BRPI0210598B1

BRPI0210598B1 - Processos para a produção de um complexo solúvel que compreende uma proteína amiloidogênica alvo e uma chaperona peptidil-prolil-isomerase, para a produção de um complexo de glicoproteína retroviral de superfície-chaperona solúvel, e para detectar pelo menos um anticorpo para uma glicoproteína retroviral de superfície em umaamostra, bem como complexo solúvel, e composição

Info

Publication number: BRPI0210598B1
Application number: BRPI0210598A
Authority: BR
Inventors: Engel Alfred; Scholz Christian; Sizmann Dorothea; Faatz Elke; Andres Herbert
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 2001-06-22
Filing date: 2002-06-24
Publication date: 2018-11-13
Also published as: JP2007125026A; US7244819B2; JP4174422B2; AU2002317841A1; KR100702373B1; JP2004535195A; US8426167B2; ATE522603T1; JP2009100770A; DK2267452T3; EP1402015B1; US20030096352A1; ES2333108T3; CA2450476C; ES2372031T3; EP2267452A1; BRPI0210598B8; JP2007322436A; WO2003000877A2; JP4262594B2

Abstract

"complexo solúvel que compreende uma glicoproteína retroviral de superfície". a presente invenção refere-se ao diagnóstico de infecções pelo hiv. esta ensina especialmente a produção de um complexo glicoproteína retroviral solúvel de superfície - (ou glicoproteína transmembrana) - chaperona e o uso vantajoso de um complexo chaperona-antígeno, especialmente na detecção de anticorpos para o hiv em ensaios imunológicos, preferencialmente de acordo com o conceito da ponte de antígenos duplos ou como um imunógeno. a invenção divulga ainda complexos solúveis que compreendem uma variação da gp41 do hiv-1 ou uma variação da gp36 do hiv-2, respectivamente e um chaperona selecionada da classe de chaperonas peptidil-prolil-isomerase. as variações que compreendem substituições específicas de aminoácidos no domínio da hélice n da gp41 do hiv-1 ou da gp36 do hiv-2, respectivamente, são também descritas.

Description

(54) Título: PROCESSOS PARA A PRODUÇÃO DE UM COMPLEXO SOLÚVEL QUE COMPREENDE UMA PROTEÍNA AMILOIDOGÊNICA ALVO E UMA CHAPERONA PEPTIDIL-PROLIL-ISOMERASE, PARA A PRODUÇÃO DE UM COMPLEXO DE GLICOPROTEÍNA RETROVIRAL DE SUPERFÍCIE-CHAPERONA SOLÚVEL, E PARA DETECTAR PELO MENOS UM ANTICORPO PARA UMA GLICOPROTEÍNA RETROVIRAL DE SUPERFÍCIE EM UMA AMOSTRA, BEM COMO COMPLEXO SOLÚVEL, E COMPOSIÇÃO (51) Int.CI.: C12N 9/90; A61K 39/21; A61K 38/52; A61P 31/18; G01N 33/53.

(30) Prioridade Unionista: 22/06/2001 EP 01 115225.3; 31/08/2001 EP 01 120939.2.

(73) Titular(es): F. HOFFMANN-LA ROCHE AG.

(72) Inventor(es): CHRISTIAN SCHOLZ; HERBERT ANDRES; ELKE FAATZ; ALFRED ENGEL; DOROTHEA SIZMANN.

(86) Pedido PCT: PCT EP2002006956 de 24/06/2002 (87) Publicação PCT: WO 2003/000877 de 03/01/2003 (85) Data do Início da Fase Nacional: 22/12/2003 (57) Resumo: COMPLEXO SOLÚVEL QUE COMPREENDE UMA GLICOPROTEÍNA RETROVIRAL DE SUPERFÍCIE. A presente invenção refere-se ao diagnóstico de infecções pelo HIV. Esta ensina especialmente a produção de um complexo glicoproteína retroviral solúvel de superfície - (ou glicoproteína transmembrana) - chaperona e o uso vantajoso de um complexo chaperona-antígeno, especialmente na detecção de anticorpos para o HIV em ensaios imunológicos, preferencialmente de acordo com o conceito da ponte de antígenos duplos ou como um imunógeno. A invenção divulga ainda complexos solúveis que compreendem uma variação da gp41 do HIV-1 ou uma variação da gp36 do HIV-2, respectivamente e um chaperona selecionada da classe de chaperonas peptidil-prolil-isomerase. As variações que compreendem substituições específicas de aminoácidos no domínio da hélice N da gp41 do HIV-1 ou da gp36 do HIV-2, respectivamente, são também descritas.

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PROCESSOS PARA PRODUÇÃO DE UM COMPLEXO SOLÚVEL QUE COMPREENDE UMA PROTEÍNA AMILOIDOGÊNICA ALVO E UMA CHAPERONA PEPTIDIL-PROLIL-ISOMERASE, PARA PRODUÇÃO DE UM COMPLEXO DE

GLICOPROTEÍNA RETROVIRAL DE SUPERFÍCIE-CHAPERONA SOLÚVEL, E PARA DETECTAR PELO MENOS UM ANTICORPO PARA UMA GLICOPROTEÍNA RETROVIRAL DE SUPERFÍCIE EM UMA AMOSTRA, BEM COMO COMPLEXO SOLÚVEL, E COMPOSIÇÃO.

A presente invenção refere-se ao diagnóstico de infecções pelo 10 HIV. Esta ensina especialmente a produção de um complexo glicoproteína retroviral solúvel de superfície - (ou glicoproteína transmembrana) - chaperona e o uso vantajoso de um complexo de chaperona-antígeno, especialmente na detecção de anticorpos para o HIV em ensaios imunológicos, preferencialmente de acordo com o conceito da ponte de antígenos duplos ou como um imunógeno. A invenção descreve ainda complexos solúveis que compreendem uma variação da gp41 do HIV-1 ou uma variação da gp36 do HIV-2, respectivamente, e uma chaperona selecionada da classe de chaperonas peptidil-prolil-isomerase. As variações que compreendem substituições específicas de aminoácidos no domínio da hélice N da gp41 do HIV-1 ou da gp36 do HIV-2, respectivamente, são também descritas.

Fundamento

O Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) é o agente da Síndrome de Imunodeficiência Adquirida, que é comumente referida pelo seu acrônimo AIDS. Há duas cepas principais deste vírus, denominadas HIV-1 e

HIV-2. O HIV está atualmente amplamente disseminado e constitui uma ameaça grave à saúde e à riqueza por todo o mundo, forçando os sistemas de cuidados com a saúde pública a gastar enormes quantidades de dinheiro para o diagnóstico do HIV e para o tratamento da AIDS.

Uma das vias para o espalhamento viral é a transfusão de san30 gue ou de produtos sangüíneos infectados. Virtualmente todos os países industrializados, assim como muitos países em desenvolvimento, até hoje requerem um teste básico obrigatório de todas as doações de sangue, para

Segue-se folha 1a

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1a prevenir o espalhamento adicional deste vírus. A tarefa de todos os métodos de diagnóstico no campo é diagnosticar a infecção do sangue pelo HIV da forma mais confiável e o mais rápido possível, após a infecção.

Basicamente, estão disponíveis três modos diferentes de diag-

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(1) diagnóstico do material genômico viral proveniente do sangue, através de procedimentos de diagnóstico sensíveis do ácido nucléico, como a reação em cadeia da polimerase (PCR), (2) a detecção de antígenos virais provenientes do sangue e (3) a detecção de anticorpos contra o HIV proveniente de fluidos corporais.

Durante o curso de uma infecção causada pelo HIV, são conhecidas várias fases distintas em relação ao diagnóstico e relevantes em relação ao diagnóstico. Na fase inicial da infecção apenas proteínas ou peptídeos derivados do HIV podem ser encontrados (fase virêmica), enquanto que ainda não estão presentes os anticorpos anti-HIV. Na fase subseqüente, que é denominada soroconversão, os anticorpos contra os antígenos do HIV aparecem, enquanto que a quantidade de antígenos virais (carga viral) diminui. A maior parte dos anticorpos formados na fase inicial da soroconversão pertence à classe M de imunoglobulina (IgM). Mais tarde na resposta imunológica contra o HIV, muda para a classe G de imunoglobulina (IgG), que então constitui a maioria dos anticorpos direcionados contra o HIV. Durante a continuação do curso da infecção o nível de anticorpos anti-HIV pode diminuir enquanto que a carga viral (a presença de partículas virais ou de antígenos virais) nos fluidos corporais pode aumentar novamente. A detecção da presença da infecção pelo HIV é feita preferencialmente com ensaios sorológicos que detectam anticorpos contra os antígenos do HIV, algumas vezes combinados com a detecção do antígeno do HIV. Uma vez que a resposta imunológica em um paciente muda durante o curso da infecção e também varia de paciente para paciente, é importante ter ensaios imunológicos extremamente sensíveis e confiáveis que detectam os anticorpos anti-HIV que pertencem às subclasses IgM e IgG. Foram descritas muitas abordagens diferentes para a detecção de infecções pelo HIV. Precocemente, a detecção confiável e sensível de anticorpos contra as proteínas virais é crucial e de maior importância.

As proteínas virais, que freqüentemente são denominadas antígenos virais, podem ser detectadas apenas no início da infecção e em um ·· ··· ·· ·· · ·· ···· ·· ·· • · · · · ···· ·· · ·· • ·· · · ·· ····· ···

estágio muito tardio da doença. Os ensaios para a detecção de antígenos virais, como os ensaios que medem a p24 (do HIV-1) ou a p26 (do HIV-2), das quais ambas são proteínas do cerne viral, podem ser portanto utilizados somente em combinação com outros meios de diagnóstico para detectar de forma confiável uma infecção pelo HIV.

Estão teoricamente disponíveis três grupos de antígenos virais, que podem induzir a formação de anticorpos no hospedeiro e assim ser utilizados como antígenos em procedimentos para diagnóstico. Estes são as proteínas de envelope (codificadas pela região do gene env), as enzimas virais ou as proteínas reguladoras, tal como a transcriptase reversa ou a integrase (codificada pela região do gene pol), e as proteínas do cerne estrutural (codificadas pela região do gene gag). As proteínas do envelope viral, tanto no HIV-1, quanto no HIV-2, são glicoproteínas que são sintetizadas na forma de proteínas precursoras de polipeptídeos (gp160 para o HIV e gp140 para o HIV-2). Estes precursores de alto peso molecular, após a síntese, são clivados para resultar na gp120 e gp41 (HIV-1) ou na gp110 e gp36 (HIV-2), respectivamente. Os polipeptídeos maiores (gp120 ou gp110, respectivamente) formam uma subunidade de superfície, que fica associada à membrana, que abrange os polipeptídeos menores (gp41 e gp36, respectivamente), através de contatos soltos. Em muitos hospedeiros (pacientes), as glicoproteínas de envelope são alvos preferidos da resposta imunológica antiviral. Ratner, L. e outros, Nature 313 (1985) 277-84 demonstraram que especialmente a membrana que abrange estas proteínas do envelope, isto é, gp41 ou gp36, respectivamente, carrega o potencial mais imunogênico entre estas proteínas virais.

Os métodos de ensaios imunológicos, tal como, por exemplo, o ELISA (ensaio imunoabsorvente ligado à enzima), que empregam os polipeptídeos codificados pelo HIV, têm sido extensivamente utilizados no diagnóstico e na detecção. Os polipeptídeos virais são preparados diretamente partindo do material viral ou são derivados de sistemas de expressão in vitro ou in vivo, utilizando a tecnologia do DNA recombinante. Ambas as formas de produção de antígenos sofrem limitações graves. Os polipeptí30

deos derivados de preparações virais podem ser contaminados por vírus viável ou por material genético infeccioso, colocando assim em perigo o pessoal que utiliza o material. O material derivado da recombinação pode estar contaminado por proteínas hospedeiras sem ser do HIV, que podem resultar na especificidade reduzida ou na sensibilidade reduzida de tais ensaios.

Na detecção de anticorpos contra agentes patogênicos, tais como agentes patogênicos virais, muito freqüentemente e com grande vantagem são utilizados sistemas de detecção de anticorpos de acordo com o formato de ponte de antígenos duplos, por exemplo, descrito na US 4.945.042. Os ensaios imunológicos, de acordo com este conceito de ponte, requerem o uso de um antígeno ligado diretamente ou indiretamente a uma fase sólida e do mesmo ou de um antígeno facilmente solúvel reativo de forma cruzada, que é diretamente ou indiretamente detectável. Os anticorpos sob investigação, se presentes, formam uma ponte entre o antígeno ligado à fase sólida e o antígeno de detecção rotulado. Somente se os dois antígenos estiverem formando uma ponte através de anticorpos específicos é gerado um sinal positivo.

Foram descritas várias tentativas de utilizar uma gp41 produzida de forma recombinante como um antígeno para a detecção de anticorpos anti-HIV. A gp41 produzida de forma recombinante, com algumas limitações, pode ser utilizada para detectar anticorpos anti-HIV. Tal gp41 é utilizada isoladamente ou em combinação com outros antígenos do HIV para medir anticorpos anti-HIV. Atualmente, são conhecidos ensaios que visam independentemente a detecção, tanto do antígeno do HIV, quanto/ou dos anticorpos anti-HIV. Na WO 93/21346, é descrito um combi-teste para a detecção simultânea do antígeno gp24 e de anticorpos para a gp41 do HIV-1 e para a gp36 do HIV-2. Neste ensaio, é utilizada uma fase sólida na qual a gp41 produzida de forma recombinante é revestida diretamente.

Está também bem-estabelecido que o uso de valores de pH extraordinariamente altos ou baixos é uma forma de manter a gp41 (ou a gp36) em solução. É conhecido que a gp41 produzida de forma recombinante é solúvel em pH em tomo e abaixo de 3,0 e em pH em tomo e acima de 11,0.

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Infelizmente, entretanto, tanto a gp41 do HIV-1 quanto a gp36 do HIV-2, respectivamente, são essencialmente insolúveis sob condições de tampão fisiológicas.

Os ensaios imunológicos em geral são realizados em pH fisioló5 gico. Devido a sua insolubilidade sob condições de tampão fisiológicas, os antígenos de glicoproteínas retrovirais de superfície, em muitos ensaios imunológicos, são utilizados diretamente revestidos sobre um material em

I fase sólida. O revestimento direto dos antígenos nos materiais em fase sólida, entretanto, é prejudicial em muitos casos e resulta em desvantagens,

MO como alterações na conformação, desdobramento molecular, alteração na antigenicidade, instabilidade e problemas na estrutura (cf. Butler, J. E. e outros, J. Immunol. Methods 150 (1992) 77-90).

Embora seja possível solubilizar uma glicoproteína retroviral de superfície (rsgp) através de reagentes fortemente caotrópicos ou de deter15 gentes apropriados, o material solubilizado de tal forma tem uso limitado como uma ferramenta para diagnóstico.

A insolubilidade das glicoproteínas retrovirais de superfície em condições de tampão fisiológicas em adição torna estas proteínas um alvo muito difícil para procedimentos (bio)químicos de rotina. A grande maioria de químicas de rotulação, isto é, os procedimentos químicos utilizados para a ligação de uma rotulação, por exemplo, um grupo marcador em um polipeptídeo, se baseia na química nucleofílica e portanto está bastante restrita a uma janela de pH, de aproximadamente pH 6 até aproximadamente pH 8, e assim funciona somente mais ou menos nas condições de tampão fisioló25 gicas. Estes procedimentos de rotina, por exemplo, que são descritos em Aslam, M. e Dent, A., The preparation of protein-protein conjugates em Bioconjugation (1998) 216-363, Eds. M. Aslam e A. Dent, McMillan Reference, Londres, ainda não funcionam apropriadamente ou são difíceis de serem realizados em valores de pH extremos (ou na presença de detergentes tal como SDS), necessários para solubilizar uma glicoproteína retroviral de superfície.

Como mencionado anteriormente, os ensaios imunológicos, de

acordo com o conceito de ponte, provaram ser vantajosos em uma ampla variedade de ensaios diferentes, visando a detecção de anticorpos reativos com organismos patogênicos. Entretanto, devido a sua insolubilidade, não foi possível, por exemplo, utilizar a molécula e-gp41 (isto é, ectodomínio da glicoproteína 41) da HIV-1 ou a e-gp36, respectivamente, em tal arranjo de ensaio.

Com a finalidade de compensar as desvantagens do revestimento direto, foi planejada uma variedade de ensaios, que ao invés de utilizar o antígeno e-gp41, faz uso de seqüências parciais do mesmo, produzidas sinteticamente ou de forma recombinante, abrangendo mais ou menos a região imunodominante assim chamada de alça. Os exemplos de tais ensaios são fornecidos na literatura da patente discutida abaixo.

A região da alça na parte extracelular da gp41 é o grampo apical sem hélice da molécula que liga o domínio em hélice do N-terminal ao domínio C-terminal em hélice, similarmente. Uma parte significativa do anti-soro reativo para gp41 compreende anticorpos para o motivo da alça apical. Esta estrutura em grampo ou em alça com ponte dissulfeto representa, assim, uma região imunodominante da gp41. Um atalho para vencer os problemas associados com a gp41 derivada de forma recombinante é portanto a produção química de peptídeos que representam as seqüências parciais da gp41. É importante observar que a gp41 ou a gp36, respectivamente, como referido na presente invenção, é definida como o assim chamado ectodomínio, que abrange as hélices N e C conectadas com a alça, mas sem o peptídeo de fusão N-terminal e o segmento transmembrana C-terminal.

Os fragmentos peptídicos de uma variedade de antígenos do HIV são descritos na literatura de patente relevante (Pedido de Patente Australiana N^s 597884 (57733/86) e nas Patentes U.S. Ν^Ω 4735896 e N° 4879212). Em particular, estes três relatórios descritivos descrevem uma região imunodominante conservada da glicoproteína gp41, a região da alça da proteína principal do envelope do HIV-1. Uma região imunodominante análoga da proteína gp36 do HIV-2 também foi sintetizada. Os peptídeos que correspondem a estas regiões da alça, que constituem o ápice do ecto30 ±4 domínio, possibilitam um diagnóstico precoce do HIV-1 e do HIV-2 e são responsáveis por ensaios com sensibilidade suficiente, mas não ótima, e com boa especificidade. Suas limitações entretanto, se tornam evidentes em relação à detecção de anticorpos IgM durante os primeiros dias de soroconversão, em certos pacientes.

O WO 92/22573 descreve peptídeos que possuem propriedades imunológicas em comum com a estrutura fundamental, isto é, com uma região imunodominante da proteína de envelope transmembrana (por exemplo, gp41 ou gp36) de vários vírus de imunodeficiência de mamíferos. Esta confirma ainda que esta região imunodominante compreende uma alça dissulfeto, que é altamente conservada em isolados de vírus de imunodeficiência derivados de espécies de mamíferos diferentes.

