ES2333108T3 - Utilizacion de chaperonas fkbp como herramienta de expresion. - Google Patents
Utilizacion de chaperonas fkbp como herramienta de expresion. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2333108T3 ES2333108T3 ES02747428T ES02747428T ES2333108T3 ES 2333108 T3 ES2333108 T3 ES 2333108T3 ES 02747428 T ES02747428 T ES 02747428T ES 02747428 T ES02747428 T ES 02747428T ES 2333108 T3 ES2333108 T3 ES 2333108T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- polypeptide
- fusion protein
- fkbp
- protein
- fkpa
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
- G01N33/56988—HIV or HTLV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
- C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
- G01N2333/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus, feline leukaemia virus, human T-cell leukaemia-lymphoma virus
- G01N2333/155—Lentiviridae, e.g. visna-maedi virus, equine infectious virus, FIV, SIV
- G01N2333/16—HIV-1, HIV-2
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
- G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pathology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Epidemiology (AREA)
Abstract
Una molécula de DNA recombinante, que codifica una proteína de fusión, que comprende al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido diana, corriente arriba de la misma al menos una secuencia de nucleótido que codifica para una chaperona FKBP, y al menos otra secuencia de nucleótidos que codifica para una chaperona FKBP, que se caracteriza porque la chaperona FKBP se selecciona de entre el grupo que consiste en FkpA y SlyD.
Description
Utilización de chaperonas FKBP como herramienta
de expresión.
La presente invención está relacionada con el
clonaje y expresión de una proteína heteróloga o polipéptido en
bacterias como Escherichia coli. En particular, esta
invención está relacionada con herramientas de expresión que
comprenden una peptidil prolil isomerasa de tipo FKBP seleccionadas
de entre el grupo que consiste de FkpA y SlyD, a métodos de
expresión de proteína recombinante, a los polipéptidos recombinantes
así obtenidos así como al uso de tales polipéptidos.
Se han descrito una gran variedad de sistemas de
expresión en las patentes así como en las literatura científica. No
obstante, a pesar del hecho que las proteínas de fusión se han
convertido en la piedra angular de la biología moderna, la
obtención de una proteína diana en una forma soluble, biológicamente
activa, así como en un alto rendimiento, continua siendo un gran
reto (Kapust, R. B. y Waugh, D. S., Proteine Sci 8 (1999)
1668-74).
Ejemplos de parejas de fusión que han sido
anunciados como agentes solubilizantes incluye tioredoxina (TRX),
glutatión S-transferasa (GST), proteína de unión a
maltosa (MBP), Proteína A, ubiquitina, y DsbA. Aunque es
ampliamente reconocido y potencialmente de gran importancia, este
efecto solubilizante sigue estando pobremente comprendido. No queda
claro, por ejemplo, qué características a parte de la alta
solubilidad intrínseca representa a un agente solubilizador
efectivo. ¿Son todas las parejas de fusión solubles igualmente
competentes en esta labor? o ¿algunas son consistentemente más
efectivas que otras? De forma similar, no se conoce si la
solubilidad de muchos polipéptidos diferentes puede mejorarse
fusionándolos a una pareja altamente soluble o si esta aproximación
sólo es efectiva en una pequeña parte de los casos.
US 6.207.420 está relacionada con los sistemas
de proteínas de fusión diseñados para aumentar la expresión
citoplasmática soluble de proteínas heterólogas en Escherichia
coli.
El estado de la técnica en relación a los
sistemas de expresión más potentes, se ha resumido recientemente
por Kapust et al., supra. En su intento de producir
proteínas de fusión solubles que comprenden varias proteínas diana,
han analizado tres parejas de fusión candidatas diferentes y
prominentes. La proteína de unión a Maltosa (MBP), la glutatión
S-transferasa (GST), y la tioredoxina (TRX) se han
analizado por su capacidad de inhibir la agregación de seis
proteínas diferentes que normalmente se acumulan en una forma
insoluble. Todos estos sistemas candidatos de expresión son
conocidos por los expertos en la materia y están descritos en
detalle en varios sitios (por ejemplo, PE 293 249 describe en
detalle el uso de GST como una herramienta de expresión).
De forma remarcable, Kapust et al.,
supra, encontraron que la MBP es de lejos un agente más
efectivo al solubilizar que las otras dos parejas de fusión que
también se usan ampliamente en la técnica. Además, demostraron que
sólo en algunos casos la fusión a MBP puede promover el plegamiento
correcto de la proteína unida en su conformación biológicamente
activa.
Es especialmente crítico que muchos polipéptidos
que tienen tendencia a agregar se mantengan solubles al fusionarlos
con una pareja apropiada, pero algunas parejas de fusión candidatas
de una forma más o menos impredecible son mucho mejor agentes
solubilizadores que otros.
Mientras se trabajaba en la expresión
recombinante de varias glicoporteínas retrovirales de superficie
(rsgps), se investigó la utilidad de muchas herramientas de
expresión conocidas y recomendadas en la técnica, por ejemplo, por
Kapust et al., supra. No obstante, se encontró que
todos los sistemas de expresión ensayados sufrieron alguno o varios
de los siguientes defectos: bajo rendimiento, polipéptido de fusión
difícil de manipular, o insolubilidad de la proteína de fusión en
condiciones de tampón fisiológicas.
Existe una gran demanda para proporcionar una
alternativa, herramientas de expresión eficientes, que son
especialmente apropiadas para la expresión recombinante de
proteínas con tendencia a agregarse, por ejemplo, como las
rsgps.
Existe una gran riqueza de bibliografía de
patentes relacionadas con proteínas que se unen al inmunosupresor
FK-506, las denominadas proteínas de unión a
FK-506 o FKBP.
Estas proteínas se han estudiado ampliamente y
se han diseñado aplicaciones comerciales centradas en la actividad
de unión a FK-506 de estas proteínas. Por ejemplo,
WO 93/25533 utiliza
CTP:CMP-3-deoxi-D-mano-octulosonato
citidil transferasa (=CKS) como herramienta de expresión. Se
inserta un FKBP en un vector de expresión basado en CKS corriente
abajo del gen CKS. La proteína de fusión obtenida se utiliza para
mejorar las mediciones de FK-506 y otros
inmunosupresores.
WO 00/28011 describe materiales y métodos para
la regulación de eventos biológicos como la transcripción de genes
diana y crecimiento, proliferación y diferenciación de células
modificadas.
WO 97/10253 está relacionada con un ensayo de
alto rendimiento para el cribado de compuestos capaces de unirse a
una proteína de fusión que consta de una proteína diana y una
proteína de unión a FK-506. Se describe la
utilización de una proteína de fusión FKBP12 (SH2) por homología a
Src en un ensayo de cribado de alto rendimiento. La proteína de
fusión se produce en forma soluble en el periplasma bacteriano y se
libera mediante tratamiento de
congelación-descongelación estándar.
La tarea de la presente invención fue investigar
si es posible desarrollar y proporcionar sistemas de expresión
alternativos eficientes que puedan utilizarse para mejorar la
expresión de una proteína recombinante que comprende una rsgp como
proteína diana y que a la vez es también apropiado para proteínas
diana menos críticas.
Para sorpresa nuestra fuimos capaces de
identificar ciertos miembros modulares de la familia de tipo FKBP
de las chaperonas de la peptidil prolil isomerasa (PPI o PPIasa)
como herramientas de clonaje muy prometedoras. Encontramos que un
sistema de expresión basado en una familia de tipo FKBP de la
chaperona seleccionada del grupo que consiste en SlyD, FkpA, y
factor disparador (trigger factor) es ideal para expresar proteínas
críticas como una rsgp y a la vez pudimos demostrar también que
estas chaperonas representan a su vez herramientas de clonaje
extremadamente prometedoras para proteínas diana menos crítica.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención en una primera realización
está relacionada con una molécula de DNA recombinante, que codifica
una proteína de fusión, que comprende al menos una secuencia de
nucleótido que codifica para un polipéptido diana y corriente
arriba del mismo al menos una secuencia de nucleótidos que codifica
para una chaperona FKBP y al menos otra secuencia de nucleótidos
que codifica para una chaperona FKBP, que se caracteriza en que la
chaperona FKBP se selecciona de entre el grupo que consiste en FkpA
y SlyD.
También se describen las vías preferibles para
diseñar dichas moléculas de DNA recombinante, así como su uso como
parte de un vector de expresión, una célula huésped que comprende
dicho vector de expresión, y en la producción de polipéptido de
fusión.
Se ha encontrado además que los polipéptidos de
fusión recombinantes por sí mismos presentan propiedades
sorprendentes y ventajosas, por ejemplo, respecto a la
solubilización, purificación y manejo. En otra realización, la
presente invención está relacionada con una proteína de fusión
producida de forma recombinante que comprende al menos dos
secuencias de polipéptido que corresponden a una chaperona FKBP
seleccionada de entre el grupo que consiste en FkpA y SlyD y al
menos una secuencia de polipéptido que corresponde a un péptido
diana.
Otra realización está relacionada con una
proteína de fusión producida de forma recombinante que comprende al
menos dos secuencias de polipéptido que corresponden a una chaperona
FKBP seleccionada de entre el grupo que consiste en FkpA y SlyD, al
menos una secuencia de polipéptido que corresponde a un polipéptido
diana, y al menos una secuencia enlazante peptídica de 10 - 100
aminoácidos.
Los polipéptidos de fusión recombinantes
preferibles también se describen como el uso de dichos polipéptidos
de fusión en varias solicitudes.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1 Espectro UV de
FkpA-gp41 a pH 2,5
Espectro UV del polipéptido de fusión
FkpA-gp41 tras la diálisis en fosfato sódico 50 mM,
pH 2,5; 50 mM NaCl. Sorprendentemente, la construcción de dos
dominios permanece completamente soluble tras la eliminación del
agente solubilizador caotrópico GuHCl. No hay evidencias de la
existencia de agregados que desvíen la luz que se esperaría que
provocasen una deriva en la línea basal y una absorción aparente
significativa a longitudes de onda por encima de 300 nm.
Figura 2 Espectro UV DC cercano de
FkpA-gp41 a pH 2,5.
El espectro se registró en un
espectropolarímetro Jasco 720 en fosfato de sodio 20 mM, pH 2,5; 50
mM NaCl a 20ºC y se acumuló nueve veces para disminuir el ruido. La
concentración de proteína fue de 22,5 \muM a una longitud de paso
de 0,5 cm. La elipticidad aromática muestra la firma típica de gp41.
A pH 2,5, FkpA está muy desestructurado y no contribuye nada a la
señal de UV DC cercano.
Figura 3 Espectro UV DC lejano de
FkpA-gp41 a pH 2,5.
El espectro se registró en un
espectropolarímetro Jasco 720 en fosfato de sodio 20 mM pH 2,5; 50
mM NaCl a 20ºC y se acumuló nueve veces para mejorar la proporción
señal-ruido. La concentración de proteína fue de
2,25 \muM a una longitud de paso de 0,2 cm. La mínima a 220 y 208
nm apuntan hacia una gran estructura helicoidal de gp41 en el
contexto de la proteína de fusión. El ruido espectral por debajo de
197 nm se debe a la alta absorción de amida y no informa sobre
cualquier característica estructural de la proteína de fusión. Sin
embargo, se puede adivinar el típica máximo de hélice a 193 nm.
