RS92604A - Polipeptidi i putevi biosinteze - Google Patents

Abstract

Ovde su prikazane metode i kompozicije koje mogu da se koriste da naprave monatin iz glukoze, triptofana, indol-3-mlečne kiseline, indol-3-piruvata, i 2-hidroksi 2-(indol-3-ilmetil)-4-keto glutarične kiseline. Ove metode su takođe otkrivene za produkciju međuproizvoda indol-3-piruvata, i 2-hidroksi 2-(indol-3-ilmetil)-4-keto glutarične kiseline. U prikazane kompozicije spadaju molekuli nukleinske kiseline, polipeptidi, hemijske structure, i ćelije. Ove metode uključuju i in vitro i in vivo procese, a in vitro metode uključuju i hemijske reakcije

Description

POLIPETIDII PUTEVI BIOSINTEZE

Unakrsna referenca za srodne prijave

Ova prijava traži prvenstvo nad patentnom prijavom SAD 60/374,831 podnetom 23. aprila, 2002.

Oblast tehnike

Ovo otkriće se odnosi na polipeptide i puteve biosinteze koji su korisni za produkciju indol-3-piruvat, 2-hidroksi 2-(indol-3ilmetil)-4-keto glutarične kiseline (MP) i/ili monatina.

Stanje tehnike

Indol piruvat.

Indol-3-piruvat je snažan antioksidant za koji se smatra da se suprotstavlja oksidativnom stresu u tkivima sa visokom koncentracijom kiseonika (Politi/ saradnici " Recent advances in Triptofan Research"(Novija dostignuća u istraživanjima triptofana), urednika G. A. Filippinii saradniciPlenum Press, New York, 1996, str. 291-8). Indol piruvat je i poluproizvod na putu za proizvodnju indol-sirćetne kiseline (IAA), primarnog hormona rasta biljaka auksina (difuzibilni haktor unapređenja rasta). IAA je aktivan u submikrogramskim količinama i širokom spektru fizioloških procesa uključujući apikalnu dominancu, tropizme, elongaciju izdanaka, indukciju deobe kambijalnih ćelija, i začetak korena. Sintetički auksini se koriste u hortikulturi da se indukuje razvoj korena i da se unapredi rasad i razvoj ploda. U visokim koncentracijama sintetički auksini su delotvorni herbicidi protiv širokolisnih vrsta. Prirodni auksini koji se proizvode fermentacijom se mogu smatrati ekološki prihvatljivijim od hemijski proizvedenih herbicida. Prodaja regulatora rasta na svetskom tržišu 1999. godine dostigla je 0,4 milijarde funti (1,4 milijarde američkih dolara).

U neke primere patenata indol sirćetne kiseline i njenih derivata spadaju: SAD Patent br. 5,843,782 Mikropropagacija ružinih sadnica gde se auksin koristi kao podloga za kulturu i SAD 5,952,231 Patent br. Mikropropagacija ružinih sadnica.

Uz upotrebe vezane za biljke, indol sirćetna kiselina je korisna i u farmaceutskim aplikacijama. Na primer, SAD Patent br. 5,173,497 "Metoda pripreme alfa-oksopirolo[2,3-B]indol sirćetnih kiselina i derivata" predlaže upotrebu ovih jedinjenja za lečenje slabljenja pamćenja, kao što je to slučaj kod Alchajmerove bolesti i senilne demencije. Mehanizam koji predlaže SAD Patent br. 5,173,497 jeste da ova jedinjenja inhibiraju polipeptid acetilholinesterazu i povećavaju nivoe acetilholina u mozgu.

Indol-3-karbinol se proizvodi od indol-3-sirćetne kiseline peroksidazom katalizovanom oksidacijom i lako se može konvertovati u diindolilmetan. Za oba ova jedinjenja se smatra da eliminišu toksine i unapređuju produkciju hormona koji su blagotvorni za zdravlje žena.

