BRPI0210345B1 - processo para produção de planta de algodão resistente a inseto compreendendo evento elite mon15985 e método para detecção do evento elite mon15985, bem como sequências de dna e kit de detecção de dna - Google Patents
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Abstract
"evento mon15985 do algodão e composições e métodos para detecção do mesmo". a presente invenção refere-se plantas de algodão, tecidos de algodão e sementes de algodão que incluem o evento mon15985, o qual confere resistência a dano por inseto lepidóptero. também se providencia testes para detectar a presença do evento mon15985 com base na seqüência de dna do construto recombinante inserido no genoma de algodão que resultou no evento mon15985, e/ou as seqüências genômicas flanqueando o sítio de inserção.
Description
(54) Título: PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE PLANTA DE ALGODÃO RESISTENTE A INSETO COMPREENDENDO EVENTO ELITE MON15985 E MÉTODO PARA DETECÇÃO DO EVENTO ELITE MON15985, BEM COMO SEQUÊNCIAS DE DNA E KIT DE DETECÇÃO DE DNA (51) Int.CI.: A01H 1/04; A01H 5/00; A01H 5/10; C07H 21/04; C12N 15/82; C12Q 1/68 (30) Prioridade Unionista: 11/06/2001 US 60/297,406 (73) Titular(es): MONSANTO TECHNOLOGY LLC (72) Inventor(es): SCOTT A. HUBER; JAMES K. ROBERTS; ZACHARY W. SHAPPLEY; SEAN DOHERTY (85) Data do Início da Fase Nacional: 11/12/2003
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE PLANTA DE ALGODÃO RESISTENTE A INSETO COMPREENDENDO EVENTO ELITE MON15985 E MÉTODO PARA DETECÇÃO DO EVENTO ELITE MON15985, BEM COMO SEQUÊNCIAS DE DNA E KIT DE DETECÇÃO DE DNA.
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se ao campo da biologia molecular de plantas, e, em particular, à proteção da planta contra insetos e a seu cultivo, e é direcionada a um novo evento de transformação de plantas do algodão, Gossypium hirsutum, compreendendo uma sequência de polinucleotídeo inserida em um sítio específico dentro do genoma de uma célula de algodão, a referida seqüência codificando uma proteína inibidora de inseto lepidóptero, Cry2Ab. Adicionalmente, a invenção relaciona-se a plantas de algodão derivadas daquele evento de transformação e a testes para detectar a presença do evento em uma amostra.
Antecedentes da Invenção
Esta invenção refere-se a um evento de planta de algodão resistente a Lepidópteros previamente comercializada, conhecido como MON531, expressando uma forma quimérica de uma proteína inibidora de inseto Cry1A. Plantas de algodão são suscetíveis à infestação por inseto em todos os lugares do mundo em que estas plantas são cultivadas. A tecnologia de DNA recombinante foi aplicada a células da planta de algodão por cerca de uma década, e foram produzidas plantas de algodão que apresentam características melhoradas como um resultado da inserção de sequências de DNA heterólogo, usando tecnologia de DNA recombinante desde cerca do início dos anos 90. Algumas dessas melhoras apresentadas pelas plantas de algodão recombinantes incluem tolerância à herbicida, características melhoradas de fibra e resistência à infestação por inseto.
As primeiras plantas de algodão recombinantes protegidas da infestação de inseto Lepidóptero foram produzidas, aprovada por agências governamentais para distribuição comercial, e a seguir comercializadas em 1996. Essas plantas de algodão continham uma sequência de DNA /
* ·· ··· ·· ·· · ·· »···· ····
··· ·· ···· ··« ·· ·· · ·· codificando uma proteína inibidora de inseto lepidóptero Cry1A, originariamente a partir do evento MON531. Este traço particular juntamente com uma seqüência de DNA ligada adjacente codificando um marcador selecionável, foi transferido por cultivo convencional para uma série de variedades de algodão, cada uma das quais particularmente adequada para produção aumentada do algodão em localidades geográficas diversificadas por todo o mundo. Essas variedades recombinantes conseguiram um tremendo sucesso comercial por uma série de motivos. Um motivo é que os rendimentos por acre da produção do algodão melhoraram, em média, dramaticamente devido à reduzida infestação por inseto como resultado da presença da proteína inibidora de inseto presente dentro de cada célula da planta de algodão. Um outro motivo principal para o sucesso comercial foi o trabalho e custos reduzidos por conta da redução em aplicações de pesticidas químicos necessários para proteger a colheita da infestação por inseto. Além disso, a redução em aplicações de pesticida químico melhora a saúde global do meio evitando o aniquilamento dos insetos ou aracnídeos e de outras espécies que não apresentam ameaça material para o cultivo no campo, reduzem a carga de toxinas de pesticida químico aplicada ao meio, e permitem ao fazendeiro evitar os riscos associados com os efeitos potencial mente danosos da exposição a pesticidas químicos.
Tornou-se então evidente que um produto com uma faixa mais ampla de eficácia contra insetos seria conveniente. Embora este possa ser visto como simples, em virtude da técnica química em providenciar uma combinação de proteínas inibidoras de inseto para este fim, e, possivelmente retardar ou prevenir a resistência à toxina de se desenvolver na população de inseto alvo, na realidade o desenvolvimento de uma planta que atende essas características é problemática, e requer muitas pesquisas, capacidade técnica, e experimentos de tentativa e erros de modo a obter um único evento de transformação de planta recombinante, que resulte em uma planta morfologicamente normal apresentando a combinação desejada de proteínas inibidoras de inseto produzidas em níveis suficientes e em tempos apropriados durante o período de crescimento da planta e nos tecidos com os
quais as espécies de peste alvo se alimentam.
Assim, havia uma necessidade quanto ao desenvolvimento e caracterização de plantas de algodão apresentando as características de resistência ao inseto intensificadas como um resultado da presença de duas ou mais proteínas inibidoras de inseto produzidas de seqüência de DNA incorporadas ao genoma das células da planta. Além disso, seria desejável no caso dos traços de inibição de inseto (i) segregar independentemente, um do outro, (ii) não ocasionar quaisquer efeitos adversos com a fisiologia e metabolismo da planta, e (ii) ter pouco, caso algum, efeito adverso na produção ou qualidade da fibra produzida da referida planta.
É vantajoso poder detectar a presença de um evento particular de modo a determinar, se a progênie de um cruzamento sexual contém um transgene de interesse. Além disso, um método para detectar um evento particular pode ser de auxílio para aquiescer às regulamentações que reque15 rem a aprovação prévia do mercado de venda de sementes para produzir plantas de cultivo transgênico e alimentos derivados dessas plantas, por exemplo, ou para uso na monitoração ambiental, traços de monitoração em cultivos no campo, ou produtos de monitoração derivados de uma colheita de cultivo, bem como para uso em assegurar a aquiescência das partes su20 jeitas aos termos governamentais ou contratuais.
É possível detectar quanto à presença de um transgene por qualquer método de detecção de ácido nucléico conhecido na técnica, incluindo, sem estar limitado, a amplificação térmica (POR®) ou hibridização de DNA usando sondas de ácido nucléico. Tipicamente, por motivos de sim25 plicidade e uniformidade dos reagentes e metodologias para uso na detecção de construto de DNA que foi usado para transformar várias variedades de planta, esses métodos de detecção geralmente atém-se a elementos genéticos freqüentemente usados, tais como promotores, terminadores, genes marcadores, etc., porque para muitos construtos de DNA, a região de se30 qüência de codificação é intercambiável. Como resultado, tais métodos podem não ser úteis para discriminar entre eventos separados produzidos do mesmo construto de DNA ou construtos muito similares. Esses métodos po-
dem ser usados, contudo, caso a seqüência de DNA cromossomal adjacente ao DNA inserido (DNA lateral) seja conhecida. Um ensaio de amplificação térmico específico para evento (PCR®) é discutido, por exemplo, por Windels et al, (Med. Fac. Landbouww, Univ. Genf 64/5b:459-462, 1999), que identificou o evento 40-3-2 de soja tolerante ao glifosato usando um iniciador de amplificação térmico medindo a junção entre o inserto e o DNA de flanco. Especificamente, um iniciador incluiu a seqüência de dentro do inserto e um segundo iniciador incluiu a seqüência do DNA de flanco. Um tal método também foi desenvolvido para o evento MON531 e é o assunto de um pedido de patente separado. Seria conveniente ter-se tal método que detectaria quanto à presença do novo evento da presente invenção, mesmo na presença do evento MON531. Estes e outros avanços vantajosos foram conseguidos pela presente invenção.
Sumário da Invenção
O evento MON531 do algodão, descrito acima, foi transformado uma segunda vez com um construto genético denominado PV-GHBK11 compreendendo a seqüência de codificação para Cry2Ab, uma proteína inibidora de inseto e um evento deste esforço de transformação foi selecionado para potencial introdução comercial. Ele é denominado MON15985. Devido a ser um novo evento de inserção, ele irá segregar do gene crylAc inserido de MON531 no cultivo. Uma linhagem de algodão contendo apenas a inserção MON15985 é denominada MON15985X. De acordo com um aspecto da invenção, são providenciadas composições de matéria para essas linhagens de algodão. As sementes de algodão compreendendo o evento MON 15985 do algodão foram depositadas em 29 de setembro de 2000, junto à American Type Culture Collection e são indicadas com o número de acesso na ATCC, PTA-2516.
Em um outro aspecto da invenção são providos métodos para detectar a presença do evento MON 15985. Seqüências de DNA são providenciadas, as quais identificam as seqüências de DNA inserido e as seqüências de flanco do algodão nativo de MON15985. Dessas seqüências de DNA podem ser indicados iniciadores para uso em um ensaio de diagnóstico
por PCR. Iniciadores exemplares são providenciados como o são os amplicons produzidos para uso em tais iniciadores quando amplificados na presença de DNA MON15985.
Deve ser observado que, a detecção de um diagnóstico de se5 qüência para inserção do evento MON5985 do algodão pode ser insuficiente para responder todas as questões acerca de uma dada amostra de semente. A linhagem de semente denominada MON 15985 contém, tanto a inserção como a anterior identificada como MON531. Assim, em um outro aspecto da invenção, é providenciado um método para distinguir entre MON 15985 e
MON15985X, uma linhagem que carece do evento MON531. O método utiliza um ou mais diagnósticos de seqüências previamente conhecidos para MON531.
Uma seqüência de junção aqui mede o ponto ao qual o DNA inserido no genoma é ligado ao DNA do genoma nativo do algodão flanquean15 do o ponto de inserção, a identificação ou detecção de uma ou mais seqüências de junção em um material genético da planta sendo suficiente para ser diagnóstico para o evento. Incluídas estão as seqüências de DNA que medem as inserções no evento de algodão MON 15985 e extensões similares de DNA de flanco. Exemplos de tais seqüência de diagnósticos são as seqüências de junção 20-mer de SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, e SEQ ID NO: 18, contudo outras seqüência de no mínimo 15 pares de base que, sobrepõem-se às junções das inserções ou às junções das inserções e a seqüência genômica também são diagnósticos e podem ser usadas. A amplificação do ácido nucléico do DNA genômico do evento, usando os iniciadores aqui providenciados ou indicados pelo versado na técnica, produz um amplicon compreendendo tais seqüência de DNA de diagnóstico. Além disso, a detecção da ligação dos oligonucleotídeos que se ligam especificamente às seqüências de diagnóstico aqui descritas também é diagnóstico para o evento.
De acordo com um outro aspecto da invenção, são providenciados pares de iniciadores da seqüência de oligonucleotídeo para distinguir o evento do algodão MON1598 da seqüência nativa, não-transformada, e não-
perturbada. Em particular tais pares de iniciadores da seqüência de flanco compreendem duas moléculas de ácido nucléico isoladas selecionadas dentre SEQ ID NO: 11, ou alternativamente, SEQ ID NO: 12, o amplicon das quais se sobrepõe uma ou mais seqüências de junção no DNA inserido, ilustrado como números de referência 2, 4, 6, 9, e 11 na Figura 1. Por exemplo, pode-se selecionar um ácido nucléico isolado compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos adjacentes de cerca de posições de pares de base 1361 como indicado na SEQ ID NO: 11, que são desde a seqüência de DNA genômico do algodão flanqueando a extremidade 5' do DNA inserido, ilustrado como referência 1 na figura 1 e pelo menos um ácido nucléico isolado compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos adjacentes desde cerca das posições de pares de base 674-1361, como indicado na SEQ ID NO: 11, que estão dentro do DNA inserido, que está ilustrado como número de referência 3 e parte de 5 na Figura 1. Pares de iniciadores adicionais úteis na análise para o evento MON15985 do algodão compreendendo pelo menos um ácido nucléico isolado de pelo menos 15 nucleotídeos adjacentes dos nucleotídeos 1-1885 da SEQ ID NO: 11 emparelhada com pelo menos um ácido nucléico isolado de pelo menos 15 nucleotídeos adjacentes, de nucleotídeos 3622267 da SEQ ID NO: 11 podem ser prontamente realizados por um dos versados na técnica. De modo similar, pares de iniciadores podem ser derivados dos nucleotídeos 1-673 da SEQ ID NO: 12 e nucleotídeo dos nucleotídeos 350-1361 da SEQ ID NO: 12, sendo cada iniciador pelo menos de quinze nucleotídeos de comprimento.