Figura 4 Espectro UV DC cercano de
FkpA-gp41 bajo condiciones de tampón
fisiológicas.
El espectro se registró en un
espectropolarímetro Jas-co 720 en fosfato de sodio
20 mM, pH 7,4; NaCl 50 mM a 20ºC y se acumuló nueve veces para
disminuir el ruido. La concentración de proteína fue de 15,5 \muM
a una longitud de paso de 0,5 cm. Sorprendentemente, la elipticidad
aromática de los dominios de proteína unidos covalentemente de g41
y FkpA (línea continua) se compone de la suma de las contribuciones
de todas las hélices similares a la nativa de gp41 a pH 3,0 (línea
inferior rayada) y de las contribuciones de FkpA a pH 7,4 (línea
superior rayada). Esto indica que el transportador FkpA y la gp41
diana (es decir, dos unidades de plegamiento funcional distintas)
se replegan de forma reversible y casi independientemente cuando se
unen a un polipéptido de proteína de fusión.
Figura 5 Espectro UV DC lejano de
FkpA-gp41 bajo condiciones de tampón
fisiológicas.
El espectro se registró en un
espectropolarímetro Jas-co 720 en fosfato de sodio
20 mM, pH 7,4; NaCl 50 mM a 20ºC y se acumuló nueve veces para
mejorar la proporción señal-ruido. La concentración
de proteína fue de 1,55 \muM a una longitud de paso de 0,2 cm.
Las fuertes señales a 222 nm y 208 nm, respectivamente, apuntan
hacia una gran estructura helicoidal de gp41 en el contexto de la
construcción de fusión. El ruido por debajo de 198 nm se debe a la
alta absorción de proteína y no reflejan ninguna propiedad
estructural secundaria de FkpA-gp41.
Figura 6 El espectro UV DC cercano de scFkpA
y scSlyD se asemejan entre ellos.
El espectro de DC se registró en un
espectropolarímetro Jasco 720 en cubetas de 0,5 cm y se hizo la
media para mejorar la proporción señal-ruido. Las
condiciones de tampón fueron fosfato sódico 50 mM pH 7,8, cloruro
sódico 100 mM a 20ºC. La concentración de proteína fue de 45 \muM
para ambos scFkpA (línea superior a 280 nm) y scSlyD (línea
inferior a 280 nm), respectivamente. La similitud estructural de
ambas proteínas se evidencia por la firma similar en la "región
huella".
La presente invención describe nuevos sistemas
de expresión de polipéptidos. En una realización preferible está
relacionada con una molécula de DNA recombinante, que codifica una
proteína de fusión, que comprende al menos una secuencia de
nucleótido que codifica para un polipéptido diana y corriente arriba
del mismo al menos una secuencia de nucleótido que codifica para
una chaperona FKBP y al menos otra secuencia de nucleótido que
codifica para una chaperona FKBP, que se caracteriza en que la
chaperona FKBP se selecciona de entre el grupo que consiste en FkpA
y SlyD.
Como los expertos en la materia apreciarán, el
término "al menos uno" se utiliza para indicar que una o más
secuencias de nucleótido que codifican para un polipéptido diana, o
para una chaperona FKBP, respectivamente, pueden utilizarse en la
construcción de una molécula de DNA recombinante sin alejarse del
alcance de la presente invención. Preferiblemente la construcción
de DNA comprende una o dos secuencias que codifican para un
polipéptido diana, siendo uno más preferible, y a la vez contendrá
al menos uno y como máximo cuatro secuencias que codifican para una
chaperona, siendo más preferibles una o dos.
El término "molécula de DNA recombinante"
se refiere a una molécula de DNA que está hecha de la combinación
de dos segmentes que de otra manera estarían separados de la
Secuencia obtenida mediante la manipulación artificial de segmentos
aislados de polinucleótidos mediante técnicas de ingeniería genética
o mediante síntesis química. Así, se pueden juntar segmentos de
polinucleótidos con funciones deseadas para generar una combinación
de las funciones deseadas.
Se puede producir grandes cantidades del
polinucleótido mediante la replicación en una célula huésped
adecuada. Se pueden incorporar fragmentos de DNA naturales o
sintéticos que codifican proteínas o fragmentos de las mismas en
construcciones de polinucleótidos recombinantes, normalmente
construcciones de DNA, capaces de la introducción y replicación en
una célula procariota o eucariota.
Los polinucleótidos pueden también producirse
mediante síntesis química, que incluye, pero no se limita a, el
método fosforamidita descrito en Beaucage, S. L. y Caruthers, M. H.,
Tetrahedron Letters 22 (1981) 1859-1862 y el método
triéster de acuerdo con Matteucci, M. D. y Caruthers, M. H., J. Am.
Chem. Soc. 103 (1981) 3185-3191. Puede obtenerse un
fragmento de doble cadena a partir del producto de cadena única de
síntesis química mediante la síntesis de la cadena complementaria e
hibridando las cadenas juntas bajo las condiciones apropiadas o
mediante la adición de la cadena complementaria utilizando la
polimerasa de DNA con una secuencia cebadora apropiada.
Se dice que un polinucleótido "codifica" un
polipéptido si, en su estado nativo o cuando se manipula por métodos
conocidos, el polinucleótido puede transcribirse y/o traducirse
para producir el polipéptido o un fragmento del mismo.
Un polipéptido diana de acuerdo con la presente
invención puede ser cualquier polipéptido necesario en grandes
cantidades y por lo tanto, difícil de aislar o purificar a partir de
otras fuentes no recombinantes. Ejemplos de proteínas Diana
producidas preferiblemente mediante los presentes métodos incluye
productos génicos de mamíferos como enzimas, citocinas, factores de
crecimiento, hormonas, vacunas, anticuerpos y similares. Más en
particular, los productos génicos sobreexpresados preferibles de la
presente invención incluye productos génicos como la ertropoyetina,
insulina, somatotropina, factor de liberación de la hormona de
crecimiento, factor de crecimiento derivado de las plaquetas,
factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento
transformante a, factor de crecimiento transformante 13, factor de
crecimiento epidérmico, factor de crecimiento de fibroblastos,
factor de crecimiento de nervios, factor de crecimiento similar a la
insulina I, factor de crecimiento similar a la insulina II, Factor
VIII de coagulación, superóxido dismutasa, interferón \alpha,
interferón \gamma, interleucina-1,
interleucina-2, interleucina-3,
interleucina-4, interleucina- 5,
interleucina-6, factor estimulador de colonias de
granulocitos, actividad estimuladora de colonias multilinaje, factor
estimulador de granulocitos-macrófagos, factor
estimulador de colonias de macrófagos, factor de crecimiento de
células T, linfotoxina y similares. Los productos génicos
sobreexpresados preferibles son productos génicos humanos. Además,
los presentes métodos pueden adaptarse fácilmente para aumentar la
secreción de cualquier producto génico sobreexpresado que puede
utilizarse como vacuna. Los productos génicos sobreexpresados que
pueden utilizarse como vacunas incluye cualquier producto génico
estructural, asociado a membrana, unido a membrana o secretado de un
patógeno de mamífero. Los patógenos de mamífero incluye virus,
bacterias, parásitos unicelulares o multicelulares que pueden
infectar o atacar a mamíferos. Por ejemplo, las vacunas víricas
pueden incluir vacunas contra los virus como el virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH), viruela, virus de la polio,
adenovirus, gripe, hepatitis A, hepatitis B, dengue, encefalitis
Japonesa B, Varicela zoster, citomegalovirus, hepatitis A,
rotavirus, así como vacunas contra enfermedades virales como
paperas, fiebre amarilla, sarampión, rabia, herpes, gripe,
parainfluenza y similares. Las vacunas bacterianas puede incluir
vacunas frente a bacterias como Vibrio cholerae,
Salmonella typhi, Bordetella pertussis, Streptococcus
pneumoniae, Hemophilus influenza, Clostridium tetani,
Corynebacterium diphtheriae, Mycobacterium leprae, R. rickettsii,
Shigella, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis,
Coccidioides immitis, Borellia burgdorferi, y similares.
Preferiblemente, la proteína diana es un miembro
de un grupo que consiste en gp41 de HIV-1, gp36 de
HIV-2, gp21 de HTLV, p17 de HIV-1,
SlyD, FkpA, y factor disparador.
Un polipéptido diana de acuerdo con la presente
invención puede también comprender secuencias, por ejemplo,
epítopos relevantes para diagnóstico, a partir de varias proteínas
diferentes construidas para expresarse como un polipéptido
recombinante único.
Los ayudantes de plegamiento denominados
peptidil prolil isomerasas (PPI o PPIasa) se subdividen en tres
familias, las parvulinas (Schmid, F. X., Molecular chaperones in
the life cycle of proteins (1998) 361-389, Eds. A.
L. Fink y Y. Goto, Marcel Decker In., New York), Rahfeld, J. U.,
et al., FEBS Lett 352 (1994) 180-4) las
ciclofilinas (Fischer, G., et al., Nature 337 (1989)
476-8, y la familia FKBP (Lane, W. S., et
al., J Protein Chem 10 (1991) 151-60). La
familia FKBP presenta una característica bioquímica interesante ya
que sus miembros se han identificado originariamente por su
capacidad de unirse a macrólidos, por ejemplo, FK 506 y rapamicina
(Kay, J. E., Biochem J 314 (1996) 361-85).
De acuerdo con la presente invención las PPIasas
modulares preferibles son FkpA (Ramm, K. y Pluckthun, A., J Biol
Chem 275 (2000) 17106-13), SlyD (Hottenrott, S.,
et al., J Biol Chem 272 (1997) 15697-701) y
factor disparador (Scholz, C., et al., Embo J 16 (1997)
54-8), todos los miembros de la familia FKBP. Los
más preferibles son las chaperonas FkpA y SlyD.
También se sabe que no es necesario utilizar
siempre la secuencia completa de una chaperona molecular. También
pueden utilizarse los fragmentos funcionales de las chaperonas
(llamados módulos) que aún conservan las capacidades y funciones
necesarias (véase WO 98/13496).
Por ejemplo, FkpA es una PPI periplásmica que se
sintetiza como una molécula precursora inactiva en el citosol
bacteriano y se transloca a través de la membrana citoplasmática. La
forma activa de FkpA (FkpA madura o FkpA periplásmica) carece de la
secuencia señal (aminoácidos 1 a 25) y así comprende los aminoácidos
26 a 270 de la molécula precursora. La información relevante de la
secuencia relacionada con FkpA puede obtenerse fácilmente a partir
de las bases de datos públicas, por ejemplo, a partir de
"SWISS-PROT" bajo el número de acceso P 45523.
La FkpA utilizada como herramienta de expresión de acuerdo con la
presente invención carece de la secuencia señal N terminal.
Un pariente cercano de FkpA, denominado SlyD,
contiene un dominio N-terminal estructurado
responsable de las funciones catalíticas y de chaperona y de un
gran C-terminal desestructurado que es
excepcionalmente rico en residuos histidina y cisteína (Hottenrott,
supra). Encontramos que una variante truncada de
C-terminal de SlyD que comprende los aminoácidos
1-165 ejerce efectos excepcionalmente positivos en
la expresión eficiente de proteínas diana. A diferencia del SlyD de
tipo salvaje, el peligro de comprometer los puentes disulfuro se
evita con éxito en la variante utilizada de SlyD truncada
(1-165). Una molécula de DNA recombinante que
comprende un SlyD truncado (1-165) representa una
realización preferible de la presente invención.
