BRPI0309527B1 - Métodos para produção de monatina - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS PARA PRODUÇÃO DE MONATINA".

REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIOD CORRELATO

Este pedido reivindica prioridade para Pedido de Patente U.S. 60/374.831, depositado em 23 de abril de 2002.

CAMPO

Esta descrição proporciona polipeptídeos e caminhos biossinté-ticos que são úteis na produção de indol-3-piruvato, ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutárico (MP) e/ou monatina. FUNDAMENTO Indol piruvato lndol-3-piruvato é um forte antioxidante que se acredita neutralizar tensão oxidante em tecidos com altas concentrações de oxigênio (Politi e outros, "Recent advances in Tryptophan Research", editado por G.A. Filippini e outros, Plenum Press, Nova Iorque, 1996, pp. 291-8). Indol piruvato também é um intermediário em um caminho para produzir ácido indol-acético (IAA), o hormônio primário de crescimento de plantas auxina (fator de promoção de crescimento difusível). IAA é ativo em quantidades de submicro-grama em uma faixa de processos fisiológicos que incluem dominância api-cal, tropismos, alongamento de brotos, indução de divisão celular cambial e iniciação de raízes. Auxinas sintéticas são usadas em horticultura para induzir formação de raízes e promover a formação e desenvolvimento de frutas. Em altas concentrações, as auxinas sintéticas são herbicidas eficazes contra plantas de folhas largas. Auxinas naturais produzidas por fermentação poderão ser consideradas mais ambientalmente favoráveis do que herbicidas quimicamente produzidos. Reguladores de crescimento registraram vendas mundiais em 1999 de 1,4 bilhões de dólares americanos (0,4 bilhões de libras).

Alguns exemplos de patentes sobre ácido indol acético e derivados deste incluem: Patente U.S. N° 5.843.782, Micropropagação de rose plants, auxina usada em meio de cultura, e Patente U.S. N° 5.952.231, Micropropagação de rose plants.

Além de utilidades relacionadas com plantas, ácido indol acético é útil em aplicações farmacêuticas. Por exemplo, a Patente U.S. N° 5.173.497, "Método de preparação de ácidos alfa-oxopirrolo[2,3-B]indol acético e derivados", propõe o uso desses compostos no tratamento de dano à memória tal como aquele associado a doença de Alzheimer e demência senil. O mecanismo proposto in Patente U.S. N° 5.176.497 é que esses compostos inibem os níveis de polipeptídeo acetilcolinesterase e aumentam os níveis de acetilcolina no cérebro. lndol-3-carbinol é produzido a partir de ácido indol-3-acético por oxidação catalisada por peroxidase e pode facilmente ser convertido em diindolilmetano. Ambos os compostos são relatados eliminar toxinas e promover a produção de hormônios benéficos à saúde das mulheres.

Derivados de Triptofano D-triptofano clorado foi identificado como um edulcorante não-nutritivo e há interesse crescente em perseguir outros derivados também. Monatina é um edulcorante natural que é de composição similar ao aminoá-cido triptofano. Ela pode ser extraída da casca das raízes do arbusto sul-africano Sclerochiton ilicifolius e promete na indústria de alimentos e bebidas como um edulcorante de alta intensidade. Alguns exemplos de patentes sobre monatina incluem: Patente U.S. N° 5.994.559, síntese de monatina - A edulcorante natural de alta intensidade, Patente U.S. N° 4.975.298, compostos de 3-(1-amino-1,3-dicarbóxi-3-hidróxi-but-4-il)-indol, Patente U.S. N° 5.128.164, Composição para consumo humano contendo compostos de 3-1(1-amino-1,3-dicarbóxi-3-hidróxi-but-4-il)-indol; e Patente U.S. N° 5.128.482, Processo para a produção de 3-(1-amino-1,3-dicarbóxi-3-hidróxi-but-4-il)-indol.

Alguns dos precursores de monatina descritos aqui podem também ser úteis como edulcorantes sintéticos ou como intermediários na síntese de derivados de monatina.

SUMÁRIO A descrição proporciona diversas rotas biossintéticas para produzir monatina a partir de glicose, triptofano, ácido indol-3-lático e/ou através de precursores de monatina tais indol-3-piruvato e ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutárico. São descritos polipeptídeos e sequências de ácidos nucléicos que podem ser usados para produzir monatina, indol-3-piruvato e ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutárico.

Monatina pode ser produzida através de indol-3-piruvato, ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutárico (precursor de monatina, MP, a forma alfa-ceto de monatina), ácido indol-3-lático, triptofano e/ou glicose (Figura 1). Métodos de produção ou fabricação de monatina ou seus intermediários mostrados nas Figuras 1-3 e 11-13 que envolvem converter um substrato em um primeiro produto e, em seguida, converter o primeiro produto em um segundo produto, e assim por diante, até o produto final desejado ser criado, são descritos.

As Figuras 1-3 e 11-13 mostram produtos intermediários potenciais e produtos finais em caixas. Por exemplo, uma conversão de um produto em outro, tal como glicose em triptofano, triptofano em indol-3-piruvato, indol-3-piruvato em MP, MP em monatina ou ácido indol-3-lático (indol-lactato) em indol-3-piruvato, pode ser realizada usando esses métodos. Essas conversões podem ser facilitadas química ou biologicamente. O termo "converter" refere-se ao uso de meios químicos ou polipeptídeos em uma reação que muda um primeiro intermediário em um segundo intermediário. O termo "conversão química" refere-se a reações que não são ativamente facilitadas por polipeptídeos. O termo "conversão biológica" refere-se a reações que são ativamente facilitadas por polipeptídeos. Conversões podem ocorrer in vivo ou in vitro. Quando conversões biológicas são usadas, os polipeptídeos e/ou células podem ser imobilizados em suportes tal por ligação química sobre suportes poliméricos. A conversão pode ser realizada usando qualquer reator conhecido daquele versado no estado da técnica, por exemplo em um reator de batelada ou um reator contínuo. São também proporcionados métodos que incluem contactar um primeiro polipeptídeo com um substrato e produzir um primeiro produto, e, em seguida, contactar com um segundo polipeptídeo o primeiro produto criado e criar um segundo produto, e então contactar com um terceiro poli- peptídeo o segundo produto criado e criar um terceiro produto, por exemplo monatina. Os polipeptídeos usados e os produtos produzidos são mostrados nas Figuras 1-3 e 11-13.

Polipeptídeos, e suas seqüências de codificação, que podem ser usados para realizar as conversões mostradas nas Figuras 1-3 e 11-13 são descritos. Em alguns exemplos, polipeptídeos que apresentam uma ou mais mutações pontuais que permitem ser modificadas a especificidade do substrato e/ou a atividade dos polipeptídeos são usados para produzir monatina. Células isoladas e recombinantes que produzem monatina são descritas. Essas células podem ser qualquer célula, tal como uma célula vegetal, animal, bacteriana, de lêvedo, algácea, arqueal ou fúngica.

Em um exemplo particular, as células descritas incluem uma ou mais das seguintes atividades, por exemplo duas ou mais ou três ou mais, das seguintes atividades: triptofano aminotransferase (EC 2.6.1.27), tirosina aminotransferase (aromática) (EC 2.6.1.5), aminotransferase substrato múltiplo (EC 2.6.1.-), aspartato aminotransferase (EC 2.6.1.1), triptofano desi-drogenase (EC 1.4.1.19), triptofano-fenilpiruvato transaminase (EC 2.6.1.28), L-aminoácido oxidase (EC 14.3.2), triptofano oxidase (sem número EC, Ha-dar e outros, J. Bacteriol 125:1096-1104, 1976, e Furuya e outros, Biosci Biotechnol Biochem 64:1486-93, 2000), D-aminoácido desidrogenase (EC 1.4.99.1), D-aminoácido oxidase (EC 14.3.3), D-alanina aminotransferase (EC 2.6.1.21), sintase/liase (EC 4.1.3.-), tal como 4-hidróxi-4-metil-2-oxoglutarato aldolase (EC 4.1.3.17) ou 4-hidróxi-2-oxoglutarato aldolase (EC 4.1.3.16), sintase/liase (4.1.2.-), D-triptofano aminotransferase (Kohiba e Mito, Atas do 8o. Simpósio Internacional Sobre Vitamina B6 e Catálise com Carbonila, Osaka, Japão, 1990), fenilalanina desidrogenase (EC 1.4.120) e/ou glutamato desidrogenase (EC 1.4.1.2,1.4.1.3,1.4.1.4).

Em um outro exemplo, as células incluem uma ou mais, por exemplo duas ou mais ou três ou mais, das seguintes atividades: indol lac-tato desidrogenase (EC 1.1.1.110), R-4-hidroxifenil lactato desidrogenase (EC 1.1.1.222), 3-(4)-hidroxifenilpiruvato redutase (EC 1.1.1.237), lactato desidrogenase (EC 1.1127, 1.11.28, 1.12.3), (3-imidazol-5-il) lactato desi- drogenase (EC 1.1.1.111), lactato oxidase (EC 1.1.3.-), sintase/liase (4.1.3.-), tal como 4-hidróxi-4-metil-2-oxoglutarato aldolase (EC 4.1.3.17) ou 4-hidróxi-2-oxoglutarato aldolase (EC 4.1.3.16), sintase/liase (4.1.2.-), triptofa-no desidrogenase (EC 1.4.1.19), triptofano-fenilpiruvato transaminase (EC 2.6.1.28), triptofano aminotransferase (EC 2.6.1.27), tirosina aminotransfera-se (aromática) (EC 2.6.1.5), aminotransferase substrato múltiplo (EC 2.6.1.-), aspartato aminotransferase (EC 2.6.1.1), fenilalanina desidrogenase (EC 1.4.1.20) , glutamato desidrogenase (EC 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4), D-aminoácido desidrogenase (EC 1.4.99.1), D-triptofano aminotransferase e/ou D-alanina aminotransferase (EC 2.6.1.21).

Adicionalmente, as células descritas podem incluir uma ou mais das seguintes atividades, por exemplo duas ou mais ou três ou mais, das seguintes atividades: triptofano aminotransferase (EC 2.6.1.27), tirosina aminotransferase (aromática) (EC 2.6.1.5), aminotransferase substrato múltiplo (EC 2.6.1.-), aspartato aminotransferase (EC 2.6.1.1), triptofano desidrogenase (EC 1.4.1.19), triptofano-fenilpiruvato transaminase (EC 2.6.1.28), L-aminoácido oxidase (EC 1.4.3.2), triptofano oxidase (sem número EC), D-aminoácido desidrogenase (EC 1.4.99.1), D-aminoácido oxidase (EC 1.4.3.3), D-alanina aminotransferase (EC 2.6.1.21), indol lactato desidrogenase (EC 1.1.1.110), R-4-hidroxifenil lactato desidrogenase (EC 1.1.1.222), 3-(4)-hidroxifenilpiruvato redutase (EC 1.1.1.237), lactato desidrogenase (EC 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3), (3-imidazol-5-il) lactato desidrogenase (EC 1.1.1.111), lactato oxidase (EC 1.1.3.-), sintase/liase (4.1.3.-), tal como 4-hidróxi-4-metil-2-oxoglutarato aldolase (EC 4.1.3.17) ou 4-hidroxi-2-oxoglutarato aldolase (EC 4.1.3.16), sintase/liase (4.1.2.-), glutamato desidrogenase (EC 1.4.1.2, 1.4.11.3, 1.4.14), fenilalanina desidrogenase (EC 1.4.1.20) e/ou D-triptofano aminotransferase.

Monatina pode ser produzida através de um método que inclui contactar triptofano e/ou ácido indol-3-lático com um primeiro polipeptídeo, onde o primeiro polipeptídeo converte triptofano e/ou ácido indol-3-lático em indol-3-piruvato (a forma D ou a forma L de triptofano e/ou ácido indol-3-lático pode ser usada como o substrato que é convertido em indol-3-piruvato; aquele versado no estado da técnica entenderá que o polipeptídeo escolhido para essa etapa exibirá idealmente a especificidade apropriada), contactar o indol-3-piruvato resultante com um segundo polipeptídeo, onde o segundo polipeptídeo converte o indol-3-piruvato em ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetil)- 4-cetoglutárico (MP), e contactar o MP com um terceiro polipeptídeo, onde o terceiro polipeptídeo converte MP em monatina. Polipeptídeos exemplares que podem ser usados para essas conversões são mostrados nas Figuras 2 e 3.

Um outro aspecto da invenção proporciona composições tal como MP, células que contêm pelo menos dois polipeptídeos, ou às vezes pelo menos três ou pelo menos quatro polipeptídeos, que são condificados em pelo menos uma seqüência exógena de ácidos nucléicos.

Estes e outros aspectos da descrição são evidentes da descrição detalhada e exemplos ilustrativos seguintes.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 mostra caminhos biossintéticos usados para produzir monatina e/ou indol-3-piruvato. Um caminho produz indol-3-piruvato via trip-tofano, enquanto outro produz indol-3-piruvato via ácido indol-3-lático. Monatina é subseqüentemente produzida via um intermediário ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutárico (MP).

Compostos mostrados em caixas são substratos e produtos produzidos nos caminhos biossintéticos.

Composições adjacentes às setas são co-fatores ou reagentes que podem ser usados durante a conversão de um substrato em um produto. O co-fator ou reagente usado dependerá do polipeptídeo usado para a etapa particular do caminho biossintético. O co-fator PLP (piridoxal 5'-fosfato) pode catalisar reações independente de um polipeptídeo, e, portanto, proporcionando meramente PLP pode permitir a progressão de substrato em produto. A Figura 2 é um diagrama mais detalhado do caminho biossintético que utiliza o intermediário MP. Os substratos para cada etapa nos caminhos são mostrados em caixas. Os polipeptídeos que permitem a conversão entre substratos são listados de forma adjacente às setas entre os substratos. Cada polipeptídeo é descrito por seu nome comum e número de classe enzimática (EC). A Figura 3 é um diagrama mais detalhado do caminho biossinté-tico da conversão de ácido indol-3-lático em indol-3-piruvato. Os substratos são mostrados em caixas e os polipeptídeos que permitem a conversão entre os substratos são listados de forma adjacente às setas entre os substratos. Cada polipeptídeo é descrito por seu nome comum e número de classe enzimática (EC). A Figura 4 mostra uma reação possível para produzir MP via meio químico.

As Figuras 5A e 5B são cromatogramas que mostram a identificação LC/EM de monatina produzida enzimaticamente. A Figura 6 é um espectro de massa de eletropulverização de monatina sintetizada enzimaticamente.

As Figuras 7A e 7B mostram cromatogramas das análises de íons-filhos LC/EM/EM de monatina produzida em uma mistura enzimática. A Figura 8 é um cromatograma que mostra a medição de massa de alta resolução de monatina produzida enzimaticamente.

As Figuras 9A-9C são cromatogramas que mostram a separação quiral de (A) R-triptofano, (B) S-triptofano e (C) monatina produzida enzimaticamente. A Figura 10 é um gráfico de barras que mostra a quantidade relativa de monatina produzida em células bacterianas após indução por IPTG. (-) indica uma falta de adição de substrato (sem adição de triptofano ou piru-vato).

As Figuras 11-12 são diagramas esquemáticos que mostram caminhos usados para aumentar o rendimento de monatina produzida a partir de triptofano ou indol-3-piruvato. A Figura 13 é um diagrama esquemático que mostra um caminho que pode ser usado para aumentar o rendimento de monatina produzida a partir de triptofano ou indol-3-piruvato.

LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

As seqüências de ácidos nucléicos e aminoácidos listadas na listagem de seqüências acompanhantes são mostradas usando abreviações padrão de letras para bases de nucleotídeos, e código de três letras para aminoácidos. Somente um filamento de cada seqüência de ácidos nucléicos é mostrado, mas entende-se que o filamento complementar está incluído por qualquer referência ao filamento não mostrado.

As SEQ ID NOS: 1 e 2 mostram as seqüências de ácidos nucléicos e aminoácidos de uma aminotransferase de Sinorhizobium meliloti, respectivamente (gene tatA, chamado tirosina ou aminotransferase aromática na literatura).

As SEQ ID NOS: 3 e 4 mostram as seqüências de ácidos nucléicos e aminoácidos de uma tirosina aminotransferase de Rhodobacter sphae-roides (2.4.1), respectivamente (por homologia com tatA (SEQ ID NOS: 1 e 2) predita como sendo uma "aspartato aminotransferase" através de software genômico).

As SEQ ID NOS: 5 e 6 mostram as seqüências de ácidos nucléicos e aminoácidos de uma tirosina aminotransferase de Rhodobacter sphae-roides (35053), respectivamente (nova, clonada com base na seqüência 2.4.1 SEQ ID NOS 3 e 4).

As SEQ ID NOS: 7 e 8 mostram as seqüências de ácidos nucléicos e aminoácidos de uma aminotransferase substrato amplo (bsat) de Leishmania major, respectivamente.

As SEQ ID NOS: 9 e 10 mostram as seqüências de ácidos nucléicos e aminoácidos de uma aminotransferase aromática (ara7) de Baciltus subtilis, respectivamente.

As SEQ ID NOS: 11 e 12 mostram novas seqüências de ácidos nucléicos e aminoácidos de uma aminotransferase aromática (araT) de Lactobacillus amylovorus, respectivamente (por homologia identificadas como uma aminotransferase aromática).

As SEQ ID NOS: 13 e 14 mostram as seqüências de ácidos nucléicos e aminoácidos de uma aminotransferase substrato múltiplo (msa) de R. sphaeroides (35053), respectivamente (identificadas como uma amino-transferase substrato múltiplo por homologia com N° de Acesso AAAE01000093.1, pb 14743-16155, e N° de Acesso ZP00005082.1).

As SEQ ID NOS: 15 e 16 mostram iniciadores usados para clo-nar a seqüência de D-alanina aminotransferase aromática (dat) de B. subti-lis.

As SEQ ID NOS: 17 e 18 mostram iniciadores usados para clo-nar a seqüência tatA de S. meliloti.

As SEQ ID NOS: 19 e 20 mostram iniciadores usados para clo-nar a seqüência de aminotransferase araTde B. subtilis.

As SEQ ID NOS: 21 e 22 mostram iniciadores usados para clo-nar as sequências de aminotransferase substrato múltiplo de Rhodobacter sphaeroides (2.4.1 e 35053).

As SEQ ID NOS: 23 e 24 mostram iniciadores usados para clo-nar a seqüência bsat de Leishmania major.

As SEQ ID NOS: 25 e 26 mostram iniciadores usados para clo-nar a seqüência araT de Lactobacillus amylovorus.

As SEQ ID NOS: 27 e 28 mostram iniciadores usados para clo-nar as seqüências tatA de R. sphaeroides (tanto 2.4.1 quanto 35053).

As SEQ ID NOS: 29 e 30 mostram iniciadores usados para clo-nar a seqüência aspC de E. coli (seqüência de genes N° de Acesso Genbank. AE000195.1, seqüência de proteínas genes N° de Acesso Genbank. AAC74014.1).

As SEQ ID NOS: 31 e 32 mostram as seqüências de ácidos nu-cléicos e aminoácidos de aminotransferase aromática (tyrB) de E. coli, respectivamente.

As SEQ ID NOS: 33 e 34 mostram iniciadores usados para clo-nar a seqüência tyrB de E. coli.

As SEQ ID NOS: 35-40 mostram iniciadores usados para clonar polipeptídeos com atividade 4-hidróxi-2-oxoglutarato aldolase (KHG) (EC 4.1.3.16).

As SEQ ID NOS: 41 e 42 mostram as seqüências de ácidos nu- cléicos de triptofanase (tna) de E. coli e tirosina fenol-liase (tpl) de Citrobac-ter freundíi, que codificam as proteínas P00913 (Gl:401195) e (Gl:401201), respectivamente.

As SEQ ID NOS: 43-46 mostram iniciadores usados para clonar polipeptídeos de triptofanase e polipeptídeos de β-tirosinase (tirosina fenol-liase).

As SEQ ID NOS: 47-54 mostram iniciadores usados para mudar polipeptídeos de triptofanase e polipeptídeos de β-tirosinase.

As SEQ ID NOS: 55-64 mostram iniciadores usados para clonar polipeptídeos com atividade 4-hidróxi-4-metil-2-oxoglutarato aldolase (EC 4.1.3.17).

As SEQ ID NOS: 65 e 66 mostram as seqüências de ácidos nu-cléicos e aminoácidos de 4-hidróxi-4-metil-2-oxoglutarato aldolase (proA) de C. testosteroni, respectivamente.

As SEQ ID NOS: 67-68 mostram iniciadores usados para clonar 4-hidróxi-4-metil-2-oxoglutarato aldolase iproA) de C. testosteroni em um óperon com aspC de E. coli em pET30 Xa/LIC.

As SEQ ID NOS: 69-72 mostram iniciadores usados para clonar aspC de E. coli e proA de C. testosteroni em pESC-his.

As SEQ ID NOS: 73-74 mostram seqüências adicionadas à extremidade 5' de iniciadores usados para clonar os genes apresentados aqui. DESCRICÃO DETALHADA DE DIVERSAS MODALIDADES Abreviações e Termos As explicações seguintes de termos e métodos são proporcionadas para descrever melhor a presente apresentação e guiar aqueles versados no estado da técnica na prática da presente apresentação. Como usado nesta invenção, "compreendendo" significa "incluindo", e as formas "um" ou "uma" ou "o(s)" ou "a(s)" incluem referências plurais, a não ser que o contexto dite claramente de outra maneira. Por exemplo, referência a "compreendendo uma proteína" inclui uma ou uma pluralidade de tais proteínas, e referência a "compreendendo a célula" inclui referência a uma ou mais células e equivalentes destas conhecidas daqueles versados no estado da técni- ca, e assim por diante. A menos que explicado de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos usados nesta invenção têm o mesmo significado conforme comumente entendido por aquele versado no estado da técnica a que esta apresentação pertence. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos nesta invenção possam ser usados na prática ou teste da presente apresentação, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Os materiais, métodos e exemplos são ilustrativos apenas e não pretendem ser limitativos. Outras características e vantagens da apresentação são evidentes da descrição detalhada seguinte e das reivindicações. cDNA (DNA complementar): Um pedaço de segmentos internos não-codificáveis (íntrons) ou seqüências reguladoras que faltam no DNA os quais determinam transcrição. cDNA pode ser sintetizado no laboratório por transcrição inversa de RNA mensageiro extraído de células.

Substituição conservativa: Uma ou mais substituições de amino-ácidos (por exemplo, 2, 5 ou 10 resíduos) para resíduos de aminoácidos que apresentam propriedades bioquímicas similares. Tipicamente, substituições conservativas têm pequeno a nenhum impacto na atividade de um polipeptí-deo resultante. Por exemplo, idealmente, um polipeptídeo de triptofano ami-notransferase que inclui uma ou mais substituições conservativas retém atividade triptofano aminotransferase. Um polipeptídeo pode ser produzido para conter uma ou mais substituições conservativas mediante manipulação da seqüência de nucleotídeos que codifica esse polipeptídeo usando, por exemplo, procedimentos padrão tais como mutagênese dirigida a sítios ou PCR.

Variantes substitutivas são aquelas em que pelo menos um resíduo na seqüência de aminoácidos foi removido e um resíduo diferente foi introduzido em seu lugar. Exemplos de aminoácidos que poderão ser substituídos no lugar de um aminoácido original em uma proteína e que são considerados como substituições conservativas incluem: ala substituído por ser ou thr; arg substituído por gin, his ou lys; asn substituído por glu, gin, lys, his, asp; asp substituído por asn, glu ou gin; cys substituído por ser ou ala; gin substituído por asn, glu, lys, his, asp ou arg; glu substituído por asn, gin, lys ou asp; gly substituído por por; his substituído por asp, lys, gin, arg, tyr; ile substituído por leu, met, vai, phe; leu substituído por ile, met, vai, phe; lys substituído por asn, glu, gin, his, arg; met substituído por ile, leu, vai, phe; phe substituído por trp, tyr, met, ile ou leu; ser substituído por thr, ala; thr substituído por ser ou ala; trp substituído por phe, tyr; tyr substituído por his, phe ou trp; e vai substituído por met, ile, leu.

Informação adicional sobre substituições conservativas pode ser encontrada in, entre outros locais, Ben-Bassat e outros (J. Bacteriol. 169:751-7, 1987), 0'Regan e outros (Gene 77:237-51, 1989), Sahin-Toth e outros (Protein Sei. 3:240-7,1994), Hochuli e outros (Bio/Technology 6:1321-5, 1988), WO 00/67796 (Curd e outros) e em livros-texto padrão de genética e biologia molecular.

Exógeno: O termo "exógeno" como usado nesta invenção com referência a ácido nucléico e a uma célula particular refere-se a qualquer ácido nucléico que não se origina dessa célula particular conforme encontrada na natureza. Assim, ácido nucléico que não ocorre naturalmente é considerado ser exógeno a uma célula, uma vez introduzido na célula. Ácido nucléico que ocorre naturalmente também pode ser exógeno a uma célula particular. Por exemplo, um cromossomo inteiro isolado de uma célula de pessoa X é um ácido nucléico exógeno com relação a uma célula de pessoa Y, uma vez esse cromossomo introduzido em célula de Y.

Funcionalmente equivalente: Tendo uma função equivalente. No contexto de uma enzima, moléculas funcionalmente equivalentes incluem diferentes moléculas que retêm a função da enzima. Por exemplo, equivalentes funcionais podem ser proporcionados através de alterações de se-qüência em uma seqüência de enzima, onde o peptídeo com uma ou mais alterações de seqüência retém uma função do peptídeo inalterado, tal que ele retenha sua atividade enzimática. Em um exemplo particular, um equivalente funcional de triptofano aminotransferase retém a capacidade de converter triptofano em indol-3-piruvato.

Exemplos de alterações de seqüência incluem, mas sem se limitar às mesmas, substituições conservativas, supressões, mutações, deslocamentos estruturais e inserções. Em um exemplo, um dado polipeptídeo liga-se a um anticorpo, e um equivalente funcional é um polipeptídeo que se liga ao mesmo anticorpo. Assim, um equivalente funcional inclui peptídeos que apresentam a mesma especificidade de ligação que um polipeptídeo e podem ser usados como um reagente em lugar do polipeptídeo. Em um exemplo, um equivalente funcional inclui um polipeptídeo onde a seqüência de ligação é descontínua, onde o anticorpo liga-se a um epitopo linear. Assim, se a seqüência peptídica é MPELANDLGL (aminoácidos 1-10 de SEQ ID NO: 12), um equivalente funcional inclui epitopos descontínuos, que podem aparecer como segue (** = qualquer número de aminoácidos interveni-entes): NH2-**-M**P**E**L**A**N**D**L**G**L-COOH. Nesse exemplo, o polipeptídeo é funcionalmente equivalente aos aminoácidos 1-10 de SEQ ID NO: 12 se a estrutura tridimensional do polipeptídeo é tal que ele pode ligar-se a um anticorpo monoclonal que se liga aos aminoácidos 1-10 de SEQ ID NO: 12.

