citocromo P450 redutase, do citocromo P450 C17, do citocromo P450 C21, do citocromo P450 C11, e das sequências que codificam para essas proteínas.

[0031] Esses genes ou cDNA heterólogos estão sob o controle de uma sequência promotora escolhida no grupo constituído pelas sequências promotoras endógenas de levedura TDH3, TEF1, PGK1, CYC1, GAL10, ATF2, TIR1, ARH1, ADE2, e pelo promotor híbrido GAL10-CYC1.

[0032] É necessário utilizar uma sequência terminadora para qualquer gene ou cDNA heterólogo introduzido, de preferência, escolhida entre as sequências terminadoras dos genes endógenos

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PGK1, CYC1, ATF2, ADE2, NCP1.

[0033] Obtém-se nesse caso blocos ou cassetes de expressão, que consistem em um promotor, o gene heterólogo (ou cDNA, eventualmente que codifica para a proteína madura precedida pelo códon ATG que codifica para a metionina (Met-mat) ou uma proteína de fusão que possui eventualmente sinais de endereçamento para compartimentos celulares), e uma sequência terminadora.

[0034] Em um modo de realização, a cepa de levedura de acordo com a invenção apresenta o bloco de expressão heterólogo esterol Δ7redutase integrado no cromossomo ao lócus ADE2.

[0035] Em um modo de realização especial da invenção, a cepa de levedura compreende pelo menos um cassete de expressão dos genes que codificam para o P450scc, adrenodoxina co-fator do P450SCC localizado em um plasmídeo de grande número de cópias, e ela compreende um cassete de expressão da adrenodoxina redutase co-fator do P450SCC localizado em um plasmídeo de uma cópia ou de pequeno número de cópias ou integrado no cromossomo. De modo preferido, esses cassetes de expressão contêm a proteína madura precedida de uma metionina, e a proteína está localizada no citosol.

[0036] Em um modo de realização, a cepa de levedura compreende pelo menos um cassete de expressão escolhido entre os cassetes de expressão da 33-hidroesteróide desidrogenase isomerase, do citocromo P450c17, do citocromo P450c21 localizado em um plasmídeo de grande número de cópias, ou pequeno número de cópias ou integrado no cromossomo.

[0037] Em um modo de realização especial, a cepa de levedura de acordo com a invenção compreende pelo menos um cassete de expressão para a P45011p situado em um plasmídeo de cópias múltiplas, a proteína produzida apresentando um sinal de endereçamento para as mitocôndrias e/ou pelo menos um cassete de

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9/65 expressão para a adrenodoxina co-fator da Ρ45011β situado em um plasmídeo de cópias múltiplas, com um promotor fraco (ou melhor do qual a força se aparenta à força do promotor CYC1), a proteína produzida apresentando um sinal de endereçamento para as mitocôndrias. De modo preferido, as proteínas são produzidas sob a forma de um precursor, com um sinal homólogo ou heterólogo de endereçamento para as mitocôndrias, as proteínas tomando sua forma madura nesse compartimento celular.

[0038] É portanto interessante notar que em um caso especialmente preferido da execução da invenção, são introduzidas na cepa de levedura duas cópias do gene que codifica para a adrenodoxina, uma entre elas sendo destinada a expressar a proteína no citosol da célula, a outra sendo fabricada de tal modo para que a proteína madura se encontre nas mitocôndrias.

[0039] Em um modo de realização especial, a cepa de levedura compreende também pelo menos um cassete de expressão (promotor de expressão tal como citado acima com a parte codificante do gene NCP1, ATR1, e/ou ATR2, com seu próprio terminador ou um terminador tal como definido acima) situado em um plasmídeo de cópias múltiplas, de pequeno número de cópias ou integrado no cromossomo. Os cassetes de expressão para NCP1, ATR1 e ATR2 poderão notadamente ser integrados ao lócus NCP1 de S. cerevisiae.

[0040] Em um modo de realização especial, a cepa de levedura de acordo com a invenção expressa também a proteína ARH1p, proteína homóloga da adrenodoxina redutase dos mamíferos na levedura, a um nível superior ao nível de expressão fisiológico. A superexpressão dessa proteína pode ser obtida por técnicas bem conhecidas pelo profissional, por exemplo pela incorporação de um novo cassete de expressão (promotor de expressão, parte codificante do gene ARH1 com seu próprio terminador ou um terminador tal como definido acima)

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10/65 além do gene endógeno na levedura. De maneira surpreendente, foi de fato mostrado que uma expressão do gene ARH1 a um nível superior ao nível de expressão fisiológico aumenta de modo significativo a quantidade de esteróides produzidos. No entanto essa expressão não deve ser muito grande para obter o efeito desejado. Assim, se uma expressão da proteína ARH1 a um nível superior em relação a um nível fisiológico é desejável, é preciso ter cuidado para não superexpressar demais essa proteína sob pena de perder esse aumento de produção em esteróides.

[0041] A cepa de levedura de acordo com a presente invenção pode possuir um caráter poliplóide, diplóide, haplóide ou aneuplóide, sem que isso prejudique a execução da invenção.

[0042] Trata-se de preferência de uma cepa de Saccharomyces cerevisiae, notadamente derivada de uma das cepas FY 1679-28c, FY 1679-18b que são esporos da cepa FY 1679 depositada na American Type Culture Collection sob o número 96604.

[0043] A invenção também tem como objeto uma cepa de levedura, caracterizada pelo fato de que trata-se da cepa CDR07 Matα ou TGY260, depositadas na CNCM em 24 de janeiro de 2001 sob os números de ordem respectivos I-2616 e I-2615. A invenção refere-se também a uma cepa obtida depois de cruzamento de CDR07 Mat-α e TGY260, e eventualmente esporulação e transformação com um plasmídeo de levedura, notadamente as cepas UCY2 e UCY4 e as cepas UCY3 e UCY26 descritas na presente invenção. A invenção também tem como objeto cepas de leveduras obtidas depois de cruzamento de UCY2 e TGY245, e eventualmente esporulação e transformação com pelo menos um plasmídeo de levedura, notadamente as cepas UCY5, UCY6, UCY16, UCY19, UCY20, UCY24, UCY25 e UCY26 também descritas na presente invenção.

[0044] É útil que a cepa de levedura de acordo com a invenção

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11/65 possua os elementos necessários para a excreção do esteróide produzido no meio de cultura, a fim de simplificar a purificação do produto final.

[0045] A invenção também refere-se a um processo de produção de um esteróide, caracterizado pelo fato de que ele compreende as etapas de fermentação de uma cepa de levedura de acordo com a invenção na presença de uma fonte de carbono simples, e de recuperação do esteróide produzido.

[0046] Finalmente, a invenção também tem como objeto uma preparação farmacêutica que compreende uma cepa de levedura de acordo com a invenção, com eventualmente um excipiente farmaceuticamente aceitável, um tal excipiente sendo bem conhecido pelo profissional.

[0047] Ainda que a cepa de levedura de acordo com a invenção produza um esteróide de modo autônomo a partir de uma fonte de carbono simples, também é possível fornecer a ele colesterol ou uma estrutura aparentada, ou um substrato já presente como derivado do colesterol a fim de obter os produtos situados a jusante. A possibilidade de poder entrar em qualquer etapa, notadamente ao nível pregnenolona ou posterior da via de metabolismo do esteróide procurado permite portanto notadamente que se possa fornecer à levedura substratos não naturais, que levam à síntese de esteróides não naturais e substituídos, notadamente fluorados.

[0048] Em um primeiro modo de realização, a cepa de levedura de acordo com a presente invenção permite notadamente produzir o esteróide procurado (notadamente o cortisol), em quantidade superior a 10 mg/l, de preferência superior a 50 mg/l, de modo mais preferido 80 mg/l, de modo mais preferido 100 mg/l, de modo o mais preferido 200 mg/l.

[0049] Em um outro modo de realização, o esteróide de interesse

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12/65 (de modo preferido a hidrocortisona) está presente em uma proporção superior a 20%, de preferência 25%, de modo mais preferido 30%, de modo mais preferido 35%, de modo mais preferido 40%, de modo mais preferido 50%, do modo o mais preferido 65% do total dos esteróides produzidos pela cepa de acordo com a invenção (notadamente os intermediários de síntese).

[0050] A fim de que a cepa de levedura de acordo com a presente invenção possa produzir os esteróides de interesse, é necessário que ela apresente modificações genéticas. Assim, a cepa de levedura de acordo com a invenção apresenta pelo menos uma modificação genética escolhida no grupo constituído pela ruptura ou inativação de um gene endógeno, pela introdução de pelo menos um gene heterólogo (notadamente um bloco de expressão com promotor e/ou terminador homólogo e uma parte codificante heteróloga), em uma ou várias cópias, de modo epissomal ou cromossomal.

[0051] De modo preferido, a cepa de levedura de acordo com a invenção apresenta várias (pelo menos quatro) modificações genéticas tais como enunciadas acima.

[0052] Assim, certos genes endógenos da levedura são favoravelmente inativados ou rompidos. É possível inativar ou romper os genes pela introdução, na sequência codificante, de um gene exógeno (notadamente um bloco de expressão com promotor e/ou terminador homólogo e uma parte codificante heteróloga) tal como descrito mais embaixo, e/ou de um marcador de seleção. Também é possível modificar os promotores desses genes a fim de reduzir o nível de expressão.

[0053] O gene de levedura ATF2 (Cauet et al., 1999) codifica para uma acetil transferase que utiliza a pregnenolona como substrato e sua ruptura permite suprimir essa reação parasita de acetilação, cujo produto não pode nesse caso ser utilizado, e aumentar assim o

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13/65 rendimento em esteróide de interesse. Assim, os rendimentos podem ser multiplicados por valores compreendidos entre 3 e 7 depois de inativação do gene ATF2.

[0054] Os genes GCY1 e YPR1 codificam para as aldo-cetoredutases. Esses genes são vantajosamente inativados ou rompidos. Esses dois genes fazem parte de uma família de 6 genes mais ou menos homólogos e que se supõe codificar todos os seis para as aldoceto-redutases. No entanto, os produtos desses dois genes são os mais ativos nos substratos aqui considerados, notadamente GCY1,e a inativação dos mesmos é portanto extremamente interessante para a obtenção da hidrocortisona.

[0055] Assim como precisado acima, é interessante inativar o gene

ERG5, a fim de acumular um substrato que apresenta uma estrutura que é mais a próxima possível da estrutura do colesterol. No entanto, foi mostrado que a levedura de acordo com a invenção pode apesar de tudo produzir os esteróides de interesse apesar da atividade desse gene. No entanto, a fim de otimizar os rendimentos, pode ser útil inativar o mesmo por mutação, deleção e/ou inserção.

[0056] É possível também, sem que isso seja realmente crítico para o sucesso global da produção de esteróides com a levedura de acordo com a invenção, inativar outros genes, tais como ARE1, ARE2, ADE2 ou ATF1. Esses genes codificam todos eles para as proteínas, cuja ausência pode melhorar o rendimento global de síntese do esteróide de interesse.

[0057] Assim como descrito no artigo de Duport et al., precedentemente citado (Duport et al., 1998), é indicado que a presença de um bloco de expressão com promotor e/ou terminador homólogo e uma sequência que codifica para a A7-redutase é útil pelo fato de que ela permite efetuar a dessaturação da dupla ligação 7-8 do ergosterol e de seus derivados, e obter assim um ou vários

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14/65 precursores com estrutura mais próxima da estrutura do colesterol, substrato de partida para a produção de pregnenolona. Assim, é vantajoso que a cepa de levedura de acordo com a presente invenção contenha esse bloco de expressão. Em um caso especial, o dito bloco de expressão da A7-redutase é integrado no genoma da levedura, de modo preferido ao lócus do gene ADE2, levando através disso à ruptura do gene ADE2. O promotor utilizado para a transcrição é um promotor induzível tal como o GAL10-CYC1, ou um promotor constitutivo, tal como o promotor GAL10-GAL10-CYC1 que é desregulado na cepa CA10 descrita em Duport et al., 1998. A proteína utilizada é preferencialmente proveniente de Arabidopsis thaliana (mas pode também ser proveniente de uma espécie de mamífero), o cDNA sendo clonado sob a forma nativa (DNA complementar justo após uma metionina de iniciação da tradução), e sob o controle de um terminador de transcrição clássico na levedura tal como PGK1.

[0058] Deve-se notar que a atividade do gene A7-redutase na levedura foi descrita por Lecain et al., 1996, cujo conteúdo técnico (notadamente as sequências do gene A7-redutase e as construções são métodos operatórios) é incorporado como referência no presente pedido.

[0059] A primeira etapa é a produção de pregnenolona, obtida depois de introdução, na levedura, das enzimas que permitem transformar normalmente o colesterol em pregnenolona. No presente caso, trata-se da enzima que permite a clivagem da cadeia lateral (P450scc para a clivagem de parte da cadeia com duas co-enzimas (adrenodoxina, ADX, e adrenodoxina redutase, ADR). A transformação da levedura com esses blocos de expressão respectivos está descrita em Duport et al., 1998, precedentemente citado.

[0060] É utilizado de preferência um DNA complementar que codifica para as proteínas maduras, com uma metionina acrescentada

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15/65 na extremidade N-terminal para permitir a tradução. São utilizados promotores tais como o promotor híbrido GAL10-CYC1, ou o promotor TEF1, para assegurar a transcrição dos cDNA. São utilizados os terminadores clássicos, notadamente o terminador PGK1.

[0061] Os diferentes cDNA que codificam para as proteínas

P450scc, ADR ou ADX podem ser de origem de um vertebrado, por exemplo humana ou bovina, mas também rato ou peixe. Os genes que codificam para essas proteínas são de preferência colocados em plasmídeos, é preferido para P450SCC e ADX um plasmídeo de cópias múltiplas com pequeno ou grande número de cópias, notadamente derivado de um plasmídeo 2 mícron de levedura, enquanto que é utilizado de preferência um plasmídeo de uma cópia ou de pequeno número de cópias para a expressão de ADR. O bloco de expressão para ADR pode também ser integrado no cromossomo da levedura. Isso permite controlar a expressão do ADR, pois parece que expressão demais prejudique a atividade scc procurada.

[0062] As proteínas são de preferência expressas para poder exercer sua atividade no citosol.

[0063] A etapa seguinte é a conversão da pregnenolona em 17 ahidróxi progesterona, pela ação conjugada da 17a-hidroxilase (P450c17) e da 3p-OH-esteróide desidrogenase (3p-HSD).