En un modo preferible de diseño de una
construcción de DNA de acuerdo con la presente invención no se
incluyen péptidos señal. Los sistemas de expresión de acuerdo con
la presente invención se han encontrado más ventajosos cuando se
trabaja como sistema de expresión citosólico. Esta expresión
citosólico resulta en la formación de cuerpos de inclusión. A
diferencia de los grandes y bien conocidos problemas normalmente
asociados a los cuerpos de inclusión, hemos encontrado que no solo
se produce una cantidad excepcionalmente alta de proteína, sino que
las proteínas recombinantes de acuerdo con la presente invención
también son fáciles de manejar, por ejemplo, fáciles de solubilizar
y de replegar. En una realización preferible la presente invención
está relacionada con una molécula de DNA recombinante, que codifica
una proteína de fusión, que comprende al menos una secuencia de
nucleótido que codifica para un polipéptido diana y corriente arriba
de la misma al menos una secuencia de nucleótido que codifica para
una chaperona FKBP y al menos otra secuencia de nucleótido que
codifica para una chaperona FKBP, en el que la chaperona FKBP se
selecciona de entre el grupo que consiste en FkpA y SlyD que se
caracteriza además que la construcción de DNA carece de péptido
señal.
El término "carece de péptido señal" no
debe entenderse como una limitación indebida. Como los expertos en
la materia apreciarán fácilmente, la construcción puede carecer, de
hecho, de la secuencia de péptido señal. Como alternativa, no
obstante, la secuencia puede simplemente modificarse para carecer de
la función del péptido señal.
Las variantes de las chaperonas anteriormente
descritas, portadoras de una o varias sustituciones o deleciones de
aminoácidos, pueden también utilizarse para obtener un DNA
recombinante o un polipéptido de fusión de acuerdo con la presente
invención. Los expertos en la materia pueden afirmar fácilmente si
dichas variantes, por ejemplo,, fragmentos o mutantes de chaperonas
o chaperonas de fuentes alternativas, son apropiadas para un método
de la invención utilizando los procedimientos como se ha descrito
en la sección de Ejemplos.
El término "recombinante" o "polipéptido
de fusión" como se utiliza en la presente invención, se refiere a
un polipéptido que comprende al menos un dominio de polipéptido que
corresponde a la chaperona FKBP utilizada como herramienta de
expresión y al menos un dominio de polipéptido que corresponde a la
proteína diana. Opcionalmente dicha proteína de fusión puede
comprender adicionalmente un polipéptido enlazante de 10 - 100
residuos de aminoácido. Como los expertos en la materia apreciarán
dicho polipéptido enlazante está diseñado de la forma más apropiada
para la aplicación que se pretende, especialmente en términos de
longitud, flexibilidad, carga e hidrofili-
cidad.
cidad.
Preferiblemente la construcción de DNA de la
presente invención codifica una proteína de fusión que comprende un
polipéptido enlazante entre la secuencia de polipéptido que
corresponde a la chaperona FKBP y la secuencia de polipéptido que
corresponde a la proteína diana. Dicha secuencia de DNA que codifica
para un enlazante además de por ejemplo, proporcionar un sitio de
escisión proteolítico, puede también servir como polienlazante, es
decir, puede proporcionar múltiples sitios de restricción de DNA
para facilitar la fusión de los fragmentos de DNA que codifican
para una proteína diana y un dominio de chaperona.
La presente invención utiliza tecnología de DNA
recombinante para poder construir moléculas de DNA apropiadas.
En otra realización preferible, la presente
invención está relacionada con una molécula de DNA recombinante,
que codifica una proteína de fusión, que comprende al menos una
secuencia de nucleótidos unida de forma operativa que codifica para
un polipéptido diana y corriente arriba de la misma al menos una
secuencia de nucleótidos que codifica para una chaperona FKBP y al
menos otra secuencia de nucleótidos que codifica para una chaperona
FKBP, que se caracteriza en que la chaperona FKBP se selecciona de
entre el grupo que consiste en FkpA y SlyD.
Las secuencias de polinucleótido están unidas de
forma operativa cuando están situadas en una relación funcional con
otra secuencia de polinucleótido. Por ejemplo, un promotor está
unido de forma operativa a una secuencia codificante si el promotor
afecta a la transcripción o expresión de la secuencia codificante.
Generalmente, unida de forma operativa significa que las secuencias
enlazadas son contiguas y, cuando es necesario unir dos regiones de
proteínas codificantes, ambas contiguas y en marco de lectura. No
obstante, se sabe bien que ciertos elementos genéticos, como
potenciadores, pueden estar unidos de forma operativa aún en la
distancia, es decir, aún si no están
contiguos.
contiguos.
Como los expertos en la materia apreciarán es a
menudo ventajoso diseñar una secuencia de nucleótidos que codifique
para una proteína de fusión en la que uno o unos cuantos, por
ejemplo, hasta nueve, aminoácidos estén localizados entre los dos
dominios de polipéptido de dicha proteína de fusión. Las proteínas
de fusión así construidas, así como las moléculas de DNA que las
codifican, también están dentro del alcance de la presente
invención.
Las construcciones de DNA preparadas para la
introducción en un huésped normalmente comprenden un sistema de
replicación reconocido por el huésped, que incluye el fragmento de
DNA pretendido que codifica el péptido de fusión diana deseado, e
incluirá también preferiblemente las secuencias reguladoras de la
transcripción e inicio de la traducción unidas de forma operativa
al segmento que codifica el polipéptido. Los sistemas de expresión
(vectores de expresión) pueden incluir, por ejemplo, un origen de
replicación o secuencia de replicación autónoma (SRA) y secuencias
de control de la expresión, un promotor, un potenciador y sitios de
procesado de la información necesarios, como los sitios de unión a
ribosomas, sitios de escisión del RNA, sitios de poliadenilación,
secuencias terminadoras de la transcripción, y secuencias
estabilizadoras de mRNA.
El promotor apropiado y otras secuencias de
vector necesarias se seleccionan por su funcionalidad en el huésped.
Ejemplos de combinaciones que puedan funcionar en líneas celulares
y vectores de expresión incluyen pero no se limitan a aquellas
descritas en Sambrook, J., et al., en "Molecular Cloning: A
Laboratory Manual" (1989) -, Eds. J. Sambrook, E. F. Fritsch y
T. Maniatis, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring
Harbour, o Ausubel, F., et al., en "Current protocols in
molecular biology" (1987 y actualizaciones periódicas), Eds. F.
Ausubel, R Brent y K. R.E., Wiley & Sons Verlag, New York; y
Metzger, D., et al., Nature 334 (1988) 31-6.
Muchos vectores útiles para la expresión en bacterias, levaduras,
mamíferos, insectos, plantas u otras células son conocidas en la
material y pueden obtenerse a partir de proveedores que incluye pero
no se limita a Stratagene, New England Biolabs, Promega Biotech, y
otros. Además, la construcción puede unirse a un gen amplificable
(por ejemplo, DHFE) por lo que se pueden obtener múltiples copias
del gen.
Los vectores de expresión y clonaje contendrán
probablemente un marcador de selección, un gen que codifica una
proteína necesaria para la supervivencia o crecimiento de una célula
huésped transformada con el vector, aunque dicho gen marcador puede
estar en otra secuencia de polinucleótidos cointroducida en la
célula huésped. Sólo aquellas células huésped que expresen el gen
marcador sobrevivirán y/o crecerán bajo condiciones de selección.
Los genes de selección típicos incluyen pero no se limitan a
aquellos que codifican proteínas que (a) confieren resistencia a
antibióticos u otras sustancias tóxicas, por ejemplo, ampicilina,
tetraciclina, etc.; (b) complementar deficiencias auxotróficas; o
(c) suministrar nutrientes críticos no disponibles en el medio
complejo. La elección del marcador de selección adecuado dependerá
de la célula huésped, y los marcadores adecuados para diferentes
huéspedes son conocidos en la materia.
Los vectores que contienen los polinucleótidos
de interés pueden introducirse en la célula huésped mediante
cualquier método conocido en la materia. Estos métodos varían
dependiendo del tipo de huésped celular, lo que incluye pero no se
limita a la transfección que emplea cloruro de calcio, cloruro de
rubidio, fosfato de calcio, DEAE-dextrano, otras
sustancias, e infección por virus. Se pueden preparar grandes
cantidades de polinucleótidos y polipéptidos de la presente
invención mediante la expresión de polinucleótidos de la presente
invención en vectores u otros vehículos de expresión en células
huésped compatibles. Los huéspedes procariotas más comúnmente
utilizados son cepas de Escherichia coli, aunque también se
pueden utilizar otros procariotas, como Bacillus subtilis.
La expresión en Escherichia coli representa un modo
preferible de llevar a cabo la presente invención.
La construcción de un vector de acuerdo con la
presente invención utiliza técnicas de ligación convencionales. Los
plásmidos aislados o los fragmentos de DNA se escinden, se ajustan,
y se religan en la forma deseada para generar los plásmidos
necesarios. Si se desea, se realizan análisis para confirmar las
secuencias correctas en los plásmidos construidos de forma
conocida. Los métodos adecuados para construir vectores de
expresión, preparación de transcritos in vitro, introducir
el DNA en las células huésped, y realizar análisis para evaluar la
expresión y la función, son conocidos por los expertos en la
materia. La presencia del gen, amplificación y/o expresión puede
medirse en una muestra directamente, por ejemplo, mediante Southern
blotting convencional, Northern blotting para cuantificar la
transcripción de mRNA, dot blotting (análisis de DNA o RNA), o
hibridación in situ, utilizando una sonda marcada de forma
apropiada que puede basarse en una secuencia proporcionada aquí.
Los expertos en la materia se harán una idea fácilmente cómo estos
métodos pueden modificarse si se desea.
Una proteína de fusión que comprende dos
dominios de chaperona FKBP y un dominio de proteína diana también
es muy ventajoso. En otra realización preferible, la molécula de DNA
recombinante de acuerdo con la presente invención comprende dos
secuencias que codifican para una chaperona FKBP y una secuencia que
codifica para un polipéptido diana.
La molécula de DNA puede diseñarse para
comprender ambas secuencias de DNA que codifican para la chaperona
FKBP corriente arriba de la proteína diana. Alternativamente, los
dos dominios FKBP pueden organizarse para enmarcar la proteína
diana. La construcción que comprende ambos dominios FKBP corriente
arriba de la proteína diana representa una realización preferible
de acuerdo con la presente invención.
La construcción de DNA que comprende dos
dominios de chaperona así como un dominio de polipéptido diana
también contiene preferiblemente dos péptidos enlazantes entre
estos dominios. Para poder permitir un clonaje sistemático, las
secuencias de nucleótido que codifican estas dos secuencias de
péptidos enlazantes preferiblemente son diferentes. Esta diferencia
en la secuencia de nucleótidos no necesariamente debe resultar en
una diferencia en la secuencia de aminoácidos de los péptidos
enlazantes. En otra realización preferible las secuencias de
aminoácidos de los dos péptidos enlazantes son idénticas. Dichas
secuencias idénticas de péptidos enlazantes por ejemplo son
ventajosas si la proteína de fusión que comprende dos dominios de
chaperona FKBP así como su dominio de proteína diana es para usarse
en un inmunoensayo.