Hibridização: O termo "hibridização" como usado nesta invenção refere-se a um método de teste de complementaridade na seqüência de nu-cleotídeos de duas moléculas de ácidos nucléicos, baseado na capacidade de DNA de filamento único complementar e/ou RNA formar uma molécula dupla. Técnicas de hibridização de ácidos nucléicos podem ser usadas para obter um ácido nucléico isolado dentro do escopo da apresentação. Em resumo, qualquer ácido nucléico que apresente alguma homologia com uma seqüência apresentada em SEQ ID NO: 11 pode ser usada como sonda para identificar um ácido nucléico similar através de hibridização sob condições de moderada a alta severidade. Uma vez identificado, o ácido nucléico pode então ser purificado, seqüenciado e analisado para determinar se ele está dentro do escopo da presente invenção.

Hibridização pode ser efetuada por análise Southern ou Northern para identificar uma seqüência de DNA ou RNA, respectivamente, que se hibridiza com uma sonda. A sonda pode ser marcada com uma biotina, digo- xigenina, um polipeptídeo ou um radiosótopo tal como 32P. O DNA ou RNA a ser analisado pode ser eletroforeticamente separado sobre um gel de agaro-se ou de poliacrilamida, transferido para nitrocelulose, náilon ou outra membrana adequada, e hibridizado com a sonda usando técnicas padrão bem conhecidas no estado da técnica, tais como aquelas descritas nas seções 7.39-7.52 de Sambrook e outros (1989), Clonagem Molecular, segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, Nova Iorque. Tipicamente, uma sonda tem pelo menos cerca de 20 nucleotídeos de comprimento. Por exemplo, uma sonda que corresponde a uma seqüência de 20 nucleotídeos contíguos apresentada em SEQ ID NO: 11 pode ser usada para identificar um ácido nucléico idêntico ou similar. Adicionalmente, podem ser usadas sondas mais longas ou mais curtas do que 20 nucleotídeos. A apresentação também proporciona seqüências isoladas de ácidos nucléicos que têm pelo menos cerca de 12 bases de comprimento (por exemplo, pelo menos cerca de 13, 14,15, 16, 17, 18,19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 100, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000 ou 5000 bases de comprimento) e hibridizam-se, sob condições de hibridização, com o filamento com sentido ou anti-sentido de um ácido nucléico que tem a seqüência apresentada em SEQ ID NO: 11. As condições de hibridização podem ser condições de hibridização moderadas ou altamente severas.

Para o fim desta apresentação, condições de hibridização moderadamente severas significam que a hibridização é realizada a cerca de 42°C em uma solução de hibridização contendo 25 mM de KPO4 (pH 7,4), 5X SSC, 5X solução de Denhart, 50 pg/mL de DNA de esperma de salmão desnaturado e submetido a ultra-som, 50% de formamida, 10% de sulfato de dextrano e 1-15 ng/mL de sonda (cerca de 5x107 cpm/pg), enquanto as lavagens são realizadas a cerca de 50°C com uma solução de lavagem contendo 2X SSC e 0,1% de dodecil sulfato de sódio.

Condições de hibridização altamente severas significam que a hibridização é realizada a cerca de 42°C em uma solução de hibridização contendo 25 mM de KPO4 (pH 7,4), 5X SSC, 5X solução de Denhart, 50 pg/mL de DNA de esperma de salmão desnaturado e submetido a ultra-som, 50% de formamida, 10% de sulfato de dextrano e 1-15 ng/mL de sonda (cerca de 5x107 cpm/pg), enquanto as lavagens são realizadas a cerca de 65°C com uma solução de lavagem contendo 0,2X SSC e 0,1% de dodecil sulfato de sódio.

Isolado: O termo "isolado" como usado nesta invenção com referência a ácido nucléico refere-se a um ácido nucléico que ocorre naturalmente o qual não é imediatamente contíguo a ambas as seqüências com que ele é imediatamente contíguo (um na extremidade 5' e um na extremidade 3') no genoma do organismo que ocorre naturalmente de que ele é derivado. Por exemplo, um ácido nucléico isolado pode ser, sem limitação, uma molécula de DNA recombinante de qualquer comprimento, contanto que uma das seqüências de ácidos nucléicos normalmente encontrada flanque-ando imediatamente essa molécula de DNA recombinante em um genoma que ocorre naturalmente seja removida ou esteja ausente. Assim, um ácido nucléico isolado inclui, sem limitação, um DNA recombinante que existe como molécula separada (por exemplo, um fragmento de cDNA ou de DNA genômico produzido por PCR ou tratamento com endonuclease de restrição) independente de outras seqüências, bem como DNA recombinante que é incorporado em um vetor, um plasmídeo autonomamente replicante, um vírus (por exemplo, um retrovírus, adenovírus ou vírus de herpes), ou no DNA genômico de um procariote ou eucariote. Adicionalmente, um ácido nucléico isolado pode incluir uma molécula de DNA recombinante que é parte de uma seqüência híbrida ou de ácidos nucléicos de fusão. O termo "isolado" como usado nesta invenção com referência a ácido nucléico também inclui qualquer ácido nucléico que não ocorre naturalmente, uma vez que seqüências de ácidos nucléicos que não ocorrem naturalmente não são encontradas na natureza e não apresentam seqüências imediatamente contíguas em um genoma que ocorre naturalmente. Por exemplo, um ácido nucléico que não ocorre naturalmente, tal como um ácido nucléico produto de engenharia, é considerado ser ácido nucléico isolado. Ácido nucléico produto de engenharia pode ser produzido usando técnicas de clonagem molecular comum ou de síntese química de ácidos nucléicos. Ácido nucléico isolado que não ocorre naturalmente pode ser independente de outras seqüências ou incorporado em um vetor, um plasmídeo autono-mamente replicante, um vírus (por exemplo, um retrovírus, adenovírus ou vírus de herpes), ou no DNA genômico de um procariote ou eucariote. Adicionalmente, um ácido nucléico que não ocorre naturalmente pode incluir uma molécula de ácido nucléico que é parte de uma seqüência híbrida ou de ácidos nucléicos de fusão.

Será evidente àqueles versados no estado da técnica que um ácido nucléico que existe entre centenas e milhões de outras moléculas de ácidos nucléicos dentro, por exemplo, de bicliotecas de cDNA ou genômicas, ou fatias de gel contendo um digesto de restrição de DNA genômico, não deve ser considerado um ácido nucléico. Ácido nucléico: O termo "ácido nucléico" como usado nesta invenção abrange tanto RNA quanto DNA, incluindo, sem limitação, cDNA, DNA genômico e DNA sintético (por exemplo, quimicamente sintetizado). O ácido nucléico pode ser de filamento duplo ou de filamento simples. Onde há filamento simples, o ácido nucléico pode ser o filamento com sentido ou o filamento anti-sentido. Adicionalmente, o ácido nucléico pode ser circular ou linear.

Operavelmente ligado: Uma primeira seqüência de ácidos nucléicos é "operavelmente ligada” com uma segunda seqüência de ácidos nucléicos sempre que a primeira seqüência de ácidos nucléicos é colocada em uma relação funcional com a segunda seqüência de ácidos nucléicos. Por exemplo, um promotor é operavelmente ligado a uma seqüência de codificação se o promotor afeta a transcrição da seqüência de codificação. Geralmente, seqüências de DNA operavelmente ligadas são contíguas e, onde se faz necessário ligar duas regiões de codificação de polipeptídeos, na mesma estrutura de leitura.

Modificações peptídicas: A presente descrição inclui enzimas, bem como modalidades sintéticas destas. Adicionalmente, análogos (moléculas orgânicas não-peptídicas), derivados (moléculas peptídicas quimicamente funcionalizadas obtidas partindo com as seqüências de peptídeos apresentadas) e variantes (homólogos) que apresentam a atividade enzimá-tica desejada podem ser utilizados nos métodos descritos nesta invenção. Os peptídeos apresentados nesta invenção incluem uma seqüência de ami-noácidos, que podem ser L- e/ou D-aminoácidos, de ocorrência natural ou não.

Peptídeos podem ser modificados através de uma variedade de técnicas químicas para produzir derivados que apresentam essencialmente a mesma atividade que os peptídeos não-modificados, e opcionalmente apresentando outras propriedades desejáveis. Por exemplo, grupos ácido carboxílico da proteína, seja com terminal carboxila ou com cadeia lateral, poderão ser proporcionados na forma de um sal de um cátion farmaceutica-mente aceitável ou esterificados na forma de um C1-C16 éster, ou convertidos em uma amina de fórmula NR1R2, onde R1 e R2 são cada um independentemente H ou C1-C16 alquila, ou combinados para formar um anel hete-rocíclico, tal como um anel de 5 ou 6 membros. Grupos amino do peptídeo, seja com terminal carboxila ou com cadeia lateral, poderão ser na forma de um sal de adição de ácido farmaceuticamente aceitável, tais como os sais de HCI, HBr, acético, benzóico, tolueno sulfônico, maléico, tartárico e outros sais orgânicos, ou poderão ser modificados em C1-C16 alquila ou dialquil amino, ou adicionalmente convertidos em uma amina.

Grupos hidroxila das cadeias laterais peptídicas poderão ser convertidos em C1-C16 alcóxi ou em um C1-C16 éster usando técnicas bem reconhecidas. Anéis fenila e fenólicos das cadeias laterais peptídicas poderão ser substituídos por um ou mais átomos de halogênio, tais como F, Cl, Br ou I, ou por C1-C16 alquila, C1-C16 alcóxi, ácidos carboxílicos e ésteres destes, ou amidas desses ácidos carboxílicos. Grupos metileno das cadeias laterais peptídicas podem ser estendidos em C2-C4 alquilenos homólogos. Tióis podem ser protegidos com qualquer um de vários grupos protetores bem reconhecidos, tais como grupos acetamida. Aqueles versados no estado da técnica também reconhecerão métodos para introduzir estruturas cíclicas nos peptídeos dessa apresentação para selecionar e proporcionar coer-ções conformativas à estrutura que resultam em aumento de estabilidade.

Por exemplo, uma cisteína com terminal-C ou -N pode ser adicionada ao peptídeo, de modo que quando oxidada o peptídeo conterá uma ligação dis-sulfeto, gerando um peptídeo cíclico. Outros métodos de ciclização peptídica incluem a formação de tioéteres e amidas e ésteres carboxila e amino-terminal.

Modalidades peptidomiméticas e organomiméticas estão também dentro do escopo da presente descrição, por meio do que o arranjo tridimensional dos constituintes químicos desses peptidomiméticos e organo-miméticos imitam o arranjo tridimensional da cadeia principal peptídica e das cadeias laterais de aminoácidos componentes, resultando nesses peptidomiméticos e organomiméticos das proteínas desta apresentação que apresentam atividade enzimática detectável. Para aplicações de modelagem por computador, um farmacóforo é uma definição tridimensional idealizada das exigências estruturais para atividade biológica. Peptidomiméticos e organomiméticos podem ser projetados para adaptar cada farmacóforo com software corrente de modelagem por computador (usando projeto de droga auxiliado por computador ou CADD). Ver Walters, ”Computer-Assisted Mode/ing of Drugs", in Klegerman & Groves (eds.), Pharmaceutical Biotechnology, 1993, Interpharm Press: Buffallo Grove, IL, pp. 165-74, e Ch. 102 in Munson (ed.), Principies of Pharmacology, 1995, Chapman & Hall, para descrições de técnicas usadas em CADD. Também incluídos no escopo da apresentação são miméticos preparados usando tais técnicas. Em um exemplo, um mimético imita a atividade enzimática gerada por uma enzima ou uma variante, fragmento ou fusão destes.

Sondas e iniciadores: Sondas e iniciadores de ácidos nucléicos podem ser preparados prontamente com base nas seqüências de aminoácidos e seqüências de ácidos nucléicos proporcionadas nesta invenção. Uma "sonda" inclui um ácido nucléico isolado que contém um marcador detectável ou molécula mensageira. Marcadores exemplares incluem, mas sem se limitar aos mesmos, isótopos radioativos, ligantes, agentes quimiluminescen-tes e polipeptídeos. Métodos para marcação e orientação na escolha de marcadores apropriados para vários fins são discutidos in, por exemplo, Sambrook e outros (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Clonagem Molecular: Manual de Laboratório), 2a. Ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989, e Ausubel e outros (ed.), Current Protocols in Molecular Biology (Protocolos Correntes em Biologia Molecular), Green Publishing e Wiley-lnterscience, Nova Iorque (com atualizações periódicas), 1987. "Iniciadores" são tipicamente moléculas de ácidos nucléicos que apresentam dez ou mais nucleotídeos (por exemplo, moléculas de ácidos nucléicos que apresentam entre cerca de 10 nucleotídeos e cerca de 100 nucleotídeos). Um iniciador pode ser recozido em um filamento de ácido nu-cléico alvo complementar por hibridização de ácido nucléico para formar um híbrido entre o iniciador e o filamento de ácido nucléico alvo, e em seguida estendido ao longo do filamento de ácido nucléico alvo através de, por exemplo, um polipeptídeo de DNA polimerase. Pares de iniciadores podem ser usados para amplificação de uma seqüência de ácidos nucléicos, por exemplo pela reação em cadeia de polimerase (PCR) ou outros métodos de amplificação de ácido nucléico conhecidos no estado da técnica. Métodos para preparar e usar sondas e iniciadores são descritos, por exemplo, em referências tais como Sambrook e outros (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. Ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989; Ausubel e outros (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing e Wiley-lnterscience, Nova Iorque (com atualizações periódicas), 1987; e Innis e outros (eds.), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Protocolos de PCR: Guia Para Métodos e Aplicações), Academic Press: San Die-go. 1990. Pares de iniciadores de PCR podem ser derivados de uma seqüência conhecida, por exemplo usando programas de computador destinados a esse fim, tal como Iniciador (Versão 0.5, © 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research (Instituto Whitehead Para Pesquisa Biomédica), Cambridge, Mass.). Aquele versado no estado da técnica entenderá que a especificidade de uma sonda ou iniciador particular aumenta com o comprimento, mas essa sonda ou iniciador pode variar de tamanho de uma se- qüência de comprimento pleno a seqüências tão curtas quanto cinco nucleo-tídeos consecutivos. Assim, por exemplo, um iniciador de 20 nucleotídeos consecutivos pode recozer com um alvo com uma especificidade maior do que um iniciador correspondente de apenas 15 nucleotídeos. Assim, a fim de obter maior especificidade, podem ser selecionados sondas e iniciadores que compreendem, por exemplo, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950,1000, 1050,1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 2000, 2050, 2100, 2150, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2600, 2650, 2700, 2750, 2800, 2850, 2900, 3000, 3050, 3100, 3150, 3200, 3250, 3300, 3350, 3400, 3450, 3500, 3550, 3600, 3650, 3700, 3750, 3800, 3850, 3900, 4000, 4050, 4100, 4150, 4200, 4250, 4300, 4350, 4400, 4450, 4500, 4550, 4600, 4650, 4700, 4750, 4800, 4850, 4900, 5000, 5050, 5100, 5150, 5200, 5250, 5300, 5350, 5400, 5450, ou mais nucleotídeos consecutivos.

Promotor: Um arranjo de seqüências de ácidos nucléicos de controle com transcrição direta de um ácido nucléico. Um promotor inclui seqüências de ácidos nucléicos necessárias perto do sítio de partida de transcrição, tal como, no caso de um promotor do tipo polimerase II, um elemento TATA. Um promotor pode incluir elementos intensificadores ou repressores distais que podem localizar-se como diversos milhares de pares de bases do sítio de partida de transcrição.

Purificado: O termo "purificado" como usado nesta invenção não exige pureza absoluta; preferencialmente, pretende-se que seja um termo relativo. Assim, por exemplo, uma preparação de polipeptídeo ou ácido nucléico purificada pode ser uma preparação em que a substância polipeptídeo ou ácido nucléico, respectivamente, está em uma concentração maior do que aquela em que o polipeptídeo ou ácido nucléico estaria em seu ambiente natural dentro de um organismo. Por exemplo, uma preparação de polipeptídeo pode ser considerada purificada se o teor de polipeptídeo na preparação representa pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 98% ou 99% do teor total de proteína da preparação.

Recombinante: Um ácido nucléico "recombinante" é um ácido nucléico que apresenta (1) uma seqüência que não ocorre naturalmente no organismo em que ele é expresso ou (2) uma seqüência produzida através de uma combinação artificial de duas seqüências mais curtas separadas de outra maneira. Essa combinação artificial é freqüentemente realizada por síntese química ou, mais comumente, pela manipulação artificial de segmentos isolados de ácidos nucléicos, por exemplo por meio de técnicas de engenharia genética. "Recombinante" é também usado para descrever moléculas de ácido nucléico que foram artificialmente manipuladas, mas contêm as mesmas seqüências reguladoras e regiões de codificação que são encontradas no organismo de que o ácido nucléico foi isolado.

Identidade de seqüências: A similaridade entre seqüências de aminoácidos é expressa em termos da similaridade entre as seqüências, também referida como identidade de seqüências. A identidade de seqüên-cias é freqüentemente medida em termos de identidade percentual (ou similaridade ou homologia); quanto maior a porcentagem, mais similar são as duas seqüências. Homólogos ou variantes de um peptídeo, tal como SEQ ID NO: 12, possuem um grau relativamente alto de identidade de seqüências quando alinhados usando métodos padrão. Métodos de alinhamento de seqüências para comparação são bem conhecidos no estado da técnica. Vários programas e algoritmos de alinhamento são descritos irr. Smith e Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-53, 1970; Pearson e Li-pman, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85:2444-8,1988; Higgins e Sharp, Gene 73:237-44, 1988; Higgins e Sharp, CABIOS 5:151-3, 1989; Corpet e outros, Nucleic Acids Research 16:10881-90, 1988; e Altschul e outros, Nature Ge-net. 6:119-29, 1994. A Ferramenta de Busca de Alinhamento Local Básico NCBI (BLAST®) (Altschul e outros, J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990) é disponível de várias fontes, incluindo o Centro Nacional Para Informação de Biotecnologia (NCBI, Bethesda, MD) e na Internet, para uso juntamente com os programas de análise de seqüências blastp, blastn, blastx, tblastn e tblastx.

Variantes de um peptídeo caracterizam-se tipicamente por possuir pelo menos 50% de identidade de seqüências contados sobre o alinhamento de comprimento pleno com a seqüência de aminoácidos usando o NCBI Blast 2.0, blastp fendido ajustado em parâmetros padrão. Para comparações de seqüências de aminoácidos maiores que cerca de 30 aminoácidos, é empregada a função de seqüências Blast 2 usando a matriz padrão BLOSUM62 ajustada em parâmetros padrão (custo de existência de abertura de 11, e um custo de abertura por resíduo de 1). Quando se alinham peptídeos curtos (menores do que cerca de 30 aminoácidos), o alinhamento é realizado usando a função de seqüências Blast 2, empregando a matriz padrão PAM30 ajustada em parâmetros padrão (folga de abertura de 9, penalidades de abertura de extensão 1). Proteínas com similaridade ainda maior em relação às seqüências de referência mostrarão porcentagem crescente de identidades quando avaliadas por esse método, tal como pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou ainda pelo menos 99% de identidade de seqüências. Quando menos de toda a seqüência está sendo comparado em relação a identidade de seqüências, homólogos e variantes possuirão tipicamente pelo menos 80% de identidade de seqüências sobre janelas curtas de 10-20 aminoácidos, e poderão possuir identidades de seqüências de pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 98%, dependendo de sua similaridade com a seqüência de referência. Métodos para determinar identidade de seqüências sobre tais janelas curtas são descritos no website que é mantido pelo Centro Nacional Para Informação de Biotecnologia em Bethesda, Maryland. Aquele versado no estado da técnica entenderá que essas faixas de identidades de seqüências são proporcionadas para orientação apenas; é inteiramente possível que poderíam ser obtidos homólogos fortemente significativos que caem fora das faixas fornecidas. Métodos similares podem ser usados para determinar a porcentagem de identidade de seqüencia de uma seqüência de ácido nucléico. Em um exemplo particular, uma seqüência homóloga é alinhada a uma seqüência nativa, e o número de conjugações é determinado por contagem do nú- mero de posições onde um nucleotídeo idêntico ou resíduo de aminoácido é apresentado em ambas as seqüências. A porcentagem de identidade de se-qüencia é determinada dividindo o número de conjugações pelo comprimento da seqüência apresentada na seqüência identificada (por exemplo, SEQ ID NO: 11), ou por um comprimento articulado (por exemplo, 100 nu-cleotídeos consecutivos ou resíduos de aminoácidos de uma seqüência apresentada em uma seqüência identificada), seguido por multiplicação do valor resultante por 100. Por exemplo, uma seqüência de ácido nucléico que apresenta 1.166 conjugações quando alinhadas com a seqüência apresentada na SEQ ID NO: 11 é 75,0 por cento idêntica às seqüências apresentadas na SEQ ID NO: 11 (isto é, 1166 1554*100 = 75,0). Nota-se que o valor da porcentagem de identidade de seqüência é arredondado para o décimo mais próximo. Por exemplo, 75,11, 75,12, 75,13 e 75,14 é arrendondado para 75,1, enquanto 75,15, 75,16, 75,17, 75,18 e 75,19 é arredondado para 75,2. Nota-se também que o valor de comprimento sempre será um número inteiro. Em um outro exemplo, uma seqüência-alvo contendo uma região de 20 nucleotídeos que se alinha com 20 nucleotídeos consecutivos de uma seqüência identificada como segue, contém uma região que compartilha 75 por cento de identidade seqüencial a essa seqüência identificada (isto é, 15 * 20*100 = 75).

1 20 Seqüência alvo aggtcgtgtactgtcagtca I II III llll INI I

Seqüência identificada acgtggtgaactgccagtga Agente de ligação específico: Um agente que é capaz de especificamente ligar-se a qualquer dos polipeptídeos descritos nesta invenção. Exemplos incluem, mas sem se limitar a anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais humanizados), e fragmentos de anticorpos monoclonais tais como fragmentos de Fab, F(ab’)2 e Fv, bem como qualquer outro agente capaz de especificamente ligar-se a um epitopo desse polipeptídeos.

Anticorpos para os polipeptídeos proporcionados nesta invenção (ou fragmentos, variantes ou fusões dos mesmos) podem ser usados para purificar ou identificar esses polipeptídeos. As seqüências de aminoácidos e ácido nucléico proporcionadas nesta invenção permitem a produção de agentes de ligação específicos à base de anticorpos que reconhecem os polipeptídeos descritos nesta invenção.

Anticorpos monoclonais ou policlonais podem ser produzidos com os polipeptídeos, porções dos polipeptídeos ou variantes dos mesmos. Otimamente, aumento de anticorpos contra um ou mais epitopos sobre um antígeno de polipeptídeo detectará especificamente esse polipeptídeo. Isto é, aumento nos anticorpos contra um polipeptídeo particular reconhecerá e ligará esse polipeptídeo particular, e não reconhecería ou ligaria substancialmente a outros polipeptídeos. A determinação que um anticorpo especificamente liga-se a um polipeptídeo particular é feita por qualquer um de vários métodos imunoensaios padrão; por exemplo, Western blotting (Ver, por exemplo, Sambrook e outros (ed.), Molecular Cloning (Clonagem Molecular): Um Manual de Laboratório, 2a. Ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989).

Para determinar que uma dada preparação de anticorpos (tal como uma preparação produzida em um camundongo contra um polipeptídeo que apresenta a seqüência de aminoácidos apresentados na SEQ ID NO: 12) detecta especificamente o polipeptídeo apropriado (por exemplo, um polipeptídeo que apresenta a seqüência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 12) por Western blotting, proteína celular total pode ser extraída de células e separadas por eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida. A proteína celular total separada pode em seguida ser transferida para uma membrana (por exemplo nitrocelulose), e a preparação de anticorpo incubada com a membrana. Após lavagem da membrana para remover anticorpos não especificamente ligados, a presença de anticorpos especificamente ligados pode ser detectada usando um anticorpo secundário apropriado (por exemplo, anticorpo anticamundongo) conjugado com um polipeptídeo tal como fosfatase alcalina uma vez que aplicação de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolil/nitro azul tetrazólio resulta na produção de um composto colorido densamente azul por fosfatase alcalina imuno-localizada.

Polipeptídeos substancialmente puros adequados para uso como imunogênio podem ser obtidos de células transfectadas, células transformadas ou células do tipo selvagem. Concentrações de polipeptídeos na preparação final podem ser ajustadas, por exemplo, por concentração em um dispositivo de filtro Amicon, a nível de alguns microgramas por mililitro. Além disso, polipeptídeos que variam de tamanho de polipeptídeos de comprimento total a polipeptídeos que apresentam tão poucos quanto nove resíduos de aminoácidos podem ser utilizados como imunogênios. Esses polipeptídeos podem ser produzidos em cultura de células, podem ser quimica-mente sintetizados usando métodos padrão, ou podem ser obtidos através de divagem de polipeptídeos grandes em polipeptídeos menores que podem ser purificados. Polipeptídeos que apresentam tão poucos quanto nove resíduos de aminoácidos de comprimento podem ser imonogênicos quando apresentados a um sistema imune no contexto de uma molécula Complexa de Importante Histocompatibilidade (MHC) tal como uma molécula MHC de classe I ou MHC de classe II. Conseqüentemente, polipeptídeos que apresentam pelo menos 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 900, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, ou resíduos de aminoácidos mais consecutivos de qualquer seqüência de ami-noácido descrita nesta invenção podem ser usados como imunogênios para produzir anticorpos.

Anticorpos monoclonais para qualquer dos polipeptídeos descritos nesta invenção podem ser preparados de hibridomas murino de acordo com o método clássico de Kohler & Milstein (Nature 256:495-7,1975) ou um método derivado do mesmo.

Anticorpos que contém anti-soro policlonal para os epitopos heterogêneos de qualquer polipeptídeo descrito nesta invenção podem ser preparados através de imunização de animais adequados com o polipeptídeo (ou fragmento do mesmo), que pode ser não-modificado ou modificado para aumentar imunogenicidade. Um protocolo de imunização efetiva para coelhos pode ser encontrado in Vaitukaitis e outros (J. Clin. Endocrinol. Me- tab. 33:988-91,1971).

Fragmentos de anticorpos podem ser usados em lugar de anticorpos totais e podem ser prontamente expressos em células procarióticas hospedeiras. Métodos de produção e utilização de porções imunologica-mente eficazes de anticorpos monoclonais, também referidos como "fragmentos de anticorpos", são bem conhecidos e incluem aqueles descritos in Better & Horowitz (Methods Enzymol. 178:476-96, 1989), Glockshuber e outros (Biochemistry 29:1362-7,1990), Patente U.S. N° 5.648.237 ("Expression of Functional Antibody Fragments"), Patente U.S. N° 4.946.778 ("Moléculas de Ligação de Polípeptídeo de Cadeia Única”), Patente U.S. N° 5.455.030 ("Imunoterapia Usando Moléculas de Ligação de Polípeptídeo de Cadeia Única") e referências citadas nesta invenção.

Transformada: Uma célula "transformada" é uma célula em que uma molécula de ácido nucléico tem sido introduzida, por exemplo, técnicas de biologia molecular. Transformação abrange todas as técnicas por quais uma molécula de ácido nucléico pode ser introduzida nessa célula incluindo, sem limitação, transfecção com um vetor viral, conjugação, transformação com um vetor de plasmídeo e introdução de DNA nu por eletroporação, li-pofecção e aceleração por pistola de partículas.