[0064] Para a expressão dessas duas proteínas, são utilizados de preferência promotores fortes, tais como TEF1, TDH3, GAL10-CYC1. No entanto, um promotor mais fraco tal como CYC1, também pode convir. Os terminadores utilizados são clássicos, notadamente provindo dos genes PGK1 ou NCP1. São expressos os DNA complementares que codificam para as proteínas completas. A espécie de origem dessas proteínas não parece modificar os resultados obtidos, assim é possível utilizar proteínas de origem humana (notadamente um ou outro dos dois isótipos da 3β-HSD),

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16/65 bovina, ou de outros organismos (notadamente de peixes). Trata-se, para essas duas proteínas, de obter a melhor expressão possível, e é possível portanto expressar as mesmas em plasmídeos de uma ou de cópias múltiplas com pequeno ou grande número de cópias, ou tendose integrado os blocos de expressão em pelo menos um cromossomo da levedura.

[0065] Busca-se em seguida a conversão da 17a-hidróxi progesterona em desoxicortisol, por intermédio da P450c21, que permite uma hidroxilação em 21. Trata-se de expressar a proteína, a partir de ser cDNA, do melhor modo possível. Para fazer isso, é utilizado um promotor forte (TEF1, TDH3, GAL10-CYC1...), e mesmo o promotor CYC1, e um terminador clássico (notadamente PGK1) para conceber a unidade transcricional. Essa última é colocada em um plasmídeo de uma ou de cópias múltiplas, com pequeno ou grande número de cópias, ou então integrada no genoma da levedura. Deve ser notado que a espécie de origem parece importante aqui, e que é preferível utilizar a P450c21 de origem humana.

[0066] O desoxicortisol é em seguida convertido em cortisol, sob a ação do sistema P450c11, que contém a P450c11, que permite a hidroxilação em 11-β, uma adrenodoxina e uma adrenodoxina redutase, como co-fatores.

[0067] Os inventores do presente pedido mostraram que os resultados obtidos eram melhores quando esse último sistema é expresso na membrana interna das mitocôndrias das leveduras. Assim, é interessante produzir proteínas de fusão, que portam como precursor a sequência de endereçamento mitocondrial do precursor da proteína Cox6p da levedura.

[0068] É utilizado de preferência também o cDNA que codifica para as proteínas maduras. A proteína P450c11 é assim a proteína de origem humana, bovina ou uma proteína híbrida humana-bovina. Essa

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17/65 última construção é a forma preferida para a execução da invenção. O gene utilizado na unidade transcricional está de preferência sob o controle do promotor CYC1. É interessante posicionar um íntron de βglobina de coelho e um terminador do gene do hormônio de crescimento humano em 3' da sequência codificante. A unidade transcricional é colocada de preferência em um plasmídeo de cópias múltiplas.

[0069] A adrenodoxina é utilizada sob sua forma madura, colocada com uma sequência de endereçamento para as mitocôndrias, por exemplo escolhida entre aquelas dos precursores das proteínas Cox6p, Cox4p, fumarase, ARH1p, F9 ATPase, e sob o controle de um promotor escolhido notadamente entre TDH3, TEF1, CYC1. Prefere-se uma proteína de origem bovina ou humana. É conveniente colocar um terminador em uma unidade transcricional, que pode ser PGK1. Expressa-se o bloco de expressão de preferência a partir de um plasmídeo de cópias múltiplas.

[0070] A proteína que desempenha o papel de adrenodoxina redutase é a proteína ARH1p, endógena da levedura, que é normalmente expressa nas mitocôndrias do hospedeiro. De modo preferido, transforma-se no entanto a levedura de tal modo para que a cepa hospedeira contenha uma cópia natural do gene ARH1 e uma segunda cópia do gene ARH1 sob o controle do promotor CYC1. A atividade dessa proteína é indispensável para obter o efeito procurado, e foi mesmo observado que a inativação do gene é letal para a levedura (Lacour et al., 1998). É conveniente notar que a superexpressão desse gene parece tóxica para o organismo, e que o promotor escolhido deve permitir um nível de expressão que leve à atividade 11-β hidroxilase procurada sem der deletério para a levedura. De maneira surpreendente, foi de fato mostrado que uma expressão do gene ARH1 em um nível superior ao nível de expressão fisiológico

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18/65 aumenta de modo significativo a quantidade de esteróides produzidos. No entanto como foi dito acima, essa expressão não deve ser muito grande para obter o efeito desejado. Assim, se uma expressão da proteína ARH1 em um nível superior em relação a um nível fisiológico é desejável, é preciso tomar cuidado para não superexpressar demais essa proteína sob pena de perder esse aumento de produção em esteróides. A título de exemplo, uma integração do cassete de expressão para ARH1, que compreende como promotor o promotor CYC1, ao nível do lócus LEU2 de S. cerevisiae dá níveis de expressão e resultados satisfatórios. Ao contrário a integração ao mesmo lócus de um cassete que compreende o promotor TEF1, reconhecido como muito mais forte do que o promotor CYC1, dá resultados menos interessantes.

[0071] Assim, são introduzidas de preferência duas cópias de uma unidade transcricional que codifica para a proteína co-enzima ADX, uma dentre elas tendo uma atividade no exterior das mitocôndrias e notadamente no citosol, a outra tendo uma atividade nas mitocôndrias da célula hospedeira.

[0072] Também é possível introduzir outros genes, notadamente os genes que codificam para as proteínas que têm uma atividade NADPH P450 redutase, tais como NCP1 (redutase de levedura também chamada CPR1), ATR1 ou ATR2 (redutases de plantas), redutase humana. Essas proteínas melhoram as atividades P450c17 e P450c21. É utilizado ou o promotor endógeno (NCP1), ou coloca-se os DNA que codificam para as proteínas sob o controle de promotores tais como GAL10-CYC1, CYC1, TEF1...

[0073] Também é possível introduzir o gene TGL1, que codifica para uma proteína que tem uma atividade de desesterificação, sob o controle de um promotor forte tal como GAL10-CYC1, em um plasmídeo de cópias múltiplas ou de uma cópia. Isso permite reduzir o

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19/65 efeito das reações de esterificação parasitas dos esteróis que podem subexistir mesmo depois da inativação de ATF2, e notadamente aquelas produzidas pelo produto dos genes ARE1 e ARE2.

[0074] Também é possível acrescentar um plasmídeo que expressa o citocromo b5 de levedura ou uma outra espécie, que é um co-fator em várias reações definidas acima.

[0075] Também é possível, quando se deseja produzir DHEA, introduzir um plasmídeo que codifica para a desmolase (P450 17α), com pequeno ou grande número de cópias, sob o controle de um promotor tal como GAL10-CYC1, CYC1, TEF1, com um terminador PGK1.

[0076] Também é possível introduzir um cDNA que codifica para o citocromo P450c17 que tem uma atividade liase, por exemplo aquele de origem humana, na presença de um excesso de NADPH P-450 redutase, como as redutases de mamíferos, NCP1, ATR1, ou ATR2. Essas unidades transcricionais utilizam de preferência um promotor forte.

[0077] Finalmente, é possível restaurar a atividade dos genes endógenos ERG6 e ERG2, inibidos pela pregnenolona, colocando-se os mesmos sob o controle de um promotor constitutivo forte.

[0078] Também é possível introduzir outros genes heterólogos, que codificam notadamente para uma proteína de atividade 24,25 esterol redutase, ou o gene HMG1, presente na via de síntese do colesterol no ser humano. Também é interessante introduzir o gene MDR1 humano, que codifica para uma bomba não inibida pela acumulação dos esteróis anormais que aparecem em razão da inibição do ERG6 pela pregnenolona. Isso permite expulsar esses produtos dos quais uma acumulação muito grande poderia se revelar tóxica para a célula hospedeira.

[0079] Também é possível superexpressar o gene PDR12 da

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20/65 levedura que terá um efeito de desintoxicação para os esteróides que podem inibir o crescimento da levedura.

[0080] Está entendido que quando se fala de gene acima, entende-se não somente o fragmento de DNA que codifica para a proteína que apresenta a atividade procurada (e notadamente o fragmento de cDNA que representa em especial as formas maduras), mas também os promotores (notadamente TEF1, GAL10-CYC1, CYC1, TDH3) e os terminadores (em especial PGK1). Essas unidades transcricionais são introduzidas preferencialmente em plasmídeos de pequeno ou grande número de cópias, ou integrados no cromossomo da levedura.

[0081] Também está entendido que, de acordo com o objetivo procurado, e notadamente o esteróide que se deseja produzir, é possível só introduzir alguns dos genes que codificam para as diferentes proteínas a cada etapa, e fornecer um intermediário à levedura a fim de obter um esteróide a jusante na cadeia de metabolismo.

[0082] Também é fácil não introduzir os genes que permitem obter os produtos situados muito a jusante, e poder portanto parar relativamente alto na cadeia do metabolismo.

[0083] As leveduras utilizadas para a execução da presente invenção são de preferência:

- a cepa FY1679-28c, descrita em Duport et al., 1998, que possui o genótipo (MATa, rho^-, ura3-52, trp1A63, leu2A1, his3A200, GAL2,fen1). Essa cepa também foi descrita por Thierry etal., 1990.

- a cepa FY1679-18b, que possui o genótipo (MATa, rho^-, ura3-52, trp1A63, leu2A1, his3A200, GAL2,fen1).

[0084] Essas duas cepas possuem, portanto, um genótipo idêntico, e um sinal oposto.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

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21/65 [0085] Figura 1: Representação esquemática de uma via de biossíntese da hidrocortisona tal como ela pode ser obtida de acordo com a invenção.

[0086] Figura 2: Representação esquemática de construção de cepas de leveduras exemplificadas de acordo com a invenção.

[0087] Figura 3: Mapa do plasmídeo pCV29. PGK term: terminador

PGK. GAL10/CYC1 prom: promotor GAL10/CYC1. HGH term: terminador do gene do hormônio de crescimento humano. Íntron βglobin: íntron do gene da β-globina de coelho. CYC1 prom: promotor CYC1. PGK term: terminador PGK. S. cerevisiae 2 mícron: origem de replicação 2 mícron de S. cerevisiae. Cox6pré: pré-sequência da citocromo oxidase sob unidade 6. Bovino/humano P450 11 β; cDNA fundido bovino/humano da P4501^. mat-ADX: forma madura do ADX com uma metionina em NH2 terminal. E.coli replicon: Replicon E.coli.

[0088] Figura 4: Mapa do plasmídeo pCC12. CYC1 prom:

promotor CYC1. PGK term: terminador PGK. ARS CEN: origem de replicação cromossômica de S. cerevisiae. E.coli replicon: Replicon E.coli. TDH3 prom: promotor TDH3. 3β-HSDH: cDNA da 3β hidróxi esteróide desidrogenase. matADR: forma madura da ADR precedida por uma metionina.

[0089] Figura 5: Mapa do plasmídeo pFM10. CYC1p: promotor

CYC1. P4501^; cDNA fundido bovino/humano da P4501^. ADE2: gene ADE2 da levedura. TDH3p: promotor TDH3. 3f-HSD: cDNA da 3β hidróxi esteróide desidrogenase. R1: base de recombinação cuja sequência é dada em SEQ ID N° 39. GAL10/CYC1p: promotor GAL10/CYC1. matADX: cDNA que codifica para a forma madura do ADX. URA3: gene URA3 da levedura. P450SCC: cDNA que codifica para a forma madura do P450SCC (CYP11A1). Origem 2 mícron: origem de replicação 2 mícron de S. cerevisiae. R2: base de recombinação cuja sequência é dada em SEQ ID N° 40.

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EXEMPLOS [0090] Os exemplos abaixo descrevem um modo de execução da presente invenção e não devem ser considerados como limitando a invenção.

[0091] Parte-se, para as construções das cepas de levedura

FY1679-28c e FY1679-18b descritas acima.

Exemplo 1: Ruptura do gene YPR1 [0092] A construção da interrupção do gene YPR1 (YDR368w) pelo gene URA3 no plasmídeo pPOLYIII foi obtida por 4 PCR sucessivas. Por um lado três PCR independentes foram realizadas para obter a parte 5' do gene YPR1 (PCR 5), o gene URA3 funcional bordejado por sequências YPR1 (PCR 6), a parte 3' do gene YPR1 (PCR 7).

[0093] O DNA da PCR5 foi obtido por amplificação em uma matriz de DNA genômica com os oligonucleotídeos OTG11314 (SEQ ID N° 1) e OTG11315 (SEQ ID N° 2) assim como o DNA da PCR7 é obtido por amplificação com o auxílio dos oligonucleotídeos OTG11316 (SEQ ID N° 3) e OTG11317 (SEQ ID N° 4) na mesma matriz.

[0094] O gene URA3 flanqueado de região YPR1 5' e 3' é amplificado com o auxílio dos oligonucleotídeos OTG11463 (SEQ ID N° 5) e OTG11464 (SEQ ID N° 6) em uma matriz pTG10054 descrito em Degryse et al., 1995 incorporado aqui como referência no que diz respeito à descrição desse plasmídeo.

[0095] Os produtos das PCR5, PCR6 e PCR7 foram misturados de modo equimolecular e depois amplificados por PCR com o auxílio dos oligonucleotídeos OTG11314 (SEQ ID N° 1) e OTG11317 (SEQ ID N°

4) para obter um produto de PCR8.

[0096] Esse produto de PCR8 foi digerido por meio da enzima

XhoI e depois sub-clonado no plasmídeo pPOLYIII (descrito por Lathe et al., 1987 e incorporado aqui como referência no que diz respeito à

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23/65 descrição desse plasmídeo) digerido por meio de XhoI para dar o plasmídeo pTG12011. A orientação da inserção no plasmídeo pPOLYIII foi determinada por digestão pelas enzimas NcoI e EcoRI.

[0097] O plasmídeo pTG12011 que permite a ruptura do gene parasita YPR1 pelo gene URA3 é digerido por meio da enzima XhoI. O produto da digestão é utilizado para transformar a cepa FY1679-18b utilizando-se para isso o método com cloreto de lítio bem conhecido pelo profissional. Os transformantes são selecionados em um meio desprovido de uracila. Os transformantes são analisados por amplificação por PCR utilizando-se para isso os oligonucleotídeos que serviram para a construção do plasmídeo pTG12011.