En los casos en los que se desea liberar una o
todas las chaperonas fuera de la proteína de fusión de acuerdo con
la presente invención, el péptido enlazante se construye para que
comprenda un sitio de escisión proteolítico. Una molécula de DNA
recombinante que codifica una proteína de fusión que comprende al
menos una secuencia de polipéptido que codifica para un polipéptido
diana, corriente arriba de la misma, al menos una secuencia de
nucleótido que codifica para una chaperona FKBP seleccionada de
entre el grupo que consiste en FkpA y SlyD, y adicionalmente que
comprenda una secuencia de ácido nucleico que codifica para un
enlazante peptídico que comprende un sitio de escisión
proteolítico, representa otra realización de esta invención.
Un vector de expresión que comprende una
molécula de DNA recombinante unida de forma operativa de acuerdo
con la presente invención, es decir, una molécula de DNA
recombinante que codifica una proteína de fusión que comprende al
menos una secuencia de polinucleótido que codifica para un
polipéptido diana y corriente arriba de la misma, al menos una
secuencia de nucleótidos que codifica para una chaperona FKBP y al
menos otra secuencia de nucleótidos que codifica para una chaperona
FKBP, en la que la chaperona FKBP se selecciona de entre FkpA y
SlyD, se ha probado que es muy ventajoso.
El vector de expresión que comprende un DNA
recombinante de acuerdo con la presente invención, puede utilizarse
para expresar la proteína de fusión en un sistema de traducción
libre de células o puede utilizarse para transformar una célula
huésped. En una realización preferible, la presente invención está
relacionada con una célula huésped transformada con un vector de
expresión de acuerdo con la presente invención.
En otra realización preferible, la presente
invención está relacionada con un método para producir una proteína
de fusión. Dicho método comprende los pasos de cultivar una célula
huésped transformada con un vector de expresión de acuerdo con la
presente invención, la expresión de esta proteína de fusión en la
correspondiente célula huésped y la purificación de dicha proteína
de fusión.
Como se ha discutido antes, el dominio de la
chaperona FKBP de FkpA y SlyD, respectivamente, se construye de
forma natural o artificial para proporcionar un polipéptido de
fusión de expresión citosólico. La proteína de fusión así producida
se obtiene en forma de cuerpos de inclusión. Mientras que se han
realizado esfuerzos enormes en la técnica para obtener cualquier
proteína recombinante deseada o la proteína de fusión directamente
en una forma soluble, hemos encontrado que la proteína de fusión de
acuerdo con la presente invención se obtiene fácilmente en forma
soluble a partir de los cuerpos de inclusión. En otra realización
preferible, la presente invención por lo tanto, está relacionada
con un método para producir una proteína de fusión de acuerdo con
los pasos descritos anteriormente, en la que dicha proteína de
fusión se purifica a partir de cuerpos de inclusión.
La purificación de la proteína de fusión a
partir de cuerpos de inclusión se logra fácilmente y se realiza de
acuerdo con procesos estándar conocidos por los expertos en la
materia, como la solubilización caotrópica y varias formas de
replegamiento.
El aislamiento y purificación de la proteína de
fusión comienza a partir de condiciones de tampón solubilizadoras,
es decir, a partir de un tampón en que los cuerpos de inclusión, es
decir, la proteína de fusión se solubiliza. Un tampón apropiado,
que puede denominarse "no fisiológico" o tampón
"solubilizador" debe reunir el requisito que ambas proteína
diana y la chaperona FKBP no se desnaturalicen de forma
irreversible. Comenzando a partir de dichas condiciones de tampón,
la chaperona está muy cerca de la proteína diana, y es posible un
cambio en las condiciones del tampón desde las condiciones no
fisiológicas a las condiciones fisiológicas sin precipitar la
proteína de
fusión.
fusión.
Un tampón apropiado (no fisiológico), es decir,
un tampón en el que ambas proteínas diana que es esencialmente
insoluble y la chaperona PPI son solubles utiliza tanto un pH bajo
como alto, o de una concentración de sal caotrópica o de una
combinación de las mismas. El tampón solubilizador preferiblemente
es un tampón con una alta concentración de sal caotrópica, por
ejemplo, cloruro de guanidinio 6,0 M a un pH de 6 aproximadamente.
Tras la renaturalización, ambas proteína Diana y la chaperona asumen
su estructura similar a la nativa y la chaperona ejerce su efecto
solubilizador positivo.
En el contexto de esta invención, las
condiciones de tampón fisiológicas se definen por un valor de pH
entre 5,0 y 8,5 y una concentración total de sal por debajo de 500
mM, sin tener en cuenta los otros ingredientes no salinos que
opcionalmente pueden estar presentes en el tampón (por ejemplo,
azúcares, alcoholes, detergentes) así como aditivos que no impidan
la solubilidad de la proteína de fusión que comprende la proteína
diana y la chaperona.
Una serie de proteínas diana, se han expresado
en grandes cantidades.
El sistema de expresión de acuerdo con la
presente invención, por ejemplo, ha demostrado trabajar
extremadamente bien con proteínas diana bastante diferentes
bioquímicamente, por ejemplo, SlyD, FkpA (proteínas que son
fácilmente solubles), p17 de HIV-1 (una proteína
que es difícil de expresar en grandes cantidades utilizando sistemas
de expresión convencionales), gp21 de HTLV (una proteína que tiende
a agregar), y gp41 de HIV-1, así como gp36 de
HIV-2 (ambas proteínas tienden extremadamente a la
agregación y son esencialmente insolubles bajo condiciones de
tampón fisiológicas). Como puede fácilmente recogerse del Ejemplo 4
relacionado específicamente con estas proteínas, los sistemas de
expresión eficientes de acuerdo con la presente invención trabajan y
resultan en altos niveles de proteína de fusión producida. Se han
realizado hallazgos positivos similares con una variedad de otras
proteínas diana expresadas como una proteína de fusión de acuerdo
con la presente invención.
A partir de la lista de ejemplos positivos,
parece obvio que el nuevo sistema de expresión descrito en la
presente invención, proporciona sistemas de expresión universales
extremadamente atractivos.
Los sistemas de expresión descritos aquí,
también se han comparado con los sistemas de expresión estándar
utilizando proteínas transportadoras como se recomienda en la
materia, como MBP. Se ha encontrado que los nuevos sistemas con los
polipéptidos diana analizados son bastante ventajosos. El
rendimiento relativo de proteína de fusión producida de acuerdo con
la presente invención fue al menos tan bueno y en la mayoría de
casos aún superior si se compara al rendimiento relativo utilizando
la expresión basada en MBP. La eficacia de la expresión puede
analizarse en términos de rendimiento de proteína de fusión, por
ejemplo, por g de masa celular de E. coli o en términos
molares, comparando las concentraciones de una proteína diana
comprendida en diferentes proteínas de fusión.
La presente invención en una realización
preferible está relacionada con una proteína de fusión producida de
forma recombinante que comprende al menos dos secuencias de
polipéptido que corresponden a una chaperona FKBP seleccionada de
entre el grupo que consiste en FkpA y SlyD y al menos una secuencia
de polipéptido que corresponden a un péptido diana.
Se ha encontrado que las proteínas de fusión de
acuerdo con la presente invención presentan propiedades ventajosas,
así por ejemplo, facilitando la producción, manejo y uso de
proteínas que de otra manera son críticas. Esto resulta muy obvio a
partir de la descripción de los resultados positivos obtenidos con
una proteína de fusión que comprende gp41 de HIV-1.
Mientras que la gp41 producida de forma recombinante es
esencialmente insoluble por sí misma, ésta se solubiliza fácilmente
si está presente como parte de un proteína de fusión de acuerdo con
la presente invención.
En general una proteína se considera
"esencialmente insoluble" si en un tampón que consiste en
fosfato sódico 20 mM pH 7,4, NaCl 150 mM es soluble en una
concentración de 50 nM o inferior. Una proteína de fusión de acuerdo
con la presente invención que comprende una chaperona FKBP y una
proteína diana se considera "soluble" si bajo condiciones de
tampón fisiológicas, por ejemplo, en un tampón que consiste en
fosfato sódico 20 mM pH 7,4, NaCl 150 mM la proteína diana
comprendida en el complejo de chaperona PPI es soluble a una
concentración de 100 nM o más.
Se ha descubierto que la proteína de fusión
obtenida de forma recombinante de acuerdo con la presente invención
puede obtenerse fácilmente a partir de cuerpos de inclusión en forma
soluble, incluso si la proteína diana es una proteína con tendencia
a la agregación como la gp41 del HIV-1. Una
característica sorprendente de la gp41 comprendida en un en una
FkpA-gp41 obtenida de forma recombinante es su
excepcional solubilidad en condiciones de tampón fisiológicas
comparado con el ectodominio gp41 sin chaperona.
Además, ha sido posible demostrar que la
proteína diana comprendida en una proteína de fusión de acuerdo con
la presente invención puede obtenerse fácilmente con una estructura
similar a la nativa. Tal estructura similar a la nativa, por
ejemplo, de la gp41 del HIV-1 se ha confirmado
mediante DC en el UV cercano o por su inmmunoreactividad. El
análisis de DC en el UV cercano ha demostrado la típica firma de
gp41 que reconocen los expertos en la materia.
La proteína de fusión de acuerdo con la presente
invención también es muy fácil de manipular, por ejemplo, tal
proteína de fusión es bastante fácil de renaturalizar. Es
interesante que el "material caotrópico" (es decir
FkpA-gp41 en GuHCl 6,0-7,0 M) puede
replegarse de diferentes formas, toda ellas resultantes en una forma
similar a la nativa termodinámicamente estable y soluble. El
replegamiento se consigue con un rendimiento elevado tanto mediante
diálisis como por dilución rápida, así como mediante cromatografía
de exclusión por tamaño renaturalizante o por replegamiento
asistido por matriz. Estos hallazgos sugieren que es una forma
unida covalentemente, el polipéptido de fusión
gp41-FkpA es una proteína termodinámicamente estable
en lugar de una proteína metaestable.
Algunas de las chaperonas FKBP (por ejemplo,
FkpA) ejercen su función chaperona en forma de oligómeros, es
decir, en un complejo que comprende dos o más polipéptidos FKBP
asociados no covalentemente. Se ha descubierto que
sorprendentemente es posible diseñar y producir tal dímero FKBP
activo como una única proteína de fusión en un mismo polipéptido.
Se han denominado estas construcciones PPI de cadena sencilla o FKBP
de cadena sencilla. La PPI de cadena sencilla que comprende dos
dominios SlyD se denomina por lo tanto scSlyD y la PPI de cadena
sencilla que comprende dos dominios FkpA se denominan por lo tanto
scFkpA. Una
peptidil-prolil-isomerasa de cadena
sencilla, es decir una proteína de fusión que comprende dos dominios
PPI representa una realización muy ventajosa y por lo tanto
preferible de la presente invención. La PPIcs de acuerdo con la
presente invención puede ser una parvulina, una ciclofilina o una
FKBP. Son preferibles las PPIcs seleccionadas de entre la familia
FKBP de chaperonas. Las más preferibles son SlyD cs y FkpA cs,
respectivamente.