Variantes, fragmentos ou proteínas de fusão: As proteínas descritas, incluem variantes, fragmentos e fusões das mesmas. Seqüências de DNA (por exemplo SEQ ID NO: 11) que codificam uma proteína (por exemplo SEQ ID NO: 12), proteína de fusão, ou um fragmento ou variante de uma proteína, podem ser engenheirados para permitir que a proteína seja expressa em células eucarióticas, bactérias, insetos e/ou plantas. Para obter expressão, a seqüência de DNA pode ser alterada e operavelmente ligada a outras seqüências reguladoras. O produto final, que contém as seqüências reguladoras e a proteína, é referido como um vetor. Esse vetor pode ser introduzido em células eucarióticas, bactérias, insetos e/ou plantas. Uma vez que no interior da célula o vetor permite a proteína ser produzida.

Uma proteína de fusão, incluindo uma proteína, tal como tripto-fano aminotransferase (ou variante, polimorfismo, mutante ou fragmento da mesma), por exemplo SEQ ID NO: 12, ligada a outras seqüências de amino-ácido que não inibem a atividade desejada da proteína, por exemplo a capacidade de converter triptofano em indol-3-piruvato. Em um exemplo, as outras seqüências de aminoácido não são mais de cerca de 10,12,15, 20, 25, 30 ou 50 aminoácidos de comprimento.

Aquele versado no estado da técnica apreciará que uma se-qüência de DNA pode ser alterada de numerosas maneiras sem afetar a atividade biológica da proteína codificada. Por exemplo, PCR pode ser usada para produzir variações na seqüência de DNA que codifica uma proteína. Esses variantes podem ser variantes otimizados para preferência de códon em uma célula hospedeira usada para expressar a proteína, ou outras alterações de seqüências que facilitam expressão.

Vetor: Uma molécula de ácido nucléico como introduzida em uma célula, produzindo desse modo uma célula transformada. Um vetor poderá incluir seqüências de ácido nucléicos que permitem que ele se replica na célula, tal como uma origem de réplica. Um vetor poderá também incluir um ou mais genes marcadores selecionáveis e outros elementos genéticos conhecidos no estado da técnica.

Revisão Geral de Caminhos Biossintéticos Como mostrado nas Figuras 1-3 e 11-13, muitos caminhos biossintéticos podem ser usados para produzir monatina ou seus intermediários tal como indol-3-piruvato ou MP. Para a conversão de cada substrato (glicose, triptofano, ácido indol-3-lático, indol-3-piruvato e MP) em cada produto (triptofano, indol-3-piruvato, MP e monatina) diversos polipeptídeos diferentes podem ser usados. Além disso, essas reações podem ser realizadas in vivo, in vibro, ou através de uma combinação de reações in vivo e reações in vitro, tais como reações in vitro que incluem reações químicas não-enzimáticas. Portanto, as Figuras 1-3 e 11-13 são exemplares, e mostram caminhos múltiplos diferentes que podem ser usados para obter produtos desejados.

Glicose em Triptofano Muitos organismos podem sintetizar triptofano de glicose. O(s) constructo(s) contendo o(s) gene(s) necessário(s) para produzir monatina, MP e/ou indol-3-piruvato a partir de glicose e/ou triptofano podem ser clona-dos nesses organismos. Nesta invenção mostra-se que triptofano pode ser convertido em monatina.

Em outros exemplos, um organismo é engenheirado usando po-lipeptídeos conhecidos para produzir triptofano, ou superproduzir triptofano. Por exemplo, Patente U.S. N° 4.371.614 (aqui incorporada como referência) descreve uma cepa de E. coli transformada em um plasmídeo contendo um óperon de triptofano do tipo selvagem.

Titulações máximas de triptofano descritas em Patente U.S. N° 4.371.614 são de cerca de 230 ppm. Similarmente, WO 8701130 (aqui incorporado como referência) descreve uma cepa de E. coli que foi geneticamente engenheirada para produzir triptofano e discute produção fermentati-va crescente de L-triptofano. Aqueles versados na técnica reconhecerão que organismos capazes de produzir triptofano a partir de glicose são também capazes de utilizar outras fontes de carbono e energia que podem ser convertidas em glicose ou frutose-6-fosfato, com resultados similares. Fontes de carbono e energia exemplares incluem, mas sem se limitar as mesmas, sa-carose, frutose, amido, celulose ou glicerol.

Triptofano em lndol-3-piruvato Diversos polipeptídeos podem ser usados para converter triptofano em indol-3-piruvato. Exemplos de polipeptídeos incluem membros das classes de enzima (CE) 2.6.1.27, 1.4.1.19, 1.4.99.1, 2.6.1.28, 1.4.3.2, 1.4.3.3, 2.6.1.5, 2.6.1.-, 2.6.1.1 e 2.6.1.21. Essas classes incluem polipeptídeos denominados triptofano aminotransferase (também denominado L-fenilalanina-2-oxoglutarato aminotransferase, triptofano transaminase, 5-hidroxitriptofano-cetoglutárico transaminase, hidroxitriptofano aminotransferase, L-triptofano aminotransferase, L-triptofano transaminase e L-triptofano:2-oxoglutarato aminotransferase) que converte L-triptofano e 2-oxoglutarato em indol-3-piruvato e L-glutamato; D-triptofano aminotransferase que converte D-triptofano e um 2-oxoácido em indol-3-piruvato e um ami-noácido; triptofano desidrogenase (também denominado NAD(P)-L-triptofano desidrogenase, L-triptofano desidrogenase, L-Trp-desidrogenase, TDH e L-triptofano:NAD(P)oxidorredutase (desaminação)) que convertem L-triptofano e NAD(P) em indol-3-piruvato e NH3 e NAD(P)H; D-aminoácido desidrogenase que converte D-aminoácidos e FAD em indol-3-piruvato e NH3 e FADH2; triptofano-fenilpiruvato transaminase (também denominado L-triptofano-a-cetoisocaproato aminotransferase e L-triptofano:fenilpiruvato aminotransferase) que convertem L-triptofano e fenilpiruvato em indol-3-piruvato e L-fenilalanina; L-aminoácido oxidase (também denominado ófio-aminoácido oxidase e L-aminoácido:oxigênio oxidorredutase (desaminação)) que converte um L-aminoácido e H20 e O2 em um 2-oxoácido e NH3 e H2O2; D-aminoácido oxidase (também denominado ófio-aminoácido oxidase e D-aminoácido:oxigênio oxidorredutase (desaminação)) que converte um D-aminoácido e H20 e O2 em um 2-oxoácido e NH3 e H2O2; e triptofano oxidase que converte L-triptofano e H20 e O2 em indol-3-piruvato e NH3 e H202. Essas classes também contém tirosina aminotransferase (aromática), as-partato aminotransferase, D-aminoácido (ou D-alanina) aminotransferase, aminotransferase ampla (substrato múltiplo) que apresentam atividades múltiplas de aminotransferase, algumas das quais podem converter triptofano e um 2-oxoácido em indol-3-piruvato e um aminoácido.

Onze membros da classe aminotransferase que apresentam essa atividade são descritos abaixo no Exemplo 1, incluindo uma nova aminotransferase mostrada em SEQ ID NOS: 11 e 12. Portanto, essa descrição proporciona seqüências isoladas de ácido nucléicos e proteína que apresentam pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou ainda pelo menos 99% de identidade de seqüên-cia para SEQ ID NOS: 11 e 12. Também abrangidos nessa descrição são fragmentos e fusões de SEQ ID NOS: 11 e 12 que retêm atividade aminotransferase ou codificam uma proteína que apresenta atividade aminotransferase. Exemplos de fragmentos incluem, mas sem se limitar aos mesmos, pelo menos 10,12, 15, 20, 25, 50,100, 200, 500 ou 1.000 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 11 ou pelo menos 6, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300 ou 350 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 12. As seqüências des- critas (e variantes, fragmentos e fusões das mesmas) podem ser parte de um vetor. O vetor pode ser usado para transformar células hospedeiras, produzindo desse modo células recombinantes que podem produzir indol-3-piruvato a partir de triptofano, e em alguns exemplos podem adicionalmente produzir MP e/ou monatina. L-aminoácidos oxidases (1.4.3.2) são conhecidos, e seqüências podem ser isoladas de diversas fontes diferentes, tais como Vipera lebetine (sp P81375), Ophiophagus hannah (sp P81383), Agkistrodon rhodostoma (sp P81382), Crotalus atrox (sp P56742), Burkholdería cepacia, Arabidopsis thaliana, Caulobacter cresentus, Chlamydomonas reinhardtii, Mus musculus, Pseudomonas syringae e Rhodococcus str. Além disso, triptofano oxidases são descritas na literatura e podem ser isoladas, por exemplo, de Coprinus sp. SF-1, repolho chinês com doença da raiz deformada, Arabidopsis thaiia-na e fígado de mamífero. Um membro da classe de L-aminoácido oxidase que pode converter triptofano em indol-3-piruvato é discutido abaixo no Exemplo 3, bem como fontes alternativas para clonagem molecular. Muitos genes de D-aminoácido oxidase são disponíveis em banco de dados para clonagem molecular.

Triptofano desidrogenases são conhecidas, e podem ser isoladas, por exemplo, de e"spin"afre, Pisum sativum, Prosopis juliflora, ervilha, algarobeira, trigo, milho, tomate, tabaco, Chromobacteríum violaceum e Lactobacilli. Muitas seqüências de genes D-aminoácido desidrogenase são conhecidas.

Como mostrado nas Figuras 11-13, se um aminoácido oxidase, tal como triptofano oxidase, é usado para converter triptofano em indol-3-piruvato, catalase pode ser adicionada para reduzir ou mesmo eliminar a presença de peróxido de hidrogênio. lndol-3-lactato em lndol-3-piruvato A reação que converte indol-3-lactato em indol-3-piruvato pode ser catalisada por uma variedade de polipeptídeos, tais como membros das classes de polipeptídeos 1.1.1.110, 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3, 1.1.1.222, 1.1.1.237, 1.1.3.- ou 1.1.1.111. A classe de polipeptídeos 1.1.1.110 inclui indolelactato desidrogenases (também denominado ácido indolelático:NAD+ oxidorredutase). As classes 1.1.1.27,1.1.1.28 e 1.1.2.3 incluem lactato desidrogenases (também denominado ácido lático desidrogenases, lactato:NAD+ oxidorredutase). A classe 1.1.1.222 contém (R)-4-hidroxifenillactato desidro-genase (também denominado D-lactato aromático desidrogenase, R-lactato aromático desidrogenase, e R-3-(4-hidroxifenil)lactato:NAD(P)+2-oxidorredutase) e a classe 1.1.1.237 contém 3-(4-hidroxifenilpiruvato) redu-tase (também denominado hidroxifenilpiruvato redutase e 4-hidroxifenillactato:NAD+ oxidorredutase). A classe 1.1.3.- contém lactato oxi-dases, e a classe 1.1.1.111 contém (3-imidazol-5-il) lactato desidrogenases (também denominado (S)-3-(imidazol-5-il)lactato:NAD(P)+ oxidorredutase). É provável que diversos polipeptídeos nessas classes permitem a produção de indol-3-piruvato a partir de ácido indol-3-lático. Exemplos dessa conversão são proporcionados no Exemplo 2.

Reações químicas podem também ser usadas para converter ácido indol-3-lático em indol-3-piruvato. Essas reações químicas incluem uma etapa de oxidação que pode ser realizada usando diversos métodos, por exemplo:oxidação por ar usando um catalisador B2 (China Chemical Repórter, v. 13, n 28, p. 18 (1), 2002), permanganato e perclorato diluídos, ou peróxido de hidrogênio na presença de catalisadores de metal. lndol-3-piruvato em 2-hidróxi-2(indol-3-ilmetil)-4-cetoácido qlutárico (MP) Diversos polipeptídeos conhecidos podem ser usados para converter indol-3-piruvato em MP. Classes de polipeptídeos exemplares incluem 4.1.3.-, 4.1.3.16, 4.1.3.17 e 4.1.2.-. Essas classes incluem carbono-carbono sintases/liases, tais como aldolases que catalisam a condensação de dois substratos de ácido carboxílico. As classes de peptídeo EC 4.1.3.- são sintases/liases que formam ligações carbono-carbono utilizando substratos oxo-ácido (tal como indol-3-piruvato) como o eletrófilo, enquanto EC 4.1.2.- são sintases/liases que formam ligações carbono-carbono utilizando substratos de aldeído (tal como benzaldeído) como o eletrófilo.

Por exemplo, o polipeptídeo descrito em EP 1045-029 (EC 4.1.3.16, 4-hidróxi-2-oxoglutarato glioxilato-liase também denominado 4- hidróxi-2-oxoglutarato aldolase, 2-oxo-4-hidroxiglutarato aldolase ou KHG aldolase) converte ácido glioxílico e piruvato em ácido 4-hidróxi-2-cetoglutárico, e o polipeptídeo 4-hidróxi-4-metil-2-oxoglutarato aldolase (EC 4.1.3.17, também denominado 4-hidróxi-4-metil-2-oxoglutarato piruvato-liase ou ProA aldolase), condensa dois cetoácidos tais como dois piruvatos em 4-hidróxi-4-metil-2-oxoglutarato. Reações utilizando essas liases são descritas nesta invenção.

As Figuras 1-2 e 11-13 mostram diagramas esquemáticos dessas reações em que uma molécula de 3-carbono (C3) é combinada com in-dol-3-piruvato. Muitos membros de EC 4.1.2.- e 4.1.3.-, particularmente poli-peptídeos utilizando PLP, podem utilizar moléculas C3 que são aminoácidos tais como serina, cisteína e alanina, ou derivados dos mesmos. Condensações de aldol catalisadas por representativos de EC 4.1.2.- e 4.1.3.- exigem que as três moléculas de carbono nesses caminhos sejam piruvato ou um derivado de piruvato. Contudo, outros compostos podem servir como uma fonte de carbono C3 e ser convertidos em piruvato. Alanina pode ser transaminada por muitas transaminases que utilizam PLP, incluindo muitas dessas mencionadas acima, para produzir piruvato. Piruvato e amônia podem ser obtidos por reações de betaeliminação (tais como aquelas catalisadas por triptofanase ou β-tirosinase) de L-serina, L-cisteína e derivados de serina e cisteína com grupos de saída suficientes, tais como O-metil-L-serina, O-benzil-L-serina, S-metilcisteína, S-benzilcisteína, S-alquil-L-cisteína, O-acil-L-serina e 3-cloro-L-alanina. Aspartato pode servir como uma fonte de piruvato em reações de beta-liase mediadas por PLP tais como aquelas catalisadas por triptofano (EC 4.1.99.1) e/ou β-tirosinase (EC 4.1.99.2, também denominada tirosina-fenol liase). A taxa de reações beta-liase pode ser aumentada realizando mutagêneses dirigidas a sítios nos po-lipeptídeos (4.1.99.1-2) conforme descrito por Mouratou e outros (J. Biol. Chem. 274:1320-5, 1999) e no Exemplo 8. Essas modificações permitem os polipeptídeos reconhecerem substratos de aminoácidos dicarboxílicos. Lac-tato pode também servir como uma fonte de piruvato e é oxidado a piruvato pela adição de lactato desidrogenase e um co-fator oxidado ou lactato oxi- dase e oxigênio. Exemplos dessas reações são descritos abaixo. Por exemplo, como mostrado na Figura 2 e nas Figuras 11-13, ProA aldolase pode ser contatado com indol-3-piruvato quando piruvato é usado como a molécula C3. O MP pode também ser gerado usando reações químicas, tais como as condensações de aldol proporcionadas no Exemplo 5. MP em Monatina Conversão de MP em monatina pode ser catalisada por um ou mais de: triptofano aminotransferases (2.6.1.27), triptofano desidrogenases (1.4.1.19), D-aminoácido desidrogenases (1.4.99.1), glutamato desidrogenases (1.4.1.2-4), fenilalanina desidrogenase (EC 1.4.1.20), triptofano-fenilpiruvato transaminases (2.6.1.28), ou mais geralmente membros da família aminotransferase (2.6.1.-) tais como aspartato aminotransferase (EC 2.6.1.1), tirosina (aromática) aminotransferase (2.6.1.5), D-triptofano aminotransferase ou D-alanina (2.6.1.21) aminotransferase (Figura 2). Onze membros da classe de aminotransferase são descritos abaixo (Exemplo 1), incluindo um novo membro da classe mostrado na SEQ ID NOS: 11 e 12, e reações que demonstram a atividade de enzimas aminotransferase e desidrogenase são proporcionadas no Exemplo 7.

Essa reação pode também ser realizada usando reações químicas. Aminação do cetoácido (MP) é efetuada por aminação redutiva usando amônia e cianoboridreto de sódio.

As Figuras 11-13 mostram polipeptídeos adicionais que podem ser usados para converter MP em monatina, bem como proporcionando aumento de rendimentos de monatina a partir de indol-3-piruvato ou triptofano. Por exemplo, se aspartato é usado como o doador de amino, aspartato aminotransferase pode ser usado para converter o aspartato em oxaloacetato (Figura 11). O oxaloacetato é convertido em piruvato e dióxido de carbono por um descarboxilato, tal como oxaloacetato descarboxilase (Figurai 1). Além disso, se lisina é usada como o doador de amino, lisina epsílon aminotransferase pode ser usada para converter a lisina em alisina (Figura 12). A alisina é espontaneamente convertida em 1-piperideína 6-carboxilato (Figura 12). Se um polipeptídeo capaz de catalisar reações de aminação redutivas (por exemplo, glutamato desidrogenase) é usado para converter MP em mo-natina, um polipeptídeo que pode reciclar NAD(P)H e/ou produzir um produto volátil (Figura 13) pode ser usado, tal como formato desidrogenase. Considerações Adicionais no Projeto dos Caminhos Biossintéticos Dependendo de quais polipeptídeos são usados para gerar in-dol-3-piruvato, MP e/ou monatina, co-fatores, substratos e/ou polipeptídeos adicionais podem ser proporcionados à célula de produção para aumentar formação de produto.

Remoção de Peróxido de Hidrogênio Peróxido de hidrogênio (H2O2) é um produto que, se gerado, pode ser tóxico para células de produção e podem danificar os polipeptídeos ou intermediários produzidos. O L-aminoácido oxidase descrito acima gera H2O2 como um produto. Portanto, se L-aminoácido oxidase é usado, ο H2O2 resultante pode ser removido ou seus níveis reduzidos para diminuir dano potencial à célula ou ao produto.

Catalase pode ser usada para reduzir o nível de H2O2 na célula (Figuras 11-13). A célula de produção pode expressar um gene ou seqüên-cia de cDNA que codifica uma catalase (EC 1.11.1.6), que catalisa a decomposição de peróxido de hidrogênio em água e gás oxigênio. Por exemplo, uma catalase pode ser expressa a partir de um vetor transfectado na célula de produção. Exemplos de catalases que podem ser usados incluem, mas sem se limitar aos mesmos, tH Q9EV50 (Staphylococcus xylosus), trl Q9KBE8 (Bacillus halodurans), tr| Q9URJ7 (Candida albicans), tH P77948 (Streptomyces coelicolor), tHQ9RBJ5 (Xanthomonas campestrís) (Nos. de Acesso SwissProt.). Reatores biocatalíticos utilizando L-aminoácido oxidase, D-aminoácido oxidase, ou triptofano oxidase podem também conter um polipeptídeo catalase.

Modulação de Disponibilidade de PLP (piridoxal-S-fosfato) Como mostrado na Figura 1, PLP pode ser utilizado em uma ou mais das etapas biossintéticas descritas nesta invenção. A concentração de PLP pode ser suplementada de modo que PLP não torne uma limitação so- bre a eficiência global da reação. O caminho biossintético para vitamina B6 (o precursor de PLP) foi completamente estudado em E. coli e algumas das proteínas foram cristalizadas (Laber e outros, FEBS Letters, 449:45-8, 1999). Dois dos genes (epd ou gapB e serC) são exigidos em outros caminhos metabólicos, enquanto três genes (pdxA, pdxB e pdxJ) são únicos para biossíntese de piri-doxal fosfato. Um dos materiais de partida no caminho de E. coli é 1-desóxi-D-xilulose-5-fosfato (DXP). Síntese desse precursor de metabólitos centrais comuns de 2 e 3 carbonos é catalisada pelo polipeptídeo 1-desóxi-D-xilulose-5-fosfato sintase (DSX). O outro precursor é um derivado de treoni-na formado do açúcar de 4 carbonos, D-eritrose 4-fosfato. Os genes exigidos para a conversão em fosfo-4-hidroxil-L-treonina (HTTP) são epd, pdxB e serC. A última reação para a formação de PLP é uma condensação intra-molecular complexa e reação de fechamento de anel entre DXP e HTP, catalisada pelos produtos de gene de pdxA e pdxJ.

Se PLP torna um nutriente de limitação durante a fermentação para produzir monatina, aumento na expressão de um ou mais dos genes de caminho em uma célula hospedeira de produção pode ser usado para aumentar o rendimento de monatina. Um organismo hospedeiro pode conter cópias múltiplas de seus genes de caminho nativos ou cópias de genes de caminho não-nativos pode ser incorporado no genoma do organismo. Adicionalmente, cópias múltiplas dos genes de caminho de salvamento podem ser clonadas no organismo hospedeiro.

Um caminho de salvamento que é convertido em todos os organismos recicla os vários derivados de vitamina B6 à forma de PLP ativo. Os polipeptídeos envolvidos nesse caminho são pdxK quinase, pdxH oxidase e pdxY quinase. Superexpressão de um ou mais desses genes pode aumentar disponibilidade de PLP. Níveis de vitamina B6 podem ser elevados por eliminação ou repressão da regulação metabólica dos genes de caminho biossintético nativo no organismo hospedeiro. PLP reprime polipeptídeos envolvidos na biossíntese do derivado de precursor de treonina na cepa da bactéria Flavobac- terium sp. 238-7. Essa cepa bacteriana, livre de controle metabólico, super-produz derivados piridoxais e pode excretar até 20 mg/L de PLP. Manipulação genética do organismo hospedeiro produzindo monatina em uma forma similar permitirá o aumento na produção de PLP sem superexpressão dos genes de caminho biossintético.

Utilização de Amônio Reações de triptofanase podem ser conduzidas no sentido da direção sintética (produção de triptofano a partir de indol) tornando amônia mais disponível ou através de remoção de água. Reações de aminação re-dutivas, tais como aquelas catalisadas por giutamato desidrogenase, podem também ser aceleradas por um excesso de amônio.

Amônia pode ser tomada disponível como um sal de carbonato de amônio ou fosfato de amônio em um sistema tamponado de carbonato ou fosfato. Amônia pode também ser proporcionada como piruvato de amônio ou formato de amônio. Altemativamente, amônia pode ser alimentada se a reação é acoplada com uma reação que gera amônia, tal como giutamato desidrogenase ou triptofano desidrogenase. Amônia pode ser gerada por adição dos substratos naturais de EC 4.1.99.- (tirosina ou triptofano), que será hidrolisada a fenol ou indol, piruvato e NH3. Essa também permite um aumento no rendimento de produto sintético sobre a quantidade de equilíbrio normal permitindo a enzima hidrolisar seu substrato preferido.

Remoção de produtos e subprodutos A conversão de triptofano em indol-3-piruvato via um triptofano aminotransferase poderá adversamente afetar a taxa de produção de indol-3-piruvato porque a reação produz giutamato e exige 0 co-substrato de 2-oxoglutarato (α-cetoglutarato). Giutamato poderá causar inibição da aminotransferase, e a reação consumirá grandes quantidades do co-substrato. Além disso, altas concentrações de giutamato são prejudiciais a processos de separação a jusante. O polipeptídeo giutamato desidrogenase (GLDH) converte glu-tamato em 2-oxoglutarato, reciclando desse modo 0 co-substrato na reação catalisada por triptofano aminotransferase. GLDH também gera equivalentes de redução (NADH ou NADPH) que podem ser usados para gerar energia para a célula (ATP) sob condições aeróbicas. A utilização de glutamato por GLDH também reduz formação subproduto. Adicionalmente, a reação gera amônia, que pode funcionar como uma fonte de nitrogênio para a célula ou como um substrato em uma aminação redutiva para a etapa final mostrada na Figura 1. Portanto, uma célula de produção que superexpressa um poli-peptídeo GLDH pode ser usada para aumentar o rendimento e reduzir o custo de meios e/ou processos de separação.

No caminho de triptofano para monatina, o doador de amino de etapa três (por exemplo, glutamato ou aspartato) pode ser convertido de volta ao aceitador de amino exigido para a etapa 1 (por exemplo, 2-oxoglutarato ou oxaloacetato), se uma aminotransferase das classes de enzima apropriadas é usada. Utilização de duas transaminases separadas para esse caminho, em que o substrato de uma transaminase não competitivamente inibe a atividade da outra transaminase, pode aumentar a eficiência desse caminho.

Muitas das reações nos caminhos descritos são reversíveis e atingirão, portanto, um equilíbrio entre substratos e produtos. O rendimento do caminho pode ser aumentado por remoção contínua dos produtos dos polipeptídeos. Por exemplo, secreção de monatina no caldo de cultura de fermentação usando uma permease ou outra proteína de transporte, ou cristalização seletiva de monatina de uma corrente no reator biocatalítico com reciclo concomitante de substratos aumentará o rendimento da reação. A remoção de subprodutos através de reações enzimáticas adicionais ou por substituição de grupos doadores de amino é um outro meio de aumentar o rendimento da reação. Diversos exemplos são discutidos no Exemplo 13 e mostrado nas Figuras 11-13. Idealmente, produz-se um subproduto que é indisponível para reagir na direção inversa, através de alteração de fase (evaporação) ou através de conversão espontânea a um produto final não-reativo, tal como dióxido de carbono.

Modulação dos Pools de Substato O pool de indol pode ser modulado aumentando a produção de precursores de triptofano e/ou alterando caminhos catabólicos envolvendo indol-3-piruvato e/ou triptofano. Por exemplo, a produção de ácido indol-3-acético de indol-3-piruvato pode ser reduzida ou eliminada suprimindo funcionalmente a codificação de genes para EC 4.1.1.74 na célula hospedeira. Produção de indol a partir de triptofano pode ser reduzida ou eliminada suprimindo funcionalmente a codificação de genes para EC 4.1.99.1 na célula hospedeira. Alternativamente, um excesso de indol pode ser utilizado como um substrato em um processo in vitro ou in vivo em combinação com quantidades elevadas da codificação de genes para EC 4.1.99.1 (Kawasaki e outros, J. Ferm. And Bioeng., 82:604-6, 1996). Modificações genéticas podem ser feitas para aumentar o nível de intermediários tais como D-eritrose-4-fosfato e corismato.

Produção de triptofano é regulada na maior parte dos organismos. Um mecanismo é via inibição de retroalimentação de certas enzimas no caminho; à medida que níveis de triptofano aumentam, a taxa de produção de triptofano diminui. Desse modo, ao usar uma célula hospedeira en-genheirada para produzir monatina via um intermediário de triptofano, pode ser usado um organismo que não seja sensível a concentrações de triptofano. Por exemplo, uma cepa de Catharanthus roseus que é resistente à inibição de crescimento por vários análogos de triptofano, foi selecionada por exposição repetida a altas concentrações de 5-metiltriptofano (Schallenberg e Berlin, Z. Naturforsch 34:541-5, 1979). A atividade de triptofano sintase resultante da cepa foi menos afetada por inibição do produto, provavelmente devido a mutações no gene. Similarmente, uma célula hospedeira usada para produção de monatina pode ser otimizada.