A EP 396 559 refere-se a peptídeos artificiais que portam uma seqüência de aminoácidos, que corresponde a uma seqüência de aminoácidos que ocorre naturalmente de um HIV. Os epítopos novamente são derivados de seqüências que correspondem à estrutura da alça da gp41 ou da gp36, respectiva mente. Foram ainda refinados para conter uma ponte dissulfeto, formada através de uma etapa de oxidação química entre os dois resíduos de cisteína da alça imunodominante.

Uma porcentagem bastante significativa de anticorpos que estão contidos no anti-soro anti-HIV de pacientes infectados pelo HIV, entretanto, não reage com o motivo da seqüência ou com suas variações derivadas da alça imunodominante da gp41 ou da gp36. Embora estes antígenos peptídicos possam ser utilizados em combinação com o conceito vantajoso de ponte, os anticorpos reativos com os epítopos fora da região da alça da gp41 do HIV não são detectados. Não só o diagnóstico muito precoce de uma infecção pelo HIV é crucial, como é extremamente importante que o maior número possível de subtipos do HIV-1 e do HIV-2 seja detectado. Quanto maior a quantidade de epítopos, especialmente dos epítopos conformacionais dobrados corretamente de uma rsgp, presente, menos provável é a chance de errar uma amostra infectada devido a um diagnóstico falso negativo.

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Foram portanto empreendidos esforços contínuos para fornecer partes maiores de uma molécula de glicoproteína retroviral de superfície, especialmente da gp41 do HIV-1, na forma solúvel.

As propriedades biofisiológicas, assim como as bioquímicas, da gp41, foram extensivamente estudadas nos últimos anos. Lu, M. e outros, Nat. Struct. Biol. 2 (1995) 1075-82) elucidaram particularmente a estrutura trimérica da gp41. Uma vez que a gp41, sob condições fisiológicas, forma um agregado insolúvel, as investigações foram centralizadas nas versões truncadas do ectodomínio da gp41.

Foi confirmado recentemente, através da espectroscopia de RMN (Caffrey, M. e outros, J Biol Chem 275 (2000) 19877-82), que o trímero nativo da gp41 forma um feixe de seis hélices, que compreende três hélices centrais N-terminais paralelas, nas quais as hélices C-terminais se compactam em uma orientação antiparalela.

Foram também descritos os agregados de alto peso molecular da gp41. Tais agregados são formados, de maneira mais provável, através da interação da assim chamada região da alça apical da gp41.

Através do planejamento de proteínas, um inibidor da entrada do HIV-1 nas células alvo foi desenvolvido por Root, M. J. e outros, Science 291 (2001) 884-8. Este inibidor compreende três extensões derivadas do domínio da hélice N-terminal da gp41 e duas extensões do domínio da hélice C-terminal desta molécula. Entretanto, este constructo geneticamente engenheirado não possui muitos domínios e muitos epítopos antigênicos da molécula nativa, e especialmente não contém o assim chamado motivo da alça, que é conhecido por portar epítopos particularmente imunogênicos (ver acima).

Existe ainda, portanto, uma enorme necessidade de fornecer o maior número de epítopos de glicoproteínas retrovirais de superfície possível, em uma forma solúvel. Especialmente, há uma necessidade de fornecer tais antígenos solúveis que compreendem a gp41 do HIV-1 ou a gp36 da HIV-2, respectivamente, para uso em várias aplicações terapêuticas, assim como de diagnóstico.

Foi uma tarefa da presente invenção investigar se é possível fornecer mais epítopos de glicoproteínas retrovirais de superfície ou até mesmo a molécula da e-gp41 ou da e-gp36, respectivamente, na forma solúvel.

Uma tarefa adicional da presente invenção foi investigar se é possível fornecer variações da gp41 ou da gp36, respectivamente, com maior facilidade de manipulação e/ou que, especialmente sob as condições de tampão que são requeridas para a realização de um ensaio imunológico, ou que são necessárias para a imunização, são solúveis na forma de um complexo que compreende a variação e uma chaperona da classe de chaperonas da peptidil-prolil-isomerase.

As chaperonas, que são conhecidas como auxiliadores do dobramento clássicos, são polipeptídeos que auxiliam o dobramento e a manutenção da integridade estrutural de outras proteínas. Estas possuem a capacidade de promover o dobramento de um polipeptídeo, tanto in vivo, quanto in vitro. Geralmente, os auxiliadoras do dobramento estão subdivididos em catalisadores do dobramento e em chaperonas. Os catalisadores do dobramento aceleram as etapas limitantes da taxa no dobramento das proteínas, por causa de sua função catalítica. Os exemplos de catalisadores são descritos adicionalmente abaixo. É conhecido que as chaperonas se ligam a polipeptídeos desnaturados, ou parcialmente desnaturados, e assim auxiliam as proteínas a se renaturarem. Assim, ao contrário dos catalisadores do dobramento, as chaperonas exercem uma simples função de ligação (Buchner, J., Faseb J 10 (1996) 10-19).

As chaperonas são proteínas ubíquas induzidas pelo estresse na maturação, no dobramento, na translocação e na degradação das proteínas (Gething, M. J. e Sambrook, J., Nature 355 (1992) 33-45). Embora também presentes sob condições normais de crescimento, são induzidas de forma abundante sob condições de estresse. Isto sustenta adicionalmente a idéia de que sua função fisiológica serve para lidar com as condições de estresse.

Até hoje, são conhecidas várias famílias diferentes de chapero·· · ·· ···· ·· ·« • · · · · · · · · · · • ·· · ·«··· *

nas. Todas estas chaperonas são caracterizadas por sua capacidade de se ligarem a proteínas desdobradas, ou parcialmente desdobradas, e terem uma função fisiológica que está associada com o dobramento correto das proteínas, ou com a remoção da proteína desnaturada ou agregada.

Os exemplos bem-caracterizados de chaperonas são membros das assim chamadas famílias de proteínas de choque térmico, que são denominadas de acordo com seu peso molecular relativo; por exemplo, hsplOO, hsp90, hsp70 e hsp60, assim como as assim chamadas shsps (proteínas de choque térmico pequenas), que são descritas por Buchner, J., Faseb J 10 (1996) 10-19 e por Beissinger, M. e Buchner, J., Biol. Chem. 379 (1998)245-59.

Os catalisadores do dobramento, ao contrário das chaperonas, auxiliam no dobramento através da aceleração de etapas definidas que limitam a taxa, reduzindo desta maneira a concentração de intermediários do dobramento sujeitos à formação de agregados. Uma classe de catalisadores, as proteínas dissulfeto isomerases (alternativamente denominadas tioldissulfeto-óxido-redutases), catalisa a formação ou o rearranjo de ligações dissulfeto nas proteínas secretoras. Nas bactérias Gram-negativas, o dobramento oxidativo de proteínas secretoras no periplasma é ajustado através de uma cascata de proteína dissulfeto isomerases denominada DsbA, DsbB, DsbC e DsbD (Bardwell, J. C., Mol Microbiol 14 (1994) 199-205 e Missiakas, D. e outros, Embo J 14 (1995) 3415-24).

Uma outra classe importante de catalisadores do dobramento, referida como peptidil prolil cis/trans isomerases (PPIs), compreende membros diferentes, tais como CypA, PpiD (Dartigalongue, C. e Raina, S., Embo J 17 (1998) 3968-80, FkpA (Danese, P. N. e outros, Genes Dev 9 (1995) 387-98), fator de ativação (Crooke, E. e Wickner, W., Proc Natl Acad Sei USA 84 (1987) 5216-20 e Stoller, G. e outros, Embo J 14 (1995) 4939-48) e Sly D (Hottenrott, S. e outros, J Biol Chem 272 (1997) 15697-701). Dentre estes, foi descoberto que o FkpA, o SlyD e o fator de ativação estão relacionados com base nos alinhamentos de seqüências.

A peptidil prolil isomerase FkpA foi localizada no periplasma das bactérias Gram-negativas. Foi especulado que esta chaperona é importante para o transporte e para a translocação de proteínas bacterianas da membrana externa. Ramm, K. e Pluckthun, A., J Biol Chem 275 (2000) 17106-13) mostraram que a FkpA exibe seu efeito benéfico sobre o dobramento correto de proteínas de duas maneiras diferentes. Em primeiro lugar, a FkpA interage com os intermediários iniciais do dobramento, prevenindo assim a sua agregação. Em segundo lugar, esta possui a capacidade de reativar uma proteína inativa, possivelmente também através da ligação às espécies parcialmente desdobradas que podem existir em equilíbrio com a forma agregada.

Alguns auxiliadores do dobramento compreendem tanto um domínio cataliticamente ativo, assim como um domínio de chaperona (ou de ligação polipeptídica). Os exemplos representativos são, por exemplo, o fator de ativação (Zarnt, T. e outros, J Mol Biol 271 (1997) 827-37), Wang, C. C. e Tsou, C. L., Faseb J 7 (1993) 1515-7), SurA (Behrens e outros, EMBO J. (2001) 20(1), 285-294) e DsbA (French, C. e outros, Embo J 15 (1996) 39298). De acordo com as presentes observações, a mesma estrutura modular parece ser percebida nas PPIases FkpA e SlyD, respectivamente.

Foi demonstrado em sistemas independentes diferentes que uma expressão melhorada de chaperonas pode facilitar a produção recombinante de um polipeptídeo. Um exemplo para isto pode ser encontrado no WO 94/08012.

É também conhecido que uma produção maior de proteínas pode ser conseguida utilizando um constructo gênico, que compreende uma seqüência que codifica um polipeptídeo assim, como uma seqüência de chaperona. Foi mostrado, por exemplo, que este conceito de fusão resulta em uma produção significativamente maior da pró-insulina humana no periplasma de Escheríchia coli”, utilizando um constructo gênico que compreende o gene da pró-insulina humana e DsbA (Winter, J. e outros, Journal of Biotechnology 84 (2000) 175-185).

A abordagem de utilizar chaperonas para a maior produção de polipeptídeos dobrados, similares aos nativos, é principalmente devido à li12 gação e, assim, à função de solubilização das proteínas chaperonas. Após a produção recombinante de um polipeptídeo de fusão, que compreende a chaperona e a proteína alvo, as chaperonas são costumeiramente clivadas do polipeptídeo resultante, para fornecer o polipeptídeo desejado na forma pura. Em contraste, a presente invenção se baseia no efeito benéfico de solubilização de uma chaperona apropriada enquanto está sendo associada com uma glicoproteína retroviral de superfície.

Descobriu-se surpreendentemente que os auxiliadores do dobramento, por exemplo, muitos membros da classe da peptidil prolil isomerase (PPI), especialmente da família FKBP, não somente exibe atividade catalítica, mas também provocam efeitos benéficos drásticos sobre a solubilidade de proteínas amiloidogênicas, ou de forma mais geral, de proteínas que tendem à degradação. Isso ocorre através da formação de complexos solúveis com tais proteínas, que são de outra maneira (isto é em uma forma isolada sem chaperona) sujeitas à agregação. Tais proteínas que são de outra maneira dificilmente solúveis ou insolúveis, sob condições fisiológicas, se tornam solúveis sob condições fisiológicas suaves (isto é, sem a necessidade de aditivos para solubilização, tais como detergentes ou agentes caotrópicos), uma vez que estão ligadas em um complexo com a chaperona PPI apropriada. Assim, foi possível produzir, por exemplo, complexos proteínachaperona solúveis que compreendem, por exemplo, a proteína gp41 do HIV-1 como uma proteína alvo sujeita à agregação e FkpA, e outras FKBPs como chaperonas, que conferem a solubilidade.

Em adição, foi descoberto que certas variações bem-definidas da gp41 do HIV-1 ou da gp36 do HIV-2, respectivamente, são especialmente adequadas para formar um complexo solúvel com chaperonas da classe PPI.

Os complexos de gp41 e FkpA, ou de gp36 e FkpA, por exemplo, são facilmente solúveis, por exemplo, sob condições fisiológicas, podem ser facilmente rotulados em faixas de pH convenientes e podem ser utilizados com grande vantagem na detecção de anticorpos contra a gp41 ou a gp36, respectiva mente, do HIV (1 ou 2, respectivamente) e portanto, no dia13

gnóstico de uma infecção pelo HIV.

Breve descrição das Figuras

Figuras 1A e 1B UV CD distante (1A) e próximo (1B) do ectodomínio da gp41 do HIV-1 (535-681 )-His_R gp41 dobrada (linha grossa): as condições de tampão (formiato de sódio 30 mM, pH 3,0) foram ajustadas para induzir uma conformação toda em hélice, similar à nativa da gp41; gp41 desnaturada (linha fina): as condições de tampão (fosfato de sódio 50 mM pH 3,0, GuHCI 7,0 M) foram ajustadas para desnaturar completamente (desdobrar) a gp41. Devido à alta molaridade do sal caotrópico, o sinal dicroítico de referência na Figura 1A (linha fina) não pode ser monitorado de forma confiável na região de comprimento de onda abaixo de 215 nm. Os espectros foram registrados em um espectropolarímetro Jasco-720 e foram tiradas em média nove vezes para diminuir o ruído. O comprimento do caminho foi de 0,2 cm para UV CD distante (Figura 1 A) e de 0,5 cm para UV CD próximo (Figura 1B). As concentrações respectivas da proteína foram 1,5 μΜ e 29 μΜ. As unidades das ordenadas são a capacidade elíptica média do resíduo e possuem a dimensão deg x cm² x dmol'¹.

Figura 2 Agregação da gp41 sem chaperona em tampão fisiológico.

São mostrados espectros de UV do ectodomínio da gp41, um minuto (linha inferior) e 10 minutos (linha superior), após um salto do pH de 3,0 para 7,5. As moléculas que se agregam levam a efeitos de luz difusa e produzem a absorção aparente além de 310 nm. A figura serve apenas para demonstrar a enorme tendência de agregação da gp41; é notável que o processo de agregação não para no estágio indicado pela linha superior.

Figuras 3A e 3B FkpA solubiliza o ectodomínio da gp41 em pH neutro

A gp41 e a FkpA foram co-incubadas em pH baixo e depois disso foram trocadas para condições de tampão finais de fosfato de sódio 20 mM, pH 7,4; NaCI 50 mM, EDTA 1 mM. Após 1 e 10 minutos (as linhas inferior e superior, respectivamente), foram registrados os espectros de UV, para avaliar a extensão da agregação nas amostras. A Figura 3A mostra a supressão da agregação, através de um excesso molar de duas vezes da chaperona, a Figura 3B mostra o efeito de um excesso de quatro vezes. A concentração final da gp41 foi de aproximadamente 1 μΜ. Uma vez que a luz difusa (que leva a uma absorção aparente além de 300 nm) foi reduzida para um mínimo, há uma evidência espectroscópica obrigatória de que a FkpA solubiliza eficientemente o ectodomínio da gp41, de uma forma dependente da dose.

Figura 4 Espectro de UV do FkpA-qp41 em pH 2,5

Espectro de UV do polipeptídeo de fusão FkpA-gp41, após a diálise contra fosfato de sódio 50 mM, pH 2,5; NaCI 50 mM. Surpreendentemente, o construto com os dois domínios permanece completamente solúvel após a remoção do agente caotrópico solubilizante GuHCI. Não há evidência da existência de agregados que difundem a luz, que se possa esperar, que cause uma alteração da linha de base e uma absorção aparente significativa em comprimentos de onda além de 300 nm.

Figura 5 Espectro de UV CD próximo do FkpA-qp41 em pH 2,5

O espectro foi registrado em um espectropolímetro Jasco 720 em fosfato de sódio 20 mM, pH 2,5; NaCI 50 mM a 20°C e foi acumulado nove vezes para diminuir o ruído. A concentração de proteína foi de 22,5 μΜ, em um comprimento de caminho de 0,5 cm. A capacidade aromática elíptica exibe a assinatura típica da gp41 (para referência veja a Figura 1B). Em pH 2,5, a FkpA fica enormemente desestruturada e não contribui de forma alguma para o sinal no UV-CD próximo.

Figura 6 Espectro de UV CD distante do FkpA-qp41 em pH 2,5

O espectro foi registrado em um espectropolarímetro Jasco 720 em fosfato de sódio 20 mM pH 2,5; NaCI 50 mM a 20°C e foi acumulado nove vezes para melhorar a proporção do sinal em relação ao ruído. A concentração de proteína foi de 2,25 μΜ, em um comprimento de caminho de 0,2 cm. Os mínimos nos pontos de 220 e 208 nm, para uma estrutura bastante helicoidal da gp41, no contexto da proteína de fusão. O ruído do espectro abaixo de 197 nm é devido a alta absorção de amida e não refere-se a quaisquer características da proteína de fusão. Não obstante, a hélice típica máxima a 193 nm pode ser suposta.

Figura 7 UV CD próximo da FkpA-qp41 sob condições de tampão fisiológicas

O espectro foi registrado em um espectropolarímetro Jasco 720 em fosfato de sódio 20 mM, pH 7,4; NaCI 50 mM a 20°C e foi acumulado nove vezes para diminuir o ruído. A concentração de proteína foi de 15,5 μΜ, em um comprimento de caminho de 0,5 cm. De forma surpreendente, a capacidade elíptica dos domínios da proteína ligados de forma covalente da gp41 e da FkpA (linha contínua) é constituída aditivamente das contribuições da gp41 toda em hélice, similar à nativa, em pH 3,0 (linha pontilhada inferior) e das contribuições da FkpA em pH 7,4 (linha pontilhada superior). Isto indica que o veículo FkpA e o alvo gp41 (isto é, duas unidades funcionais de dobramento distintas) se redobram reversivelmente e de forma quase independente, quando ligados em uma proteína de fusão de polipeptídeos.

Figura 8 UV CD distante da FkpA-qp41 sob condições de tampão fisiológicas

O espectro foi registrado em um espectropolarímetro Jasco 720 em fosfato de sódio 20 mM, pH 7,4; NaCI 50 mM a 20°C e foi acumulado nove vezes para melhorar a proporção do sinal em relação ao ruído. A concentração de proteína foi de 1,55 μΜ, em um comprimento de caminho de 0,2 cm. Os sinais fortes em 222 nm e 208 nm, respectivamente, apontam para uma estrutura bastante helicoidal da gp41, no contexto do construto de fusão. O ruído abaixo de 198 nm é causado pela alta absorção de proteína e não reflete quaisquer propriedades estruturais secundárias do FkpA-gp41. Figura 9 qp41 ligada a FkpA é tanto solúvel, quanto altamente reativa imunologicamente em um ensaio para HIV

O FkpA-gp41 é um forte competidor no ensaio de Combi COBAS CORE HIV. É mostrado o potencial inibidor do polipeptídeo FkpA-gp41 solúvel (círculos preenchidos), após o pré-tratamento com tampão diluente (contendo Triton X-100 como um detergente auxiliador), em comparação ao ectodomínio da gp41 isoladamente (círculos vazios). É evidente que o ectodomínio da gp41 (dentro do complexo intramolecular da proteína de fusão) mantém sua alta reatividade imunológica mesmo na presença de detergente, enquanto que o ectodomínio nu perde quase completamente a reatividade

ΧΎ imunológica. Ο soro positivo para HIV testado foi o soro interno número 21284, em uma diluição de 1:3000.