[0098] Os clones positivos nesse teste são em seguida triados pelo método de bioconversão do 170H progesterona descrito mais abaixo em presença de glicose como fonte de carbono. A capacidade de bioconversão é analisada em HPLC como descrito por Dumas et al., 1996 e Degryse et al., 1999 cujos conteúdos são incorporados como referência ao presente pedido, notadamente as explicações dos estudos de bioconversão ou como descrito em Kuronen et al., 1999. Um clone TGY195#4 é selecionado para novas caracterizações. A cepa TGY195#4 é transformada utilizando-se para isso ao mesmo tempo o plasmídeo YRp7 (Parent et al., 1985, que é incorporado como referência no que diz respeito à descrição desse plasmídeo) (1 pg) e 5 pg de plasmídeo pTG12045 (descrito mais abaixo) digerido por meio de NotI. As cepas transformadas são selecionadas em um meio desprovido de triptofano. Colônias (678 colônias) são transplantadas em um meio que contém triptofano (para se desembaraçar do plasmídeo YRp7) e em um meio que contém triptofano e o 5 flúororotato (5F0) para selecionar as colônias que perderam o gene URA3 que interrompe o gene YPR1.

Exemplo 2: Construção de diferentes plasmídeos

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24/65 [0099] Para a superexpressão da proteína P450c21 na levedura dois tipos de promotores foram utilizados, TEF1 (Transcription elongation factores) e TDH3 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 3). Em todos os casos, o terminador de transcrição é o terminador PGK. Nesses plasmídeos, o fragmento SalI, MluI porta o cDNA da P450c21 humana.

a) Construção dos plasmídeos pTG10470 e pTG10469 [00100] O plasmídeo pTG10289 foi obtido por modificação do pMAc21 (Wu et al., 1991) por digestão com KpnI, MluI e introdução do oligonucleotídeo OTG5868 (SEQ ID N° 27).

[00101] O cDNA desse plasmídeo provém da American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Maryland, USA) sob o nome de pc21/3c. É o fragmento EcoRI-BamHI de 1,6 Kb que serviu de base para a construção dos diferentes plasmídeos. As modificações trazidas estão descritas no artigo acima e no artigo de Hu et al., 1990.

[00102] Nessa manobra, a parte não codificante da P450c21 do plasmídeo pMAc21 que contém o cassete de expressão da P450c21 foi eliminada assim como o sítio KpnI que se encontrava lá.

[00103] O plasmídeo pTG10292 foi obtido por transferência do cDNA c21 humano (fragmento SalI, MluI) do plasmídeo pTG10289 para o plasmídeo pTG10031 (descrito em Degryse et al., 1995, que é incorporado como referência ao pedido) com o auxílio dos sítios SalI e MluI.

[00104] O plasmídeo pTG10475 foi obtido por PCR e recombinação. De fato a partir do plasmídeo pTG10292, um fragmento do cDNA P450c21 humano representando aproximadamente 250 nucleotídeos foi amplificado com o auxílio dos oligonucleotídeos OTG7410 (SEQ ID N° 7) e OTG5927 (SEQ ID N° 8). Esse fragmento representa sequência codificante, da P450c21 humana de um sítio SalI e da sequência AAAA.

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25/65 [00105] Esse fragmento foi digerido por meio de Sa/I e depois ligado no fragmento linear de pTG10292 digerido por meio de Sa/I e em seguida uma experiência de recombinação foi realizada na cepa BJ5183 descrita por Degryse et a/., 1995.

[00106] O plasmídeo obtido pTG10475 porta um cDNA da P450c21 com uma sequência codificante idêntica àquela do cDNA natural, contrariamente ao plasmídeo pMAc21, em um fragmento compatível com os vetores utilizados geralmente pelos inventores, ou melhor um fragmento bordejado pelos sítios de restrição Sa/I e M/uI. Esse fragmento possui o ambiente seguinte em torno do códon ATG de iniciação da tradução GTCGACAAAAATGCTGCTCCTGGGCCTGC TGC (SEQ ID N° 9).

[00107] A partir desse plasmídeo o fragmento Sa/I, M/uI que porta o cDNA da P450c21 humana foi transferido para o plasmídeo pTG10158 (Degryse et a/., 1995) por clonagem clássica para dar o plasmídeo pTG10472.

[00108] Esse mesmo fragmento Sa/I, M/uI do plasmídeo pTG10472 foi em seguida transferido por clonagem clássica para o plasmídeo pTG10085 (Degryse et a/., 1995) para dar o plasmídeo pTG10469. Esse plasmídeo possui, portanto, o cDNA da P450c21 humana sob o controle do promotor TEF1, com o terminador PGK1.

[00109] Esse mesmo fragmento que porta o cDNA P450c21 em um fragmento de restrição Sa/I e M/uI é transferido para o plasmídeo pTG10092 por recombinação na cepa BJ5183 para dar o plasmídeo pTG10470 (Degryse et a/., 1996).

[00110] O plasmídeo pTG10470 porta, portanto, o cDNA da P450c21 humana sob o controle do promotor TEF1 e de um terminador PGK1 com um marcador de seleção URA3-d com o ambiente do códon iniciador ATG descrito precedentemente.

b) Construção do plasmídeo pTG12036

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26/65 [00111] O plasmídeo pTG12036 foi construído em 4 etapas a partir do pTG10802. O plasmídeo pTG10801 (que está na origem do plasmídeo pTG10802) é um plasmídeo de tipo pUC no qual uma série de sítios de restrição foi inserida entre os sítios XhoI e XhoI. Essa série de sítios compreende os sítios HindIII, SnabI, ClaI e SpeI.

[00112] Entre os sítios HindIII e ClaI, o cassete HindIII ClaI do pTG10470 que compreende o promotor TEF1, o cDNA P450c21 humano e o terminador PGK1 foi inserido entre os sítios HindIII e ClaI de pTG10801 para dar pTG10802.

[00113] Esse plasmídeo foi em seguida digerido por meio de XhoI e o cassete introduzido é, portanto, deletado para introduzir um fragmento de PCR bordejado por sítios XhoI. Esse fragmento de 2,5 Kb provém da amplificação pelo par de oligonucleotídeos OTG11844 (SEQ ID N° 10) e OTG11845 (SEQ ID N° 11) no plasmídeo pTG12010#40 (conforme abaixo) para obter um fragmento bordejado por XhoI que contêm o gene GCY1 interrompido pelo gene URA3 bordejado em 5' por um sítio de restrição ClaI.

[00114] Esse fragmento foi clonado entre os sítios XhoI do plasmídeo pTG10802 para obter o plasmídeo pTG12035. Com o objetivo de introduzir o sítio HindIII que falta, o plasmídeo pTG12010#36 foi utilizado. Esse plasmídeo é essencialmente idêntico ao pTG12010#40, mas possui um sítio HindIII em 3' do gene URA3 no limite com o gene GCY1, mas não possui sítio ClaI em 51 do gene URA3 na junção com o gene GCY1 (conforme abaixo). Por recombinação in vivo em E. coli, entre o fragmento NcoI BamHI de 2,2 Kb que porta de 5' para 3' um fragmento do gene URA3, o fragmento 3' do gene GCY1 e finalmente uma parte do plasmídeo pTG12035 ou melhor o grande fragmento StuI, AflII de 4,45 Kb. Obtém-se o plasmídeo pTG12036.

[00115] O plasmídeo obtido pTG12036 possui o gene GCY1

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27/65 interrompido pelo gene URA3 bordejado pelos sítios ClaI e HindIII respectivamente em 5' e 3'. Esse fragmento é em seguida substituído pelo cassete de expressão da P450c21 portado pelo fragmento 2,33 Kb ClaI, HindIII do plasmídeo pTG10469 (ver mais acima) para obter o plasmídeo pTG12086.

c) Construção do plasmídeo pTG12045 [00116] O sítio único SphI do plasmídeo pPOLYIII é destruído por inserção do par de oligonucleotídeos complementares OTG11975 (SEQ ID N° 12) e OTG11976 (SEQ ID N° 13).

[00117] O sítio SphI do pPOLYIII é destruído e substituído por um sítio ClaI para dar o plasmídeo pTG12040. No plasmídeo pTG12040 entre os sítios únicos ClaI e EcoRI, é introduzido um fragmento de DNA genômico ClaI EcoRI que corresponde à parte 3' de 0,7 Kb do gene YPR1 obtido por amplificação com os oligonucleotídeos OTG11981 (SEQ ID N° 14) e OTG11982 (SEQ ID N° 15) para dar o plasmídeo pTG12041.

[00118] Nesse plasmídeo pTG12041 de 2,84 Kb, a parte 5' do gene YPR1 (0.66 Kb) amplificada pelos oligonucleotídeos OTG11314 (SEQ ID N° 1) e OTG11980 (SEQ ID N° 16) a partir de DNA genômico de levedura selvagem é clonada sob a forma de um fragmento XhoI HindIII entre os sítios SalI e HindIII do plasmídeo pTG12041.

[00119] Obtém-se o plasmídeo pTG12042 de 3,5 kb. Esse plasmídeo porta o gene YPR1 interrompido pelos sítios ClaI e HindIII. Entre esses sítios o cassete do citocromo P450c21 é clonado sob a forma de um fragmento ClaI HindIII de 2,33 Kb que provém do plasmídeo pTG10469. Obtém-se assim o plasmídeo pTG12045.

d) Construção dos plasmídeos pTG12010#36 e #49 [00120] O plasmídeo pTG12010 foi construído sobre uma base do plasmídeo pUC19 (Yanisch-Perron et al., 1985) enquanto que o plasmídeo pTG12011 foi construído sobre uma base do plasmídeo

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28/65 pPOLYIII (Lathe et al., 1987).

[00121] A construção da ruptura do gene GCY1 pelo gene URA3 no plasmídeo pUC19 foi obtida por quatro amplificações por PCR sucessivas. Por um lado três PCR independentes foram realizadas para obter a parte 5' do gene GCY1 (PCR1), o gene URA3 funcional bordejado por sequências GCY1 (PCR2), a parte 3'1 do gene GCY1 (PCR3).

[00122] As partes 3' e 5' do gene GCY1 com o auxílio dos pares OTG11285, OTG11286 e OTG11287, OTG11289 (respectivamente

SEQ ID N° 17 a SEQ ID N° 20) em uma matriz de DNA genômico da cepa FY1679-28c.

[00123] O gene URA3 flanqueado de sequências GCY1 (de modo a obter uma deleção de uma parte da sequência codificante do gene GCY1) é amplificado com o auxílio dos oligonucleotídeos OTG11305 (SEQ ID N° 21) e OTG11306 (SEQ ID N° 22) a partir de uma matriz plasmídeo pTG10054 linearizado (Degryse et al., 1995).

[00124] As condições de tampão e de concentração em matriz e sementes para a amplificação são descritas pelo produtor ou fabricante da enzima Taq DNA polimerase, e em especial para a enzima elongase desenvolvida por Life Technologies. Os ciclos de temperaturas são os seguintes: um primeiro ciclo de 6'30 para desnaturar semente e matriz e depois 30 ciclos de 30 s a 93°C, 2 minutos a 54°C e 3 minutos a 68°C, o último ciclo é de 5 min a 72°C. Os produtos PCR1, PCR2 e PCR3 são misturados de modo equimolecular e amplificados de novo com o auxílio dos oligonucleotídeos OTG11285 (SEQ ID N° 17) e OTG11289 (SEQ ID N° 20). O produto final PCR4 com um tamanho de 2,9 Kb é em seguida sub-clonado entre os sítios de restrição KpnI e BamHI do plasmídeo pUC19 para obter o plasmídeo pTG12010.

[00125] A estrutura do plasmídeo foi verificada por perfil de

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29/65 restrição e sequenciamento nucleotídico das extremidades.

[00126] A clonagem do pTG12010 permitiu de fato obter duas versões desse plasmídeo, a versão pTG12010#40 (pTG12040 clone 40) e pTG12010#36. A vontade inicial era obter o gene GCY1 interrompido pelo gene URA3 bordejado pelos sítios de ClaI e HindIII respectivamente em 5' e em 3' do gene. De fato dois plasmídeos diferentes foram obtidos, que diferem unicamente pela presença ou pela ausência de sítios ClaI e HindIII nas extremidades do gene URA3. O plasmídeo pTG12010#40 possui um sítio de restrição HindIII na extremidade 3' do gene URA3 mas nenhum sítio ClaI em 5'. O plasmídeo pTG12010#36 não possui sítio HindIII na extremidade 3' mas possui um sítio ClaI na extremidade 5' do gene. Essa propriedade é utilizada para obter o plasmídeo que possui o gene URA3 bordejado pelos sítios HindIII e ClaI que interrompe a sequência codificante de GCY1.

e) Construção do plasmídeo pTG12086 [00127] Esse plasmídeo serve para a integração de um cassete de expressão para a P450c21 assim como para a ruptura do gene GCY1 ao mesmo tempo. Esse plasmídeo foi construído a partir do plasmídeo pTG12036 e do plasmídeo pTG10614.

[00128] A construção do plasmídeo pTG10614 foi realizada como se segue. Esse plasmídeo foi construído a partir do pTG10212 (Degryse et al., 1995) que é um plasmídeo de expressão de levedura baseado em um promotor TDH3, um terminador PGK1 e um marcador de seleção URA3-d.

[00129] Por recombinação homóloga em E. coli, o marcador de seleção é substituído pelo marcador de seleção do plasmídeo pTG10054 (Degryse et al., 1995), para fazer isso o fragmento MluI do pTG10054 de 2,1 Kb que contém o marcador URA3 flanqueado por sequências de recombinação é recombinado com o grande fragmento

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HindIII de pTG10212 para dar o plasmídeo pTG10610 que possui as mesmas características que pTG10212 (Degryse et al., 1995), com um marcador URA3 na mesma orientação que pTG10054.

[00130] O fragmento SalI MluI que porta o cDNA do citocromo

P450c21 humano do plasmídeo pTG10472 (conforme acima) é transferido para o plasmídeo pTG10610 para dar o plasmídeo pTG10614.

[00131] O fragmento ClaI Hind\W desse plasmídeo contendo de 5' para 3', o promotor TDH3, o cDNA da P450c21 humana bordejado por sítios SalI e MluI e depois o terminador PGK1 é transferido para o plasmídeo pTG12036 para dar o plasmídeo pTG12086 que contém portanto a sequência do gene GCY1 interrompido pelo cassete de expressão TDH3 do citocromo P450c21 humano.

f) Construção do plasmídeo pTG12048 [00132] O plasmídeo pTG12048 foi construído a partir dos plasmídeos pFL26CD, pTG10925 e pTG10953.

[00133] O pTG10953 é idêntico ao plasmídeo descrito em Lacour et al., 1998, mas o promotor TEF1 que é portado por um fragmento ClaI SalI é substituído por um promotor CYC1 (Degryse et al., 1995). O cassete de expressão é portado por um fragmento de DNA NotI-NotI.