De acordo com um outro aspecto da invenção, são providenciadas configurações de iniciadores específicos, de utilidade para amplificação do ácido nucléico, por exemplo. Especificamente, SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 27 são um tal conjunto de iniciadores e podem ser usados para produzir um amplicon que é diagnóstico da presença do evento MON 15985 DNA no algodão. SEQ ID NO: 28 e SEQ ID NO: 29 são um outro conjunto de iniciadores. Em contraste, SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 29 são capazes de produzir um amplicon de amostras de DNA obtidas de evento diferente do MON 15985 do algodão, e de genomas hemizigotos compreendendo a se-
qüência do tipo selvagem no ponto em que a seqüência MON15985 integrou-se ao genoma, bem como a seqüência integrante MON 15985, e tal amplicon pareceria ser diagnóstico da ausência do DNA inserido do evento MON15985 do algodão em uma amostra, e não produz amplicon em uma amostra contendo DNA daquele evento. Deve-se tomar precaução na interpretação de um tal resultado, contudo, e o versado na técnica reconhecerá que, quando presente como um membro hemizigoto de um par cromossomal, o uso de SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 29 como uma ferramenta de diagnóstico para provar um negativo ou um positivo pode ser falso.
De acordo com mais um aspecto da invenção, são providenciados métodos de detecção da presença de DNA correspondente ao evento do algodão MON 15985 em uma amostra. Tais métodos compreendem: (a) contatar a amostra compreendendo DNA com uma configuração de iniciador que, quando usado em uma reação de amplificação de ácido nucléico com DNA genômico do evento MON 156985 do algodão produz um amplicon que, é diagnóstico para o evento MON 15985 do algodão, (b) realizar uma reação de amplificação de ácido nucléico produzindo, por esse meio, o amplicon, e (c) detectar o amplicon.
De acordo com um outro aspecto da invenção, métodos de detectar a presença de DNA correspondente ao evento MON15985 do algodão em uma amostra, compreendendo tais métodos: a) contatar a amostra compreendendo DNA com uma sonda que hibridiza sob condições de hibridização rigorosas com DNA genômico do evento MON 15985 do algodão e não hibridiza sob as condições de hibridizaçao rigorosas com DNA de uma planta de algodão de controle, b) submeter a amostra e a sonda a condições de hibridização rigorosas, e c) detectar a hibridização da sonda ao DNA.
Um outro aspecto da presente invenção são métodos e composições para detectar a presença de um sítio alvo, ou seja, pelo menos uma das junções, identificação ou detecção da qual seria o diagnóstico quanto à presença do DNA integrado com o genômico da planta de algodão no evento MON15985 do algodão, em uma amostra de ácido nucléico derivada de, ou obtida do genoma do evento MON 15985 do algodão, usando uma série de ··· ·· ···· ··· ·· ·· · ·· métodos de detecção, incluindo TAQMAN (Perkin Elmer) ou metodologias de fluorporo/resfriamento brusco, amplificação térmica, reação em cadeia de ligase, hibridização southem, métodos ELISA, e métodos de detecção colorimétricos e fluorescentes relacionados. Em particular, a presente invenção propicia kits para detectar quanto à presença da seqüência alvo, ou seja, pelo menos uma das seqüências de junção no evento MON15985 do algodão, em uma amostra contendo ácido nucléico genômico do evento MON15985 do algodão. O kit é composto de pelo menos um polinucleotídeo capaz de ligar-se ao sítio alvo ou substancialmente adjacente ao sítio alvo, e pelo menos um meio para detectar a ligação do polinucleotídeo ao sítio alvo. O meio de detecção pode ser selecionado do grupo consistindo em fluorescente, quimioluminescente, colorimétrico, ou isotópico e pode ser acoplado pelo menos com métodos imunológicos para detectar a ligação. Também se considera um kit que pode detectar a presença de um sítio alvo em uma amostra, ou seja, pelo menos uma das junções do DNA de inserto com o DNA genômico da planta de algodão no evento MON 15985, retirando vantagem de duas ou mais seqüências de polinucleotídeo que juntas são capazes de ligar-se às seqüências de nucleotídeo adjacentes a, ou dentro de cerca de 100 pares de base, ou dentro de cerca de 200 pares de base, ou dentro de cerca de 500 pares de base, ou dentro de cerca de 1000 pares de base da seqüência alvo e que pode ser prolongada entre si para formar um amplicon que contém pelo menos o sítio alvo.
O precedente e outros aspectos da invenção tornar-se-ão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada e do desenho anexo. Desenho
A figura 1 é uma representação gráfica do alinhamento de seqüência para o DNA que flanqueia as seqüências inseridas e as próprias seqüência inseridas, incluindo o gene cry2Ab no evento MON15985 de algodão. O DNA inserido é ilustrado como um filamento único com 5' da esquerda até 3' para a direita. Seqüências individuais de DNA aqui identificadas são rotuladas a seguir: número de referência 1 é a seqüência de genoma lateral da extremidade 5'(SEQ ID NO: 19); número de referência 2 é a se·· ··· ·· ·· · ·· ·····
···· • · ·
qüência de junção sobrepondo-se às seqüências sobrepostas de números de referência 1 e 3, uma sequência de diagnóstico como indicado em SEQ ID NO: 14; número de referencia 3 é uma seqüência relacionada de cloroplasto de DNA extrínseco (SEQ ID NO: 20); número de referência 4 é a seqüência de junção sobrepondo-se às seqüências dos números de referência 3 e 5, uma seqüência de diagnóstico como indicado em SEQ ID NO: 15; número de referência 5 é um fragmento da seqüência do genoma de algodão (SEQ ID NO: 21); número de referência 6 é a seqüência de junção sobrepondo-se às seqüências dos números de referência 5 e 7, uma seqüência de diagnóstico como indicado em SEQ ID NO: 16; número de referência 7 é uma parte da extremidade 5' da seqüência intencionalmente inserida (SEQ ID NO: 22); número de referência 8 é uma parte da extremidade 3' da seqüência intencíonalmente inserida (SEQ ID NO: 23); número de referência 9 é a seqüência de junção sobrepondo-se às seqüências dos números de referência 8 e 10, uma seqüência de diagnóstico como indicado em SEQ ID NO: 17; número de referência 10 é um outro fragmento não-intencionalmente inserido da seqüência do genoma de algodão (SEQ ID NO: 24); número de referencia 11 é a seqüência de junção sobrepondo-se às seqüência dos números de referencia 10 e 12, uma seqüência de diagnóstico como indicado em SEQ ID NO: 18; e número de referência 12 é a seqüência do genoma de algodão de flanco 3', como indicado em SEQ ID NO: 25.
DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERIDAS
Algodão, Gossypium hirsutum, foi geneticamente modificada para resistir a pestes de Lepidópteros, que têm um impacto negativo na produção do algodão. Isto foi realizado por inserção de um primeiro estojo de DNA que codifica a proteína CrylAc inseticida de Bacillus thuringiensis e um segundo estojo de DNA que codifica a proteína Cry2Ab inseticida de Bacillus thuringiensis. Esta invenção refere-se, preferivelmente a plantas, parte de plantas, plantas da progênie que contém pelo menos as seqüências compreendendo o segundo estojo de DNA, e a métodos e composições e matéria para uso na detecção da presença de tais seqüências em uma
amostra.
Ο primeiro estojo de DNA foi inserido no genoma de Coker 312 cultivada do algodão através da transformação de Agrobacterium sp usando um fragmento de DNA derivado do plasmídeo PV-GHBK04 (pMON10518 na Patente U.S. 5.500.365) para produzir o evento MON531 do algodão, que foi cultivado com muitas variedades diferentes de algodão e introduzido com sucesso no mercado de algodão por todo o mundo. O evento MON531 do algodão foi retransformado usando tecnologia de aceleração de partícula com um fragmento de DNA linear purificado com gel, ou seja, o segundo estojo aqui indicado acima, do plasmídeo PV-GHBK11 (alternativamente, denominado pB1579), que continha regiões de codificação cry2Ab e βglucuronidase (uidA). (John, M.E. 1997. Cotton Crop Improvement Through Genetic Engineering. Criticai Reviews in Biotechnology, 17(3):185-208). O gene uidA foi usado como um marcador selecionável para ajudar na identificação de células que continham a região de codificação cry2Ab. A região de codificação cry2Ab derivada do plasmídeo PV-GHBK11 compreende o promotor do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV)35S com uma região intensificada duplicada (Patentes U.S. 5.530.196, 5.424.200 e 5.359.142) operavelmente ligada a uma seqüência líder não-traduzida da proteína da petúnia vivaz (PetHSP70-líder) operavelmente conectada ou aderida ao N-terminal de peptídeo transiente de cloroplasto do gene EPSPS de Arabidopsis thaliana (AEPSPS/CTP2) (Van den Broeck, et al., 1985. Targeting of a foreing protein to chloroplasts by fusion to the transit peptide from the small subunit of ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase. Nature 313, 358-63), operavelmente conectada ou aderida a uma seqüência sintética codificando a proteína Cry2Ab (Widner, W.R. and Whiteley, H.R. 1990. Location ofthe Dipteran Specificity Pegion in a Lepidopteran-Dipteran Crystal Protein from Bacillus thuringiensis J. Bacteriol. 172, 2826-32) que é operavelmente conectada ou ligada à região 3' não-traduzida do gene nopalina sintase (NOS) de Agrobacterium tumifaciens que termina a transcrição e direciona a poliadenilação (Fraley, R.T. et al., 1983. Expression of bacterial genes in plant cells. Proc. Natl Acad Sei U.S.A, 80 (15), 4803-07). A região de codificação β-glucu-
ronidase também é controlada por um promotor de CaMV35S intensificado e uma seqüência de poliadenilação NOS 3'. A inserção do estojo, ou substancialmente, de todo o estojo, contendo as seqüência de codificação cry2Ab e uidA ao evento MON531 do algodão deu origem a um evento indicado como MON15985 que compreende ambas as seqüência de codificação cry1A, bem como o estojo codificando a seqüência de codificação cry2Ab. A análise genética do evento MON 15985 demonstrou que, os dois estojos inseridos estão em cromossomas diferentes e assim, podem ser segregados no cultivo, os segregantes dando origem ao genótipo do evento MON531 original, bem como um segundo genótipo indicado como MON15985X compreendendo apenas um único estojo inserido compreendendo o gene responsável pela codificação da proteína Cry2Ab. É o evento de transformação que dá origem ao genótipo MON 15985 do algodão, bem como o genótipo MON15985X que se destinam ao assunto desta invenção.
As seguintes definições e métodos são providenciados para definir melhor a presente invenção e para guiar os versados na técnica na prática da presente invenção. A menos que de outro modo indicado, os termos devem ser entendidos de acordo com o uso convencional pelos versados na técnica relevante. Definições de termos comuns na biologia molecular também podem ser encontradas em Rieger et al., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5th edition, Springer-Verlag: New York, 1991, e Lewin, Genes V, Oxford University Press: New York, 1994. É usada uma nomenclatura para bases de DNA como indicado em 37 CFR § 1.822.
Compreendendo
Como aqui empregado, o termo compreendendo significa incluindo, sem estar limitado a.
