JP4620932B2 - ステロイドを自律的に産生する酵母株 - Google Patents

Description

本発明は微生物、特に酵母株でのステロイドの製造に関する。

ステロイド、特にコレステロール由来ステロイドは、とりわけ血流中の炭水化物およびコレステロールのレベル調節、筋肉量の維持および発達、並びに中枢神経系の発達の調節が挙げられる多くの生理学的プロセスに必要とされる。

循環ステロイドレベルの不均衡に関連する事象で観察される障害では、とりわけ自己免疫疾患（例えば狼瘡）、ある種の癌（例えば乳癌）、心脈管系疾患（例えばアテローム性硬化症）のきっかけとなる可能性が挙げられる。ステロイド調節に関する問題ではまた、ある種の神経学的疾患（例えばパーキンソン病またはアルツハイマー病）のきっかけとなる事例が疑われている。

ステロイド、特にヒドロコルチゾンは治療薬としても用いることができるが、また他の治療の補充としても用いることができる。したがって、グルココルチコイドの合成誘導体はその抗炎症性作用のために、さらに高用量では免疫抑制作用を目的として用いられる。

ステロイドの製造は部分的には高価な抽出または合成方法を伴なう。John Warcup Cornforthは、酵素的方法を用いてステロイド（コレステロール）の完全合成を実施した最初の人であった。しかしながら、相応の価格で問題のステロイド、特にコレステロール誘導体を入手する方法を得ることが重要である。

ステロイド生合成に必要とされるいくつかのタンパク質が酵母で発現された。したがって欧州特許EP360361では、酵母菌Kluyveromyces lactisでのタンパク質Ｐ４５０１７αおよびＰ４５０ｃ２１の活性を示している。同様に、Ｐ４５０ｃ１１を発現する遺伝的に改変された酵母菌での１１−デオキシコルチゾルのヒドロコルチゾンへのin vivo変換の可能性が報告され（Dumas et al., 1996）、同じく酵母でのプレグネノロンから１７α−ヒドロキシプロゲステロンの産生が報告された（Degryse et al., 1999）。さらに、Duport
et al.,（1998）は遺伝的改変酵母でのプレグネノロンおよびプロゲステロンの合成を記載している。さらにまた特許出願WO99/40203には、酵母株のＡＴＦ２遺伝子の不活化はこの株によって産生されるステロイドのアセチル化を回避できることが記載されている。

本発明は、単純な炭素源の存在下で遺伝的改変酵母株を発酵させることによってステロイド合成を実施することを可能にする。本発明によって提供される方法は、酵母菌の発酵および市場で容易に入手できる単純炭素源の添加を用いるので、したがって問題のステロイドを大量に低コストで得ることを可能にする。

定義：
本発明にしたがえば、“単純炭素源”という表現は、酵母の通常の増殖のために当業者が用いることができる炭素源を意味する。前記は、特に種々の同化可能な糖（例えばグルコース、ガラクトースまたはシュクロース）または糖蜜またはこれらの糖の副生成物を示すことを意図している。極めて好ましい単純炭素源はエタノールおよびグリセロールである。

本発明にしたがえば、“ステロイド誘導体”という用語は、特に１つまたは２つの酵素反応（parasitic reaction）もしくは化学反応により前記ステロイドから得ることができる化合物を示すことを意図している。前記は、特にアセチル化もしくはヒドロキシル化ステロイドまたは置換基を有するステロイド（例えばハロゲン化（フッ素、ヨウ素）誘導体またはメチル基）を示すことを意図している。

微生物でステロイドを製造することが可能であるためには解決しなければならない種々のタイプの問題が存在する：
‐選択した微生物に存在する内在性酵素のために観察される可能性がある寄生的反応（parasitic reaction）を排除することが望ましい；
‐合成中間体を改変するために遺伝子を導入し、得られる発現レベルを哺乳類で観察されるレベルに可能なかぎり近づけることが望ましい。したがって、正しい均衡を作り直すことが前記のプロジェクトの成功のために重要な条件である；
‐選択したステロイドの生合成を優先的に指令することを可能にする種々の遺伝子の発現レベルを得ることが望ましい。

ステロイド合成は一連の極めて複雑な反応で、コレステロールからコルチゾルを得るためにいくつかの酵素を必要とする。

２０,２２−ジヒドロキシコレステロールが先ず初めに生成され、前記は続いてプレグネノロンに変換され、それ自体ヒドロキシル化されて１７α−ヒドロキシプレグネノロンが生成される。前記は続いて１７α−ヒドロキシプロゲステロンに変換され、前記はデオキシコルチゾルを生じ、コルチゾル（ヒドロコルチゾン）が得られる。

また別の経路はプレグネノロンの生成、続いてプロゲステロンの生成、１７α−ヒドロキシプロゲステロンへの変換から成る。

プレグネノロンは、単純な炭素源から酵母で産生できることが示された（Duport et al., 1998（前記文献の内容は参照により本明細書に組み込まれる））。前記を実施するためには、内在性経路を欠落させ（内在性エルゴステロール生合成経路のΔ２２−ステロールデサチュラーゼ（ＥＲＧ５）遺伝子の破壊による）、Ｃ−２２飽和生成物を蓄積させることが必要であった。具体的には、酵母によって正常に産生されるエルゴステロールは、Ｂ環のＣ−７（８）の不飽和、Ｃ−２２の不飽和およびＣ−２４のメチル基に関してコレステロールと異なっている。したがって、Ｃ−２２およびＢ環のＣ−７が飽和されている生成物は、コルチゾル生成連鎖における酵素の基質として用いることができる。

本発明はステロイド、特にプレグネノロンよりもさらに下流に位置するステロイドの合成を可能にする。前記は、単に遺伝的に改変した酵母株を単純炭素源の存在下で発酵させることによって達成される。本発明のある特定の事例では、合成ステロイドは培養液中に分泌され、これは前記ステロイドの精製を単純化させる。したがって、本発明によって提供される方法は、酵母の発酵および容易に市場で入手できる単純炭素源の添加を用いるので、問題のステロイドを低コストで大量に得ることを可能にする。

本発明にしたがって酵母株で製造することができるステロイドは、好ましくは上記で述べたコルチゾル合成経路に含まれるステロイドである。さらにまた、１７α−ヒドロキシプレグネノロンから他のタイプのステロイド、特にジヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）（１７α−ヒドロキシラーゼおよびリアーゼ酵素の作用による）および誘導ステロイド（アンドロステンジオン、テストステロンなど）を製造することもできる。これらのステロイドは、本発明で実証した株について用いた方法と同じ方法で酵母株に適当な酵素を導入することによって製造できる。

本発明の方法を実施するために、本発明はまた、ステロイドまたはステロイド誘導体を製造する遺伝的に改変された、単純炭素源から自律的な産生が可能であることを特徴とする酵母株に関する。

前記産生が自律的に行われるという事実は、問題のステロイドを得るために基質を添加する必要がないということであり、その結果酵母は出発の単純炭素源のみから前記ステロイドを生成することができる。さらに、本発明の酵母株がステロイド生成の代謝経路を完結させるために必要な全ての遺伝子を含んでいるかぎり、前記株は、代謝経路の上流に位置する基質を用いて前記代謝経路のステロイドを生成することができることもまた明瞭である。

好ましくは、本発明の酵母株は、コレステロール代謝（すなわちコレステロール代謝連鎖の一部分である）の誘導体であるステロイドまたはステロイド誘導体を産生する。コレステロール代謝は当業者には周知であり、生化学および内分泌学の刊行物で説明されている。

したがって、好ましくは前記ステロイドまたはステロイド誘導体は、特に１７α−ヒドロキシプレグネノロン、コルチゾル、コルチゾン、コルテキソロン、１７α−ヒドロキシプロゲステロンおよび前記の誘導体から成る群に含まれる。

さらにまた、本発明の酵母株を用いてプレグネノロンおよびプロゲステロンを製造することができる。

したがって、本発明の目的は特に、コレステロール代謝から誘導されるステロイドまたはステロイド誘導体を単純炭素源から自律的に産生する、遺伝的に改変された酵母株であり、前記ステロイドまたはステロイド誘導体が、１７α−ヒドロキシプレグネノロン、ヒドロコルチゾン、コルテキソロン、１７α−ヒドロキシプロゲステロンおよび前記の誘導体から成る群に含まれることを特徴とする。

後述するように、本発明の酵母株は、以下から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝的改変を有する：内在性遺伝子の破壊または不活化、内在性遺伝子のプロモーターの改変、内在性遺伝子の重複化および少なくとも１つの異種遺伝子の１つもしくは２つ以上のコピーとしてエピソームまたは染色体の一部に導入すること。

さらにまた、本発明の酵母株が前記遺伝子改変の組み合わせを有することは有益である。

後述するように、第一の実施態様では、本酵母株はＥＲＧ５、ＡＴＦ２、ＧＣＹ１、ＹＰＲ１、ＡＲＥ１、ＡＲＥ２、ＡＴＦ１およびＡＤＥ２から成る群から選択される内在性遺伝子の少なくとも１つの破壊を含む。

好ましい実施態様では、本発明の酵母株は、内在性遺伝子ＥＲＧ５、ＡＴＦ２、ＧＣＹ１およびＹＰＲ１の破壊を含む。後述するように、これらの遺伝子は、酵母の寄生的反応を誘発するタンパク質をコードする。

ＡＤＥ２遺伝子に関しては、特に異種遺伝子を酵母株に組み込むために前記ＡＤＥ２遺伝子もまた場合によって破壊することができる。

１つの実施態様では、本発明の酵母株には、少なくとも１つの異種遺伝子がＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、ＧＣＹ１、ＡＴＦ２およびＹＰＲ１から選択される少なくとも１つの遺伝子座で染色体に組み込まれ、前記組み込みは、前記遺伝子座の１つのすぐ近傍の遺伝子内または遺伝子間で実施される。

本発明の１つの実施態様では、前記酵母株は、マルチコピープラスミドまたは低コピープラスミドに配置された少なくとも１つの異種遺伝子を有し、前記マルチコピープラスミ
ドは、サッカロミセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）で複製する酵母の２−ミクロンレプリコン系プラスミドから選択され、前記低コピープラスミドは、酵母の動原体を含む染色体のＡＲＳ複製起点をベースにしたプラスミドから選択される。

下記で展開されるように、本発明を実施するために本発明の酵母株は、ステロールΔ７−レダクターゼ遺伝子、並びにチトクロームＰ４５０ＳＣＣ、アドレノドキシンレダクターゼ、チトクロームｂ５、３β−ヒドロステロイドデヒドロゲナーゼイソメラーゼ、チトクロームＰ４５０レダクターゼ、チトクロームＰ４５０Ｃ１７、チトクロームＰ４５０Ｃ２１およびチトクロームＰ４５０Ｃ１１のｃＤＮＡ、並びに前記のタンパク質をコードする配列から成る群から選択される少なくとも１つの異種遺伝子またはｃＤＮＡを有する。

前記の異種遺伝子またはｃＤＮＡは、酵母の内在性プロモーター配列ＴＤＨ３、ＴＥＦ１、ＰＧＫ１、ＣＹＣ１、ＧＡＬ１０、ＡＴＦ２、ＴＩＲ１、ＡＲＨ１およびＡＤＥ２、並びにハイブリッドプロモーターＧＡＬ１０−ＣＹＣ１から成る群から選択されるプロモーター配列の制御下にある。

導入される異種遺伝子またはｃＤＮＡはいずれもターミネーター配列を用いることを必要としており、前記は好ましくは、内在性遺伝子ＰＧＫ１、ＣＹＣ１、ＡＴＦ２、ＡＤＥ２およびＮＣＰ１のターミネーター配列から選択される。

続いて発現カセットまたは発現ブロックが得られる。前記は、プロモーター、異種遺伝子（またはｃＤＮＡ、場合によってメチオニンをコードするＡＴＧコドンが先行する成熟タンパク質（Ｍｅｔ−ｍａｔ）をコードするか、または細胞の小区画へ誘導するためのシグナルを場合によって有する融合タンパク質をコードする）、およびターミネーター配列から成る。

１つの実施態様では、本発明の酵母株はステロールΔ７−レダクターゼ異種発現ブロックを有し、前記はＡＤＥ２遺伝子座で染色体に組み込まれる。

本発明の特定の実施態様では、酵母株は、Ｐ４５０_SCCおよびＰ４５０_SCCのアドレノドキシン補助因子をコードする遺伝子の発現のための少なくとも１つのカセット（高コピープラスミドに存在する）を含み、さらに本酵母株は、Ｐ４５０_SCCのアドレノドキシンレダクターゼ補助因子の発現のためのカセット（前記カセットはシングルコピープラスミドもしくは低コピープラスミドに存在するかまたは染色体に組み込まれている）を含む。好ましくは、前記の発現カセットはメチオニンが先行する成熟タンパク質を含み、さらに前記タンパク質はサイトゾルに存在する。

１つの実施態様では、酵母株は、３β−ヒドロステロイドデヒドロゲナーゼイソメラーゼの発現のためのカセット、チトクロームＰ４５０ｃ１７またはチトクロームＰ４５０ｃ２１の発現のためのカセットから選択される少なくとも１つの発現カセットを含み、前記カセットは高コピープラスミドもしくは低コピープラスミドに存在するか、または染色体に組み込まれる。

１つの特定の実施態様では、本発明の酵母株は、マルチコピープラスミドに存在する、Ｐ４５０１１βのための少なくとも１つの発現カセット（生成されるタンパク質はミトコンドリアへの誘導のためのシグナルを有する）、および／またはマルチコピープラスミドに存在する、Ｐ４５０１１βのアドレノドキシン補助因子のための少なくとも１つの発現カセットを弱いプロモーター（すなわちその強さはＣＹＣ１プロモーターのそれに合致する）とともに含む（生成されるタンパク質はミトコンドリアへの誘導のためのシグナルを有する）。好ましくは、前記タンパク質は前駆体の形態で生成され、ミトコンドリアに誘導されるための同種または異種シグナルを有し、前記タンパク質はその細胞小区画内でそ
れら自身の成熟形を得る。

したがって、本発明の特に好ましい実施態様では、アドレノドキシンをコードする遺伝子の２つのコピーが酵母株に導入され、そのうちの１つは細胞のサイトゾルで発現され、他方は成熟タンパク質がミトコンドリアに存在できるように生成されることを特記することは重要である。

特定の実施態様では、酵母株はまた、少なくとも１つの発現カセット（ＮＣＰ１、ＡＴＲ１および／またはＡＴＲ２遺伝子のコード部分、上記の発現プロモーター、それ自身のターミネーターまたは上記で規定したターミネーターを含む）を含み、前記カセットはマルチコピープラスミドもしくは低コピープラスミドに存在するか、または染色体に組み込まれる。ＮＣＰ１、ＡＴＲ１およびＡＴＲ２のための発現カセットは特にサッカロミセス
セレビシエ（S. cerevisiae）のＮＣＰ１遺伝子座に組み込むことができる。

１つの特定の実施態様では、本発明の酵母株はまた、哺乳類のアドレノドキシンレダクターゼと同種のＡＲＨ１ｐタンパク質をその生理学的発現レベルよりも高いレベルで酵母内で発現させる。このタンパク質の過剰発現は当業者に周知の技術を用いて、例えばその内在性遺伝子の他に、新しい発現カセット（発現プロモーター、それ自身のターミネーターまたは上記で規定したターミネーターを有するＡＲＨ１遺伝子のコード部分）を酵母に導入することによって達成することができる。実際驚くべきことに、その生理学的な発現レベルよりも高いレベルでのＡＲＨ１遺伝子の発現は、生成されるステロイドの量を顕著に増加させることが示された。しかしながら、この発現は所望の効果を得るためにはあまりに高すぎてはいけない。したがって、生理学的レベルよりも高いレベルのＡＲＨ１タンパク質の発現を所望する場合は、前記タンパク質があまりに強く過剰発現されないように注意すべきで、そうでなければステロイド産生の増加を損なう危険性がある。

本発明の酵母株は、本発明の実施に有害でないかぎり、性質として倍数体、二倍体、半数体または異数体であってもよい。

好ましくは本発明の酵母株は、サッカロミセス セレビシエの株、特にＦＹ１６７９−２８ｃおよびＦＹ１６７９−１８ｂ株の１つに由来する。前記は、American Type Culture Collectionに寄託されたＦＹ１６７９株（＃９６６０４）の胞子である。

本発明の目的はまた酵母株であり、前記株は、ＣＤＲ０７Ｍａｔ−αまたはＴＧＹ２６０株であり２００１年１月２４日にＣＮＣＭに寄託されそれぞれ寄託番号Ｉ−２６１６およびＩ−２６１５を有することを特徴とする。本発明はまた、ＣＤＲ０７Ｍａｔ−αおよびＴＧＹ２６０の交雑、並びに場合によって胞子形成、および酵母から得たプラスミドによる形質転換の後に得られる株、特に本発明に記載した株ＵＣＹ２およびＵＣＹ４並びに株ＵＣＹ３およびＵＣＹ２６に関する。本発明の目的はまた、ＵＣＹおよびＴＧＹ２４５の交雑、並びに場合によって胞子形成、および酵母から得た少なくとも１つのプラスミドによる形質転換後に得られた酵母株、特にＵＣＹ５、ＵＣＹ６、ＵＣＹ１６、ＵＣＹ２０、ＵＣＹ２４、ＵＣＹ２５およびＵＣＹ２６（前記もまた本発明で開示される）株である。

本発明の酵母株が産生されたステロイドを培養液中に分泌するために必要な成分をもち、最終生成物の精製を単純化させることは有益である。

本発明はまたステロイドの製造方法にも関する。前記方法は、本発明の酵母株を単純炭素源の存在下で発酵させ、さらに前記産生されたステロイドを回収する工程を含むことを特徴とする。