[00134] O plasmídeo pTG10925 foi construído a partir de pFL26CD descrito por Duport et al., 1998. O plasmídeo contém um fragmento genômico da levedura que compreende os genes LEU2 e NFS1 orientado de 5' para 3' e 3' e 5' respectivamente. Um cassete de expressão da ADR bordejado por sítios NotI foi introduzido na região intergênica para dar o plasmídeo pTG10925. Esse cassete (TEF1 ADR bovina madura - terminador PGK1) foi substituído por um novo cassete que compreende o gene ARH1 sob controle do promotor CYC1 e do terminador PGK1 para dar o plasmídeo pTG12048. Nesse plasmídeo, o gene LEU2 e o cassete de expressão estão na mesma

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31/65 orientação transcricional.

Exemplo 3: Construção da cepa TGY212#1 [00135] Uma colônia é selecionada na triagem descrita no exemplo

1. Ela é chamada de TGY212#1. Essa colônia é submetida a uma experiência de bioconversão como descrito precedentemente com 100 μg/ml de substrato 170H progesterona, a cepa é colocada para crescer em um meio mínimo complementado com aminoácidos necessários e uracila.

[00136] Essa cepa é capaz de converter a 170H progesterona em 11-deoxicortisol com uma eficácia da ordem de 47% em 24 horas com uma pequena produção de 4 pregneno 17α,20α diol 3 ona nessas condições (< 0.5%). Em certas condições (meio rico definido de tipo Kappeli com galactose como fonte de carbono e início da cultura em alta densidade: D0 600 nm = 5), a capacidade de redução da cetona é aumentada para atingir 11% do substrato de partida com uma capacidade de bioconversão reduzida a 1,5% do substrato de partida.

[00137] Nessas condições, a presença provável do gene GCY1 constitui um incômodo para a bioconversão da 170H progesterona. Foi portanto decidido executar uma ruptura no gene GCY1 para impedir sua atividade.

Exemplo 4: Construção da cepa TGY243 [00138] Para fazer isso, a cepa TGY212#1 foi transformada por 3 μg do plasmídeo pTG12010#36 linearizado pelas enzimas de restrição SphI e EcoRI. Vinte e sete transformantes foram selecionados em um meio mínimo complementado para as auxotrofias de TGY212#1 mas que não contém uracila.

[00139] Essas colônias foram submetidas a testes de bioconversão em um meio mínimo complementado com galactose como fonte de carbono pois ela é um indutor conhecido de GCY1. Todos os clones TGY243 apresentavam uma capacidade de converter a 170H

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32/65 progesterona em 11-deoxicortisol sem por causa disso produzir quantidades detectáveis de 4 pregneno 17α,20α diol 3 ona.

[00140] Um clone TGY243#1 foi selecionado para introduzir no lugar do gene URA3 um cassete de expressão para a P450c21 humana.

Exemplo 5: Construção da cepa TGY245 [00141] Essa cepa TGY243#1 é transformada pelo plasmídeo YRp7 (1 pg) descrito por Parent et al., 1985 e pelo plasmídeo pTG12086 linearizado pela enzima XhoI (5 pg).

[00142] O fragmento transformador de pTG12086 contém a sequência codificante de GCY1 interrompida por um cassete de expressão para a P450c21 humana (TDH3::cDNAP450c21 humana: terminador PGK1).

[00143] As colônias que crescem na ausência de triptofano são selecionadas. Essas 381 colônias são em seguida transferidas para um meio que contém triptofano e o 5 flúor-orotato. Uma dezena de colônias são em seguida testadas em um meio rico de tipo YPG complementado com triptofano, histidina, leucina e uracila a uma concentração de 50 pg/ml.

[00144] As cepas são colocadas para converter a 170H progesterona a uma concentração de 100 pg/ml a partir de uma DO 600 nm de 0.1 durante 16 horas.

[00145] Entre esses 10 clones, um clone TGY245#2D é escolhido de acordo com dois critérios, sua capacidade de converter a 170H progesterona em 11-deoxicortisol e em segundo lugar a ausência da formação de 4 pregneno 17α,20α diol 3 ona que indica a ruptura de GCY1.

Exemplo 6: Construção da cepa TGY260 [00146] A cepa foi construída por transformação da TGY245 pelo plasmídeo pTG12048 que permite a superexpressão do gene ARH1

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33/65 no lócus LEU2.

[00147] A cepa TGY260 foi construída a partir da cepa TGY245 que foi transformada pelo plasmídeo pTG12048 linearizado.

[00148] Esse plasmídeo pTG12048 é um plasmídeo de integração intergênica que porta o marcador de seleção LEU2. Nesse plasmídeo, na região entre o gene LEU2 e o gene NFS1 é integrado um cassete de expressão para o gene ARH1 (Lacour et al., op. cit.).

[00149] Esse cassete compreende o promotor CYC1 seguido pelo gene ARH1 e pelo terminador PGK1 bordejado pelos sítios de restrição NotI. Esse plasmídeo pTG12048 foi linearizado pelas enzimas de restrição XhoI e SalI.

[00150] Esse fragmento é utilizado para transformar a cepa TGY245 utilizando-se para isso um método clássico de transformação com cloreto de lítio. As colônias transformantes são em seguida transferidas para um meio que não contém leucina. Uma cepa TGY260 foi selecionada.

[00151] A cepa TGY260 foi depositada na CNCM em 24 de janeiro de 2001 sob o número I-2615.

Exemplo 7: Construção da cepa CDR07matq [00152] A cepa FY1679-28c foi transformada pelo plasmídeo pCD62.1, descrito em Duport et al., 1998 (cujo conteúdo técnico de construção dos plasmídeos e a obtenção das cepas são incorporados como referência ao presente pedido), para dar a cepa CDR01. Essa última é transformada pelo plasmídeo pCD78, também descrito em Duport et al., e obtém-se a cepa CA03.

[00153] O gene ERG5 da dita cepa CA03 é submetido a uma ruptura com um cassete que confere a resistência à higromicina, e obtém-se a cepa CA10.

[00154] Essa cepa é cruzada com uma cepa parente FY1679-18b, e depois colocada para esporular. Os esporos são isolados de acordo

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34/65 com as técnicas clássicas em um meio mínimo complementado para as auxotrofias ou melhor uracila, triptofano, leucina e histidina.

[00155] Os esporos são triados de acordo com dois critérios que são a resistência à nistatina (12 pg/ml em meio mínimo) e a resistência à higromicina (100-150 pg/ml em meio rico). Os esporos que são resistentes a esses dois produtos são em seguida analisados em cromatografia em fase gasosa para a presença de campesterol como esterol principal das membranas. A presença de campesterol nas membranas das cepas acoplada com a ausência de esgosta 5-22 dienol indica o bom funcionamento da Δ7 redutase. Um esporo CDR07 MATa é selecionado de acordo com os critérios acima.

[00156] A cepa CDR07 MATa foi depositada na CNCM em 24 de janeiro de 2001 sob o número I-2616.

Exemplo 8: Construção das cepas UCY2 e UCY4 [00157] Cruza-se as cepas TGY260 e CDR07 MAT a para obter a cepa SB14. Essa cepa é então colocada para esporular e obtém-se as cepas segregantes YCC4 e YCC5 (ver também abaixo).

[00158] Essas cepas são transformadas pelo plasmídeo pLIP5 (ver abaixo) e dão respectivamente as cepas YCC8 e YCC9.

[00159] Essas cepas são transformadas pelo plasmídeo pTG12093 para obter respectivamente as cepas UCY2 e UCY3.

[00160] O gene ATF2 é inativado na cepa UCY2, por utilização de um plasmídeo e de uma seleção com G418, e obtém-se então a cepa UCY4.

Exemplo 9: Construção dos plasmídeos de transformação das cepas UCY2, UCY3 e UCY4

a) Construção do plasmídeo pCV29 [00161] Para a construção do pCV29 (conforme Figura 3), os plasmídeos pTG10767, pTG10022 e pCD63 foram utilizados.

1. Construção do plasmídeo pTG10767

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35/65 [00162] O plasmídeo pTG10767 é um plasmídeo de expressão para a P450c11 de origem humana. Ele contém de fato dois cassetes de expressão um para a P450c11 de origem humana e o outro para a adrenodoxina. Essas duas proteínas são marcadas para serem ativas nas mitocôndrias da levedura S. cerevisiae, pela presença de sequências de endereçamento do precursor do citocromo Cox6p.

[00163] Esse cassete de expressão para a P450c11 de origem humana é bordejado por dois sítios de restrição NotI que permitem transportar o mesmo para os diferentes vetores descritos por Degryse et al., 1995. De 5' para 3', ele compreende, o promotor CYC1 como descrito na publicação acima e depois o cDNA da P450c11 humana modificado como descrito abaixo e finalmente uma parte não codificante de eucarioto superior.

[00164] O cDNA P450c11 humano é aquele descrito por Chua et al., com as seguintes modificações.

[00165] A parte que codifica para o peptídeo sinal no cDNA original foi retirada até o sítio de restrição BglII e substituída. Isso retira pela mesma ocasião 31 aminoácidos da sequência codificante da forma madura do cDNA para dar a sequência protéica seguinte em NH2 terminal (SEQ ID N° 23):

[00166] MLSRAIFRNPVINRTLLRARPGAYHA TRLTKNTFIQSRKYG

TRGAAAPKAVLPFEAMPRCPGNKWMRMLQIWREQGYEDLHLEVH QTFQELGPIFRYDLGGAGMVCVMLPEDVEKLQQVDSLHPHRMSLEP WVAYRQH [00167] Na linha precedente, a parte em itálico corresponde à sequência em aminoácidos da sequência de endereçamento do precursor da citocromo oxidase sob unidade VI de levedura (COX6), a parte em negrito corresponde à parte NH2 terminal da P450c11 bovina (Dumas et al., 1996). A parte sublinhada corresponde ao início da sequência idêntica àquela publicada do cDNA da P45011p1 humana

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36/65 (Kawamoto et al., 1990).

[00168] O cassete NotI que porta o promotor CYC1 e o cDNA quimérico da Ρ45011β1 contém também uma parte não codificante situada em 3' do cDNA. Essa parte não codificante é composta por 3 elementos, uma parte não codificante que provém do cDNA natural e uma parte não codificante que provém do plasmídeo pCMV4 cuja sequência está depositada no Genbank sob o número AF239248 (Anderson et al., 1989). Por outro lado, as únicas partes não codificantes que provêm do pCMV4 terminador do gene do hormônio de crescimento humano e do íntron do gene da β globina de coelho são conservadas no vetor final pCV29.

[00169] No final um fragmento de DNA que porta sítios de restrição NotI contém de 5' para 3' o promotor CYC1, um cDNA quimérico enquadrado por sítios SalI e MluI contendo uma parte que codifica para a pré-sequência da citocromo oxidase fundida a um fragmento da Ρ45011β bovina até a parte que corresponde ao sítio de restrição e depois o final do cDNA corresponde ao cDNA da Ρ45011β humana. A parte não codificante é composta por três de origem de mamífero.

[00170] Esse cassete NotI é transferido para o plasmídeo pTG10359 que é proveniente do plasmídeo pTG10350 (Dumas et al., 1996) digerido pelas enzimas de restrição ClaI e PvuII e religado sobre si próprio.

[00171] Esse plasmídeo pTG10359 possui por outro lado um sítio de restrição único NotI. O plasmídeo pCV29 é um plasmídeo de 3 cassetes que contém os cassetes de expressão para a forma madura da ADX e a forma madura da P450scc e uma forma da CYP11B1 humana marcada com a mitocôndria.

[00172] O plasmídeo pTG10022 é descrito na publicação de Degryse et al., 1995, incorporada como referência no presente pedido, e contém uma origem de replicação 2 mícron para a levedura S.

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37/65 cerevisiae assim como os elementos para a clonagem em E. coli.

[00173] Os sítios de restrição desse plasmídeo foram modificados com os oligonucleotídeos OLIP 174 e OLIP 175 (respectivamente SEQ ID N° 28 e 29) a fim de integrar neles os sítios de restrição AscI e PmeI.

[00174] No sítio de restrição NotI desse plasmídeo, foi introduzido um cassete duplo de expressão do plasmídeo pCD63 descrito por Duport et al., 1998. Esse cassete duplo de expressão contido em um fragmento NotI contém um cassete de expressão para a forma madura da ADX bovina e um cassete de expressão para a forma madura da P450scc bovina que enquadram um marcador de seleção URA3. No sítio único PmeI de extremidades livres desse plasmídeo, o cassete de expressão do citocromo p45011p que contém o cDNA da P45011p humana sob controle dos promotores CYC1 e terminador PGK1 foi introduzido depois de enchimento das extremidades NotI com o DNA polimerase fragmento de Klenow.

[00175] Um dos plasmídeos obtidos pCV29 contém três cassetes de expressão para a ADX, a P450scc (ambas sob a forma madura), assim como uma forma da P45011p humana dirigida para a mitocôndria. Por outro lado esse plasmídeo porta como marcador o gene URA3 enquadrado por dois cassetes de expressão.

b) Construção do plasmídeo pCC12 [00176] O plasmídeo pCC12 (Figura 4) é um plasmídeo replicativo de levedura na base da origem de replicação cromossômica como o ARS1 e de um centrômero CEN (há 16 deles na levedura) ambos de

S. cerevisiae. Esse plasmídeo se replica sob a forma com uma ou duas cópias na levedura.

[00177] Ele foi construído a partir do pFL38C2 que é derivado de pFL38 (Bonneaud et al., 1991, cujo conteúdo é incorporado como referência ao presente pedido, notadamente as descrições dos

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38/65 plasmídeos). Nesse plasmídeo, foi introduzido no sítio HindIII um oligonucleotídeo que contém a sequência de reconhecimento dos sítios NotI, Pad e AscI (OLIP FL SEQ ID N° 24). A orientação do poliligante foi verificada por sequenciamento. Esse plasmídeo porta um marcador de seleção URA3 bordejado por sítios BglII.

[00178] O gene URA3 foi substituído por um gene ADE2 de 2,7 Kb obtido por amplificação por PCR no genoma de FY1679-28c utilizando-se para isso os oligonucleotídeos 5’ADE2090 (SEQ ID N° 37, CGATTCGGATCCACTAGTAACGCCGTATCGTGATTAACG) e 3’ADE2089 (SEQ ID N° 38, CCTCAAGGATCCTCCTGACGTAGCG CTATCCTCGGTTCTG).