Evento
Como aqui empregado, um evento transgênico refere-se a uma planta recombinante produzida por transformação de células de planta com DNA heterólogo, ou seja, um construto de ácido nucléico que inclui um transgene de interesse, regeneração de uma população de plantas resultante da inserção do transgene ao genoma da planta, e seleção de uma planta particular caracterizada pela inserção em um sítio do genoma particular. O termo evento refere-se ao transformante original e a progênie do transformante que inclui o DNA heterólogo. O termo evento refere-se também à progênie produzida por um cruzamento externo sexual entre o transformante e uma outra variedade, que inclui o DNA heterólogo. Mesmo após repetidos retrocruzamentos a uma origem recorrente, o DNA inserido e DNA de flanco da origem transformada está presente na progênie do cruzamento no mesmo sítio cromossomal. O termo evento também se refere a DNA do transformante original compreendendo o DNA inserido e a seqüência de flanco imediatamente adjacente ao DNA inserido que se esperaria ser transferido para uma progênie que recebe o DNA inserido, incluindo o transgene de interesse como resultado de um cruzamento sexual de uma linhagem de origem que inclui o DNA inserido, (por exemplo, o transformante original e progênie resultante deles) e uma linhagem de origem que não contém o DNA inserido.
Sondas e Iniciadores
Uma sonda é um ácido nucléico isolado ao qual é ligado um rótulo detectável convencional ou molécula repórter, por exemplo, um isótopo radioativo, ligante, agente quimioluminescente ou enzima. Uma tal sonda é complementar a um filamento de um ácido nucléico alvo, no caso da presente invenção, a um filamento do DNA genômico do evento MON15985 do algodão (seja de uma planta de algodão ou de uma amostra que inclui o DNA do evento). Sondas de acordo com a presente invenção incluem, não apenas, ácidos desoxirribonucléicos ou ribonucléicos, mas também poliamidas e outros materiais de sonda que se ligam especificamente a uma seqüência alvo de DNA e podem ser usados para detectar quanto à presença daquela seqüência de DNA alvo.
Iniciadores são ácidos nucléicos isolados anelados a um filamento de DNA alvo complementar por hibridização do ácido nucléico para formar um híbrido entre o iniciador e o filamento de DNA alvo, a seguir prolongados ao longo do filamento de DNA alvo por uma polimerase, por exemplo, um DNA polimerase. Pares de iniciadores ou configurações podem ser usados para amplificação de uma seqüência de ácido nucléico, por exemplo, por reação em cadeia por polimerase (PCR®) também conhecidos como métodos de amplificação térmicos, ou outros métodos de amplificação de ácido nucléico convencionais.
Sondas e iniciadores podem ser tão pequenos quanto dez nucleotídeos, mas em geral 15 nucleotídeos ou mais em comprimento, de preferência 20 nucleotídeos ou mais, mais preferivelmente 25 nucleotídeos e mais preferivelmente ainda 30 nucleotídeos ou mais. Tais sondas e iniciadores hibridizam especificamente para uma seqüência alvo sob condições de hibridização muito rigorosas. De preferência, sondas e iniciadores de acordo com a presente invenção têm complementaridade de seqüência completa com a seqüência alvo, embora as sondas que diferem da seqüência alvo e que retém a capacidade em hibridizar para seqüências alvo possam ser indicadas por métodos convencionais. Qualquer referência para uma seqüência específica para uma sonda ou iniciador ou outra seqüência de DNA inclui sua seqüência complementar.
Métodos para preparar e utilizar sondas e iniciadores estão descritos, por exemplo, em Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2th ed. vol. 1-3. ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (a seguir Sambrook ef al. 1989), Current Protocols in Molecular Biology ed. Ausubel et al., Greene Publishing and WileyInterscience, New York, 1992 (com atualizações periódicas) (a seguir Ausubel et al, 1992) e Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990. Pares de iniciadores PCR® podem ser derivados de uma seqüência conhecida, por exemplo, mediante uso de programas de computador destinados para aquele fim como Iniciador (Versão 0.5, © 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA).
Iniciadores e sondas com base no DNA de flanco e seqüência para inserção aqui descritos podem ser usados para confirmar (e, caso necessário, corrigir) as seqüência descritas por métodos convencionais, por exemplo, por nova clonagem e seqüenciamento de tais seqüências.
Hibridização de Ácido Nucléico; Condições Rigorosas; Especificações
As sondas e iniciadores de ácido nucléico da presente invenção hibridizam sob condições rigorosas para uma seqüência alvo de DNA. Qualquer método de hibridização ou amplificação de ácido nucléico convencional pode ser usado para identificar a presença do DNA de um evento transgênico em uma amostra.
O termo condições rigorosas é funcionalmente definido com respeito à hibridização de uma sonda de ácido nucléico para um ácido nucléico alvo (ou seja, para uma seqüência de ácido nucléico particular de interesse) por procedimento de hibridização específico discutido em Sambrook et al. 1989 at 9.52-9.55. Ver também, Sambrook et al., 1989 at 9.47-9.52, 9.56-9.58, Kanehisa, Nucl. Acids Res. 12:203-213, 1984 and Wetmur and Davidson, J. Mol. Biol. 31:349-370, 1968.
A respeito da amplificação de uma seqüência de ácido nucléico alvo (por exemplo, por PCR®) usando um par de iniciadores de amplificação particular, condições rigorosas são condições que permitem ao par de iniciadores hibridizar apenas para a seqüência de ácido nucléico alvo, à qual um iniciador com a correspondente seqüência do tipo selvagem (ou seu complemento) iria ligar-se, e, preferivelmente produzir um único produto de amplificação.
O termo específico para (uma seqüência alvo) indica que uma sonda ou iniciador hibridiza sob condições de hibridização rigorosas apenas para a seqüência alvo em uma amostra compreendendo a seqüência alvo. Amplificação do ácido nucléico
Como aqui empregado, DNA amplificado ou amplicon referese ao produto de amplificação do ácido nucléico de uma seqüência de ácido nucléico alvo que é parte de uma matriz de ácido nucléico. Por exemplo, para determinar se a planta de algodão resultante de um cruzamento sexual contém um DNA genômico de evento transgênico de uma planta de algodão pode ser submetida à amplificação de ácido nucléico usando um par de iniciadores que inclui um iniciador derivado da seqüência de flanco no genoma da planta adjacente ao sítio de inserção do DNA heterólogo inserido e um
segundo iniciador derivado do DNA heterólogo inserido, para produzir um amplicon que é diagnóstico quanto à presença do evento (por exemplo, o amplicon é de um comprimento e possui uma seqüência que é diagnóstico para o evento). Alternativamente, um par de iniciadores pode ser derivado da seqüência de flanco em ambos os lados do DNA inserido de modo a produzir um amplicon que inclui todo o inserto.
A amplificação do ácido nucléico pode ser realizada por quaisquer de vários métodos de amplificação de ácido nucléico conhecidos na técnica, incluindo a reação em cadeia por polimerase (PCR®). Uma série de métodos de amplificação são conhecidos na técnica e estão descritos, inter alia, na Patente U.S. nQs 4.683.195 e 4.683.202 e em PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, ed Innis et al., Academic Press, San Diego, 1990. Qualquer método conhecido para amplificação de ácido nucléico pode ser usado na prática da presente invenção.
A seqüência do inserto do DNA heterólogo ou seqüência de flanco do evento MON15985 do algodão pode ser verificada (e corrigida, caso necessário) por amplificação de tais seqüências do evento usando iniciadores derivados das seqüências aqui providenciadas seguido por seqüenciamento de DNA padrão.
Kit de Detecção
Como aqui empregado, kit de detecção refere-se a um kit usado para detectar a presença ou ausência do DNA de um evento MON 15985 em uma amostra compreendendo sondas e iniciadores de ácido nucléico da presente invenção, que hibridizam sob condições rigorosas, a uma seqüência de DNA alvo, e outros materiais necessários para permitir métodos de hibridização ou amplificação de ácido nucléico. Alternativamente, um kit de detecção pode compreender materiais necessários para permitir o versado na técnica realizar métodos similares aos descritos no Pedido PCT Internacional WO 97/22719, incorporado por referência a fim de detectar quanto à presença ou ausência de DNA de um evento MON 15985 em uma amostra.
Exemplo 1
Algodão, Gossypium hirsutum foi geneticamente modificado para resistir a pestes de Lepidópteros, que têm um impacto negativo sobre a produção de algodão. Isto foi realizado como aqui indicado por inserção de um estojo de DNA que codifica a proteína CrylAc inseticida do Bacillus thuríngiensis ao genoma de Coker 312 cultivado do algodão através da transformação de Agrobacterium sp usando um fragmento de DNA derivado do plasmídeo PV-GHBK04 (pMON10518 na Patente U.S. n- 5.500.365). Esta transformação resultou em três inserções separadas ao genoma do algodão. O primeiro, inserto funcional responsável pela expressão da proteína CrylAc no evento 531 do algodão compreende o promotor 35S intensificado descrito acima, região de codificação crylAc e seqüência de terminação ligada a uma seqüência que codifica um marcador selecionável antibiótico. Um segundo inserto adjacente e imediatamente a montante da primeira seqüência inserida compreende uma região de codificação crylAc parcial e seqüência de terminação. O terceiro inserto compreende apenas uma seqüência de terminação parcial e demonstrou segregar, independentemente, das primeiras duas seqüências indicadas acima. A primeira e segunda seqüência inseridas são estreitamente ligadas e, portanto, não segregam uma da outra. A seqüência do genoma do algodão flanqueia as extremidades 5'e 3' de todos os três insertos. Portanto, seis únicas junções genoma/inserto de algodão foram criadas como resultado do processo de transformação. Quaisquer das seis junções puderam ser analisadas na determinação se o evento MON531 está presente em uma amostra de semente de algodão.
Análises moleculares foram realizadas no evento MON531 do algodão, para definir a extremidade de uma das inserções de DNA transgênico e identificar o DNA genômico do algodão que flanqueia os insertos do DNA transgênico. Testes em andamento do genoma combinados com seqüenciamento de nucleotídeo rendeu as seqüência de DNA de duas das junções genoma/inserto de algodão referidas para o inserto primário, SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 e seus complementos. O diagnóstico de seqüência de flanco e seqüência de inserto para MON531, foram então identificados • ·
como segue: SEQ ID NO: 3 a seqüência da extremidade 5' do inserto primário, SEQ ID NO: 4 a seqüência do genoma do algodão que flanqueia aquela extremidade 5'; SEQ ID NO: 5, a seqüência do inserto na extremidade 3'; e SEQ ID NO: 6 a seqüência do genoma que flanqueia aquela extremidade 3'. Como acima discutido, os iniciadores podem ser derivados dessas seqüências para uso nos métodos de amplificação de DNA. Exemplos são SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8. SEQ ID NO: 9 é a seqüência de um corte de DNA que sobrepõem-se ao DNA do genoma do algodão e uma extremidade do DNA inserido; SEQ ID NO: 10 é a seqüência de um corte de DNA que sobrepõem-se ao DNA do genoma do algodão e a extremidade oposta do DNA inserido.
A seguir providencia-se um exemplo não-limitante de como se pode usar essas novas seqüências de ácido nucléico para detectar o evento MON5631 do algodão em uma amostra, incluindo a linhagem de semente denominada MON15985, e para verificar quanto a sua ausência na linhagem de semente denominada MON15985X.
Isolamento de DNA para Análises PCR®
DNA do evento MON531 do algodão foi extraído de tecido de semente. O DNA foi extraído de, tanto semente como tecidos folhares da substância de controle (semente de algodão não-transgênica e tecido folhar). DNA de semente foi isolado por processamento da semente até um pó fino usando um misturador comercialmente disponível. Aproximadamente 2 g da semente processada foram transferidos para um tubo cônico de 50 ml, e ~16 ml de tampão de extração CTAB [1,5% (peso:peso) CTAB, 75 mM de Tris-HCI pH 8,0, 100 mM de EDTA pH 8,0, NaCI 1,05 M, e 0,75% (peso/peso) polivinilpirrolidona (peso molecular = 40.000)] foi adicionado à semente processada. As amostras foram incubadas a 65°C por aproximadamente 30 minutos com misturação intermitente e à seguir deixadas resfriar a temperatura ambiente. Um volume igual (~16 ml) de clorofórmio:álcool isoamílico à temperatura ambiente (24:1 v/v)) ou clorofórmio foi adicionado às amostras. A suspensão foi misturada por inversão, e as duas fases separadas por centrifugação a -16.000 x g durante 5 minutos. A camada aquosa » · · · · «
(topo) foi removida usando uma pipeta de transferência e colocada em um tubo cônico limpo de 50 ml. Aproximadamente 1/10 volume (—1,6 ml) de tampão CTAB a 10% [10% (peso:peso) CTAB e NaCl 0,7 M] foi adicionado para a fase aquosa, que foi a seguir misturada por inversão. As amostras foram centrifugadas a -16.000 x g por 5 minutos para separar as fases. A fase aquosa (superior) foi removida, misturada com um volume igual (-15 ml) de tampão de precipitação CTAB [1% (peso:peso) CTAB, 50 mM de Tris pH 8,0 e EDTA 10 mM pH 80] e deixada repousar à temperatura ambiente por aproximadamente 1 hora. As amostras foram centrifugadas a -10.000 x g para peletizar o DNA, sendo o sobrenadante decantado, e o pélete dissolvido em aproximadamente 2 ml de alto teor de sal TE [10 mM de Tris-HCI, pH 8,0, 10 mM de EDTA, pH 8,0, e NaCl 1M] incubado-se a 37°C com turbiIhonamento suave por aproximadamente 2 horas. A centrifugação foi realizada a -23.000 x g para peletizar quaisquer impurezas restantes. O sobrenadante foi removido, colocado em um tubo de 15 ml limpo e aproximadamente 1/10 volume (-150 μΙ) de NaOAc 3M, pH 5,2 e 2 volumes (-4 ml relativo ao sobrenadante) de etanol a 100% resfriado foram adicionados para precipitar o DNA. O DNA precipitado foi enrolado em um tubo de microcentrífuga contendo aproximadamente 1 ml de etanol a 70%. O DNA foi peletizado em uma microcentrífuga à velocidade máxima (14.000 rpm) por 5 minutos, seco e redissolvido em TE, pH 8,0 em um refrigerador a 4°C durante a noite.