Figura 10 Espectro de UV de FF36, após a filtração em gel renaturante

O espectro fornece a evidência obrigatória de que o peptídeo de fusão com a gp36 é solúvel e não se agrega quando redobrado em uma coluna Sux 200, de acordo com o método de filtração em gel renaturante que é descrito na seção de Exemplos.

Figura 11 (a e b) FkpA-gp21 é um polipeptídeo de fusão tanto solúvel quanto reativo imunologicamente

Após a filtração em gel renaturante, a proteína de fusão FkpAgp21 redobrada é eluída de forma altamente solúvel e não exibe tendência de agregação no espectro de UV (11.a). Quando avaliada em um experimento de ensaio imunológico do tipo competitivo no COBAS CORE com soro 858893-00 positivo para HTLV (diluição de 1:10), o FkpA-gp21 passa a possuir excelentes propriedades imunológicas (11 .b).

Descrição detalhada

A presente invenção refere-se a um método de produção de um complexo solúvel que compreende uma proteína alvo, que é essencialmente insolúvel, e uma chaperona da classe peptidil-prolil-isomerase, que compreende a mistura da dita proteína e da dita chaperona em um tampão, em que tanto a proteína quanto a chaperona são solubilizadas, e ajustando o tampão para condições fisiológicas em que o complexo proteína-chaperona formado é solúvel.

Uma proteína alvo de acordo com a presente invenção, pode ser qualquer proteína, que é essencialmente insolúvel em uma solução tamponante aquosa com pH 7,4, que consiste em fosfato de sódio 20 mM e cloreto de sódio 150 mM. As proteínas alvo preferidas, por exemplo, são proteínas amiloidogênicas, glicoproteínas de superfície de vírus amiloidogênicos, glicoproteínas retrovirais de superfície, especialmente a gp41 do HIV-1, a gp36 do HIV-2 e a gp21 do HTLV.

Um grupo importante de polipeptídeos alvos são as assim chamadas proteínas ou polipeptídeos amiloidogênicos. Tais proteínas amiloido··· ··« *· · · · · · »·· • · · · · · · · ·*·· ··· « · · · · · · gênicas foram descobertas na forma agregada em fluidos ou compartimentos corporais. Os exemplos bem-conhecidos são o amilóide A do soro (sAA), o assim chamado β-Α4 ou Αβ (um polipeptídeo de 42 ou 43 aminoácidos conhecido como sendo formador dos depósitos amiióides, característicos no cérebro, da Doença de Alzheimer), as assim chamadas proteínas príon (a forma PrP^Sc se acumula em agregados em BSE ou na doença de Creutzfeldt-Jacob) e glicoproteínas retrovirais de superfície, como a gp41 do HIV-1, que é encontrada em placas similares às amiióides no cérebro de pacientes que sofrem de HAD (demência associada ao HIV). Em uma modalidade preferida, uma chaperona, preferencialmente uma chaperona PPI, é utilizada para formar um complexo solúvel, que compreende uma proteína amiloidogênica e a chaperona. Em grande vantagem, tal complexo pode ser utilizado em muitos procedimentos de ensaios imunológicos diferentes. Preferencialmente, tal complexo é utilizado em um ensaio imunológico de acordo com o conceito de ponte de antígeno duplo.

O HIV e outros vírus envelopados, tais como o HTLV, o vírus influenza e o vírus Ebola, todos expressam glicoproteínas de superfície que medeiam tanto a adesão celular, quanto a fusão com a membrana. Para exercer essas funções, todas estas glicoproteínas de superfície contêm segmentos extremamente hidrofóbicos, o que torna difícil manipulá-las in vitro, ficam sujeitas à agregação e as tornam alvos desafiadores para tentativas de redobramento in vitro. Em uma modalidade preferida adicional, a presente invenção refere-se a um complexo solúvel, que compreende uma chaperona PPI e uma glicoproteína de superfície de um vírus envelopado. Refere-se especialmente ao uso de um complexo, que compreende uma chaperona PPI e uma glicoproteína de um vírus envelopado em um ensaio imunológico para a detecção de anticorpos na glicoproteína de superfície.

A HAD é uma complicação bem-conhecida da infecção pelo HIV. Como é descrito por Caffrey, M. e outros supra, em relação aos fenômenos histológicos, a HAD é muito similar à encefalopatia espongiforme, chamada de doença de Creutzfeldt-Jacob. Considera-se que a etiologia da doença de Creutzfeldt-Jacob seja geralmente originada do acúmulo amiloidogênico de ·· · placas, que compreendem uma proteína príon modificada (Prusiner, S. B., Proc Natl Acad Sei USA 95 (1998) 13363-83). Uma patogênese análoga para a HAD, que envolve agregados de alto peso molecular do e-gp41, é muito provável. É digno de nota que as lesões neurológicas na encefalite causada pelo HIV compartilha características patológicas e radiológicas com a doença de Binswanger.

As proteínas amiloidogênicas preferidas, de acordo com a presente invenção, são a gp41 derivada do HIV-1, a gp36 derivada do HIV-2 ou a gp21 derivada do HTLV, respectivamente.

Uma proteína é considerada essencialmente insolúvel se em um tampão, que consiste em fosfato de sódio 20 mM pH 7,4, NaCI 150 mM, for insolúvel em uma concentração de 50 nM ou inferior.

Um complexo de acordo com a presente invenção, que compreende uma chaperona PPI e uma proteína alvo, é considerado solúvel se, sob condições de tampão fisiológica, por exemplo, em um tampão que consiste em fosfato de sódio 20 mM pH 7,4, NaCI 150 mM, a proteína alvo, compreendida no complexo com a chaperona PPI, for solúvel em uma concentração de 100 nM ou superior.

Foi desenvolvido um método que compreende as etapas de mistura da proteína alvo e da chaperona em um tampão em que tanto a proteína, quanto a chaperona são solubilizadas, e de ajuste do tampão para condições fisiológicas em que o complexo proteína-chaperona formado permanece solúvel.

A produção do complexo solúvel chaperona-proteína alvo começa partindo de uma condição tamponante solubilizante, isto é, a partir de um tampão em que tanto a proteína alvo, quanto a chaperona são solúveis. Um tampão apropriado, que pode ser denominado tampão não-fisiológico ou solubilizante, tem que satisfazer o requerimento de que tanto a proteína alvo, quanto a chaperona PPI não sejam desnaturadas, ou pelo menos não sejam desnaturadas de forma irreversível. Partindo de tais condições de tampão, a chaperona se liga à proteína alvo e uma alteração das condições de tampão de condições não-fisiológicas para fisiológicas é possível, sem a

precipitação da proteína alvo.

Um tampão apropriado (não-fisiológico), isto é, um tampão em que tanto a proteína alvo, que é essencialmente insolúvel, quanto a chaperona PPI, são solúveis, faz uso de pH alto ou baixo, ou de uma alta concentração de sal caotrópico, ou de uma combinação dos mesmos.

No caso da produção de um complexo intermolecular que compreende uma chaperona PPI e uma proteína alvo, que é essencialmente insolúvel, o tampão não-fisiológico é preferencialmente um tampão com um pH preferivelmente alto ou preferivelmente baixo. Preferencialmente, tal tampão possui um pH de 9 até 12, na faixa de pH alto, ou de 2 até 4,5, na faixa de pH baixo.

No caso da produção de um complexo intramolecular que compreende uma chaperona PPI e uma proteína alvo, que é essencialmente insolúvel, o tampão solubilizante é preferencialmente um tampão com uma concentração mais alta de um sal caotrópico, por exemplo, cloreto de guanidínio 6,0 M em um pH de aproximadamente 6. Após a renaturação, a proteína alvo assume a sua estrutura similar à nativa e forma o complexo intramolecular.

No contexto desta invenção, as condições de tampão fisiológicas são definidas por um valor de pH entre 5,0 e 8,5 e uma concentração de sal total abaixo de 500 mM, independentemente de outros ingredientes que não são sais, que podem estar opcionalmente presentes no tampão (por exemplo açúcares, álcoois, detergentes), contanto que tais aditivos não prejudiquem a solubilidade do complexo que compreende a proteína alvo e a chaperona.

Em uma modalidade adicionalmente preferida, a presente invenção refere-se a um método de produção de um complexo solúvel glicoproteína retroviral de superfície-chaperona, que compreende: a mistura de uma glicoproteína retroviral de superfície e uma peptidil prolil isomerase em um tampão em que tanto a glicoproteína retroviral de superfície, quanto a peptidil prolil isomerase são solubilizadas e formam um complexo, e o ajuste do tampão para condições fisiológicas em que o complexo é solúvel.

• · ···· ··

O termo glicoproteína retroviral solúvel ou rsgp, como é utilizado na presente invenção deve compreender a gp41 do HIV-1 e a gp36 do HIV-2, assim como as glicoproteínas de envelope correspondentes derivadas de outros vírus de imunodeficiência de mamíferos. As glicoproteínas retrovirais de superfície preferidas são a gp41 do HIV-1, a gp36 do HIV-2 e a gp21 do HTLV. As rsgps especialmente preferidas são a gp41 do HIV-1 e a gp36 do HIV-2. O termo rsgp como é ressaltado aqui compreende ainda as variações que ocorrem naturalmente assim como as sinteticamente engenheiradas de uma rsgp.

Foi descoberto que certas substituições de aminoácidos, bemdefinidas dentro do domínio da hélice N da gp41 ou da gp36, respectivamente, produziam vantagens adicionais nas propriedades globais destas moléculas, quando comparadas com os polipeptídeos que possuem a seqüência do tipo selvagem da gp41 ou da gp39, respectivamente. Estas variações representam uma modalidade preferida de acordo com a presente invenção. Especialmente uma variação da gp41 do HIV-1, que compreende pelo menos uma substituição de aminoácido e no máximo quatro substituições de aminoácidos, em uma ou mais posições selecionadas do grupo de posições Leu 555, Leu 566, lie 573 e lie 580, em que estas posições são as posições conhecidas partindo da seqüência do tipo selvagem da gp41 do HIV-1 (SEQ ID N°: 1) ou correspondem às posições conhecidas partindo desta, caracterizadas pelo fato de que o aminoácido da substituição é ou, respectivamente ou independentemente, são selecionados do grupo que consiste em serina, treonina, asparagina, glutamina, ácido aspártico e ácido glutâmico, ou uma variação da gp36 do HIV-2, que compreende pelo menos uma substituição de aminoácido e no máximo três substituições de aminoácidos, em uma posição selecionada do grupo de posições Leu 554, Leu 565 e Vai 579, em que estas posições são posições conhecidas partindo da seqüência do tipo selvagem da gp36 do HIV-2 (SEQ ID N°: 2), ou correspondem às posições conhecidas partindo desta, caracterizadas pelo fato de que o aminoácido da substituição é ou, respectiva mente ou independentemente, são selecionados do grupo que consiste em serina, treonina, asparagina,

glutamina, ácido aspártico e ácido glutâmico, é apropriada para, pelo menos parcialmente, resolver os problemas conhecidos na técnica.

As novas variações da gp41 ou da gp36, respectivamente, são menos sujeitas à agregação, mais solúveis e mais fáceis de serem manipuladas, quando comparadas com seus polipeptídeos correspondentes das seqüências do tipo selvagem. A maior solubilidade se toma especialmente evidente, uma vez que são feitas tentativas de fornecer um reagente que sob condições de tampão fisiológicas compreende a gp41 ou a gp36 na forma solúvel. Foi provado ser especialmente vantajoso combinar as propriedades favoráveis das novas variantes com os efeitos fornecidos por uma chaperona selecionada da classe peptidil-prolil-isomerase (PPI) de chaperonas. Portanto, a invenção refere-se ainda ao uso de uma variação da gp41 e/ou de uma variação da gp36, que é descrito na presente invenção, na produção de um complexo solúvel que compreende a dita variação e uma chaperona da classe peptidil-prolil-isomerase de chaperonas.

Um complexo solúvel, que compreende uma variação da glicoproteína do HIV e uma chaperona da classe PPI, é preferencialmente obtido partindo de uma única proteína recombinante, que compreende uma gp41 do HIV ou uma gp36 do HIV-2, respectivamente, e uma chaperona da classe PPI. Assim, uma modalidade preferida é uma proteína recombinante que compreende uma variação da gp41 do HIV-1 ou a gp36 do HIV-2, que é descrita na presente invenção, e uma chaperona selecionada da classe peptidil-prolil-isomerase de chaperonas.

O fato de que as novas variações da gp41 ou da gp36 serem mais fáceis de manipular que os polipeptídeos do tipo selvagem, as tornam ideais para várias finalidades, como o uso como um imunógeno ou o uso como um antígeno. Em uma modalidade preferida, a presente invenção está direcionada ao uso de uma variação da gp41 e/ou da gp36, de acordo com a presente invenção, ou de um complexo que compreende uma chaperona PPI e tal variação, por exemplo, na forma de uma proteína recombinante única, em um ensaio imunológico. De forma mais intrigante, uma proteína de fusão que compreende tanto uma glicoproteína retroviral de superfície,

quanto uma chaperona PPI, pode ser solubilizada e renaturada sob condições apropriadas e foi descoberto que forma um complexo intramolecular solúvel rsgp-chaperona, que possibilita a rotulação conveniente e a detecção confiável em um ensaio imunológico para HIV.

O complexo solúvel entre uma glicoproteína retroviral de superfície e uma chaperona pode ser utilizado com grande vantagem em um ensaio imunológico para a detecção de anticorpos, de acordo com o conceito de ponte de antígenos duplos.

Um complexo rsgp-chaperona, que compreende a gp41 do HIV1 ou a gp36 do HIV-2 é especialmente vantajoso na detecção de anticorpos contra HIV, em uma fase inicial de infecção. Com um complexo solúvel chaperona-gp41 ou um complexo solúvel chaperona-gp36, é possível realizar um ensaio imunológico, preferencialmente de acordo com o conceito de ponte, que permite a detecção sensível e precoce de anticorpos contra HIV, em uma amostra de fluido corporal.

O fato de que as chaperonas podem formar complexos com proteínas de outra forma insolúveis pode ser também utilizado, com grande vantagem, com a finalidade de melhorar de forma mais geral os ensaios imunológicos, preferencialmente os ensaios imunológicos de acordo com o conceito de ponte. O conceito de ponte permite o uso de um complexo chaperona-antígeno como um primeiro antígeno (principalmente um assim chamado antígeno de captura sobre o lado da fase sólida) e um segundo complexo chaperona-antígeno (principalmente um antígeno de detecção sobre o lado de detecção). Com a finalidade de minimizar os problemas de reação de fundo, causados pela ligação de anticorpos que reagem com a chaperona, tais ensaios de ponte podem ser ainda modificados vantajosamente fazendo uso de uma primeira chaperona para o lado da fase sólida e uma segunda chaperona para o lado de detecção, derivadas de espécies diferentes.

É agora possível realizar ensaios imunológicos, de acordo com o conceito de ponte empregando um complexo chaperona-antígeno rotulado. É também possível produzir um complexo chaperona-antígeno em que somente a chaperona é rotulada, assegurando que o antígeno não é modifica23

do ou influenciado negativamente (por exemplo em termos de conformação), através de tal rotulação.

O modo e a estratégia de acoplamento químico podem ser selecionados quando necessário. No caso de polipeptídeos, reagentes químicos de acoplamento direcionados para os resíduos -SH, -NH₂ ou -COO, assim como para o grupo OH das tirosinas, o grupo imidazol das histidinas, ou os grupos imino heterocíclicos dos triptofanos, já existem. São conhecidos vários reagentes químicos de acoplamento apropriados para cada um destes grupos funcionais (Aslam, M. e Dent, A., supra). Várias reações químicas de rotina para o acoplamento de proteínas requerem que uma proteína seja solúvel sob as condições de tampão de trabalho, por exemplo, dentro de uma faixa de pH de aproximadamente 5 até 8,5. Como, por exemplo, a gp41 não é solúvel nesta faixa de pH, a não ser que esteja desnaturada, por exemplo, por SDS, a gp41 dobrada similar à nativa não era até agora suscetível ao acoplamento químico. Os complexos gp41-chaperona que são descritos aqui fornecem um meio conveniente para produzir proteínas de envelope solúveis do HIV marcadas para ensaios imunológicos independente do formato de detecção utilizado.

Em uma modalidade preferida, a presente invenção se refere ao processo para a produção de um complexo solúvel rsgp-chaperona, que compreende as etapas de mistura de uma glicoproteína retroviral de superfície solubilizada e uma chaperona selecionada da classe peptidil prolil isomerase, sob condições de tampão não-fisiológicas, e depois disso ajustando o tampão para condições fisiológicas formando assim um complexo intermolecular.

A chaperona e uma glicoproteína retroviral de superfície não podem ser usadas apenas como polipeptídeos separados. Foi observado, de forma surpreendente, que é vantajoso ligar ambas as proteínas de forma covalente. Tal ligação covalente é possível através de procedimentos químicos convencionais de reticulação; preferencialmente, entretanto, a ligação covalente é conseguida através da produção de um polipeptídeo recombinante que compreende uma glicoproteína retroviral de superfície e uma chaperona.

Em uma modalidade adicionalmente preferida, a presente invenção se refere a um processo para a produção de um complexo solúvel rsgpchaperona que compreende as etapas de solubilização, sob condições de tampão apropriadas, uma proteína compreendendo uma glicoproteína retroviral de superfície ligada covalentemente e uma proteína chaperona selecionada da classe peptidil prolil isomerase e, depois disso, o ajuste do tampão para condições fisiológicas. Desta forma, é obtido um complexo intramolecular.

A presente invenção ensina o uso de chaperonas derivadas da classe de auxiliadores do dobramento denominadas peptidil prolil cis/trans isomerases (PPIs) (cf. Dartigalongue, C. e Raina, supra). Os exemplos bemconhecidos desta família são membros denominados CypA, PpiD (Dartigalongue, C. e Raina, S., Embo J 17 (1998) 3968-80; Schmid, F. X., Molecular chaperones in the life cycle of proteins (1998) 361-389, Eds. A. L. Fink e Y. Goto, Marcei Decker In., Nova York), FkpA (Danese, P. N., e outros, Genes Dev 9 (1995) 387-98) e o fator de ativação (Crooke, E. e Wickner, W., Proc Natl Acad Sei USA 84 (1987) 5216-20; Stoller, G. e outros, Embo J 14 (1995) 4939-48).