Una proteína de fusión obtenida de forma
recombinante que comprende al menos una secuencia de polipéptido
que corresponde a una chaperona FKBP seleccionada de entre el grupo
que consiste en FkpA y SlyD, al menos una secuencia de polipéptido
que corresponde a un polipéptido diana, y al menos una secuencia
peptídica enlazante de 10 - 100 aminoácidos representa otra
realización preferible de la presente invención.
Como podrán apreciar los expertos en la materia,
el enlazante peptídico puede construirse de forma que contenga los
aminoácidos que sean más apropiados para la aplicación requerida.
Por ejemplo, en el caso de una proteína diana hidrofóbica el
polipéptido enlazante preferiblemente contendrá un número apropiado
de aminoácidos hidrofílicos. La presente invención también está
específicamente relacionada con las proteína de fusión que
comprenden el polipéptido diana y una o dos chaperonas FKBP o
dominios chaperona y secuencias de un enlazante peptídico adecuado
entre dominios. Para tales aplicaciones en las que la proteína diana
se necesita en forma libre, se utiliza un péptido enlazante o
péptidos enlazantes, que contienen un punto de corte proteolítico
adecuado. Las secuencias peptídicas adecuadas para la escisión
proteolítica son bien conocidas por los expertos en la materia y
comprenden entre otras, por ejemplo,
Ile-Glu-Gly-Arg,
escindida en el lado carboxilo del residuo de arginina por el
factor de coagulación Xa, o Gly-Leu
Pro-Arg-Gly- Ser, un lugar de
escisión de la trombina, etc.
Como se ha mencionado anteriormente las
proteínas de fusión de acuerdo con la presente invención pueden
obtenerse fácilmente a partir de cuerpos de inclusión siguiendo un
protocolo sencillo de replegamiento. Éstas ya son solubles y los
polipéptidos diana comprendidos en tales proteínas de fusión pueden
obtenerse fácilmente en una conformación similar a la nativa. Esto
es bastante ventajoso para los polipéptidos derivados de un
organismo infeccioso ya que tales polipéptidos similares al nativo
son los más ventajosos en las aplicaciones diagnósticas así como en
las terapéuticas. En una realización preferible, la proteína de
fusión de acuerdo con la presente invención se caracteriza además
porque una proteína diana es un polipéptido de interés como el de un
organismo infeccioso. Los organismos infecciosos preferibles de
acuerdo con la presente invención son HIV, HTLV y HCV.
En la literatura científica así como en las
patentes se describen las secuencias peptídicas que contienen
epítopos relevantes para el diagnóstico. Para los expertos en la
materia, actualmente no es un problema la identificación de tales
epítopos relevantes. En otra realización preferible, la proteína
diana que corresponde a un polipéptido derivado de un organismo
infeccioso contiene al menos un epítopo relevante para el
diagnóstico.
Debido a sus propiedades ventajosas, las
proteínas de fusión obtenidas de forma recombinante de acuerdo con
la presente invención, en otra realización se utilizan
preferiblemente para la inmunización de animales de laboratorio, en
la producción de vacunas o en inmunoensayos, respectivamente.
En el caso de que se pretenda llevar a cabo una
aplicación terapéutica de las nuevas proteínas de fusión,
preferiblemente se formulará una composición que comprenda una
proteína de fusión obtenida de forma recombinante de acuerdo con la
presente invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Los siguientes ejemplos, referencias, listado de
secuencias y Figuras se proporcionan como un apoyo para mayor
entendimiento de la presente invención, cuyo verdadero alcance se
detalla en las reivindicaciones anexas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
La FkpA salvaje se clonó, expresó y purificó de
acuerdo con Bothmann y Plückthun, J Biol Chem 275 (2000)
17106-17113, con algunas modificaciones menores.
Para su almacenamiento, la solución de proteína se dializó frente a
NaH_{2}PO_{4} 20 mM /NaOH (pH 6.0), NaCl 100 mM y se concentró
hasta 26 mg/ml (1 mM).
Para la expresión en el citosol, la secuencia
codificante de FkpA del anterior vector de expresión se modificó
para que careciera de la parte de la secuencia que codifica el
péptido señal y comprendiera en su lugar sólo la región codificante
de la FkpA madura.
\vskip1.000000\baselineskip
En el primer paso, la diana de restricción BamHI
en la región codificante de la FkpA madura de E. coli se
delecionó utilizando el equipo QuikChange de mutagénesis dirigida de
Stratagene (La Jolla, CA; USA) con los cebadores:
\vskip1.000000\baselineskip
La construcción se denominó
EcFkpA(\DeltaBamHI) [GGGS]3.
Se clonó y expresó la
gp41(535-681)-His6 del
HIV-1 en un sistema de expresión basado en el
promotor del T7. El fragmento génico que codifican los aminoácidos
535-681 de la proteína de cubierta del
HIV-1 se amplificó mediante PCR a partir del vector
de expresión basado en T7 utilizando los cebadores:
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento se insertó en
EcFkpA(\DeltaBamHI)[GGGS]3 utilizando las dianas de
restricción BamHI y XhoI.
Los codones de un enlazante rico en
glicina-serina [GGGS]3 se insertaron entre
FkpA y e-gp41 con el cebador reverso del clonaje de
FkpA y con el cebador directo del clonaje de
e-gp41.
La construcción resultante se secuenció y se
comprobó que codificaba para la proteína deseada. También se han
generado variantes de esta proteína mediante mutagénesis dirigida de
acuerdo con procedimientos estándar. Una variante de gp41 que
comprende cuatro sustituciones de aminoácido comparado con la
secuencia salvaje, por ejemplo, está codificado por las
construcciones de DNA de Id. de Sec. Nº 5 y 6, utilizando como
sistema de expresión FkpA o SlyD, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células de E. coli BL21 que son
portadoras del plásmido de expresión se hicieron crecer hasta una
DO600 de 0,7, y se indujo la sobreexpresión citosólica mediante la
adición de IPTG 1 mM a una temperatura de crecimiento de 37ºC.
Cuatro horas tras la inducción, las células se recogieron mediante
centrifugación (20 min a 5000 g). El botón de bacterias se
resuspendió en fosfato sódico 50 mM pH 7,8, GuHCl 6,0 M (cloruro de
guanidinio), imidazol 5 mM y se agitó a temperatura ambiente (10
min) para completar la lisis. Tras repetidas centrifugaciones
(Sorvall SS34, 20000 rpm, 4ºC), se filtró el sobrenadante (0,8/0,2
\mum) y se aplicó a una columna de Ni-NTA (NTA:
Nitrilotriacetato; Qiagen; Germantown, MD), preequilibrada en tampón
de lisis. Las proteínas unidas no especificamente se eliminaron en
un paso de lavado aplicando 10 volúmenes de columna de tampón de
lisis. Finalmente, la proteína unida se eluyó con fosfato de sodio
50 mM, pH 2,5, GuHCl 6,0 M, y se recogió en fracciones de 4 ml. La
absorbancia se registró a 280 nm.
La solución acídica y caotrópica resultante
puede almacenarse a 4ºC para posteriores pasos de purificación o
experimentos de replegamiento in vitro.
A partir de este material no plegado, puede
utilizarse diferentes métodos de replegamiento, como la diálisis,
dilución rápida, cromatografia de exclusión por tamaño de
renaturalización o replegamiento asistido por matriz y llevarse a
cabo con éxito, dando lugar todos ellos a una proteína con un
plegamiento virtualmente idéntico al de la nativa y soluble.
\vskip1.000000\baselineskip
El material, solubilizado como se ha descrito
anteriormente, se transfiere a un tampón con condiciones
fisiológicas mediante diálisis. El valor de punto de corte escogido
del tubo de diálisis fue de 4000 - 6000 Daltons.
Para inducir el replegamiento del ectodominio
(la parte de gp41 del HIV-1 de la proteína de
fusión), se eliminó el GuHCl a partir de la proteína eluída
mediante diálisis frente a fosfato de sodio 50 mM, pH 2,5, NaCl 50
mM (cloruro de sodio). Es bien conocido que el ectodominio aislado
es totalmente helicoidal y forma contactos terciarios a este pH
extremo. Cuando se analizó la FkpA obtenida de forma recombinante
mediante DC en el UV cercano, se detectó que FkpA se encuentra
esencialmente sin estructura bajo las mismas condiciones. Es
sorprendente que el replegamiento de gp41-FkpA
mediante diálisis resulte en un complejo de proteínas fácilmente
soluble que comprende los dominios de proteína gp41 y FkpA unidos
covalentemente. El espectro de UV (Figura 1) carece de luz difusa,
es decir, de absorción aparente por encima de 300 nm. La luz difusa
sería indicativa de agregados, por lo tanto el espectro que se
muestra en la Figura 1 implica que el material replegado no contiene
cantidades significativas de agregados.
La espectroscopia de dicroismo circular (DC) es
el método de elección para valorar tanto la estructura secundaria
como la terciaria en las proteínas. La elipticidad en la región
aromática (260-320 nm) informa sobre los contactos
terciarios dentro de una proteína (es decir, la estructura globular
de una proteína plegada normalmente), mientras que la elipticidad
en la región amida refleja elementos repetitivos regulares en el
esqueleto de la proteína, es decir, la estructura secundaria.
El espectro de DC en el UV cercano que se
muestra en la Figura 2 proporciona una evidencia convincente de que
el ectodominio (en el contexto de la proteína de fusión) muestra
unos contactos terciarios similares a los nativos a pH 2,5. El
espectro de los dominios de proteína gp41/FkpA covalentemente unidos
casi coincide con el espectro del ectodominio aislado bajo
condiciones idénticas (los datos no se muestran). Se encontró la
típica firma de gp41: un máximo de elipticidad a 290 nm, un hombro
característico a 285 nm y otro máximo a 260 nm lo que refleja un
puente disulfuro ópticamente activo. Es importante hacer notar que
FkpA no contribuye en absoluto a la señal en el UV cercano bajo las
respectivas condiciones. De hecho, la elipticidad aromática de FkpA
a pH 2,5 es virtualmente igual a la línea de base (los datos no se
muestran).
De acuerdo con los resultados de la región del
UV cercano, el DC en el UV lejano de la construcción de fusión a pH
2,5 apunta hacia una molécula gp41 muy estructurada. Aparecen dos
máximos a 220 nm y 208 nm, y se corresponden con la típica firma de
un ectodominio totalmente helicoidal (Figura 3). A partir de las
condiciones indicadas (fosfato de sodio 50 mM, pH 2,5, NaCl 50 mM),
el polipéptido de fusión FkpA-gp41 puede
transferirse fácilmente a unas condiciones de tampón fisiológicas
mediante dilución rápida. En conclusión, tanto el DC en el UV
cercano como lejano indican que se encuentra disponible la gp41 de
estructura similar a la nativa (en el contexto de la proteína de
fusión que también contiene FkpA) de forma muy cómoda.