O DNA genômico do algodão não-transgênico, usado como controle, foi isolado de tecido folhar que foi congelado em nitrogênio líquido e triturado em um pó fino usando um almofariz e pilão. Aproximadamente 1 g do tecido folhar moído foi transferido para um tubo centrífugo de 13 ml e adicionou-se 6 ml do tampão de extração [2,5 ml de tampão de extração de DNA (sorbitol 350 mM, Tris 100 mM pH 7,5, EDTA 5 mM, 0,38% (peso/volume) bissulfito de sódio), 2,5 ml de tampão de lise de núcleo (200 mM de Tris, pH 7,5, EDTA 50 mM, NaCl 2M, 2% (peso/volume) CTAB) e 1 ml de Sarkosyl (solução a 5% peso/volume)]. As amostras foram incubadas a 65°C por aproximadamente 30 minutos com misturação intermitente. Qua19
tro e meio mililitros de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1 (v/v)) à temperatura ambiente foi adicionado às amostras. A suspensão foi misturada por 2 a 3 minutos e as duas fases separadas por centrifugação por 15 minutos a -2.000 x g a 4°C. A camada aquosa (topo) foi removida usando uma pipeta transferidora e colocada em um tubo centrífugo de 13 ml. Cinco mililitros de isopropanol a 100% foram adicionados e os tubos foram misturados por inversão para precipitar o DNA. O DNA precipitado foi enrolado em um tubo microcentrífugo contendo 500 μΙ de etanol a 70%. O DNA foi peletizado em uma microcentrífuga à velocidade máxima (14.000 rpm) por 2 minutos. O DNA foi seco e dissolvido em tampão de TE em um refrigerador a 4°C durante a noite.
Verificação por PCR® das Únicas Junções do Genoma do Inserto de Algodão no Evento MON531 de Algodão
As seqüências de DNA de quatro junções genoma/inserto do algodão foram identificadas usando o Universal Genome Walker Kit® com base em PCR® segundo o protocolo do fabricante seguido por seqüenciamento de nucleotídeo dos produtos PCR®. A seguir, testes PCR® foram revelados usando um iniciador complementar ao DNA genômico do algodão e um outro iniciador complementar ao DNA transgênico inserido. Por exemplo, um iniciador indicado para a extremidade 3' do inserto primário, funcional complementar à seqüência de flanco genômica (por exemplo, SEQ ID NO: 6) emparelhou com um segundo iniciador na extremidade 3' do inserto primário, funcional complementar à seqüência transgênica inserida (por exemplo, SEQ ID NO: 5). Os testes PCR® foram realizados usando 10 - 100 ng da matriz de DNA genômico do evento MON531 do algodão em um volume de reação de 50 μΙ contendo uma concentração final de 1,1 mM Mg2+, 0,4 μΜ de cada iniciador, 200 μΜ cada dNTP, e 2,5 unidades de Taq DNA polimerase. As reações para os testes PCR® foram realizadas sob as seguintes condições cíclicas: 1 ciclo a 94°C por 3 minutos; 38 ciclos de 94°C por 30 segundos, 60°C por 30 segundos, 72°C por 90 segundos; 1 ciclo a 72°C por 10 minutos. Os produtos PCR® foram separados usando eletroforese em gel de agarose visualizados com manchamento de brometo de etídio, exci20
sados do gel e submetidos a seqüenciamento de DNA usando química de terminação com corante para confimar as seqüências.
No exemplo acima, como esperado, as reações de controle sem DNA matriz e DNA de controle negativo não-transgênico Coker 312 não geraram um produto PCR®. As amostras de evento MON531 do algodão geraram o tamanho esperado dos produtos PCR® de 264 pares de base para a seqüência de flanqueio 3'. Portanto, as novas seqüências de ácido nucléico na junção do DNA inserido e DNA genômico do algodão no evento MON531 do algodão são de utilidade para detecção de DNA derivado do evento MON531 do algodão em uma amostra.
MON531 na variedade substrato Coker 312 foi cruzado na variedade DP50 (Delta & Pine Land Company) para produzir uma variedade contendo o evento MON531 codificando a proteína CrylAc que foi indicada como DP50B.
Exemplo 2
Este exemplo descreve a produção de uma planta de algodão transformada indicada como Mon15985 derivada de DP50B que contém um evento de inserção adicional codificando uma proteína inibidora de inseto Cry2Ab, e o isolamento e caracterização da seqüência de DNA 5' e 3' que flanqueiam as extremidades 5' e 3' de MON15985.
Células de planta DP50B alvo foram transformadas usando tecnologia de aceleração de partícula com um segmento de DNA linear derivado do plasmídeo PV-GHBK11. O segmento de DNA linear foi preparado por digestão do plasmídeo PV-GHBK11 com a enzima de restrição Kpnl, separação dos fragmentos de plasmídeo por eletroforese de gel de agarose e isolamento do segmento de DNA contendo o estojo compreendendo a seqüência de codificação cry2Ab e a seqüência de codificação uidA (GUS). Nenhuma estrutura principal de plasmídeo estava contida dentro do segmento ou seqüência isolada e purificada e preparada para bombardeamento do tecido de algodão. O estojo de expressão consiste em uma região de codificação cry2Ab regulada por um promotor expressável de planta CaMV 35S intensificado e uma terminação de transcrição NOS31 de Agrobacterium
tumefaciens e seqüência de poliadenilação. A seqüência de codificação cry2Ab é indicada para visar o produto de expressão como uma proteína precursora para importar cloroplasto em células de planta (conforme descrito em WO 0026371 e Pedido de Patente US nQ de série 09/186.002, depositado em 4 de novembro de 1998, cujo conteúdo está aqui incorporado a título de referência).
A variedade de algodão DP50B foi transformada com o estojo de DNA descrito acima por bombardeamento com partículas de ouro revestidas com DNA usando método de descarga eletrostática (John, M.E., Cotton Crop Improvement Through Genetic Engineering. Criticai Reviews in Biotechnology, 17:185-208 (1997)). Eventos diferentes foram selecionados quanto à eficácia contra pestes de inseto, fenótipo e segregação genética para expressão da proteína Cry2Ab. Com base nesses critérios, 6 linhagens foram escolhidas para caracterização adicional do evento de inserção. Southern blot foi usado como o primeiro método para avaliação da presença de um ou mais números de cópia de inserção e integralidade do evento de inserção. Uma linhagem, 15985, foi escolhida para uma cuidadosa caracterização molecular do evento de inserção que foi inserido no genoma de DP50B. O DNA envolvendo o evento de inserção foi isolado e caracterizado.
Isolamento do DNA flanqueando o evento de inserção: O DNA foi extraído de folhas jovens de algodão por um método Phyto-Pure® modificado da Amersham que se destina a extrair DNA de plantas com grandes quantidades de carboidratos contaminantes. De modo a determinar a seqüência do DNA em torno da seqüência de codificação cry2Ab inserida, foi usado o protocolo Genome Walker® de Clone Tech, Inc. As condições recomendadas pelo fabricante foram seguidas com apenas uma modificação, ao invés de usar extração com fenol para purificação do DNA após clivagem da endonuclease de restrição, o DNA foi purificado com uma coluna giratória Qiagen QIAquick® de acordo com o manual de instrução do fabricante.
As enzimas usadas para cortar o DNA genômico antes da ligação ao ligante foram Dral, Pvull, Seal e Stu\. Seguinte ao procedimento fornecido por Qiagen, o DNA foi extraído em 5 volumes de tampão PB, ligado à
coluna, lavado com 0,75 ml de PE e a seguir eluído da coluna em 20 ml de Tris 10 mM a pH 8,5. Este DNA foi a seguir usado como a fonte para bibliotecas do ligador. Posições de iniciador foram deliberadamente escolhidas distantes das extremidades de onde o DNA foi linearizado para permitir uma determinada quantidade de deleção em quaisquer extremidades. Os primeiros iniciadores (SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 31) foram indicados para anelamento das seqüências que são únicas a uma seqüência de codificação cry2Ab devido à presença de elementos de DNA repetidos no genoma do algodão. Os produtos PCR® foram submetidos a uma segunda reação de PCR® usando iniciadores aninhados diretamente adjacentes aos usados na primeira reação (SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 33). Os parâmetros de PCR® usados foram os recomendados por Clone Tech. Os parâmetros de amplificação primários foram como a seguir: 7 ciclos 94 °C 2 segundos, 72°C 3 minutos, 32 ciclos 94°C 2 segundos, 68°C 3 min, e parâmetros de amplificação secundários foram como segue: 5 ciclos 94°C 2 segundos, 72°C 3 minutos, 20 ciclos 94°C 2 segundos, 68°C 3 min e 68°C 4 minutos no último ciclo. Todas as reações PCR® foram realizadas em uma máquina Perkin-Elmer 9700.
Os produtos PCR® resultantes da segunda amplificação foram clonados no vetor pBS(SK+) de Stratagene que tinham sido cortados com Sma\ para gerar uma extremidade cega e tratados com fosfatase alcalina para evitar auto-ligação. Os fragmentos de DNA que forma gerados na reação PCR® secundária foram tratados com DNA quinase T4 para adicionar um 5'fosfato e a seguir ligados no vetor de extremidade cega sob condições de ligação padrão.
Protocolo Genome Walkei®'. As reações PCR® secundárias usando os pares de iniciadores aninhados produziram fragmentos múltiplos sintetizados de ambas as extremidades 5'e 3'. Três fragmentos independentes para a extremidade 5'foram clonados e seqüenciados usando métodos do conhecimento da técnica, enquanto dois fragmentos foram clonados e seqüenciados da extremidade 3‘. Para cada fragmento individual pelo menos dois clones independentes foram obtidos.
/0
A seqüência dos clones de cada configuração de iniciador foram comparadas entre si. As seqüências entre os respectivos clones foram determinadas como os mesmos, e continham a mesma junção trans-genética da planta.
Exemplo 3
Este exemplo ilustra como as seqüência de DNA que flanqueiam o evento de inserção MON 15985 podem ser usadas para determinar zigosidade.
Projeto e desenvolvimento de um teste baseado em PCR® para homozigosidade do evento de inserção MON15985-. A seqüência de DNA das duas regiões que flanqueiam o evento de inserção MON 15985 foi usada para construir um teste de homozigosidade com base em PCR®. Um tal teste seria considerado útil caso fosse capaz de detectar ambos o evento de inserção MON 15985 específico e o cromossoma do tipo selvagem. Para testar a exeqüibilidade do desenvolvimento de um ensaio que também detecta o cromossoma do tipo selvagem, determinaram-se iniciadores da seqüência diretamente adjacente ao evento de inserção para testar se eles podiam ser usados para sintetizar um fragmento de DNA no algodão não-transgênico, bem como na linhagem 15895. Os iniciadores escolhidos foram capazes de sintetizar todo o evento de inserção MON 15985, mas nenhum produto foi observado nos controles não-transgênicos. Esses resultados indicaram que o evento de inserção não era uma simples quebra no DNA e inserção da seqüência de DNA e estojo codificando a proteína Cry2Ab. Este resultado contudo, estabeleceu que as duas extremidades estão de fato ligadas e flanqueiam um estojo de gene intacto contendo cry2Ab.