最後に本発明の目的はまた、本発明の酵母株、場合によって医薬として許容できる賦形剤（例えば当業者に周知の賦形剤）を含む医薬調製物である。

本発明の酵母株は単純炭素源から自律的にステロイドを産生するが、前記はまた、下流に位置する生成物を得るために、コレステロールもしくは関連する構造を有するステロイドまたはコレステロール誘導体として既に存在する基質を提供することもできる。任意の段階、特に所望のステロイドの代謝経路でプレグネノロンレベルまたはそれより先の段階で経路に入ることができるということは、したがって特に酵母に非天然の基質を提供することを可能にし、これによって、非天然ステロイドおよび置換ステロイド、特にフッ素化ステロイドの合成が得られる。

第一の実施態様では、本発明の酵母株は、特に所望のステロイド（特にコルチゾル）を１０mg／Ｌを越える量で、好ましくは５０mg／Ｌ、より好ましくは８０mg／Ｌ、さらに好ましくは１００mg／Ｌ、なお好ましくは２００mg／Ｌを超える量で製造することを可能にする。

別の実施態様では、問題のステロイド（好ましくはヒドロコルチゾン）は、本発明の株によって産生される（特に合成中間体としての）全ステロイドの２０％を越える割合で、好ましくは２５％、よりこのましくは３０％、さらに好ましくは３５％、なお好ましくは４０％、さらに好ましくは５０％、さらに好ましくは６５％で存在する。

本発明の酵母株が問題のステロイドを産生することを可能にするために、前記株が遺伝的改変を有することが必要である。したがって、本発明の酵母株は以下から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝的改変を有する：内在性遺伝子の破壊または不活化、内在性遺伝子のプロモーターの改変、内在性遺伝子の重複化および少なくとも１つの異種遺伝子（特に同種プロモーターおよび／またはターミネーター並びに異種コード部分を有する発現ブロック）の１つもしくは２つ以上のコピーとしてエピソームにまたは染色体の一部への導入。

好ましくは、本発明の酵母株は、上記で述べたいくつかの（少なくとも４つの）遺伝的改変を有する。

したがって、前記酵母のいくつかの内在性遺伝子は有利には不活化または破壊される。前記遺伝子は、そのコード配列中に下記で述べるように、外来性遺伝子（特に同種プロモーターおよび／またはターミネーター並びに異種コード部分を有する発現ブロック）および／または選別可能なマーカーを導入することによって不活化または破壊することができる。これら遺伝子のプロモーターを改変し、発現レベルを低下させることもまた可能である。

酵母の遺伝子ＡＴＦ２（Cauet et al., 1999）は、プレグネノロンを基質として用いるアセチルトランスフェラーゼをコードし、前記の破壊は、この寄生的アセチル化反応（parasitic acetylation reaction）を排除し、前記の生成物をその後用いることができず、したがって問題のステロイドの収量を増加させることができる。したがって、前記収量は、ＡＴＦ２遺伝子の不活化後３から７倍増加させることができる。

ＧＣＹ１およびＹＰＲ１遺伝子はアルド−ケトレダクターゼをコードする。これらの遺伝子は有利には不活化または破壊される。前記２つの遺伝子は、多かれ少なかれ同質の６つの遺伝子が属するファミリーの一部分である（前記６つの全てはアルド−ケトレダクターゼをコードすると思われる。しかしながら、これら遺伝子（特にＧＣＹ１）の生成物は本明細書で検討される基質に対してもっとも強い活性を有し、したがってその不活化はヒドロコルチゾンを得るために極めて有利である。

上記で具体的に述べたように、ＥＲＧ遺伝子を不活化し、コレステロールの構造に可能なかぎり近い構造を有する基質を蓄積することは有益である。他方、本発明の酵母は、この遺伝子の活性にもかかわらず問題のステロイドを産生することができることが示された。しかしながら、収量を最適化させるために、突然変異誘発、欠失および／または挿入によって前記を不活化することが有用であろう。

さらにまた、本発明の酵母によるステロイド生成の全体的な成功に必須であるとはいえないが、他の遺伝子（例えばＡＲＥ１、ＡＲＥ２、ＡＤＥ２またはＡＴＦ１）を不活化することも可能である。前記遺伝子は全て、その欠如が問題のステロイドの全体的な合成収量を改善することができるタンパク質をコードする。

上記で引用したDuport et al.（1998）の文献に記載されているように、同種のプロモーターおよび／またはターミネーターおよびΔ７−レダクターゼをコードする配列を有する発現ブロックの存在は、エルゴステロールおよびその誘導体の７−８二重結合を脱飽和させ、したがってコレステロール（プレグネノロンの生成のための出発基質）の構造により近い構造を有する１つまたは２つ以上の前駆体を得ることを可能にさせるということで有用であることが示されている。したがって、本発明の酵母株がこの発現ブロックを含むことは有益である。特定の事例では、Δ７−レダクターゼのための前記発現ブロックは、好ましくはＡＤＥ２遺伝子座で酵母ゲノムに組み込まれ、同様にＡＤＥ２遺伝子の破壊をもたらす。転写に用いられるプロモーターは誘発性プロモーター（例えばＧＡＬ１０−ＣＹＣ１）または構成性プロモーター（例えばＧＡＬ１０−ＧＡＬ１０−ＣＹＣ１プロモーター（これはDuport et al.（1998）の文献に記載されている株ＣＡ１０では破壊されている）である。優先的に使用されるタンパク質は、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）に由来し（ただし哺乳類の種に由来するものもまた可能である）、ｃＤＮＡは天然の形態でクローニングされ（転写開始メチオニンのすぐ後の相補性ＤＮＡ）、さらに、酵母では一般的な転写ターミネーター（例えばＰＧＫ１）の制御下にある。

酵母のΔ７−レダクターゼ遺伝子の活性はLecain et al.（1996）によって報告されたことは特記されるべきであり、前記文献の技術内容（特にΔ７−レダクターゼ遺伝子の配列並びにその構築および方法）は参照により本明細書に組み込まれる。

最初の工程はプレグネノロンの生成で、前記はコレステロールをプレグネノロンに正常に変換する酵素を酵母に導入後達成される。本事例では、これは、側鎖を切断するための酵素（側鎖切断のためのＰ４５０_ssc）で、２つの補酵素（アドレノドキシ（ＡＤＸ）およびアドレノドキシンレダクターゼ（ＡＤＲ））を伴なう。これらの対応する発現ブロックによる酵母の形質転換は上記に引用したDuport et al.（1998）の文献に記載されている。

成熟タンパク質をコードする相補的ＤＮＡ（翻訳を可能にするためにそのＮ末端にメチオニンが付加されている）が好ましくは用いられる。プロモーターは例えばＧＡＬ１０−ＣＹＣ１ハイブリッドプロモーターまたはＴＥＦ１プロモーターが用いられ、ｃＤＮＡの転写が確保される。通常のターミネーター（特にＰＧＫ１ターミネーター）が用いられる。

Ｐ４５０_ssc、ＡＤＲまたはＡＤＸタンパク質をコードする種々のｃＤＮＡは脊椎動物由来、例えばヒトまたはウシ由来であるが、ラットまたは魚類もまた可能である。これらタンパク質をコードする遺伝子は好ましくはプラスミドに配置される。Ｐ４５０_sscおよびＡＤＸの場合は、マルチコピー、低コピーまたは高コピープラスミド、特に２ミクロン
酵母プラスミドに由来するものが好ましいが、一方、シングルコピープラスミドまたは低コピープラスミドがＡＤＲの発現にはむしろ用いられる。ＡＤＲのための発現ブロックはまた酵母の染色体に組み込むことができる。これはＡＤＲの発現の制御を可能にする。なぜならばあまりに高い発現は所望のｓｃｃ活性に有害であるように思われるからである。

前記タンパク質は、好ましくはそれらの活性をサイトゾルで示すことができるように発現される。

次の工程は、１７α−ヒドロキシラーゼ（Ｐ４５０ｃ１７）および３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３β−ＨＳＤ）の合同作用によるプレグネノロンの１７α−ヒドロキシプロゲステロンへの変換である。

前記２つのタンパク質を発現させるために、好ましくは強力なプロモーター（例えばＴＥＦ１、ＴＤＨ３またはＧＡＬ１０−ＣＹＣ１）が用いられる。しかしながら、より弱いプロモーター（例えばＣＹＣ１）もまた適当である。使用されるターミネーターは通常のものであり、特にＰＧＫ１またはＮＣＰ１遺伝子に由来する。完全なタンパク質をコードする相補性ＤＮＡが発現される。これらタンパク質が由来する種によって得られる結果が変更されるとは思われない。したがって、ヒト由来のタンパク質（特に３β−ＨＳＤの２つのアイソタイプの一方または他方）、ウシ由来のタンパク質または他の生物由来（特に魚類由来）のタンパク質を用いることが可能である。これら２つのタンパク質の場合、可能なかぎり最良の発現を得ることが問題である、したがって、それらはシングルコピーまたはマルチコピープラスミド、低コピーまたは高コピープラスミドで発現させることもできるし、または酵母の少なくとも１つの染色体に発現ブロックを組み込むことによって発現させることもできる。

続いて、Ｐ４５０ｃ２１（これは２１位のヒドロキシル化を可能にする）を介する１７α−ヒドロキシプロゲステロンのデオキシコルチゾルへの変換が求められる。その問題は、可能なかぎりもっとも効果的な方法でそのｃＤＮＡから前記タンパク質を発現させることである。そのために、強力なプロモーター（ＴＥＦ１、ＴＤＨ３、ＧＡＬ１０−ＣＹＣ１など）またはＣＹＣ１プロモーターでさえも用いられ、さらに通常的なターミネーターが用いられ転写ユニットがデザインされる。前記ユニットはシングルコピーまたはマルチコピープラスミド、低コピーまたは高コピープラスミドに配置されるか、または別には酵母のゲノムに組み込まれる。由来する種がこの場合は重要であると考えられ、ヒト由来のＰ４５０ｃ２１を用いることが好ましいということに注目すべきである。

続いて、デオキシコルチゾルは、Ｐ４５０ｃ１１系（Ｐ４５０ｃ１１を含む）（Ｐ４５０ｃ１１系は１１−β位でヒドロキシル化させる）並びに補助因子としてアドレノドキシンおよびアドレノドキシンレダクターゼの作用によりコルチゾルに変換される。

本出願の発明者らは、この最後の系が酵母ミトコンドリアの内膜内で発現されるときに、より良好な結果が得られることを示した。したがって、前駆体として酵母のミトコンドリアへの誘導配列Ｃｏｘ６ｐタンパク質前駆体を含む融合タンパク質を生成させることが有利である。

好ましくは、成熟タンパク質をコードするｃＤＮＡもまた用いられる。したがって、Ｐ４５０ｃ１１タンパク質はヒトまたはウシ由来のタンパク質であるか、またはヒト−ウシハイブリッドタンパク質である。後者の構築物が本発明の実施に好ましい形態である。転写ユニットに用いられる遺伝子は好ましくはＣＹＣ１プロモーターの制御下にある。ウサギβ−グロビンのイントロンおよびヒト成長ホルモン遺伝子のターミネーターを前記コード配列の３’位に配置するのが有利である。転写ユニットは好ましくはマルチコピープラスミドに配置される。

アドレノドキシンはその成熟形で用いられ、ミトコンドリアへ誘導するための配列（例えばＣｏｘ６ｐ、Ｃｏｘ４ｐ、フマラーゼ、ＡＲＨ１ｐおよびＦ９ＡＴＰアーゼタンパク質前駆体の配列から選択される）と一緒に、特にＴＤＨ３、ＴＥＦ１およびＣＹＣ１から選択されるプロモーターの制御下に配置される。ウシまたはヒト由来のタンパク質が好ましい。ターミネーター（ＰＧＫ１であってよい）は、転写ユニット内に配置されるべきである。発現ブロックは好ましくはマルチコピープラスミドから発現される。

アドレノレダクターゼとして作用するタンパク質はＡＲＨ１タンパク質（内在性酵母タンパク質）であり、前記は通常ではホストのミトコンドリア内で発現される。しかしながら、好ましくは前記酵母は、ホスト株がＡＲＨ１遺伝子の天然のコピーおよびＣＹＣ１プロモーター下にある第二のＡＲＨ１遺伝子コピーを含むように形質転換される。前記タンパク質の活性は所望の活性を得るために必須であり、前記遺伝子の不活化は酵母にとって致死的であることさえ観察された（Lacour et al., 1998）。前記遺伝子の過剰発現はこの生物にとって有毒であるように思われ、したがって選択プロモーターによって、酵母にとって有害でない所望の１１−βヒドロキシラーゼ活性をもたらすレベルの発現が許容されるべきであるということは特記されねばならない。

実際驚くべきことには、生理学的発現レベルよりも高いレベルでのＡＲＨ１遺伝子の発現は、ステロイド産生量を増加させることが示された。しかしながら、上記で述べたように、この発現は所望の効果を得るためにはあまりに強すぎてはいけない。したがって、生理学的レベルよりも高いレベルでのＡＲＨ１タンパク質の発現が所望される場合は、前記タンパク質があまりに強く過剰発現しないように注意を払わなければならない。そうでなければ、ステロイド産生における前記の増加を失う危険性が存在する。例えば、ＡＲＨ１のための発現カセット（プロモーターとしてＣＹＣ１プロモーターを含む）のサッカロミセス セレビシエのＬＥＵ２遺伝子座への組み込みは満足できる発現レベルおよび結果をもたらす。他方、ＴＥＦ１プロモーターを含むカセットの同じ遺伝子座での組み込みはＣＹＣ１プロモーターよりもはるかに強力であるが、不都合な結果がもたらされる。

したがって、好ましくはＡＤＸ補酵素タンパク質をコードする転写ユニットの２つのコピーが導入され、それらの一方はミトコンドリア外で、特にサイトゾルで活性を有し、他方はホスト細胞のミトコンドリア内で活性を有する。

さらにまた他の遺伝子、特にＮＡＤＰＨＰ４５０レダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、例えばＮＣＰ１（ＣＰＲ１とも称される酵母のレダクターゼ）、ＡＴＲ１もしくはＡＴＲ２（植物レダクターゼ）、またはヒトレダクターゼを導入することもできる。前記タンパク質はＰ４５０ｃ１７およびＰ４５０ｃ２１の活性を改善する。内在性プロモーター（ＮＣＰ１）を用いるか、または前記タンパク質をコードするＤＮＡを、ＧＡＬ１０−ＣＹＣ１、ＣＹＣ１、ＴＥＦ１などのようなプロモーターの制御下に配置する。

また強力なプロモーター（例えばＧＡＬ１０−ＣＹＣ１）の制御下に置いたＴＧＬ１遺伝子（脱エステル化活性を有するタンパク質をコードする）をマルチコピープラスミドまたはシングルコピープラスミドで導入することもできる。これによって、ステロールエステル化の寄生的反応（ＡＴＦ２の不活化後でさえも残留している可能性がある）、特にＡＲＦ１およびＡＲＦ２遺伝子生成物によって産生されるものの影響を減少させることができる。

さらにまた、酵母または別の種に由来するチトクロームｂ５（上記で規定した反応のいくつかにおける補助因子である）を発現するプラスミドを付加することもできる。

ＤＨＥＡを生成することを所望するときは、ＧＡＬ１０−ＣＹＣ１、ＣＹＣ１またはＴＥＦ１のようなプロモーターの制御下に置いたデスモラーゼ（Ｐ４５０１７α）をコードする、ＰＧＫ１ターミネーターを含む低コピーまたは高コピープラスミドを導入することもまた可能である。

さらにまた、リアーゼ活性を有するチトクロームＰ４５０ｃ１７をコードするｃＤＮＡ（例えばヒト由来）を、過剰なＮＡＤＰＨＰ４５０レダクターゼ（例えば哺乳類レダクターゼ）の存在下で、ＮＣＰ１、ＡＴＲ１またはＡＴＲ２とともに導入することもできる。これらの転写ユニットには好ましくは強力なプロモーターを用いる。

最後に、プレグネノロンによって抑制されていた内在性ＥＲＧ６およびＥＲＧ２遺伝子の活性を、強力な構成性プロモーターの制御下に置くことによって回復させることができる。

また、他の異種遺伝子（特に２４，２５ステロールレダクターゼ活性をもつタンパク質をコードする遺伝子、またはヒトのコレステロールに関する合成経路に存在するＨＭＧ１遺伝子）を導入することもできる。ヒトのＭＤＲ１遺伝子（プレグネノロンによるＥＲＧ６の抑制のために出現する異常なステロールの蓄積によって抑制されないポンプをコードする）を導入することもまた有益である。これによって、これら生成物（その大量の蓄積はホスト細胞にとって有毒であることが証明できよう）の排除を可能にする。

また、酵母のＰＤＲ１２遺伝子を過剰発現させることもできる。前記は酵母の増殖を抑制するおそれのあるステロイドに対して無毒化作用を有するであろう。

上記で“遺伝子”というとき、前記用語は、所望の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡフラグメント（および特に成熟形を表すｃＤＮＡフラグメント）だけでなく、プロモーター（特にＴＥＦ１、ＧＡＬ１０−ＣＹＣ１、ＣＹＣ１、ＴＤＨ３）およびターミネーター（特にＰＧＫ１）も意味することが意図される。これらの転写ユニットは、好ましくは低コピーもしくは高コピープラスミドに導入されるか、または酵母の染色体に組み込まれる。