[00179] Para fazer isso o plasmídeo pFL 3862 foi digerido pela enzima BglII, o fragmento BglII URA3foi substituído pelo fragmento de

2,7 Kb que contém o gene ADE2. O plasmídeo obtido pAM1 serve de base para a construção do plasmídeo pCC12.

[00180] Construção do plasmídeo a partir do plasmídeo pAM 1: [00181] O plasmídeo pCC12 contém dois cassetes de expressão, um para o 3p-HSDH de origem bovina, o outro para a adrenodoxina redutase também de origem bovina.

[00182] O cDNA da 3p-HSDH bovina foi reclonado por PCR a partir de um banco de cDNA de supra-renais de boi. A sequência codificante do cDNA publicada por Zhao et al., 1989, não foi modificada.

[00183] Os dois oligonucleotídeos acrescentam um sítio SalI e 4 adeninas diante do ATG para dar a sequência GTCGACAAAAATG (SEQ ID N° 25). O sítio MluI está situado ao rés do códon de terminação do cDNA da 3p-HSDH bovina para dar a sequência: fim do cDNA TGACCTGGAGTGACAATGACGCGT (SEQ ID N° 26). A sequência reconhecida pela enzima MluI é ACGCGT.

[00184] O cDNA é transferido sob a forma de um fragmento SalI, MluI para o plasmídeo pTG10212 para dar o plasmídeo pCC4. Esse

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39/65 plasmídeo possui portanto um fragmento NotI que contém o cDNA da 3p-HSDH em torno e um promotor TDH3 e um terminador PGK1, respectivamente em 5' e em 3'. Esse cassete de expressão é transferido em seguida para o plasmídeo pTG12018, assim o cassete está agora bordejado em 5' por um sítio NotI e em 3' por um sítio AscI. Esse fragmento é em seguida clonado no plasmídeo de expressão da levedura pAM1 nos sítios NotI e AscI para dar o plasmídeo pCC11.

[00185] No sítio NotI desse plasmídeo, é inserido o fragmento NotI que porta o promotor TEF1, o cDNA da forma madura da adrenodoxina redutase de origem bovina, e o terminador de levedura PGK1, respectivamente nessa ordem que provém do plasmídeo pTG10361.

[00186] Esse plasmídeo porta o mesmo cDNA que está descrito em Dumas et al., 1996, (cujo conteúdo é incorporado como referência ao presente pedido, notadamente as descrições dos plasmídeos) exceto que a sequência de endereçamento do precursor da citocromo oxidase foi substituída por um códon metionina. O cDNA codifica portanto para uma forma madura do cDNA da adrenodoxina redutase.

Exemplo 10: Construção da cepa CDR07 [00187] A cepa CDR07 foi obtida por cruzamento entre as cepas FY1679-18b MAT a e a cepa CA10 MAT α descrita por Duport et al., 1998.

[00188] Essas das cepas foram primeiro isoladas em um meio rico que contém glicerol e depois em um meio que contém acetato de potássio como descrito em Yeast Protocols Methods in Cell and Molecular Biology Edited by Ivor H Evans in 1996. Humana Press Totowa Ney Jersey.

[00189] Depois de esporulação, as tétrades foram digeridas pela zimoliase 100T durante 30 minutos a 37°C. Vários ciclos de seleção foram aplicados para obter um clone que produza campesterol como

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40/65 esterol majoritário tendo para isso perdido os outros caracteres de CA10.

[00190] Os esporos são primeiramente selecionados em um meio mínimo que contém nistatina com suplementos (adenina, leucina, triptofano, uracila, histidina). Os clones que resistem à nistatina e que são auxotróficos para a adenina e a leucina são em seguida transplantados em meio rico que contém adenina e higromicina (200 pg/ml) para detectar a deleção do gene ERG5 pelo gene de resistência à higromicina.

[00191] Clones auxotróficos para a adenina, a leucina (e a uracila e o triptofano) e também resistentes à higromicina e à nistatina são analisados por seu perfil esterólico. Dois clones de sinais sexuais opostos que produzem campesterol como esterol majoritariamente são selecionados.

[00192] Eles são chamados de CDR07 MAT a e CDR07 MAT α. Exemplo 11: Construção dos plasmídeos de integração pTG12093 e pLIP5 respectivamente para os lócus HIS3 e TRP1

a) Construção do pLIP5 [00193] o pLIP5 é um plasmídeo que pode ser utilizado para as integrações genômicas ao lócus TRP1 ou como plasmídeo de cópias múltiplas na levedura S. cerevisiae. O plasmídeo de base que serviu para a construção desse plasmídeo é o plasmídeo pFL45S descrito em Bonneaud et al., 1991, cujo conteúdo é incorporado como referência ao presente pedido, notadamente as descrições dos plasmídeos.

[00194] Um fragmento de DNA genômico que corresponde à parte 5' a montante do promotor TRP1 foi primeiramente clonado utilizando se para isso os oligonucleotídeos OLIP21 e OLIP22 (respectivamente SEQ ID N° 30 E 31) para fazer uma amplificação por PCR.

[00195] O produto de PCR foi primeiramente subclonado em pCR

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Script AmpSK(+) (Stratagène, La Jolea Califórnia EUA). As extremidades OLIP21 e OLIP22 possuem de fato em 5' um sítio NarI assim como um sítio HindIII em 3'. Esse fragmento NarI, HindIII substituiu os sítios de clonagem múltiplos do plasmídeo pFL45S descrito mais acima.

[00196] O plasmídeo obtido pLIP3 é de novo modificado utilizandose para isso o oligonucleotídeo OLIP20 (SEQ ID N° 32) que serve para substituir o sítio único HindIII pelo sítio único NotI. No sítio NotI, é introduzido um fragmento que contém de 5' para 3' o promotor TEF1, o cDNA do citocromo P-450c17alfa e depois o terminador PGK1 como descrito em Degryse et al., 1999 (cujo conteúdo é incorporado como referência ao presente pedido, notadamente as descrições dos plasmídeos).

[00197] O plasmídeo final pLIP5 pode servir ao mesmo tempo como plasmídeo de cópias múltiplas à base do marcador TRP1, quando a parte 2 mícron é retirada, é possível utilizá-lo como plasmídeo de integração ao nível do lócus TRP1. O cassete é assim integrado em 5' do gene TRP1.

b) Construção do plasmídeo pTG12093 [00198] Esse plasmídeo é um plasmídeo de integração intergênica ao nível do lócus HIS3. Esse plasmídeo é construído a partir do plasmídeo pUC-HIS3 descrito por Duport et al., 1998. O sítio único de restrição XhoI desse plasmídeo foi transformado em um sítio de restrição único NotI utilizando-se para isso um adaptador apropriado ao mesmo tempo em que se destrói o sítio XhoI para dar o plasmídeo pUC19-HIS3. No sítio NotI único desse plasmídeo, um fragmento NotI que provém do pTG10792. Esse fragmento contém o promotor TDH3 cDNA que codifica para a ADX bovina madura fundida na sequência de endereçamento do precursor do citocromo de COX6 (da subunidade 6 da citocromo oxidase de levedura como descrito em Dumas et al.,

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1996). O fragmento de restrição Sa/I M/uI do plasmídeo pTG 10350 que contém o cDNA precedentemente descrito foi transferido para o plasmídeo pTG10211 para formar o plasmídeo pTG10792.

[00199] Esse plasmídeo possui portanto um fragmento de 1,6 quilobases que contém o promotor TDH3, o cDNA fundido entre a ADX bovina madura e a pré-sequência COX6 de levedura, e o terminador PGK1 de 5' para 3'. Esse fragmento NotI-NotI é inserido no plasmídeo pTG12093. A transcrição de HIS3 e do cassete de expressão está na mesma orientação.

Exemplo 12: Cruzamento de CDR07 MAT g com TGY260 MATa [00200] A cepa SB14 (CDR07 MAT g X TGY260 MATa) é colocada para esporular em um meio muito pobre que contém acetato de potássio. As diferentes ascii são em seguida colocadas para crescer em um meio mínimo que contém os produtos seguintes uracila, histidina, triptofano e adenina.

[00201] Os esporos são em seguida selecionados em um meio mínimo corretamente complementado que contém de 8 a 12 pg/ml de nistatina. Os esporos positivos são em seguida selecionados baseados na presença do cDNA da P450-c21 humana. Para fazer isso, realiza-se uma triagem dos clones em meio Kappeli (Arreguin de Lorencez M., Kappeli O. J., 1987) com como fonte de carbono 2% de etanol (e 0,1% de glicose) em presença de 300 mg/ml de 17-OH progesterona.

[00202] A bioconversão é incubada até 72 horas. A capacidade de bioconversão é analisada em HPLC como descrito por Dumas et al., 1996 e Degryse et al., 1999 (cujos conteúdos são incorporados como referência ao presente pedido, notadamente as explicações dos estudos de bioconversão).

[00203] Esses clones também são analisados por seu perfil esterólico em cromatografia em fase gasosa como descrito por Duport

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43/65 et al., 1998 (cujo conteúdo é incorporado como referência ao presente pedido, notadamente as explicações dos estudos de bioconversão) tendo em vista detectar o campesterol e o ergosta 5,22 dienol.

[00204] Três esporos YCC3, YCC4 e YCC5 são selecionados como produzindo ergosta 5,22 dienol e campesterol e convertendo o 17-OH progesterona em 11-deoxicortisol com uma eficácia de produção de 25, 120 e 42 μg/ml em 72 horas, respectivamente.

[00205] YCC4 e YCC5 são em seguida selecionados para duas novas transformações sucessivas com os plasmídeos pLIP5 e pTG12093 linearizados respectivamente pelas enzimas ApaLI e EcoRI. Os plasmídeos pLIP5 e pTG12093 são plasmídeos de expressão intergênica respectivamente para a P450c17 bovina e a ADX bovina mitocondrial.

[00206] O pTG12093 é um plasmídeo de integração na região intergênica em 3' do lócus HIS3 enquanto que o pLIP5 é um plasmídeo de integração na região intergênica em 5' do lócus TRP1. Por outro lado esses dois plasmídeos portam um sítio único NotI que permite a integração de um cassete de expressão que contém nessa ordem: promotor TEF1, cDNA P450c17 bovina, terminador PGK1 para o pLIP5, e nessa ordem: promotor TDH3, cDNA COXVIpre: :mat ADX bovina, terminador PGK1 para o pTG12093.

[00207] A cepa YCC4 é transformada sucessivamente pelos plasmídeos pLIP5 e pTG12093 linearizados (pelas enzimas de restrição ApaLI e EcoRI).

[00208] Por ocasião da primeira transformação, os clones transformantes são primeiramente selecionados em um meio que não contém triptofano. Os clones que crescem na ausência de triptofano são em seguida selecionados por PCR com os oligonucleotídeos C173 e C17-5 (respectivamente SEQ ID N° 33 e SEQ ID N° 34).

[00209] Um clone YCC8 é selecionado para uma nova

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44/65 transformação pelo plasmídeo pTG12093 linearizado. Da mesma maneira, os clones que crescem na ausência de histidina são selecionados e depois a presença do cDNA ADX é verificada por PCR com o auxílio dos oligonucleotídeos ADX-3 e ADX-5 (respectivamente SEQ ID N° 35 e SEQ ID N° 36).

[00210] Um clone UCY2 é selecionado, seu sinal sexual é MAT α. Exemplo 13: Construção da cepa UCY4 [00211] A cepa UCY2 possui um gene ATF2 funcional, isto é quer dizer que a maior parte da pregnenolona produzida é transformada em acetato de pregnenolona pela proteína ATF2p que é uma pregnenolona acetil transferase cuja função natural na levedura é desconhecida (Cauet et al., 1999). Além disso essa reação é irreversível e portanto, uma vez produzida a acetil pregnenolona não é mais transformável em hidrocortisona. Se revela portanto importante destruir essa atividade para permitir uma melhor produção de hidrocortisona.

[00212] O gene ATF2 foi portanto submetido a uma ruptura utilizando-se para isso um gene de resistência ao G418. Para fazer isso um plasmídeo pAM3kanaC de ruptura foi construído permitindo a introdução de um marcador de resistência ao G418 no gene ATF2.

[00213] Esse plasmídeo foi construído a partir do plasmídeo pAM1 (cuja construção foi descrita mais acima), do plasmídeo pTG12002 que é um plasmídeo de expressão para o gene ATF2.

[00214] O pTG12002 é um plasmídeo de expressão para ATF2 baseado no plasmídeo pTG10260 (Degryse et al., 1995) no qual o sítio de restrição XbaI da origem de replicação 2 mícron foi inativado. Esse plasmídeo compreende portanto um cassete de expressão para o gene ATF2 (Cauet et al., 1999) que compreende o promotor CYC1, o gene ATF2 (enquadrado pelos sítios de restrição SalI e MluI) e o terminador PGK1. Esse cassete foi modificado por PCR para conter o

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45/65 gene ATF2 completo que compreende o promotor do gene ATF2, a sequência codificante do gene ATF2, o terminador do gene ATF2 em um fragmento de restrição KpnI, NotI. Esse fragmento KpnI-NotI é introduzido nos sítios KpnI-NotI do plasmídeo pAM1 para dar o plasmídeo pAM3.

[00215] No plasmídeo pAM3, o cassete de expressão da resistência ao G418 é introduzido no gene ATF2 acarretando sua inativação.

[00216] Para fazer isso o plasmídeo pAM3 é digerido pela enzima de restrição AccI, e depois parcialmente pela enzima de restrição SacI. Uma banda de cerca de 7500 pb é purificada em gel. O plasmídeo pFA6a kanMX4 (Wach et al., Methods in Microbiology Volume 26 Yeast Gene Analysis Chapitre 5 PCR-based Gene Targeting in Saccharomyces cerevisiae) é digerido por SacI e AccI, a banda de 1500 pb é purificada em gel. Os dois fragmentos são ligados e depois transformados. Um plasmídeo é obtido pAM3kanaC. O pAM3kanaC é digerido por PvuII e NotI, a banda de 2215 pb é purificada em gel, e depois transformada em UCY2 que é espalhada em placas de meio rico que contém 130 pg/ml de G418. Cerca de 600 clones são transplantados nesse meio que contém o G418, dois clones são resistentes ao G418. Um clone que não contém o plasmídeo pAM3 é conservado.

[00217] Esse método de inativação de gene é bem conhecido pelo profissional.

[00218] O clone único assim obtido é colocado para bioconverter com 100 pg/ml de pregnenolona em meio Kappeli.