As peptidil prolil isomerases são subdivididas em três famílias, as parvulinas (Schmid, F. X., supra, Rahfeld, J. U. e outros, FEBS Lett 352 (1994) 180-4) as ciclofilinas (Fischer, G. e outros, Nature 337 (1989) 476-8 e a família FKBP (Lane, W. S. e outros, J Protein Chem 10 (1991) 151-60). A família FKBP exibe uma característica bioquímica interessante, uma vez que seus membros foram originalmente identificados através de sua capacidade de se ligar a macrolídeos, por exemplo, FK 506 e rapamicina (Kay, J. E., Biochem J 314 (1996) 361-85).

As prolil isomerases podem compreender subunidades ou módulos diferentes com funções diferentes, por exemplo, um módulo que exibe a atividade de chaperona ou de ligação. Tais membros modulares da família FKBP são FkpA (Ramm, K. e Pluckthun, A., J Biol Chem 275 (2000) 1710613), SlyD (Hottenrott, S. e outros, J Biol Chem 272 (1997) 15697-701) e o fator de ativação (Scholz, C. e outros, Embo J 16 (1997) 54-8). Em uma mo··· • »·

dalidade preferida, a invenção se refere a um complexo solúvel que compreende uma glicoproteína retroviral de superfície e uma chaperona selecionada da classe peptidil prolil isomerase de catalisadores do dobramento.

Evidentemente, a presente invenção não está restrita ao uso dos membros mencionados especificamente da classe peptidil prolil isomerase, mas pode também ser realizada utilizando chaperonas que derivam da mesma classe, mas derivadas de uma espécie diferente de bactérias. Preferencialmente são utilizados os membros da família FKBP da classe PPI de chaperonas.

Em uma modalidade adicional, é preferido utilizar homólogos derivados de organismos eucarióticos e é muito preferido utilizar PPIases de origem humana, porque estas PPIases não deverão ser reconhecidas pelos anticorpos do soro humano e assim não deverão interferir nos ensaios sorológicos (isto é, ensaios baseados na detecção de anticorpos humanos).

É também bem-conhecido e considerado que não é necessário utilizar sempre a seqüência completa de uma chaperona molecular. Os fragmentos funcionais das chaperonas (assim chamados de módulos) que ainda possuem as capacidades e as funções necessárias podem ser também utilizados (cf. \NO 98/13496).

Por exemplo, a FkpA é uma PPI periplásmica que é sintetizada na forma de uma molécula precursora inativa no citosol bacteriano e é translocada através da membrana cítoplasmática. A forma ativa da FkpA (FkpA madura ou FkpA periplasmática) não possui a seqüência sinal (aminoácidos 1 até 25) e compreende, assim, os aminoácidos 26 até 270 da molécula precursora. A informação relevante da seqüência em relação à FkpA pode ser facilmente obtida de bancos de dados públicos, por exemplo, do SWISS-PROT, sob o número de acesso P 45523.

Um parente próximo da FkpA, denominada SlyD, consiste em um domínio N-terminal estruturado responsável pelas funções catalíticas e de chaperona, e de um C-terminal bastante desestruturado, que é excepcionalmente rico em resíduos de histidina e de cisteína (Hottenrott, S. e outros, J Biol Chem 272 (1997) 15697-701). Foi descoberto que uma variação trun3Ύ cada no C-terminal da SlyD, que compreende os aminoácidos 1-165, exerce eficientemente suas funções de solubilização na gp41 e na gp36. Ao contrário da SlyD do tipo selvagem, o risco de comprometer o embaralhamento de dissulfeto é vencido de forma bem sucedida na variação truncada da SlyD (1-165) utilizada.

As variações das chaperonas discutidas acima, que carregam uma ou várias substituições ou deleções de aminoácidos, podem ser também utilizadas para realizar um processo, de acordo com a presente invenção.

Chaperonas apropriadas provenientes de fontes alternativas e fragmentos ou mutantes apropriados de chaperonas podem ser facilmente selecionados utilizando os procedimentos que são descritos nos Exemplos. Podem ser utilizados na forma livre ou ligados de forma covalente a uma glicoproteína retroviral de superfície, a fim de produzir um complexo solúvel rsgp-chaperona. Em uma modalidade preferida, de acordo com a presente invenção, uma chaperona PPIase, competente em relação à aglutinação, é ligada de forma recombinante a uma glicoproteína retroviral de superfície, para fornecer a alta expressão do produto gênico no citosol bacteriano. Uma PPIase competente em relação à ligação, à qual é referida na presente invenção, abrange pelo menos a unidade funcional que medeia a ligação aos substratos polipeptídicos estendidos (isto é, o motivo de ligação ao substrato ou de chaperona), independente de sua atividade catalítica de PPIase.

Foi também observado que algumas chaperonas, que não pertencem à classe de PPI de catalisadores do dobramento, podem formar um complexo solúvel com uma glicoproteína retroviral de superfície. Uma modalidade adicionalmente preferida, de acordo com a presente invenção, portanto, é um complexo solúvel entre Skp (também conhecida como OmpH; Missiakas, D. e outros, Mol Microbiol 21 (1996) 871-84) e uma glicoproteína retroviral de superfície. Ainda uma modalidade adicionalmente preferida é um complexo solúvel, que compreende uma glicoproteína retroviral de superfície e GroEL ou partes da mesma. As chaperonas que são homólogas à Skp também podem ser utilizadas.

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É sabido (por exemplo, Scholz e outros, supra) que as PPIs modulares se aglutinam preferencialmente às proteínas desnaturadas ou parcialmente desnaturadas. Foi descoberto agora que as PPIases possuem a propriedade surpreendente de não somente catalisar o dobramento de proteínas, mas também formar complexos estáveis com tais proteínas, conferindo desta maneira a solubilidade. De forma surpreendente as PPIases estudadas (tais como a TF, a SlyD e a FkpA) se aglutinam e assim, por exemplo, solubilizam a glicoproteína retroviral de superfície dobrada similar à nativa. A gp41 similar à nativa ou dobrada, de forma similar à nativa, de acordo com a presente invenção, é caracterizada tanto pelo alto conteúdo de hélices na estrutura secundária quando analisada por UV-CD Distante, quanto pelos contatos terciários quando analisada por UV-CD Próximo, que são refletidos na assinatura da gp41 típica, como é mostrado nas Figuras 1B e 5, respectivamente. Além disso, o espectro de UV da gp41 similar à nativa, de acordo com a presente invenção, não exibe absorção significativa em comprimentos de onda superiores a 320 nm (que indicaria partículas difusoras da luz, tais como agregados).

Há uma abundância de informação sobre a formação de complexos entre biomoléculas modelo, por exemplo, entre um anticorpo e um antígeno (para revisão veja Braden, B. C. e Poljak, R. J., Faseb J 9 (1995) 916). Geralmente, a formação e a dissociação de complexos ocorrem em paralelo, os padrões de complexos e de aglutinação coexistem em livre equilíbrio. Similarmente, o mesmo parece verdadeiro para os complexos entre chaperonas PPI e as proteínas amiloidogênicas, que são descritos na presente invenção.

A formação de um complexo, como é descrito na presente invenção, é uma propriedade especialmente importante, porque foi descoberto que os complexos entre a chaperona PPI e uma proteína, que é essencialmente insolúvel, por exemplo sob condições de tampão fisiológicas é facilmente solúvel, por exemplo, sob condições de tampão fisiológicas. Os antígenos que são solúveis sob condições fisiológicas possuem enorme vantagem nas aplicações para diagnósticos. Podem também ser utilizados dire3>â>

tamente, por exemplo, como material padronizado. Além disso, podem ser conjugados com marcadores apropriados ou com grupos de aglutinação apropriados.

Como discutido anteriormente, a gp36 proveniente do HIV-2 possui funções similares (isto é, fusão com a membrana e entrada do vírus) e possui relevância similar para diagnóstico à da gp41 proveniente do HIV-1. Muitos problemas técnicos são discutidos neste pedido de patente utilizando a gp41 do HIV-1 como um exemplo prototípico de uma glicoproteína retroviral de superfície. Somente para a finalidade de esclarecimento, a discussão e a descrição estão centralizadas predominantemente na gp41 do HIV-1. Entretanto, considerações similares se aplicam para outras glicoproteínas retrovirais de superfície, especialmente para a gp36 do HIV-2 e para a gp21 do HTLV.

É sabido que os isolados, que ocorrem naturalmente do HIV-1 ou do HIV-2 podem compreender variações das seqüências de aminoácidos isoladas naturalmente e descritas. Tais variações que ocorrem naturalmente assim como as sinteticamente engenheiradas de rsgps de imunodeficiência de mamíferos estão também dentro do âmbito da presente invenção.

A presente invenção, em uma modalidade preferida, se refere às variações da rsgp ou da glicoproteína transmembrana do vírus da imunodeficiência humana (HIV). São divulgadas as variações que compreendem substituições de aminoácidos específicos no domínio da hélice N da gp41 do HIV-1 ou da gp36 do HIV-2.

As posições dos aminoácidos tanto dos domínios de hélice N, assim quanto de hélice C, envolvidos no contato hélice-a-hélice, são conhecidas a partir da literatura para a gp41 do HIV-1 e podem ser extrapoladas para a gp36 homóloga do HIV-2. Foi descoberto que a mutação destas posições influencia as propriedades da gp41 ou da gp36, respectivamente, especialmente no contexto de uma proteína de fusão, que compreende esta variação e um domínio de chaperona PPI.

As posições de aminoácidos a e d na projeção da roda helicoidal do zíper de leucina da gp41 são alvos preferidos para criar uma varia29

ção, de acordo com a presente invenção. Os resíduos de aminoácidos na posição a (numeração de acordo com Chan, D. C. e outros, Cell 89 (1997) 263-73) são Q552, I559, L566, I573 e I580; as posições d respectivas são I548, L555, Q562, T569 e L576.

Com a finalidade de aumentar a solubilidade sem comprometer a integridade das hélices do motivo de zíper, é preferido que as posições das mutações estejam separadas uma das outras por mais de uma volta da hélice. Este pré-requisito é satisfeito, por exemplo, por substituição dos resíduos consecutivos de a Q552, I559, L566 e I573, assim como, por exemplo, por substituição dos resíduos consecutivos de d I548, L555, Q562 e T569. Em outras palavras, os resíduos mutados são separados um dos outros por pelo menos 6 resíduos de aminoácidos do tipo selvagem, seguindo assim exatamente o motivo heptavalente. É também possível ambos os resíduos a e d dentro de uma variação, sob a condição mencionada anteriormente, em que as posições das substituições estejam separadas uma das outras por mais de uma volta da hélice.

Similarmente, foi descoberto que alterações no ectodomínio da gp36 do HIV-2 produzem uma proteína recombinante facilmente solúvel quando fundida à SlyD ou à FkpA. Aqui, as posições a são Q551, V558, L565, T572, V579 e as posições d são I547, L554, Q561, T568 e L575.

Preferencialmente, 1 a 6 aminoácidos selecionados do grupo de posições que compreende as posições Q552, I559, L566, I573, I580, I548, L555, Q562, T569 e L576 da gp41 do HIV-1 ou Q551, V558, L565, T572, V579, I547, L554, Q561, T568 e L575 da gp36 do HIV-2, respectivamente, são substituídos por um aminoácido menor ou mais hidrofílico.

Preferencialmente, as posições de aminoácidos que serão substituídas são selecionadas do grupo de posições que consiste em Q552, I559, L566, I573 e I580 do HIV-1 e do grupo que consiste em L554, Q561, T568 e L575 do HIV-2, respectivamente.

Em uma modalidade preferida, a presente invenção se refere a uma variação da gp41 do HIV-1, que compreende pelo menos uma e no máximo quatro substituições de aminoácidos nas posições selecionadas do ··· ··· ·· · · ····· ··· • · · · · · · ·· • · · · · · ·

Ml grupo de posições Leu 555, Leu 566, lie 573 e lie 580, em que estas posições são as posições conhecidas, partindo da seqüência do tipo selvagem da gp41 descrita na SEQ ID N²: 1 ou correspondem a estas posições conhecidas partindo desta, caracterizadas pelo fato de que a substituição de aminoácidos é, ou respectivamente e independentemente, selecionada do grupo que consiste em serina, treonina, asparagina, glutamina, ácido aspártico e ácido glutâmico.

Esta modalidade preferida da presente invenção se baseia na descoberta surpreendente de que podem ser fornecidas variações da gp41 do tipo selvagem, que representam melhorias significativas quando comparadas ao polipeptídeo correspondente da seqüência do tipo selvagem da gp41. As substituições de aminoácidos, que levam às variações da presente invenção, são descritas com base na composição de aminoácidos e na numeração da seqüência do tipo selvagem da gp41 que é conhecida a partir de Chan, D. C. e outros, Cell 89 (1997) 263-73 e são fornecidas na SEQ ID N²: 1.

Obviamente, as substituições de aminoácidos, descritas na presente invenção, podem ser também utilizadas para substituir aminoácidos em posições correspondentes da seqüência dentro da gp41 de outros isolados do HIV-1, conhecidos e ainda desconhecidos. O termo correspondente a uma posição é utilizado para indicar que também podem ser descobertos ou gerados isolados do HIV-1 e variações dos mesmos que compreendem aminoácidos adicionais ou com aminoácidos ausentes, que após o alinhamento das seqüências com a SEQ ID N²: 1 resulta em um número absoluto diferente para a posição da seqüência ou para o motivo da seqüência correspondente.

O alinhamento múltiplo e a comparação de uma seqüência da gp41 com a seqüência do tipo selvagem da SEQ ID N²: 1 são realizados com o programa PileUp do GCG Package Version 10.2 (Genetics Computer Group, Inc.). O PileUp cria um alinhamento múltiplo de seqüências utilizando uma simplificação do método de alinhamento progressivo de Feng, D. F. Doolittle, R. F., J Mol Evol 25 (1987) 351-60 e as matrizes de atribuição de

Ία valores para os resíduos de aminoácidos idênticos, similares ou diferentes são definidas conseqüentemente. Este processo se inicia com o alinhamento em pares das duas seqüências mais similares, produzindo um agrupamento de duas seqüências alinhadas. Este agrupamento pode ser então alinhado com a próxima seqüência mais relacionada ou com o agrupamento de seqüências alinhadas. Dois agrupamentos de seqüências podem ser alinhados através de uma simples extensão do alinhamento em par de duas seqüências individuais. O alinhamento final é conseguido através de uma série de alinhamentos em pares progressivos, que incluem seqüências e agrupamentos cada vez mais dissimilares, até que todas as seqüências tenham sido incluídas no alinhamento final em pares. As posições de aminoácidos de um novo isolado do HIV-1 ou de moléculas de gp41 engenheiradas, que correspondem às posições 555, 566, 573 e 580 da seqüência do tipo selvagem, são assim facilmente localizadas.

Uma variação preferida de um polipeptídeo da gp41 do HIV-1, de acordo com a presente invenção, é caracterizada pelo fato de que compreende uma substituição de aminoácido na posição 555, em que a Leu 555 é substituída por ácido aspártico ou por ácido glutâmico, a substituição pelo ácido glutâmico sendo a substituição mais preferida.

Uma variação preferida adicional de um polipeptídeo da gp41 do HIV-1, de acordo com a presente invenção, é caracterizada pelo fato de que compreende uma substituição de aminoácido na posição 566, em que a Leu 566 é substituída por ácido aspártico ou por ácido glutâmico, a substituição pelo ácido glutâmico sendo a substituição mais preferida.

Uma variação preferida adicional de um polipeptídeo da gp41 do HIV-1, de acordo com a presente invenção, é caracterizada pelo fato de que compreende uma substituição de aminoácido na posição 573, em que a lie 573 é substituída por serina ou por treonina, a substituição pela serina sendo a substituição mais preferida.

Uma variação preferida adicional de um polipeptídeo da gp41 do HIV-1, de acordo com a presente invenção, é caracterizada pelo fato de que compreende uma substituição de aminoácido na posição 580, em que a lie * · lí·· ·· «· · ·« ···· ·« ·· • · * · · · · · · r * · · · · • · · · · λ · ···· · · ·· ·· · · * · ·«· · ···· ·

580 é substituída por ácido aspártico ou por ácido glutâmico, a substituição pelo ácido glutâmico sendo a substituição mais preferida.

A presente invenção se refere ainda a uma variação da gp36 do HIV-2, que compreende pelo menos uma substituição de aminoácido e no máximo três substituições de aminoácidos, em uma posição selecionada do grupo de posições Leu 554, Leu 565 e Vai 579, em que estas posições são as posições conhecidas partindo da seqüência do tipo selvagem da gp36 do HIV-2 (SEQ ID N^e: 2), ou correspondem às posições conhecidas partindo desta, caracterizadas pelo fato de que o aminoácido da substituição é, ou respectivamente e independentemente, selecionado do grupo que consiste em serina, treonina, asparagina, glutamina, ácido aspártico e ácido glutâmico.

A numeração segue a seqüência do tipo selvagem (SEQ ID N^e: 2) publicada por Guyader, M. e outros, Nature 326 (1987) 662-9. As posições de aminoácidos dentro da gp36 que correspondem às posições conhecidas partindo desta seqüência são determinadas como descrito anteriormente para a gp41.

Uma variação preferida de um polipeptídeo da gp36 do HIV-2, de acordo com a presente invenção, é caracterizada pelo fato de que compreende uma substituição de aminoácido na posição 554, em que a Leu 554 é substituída por ácido aspártico ou por ácido glutâmico, a substituição pelo ácido glutâmico sendo a substituição mais preferida.

Uma variação preferida de um polipeptídeo da gp36 do HIV-2, de acordo com a presente invenção, é caracterizada pelo fato de que compreende uma substituição de aminoácido na posição 565, em que a Leu 565 é substituída por ácido aspártico ou por ácido glutâmico, a substituição pelo ácido glutâmico sendo a substituição mais preferida.

Uma variação preferida de um polipeptídeo da gp36 do HIV-2, de acordo com a presente invenção, é caracterizada pelo fato de que compreende uma substituição de aminoácido na posição 579, em que a Vai 579 é substituída por ácido aspártico ou por ácido glutâmico, a substituição pelo ácido glutâmico sendo a substituição mais preferida. Em uma modalidade

preferida, a variação da gp41 ou a variação da gp36, respectivamente, compreende substituições em duas das posições de aminoácidos, como descrito anteriormente. As variações que compreendem três substituições de aminoácidos são também preferidas. Ainda em uma modalidade adicionalmente preferida a variação da gp41 compreende substituições nas quatro posições de aminoácidos discutidas em detalhes anteriormente.