さらにまた、所望の目的および特に製造しようとするステロイドに応じて、各工程の種々のタンパク質をコードする遺伝子のいくつかだけを導入し、酵母に中間体を提供して、代謝連鎖の下流に存在するステロイドを得ることができることは理解されよう。

さらにまた、下流に位置する生成物を得るための遺伝子を導入しないで，したがって代謝連鎖の比較的上流で停止させることも容易である。

本発明の実施に用いられる酵母は好ましくは以下のものである：
−ＦＹ１６７９−２８ｃ株−（Duport et al.（1998）により報告された）、前記株は以下の遺伝子型を有する（ＭＡＴα、ｒｈｏ^-、ｕｒａ３−５２、ｔｒｐ１Δ６３、ｌｅｕ２Δ１、ｈｉｓ３Δ２００、ＧＡＬ２、ｆｅｎ１）。前記株はまたThierry et al.（1990）によって記載された；
−ＦＹ１６７９−１８ｂ株、以下の遺伝子型を有する（ＭＡＴａ、ｒｈｏ^-、ｕｒａ３−５２、ｔｒｐ１Δ６３、ｌｅｕ２Δ１、ｈｉｓ３Δ２００、ＧＡＬ２、ｆｅｎ１）。
前記２つの株は、したがって同一の遺伝子型および反対のサインを有する。

下記の実施例は本発明の実施態様の説明であり、本発明を制限するものと解すべきではない。
構築のためには、上記で述べたＦＹ１６７９−２８ｃおよびＦＹ１６７９−１８ｂ酵母株を出発物質として用いる。

ＹＰＲ１遺伝子の破壊
プラスミドｐＰＯＬＹIII内でＵＲＡ３遺伝子によってＹＰＲ１遺伝子が中断されてある構築物（ＹＤＲ３６８ｗ）を連続した４つのＰＣＲによって得た。最初に、３つのそれぞれ別個のＰＣＲを実施し、ＹＰＲ１遺伝子の５’部分（ＰＣＲ５）、ＹＰＲ１配列と境を接する機能的ＵＲＡ３遺伝子（ＰＣＲ６）およびＹＰＲ１遺伝子の３’部分（ＰＣＲ７）を得た。

ＰＣＲ５ＤＮＡは、オリゴヌクレオチドＯＴＧ１１３１４（配列識別番号１）およびＯＴＧ１１３１５（配列識別番号２）を用いゲノムＤＮＡマトリックスで増幅することによって得た。同様にＰＣＲ７ＤＮＡは、同じマトリックスでオリゴヌクレオチドＯＴＧ１１３１６（配列識別番号３）およびＯＴＧ１１３１７（配列識別番号４）を用いて増幅することによって得られる。

５’および３’ＹＰＲ１領域と側面を接するＵＲＡ３遺伝子は、オリゴヌクレオチドＯＴＧ１１４６３（配列識別番号５）およびＯＴＧ１１４６４（配列識別番号６）を用い、Degryse et al.（1995）が記載したマトリックスｐＴＧ１００５４（前記文献は前記プラスミドの記載に関し参照により本明細書に組み込まれる）で増幅される。

生成物、ＰＣＲ５、ＰＣＲ６およびＰＣＲ７を等モル濃度で混合し、続いてオリゴヌクレオチドＯＴＧ１１３１４（配列識別番号１）およびＯＴＧ１１３１７（配列識別番号４）を用いてＰＣＲで増幅し、生成物ＰＣＲ８を得た。

前記ＰＣＲ８生成物をＸｈｏＩ酵素で消化し、続いて、ＸｈｏＩで消化したプラスミドｐＰＯＬＹIII（Lathe et al., 1987（前記文献はこのプラスミドの記載に関し参照により本明細書に組み込まれる））にサブクローニングしてプラスミドｐＴＧ１２０１１を得た。プラスミドｐＰＯＬＹIIIへの挿入の方向は、ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ酵素での消化によって決定した。

プラスミドｐＴＧ１２０１１（前記プラスミドは寄生的ＹＰＲ１遺伝子のＵＲＡ３遺伝子による破壊を可能にする）をＸｈｏＩ酵素で消化する。前記消化生成物を用い、当業者に周知の塩化リチウム法でＦＹ１６７９−１８ｂ株を形質転換する。形質転換体をウラシル非含有培地で選別する。プラスミドｐＴＧ１２０１１の構築に用いたオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ増幅を実施して形質転換体を分析する。

続いて、この検査で陽性のクローンを、炭素源としてグルコースの存在下で下記に述べる１７ＯＨ−プロゲステロンのバイオ変換法によりスクリーニングする。バイオ変換能力は、Dumas et al.（1996）および Degryse et al.（1999）（前記文献の内容、特にバイオ変換実験の説明は参照により本明細書に組み込まれる）が記載したＨＰＬＣによって、またはKuronen et al.（1999）が記載したように分析される。クローン、ＴＧＹ１９５＃４を更なる性状決定のために選別する。ＴＧＹ１９５＃４株は、１μgのプラスミドＹＲｐ７（Parent et al., 1985；前記文献は前記プラスミドの記載に関し参照により本明細書に組み込まれる）および５μgのプラスミドｐＴＧ１２０４５（下記に記載）（ＮｏｔＩで消化）の両プラスミドを用いて形質転換される。形質転換株をトリプトファン非含有培地で選別する。コロニー（６７８コロニー）をトリプトファン含有培地でサブ培養し（プラスミドＹＲｐ７を除去するため）、さらにトリプトファンおよび５−フルオロオロテート（５Ｆ０）を含む培地でサブ培養し、ＹＰＲ１遺伝子を中断させているＵＲＡ３遺伝子を失ったコロニーを選別する。

種々のプラスミドの構築
酵母でＰ４５０ｃ２１タンパク質を過剰発現させるために、２つのタイプのプロモーター、ＴＥＦ１（転写伸長因子１）およびＴＤＨ３（グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ３）を用いた。全ての事例で、転写ターミネーターはＰＧＫターミネ
ーターである。これらのプラスミドで、ＳａｌＩ、ＭｌｕＩフラグメントはヒトＰ４５０ｃ２１ｃＤＮＡを含む。

ａ）プラスミドｐＴＧ１０４７０およびｐＴＧ１０４６９の構築
プラスミドｐＴＧ１０２８９は、ＫｐｎＩおよびＭｌｕＩでｐＭＡｃ２１（Wu et al.,
1991）を消化し、オリゴヌクレオチドＯＴＧ５８６８（配列識別番号２７）を導入することによってｐＭＡｃ２１を改変して得られた。

前記プラスミドのｃＤＮＡは、American Type Culture Collection（ATCC, Rockville,
Maryland, USA）からｐｃ２１／３ｃの名称で得られる。前記は１.６ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントで、種々のプラスミドの構築のためのベースとして用いられた。導入された改変は上記文献および他の文献（Hu et al., 1990）に記載されている。

この方法では、ｐ４５０ｃ２１のための発現カセットを含むプラスミドｐＭＡｃ２１のＰ４５０ｃ２１の非コード部分は、その中にＫｐｎＩ部位が存在するので除去した。

プラスミドｐＴＧ１０２９２は、プラスミドｐＴＧ１０２８９のヒトｃ２１ｃＤＮＡ（ＳａｌＩ、ＭｌｕＩフラグメント）をプラスミドｐＴＧ１００３１にＳａｌＩおよびＭｌｕＩ部位を用いて移動させることによって得られた。プラスミドｐＴＧ１００３１はDegryse et al.（1995）が報告した（前記文献は参照により本明細書に組み込まれる）。

プラスミドｐＴＧ１０４７５はＰＣＲおよび組換えによって得られた。具体的には、ｐＴＧ１０２９２を用い、約２５０ヌクレオチドのヒトＰ４５０ｃ２１ｃＤＮＡのフラグメントをオリゴヌクレオチドＯＴＧ７４１０（配列識別番号７）およびＯＴＧ５９７２（配列識別番号８）により増幅した。このフラグメントは、ヒトＰ４５０ｃ２１、ＳａｌＩ部位および配列ＡＡＡＡを含む。

前記フラグメントをＳａｌＩで消化し、続いて、ＳａｌＩで消化したｐＴＧ１０２９２の直鎖状フラグメントに連結し、さらにＢＪ５１８３（Degryse et al., 1995）で組換え実験を実施した。

得られたプラスミド、ｐＴＧ１０４７５は、プラスミドｐＭＡｃ２１と異なり、天然のｃＤＮＡのそれと同一のコード配列を有するＰ４５０ｃ２１ｃＤＮＡを、本発明者らが一般的に用いるベクターに適合するフラグメント（すなわちＳａｌＩおよびＭｌｕＩ制限部位と境界を接するフラグメント）上に含む。前記フラグメントは翻訳開始のためのＡＴＧコドンの周囲に以下の環境を有する：
ＧＴＣＧＡＣＡＡＡＡＡＴＧＣＴＧＣＴＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣ（配列識別番号９）。

前記プラスミドを用いて、ヒトｐ４５０ｃ２１ｃＤＮＡを有するＳａｌＩ、ＭｌｕＩフラグメントを、プラスミドｐＴＧ１０１５８（Degryse et al., 1995）に通常のクローニングによって移してプラスミドｐＴＧ１０４７２を作製した。

プラスミドｐＴＧ１０４７２の同じＳａｌＩ、ＭｌｕＩフラグメントを続いてプラスミドｐＴＧ１００８５（Degryse et al., 1995）に通常のクローニングによって移し、プラスミドｐＴＧ１０４６９を作製した。このプラスミドはしたがって、ＴＥＦ１プロモーターの制御下のヒトＰ４５０ｃ２１ｃＤＮＡをＰＧＫ１ターミネーターとともに有する。

ＳａｌＩとＭｌｕＩとの制限フラグメント上にＰ４５０ｃ２１ｃＤＮＡを有するこの同じフラグメントをＢＪ５１８３株の組換えによってプラスミドｐＧＴ１００９２に移し、プラスミドｐＧＴ１０４７０（Degryse et al., 1996）を作製する。

したがって、プラスミドｐＧＴ１０４７０は、ＴＥＦ１プロモーターおよびＰＧＫ１ターミネーターの制御下にＰ４５０ｃ２１ｃＤＮＡを有し、上記に述べたＡＴＧ開始コドンの環境とともにＵＲＡ３−ｄ選別マーカーを含む。

ｂ）プラスミドｐＴＧ１２０３６の構築
プラスミドｐＴＧ１２０３６は４工程でｐＴＧ１０８０２から構築された。プラスミドｐＴＧ１０８０１（前記からプラスミドｐＴＧ１０８０２が得られた）は、一連の制限部位がＸｈｏＩ部位とＸｈｏＩ部位との間に挿入されたｐＵＣ型のプラスミドである。前記一連の部位にはＨｉｎｄIII、ＳｎａｂＩ、ＣｌａＩおよびＳｐｅＩ部位が含まれる。

ｐＴＧ１０８０１のＨｉｎｄIII部位とＣｌａＩ部位との間に、ｐＴＧ１０４７０のＨｉｎｄIII、ＣｌａＩカセット（ＴＥＦ１プロモーター、ヒトＰ４５０ｃ２１ｃＤＮＡおよびＰＧＫ１ターミネーターを含む）を挿入し、ｐＴＧ１０８０２を作製した。

続いて、前記プラスミドをＸｈｏＩで消化し、したがって導入したカセットを欠落させてＸｈｏＩ部位と境を接するＰＣＲフラグメントを導入する。この２.５ｋｂフラグメントは、プラスミドｐＴＧ１２０１０＃４０（下記参照）をマトリックスとしてオリゴヌクレオチドＯＴＧ１１８４４（配列識別番号１０）およびＯＴＧ１１８４５（配列識別番号１１）対を用い増幅により生成され、それによってＸｈｏＩ部位と境を接するフラグメント（その５’位でＣｌａＩ制限部位と境を接するＵＲＡ３遺伝子により中断されたＧＣＹ１遺伝子を含む）が得られる。

前記フラグメントをプラスミドｐＴＧ１０８０２のＸｈｏＩ部位の間でクローニングし、プラスミドｐＴＧ１２０３５を得る。プラスミドｐＴＧ１２０１０＃３６を失われたＨｉｎｄIII部位を導入する目的で用いた。前記プラスミドは本質的にｐＴＧ１２０１０＃４０と同一であるが、しかし前記はＧＣＹ１遺伝子との境界のＵＲＡ３遺伝子の３’側に位置するＨｉｎｄIII部位を有するが、ＧＣＹ１遺伝子との接合部のＵＲＡ３遺伝子の５’側に位置するＣｌａＩ部位をもたない（下記参照）。２.２ｋｂのＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩフラグメント間における大腸菌でのin vivo組換えによって、プラスミドｐＴＧ１２０３６が得られる（前記フラグメントは、ＵＲＡ３遺伝子の５’から３’方向フラグメント、ＧＣＹ１遺伝子の３’フラグメント、および最終のｐＧＴ１２０３５の一部分（すなわち大きな４.４５ｋｂのＳｔｕＩ、ＡｆｌIIフラグメント）を含む）。

得られたプラスミドｐＴＧ１２０３６は、ＣｌａＩおよびＨｉｎｄIII部位とそれぞれ５’および３’位で境を接するＵＲＡ３遺伝子によって中断されたＧＣＹ１遺伝子を有する。続いて、前記フラグメントを、プラスミドｐＴＧ１０４６９（上記参照）の２.３３ｋｂのＣｌａＩ、ＨｉｎｄIIIフラグメントにより運ばれるＰ４５０ｃ２１のための発現カセットで置換して、プラスミドｐＴＧ１２０８６を得る。

ｃ）プラスミドｐＴＧ１２０４５の構築
プラスミドｐＰＯＬＹIIIのただ１つのＳｐｈＩ部位をオリゴヌクレオチドＯＴＧ１１９７５（配列識別番号１２）およびＯＴＧ１１９７６（配列識別番号１３）の相補対を挿入することにより破壊する。

ｐＰＯＬＹIIIのＳｐｈＩ部位を破壊し、ＣｌａＩ部位で置き換え、プラスミドｐＴＧ１２０４０を作製した。ＹＰＲ１遺伝子の０.７ｋｂの３’フラグメントに対応するＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩゲノムＤＮＡフラグメント（オリゴヌクレオチドＯＴＧ１１９８１（配列識別番号１４）およびＯＴＧ１１９８２（配列識別番号１５）を用いて増幅により得られる）をただ１つのＣｌａＩおよびＥｃｏＲＩ部位間に導入してプラスミドｐＴＧ１２０４１を作製する。

この２.８４ｋｂのプラスミドｐＴＧ１２０４１で、０.６６ｋｂのＹＰＲ１遺伝子の５’部分（野生型酵母ゲノムＤＮＡからオリゴヌクレオチドＯＴＧ１１３１４（配列識別番号１）およびＯＴＧ１１９８０（配列識別番号１６）により増幅）を、プラスミドｐＴＧ１２０４１のＳａｌＩおよびＨｉｎｄIII部位の間で、ＸｈｏＩ、ＨｉｎｄIIIフラグメントの形でクローニングする。

３.５ｋｂのプラスミドｐＴＧ１２０４２が得られる。このプラスミドは、ＣｌａＩおよびＨｉｎｄIII部位によって中断されたＹＰＲ１遺伝子を含む。チトクロームＰ４５０Ｃ２１カセットは、プラスミドｐＴＧ１０４６９に由来する２．３３ｋｂのＣｌａＩ、ＨｉｎｄIIIフラグメントの形態で前記部位間でクローニングされる。プラスミドｐＴＧ１
２０４５は前記のようにして得られる。

ｄ）プラスミドｐＴＧ１２０１０＃３６および＃４０の構築
プラスミドｐＴＧ１２０１０はプラスミドｐＵＣ１９（Yanisch-Perron et al., 1985）をベースに構築し、一方、プラスミドｐＴＧ１２０１１はプラスミドｐＰＯＬＹIII（Lathe et al., 1987）をベースに構築した。

プラスミドｐＵＣ１９内でＵＲＡ３遺伝子によってＧＣＹ１遺伝子が破壊された構築物を４つの連続したＰＣＲ増幅によって得た。最初に３つのそれぞれ別個のＰＣＲを実施し、ＧＣＹ１遺伝子の５’部分（ＰＣＲ１）、ＧＣＹ１配列と境を接する機能的ＵＲＡ３遺伝子（ＰＣＲ２）およびＧＣＹ遺伝子の３’部分（ＰＣＲ３）を得た。

ＧＣＹ１遺伝子の５’および３’部分は、ＯＴＧ１１２８５、ＯＴＧ１１２８６およびＯＴＧ１１２８７、ＯＴＧ１１２８９対（それぞれ配列識別番号１７から２０）を用いて、ＦＹ１６７９−２８ｃ株のゲノムＤＮＡのマトリックスで［欠文］。

ＧＣＹ１配列と側面を接するＵＲＡ３遺伝子（ＧＣＹ１遺伝子のコード配列の一部が欠失させられた態様で）を、オリゴヌクレオチドＯＴＧ１１３０５（配列識別番号２１）およびＯＴＧ１１３０６（配列識別番号２２）を用いて直鎖状プラスミドｐＴＧ１００５４マトリックス（Degryse et al., 1995）から増幅させる。