[00219] No final de 24 horas, a ausência de acetato de pregnenolona é verificada por extração e cromatografia em fase gasosa como descrito em Cauet et al., 1999. Esse fenômeno indica que o gene ATF2 responsável pela acetilação da pregnenolona sofreu mesmo ruptura e não é mais funcional. A cepa é chamada de UCY4.

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Exemplo 14: Construção das cepas UCY3 e UCY26 [00220] A triagem dos esporos obtidos por cruzamento das cepas CDR07 e TGY260 resultou em várias cepas entre as quais as cepas YCC4 e YCC5. Como descrito acima, a cepa YCC4 foi transformada por uma série de 2 plasmídeos: pLIP5 e pTG12093. Um esporo UCY2 foi então selecionado (conforme exemplo 12). Da mesma maneira, a cepa YCC5 também foi transformada pelos plasmídeos pLIP5 e pTG12093 e um novo esporo chamado de UCY3 foi obtido. Como UCY2, UCY3 é caracterizado pela presença e pela expressão da Δ7 redutase de A. thaliana medida pela resistência à nistatina e pela presença de brassicasterol e de campesterol como esterol majoritário dessas leveduras recombinantes. A presença de cDNA ADX é verificada por PCR com o auxílio dos nucleotídeos ADX-3 e ADX-5 (respectivamente SEQ ID N° 35 e SEQ ID N° 36), e depois por Western Blot como descrito em Dumas et al., 1996, incorporado como referência aqui no que refere-se à descrição dessa técnica.

[00221] A atividade de hidroxilação em 17 e 21 da progesterona é verificada por bioconversão da progesterona em 17OH-progesterona e 11-deoxicortisol. Para fazer isso, a cepa é incubada em presença de 200 mg/l de progesterona como descrito em Dumas et al., 1996 e Degryse et al., 1999, UCY3 é capaz de produzir o 11-deoxicortisol a partir da progesterona indicando a presença das atividades P450c17 e P450c21. Detecta-se também a presença de 4 pregneno 17a,20a diol 3 ona indicando que pelo menos uma das duas atividades codificadas por GCY1 ou YPR1 está presente na cepa. Para evitar o acúmulo de acetato de pregnenolona, a atividade de acetilação da pregnenolona codificada pelo gene ATF2 foi eliminada. Com esse objetivo, o plasmídeo pAM3kanaC (conforme exemplo 13) foi usado para transformar a cepa UCY3. o pAM3KanaC é primeiramente digerido por PvuII e NotI, a banda de 2215 pb é purificada em gel, e depois

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47/65 transformada em UCY3 que é espalhada em placas de meio rico que contém 130 μg/ml de G418. Colônias resistentes ao antibiótico G418 e que não são mais capazes de transformar a pregnenolona em acetato de pregnenolona são isoladas; uma colônia UCY26 é mais especialmente selecionada para novas transformações e para testar sua produção de hidrocortisona.

Exemplo 15: Construção da cepa UCY5 [00222] Com o objetivo de dispor de uma melhor variabilidade genética, a cepa UCY2 (conforme exemplo 12) foi cruzada com a cepa TGY245 (conforme exemplo 5), uma cepa diplóide YSA2-2n foi assim selecionada. Essa cepa foi colocada em condição de produção de ascos e 85 ascos foram dissecados (como descrito em Yeast Protocols in Molecular Biology Volume 53 p 59-67, 1996). Os esporos isolados são triados baseado em sua propriedade auxotrófica. Assim, os clones capazes de crescer na ausência de triptofano e de histidina e que necessitam da adenina são mais especialmente selecionados. A expressão da Δ7 redutase é verificada tendo-se para isso a certeza da resistência da cepa à nistatina assim como da presença de campesterol e brassicasterol na membrana dessas cepas. Essa última análise é realizada por cromatografia em fase gasosa dos esteróis totais dessas cepas como descrito em Duport et al., 1998. Além da presença dos csDNA que codificam para a P450c17 e a ADX é verificada por PCR com o auxílio dos nucleotídeos C17-3 e C17-5 (respectivamente, SEQ ID N° 33 E SEQ ID N° 34) oligonucleotídeos ADX-3 e ADX-5 (respectivamente SEQ ID N° 35 e SEQ ID N° 36) respectivamente. Finalmente, a funcionalidade dos genes GCY1 e YPR1 nesses esporos positivos é verificada de duas maneiras: ou por PCR, ou por ausência da atividade 20 alfa redutase sobre a 17 OH progesterona.

[00223] Por PCR, utilizando-se o par de oligonucleotídeos X1TEF1

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48/65 e X2C21 (respectivamente SEQ ID N° 47 e SEQ ID N° 48), detecta-se a ruptura do gene YPR1 pelo cassete de expressão para a P450c21 humana em S. cerevisiae que contém o promotor TEF1, o cDNA da P450c21 humana assim como o terminador PGK. Detecta-se também por PCR, utilizando-se para isso os pares de oligonucleotídeos X3TDH3 e X2C21 (respectivamente SEQ ID N° 49 e SEQ ID N° 48), a ruptura do gene CGY1 pelo cassete de expressão para a P450c21 humana em S. cerevisiae que contém o promotor TDH3, o cDNA da P450c21 humana assim como o terminador PGK.

[00224] O desaparecimento das duas atividades CGY1 e YPR1 e a presença da atividade que corresponde à atividade P450c17 e P450c21 são finalmente verificadas por bioconversão da progesterona em 11-deoxicortisol nas condições descritas por Dumas et al., 1996, modificadas por Degryse et al., 1999. As leveduras recombinantes são incubadas a 30°C em presença de 200 mg/l de progesterona com uma densidade celular de 5 em um meio de cultura de tipo Kappeli que contém 2% de galactose ou 2% de glicose como fonte de carbono, em um volume de 10 ml. Depois de uma incubação de 48 horas, extrai-se o meio de cultura dessas leveduras como descrito precedentemente e mede-se em especial a quantidade de 17OH progesterona e 11deoxicortisol produzida por HPLC. O esporo selecionado não produz mais quantidade detectável de 4 pregneno 17α,20α diol 3 ona mas produz a 17OH progesterona e o 11-deoxicortisol utilizando para isso as duas fontes de carbono. O clone escolhido produz a maior quantidade de 11-deoxicortisol.

[00225] Uma cepa que responde positivamente a todos esses critérios é mais especialmente selecionada para novas transformações, essa cepa é chamada de UCY5.

Exemplo 16: Construção dos plasmídeos pFM10 e pTG10897

a) Construção do plasmídeo pFM10

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49/65 [00226] O plasmídeo pFM10 é um vetor que permite a expressão simultânea de 4 proteínas na levedura. Ele não contém origem de replicação para E. coli nem gene de resistência à ampicilina, esse plasmídeo não pode portanto se replicar em E. Coli. Sua obtenção é realizada por recombinação na levedura de dois plasmídeos: pFM7 e pCB12. Contrariamente ao plasmídeo pFM10, esses últimos se replicam ambos em E. coli visto que eles possuem o replicon E. coli. O plasmídeo pFM7 também se replica na S. cerevisiae, visto que ele compreende também a origem de replicação 2 mícron da levedura S. cerevisiae. Esses dois plasmídeos possuem por outro lado as sequências R1 e R2 (respectivamente SEQ ID N° 39 e SEQ ID N° 40) que bordejam os cassetes de expressão assim como os marcadores de seleção. As sequências R1 e R2 são provenientes do gene da fotoclorofilida oxidoredutase de A. thaliana e seu tamanho é de cerca de 300 pares de bases cada uma.

[00227] As duas sequências R1 e R2 são clonadas em orientação inversa nos plasmídeos pFM7 e pCB12. Assim, entre as sequências R1 e R2, o plasmídeo pFM7 contém na ordem: a origem de replicação 2 mícron contida no fragmento 2 mícron (fragmento bordejado pelos sítios de restrição EcoRI, tal como descrito por Urban et al., 1994), um fragmento bordejado por sítios NotI que provém do plasmídeo pCD63 descrito em Duport et al., 1998, que contém dois cassetes de expressão para a forma madura da P450SCC e a forma madura da ADX separada pelo gene URA3 da levedura funcional, vem em seguida a sequência R2. Do mesmo modo o plasmídeo pCB12 contém as sequências R1 e R2 mais clonadas no sentido inverso das sequências do plasmídeo pFM7. Assim, entre as sequências R1 e R2, são encontrados o cassete de expressão para a P450n_P, o marcador de seleção ADE2, o cassete de expressão para a 3p-HSD de origem bovina. O cassete de expressão para a P450n_P provém do plasmídeo

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50/65 pCV29 e contém o promotor CYC1, um cDNA híbrido que codifica para a P450iip e um terminador PGK. O gene ADE2 que provém do plasmídeo pAM1, trata-se do fragmento BgIII-fígIII. Do mesmo modo, o cassete de expressão para a 3p-HSD bovina, quer dizer o promotor TDH3, o cDNA da 3p-HSD bovina e o terminador PGK, provém do plasmídeo pCC12, trata-se do fragmento C/aI-AscI.

b) Construção do plasmídeo pTG10897 [00228] Com o auxílio de dois oligonucleotídeos de 20 meros que correspondem respectivamente à parte 5' e 3' da sequência codificante do gene ATF2 (e que compreendem também os sítios de clonagem) e utilizando-se para isso como matriz DNA genômico da cepa FY 1679-28c, amplifica-se por PCR a sequência codificante do gene ATF2. Esse produto de PCR é em seguida digerido pelas enzimas C/aI e HindIII e é clonado entre os sítios C/aI e HindIII do plasmídeo pTG10031 [Degryse, 1995 #102] para dar o plasmídeo pTG10885. Esse plasmídeo serve de base para a construção de um plasmídeo de ruptura do gene ATF2. A sequência do gene URA3 foi amplificada a partir de DNA genômico da cepa TGY156 (descrita em Cauet et a/., 1999 e incorporada aqui como referência), essa cepa possui de fato um gene ATF2 interrompido pelo gene URA3. Os oligonucleotídeos OTG10842 (SEQ ID N° 41) e OTG10841 (SEQ ID N° 42) serviram portanto para a amplificação em matriz de DNA genômico da cepa TGY156 e o produto da amplificação serviu como semente de recombinação com o plasmídeo pTG10885 digerido pelas enzimas de restrição BstXI e StuI.

[00229] Obtém-se assim o plasmídeo pTG10897 que contém a sequência codificante do gene ATF2 interrompida pelo gene URA3. De fato, o gene URA3 funcional se encontra entre 509 nucleotídeos da parte 5' da sequência codificante de ATF2 e 444 nucleotídeos da parte 3' dessa sequência codificante.

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Exemplo 17: Construção das cepas UCY6, UCY16, UCY16-pFM10, UCY19, UCY20, UCY24, UCY25, UCY27 [00230] A partir da cepa UCY5, uma série de novas cepas foi construída com o objetivo de melhorar a produção de esteróide de interesse. De fato, a cepa UCY5 não expressa adrenodoxina redutase que é um componente essencial da reação de corte da cadeia lateral pela P450SCC. Por outro lado, como foi descrito antes, o gene ATF2 codifica para uma acetil transferase que utiliza a pregnenolona como substrato e sua ruptura permite suprimir essa reação parasita de acetilação e aumentar assim o rendimento em esteróide de interesse. Finalmente, a via de biossíntese exógena utiliza a atividade ARH1p endógena, essa última sendo essencial para a sobrevivência da levedura. No entanto, essa atividade mitocondrial, que substitui a adrenodoxina redutase de mamífero, poderia ser limitante nas cepas que produzem hidrocortisona. Uma cepa que possui certas modificações que permitem aumentar de maneira considerável o rendimento de produção em esteróide de interesse foi portanto construída a partir da cepa UCY5. Assim essa cepa é desprovida de atividade ATF2, superproduz a proteína adrenodoxina redutase e superproduz também a proteína ARH1.

[00231] Para permitir uma expressão da ADR na cepa UCY5, essa última foi transformada pelo vetor pTG10925 (conforme exemplo 2 f) que quando ele é transformado na levedura sob a forma linear permite a integração no lócus LEU2 e a expressão da ADR sob o controle do promotor TEF1. A expressão da ADR foi verificada por Western Blot como descrito em Dumas et al., 1996. Um clone que expressa a ADR e chamado de UCY6 foi mais especialmente utilizado para as transformações seguintes.

[00232] Com o objetivo de eliminar a reação parasita de acetilação que transforma a pregnenolona em acetato de pregneno lona e que é

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52/65 catalisada pela enzima ATF2, o gene ATF2 que codifica para essa enzima foi rompido. Esse último foi de fato interrompido pelo marcador URA3, para fazer isso, o fragmento NotI do plasmídeo pTG10897 que contém a sequência do gene ATF2 interrompido pelo gene funcional de levedura URA3 foi utilizado. Esse fragmento é utilizado para transformar a cepa UCY6. As colônias capazes de crescer na ausência de uracila são selecionadas, e depois mede-se a capacidade desses clones para transformar a pregnenolona em acetato de pregnenolona como descrito por Cauet et al., 1999. Um clone capaz de crescer na ausência de uracila e incapaz de transformar a pregnenolona em acetato de pregnenolona é mais especialmente isolado. Esse clone é chamado de UCY16.

[00233] Essa cepa não podendo ser transformada por plasmídeos que portam unicamente o marcador URA3, dois novos plasmídeos foram construídos: os plasmídeos pCB12 e pFM7. Esses dois plasmídeos quando eles são recombinados juntos, permitem obter o plasmídeo pFM7 baseado nos marcadores URA3 ou/e ADE2 (conforme acima e Figura 5). Assim para obter o plasmídeo pFM10, o plasmídeo pFM10 é linearizado pela enzima de restrição AatII e o fragmento de DNA correspondente é isolado em gel. O plasmídeo pCB12 é no que lhe diz respeito digerido por BamHI e a banda de 9300 pares de bases é isolada de acordo com as técnicas clássicas de biologia molecular. Cerca de 5 pg dos fragmentos de pCB12 e pFM7 são misturados e servem para transformar a cepa UCY16. Alguns clones UCY16-pFM10, capazes de crescer em meio mínimo (sem uracila e aminoácidos), são isolados e as cepas correspondentes são testadas para seu nível de produção de esteróides de aco rdo com o protocolo descrito abaixo.

[00234] Alternativamente e com o objetivo de poder utilizar depois os plasmídeos do tipo pCV29 baseados em um marcador URA3, a

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53/65 ruptura do gene ATF2 na cepa UCY6 também foi obtida transformando-se para isso essa cepa pelo plasmídeo pAM3kanaC linearizado (conforme exemplo 13). As colônias resistentes ao G418 são em seguida testadas para a ausência ou a presença da atividade pregnenolona acetil transferase como descrito por Cauet et al., 1999. Uma colônia resistente ao G418 é que não possui mais a atividade pregnenolona acetil transferase é mais especialmente selecionada. Essa cepa é chamada de UCY24.