Em uma modalidade preferida, a seqüência completa da gp41 ou da gp36, respectivamente, (isto é, o ectodomínio que não possui o peptídeo de fusão e o segmento transmembrana) ou de uma proteína de envelope viral de imunodeficiência de mamíferos correspondente (por exemplo, gp21 do HTLV), é utilizada para formar um complexo com uma chaperona PPI. É também concebível utilizar fragmentos de uma glicoproteína retroviral de superfície, tal como um para a gp41 do HIV-1 descrito por Lu e outros, supra. Tais fragmentos compreendem preferencialmente a hélice C-terminal, assim como a hélice N-terminal da parte extracelular da gp41.

Uma gp41 relevante para diagnósticos, que compreende as posições de aminoácidos 535 até 681 (nomenclatura de acordo com Chan, D. C. e outros, Cell 89 (1997) 263-73), pode ser produzida através de técnicas recombinantes, de acordo com procedimentos padronizados. Como é descrito na Figura 1 de Lu e outros, supra, uma outra molécula interessante da gp41 abrange os aminoácidos 540 - 669 da molécula precursora gp160.

Como um exemplo típico para uma glicoproteína retroviral de superfície, a proteína pequena do envelope do HIV é extremamente difícil de ser manipulada e exibe propriedades bastante diferentes. Como já foi mencionado, uma das características mais críticas da molécula de e-gp41 é a sua insolubilidade em condições de tampão fisiológicas. A gp41 produzida de forma recombinante é tanto solúvel, quanto exibe uma estrutura similar à nativa em pH 3,0 e força iônica baixa. Entretanto, mesmo neste pH, permanece sensível à concentração de sais no tampão. Dependendo do sal utilizado, a gp41 precipita na presença de mais de 100 a 500 mM de sal. Como será discutido em maiores detalhes abaixo, esta pode ser (novamente) solubilizada (na forma desnaturada) por agentes caotrópicos.

Entende-se geralmente que as condições de tampão fisiológicas correspondam às condições de sais e de pH encontradas no plasma ou no soro de animais e são definidas por um valor de pH em torno de 7,4 e uma concentração de sais de aproximadamente 150 mM. O complexo rsgpchaperona, de acordo com a presente invenção, é facilmente solúvel sob estas condições de tampão. A rsgp presente ali é imunologicamente ativa, indicando assim uma estrutura similar à nativa. Enquanto a gp41 na ausência de, ou sem o pré-tratamento com um detergente apropriado é essencialmente insolúvel sob condições de tampão fisiológicas (por exemplo, fosfato de sódio 20 mM pH 7,4, NaCI 150 mM), o complexo descrito de acordo com esta invenção é facilmente solúvel após o redobramento de acordo com o protocolo apropriado. O ectodomínio da gp41, que é compreendido no complexo da invenção, é solúvel pelo menos em uma concentração de 100 nM, preferencialmente em uma concentração de 1 μΜ e superior, mais preferido em 10 μΜ ou superior. Assim, a solubilidade é substancialmente maior partindo de concentrações subnanomolares até aproximadamente micromolares.

Para um melhor entendimento do âmbito da presente invenção, é necessário enfatizar que as condições de tampão aplicadas para a solubilização e para a renaturação podem ser modificadas, quando necessário e apropriado, e não devem ser entendidas como uma restrição indevida da invenção, que é realizada de forma bem sucedida ao longo de uma faixa ampla de condições de tampão.

A concentração total de sais do tampão fisiológico não é crítica, contanto que sejam tomados cuidados para que o complexo chaperonagp41 não se dissocie e que a gp41 permaneça em solução. Preferencialmente o tampão fisiológico compreende pelo menos 10 mM do sistema tamponante e no máximo 200 mM. O resto dos constituintes do tampão, se algum, podem ser um sal sem capacidade tamponante significativa, por exemplo, cloreto de sódio. O tampão fisiológico possui preferencialmente uma concentração de sal entre 20 e 500 mM, mais preferido entre 50 e 300 mM e mais preferido entre 100 e 200 mM.

Μ6

Em um processo, de acordo com a presente invenção, o tampão fisiológico pode ser variado para possuir um valor de pH na faixa de 5,0 até 8,5; mais preferencialmente, a faixa de tal tampão está entre pH 5,5 e pH 8,3. Ainda mais preferido, tais condições de tampão fisiológicas são definidas pelas concentrações de sais que são fornecidas anteriormente e um valor de pH entre 6,0 e 8,0; mais preferencialmente, o pH de tal tampão fisiológico fica entre 6,5 e 7,8.

De acordo com um processo que é descrito na presente invenção, uma glicoproteína retroviral de superfície é solubilizada sob condições de tampão não-fisiológicas, a chaperona é adicionada (ou já está presente na forma de um domínio protéico adicional ligado de forma covalente) e a mistura que compreende a glicoproteína retroviral de superfície solubilizada e a chaperona é então ajustada para condições de tampão fisiológicas. Enquanto uma glicoproteína retroviral de superfície sozinha iria precipitar espontaneamente quando isso fosse feito, surpreendentemente esta permanece em solução no processo acima. É mais provável que esta descoberta importante seja por causa da formação de um complexo entre a glicoproteína retroviral de superfície e a chaperona.

No caso da produção recombinante da gp41 em E. coli, a gp41 produzida de forma recombinante é obtida na forma de corpos de inclusão. Este material é solubilizado utilizando um reagente altamente caotrópico, por exemplo, tiocianato de guanidínio 7,0 Μ. O polipeptídeo da gp41 fica muito desestruturado sob estas condições. Alterando o tampão em etapas apropriadas para ácido fórmico 30 mM em pH 3,0, a gp41 em solução assume o que é percebido como sua estrutura toda em hélice, similar à nativa. Uma forma fácil de monitorar o estado do dobramento correto ou incorreto de uma proteína é analisar o espectro de CD correspondente nas regiões amídicas (185 - 250 nm) e aromáticas (260 - 320 nm). Além disso, a informação sobre as partículas que difundem a luz (como os agregados) pode ser facilmente obtida partindo de espectros de UV padronizados.

O que é importante enfatizar aqui é o fato de que a glicoproteína retroviral de superfície dentro do complexo glicoproteína retroviral de super36

fície-chaperona, de acordo com a presente invenção, adota o que é considerado como sendo um dobramento similar ao nativo. Pelo contrário, a glicoproteína retroviral de superfície, que foi solubilizada em pH neutro por agentes caotrópicos, fica muito desestruturada, perdendo assim os epítopos com a conformação desejada. É também possível solubilizar uma glicoproteína retroviral de superfície alternativamente utilizando detergentes. Por exemplo, o dodecil sulfato de sódio (SDS) foi utilizado de forma bem sucedida para solubilizar a gp41. Entretanto, tal material solubilizado pelo SDS não é o material de escolha, por exemplo, para uso em um ensaio imunológico para a detecção de anticorpos para a gp41. Além disso (como discutido anteriormente), tais ensaios imunológicos preferencialmente também detectam anticorpos para epítopos conformacionais da gp41 e não pode ser excluído que os detergentes parcialmente anulam os epítopos conformacionais.

Preferencialmente, o complexo rsgp-chaperona de acordo com a presente invenção, é caracterizado pela rsgp estando dobrada de forma similar à nativa. A rsgp dobrada de forma similar à nativa dentro de tal complexo, por exemplo, exibe as características imunológicas ou físicas requeridas.

O dobramento similar ao nativo é preferencialmente analisado através da espectroscopia de UV CD próxima, que se refere aos contatos terciários dentro de proteínas globulares compactas. É sabido que a gp41 é facilmente solúvel em pH aproximadamente 3,0 e em uma concentração de sais de baixa força iônica. Os dados de UV CD próximo demonstram que sob tais condições de tampão, a gp41 exibe um sinal de capacidade elíptica característico com a assinatura típica de uma proteína globular dobrada de forma similar à nativa. Como é mostrado na Figura 5, a parte da gp41 de um peptídeo de fusão que compreende a gp41 e a FkpA, exibe este espectro de UV CD próximo típico em tampão ácido. Sob condições de tampão fiosiológicas, o espectro de UV CD próximo de um complexo solúvel, de acordo com a presente invenção, é composto tanto dos espectros da chaperona dobrada corretamente, quanto da gp41 dobrada de forma similar à nativa.

....................

Η'ΐ

Isto é mostrado para a proteína de fusão FkpA-gp41, na Figura 7.

Em uma modalidade preferida, de acordo com a presente invenção, o dobramento similar ao nativo da gp41 em um complexo gp41chaperona é avaliado através da análise do UV CD próximo. É preferido que este UV CD próximo seja utilizado para demonstrar que ambas as moléculas da gp41 e da chaperona estejam dobradas de forma similar à nativa.

A produção do complexo solúvel chaperona-gp41 se inicia partindo de condições de tampão não-fisiológicas. No caso da formação de complexos entre a chaperona livre e uma proteína alvo livre (por exemplo, a gp41 do HIV-1), o tampão não-fisiológico tem que satisfazer dois requerimentos, que (a) a gp41 esteja presente em sua estrutura ácida similar à nativa e (b) a chaperona PPI seja pelo menos parcialmente funcional (isto é, competente em relação à ligação). Partindo de tais condições de tampão, a chaperona se liga à proteína amiloidogênica e é possível uma alteração das condições de tampão, partindo das não-fisiológicas para condições mais ou menos fisiológicas, sem a precipitação da proteína amiloidogênica.

Enquanto as chaperonas se ligam geralmente a proteínas desnaturadas e atuam sobre as mesmas, facilitando desta maneira o seu (re)dobramento correto, a situação em que a presente invenção está baseada é surpreendentemente diferente. A gp41 solubilizada sob condições de tampão não-fisiológicas apropriadas parece estar presente em uma forma similar à nativa (cf. Figuras 1A e 1B e Figura 5). Diferente da visão costumeira das funções das chaperonas, no método da invenção a chaperona parece se ligar à proteína dobrada de forma similar à nativa e estabilizar esta proteína em condições de tampão, sob as quais a gp41 é diferentemente insolúvel e precipita.

Em uma modalidade preferida, de acordo com a presente invenção, a chaperona PPI é selecionada do grupo que compreende FkpA, SlyD e o fator de ativação.

Foi descoberto que especialmente a FkpA ou a SlyD aumentam a solubilidade da gp41 e formam complexos bastante estáveis com esta. Uma modalidade adicionalmente preferida, portanto é caracterizada pelo fato

de que a chaperona é selecionada do grupo que compreende a FkpA e a SlyD. A mais preferida é a chaperona FkpA.

Como é descrito adicionalmente acima, fragmentos de chaperonas também podem ser utilizados para exercer a função desejada. No caso de chaperonas modulares, como as FKBPs, que compreendem um módulo catalítico e um módulo de aglutinação, é preferido que tais fragmentos compreendam pelo menos o domínio de aglutinação ou que estes fragmentos exibam pelo menos essencialmente uma função comparável com o domínio de aglutinação.

A FKBP12 é um membro humano da família FKBP e compreende essencialmente o domínio da isomerase catalítica de uma PPIase. Uma vez que não possui um domínio adicional de aglutinação ao polipeptídeo, exibe uma afinidade de aglutinação significativamente reduzida para substratos protéicos não-dobrados ou parcialmente dobrados quando comparada com outros membros da família FKBP. Foi mostrado que o desdobramento e o redobramento da FKBP12 é um processo reversível (Egan, D. A. e outros, Biochemistry 32 (1993) 1920-7; Scholz, C. e outros, J Biol Chem 271 (1996) 12703-7). Foi descoberto que o redobramento e o desdobramento da FkpA (25-270) e da SlyD (1-165) são ambos reversíveis, satisfazendo um requisito importante do processo descrito aqui.

Em uma modalidade preferida, a presente invenção se refere a um complexo solúvel, que compreende a gp41 e uma chaperona selecionada da família FKBP.

Como descrito anteriormente, tais complexos solúveis, que compreendem a gp41 do HIV-1 ou um homólogo derivado de um outro vírus de imunodeficiência de mamífero, podem ser facilmente preparados através da mistura da chaperona PPI (por exemplo, produzidos através de técnicas recombinantes) e uma gp41 produzida de forma recombinante. O complexo é então formado entre duas moléculas independentes, isto é, intermolecularmente.

A formação dos complexos é um processo dinâmico, em que a dissociação e a reassociação ocorrem em paralelo. Isto é verdadeiro para a

'SO associação tanto intermolecular, quanto intramolecular (por exemplo, em um constructo de fusão), entre, por exemplo, FkpA e gp41. Uma vez que a gp41 precipita imediatamente e quantitativamente partindo de uma solução tamponante fisiológica, foram escolhidas concentrações de ambos os parceiros que garantem que somente uma concentração não-crítica ou que não se agrega da gp41 na forma livre esteja presente e que a grande maioria da gp41 esteja ligada e estabilizada na forma de um complexo gp41-chaperona.

Dependendo da chaperona utilizada, foi descoberto que era necessário misturar em uma base molar pelo menos 2 vezes mais chaperonas quando comparadas às moléculas da gp41. Em uma modalidade preferida, a invenção, se refere portanto, a um reagente que compreende uma mistura da gp41 e uma chaperona, preferencialmente FkpA. Preferencialmente tal mistura contém FkpA em um excesso molar, que é comparado à gp41. É preferido que 3 a 10 vezes mais FkpA estejam presentes. A proporção molar mais preferida da FkpA em relação à gp41 fica entre 4 e 6.

Foi também descoberto que a formação de um complexo intramolecular, por exemplo, entre os domínios diferentes de uma proteína que compreende ligados covalentemente pelo menos um domínio da rsgp e pelo menos um domínio da chaperona PPI, leva a efeitos vantajosos adicionais, por exemplo, em termos de estabilidade e facilidade de produção. Foi descoberto, por exemplo, que uma proporção de 1:1 (rsgp em relação à chaperona) é suficiente para formar o complexo solúvel, se ambos os domínios estiverem ligados covalentemente.

Um complexo solúvel, que compreende uma glicoproteína retroviral de superfície e uma chaperona em uma forma ligada de forma covalentemente, representa uma modalidade adicionalmente preferida, de acordo com a presente invenção. As rsgps mais preferidas em tal polipeptideo recombinante são a gp41 do HIV-1 e a gp36 do HIV-2.

Para uma proteína recombinante, que compreende pelo menos um domínio de rsgp e pelo menos um domínio de chaperona PPI, a transferência de condições de tampão não-fisiológicas para fisiológicas pode ser realizada de formas diferentes. Os complexos intramoleculares solúveis en40

tre a gp41 e a FkpA são facilmente obtidos através do ajuste das condições de tampão não-fisiológicas para condições de tampão fisiológicas, através de diálise, diluição rápida ou redobramento auxiliado por matriz. A mistura que compreende o complexo solúvel gp41-chaperona pode ser utilizada diretamente para a modificação.

Um complexo solúvel que compreende, por exemplo, a gp41 e uma chaperona PPI, de acordo com a presente invenção, pode ser também produzido partindo de um polipeptídeo que compreende ambos os domínios protéicos (gp41 e chaperona) obtidos através de técnicas recombinantes. O complexo gp41-chaperona contido aqui é de natureza intramolecular. Preferencialmente, o polipeptídeo recombinante, de acordo com a presente invenção, compreende a gp41 e uma chaperona, ou a gp36 e uma chaperona. Ainda em uma modalidade adicionalmente preferida, a presente invenção se refere a uma proteína recombinante, que compreende pelo menos um domínio da rsgp e pelo menos dois domínios da chaperona PPI. Os polipeptídeos recombinantes que compreendem um domínio rsgp e duas chaperonas PPI são também preferidos.

O polipeptídeo recombinante utilizado para a obtenção de um complexo solúvel gp41-chaperona, de acordo com a presente invenção, é expresso, aplicando técnicas padronizadas de biologia molecular. Preferencialmente o gene da chaperona é colocado em quadro a montante do gene da proteína alvo, em um vetor de expressão que compreende tanto a informação genética para a gp41, quanto para a chaperona, e opcionalmente também a informação genética para uma seqüência ligante peptídica apropriada. Um hospedeiro preferido para a produção em grande escala de tal proteína de fusão recombinante é a E coli.

Em uma modalidade preferida, a presente invenção se refere a um complexo solúvel que compreende a gp41 ou a gp36, respectivamente, e uma chaperona selecionada da classe peptidil prolil isomerase de chaperonas. É ainda adicionaimente preferido que este complexo solúvel seja um complexo intramolecular, preferencialmente um complexo intramolecular dentro de um polipeptídeo recombinante que compreende a gp41 ou a gp36 ··· ··· ·· ·· · ·· ···· ·· ·· • · · · ·· ···· « · · ·· · • * ·· · · · · «···· · · t ··♦ · * · · ··· · ···· · • · · r · · · · · · · · · e uma chaperona PPI. Mais preferencialmente, a parte da chaperona PPI do polipeptídeo recombinante não possui qualquer peptídeo sinal de exportação (da molécula precursora correspondente) e corresponde à chaperona PPI madura. Uma vez que nesta modalidade preferida a proteína recombinante não possui uma seqüência sinal funcional, o produto gênico se acumula no citosol bacteriano.

Uma característica surpreendente da gp41, compreendida em um FkpA-gp41 produzido de forma recombinante, é sua solubilidade excepcional, quando comparada à do ectodomínio da gp41 sem chaperona. É interessante que o material caotrópico (isto é, FkpA-gp41 em GuHCI 6,07,0 M) pode ser redobrado de formas diferentes, todas resultando em uma forma similar à nativa, termodinamicamente estável e solúvel. O redobramento é conseguido em altos rendimentos, tanto através da diálise quanto através da diluição rápida, assim como através da cromatografia de exclusão de tamanho renaturante ou do redobramento auxiliado por matriz. Estas descobertas sugerem que nesta forma ligada covalentemente, o polipeptídeo de fusão gp41-FkpA é uma proteína termodinamicamente estável, ao invés de metaestável.

O polipeptídeo FkpA-gp41 recombinante compreende dois do20 mínios protéicos que possuem requerimentos de dobramento diferentes. Uma vez que o protocolo de purificação inclui uma etapa inicial de desnaturação, é obrigatório que o dobramento da chaperona seja reversível. Na verdade, há uma evidência espectroscópica obrigatória para o redobramento reversível e independente tanto da FkpA, quanto da gp41, dentro do com25 plexo protéico ligado covalentemente. Foi também descoberto que o redobramento de uma SlyD truncada no C-terminal era reversível.