増幅のための緩衝液の条件、およびマトリックスおよびプライマーの濃度条件は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素の製造元により記載されている。特にLife Technologiesが開発したエロンガーゼ酵素については製造元が記載している。温度サイクルは以下のとおりである：最初のサイクルはプライマーおよびマトリックスの変性のために６分３０秒、続いて９３℃で３０秒、５４℃で２分および６８℃で３分の３０サイクル、さらに最後のサイクルは７２℃で５分。ＰＣＲ１、ＰＣＲ２およびＰＣＲ３生成物は等モル濃度で混合し、オリゴヌクレオチドＯＴＧ１１２８５（配列識別番号１７）およびＯＴＧ１１２８９（配列識別番号２０）を用いて再度増幅させる。最終生成物ＰＣＲ４（サイズは２.９ｋｂ）を続いてプラスミドｐＵＣ１９のＫｐｎＩとＢａｍＨＩ制限部位との間でサブクローニングして、プラスミドｐＧＴ１２０１０を得る。

前記プラスミドの構造は制限プロフィールおよび末端のヌクレオチドの配列決定によって確認した。

実際のところ、ｐＴＧ１２０１０のクローニングは、このプラスミドの２つの型、ｐＴＧ１２０１０＃４０型（ｐＴＧ１２０４０クローン４０）およびｐＴＧ１２０１０＃３６型の入手を可能にした。最初に所望したことは、ＵＲＡ３遺伝子の５’および３’側でそれぞれＣｌａＩおよびＨｉｎｄIII部位と境を接するＵＲＡ３遺伝子により中断されたＧＣＹ１遺伝子を得ることであった。実際、２つの異なるプラスミドが得られ、前記はＵＲＡ３遺伝子の末端にＣｌａＩおよびＨｉｎｄIII部位が存在するか欠落しているかだけの違いを有する。プラスミドｐＴＧ１２０１０＃４０はＵＲＡ３遺伝子の３’末端にＨｉｎｄIII制限部位をもつが、５’側にＣｌａＩ部位は存在しない。プラスミドｐＴＧ１２０１０＃３６は３’末端にＨｉｎｄIII部位をもたないが、前記遺伝子の５’末端にＣｌａＩ部位を有する。この特性を用いて、ＧＣＹ１のコード配列を中断させる、ＨｉｎｄIIIおよびＣｌａＩ部位と境を接するＵＲＡ３遺伝子を有するプラスミドを得る。

ｅ）プラスミドｐＴＧ１２０８６の構築
本プラスミドを用いて、Ｐ４５０ｃ２１のための発現カセットを組み込み、同時にＧＣＹ１遺伝子を破壊する。本プラスミドはプラスミドｐＴＧ１２０３６およびプラスミドｐＴＧ１０６１４から構築された。

プラスミドｐＴＧ１０６１４の構築は以下のように実施した。前記プラスミドは、ＴＤＨ３プロモーター、ＰＧＫ１ターミネーターおよびＵＲＡ３−ｄ選別マーカーをベースにした酵母発現プラスミドである、ｐＴＧ１０２１２（Degryse et al., 1995）から構築し
た。

前記選別マーカーは、大腸菌での相同組換えによってプラスミドｐＧＴ１００５４（Degryse et al., 1995）の選別マーカーと置換される。前記を実施するために、組換え配列と側面を接するＵＲＡ３マーカーを含むｐＴＧ１００５４のＭｌｕＩ、ＦｓｐＩフラグメント（２.１ｋｂ）をｐＴＧ１０２１２の大型のＨｉｎｄIIIフラグメントと組換えを実施し、プラスミドｐＴＧ１０６１０を作製する。前記プラスミドは、ｐＴＧ１０２１２（Degryse et al., 1995）と同じ特性を有し、ｐＴＧ１００５４と同じ向きのＵＲＡ３マーカーを有する。

プラスミドｐＴＧ１０４７２（上記参照）のヒトチトクロームＰ４５０ｃ２１ｃＤＮＡを含むＳａｌＩ、ＭｌｕＩフラグメントをプラスミドｐＴＧ０６１０に移動させてプラスミドｐＴＧ１０６１４を作製する。

前記プラスミド（５’から３’方向に、ＴＤＨ３プロモーター、ＳａｌＩおよびＭｌｕＩ部位と境を接するヒトＰ４５０ｃ２１ｃＤＮＡ、およびＰＧＫ１ターミネーターを含む）をプラスミドｐＴＧ１２０３６に移し、プラスミドｐＴＧ１２０８６を作製する。したがって、後者のプラスミドは、ヒトチトクロームＰ４５０ｃ２１のためのＴＤＨ３発現カセットによって中断されたＧＣＹ１遺伝子の配列を含む。

ｆ）プラスミドｐＴＧ１２０４８の構築
本プラスミドｐＴＧ１２０４８はプラスミドｐＦＬ２６ＣＤ、ｐＴＧ１０９２５およびｐＴＧ１０９５３から構築された。

ｐＴＧ１０９５３はLacour et al.（1998）が記載したプラスミドと同一であるが、ＣｌａＩ、ＳａｌＩフラグメントが含んでいるＴＥＦ１プロモーターはＣＹＣ１プロモーターで置換されている（Degryse et al., 1995）。発現カセットはＮｏｔＩ−ＮｏｔＩＤＮＡフラグメントに含まれている。

プラスミドｐＴＧ１０９２５は、Duport et al.（1998）が記載したｐＦＬ２６ＣＤから構築された。前記プラスミドは酵母のゲノムフラグメント（Ｌｅｕ２およびＮＦＳ１遺伝子をそれぞれ５’から３’および３’から５’の向きで含んでいる）を含んでいる。ＮｏｔＩ部位と境を接するＡＤＲのための発現カセットは遺伝子間領域に導入され、プラスミドｐＴＧ１０２９５が得られた。このカセット（ＴＥＦ１−成熟ウシＡＤＲ−ＰＧＫ１ターミネーター）は新しいカセット（ＣＹＣ１プロモーターおよびＰＧＫ１ターミネーターの制御下にあるＡＲＨ１遺伝子を含む）で置換され、プラスミドｐＴＧ１２０４８が得られた。前記プラスミドで、ＬＥＵ２遺伝子および発現カセットは同じ転写方向にある。

ＴＧＹ２１２＃１株の構築
コロニーは実施例１で述べたスクリーニングで選別する。前記コロニーをＴＧＹ２１２＃１と称する。このコロニーを以前に記載したように１００μg／mLの１７ＯＨ−プロゲステロン基質を用いてバイオ変換実験に付し、さらに前記コロニーを必要なアミノ酸およびウラシルを補充した最小培地で増殖させる。

前記株は、１７ＯＨ−プロゲステロンを２４時間経過の間に４７％の規模の効率で１１−デオキシコルチゾルに変換する能力を有し、さらに前記条件下で４−プレグネン−１７α,２０α−ジオール−３−オンは弱く産生される（＜０.５％）。一定の条件下では（炭素源としてガラクトースを含むカッペリ（Kappeli）型の規定富裕培地（rich medium）で高密度（ＯＤ６００ｎｍ＝５）で培養開始）ケトンの還元能力は増加し、出発基質の１１％に達し、バイオ変換能力は出発基質の１.５％に減少する。

前記の条件下では、ＧＣＹ１遺伝子の存在がおそらく１７ＯＨ−プロゲステロンのバイオ変換のための遺伝子を構成する。したがって、その活性を防止するためにＧＣＹ１遺伝子を破壊することにした。

ＴＧＹ２４３株の構築
これを実施するために、ＴＧＹ２１２＃１株を３μgのプラスミドｐＧＴ１２０１０＃３６（ＳｐｈＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素で直鎖化）で形質転換した。２７個の形質転換体を、ＴＧＹ２１２＃１の栄養素要求にあわせて補充した（しかしウラシルは含まない）最少培地で選別した。

前記コロニーを炭素源としてガラクトースを補充した最少培地でバイオ変換テストに付した（なぜならばガラクトースはＧＣＹ１の誘発物質であることが知られているからである）。全てのＴＧＹ２４３クローンは１７ＯＨ−プロゲステロンを１１−デオキシコルチゾルに変換する能力を示したが、検出可能量の４−プレグネン−１７α,２０α−ジオール−３−オンは産生されなかった。

クローンＴＧＹ２４３＃１を選別しＵＲＡ３遺伝子の代わりにヒトＰ４５０ｃ２１のための発現カセットを導入した。

ＴＧＹ２４５株の構築
前記ＴＧＹ２４３＃１株を、プラスミドＹＲｐ７（１μg）（Parent et al., 1985）および５μgのプラスミドｐＴＧ１２０８６（ＸｈｏＩ酵素で直鎖化）で形質転換する。

ｐＴＧ１２０８６形質転換フラグメントは、ヒトＰ４５０ｃ２１のための発現カセット（ＴＤＨ３：：ヒトＰ４５０ｃ２１ ｃＤＮＡ：ＰＧＫ１ターミネーター）によって中断されたＧＣＹ１のコード配列を含む。

トリプトファンの非存在下で増殖するコロニーを選別する。これら３８１個のコロニーを続いてトリプトファンおよびフルオロオロテートを含む培地に移す。続いて約１０個のコロニーを、トリプトファン、ヒスチジン、ロイシンおよびウラシル（濃度５０μg／mL）を補充したＹＰＧ型の富裕培地でテストする。

前記株で、０.１のＯＤ６００ｎｍで開始し１６時間、１００μg／mLの濃度の１７ＯＨ−プロゲステロンを変換させる。

前記１０クローンのうち、１つのクローンＴＧＹ２４５＃２Ｄを以下の２つの基準により選択する：１７ＯＨ−プロゲステロンを１１−デオキシコルチゾルに変換する能力、および第二に４−プレグネン−１７α,２０α−ジオール−３−オンを生成しないこと（ＧＣＹ１の破壊を示す）。

ＴＧＹ２６０株の構築
本株はＴＧＹ２４５をプラスミドｐＴＧ１２０４８（ＬＥＵ２遺伝子座のＡＲＨ１を過剰発現させる）で形質転換させて構築した。

ＴＧＹ２６０株は、直鎖化されたプラスミドｐＴＧＹ１２０４８で形質転換したＴＧＹ２４５株から構築した。

前記プラスミドｐＴＧ１２０４８は、ＬＥＵ２選別マーカーを含む遺伝子間組み込みプラスミドである。前記プラスミドで、ＡＲＨ１遺伝子のための発現カセット（Lacour et al. 前掲書）がＬＥＵ２遺伝子とＮＦＳ１遺伝子との間に組み込まれている。

前記カセットは、ＣＹＣ１プロモーターとそれに続くＡＲＨ１遺伝子、さらにＮｏｔＩ制限部位と境界を接するＰＧＫ１ターミネーターを含む。プラスミドｐＴＧ１２０４８はＸｈｏＩおよびＳａｌＩ制限酵素で直鎖化した。

前記フラグメントを用い、塩化リチウムによる通常の形質転換法でＴＧＹ２４５株を形質転換する。続いて、形質転換コロニーをロイシン非含有培地で選別する。ＴＧＹ２６０株が選別された。

前記ＴＧＹ２６０株は、ＣＮＣＭ（National Collection of Culture in Microorganisms）に２００１年１月２４日に番号Ｉ−２６１５で寄託された。

ＣＤＲ０７ｍａｔα株の構築
ＦＹ１６７９−２８ｃ株を、Duport et al.（1998）（プラスミド構築および株の入手についての前記文献の技術的内容は参照により本明細書に組み込まれる）が記載したプラスミドｐＣＤ６２.１で形質転換して、ＣＤＲ０１株を作製した。前記株をプラスミドｐＣＤ７８（Duport et al.も記載している）で形質転換して、ＣＡ０３株を得る。

前記ＣＡ０３株のＥＲＧ５遺伝子をヒグロマイシン耐性を付与するカセットで中断し、ＣＡ１０株を得る。

前記株をＦＹ１６７９−１８ｂ親株と交雑し、続いて胞子を形成させる。通常の技術にしたがって、その栄養素要求にあわせて補充（すなわちウラシル、トリプトファン、ロイシンおよびヒスチジン）を加えた最少培地で胞子を単離する。

２つの基準（ナイスタチン耐性（最少培地に１２μg／mL）およびヒグロマイシン耐性（富裕培地に１００−１５０μg／mL））にしたがって前記胞子をスクリーニングする。前記２生成物に耐性を示す胞子をさらに、主要な膜ステロールとしてカンペステロールの存在についてガスクロマトグラフィーにより分析する。前記株の膜にカンペステロールが存在し、併せてエルゴスタ−５,２２−ジエノールが存在しない場合は、Δ７レダクターゼが正常に機能していることを示している。ＣＤＲ０７ＭＡＴαの胞子を上記基準にしたがって選別する。

前記ＣＤＲ０７ＭＡＴα株はＣＮＣＭに２００１年１月２４日に番号Ｉ−２６１６で寄託された。

ＵＣＹ２およびＵＣＹ４株の構築
ＴＧＹ２６０およびＣＤＲ０７ＭＡＴα株を交雑してＳＢ１４株を得る。続いて前記株で胞子を形成させ、分離株ＹＣＣ４およびＹＣＣ５を得る（下記もまた参照されたい）。

これらの株をプラスミドｐＬＩＰ５（下記参照）で形質転換し、それぞれＹＣＣ８およびＹｃｃ９株が得られる。

前記株をプラスミドｐＴＧ１２０９３で形質転換し、それぞれＵＣＹ２およびＵＣＹ３株を得る。

ＵＣＹ２株でプラスミドを用いてＡＴＦ２遺伝子を不活化し、Ｇ４１８による選別でＵＣＹ４が得られる。

ＵＣＹ２、ＵＣＹ３およびＵＣＹ株の形質転換プラスミドの構築
ａ）プラスミドｐＣＶ２９の構築
プラスミドｐＧＴ１０７６７、ｐＴＧ１００２２およびｐＣＤ６３を用いて、ｐＣＶ２９を構築した（図３参照）。
１．プラスミドｐＴＧ１０７６７の構築
プラスミドｐＴＧ１０７６７はヒト由来のＰ４５０ｃ１１のための発現カセットである。前記は、実際２つの発現カセット（１つはヒト由来のＰ４５０ｃ１１のためのカセット、他方はアドレノドキシンのためのカセット）を含む。前記２つのタンパク質では、チトクロームＣｏｘ６ｐ前駆体の誘導配列の存在によってサッカロミセス セレビシエのミトコンドリアで活性を有することが目標とされる。

ヒト由来のＰ４５０ｃ１１のための前記発現カセットは２つのＮｏｔＩと境界を接し、それによってDedryse et al.（1995）が記載した種々のベクターに前記カセットを移動させることが可能になる。前記カセットは、５’から３’方向に、上記文献に記載されているようにＣＹＣ１プロモーター、続いて上記に記載されているように改変ヒトＰ４５０ｃ１１ｃＤＮＡ、最後に高等真核細胞由来の非コード部分を含む。

ヒトＰ４５０ｃ１１ｃＤＮＡはChua et al.（1987）が記載したもので、以下の改変を有する。

元のｃＤＮＡでシグナルペプチドをコードする部分はＢｇｌII制限部位まで除去され置
換された。前記は同時にｃＤＮＡの成熟形コード配列の３１アミノ酸が除去され、以下のアミノ末端のタンパク質配列（配列識別番号２３）を生じる：

先行する行では、イタリック体の部分は、酵母チトクロームオキシダーゼサブユニットＶＩ（ＣＯＸ６）の前駆体の誘導配列のアミノ酸配列に対応し、太字活字体部分はウシＰ４５０ｃ１１（Dumas et al., 1996）のアミノ末端部分に対応する。下線部は、ヒトＰ４５０１１β１ｃＤＮＡについて報告された配列（Kawamoto et al., 1990）と同一の配列の開始部に対応する。

ＣＹＣ１プロモーターおよびＰ４５０１１β１のキメラｃＤＮＡを含むＮｏｔＩカセットはまたｃＤＮＡの３’に位置する非コード部分を含む。前記非コード部分は３つの成分で構成される：天然のｃＤＮＡに由来する非コード部分およびプラスミドｐＣＭＶ４に由来する非コード部分（前記配列はＧｅｎｂａｎｋにＡＦ２３９２４８の番号で寄託された（Andersson et al., 1989））。さらに、ｐＣＭＶ４、ヒト成長ホルモン遺伝子のターミネーターおよびウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンに由来する非コード部分のみが最終ベクターｐＣＶ２９に保存される。

最終的に、ＮｏｔＩ制限部位を運ぶＤＮＡフラグメントは、５’から３’方向に、ＣＹＣ１プロモーター、ＳａｌＩとＭｌｕＩ部位で囲まれたキメラｃＤＮＡ（前記制限部位と一致する部分までを含むウシＰ４５０₁₁βのフラグメントに融合したチトクロームオキシダーゼのプレシークェンスをコードする部分を含む）、続いてヒトＰ４５０₁₁β₁ｃＤＮＡに一致するｃＤＮＡの末端を含む。非コード部分は哺乳類由来の３つの部分で構成される。

前記ＮｏｔＩカセットはプラスミドｐＴＧ１０３５９に移される。前記ｐＴＧ１０３５９はプラスミドｐＴＧ１０３５０（Dumas et al., 1996）に由来し、ＣｌａＩおよびＰｖｕＩＩ制限酵素で消化され再びそれ自体で連結されてある。

前記プラスミドｐＴＧ１０３５９はまたただ１つのＮｏｔＩ制限部位を有する。プラスミドｐＣＶ２９は３−カセットプラスミドであり、ＡＤＸの成熟形のための発現カセット、Ｐ４５０_SCCの成熟形のための発現カセットおよびミトコンドリアへ誘導されるヒトＣＹＰ１１Ｂ１のための発現カセットを含む。

プラスミドｐＴＧ１００２２はDegryse et al.（1995）によって記載され（前記文献は参照により本明細書に組み込まれる）、サッカロミセス セレビシエの２−ミクロンの複製起点、さらにまた大腸菌でのクローニングのための成分を含んでいる。