Produção de triptofano pode ser otimizada através do uso de evolução dirigida para desenvolver polipeptídeos que são menos sensíveis a inibição do produto. Por exemplo, seleção pode ser efetuada em placas que não contém triptofano no meio, mas com altos níveis de análogos de triptofano não-metabolizável. As Patentes U.S. N°s 5.756.345; 4.742.007 e 4.371.614 descrevem métodos usados para aumentar produtividade de triptofano em um organismo de fermentação. A última etapa de biossíntese de triptofano é a adição de serina em indol; portanto a disponibilidade de serina pode ser elevada para aumentar produção de triptofano. A quantidade de monatina produzida por um organismo de fermentação pode ser elevada aumentando a quantidade de piruvato produzido pelo organismo hospedeiro. Certos levedos, tais como Trichosporon cuta-neum (Wang e outros, Lett. Appl. Microbiol., 35:338-42, 2002) e Torulopsis glabrata (Li e outros, Appl. Microbiol. Biotechnol. 57:451-9, 2001) superpro-duz piruvato e pode ser usado para prática dos métodos descritos nesta invenção. Além disso, modificações genéticas podem ser feitas a organismo para promover produção de ácido pirúvico, tais como aqueles em cepa de E. co//W1485 Iip2 (Kawasaki e outros, J. Ferm. and Bioeng. 82:604-6,1996). Controle de Quiralidade O perfil gustativo de monatina pode ser alterado através de controle da estereoquímica (quiralidade) da molécula. Por exemplo, isômeros diferentes de monatina poderão ser desejados em diferentes combinações de concentrações para sistemas de alimento diferentes. Quiralidade pode ser controlada via uma combinação de pH e polipeptídeos.

Racemização na posição C-4 de monatina (ver molécula numerada acima) pode ocorrer através de desprotonação e reprotonação do alfa-carbono, que pode ocorrer por um deslocamento no pH ou por reação com o co-fator PLP. Em um microorganismo, é improvável que o pH desloque-se o bastante para causar a racemização, mas PLP é abundante. Métodos para controlar a quiralidade com polipeptídeos dependem da via biossintética uti- lizada para produção de monatina.

Quando monatina é formada usando o caminho mostrado na Figura 2, o seguinte pode ser considerado. Em uma reação biocatalítica, a quiralidade de carbono 2 é determinada pela enzima que converte indol-3-piruvato em MP. Enzimas múltiplas (por exemplo, de EC 4.1.2.-, 4.1.3) podem converter indol-3-piruvato em MP, desse modo, uma pode escolher a enzima que forma o isômero desejado.

Alternativamente, a enantioespecificidade da enzima que converte indol-3-piruvato em MP pode ser modificada através do uso de evolução dirigida ou anticorpos catalíticos podem ser engenheirados para catalisar a reação desejada. Um vez que MP é produzida (enzimaticamente ou por condensação química), o grupo amino pode ser adicionado estereoes-pecificamente usando uma transaminase, tais como aquelas descritas nesta invenção. A configuração R ou S de carbono-4 pode ser gerada dependendo se um D-ácido aromático ou L-ácido aromático aminotransferase é usado. A maior parte das aminotransferases são específicas para o L-isômero, contudo, D-triptofano aminotransferases existe em certas plantas (Kohiba e Mito, Proceedings of the 8^ International Symposium on Vitamin Be and Carbonyl Catalysis (Procedimentos do 8o. Simpósio Internacional sobre Vitamina B6 e Catálise de Carbonila), Osaka, Japão, 1990). Além disso, D-alanina aminotransferase (2.6.1.21), D-metionina-piruvato aminotransferases (2.6.1.41) e tanto (R)-3-amino-2-metilpropanoato aminotransferase (2.6.1.61) quanto (S)-3-amino-2-metilpropanoato aminotransferase (2.6.1.22) têm sido identificadas. Certas aminotransferases poderão apenas reconhecer o substrato para essa reação com uma configuração particular no carbono C2. Portanto, mesmo que a conversão para MP não seja estereoespecífi-ca, a estereoquímica do produto final pode ser controlada através da seleção apropriada de uma transaminase. Uma vez que as reações sejam reversíveis, o MP (isômero indesejado) não reagido pode ser reciclado de volta a seus constituintes e uma mistura racêmica de MP pode ser reformada.

Ativação de substratos Substratos fosforilados, tal como fosfoenolpiruvato (PEP), podem ser usados nas reações descritas nesta invenção. Substratos fosforilados podem ser mais energeticamente favoráveis e, portanto, podem ser usados para aumentar as taxas e/ou rendimentos da reação. Em condensações de aldol, a adição de um grupo fosfato estabiliza o tautômero enol do substrato nucleofílico, tomando-o mais reativo. Em outras reações, um substrato fosforilado freqüentemente proporciona um melhor grupo de saída. Similarmente, substratos podem ser ativados por conversão em derivados de CoA ou derivados de pirofosfato.

Exemplo 1 Clonagem e Expressão de Triptofano Aminotransferases Este exemplo descreve métodos que foram usados para clonar triptofano aminotransferases, os quais podem ser usados para converter triptofano em indol-3-piruvato.

Revisão Geral do Experimento Onze genes que codificam aminotransferases foram clonados em E.coli. Esses genes foram Bacillus subtills D-alanina aminotransferase (dat, N° de Acesso Genbank Y14082.1 pb 28622-29470 e N° de Acesso Genbank. NP_388848.1, seqüência de ácido nucléico e seqüência de ami-noácido, respectivamente), Sinorhizobium meliloti (também denominado Rhizobium meliloti) tirosina aminotransferase (tatA, SEQ ID NOS: 1 e 2, seqüência de ácido nucléico e seqüência aminoácido, respectivamente), cepa de Rhodobacter sphaeroides 2.4.1 tirosina aminotransferase (tatA confirmado por homologia, SEQ ID NOS: 3 e 4, seqüência de ácido nucléico e seqüência de aminoácido, respectivamente), R. sphaeroides 35053 tirosina aminotransferase (confirmado por homologia, SEQ ID NOS: 5 e 6, seqüência de ácido nucléico e seqüência de aminoácido, respectivamente), Leishmania major substrato amplo aminotransferase (bsat, confirmado por homologia a fragmentos peptídicos de L. mexicana, SEQ ID NOS: 7 e 8, seqüência de ácido nucléico e seqüência de aminoácido, respectivamente), Bacillus subti-lis aromático aminotransferase (ara7, confirmado por homologia, SEQ ID NOS: 9 e 10, seqüência de ácido nucléico e seqüência de aminoácido, respectivamente), Lactobacillus amylovorus aromático aminotransferase (araT, confirmado por homologia, SEQ ID NOS: 11 e 12, seqüência de ácido nucléico e seqüência de aminoácido, respectivamente), R. sphaeroides 35053 aminotransferase substrato múltiplo (confirmado por homologia, SEQ ID NOS: 13 e 14, seqüência de ácido nucléico e seqüência de aminoácido, respectivamente), cepa de Rhodobacter sphaeroides 2.4.1 aminotransferase substrato múltiplo (msa, confirmado por homologia, N° de Acesso Genbank AAAE01000093.1, pb 14743-16155 e N° de Acesso Genbank ZP00005082.1, seqüência de ácido nucléico e seqüência de aminoácido, respectivamente), Escheríchia coii aspartato aminotransferase (aspC, N° de Acesso Genbank AE000195.1 pb 2755-1565 e N° de Acesso Genbank AAC74014.1, seqüência de ácido nucléico e seqüência de aminoácido, respectivamente), e E. coli tirosina aminotransferase (tyrB, SEQ ID NOS: 31 e 32, seqüência de ácido nucléico e seqüência de aminoácido, respectivamente).

Os genes foram clonados, expressos, e testados para atividade na conversão de triptofano em indol-3-piruvato, juntamente com enzimas comercialmente disponíveis. Todos os onze clones apresentaram atividade. Identificação de Cepas Bacterianas que Poderão Conter Polipeptídeos com a Atividade Deseiada Nenhum gene no banco de dados do CNIB (Centro Nacional para Informação de Biotecnologia) foi designado como triptofano amino-transferases. Todavia, organismos que apresentam essa atividade enzimáti-ca têm sido identificados. Atividade de L-triptofano aminotransferase (TAT) foi medida em extratos celulares ou de proteína purificada das seguintes fontes: Isolato rizobacteriano de Festuca octoflora, mitocôndria de ervilha e citosol, células biliares de coroa de girassol, Rhizobium leguminosarum bio-var trifoli, Erwinia herbicola pv gipsófila, Pseudomonas syringae pv. savasta-noi, Agrobacterium tumefaciens, Azospirillum lipferum & brasilense, Entero-bacter cloacae, Enterobacter agglomerans, Bradyrhizobium elkanii, Candida maltosa, Azotobacter vinelandii, cérebro de rato, fígado de rato, Sinorhizo- bium meliloti, Pseudomonas fluorescens CHAO, Lactococcus lactis, Lactoba-cillus casei, Lactobacillus helveticus, mudas de trigo, cevada, Phaseolus au-reus (feijão-mungo), Saccharomyces uvarum (carlsbergensis), Leishmania sp., milho, brotos de tomate, plantas de ervilha, tabaco, suíno, Clostridium sporogenes e Streptomyces gríseus.

Isolamento de DNA Genômico para Clonagem S. meliloti (número 9930 ATCC) foi desenvolvida em meio TY a 25°C, pH 7,2. Células foram desenvolvidas a uma densidade óptica sob 600 nm (ODeoo) de 1,85 e 2% de inóculos foram usados para preparações de DNA genômico. O kit genomic tip 20/G Qiagen (Valencia, CA) foi usado para isolamento de DNA genômico.

Bacillus subtilis 6051 (ATCC) foi desenvolvido a 30°C em Bereto Nutrient Broth (Difco; Detroit, Ml). O protocolo genômico tip 20/G Qiagen foi usado para isolar o DNA genômico com as seguintes alterações: as concentrações de proteinase K e lisozima foram duplicadas e tempos de incubação foram aumentados 2-3 vezes. DNA genômico de Leishmania major ATCC 50122 foi fornecido por IDI, Inc. (Quebec, Canadá) em tampão TE, pH 8,0,17 ng/pL.

Rhodobacter sphaeroides 2.4.1 (proporcionado por Professor Sam Kaplan, Universidade de Texas, Houston), R. sphaeroides 35053 (número ATCC) e DNA genômico de L. amyiovorus foi preparado por extração padrão de fenol. Células foram colhidas em fase log atrasada, ressuspensas em tampão TEN (10 mM de Tris-HCI, pH 7,5, 1 mM de EDTA, 100 mM de NaCI), e lisadas pela adição de 0,024 mL de lauril sarcosina sódica por mL de suspensão de células. Após extração de pelo menos três vezes com um volume igual de fenol saturado com tampão (10 mM de Tris-HCI, pH 7,5, 1 mM de EDTA), a solução de DNA foi extraída uma vez com clorofór-mioioctanol 9:1 e três vezes com clorofórmio. O DNA foi precipitado pela adição de 0,1 em volume de acetato de sódio 3 M, pH 6,8 e 2 volumes de etanol. O precipitado foi coletado por centrifugação e lavado uma vez com 70% de etanol. Finalmente o DNA foi dissolvido em 0,10 ml de água destilada. DNA genômico de Escherichia coli foi isolado de cepa DH10B (Invitrogen) e preparado usando o kit Genomic-tip® Qiagen (500/G). De 30 mL dessa cepa desenvolvida em LB até uma OD eso de 1,87, foi obtido 0,3 mg de DNA purificado. O DNA purificado foi dissolvido em tampão de eluição Qiagen (TE) sob uma concentração de 0,37 μg/μL.

Protocolo de Reação em Cadeia de Polimerase Iniciadores foram projetados com projeções compatíveis para o vetor pET 30 Xa/LIC (Novagen, Madison, Wl). O vetor pET tem uma projeção de filamento simples de 12 bases no lado 5' do sítio Xa/LIC e uma projeção de filamento simples de 15 bases no lado 3' do sítio Xa/LIC. O plasmí-deo é projetado para clonagem independente de ligação, com marcadores de His e S N-terminal e marcador de His C-terminal opcional. O sítio de identificação de Xa protease (IEGR) situa-se diretamente em frente do códon de partida do gene de interesse, tal que as pontas de proteína de fusão possam ser removidas.

As seqüências seguintes foram adicionadas às extremidades 5' das seqüências de organismo específicas quando se projeta iniciadores: ini-ciador dianteiro, 5' GGTATTGAGGGTCGC (SEQ ID NO: 73); iniciador inverso: 5' AGAGGAGAGTTAGAGCC (SEQ ID NO: 74).

Iniciadores dat de Bacillus subtilis: terminal N: 5- GGTATTGA-GGGTCGCATGAAGGTTTTAGTCAATGG-3' e terminal C: 5’- AGAGGAG AGTTAGAGCCTT AT GAAAT GCTAGCAGCCT-3' (SEQ ID NOS: 15 e 16).

Iniciadores tatA de Sinorhizobium meliloti: terminal N 5'-GGTATTGAGGGTCGCATGTTCGACGCCCTCGCCCG e terminal C: 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGAGACTGGTGAACTTGC (SEQ ID NOS: 17 e 18).

Iniciadores araTde Bacillus subtilis: terminal N: 5'- GGTATTGA-GGGTCGCATGGAACATTTGCTGAATCC e terminal C: 5'- AGAGGAGAGTTAGAGCCTTAAACGCCGTTGTTTATCG (SEQ ID NOS: 19 e 20).

Msa de Rhodobacter sphaeroides (tanto 2.4.1 e 35053): terminal N: 5-GGTATTGAGGGTCGCATGCGCGAGCCTCTTGCCCT e terminal C: 5'- AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGCCGGGGAAGCTCCGGG (SEQ ID NOS: 21 e 22).

Bsat de Leishmania major, terminal N: 5'- GGTATTGA-GGGTCGCATGTCCACGCAGGCGGCCAT e terminal C: 5- AGAGGAGA-GTTAGAGCCTCACTCACGATTCACATTGC (SEQ ID NOS: 23 e 24).

AraT de Lactobacillus amylovorus: terminal 5'- GGTATTGA-GGGTCGCATGCCAGAATTAGCTAATGA e terminal C: 5’- AGAGGAGA-GTTAGAGCCTTATTCGTCCTCTTGTAAAA (SEQ ID NOS: 25 e 26).

TatA de Rhodobacter sphaeroides (cepas tanto 2.4.1 quanto 35053): terminal N: 5’- GGTATTGAGGGTCGCATGCGCTCTACGACGGCTCC e terminal C: 5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGCCGCGCAGCACCTTGG (SEQ ID NOS: 27 e 28).

AspC de Escherichia coli: terminal N: 5'- GGTATTGA-GGGTCGCATGTTTGAGAAACATTACCGC-3' e terminal C: 5- AGAGGA-GAGTTAGAGCCTTACAGCACTGCCACAATCG-3' (SEQ ID NOS: 29 e 30).

TyrB de Escherichia coli: terminal N: 5'- GGTATTGA-GGGTCGCGTGTTCAAAAAGTTGACGC e terminal C: 5’- AGAGGAGA-GTTAGAGCCTTACATCACCGCAGCAAACG-3’ (SEQ ID NOS: 33 e 34). O gene derivado de (tatA) S. meliloti foi amplificado usando o seguinte protocolo de PCR. Em uma reação de 50 pL, foram usados 0,1-0,5 pg de padrão, 1,5 pM de cada iniciador, 0,4 mM de cada dNTP, 3,5 U de Polimerase Expand High Fidelity® (Roche, Indianápolis, IN), e 1 X tampão Exparuf1 com Mg. O programa termociclador usado incluiu uma partida quente a 96°C por 5 minutos, seguido por 29 repetições das seguintes etapas: 94°C por 30 segundos, 55°C por 2 minutos e 72°C por 2,5 minutos. Após as 29 repetições a amostra foi mantida em 72°C por 10 minutos e em seguida armazenada a 4°C. Esse protocolo de PCR produziu um produto de 1199 pb.

As sequências dos genes derivados de (msa e tatA) de R. sphaeroides, araT de L amylovorus e araT de Baciiius foram amplificados usando o seguinte protocolo de PCR. Em uma reação de 50 μΙ_, foram adicionados 0,1-0,5 pg de padrão, 1,5 μΜ de cada iniciador, 0,4 mM de cada dNTP, 3,5 U de Polimerase Expand High Fidelity® e tampão 1X Expand® com Mg. O programa termociclador usado incluiu uma partida quente a 96°C por 5 minutos, seguido por 29 repetições das seguintes etapas: 94°C por 30 segundos, 40-60°C por 1 minuto, 45 segundos (termociclador de gradiente) e 72°C por 2 minutos, 15 segundos. Após as 29 repetições a amostra foi mantida em 72°C por 10 minutos e em seguida armazenada a 4°C.

Para cada gene msa de R. sphaeroides, as temperaturas de re-cozimento a 42°C e 48°C produziram produtos múltiplos, mas uma banda distinta sob aproximadamente 1464 bp. Para araTde L. amylovorus, as temperaturas de recozimento a 42°C, 48°C e 56°C renderam produtos simples com bandas intensas sob 1173 bp. Para araT de B. subtilis, as temperaturas de recozimento a 40°C, 45°C, 50°C, 55°C geraram produtos intensos simples (1173 pb), tanto de DNA genômico quanto de colônias. Para bsat de L major, a temperatura de recozimento a 55°C forneceu o produto mais puro (1239 pb). Para genes tatA de Rhodobacter, as temperaturas de recozimento a 50-55°C forneceram produtos puros no tamanho correto (1260 pb). Tanto para genes de E. coli quanto o gene dat de B. subtilis, uma temperatura de recozimento de 55-60°C foi usada, e o tempo de recozimento foi encurtado a 45 segundos. Produtos puros de tamanhos corretos foram obtidos (aproximadamente 1,3 kb para os genes de E. coli, 850 pb para o gene dat). Clonagem Os produtos de PCR foram purificados em gel de 0,8 ou 1% de géis de TAE-agarose usando o kit de extração em gel Qiagen (Valencia, CA). Os produtos de PCR foram quantificados por comparação a padrão sobre um gel de agarose, e em seguida tratados com DNA polimerase T4 seguindo os protocolos recomendados pelo fabricante para Clonagem Independente de Ligação (Novagen, Madison, Wl).

De forma resumida, aproximadamente 0,2 pmol de produto de PCR purificado foi tratado com 1 U de DNA polimerase T4 na presença de dGTP por 30 minutos a 22°C. A polimerase remove bases sucessivas das extremidades 3’ do produto de PCR. Quando a polimerase encontra um resíduo de guanina, a atividade de polimerase 5' a 3' da enzima contra-ataca a atividade de exonuclease para impedir efetivamente excisão adicional. Isso cria projeções de filamento simples que são compatíveis com o vetor pET Xa/LIC. A polimerase é inativada através de incubação a 75°C por 20 minutos. O vetor e inserção tratada foram recozidos como recomendado por Novagen. Aproximadamente 0,02 pmol de inserção tratada e 0,01 pmol de vetor foram incubados por 5 minutos a 22°C, 6,25 mM de EDTA (concentração final) foram adicionados, e a incubação a 22°C foi repetida. A reação de recozimento (1 μΙ_) foi adicionada a células competentes simples Nova-Blue® (Novagen, Madison, Wl), e incubada sobre gelo por 5 minutos. Após mistura, as células foram transformadas por choque térmico por 30 segundos a 42°C. As células foram colocadas em gelo por 2 minutos, e deixadas a recuperar em 250 μΐ_ de temperatura ambiente SOC por 30 minutos a 37°C com agitação vigorosa a 225 rpm. As células foram colocadas em lâminas sobre LB contendo canamicina (25-50 pg/mL). DNA de plasmídeo foi purificado usando kit miniprep "spin" Q/a-gen e selecionado para as inserções corretas através de digestão por restrição com XhoI e Xba\. As seqüências de plasmídeos que mostraram apresentar a inserção correta foram verificadas por seqüenciamento de DNA de terminação de cadeia didesóxi. SEQ ID NOS: 1-14 e 31-32 mostra seqüências de nucleotídeo e aminoácidos correspondentes das aminotransferases recombinantes, quaisquer alterações das seqüências de Genbank foram substituições conservati-vas silenciosas ou geradas na seqüência de proteína. SEQ ID NOS: 11 e 12 são seqüências novas.

Expressão e Ensaios de Genes DNA de plasmídeo, verificado por análise seqüencial, foi subclo-nado em hospedeiros de expressão de E. coli BLR(DE3) ou BL21(DE3) (Novagen, Madison, Wl). As culturas foram crescidas e os plasmídeos foram isolados usando kit miniprep Qiagen, e analisado por digestão por restrição para confirmar identidade.

Indução foi inicialmente efetuada com araT de L amylovorus, araT de B. subtilis e tatA de S. meliloti tanto em células BLR(DE3) quanto em células BL21(DE3). Um estudo do curso de tempo foi realizado com crescimento de culturas em LB contendo canamicina (30 mg/L) a uma Οϋβοο de 0,5-0,8 e induzido com 1 mM de IPTG (isopropil tiogalatosida) e amostrado em 0,1, 2 e 4 horas pós-indução. Células de 2,0 mL foram ressuspensas em 0,10 mL 120 mM de Tris-HCI, pH 6,8 contendo dodecil sulfato de sódio a 10%, 2-mercaptoetanol a 10%, e glicerol a 20%, aquecidas a 95°C por 10 minutos, esfriadas e diluídas com 0,10 mL de H2O. Alíquotas dessas amostras de proteína celular totais foram analisadas por SDS-PAGE usando um gel de gradiente a 4-15%. Não houve diferenças significativas na quantidade de proteína expressa entre 2 e 4 horas de indução, nem entre as células BLR(DE3) e BL21(DE3).

Extratos de células foram também preparadas das amostras de 4 horas através de suspensão dos péletes de células de 2 mL de cultura em 0,25 mL de reagente NovagenBugBustei® contendo 0,25 pL de benzonase nuclease, incubação sob temperatura ambiente por 20 minutos com agitação vigorossa moderada, e centrifugação em 16.000 x g para remover fragmentos de células. Os sobrenadantes (extratos de células) foram carregados em géis de gradiente a 4-15% para análise das proteínas celulares solúveis.

Os três clones, (araT de L. amylovorus (SEQ ID NOS: 11 e 12), araT de B. subtilis (SEQ ID NOS: 9 e 10) e tatA de S. meliloti (SEQ ID NOS: 1 e 2) mostraram proteína solúveis que correspondem ao tamanho correto (aproximadamente 45 kDa). O produto de gene araT de B. subtilis foi super-expressado no nível mais alto e/ou foi mais solúvel do que os outros dois produtos de gene.

Em métodos de expressão subseqüentes, DNA de plasmídeo de clones positivos foi subclonado em BL21(DE3) devido a melhores características de crescimento desse hospedeiro. Indução foi repetida usando 1 mM de IPTG com crescimento de culturas em LB contendo canamicina em 50 mg/L, indução quando Οϋβοο atingiu aproximadamente 0,8. Células foram colhidas após 4 horas de crescimento em 37°C, centrifugadas em 3.000 rpm por 10 minutos (4°C), lavadas com tampão de TEGGP (50 mM de Tria-HCI (pH 7,0), 0,5 mM de EDTA, 100 mg/L de glutationa, glicerol a 5%, com coquetel completo inibidor de protease Roché), e instantaneamente congelado em etanol a -80°C.

Amostras foram ressuspensas em 5 mL/g em peso de célula úmida de reagente BugBustei® (Novagen) contendo 5 μΙ_/ηιΙ_ de conjunto coquetel inibidor de protease N° 3 (Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego, CA) e 1 pL/mL de benzonase nuclease. Amostras foram incubadas sob temperatura ambiente por 20 minutos em um agitador orbital. Fragmentos de células insolúveis foram removidos por centrifugação sob 16.000 X g por 20 minutos em 4°C.

Extratos de células foram analisados por SDS-PAGE, e ensaiados para atividade de triptofano aminotransferase seguindo produção de ácido indol-pirúvico usando o seguinte protocolo. Reações de 1 mL foram realizadas em 50 mM de tetraborato de sódio (pH 8,5), 0,5 mM de EDTA, 0,5 mM de arsenato de sódio, 50 μΜ de fosfato piridoxal, 5 mM de a-cetoglutarato e 5 mM de L-triptofano. As reações foram iniciadas pela adição de extratos de célula livres ou enzima purificada e foram incubadas 30 minutos a 30°C. 20% de TCA (200 μΙ_) foram adicionados para cessar a reação, e a proteína precipitada foi removida por centrifugação. A absorbância em 327 nm foi medida e comparada com uma curva padrão de indol-3-piruvato recentemente preparado no tampão de ensaio. Reações de controle sem o substrato de triptofano ou usando extratos de células livres de clones transformados com pET30 separado foram também realizadas.

Devido a fundo das E. coli aminotransferases nativas em extratos de células, proteínas recombinantes foram purificadas usando cartuchos de His-Bind seguindo protocolos do fabricante (Novagen, Madison, Wl). As frações de eluente foram dessalgadas sobre colunas de PD-10 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) e eluídos em 50 mM de Tris, pH 7,0. Proteínas purificadas foram analisadas por SDS-PAGE e ensaiadas para atividade de aminotransferase.

Resultados da indução a 37°C com 1 mM de IPTG (4 horas) demonstram que bsat de L. major, tatA de S. meliloti, aspC de E. coli e ambos os clones de tatA de R. sphaeroides apresentam níveis significativos de atividade de triptofano aminotransferase. A proteína araT de B. subtilis foi superexpressa e solúvel, mas mostrou pouca atividade enzimática. O produto de gene L. amylovorus araT pareceu ser solúvel no extrato de célula, mas purificação usando um cartucho de His-Bind resultou em apenas pequenas quantidades de proteína com o peso molecular correto. Os produtos de gene msa foram insolúveis e experimentos de expressão adicionais foram feitos a 24°C para minimizar inclusão de formação corporal. Diversas concentrações de IPTG entre 10 μΜ e 1 mM foram usados para maximizar a quantidade de proteína solúvel. A Tabela 1 lista as atividades específicas medidas em micro-gramas de indol-3-piruvato (I3P) formado por miligrama de proteína por minuto. Em alguns casos, quantidades muito pequenas de proteína recombi-nante mostraram altos níveis de atividade acima da faixa linear eficaz do ensaio. Nesses casos a'>' precede o número de atividade específica.

Tabela 1: Atividades de Clones Específicas em Extratos Celulares (EC) e Enzimas Purificadas (P) e Comerciais Continuação Um alinhamento comparando todas as proteínas recombinantes clonadas ilustram que não há muitas áreas altamente conservadas entre as seqüências de araT, tatA, bsate msa. Um alinhamento de proteínas recombinantes de atividade mais alta: homólogos do produto de gene tatA de Rho-dobacter, substrato amplo aminotransferase de L. major e a tirosina amino-transnferase de Sinorhizobium meliloti mostraram diversas regiões conservadas, contudo, eles são apenas aproximadamente 30-43% idênticos no nível de proteína. A disponibilidade da faixa ampla, (D-alanina) aminotransferase D-específico pode ser útil na produção de outros estereoisômeros de monatina.