Também é preferido um polipeptídeo recombinante, que compreende uma glicoproteína retroviral de superfície e uma chaperona, que compreende adicionalmente uma seqüência ligante peptídica apropriada entre estes dois domínios polipeptídicos. Tal seqüência ligante peptídica é selecionada para garantir a associação intramoiecular ótima da rsgp e o domínio da chaperona utilizado. Preferencialmente, tal seqüência ligante pos42

··· ·· • · · · • · · • ·· ···· · · ·· • ·· · · · · ·· · • · · · ··· · · ·· • · · ····· · sui aproximadamente 20 aminoácidos de comprimento e compreende aminoácidos que sustentam tanto a flexibilidade quanto a solubilidade, tais como por exemplo, a glicina e a serina. Preferencialmente o ligante possui 10 até 50 aminoácidos de comprimento. Mais preferencialmente, o comprimento é de 12 até 40 aminoácidos e mais preferencialmente, o ligante compreende 15 até 35 aminoácidos. Tanto a rsgp quanto a chaperona estão sempre em grande proximidade (mantidas juntas, por exemplo, através de um ligante apropriado). Em uma modalidade preferida o polipeptídeo recombinante compreende a FkpA madura ligada à sua proteína alvo através de um ligante flexível. Isto, como os dados indicam, produz um efeito estabilizador adicional.

Foi descoberto de forma surpreendente que a gp41, como parte do complexo intramolecular entre uma chaperona PPI e a gp41, é tanto solúvel quanto estável. O mesmo se mantém verdadeiro para um complexo intramolecular que compreende uma chaperona PPI e a gp36, ou uma chaperona PPI e a gp21 do HTLV. A maior estabilidade da gp41 em tal complexo produz vantagens adicionais. Por exemplo, é possível obter uma molécula gp41-chaperona recombinante completamente renaturada muito facilmente. A proteína recombinante é inicialmente solubilizada através de tratamento com um agente caotrópico (por exemplo, cloreto de guanidínio). Simplesmente passando o material solubilizado através de uma coluna de filtração em gel, equilibrada com o tampão fisiológico apropriado, pode ser obtida uma proteína completamente renaturada que compreende os domínios protéicos ligados covalentemente (cf. Exemplo 2.3 e Figuras 7 e 8).

O complexo intramolecular solúvel gp41-chaperona exibe ainda uma vantagem adicional surpreendente: é bastante estável contra os efeitos desnaturantes dos detergentes. Estes efeitos se tornam ainda mais pronunciados, se a proteína de fusão contiver duas chaperonas e uma gp41 ou uma gp36, respectivamente. A maioria dos ensaios imunológicos é realizada na presença de detergentes, com a finalidade de reduzir, e pelo menos parcialmente evitar, os problemas causados pela aglutinação não-específica. No caso do diagnóstico para HIV, são utilizados detergentes bastante fortes pela razão mencionada acima, mas também para desintegrar e romper partículas virais e assim facilitar a detecção de antígenos virais, como o gp24.

O ectodomínio da gp41 produzido de forma recombinante solubilizado pelo SDS (dodecil sulfato de sódio) não é imunorreativo em um tampão de ensaio utilizado rotineiramente, por exemplo na detecção de anticorpos anti-HIV ou do antígeno p24 (cf. Figura 9). Sob as mesmas condições de tampão, entretanto, a gp41, que é parte de um complexo intramolecular com uma chaperona PPI, de acordo com esta invenção, é fortemente imunorreativa. Como pode ser observado na Figura 9, sob as mesmas condições de ensaio e com o soro do mesmo paciente, este material fornece curvas de competição excelentes, que podem ser explicadas apenas pela presença de uma gp41 solúvel similar à nativa, que em adição é estável na presença do detergente testado.

É uma característica muito importante do complexo, de acordo com a presente invenção, que a rsgp dentro do complexo solúvel rsgpchaperona esteja dobrada, de forma similar à nativa, sob condições de tampão fisiológicas, por exemplo, em pH 7,4 em tampão fosfato 20 mM cloreto de sódio 150 mM. Esta é uma enorme vantagem para aplicações terapêuticas, assim como de diagnósticos. Em uma modalidade preferida, a presente invenção se refere a uma composição de reagentes que é solúvel sob condições de tampão fisiológicas, que compreende um complexo intra ou intermolecular compreendendo uma glicoproteína retroviral de superfície e uma chaperona selecionada da classe peptidil prolil isomerase de chaperonas.

Um complexo solúvel que compreende a gp41 do HIV-1 dobrada de forma similar à nativa e uma chaperona selecionada da classe peptidil prolil isomerase de chaperonas representa, portanto, uma modalidade muito preferida da presente invenção.

Um complexo solúvel que compreende a gp36 do HIV-2 dobrada de forma similar à nativa e uma chaperona selecionada da classe peptidil prolil isomerase de chaperonas representa, portanto, também uma modalidade muito preferida da presente invenção.

Em termos de terapia, o progresso feito através do fornecimento

de uma gp41 ou de uma gp36 solúvel e dobrada de forma similar à nativa, respectivamente, é bastante óbvio. Pela primeira vez, por exemplo, a gp41 está agora disponível para injeção, sob condições de tampão fisiológicas.

Em uma modalidade preferida, o complexo solúvel descrito é utilizado para produzir uma composição de reagentes para uso como um medicamento. A composição de reagentes compreende o complexo gp41chaperona junto com excipientes aceitáveis fisiologicamente e, quando apropriado, aditivos adequados e/ou substâncias auxiliares convencionais.

É sabido que peptídeos derivados da repetição heptavalente da gp41 ou da hélice C-terminal da gp41 possuem atividade antiviral (Wild, C. e outros, Proc Natl Acad Sei USA 89 (1992) 10537-41). Estes impedem a entrada do vírus, interagindo especifica mente com um assim chamado intermediário em grampo da gp41 (para revisão veja Doms, R. W. e Moore, J. P., J Cell Biol 151 (2000) F9-14). Foi descoberto que um complexo rsgpchaperona, de acordo com a presente invenção, exibe atividade antiviral. A composição de reagentes contendo o complexo gp41-chaperona ou um complexo gp36-chaperona ou ambos em uma dose eficiente terapeuticamente, em uma primeira aplicação terapêutica preferida, é utilizada para prevenir a entrada do HIV e o espalhamento do HIV dentro do organismo hospedeiro (inibição da entrada do vírus).

Isto representa uma aplicação terapêutica preferida adicional de uma composição de reagentes que compreende um complexo gp41chaperona, utilizar tal composição para ativar uma resposta imunológica em um mamífero. O complexo descrito torna disponíveis muitos mais epítopos de gp41 do que qualquer outro imunógeno do HIV conhecido, cf., por exemplo, Root e outros, supra. Espera-se, portanto, que o novo imunógeno induza uma resposta imunológica mais ampla.

Em relação aos procedimentos para diagnóstico, as vantagens óbvias de um complexo solúvel rsgp-chaperona, de acordo com a presente invenção, são, por exemplo, a maior estabilidade de uma glicoproteína retroviral de superfície, tal como a gp41 sob condições de tampão fisiológicas e/ou o aumento na sensibilidade do diagnóstico e/ou os números maiores de epítopos conformacionais presentes e/ou a possibilidade de marcar facilmente uma rsgp dobrada corretamente, como a gp41.

Os marcadores bem-conhecidos são os grupos marcadores ou os grupos efetores, como os grupos de aglutinação à fase sólida. Um complexo solúvel rsgp-chaperona marcado representa uma modalidade adicionalmente preferida, de acordo com a presente invenção.

O grupo marcador pode ser selecionado de quaisquer grupos marcadores detectáveis conhecidos, tais como corantes, grupos marcadores luminescentes, tais como grupos quimioluminescentes, por exemplo, ésteres acridínio ou dioxetanos ou corantes fluorescentes, por exemplo, fluoresceína, cumarina, rodamina, oxazina, resorufina, cianina e derivados dos mesmos. Outros exemplos de grupos marcadores são complexos metálicos luminescentes, tais como complexos de rutênio ou de európio, enzimas, por exemplo, que são utilizadas para ELISA ou para CEDIA (Ensaio Imunológico com Doador de Enzima Clonada, por exemplo, EP-A-0 061 888) e radioisótopos.

Os grupos efetores compreendem, por exemplo, um parceiro de um par de aglutinação da bioafina. Enquanto se realiza um ensaio, o grupo efetor interage, especificamente e preferencialmente de forma não-covalente com o outro parceiro do par de aglutinação da bioafina. Os exemplos de pares de aglutinação adequados são hapteno ou antígeno/anticorpo, biotina ou análogos da biotina, tal como aminobiotina, iminobiotina ou destiobiotina/avidina ou estreptavidina, açúcar/lectina, ácido nucléico ou análogo de ácido nucléico/ácido nucléico complementar e receptor/ligante, por exemplo, receptor para hormônio esteróide/hormônio esteróide. Os membros preferidos do par de aglutinação compreende hapteno, antígeno e hormônio. São especialmente preferidos os haptenos, como a digoxina e a biotina e análogos dos mesmos.

O complexo solúvel que compreende a rsgp e uma chaperona PPI é preferencialmente utilizado em um ensaio imunológico para a detecção de anticorpos para a rsgp. Preferencialmente são utilizados os complexos gp41- e/ou gp36-chaperona. Em uma modalidade muito preferida, um όΥ

complexo solúvel marcado, que compreende a gp41 e uma chaperona PPI, é utilizado em um ensaio imunológico para a detecção de anticorpos para a gp41. Mais preferencialmente, o complexo marcado é um complexo intramolecular dentro de um polipeptídeo recombinante que compreende a chaperona PPI e a gp41.

Os ensaios imunológicos são bem-conhecidos pelo versado na técnica. Os métodos para realizar tais ensaios, assim como as aplicações práticas e os procedimentos, estão resumidos nos livros texto relacionados. Os exemplos de livros texto relacionados são Tijssen, P., Preparation of enzym-antibody or other enzyme-macromolecule conjugates em Pratice and theory of enzyme immunoassays (1990) 221-278, Eds. R. H. Burdon e v. P. H. Knippenberg, Elsevier, Amsterdã) e vários volumes de Tijssen, em Methods in Enzymology (1980), Eds. S. P. Colowick, N. O. Caplan e S. P., Academic Press), lidando com métodos de detecção imunológica, especialmente os volumes 70, 73, 74, 84, 92 e 121.

O novo complexo solúvel rsgp-chaperona PPI pode ser utilizado para melhorar os ensaios para a detecção de anticorpos anti-HIV, independentemente do modo de detecção (por exemplo, ensaio com radioisótopos, ensaio imunológico com enzima, ensaio eletroquimioluminescente etc) ou do princípio do ensaio (por exemplo, ensaio de teste em tiras, ensaio de sanduíche ou ensaio homogêneo etc).

Para a detecção precoce confiável e sensível de uma infecção causada pelo HIV, é essencial medir tanto o antígeno viral, assim como o anticorpo antiviral, em amostras de fluidos corporais. O complexo solúvel de acordo com a presente invenção, possibilita a detecção de anticorpos antigp41 e/ou anti-gp36, em condições de tampão fisiológicas. A detecção de anticorpos anti-gp41 e/ou anti-gp36 é uma parte valiosa de tais sistemas combinados de detecção do HIV. Em uma modalidade preferida, a presente invenção se refere, portanto, a sistemas de detecção do HIV que compreendem a detecção de anticorpos anti-gp41 e/ou anti-gp36 com base no uso de um complexo gp41 e/ou gp36 chaperona. Mais preferencialmente, a detecção de anticorpos anti-gp41 e/ou anti-gp36, com base em tal complexo, é realizada junto com a detecção de um antígeno do HIV, preferencialmente o antígeno p24.

Como é conhecido na técnica, os anticorpos para os agentes infecciosos, tais como bactérias, fungos ou vírus, são preferencialmente detectados através de um ensaio realizado de acordo com o conceito de ponte de antígenos duplos (algumas vezes este conceito de ensaio é também denominado conceito de ponte de antígenos duplos, porque os dois antígenos formam uma ponte com um anticorpo). Em tal ensaio, a capacidade de um anticorpo se aglutinar pelo menos a duas moléculas diferentes de um certo antígeno, com seus dois (IgG, IgA, IgE) ou 10 (IgM) paratopos, é necessária e utilizada.

A detecção de anticorpo dos fluidos corporais, de acordo com o conceito de ponte, pode ser realizada em muitos ajustes de ensaios diferentes. Um ajuste simples compreende o revestimento direto de um antígeno em uma fase sólida e o uso do mesmo antígeno em uma forma marcada. Sob condições de ensaio apropriadas, um anticorpo em uma amostra forma uma ponte entre o antígeno ligado à fase sólida e o antígeno marcado. Portanto, somente se o anticorpo sob investigação estiver presente na amostra é formada uma ponte e pode ser detectado um sinal.

As estruturas básicas do antígeno em fase sólida e do antígeno de detecção são preferencialmente as mesmas. Por exemplo, um polipeptídeo que compreende um ou vários epítopos pode ser utilizado diretamente ou indiretamente, revestido em uma fase sólida, e o mesmo polipeptídeo sintético, entretanto, ligado a uma marcação ou agente marcador, é utilizado como o antígeno de detecção. É também possível utilizar antígenos similares porém diferentes, que reagem imunologicamente de forma cruzada em um ensaio de ponte de antígenos duplos. O requerimento essencial para a realização de tais ensaios é que o epítopo relevante ou os epítopos relevantes estejam presentes em ambos os antígenos. Obviamente, há muitas variações do formato de ensaio de ponte de antígenos duplos. Tais variações compreendem, por exemplo, o revestimento indireto de um antígeno em uma fase sólida. Preferencialmente, um par de aglutinação específica,

mais preferencialmente o sistema biotina-estreptavidina (ou -avidina), é utilizado para se aglutinar indiretamente a um antígeno em uma fase sólida. Por outro lado, o antígeno utilizado para a detecção em tal sistema pode não carregar diretamente um marcador (por exemplo, um radioisótopo, uma enzima, uma molécula fluorescente etc), mas ao invés disso pode ser detectado indiretamente, por exemplo, carregando um hapteno (por exemplo, a digoxina). Tal detecção indireta então, por exemplo, pode ser realizada através de um anticorpo antidigoxina marcado.

Em uma modalidade preferida, a presente invenção se refere a um ensaio imunológico de acordo com o conceito de ponte de antígenos duplos, que compreende: um primeiro antígeno que compreende um primeiro complexo chaperona-antígeno e um segundo antígeno que compreende um segundo complexo chaperona-antígeno.

Em uma modalidade adicionalmente preferida, a presente invenção se refere a um ensaio imunológico de acordo com o conceito de ponte de antígenos duplos, caracterizado pelo fato de que é utilizado um primeiro complexo chaperona-antígeno como um antígeno de captura e é utilizado um segundo complexo chaperona-antígeno como o antígeno de detecção.

Os complexos chaperona-antígeno, que são descritos na presente invenção, não somente provocam a solubilidade de vários polipeptídeos que são de outra forma difíceis de serem manipulados, mas também são responsáveis por um ensaio imunológico muito vantajoso, de acordo com o conceito de ponte de antígenos duplos.

É uma característica especialmente atraente de tal ensaio imunológico, de acordo com o conceito de ponte de antígenos duplos, que é agora possível utilizar chaperonas diferentes para a formação de complexos com o antígeno ligado à fase sólida e para a formação de complexos com o antígeno de detecção, respectivamente. Tal modificação de um ensaio melhora adicionalmente o problema de aglutinação não-específica. Os anticorpos em uma amostra, que poderíam ser reativos a uma chaperona e assim poderíam causar um sinal falso positivo, não formarão uma ponte, se chaperonas diferentes forem utilizadas para complexar o antígeno da fase sólida e

(èO o antígeno de detecção, respectiva mente. Portanto, neste modo da invenção, a probabilidade de um sinal positivo causado pela ligação nãoespecífica é enormemente reduzida. Em uma modalidade preferida, a presente invenção se refere, portanto, a um ensaio imunológico de acordo com o conceito de ponte de antígenos duplos que é caracterizado pelo fato de que a primeira chaperona e a segunda chaperona de um primeiro e de um segundo complexo chaperona-antígeno diferem uma da outra.

A maioria das chaperonas que são mais bem caracterizadas foi isolada de Escherichia coli, que é amplamente utilizada na pesquisa biotecnológica. Uma vez que a Escherichia coli é uma espécie bacteriana amplamente distribuída, muitos mamíferos desenvolveram anticorpos contra as proteínas derivadas desta bactéria. Com a finalidade de reduzir a probabilidade de reações falso positivas causadas por tais anticorpos, é preferido utilizar pelo menos uma chaperona PPI derivada de uma espécie bacteriana diferente, preferencialmente de uma termofílica. Preferencialmente, a chaperona é derivada de bactérias extremofílicas, especialmente do grupo de bactérias que compreende Thermatoga marítima, Aquifex aeolicus e Thermus thermophilus.

O uso de um complexo chaperona-antígeno em um ensaio imunológico, em geral e preferencialmente em um ensaio imunológico de acordo com o conceito de ponte, fornece também a possibilidade de derivatizar a chaperona de tal complexo e não requer a modificação do próprio antígeno. É geralmente aceito que a modificação de um polipeptídeo por um segundo grupamento químico, por exemplo, o acoplamento de uma marcação a tal molécula, inclua o risco de influenciar negativamente o polipeptídeo. Por exemplo, o epítopo sob investigação pode ser comprometido ou pode ser causada uma ligação não-específica por tal marcação. De acordo com a presente invenção, é agora possível derivatizar especificamente a chaperona dentro de um complexo chaperona-antígeno.

Em uma modalidade preferida, um ensaio imunológico de acordo com o conceito de ponte de antígenos duplos é adicionalmente caracterizado pelo fato de que o primeiro complexo chaperona-antígeno utilizado como

Gi··· ··· ·· • * · · o antígeno de captura compreende um grupo de ligação à fase sólida.

Em uma modalidade preferida, é realizado um ensaio imunológico de acordo com o conceito de ponte, que é caracterizado ainda pelo fato de que o segundo complexo chaperona-antígeno, utilizado como o antígeno de detecção, compreende um grupo marcador.

Em uma outra modalidade preferida, um complexo solúvel que compreende a rsgp e uma chaperona PPI, tal como os complexos gp41e/ou gp36-chaperona, pode ser ainda utilizado para ativar uma resposta imunológica em um indivíduo, tal como um ser humano ou um animal não humano. Os complexos solúveis podem ser administrados a um indivíduo em composições, tais como aquelas que podem conter um excipiente ou um veículo. Tais composições podem incluir ainda um adjuvante. Os exemplos de adjuvantes convencionais incluem, mas não estão limitados ao adjuvante incompleto de Freund, ao adjuvante completo de Freund, Merck 65, AS-2, alúmen, fosfato de alumínio, géis minerais, tais como hidróxido de alumínio e substâncias tensoativas, tais como lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos, emulsões oleosas, hemocianina da lapa buraco de fechadura e dinitrofenol. Outros adjuvantes úteis incluem, mas não estão limitados aos polissacarídeos capsulares bacterianos, ao dextrano, à IL-12, ao GM-CSF, ao ligante CD40, ao IFN-γ, à IL-1, à IL-2, à IL-3, à IL-4, à IL-10, à IL-13, à IL18 ou qualquer citocina ou fragmento de DNA bacteriano.