[00235] Com o objetivo de aumentar a atividade ARH1 em uma cepa que contém uma via de produção exógena da hidrocortisona, a cepa UCY5 foi transformada pelos plasmídeos pTG12048 ou pTG12050 linearizado previamente por XhoI e SapI respectivamente. O plasmídeo pTG12048 que foi descrito acima permite a superexpressão do gene ARH1 no lócus LEU2 sob o controle do promotor CYC1. O plasmídeo pTG12050 difere do plasmídeo pTG12048 unicamente pelo fato de que o promotor CYC1 que controla a expressão do gene ARH1 foi substituído pelo promotor TEF1 tal como descrito em Degryse et al., 1995 e Dumas et al., 1996. UCY5 foi transformado por pTG12048 ou pTG12050 linearizado. Em cada um dos dois casos, as colônias capazes de crescer na ausência de leucina foram selecionadas. Além disso a presença dos cassetes de expressão para o gene ARH1 foi verificada por PCR. Dois pares de oligonucleotídeos permitem de fato verificar a presença de uma cópia suplementar do gene ARH1 (sob o controle do promotor CYC1 ou TEF1). Por um lado, o par arh1D (SEQ ID N° 43) e nfs1R (SEQ ID N° 44) permite verificar a presença da junção entre o gene ARH1 e o gene NFS1. Por outro lado, o par leu2D (SEQ ID N° 45) e arh1R (SEQ ID N° 46) permite verificar a junção entre o gene LEU2 e o gene ARH1.

[00236] Além da presença do cassete de expressão para o gene

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ARH1 que codifica para a atividade ARH1, a expressão da proteína ARH1p também foi testada nos clones obtidos. A detecção da superexpressão de ARH1p não é no entanto uma coisa fácil. Esse fato é devido à presença natural da proteína ARH1p a um baixo nível nas cepas de S. cerevisiae. Experiências de Western Blot realizadas como descrito em Dumas et al., 1996 permitem no entanto confirmar o aumento da quantidade de ARH1p. Além das experiências de Western Blot que se revelam delicadas, a presença de uma quantidade aumentada de ARH1p pode ser verificada por experiências de redução do citocromo c ou de 11 beta hidroxilação do 11-deoxicortisol reconstituídas in vitro com mitocôndrias purificadas de leveduras recombinantes como descritas em Lacour et al., 1998 e Dumas et al., 1996, respectivamente. Dois clones, UCY19 e UCY20, respectivamente transformados por pTG12048 e pTG12050 e que sobre-expressam ARH1, são mais especialmente selecionados. O gene ATF2 foi em seguida rompido nessas cepas como descrito mais acima. Brevemente, o plasmídeo pAM3kanaC foi linearizado e depois utilizado para transformar as cepas UCY19 e UCY20. Os clones foram em seguida selecionados por sua propriedade de resistência ao G418 e pela ausência de atividade pregnenolona acetil transferase como descrito por Cauet e al, 1999. Dois clones derivados de UCY19 e UCY20 são mais especialmente selecionados. Trata-se respectivamente das cepas UCY25 e UCY27 (conforme Figura 2).

Exemplo 18: Produção de esteróides pelas cepas de acordo com a invenção

a) T ransformação dos UCY2 e UCY4 por pCV29 e pCC12 [00237] As cepas UCY2 e UCY4 foram transformadas pelos dois plasmídeos pCV29 e pCC12, descritos mais acima, dos quais as estruturas são lembradas abaixo e nas figuras 3 e 4.

[00238] O plasmídeo pCV29 porta uma origem de replicação de tipo

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55/65 micron para replicação na levedura. Por outro lado, esse plasmídeo porta 3 cassetes de expressão respectivamente para a P45011 β humana/bovina híbrida marcada com a mitocôndria tal como descrito precedentemente, as formas maduras (com uma metionina na extremidade NH2 terminal) da adrenodoxina e da P450SCC. A expressão dessas três proteínas está sob o controle dos promotores CYC1 ^45011β) e GAL10/CYC1 (ADX e P450scc sob a forma madura).

[00239] O plasmídeo pCC12 é um plasmídeo de pequeno número de cópias que porta um cassete de expressão para a forma madura da adrenodoxina redutase bovina sob o controle do promotor TEF1 assim como um cassete de expressão para a 3β-HSD bovina sob o controle do promotor TDH3.

[00240] Essas cepas são colocadas para crescer em condições clássicas de fermentação em meio Kappeli com glicose como fonte de carbono. No final da fermentação (180 h), os esteróides são extraídos como descrito precedentemente e caracterizados em cromatografia líquida de alta pressão.

[00241] A identidade dos produtos foi verificada por cromatografia em fase gasosa, por cromatografia de alta pressão em fase líquida e em fase reversa combinada ou não com a espectrometria de massa e a ressonância magnética nuclear (conforme Tabela 1).

Tabela 1. Balanço dos esteróides obtidos (resultados expressos em mg/l)

Cepas	Acetato de pregnenolona	Progesterona	4-pregneno- 17α,20α diol 3 ona	Não identificado	Corticosterona	Hidrocortiso na
UCY2/pC V29 + pCC12	18	7	5	5	12	15
UCY4/pC V29 + pCC12	0	30	44	24	23	80

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b) Transformação das cepas UCY24, UCY25, UCY26 e UCY27 por pCV29 e pCC12 e transformação da cepa UCY16 por pFM10 [00242] Essas cepas possuem numerosas modificações e se revelam difíceis de transformar. Em consequência disso, um protocolo baseado na preparação de esferoplastos foi utilizado para essas transformações, como descrito por Burgers et al., 1987. UCY16 foi transformado de acordo com esse protocolo pelos plasmídeos pFM7 e pCB12, esses últimos dando o plasmídeo pMF10 por recombinação in vivo na levedura. Como descrito acima, o plasmídeo pFM10 é um plasmídeo de cópias múltiplas de levedura, que não contém sequências bacterianas e que permite a expressão de 4 proteínas heterólogas. Essas quatro proteínas são como foi visto precedentemente: uma forma quimérica do citocromo P450n_P, a 3βHSD bovina, a ADX madura e o citocromo P450scc maduro. Os cDNA correspondentes são colocados respectivamente sob o controle dos promotores CYC1, TDH3, GAL10/CYC1 e GAL10/CYC1. Os transformantes são selecionados em um meio mínimo sem nenhuma adição. A seleção é feita unicamente baseada no marcador ADE2 (crescimento na ausência de adenina), a presença de um gene funcional URA3 no genoma e que serve para a inativação do gene ATF2 não permite a seleção baseada no gene URA3. É portanto necessário triar várias colônias para que se tenha certeza de ter um plasmídeo pFM10 funcional na cepa UCY16.

[00243] As cepas UCY24, UCY25, UCY26 e UCY27 foram transformadas pelos plasmídeos pCV29 e pCC12 de acordo com o mesmo protocolo de preparação de esferoplastos. Como descrito acima, o plasmídeo pCV29 é um plasmídeo de cópias múltiplas em naveta entre E. coli e S. cerevisiae. Ele permite a expressão do citocromo P450i^, da ADX madura e do citocromo P450scc respectivamente sob o controle dos promotores CYC1, GAL10/CYC1 e

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GAL10/CYC1 (conforme Figura 3). O plasmídeo pCC12 é um plasmídeo de uma cópia de levedura que permite a expressão da ADR madura bovina e da 3p-HSD bovina sob o controle dos promotores TEF1 e TDH3, respectivamente (conforme Figura 4).

[00244] Todas essas cepas são colocadas para cresce em Erlenmeyer (volume 100 ml e que contém 30 ml de meio de cultura) em condições clássicas de fermentação em meio Kappeli com como fonte de carbono 2% de etanol e 0.1% de glicose. Depois de 168 horas de cultura, 500 pl de meio de cultura (células + meio) são extraídos em duas vezes como auxílio de 4 ml de dicloroetano. A fase orgânica é reunida e depois separada em dois para ser secada sob fluxo de nitrogênio. O extrato seco é recolocado em suspensão em 100 pl de uma mistura de acetonitrila/água (50/50 volume/volume) ou 100 pl de dicloroetano. Os extratos recolocados em suspensão na mistura de acetonitrila/água são tratados por HPLC, isso permite uma análise da composição em diferentes esteróides (hidrocortisona, cortexolona, corticosterona, 17-OH progesterona, 4 pregneno 17α,20α diol 3 ona) como descrito em Valvo et al., 1994. Os extratos recolocados em suspensão no dicloroetano são analisados por cromatografia em fase gasosa como descrito em Duport et al., 1998, essa última análise permitindo medir a quantidade de pregnenolona e de progesterona das amostras. Para cada uma das cepas transformadas, mede-se assim a produtividade em esteróides de uma dezena de clones. Os resultados apresentados abaixo, dão os resultados do melhor dos dez clones testados para cada uma das cepas UCY24, UCY25, UCY26 e UCY27 transformadas por pCV29 e pCC12 e da cepa UCY16 transformada por pFM10.

Tabela 2. Balanço das esteróides obtidos (resultados expressos em mg/l exceto a última linha: resultados expressos em porcentagem da totalidade dos esteróides)

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	UCY24 pCV29+ pCC12	UCY25 pCV29+ pCC12	UCY26 pCV29+ pCC12	UCY27 pCV29+ pCC12	UCY16 pFM10	UCY4 pCV29+ pCC12
17 OH progesterone	0,6	0,6	1,0	0,6	0,5	02
deoxicorticoslerona	0,5	00	02	03	1	0,0
cortexolona	4,5	2,7	2,1	2,0	7,6	0,7
4 pregneno 17a,20 diol 3 ona	00	00	00	0,0	0,0	4,5
aortcosterona	7,5	10,8	7,5	9,0	89	34
hidrocortisona	17,7	29,2	22,3	24,7	15,8	12,3
Esteóides Totais	30,8	43,3	33,1	36,6	33,8	21,2
% hidrocortsona	57	67	67	67	47	58

NB: Não se detecta nem pregnenolona nem acetato de pregnenolona no meio de cultura dessas cepas [00245] As cepas UCY16 pFM10, UCY24 pCV29+pCC12, UCY25 pCV29+pCC12, UCY26 pCV29+pCC12 e UCY27 pCV29+pCC12 apresentadas acima são portanto capazes de produzir quantidades de hidrocortisona superiores às quantidades de hidrocortisona produzidas pela cepa UCY4/pCV29+pCC12. A quantidade total de esteróides passa assim de 21,2 μg/ml na cepa UCY4/pCV29+pCC12 para 43,3 μg/ml na cepa UCY25 pCV29+pCC12 enquanto que a quantidade de hidrocortisona passa de 12,3 μg/ml para 29,2 μg/ml, respectivamente. Além disso, a hidrocortisona representa nesses exemplos até cerca de 70% dos esteróides totais. Observa-se portanto um grande aumento da quantidade e da qualidade da hidrocortisona produzida pois nenhuma dessas cepas produz o contaminante 4 pregnen 17,20 diol 3 ona. Essa última característica especialmente vantajosa é devido à ausência das proteínas codificadas pelos genes GCY1 e/ou YPR1 que são responsáveis pela reação da cetona em 20.

[00246] Também é interessante notar que de maneira inesperada, a

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59/65 superprodução controlada de ARH1p sob o controle do promotor CYC1 aumenta de modo significativo a quantidade de esteróides totais produzidos assim como a produção de hidrocortisona (conforme UCY24 pCV29+pCC12 versus UCY25 pCV29+pCC12). No entanto essa expressão não deve ser muito grande para que se obtenha o efeito desejado. Assim, se uma expressão da proteína ARH1 a um nível superior em relação a um nível fisiológico é desejável, é preciso ter o cuidado para não superexpressar demais essa proteína sob pena de perder esse aumento de produção em esteróides. Assim, o promotor TEF1 que é reconhecido como muito mais forte do que CYC1 (Nacken et al., 1996) dá resultados insatisfatórios (conforme UCY25 pCV29+pCC12 versus UCY27 pCV29+pCC12). Em conclusão a cepa UCY25/pCV29+pCC12 tem um potencial estimado para produzir 200 mg/l de hidrocortisona em fermentador com um único contaminante maior (a corticosterona).

c) Exemplo de produção em grande volume das cepas de acordo com a invenção [00247] Duas das cepas precedentes foram colocadas para crescer em um fermentador de grande volume em meio Kappeli de acordo com técnicas bem conhecidas pela pessoa versada na técnica (conforme por exemplo Risenberg D. et al., 1999). A técnica de cultura utilizada é um elemento descontínuo alimentado com meio concentrado (fed-batch). O fermentador com volume total de 15 litros contém no início 6 litros de meio. A adição de modo contínuo de 4 litros de meio concentrado suplementar no decorrer da fermentação assim como de líquidos corretores de pH e a adição contínua de etano l leva o volume final a cerca de 11,5 litros no final da cultura. As cepas UCY4 pCV29+pCC12 e UCY16 pFM10 foram assim cultivadas durante 180 h e uma produção aumentada em hidrocortisona pôde assim ser obtida (conforme tabela 3). A partir desses resultados, foram

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60/65 extrapolados os resultados que podem ser considerados para as cepas UCY24 pCV29+pCC12, UCY25 pCV29+pCC12, UCY26 pCV29+pCC12 e UCY27 pCV29+pCC12 (conforme tabela 3).

Tabela 3. Produção de hidrocortisona de diferentes clones obtidos de acordo com a invenção (resultados em mg/l)

Cepas Hidrocortisona em mg/l

UCY4 pCV29+pCC12	80
UCY16 pFM10	110
UCY24 pCV29+pCC12	123
UCY25 pCV29+pCC12	203
UCY26 pCV29+pCC12	155
UCY27 pCV29+pCC12	172

* Esses resultados foram obtidos por extrapolação dos resultados obtidos em fermentador de grande volume com as cepas UCY4 pCV29+pCC12 e UCY16 pFM10.

Depósito de material biológico [00248] Os organismos seguintes foram depositados em 24 de janeiro de 2001 na Coleção Nacional de Culturas de Microorganismos (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, França, de acordo com as disposições do tratado de Budapeste.

- Cepa CDR07 MAT a Número de ordem I-2616

- Cepa T GY260 Número de ordem I-2615

Lista das cepas descritas no presente pedido

Fy1679-18b = (n) MATa ura3-52 trp1-\63 leu2-\1 his3Δ200 fenl GAL fen^S ura- trp^- leu- his^-.