本プラスミドの制限部位は、オリゴヌクレオチドＯＬＩＰ１７４およびＯＬＩＰ１７５（それぞれ配列識別番号２８および２９）を用いて改変され、その中にＡｓｃＩおよびＰｍｅＩ制限部位が組み込まれた。

Duport et al.（1998）が記載したプラスミドｐＣＤ６３の二重発現カセットをこのプ
ラスミドのＮｏｔＩ制限部位に導入した。前記二重発現カセット（ＮｏｔＩフラグメントに含まれる）は、ＵＲＡ３選別マーカーを囲むウシＡＤＸの成熟形の発現カセットおよびウシＰ４５０_SCCの成熟形の発現カセットを含む。クレノーフラグメントＤＮＡポリメラーゼでＮｏｔＩ末端を充填した後、ＣＹＣ１プロモーターおよびＰＧＫ１ターミネーターの制御下にあるヒトＰ４５０１１βｃＤＮＡを含むチトクロームＰ４５０１１βのための発現カセットを、前記プラスミドの平滑末端をもつただ１つのＰｍｅＩ部位に導入した。

得られたプラスミドの１つ、ｐＣＶ２９は、３つの発現カセット、ＡＤＸ、Ｐ４５０_SCC（両者とも成熟形）のためのカセット、およびミトコンドリアに誘導されるヒトＰ４５０１１β形のためのカセットを含む。さらに、前記プラスミドは、２つの発現カセットに囲まれたＵＲＡ３遺伝子をマーカーとして含む。

ｂ）プラスミドｐＣＣ１２の構築
プラスミドｐＣＣ１２（図４参照）は、染色体複製起点、例えばともにサッカロミセス
セレビシエ由来であるＡＲＳ１およびＣＥＮ動原体（酵母にはそれらのうちの１６が存在する）をベースにした複製型酵母プラスミドである。前記プラスミドは酵母内で１つまたは２つのコピーとして複製する。

前記は、ｐＦＬ３８（Bonneaud et al., 1991；前記文献の内容、特に前記プラスミドの記載は参照により本明細書に組み込まれる）に由来するｐＦＬ３８Ｃ２から構築された。ＮｏｔＩ、ＰａｃＩ、およびＡｓｃＩ部位の認識配列を含むオリゴヌクレオチド（ＯＬＩＰＦＬ；配列識別番号２４）を前記プラスミドのＨｉｎｄIII部位に導入した。前記ポリリンカーの向きは配列決定によって確認した。このプラスミドは、ＢｇｌII部位によって囲まれたＵＲＡ３選別マーカーを含む。

ＵＲＡ３遺伝子は２.７ｋｂのＡＤＥ２遺伝子で置換した。前記ＡＤＥ２遺伝子は、オリゴヌクレオチド５’ＡＤＥ２０９０（配列識別番号３７；ＣＧＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＡＣＴＡＧＴＡＡＣＧＣＣＧＴＡＴＣＧＴＧＡＴＴＡＡＣＧ）および３’ＡＤＥ２０８９（配列識別番号３８；ＣＣＴＣＡＡＧＧＡＴＣＣＴＣＣＴＧＡＣＧＴＡＧＣＧＣＴＡＴＣＣＴＣＧＧＴＴＣＴＧ）を用い、ＦＹ１６７９−２８ｃでのＰＣＲ増幅によって得られた。

前記置換を実施するために、プラスミドｐＦＬ３８Ｃ２をＢｇｌII酵素で消化し、ＵＲＡ３ＢｇｌＩフラグメントをＡＤＥ２遺伝子を含む２.７ｋｂフラグメントで置換した。得られたプラスミド、ｐＡＭ１はプラスミドｐＣＣ１２の構築の基礎として機能する。

プラスミドｐＡＭ１からプラスミドの構築：
プラスミドｐＣＣ１２は、２つの発現カセット（１つはウシ由来の３β−ＨＳＤＨ、他方は同様にウシ由来のアドレノドキシンレダクターゼ）を含む。

ウシの３β−ＨＳＤＨｃＤＮＡをウシ副腎腺ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲにより再クローニングした。Zhao et al.（1989）によって報告されたｃＤＮＡのコード配列は改変しなかった。

２つのオリゴヌクレオチドをＳａｌＩ部位およびＡＴＧの前の４つのアデニンに付加し、配列ＧＴＣＧＡＣＡＡＡＡＡＴＧ（配列識別番号２５）を得る。ＭｌｕＩ部位はウシ３β−ＨＳＤＨｃＤＮＡのすぐ隣に配置し、以下の配列を得る：ｃＤＮＡＴＧＡＣＣＴＧＧＡＧＴＧＡＣＡＡＴＧＡＣＧＣＧＴ（配列識別番号２６）。ＭｌｕＩ酵素によって認識される配列はＡＣＧＣＧＴである。

前記ｃＤＮＡを、ＳａｌＩ、ＭｌｕＩフラグメントの形でプラスミドｐＴＧ１０２１２に移し、プラスミドｐＣＣ４を作製する。このプラスミドはしたがって、それぞれ５’および３’に配置されたＴＤＨ３プロモーターおよびＰＧＫ１ターミネーターの両方と境を接する３β−ＨＳＤＨｃＤＮＡを含むＮｏｔＩフラグメントを有する。続いてこの発現カセットをプラスミドｐＴＧ１２０１８に移し、したがって前記発現カセットは、今は５’位でＮｏｔＩ部位と、３’位でＡｓｃＩ部位と境を接する。続いてこのフラグメントを酵母の発現プラスミドｐＡＭ１のＮｏｔＩおよびＡｓｃＩでクローニングしてプラスミドｐＣＣ１１を得る。

前記プラスミドのＮｏｔＩ部位にプラスミドｐＴＧ１０３６１に由来する、それぞれ表示した順序で以下を含むＮｏｔＩフラグメントを挿入する：ＴＥＦ１プロモーター、ウシ由来のアドレノドキシンレダクターゼの成熟形、およびＰＧＫ１酵母ターミネーター。

前記プラスミドは、Dumas et al.（1996）（前記文献の内容、特にプラスミドの記載は参照により本明細書に組み込まれる）が記載した同じｃＤＮＡを含むが、ただしチトクロームオキシダーゼ前駆体の誘導配列はメチオニンコドンと置換されてあった。前記ｃＤＮＡはしたがってアドレノドキシンレダクターゼｃＤＮＡの成熟形をコードする。

ＣＤＲ０７株の構築
ＣＤＲ０７株は、ＦＹ１６７９−１８ｂＭＡＴａ株とDuport et al.（1998）が報告したＣＡ１０ＭＡＴα株との交雑によって得られた。

前記２つの株は、成書（“Yeast Protocols Methods in Cell and Molecular Biology"
edited by Ivor H. Evans (1996), Humana Press, Totowa, New Jersey）の記載にしたがって、先ず第一にグリセロールを含む富裕培地で、続いて酢酸カリウム含有培地で単離された。

胞子形成後、四分子をチモラーゼ１００Ｔで３７℃３０分消化した。数サイクルの選別を実施し、主要ステロールとしてカンペステロールを産生し、ＣＡ１０の他の特性を失ったクローンを得た。

胞子は先ず第一に補充物（アデニン、ロイシン、トリプトファン、ウラシル、ヒスチジン）とともにナイスタチンを含有する最少培地で選別する。ナイスタチン耐性でアデニンおよびロイシンに対して栄養要求性を有するクローンを続いてアデニンおよびヒグロマイシン（２００μg／mL）を含む富裕培地でサブ培養して、ヒグロマイシン耐性遺伝子によってＥＲＧ５遺伝子の欠失を検出する。

アデニンおよびロイシン（並びにウラシルおよびトリプトファン）に対して栄養要求性を有し、さらにまたヒグロマイシン耐性およびナイスタチン耐性を示すクローンを、それらのステロールプロフィールについて分析する。主要ステロールとしてカンペステロールを産生する、反対の交配型サインをもつ２つのクローンを選別する。それらをＣＤＲ０７ＭＡＴａおよびＣＤＲ０７ＭＡＴαと称する。

それぞれＨＩＳ３およびＴＲＰ１遺伝子座のための組み込みプラスミドｐＧＴ１２０９３およびｐＬＩＰ５の構築
ａ）ｐＬＩＰ５の構築
ｐＬＩＰ５は、ＴＲＰ１遺伝子座でゲノムに組み込むために、またはマルチコピープラスミドとしてサッカロミセス セレビシエで用いることができる。このプラスミドを構築するために用いた基本プラスミドは、Bonneau et al.（1991）（前記文献の内容、特に前記プラスミドの記載は参照により本明細書に組み込まれる）が記載したプラスミドｐＦＬ４５Ｓである。

ＴＲＰ１プロモーターの上流５’部分に対応するゲノムＤＮＡフラグメントを先ず初めにオリゴヌクレオチドＯＬＩＰ２１およびＯＬＩＰ２２（それぞれ配列識別番号３０および３１）を用いてクローニングし、ＰＣＲ増幅を実施した。

最初にＰＣＲ生成物をpCR-Script AmpSK（＋）（Stratagene, La Jolla, CA, USA）でサブクローニングした。ＯＬＩＰ２１およびＯＬＩＰ２２の末端は実際に、ＮａｒＩ部位を５’末端に、ＨｉｎｄIII部位を３’末端に有する。このＮａｒＩ、ＨｉｎｄIIIフラグメントを上記に記載されたプラスミドｐＦＬ４５Ｓのマルチクローニング部位と入れ換えた。

得られたプラスミド、ＰＬＩＰ３をオリゴヌクレオチドＯＬＩＰ２０（配列識別番号３２）を用いてさらに改変する（ＯＬＩＰ２０を用いてただ１つのＨｉｎｄIII部位をただ１つのＮｏｔＩ部位で置換する）。５’から３’方向に、ＴＥＦ１プロモーター、チトクロームＰ４５０ｃ１７アルファｃＤＮＡ、続いてＰＧＫ１ターミネーターを含むフラグメント（Degryse et al., 1999；前記文献の内容、特にプラスミドの記載は参照により本明細書に組み込まれる）を前記ＮｏｔＩ部位に導入する。

最終的プラスミドＰＬＩＰ５は、ＴＲＰ１マーカーによるマルチコピープラスミドとしても（２−ミクロン部分が除去された場合）、およびＴＲＰ１遺伝子座での組み込み用プラスミドとしても用いることができる。したがって前記カセットはＴＲＰ１遺伝子の５’に組み込まれる。

ｂ）プラスミドｐＴＧ１２０９３の構築
このプラスミドはＨＩＳ３遺伝子座の遺伝子間組み込み用プラスミドであった。前記プラスミドは、Duport et al.（1998）が記載したプラスミドｐＵＣ−ＨＩＳ３から構築する。前記プラスミドのただ１つのＸｈｏＩ制限部位を適切なリンカーを用いてただ１つのＮｏｔＩ制限部位に変換し、同時にＸｈｏＩ部位を破壊してプラスミドｐＵＣ１９−ＨＩＳ３を得る。本プラスミドのただ１つのＮｏｔＩ部位に、ｐＴＧ１０７９２由来のＮｏｔＩフラグメントを［欠文］。前記フラグメントは、ＴＤＨ３プロモーターおよびＣＯＸ₆チトクローム（Dumas et al.（1996）が記載した酵母チトクロームオキシダーゼサブユニット６）の前駆体の誘導配列と融合させたウシ成熟ＡＤＸをコードするｃＤＮＡを含む。上記に述べたｃＤＮＡを含むプラスミドｐＴＧ１０３５０のＳａｌＩ、ＭｌｕＩ制限フラグメントをプラスミドｐＴＧ１０２１１に移し、プラスミドｐＴＧ１０７９２を作製する。

したがって、前記プラスミドは、５’から３’方向に、ＴＤＨ３プロモーター、成熟ウシＡＤＸと酵母ＣＯＸ₆プレシークェンスとを融合させたｃＤＮＡ、およびＰＧＫ１ターミネーターを含む１.６ｋｂのフラグメントを有する。前記ＮｏｔＩ−ＮｏｔＩフラグメントをプラスミドｐＴＧ１２０９３に挿入する。ＨＩＳ３および前記発現カセットは同じ向きで転写される。

ＣＤＲ０７ＭＡＴαとＴＧＹ２６０ＭＡＴａとの交雑
酢酸カリウムを含む非常に枯渇されている培地（depleted medium）でＳＢ１４株（ＣＤＲ０７ＭＡＴα×ＴＧＹ２６０ＭＡＴａ）の胞子を形成させる。続いて、種々の子嚢を以下の生成物を含む最少培地で増殖させる：ウラシル、ヒスチジン、トリプトファンおよびアデニン。

続いて、８から１２μg／mLのナイスタチンを含む正確に補充された最少培地で胞子を選別する。さらに陽性胞子をヒトＰ４５０ｃ２１ｃＤＮＡの存在について選別する。前記を実施するために、炭素源として２％のエタノール（および０．１％のグルコース）を含むカッペリ（Kappeli）培地（M. Arreguin de Lorencez, O.J. Kappeli, 1987）で、３００mg／mLの１７ＯＨ−プロゲステロンの存在下でクローンを選別する。

前記バイオ変換は７２時間までインキュベートする。バイオ変換能力を、Dumas et al.（1996）およびDegryse et al.（1999）（前記文献の内容、特にバイオ変換実験の説明は参照により本明細書に組み込まれる）が記載したようにＨＰＬＣで分析する。

前記クローンはまた、Duport et al.（1998）（前記文献の内容、特にバイオ変換実験の説明は参照により本明細書に組み込まれる）が記載したようにガスクロマトグラフィーによってそのステロール産生プロフィールについて分析し、カンペステロールおよびエルゴスタ−５,２２−ジエノールを検出する。

３つの胞子、ＹＣＣ３、ＹＣＣ４およびＹＣＣ５を、エルゴスタ−５,２２−ジオール
およびカンペステロールの産生並びにそれぞれの胞子について７２時間で２５、１２０および４２μg／mLの産生効率をもたらす１７ＯＨ−プロゲステロンから１１−デオキシコルチゾルへの変換を基準にして選択する。

続いてＹＣＣ４およびＹＣＣ５を選択し、それぞれＡｐａＬＩおよびＥｃｏＲＩ酵素で直鎖化したプラスミドｐＬＩＰ５およびｐＧＴ１２０９３でさらに２回連続して形質転換する。プラスミドｐＬＩＰ５およびｐＴＧ１２０９３は、それぞれウシＰ４５０ｃ１７およびミトコンドリア型ウシＡＤＸのための遺伝子間発現プラスミドである。

ｐＴＧ１２０９３は、ＨＩＳ３遺伝子座の３’位に存在する遺伝子間領域に組み込まれるプラスミドで、一方、ｐＬＩＰ５はＴＲＰ１遺伝子座の５’位に存在する遺伝子間領域に組み込まれるプラスミドである。さらに、前記２つのプラスミドはただ１つのＮｏｔＩ部位を有し、前記部位は以下の順序でエレメントを含む発現カセットの組み込みを可能にする：ｐＬＩＰ５については、ＴＥＦ１プロモーター、ウシＰ４５０ｃ１７ｃＤＮＡ、ＰＧＫ１ターミネーター；さらにｐＴＧ１２０９３については、ＴＤＨ３プロモーター、ＣＯＸＶＩ_pre：：成熟形ウシＡＤＸｃＤＮＡ、ＰＧＫ１ターミネーター。

ＹＣＣ４株を連続してプラスミドｐＬＩＰ５およびｐＴＧ１２０９３で形質転換する（前記２つのプラスミドはＡｐａＬＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素で直鎖化されている）。

最初の形質転換では、形質転換クローンは第一にトリプトファン非含有培地で選別される。トリプトファン非存在下で増殖するクローンを、続いてオリゴヌクレオチドＣ１７−３およびＣ１７−５（それぞれ配列識別番号３３および３４）を用いてＰＣＲを実施することによって選別する。

クローンＹＣＣ８が直鎖化プラスミドｐＴＧ１２０９３による更なる形質転換のために選別される。同様にして、ヒスチジンの非存在下で増殖するクローンを選別し、続いてＡＤＸｃＤＮＡの存在をオリゴヌクレオチドＡＤＸ−３およびＡＤＸ−５（それぞれ配列識別番号３５および３６）を用いてＰＣＲを実施することによって確認する。

クローンＵＣＹ２を選別する。前記交配型のサインはＭＡＴαである。

ＵＣＹ４株の構築
ＵＣＹ２株は機能的なＡＴＦ２遺伝子を有する。換言すれば、産生されるプレグネノロンの大半は、プレグネノロンアセチルトランスフェラーゼであるＡＴＦ２ｐタンパク質によって酢酸プレグネノロンに変換される（前記トランスフェラーゼの天然の状態での機能は不明である（Cauet et al., 1999）。さらに、前記作用は不可逆的で、したがっていったん生成されてしまうと、アセチルプレグネノロンはもはやヒドロコルチゾンに変換できない。したがって、この活性を破壊し、より効率的なヒドロコルチゾンの生成を可能にすることが重要である。

したがって、ＡＴＦ２遺伝子をＧ４１８耐性遺伝子を用いて破壊した。そのために、破壊プラスミド、ｐＡＭ３ｋａｎａＣを構築し、ＡＴＦ２遺伝子にＧ４１８耐性マーカーを導入した。

前記プラスミドは、プラスミドｐＡＭ１（その構築は上記に記載されている）およびプラスミドｐＧＴ１２００２（前記はＡＴＦ２遺伝子のための発現プラスミドである）から構築した。