\vskip1.000000\baselineskip
El polipéptido gp41-FkpA no
plegado (disuelto en fosfato de sodio 50 mM, pH 7,8, GuHCl 7,0 M) se
aplicó en una columna de filtración en gel Superdex 200 equilibrada
con fosfato de sodio 20 mM, pH 7,4, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM.
FkpA-gp41 se eluye esencialmente en tres fracciones
principales: como un asociado de elevado peso molecular, como una
especie aparente de hexámero y como una especie aparente de trímero.
La fracción aparente de trímero se concentró y se valoró se
estructura terciaria en una medida de DC en el UV (Figura 4).
El gráfico resultante es virtualmente una curva
sumatorio a la que tanto la proteína transportadora FkpA como la
proteína diana gp41 contribuyen en una proporción 1:1.
Afortunadamente, gp41 muestra una estructura terciaria a pH neutro
y está evidentemente solubilizada por la chaperona unida
covalentemente. En otras palabras, la chaperona FkpA parece aceptar
el ectodominio gp41 con una estructura similar a la nativa como un
sustrato y solubiliza esta proteína difícil de plegar a un pH
neutro de trabajo. Por lo tanto, se consigue un requerimiento
crucial para producir elevadas cantidades de antígeno gp41 soluble
con propósito diagnóstico.
El DC en UV lejano de FkpA-gp41
a pH 7,4 (Figura 5) confirma los resultados de DC en el UV cercano
en tanto que muestran la aditividad de las contribuciones de señal
de FkpA y gp41, respectivamente. Como se esperaba, el espectro está
dominado por el ectodominio gp41 altamente helicoidal (elipticidad
máxima a 220 nm y 208 nm, respectivamente).
Los datos obtenidos con los dominios de la
proteína gp41/FkpA covalentemente unidos solubilizados a pH 7,4
bajo las condiciones mencionadas anteriormente indican que FkpA y
gp41 se comportan como unidades de plegamiento independientes
dentro de la construcción de polipéptido.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
La chaperona SlyD se ha aislado mediante
procedimentos de clonaje rutinarios a partir de E. coli. Para
la expresión recombinante se ha preparado una construcción de DNA
que codifica los aminoácidos de 1 a 165 de SlyD. Se ha obtenido un
vector de expresión que comprende SlyD(1-165)
como pareja de fusión y la gp41 del HIV-1 como
proteína diana (véase el Id. de Sec. Nº 6). La proteína de fusión se
expresó y se purificó con éxito como se ha descrito para
FkpA-gp41 anteriormente. De forma interesante, se ha
encontrado que un polipéptido de fusión similar al nativo de tipo
SlyD(1-165)-gp41 puede
obtenerse de forma muy cómoda mediante diálisis del material
caotrópico (disuelto, por ejemplo, en GuHCl 7,0 M) frente a fosfato
sódico 50 mM pH 7,4, NaCl 150 mM a temperatura
ambiente.
ambiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Las PPI de cadena sencilla scSlyD (Id. de Sec.
Nº 7) y scFkpA (Id. de Sec. Nº 8), respectivamente, se obtuvieron a
partir de un E. coli sobreproductor de acuerdo con un
protocolo de purificación virtualmente idéntico al descrito en el
Ejemplo 1. En breve: las células inducidas se recogieron, se lavaron
en PBS y se lisaron en fosfato sódico 50 mM pH 7,8, cloruro sódico
100 mM, GuHCl 7,0 M a temperatura ambiente. Las proteínas diana no
plegadas se unieron a una columna de Ni-NTA a través
de su cola de hexa-His en C-teminal
y se replegaron en fosfato sódico 50 mM pH 7,8, cloruro sódio 100
mM. Tras este procedimiento de replegamiento asistido por matriz,
las proteínas se eluyeron en un gradiente de imidazol y se
sometieron a una filtración en gel en una columna Superdex
200®.
Alternativamente, scSlyD y scFkpA pueden
dializarse tras la elución para eliminar la concentración residual
de imidazol. Ambas proteínas resultaron ser altamente solubles.
ScSlyD, por ejemplo, no tiende a la agregación a concentraciones de
hasta 25 mg/ml. Para elucidar la estructura terciaria del las scPPI
replegadas, se monitorizó el espectro de DC en la región de UV
cercano. Las firmas tanto de scSlyD como de scFkpA son parecidas
entre ellas y por lo tanto reflejan la fuerte relación y la
homología estructural de las dos FKBP. No obstante, debido al bajo
contenido en residuos aromáticos, la intensidad de señal de scSlyD
(Fig. 6), es significativamente inferior que la de
scFkpA.
scFkpA.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Las proteínas diana bioquímicamente bastante
diferentes gp41 del HIV-1, gp36 del
HIV-2, p17 del HIV-1 y gp21 del
HTLV se han expresado utiizando el sistema de expresión pET/BL21 sin
pareja de fusión (gp41, gp36, p17, gp21) o bien utilizando el mismo
sistema de expresión estándar pero con una construcción de DNA que
codifica para una proteína de fusión de acuerdo con la presente
invención (SlyD-gp41, FkpA-gp41,
FkpA-p17, SlyD-gp36,
FkpA-gp21). La eficiencia de estos sistemas se ha
comparado en términos de rendimiento de la proteína recombinante
por unidad de masa celular de E. coli [mg/g]. Como fácilmente
se hace obvio a partir de la Tabla 1, los nuevos sistemas de
expresión dan lugar a una mejora significativa en todas las
proteínas testadas.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Sambrook, J., et al., en
"Molecular Cloning. A Laboratory Manual" (1989) -, Ed.
J. Sambrook, E. F. Fritsch y T. Maniatis, Cold Spring Harbour
Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY
Beaucage, S. L. y Caruthers, M.
H., Tetrahedron Letters 22 (1981)
1859-1862
Ausubel, F., et al., en
"Current protocols in molecular biology" (1987 y
actualizaciones periódicas), Ed. F. Ausubel, R Brent y K. RE.,
Wiley & Sons Verlag, New York
Fischer, G., et al., Nature
337 (1989) 476-8
Hottenrott, S., et aL, J Biol
Chem 272 (1997) 15697-701
Kapust, R B. y Waugh, D. S.,
Protein Sci 8 (1999) 1668-74
Kay, J. E., Biochem J 314
(1996) 361-85
Lane, W. S., et al., J Protein
Chem 10 (1991) 151-60
Matteucci, M. D. y Caruthers, M.
H., J. Am. Chem. Soc. 103 (1981)
3185-3191
Metzger, D., et al., Nature
334 (1988) 31-6
Rahfeld, J. U., et al., FEBS
Lett 352 (1994) 180-4
Ramm, K. y Pluckthun, A., J
Biol Chem 275 (2000) 17106-13
Schmid, F. X., Molecular chaperons in the
life cile of proteins (1998) 361-389, Ed. A.
L. Fink y Y. Goto, Marcel Decker In., New York
Scholz, C., et al., Embo J
16 (1997) 54-8
PE 293 249
WO 00/28011
WO 93/25533
WO 97/10253
WO 98/1349
<110> Roche Diagnostics GmbH y F.
Hoffmann-La Roche AG
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Utilización de chaperonas FKBP como
herramienta de expresión
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 21306WO
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP01115225.3
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-06-22
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP01120939.2
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-08-31
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgggtgttc cgggtatccc accgaattc
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaattcggtg ggatacccgg aacacccgc
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgctcgagg taccacagcc aatttgttat
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1269
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: codifica para una proteína de fusión
FkpA-gp41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1026
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: codifica para una proteína de fusión
SlyD-gp41
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 367
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: SlyD de cadena sencilla
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 537
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: FkpA de cadena sencilla
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (26)
1. Una molécula de DNA recombinante, que
codifica una proteína de fusión, que comprende al menos una
secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido diana,
corriente arriba de la misma al menos una secuencia de nucleótido
que codifica para una chaperona FKBP, y al menos otra secuencia de
nucleótidos que codifica para una chaperona FKBP, que se
caracteriza porque la chaperona FKBP se selecciona de entre
el grupo que consiste en FkpA y SlyD.
2. La molécula de DNA recombinante de acuerdo
con la reivindicación 1 que además se caracteriza porque
comprende al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un
enlazante peptídico de 10 - 100 aminoácidos localizados entre dicha
secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido diana y al
menos una secuencia de nucleótidos que codifica una chaperona
FKBP.
3. Una molécula de DNA recombinante de acuerdo
con la reivindicación 1 o 2, que comprende dos secuencias de
nucleótidos que codifican para dicha chaperona FKBP.
4. Una molécula de DNA recombinante de acuerdo
con la reivindicación 1 o 2, que comprende dos secuencias de
nucleótido que codifican para SlyD.
5. La molécula de DNA recombinante de la
reivindicación 3 que además se caracteriza porque las dos
secuencias que codifican para una chaperona FKBP se localizan
corriente arriba de la secuencia que codifica para el polipéptido
diana.
6. La molécula de DNA recombinante de la
reivindicación 3 que además se caracteriza porque una
secuencia que codifica para una chaperona FKBP se localiza
corriente arriba de la secuencia que codifica para el polipéptido
diana y la otra secuencia que codifica para una chaperona FKBP se
localiza corriente abajo de la secuencia que codifica para el
péptido diana.
7. La molécula de DNA recombinante de acuerdo
con las reivindicaciones de 3 a 6, que además se caracteriza
porque, comprende dos secuencias de ácido nucleico que codifican
para un polipéptido enlazante de 10 - 100 aminoácidos.
8. La molécula de DNA recombinante de acuerdo
con la reivindicación 7, en la que las dos secuencias de ácido
nucleico que codifican para un enlazante de 10 - 100 aminoácidos son
diferentes.
9. La molécula de DNA recombinante de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones de 2 a 8, en la que al menos
una de dichas secuencias enlazantes codifica para un polipéptido
enlazante que comprende un lugar de escisión proteolítica.
10. Un vector de expresión que comprende una
molécula de DNA recombinante ligada de forma operativa de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones 1-9.
11. Una célula huésped transformada con un
vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 10.
12. Un método para producir una proteína de
fusión, en el que dicho método comprende los pasos de a) cultivar
las células huésped de acuerdo con la reivindicación 11, b) expresar
dicha proteína de fusión y c) purificar dicha proteína de
fusión.
13. Una proteína de fusión obtenida de forma
recombinante que comprende al menos dos secuencias de polipéptido
que corresponden a una chaperona FKBP seleccionada de entre el grupo
que consiste en FkpA y SlyD y al menos una secuencia de polipéptido
que corresponde a un péptido diana.
14. Una proteína de fusión obtenida de forma
recombinante que comprende al menos dos secuencias de polipéptido
que corresponde a una chaperona FKBP seleccionada de entre el grupo
que consiste en FkpA y SlyD, al menos una secuencia de polipéptido
que corresponde a un polipéptido diana, y al menos una secuencia
enlazante peptídico de 10 - 100 aminoácidos.
15. La proteína de fusión de acuerdo con las
reivindicaciones 13 o 14, que además se caracteriza porque,
comprende dos secuencias de polipéptido que corresponden a dicha
chaperona FKBP.
16. La proteína de fusión de acuerdo con las
reivindicaciones 13 o 14, que además se caracteriza porque,
comprende dos secuencias de polipéptido que corresponde a SlyD.