Exemplo 2 Conversão de lndol-3-lactato em lndol-3-piruvato Como mostrado nas Figuras 1 e 3, ácido indol-3-lático pode ser usado para produzir indol-3-piruvato. Conversão entre ácido lático e piruvato é uma reação reversível, como é conversão entre indol-3-piruvato e indol-3-lactato. A oxidação de indol-lactato foi tipicamente seguida devido à alta quantidade de fundo a 340 nm de indol-3-piruvato. A mistura de ensaio padrão continha 100 mM de fosfato de potássio, pH 8,0, 0,3 mM de NAD+, 7 unidades de lactato desidrogenase (LDH) (S/gma-L2395, St. Louis, MO) e 2 mM de substrato em 0,1 mL. O ensaio foi efetuado em duplicata em uma placa de microtitulação transparente a UV, usando uma leitora de placa SpectraMax Plus Molecular Devices. Polipeptí-deo e tampão foram misturados e pipetados nas cavidades contendo o ácido indol-3-lático e NAD+ e a absorbância em 340 nm de cada cavidade foi lida sob intervalos de 9 segundos após mistura rápida. A reação foi mantida em 25°C por 5 minutos. O aumento na absorbância sob 340 nm segue a produção de NADH de NAD+. Controles negativos separados foram efetuados sem NAD+ e sem substrato. D-LDH de Leuconostoc mesenteroides (catálogo Sigma número L2395) pareceu exibir maior atividade com os substratos de derivado indol do que L-LDH de Bacillus stearothermophilus (catálogo Sigma número L5275). Métodos similares foram utilizados com ácido D-lático e NAD+ ou NADH e piruvato, os substratos naturais de polipeptídeos D-LDH. A Vmáx. para a redução de piruvato foi de 100-1.000 vezes mais que a Vmáx. para a oxidação de lactato. A VmáX. para a reação de oxidação de indol-3-lático com D-LDH foi de aproximadamente um quinto daquela com ácido lático. A presença de indol-3-piruvato foi também medida seguindo a alteração na absorbância em 327 (o derivado de enol-borato) usando 50 mM de tampão bo-rato de sódio contendo 0,5 mM de EDTA e 0,5 mM de arsenato de sódio. Alterações pequenas mas repetíveis de absorbância foram observadas, quando comparadas à controles negativos tanto para polipeptídeos L quanto para polipeptídeos D-LDH.

Adicionalmente, lactato desidrogenase de especificidade ampla (enzimas com atividade associadas a EC 1.1.127, EC 1.1.1.28 e/ou EC 1.1.2.3), pode ser clonado e usado para produzir indol-3-piruvato a partir de ácido indol-3-lático. Fontes de desidrogenase de especificidade ampla incluem E. coli, Neisseria gonorrhoeae e Lactobaciilus plantarum.

Altemativamente, indol-3-piruvato pode ser produzido através de contato de indol-3-lactato com extratos celulares de Clostridium sporogenes que contêm uma indolelactato desidrogenase (EC 1.1.1.110); ou extratos celulares de Trypanosoma cruzi epimastigotes que contêm p-hidroxifenilactato desidrogenase (EC 1.1.1.222) sabidos apresentar atividade sobre indol-3-piruvato; ou Pseudomonas acidovorans ou extratos celulares de E. coli, que contêm um lactato desidrogenase imidazol-5-ila (EC 1.1.1.111); ou Coleus blumei, que contém um hidroxifenilpiruvato redutase (EC 1.1.1.237); ou Candida maltosa que contém um lactato desidrogenase D-aromático (EC 1.1.1.222). Referências descrevendo essas atividades incluem, Nowicki e outros (FEMS Microbiol. Lett. 71: 119-24, 1992), Jean e DeMoss (Canadian J. Microbiol. 14, 1968, Coote e Hassall (Biochem. J. 111: 237-9, 1969), Cortese e outros (C.R. Seances Soc. Biol. Fil. 162 390-5, 1968), Petersen e Alfermann (Z. Naturforsch. C.Biosci. 43 501-4, 1988) e Bhatnagar e outros (J. Gen. Microbiol. 135: 353-60, 1989). Além disso, um lactato oxidase tal como aquele de Pseudomonas sp. (Gu e outros, J. Mol. Catalysis B: Enzymatic: 18:299-305, 2002), pode ser utilizado para oxidação de indol-3-lático em indol-3-piruvato.

Exemplo 3 Conversão de L-triptofano em lndol-3-piruvato utilizando L-aminoácido oxidase Este exemplo descreve métodos usados para converter triptofa-no em indol-3-piruvato via uma oxidase (EC 1.4.3.2), como uma alternativa a usar um triptofano aminotransferase conforme descrito no Exemplo 1. L-aminoácido oxidase foi purificado de Crotalus durissus (Sigma, St. Louis, MO, número catálogo A-2805). Os números de acesso de L-aminoácido oxi-dases para clonagem molecular incluem: CAD21325.1, AAL14831, NP_-490275, BAB78253, A38314, CAB71136, JE0266, T08202, S48644, CAC00499, P56742, P81383, 093364, P81382, P81375, S62692, P23623, AAD45200, AAC32267, CAA88452, AP003600 e Z48565.

Reações foram efetuadas em tubos de microcentrífuga em um volume total de 1 mL, incubados por 10 minutos enquanto se agita vigorosamente a 37°C. A mistura reacional continha 5 mM de L-triptofano, 100 mM de tampão fosfato de sódio, pH 6,6, 0,5 mM de arsenato de sódio, 0,5 mM de EDTA, 25 mM de tetraborato de sódio, 0,016 mg de catalase (83 U, Sigma C-3515), 0,008 mg de FAD (Sigma) e 0,005-0,125 Unidades de L-aminoácido oxidase. Controles negativos continham todos os componentes exceto triptofano, e blanks continham todos os componentes exceto a oxidase. Catalase foi usada para remover o peróxido de hidrogênio formado durante a desaminação oxidante. O tetraborato de sódio e arsenato foram usados para estabilizar a forma enol-borato de indol-3-piruvato, que mostra uma absorbância máxima em 327 nm. Padrão de indol-3-piruvato foram preparados sob concentrações de 0,1-1 mM na mistura reacional. A L-aminoácido oxidase adquirida tinha uma atividade específica de 540 pg de indol-3-piruvato formado por minuto por mg de proteína. Esta é a mesma ordem de magnitude como a atividade específica de enzimas triptofano aminotransferase.

Exemplo 4 Conversão de lndol-3-piruvato em 2-hidróxi 2-(indol-3-ilmetih-4-cetoácido alutárico com uma Aldolase Este exemplo descreve métodos que podem ser usados para converter indol-3-piruvato no precursor de monatina (MP) 2-hidróxi 2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoácido glutárico usando uma aldolase (liase) (Figura 2). Condensações de aldol são reações que formam ligações carbono-carbono entre o β-carbono de um aldeído ou cetona e o carbono de carbonila de um outro aldeído ou cetona. Um carbônio é formado no carbono adjacente ao grupo carbonila de um substrato, e funciona como um nucleófilo que ataca o carbono de carbonila do segundo substrato (o carbono eletrofílico). Mais comumente, o substrato eletrofílico é um aldeído, assim mais aldolases enquadram-se na categoria EC 4.1.2-. Bastante freqüente, o substrato nucleo-fílico é piruvato. Ele é menos comum para aldolases catalisar a condensação entre dois cetoácidos ou dois aldeídos.

Todavia, aldolases que catalisam a condensação de dois ácidos carboxílicos têm sido identificadas. Por exemplo, EP 1045-029 descreve a produção de ácido L-4-hidróxi-2-cetoglutárico a partir de ácido glioxílico e piruvato usando uma cultura de Pseudomonas (EC 4.1.3.16). Além disso, 4- hidróxi-4-metil-2-oxogIutarato aldolase (4-hidróxi-4-metil-2-oxoglutarato piru-vato liase, EC 4.1.3.17) pode catalisar a condensação de dois cetoácidos. Portanto, polipeptídeos de aldolase similares foram usados para catalisar a condensação de indol-3-piruvato com piruvato.

Clonagem 4-Hidróxi-4-metil-2-oxoglutarato piruvato liases (ProA aldolase, EC 4.1.3.17) e 4-hidróxi-2-oxoglutarato glioxilato-liase (KHG aldolase, EC 4.1.3.16) catalisa reações muito similares à reação de aldolase da Figura 2. Iniciadores foram projetados com projeções compatíveis para o vetor pET30 Xa/LIC. (Novagen, Madison, Wl). O projeto desses iniciadores é descrito acima no Exemplo 1.

Os iniciadores seguintes foram projetados para clonagem de pET30 Xa/LIC: 1. Gene proA de Pseudomonas straminea (No. de Acesso Genbank: 12964663 Versão: 12964663) e gene proA de Comamonas tes-tosteroni (SEQ ID NOS: 65-66, seqüência de ácido nucléico e seqüência de aminoácido, respectivamente) 5'- GGTATTGAGGGTCGCATGTACGAACTGGGAGTTGT-3' adiantada e 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTAGTCAATATATTTCAGCG-3' inversa (SEQ ID NOS: 55 e 56). 2. Gene de Sinorhizobium meliloti 1021 SMc00502 (homólogo a proA, N°s de Acesso Genbank 15074579 e CAC46344, seqüência de ácido nucléico e seqüência de aminoácido, respectivamente) 5'- GGTATTGAGGGTCGCATGAGCGTGGTTCACCGGAA-3' adiantada e 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAATCGATATATTTCAGTC-3' inversa (SEQ ID NOS: 61 e 62). 3. Gene de Shingomonas sp. LB126 fldZ (No. de Acesso Genbank 7573247 Versão: 7573247, códigos para uma acila transferase) 5'-GGTATTGAGGGTCGCATGTCCGGCATCGTTGTCCA-3' adiantada e 5-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGACATATTTCAGTCCCA-3' inversa (SEQ ID NOS: 57 e 58). 4. Gene pcmE de Arthrobacter keyserí (No. de Acesso Genbank: AF331043 Versão: AF331043.1, códigos para uma oxalocitramalato aldola-se) 5'-GGTATTGAGGGTCGCATGCGACTGAACAACCTCGG-3’ adiantada e 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGTTCTCCACGTATTCCA-3' inversa (SEQ ID NOS: 59 e 60). 5. Gene de cepa Yersinia pestis C092 YP00082 (No. de Acesso Genbank: 15978115 Versão: 15978115, códigos para uma possível transfe-rase) 5'-GGTATTGAGGGTCGCATGAGCCTGGTTAATATGAA-3' adiantada e 5'- AG AG G AG AGTTAG AG CCTTAT G ACTTTAACG CGTTG A-3' inversa (SEQ ID NOS: 63 e 64). 6. Gene khg de Bacillus subtilis (No. de Acesso Genbank: Z99115.1 Gl: 2634478, 126711-127301 e CAB14127.1, seqüência de ácido nucléico e seqüência de aminoácido, respectivamente) 5'-GGTATTGAGGGTCGCATGGAGTCCAAAGTCGTTGA-3' adiantada e 5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACACTTGGAAAACAGCCT-3' inversa (SEQ ID NOS: 35 e 36). 7. Gene khg de E. coli (No. de Acesso Genbank: AE000279.1 1331-1972 e AAC74920.1, seqüência de ácido nucléico e aminoácido, respectivamente) 5'-GGTAUGAGGGTCGCATGAAAAACTGGAAAACAAG-3’ adiantada e δ’-ΑβΑθβΑΟΑΟπΑΟΑΟΟσΓΤΑΟΑΟΟπΑβΟβΟσΠΌΤΑ-^ inversa (SEQ ID NOS: 37 e 38). 8. Gene khg de S. meliloti(No. de Acesso Genbank: AL591792.1 Gl: 15075850, 65353-64673 e CAC47463.1, seqüência de ácido nucléico e aminoácido, respectivamente) 5- GGTATTGAGGGTCGCATGCGAGGGGCATTATTCAA-3' adiantada e 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGCCCTTGAGCGCGAAG-3’ inversa (SEQ ID NOS: 39 e 40). DNA genômico dos organismos descritos em 1 -2 e 6-8 acima, foi purificado usando o protocolo genomic-tip Qiagen. Usando técnicas similares, o DNA genômico de organismos descritos em 3-5 pode ser purificado.

Pseudomonas straminea (ATCC 33636) crescru a 30°C em Caldo Nutriente e meio hidroxibenzoato. Comamonas testosteroni (ATCC 49249) cresceu a 26°C em Caldo Nutriente e meio hidroxibenzoato. Sphin- gomonas sp. LB126 (Instituto Flemish para Pesquisa Tecnológica, VITO, B-2400 Mol, Bélgica) creceu de acordo com o método descrito por Wattiau e outros (Research in Microbiol. 152:861-72, 2001). Arthrobacter keyseri (Gulf Ecology Division, National Health and Environmental Effects Research Labo-ratory, U.S. Environmental Protectlon Agency, Gulf Breeze, FL 32561 EUA) cresceu de acordo com o protocolo descrito por Eaton (J. Bacteriol. 183:3689-3703, 2001). Sinorhizobium meliloti 1021 (ATCC 51124) cresceu a 26°C em meio ATCCTY e meio hidroxibenzoato. Cepa de Yersinia pestis C092 (ATCC) cresceu a 26°C em meio ATCC 739 de sangue eqüino ágar. Bacillus subtilis 6051 (ATCC) cresceu a 30°C em Caldo de Nutriente Bereto (D/fco; Detroit, Ml). DNA genômico de E. coli foi isolado de cepa DH10B (In-vitrogen) conforme descrito no Exemplo 1.

Os protocolos de PCR, clonagem, e seleção descritos no Exemplo 1 foram usados para clonar as seqüências de proA de C. testosteroni e S.meliloti, bem como as seqüências de khg de E. coli, B. subtilis e S.meliloti. Os mesmos métodos podem ser usados para clonar as outras seqüências descritas acima.

Clones positivos foram seqüenciados usando seqüenciamento de terminação de cadeia didesóxi (Seqwright, Houston, TX) com pontas S e iniciadores terminadores T7 (Novagen), e iniciadores internos de Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA).

Ensaios de Expressão e Atividade DNA de plasmídeo (verificado por análise de seqüência) foi sub-clonado em hospedeiro de expressão BL21 (DE3) (Novagen). As culturas cresceram em meio LB com 50 mg/L de canamicina, os plasmídeos isolados usando um kit miniprep "spin" Qiagen de plasmídeo e subseqüentemente analisado em relação a digestão por retrição para confirmar identidade. Experimentos de indução foram feitos com os constructos BL21 (DE23) crescidos em meio LB contendo 50 mg/L de canamicina a 37°C. Expressão de proteína foi induzida usando 0,1 mM de IPTG após a OD6oo ter atingido aproximadamente 0,6. As células cresceram por 4 horas a 30°C e colhidas por centrifugação. As células foram em seguida lisadas usando reagente Bugbuster™ (Novagen) e as proteínas recombinantes marcadores de His foram purificadas usando cartuchos His-Bind conforme descrito acima (Exemplo 1). Proteínas purificadas foram dessalgadas sobre colunas disponíveis PD-10 e eluídas em 50 mM de tampão Tris-HCI, pH 7,3 com 2 mM de MgCI2.

As proteínas foram analisadas por SDS-PAGE sobre géis de gradiente a 4-15% para detectar níveis de proteína solúveis no MP predito da proteína de fusão recombinante.

As proteínas foram ensaiadas para atividade usando indol-3-piruvato e piruvato de sódio como substratos. A mistura de ensaio continha 100 mM de Tris-HCI (pH 7 - pH 8,9), 0-8 mM de MgCI2, 3 mM de fosfato de potássio (pH 8) e 6 mM de cada substrato em 1 mL. A reação foi iniciada adicionando quantidades variantes de polipeptídeo (por exemplo de 10 a 100 pg), e foi incubada a 25°C - 37°C por 30 minutos, filtrada e em seguida congelada a -80°C.

Resultados de Atividade com produtos de gene proA

Tanto os constructos de gene proA de C. testosteroni quanto SMc00502 de S. meliloti apresentaram altos níveis de expressão quando induzidos com IPTG. As proteínas recombinantes foram altamente solúveis, como determinadas por análise de SDS-PAGE de amostras de proteína total e extratos celulares. O produto de gene de C. testosteroni foi purificado a pureza > 95%. Porque o rendimento do produto de gene de S. meliloti foi muito baixo após purificação de afinidade usando um cartucho His-Bind, extrato celular foi usado para os ensaios enzimáticos.

Tanto aldolases recombinantes catalisaram a formação de MP a partir de indol-3-piruvato quanto piruvato. A presença tanto de magnésio di-valente quanto de fosfato de potássio foram exigidas para atividade enzimá-tica. Nenhum produto foi visível quando indol-3-piruvato, piruvato, ou fosfato de potássio estavam presentes. Uma pequena quantidade do produto foi também formada na ausência de enzima (tipicamente uma ordem de magnitude menor que quando a enzima estava presente). O pico de produto eluído da coluna de fase inversa C18 ligeira- mente posterior ao padrão de indol-3-piruvato, o espectro de massa desse pico mostraram um íon parente colisionalmente induzido ([M + H]+) de 292,1, o íon parente esperado para o produto MP. Os fragmentos-filhos importantes presentes no espectro de massa incluídos aqueles com m/z = 158 (1/-/-indol-3-carbaldeído íon carbônio), 168 (íon 3-buta-1,3-dienil-1H-indol carbônio), 274 (292 - H20), 256 (292 - 2 H20), 238 (292 - 3 H20), 228 (292 -CH4O3) e 204 (perda de piruvato). O produto também exibiu uma característica de espectro de UV de outros compostos contendo indol tal como tripto-fano, com 0 Xmáx. de 279 - 280 e um pico sob aproximadamente 290 nm. A quantidade de MP produzida pela C. testosteroni aldolase ele-vou-se com um aumento na temperatura de reação de temperatura ambiente a 37°C, quantidade de substrato, e quantidade de magnésio. A atividade sintética da enzima diminui com aumento do pH, 0 produto máximo observado foi sob pH 7. Com base em padrão de triptofano, a quantidade de MP produzida sob um ensaio padrão usando 20 μg de proteína purificada foi aproximadamente de 10 - 40 μg por 1 mL de reação.

Devido ao alto grau de homologia das seqüências de codificação de ProA aldolase de S. meliloti e C. testosteroni com os outros genes descritos acima, espera-se que todos os produtos de genes recombinantes possam catalisar essa reação. Além disso, espera-se que aldolases que apresentam treonina (T) sob posições 59 e 87, arginina (R) sob 119, aspartato (D) sob 120 e histidina (H) sob 31 e 71, (com base no sistema de numeração de C. testosteroni) apresentem atividade similar.

Resultados de Atividade com produtos de gene kha Tanto os constructos de gene khg de B. subtilis quanto de E. coli apresentam altos níveis de expressão de proteína quando induzidos com IPTG, enquanto o khg de S. meliloti tinha um baixo nível de expressão. As proteínas recombinantes foram altamente solúveis, conforme julgadas por análise de SDS-PAGE de proteínas totais e extratos celulares. Os produtos de gene khg de B. subtilis e E. coli foram purificados a pureza > 95%; 0 rendimento do produto de gene de S. meliloti não foi tão alto após purificação de afinidade usando um cartucho His-Bind. Não há evidência que magnésio e fosfato sejam exigidos para atividade para essa enzima. Todavia, a literatura registra realização dos ensaios em tampão de fosfato de sódio, e a enzima relatavelmente é bifuncio-nal e apresenta atividade em substratos fosforilado tal como 2-ceto-3-desóxi-6-fosfogluconato (KDPG). Os ensaios enzimáticos foram realizados conforme descritos, em alguns exemplos o fosfato foi omitido. Os resultados indicam que o khg aldolases recombinante produziu MP, mas não foi tão ativo como o ProA aldolases. Em alguns casos o nível de MP produzido por khg foi quase idêntico à quantidade produzida por magnésio e fosfato isolados. Fosfato não parece aumentar as atividades de khg. A enzima de Bacillus apresentava a atividade mais alta, aproximadamente 20 - 25% de atividade maior do que o magnésio e fosfato separados, conforme determinado por SRM (ver Exemplo 10). A enzima de Sinorhizobium apresentava a menor quantidade de atividade, a qual poderá ser associada a problemas de do-bradura e solubilidade notados na expressão. Todas as três enzimas apresentam o glutamato de sítio ativo (posição 43 em sistema de numeração de B. subtilis), bem como a lisina exigida para formação de base de Shiff com piruvato (posição 130); contudo, a enzima de B. subtilis contém uma treonina na posição 47, um resíduo no sítio ativo, em vez de arginina. O khg de B. subtilis é menor e parece estar em um grupamento distinto das enzimas de S. meliloti e E. coli, com outras enzimas que apresentam a treonina no sítio ativo. As diferenças no sítio ativo poderão ser a razão para o aumento na atividade da enzima de B. subtilis.

Aperfeiçoamento de Atividade Aldolase Anticorpos catalíticos podem ser aldolases tanto eficientes quanto naturais, aceitar uma faixa ampla de substratos, e podem ser usados para catalisar a reação mostrada na Figura 2.

Aldolases podem também ser aperfeiçoadas por evolução dirigida, por exemplo como anteriormente descrito para uma kDPG aldolase (altamente homóloga a KHG descrito acima) desenvolvidas por embaralhamento de DNA e PCR propensa a erro para remover a exigência para fosfato e para inverter a enantiosseletividade. Os polipeptídeos de KDPG aldolase são úteis em reações bioquímicas uma vez que eles são altamente específicos para o substrato doador (aqui, piruvato), mas são relativamente flexíveis com relação à substrato aceitante (isto é, indol-3-piruvato) (Koeller & Wong, Nature 409:232-9, 2001). KHG aldolase apresenta atividade para condensação de piruvato com vários ácidos carboxílicos. Pensa-se que versões do khg aldolase de mamíferos apresentam especificidade mais amplas do que versões bacterianas, incluindo atividade maior em 2-oxoglutarato de 4-hidróxi 4-metila e aceitação de ambos os estereoisômeros de 4-hidróxi-2-cetoglutarato. Fontes bacterianas parecem apresentar uma preferência 10 vezes maior para o isômero R. Há quase 100 homólogos de KHG disponíveis em banco de dados de genômicos, e atividade tem sido demonstrada em Pseudomonas, Paracoccus, Providencia, Sinorhizobium, Morganella, E. coli e tecidos de mamíferos. Essas enzimas podem ser usadas como um ponto de partida para adequar a enantioespecificidade que é desejada para produção de monatina.

Aldolases que utilizam piruvato e um outro substrato que é um cetoácido e/ou apresenta um grupo hidrofóbico em massa tal como indol podem ser "desenvolvidas" para adequar a especificidade, velocidade e seletividade de polipeptídeos. Além de khg e ProA aldolases demonstradas aqui, exemplos dessas enzimas incluem, mas sem se limitar a: KDPG aldolase e polipeptídeos relacionados (KDPH); transcarboxibenzalpiruvato hi-dratase-aldolase de Nocardioides st, 4-(2-carboxifenil)-2-oxobut-3-enoato aldolase (2'-carboxibenzalpiruvato aldolase) que condensa piruvato e 2-carboxibenzaldeído (um substrato que contém anel aromático); trans-O-hidroxibenzilidenopiruvato hidratase-aldolase de Pseudomonas putida e Sphingomonas aromaticivorans, que também utiliza piruvato e um aldeído que contém aromático como substratos; 3-hidroxiaspartato aldolase (eritro-3-hidróxi-L-aspartato glioxilato liase), que usa 2-oxoácidos como os substratos e pensa-se estar no organismo Micrococcus denitrificans; benzoína aldolase (benzaldeído liase), que utiliza substratos que contém grupos benzila; diidro-neopterina aldolase; L-treo-3-fenilserina benzaldeído-liase (fenilserina aldolase) que condensa glicina com benzaldeído; 4-hidróxi-2-oxovalerato aldola- se; 1,2-diidroxibenzilpiruvato aldolase; e 2-hidroxibenzalpiruvato aldolase.

Um polipeptídeo que apresenta a atividade desejada pode ser selecionado através de seleção de clones de interesse usando os seguintes métodos. Triptofano auxotrofos são transformados com vetores que transportam os clones de interesse em um cassete de expressão e crescem em um meio contendo pequenas quantidades de monatina ou MP. Uma vez que reações de aminotransferases e aldolase sejam reversíveis, as células são capazes de produzir triptofano a partir de uma mistura racêmica de monatina. Similarmente, organismos (tanto recombinantes quanto do tipo selvagem) podem ser selecionados por capacidade de utilizar MP ou monatina como uma fonte de carbono e energia. Uma fonte de aldolases-alvo é bibliotecas de expressão de várias cepas Pseudomonas e rizobactérias. Pseu-domonas apresentam muitos caminhos catabólicos incomuns para degradação de moléculas aromáticas e elas também contêm muitas aldolases; considerando que a rizobactéria contém aldolases, são conhecidas crescer na rizoesfera de plantas, e apresentam muitos genes descritos para construção de um caminho biossintético para monatina.

Exemplo 5 Síntese Química do Precursor de Monatina O Exemplo 4 descreveu um método de uso de uma aldolase para converter indol-3-piruvato no precursor de monatina ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutárico (MP). Este exemplo descreve um método alternativo de sintetizar quimicamente MP. O MP é formado usando uma condensação típica do tipo aldol (Figura 4). Em resumo, uma reação típica do tipo aldol envolve a geração de um carbânio do éster piruvato usando uma base forte, tal como LDA (lítio diisopropilamida), lítio hexametildissilazano ou butil lítio. O carbânio que é gerado reage com o indol-piruvato para formar o produto acoplado.

Grupos protetores que podem ser usados para proteger o nitrogênio indólico incluem, mas sem se limitar aos mesmos, t-butiloxicarbonila (Boc) e benziloxicarbonila (Cbz). Grupos de bloqueio para ácidos carboxíli-cos incluem, mas sem se limitar aos mesmos, ésteres alquílicos (por exem- pio, ésteres metílico, etílico, benzílico). Quando esses grupos protetores são usados, não é possível controlar a estereoquímica do produto que se forma. Entretanto, se R2 e/ou R3 são grupos protetores quirais (Figura 4), tais como (S)-2-butanol, mentol ou uma amina quiral, isso pode favorecer a formação de um enantiômero de MP sobre o outro.

Exemplo 6 Conversão de Triptofano ou lndol-3-Piruvato em Monatina Um processo in vitro utilizando duas enzimas, uma aminotrans-ferase e uma aldolase produziu monatina a partir de triptofano e piruvato. Na primeira etapa, alfa-cetoglutarato foi o aceitador do grupo amino de triptofano em uma reação de transaminação, gerando indol-3-piruvato e glutamato. Uma aldolase catalisou a segunda reação em que piruvato foi reagido com indol-3-piruvato, na presença de Mg2+ e fosfato, gerando o derivado alfa-ceto de monatina (MP), ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutárico. Transferência do grupo amino do glutamato formado na primeira reação produziu o produto desejado, monatina. Purificação e caracterização do produto estabeleceu que o isômero formado foi S,S-monatina. Substratos, enzimas e condições alternativos são descritos, bem como aperfeiçoamentos que foram feitos nesse processo.