Pode ser fornecida uma dose (administração) de uma composição do complexo solúvel. Entretanto, a primeira administração pode ser seguida por doses de reforço, tais como uma, duas, três vezes ou mais. O número de doses administradas a um indivíduo depende em parte da resposta de um indivíduo a uma composição do complexo solúvel. Dentro do âmbito da presente invenção, um número adequado de doses inclui qualquer número necessário para imunizar um animal ao complexo solúvel.

Uma segunda administração (reforço) da composição do complexo solúvel pode ser fornecida entre aproximadamente 7 dias e 1 ano após a^primeira administração. O período de tempo entre a primeira e a segunda administração pode ser de 14 dias até 6 meses, 21 dias e 3 meses, fre51 qüentemente entre aproximadamente 28 dias e 2 meses após a administração original. Uma terceira administração (segundo reforço) pode ser fornecida entre aproximadamente 14 dias e 10 anos após a primeira administração, por exemplo, entre aproximadamente 14 dias e 3 anos, freqüentemente entre aproximadamente 21 dias e 1 ano, muito freqüentemente entre aproximadamente 28 dias e 6 meses após a primeira administração. Os reforços subseqüentes podem ser administrados em intervalos de duas semanas ou intervalos de 1 mês, 3 meses ou 6 meses, até 10 anos.

Tipicamente, será administrada a um indivíduo a quantidade de complexo solúvel que é suficiente para imunizar um animal contra um antígeno (isto é, uma dose eficiente imunologicamente ou uma dose terapeuticamente eficiente). Uma quantidade adequada para atingir uma dose eficiente imunologicamente dependerá em parte do peso e da condição geral da saúde do indivíduo e do julgamento do médico prescrevente ou de outra pessoa qualificada.

A dose eficiente do complexo solúvel pode ser formulada em modelos animais para atingir uma indução de uma resposta imunológica; tais dados podem ser utilizados para otimizar facilmente a administração a seres humanos, com base nos dados dos animais. Uma dose estará tipicamente entre aproximadamente 1 fg e aproximadamente 100 pg, freqüentemente entre aproximadamente 1 pg e aproximadamente 100 pg, mais freqüentemente entre aproximadamente 1 ng e aproximadamente 50 pg e geralmente entre aproximadamente 100 ng e aproximadamente 50 pg. Em algumas modalidades, a dose está entre aproximadamente 1 fg e aproximadamente 100 pg por kg de peso corporal do indivíduo, freqüentemente entre aproximadamente 1 pg e aproximadamente 100 pg, mais freqüentemente entre aproximadamente 1 ng e aproximadamente 50 pg e geralmente entre aproximadamente 100 ng e aproximadamente 50 pg por kg de peso corporal do indivíduo.

As composições contendo o complexo solúvel da invenção podem ser administradas de várias maneiras e de várias formas. Uma composição do complexo solúvel pode incluir veículos e excipientes, tais como

tampões, carbohidratos, manitol, proteínas, polipeptídeos ou aminoácidos, tal como a glicina, antioxidantes, bacterioestáticos, agentes quelantes, agentes de suspensão, agentes espessantes e/ou conservantes; água, óleos, soluções salinas, dextrose aquosa e soluções de glicerol, outras substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis, que são requeridas para a aproximação às condições fisiológicas, tais como agentes tamponadores, agentes de ajuste da tonicidade, agentes umectantes, etc. Um adjuvante convencional pode ser também incorporado na composição.

Embora qualquer veículo adequado possa ser utilizado para a administração das composições da invenção, o tipo de veículo variará dependendo do modo de administração. Os compostos podem ser também encapsulados com lipossomos. Microesferas biodegradáveis são convenientes em alguns casos como veículos; por exemplo, tais como as descritas em (Tice e outros, Patente U.S. 5.942.252, 1999).

É desejável a esterilização das composições, da forma realizada por técnicas convencionais, tal como a esterilização por filtração. As soluções aquosas resultantes podem ser embaladas para uso nesta forma ou podem ser liofilizadas.

As composições do complexo solúvel da invenção podem ser administradas de várias maneiras, inclusive através de injeção (por exemplo, intradérmica, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal etc), através de inalação, através de administração tópica, através de supositório, através do uso de um emplastro transdérmico ou pela boca.

Quando a administração é feita através de injeção, as composições podem ser formuladas em soluções aquosas, preferencialmente em tampões fisiologicamente compatíveis, tais como a solução de Hank, a solução de Ringer, tampão fosfato 20 mM, cloreto de sódio 150 mM (pH 7,4) ou tampão salino fisiológico. A solução pode conter agentes de formulação, tais como agentes de suspensão, estabilizantes e/ou de dispersão. Alternativamente, a composição pode estar na forma de pó para constituição com um veículo adequado, por exemplo, água estéril livre de pirogênio, antes do uso. As composições fornecidas para inalação podem estar na forma de borrifa53

dores de aerossol, a partir de embalagens pressurizadas ou de um nebulizador, com o uso de um propulsor adequado, por exemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, dióxido de carbono ou outros gases adequados. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada através do fornecimento de uma válvula para distribuir uma quantidade medida. Cápsulas e cartuchos, por exemplo, de gelatina, para uso em um inalador ou um insuflador, podem ser formulados contendo uma mistura de pó das proteínas e uma base de pó adequada, tal como a lactose ou o amido. Para a administração tópica, as composições podem ser formuladas na forma de soluções, géis, ungüentos, cremes, suspensões e similares, que são bem-conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, a administração é feita através de um emplastro transdérmico. As composições para supositórios podem ser também formuladas para conter bases convencionais para supositórios.

Quando a administração é oral, uma composição pode ser facilmente formulada através da combinação da composição com veículos farmaceuticamente aceitáveis. Os veículos sólidos incluem manitol, lactose, estearato de magnésio etc; tais veículos possibilitam a formação de comprimidos, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas, suspensões etc, para ingestão oral. Tais formulações podem ser pós, cápsulas e comprimidos: os excipientes adequados incluem enchimentos tais como açúcares, preparação de celulose, agentes de granulação e agentes aglutinantes.

Os métodos de produção de anticorpos policlonais e monoclonais, incluindo fragmentos de ligação (por exemplo, F(ab)2) e versões de cadeia isolada são bem-conhecidos. Entretanto, muitos antígenos são incapazes de ativar uma resposta adequada de anticorpos. Em uma modalidade, uma composição que compreende um complexo solúvel da invenção e um antígeno é administrada a um animal, ativando assim uma resposta imunológica no animal. Os anticorpos policlonais e monoclonais são subseqüentemente preparados através de técnicas padronizadas.

O complexo solúvel que compreende a rsgp e uma chaperona

PPI, tais como os complexos gp41- e/ou gp36-chaperona, pode ser utilizado para inibir a entrada viral em uma célula, tal como através da inibição da fusão da membrana. A célula pode estar in vitro, in vivo ou ex vivo. As composições e os métodos de administração são similares aos descritos para as composições e os métodos utilizados para ativar uma resposta imunológica. Se a inibição da entrada viral em uma célula for realizada utilizando a vacinação, então podem ser utilizados adjuvantes. Para as administrações in vitro e ex vivo, um perito na técnica escolherá métodos apropriados, com base em parte na(s) célula(s), nas condições da cultura e nas restrições de tempo (se alguma). Por exemplo, um dos tais métodos úteis seria formular lipossomos que carregam os complexos solúveis.

Os exemplos, referências e figuras a seguir são fornecidos para auxiliar o entendimento da presente invenção, cujo âmbito real é apresentado nas reivindicações em anexo. Entende-se que podem ser feitas modificações nos procedimentos apresentados, sem sair do espírito da invenção. EXEMPLOS

Exemplo 1 Produção de um complexo intermolecular solúvel, que compreende qp41 e uma chaperona PPI

1.1 Produção da FkpA de E. coli

A FkpA foi clonada, expressa e purificada de acordo com Bothmann, H. e Pluckthun, A., J Biol Chem 275 (2000) 17100-5, com algumas modificações mínimas. Para o armazenamento, a solução de proteína sofreu diálise contra NaH₂PO4/NaOH 20 mM (pH 6,0), NaCI 100 mM e foi concentrada em 26 mg/mL (1 mM).

Para a expressão no citosol, a sequência codificadora da FkpA do vetor de expressão acima foi modificada para não conter a parte da seqüência que codifica o peptídeo sinal e para conter, ao invés disso, apenas a região codificadora da FkpA madura.

1.2 Produção da gp41 (535-681 )-His6

A gp41 (535-681 )-HiS6 foi clonada e expressa em um sistema de expressão baseado no promotor do T7 e acumulada em corpos de inclusão na célula hospedeira. Os corpos de inclusão isolados foram dissolvidos em

cloreto de guanidínio 6 Μ. A proteína marcada com His foi purificada em uma coluna quelada com Ni, seguida pela filtração em gel em guanidínio 6 M sobre Sephacryl 100. A proteína foi redobrada através da diluição rápida, que é descrita por Wingfield, P. T. e outros, Protein Sci 6 (1997) 1653-60. As condições de tampão finais eram de formiato de sódio 30 mM, pH 3,0. O estado do dobramento foi avaliado para ambas as condições de tampão, utilizando UV CD próximo e distante. Como pode ser observado nas Figuras 1A e 1B, ambos os espectros de UV CD Distante e Próximo sugerem que a gp41 adota um dobramento similar ao nativo somente em pH 3,0, na ausência de agente caotrópico.

1.3 Modificação do pH do ectodomínio da qp41 (HIV) do pH 3,0 para pH fisiológico, na presença da FkpA de E. coli

1.3.1 Experimento de controle

Em um experimento de controle, o e-gp41 solúvel (em formiato 30 mM, pH 3,0) foi diluído 100 vezes em condições de tampão finais de fosfato de sódio 20 mM (pH 7,5), NaCI 50 mM, EDTA 1 mM. A concentração final da proteína foi de aproximadamente 1 μΜ. Os espectros de UV foram registrados após 1 minuto e 10 minutos. É óbvio, partindo dos espectros de UV na Figura 2, que o ectodomínio sem chaperona se agrega espontaneamente, após a modificação do pH para neutro. Entende-se que a Figura 2 enfatiza a tendência excepcional de agregação da gp41; a agregação espontânea da molécula continua muito além do estágio indicado pela linha superior.

1.3.2 A pré-incubação da gp41 com FkpA em pH 3,0 possibilita a modificação para pH neutro

Para testar o potencial de solubilização da chaperona molecular FkpA, o ectodomínio da gp41 e a FkpA foram misturadas em uma proporção molar de 1:2 e de 1:4 (em formiato 30 mM, em um pH de aproximadamente 3,5) e co-incubadas durante 1 minuto. Então, o complexo resultante foi modificado para pH neutro através da diluição de 12 vezes em condições de tampão de fosfato de sódio 20 mM pH (7,4), NaCI 50 mM, EDTA 1 mM. As concentrações finais dos parceiros de ligação no tubo de ensaio eram de

gp41 1 μΜ, FkpA 2 μΜ e 4 μΜ, respectivamente. Todas as reações foram realizadas à temperatura ambiente. Após 1 e 10 minutos, os espectros de UV foram registrados para testar as amostras da gp41 em relação aos agregados. Partindo das Figuras 3A e 3B, é evidente que a FkpA reduz substancialmente a agregação da gp41 de forma dependente da dose. Dados comparáveis foram obtidos com o fator de ativação de Thermatoga marítima e com uma SlyD truncada no C-terminal de E. coli.

Exemplo 2 Produção recombinante de um qp41-FkpA ligado covalentemente

2.1 Construção de um plasmídeo de expressão que compreende FkpA e flp41

Na primeira etapa, o sítio de restrição BamHI na região codificadora da FkpA madura de E. coli do plasmídeo do Exemplo 1.1 foi deletado, utilizando o conjunto para mutagênese direcionada ao sítio QuickChange da Stratagene (La Jolla, CA; USA), com os iniciadores:

S-gcgggtgttccgggtatcccaccgaattc-S' (SEQ ID N⁹: 3)

5'-gaattcggtgggatacccggaacacccgc-3' (SEQ ID N⁹: 4)

A construção foi chamada de EcFkpa(ABamHI)[GGGS]3.

Em uma segunda etapa, um fragmento gênico, que codifica os aminoácidos 535-681 da proteína do envelope do HIV-1, foi amplificado através da PCR do construto do Exemplo 1.2, utilizando os iniciadores: 5'-cgggatccggtggcggttcaggcggtggctctggtggcggtacgctg-acggtacaggccag-3' (SEQ ID N²: 5)

5'-ccgctcgaggtaccacagccaatttgttat-3' (SEQ ID N²: 6)

O fragmento foi inserido na EcFkpA(ABamHI)[GGGS]₃ utilizando os sítios de restrição SamHI e Xho\.

Os códons para o ligante de glicina-serina entre FkpA e e-gp41 foram inseridos com iniciador reverso para clonagem de FkpA e com iniciador para adiante para clonagem de e-gp41.

A construção resultante foi seqüenciada e descobriu-se que ela codifica a proteína desejada.

2.2 Purificação da proteína de fusão:

Células de E. coli BL21, que estão ligadas ao plasmídeo de expressão, foram cultivadas até um OD₆oode 0,7 e foi induzida superexpressão

0¾ citossólica por adição de 1 mM de IPTG, a uma temperatura de crescimento de 37°C. Quatro horas após a indução, as células foram colhidas por centrifugação (20 minutos a 5000 g). O pélete bacteriano foi ressuspenso em fosfato de sódio 50 mM pH 7,8, GuHCI (cloreto de guanidínio) 6,0 M, imidazol 5 mM e agitada à temperatura ambiente (10 minutos), para lise completa. Após centrifugação repetida (Sorvall SS34, 20000 rpm, 4°C), o sobrenadante foi filtrado (0,8/0,2 pm) e aplicado a uma coluna de Ni-NTA (NTA: Nitrilotriacetato; Qiagen; Germantown, MD), pré-equilibrado em tampão de lise. As proteínas inespecificamente ligadas foram removidas em uma etapa de lavagem, por aplicação de 10 volumes de coluna de tampão de lise. Finalmente, a proteína alvo ligada foi eluída com fosfato de sódio 50 mM, pH 2,5, GuHCI 6,0 M e foi coletada em frações de 4 ml. A absorbância foi registrada a 280 nm.

A solução ácida e caotrópica resultante pode ser armazenada a 4°C para etapas adicionais de purificação ou para experimentos de redobramento in vitro.

Partindo deste material desdobrado, podem ser usados e realizados, com sucesso, diferentes métodos de redobramento, tais como diálise, diluição rápida, cromatografia por exclusão de tamanho renaturante ou redobramento auxiliado pela matriz, todos levando virtualmente a mesma proteína dobrada semelhante à nativa e solúvel.

2.3_Renaturação por diálise e diluição rápida

O material, solubilizado como descrito acima, é transferido para condições de tampão fisiológico por diálise. O valor da faixa escolhido da tubulação da diálise foi 4000 - 6000 Dáltons.

Para induzir redobramento do ectodomínio (a parte do gp4a dos domínios de proteína gp41 e FkpA ligados covalentemente), foi removido o GuHCI da proteína eluída por diálise contra fosfato de sódio 50 mM, pH 2,5, NaCI 50 mM (cloreto de sódio). É bem conhecido que o ectodomínio isolado é todo helicoidal e forma contatos terciários neste pH extremo. Quando se analisa FkpA produzido recombinantemente por meio de CD no UV próximo, foi descoberto que o FkpA é essencialmente não estruturado sob as mes58 ···

A Cfx mas condições. É surpreendente que o redobramento de gp41-FkpA por diálise resulta em um complexo de proteína facilmente solúvel, que compreende os domínios de proteína gp41 e FkpA ligados covalentemente. O espectro UV (Figura 4) apresenta falta de luz difusa, isto é, absorção aparente além de 300 nm. A luz difusa seria indicação de agregados, assim o espectro apresentado na Figura 4 implica que o material redobrado não contém quantidades significativas de agregados.

Espectroscopia circular de dicroismo (CD) é um método preferido para avaliar tanto estrutura secundária como terciária em proteínas. A elipticidade na região aromática (260-320 nm) relata contatos terciários dentro de uma proteína (isto é, a estrutura globular de uma proteína regularmente dobrada), ao passo que a elipticidade na região da amida reflete elementos regulares repetitivos na cadeia principal da proteína, isto é, estrutura secundária.

O espetro CD no UV próximo, apresentado na Figura 5, fornece evidência obrigatória de que o ectodomínio (no contexto da proteína de fusão) apresenta contatos terciários, semelhantes a nativos, no pH 2,5. O espetro dos domínios de proteína gp41 / FkpA ligados covalentemente quase coincide com o espectro do ectodomínio isolado sob condições idênticas (dados não apresentados). A assinatura típica de gp41 foi encontrada: um máximo de elipticidade a 290 nm, um patamar característico a 285 nm e um outro máximo a 260 nm, que reflete uma ponte de dissulfeto opticamente ativa. É importante observar que o FkpA não contribui de forma alguma para o sinal de UV próximo, sob as respectivas condições. De fato, a elipticidade aromática de FkpA a pH 2,5 igual virtualmente à linha base (dados não apresentados).

Em concordância com os resultados provenientes da região do UV próximo, o CD do UV remoto do construto de fusão em pH 2,5 aponta para uma molécula de gp41 largamente estruturada. Os dois máximos a 220 nm e 208 nm constituem e correspondem à assinatura típica de um ectodomínio todo helicoidal (Figura 6). Pelas condições indicadas (fosfato de sódio 50 nM, pH 2,5, NaCI 50 mM), o polipeptídeo de fusão FkpA-gp41 pode ser

facilmente transferido para condições de tampão fisiológico, por diluição rápida. Em conclusão, CD tanto de UV próximo, como remoto, ressaltam que o gp41 estruturado semelhante ao nativo é disponível (no contexto da proteína de fusão que também contém FkpA), em uma maneira muito conveniente. Curiosamente, descobriu-se que um polipeptideo de fusão semelhante a nativo do tipo SlyD (1-165)-gp41 pode ser obtido ainda mais simplesmente, por diálise do material caotrópico (dissolvido, por exemplo em GuHCI 7,0 M) contra fosfato de sódio 50 nM, pH 7,4, NaCi 150 mM, à temperatura ambiente. As seqüências de nucleotídeo de duas construções de fusão chaperona-gp41 que funcionavam excepcionalmente bem, de acordo com a presente invenção, são representadas na SEQ ID N° 7 e na SEQ ID N° 8, respectivamente.