ｐＧＴ１２００２は、プラスミドｐＧＴ１０２６０（Degryse et al., 1995）をベースにしたＡＴＦ２のための発現プラスミドである（プラスミドｐＧＴ１０２６０では、２−ミクロン複製起点のＸｂａＩ制限部位は不活化されてある）。前記プラスミドは、したがって、ＣＹＣ１プロモーター、ＡＴＦ２遺伝子（ＳａｌＩおよびＭＬＵＩ制限部位で囲まれている）およびＰＧＫ１ターミネーターを含むＡＴＦ２遺伝子のための発現カセット（Cauet et al., 1999）を含む。ＫｐｎＩ、ＮｏｔＩ制限フラグメントに以下を含む完全なＡＴＦ２遺伝子を含むように、前記カセットをＰＣＲで改変した：ＡＴＦ２遺伝子のプロモーター、ＡＴＦ２遺伝子のコード配列およびＡＴＦ２遺伝子のターミネーター。前記ＫｐｎＩ−ＮｏｔＩフラグメントをプラスミドｐＡＭ１のＫｐｎＩ−ＮｏｔＩ部位に導入しプラスミドｐＡＭ３を得る。

プラスミドｐＡＭ３では、Ｇ４１８耐性のための発現カセットがＡＴＦ２遺伝子に導入され、その不活化がもたらされる。

そのために、プラスミドｐＡＭ３をＡｃｃＩ制限酵素で消化し、続いて部分的にＳａｃＩ制限酵素で消化する。約７５００ｂｐのバンドをゲルで精製する。プラスミドpFA6a KanMX4（Wach et al., Methods in Microbiology, Vol.26, Yeast Gene Analysis, Chapter 5; PCR-based Gene Targeting in Saccharomyces cerevisiae）をＳａｃＩおよびＡｃｃＩで消化し、１５００ｂｐのバンドをゲルで精製する。前記２つのフラグメントを連結し、続いて形質転換する。ｐＡＭ３ｋａｎａＣプラスミドが得られる。前記プラスミドをＰｖｕＩＩおよびＮｏｔＩで消化し、２２１５ｂｐのバンドをゲルで精製し、続いてＵＣＹ２を形質転換する。前記ＵＣＹを１３０μg／mLのＧ４１８を含む富裕培地で平板培養する。約６００コロニーをＧ４１８を含む前記培地で継代培養する。２つのクローンがＧ４１８に耐性を有する。プラスミドｐＡＭ３を含まないクローンを保存する。

前記の遺伝子活性化の方法は当業者には周知である。

このようにして得られたシングルクローンで、１００μg／mLのプレグネノロンを用いてカッペリ培地でバイオ変換を実施する。

２４時間後に酢酸プレグネノロンが存在しないことが、Cauet et al.（1999）の記載にしたがって抽出およびガスクロマトグラフィーにより実証される。前記の現象によって、プレグネノロンのアセチル化に必要なＡＴＦ２遺伝子は明瞭に破壊され、もはや機能をもたないことが示される。前記の株をＵＣＹ４と称する。

ＵＣＹ３およびＵＣＹ２６株の構築
ＣＤＲ０７とＴＧＹ２６０株との交雑によって得られた胞子のスクリーニングによってＹＣＣ４およびＹＣＣ５株を含むいくつかの株が得られた。上記に記載したように、ＹＣＣ４株を２つのプラスミド（ｐＬＩＰ５およびｐＴＧ１２０９３）で形質転換した。胞子ＵＣＹ２を続いて選別した（実施例１２参照）。同じようにして、ＹＣＣ５株もまたプラスミドｐＬＩＰ５およびｐＴＧ１２０９３で形質転換し、さらに別の胞子（ＵＣＹ３と称する）を得た。ＵＣＹ２と同様に、ＵＣＹ３はシロイヌナズナ（A. thaliana）のΔレダクターゼの存在および発現を特徴とする（前記はナイスタチン耐性であること、およびリコンビナント酵母の主要ステロールとしてブラシカステロールおよびカンペステロールが存在することによって決定される）。ＡＤＸｃＤＮＡの存在はオリゴヌクレオチドＡＤＸ−３およびＡＤＸ−５（それぞれ配列識別番号３５および３６）を用いてＰＣＲを実施し、続いてDumas et al.（1996）が記載したようにウェスタンブロットを実施することによって立証される（前記技術に関し前記文献は参照により本明細書に組み込まれる）。

１７位および２１位におけるプロゲステロンヒドロキシル化活性は、プロゲステロンの１７ＯＨ−プロゲステロンおよび１１−デオキシコルチゾルへのバイオ変換によって立証される。前記を実施するために、前記の株を２００mg／Ｌのプロゲステロンの存在下でDumas et al.（1996）およびDegryse et al.（1999）が記載したようにインキュベートする。ＵＣＹ３はプロゲステロンから１１−デオキシコルチゾルを生成することができ、Ｐ４５０ｃ１７およびＰ４５０ｃ２１活性の存在を示唆する。４−プレグネン−１７α，２０α−ジオール−３−オンの存在もまた検出され、ＧＣＹ１またはＹＰＲ１によってコードされる２つの活性の少なくとも１つがこの株に存在することを示している。酢酸プレグネノロンの蓄積を回避するために、ＡＴＦ２遺伝子によってコードされるプレグネノロンアセチル化活性を排除した。この目的のために、プラスミドｐＡＭ３ｋａｎａＣ（実施例１３参照）を用いてＵＶＹ３株を形質転換した。ｐＡＭ３ｋａｎａＣは、第一にＰｖｕＩＩおよびＮｏｔＩで消化し、２２１５ｂｐのバンドをゲルで精製し、続いてＵＣＹ３を形質転換し、１３０μg／mLのＧ４１８を含む富裕培地で平板培養する。Ｇ４１８抗生物質に耐性を示し、さらにプレグネノロンを酢酸プレグネノロンにもはや変換できないコロニーを単離する。コロニーＵＣＹ２６は更なる形質転換およびそのヒドロコルチゾン産生のテストのためにより厳密に選別される。

ＵＣＹ５株の構築
より良好な遺伝的多様性を目的として、ＵＣＹ２株（実施例１２参照）をＴＧＹ２４５株（実施例５参照）とを交雑し、二倍体株ＹＳＡ２−２ｎを選別した。前記株を子嚢産生条件下に置き、８５個の子嚢を文献にしたがって解体した（“Yeast Protocols in Molecular Biology", Vol.53, p59-67(1996)）。単離した胞子は、その栄養素要求性を基準にスクリーングされる。したがって、トリプトファンおよびヒスチジンの非存在下で増殖することができ、さらにアデニンを要求するコロニーをより厳密に選別する。Δレダクターゼの発現は、前記株がナイスタチンに耐性を有すること、およびそれら株の膜にカンペステロールおよびブラシカステロールが存在することを確認することによって立証される。後者の分析は、Duport et al.（1998）が記載したようにこれらの株の全ステロールのガスクロマトグラフィーによって実施される。さらに、Ｐ４５０ｃ１７をコードするｃＤＮＡおよびＡＤＸの存在は、オリゴヌクレオチドＣ１７−３およびＣ１７−５（それぞれ配列識別番号３３および３４）、並びにオリゴヌクレオチドＡＤＸ−３およびＡＤＸ−５（それぞれ配列識別番号３５および３６）を用いてＰＣＲによって立証される。最後に、これら陽性胞子のＧＣＹ１およびＹＰＲ１遺伝子の機能性は、ＰＣＲによるか、または１７ＯＨ−プロゲステロンに対する２０−α−レダクターゼ活性が存在しないことによる前記２つの方法のどちらかによって立証される。

サッカロミセス セレビシエにおけるヒトＰ４５０ｃ２１のための発現カセット（ＴＥＦ１プロモーター、ヒトＰ４５０ｃ２１ｃＤＮＡおよびＰＧＫターミネーターを含む）によるＹＰＲ１遺伝子の破壊は、オリゴヌクレオチド対、Ｘ１ＴＥＦ１およびおよびＸ２Ｃ２１（それぞれ配列識別番号４７および４８）を用いてＰＣＲによって検出される。ヒトＰ４５０ｃ２１のための発現カセット（ＴＤＨ３プロモーター、ヒトＰ４５０ｃ２１ｃＤＮＡおよびＰＧＫターミネーターを含む）によるサッカロミセス セレビシエのＧＣＹ１遺伝子の破壊はまた、オリゴヌクレオチド対、Ｘ３ＴＤＨ３およびＸ２Ｃ２１（それぞれ配列識別番号４９および４８）を用いてＰＣＲによって検出される。

ＧＣＹ１およびＹＰＲ１の２つの活性の消失並びにＰ４５０ｃ１７およびＰ４５０ｃ２１に対応する活性の存在は最終的には、Dumas et al.（1996）が記載しDegryse et al.（1999）が改変した条件下でプロゲステロンの１１−デオキシコルチゾルへのバイオ変換によって立証される。リコンビナント酵母は、２００mg／Ｌのプロゲステロンの存在下で、炭素源として２％のガラクトースまたは２％のグルコースを含むカッペリ型の培養液１０mL中で細胞密度５で３０℃でインキュベートされる。４８時間のインキュベーション後、前記酵母の培養液を先に記載されたように抽出し、特に生成された１７ＯＨ−プロゲステロンおよび１１−デオキシコルチゾルの量をＨＰＬＣで測定する。選別した胞子はもはや検出可能な量の４−プレグネン−１７α,２０α−ジオール−３−オンを産生しないが、２つの炭素源を用いて１７ＯＨ−プロゲステロンおよび１１−デオキシコルチゾルを産生する。選別したクローンは大量の１１−デオキシコルチゾルを産生する。

前記全ての基準を良好に満たす株を更なる形質転換のためにさらに厳密に選別する。その株をＵＣＹ５と称する。

プラスミドｐＦＭ１０およびｐＴＧ１０８９７の構築
ａ）プラスミドｐＦＭ１０の構築
プラスミドｐＦＭ１０は４つのタンパク質を酵母で同時に発現させるベクターである。前記は大腸菌のための複製起点を含まず，アンピシリン耐性遺伝子ももたない。このプラスミドは大腸菌で複製できない。前記は２つのプラスミドｐＦＭ７およびｐＣＢ１２を酵母で組換えることによって得られる。これらプラスミドは、プラスミドｐＦＭ１０と異なり、両者とも大腸菌レプリコンを有するので大腸菌で複製する。プラスミドｐＦＭ７はまたサッカロミセス セレビシエでも複製する。なぜならば、前記はまたサッカロミセス セレビシエの２−ミクロン複製起点を含むからである。前記２つのプラスミドはまた、発現カセットおよびまた選別マーカーと境界を接するＲ１およびＲ２配列（それぞれ配列識別番号３９および４０）を有する。前記Ｒ１およびＲ２配列はシロイヌナズナ（A. thaliana）のフォトクロロフィリドオキシドレダクターゼ遺伝子に由来し、各々サイズが約３００塩基対である。

２つの配列Ｒ１およびＲ２は逆向きにプラスミドｐＦＭ７およびｐＣＢ１２でクローン化される。したがって、Ｒ１およびＲ２配列間で、ｐＦＭ７プラスミドは以下の成分を下記の順序で含む：２−ミクロンフラグメント（Urban et al.（1994）が記載したようにＥｃｏＲＩ制限部位と境界を接するフラグメント）に含まれる２−ミクロン複製起点、Duport et al.（1998）が記載したプラスミドｐＣＤ６３に由来するＮｏｔＩ部位と境界を接するフラグメント（機能的酵母ＵＲＡ３遺伝子によって分離されてある、Ｐ４５０ｓｃｃの成熟形のためおよびＡＤＸの成熟形のための２つの発現カセットを含む）、続いてＲ２配列。同様にプラスミドｐＣＢ１２はＲ１およびＲ２配列を含むが、それらはプラスミドｐＦＭ７の向きとは反対の向きでクローン化されてある。したがって、Ｒ２およびＲ１配列との間には、Ｐ４５０₁₁βのための発現カセット、ＡＤＥ２選別マーカーおよびウシ由来３β−ＨＳＤのための発現カセットが存在する。Ｐ４５０₁₁βのための発現カセットはプラスミドｐＣＶ２９に由来し、ＣＹＣ１プロモーター、Ｐ４５０₁₁βをコードするハイブリッドｃＤＮＡおよびＰＧＫターミネーターを含む。ＡＤＥ２遺伝子はプラスミドｐＡＭ１に由来し、ＢｇｌII−ＢｇｌIIフラグメントである。同様に、ウシ３β−ＨＳＤのための発現カセット（ＴＤＨ３プロモーター、ウシ３β−ＨＳＤｃＤＮＡおよびＰＧＫプロモーター）はプラスミドｐＣＣ１２に由来し、ＣｌａＩ−ＡｓｃＩフラグメントである。

ｂ）プラスミドｐＧＴ１０８９７の構築
ＡＴＦ２遺伝子のコード配列は、２つの２０量体オリゴヌクレオチド（それぞれＡＴＦ２遺伝子のコード配列の５’および３’部分に一致し、さらにまたクローニング部位を含む）およびマトリックスとしてＦＹ１６７９−２８ｃ株のゲノムＤＮＡを用いＰＣＲによって増幅される。前記ＰＣＲ生成物を続いてＣｌａＩおよびＨｉｎｄIII酵素で消化し、さらにプラスミドｐＧＴ１００３１（Degryse, 1995 #102）のＣｌａＩおよびＨｉｎｄIII部位の間でクローン化し、プラスミドｐＧＴ１０８８５を得る。前記プラスミドをＡＴＦ２遺伝子破壊のためのプラスミドを構築する基礎として用いる。ＵＲＡ３遺伝子配列をＴＧＹ１５６株（Cauet et al., 1999；前記文献は参照により本明細書に組み込まれる）のゲノムＤＮＡから増幅させた。前記ＴＧＹ１５６株は実際ＵＲＡ３遺伝子によって中断されたＡＴＦ２遺伝子を有する。したがってオリゴヌクレオチドＯＴＧ１０８４２（配列識別番号４１）およびＯＴＧ１０８４１（配列識別番号４２）を、ＴＧＹ１５６株のゲノムＤＮＡをマトリックスとして増幅に用い、さらにこの増幅生成物をＢｓｔＸＩおよびＳｔｕＩ制限酵素により消化したプラスミドｐＧＴ１０８８５との組換えのイニシエーターとして用いた。

前記のようにして、ＵＲＡ３遺伝子によって中断されたＡＴＦ２遺伝子のコード配列を含むプラスミドｐＧＴ１０８９７が得られる。特に機能的ＵＲＡ３遺伝子は、ＡＴＦ２のコード配列の５’部分の５０９ヌクレオチドと前記コード配列の３’部分の４４４ヌクレ
オチドとの間に位置する。

ＵＣＹ６、ＵＣＹ１６、ＵＣＹ１６−ｐＦＭ１０、ＵＣＹ１９、ＵＣＹ２０、ＵＣＹ２４、ＵＣＹ２５およびＵＣＹ２７株の構築
問題のステロイドの生成を改善する目的で、一連の新規な株をＵＣＹ５株をベースにして構築した。具体的には、ＵＣＹ５株はアドレノドキシンレダクターゼを発現しない（レダクターゼはＰ４５０_SCCによる側鎖切断反応に必須の成分である）。さらにまた、以前に述べたように、ＡＴＦ２遺伝子は、基質としてプレグネノロンを用いるアセチルトランスフェラーゼをコードし、その破壊は前記の寄生的アセチル化反応を排除し、したがって問題のステロイドの収量を増加させることができる。ついには、外因性生合成経路は内在性ＡＲＨ１ｐ活性を使用し、後者は酵母の生存に必須である。しかしながら、このミトコンドリア活性（哺乳類のアドレノドキシンレダクターゼの代りとなる）は、ヒドロコルチゾン産生株では限定的であるかもしれない。したがって、問題のステロイドの産生収量を顕著に増加させることができるある種の改変を有する株をＵＣＹ５株をベースにして構築した。したがってこの株はＡＴＦ２活性を欠き、アドレノドキシンレダクターゼタンパク質を過剰産生し、さらにまたＡＲＨ１タンパク質も過剰に産生する。

ＵＣＹ５株でＡＤＲを発現させるために、前記ＵＣＹ株をベクターｐＧＴ１０９２５（実施例２ｆ参照）で形質転換した。前記ベクターの直鎖形で酵母を形質転換するとき、ＬＥＵ２遺伝子座で組み込まれ、ＴＥＦ１プロモーターの制御下でＡＤＲの発現が可能になる。ＡＤＲの発現は、Dumas et al.（1996）が記載したようにウェスタンブロットで立証した。ＡＤＲを発現するクローン（ＵＣＹ６と称される）は、その後の形質転換に特に用いられた。

ＡＴＦ２酵素によって触媒されるプレグネノロンを酢酸プレグネノロンに変換する寄生的アセチル化を排除する目的で、この酵素をコードするＡＴＦ２遺伝子を破壊した。具体的には、この遺伝子をＵＲＡ３マーカーで中断させる。そのために、プラスミドｐＴＧ１０８９７のＮｏｔＩフラグメント（機能的な酵母ＵＲＡ３遺伝子によって中断されたＡＴＦ２遺伝子配列を含む）を用いた。前記フラグメントを用いてＵＣＹ６株を形質転換する。ウラシルの不存在下で増殖することができるコロニーを選別し、続いてこれらのクローンのプレグネノロンから酢酸プレグネノロンへの変換能をCauet et al.（1999）の記載にしたがって測定する。ウラシルの不存在下で増殖でき、プレグネノロンを酢酸プレグネノロンに変換できないクローンをより厳密に単離する。このクローンをＵＣＹ１６と称する。