Enzimas A aldolase, 4-hidróxi-4-metil-2-oxoglutarato piruvato liase (ProA aldolase, gene proA) (EC 4.1.3.17), de Comamonas testosteroni foi clonada, expressa e purificada conforme descrito no Exemplo 4. As 4-hidróxi-2-oxoglutarato glioxilato liases (KHG aldolases) (EC 4.1.3.16) de B. subtilis, E. coli e S. meliloti foram clonadas, expressas e purificadas conforme descrito no Exemplo 4.

As aminotransferases usadas em conjunto com as aldolases para produzir monatina foram L-aspartato aminotransferase codificada pelo gene aspC de E. coli, a tirosina aminotransferase codificada pelo gene tyrB de E. coli, a enzima TatA de S. meliloti, a aminotransferase substrato amplo codificada pelo gene bsat de L major, ou a transaminase glutâmico-oxaloacética de coração de porco (Tipo lia). A clonagem, expressão e purifi- cação das proteínas de não-mamíferos são descritas no Exemplo 1. Transaminase glutâmico-oxaloacética de coração de porco (Tipo lia) foi obtida de Sigma (N° G7005). Método que usa ProA aldolase e L-aspartato aminotransferase A mistura reacional continha 50 mM de acetato de amônio, pH 8,0, 4 mM de MgCl2, 3 mM de fosfato de potássio, 0,05 mM de fosfato de piridoxal, 100 mM de piruvato de amônio, 50 mM de triptofano, 10 mM de alfa-cetoglutarato, 160 mg de ProA aldolase recombinante de C. testosteroni (extrato celular não-purificado, ~30% de aldolase), 233 mg de L-aspartato aminotransferase recombinante de E. coli (extrato celular não-purificado, ~40% de aminotransferase) em um litro. Todos os componentes, exceto as enzimas, foram misturados juntamente e incubados a 30°C até o triptofano dissolver. As enzimas foram então adicionadas e a solução reacional foi incubada a 30°C com agitação moderada (100 rpm) por 3,5 horas. Em 0,5 e 1 hora após a adição das enzimas, alíquotas de triptofano sólido (50 mmoles cada) foram adicionadas à reação. Todo o triptofano adicionado não dissolveu, mas a concentração foi mantida em 50 mM ou mais. Após 3,5 horas, o triptofano sólido foi filtrado. Análise da mistura reacional por LC/EM usando uma quantidade definida de triptofano como padrão mostrou que a concentração de triptofano na solução foi de 60,5 mM e a concentração de monati-na foi de 5,81 mM (1,05 g).

Os métodos seguintes foram usados para purificar o produto final. Noventa por cento da solução transparente foram aplicados em uma coluna de resina AG50W-X8 BioRad (225 mL; capacidade de ligação de 1,7 meq/mL). A coluna foi lavada com água, coletando frações de 300 mL, até a absorbância sob 280 nm ser <5% da primeira vazão de fração. A coluna foi então eluída com acetato de amônio 1 M, pH 8,4, coletando frações de 4.300 mL. Todas as quatro frações continham monatina e foram evaporadas até 105 mL usando roto-evaporador com um banho-maria tépido. Um precipitado formou-se como volume reduzido e foi filtrado no curso do processo de evaporação.

Análise das frações da coluna por LC/EM mostrou que 99% do triptofano e monatina ligaram-se à coluna. O precipitado que se formou durante o processo de evaporação continnha >97% de triptofano e <2% de monatina. A razão de triptofano para produto no sobrenadante foi de aproximadamente de 2:1. O sobrenadante (7 mL) foi aplicado em 100 ml_ de coluna de DEAE Sefarose de Fluxo Rápido (Amersham Biosciences) previamente convertida na forma acetato mediante lavagem com 0,5 L de NaOH 1 M, 0,2 L de água, 1,0 L de acetato de amônio 1,0 M, pH 8,4, e 0,5 L de água. O sobrenadante foi carregado sob <2 mL/min e a coluna foi lavada com água sob 3-4 mL/min até a absorbância sob 280 nm ser ~0. Monatina foi eluída com acetato de amônio 100 mM, pH 8,4, coletando frações de 4.100 mL.

Análise das frações mostrou que a razão de triptofano para monatina nas vazões de frações foi de 85:15 e a razão nas frações de eluente foi de 7:93. Admitindo que o coeficiente de extinção a 280 nm de monatina é o mesmo de triptofano, as frações de eluente continham 0,146 mmol de produto. Extrapolação à reação total de 1 L produziría ~2,4 mmoles (~710 mg) de monatina, para uma recuperação de 68%.

Aa frações de eluente da coluna de DEAE Sefarose foram evaporadas até <20 mL. Uma alíquota do produto foi adicionalmente purificada mediante aplicação em uma coluna de fase inversa preparativa de C8 usando as mesmas condições cromatrográficas que aquelas descritas no Exemplo 10 para a caracterização de monatina em escala analítica. Software Fractionlynx® Waters foi empregado para disparar coleta automatizada de frações de monatina com base em detecção do íon m/z = 293. A fração da coluna de C8 com o íon molecular protonado correspondente a monatina foi coletada, evaporada até secura e então dissolvida em um pequeno volume de água. Essa fração foi usada para caracterização do produto. O produto resultante foi caracterizado usando os métodos seguintes.

Espectroscopia UV/Visível. Medições espectroscópicas UV/visível de monatina produzida enzimaticamente foram realizadas usando um espectrofotômetro UV/visível Cary 100 Bio. O produto purificado, dissol- vido em água, mostrou um máximo de absorção de 280 nm com um pico em 288 nm, características típicas de compostos que contêm indol.

Análise LC/EM. Análises de misturas para monatina derivadas das reações bioquímicas in vitro foram realizadas conforme descrito no Exemplo 10. Uma análise LC/EM típica de monatina em uma mistura sintética enzimática in vitro é ilustrada na Figura 5. O painel inferior da Figura 5 ilustra um cromatograma de íons selecionados para o íon molecular proto-nado de monatina em m/z = 293. Essa identificação de monatina na mistura foi corroborada pelo espectro de massa ilustrado na Fig. 6. Análise do produto purificado por LC/EM mostrou um pico simples com um íon molecular de 293 e absorbância em 280 nm. O espectro de massa foi idêntico àquele mostrado na Figura 6.

Análise EM/EM. Experimentos de íons-filhos por LC/EM/EM, conforme descrito no Exemplo 10, foram também realizados sobre monatina. Um espectro de massa de íons-filhos de monatina é ilustrado na Figura 7. Especificações estruturais por tentativa de todos os íons-fragmento marcados na Figura 7 foram efetuadas. Estas incluem íons-fragmentos de m/z = 275 (293 - H20), 257 (293 - (2 x H20)), 230 (275 - COOH), 212 (257 - CO-OH), 168 (íon 3-buta-1,3-dienil-1H-indol carbônio), 158 (íon 1 H-indol-3-carbaldeído carbônio), 144 (íon 3-etil-1W-indol carbônio), 130 (3-metileno-1 /-/-indol carbônio) e 118 (íon indol carbônio). Muitos destes são os mesmos que aqueles obtidos para MP (Exemplo 4), conforme esperado se derivado da porção indol da molécula. Alguns são de massa unitária 1 maior que aquelas observadas para MP, devido à presença de um grupo amino em vez de uma cetona.

Análise EM de Alta Resolução. A Figura 8 ilustra espectro de massa obtido para monatina purificada empregando um espectrofotômetro de massa híbrido quadripolar/tempo de trajetória Q-Star Applied Biosystems-Perkin Elmer. A massa medida para monatina protonada usando triptofano como padrão interno de calibração de massa foi de 293,1144. A massa calculada de monatina protonada, com base na composição elementar C14H17N2O5, é de 293,1137. Isto é, um erro de medição de massa menor que 2 partes por milhão (ppm), proporcionando evidência conclusiva da composição elementar de monatina produzida enzimaticamente.

Espectroscopia de RMN. Os experimentos de RMN foram realizados em um instrumento Varian Inova de 500 MHz. A amostra de monatina (~3 mg) foi dissolvida em 0,5 ml de D20. Inicialmente, o solvente (D20) foi usado como referência interna em 4,78 ppm. Uma vez que o pico para água foi grande, a RMN de 1H foi operada com supressão do pico para água. Subseqüentemente, devido à largura do pico para água, o próton C-2 de monatina foi usado como pico de referência e ajustado no valor publicado de 7,192 ppm.

Para RMN de 13C, uma operação inicial de diversas centenas de varreduras indicou que a amostra foi diluída demais para obter um espectro adequado de 13C no tempo alotado. Portanto, foi realizado um experimento de coerência quântica múltipla heteronuclear (HMQC), que permitiu a correlação dos hidrogênios e dos carbonos aos quais eles foram ligados, e também fornecendo informação sobre os deslocamentos químicos dos carbonos.

Um resumo dos dados de 1H e HMQC é mostrado nas Tabelas 2 e 3. Mediante comparação com valores publicados, os dados de RMN indicaram que monatina enzimaticamente produzida era (S,S), (R,R) ou uma mistura de ambos.

Análise Quiral LC/EM. Para estabelecer que a monatina produzida in vitro era um isômero e não uma mistura dos enantiômeros (R,R) e (S,S), análises quirais LC/EM foram realizadas usando a instrumentação descrita no Exemplo 10.

Separações quirais LC foram feitas usando uma coluna de cro-matografia quiral Chirobiotic T (Advanced Separations Technology) a temperatura ambiente. Separação e detecção, com base em protocolos publicados do vendedor, foram otimizadas para os isômeros R-(D) e S-(L) de triptofano. A fase móvel de LC consistiu em A) água contendo ácido trifluoracético a 0,05% (v/v); B) metanol contendo ácido trifluoracético a 0,05% (v/v). A elui-ção foi isocrática a 70% de A e 30% de B. A vazão foi de 1,0 mL/min e a ab- sorbância de PDA foi monitorada de 200 nm a 400 nm. Os parâmetros instrumentais usados para análise quiral LC/EM de triptofano e monatina são idênticos àqueles descritos no Exemplo 10 para análise LC/EM. Foi utilizada coleta de espectros de massa para a região m/z 150-400. Cromatogramas de íons selecionados para íons moleculares protonados ([M + H]+ = 205 tanto para R- quanto para S-triptofano e [M + H]+ = 293 para monatina) permitiram identificação direta desses análitos nas misturas.

Os cromatogramas de R- e S-triptofano e monatina, separados por cromatografia quiral e monitorados por EM, são mostrados na Figura 9.

0 pico único nos cromatograma de monatina indica que o composto é um isômero, com um tempo de retenção quase idêntico ao de S-triptofano. Tabela 2: Dados de RMN de 1H 1 Vleggaare outros (J.C.S. Perkin Trans. 1:3095-8,1992). 2 Takeshi e outros2 (JP2002060382, 26-02-2002).

Tabela 3: Dados de RMN de 13C (de espectro de HMQC) 1 Vleggaar e outros (J.C.S. Perkin Trans. 1:3095-8,1992).

Polarimetria. A rotação óptica foi medida em um polarímetro Ru-dolph Autopol III. A monatina foi preparada como uma solução de 14,6 mg/mL em água. A rotação específica esperada ([a]o20) para S,S-monatina (forma de sal) é de -49,6 para uma solução de 1 g/mL em água (Vleggaar e outros). A ([cx]d20) observada foi de -28,1 para a monatina enzimaticamente produzida purificada, indicando que ela era o isômero S,S.

Aperfeiçoamentos As reações de reação, incluindo concentrações de reagentes e enzimas, foram otimizadas e rendimentos de 10 mg/mL foram produzidos usando a seguinte mistura de reagentes: 50 mM de acetato de amônio, pH 8,3, 2 mM de MgCh, 200 mM de piruvato (sal de sódio ou de amônio), 5 mM de alfa-cetoglutarato (sal de sódio), 0,05 mM de fosfato de piridoxal, água desaerada para obter um volume final de 1 mL após a adição das enzimas, 3 mM de fosfato de potássio, 50 pg/mL de ProA aldolase recom- binante (extrato celular; concentração total de proteína de 167 pg/mL), 1000 pg/mL de L-aspartato aminotransferase codificada pelo gene aspC de E. coli (extrato celular; concentração total de proteína de 2500 pg/mL), e triptofano sólido para fornecer uma concentração >60 mM (saturada; algum não-dissolvido através da reação). A mistura foi incubada a 30°C por 4 horas com agitação ou mistura moderada.

Substituições A concentração de alfa-cetoglutarato pode ser reduzida a 1 mM e suplementada com 9 mM de aspartato com um rendimento equivalente de monatina. Aceitadores alternativos de aminoácidos podem ser utilizados na primeira etapa, tal como oxaloacetato.

Quando aminotransferase substrato amplo recombinante de L. major foi usada em lugar do L-aspartato aminotransferase de E. coli, rendimentos similares de monatina foram obtidos. No entanto, um segundo produto não-identificado (3-10% do produto principal) com uma massa molecular de 292 foi também detectado por análise LC-EM. Concentrações de monatina de 0,1-0,5 mg/mL foram produzidas quando o tyrB de E. coli codificou enzima, o tatA de S. meliloti codificou enzima ou a transaminase glutâmico-oxaloacética de coração de porco (tipo lia) foi adicionada como aminotransferase. Quando se parte da reação de indol-3-piruvato, uma aminação re-dutora pode ser produzida na última etapa com glutamato desidrogenase e NADH (como no Exemplo 7).

As aldolases KHG de B. subtilis, E. coli e S. meliloti foram também usadas com a L-aspartato aminotransferase de E. coli para produzir monatina enzimaticamente. As seguintes condições de reação foram usadas: 50 mM de NH4-OAc, pH 8,3, 2 mM de MgCI2, 200 mM de piruvato, 5 mM de glutamato, 0,05 mM de fosfato de piridoxal, água desaerada para obter um volume final de 0,5 mL após a adição das enzimas, 3 mM de fosfato de potássio, 20 pg/mL de KHG aldolase recombinante (purificada) de B. subtilis, cerca de 400 pg/mL de L-aspartato aminotransferase de E. coli (AspC) não-purificada de extrato celular, e 12 mM de indol-3-piruvato. As reações foram incubadas a 30°C por 30 minutos com agitação. A quantidade de monatina produzida usando a enzima de B. subtilis foi de 80 ng/mL, e aumentou com quantidades crescentes de aldolase. Se indol-3-piruvato e glutamato fossem substituídos por quantidades saturantes de triptofano e alfa-cetoglutarato 5 mM, a produção de monatina era aumentada para 360 ng/mL. As reações foram repetidas com 30 pg/mL de cada uma das três enzimas KHG em 50 mM de Tris, pH 8,3, com quantidades saturantes de triptofano, e foram deixadas continuar por uma hora a fim de aumentar a detecção. A enzima Bacillus apresentou a maior atividade como no Exemplo 4, produzindo aproximadamente 4000 ng/mL de monatina. A KHG de E. coli produziu 3000 ng/mL de monatina e a enzima de S. meliloti produziu 2300 ng/mL.

Exemplo 7 Interconversão entre MP e Monatina A aminação de MP para formar monatina pode ser catalisada por aminotransferases, tais como aquelas identificadas nos Exemplos 1 e 6, ou por desidrogenases que exigem um co-fator de redução, tais como NADH ou NADPH. Essas reações são reversíveis e podem ser medidas em qualquer direção. A direcionabilidade, quando do uso de uma enzima desidroge-nase, pode ser grandemente controlada pela concentração de sais de amô-nio.

Atividade desidrogenase. A desaminação oxidante de monatina foi monitorada seguindo o aumento de absorbância a 340 nm à medida que NAD(P)+ era convertido no NAD(P)H mais cromofórico. Monatina foi enzi-maticamente produzida e purificada conforme descrito no Exemplo 6.

Uma mistura típica para ensaio continha 50 mM de Tris-HCI, pH 8,0 a 8,9, 0,33 mM de NAD+ ou NADP+, 2 a 22 unidades de glutamato desidrogenase (Sigma) e 10-15 mM de substrato em 0,2 mL. O ensaio foi realizado em duplicata em uma placa de microtitulação transparente a UV, sobre uma leitora de placa SpectraMax Plus Molecular Devices. Uma mistura da enzima, tampão e NAD(P)+ foi pipetada nas cavidades contendo o substrato e o aumento de absorbância a 340 nm foi monitorado a intervalos de 10 segundos após breve mistura. A reação foi incubada a 25°C por 10 minutos.

Controles negativos foram realizados sem a adição de substrato, e gluta-mato foi utilizado como controle positivo. A glutamato desidrogenase tipo III de fígado bovino (Sigma N° G-7882) catalisou a conversão da monatina no precursor de monatina a uma taxa de conversão de aproximadamente um centésimo da taxa de conversão de glutamato em alfa-cetoglutarato.

Atividade de transaminação. Ensaios de monatina aminotransfe-rase foram conduzidos com a aspartato aminotransferase (AspC) de E. coli, a tirosina aminotransferase (TyrB) de E. coli, a aminotransferase substrato amplo (BSAT) de L. major, e as duas glutamato-oxaloacetato aminotransfe-rases porcinas comercialmente disponíveis descritas no Exemplo 1. Tanto oxaloacetato quanto alfa-cetoglutarato foram testados como aceitadores de amino. A mistura de ensaio continha (em 0,5 mL) 50 mM de Tris-HCI, pH 8,0, 0,05 mL de PLP, 5 mM de aceitador de amino, 5 mM de monatina e 25 pg de aminotransferase. Os ensaios foram incubados a 30°C por 30 minutos e as reações foram interrompidas mediante adição de 0,5 mL de álcool iso-propílico. A perda de monatina foi monitorada por LC/EM (Exemplo 10). A maior quantidade de atividade foi observada com BSAT de L. major, com oxaloacetato como aceitador, seguido da mesma enzima com alfa-cetoglutarato como aceitador de amino. A atividade relativa com oxaloacetato foi: BSAT > AspC > tipo Ha porcino > tipo I porcino = TyrB. A atividade relativa com alfa-cetoglutarato foi: BSAT > AspC > tipo I porcino > tipo lia porcino > TyrB.

Exemplo 8 Produção de Monatina a partir de Fontes de Triptofano e C3 Diferentes de Piruvato Conforme descrito acima no Exemplo 6, indol-3-piruvato ou triptofano podem ser convertidos em monatina usando piruvato como molécula de C3. Entretanto, em algumas circunstâncias, piruvato poderá não ser uma matéria-prima desejável. Por exemplo, piruvato poderá ser mais caro do que outras fontes de carbono C3, ou poderá apresentar efeitos adversos em fermentações se adicionado ao meio. Alanina pode ser transaminada através de muitas enzimas PLP para produzir piruvato.

Enzimas similares a triptofanase realizam reações de beta-eliminação a taxas mais rápidas do que outras enzimas PLP tais como ami-notransferases. Enzimas dessa classe (4.1.99.-) podem produzir amônia e piruvato a partir de aminoácidos tais como L-serina, L-cisteína e derivados de serina e cisteína com bons grupos de saída, tais como O-metil-L-serina, O-benzil-L-serina, S-metilcisteína, S-benzilcisteína, S-alquil-L-cisteína, O-acil-L-serina, 3-cloro-L-alanina.

Processos para produzir monatina usando polipeptídeos EC 4.1.99.- podem ser aperfeiçoados mudando a β-tirosinase (TPL) ou triptofanase de acordo com o método de Mouratou e outros (J. Biol. Chem. 274:1320-5,1999). Mouratou e outros descrevem a capacidade de converter a β-tirosinase em um aminoácido dicarboxílico β-liase, o que não foi relatado ocorrer na natureza. A mudança de especificidade foi realizada convertendo valina (V) 283 em arginina (R) e arginina (R) 100 em treonina (T). Essas mudanças de aminoácidos permitem que a liase aceite um aminoácido dicarboxílico para a reação de desaminação hidrolítica (tal como aspartato). Aspar-tato, portanto, pode também ser usado como fonte de piruvato para reações de condensação de aldol subseqüentes.

Adicionalmente, células e reatores enzimáticos podem ser supridos com lactato e uma enzima que converte lactato em piruvato. Exemplos de enzimas capazes de catalisar essa reação incluem lactato desidrogenase e lactato oxidase.

Isolamento de DNA Genômico Polipeptídeos de triptofanase foram anteriormente relatados em, por exemplo, Mouratou e outros (JBC 274:1320-5, 1999). Para isolar genes que codificam polipeptídeos de triptofanase, DNA genômico de DH10B de E. coli foi usado como padrão para PCR como descrito no Exemplo 1. O gene para tirosina-fenol liase foi isolado de C. freundii (número catálogo ATCC 8090, Designação ATCC 13316; NCTC 9750) e desenvolvido sobre Nutriente ágar (Difco 0001) e caldo nutriente (Difco 0003) a 37°C até uma OD de 2,0. O DNA genômico foi purificado usando um kit Genomic-tip® 100/G.

Amplificação de Seaüências de Codificação por PCR

Iniciadores foram projetados com projeções compatíveis para o vetor pET30 Xa/LIC (Novagen, Madison, Wl) como descrito acima no Exemplo 1. tna de E. coli (SEQ ID NO: 41). Iniciador com terminal N para clonagem de pET30 Xa/LIC: 5’-GGT ATT GAG GGT CGC ATG GAA AAC TTT AAA CAT CT-3’ (SEQ ID NO: 43). Iniciador com terminal C para clonagem de pET30 Xa/LIC: 5’-AGA GGA GAG TTA GAG CCT TAA ACT TCT TTA AGT TTT G-3' (SEQ ID NO: 44).

tpl de C. freundii (SEQ ID NO: 42). Iniciador com terminal N para clonagem de pET30 Xa/LIC: 5'-GGT ATT GAG GGT CGC ATGAATTATCCGGCAGAACC-3' (SEQ ID NO: 45). Iniciador com terminal C para clonagem de pET30 Xa/LIC: 5-AGA GGA GAG TTA GAG CCTTAGA-TGTAATCAAAGCGTG-3' (SEQ ID NO: 46). O Ciclador Térmico Eppendorf Mastercycler™ Gradiente 5331 foi usado para todas as reações de PCR. Em 50 pL foram adicionados 0,5 pg de padrão (DNA genômico), 1,0 pM de cada iniciador, 0,4 mM de cada dNTP, 3,5 U de Polimerase Expand High Fidelity (Roche), tampão 1X Ex-pand com Mg, e DMSO 5% (concentração final). O programa de PCR do termoclicador usado foi como segue: partida quente a 96°C (5 minutos), 94°C - 30 segundos, 40-60°C -1 minuto 45 segundos, 72°C - 2 minutos 15 segundos; 30 repetições. A etapa final de polimerização foi de 7 minutos e as amostras foram então armazenadas a 4°C.

Clonagem Procedimentos de clonagem e de identificação de clones positiva detalhados acima no Exemplo 1 foram usados para identificar os clones apropriados.

Expressão de Genes e Ensaios de Atividade DNA de plasmídeo (verificado por análise de seqüências) foi subclonado no hospedeiro de expressão BL21(DE3) (Novagen). As culturas foram desenvolvidas em meio LB com 30 mg/mL de canamicina, os plasmí-deos foram isolados usando um kit miniprep Qiagen e analisados através de digestão por restrição para confirmar identidade.

Experimentos de indução foram feitos com o hospedeiro de expressão BL21(DE3), os constructos foram desenvolvidos em meio LB contendo 50 mg/mL de canamicina a 37°C. Expressão de proteína foi induzida usando 0,1 mM de IPTG após a OD6oo da cultura atingir aproximadamente 0,6. As células foram desenvolvidas por 4 horas a 30°C e colhidas por cen-trifugação. As células foram então lisadas em 5 mL/g de reagente BugBus-fer™ (Novagen) peso celular úmido contendo 5 pL/mL de conjunto coquetel inibidor de protease N° lil (Calbiochem) e 1 pL/mL de benzonase nuclease (Novagen), e as proteínas recombinantes com ponta His foram purificadas usando os cartuchos His-Bind conforme descrito acima no Exemplo 1. As proteínas purificadas foram dessalgadas em uma coluna PD-10 (G25 Se-phadex, Amersham Biosciences) e eluídas em 100 mM de tampão Tris-CI, pH 8,0. As proteínas foram analisadas por SDS-PAGE sobre géis com gradiente de 4-15% para verificar níveis de proteínas solúveis sob o MP previsto da proteína de fusão recombinante.

Mutaaênese Alguns membros da classe de polipeptídeos 4.1.99.- (triptofana-se e β-tirosinase) realizarão a reação beta-liase com aspartato ou aminoáci-dos similares sem qualquer modificação. Contudo, alguns membros da classe poderão precisar ser submetidos a mutagênese para permitir o uso dos substratos e/ou criação do produto. Além disso, em alguns casos, polipeptídeos que podem realizar a conversão poderão ser adicionalmente otimizados por mutagênese.

Mutagênese dirigida a sítios foi realizada com base em análise estrutural em 3D de polipeptídeos que se ligam a PLP. Dois exemplos para mudar a especificidade do substrato dos polipeptídeos são mostrados abaixo.

Mutaaênese de Triptofanase Exemplo 1 O protocolo de mutagênese fornecido abaixo introduziu duas mutações pontuais na seqüência de aminoácidos. A primeira mutação pontual mudou arginina (R) na posição 103 para treonina (T) e a segunda muta- ção pontual mudou valina (V) na posição 299 para arginina (R) (sistema de numeração para proteína madura de E. coli). Experimentos de mutagênese foram realizados por ATG Laboratories (Eden Prairie, MN). Mutações foram introduzidas seqüencialmente por PCR de fragmentos de genes e reagru-pamento dos fragmentos foi realizado por PCR também. Iniciadores para converter arginina (R) 103 em treonina (T): 5'- CCAGGGCACCGGCGCAGAGCAAATCTATATT-3' (SEQ ID NO: 47) e 5'-TGCGCCGGTGCCCTGGTGAGTCGGAATGGT-3' (SEQ ID NO: 48).

Iniciadores para converter valina (V) 299 em arginina (R): 5'-TCCTGCACGCGGCAAAGGGTTCTGCACTCGGT-3' (SEQ ID NO: 49) e 5'-CTTTGCCGCGTGCAGGAAGGCTTCCCGACA-3' (SEQ ID NO: 50).

Mutantes foram selecionados através de digestão por restrição com Xba l/Hindlll e Sphl e verificados por seqüenciamento.

Mutagênese de Tirosina Fenol Liase (β-tirosinase) Exemplo 2 Duas mutações pontuais foram produzidas pela seqüência de aminoácidos de tirosina fenol liase. Essas mutações converteram arginina (R) na posição 100 em treonina (T) e valina (V) na posição 283 em arginina (R) (na seqüência de proteína madura de C. freundii).

Iniciadores para a conversão R100T foram: 5'- AGGGGACCGGCGCAGAAAACCTGTTATCG-3’ (SEQ ID NO: 51) e 5’-AGGGGACCGGCGCAGAAAACCTGTTATCG-3' (SEQ ID NO: 52).

Iniciadores para a conversão V283R foram: 5'- GTTAGTCCGCGTCTACGAAGGGATGCCAT-3' (SEQ ID NO: 53) e 5'-GTAGACGCGGACTAACTCTTTGGCAGAAG-3' (SEQ ID NO: 54).