Foram classificados iniciadores para a seqüência de ácido nucléico flanqueando a extremidade 3' do inserto para ampliar fragmentos via protocolo Genome Walker ® em bibliotecas de ligante produzidas de DNA de algodão não-transgênico. Um fragmento de 620 pares de base foi clonado e seqüenciado do algodão não-transgênico. Esta seqüência foi a seguir usada para classificar iniciadores para o cromossoma do tipo selvagem que iria estar presente no indivíduo heterozigoto. Vários conjuntos de iniciadores
foram produzidos e testados juntos, de modo a descobrir um conjunto que operasse em uma única reação e não providenciasse faixas de substrato. Um conjunto de iniciadores compreendendo SEQ ID NO: 34 (seqüência de flanco da planta de algodão 3') e SEQ ID NO: 35 (seqüência de flanco da planta do algodão 5') foi visto produzir um amplicon de 800 pares de base do tipo selvagem, ou DNA de algodão não-transgênico. Contudo, caso pelo menos um inserto estiver presente, o iniciador compreendendo SEQ ID NO: 36 irá anelar as seqüência específicas cry2Ab e gerar um amplicon de 1,5 kb com um iniciador anelando a seqüência de flanco de planta de algodão 3’ (SEQ ID NO: 34). Portanto, o teste resultante usando iniciador PCR® compreendendo SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 34, e SEQ ID NO: 35 é como segue: caso um indivíduo for homozigoto para o evento de inserção MON 15985 então apenas uma faixa de 1,5 kb estaria presente, mas caso ele seja heterozigoto, então uma faixa adicional de 0,8 kb estaria também presente.
Ambas essas faixas (1,5 kb e 0,8 kb) foram clonadas e seqüenciadas para confirmar sua identidade. A seqüência de DNA do fragmento de 800 pares de base gerada no indivíduo heterozigoto é idêntica à seqüência do fragmento Genome Walker® gerado com os iniciadores da extremidade 3’ e DNA não-transgênico.
Confirmação do ensaio de zigosidade com base em PCR®: A fim de verificar a exatidão do ensaio de zigosidade uma série de experimentos foram conduzidos utilizando homozigotos, heterozigotos e descendência transgênica negativa de MON 15985 conhecidos.
R2:
Fenótipo: Quinze plantas R2 individuais de três genótipos R1 suspeitos foram caracterizadas quanto à presença ou ausência da proteína Cry2Ab via ELISA. Plantas de interesse que foram positivas para o teste incluíram MON15985-2 e MON15985-34. MON15985-71 de planta foi identificado como negativo para proteína Cry2Ab.
R3:
Fenótipo: Quinze sementes R3 individuais de cada uma das
plantas R2 selecionadas foram plantadas em potes de 4 e a seguir selecionadas quanto a presença da proteína Cry2Ab via ELISA qualitativo. Os resultados do ELISA relataram que todas as plantas R3 de MON15985-2 foram positivas, conferindo assim, à origem R2 uma designação de homozigotos para o gene cry2Ab. A progênie R3 de MON15985-34 foi uma mistura de plantas positivas e negativas, conferindo à origem R2 uma designação de ser heterozigoto para o gene cry2Ab. Todas as plantas R3 de MON15985-71 foram negativas e confirmaram que a origem R2 foi negativa também.
Genótipo: Um ensaio de zigosidade com base em PCR® foi realizado em 5 plantas R3 de MON15985-2 e MON15985-71. Iniciadores e técnicas foram usados como antes descrito. Os resultados deste teste deu os padrões de faixa esperados. Toda a progênie de MON15985-2 produziu apenas a única faixa de 1,5 kb apoiando os dados ELISA, que indicaram a linhagem MON 15985-2 ser homozigota positiva para o gene cry2Ab. Toda a progênie de MON15985-71 produziu apenas a faixa única de 0,8 kb encontrada no tipo selvagem, apoiando assim os resultados ELISA na demonstração de que esta linhagem é homogizota negativa para o gene cry2Ab. Cinco progênies de cada quatorze famílias R2 individuais de MON 15985-34 foram selecionados, bem como dando combinações de plantas homozigotas, heterozigotas e negativas.
R4:
Cinco plantas individuais de todas as três populações R3 foram deixadas se auto-polinizar e foram desenvolvidas até a colheita. Quinze descendentes R4 de cada uma das plantas R3 testadas via PCR® foram plantadas em potes de 4 para confirmar os resultados das plantas R3. Assim, caso o resultado PCR® R3 fosse homozigoto, então toda a progênie R4 seria homozigota, bem como, caso o resultado PCR® R3 fosse heterozigoto, a progênie R4 seria uma mistura de plantas homozigotas, heterozigotas e negativas. Todas as famílias da progênie R4 providenciaram o resultado esperado com base no ensaio PCR® R3. Portanto, o ensaio com base em PCR® providencia um método durável genotípico de plantas quanto à zigosidade.
Exemplo 4
Este exemplo ilustra as seqüências de DNA flanqueando as extremidades 5'e 3' do inserto em evento MON 15985 de algodão.
DNA de MON 15985 foi extraído de tecido folhar, que foi congelado em nitrogênio líquido e triturado em um pó fino usando um almofariz e pilão. Aproximadamente 1 g do tecido folhar triturado foi transferido para um tubo centrífugo de 13 ml e 6 ml de tampão de extração [2,5 ml de tampão de extração de DNA (350 mM de sorbitol, 100 mM de Tris pH 7,5, 5 mM de EDTA, 0,38% (peso/volume bissulfito de sódio), 2,5 ml de tampão de lise de núcleo (200 mM de Tris pH 7,5, 50 mM de EDTA, 2M Nacl, 2% (peso/ volume) CTAB) e 1 ml de Sarkosil [5% solução peso/volume)] foram adicionados. As amostras foram incubadas a 65°C por aproximadamente 35 minutos. Quatro e meio mililitros de clorofórmio/álcool isoamílico (24:1 (v/v) à temperatura ambiente foram adicionados para as amostras. A suspensão foi misturada por 2 a 3 minutos e as duas fases separadas por centrifugação por 15 minutos a -2.000 x g a 4°C. A camada aquosa (topo) foi removida e colocada em um tubo centrífugo de 13 ml. Cinco mililitros de isopropanol a 100% foram adicionados, e os tubos foram misturados por inversão para precipitar o DNA. O DNA precipitado foi enrolado em um tubo de microcentrífuga contendo 500 μΙ de etanol a 70%. O DNA foi peletizado em uma microcentrífuga a velocidade máxima (14.000 rpm) por 2 minutos. O DNA foi seco e dissolvido em tampão TE em um refrigerador durante a noite a 4°C.
DNA do controle DP50 foi extraído do tecido de semente. DNA da semente foi isolado por processamento da semente até um pó fino usando um misturador comercialmente disponível. Aproximadamente 2 g da semente processada foram transferidas para um tubo cônico de 50 ml, e -16 ml de tampão de extração CTAB [1,5% (peso/volume) CTAB, 75 mM Tris pH 8,0, 100 mM de EDTA pH 8,0, 1,05 M de NaCI, e 0,75% (peso/volume) de NP (peso molecular 40.000)] foram adicionados à semente processada. As amostras foram incubadas a 65°C por aproximadamente 30 minutos com misturação intermitente sendo a seguir deixadas resfriar para temperatura ambiente. Um volume igual (-15 ml) de clorofórmio:álcool isoamílico à tem-
peratura ambiente [24:1 (v/v)] foi adicionado às amostras. A suspensão foi misturada por 5 minutos e as duas fases separadas por centrifugação a -16.000 x g por 5 minutos à temperatura ambiente. A camada aquosa (de topo) foi removida e colocada em um tubo cônico de 50 ml. Aproximadamente 1/10 volume (-1,5 ml) de tampão CTAB a 10% [10% (peso/volume) CTAB e NaCI 0,7M] e um volume igual de clorofórmio: álcool isoamílico [24:1 (v/v)] foi adicionado para a fase aquosa, que foi então misturada por inversão durante 5 minutos. As amostras foram centrifugadas a -16.000 x g por 5 minutos à temperatura ambiente para separar as fases. A fase aquosa (superior) foi removida, misturada com volume igual (-15 ml) de tampão de precipitação CTAB [CTAB 1% (peso/volume) 50 mM de Tris pH 8,0 e 10 mM de EDTA pH 8,0] e deixada repousar à temperatura ambiente por aproximadamente 1 hora. As amostras foram centrifugadas a -10.000 x g para peletizar o DNA, sendo o sobrenadante decantado e o pélete dissolvida em aproximadamente 2 ml de TE com alto teor de sal [10 mM de Tris-HCI pH 8,0, 10 mM de EDTA pH 8,0 e NaCI 1M] incubando-se a 37°C com turbilhonamento suave por aproximadamente 2 horas ou por repouso em um refrigerador a 4°C durante a noite. A centrifugação foi realizada a -23.000 x g para peletizar quaisquer impurezas restantes. O sobrenadante foi removido, colocado em um tubo limpo de 15 ml, e aproximadamente 1/10 volume (-150 μΙ) de NaOAc 3M, pH 5,2 e 2 volumes (-4 ml relativo ao sobrenadante) de etanol a 100% foram adicionados para precipitar o DNA. O DNA precipitado foi enrolado em um tubo de microcentrífuga contendo aproximadamente 1 ml de etanol a 70%. O DNA foi peletizado em uma microcentrífuga à velocidade máxima (14.000 rpm) por 5 minutos, seco e redissolvido em TE, pH 8,0 em um refrigerador a 4°C durante a noite.
O DNA de cada DP50 e MON 15985 foi quantificado antes da iniciação do teste dentro do teste do qual foram derivados. A quantificação de DNA foi realizada usando um Fluorímetro DyNA Quant 200 usando marcador de tamanho molecular Boehringer Mannheim IX como um padrão de calibração de DNA.
A análise PCR da seqüência genômica flanqueando a extremi-
dade 5' do inserto codificando a proteína Cry2Ab no evento MON 15985 do algodão foi realizada usando um iniciador derivado da seqüência de flanco 5' genômica emparelhado com um segundo iniciador localizado no DNA inserido próximo da extremidade 5' na seqüência do promotor de CaMV 35S intensificada que mede uma região de 1894 pares de base (SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 27). A análise PCR para a seqüência genômica flanqueando a extremidade 3' do inserto codificando a proteína Cry2Ab no evento MON 15985 do algodão foi realizada usando um iniciador localizado na seqüência de poliadenilação NOS 3'próxima da extremidade 3' do inserto emparelhado com um segundo iniciador derivado da seqüência de flanco 3'genômica que mede uma região de 763 pares de base (SEQ ID NO: 28 e SEQ ID NO: 29).
As análises PCR foram realizadas usando DNA genômico do evento MON 15985 do algodão ou linhagem DP50 de algodão não-transgênica. A análise PCR foi realizada usando 35-50 ng do evento MON15985 do algodão ou matriz de DNA genômico DP50 de linhagem não-transgênica em um volume de reação de 50 μΙ contendo uma concentração final de
1,5 mM Mg2+, 0,2 μΜ de cada iniciador, 200 μΜ de cada dNTP, e 2,5 unidades de DNA polimerase Platinum Taq (Gibco BRL). As reações para a extremidade 5' do inserto foram realizadas sob as seguintes condições cíclicas: 1 ciclo a 94°C por 3 minutos; 35 ciclos a 94°C por 1 minuto, 56°C por 1 minuto, 72°C por 2 minutos; 1 ciclo a 72°C por 10 minutos. As reações para a extremidade 3' do inserto foram executadas sobre as seguintes condições cíclicas: 1 ciclo a 94°C por 3 minutos; 35 ciclos a 94°C por 3 minutos; 53°C por 1 minuto, 72°C por 45 segundos; 1 ciclo a 72°C por 10 minutos; Os produtos PCR foram separados em um gel de agarose a 1,0%. A eletroforese foi realizada por aproximadamente 1,5-2 horas a 100V e visualizada por manchamento com brometo de etídio.
Produtos PCR de tamanhos esperados contendo as seqüências flanqueando as extremidades 5' e 3' do inserto codificando a proteína Cry2Ab no evento MON 15985 do algodão gerada com os dois pares de iniciadores, foram isolados por eletroforese de gel de 20 μΙ de produtos PCR em géis de agarose a 1,0%. Os produtos PCR representando as seqüências 5' ou 3' de flanco foram excisados de um gel e purificados usando o Kit QlAquick Gel Extraction (Qiagen) seguindo o procedimento indicado pelo fornecedor. Para ambas as análises os produtos PCR purificados foram a seguir seqüenciados com os iniciadores PCR usando química terminal com corante. Devido ao comprimento dos produtos PCR, o seqüenciamento foi realizado com ambos os iniciadores usados para gerar os produtos bem como iniciadores destinados internamente para a seqüência ampliada.