17. La proteína de fusión de acuerdo con la
reivindicación 15, que además se caracteriza porque, dichas
dos chaperonas FKBP se localizan en posición
N-terminal respecto al polipéptido diana.
\newpage
18. La proteína de fusión de acuerdo con la
reivindicación 15, que además se caracteriza porque, una de
dichas dos chaperonas FKBP se localizan en posición
N-terminal y una de dichas chaperonas FKBP se
localiza en posición C-terminal respecto al
polipéptido diana.
19. Una proteína de fusión obtenida de forma
recombinante que comprende al menos un polipéptido diana, dos
secuencias que corresponden a las chaperonas FKBP seleccionadas de
entre el grupo que consiste en FkpA y SlyD, y dos secuencias
enlazantes peptídicos de 10 - 100 aminoácidos.
20. La proteína de fusión de acuerdo con la
reivindicación 19, en la que al menos una de dichas secuencias
enlazantes peptídicos comprende un lugar de escisión
proteolítico.
21. La proteína de fusión de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones de 13 a 20, en la que dicha
proteína diana comprende un polipéptido de un organismo
infeccioso.
22. La proteína de fusión de acuerdo con la
reivindicación 21, que además se caracteriza porque dicho
polipéptido comprende al menos un epítopo relevante a nivel
diagnóstico de un organismo infeccioso.
23. La utilización de una proteína de fusión
obtenida de forma recombinante de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 13 - 22 en la producción de un inmunógeno.
24. La utilización de una proteína de fusión
obtenida de forma recombinante de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 13 - 22, en la producción de una vacuna.
25. La utilización de una proteína de fusión
obtenida de forma recombinante de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 13-22, en un inmunoensayo.
26. Una composición que comprende una proteína
de fusión obtenida de forma recombinante de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 13-22, y un excipiente
farmacéuticamente aceptable.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP01115225 | 2001-06-22 | ||
| EP01115225 | 2001-06-22 | ||
| EP01120939 | 2001-08-31 | ||
| EP01120939 | 2001-08-31 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2333108T3 true ES2333108T3 (es) | 2010-02-17 |
Family
ID=26076626
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES10173342T Expired - Lifetime ES2391623T3 (es) | 2001-06-22 | 2002-06-24 | Complejo soluble que contiene una glicoproteína de superficie retroviral |
| ES02747428T Expired - Lifetime ES2333108T3 (es) | 2001-06-22 | 2002-06-24 | Utilizacion de chaperonas fkbp como herramienta de expresion. |
| ES02758265T Expired - Lifetime ES2372031T3 (es) | 2001-06-22 | 2002-06-24 | Complejo soluble que contiene una glicoproteína de superficie retroviral y fkpa o slyd. |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES10173342T Expired - Lifetime ES2391623T3 (es) | 2001-06-22 | 2002-06-24 | Complejo soluble que contiene una glicoproteína de superficie retroviral |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES02758265T Expired - Lifetime ES2372031T3 (es) | 2001-06-22 | 2002-06-24 | Complejo soluble que contiene una glicoproteína de superficie retroviral y fkpa o slyd. |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7244819B2 (es) |
| EP (3) | EP2267452B8 (es) |
| JP (6) | JP4262594B2 (es) |
| KR (2) | KR100611545B1 (es) |
| CN (1) | CN100510068C (es) |
| AT (2) | ATE522603T1 (es) |
| AU (2) | AU2002317841A1 (es) |
| BR (1) | BRPI0210598B8 (es) |
| CA (3) | CA2449747C (es) |
| DE (1) | DE60233942D1 (es) |
| DK (2) | DK2267452T3 (es) |
| ES (3) | ES2391623T3 (es) |
| MX (1) | MXPA03011455A (es) |
| PL (2) | PL218245B1 (es) |
| WO (2) | WO2003000877A2 (es) |
Families Citing this family (51)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100611545B1 (ko) * | 2001-06-22 | 2006-08-10 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 레트로바이러스 표면 당단백질을 함유하는 가용성 복합체 |
| JP4168028B2 (ja) * | 2002-06-25 | 2008-10-22 | 積水化学工業株式会社 | 発現ベクター、宿主、融合タンパク質、融合タンパク質の製造方法及びタンパク質の製造方法 |
| AU2003283205A1 (en) * | 2002-11-26 | 2004-06-18 | Danmarks Fodevare- Og Veterinaerforskning | Dendrimer conjugates for selective of protein aggregates |
| EP1621555A4 (en) * | 2003-04-18 | 2006-08-02 | Sekisui Chemical Co Ltd | IMMUNOGENIC, COMPOSITION FOR IMMUNOLOGICAL USE AND METHOD FOR THE PRODUCTION OF ANTIBODIES WITH THEIR USE |
| AU2005317828A1 (en) * | 2004-12-23 | 2006-06-29 | Novozymes Delta Limited | Gene expression technique |
| CA2562738C (en) | 2005-10-26 | 2011-07-12 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Soluble rubella e1 envelope antigens |
| ATE527345T1 (de) * | 2006-01-03 | 2011-10-15 | Hoffmann La Roche | Chimäres fusionsprotein mit überlegenen chaperon- und faltungsaktivitäten |
| WO2007084021A2 (en) * | 2006-01-17 | 2007-07-26 | Instituto De Medicina Molecular | Compositions and methods for diagnosing hiv-2 infection |
| JP2009536958A (ja) | 2006-05-11 | 2009-10-22 | ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー | 細胞からのタンパク質抽出方法 |
| GB0611405D0 (en) | 2006-06-09 | 2006-07-19 | Univ Belfast | FKBP-L: A novel inhibitor of angiogenesis |
| DK2112158T3 (da) | 2007-04-20 | 2012-01-23 | Hoffmann La Roche | Påvisning af primære infektioner med patogener |
| US20100210827A1 (en) * | 2007-09-06 | 2010-08-19 | Nutrex Technology Co., Ltd. | Preparation Method Of Recombinant Protein By Use Of A Fusion Expression Partner |
| US9207240B2 (en) | 2007-11-14 | 2015-12-08 | Arbor Vita Corporation | Method of efficient extraction of protein from cells |
| EP2222694B1 (en) | 2007-12-13 | 2014-01-15 | Roche Diagnostics GmbH | Novel rubella e1 envelope protein variants and their use in the detection of anti-rubella antibodies |
| EP2127678A1 (en) | 2008-05-26 | 2009-12-02 | Roche Diagnostics GmbH | SlpA as a tool for recombinant protein and enzyme technology |
| CA2793959C (en) | 2010-03-25 | 2019-06-04 | Oregon Health & Science University | Cmv glycoproteins and recombinant vectors |
| EP2670847B1 (en) * | 2011-02-03 | 2016-10-05 | XOMA Technology Ltd. | Methods and materials for enhancing functional protein expression in bacteria |
| AR086250A1 (es) | 2011-05-05 | 2013-11-27 | Hoffmann La Roche | Polipeptido de fusion presentador de una secuencia de aminoacidos y utilizacion del mismo |
| CA2832109C (en) | 2011-06-10 | 2021-07-06 | Oregon Health & Science University | Cmv glycoproteins and recombinant vectors |
| EP2568289A3 (en) | 2011-09-12 | 2013-04-03 | International AIDS Vaccine Initiative | Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing hiv-1 proteins by broadly neutralizing antibodies |
| US9402894B2 (en) | 2011-10-27 | 2016-08-02 | International Aids Vaccine Initiative | Viral particles derived from an enveloped virus |
| EP2617731A1 (en) | 2012-01-19 | 2013-07-24 | Roche Diagnostics GmbH | Soluble immunoreactive Treponema pallidum TpN47 antigens |
| ES2631608T3 (es) | 2012-06-27 | 2017-09-01 | International Aids Vaccine Initiative | Variante de la glicoproteína Env del VIH-1 |
| EP2706115A1 (en) | 2012-09-06 | 2014-03-12 | Roche Diagnostics GmbH | Chaperone-chaperone fusion polypeptides for reduction of interference and stabilization of immunoassays |
| AU2013343667A1 (en) | 2012-11-08 | 2015-04-02 | F. Hoffmann-La Roche Ag | HER3 antigen binding proteins binding to the beta-hairpin of HER3 |
| MA38164B1 (fr) * | 2012-11-08 | 2018-11-30 | Hoffmann La Roche | Protéines de liaison à l'antigène anti-her3/her4 se liant à la boucle en épingle à cheveux beta |
| US12540318B2 (en) * | 2012-11-08 | 2026-02-03 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Nucleic acids encoding chimeric polypeptides for library screening |
| EP2827146A1 (en) | 2013-07-18 | 2015-01-21 | Roche Diagnostics GmbH | Vibrio cholerae lipoprotein 15 (Lp15) variants as anti-interference additive in TpN17-based immunoassays for detection of anti-Treponema antibodies |
| US20150065381A1 (en) | 2013-09-05 | 2015-03-05 | International Aids Vaccine Initiative | Methods of identifying novel hiv-1 immunogens |
| EP3049437A1 (en) | 2013-09-27 | 2016-08-03 | F. Hoffmann-La Roche AG | Thermus thermophilus slyd fkbp domain specific antibodies |
| US10058604B2 (en) | 2013-10-07 | 2018-08-28 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers |
| EP2913338A1 (en) | 2014-02-28 | 2015-09-02 | Roche Diagniostics GmbH | Soluable and immunoreactive variants of HTLV capsid antigen p24 |
| JP2015215244A (ja) * | 2014-05-12 | 2015-12-03 | 富士レビオ株式会社 | 免疫測定における抗ｈｔｌｖ抗体の検出感度を向上させる方法 |
| MX2016014416A (es) | 2014-05-14 | 2017-02-23 | Hoffmann La Roche | Anticuerpos anti-her3 que se unen a la horquilla beta de her3. |
| JP6695812B2 (ja) | 2014-05-14 | 2020-05-20 | エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト | Ｈｅｒ３のベータヘアピン及びｈｅｒ２のドメインｉｉに結合するｈｅｒ３／ｈｅｒ２二重特異性抗体 |
| CA2966358C (en) | 2014-12-01 | 2021-12-07 | Pfenex Inc. | Fusion partners for peptide production |
| US20180023098A1 (en) * | 2015-02-13 | 2018-01-25 | Sekisui Chemical Co., Ltd. | Nucleic acid, fusion protein, recombined cell, and isoprene or cyclic terpene production method |
| US10174292B2 (en) | 2015-03-20 | 2019-01-08 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers |
| US9931394B2 (en) | 2015-03-23 | 2018-04-03 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers |
| JP6967002B2 (ja) * | 2015-12-15 | 2021-11-17 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | トランスグルタミナーゼ認識部位を有するｆｋｂｐドメイン |
| WO2017207599A1 (en) | 2016-05-31 | 2017-12-07 | Roche Diagnostics Gmbh | Method for serological detection of viral antigens |
| KR102156994B1 (ko) | 2016-05-31 | 2020-09-17 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | Hcv 코어 항원의 신속한 검출을 위한 전처리 방법 |
| WO2017220551A1 (en) * | 2016-06-20 | 2017-12-28 | Metgen Oy | Method for obtaining active insoluble xylose isomerase |
| JP7068323B2 (ja) | 2017-02-02 | 2022-05-16 | エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー | 少なくとも２種のペグ化された分析物特異的結合剤を使用する免疫アッセイ |