Foram usados os métodos descritos acima e os clones foram selecionados por digestão de Kpnl/Sacl e digestão de BstX I. As seqüências foram verificadas por seqüenciamento de terminação de cadeia didesóxi. Proteína recombinante foi produzida conforme descrito acima para as enzimas do tipo selvagem. A mistura reacional consistiu em 50 mM de Tris-CI, pH 8,3, 2 mM de MgCI2, 200 mM de fonte de carbono C3, 5 mM de alfa-cetoglutarato, sal de sódio, 0,05 mM de fosfato de piridoxal, água desaerada para obter um volume final de 0,5 mL após a adição das enzimas, 3 mM de fosfato de potássio, pH 7,5, 25 pg de ProA aldolase recombinante bruta de C. testosteroni conforme preparada no Exemplo 4, 500 pg de L-aspartato aminotransferase bruta (AspC) conforme preparada no Exemplo 1, e triptofano sólido para proporcionar uma concentração >60 mM (saturada; algum não-dissolvido através da reação). A mistura reacional foi incubada a 30°C por 30 minutos com mistura. Serina, alanina e aspartato foram fornecidos como fontes de carbono 3. Ensaios foram realizados com e sem enzimas PLP secundárias (purificadas) capazes de efetuar reações de beta-eliminação e beta-liase (triptofanase (TNA), triptofanase mutante dupla, β-tirosinase (TPL)). Os resultados são mostrados na Tabela 4: Tabela 4: Produção de monatina utilizando fontes alternativas de carbono C3 A monatina produzida de alanina e serina como fontes de carbono 3 foi verificada por análise de varredura de filhos por LC/EM/EM e era idêntica à monatina caracterizada produzida no Exemplo 6. Alanina foi a melhor alternativa testada e foi transaminada pela enzima de AspC. A quantidade de monatina produzida foi aumentada por adição da triptofanase, que é capaz de transaminação como atividade secundária. A quantidade de mo-natina produzida com serina como fonte de carbono quase dobrou com a adição das enzimas triptofanases, ainda que somente um quinto da quantidade de triptofanase fosse adicionado, em comparação com a aminotransfe-rase. AspC é capaz de alguma quantidade de atividade de betaeliminação isoladamente. Os resultados com aspartato indicam que a atividade de triptofanase sobre aspartato não aumenta com as mesmas mutações dirigidas a sítios como anteriormente sugerido para β-tirosinase. Espera-se que a β-tirosinase mutante venha a apresentar maior atividade para produção de monatina.

Exemplo 9 Síntese Química de Monatina A adição de alanina a ácido indol-3-pirúvico produz monatina, e essa reação pode ser realizada sinteticamente com um reagente de Grignard ou organolítio.

Por exemplo, a 3-cloro- ou 3-bromo-alanina que foi apropriadamente bloqueada nos grupos carboxila e amino é adicionado magnésio sob condições anidras, lndol-3-piruvato (apropriadamente bloqueado) é então adicionado para formar o produto acoplado seguido de remoção dos grupos protetores para formar monatina. Grupos protetores que são particularmente úteis incluem THP (éter tetraidropiranílico) que é facilmente ligado e removido.

Exemplo 10 Detecção de Monatina e MP

Este exemplo descreve métodos usados para detectar a presença de monatina ou seu precursor ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutárico.

Análise LC/EM

Análises de misturas para a forma ácido alfa-ceto de monatina (percursor de monatina, MP) e monatina derivada de reações bioquímicas in vitro ou in vivo foram realizadas usando um instrumento de espectrometria de massa em série com cromatografia líquida (LC/EM/EM) Wa- ters/Micromass, incluindo um cromatógrafo líquido Waters 2690 com um monitor de absorbância Waters 996 Photo-Diode Array (PDA) colocado em série entre o cromatógrafo e um espectrômetro de massa quadripolar triplo Quattro Ultima Micromass. Separações por LC foram feitas usando uma coluna de cromatografia de fase inversa Cie Supelco Discovery, 2,1 mm x 150 mm, ou uma coluna de cromatografia de fase inversa Ce Xterra EM, 2,1 mm x 250 mm, a temperatura ambiente. A fase móvel de LC consistiu em A) água contendo ácido trifluoracético a 0,05% (v/v) e B) metanol contendo ácido trifluoracético a 0,05% (v/v). A eluição por gradiente foi linear de 5% de B a 35% de B, 0-9 min, linear de 35% de B a 90% de B, 9-16 min, isocrática a 90% de B, 16-20 min, linear de 90% de B a 5% de B, 20-22 min, com um período de 10 min de reequilíbrio entre operações. A vazão foi de 0,25 mL/min e a absorbância de PDA foi monitorada de 200 nm a 400 nm. Todos os parâmetros da ESI-EM foram otimizados e selecionados com base em geração de íons moleculares protonados ([M + Hf) dos análitos de interesse e produção de íons de fragmento característicos.

Os seguintes parâmetros instrumentais foram usados para análise LC/EM de monatina: Capilar: 3,5 kV; Cone: 40 V; Hex 1: 20 V; Abertura: 0 V; Hex 2: 0 V; Temperatura da fonte: 100°C; Temperatura de dessolvatação: 350°C; Gás de dessolvatação: 500 L/h; Gás do cone: 50 L/h; Baixa resolução de massa (Q1): 15,0; Alta resolução de massa (Q1): 15,0; Energia tônica: 0,2; Entrada: 50 V; Energia de colisão: 2; Saída: 50 V; Baixa resolução de massa (Q2): 15; Alta resolução de massa (Q2): 15; Energia tônica (Q2): 3,5; Multiplicador: 650. Incertezas para razões massa/carga relatadas (m/z) e massas moleculares são ± 0,01%. Detecção inicial da forma ácido alfa-ceto de monatina (MP) e monatina nas misturas foi realizada por monitoração LC/EM com coleta de espectros de massa para a região m/z 150-400. Cromatogramas de íons selecionados para íons moleculares protonados ([M + H]+ = 292 para MP, [M + H]+ = 293 para monatina) permitiram identificação direta desses análitos nas misturas.

Análise EM/EM

Experimentos de íons-filhos por LC/EM/EM foram realizados sobre monatina como seguem. Uma análise de íons-filhos envolve transmissão do íon-pai (por exemplo, m/z = 293 para monatina) de interesse do primeiro analisador de massa (Q1) na célula de colisão do espectrômetro de massa, onde argônio é introduzido e dissocia-se quimicamente do pai em íons-fragmento (filhos). Esses íons-fragmento são então detectados com o segundo analisador de massa (Q2) e podem ser usados para corroborar as especificações estruturais do pai.

Os seguintes parâmetros instrumentais foram usados para análise LC/EM/EM de monatina: Capilar: 3,5 kV; Cone: 40 V; Hex 1: 20 V; Abertura: 0 V; Hex 2: 0 V; Temperatura da fonte: 100°C; Temperatura de dessol-vatação: 350°C; Gás de dessolvatação: 500 L/h; Gás do cone: 50 L/h; Baixa resolução de massa (Q1): 13,0; Alta resolução de massa (Q1): 13,0; Energia iônica: 0,2; Entrada: -5 V; Energia de colisão: 14; Saída: 1 V; Baixa resolução de massa (Q2): 15; Alta resolução de massa (Q2): 15; Energia iônica (Q2): 3,5; Multiplicador: 650.

Determinação de Alta Vazão de Monatina Análises de alta vazão (< 5 min/amostra) de misturas de monatina derivada de reações in vitro ou in vivo foram realizadas usando instrumentação descrita acima e os mesmos parâmetros descritos para LC/EM/EM. Separações por LC foram efetuadas usando cromatografia com Ce (2,1 mm x 50 mm) EM Xterra Waters a temperatura ambiente com eluição isocrática em MeOH aquoso a 15%, ácido acético a 0,25% sob uma vazão de 0,3 mL/min. Detecção de monatina nas misturas foi realizada usando es-pectrometria de massa em série (SRM) com monitoração de reação selecionada. Isso envolveu monitorar transições íons-pais ([M + H]+ = 293,1) para íons-filhos (por exemplo, o íon-fragmento em m/z = 168,1, designado por tentativa como um íon carbônio 3-buta-1,3-dienil-1H-indol) induzidas por colisão específica para maximizar sensibilidade, seletividade e vazão para a detecção de monatina. Dados de absorbância de PDA foram coletados em paralelo para verificação adicional de identidade de monatina.

Exemplo 11 Produção de Monatina em Bactérias Este exemplo descreve métodos usados para produzir monatina em células de E. coli. Aquele versado na técnica entenderá que métodos similares podem ser usados para produzir monatina em outras células bacte-rianas. Adicionalmente, podem ser usados vetores contendo outros genes no caminho de síntese de monatina (Figura 2).

Meio Trp-1 + glicose, um meio mínimo que foi usado para aumento de produção de triptofano em células de E. coli (Zeman e outros, Folia Microbiol. 35:200-4, 1990), foi preparado como segue. A 700 mL de água nanopura foram adicionados os seguintes reagentes: 2 g de (NH4)2S04, 13,6 g de KH2P04, 0,2 g de MgS04.7H20, 0,01 g de CaCfe^hfeO e 0,5 mg de Fe-S04.7H20. O pH foi ajustado em 7,0, o volume foi aumentado para 850 mL e o meio foi submetido a autoclave. Uma solução de glicose a 50% foi preparada separadamente e filtrada de forma estéril. Quarenta mL foram adicionados ao meio-base (850 mL) para 1 L de volume final.

Uma solução de 10 g/L de L-triptofano foi preparada em fosfato de sódio 0,1 M, pH 7, e filtrada de forma estéril. Um décimo de volume foi tipicamente adicionado a culturas conforme especificado abaixo. Uma solução de piruvato de sódio a 10% foi também preparada e filtrada de forma estéril. Uma alíquota de 10 mL foi tipicamente usada por litro de cultura. Estoques de ampicilina (100 mg/mL), canamicina (25 mg/mL) e IPTG (840 mM) foram preparados, filtrados de forma estéril e armazenados a -20°C antes de uso. Tween 20 (monolaurato de polioxietileno 20-Sorbitano) foi utilizado sob uma concentração final de 0,2%. Ampicilina foi usada em concentrações não letais, tipicamente 1-10 pg/mL de concentração final.

Placas novas de BL21(DE3) de E. coli::proA de C. testostero-/7//pET30 Xa/LIC (descritos no Exemplo 4) foram preparadas sobre meio LB contendo 50 pg/mL de canamicina. Culturas da noite para o dia (5 mL) foram inoculadas de uma colônia simples e desenvolvidas a 30°C em meio LB com canamicina. Tipicamente, 1 a 50 inóculos foram usados para indução em meio trp-1 + glicose. Antibiótico novo foi adicionado até uma concentração final de 50 mg/mL. Frascos sob agitação foram desenvolvidos a 37°C antes de indução. Células foram amostradas a cada hora até uma Οϋβοο de 0,35-0,8 ser obtida. As células foram então induzidas com 0,1 mM de IPTG e a temperatura reduzida até 34°C. Amostras (1 ml) foram coletadas antes de indução (ponto de tempo zero) e centrifugadas a 5000 x g. O sobrenadante foi congelado a -20°C para análise LC/EM. Quatro horas pós-indução, uma outra amostra de 1 mL foi coletada e centrifugada para separar o caldo de cultura do pélete de células. Triptofano, piruvato de sódio, ampicilina e Twe-en foram adicionados conforme descrito acima.

As células foram desenvolvidas por 48 horas pós-indução e uma outra amostra de 1 mL foi tomada e preparada conforme acima. Em 48 horas, uma outra alíquota de triptofano e piruvato foi adicionada. Todo o volume de cultura foi centrifugado após aproximadamente 70 horas de crescimento (pós-indução), por 20 minutos a 4°C e 3500 rpm. O sobrenadante foi decantado e tanto o caldo de cultura quanto as células foram congelados a -80°C. As frações de caldo de cultura foram filtradas e analisadas por LC/EM. As alturas e as áreas dos picos de [M + H]+ = 293 foram monitoradas conforme descrito no Exemplo 10. O nível de fundo do meio foi subtraído. Os dados foram também normalizados para crescimento celular traçando um gráfico da altura do pico de [M + H]+ = 293 dividido pela densidade óptica da cultura a 600 nm. Níveis mais altos de monatina foram produzidos quando piruvato, ampicilina e Tween foram adicionados 4 horas pós-indução em vez de sob indução. Outros aditivos tais como PLP, fosfato adicional ou MgCl2 adicional não aumentaram a produção de monatina. Titulações maiores de monatina foram obtidas quando triptofano foi utilizado em lugar de indol-3-piruvato e quando o triptofano foi adicionado pós-indução em vez de sob inoculação ou sob indução. Antes de indução, e 4 horas pós-indução (quando de adição de substrato), não houve tipicamente nível detectável de monatina no caldo de fermentação ou extratos celulares. Controles negativos foram produzidos utilizando células com vetor pET30a apenas, bem como culturas onde triptofano e piruvato não foram adicionados. Uma varredura EM de pais demonstrou que o composto com (m+1 )/z = 293 não foi derivado de moléculas maiores, e varreduras de filhas (realizadas como no Exemplo 10) foram similares a monatina produzida in vitro. O efeito de Tween foi estudado utilizando concentrações finais de 0; 0,2% (vol./vol.) e 0,6% de Tween-20. A maior quantidade de monatina produzida por meio de frascos sob agitação deu-se a 0,2% de Tween. A concentração de ampicilina foi variada entre 0 e 10 pg/mL. A quantidade de monatina no caldo celular aumentou rapidamente (2,5 X) entre 0 e 1 pg/mL, e aumentou 1,3 X quando a concentração de ampicilina foi elevada de 1 para 10 pg/mL. O experimento no curso de tempo mostrando resultados típicos é apresentado na Figura 10. A quantidade de monatina secretada no caldo celular aumentou, mesmo quando os valores são normalizados para crescimento celular. Usando o coeficiente de extinção molar de triptofano, a quantidade de monatina no caldo de cultura foi estimada ser menor que 10 pg/mL. O mesmo experimento foi repetido com as células contendo vetor sem inserção de proA. Muitos dos números foram negativos, indicando que a altura do pico em m/z = 293 era menor nessas culturas do que no meio isoladamente (Figura 10). Os números foram consistentemente menores quando triptofano e piruvato estavam ausentes, demonstrando que a produção de monatina é resultado de uma reação enzimática catalisada pela enzima aldolase. A produção in vivo de monatina em células bacterianas foi repetida em experimentos com frascos de 800 mL sob agitação e em fermenta-dores. Uma amostra de 250 mL de monatina (em caldo de cultura sem células) foi purificada por cromatografia de troca aniônica e cromatografia líquida preparativa de fase inversa. Essa amostra foi evaporada e submetida a análise de massa de alta resolução (descrita no Exemplo 6). A EM de alta resolução indicou que o metabólito sendo produzido é monatina.

Ensaios in vitro indicam que aminotransferase precisa estar presente em níveis mais altos do que aldolase (ver Exemplo 6), portanto a as- partato aminotransferase de E. coli foi superexpressa em combinação com o gene para aldolase para aumentar a quantidade de monatina produzida. Ini-ciadores foram projetados para introduzir proA de C. testosteroni em um óperon com aspC/pET30 Xa/LIC, como segue: iniciador 5': AC-TCGGATCCGAAGGAGATATACATATGTACGAACTGGGACT (SEQ ID NO: 67) e iniciador 3': CGGCTGTCGACCGTTAGTCAATATATTTCAGGC (SEQ ID NO: 68). O iniciador 5' contém um sítio BamHI, o iniciador 3' contém um sítio Sall para clonagem. PCR foi realizada como descrito no Exemplo 4 e purificada em gel. O constructo aspC/pET30 Xa/LIC foi digerido com BamHI e Sall, do mesmo modo que o produto de PCR. Os digestos foram purificados usando uma coluna de "spin" da Qiagen. O produto de PCR proA foi ligado ao vetor usando o kit de Ligação Rápida de DNA da Roche (Indianó-polis, IN) de acordo com instruções do fabricante. Transformações químicas foram efetuadas usando Novablues Singles (Novagen) conforme descrito no Exemplo 1. Colônias foram desenvolvidas em meio LB contendo 50 mg/L de canamicina e DNA de plasmídeo foi purificado usando o kit de miniprepara-ção "spin" Qiagen. Clones foram selecionados através de análise de digestão por restrição e a seqüência foi confirmada por Seqwright (Houston, TX). Constructos foram subclonados em BLR(DE3), BLR(DE3)pLysS, BL21 (DE3) e BL21(DE3)pLysS {Novagen). O constructo proAIpET30 Xa/LIC foi também transformado em BL21(DE3)pLysS.

Comparações iniciais de amostras de frascos de BLR(DE3) com agitação sob as condições padrão descritas acima demonstraram que a adição do segundo gene (aspC) aperfeiçoou a quantidade de monatina produzida setuplamente. Para apressar crescimento, foram usadas cepas hospedeiras derivadas de BL21 (DE3). Os clones de proA e os dois clones de ópe-rons de genes foram induzidos em meio Trp-1 conforme acima, os hospedeiros de pLysS tinham cloranfenicol (34 mg/L) adicionado ao meio também. Experimentos com frascos sob agitação foram realizados com e sem a adição de 0,2% de Tween-20 e 1 mg/L de ampicilina. A quantidade de monatina no caldo de cultura foi calculada usando monatina purificada produzida in vitro como padrão. Análises de SRM foram realizadas conforme descrito no Exemplo 10. Células foram amostradas em zero, 4 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas e 96 horas de crescimento.

Os resultados são mostrados na Tabela 5 para as quantidades máximas produzidas nos caldos de cultura. Na maioria dos exemplos, o constructo de dois genes forneceu valores maiores do que o constructo de proA sozinho. As cepas pLysS, que devem apresentar envoltórios celulares mais vazios, tinham níveis mais altos de monatina secretada, ainda que essas cepas tipicamente cresçam a uma taxa mais lenta. As adições de Tween e ampicilina foram benéficas.

Tabela 5: Quantidade de Monatina Produzida por Bactérias de E. coli Exemplo 12 Produção de Monatina em Lêvedo Este exemplo descreve métodos usados para produzir monatina em células eucarióticas. Aquele versado na técnica entenderá que métodos similares podem ser usados para produzir monatina em qualquer célula de interesse. Adicionalmente, podem ser usados outros genes (por exemplo, aqueles listados na Figura 2) além de ou alternativamente àqueles descritos neste exemplo. O Sistema de Vetores com Ponta de Epitopo de Lêvedo pESC (Stratagene, La Jolla, CA) foi usado para clonar e expressar os genes aspC de E. coli e proA de C. testosteroni em Saccharomyces cerevisiae. Os vetores pESC contêm tanto o promotor GAL1 quanto o promotor GAL10 em filamentos opostos, com dois sítios de clonagem múltipla distintos, permitindo expressão de dois genes ao mesmo tempo. O vetor pESC-His também contém o gene His3 para complementação de auxotrofia de histidina no hospedeiro (YPH500). Os promotores GAL1 e GAL10 são reprimidos por glicose e induzidos por galactose; uma seqüência de Kozak é utilizada para expressão ótima em lêvedo. Os plasmídeos de pESC são vetores lançadores, permitindo que o constructo incial seja produzido em E. coli (com o gene bla para seleção); contudo, nenhum sítio de ligação de ribossomo bacteriano está presente nos sítios de clonagem múltipla.

Os seguintes iniciadores foram projetados para clonagem em pESC-His (sítios de restrição estão sublinhados, seqüência de Kozak está em negrito): aspC (BamH\ISal\), GAL1: 5'- CGCGGATCCATAATGGTTGAGAACATTACCG-3' (SEQ ID NO: 69) e 5'-ACGCGTÇGAÇTTACAGCACTGCCACAATCG-3' (SEQ ID NO: 70). proA (EcoRUNofí), GAL10: 5'-CCGGAATTÇATAATGGTCGAACTGGGAGTTGT-3' (SEQ ID NO: 71) e 5’-GAATGCGGCCGCTTAGTCAATATATTTCAGGCC-3' (SEQ ID NO: 72). O segundo códon para ambas as proteínas maduras foi mudado de um aminoácido aromático para valina devido à introdução da seqüência de Kozak. Os genes de interesse foram amplificados usando DNA de mini-preparação de pET30 Xa/LIC dos clones descritos nos Exemplo 1 e Exemplo 4 como padrão. PCR foi realizada usando um termociclador com gradiente ciclador Eppendorf Master e o seguinte protocolo para uma reação de 50 μΐ_: 1,0 pg de padrão, 1,0 μΜ de cada iniciador, 0,4 mM de cada dNTP, 3,5 U de Polimerase Expand High Fidelity (Roche, Indianópolis, IN) e tampão 1X Ex-pantf com Mg. O programa do termoclicador usado consistiu de uma partida quente a 94°C por 5 minutos, seguida de 29 repetições das seguintes etapas: 94°C por 30 segundos, 50°C por 1 minuto e 45 segundos e 72°C por 2 minutos 15 segundos. Após as 29 repetições, a amostra foi mantida a 72°C por 10 minutos e em seguida armazenada a 4°C. Os produtos de PCR foram purificados por separação em 1% de TAE-gel de agarose seguida de recuperação usando um Kit de Extração de Gel QIAquick (Qiagen, Valência, CA). O DNA de vetor pESC-His (2,7 pg) foi digerido com BamH\ISal\ e purificado em gel como acima. O produto de PCR aspC foi digerido com BamHilSan e purificado com uma coluna de Purificação por PCR QIAquick. Ligações foram realizadas com o Kit de Ligação Rápida de DNA da Roche seguindo os protocolos do fabricante. Ligações dessalgadas foram eletropo-radas em 40 pl de células competentes DH10B Electromax (Invltrogen) em um cadinho descartável de 0,2 cm da Biorad usando um Pulsador de Genes Biorad II com controlador de pulsos mais, de acordo com as instruções do fabricante. Após 1 hora de recuperação em 1 mL de meio SOC, os transfor-mantes foram laminados sobre meio LB contendo 100 pg/mL de ampicilina. Preparações de DNA de plasmídeo para clones foram produzidas usando Kits de minipreparação "spin" QIAprep. DNA de plasmídeo foi selecionado através de digestão por restrição e seqüenciado (Seqwright) para verificação usando iniciadores projetados para o vetor. O clone aspC/pESC-His foi digerido com EcoRI e Not\, do mesmo modo que o produto de PCR proA. DNA foi purificado conforme acima e ligado conforme acima. O constructo de dois genes foi transformado em células DH10B e selecionado através de digestão por restrição e seqüencia-mento de DNA. O constructo foi transformado em cepa YPH500 de S. cerevisiae usando o Kit de Transformação S.c. EasyComp® (Invitrogen). Reações de transformação foram laminadas sobre meio mínimo SC-His (manual de pYES2 Invitrogen) contendo 2% de glicose. Colônias de lêvedo individuais foram selecionadas em relação à presença dos genes proA e aspC por PCR de colônias usando os iniciadores de PCR acima. Células peletizadas (2 pl) foram suspensas em 20 pL de Tampão Y-Lysis (Zymo Research) contendo 1 pl de zimolase e aquecidas a 37°C por 10 minutos. Quatro pL dessa suspensão foram então usados em uma reação de PCR de 50 pL usando a mistura reacional de PCR e programa descrito acima.

Culturas de cinco mL foram desenvolvidas da noite para o dia sobre SC-His + glicose a 30°C e 225 rpm. As células foram gradualmente ajustadas para crescer sobre rafinose a fim de minimizar o período de retar- damento antes de indução com galactose. Após aproximadamente 12 horas de crescimento, medições de absorbância a 600 nm foram tomadas e um volume apropriado de células foi centrifugado e ressuspenso para fornecer uma OD de 0,4 no meio novo SC-His. As seguintes fontes de carbono foram usadas seqüencialmente: 1% de rafinose + 1% de glicose, 0,5% de glicose + 1,5% de rafinose, 2% de rafinose e finalmente 1% de rafinose + 2% de galactose para indução.

Após aproximadamente 16 horas de crescimento em meio de indução, as culturas de 50 ml_ foram divididas em culturas em duplicata de 25 mL, e o seguinte foi adicionado a apenas uma das duplicatas: (concentrações finais) 1 g/L de L-triptofano, 5 mM de fosfato de sódio, pH 7,1, 1 g/L de piruvato de sódio, 1 mM de MgCI2. Amostras de caldos de cultura e de péletes de células do meio de não-indução, e das culturas de 16 horas antes de adição de substratos para o caminho de monatina, foram preservados como controles negativos. Adicionalmente, constructos contendo somente um gene aspC funcional (e um gene proA truncado) foram utilizados como um outro controle negativo. As células foram deixadas crescer por um total de 69 horas pós-indução. Ocasionalmente, as células de lêvedo foram induzidas sob uma OD menor e somente desenvolvidas por 4 horas antes de adição de triptofano e piruvato. Entretanto, esses substratos de monatina perecem inibir crescimento e a adição sob OD maior foi mais eficaz.

Os péletes de células das culturas foram lisados com 5 mL de YeastBustei® + 50 μΙ de THP (Novagen) por grama (peso úmido) de células seguindo protocolos do fabricante, com a adição de inibidores de protease e benzonase nuclease conforme descrito em exemplos anteriores. O caldo de cultura e extratos celulares foram filtrados e analisados por SRM como descrito no Exemplo 10. Usando esse método, nenhuma monatina foi detectada nas amostras de caldo de cultura, indicando que as células não podiam se-cretar monatina sob essas condições. A força-motriz próton poderá ser insuficiente sob essas condições ou os transportadores gerais de aminoácidos poderão ser saturados com triptofano. Expressão de proteína não se deu em um nível que permitisse detecção de mudanças usando SDS-PAGE.

Monatina foi detectável (aproximadamente 60 pg/mL) transien-temente em extratos celulares da cultura com dois genes funcionais, quando triptofano e piruvato foram adicionados ao meio. Monatina não foi detectada em qualquer dos extratos celulares de controle negativo. Ensaios in vitro para monatina foram realizados em duplicata com 4,4 mg/mL de proteína total (cerca do dobro do que é tipicamente usado para extratos de células de E. coli) usando o ensaio otimizado descrito no Exemplo 6. Outros ensaios foram realizados com a adição de 32 pg/mL de proA aldolase de C. testoste-roni ou 400 pg/mL de AspC aminotransferase, para determinar que enzima foi limitante no extrato celular. Controles negativos foram realizados sem adição de enzima, ou adição somente de AspC aminotransferase (a condensação de aldol pode ocorrer em algum grau sem enzima). Controles positivos foram realizados com enzimas parcialmente puras (30-40%), usando 16 pg/mL de aldolase e 400 pg/mL de aminotransferase.