Análises PCR foram realizadas no DNA genômico extraído com evento MON15985 do algodão e linhagem DP50 do algodão não-transgênica para verificar as seqüências de flanco das extremidades 5'e 3' do inserto no evento MON15985 do algodão. A reação de controle não continha DNA matriz, bem como a reação que não continha DNA do algodão não-transgênico DP50 não gerou um produto PCR conforme esperado. Análises PCR do DNA de evento MON15985 do algodão geraram o produto de tamanho esperado de 1894 pares de base representando a seqüência de flanco 5' e uma parte de extremidade 5' do inserto codificando a proteína Cry2Ab.
A reação de controle não contendo DNA matriz, bem como a reação DNA de algodão não-transgênico DP50 não gerou um produto PCR conforme se esperava. A análise PCR do DNA de evento MON15985 do algodão gerou o produto de tamanho esperado de 763 pares de base representando a seqüência de flanco 3' e uma parte da extremidade 3' do inserto. Esses resultados demonstram que um produto PCR de tamanho previsível é gerado de ambas as extremidades do inserto codificando cry2Ab no evento MON15985 do algodão.
A seqüência de consenso representando a seqüência de DNA genômico flanqueando a extremidade 5' do inserto, bem como o DNA na extremidade 5' do inserto, é representada por SEQ ID NO: 11. Os dados da seqüência de consenso 5' contém 1877 pares de base de DNA flanqueando o inserto, seguido por 390 pares de base da seqüência de inserto contendo o promotor de CaMV 35S intensificado. Os pares de base 362-750 mostram homologia para DNA de cloroplasto. A seqüência de consenso representan-
do a seqüência genômica do algodão flanqueando a extremidade 3' do inserto, bem como o DNA na extremidade 3' do inserto, é representada em SEQ ID NO: 12. Os dados da seqüência de consenso 3' contêm 349 pares de base da seqüência do inserto contendo a extremidade 3' da seqüência de poliadenilação 3' NOS e a seqüência de poliligante seguidos por 1012 pares de base do DNA genômico do algodão que flanqueia o inserto. As seqüências de consenso 5' e 3' aqui apresentadas são a combinação de reações de seqüenciamento múltiplo e são mais curtas do que aquelas dos produtos PCR usados para gerar as seqüências. Esses dados traçam, em linhagens gerais, as extremidades 5' e 3' do inserto no evento MON15985 do algodão e mostram o DNA que flanqueia imediatamente o inserto em ambas as extremidades.
Este dado demonstra que o evento MON 15985 do algodão contém um único inserto de DNA contendo (1) uma seqüência codificando UidA (GUS) regulada pelo promotor CaMV 35S intensificado (faltando aproximadamente 260 pares de base na extremidade 5') e seqüência de poliadenilação NOS 3‘, e (2) uma seqüência de codificação codificando Cry2Ab regulada pelo promotor do CaMV 35S intensificado e a seqüência de poliadenilação NOS 3'(Figura 1). Análises PCR e seqüências realizadas neste exemplo confirmam a seqüência das extremidades 5' e 3' do inserto codificando Cry2Ab no evento MON 15985 do algodão e confirmam a seqüência de DNA genômico flanqueando as extremidades 5' e 3' do inserto.
Exemplo 5
Este exemplo ilustra as características físicas das seqüências flanqueando o evento MON 15985 do algodão, e caracteriza a natureza e localização física de seqüências de DNA adicionais, flanqueando a extremidade 5' e 3' do DNA inserido no evento MON15985 do algodão. DNA genômico foi analisado por Southern blot a fim de determinar o número de eventos de inserção, o número de cópia do DNA inserido, a integridade dos promotores inseridos, regiões de codificação e seqüências de poliadenilação e quanto à presença ou ausência da seqüência de estrutura principal do plasmídeo. Todas as análises foram realizadas com ambas as linhagens do al31
godão DP50B (controle) e com o evento MON 15985 recentemente produzido para caracterizar o DNA recentemente inserido. Além disso, a seqüência de flanco das junções 5' e 3' inserto-à-planta (previamente determinadas por Procedimento de Genoma) foi confirmada por PCR.
Plasmídeo PV-GHBK11, o plasmídeo de origem, serviu como a substância de referência primária nessas análises. O plasmídeo, misturado com DNA da substância de controle DP50, foi usado como um indicador de tamanho e um controle de hibridização positivo na análise por Southern blot. Adicionalmente, marcadores de tamanho molecular da Boehringer Mannheim [Marcadores de peso molecular II (23.1 Kb-0,6Kb) e IX (1,4 Kb-0,072 Kb), catálogo n2 236.250 e n2 1449.460, respectivamente] e Gibco BRL [Marcador de DNA de Alto peso molecular (48,5 Kb-8,3Kb) e escalonador de 100 pares de base (2,1 Kb-0,1 Kb), catálogo n2 15618-010 e n2 15628-019, respectívamente], foram usados para estimativas do tamanho.
DNA genômico do evento MON15985 do algodão protegido de inseto, foi digerido com uma variedade de enzimas de restrição e submetido à analise de hibridização de Southern blot a fim de caracterizar o DNA codificando cry2Ab e GUS integrado ao genoma de DP50B.
DNA extraído de tecido folhar foi usado para todas as análises neste exemplo, exceto para a amostra não-transgênica da mancha intacto do estojo do gene uidA analisado geneticamente com a sonda genética de seqüência de poliadenilação NOS 3' que foi isolado de acordo com o método de Rogers e Bendich (1985). Tecido folhar foi congelado em nitrogênio líquido e triturado até um pó fino usando um almofariz e pilão. Aproximadamente 1 g do tecido folhar moído foi transferido para um tubo centrífugo de 13 ml contendo 6 ml do tampão de extração [2,5 ml de tampão de extração de DNA (350 mM de Sorbitol, 100 mM de Tris pH 7,5, 5 mM de EDTA), 2,5 ml de tampão de lise de núcleo (200 mM de Tris pH 7,5, 50 mM de EDTA, NaCI 2M, CTAB a 2%) e 1 ml de Sarkosyl (5% em solução)]. As amostras foram incubadas a 65°C por aproximadamente 30 minutos com misturação intermitente. Quatro e meio mililitros de uma mistura de clorofórmio/álcool isoamílico (24:1) à temperatura ambiente foram adicionados para as amostras. A suspensão foi misturada por 2 a 3 minutos e as duas fases separadas por centrifugação por 15 minutos a -1.000 x g a 4°C. A camada de topo aquosa foi removida usando uma pipeta de transferência e colocada em um tubo centrífugo de 13 ml. Cinco mililitros de isopropanol a 100% foram adicionados e os tubos foram misturados por inversão para precipitar o DNA. O DNA precipitado foi peletizado por centrifugação a -1.000 x g por 5 minutos a 4°C. O pélete foi lavado com aproximadamente 1 mi de etanol a 70% e centrifugada por mais 5 minutos a -1.000 x g a 4°C. O DNA foi deixado secar à temperatura ambiente e redissolvido em TE a 4°C durante a noite.
O DNA genômico purificado foi quantificado usando um Fluorímetro Hoefer DyNA Quant® (San Francisco, CA) com Marcador de Peso Molecular da Boehringer Mannheim IX usado como um padrão de calibração.
Aproximadamente 10 gg do DNA genômico das linhagens de teste e de controle foi usado para os digestos da enzima de restrição. Os digestos durante a noite foram realizados a 37°C de acordo com o protocolo do fabricante em um volume total de 500 μΙ usando 100 unidades da enzima de restrição. Alguns digestos de controle foram fixados com 5 ou 10 pg de PV-GHBK11. Todas as enzimas de restrição foram adquiridas de Boehringer Mannheim. Após digestão, as amostras foram precipitadas adicionando-se 1/10 volume (-50 μΙ) de NaOAc 3M e 2 volumes (-1 ml em relação ao volume do digesto original) de etanol a 100%, seguido por incubação a -20°C por pelo menos uma hora. O DNA digerido foi peletizado por centrifugação, lavado com etanol a 70%, seco a vácuo por 10-20 minutos, e redissolvido à temperatura ambiente em água ou TE.
Os DNA's digeridos foram separados em géis de agarose a 0,8% em tampão TBE 1X. Uma 'extensão longa' e uma 'extensão curta' foram realizadas para cada análise de Southern blot. A extensão longa facilitou a maior resolução dos DNA's de maior peso molecular enquanto o comprimento curto assegurou que todos os DNA's de menores pesos moleculares ficassem retidos no gel. A extensão longa/extensão curta envolveu um eletroforese de 4-6 horas a 80-85 V e uma operação durante a noite (9-15 horas) a
35-38 V. Após a eletroforese, os géis foram manchados em brometo de etídio a 0,5 μg/ml, por 20-30 minutos e fotografados.
DNA de plasmídeo PV-GHBK11 foi isolado de culturas de E. coli durante a noite. Matrizes de sonda genética homologas à região de codificação cry2Ab, região de codificação uidA, promotor CaMV.35S intensificado, a seqüência de poliadenilação NOS 3' e toda a região de estrutura principal foram preparadas por PCR usando PV-GHBK11 como a matriz.
Aproximadamente 25 ng de cada matriz de sonda exceto a seqüência de poliadenilação NOS 3', foram rotuladas com P32-dCTP usando o método de detecção de iniciador aleatório (RadPrime DNA Labeling System, Life Technologies). A seqüência de poliadenilação NOS 3'foi rotulada usando PCR com matriz NOS 3' (15 ng), iniciadores específicos para NOS 3'(0,25 μΜ cada), MgCI2 1,5 mM, dATP 3 μΜ, dGTP e dTTP, 100 μθί de p32-dCTP e
2,5 unidades de DNA polimerase Taq em um volume final de 20 μΙ. As condições cíclicas foram como segue: 1 ciclo a 94°C por 3 minutos; 5 ciclos a 94°C por 45 segundos, 55°C por 3 segundos e 72°C por 1 minuto, 1 ciclo a 72°C por 10 minutos. A sonda radiorrotulada foi purificada usando uma coluna Sephadex G-50 (Boehringer Mannnheim).
Análises de Southern blot (Southern, 1975) foram realizadas por procedimentos padrão, geralmente Maniatis Fritsch Sambrook (Cold Spring Harbor). Seguinte à eletroforese, o gel foi incubado em solução de depurinação (HCI 0,125 N) por -10 minutos, seguido por solução de desnaturação (NaOH 0,5 M, NaCl 1,5 M) por -30 minutos, e a seguir solução neutralizante (Tris-HCI 0,5 M pH 7, NaCl 1,5 M) por 30 minutos. O DNA dos géis de agarose foram transferidos para membranas de náilon Hybond-N® (Amersham) usando um Turboblotter® (Schleicher & Schuell). O DNA foi deixado transferir por 4 horas durante a noite (em SSC 20X) e reticulado covalentemente à membrana com um Stratalinker® UV 1800 (Stratagene) ajustado para autoreticular. As manchas foram pré-hibridizadas uma média de 2 horas em uma solução aquosa de fosfato de sódio 0,5 M, 7% de SDS (peso/volume) e 0,1 mg/ml de tRNA de E. coli. A hibridização com a sonda radiorrotulada foi realizada em solução de pré-hibridização fresca por 14-21 horas a aproxima-
damente 65°C. As membranas foram lavadas pelo menos quatro vezes em uma solução aquosa de SDS (peso/volume a 0,1%) e SSC 0,1X a intervalos de 15 minutos a 65°C. Exposições múltiplas das manchas foram geradas usando filme Kodak Biomax MS® em conjunto com uma tela intensificadora Kodak Biomax MS®. As manchas foram retiradas por incubação da mancha com SDS fervente a 0,1% (peso/volume) e deixando resfriar para temperatura ambiente.
O número do inserto (o número de sítios de integração do DNA transgênico recentemente introduzido no genoma do algodão) foi avaliado. Os DNA's de teste e de controle foram digeridos com a enzima de restrição Seal, que não cliva dentro do segmento de DNA usado para transformação. Esta enzima liberou um segmento contendo o DNA inserido e DNA genômico de planta adjacente. As amostras de 'extensão curta' DP50 plasmídeofixadas também foram digeridas com Xba\ para linearizar o plasmídeo. A mancha foi testada geneticamente com o plasmídeo de referência PVGHBK11.