前記株はＵＲＡ３マーカーのみを含むプラスミドでは形質転換できないので、２つの新しいプラスミド、ｐＣＢ１２およびｐＦＭ７を構築した。これら２つのプラスミドは、それらを一緒に組換えを実施したとき、ＵＲＡ３および／またはＡＤＥ２マーカーをベースにしたプラスミドｐＦＭ１０の生成を可能にする（上記および図５参照）。したがって、プラスミドｐＦＭ１０を得るために、プラスミドｐＦＭ７をＡａｔＩＩ制限酵素で直鎖化し対応するＤＮＡフラグメントをゲルで単離する。プラスミドｐＣＢ１２をその一部を得るためにＢａｍＨ１で消化し、９３００塩基対のバンドを通常の分子生物学的技術にしたがって単離する。約５μgのｐＣＢ１２およびｐＦＭフラグメントを混合し、ＵＣＹ１６株の形質転換に用いる。最少培地（ウラシルおよびアミノ酸を含まない）で増殖できるいくつかのＵＣＹ−ｐＦＭ１０クローンを単離し、対応する株を下記に記載したプロトコルにしたがってステロイド産生レベルについてテストする。

また別には、ＵＲＡ３マーカーをベースにしたｐＣＶ２９型のプラスミドを続いて用いることができるように、ＵＣＹ６株のＡＴＦ２遺伝子の破壊はまた、前記株を直鎖化プラ
スミドｐＡＭ３ｋａｎａＣ（実施例１３参照）で形質転換することによって実施した。続いて、Ｇ４１８耐性コロニーをプレグネノロンアセチルトランスフェラーゼ活性の有無についてテストする（Caute et al., 1999）。もはやプレグネノロンアセチルトランスフェラーゼ活性をもたないＧ４１８耐性コロニーを特に厳密に選別し、この株をＵＣＹ２４と称する。

ヒドロコルチゾン生成のための外来性経路を含む株でＡＲＨ１活性を増加させる目的で、ＵＣＹ５株を、それぞれＸｈｏＩおよびＳａｐＩで直鎖化したプラスミドｐＴＧ１２０４８またはｐＴＧ１２０５０で形質転換した。上記で述べたプラスミドｐＴＧ１２０４８は、ＣＹＣ１プロモーターの制御下でＬＥＵ２遺伝子座のＡＲＨ１遺伝子を過剰発現させる。プラスミドｐＴＧ１２０５０は、ＡＲＨ１遺伝子の発現を制御するＣＹＣ１プロモーターが、Degryse et al.（1995）およびDumas et al.（1996）が記載したようにＴＥＦ１プロモーターで置換されてあるという点でのみプラスミドｐＴＧ１２０４８と異なっている。ＵＣＹ５は直鎖化ｐＴＧ１２０４８またはｐＴＧ１２０５０で形質転換された。

前記２つの事例の各々で、ロイシンの不存在下で増殖できるコロニーを選別した。さらに、ＡＲＨ１遺伝子のための発現カセットの存在はＰＣＲで証明した。具体的には、２対のオリゴヌクレオチドはＡＲＨ１遺伝子のさらに追加されたコピーの存在（ＣＹＣ１またはＴＥＦ１プロモーターの制御下にある）を証明することを可能にする。第一に、ａｒｈ１Ｄ（配列識別番号４３）およびｎｆｓ１Ｒ（配列識別番号４４）の対がＡＲＨ１遺伝子とＮＦＳ１遺伝子との間の接合部の存在を証明することを可能にし、第二には、ｌｅｕ２Ｄ（配列識別番号４５）およびａｒｈ１Ｒ（配列識別番号４６）がＬＥＵ２遺伝子とＡＲＨ１遺伝子との間の接合部を証明することができる。

ＡＲＨ１活性をコードするＡＲＨ１遺伝子のための発現カセットの存在の他に、ＡＲＨ１ｐタンパク質の発現もまた得られたクローンでテストされた。しかしながら、ＡＲＨ１ｐの過剰発現を検出することは容易ではない。これは、サッカロミセス セレビシエ株における自然な状態での低レベルのＡＲＨ１ｐタンパク質の存在のためである。Dumes et al.（1996）が記載したように実施したウェスタンブロット実験は、しかしながらＡＲＨ１ｐの量の増加確認を可能にする。ウェスタンブロット実験（慎重を要することが判明している）の他に、ＡＲＨ１ｐ量の増加の存在は、チトクロームｃの還元または１１−ジオキシコルチゾルの１１β−ヒドロキシル化から成る実験で証明できる。前記実験は、Lacour et al.（1998）およびDumas et al.（1996）がそれぞれ記載したとおり、組換え酵母に由来する精製ミトコンドリアでin vitroで再構成される。

それぞれｐＴＧ１２０４８およびｐＴＧ１２０５０で形質転換され、ＡＲＨ１を過剰発現している２つのクローン、ＵＣＹ１９およびＵＣＹ２０を厳密に選別する。続いてＡＴＦ２遺伝子を上記に記載したように前記の株で破壊した。プラスミドｐＡＭ３ｋａｎａＣを直鎖化し、続いてＵＣ１９およびＵＣ２０株の形質転換に用いた。続いて、Ｇ４１８耐性およびプレグネノロンアセチルトランスフェラーゼ活性が存在しないというその特性を基準にCauet et al.（1999）の記載にしたがって前記クローンを選別した。ＵＣＹ１９およびＵＣＹ２０に由来する２つのクローンをより厳密に選別する。前記クローンがそれぞれＵＣＹ２５およびＵＣＹ２７株である（図２参照）。

本発明の株によるステロイドの産生
ａ）ＵＣＹ２およびＵＣＹ４のｐＣＶ２９およびｐＣＣ１２による形質転換
ＵＣＹ２およびＵＣＹ４株を２つのプラスミドｐＣＶ２９およびｐＣＣ１２で上記のように形質転換した（前記株の構造は下記並びに図３および４で再度示される）。

プラスミドｐＣＶ２９は酵母の２−ミクロン複製起点を含む。さらに前記プラスミドは
それぞれ、上記で述べたようにミトコンドリアに誘導されるヒト／ウシハイブリッドＰ４５０１１β、並びにアドレノドキシンおよびＰ４５０_SCCの成熟形（アミノ末端にメチオニンを有する）のための３つの発現カセット含む。前記３つのタンパク質の発現はＣＹＣ１プロモーター（Ｐ４５０１１β）およびＧＡＬ１０／ＣＹＣ１プロモーター（ＡＤＸおよびＰ４５０_SCCの成熟形）の制御下にある。

プラスミドｐＣＣ１２は低コピープラスミドであり、ＴＥＦ１プロモーターの制御下にあるウシのアドレノドキシンレダクターゼの成熟形のための発現カセット、およびＴＤＨ３プロモーターの制御下にあるウシの３β−ＨＳＤのための発現カセットを含む。

前記株を炭素源としてグルコースを含むカッペリ培地で通常の発酵条件下で増殖させる。発酵の最後に（１８０時間）、ステロイドを以前に記載されたように抽出し、高速液体クロマトグラフィーで性状を決定する。

生成物の特定はガスクロマトグラフィー並びに、逆相および液相高速クロマトグラフィーで（可能な場合には質量分析および核磁気共鳴を併用して）確認した（表１参照）。

ｂ）ｐＣＶ２９およびｐＣＣ１２によるＵＣＹ２４、ＵＣＹ２５、ＵＣＹ２６およびＵＣＹ２７株の形質転換およびｐＦＭ１０によるＵＣＹ１６の形質転換
これらの株は多くの改変を有し、形質転換が困難であることが判明した。結果として、これらの形質転換のために、Burgers et al.（1987）が記載したようにスフェロプラストの調製を基にしたプロトコルを用いた。ＵＣＹ１６はプラスミドｐＦＭ７およびｐＣＢ１２で前記プロトコルによって形質転換された。ｐＦＭ７およびｐＣＢ１２は酵母内でin vivo組換えによりプラスミドｐＭＦ１０を生じる。上記で述べたように、プラスミドｐＦＭ１０はマルチコピー酵母プラスミドであり、前記はいずれの細菌配列も含まず、４つの異種タンパク質を発現させる。前記４つの異種タンパク質は，上記で示されたように、チトクロームＰ４５０₁₁β、ウシ３β−ＨＳＤ、成熟ＡＤＸおよび成熟チトクロームＰ４５０_SSCのキメラ形である。

対応するｃＤＮＡはそれぞれＣＹＣ１、ＴＤＨ３、ＧＡＬ１０／ＣＹＣ１およびＧＡＬ１０／ＣＹＣ１プロモーターの制御下に置かれている。形質転換体を何も加えていない最少培地で選別する。前記選別はＡＤＥ２マーカー（アデニンの不存在下で増殖）のみを基準に実施される。ゲノム内の機能的ＵＲＡ３遺伝子（ＡＴＦ２遺伝子を不活化するために用いられた）の存在は、ＵＲＡ３遺伝子を基準にして選別することを不可能にする。したがって、ＵＣＹ１６株で機能を有するプラスミドｐＦＭ１０を含むことを確認するために、いくつかのコロニーをスクリーニングすることが必要である。

ＵＣＹ２４、ＵＣＹ２５、ＵＣＹ２６およびＵＣＹ２７株は、スフェロプラストの調製と同じプロトコルにしたがってプラスミドｐＣＶ２９およびｐＣＣ１２で形質転換された。上記で述べたように、プラスミドｐＣＶ２９は、大腸菌とサッカロミセス セレビシエ
との間を往復させるためのマルチコピープラスミドである。前記はチトクロームＰ４５０_11β、成熟ＡＤＸおよびチトクロームＰ４５０_SCCをそれぞれＣＹＣ１、ＧＡＬ１０／ＣＹＣ１およびＧＡＬ１０／ＣＹＣ１プロモーターの制御下で発現させる（図３参照）。ｐＣＣ１２プラスミドはシングルコピー酵母プラスミドで、それぞれＴＥＦ１プロモーターおよびＴＤＨ３プロモーターの制御下でウシ成熟ＡＤＲおよびウシ３β−ＨＳＤを発現させる（図４参照）。

前記３つの株を全て、エルレンマイヤーフラスコ（１００mL容積、３０mLの培養液を含む）中で炭素源として２％のエタノールおよび０.１％のグルコースを用い、カッペリの培養液で通常の発行条件下で増殖させる。１６８時間培養した後、５００μLの培養液（細胞＋培養液）を４mLのジクロロエタンを用いて２回抽出した。有機層を一緒にし、続いて２つに分けて窒素流の下で乾燥させる。乾燥抽出物を１００μLのアセトニトリル／水（５０／５０、ｖ／ｖ）混合物または１００μLのジクロロエタンに再懸濁させた。前記アセトニトリル／水混合物中に再懸濁させた抽出物をＨＰＬＣで処理する。前記は、Valvo et al.（1994）が記載したように種々のステロイド組成の分析（ヒドロコルチゾン、コルテキソロン、コルチコステロン、１７ＯＨ−プロゲステロン、４−プレグネン−１７α,２０α−ジオール−３−オン）を可能にする。

ジクロロエタンに再懸濁した抽出物は、Duport et al.（1998）が記載したようにガスクロマトグラフィーで分析する。後者の分析は、サンプル中のプレグネノロンおよびプロゲステロンの量の測定を可能にする。

形質転換した各株について、約１０クローンのステロイド生産性を測定する。下記に提示した結果は、ｐＣＶ２９およびｐＣＣ１２で形質転換したＵＣＹ２４、ＵＣＹ２５、ＵＣＹ２６およびＵＣＹ２７株の各々、並びにｐＦＭ１０で形質転換したＵＣＹ１６株について最良の１０クローンの結果を示している。

上記に提示したＵＣＹ１６／ｐＦＭ１０、ＵＣＹ２４／ｐＣＶ２９＋ｐＣＣ１２、ＵＣＹ２５／ｐＣＶ２９＋ｐｃｃ１２、ＵＣＹ２６／ｐＣＶ２９＋ｐＣＣ１２およびＵＣＹ２７／ｐＣＶ２９＋ｐＣＣ１２株は、したがってＵＣＹ４／ｐＣＶ２９＋ｐＣＣ１２株によって産生されるヒドロコルチゾンの量よりも多いヒドロコルチゾンを産生することができる。したがって、ステロイドの総量は、ＵＣＹ４／ｐＣＶ２９＋ｐＣＣ１２株の２１.２μg／mLからＵＣＹ２５／ｐＣＶ２９＋ｐＣＣ１２株の４３.３μg／mLに増加し、一方、
ヒドロコルチゾンの量は１２.３μg／mLから２９.２μg／mLにそれぞれ増加する。さらに、これらの例では、ヒドロコルチゾンは、総ステロイドの約７０％を占める。これらの株ではいずれも４−プレグネン−１７,２０−ジオール−３−オン夾雑物質を産生しないために、生成されるヒドロコルチゾンの量および質における大きな改善が観察される。特に後者の有利な特性は、ケトンの還元反応に必要な２０位のＧＣＹ１および／またはＹＰＲ１遺伝子によってコードされるタンパク質の欠落によるものである。

さらにまた、予期せぬことには、ＣＹＣ１プロモーター下でのＡＲＨ１ｐの管理された過剰産生によって、生成される総ステロイド量さらにまたヒドロコルチゾン生成が顕著に増加することを記すこともまた重要であろう（ＵＣＹ２４／ｐＣＶ２９＋ｐＣＣ１２とＵＣＹ２５／ｐＣＶ２９＋ｐＣＣ１２を参照されたい）。しかしながら、所望の効果を得るためにはこの発現はあまりに強すぎてはいけない。したがって、生理学的レベルよりも高いレベルのＡＲＨ１タンパク質の発現を所望する場合、このタンパク質をあまりに強く過剰発現させないように配慮しなければならない。そうでなければ、ステロイドの生成におけるこの増加を失うおそれがある。したがって、ＣＹＣ１よりもはるかに強いと評価される（Nacken et al.,1996）ＴＥＦ１プロモーターは不満足な結果をもたらす（ＵＣＹ２５／ｐＣＶ２９＋ｐＣＣ１２とＵＣＹ２７／ｐＣＶ２９＋ｐＣＣ１２を参照されたい）。結論すれば、ＵＣＹ２５／ｐＣＶ２９＋ｐＣＣ１２株は、概算すれば、発酵で２００mg／Ｌのヒドロコルチゾンを唯一の主要な夾雑物質（コルチコステロン）とともに産生する能力を有する。

ｃ）本発明の株による大容積での産生例
上記の株の２つを当業者に周知の技術にしたがって（例えばD. Risenberg et al.（1999）参照）、カッペリの培地で大容積ファーメンターで増殖させた。使用した培養技術は濃縮培養液を用いるフェッドバッチ（fed-batch）である。総容積１５リットルのファーメンターは、開始時に６リットルの培養液を有する。培養中にさらに添加される４リットルの濃縮培養液およびｐＨ修正液の連続添加，並びにエターノールの連続添加によって、最終容積は培養終了時に約１１.５literとなる。ＵＣＹ４／ｐＣＶ２９＋ｐＣＣ１２およびＵＣＹ１６／ｐＦＭ１０株を上記のように１８０時間培養し、ヒドロコルチゾンの産生増加を得ることができた（表３参照）。ＵＣＹ２４／ｐＣＶ２９＋ｐＣＣ１２、ＵＣＹ２５／ｐＣＶ２９＋ｐＣＣ１２、ＵＣＹ２６／ｐＣＶ２９＋ｐＣＣ１２、およびＵＣＹ２７／ｐＣＶ２９＋ｐＣＣ１２株の予想結果は、前記結果から外挿することができる（表３参照）。

生物学的材料の寄託
ブダペスト条約の規定にしたがって、以下の生物を２００１年１月２４日に下記のCollection National de Cultures de Microorganismes(CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Franceに寄託した。
‐ＣＤＲ０７ＭＡＴα株 受託番号Ｉ−２６１６
‐ＴＧＹ２６０株 受託番号Ｉ−２６１５