Fy1679-28c = (n) MATa ura3-52 trp1-\63 leu2-\1 his3\ 200 fen1 GAL fen^S ura^- trp^- leu^- his^-.

TGY195#4 = Fy1679-18b ypr1::URA3.

TGY212-1 = Fy1679-18b ypr1::TEF1 p::P450c21 [5x?]ura^- trp^- leu^- his^-.

TGY243-1 = TGY212-1 gcy1::URA3 trp^- leu^- his^-.

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TGY245-2D = TGY243-1 gcy1::TDH3_p::P450c21 ura trp leu^- his^-.

TGY260-A = TGY245-2D LEU2::CYC1p::ARH1 ura^- trp^- his^-.

CDR01 = Fy1679-18b MATa LEU2::'b-mat ADR' ura^- trp his^-.

CDR07 MATa = MATaade2::GAL10/CYC1 p::\⁷ ura^- trp^- leu his^- ade^- (esporo de CA10 x Fy1679-28c).

CDR07 MATa = MATa ade2::GAL10/CYC1 γ::Δ⁷ ura^- trp^- leu his^- ade^- (esporo de CA10 x Fy1679-28c).

CA03 = CDR01 ade2::GAL10/CYC1 γ::Δ⁷ ura^- trp^- ade^- his^-, resistente à nistatina (Duport et al., 1998).

CA10 = CDR03 erg5::PGK1 _P::higro^R ura^- trp^- ade^- his^-, resistente à nistatina e à higromicina (Duport et al., 1998).

SB14 (2n) = TGY260-A x CDR07 MATa.

YCC4 = (n) MATa ade2::GAL10/CYC1 _ρ::Δ⁷, LEU2:: CYC1p::ARH1 , ypr1:: TEF1 p::P450c21, ERG5, fen1(?),ura^- trp^- ade^- his , resistente à nistatina, (esporo de SB14).

YCC8 = YCC4 transformada com pLIP5 (TRP1:: TEF1 p::P450c17::PGK1t), ura^- ade^- his^-, resistente à nistatina.

UCY2 = YCC8 transformada com pTG12093 (HIS3::TDH3p::CoxVIpré::matADX::PGK1t):

HIS3::TDH3p::CoxVIpré::matADX:: PGK1t, ERG5, fen1 (?), ura^- ade^-, resistente à nistatina.

UCY4 = UCY2 atf2-A::G418^R ura^- ade^-, resistente à nistatina e ao G418.

YCC5 = (n) MATa ade2::GAL10/CYC1 P::\7Redutase,

LEU2:: CYC1p::ARH1 , gcy1::TDH3p::P450c21, ERG5, fen1(?),ura^- trp ade^- his^-, (resistente à nistatina, esporo de SB14).

YCC9 = YCC5 transformada com pLIP5 (TRP1:: TEF1 p::P450c17::PGK1t), ura^- ade^- his^-, resistente à nistatina.

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UCY3 = YCC9 transformada com pTG12093 (H/S3::TDH3p::CoxVIp^:matADX::PGK1t):

HIS3::7DH3p::CoxVIpré::matADX:: PGK1t, ERG5, fenl (?), ura- ade-, (resistente à nistatina).

UCY26 = UCY3 atf2-A::G418^R ura- ade-, (resistente à nistatina e ao G418).

YSA2 (2n) = TGY245-2D x UCY2.

UCY5 = (n) MA7a ade2::GAL10/CYC1 P::A7Redutase, LEU2:: CYC1p::ARH1 , ypr1::7EF1 p::P450c21, ERG5, gcy1::7DH3p::P450c21 fen (?),ura- trp- his-, resistente à nistatina, (esporo de YSA2).

UCY6 = UCY5 LEU2::TEF1::matADR::PGK1_i.

UCY16 = UCY6,atf2::URA3::atf2.

UCY19 = UCY5 LEU2::CYC1::ARH1.

UCY20 = UCY5 LEU2::TEF1::ARH1.

UCY25 = UCY19,atf2-^::G418^R (resistente à nistatina e ao G418).

UCY27 = UCY20,atf2-^::G418^R (resistente à nistatina e ao G418).

UCY24 = UCY6,atf2-^::G418^R (resistente à nistatina e ao G418).

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Claims (23)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Cepa de levedura Saccharomyces cerevisiae, caracterizada pelo fato de que é geneticamente modificada para produzir, de maneira autônoma, a partir de uma fonte de carbono simples, um esteroide derivado do metabolismo do colesterol, em que o dito esteroide é selecionado do grupo consistindo em pregnenolona, 17a-hidróxi pregnenolona, cortisol, cortexolona, progesterona, 17ahidróxi progesterona; em que a modificação genética compreende:

   (a) a inativação dos genes ATF2, GCY1 e YPR1, e (b) a integração de pelo menos um gene ou um cDNA heterólogo em um cassete de expressão, em que o gene ou cDNA é escolhido do grupo consistindo do gene ou cDNA que codifica a esterol A7-redutase de A. thaliana, o citocromo P450scc bovino, a adrenodoxina (ADX) bovina, a adrenodoxina redutase (ADR) bovina, a 3p-hidroesteróide desidrogenase / isomerase bovina, a 3βhidroesteróide desidrogenase / isomerase humana, o citocromo P450 C17 bovino, o citocromo P450 C21 humano, o citocromo P450 C11 humano, o citocromo P450 C11 bovino, e o citocromo híbrido P450 C11 humano-bovino.
2. 2. Cepa de levedura de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o dito cassete de expressão está situado em um plasmídeo de cópias múltiplas ou um plasmídeo de pequeno número de cópias.
3. 3. Cepa de levedura de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o cassete de expressão está situado em um plasmídeo de cópias múltiplas, em que o plasmídeo de cópias múltiplas é um plasmídeo à base de um replicon 2 mícron de levedura que se replica em Saccharomyces cerevisiae, ou um plasmídeo de pequeno número de cópias compreendendo uma origem de replicação ARS cromossômica com um centrômero de levedura.

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4. 4. Cepa de levedura de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que pelo menos um gene ou cDNA heterólogo em um cassete de expressão está sob o controle de um promotor escolhido no grupo consistindo nos promotores endógenos de S. cerevisiae TDH3, TEF1, PGK1, CYC1, GAL10, ATF2, TIR1, ARH1, ADE2, e pelo promotor híbrido GAL10-CYC1.
5. 5. Cepa de levedura de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um gene ou cDNA heterólogo em um cassete de expressão compreende uma sequência terminadora operável selecionada do grupo consistindo nas sequências terminadoras dos genes endógenos de S. cerevisiae PGK1, CYC1, ATF2, ADE2, NCP1.
6. 6. Cepa de levedura de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um gene ou cDNA heterólogo em um cassete de expressão compreende uma sequência terminadora operável selecionada do grupo consistindo nas sequências terminadoras dos genes endógenos de S. cerevisiae PGK1, CYC1, ATF2, ADE2, NCP1.
7. 7. Cepa de levedura de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o citocromo P450scc bovino é a forma madura do citocromo P450SCC bovino tendo uma metionina na extremidade NH2 terminal, e em que a adrenodoxina bovina é a forma madura da adrenodoxina bovina tendo uma metionina na extremidade NH2 terminal.
8. 8. Cepa de levedura de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o cassete de expressão compreende um gene ou cDNA que codifica adrenodoxina redutase bovina, em que o cassete está localizado em um plasmídeo de uma cópia, um plasmídeo de pequeno número de cópias, ou integrado no cromossomo de cepa de levedura.

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9. 9. Cepa de levedura de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o cassete de expressão possui os elementos que asseguram a presença da adrenoxina redutase no citosol da cepa de levedura.
10. 10. Cepa de levedura de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o gene ou cDNA heterólogo é selecionado do grupo consistindo em gene ou cDNA que codifica 3 β hidroesteroide desidrogenase / isomerase bovino, 3β-hidroesteroide desidrogenase / isomerase humano, citocromo P450 C17 bovino, citocromo P450 C11 humano, citocromo P450 C11 bovino e citocromo híbrido P450 C11 humano-bovino, em que o cassete de expressão está localizado em um plasmídeo de grande número de cópias.
11. 11. Cepa de levedura de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o gene ou cDNA heterólogo é selecionado do grupo consistindo em gene ou cDNA que codifica citocromo P450 C11 humano, citocromo P450 C11 bovino e citocromo híbrido P450 C11 humano-bovino, em que o cassete de expressão está localizado em um plasmídeo de cópias múltiplas e o citocromo P450 C11 produzido a partir do cassete de expressão compreende um sinal de endereçamento do citocromo P450 C11 para a mitocôndria.
12. 12. Cepa de levedura de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a cepa de levedura compreende pelo menos um cassete de expressão que codifica adrenodoxina bovina, em que o cassete de expressão está situado em um plasmídeo de cópias múltiplas, com um promotor fraco, e a adrenodoxina produzida a partir do cassete de expressão compreende um sinal de endereçamento da adrenodoxina para as mitocôndrias.
13. 13. Cepa de levedura de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que ela apresenta pelo menos dois cassetes de expressão, cada compreendendo um gene ou cDNA que codifica

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    4/7 proteína adrenodoxina bovina, em que o dito primeiro cassete de expressão codifica proteína adrenodoxina bovina que é ativa no citosol da dita cepa de levedura e o dito segundo cassete de expressão codifica proteína adrenodoxina bovina que é ativa nas mitocôndrias de cepa de levedura.
14. 14. Cepa de levedura de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a cepa de levedura compreende pelo menos um cassete de expressão compreendendo um ou mais genes que codificam proteínas tendo atividade NADPH P450 redutase, em que o cassete de expressão está situado em um plasmídeo de cópias múltiplas ou integrado no cromossomo.
15. 15. Cepa de levedura de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a cepa de levedura expressa a proteína adrenodoxina redutase (ARH1) endógena de S. cerevisiae a um nível superior em relação a S. cerevisiae correspondente antes de ser geneticamente modificada.
16. 16. Cepa de levedura de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que a dita cepa de levedura compreende um gene ARH1 endógeno funcional e geneticamente modificado pela introdução de uma cópia adicional do gene ou cDNA de ARH1 endógeno que codifica uma proteína ARH1 funcional em um cassete de expressão.
17. 17. Cepa de levedura de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a expressão do gene ou cDNA de ARH1 endógeno adicional é colocada sob o controle do promotor CYC1.
18. 18. Cepa de levedura, caracterizada pelo fato de que tratase da cepa TGY260 depositada na CNCM em 24 de janeiro de 2001 sob o número de ordem I-2615 que compreende adicionalmente uma ruptura ou inativação adicional do gene ATF2.

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19. 19. Cepa de levedura Saccharomyces cerevisiae de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é geneticamente modificada para produzir, de maneira autônoma, a partir de uma fonte de carbono simples, um esteroide derivado do metabolismo do colesterol, em que o dito esteroide é selecionado do grupo consistindo em pregnenolona, 17a-hidróxi pregnenolona, cortisol, cortexolona, progesterona, 17a-hidróxi progesterona, em que a modificação genética compreende:

    (a) a inativação dos genes ADE2, ATF2, GCY1 e YPR1, e (b) a integração de pelo menos um gene ou um cDNA heterólogo em um cassete de expressão, em que o gene ou cDNA é escolhido do grupo consistindo do gene ou cDNA que codifica a esterol A7-redutase de A. thaliana, o citocromo P450scc bovino, a adrenodoxina bovina, a adrenodoxina redutase bovina, a 3βhidroesteróide desidrogenase / isomerase bovina, a 3β-hidroesteróide desidrogenase / isomerase humana, o citocromo P450 C17 bovino, o citocromo P450 C21 humano, o citocromo P450 C11 humano, o citocromo P450 C11 bovino, e o citocromo híbrido P450 C11 humanobovino.
20. 20. Cepa de levedura de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que compreende um gene ou cDNA que codifica esterol A7-redutase de A. thaliana em um cassete de expressão integrado no cromossomo da cepa de levedura no lócus ADE2.
21. 21. Cepa de levedura Saccharomyces cerevisiae de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é geneticamente modificada para produzir, de maneira autônoma, a partir de uma fonte de carbono simples, um esteroide derivado do metabolismo do colesterol, em que o dito esteroide é selecionado do grupo consistindo em pregnenolona, 17a-hidróxi pregnenolona, cortisol, cortexolona,

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    6/7 progesterona, 17a-hidróxi progesterona, em que a modificação genética compreende:

    (a) a inativação dos genes ERG5, ATF2, GCY1 e YPR1, e (b) a integração de pelo menos um gene ou um cDNA heterólogo em um cassete de expressão, em que o gene ou cDNA é escolhido do grupo consistindo do gene ou cDNA que codifica a esterol A7-redutase de A. thaliana, o citocromo P450scc bovino, a adrenodoxina bovina, a adrenodoxina redutase bovina, a 3βhidroesteróide desidrogenase / isomerase bovina, a 3β-hidroesteróide desidrogenase / isomerase humana, o citocromo P450 C17 bovino, o citocromo P450 C21 humano, o citocromo P450 C11 humano, o citocromo P450 C11 bovino, e o citocromo híbrido P450 C11 humanobovino.
22. 22. Cepa de levedura Saccharomyces cerevisiae de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é geneticamente modificada para produzir, de maneira autônoma, a partir de uma fonte de carbono simples, um esteroide derivado do metabolismo do colesterol, em que o dito esteroide é selecionado do grupo consistindo em pregnenolona, 17a-hidróxi pregnenolona, cortisol, cortexolona, progesterona, 17a-hidróxi progesterona, em que a modificação genética compreende:

    (a) a inativação dos genes ADE2, ERG5, ATF2, GCY1 e YPR1, e (b) a integração de pelo menos um gene ou um cDNA heterólogo em um cassete de expressão, em que o gene ou cDNA é escolhido do grupo consistindo do gene ou cDNA que codifica a esterol A7-redutase de A. thaliana, o citocromo P450scc bovino, a adrenodoxina bovina, a adrenodoxina redutase bovina, a 3βhidroesteróide desidrogenase / isomerase bovina, a 3β-hidroesteróide desidrogenase / isomerase humana, o citocromo P450 C17 bovino, o

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    7/7 citocromo P450 C21 humano, o citocromo P450 C11 humano, o citocromo P450 C11 bovino, e o citocromo híbrido P450 C11 humanobovino.
23. 23. Processo de produção de um esteroide, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de fermentação de uma cepa de levedura como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 22 na presença de uma fonte de carbono simples, e de recuperação do esteroide produzido.

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