O número de cópias do estojo de transformação inserido em cada local foi determinado por digestão do DNA genômico de teste com a enzima de restrição Sph\ uma enzima que corta apenas uma vez no segmento de DNA linear usado para gerar o evento. A mancha foi testada geneticamente com o plasmídeo de referência PV-GHBK11.
A integridade da região de codificação cry2Ab foi determinada por digestão com uma enzima de restrição Nco\ que cliva nas extremidades 5'e 3' da região de codificação cry2Ab. A mancha foi testada geneticamente com a região de codificação cry2Ab de comprimento total.
A integridade de cry2Ab codificando estojo (promotor de CaMV 35S intensificado, região de codificação cry2Ab e seqüência de poliadenilação NOS 3') foi avaliada por digestão com a enzima de restrição fíamHI que cliva nas extremidades 5'e 3' do estojo cry2Ab. A mancha foi seqüencialmente testada com cada elemento do estojo.
A integridade da região de codificação uidA foi determinada por digestão com as enzimas de restrição EcoRI e BglU que clivam nas extremi35 ·· ···· ·
Μ\
dades 5' e 3‘ da região de codificação uidA respectivamente.
A mancha foi sondada com a região de codificação uidA de comprimento total.
A integridade do estojo uidA (promotor de caMV 35S intensificado, região de codificação uidA e seqüência de poliadenilação NOS 3') foi avaliada por digestão com as enzimas de restrição BamHI e Sph\ que clivam nas extremidades 5' e 3' do estojo UidA. A mancha foi seqüencialmente sondada com cada elemento do estojo.
A estrutura principal do plasmídeo é definida como o fragmento de restrição Kpn\ de PV-GHBK11 que não foi usada para transformar a planta. Ela consiste em uma origem bacteriana de replicação, ori-pUC, e o gene nptll sob o controle de um promotor bacteriano. Para confirmar a ausência da estrutura principal, DNA genômico foi digerido com a enzima de restrição Kpn\ e sondado com a região de estrutura principal de comprimento total.
A seqüência das junções de DNA genômico inserto-à-planta 5' e 3‘ foi determinada como descrito acima usando o Kit Genome Walker® Universal da Clontech. Foram designados iniciadores para verificar essas junções por PCR. A junção 5' foi verificada usando um iniciador destinado para a seqüência de flanco genômica 5'emparelhada com um segundo iniciador no promotor de CaMV 35S intensificado do gene uidA. A junção 3' foi verificada usando um iniciador destinado para a seqüência de flanco genômica 3' com um segundo iniciador localizado no gene cry2Ab. As PCRs foram realizadas usando 100 ng do DNA genômico de folha (1-2 μΙ) como uma matriz, 10 pmoles de cada iniciador (1 μΙ de cada) e PCR Supermix (Gibco BRL cat. n9 10572-014) em um volume de reação de 25 μΙ. A amplificação das reações foi realizada sob as seguintes condições cíclicas: 1 ciclo 94°C por 3 minutos; 30 ciclos 94°C por 30 segundos, 55°C por 1 minuto, 72°C por 2 minutos; 1 ciclo 72°C por 4 minutos. Os produtos PCR foram separados em um gel de agarose a 1% em TAE 1X e visualizados quanto ao manchamento com brometo de etídio.
As amostras de DNA de teste e de controle foram digeridas com
Seal. DNA de controle DP50 fixado com PV-GHBK11 também foi digerido com Seal. Visto que Seal não cliva dentro do plasmídeo, uma segunda enzima Xba\ foi adicionada para linearizar o plasmídeo. O plasmídeo foi linearizado para facilitar sua migração através do gel para servir como uma estimativa de tamanho precisa. A mancha foi sondada com PV-GHBK11 radiorrotulado (Figura 1), o plasmídeo de origem para o segmento de DNA linear usado na transformação. A extensão longa DP50 não produziu qualquer faixa de substrato detectável. Plasmídeo PV-GHBK11 misturado com extensão curta de DP50 produziu a faixa de tamanho esperada a aproximadamente
8,7 Kb, o tamanho do plasmídeo total, sem faixas adicionais. Os comprimentos longo e curtode DP50B produziram duas faixas a aproximadamente 22 Kb e 15 Kb (muito indistintas). Visto essas faixas estarem presentes em ambos os eventos MON15985 e o controle (MON531) DP50B elas são consideradas faixas de substrato associadas com o evento MON531. O MON15985 longo e curto produziram cada um, uma faixa não presente na faixa estreita DP50 ou DP50B, a aproximadamente 9,3 Kb. Este resultado sugere que o evento do algodão MON12985 contém um segmento de DNA integrado localizado em um fragmento de restrição Seal de 9,3 Kb.
DNA genômico isolado de MON 15985, DP50B, DP50 (controle não-transgênico) e DP50 misturado com DNA PV-GHBK11 de plasmídeo foi digerido com Sph\. A mancha foi sondada com PV-GHBK11, o plasmídeo de origem para o segmento de DNA linear usado na transformação. A extensão longa DP50 não produziu quaisquer faixas de substrato detectáveis. PVGHBK11 de plasmídeo misturado com DP50 na extensão curta produziu as faixas de tamanho esperadas a 3,9 e 4,8 Kb, uma faixa indistinta adicional a
8,7 Kb na faixa 5, é presumivelmente devido ao DNA de plasmídeo nãodigerido. As extensões longa e curta de DP50B produziram três faixas a aproximadamente 6,4, 8,3 e 8,6 KB. Visto que essas faixas estão presentes em ambos os eventos MON 15985 e DP50B de controle, elas são consideradas faixas de substrato associadas com o evento MON531. As extensões longa e curta de MON15985 produziram cada uma, duas faixas nãopresentes entre as faixas DP50 ou DP50B a aproximadamente 2,3 Kb e 3,5
Kb. Devido à enzima Sph\ cortar apenas uma vez dentro do estojo de transformação, este resultado sugere que MON15985 contém uma cópia do DNA integrado que produz esses dois fragmentos de restrição.
DNA do teste, controles e controle misto com DNA PV-GHBK11 de plasmídeo, foi digerido com Λ/col para liberar a região de codificação cry2Ab e avaliar sua qualidade intacta. A mancha foi sondada com a região de codificação cry2Ab. Como se esperava, a extensão longa de controle não-transgênico DP50 e as extensões longa e curta do controle DP50B não demonstraram quaisquer faixas de hibridização detectáveis. PV-GHBK11 de plasmídeo misturado com DP50 na extensão curta produziu a faixa de -1,9 Kb esperada que corresponde a toda a região de codificação cry2Ab. Ambos os comprimentos longo e curto de MON 15985 também produziram uma faixa de 1,9 Kb que correspondem ao tamanho esperado de uma região de codificação cry2Ab. Este resultado estabelece que o evento MON15985 contém a região de codificação cry2Ab intacta, sem quaisquer fragmentos adicionais detectáveis.
O DNA do teste, controles, e controle misto com DNA PVGHBK11 de plasmídeo foi digerido com BamHI que libera todo o estojo codificando Cry2Ab (ou seja, região de codificação cry2Ab, o promotor de CaMV35S intensificado e a seqüência de poliadenilação NOS 3').
A mancha foi sondada com a região de codificação cry2Ab de comprimento total. A extensão longa de controle não-transgênico DP50 e os comprimentos curto e longo de controle DP50B não demonstraram quaisquer faixas de hibridização detectáveis. O plasmídeo PV-GHBK11 misturado com DP50 na extensão curta produziu uma faixa de 3,2 Kb esperada que corresponde ao estojo integral codificando Cry2Ab. Ambas extensões longa e curta de MON15985 produziram uma faixa a aproximadamente 4,0 Kb. Este resultado indica que a extremidade 3' do estojo de transformação perdeu o sítio de restrição BamHI durante a integração ao genoma do algodão. A seqüência 3' da junção inserto-à-planta, previamente determinada por procedimento de genoma foi verificada por análise PCR. Sessenta e seis pares de base da extremidade 3' do estojo de transformação demonstraram ser
deletados, incluindo o sítio BamHl. Os nucleotídeos deletados não incluem qualquer seqüência de poliadenilação NOS 3' associada com o estojo codificando Cry2Ab, somente o DNA ligante. Esses resultados provam que o estojo codificando Cry2Ab é intacto. Nenhum estojo parcial derivado daquele codificando Cry2Ab foi detectado.
A mancha usada acima foi retirada e novamente sondada com o promotor de CaMV 35S intensificado de comprimento total. A extensão longa DP50 não produziu quaisquer faixas de substrato detectáveis. Plasmídeo PV-GHBK11 misturado com DP50 na exensão curta, produziu as faixas de tamanho esperado a 5,5 e 3,2 Kb sem nenhuma faixas adicionais detectáveis. Os comprimentos longo e curto de DP50B produziram cinco faixas a aproximadamente 4,4, 5,3, 7,5, 9,4 e 22 Kb. Visto que essas faixas estão presentes em ambos os eventos MON15985 e controle DP50B, são consideradas faixas de substrato associadas com o evento MON531. As extensões longa e curta de MON 15985 produziram ambas uma faixa a aproximadamente 4,0 Kb que não está presente nas faixas estreitas de DP50 ou DP50B. Isto corresponde ao fragmento prognosticado para o estojo codificando Cry2Ab dado o resultado obtido com a sonda da região de codificação cry2Ab. Uma segunda faixa nas faixas MON 15985 resultante da hibridização ao promotor de CaMV35S intensificado, associada com o estojo codificando UidA (GUS) é prognosticada, mas não evidente nas faixas de teste. Os resultados da sonda da seqüência de poliadenilação NOS 3', discutida acima demonstra que a seqüência do promotor de CaMV 35S intensificado com o estojo de codificação UidA está presente, mas a faixa de 4,4 Kb migra cooperativamente com uma faixa de substrato de 4,4 Kb e não é evidente. Nenhum promotor externo foi detectado.
A mancha usada acima foi novamente retirada e novamente sondada com a seqüência de poliadenilação NOS 3' de comprimento total. A extensão longa de DP50 não produziu quaisquer faixas de substrato detectáveis. O plasmídeo PV-GHBK11 misturado com a extensão curta DP50 produziu as faixas de tamanho esperado a 5,5 e 3,2 Kb sem faixas adicionais detectáveis. As extensões longa e curta de DP50B produziram uma fai39
xa a aproximadamente 1,2 Kb. Visto que esta faixa está presente em ambos os eventos MON 15985 e o controle DP50B ela é considerada substrato associado com o evento MON531. As extensões longa e curta de MON15985 produziram cada qual duas faixas que não estão presentes nas faixas estreitas de DP50 ou DP50b a aproximadamente 4,0 e 4,4 Kb. A faixa de 4,0 Kb corresponde ao fragmento prognosticado para o estojo codificando Cry2Ab dado o resultado exposto acima. A faixa de 4,4 Kb não foi evidente na mancha sondada com o promotor de CaMV35S intensificado, devido à co-migração com a faixa de substrato de 4,4 Kb vista naquela mancha. Este segmento está associado com o estojo uidA.
Este resultados confirmam que o estojo de codificação Cry2Ab está intacto e que há uma deleção de 66 pares de base entre o sítio fíamHI e a extremidade 3' do casse de transformação, que não inclui qualquer seqüência de poliadenilação NOS 3' na extremidade 3' do estojo codificando Cry2Ab.
Nenhum estojo parcial derivado daquele codificando Cry2Ab foi detectado.
DNA genômico isolado de MON 15985, DP50B, DP50 (controle não-transgênico) e DP50 misturado com DNA de plasmídeo PV-GHBK11 foi digerido com EcoRI e Sg/ll afim de liberar toda a região de codificação uidA. A mancha foi sondada com a região de codificação uidA de comprimento total. A extensão longa de controle não-transgênica DP50 e as extensões longa e curta de controle DP50B não demonstraram faixas de hibridização detectáveis. O plasmídeo PV-GHBK11 misturado com a extensão curta DP50 produziu a esperada faixa de —1,9 Kb que corresponde à região de codificação uidA inteira. Ambos os comprimentos longo e curto do DNA de evento MON15985 também produziram uma faixa de 1,9 Kb que corresponde ao tamanho esperado de uma região de codificação intacta uidA. Este resultado confirma que o evento MON15985 contém a região de codificação uidA intacta, sem nehum fragmento adicional detectado.