本明細書に記載した株の一覧
Ｆｙ１６７９−１８ｂ＝（ｎ）ＭＡＴａ ｕｒａ３−５２ ｔｒｐ１−Δ６３ ｌｅｕ２−Δ１ ｈｉｓ３−Δ２００ ｆｅｎ１ ＧＡＬ ｆｅｎ^S ｕｒａ^- ｔｒｐ^- ｌｅｕ^- ｈｉｓ^-
Ｆｙ１６７９−２８ｃ＝（ｎ）ＭＡＴα ｕｒａ３−５２ ｔｒｐ１−Δ６３ ｌｅｕ２−Δ１ ｈｉｓ３−Δ２００ ｆｅｎ１ ＧＡＬ ｆｅｎ^S ｕｒａ^-ｔｒｐ^- ｌｅｕ^-
ｈｉｓ^-
ＴＧＹ１９５＃４＝Ｆｙ１６７９−１８ｂ ｙｐｒ１：：ＵＲＡ３
ＴＧＹ２１１−１＝Ｆｙ１６７９−１８ｂ ｙｐｒ１：：ＴＥＦ１_P：：Ｐ４５０ｃ２１ ［５ｘ？］ ｕｒａ^- ｔｒｐ^- ｌｅｕ^- ｈｉｓ^-
ＴＧＹ２４３−１＝ＴＧＹ２１２−１ ｇｃｙ１：：ＵＲＡ３ ｔｒｐ^- ｌｅｕ^- ｈｉｓ^-
ＴＧＹ２４５−２Ｄ＝ＴＧＹ２４３−１ ｇｃｙ１：：ＴＤＨ３_P：：Ｐ４５０ｃ２１
ｕｒａ^- ｔｒｐ^- ｌｅｕ^- ｈｉｓ^-
ＴＧＹ２６０−Ａ＝ＴＧＹ２４５−２Ｄ ＬＥＵ２：：ＣＹＣ１_P：：ＡＲＨ１ ｕｒａ^- ｔｒｐ^- ｈｉｓ^-
ＣＤＲ０１＝Ｆｙ１６７９−１８ｂ ＭＡＴαＬＥＵ２：：’ｂ−ｍａｔ ＡＤＲ’ ｕｒａ^- ｔｒｐ^- ｈｉｓ^-
ＣＤＲ０７ ＭＡＴα＝ＭＡＴα ａｄｅ２：：ＧＡＬ１０／ＣＹＣ１_P：：Δ⁷ ｕｒａ^- ｔｒｐ^- ｌｅｕ^- ｈｉｓ^- ａｄｅ^-（ＣＡ１０×Ｆｙ１６７９−２８ｃの胞子）
ＣＤＲ０７ ＭＡＴａ＝ＭＡＴａ ａｄｅ２：：ＧＡＬ１０／ＣＹＣ１_P：：Δ⁷ ｕｒａ^- ｔｒｐ^- ｌｅｕ^- ｈｉｓ^- ａｄｅ^-（ＣＡ１０×Ｆｙ１６７９−２８ｃの胞子）
ＣＡ０３＝ＣＤＲ０１ ａｄｅ２：：ＧＡＬ１０／ＣＹＣ１_P：：Δ⁷ ｕｒａ^- ｔｒ
ｐ^- ａｄｅ^- ｈｉｓ^-、ナイスタチン耐性（Duport et al., 1998）
ＣＡ１０＝ＣＡ０３ ｅｒｇ５：：ＰＧＫ１_P：：ｈｙｇｒｏ^R ｕｒａ^- ｔｒｐ^- ａｄｅ^- ｈｉｓ^-、ナイスタチンおよびヒグロマイシン耐性（Duport et al., 1998）
ＳＢ１４（２ｎ）＝ＴＧＹ２６０−Ａ×ＣＤＲ０７ Ｍａｔα
ＹＣＣ４＝（ｎ）ＭＡＴα ａｄｅ２：：ＧＡＬ１０／ＣＹＣ１_P：：Δ⁷，ＬＥＵ２：：ＣＹＣ１_P：：ＡＲＨ１，ｙｐｒ１：：ＴＥＦ１_P：：Ｐ４５０ｃ２１，ＥＲＧ５，ｆｅｎ１（？）， ｕｒａ^- ｔｒｐ^- ａｄｅ^- ｈｉｓ^- ナイスタチン耐性、（ＳＢ１４の胞子）
ＹＣＣ８＝ｐＬＩＰ５で形質転換されたＹＣＣ４（ＴＲＰ１：：ＴＥＦ１_P：：Ｐ４５０ｃ１７：：ＰＧＫ１_t）、ナイスタチン耐性
ＵＣＹ２＝ｐＴＧ１２０９３で形質転換されたＹＣＣ８（ＨＩＳ３：：ＴＤＨ３_P：：ＣｏｘＶＩ_pre：：ｍａｔＡＤＸ：：ＰＧＫ１_t）：ＨＩＳ３：：ＴＤＨ３_p：：ＣｏｘＶＩ_pre：：ｍａｔＡＤＸ：：ＰＧＫ１_t，ＥＲＧ５，ｆｅｎ１（？）， ｕｒａ^- ａｄｅ^-，ナイスタチン耐性
ＵＣＹ４＝ＵＣＹ２ ａｔｆ２−Δ：：Ｇ４１８^R ｕｒａ^- ａｄｅ^- ナイスタチンおよびＧ４１８耐性
ＹＣＣ５＝（ｎ）ＭＡＴα ａｄｅ２：：ＧＡＬ１０／ＣＹＣ１_P：：Δ７レダクターゼ、ＬＥＵ２：：ＣＹＣ１_P：：ＡＲＨ１、ｇｃｙ１：：ＴＤＨ３_P：：Ｐ４５０ｃ２１、ＥＲＧ５，ｆｅｎ１（？）， ｕｒａ^- ｔｒｐ^- ａｄｅ^- ｈｉｓ^-，（ナイスタチン耐性、ＳＢ１４の胞子）
ＹＣＣ９＝ｐＬＩＰ５で形質転換されたＹＣＣ５（ＴＲＰ１：：ＴＥＦ１_P：：Ｐ４５０ｃ１７：：ＰＧＫ１_t），ｕｒａ^- ａｄｅ^- ｈｉｓ^-，ナイスタチン耐性
ＵＣＹ３＝ｐＴＧ１２０９３で形質転換されたＹＣＣ９（ＨＩＳ３：：ＴＤＨ３_P：：ＣｏｘＶＩ_pre：：ｍａｔＡＤＸ：：ＰＧＫ１_t）：ＨＩＳ３：：ＴＤＨ３_p：：ＣｏｘＶＩ_pre：：ｍａｔＡＤＸ：：ＰＧＫ１_t，ＥＲＧ５，ｆｅｎ１（？），ｕｒａ^- ａｄｅ^-，（ナイスタチン耐性）
ＵＣＹ２６＝ＵＣＹ３ ａｔｆ２−Δ：：Ｇ４１８^R ｕｒａ^- ａｄｅ^- （ナイスタチンおよびＧ４１８耐性）
ＹＳＡ２（２ｎ）＝ＴＧＹ２４５−２Ｄ×ＵＣＹ２
ＵＣＹ５＝（ｎ）ＭＡＴα ａｄｅ２：：ＧＡＬ１０／ＣＹＣ１_P：：Δ７レダクターゼ、ＬＥＵ２：：ＣＹＣ１_P：：ＡＲＨ１、ｙｐｒ１：：ＴＥＦ１_P：：Ｐ４５０ｃ２１、ＥＲＧ５，ｇｃｙ１：：ＴＤＨ３_P：：Ｐ４５０ｃ２１、ｆｅｎ１（？），ｕｒａ^- ｔｒｐ^- ｈｉｓ^-，ナイスタチン耐性（ＹＳＡ２の胞子）
ＵＣＹ６＝ＵＣＹ５ ＬＥＵ２：：ＴＥＦ１：：ｍａｔＡＤＲ：：ＰＧＫ１_t
ＵＣＹ１６＝ＵＣＹ６ ａｔｆ２：：ＵＲＡ３：：ａｔｆ２
ＵＣＹ１９＝ＵＣＹ５，ＬＥＵ２：：ＣＹＣ１：：ＡＲＨ１
ＵＣＹ２０＝ＵＣＹ５，ＬＥＵ２：：ＴＥＦ１：：ＡＲＨ１
ＵＣＹ２５＝ＵＣＹ１９ ａｔｆ２−Δ：：Ｇ４１８^R （ナイスタチンおよびＧ４１８耐性）
ＵＣＹ２７＝ＵＣＹ２０ ａｔｆ２−Δ：：Ｇ４１８^R （ナイスタチンおよびＧ４１８耐性）
ＵＣＹ２４＝ＵＣＹ６ ａｔｆ２−Δ：：Ｇ４１８^R （ナイスタチンおよびＧ４１８耐性）

参考文献：
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本発明にしたがって得ることができるヒドロコルチゾンの生合成経路を示す図である。 本発明で例証した酵母株の構築を示す図である。 プラスミドｐＣＶ２９のマップである。ＰＧＫｔｅｒｍ＝ＰＧＫターミネーター；ＧＡＬ１０／ＣＹＣ１ｐｒｏｍ＝ＧＡＬ１０／ＣＹＣ１プロモーター；ＨＧＨｔｅｒｍ＝ヒト成長ホルモン遺伝子のターミネーター；イントロンβ−グロビン＝ウサギβ−グロビン遺伝子のイントロン；ＣＹＣ１ｐｒｏｍ＝ＣＹＣ１プロモーター；ＰＧＫｔｅｒｍ＝ＰＧＫターミネーター；S. cerevisiae ２−ミクロン＝サッカロミセス セレビシエの２−ミクロンの複製起点；Ｃｏｘ６ｐｒｅ＝チトクロームオキシダーゼサブユニット６のプレシークェンス；ウシ／ヒトＰ４５０１１β＝Ｐ４５０１１βのウシ／ヒト融合ｃＤＮＡ；ｍａｔ−ＡＤＸ＝アミノ末端メチオニンを有するＡＤＸの成熟形；Ｅ．ｃｏｌｉレプリコン＝大腸菌レプリコン。 プラスミドｐＣＣ１２のマップである。ＣＹＣ１ｐｒｏｍ＝ＣＹＣ１プロモーター；ＰＧＫｔｅｒｍ＝ＰＧＫターミネーター；ＡＲＳＣＥＮ＝サッカロミセス セレビシエの染色体の複製起点；Ｅ．ｃｏｌｉレプリコン＝大腸菌のレプリコン；ＴＤＨ３ｐｒｏｍ＝ＴＤＨ３プロモーター；３β−ＨＳＤＨ；３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼｃＤＮＡ；ｍａｔＡＤＲ＝メチオンニンが先行するＡＤＲの成熟形。 プラスミドｐＦＭ１０のマップである。ＣＹＣ１ｐ＝ＣＹＣ１プロモーター；Ｐ４５０１１β＝Ｐ４５０１１βのウシ／ヒト融合ｃＤＮＡ；ＡＤＥ２＝酵母ＡＤＥ２遺伝子；ＴＤＨ３ｐ＝ＴＤＨ３プロモーター；３β−ＨＳＤ＝３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼｃＤＮＡ；Ｒ１＝組換えのための塩基、その配列は配列識別番号３９で示される；ＧＡＬ１０／ＣＹＣ１ｐ＝ＧＡＬ１０／ＣＹＣ１プロモーター；ｍａｔｃＤＮＡ＝ＡＤＸの成熟形をコードするｃＤＮＡ；ＵＲＡ３＝酵母のＵＲＡ３遺伝子；Ｐ４５０_scc＝Ｐ４５０_scc（ＣＹＰ１１Ａ１）の成熟形をコードするｃＤＮＡ；２−ミクロン起点＝サッカロミセス セレビシエの２−ミクロン複製起点；Ｒ２＝組換えのための塩基、その配列は配列識別番号４０で示される。

Claims (25)

1. 単純炭素源からコレステロール代謝により誘導されるステロイドを自律的に産生する遺伝的に改変された酵母株であって、このステロイドが、プレグネノロン、１７α−ヒドロキシプレグネノロン、コルチゾル、コルテキソロン、プロゲステロン、１７α−ヒドロキシプロゲステロンおよびこれらのステロイドの誘導体から成る群に含まれており、この酵母株が、内在性遺伝子の破壊または不活化、内在性遺伝子のプロモーターの改変、内在性遺伝子の重複化および発現ブロック内の少なくとも１つの異種遺伝子を１つもしくは２つ以上のコピーとしてエピソームまたは染色体の一部に導入することから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝的改変を有し、内在性遺伝子ＡＴＦ２、ＧＣＹ１およびＹＰＲ１の不活化を有することを特徴とする上記酵母株。
2. 酵母株が内在性遺伝子ＥＲＧ５、ＡＴＦ２、ＧＣＹ１およびＹＰＲ１の破壊を有することを特徴とする請求項１に記載の酵母株。
3. 酵母株が、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、ＧＣＹ１、ＡＴＦ２およびＹＰＲ１から選択される少なくとも１つの遺伝子座で染色体に組み込まれている、異種遺伝子のための少なくとも１つの発現ブロックを有し、この組み込みが、上記遺伝子座のすぐ近傍の遺伝子内または遺伝子間で実施されることを特徴とする請求項１または２に記載の酵母株。
4. 酵母株が、マルチコピープラスミドまたは低コピープラスミドに配置されている、異種遺伝子のための少なくとも１つの発現ブロックを有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の酵母株。
5. マルチコピープラスミドが、サッカロミセス セレビシエで複製する酵母２−ミクロンレプリコン系プラスミドから選択されること、および低コピープラスミドが、酵母の動原体を含む染色体ＡＲＳ複製起点をベースにしたプラスミドから選択されることを特徴とする請求項４に記載の酵母株。
6. 酵母株が発現ブロック内に少なくとも１つの異種遺伝子またはｃＤＮＡを有し、この遺
   伝子またはｃＤＮＡが、ステロールΔ７−レダクターゼ、チトクロームＰ４５０ＳＣＣ、アドレノドキシン、アドレノドキシンレダクターゼ、３β−ヒドロステロイドデヒドロゲナーゼイソメラーゼ、チトクロームｂ５、チトクロームＰ４５０レダクターゼ、チトクロームＰ４５０Ｃ１７、チトクロームＰ４５０Ｃ２１およびチトクロームＰ４５０Ｃ１１の遺伝子、並びにこれらのタンパク質をコードする配列から成る群から選択されることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の酵母株。
7. 少なくとも１つの異種遺伝子またはｃＤＮＡが、酵母の内在性プロモーター配列ＴＤＨ３、ＴＥＦ１、ＰＧＫ１、ＣＹＣ１、ＧＡＬ１０、ＡＴＦ２、ＴＩＲ１、ＡＲＨ１およびＡＤＥ２、並びにハイブリッドプロモーターＧＡＬ１０−ＣＹＣ１から成る群から選択されるプロモーター配列の制御下にあることを特徴とする請求項６に記載の酵母株。
8. 発現ブロック内の少なくとも１つの異種遺伝子またはｃＤＮＡのターミネーター配列が、内在性遺伝子ＰＧＫ１、ＣＹＣ１、ＡＴＦ２、ＡＤＥ２およびＮＣＰ１のターミネーター配列から選択されることを特徴とする請求項６または７に記載の酵母株。
9. 酵母株が、ＡＤＥ２遺伝子座で染色体に組み込まれているステロールΔ７−レダクターゼ異種発現ブロックを有することを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の酵母株。
10. 酵母株が、高コピープラスミドに配置されている、Ｐ４５０ＳＣＣの成熟形およびアドレノドキシンの成熟形をコードする遺伝子の発現のための少なくとも１つのカセット含むことを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の酵母株。
11. 酵母株が、シングルコピープラスミドまたは低コピープラスミドに配置されているか、または１つもしくは２つ以上の酵母染色体に組み込まれている、Ｐ４５０ＳＣＣのためのアドレノドキシンレダクターゼの発現のためのカセットを含むことを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の酵母株。
12. アドレノドキシンレダクターゼの発現のためのカセットが、ホスト細胞のサイトゾルにタンパク質が存在することを担保する成分を有することを特徴とする請求項１１に記載の酵母株。
13. 酵母株が、３β−ヒドロステロイドデヒドロゲナーゼイソメラーゼの発現のためのカセット、チトクロームＰ４５０ｃ１７の発現のためのカセット、およびチトクロームＰ４５０ｃ２１の発現のためのカセットから選択される、高コピープラスミドに配置されている少なくとも１つの発現カセットを含むことを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項に記載の酵母株。
14. 酵母株が、マルチコピープラスミドに配置されている、Ｐ４５０１１βのための少なくとも１つの発現カセットを含み、前記生成されたタンパク質がミトコンドリアへの誘導のためのシグナルを有することを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の酵母株。
15. 酵母株が、マルチコピープラスミドに配置され、弱いプロモーターを含む、Ｐ４５０１１βのためのアドレノドキシン前駆体のための少なくとも１つの発現カセットを含み、前記生成されたタンパク質がミトコンドリアへの誘導のためのシグナルを有することを特徴とする請求項１〜１４のいずれか１項に記載の酵母株。
16. 酵母株が、アドレノドキシンのための少なくとも２つの発現カセットを有し、それによ
    り一方のタンパク質がミトコンドリア外で活性を有し、他方がホスト細胞のミトコンドリア内で活性を有することを特徴とする請求項１〜１５のいずれか１項に記載の酵母株。
17. 酵母株が、ＮＣＰ１、ＡＴＲ１および／またはＡＴＲ２のための少なくとも１つの発現カセットを含み、このカセットがシングルコピープラスミドに配置されているか、または染色体に組み込まれていることを特徴とする請求項１〜１６のいずれか１項に記載の酵母株。
18. 酵母株が、生理学的レベルよりも高いレベルでＡＲＨ１タンパク質を発現することを特徴とする請求項１〜１７のいずれか１項に記載の酵母株。
19. 酵母株が、内在性遺伝子の他に、ＡＲＨ１タンパク質のための第二の発現カセットを有することを特徴とする請求項１８に記載の酵母株。
20. ＡＲＨ１タンパク質の発現が、カセット内のＣＹＣ１プロモーターの制御下に置かれていることを特徴とする請求項１９に記載の酵母株。
21. 酵母株が倍数体、二倍体、半数体または異数体であることを特徴とする請求項１〜２０のいずれか１項に記載の酵母株。
22. 酵母株がサッカロミセス セレビシエの１株であることを特徴とする請求項１〜２１のいずれか１項に記載の酵母株。
23. 酵母株が、ＣＮＣＭにそれぞれ受託番号Ｉ−２６１６およびＩ−２６１５で２００１年１月２４日に寄託されたＣＤＲ０７Ｍａｔ−αまたはＴＧＹ２６０株であるか、または、ＣＤＲ０７Ｍａｔ−αおよびＴＧＹ２６０の交雑並びに場合によって胞子形成および酵母由来のプラスミドによる形質転換後に得られた株、特にＵＣＹ２またはＵＣＹ４株であることを特徴とする酵母株。
24. 酵母株が、産生されたステロイドを培養液中に分泌するために必要な成分を有することを特徴とする請求項１〜２３のいずれか１項に記載の酵母株。
25. 請求項１〜２４のいずれか１項に記載の酵母株を単純な炭素源の存在下で発酵させる工程、および前記産生されたステロイドを回収する工程を含むことを特徴とするステロイドの製造方法。

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