2.4_Renaturação por cromatografia por exclusão de tamanho (SEC)

O polipeptideo gp41-FkpA não dobrado (dissolvido em fosfato de sódio 50 nM, pH 7,8, GuHCI 7,0 M) foi aplicado sobre uma coluna de filtração de gel Superdex 200, equilibrada com fosfato de sódio 20 nM, pH 7,4, NaCi 50 M, EDTA 1 mM. O Fkp-gp41 é eluído essencialmente em três frações principais: como um associado de alto peso molecular, como uma espécie hexâmera aparente e como uma espécie trímera aparente. A fração trímera aparente foi concentrada e avaliada para sua estrutura terciária, em uma medida de CD em UV próximo (Figura 7).

O gráfico resultante é uma curva de sobreposição à qual tanto a proteína veículo FkpA como a proteína alvo gp41 contribuem em uma razão de 1:1. Mais felizmente, a gp41 apresenta estrutura terciária em pH neutro e é evidentemente solubilizada pela chaperona ligada covalentemente. Em outras palavras a FkpA chaperona parece aceitar a gp41 do ectodomínio estruturado semelhante a nativo como um substrato e solubilizar esta proteína difícil de se dobrar a um pH neutro de trabalho. Desse modo, é satisfeito um requisito crucial para a produção de grandes quantidades de antígeno gp41 solúvel, para fins de diagnóstico.

O CD do UV remoto de FkpA-gp41, no pH 7,4 (Figura 8), confirma os resultados de CD do UV próximo, pelo fato de que ele apresenta a aditividade das contribuições de sinal de FkpA e gp41, respectiva mente. Como é esperado, o espectro é dominado pelo ectodomínio de gp41 altamente helicoidal (elipticidade máxima a 220 nm e 208 nm, respectivamente).

Os dados obtidos com os domínios de proteína gp41/FkpA ligados covalentemente, solubilizados a pH 7,4, sob as condições mencionadas acima, indicam que FkpA e gp41 se comportam como unidades de dobra independentemente dentro do construto de polipeptídeo.

Exemplo 3 Efeito de diferentes detergentes sobre qp41 recombinante e sobre um complexo FkpA-gp41 recombinante usado como antígeno em um imunoensaio

3.1_Imunoensaio do tipo competitivo

O teste COBAS CORE HIV (Roche Diagnostics GmbH, Alemanha) fornece um meio conveniente para testar a imunorreatividade de gp41 recombinante. Em princípio, este ensaio também funciona de acordo com o conceito de dupla ponte de antígeno, para detectar anticorpos contra gp41 de HIV. O antígeno de fase sólida é revestido diretamente. O antígeno de detecção é um gp41 marcado com peroxidase, porém, material gp41 SDSsolubilizado.

Em imunoensaios para a detecção de HIV, é altamente desejável que os reagentes usados sejam facilmente solúveis e estáveis em um tampão de incubação, que compreende, de preferência, altas concentrações de detergente. Tais detergentes, por exemplo, Triton X-100® ou Nonidet P40®, são usados a uma concentração de 0,1 a 20%, para ruptura de partículas virais.

Tanto gp41 SDS-solubilizado como FkpA-gp41 produzidos como descrito no Exemplo 1 foram testados como antígenos em competição no ensaio COBAS CORE HIV Combi. Para isso, em vez do tampão de incubação comercial, é usado um tampão de incubação que compreende 0,1% de Triton X-100®, em uma matriz de tampão isenta de soro humano. O antígeno a ser testado é co-incubado com um soro humano que, se sabe, é reativo com gp41.

O antígeno gp41, em uma forma dose-dependente, extingue fortemente o sinal em um ensaio do tipo competitivo, ao passo que o gp41 SDS-solubilizado é essencialmente não reativo (Figura 9). São conseguidos 50% de inibição a uma concentração de antígeno FkpA-gp41 de 0,1 pg/ml, correspondente a uma concentração molar de 2,2 nM.

É notável que FkpA-gp41 mantenha sua imunorreatividade excelente, após pré-tratamento com tampão diluente que contém Triton X-100 a 0,1% como um detergente (detergente auxiliar), para desintegrar membranas virais intactas no teste. Isto está em contraste acentuado com o ectodomínio de gp41 sozinho (gp41 em SDS), que na presença do detergente auxiliar perde quase completamente a sua imunorreatividade (Figura 9).

Era uma preocupação principal no desenvolvimento do construto gp41-FkpA ligado covalentemente que o FkpA mascaria os epítopos cruciais, em conseqüência de dinâmica insuficiente da ligação ou que o detergente Triton X-100, inerente ao teste, destruiría o desempenho do teste, por indução da agregação do antígeno gp41. Os resultados experimentais de muitos testes de competição sobre a plataforma COBAS CORE fornecem evidência obrigatória de que os epítopos cruciais gp41 são bem acessíveis no contexto dos domínios de proteína ligados covalentemente. Além disso, a imunorreatividade de gp41 dentro do complexo intramolécula chaperonagp41 é mantida na presença de detergentes auxiliares como Triton X-100.

3.2_Ensaio de eletroluminescência

Os imunoensaios, de acordo com o formato de ponte de antígeno duplo, são de grande vantagem no diagnóstico serológico de agentes infecciosos. Como FkpA-gp41, de acordo com a presente invenção, é solúvel nas condições de tampão fisiológico, foi possível investigar se este material é adequado para uso em um ensaio de ponte de antígeno duplo, que emprega eletroluminescência como um princípio de detecção.

Tentativas de acoplar o gp41 SDS-solubilizado a marcas de Rutênio não foram bem-sucedidas. Como, entretanto, FkpA-gp41 é facilmente solúvel sob condições de tampão fisiológico, o acoplamento deste material a marcas de Ru hidrófobo provadas diretas. É digno de nota que até mesmo o complexo alvo-chaperona modificado na maneira descrita perma62

nece solúvel. Para se realizar o ensaio no sistema teste Elecsys® (Roche Diagnostics GmbH, Alemanha), o FkpA-gp41 foi biotinilado e rutenilado, respectivamente e testado para imunorreatividade em um ensaio de ponte de antígeno.

Diversos soros anti-HIV representativos contendo principalmente anticorpos da classe IgG (imunoglobulina G) testados altamente positivos, com os domínios de proteína FkpA-gp41 ligados covalentemente. Também foi descoberto que o sinal de fundo se aproxima do fundo do dispositivo intrínseco, até mesmo a concentrações de antígeno tão altas quanto 300 ng/ml. A razão de sinal-para-ruído acabou sendo excelente. Além disso, não há provas de que a proteína veículo, a chaperona molecular FkpA de E. coli provoca ligação não-específica de anticorpos contidos nestes soros humanos.

Como discutido acima, a detecção precoce de soroconversão é crucial para o diagnóstico confiável de HIV.

Durante o curso de infecção, aparecem primeiro os anticorpos da classe IgM. Para detectar confiavelmente infecção por HIV, em uma fase muito precoce, é portanto obrigatório projetar um módulo de antígeno com alta densidade de epítopo, para reconhecimento de IgM e ligação. Evidentemente, FkpA-gp41 é bem reconhecido por soros típicos anti-HIV, do tipo IgM. O que é ainda mais importante é o fato de que amostras que são difíceis de serem testadas como positivas, como soros B e C do painel de seroconversão 9003 e 4009, como fornecido por NABI (Miami, Flórida), foram testadas como sendo positivas com o construto de fusão, de acordo com a presente invenção. Isto é uma grande conquista, pois os antígenos gp41 sobre uma base de peptídeo não são reativas, de modo algum, quando testados com estes soros IgM.

Exemplo 4 Complexos chaperona-qp41 solúveis inibem a entrada de vírus

Foram avaliadas diferentes proteínas de fusão gp41-chaperona para sua capacidade de inibir fusão de membrana mediada por HIV-1, em um ensaio in vitro. Em resumo, linhagens de célula repórteres MAGI P4CCR5 que expressam CD₄, CCR5 e CXCR4 foram infectadas com HIV-1

cepa NL4-3 e avaliadas para atividade de β-galactosidase Tat-dependente, de acordo com Meister e outros, Virology (2001) 284 (2), 287-296. Evidentemente, observa-se uma inibição substancial de infecção, com valores de IC₅o na faixa de nM. SlyD-gp41, por exemplo (ver SEQ ID N°. 6) inibe significativamente a entrada de vírus com uma IC50 de < 70 nM.

Em conclusão, o complexo intramolecular solúvel que compreende gp41 de HIV-1 ou gp36 de HIV-2, respectivamente, e uma chaperona de peptidil-propil-isomerase possui excelentes propriedades em relação à solubilidade e integridade conformacional, que são responsáveis pelo projeto de testes de anticorpo anti-HIV melhorado e outras aplicações comerciais. Exemplo 5 Fusão da chaperona FkpA ao ectodomínio gp36 fornece um polipeptídeo citossólico que pode ser facilmente redobrado in vitro.

Para se obter gp36, o homólogo de gp41 de HIV-2, em uma forma solúvel e imunologicamente ativa, clonou-se um constructo denominada FF36. Este polipeptídeo de fusão compreende duas unidades FkpA e uma unidade gp36, cada uma ligada por uma extensão flexível rica em glicina. Para facilitar a purificação, o construto de fusão foi rotulada com HiS6 Cterminalmente. A proteína foi essencialmente purificada, de acordo com o protocolo mencionado antes: Após lise caotrópica, a proteína foi ligada a uma coluna de Ni-NTA e foi - após lavagem excessiva com fosfato de sódio 50 mM pH 7,8, GuHCI 7,0 M - eluída por diminuição do pH. A proteína eluída foi então redobrada, por passagem da mesma sobre uma coluna de filtração em gel equilibrada com fosfato de sódio 50 mM pH 7,8, cloreto de sódio 100 mM, EDTA 1 mM. A proteína nativa resultante deste método de filtração em gel de renaturação apresentou propriedades imunológicas e espectroscópicas satisfatórias (ver Figura 10), correspondendo assim a contrapartes gp41, tais como F41 ou FF41. O protocolo de purificação e de redobramento, como descrito aqui, foi realizado com FF36 contendo mutações em três pontos na região de repetição de heptavalente N-terminal de gp36 (para seqüência ver SEQ ID N° 9). O mesmo protocolo foi também aplicado com sucesso a um constructo de fusão, que compreende o ectodomínio wt gp36, embora com menores rendimentos de proteína solúvel.

Ή

Exemplo 6 FkpA-gp21 imunorreativo, solúvel pode ser obtido em uma maneira conveniente e reproduzível.

Foram cultivadas células de E. coli FkpA-gp21-superprodutoras (que compreendem SEQ ID N° 10), induzidas e colhidas como descrito antes. Para lise completa, as pelotas de célula foram agitadas em fosfato de sódio 50 mM pH 7,8, GuHCI 7,0 M, à temperatura ambiente, durante uma hora. O lisado de célula caotrópica foi aplicado sobre uma coluna de Ni-NTA pré-equilibrada em tampão de lise. Após a etapa de lavagem, a proteína alvo (que contém um Hexa-His-Tag C-terminal) foi eluída por diminuição do pH. Para redobramento, FkpA-gp21 (armazenado em fosfato de sódio 50 mM pH 6,0, GuHCI 7,0 M, a 4°C) foi passado sobre uma coluna de filtração em gel Superdex 200, pré-equilibrada em fosfato de sódio 50 mM pH 7,8, cloreto de sódio 100 mM. Espetro UV demonstrou que o FkpA-gp21 é eluído como uma proteína solúvel, que não é mais - em contraste com o gp21- não chaperonado - propenso a agregação (Figura 11a). Além disso, o FkpA-gp21 resultante exibe excelente atividade imunológica, quando avaliada em um experimento COBAS CORE do tipo competitivo (Figura 11b).

Exemplo 7 Fusão de uma FkpA-subunidade adicional a FkpA-qp41 melhora as propriedades imunológicas do ectodomínio gp41.

Foi controlada a questão se uma subunidade PPIase adicional, dentro do contexto do polipeptídeo de fusão, podia melhorar as propriedades globais do complexo de ectodomínio de gp41-chaperona. Para esta finalidade, foram preparados tanto F41 (um domínio FkpA localizado a montante da variante gp41), como FF41 (dois domínios FkpA localizados a montante da variante gp41), de acordo com o protocolo descrito. As proteínas de fusão biotiniladas e ruteniladas foram então avaliadas no sistema Elecsys® E2010. Os resultados são fortemente indicadores de propriedades melhoradas do construto FF41, que contém um domínio chaperona adicional.

Foi descoberto que sinais de fundo com soros negativos, que são decisivos para razão de sinal-para-ruído e medida confiável de soros de baixo título, são reduzidos mais do que cinquenta por cento, quando FF41 (aproximadamente 1600 contagens) foi comparado com F41 (aproximada65

Ύ6 • ··· · mente 3800 contagens).

Tabela 1: Comparação de F41 e FF41

	F41	FF41
Rl:	EMHR220	EMHR221
ESSinRl	F-41-Bi(UE)25	FP-41-Bi-UEEK
3(AL)	500ng/ml	750ng/ml
R2	EMHR221	EMHR222
ESSem R2	F-41-Ru(UE)25	FF41-2Ru-SK(4)
P(AL)	500ng/nJ	750ng/ml
Contagens médias com 7 soros negativos	3,768	1,589

Foram obtidos resultados positivos similares com uma proteína de fusão SS41, isto é, uma proteína de fusão que contém dois domínios SlyD e um domínio g41 C-terminal aos domínios chaperonas.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para produção de um complexo solúvel que compreende uma proteína amiloidogênica alvo e uma chaperona da classe peptidil-prolil-isomerase selecionada dentre o grupo que consiste em FkpA e

5 SlyD, caracterizado pelo fato de que compreende a mistura da dita proteína e da dita chaperona em um tampão não fisiológico em que ambas, a proteína e a chaperona, são solubilizadas, e o ajuste do tampão a condições fisiológicas em que o complexo formado de proteína-chaperona é solúvel.

10 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tampão fisiológico compreende um composto de tampão em uma concentração de 10 a 200 mM e uma concentração total de sal de 20 500 mM.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo 15 fato de que a proteína alvo é produzida de forma recombinante.

4. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a peptidil prolil isomerase é produzida de forma recombinante.

5. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína alvo e a peptidil prolil isomerase são produzidas de

20 forma recombinante.

6. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína alvo é uma glicoproteína retroviral de superfície.

7. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína alvo é gp36 do HIV-2, ou gp41 do HIV-1.

25 8. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a peptidil prolil isomerase é um fragmento competente de ligação da peptidil prolil isomerase.

9. Processo para produção de um complexo de glicoproteína retroviral de superfície-chaperona solúvel, caracterizado pelo fato de que

30 compreende:

a mistura de uma glicoproteína retroviral de superfície e uma peptidil prolil isomerase selecionada dentre o grupo que consiste em FkpA e

Petição 870180068463, de 07/08/2018, pág. 12/27

SlyD em um tampão não fisiológico, em que tanto a glicoproteína retroviral de superfície, como a peptidil prolil isomerase são solubilizadas e formam um complexo, e o ajuste do tampão a condições fisiológicas em que o complexo

5 é solúvel.

10. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a glicoproteína retroviral de superfície é produzida de forma recombinante.

11. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado 10 pelo fato de que a peptidil prolil isomerase é produzida de forma recombinante.

12. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a glicoproteína retroviral de superfície e a peptidil prolil isomerase são produzidas de forma recombinante.

15 13. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a glicoproteína retroviral de superfície é gp36 ou gp41 de HIV.

14. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a peptidil prolil isomerase compreende um fragmento com20 petente de ligação da peptidil prolil isomerase.

15. Processo para produção de um complexo de glicoproteína retroviral de superfície-chaperona solúvel, caracterizado pelo fato de que compreende:

a solubilização de uma glicoproteína retroviral de superfície liga25 da covalentemente a uma peptidil prolil isomerase selecionada dentre o grupo que consiste em FkpA e SlyD em um tampão não fisiológico, em que a glicoproteína retroviral de superfície é solubilizada, e o ajuste do tampão a condições fisiológicas em que o complexo de glicoproteína retroviral de superfície-chaperona é solúvel.

30 16. Complexo solúvel, caracterizado pelo fato de que compreende: uma glicoproteína retroviral de superfície e uma peptidil prolil isomerase selecionada dentre o grupo que consiste em FkpA e SlyD, em que é produPetição 870180068463, de 07/08/2018, pág. 13/27 zido pelo processo como definido na reivindicação 1, 9 ou 15.

17. Complexo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a glicoproteína retroviral de superfície e a peptidil prolil isomerase estão ligadas covalentemente.

5 18. Complexo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que ligado covalentemente compreende acoplado quimicamente.

19. Complexo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que ligado covalentemente compreende ligado de forma recom10 binante.

20. Complexo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que ligado de forma recombinante compreende um ligante de peptídeo.

21. Complexo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado 15 pelo fato de que o ligante de peptídeo compreende pelo menos 10 aminoácidos.

22. Complexo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o ligante de peptídeo compreende pelo menos 15 aminoácidos.

20 23. Complexo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o ligante de peptídeo compreende no máximo 50 aminoácidos.

24. Complexo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o ligante de peptídeo compreende no máximo 40 aminoáci25 dos.

25. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o complexo solúvel como definido em qualquer uma das reivindicações 16 a

24.

26. Processo para detectar pelo menos um anticorpo para uma 30 glicoproteína retroviral de superfície em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende:

colocar em contato a amostra e uma composição que comprePetição 870180068463, de 07/08/2018, pág. 14/27 ende um complexo, que compreende a glicoproteína de superfície e uma chaperona peptidil prolil isomerase selecionada dentre o grupo que consiste em FkpA e SlyD, e detectar os anticorpos ligados, em que a referida composição é como definida na reivindicação

25.

27. Processo de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o contato é conduzido sob condições apropriadas para ligação dos anticorpos à glicoproteína de superfície.

28. Processo de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a detecção dos anticorpos ligados é indicadora da presença de anticorpos antivirais na amostra.

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1/8

FIG 1A ' Desnaturado nm Dobrado

FIG 1B
2/8

FIG 2

240 260 280 300 320 340 360

Comprimento de onda λ (nm)

FIG3A

240 260 280 300 320 340 360

Comprimento de onda λ (ΠΙΤί) • · ··· ·· ·· ··
3/8 ·· •· ···* » · · · · • · · ··· ·

FIG3B

Comprimento de onda λ (ηΓΠ)

Comprimento de onda λ (nm)
4/8

Comprimento de onda λ (ΠΓΠ)

FIG 6

MRW

Comprimento de onda λ (nm)

240

260
5/8

FIG 7

FIG 8

Comprimento de onda À(nm)
6/8

FIG 9 [FkpA-gp41] (pg/ml)

5¾
7/8

FIG 10

Comprimento de onda λ (nm)
8/8

FIG 11A ···· ·· ·· * · · · · · ···· · · · · • · · · · · ·

Comprimento de onda λ (nm)