| CN110709410B (zh) | 2017-04-26 | 2024-07-02 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 可溶性和免疫反应性寨卡病毒ns1多肽 |
| EP3658171B1 (en) | 2017-07-27 | 2023-08-30 | Roche Diagnostics GmbH | Multi-epitope fusion protein of an hcv antigen and uses thereof |
| CN110066343B (zh) * | 2019-05-23 | 2021-04-09 | 北京新创生物工程有限公司 | 一种用于检测hiv新发感染的重组抗原及其应用 |
| EP4139684A1 (en) | 2020-04-23 | 2023-03-01 | F. Hoffmann-La Roche AG | Corona nucleocapsid antigen for use in antibody-immunoassays |
| WO2023012321A1 (en) | 2021-08-06 | 2023-02-09 | Roche Diagnostics Gmbh | Chimeric igg-fc-binding ligand polypeptide and uses thereof for igg affinity purification |
| JP2025517121A (ja) | 2022-05-03 | 2025-06-03 | エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー | 免疫診断アッセイのためのＨＩＶ ｇｐ４１バリアント |
| WO2025098623A1 (en) | 2023-11-09 | 2025-05-15 | Roche Diagnostics Gmbh | Transglutaminase substrates for labeling |
Family Cites Families (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2095818B (en) | 1981-03-27 | 1985-10-02 | Exxon Research Engineering Co | Staged adsorption/resorption heat pump |
| US4735896A (en) | 1986-03-04 | 1988-04-05 | United Biomedical, Inc. | Synthetic peptide and process of using same for the detection and diagnosis of AIDS and pre-AIDS conditions |
| US4879212A (en) | 1986-04-02 | 1989-11-07 | United Biomedical Inc. | Peptide composition and method for the detection of antibodies to HTLV-III |
| US6024983A (en) | 1986-10-24 | 2000-02-15 | Southern Research Institute | Composition for delivering bioactive agents for immune response and its preparation |
| DE3705686C2 (de) | 1987-02-23 | 1995-11-30 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur Bestimmung von Antikörpern |
| NZ224663A (en) | 1987-05-28 | 1990-11-27 | Amrad Corp Ltd | Fusion proteins containing glutathione-s-transferase and expression of foreign polypeptides using glutathione-s-transferase encoding vectors |
| SE8704185L (sv) | 1987-10-28 | 1989-04-29 | Ferring Ab | Nya peptider, artificiella antigener och immunoanalystestsatser |
| CA2003383A1 (en) * | 1988-11-23 | 1990-05-23 | Sushil G. Devare | Synthetic dna derived recombinant hiv antigens |
| EP0602046B2 (en) | 1991-06-14 | 2007-02-21 | IDEXX Laboratories Inc | Detection of feline immunodeficiency viruses |
| FI942907A7 (fi) * | 1991-12-20 | 1994-06-17 | Novo Nordisk As | Menetelmä lipaasin valmistamiseksi |
| JP2001504572A (ja) | 1992-04-09 | 2001-04-03 | アボツト・ラボラトリーズ | Ｈｉｖ抗原及びｈｉｖ抗体を検出するためのアッセイ |
| WO1993025533A1 (en) | 1992-06-05 | 1993-12-23 | Abbott Laboratories | Methods and reagents for the determination of immunosuppressive agents |
| DK0663010T3 (da) * | 1992-10-02 | 2000-11-13 | Res Corp Technologies Inc | Fremgangsmåde til forøgelse af sekretion af overudtrykte proteiner |
| US5459051A (en) | 1993-03-26 | 1995-10-17 | Celtrix Pharmaceuticals, Inc. | Methods and vectors for over-expression of ubiquitin fusion proteins in host cells |
| DE4428705A1 (de) * | 1994-08-12 | 1996-02-15 | Boehringer Mannheim Gmbh | Rekombinantes Antigen aus der NS3-Region des Hepatitis C Virus |
| WO1996012796A1 (en) | 1994-10-25 | 1996-05-02 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Conditional transformation of genetically engineered cells |
| WO1996041865A1 (en) | 1995-06-07 | 1996-12-27 | Ariad Gene Therapeutics, Inc. | Rapamcycin-based regulation of biological events |
| WO1997010502A1 (en) | 1995-09-15 | 1997-03-20 | Merck & Co., Inc. | A high throughput assay using fusion proteins |
| US5723125A (en) * | 1995-12-28 | 1998-03-03 | Tanox Biosystems, Inc. | Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide |
| GB9614114D0 (en) | 1996-07-05 | 1996-09-04 | Amcor Packaging Uk Ltd | New packages |
| JP2001501093A (ja) | 1996-09-26 | 2001-01-30 | メディカル リサーチ カウンシル | シャペロン断片 |
| US6225082B1 (en) * | 1997-05-09 | 2001-05-01 | Research Corporation Technologies, Inc. | Myelin basic protein MRNA transport and translation enhancer sequences |
| US5989868A (en) * | 1997-09-12 | 1999-11-23 | The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma | Fusion protein systems designed to increase soluble cytoplasmic expression of heterologous proteins in esherichia coli |
| EP1045915A2 (en) | 1998-01-15 | 2000-10-25 | Ariad Gene Therapeutics, Inc. | Regulation of biological events using multimeric chimeric proteins |
| DE19913117A1 (de) * | 1998-05-06 | 1999-11-11 | Roche Diagnostics Gmbh | Entstörung durch Rheumafaktoren |
| US6248329B1 (en) * | 1998-06-01 | 2001-06-19 | Ramaswamy Chandrashekar | Parasitic helminth cuticlin nucleic acid molecules and uses thereof |
| DE69836647D1 (de) | 1998-10-02 | 2007-01-25 | Vadeco Biotech Gmbh & Co Kg | Methode zur herstellung von (poly)peptiden unter verwendung von verkürzten varianten von sv40 'large' t antigen mit einem intakten n terminus |
| CA2346962A1 (en) | 1998-11-06 | 2000-05-18 | President And Fellows Of Harvard College | Fk506-based regulation of biological events |
| CA2364568A1 (en) | 1999-03-17 | 2000-09-21 | Adrian Woolfson | Method for refolding molecules of polypeptides containing ig domains |
| CA2372199A1 (en) | 1999-05-14 | 2000-11-23 | Medical Research Council | Oligomeric chaperone proteins |
| GB9913437D0 (en) | 1999-06-09 | 1999-08-11 | Medical Res Council | Fusion proteins |
| EP1077263A1 (de) * | 1999-07-29 | 2001-02-21 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Verfahren zur Herstellung von natürlich gefalteten und sekretierten Proteinen durch Co-Sekretion von Chaperonen |
| CA2403718A1 (en) * | 2000-03-17 | 2001-09-27 | Panacos Pharmaceuticals, Inc. | A method for generating immunogens that elicit neutralizing antibodies against fusion-active regions of hiv envelope proteins |
| JP2002262883A (ja) * | 2001-03-13 | 2002-09-17 | Sekisui Chem Co Ltd | モノクローナル抗体の製造方法 |
| KR100611545B1 (ko) * | 2001-06-22 | 2006-08-10 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 레트로바이러스 표면 당단백질을 함유하는 가용성 복합체 |
-
2002
- 2002-06-24 KR KR1020067005314A patent/KR100611545B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2002-06-24 DK DK10173342.6T patent/DK2267452T3/da active
- 2002-06-24 ES ES10173342T patent/ES2391623T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-06-24 JP JP2003507262A patent/JP4262594B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-06-24 PL PL397776A patent/PL218245B1/pl unknown
- 2002-06-24 CA CA2449747A patent/CA2449747C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-06-24 BR BRPI0210598 patent/BRPI0210598B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-06-24 EP EP10173342A patent/EP2267452B8/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-06-24 JP JP2003507263A patent/JP4174422B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-06-24 PL PL367679A patent/PL215170B1/pl unknown
- 2002-06-24 WO PCT/EP2002/006956 patent/WO2003000877A2/en not_active Ceased
- 2002-06-24 CN CNB028124715A patent/CN100510068C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2002-06-24 CA CA2450476A patent/CA2450476C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-06-24 EP EP02758265A patent/EP1402015B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-06-24 MX MXPA03011455A patent/MXPA03011455A/es active IP Right Grant
- 2002-06-24 ES ES02747428T patent/ES2333108T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-06-24 AT AT02758265T patent/ATE522603T1/de active
- 2002-06-24 US US10/179,038 patent/US7244819B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-06-24 DE DE60233942T patent/DE60233942D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-06-24 ES ES02758265T patent/ES2372031T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-06-24 KR KR1020037016770A patent/KR100702373B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2002-06-24 AU AU2002317841A patent/AU2002317841A1/en not_active Abandoned
- 2002-06-24 AU AU2002325265A patent/AU2002325265B2/en not_active Expired
- 2002-06-24 AT AT02747428T patent/ATE445016T1/de active
- 2002-06-24 DK DK02758265.9T patent/DK1402015T3/da active
- 2002-06-24 CA CA2770453A patent/CA2770453C/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-06-24 WO PCT/EP2002/006957 patent/WO2003000878A2/en not_active Ceased
- 2002-06-24 EP EP02747428A patent/EP1402041B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2006
- 2006-12-04 JP JP2006326846A patent/JP4309910B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-04-13 US US11/786,847 patent/US8426167B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-07-12 JP JP2007183508A patent/JP4320351B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-11-07 JP JP2008286959A patent/JP2009102320A/ja not_active Withdrawn
-
2009
- 2009-02-06 JP JP2009025509A patent/JP4523660B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2333108T3 (es) | Utilizacion de chaperonas fkbp como herramienta de expresion. | |
| ES2375863T3 (es) | Prote�?na de fusión quimérica con actividades de chaperón y de plegamiento superiores. | |
| ES2590340T3 (es) | SlpA como herramienta para la tecnología recombinante de proteínas y enzimas | |
| Tsukiji et al. | Sortase‐mediated ligation: a gift from gram‐positive bacteria to protein engineering | |
| ES2307550T3 (es) | Di-u oligomero de un di-, tri-,tetra- o pentametro de proteinas de fusion recombinantes. | |
| JP5823483B2 (ja) | 塩基性タンパク質タグに融合したプロセシング酵素 | |
| EP2910634A1 (en) | Vaccine for preventing porcine edema disease | |
| KR102038876B1 (ko) | 목적 단백질의 수용성 발현을 증진시키기 위한 신규한 펩타이드 | |
| ES2415890T3 (es) | Procedimiento de preparación de proteínas triméricas | |
| CN1860130B (zh) | 新的可溶且稳定的三聚体形式的gp41多肽 | |
| KR20210079235A (ko) | Whep 도메인 융합에 의한 목적 단백질의 수용성 증진 방법 | |
| WO2015127365A2 (en) | Calcium-independent sortase a mutants | |
| HK1128727B (en) | Chimaeric fusion protein with superior chaperone and folding activities | |
| WO2026007971A1 (zh) | 重组抗原、含其的试剂及用途 | |
| HK1138620B (en) | Slpa as a tool for recombinant protein and enzyme technology |