Resultados in vitro foram analisados por SRM. A análise de extratos celulares mostraram que triptofano foi eficazmente transportado para as células quando foi adicionado ao meio pós-indução, resultando em níveis de triptofano duas ordens de magnitude maiores que aqueles em que nenhum triptofano adicional foi adicionado. Os resultados para análise de monatina in vitro são mostrados na Tabela 6 (os números indicam ng/mL). Tabela 6: Produção de monatina com extratos de células de lêvedo Continuação Resultados positivos são obtidos com os extratos celulares de constructo de dois genes total com e sem substrato adicionado ao meio de crescimento. Esses resultados, em comparação aos controles positivos, indicam que as enzimas foram expressas sob níveis de aproximadamente 1% da proteína total no lêvedo. A quantidade de monatina produzida quando o extrato celular do constructo aspC (com proA truncado) foi ensaiado com aldolase foi significativamente maior do que quando os extratos celulares foram ensaiados separados, e indica que o AspC aminotransferase recombi-nante compreende aproximadamente 1 - 2% da proteína total no lêvedo. Os extratos celulares de culturas não-induzidas apresentaram uma pequena quantidade de atividade quando ensaiados com aldolase devido à presença de aminotransferases nativas nas células. Quando ensaiados com AspC aminotransferase, a atividade dos extratos de células não-induzidas aumentou a quantidade de monatina produzida pelo controle negativo com AspC (cerca de 200 ng/ml). Em contraste, a atividade observada ao ensaiar o extrato celular de constructo de dois genes, aumenta mais quando aminotransferase é suplementada do que quando aldolase é adicionada. Uma vez que ambos os genes têm de ser expressos no mesmo nível, isso indica que a quantidade de monatina produzida é maximizada quando o nível de aminotransferase é maior que aldolase, de acordo com resultados mostrados no Exemplo 6. A adição de piruvato e triptofano não apenas inibe crescimento celular, mas evidentemente inibe expressão de proteína também. A adição do plasmídeo pESC-Trp pode ser usada para corrigir auxotrofia de triptofano das células hospedeiras YPH500, para proporcionar um meio de suprir triptofano com efeitos menores no crescimento, expressão e secreção.

Exemplo 13 Aperfeiçoamento de Processos Enzimáticos usando Reações Acopladas Na teoria, se nenhuma reação lateral ou degradação de substratos ou intermediários ocorra, a quantidade máxima de produto formado da reação enzimática ilustrada na Figura 1 é diretamente proporcional ao equilíbrio constante de cada reação, e as concentrações de triptofano e piruvato. Triptofano não é um substrato altamente solúvel, e concentrações de piruvato maior que 200 mM parecem apresentar um efeito negativo no rendimento (ver Exemplo 6).

Idealmente, a concentração de monatina é maximizada com relação a substratos, a fim de diminuir o custo de separação. Separações físicas podem ser efetuadas tal que a monatina seja removida da mistura reaci-onal, impedindo de ocorrer as reações inversas. As matérias-primas e catalisadores podem em seguida ser regenerados. Devido à similaridade ao tamanho de monatina, carga e hidrofobicidade a diversos dos reagentes e intermediários, separações físicas serão difíceis a não ser que haja uma alta quantidade de afinidade para monatina (tal como uma técnica de cromato-grafia por afinidade). Contudo, as reações de monatina podem ser acopladas a outras reações tal que o equilíbrio do sistema seja deslocado no sentido de produção de monatina. O que segue são exemplos de processos para aperfeiçoar o rendimento de monatina obtida de triptofano ou indol-3-piruvato.

Reações Acopladas usando oxaloacetato decarboxilase (EC 4.1.1.3) A FIG 11 é uma ilustração da reação. Triptofano oxidase e cata-lase são utilizadas para conduzir a reação na direção de produção de indol-3-piruvato. Catalase é usada em excesso tal que peróxido de hidrogênio não seja disponível a reagir na direção inversa ou a danificar as enzimas ou intermediários. Oxigênio é regenerado durante a reação de catalase. Alternati- vamente, indol-3-piruvato pode ser usado como o substrato.

Aspartato é usado como o doador de amino para a aminação de MP, e um aspartato aminotransferase é utilizado. Idealmente, uma amino-transferase que apresenta uma baixa especificidade para a reação de trip-tofano/indol-3-piruvato em comparação com o MP para reação de monatina é usado de tal modo que o aspartato não seja utilizado para reaminar o in-dol-3-piruvato. Oxaloacetato decarboxilase (de Pseudomonas sp.) pode ser adicionada para converter o oxaloacetato em piruvato e dióxido de carbono. Uma vez que CO2 seja volátil, ele não é adequado para reação com as enzimas, diminuindo ou mesmo impedindo as reações inversas. O piruvato produzido nessa etapa pode também ser utilizado na reação de condensação de aldol. Outras enzimas decarboxilases podem ser usadas, e homólogos são sabidos existir em Actinobacillus actinomycetemcomitans, Aquifex aeolicus, Archaeoglobus fulgidus, Azotobacter vinelandii, Bacteroides fragilis, diversas espécies Bordetella, Campylobacter jejuni, Chlorobium tepidum, Chloroflexus aurantiacus, Enterococcus faecalis, Fusobacterium nucleatum, Klebsiella pneumoniae, Legionella penumophila, Magnetococcus MC-1, Mannheimia haemolytica, Methylobacillus flagellatus KT, Pasteurella multo-cida Pm70, Petrotoga miotherma, Porphyromonas gingivalis, diversas espécies Pseudomonas, diversas espécies Pyrococcus, Rhodococcus, diversas espécies Salmonella, diversas espécies Streptococcus, Thermochromatium tepidum, Thermotoga marítima, Treponema pallidum e diversas espécies Vibrio.

Ensaios de triptofano aminotransferase foram realizados com a enzima aspartato aminotransferase (AspC) de E. coli, a tirosina aminotransferase (TyrB) de E. coli, 0 substrato amplo aminotransferase (BSAT) de L. major, e as duas glutamato-oxaloacetato aminotransferases porcinas comercialmente disponíveis conforme descrito no Exemplo 1. Tanto oxaloacetato quanto alfa-cetoglutarato foram testados como 0 aceitador de amino. A razão de atividade usando monatina (Exemplo 7) versus atividade usando triptofano foi comparada, para determinar que a enzima apresentava a especificidade mais alta em relação a reação de monatina aminotransferase. Es- ses resultados indicaram que a enzima com a especificidade mais alta em relação a reação de monatina versus a reação de triptofano é a glutamato-oxaloacetato aminotransferase porcina tipo ll-A, GOAT (Sigma G7005). Essa especificidade foi independente de qual aceitador de amino foi utilizado. Portanto, essa enzima foi usada nas reações acopladas com oxaloacetato decarboxilase.

Uma reação típica partindo de indol-3-piruvato incluiu (concentrações finais), 50 mM de Tris-CI pH 7,3, 6 mM de indol-3-piruvato, 6 mM de piruvato de sódio, 6 mM de aspartato, 0,05 mM de PLP, 3 mM de fosfato de potássio, 3 mM de MgCI2, 25 pg/mL de aminotransferase, 50 pg/mL de ProA aldolase de C. testosteroni e 3 Unidades/mL de decarboxilase (Sigma 04878). As reações foram deixadas prosseguir por 1 hora a 26°C. Em alguns casos, a decarboxilase foi omitida ou o aspartato foi substituído com alfa-cetoglutarato (como controles negativos). As enzimas aminotransferase descritas acima foram também testadas em placa da GOAT para confirmar experimentos de especificidade prematuros. Amostras foram filtradas e analisadas por LC/EM conforme descrito no Exemplo 10. Os resultados demonstram que a enzima GOAT produziu a quantidade maior de monatina por mg de proteína, com a menor quantidade de triptofano produzido como um subproduto. Além disso, houve um benefício 2-3 vezes mais de ter a enzima decarboxilase adicionada. A enzima AspC de E. coli também produziu grandes quantidades de monatina em comparação com as outras amino-transferases. O aumento na produção de monatina foi mediante: 1) adicionar periodicamente adições 2mM de indol-piruvato, piruvato e aspartato (de cada meia-hora a hora), 2) efetuar as reações em um ambiente anaeróbico ou com tampões desgaseificados, 3) permitir as reações prosseguirem da noite para o dia, e 4) usar decarboxilase recentemente preparada que não foi congelada-descongelada em tempos múltiplos. A decarboxilase foi inibida por concentrações de piruvato maiores que 12 mM. Sob concentrações de indol-3-piruvato maiores que 4 mM, reações laterais com indol-3-piruvato foram apressadas. A quantidade de indol-3-piruvato usada na reação pode ser aumentada se a quantidade de aldolase fosse também aumentada. Verificou-se que altos níveis de fosfato (50 mM) e aspartato (50 mM) foram ini-bítórios à enzima decarboxilase. A quantidade de enzima decarboxilase adicionada pôde ser reduzida a 0,5 U/mL sem nenhuma diminuição na produção de monatina em uma hora de reação. A quantidade de monatina produzida aumentou quando a temperatura foi elevada de 26°C a 30°C e de 30°C a 37°C; todavia, a 37°C as reações laterais de indol-3-piruvato foram também apressadas. A quantidade de monatina produzida aumentou com pH crescente de 7 a 7,3, e foi relativamente estável de pH 7,3 - 8,3.

Uma partida típica de reação com triptofano incluiu (concentrações finais) 50 mM de Tris-CI pH 7,3, 20 mM de triptofano, 6 mM de aspartato, 6 mM de piruvato de sódio, 0,05 mM de PLP, 3 mM de fosfato de potássio, 3 mM de MgCk, 25 pg/mL de aminotransferase, 50 pg/mL de ProA aldolase de C. testosteroni, 4 Unidades/mL de decarboxilase, 5-200 mU/mL de L-aminoácido oxidase (Sigma A-2805), 168 U/mL de catalase (Sigma C-3515) e 0,008 mg de FAD. Reações foram realizadas por 30 minutos a 30°C. Aperfeiçoamento foi observado com a adição de decarboxilase. A quantidade maior de monatina foi produzida quando 50 Um/mL de oxidase foram usados. Aperfeiçoamentos foram similares aqueles observados quando in-dol-3-piruvato foi usado como o substrato. Além disso, a quantidade de monatina produzida aumentou quando 1) o nível de triptofano foi baixo (isto é, abaixo de Km da enzima aminotransferase, e portanto incapaz de competir com MP no sítio ativo), e 2) a razão de oxidase para aldolase e aminotransferase foi mantida em um nível tal que indol-3-piruvato não pode acumular-se.

Ao iniciar com indol-3-piruvato ou triptofano, a quantidade de monatina produzida em ensaios com tempos de incubação de 1-2 horas aumentou quando as quantidades de todas as enzimas foram usadas enquanto mantém-se a mesma razão de enzima. Ao usar o substrato, foram obtidas concentrações de aproximadamente 1 mg/mL de monatina. A quantidade de triptofano produzida se iniciando com indol-3-piruvato foi tipicamente menor que 20% da quantidade de produto, que mostra o benefício de utilizar rea- ções acopladas. Com otimização adicional e controle das concentrações de intermediários e reações laterais, a produtividade e rendimento podem ser grandemente aperfeiçoados.

Reações acopladas usando lisina epsílon aminotransferase (EC 2.6.1.36) Lisina epsílon aminotransferase (L-lisina 6-transaminase) é encontrada em diversos organismos, incluindo Rhodococcus, Mycobacteríum, Streptomyces, Nocardia, Flavobacterium, Candida utilis e Streptomyces. Ela é utilizada por organismos como a primeira etapa na produção de alguns antibióticos beta-lactama (Rius e Demain, J. Microbiol. Biotech., 7:95-100, 1997). Essa enzima converte lisina em L-2-aminoadipato-6-semialdeído (ali-sina), por uma transaminação mediada por PLP da C-6 de lisina, utilizando alfa-cetoglutarato como o aceitador de amino. Alisina é instável e espontaneamente sofre uma desidratação intramolecular para formar 1-piperidina-6-carboxilato, uma molécula cíclica. Esta efetivamente inibe a ocorrência de qualquer reação inversa. O esquema de reação é representado na Figura 12. Uma enzima alternativa, lisina-piruvato-6-transaminase (EC 2.6.1.71), pode também ser usada.

Uma reação típica continha em 1 mL: 50 mM de Tris-HCI pH 7,3, 20 mM de indol-3-piruvato, 0,05 mM de PLP, 6 mM de fosfato de potássio pH 8, 2-50 mM de piruvato de sódio, 1,5 mM de MgCI2, 50 mM de lisina, 100 pg de aminotransferase (lisina epsílon aminotransferase LAT-101, BioCa-talytics Pasadena, CA) e 200 pg de ProA aldolase de C. testosteroni. A quantidade de monatina produzida aumentou com concentrações crescentes de piruvato. A quantidade máxima usando essas condições de reação (sob 50 mM de piruvato) foi 10 vezes menos do que aquela observada com reações acopladas usando oxaloacetato decarboxilase (aproximadamente 0,1 mg/mL).

Um pico com [M+H]+ = 293 eluído no tempo esperado para monatina e o espectro de massa continha diversos dos mesmos fragmentos observados com outros processos enzimáticos. Um segundo pico com a massa correta para razão de carga (293) eluído ligeiramente anterior aquele tempo que é tipicamente observado para a S,S monatina produzida no Exemplo 6, e poderá indicar a presença de um outro isômero de monatina. Muito pouco triptofano foi produzido por essa enzima. Contudo, há provavelmente alguma atividade em piruvato (produzindo alanina como um subproduto). Também, a enzima é sabida ser instável. Aperfeiçoamentos podem ser feitos realizando experimentos de evolução dirigida para aumentar estabilidade, reduzir a atividade com piruvato e aumentar a atividade com MP. Essas reações podem também ser acopladas com L-aminoácido oxida-se/catalase conforme descritas acima.

Outras reações acopladas Uma outra reação de acoplamento que pode aperfeiçoar rendimento de monatina a partir de triptofano ou indol-piruvato é mostrado na Figura 13. Formato desidrogenase (EC 1.2.1.2 ou 1.2.1.43) é uma enzima comum. Algumas formato desidrogenases exigem NADH enquanto outras podem utilizar NADPH. Glutamato desidrogenase catalisou a interconversão entre o precursor de monatina e monatina em exemplos anteriores, usando tampões à base de amônia. A presença de formiato de amônio e formiato desidrogenase é um sistema eficiente para regeneração de co-fatores, e a produção de dióxido de carbono é um meio eficiente de diminuir a taxa das reações inversas (Bommarius e outros, Biocatalysis 10:37, 1994 e Galkin e outros, Appl. Environ. Microbiol. 63:4651-6, 1997). Além disso, grandes quantidades de formiato de amônio podem ser dissolvidas no tampão de reação. O rendimento de monatina produzido por reações de glutamato desidrogenase (ou aminações redutivas similares) pode ser aperfeiçoado pela adição de formiato desidrogenase e formiato de amônio.

Outros processos podem ser usados para conduzir o equilíbrio no sentido de produção de monatina. Por exemplo, se aminopropano é utilizado como o doador de aminoácido na conversão de MP em monatina com um ômega-aminoácido aminotransferase (EC 2.6.1.18) tais como aqueles descritos por patentes U.S. 5.360.724 e 5.300.437, aqueles dos produtos resultantes seriam acetona, um produto mais volátil que o substrato, aminopropano. A temperatura pode ser aumentada periodicamente por períodos curtos para manifestar completamente a acetona, aliviando desse modo equilíbrio. Acetona apresenta um ponto de ebulição de 47°C, uma temperatura não provável para degradar os intermediários se usados por períodos curtos de tempo. A maior parte de aminotransferases que apresenta atividade sobre alfa-cetoglutarato também apresenta atividade sobre o precursor de monatina. Similarmente, se um glioxilato/ácido aromático aminotransfera-se (EC 2.6.1.60) é usado com glicina como o doador de amino, glioxilato é produzido, o qual é relativamente instável e apresenta um ponto de ebulição altamente reduzido em comparação a glicina.

Exemplo 14 Expressão Recombinante Com DNA de enzima e seqüências de aminoácidos disponíveis publicamente, e as enzimas e seqüências descritas nesta invenção, tais como SEQ ID NOS: 11 e 12, bem como variantes, polimorfismos, mutantes, fragmentos e fusões dos mesmos, a expressão e purificação de qualquer proteína, tal como uma enzima, por meio de técnicas de laboratório padrão é possibilitada. Aquele versado no estado da técnica entenderá que enzimas e fragmentos das mesmas podem ser produzidos recombinantemente em qualquer célula ou organismo de interesse, e purificados antes de uso, por exemplo antes de produção de SEQ ID NO: 12 e derivados desta. Métodos para produzir proteínas recombinantes são bem conhecidos no estado da técnica. Portanto, o escopo desta descrição inclui expressão recombinante de qualquer proteína ou fragmento desta, tal como uma enzima. Por exemplo, ver Patente U.S. N° 5.342.764, concedida a Johnson e outros; Patente U.S. N° 5.846.819, concedida a Pausch e outros; Patente U.S. N° 5.876.969, concedida a Fleer e outros e Sambrook e outros {Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989, Ch. 17).

Seqüências breves, parciais, de comprimento pleno ou variantes de cDNA, que codificam uma proteína ou peptídeo, podem ser ligadas em um vetor de expressão, tal como um vetor de expressão bacteriano ou euca-riótico. Proteínas e/ou peptídeos podem ser produzidos colocando um promotor a montante da seqüência de cDNA. Exemplos de promotores incluem, mas sem se limitar aos mesmos, lac, trp, tac, trc, regiões importantes de operadores e promotores de fago lambda, a região de controle de proteína de revestimento fd, os promotores prematuros e tardios de SV40, promotores derivados de polioma, adenovírus, retrovírus, baculovírus e vírus de símios, o promotor para 3-fosfoglicerato quinase, os promotores de fosfatase ácida de lêvedo, o promotor dos fatores alfa-encaixe de lêvedo e combinações dos mesmos.

Vetores adequados para a produção de proteínas nativas intactas incluem pKC30 (Shimatake e Rosenberg, 1981, Nature 292:128), pKK177-3 (Amann e Brosius, 1985, Gene 40:183) e pEt-3 (Studier e Moffatt, 1986, J. Mol. Biol. 189:113). Uma seqüência de DNA pode ser transferida para outros veículos de clonagem, tais como, outros plasmídeos, bacteriófa-gos, cosmídeos, vírus de animais e cromossomos artificiais de lêvedo (YACs) (Burke e outros, 1987, Science 236:806-12). Esses vetores podem ser introduzidos em uma variedade de hospedeiros que incluem células somáticas e organismos simples ou complexos, tais como, bactérias, fungos (Timberlake e Marshall, 1989, Science 244:1313-7), invertebrados, plantas (Gasser e Fraley, 1989, Science 244:1293) e mamíferos (Pursel e outros, 1989, Science 244:1281-8), que são tomados transgênicos pela introdução do cDNA heterólogo.

Para expressão em células de mamífero, uma seqüência de cDNA pode ser ligada a promotores heterológos, tal como, o vírus de símio SV40, promotor no vetor pSV2 (Mulligan e Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:2072-6), e introduzida em células, tais como, células COS-1 de macaco (Gluzman, 1981, Cell 23:175-82), para obter expressão transiente ou de longo prazo. A integração estável do constructo de genes quimérico poderá ser mantida em células de mamífero por seleção bioquímica, tais como, como neomicina (Southern e Berg, 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1:327-41) e ácido micofenólico (Mulligan e Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:2072-6). A transferência de DNA para células eucarióticas, tais como células humanas ou outras células de mamífero, é uma técnica convencional.

Os vetores são introduzidos nas células recipientes como DNA puro (trans-fecção) por meio de, por exemplo, precipitação com fosfato de cálcio (Graham e vander Eb, 1973, Virology 52:466), fosfato de estrôncio (Brash e outros, 1987, Mol. Cell Biol. 7:2013), eletroporação (Neumann e outros, 1982, EMBO J. 1:841), lipofecção (Felgner e outros, 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:7413), DEAE dextrano (McCuthan e outros, 1968, J. Natl. Câncer Inst. 41:351), microinjeção (Mueller e outros, 1978, Cell 15:579), fusão de protoplastos (Schafner, 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:2163-7) ou pistolas de pélete (Klein e outros, 1987, Nature 327:70). Alternativamente, o cDNA pode ser introduzido por infecção com vetores viróticos, por exemplo retrovírus (Bernstein e outros, 1985, Gen. Engrg. 7:235), tais como, adenoví-rus (Ahmad e outros, 1986, J. Virol. 57:267) ou Herpes (Spaete e outros, 1982, Cell 30:295).

Em vista das muitas modalidades possíveis a que os princípios desta descrição poderão ser aplicados, deve-se reconhecer que as modalidades ilustradas são apenas exemplos particulares da descrição e não deverão ser tomadas como uma limitação ao escopo da apresentação. Preferencialmente, o escopo da apresentação está de acordo com as reivindicações seguintes. Portanto, é reivindicado como a invenção tudo que se enquadra no escopo e espírito dessas reivindicações.

Claims (16)

1. Método in vitro para produção de monatina, caracterizado pelo fato de que compreende converter triptofano e/ou ácido indol-3-lático em monatina, que compreende: (a) contatar triptofano ou ácido indol-3-lático com um primeiro polipeptídeo, em que quando o triptofano é colocado em contato com o primeiro polipeptídeo, o primeiro polipeptídeo é selecionado de triptofano ami-notransferase (EC 2.6.1.27), triptofano desidrogenase (EC 1.4.1.19), tirosina aminotransferase (aromática) (EC 2.6.1.5), triptofano-fenilpiruvato transami-nase (EC 2.6.1.28), aminotransferase substrato múltiplo (EC 2.6.1.-), aspar-tato aminotransferase (EC 2.6.1.1), triptofano oxidase, L-aminoácido oxidase (EC 1.4.3.2), D-aminoácido desidrogenase (EC 1.4.99.1), D-aminoácido oxidase (EC 1.4.3.3), D-triptofano aminotransferase, D-alanina aminotransferase (EC 2.6.1.21), glutamato desidrogenase (EC 1.4.1.2-4), fenilalanina desidrogenase (EC 1.4.1.20) ou uma combinação das mesmas, em que quando ácido indol-3-lático é colocado em contato com o primeiro polipeptídeo, o primeiro polipeptídeo é selecionado de indol lactato desidrogenase (EC 1.1.1.110) , FM-hidroxifenil lactato desidrogenase (EC 1.1.1.222), 3-(4)-hidroxifenilpiruvato redutase (EC 1.1.1.237), lactato desidrogenase (EC 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3), (3-imidazol-5-il) lactato desidrogenase (EC 1.1.1.111) e lactato oxidase (EC 1.1.3.-), ou uma combinação das mesmas, e em que o primeiro polipeptídeo converte triptofano ou ácido indol-3-lático em indol-3-piruvato; (b) contatar o indol-3-piruvato com um segundo polipeptídeo e uma fonte de carbono C3, em que o segundo polipeptídeo é uma enzima EC 4.1.2.- ou EC 4.1.3.-, em que o segundo polipeptídeo converte o indol-3-piruvato e a fonte de carbono C3 em ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-iImetiI)-4-cetoglutárico; e (c) contatar o ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutárico com um terceiro polipeptídeo, em que o terceiro polipeptídeo é selecionado de tirosina aminotransferase (aromática) (EC 2.6.1.5), triptofano desidrogenase (EC 1.4.1.19), triptofano-fenilpiruvato transaminase (EC 2.6.1.28), trip- tofano aminotransferase (EC 2.6.1.27), aspartato aminotransferase (EC 2.6.1.1), D-alanina aminotransferase (EC 2.6.1.21), D-triptofano aminotransferase, glutamato desidrogenase (EC 1.4.1.2-4), fenilalanina desidrogenase (EC 1.4.1.20), aminotransferase substrato múltiplo (EC 2.6.1.-), D-aminoácido desidrogenase (EC 1.4.99.1), uma lisina épsilon aminotransferase ou uma combinação das mesmas, em que o terceiro polipeptídeo converte o ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutárico em monatina.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro polipeptídeo que converte o triptofano em indol-3-piruvato é um aminoácido oxidase (EC 1.4.3.-) e uma catalase (EC 1.11.1.6) é também utilizada.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a aminoácido oxidase é uma triptofano oxidase.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a enzima EC 4.1.3.- é 4-hidróxi-2-oxoglutarato glioxilato-liase (EC 4.1.3.16), 4-hidróxi-4-metil-2-oxoglutarato piruvato-liase (EC 4.1.3,17) ou uma combinação das mesmas.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o segundo polipeptídeo é uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em: (a) SEQ ID NO: 66, N° de Acesso Genbank: CAC46344, N° de Acesso Genbank: CAB14127.1, N° de Acesso Genbank: AAC74920.1 ou N° de Acesso Genbank: CAC47463.1; e (b) uma sequência de aminoácidos que compreende pelo menos 90% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 66, N° de Acesso Genbank: CAC46344, N° de Acesso Genbank: CAB14127.1, N° de Acesso Genbank: AAC74920.1 ou N° de Acesso Genbank: CAC47463.1.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o terceiro polipeptídeo é uma aspartato aminotransferase, onde o ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutárico é contatado com aspartato para produzir oxaloacetato e monatina.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende ainda contatar oxaloacetato com uma descarboxila-se.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o terceiro polipeptídeo é uma lisina épsilon aminotransferase, onde o ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutárico é adicionalmente contatado com lisina.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro e/ou terceiro polipeptídeo é selecionado do grupo consistindo em: (a) uma sequência de aminoácidos mostrada nas SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 32, N° de Acesso Genbank: NP_388848.1, N° de Acesso Genbank: ZP00005082.1 ou N° de Acesso Genbank: AAC74014.1; e (b) uma sequência de aminoácidos que compreende pelo menos 90% de identidade de sequências com a sequência mostrada nas SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 32, N° de Acesso Genbank: NP_388848.1, N° de Acesso Genbank: ZP00005082.1 ou N° de Acesso Genbank: AAC74014.1.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o triptofano é produzido a partir de indol usando um polipeptídeo de EC 4.1.99.1.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fonte de carbono C3 é selecionada de piruvato, fosfoenolpiru-vato, alanina, serina, cisteína ou uma combinação dos mesmos.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o piruvato é produzido por: (a) alanina e um polipeptídeo capaz de transminação de alanina; (b) serina e um polipeptídeo capaz de betaeliminação de serina; (c) cisteína e um polipeptídeo capaz de betaeliminação de cisteína; (d) aspartato e um polipeptídeo capaz de reações beta-liase com um aminoácido dicarboxílico; (e) lactato e lactato oxidase (EC 1.1.3.-) ou lactato desidrogena-se (EC 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3); ou (f) uma combinação dos mesmos.

13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda reduzir uma quantidade de peróxido de hidrogênio produzido quando triptofano é convertido em indol-3-piruvato, colocando o peróxido de hidrogênio em contato com uma catalase.

14. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos 10 g/L de monatina são produzidos.

15. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda detecção do ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutárico por espectrometria de massa.

16. Método de produção de monatina, caracterizado pelo fato de que compreende converter indol-3-piruvato em monatina na presença de piruvato e um primeiro e um segundo polipeptídeo, em que o primeiro poli-peptídeo é uma aldolase, e em que o segundo polipeptídeo é selecionado de tirosina aminotransferase (aromática) (EC 2.6.1.5), triptofano desidrogenase (EC 1.4.1.19), triptofano-fenilpiruvato trans-aminase (EC 2.6.1.28), triptofano aminotransferase (EC 2.6.1.27), aspartato aminotransferase (EC 2.6.1.1), D-alanina aminotransferase (EC 2.6.1.21), D-triptofano aminotransferase, glu-tamato desidrogenase (EC 1.4.12-4), fenilalanina desidrogenase (EC 1.4.1.20), aminotransferase substrato múltiplo (EC 2.6.1.-), D-aminoácido desidrogenase (EC 1.4.99.1) ou uma combinação das mesmas.