DNA de substâncias teste e de controle foi digerido com SamHI e Sphl para liberar todo o estojo uidA (ou seja, região de codificação uidA, o
promotor de CaMV 35S intensificado, e seqüência de poliadenilação NOS 3'). O plasmídeo PV-GHBK11 foi digerido com Pstt e fixado às amostras de extensão curta DP50 após digestão (exceto para a mancha da sonda da seqüência de poliadenilação NOS 3' no qual o plasmídeo foi digerido com fíamHI e Sphl). Isto foi realizado para mostrar o tamanho de um estojo uidA de comprimento total intacto.
A mancha foi sondada com a região de codificação uidA de comprimento total. Como se esperava, a extensão longa de controle nãotransgênica DP50 e as extensões longas θ curtas de controle DP50B não demonstraram faixas de hibridização detectáveis. Plasmídeo PV-GHBK11 misturado com a extensão curta DP50 produziu a faixa esperada de 2,8 Kb que corresponde a todo o estojo uidA. Ambos os comprimentos longo e curto de MON15985 produziram uma faixa de aproximadamente 2,5 Kb. Este resultado indica que uma parte do estojo uidA não estava presente. A junção inserto-à-planta 5' previamente determinada por procedimento de genoma, foi verificada por análise PCR. Demonstrou-se previamente que 284 pares de base da porção 5‘ do estojo de transformação foram deletados. Esses resultados confirmam que o estojo uidA está faltando aproximadamente 260 pares de base da seqüência do promotor 5' e 24 pares de base do DNA de poliligante derivado do sítio de clonagem múltipla do plasmídeo. Odell et al., (1985) demonstrou que uma tal deleção não deveria afetar a iniciação de transcrição precisa. Nenhum estojo uidA parcial adicional foi detectado com a sonda da região de codificação uidA.
A mancha usada acima foi retirada e novamente sondada com o promotor de CaMV 35S intensificado de comprimento total. A extensão longa de DP50 não produziu quaisquer faixas de substrato. O plasmídeo PVGHBK11 misturado com extensão curta DP50 produziu as faixas de tamanho esperado a 1,5 e 2,8 Kb sem faixas adicionais presentes. As extensões longa e curta de DP50B produziram cinco faixas a aproximadamente 4,3, 4,6, 5,0, 6,6, e 8,5 Kb. Visto estarem essas faixas presentes em ambos os eventos MON15985 e o controle DP50B elas são consideradas faixas de substrato associadas com o evento MON531. As extensões longa e curta de
ΜΟΝ15985 produziram, cada qual duas faixas a aproximadamente 2,5 e 1,0 Kb não presente em DP50 ou nas faixas DP50B. A faixa de 2,5 Kb corresponde ao fragmento prognosticado para o estojo uidA. A faixa de 1,0 Kb resulta do promotor de CaMV 35S intensificado associado com o estojo codificando Cry2Ab. Não foi detectado nenhum promotor extrínseco.
A mancha foi sondada com a seqüência de poliadenilação NOS 3' de comprimento total. A extensão longa de DP50 não produziu quaisquer faixas de substrato detectáveis. Plasmídeo PV-GHBK11 misturado com a extensão curta DP50 produziu as faixas de tamanho esperado a 3,8 e 2,2 Kb sem faixas adicionais detectadas. A extensão longa e curta de DP50B produziu uma faixa a aproximadamente 1,2 Kb. Visto que esta faixa está presente em ambos os eventos 15985 e o DP50B de controle ela é considerada substrato associado com o evento MON531. As extensões longa e curta de MON15985 produziram cada qual, duas faixas não presentes nas faixas estreitas de DP50 ou DP50B a aproximadamente 2,5 e 2,3 Kb.
A faixa de 2,5 Kb corresponde a fragmento previsto para o estojo de uidA.
A faixa de 2,3 Kb resulta da seqüência de poliadenilação NOS 3'associada com o estojo codificando Cry2Ab.
Esses resultados confirmam que ao estojo uidA está faltando aproximadamente 260 pares de base na extremidade 5' do promotor de CaMV35S intensificado, mas está, de outro modo, intacto.
DNA genômico isolado do evento MON15985, DP50B, DP50 (controle não-transgênico) e DP50 misturado com o DNA de plasmídeo PVGHBK11 foi digerido com Kpn\. A mancha foi sondada com toda a seqüência de estrutura principal. O comprimento longo de DP50 não demonstrou faixas de hibridização detectáveis. Plasmídeo PV-GHBK11 misturado com DNA de DP50 produziu uma faixa do tamanho esperado de 2,6 Kg por toda a estrutura principal. A extensão longa e curta de DP50B produziu uma única faixa de aproximadamente 22 Kb. Visto que esta faixa está presente em ambos os eventos MON 15985 e o controle DP50B ela é considerada substrato associada com o evento MON531. As extensões longa e curta de MON15985 con42 tinham a faixa de substrato de 22 Kb sem hibridização adicional. Este resultado confirma que o evento MON15985 não contém qualquer seqüência de estrutura principal de plasmídeo detectável.
Realizou-se um ensaio PCR no DNA genômico para confirmar as seqüências da junção inserto-à-planta nas extremidades 5'e 3' do inserto MON15985 Como se esperava, as amostras não-transgênicas não produziram um produto PCR quando quaisquer iniciadores 5' ou 3' foram usados. A amostra DP50B usada como o controle não rendeu produtos com quaisquer par de iniciadores, como esperado. Um evento diferente preparado usando o mesmo construto e selecionado para expressão de Cry2Ab, MON15813, também não rendeu os produtos, quando se usou quaisquer dos iniciadores. O DNA genômico de MON 15985 rendeu os produtos de tamanho correto quando do uso de pares de iniciadores à extremidade 5' e pares de iniciadores à extremidade 3. Esta análise PCR confirmou as seqüências limítrofes 5' e 3'de MON 15985.
O evento do algodão protegido contra inseto MON15985 foi produzido por tecnologia de aceleração de partícula usando um segmento de DNA Kpnl contendo um estojo codificando Cry2Ab e UidA. O evento MON 15985 contém um único inserto de DNA localizado em um fragmento Seal de 9,3 Kb. Este inserto contém uma cópia completa do estojo inserido ao qual faltam aproximadamente 260 pares de base na extremidade 5' do promotor de CaMV 35S intensificado, acionando a expressão da seqüência de codificação UidA. Usou-se PCR para verificar as seqüências da junção 5' e 3' do inserto com o genoma da planta, bem como a integridade das extremidades 5' e 3' do inserto. O evento MON 15985 não contém qualquer seqüência de estrutura principal de plasmídeo detectável resultante do evento de transformação. Com base nas enzimas usadas neste teste, o padrão de restrição do inserto crylAc não é alterado pela inserção do DNA inserido compreendendo a seqüência de codificação cry2Ab.
Portanto, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18 e as seqüências compreendendo essas seqüências são diagnosticada para a inserção que deu origem ao evento
ΜΟΝ15985 do algodão. Com referência à Figura 1, essas seqüências são numerais de referência 2, 4, 6, 9 e 11 .respectivamente.
Todas as publicações e pedidos de patente mencionados neste relatório descritivo são indicativos do nível dos versados na técnica, à qual esta invenção é pertinente. Todas as publicações e pedidos de patente estão ora incorporados por referência na mesma extensão como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse de modo específico e individual indicado a estar incorporado por referência.
Embora a invenção precedente tenha sido descrita em algum detalhe à guisa de ilustração e exemplo para fins de elucidação, será óbvio que algumas alterações e modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações apensas.
Claims (10)
- REIVINDICAÇÕES1. Processo de produção de uma planta de algodão resistente a inseto, caracterizado pelo fato de que compreende o cultivo de uma planta de algodão resistente a inseto cuja semente foi depositada no American Type Culture Collection (ATCC) sob número de acesso PTA-2516 ou em que DNA com pelo menos uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo de SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18, faz parte do genoma da planta, e seleção de progênie por análise de pelo menos uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo de SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO:18.
- 2. Sequência de DNA, caracterizada pelo fato de que compreende SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 18.
- 3. Sequência de DNA de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que forma parte do genoma da planta.
- 4. Par de sequências de DNA, caracterizado pelo fato de que compreende, cada qual, pelo menos dez nucleotídeos e que, quando usadas juntas em um procedimento de amplificação de DNA produzirão um diagnóstico de amplicon para MON15985, em que cada sequência é escolhida de SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12 e, em que o evento MON15985 compreende uma molécula de DNA recombinante formada pela sequência codificante do gene cry2Ab e a sequência de codificação uidA integradas no DNA cromossômico, sendo que a sequência da região flanqueadora 5' e o transgene contíguo a mesma compreende a SEQ ID NO: 11 e em que a sequência da região flanqueadora 3' e o transgene contíguo a mesma compreende a SEQ ID NO: 12 e em que sementes compreendendo o referido evento foram depositadas no ATCC sob número de acesso PTA-2516.
- 5. Método de detectar quanto à presença da inserção MON15985 em tecido de algodão, caracterizado pelo fato de que compreende:a) selecionar um par de iniciadores, cada qual, compreendendo pelo menos dez nucleotídeos de SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12, onde cada membro do par está em lados opostos de um diagnóstico de sequência para a referida inserção MON15985,b) contatar uma amostra do tecido de algodão com o referido par de iniciadores,c) realizar a amplificação do DNA e análise para um amplicon, em que o evento MON15985 compreende uma molécula deDNA recombinante formada pela sequência codificante do gene cry2Ab e a sequência de codificação uidA integradas no DNA cromossômico, sendo que a sequência da região flanqueadora 5' e o transgene contíguo a mesma compreende a SEQ ID NO: 11 e em que a sequência da região flanqueadora 3' e o transgene contíguo a mesma compreende a SEQ ID NO: 12 e em que sementes compreendendo o referido evento foram depositadas no ATCC sob número de acesso PTA-2516.
- 6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o par de iniciadores é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, e SEQ ID NO: 36.
- 7. Método de detectar quanto à presença da inserção MON15985 em tecido de algodão, caracterizado pelo fato de que compreende:a) contatar uma amostra do tecido de algodão com uma sonda de polinucleotídeos que compreende sequências de DNA selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18, ou um complemento deste,b) submeter a amostra e a sonda a condições de hibridização rigorosas ec) analisar para hibridização da sonda, em que o evento MON15985 compreende uma molécula de DNA recombinante formada pela sequência codificante do gene cry2Ab e a sequência de codificação uidA integradas no DNA cromossômico, sendo que a sequência da região flanqueadora 5' e o transgene contíguo a mesma compreende a SEQ ID NO: 11 e em que a sequência da região flanqueadora 3' e o transgene contíguo a mesma compreende a SEQ ID NO: 12 e em que sementes compreendendo o referido evento foram depositadas no ATCC sob número de acesso PTA-2516.
- 8. Kit de detecção de DNA, caracterizado pelo fato de que compreende uma sonda de polinucleotídeos que compreende sequência(s) de DNA selecionada(s) do grupo que consiste em SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, e SEQ ID NO: 18 ou um complemento deste.
- 9. Kit de detecção de DNA, caracterizado pelo fato de que compreende um par de iniciadores, cada qual, compreendendo pelo menos dez nucleotídeos da SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12, onde cada um está em lados opostos de um diagnóstico de sequência para a inserção MON15985, em que o evento MON15985 compreende uma molécula de DNA recombinante formada pela sequência codificante do gene cry2Ab e a sequência de codificação uidA integradas no DNA cromossômico, sendo que a sequência da região flanqueadora 5' e o transgene contíguo a mesma compreende a SEQ ID NO: 11 e em que a sequência da região flanqueadora 3' e o transgene contíguo a mesma compreende a SEQ ID NO: 12 e em que sementes compreendendo o referido evento foram depositadas no ATCC sob número de acesso PTA-2516.
- 10. Kit de detecção de DNA de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o par de iniciadores é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 e SEQ ID NO: 36.1/1
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| B22O | Other matters related to patents and certificates of addition of invention: legal action concerning patent |
Free format text: INPI NO 52402.008035/2019-86 ORIGEM: 2A VARA FEDERAL CIVEL DA SJMT (TRF1) PROCESSO NO: 1004774-91.2019.4.01.3600 NULIDADE DA PATENTE DE INVENCAO COM PEDIDO DE ANTECIPACAO DE TUTELA AUTOR: ASSOCIACAO MATOGROSSENSE DOS PRODUTORES DE ALGODAO REU(S): MONSANTO DO BRASIL LTDA, MONSANTO TECHNOLOGY LLC., INSTITUTO NACIONAL DA PROPRIEDADEINDUSTRIAL - INPI |