Derivati triptofana

Hlorisani D-triptofan je identifikovan kao ne-nutritivni zaslađivač, a postoji i sve veći interes da se ispituju i drugi derivati. Monatin je prirodni zaslađivač koji je sastava sličnog amino kiselini triptofan. Može se estrahovati iz kore korena južnoafričkog grmlja,Sclerochiton ilicifolius,i smatra se daje supstanca od koje se mnogo očekuje u industriji hrane i pića jer je veoma intenzivan zaslađivač. U neke primere patenata monatina spadaju: SAD Patent br. 5994559 Sinteza monatina prirodnog zaslađivača velikog intenziteta, SAD Patent br. 4975298 3-(l-amino-l,3-dikarboksi-3-hidroksi-but-4-il)-indol jedinjenja, SAD Patent br. 5128164 Sastav za ljudsku upotrebu koji sadrži 3-(l-amino-l,3-dikarboksi-3-hidroksi-but-4-il)-indol jedinjenja; i SAD Patent br. 5128482 Proces za produkciju 3-l(l-amino-l,3-dikarboksi-3-hidroksi-but-4-il) indola.

Neki od prekursora monatina koji su ovde opisani mogu biti korisni i kao sintetički zaslađivači ili kao međuproizvodi u sintezi derivata monatina.

REZIME

U ovom otkriću daje se nekoliko puteva biosinteze za proizvodnju monatina od glukoze, triptofana, indol-3-mlečne kiseline, i/ili preko monatinskih prekursora kao što su indol-3-piruvat i 2-hidroksi 2-(indol-3-ilmetil)-4-keto glutarična kiselina. Ovde se otkrivaju polipeptidi i sekvence nukleinskih kiselina koji se mogu koristiti da se dobije monatin, indol-3-piruvat, i 2-hidroksi 2-(indol-3-ilmetil)-4-keto glutarična kiselina.

Monatin se može proizvesti koristeći indol-3-piruvat, 2-hidroksi 2-(indol-3-ilmetil)-4-keto glutarična kiselina (prekursor monatina, MP, alfa-keto forma monatin), indol-3-mlečna kiselina, triptofan, i/ili glukoza (SLIKA I). Metode za proizvodnju ili pravljenje monatina ili njegovih međuproizvoda pokazane su na SLIKAMA 1-3 i 11-13 koje uključuju konverziju supstrata u prvi proizvod, a zatim konverziju prvog proizvoda u drugi proizvod, i tako dalje, sve dok se ne dobije željeni krajnji proizvod koji se onda otkriva.

SLIKE 1-3 i 11-13 pokazuju potencijalne međuproizvode i krajnje proizvode u kućicama. Na primer, konverzija jednog proizvoda uz drugi, kao što je glukoza u triptofan, triptofan u indol-3-piruvat, indol-3-piruvat u MP, MP u monatin, ili indol-3-mlečna kiselina (indol-laktat) u indol-3-piruvat, može se obaviti korišćenjem ovih metoda. Ove konverzije se mogu olakšati hemijski ili biološki. Izraz "konverzija" odnosi se na bilo korišćenje hemijskih sredstava ili polipeptida u reakciji koja prvo menja prvi međuproizvod u drugi međuproizvod. Izraz "hemijska konverzija" odnosi se na reakcije koje se aktivno ne olakšavaju polipeptidima. Izraz "biološka konverzija" odnosi se na reakcije koje se aktivno olakšavaju polipeptidima. Konverzije mogu da se odigravajuin vivoiliin vitro.Kada se koriste biološke konverzije polipeptidi i/ili ćelije mogu da se imobilizuju na podlozi kao što je hemijski dodatak na polimernim podlogama. Ovakva konverzija može da se postigne korišćenjem ma kog reaktora poznatog stručnjacima za ovu oblast, na primer u seriji ili u kontinuiranom reaktoru.

Date su i metode koje uključuju kontakt prvog polipeptida sa supstratom i pravljenje prvog proizvoda, a zatim kontakt sa prvim proizvodom koji stvara drugi polipeptid i stvaranje drugog proizvoda, a zatim, kontakt sa drugim proizvodom koji se stvara sa trećim polipeptidom i stvara treći proizvod, na primer monatin. Polipeptidi koji se koriste i proizvodi koji se proizvode prikazani su na Slikama 1-3 i 11-13.

Ovde se otkrivaju polipeptidi, i njihove sekvence kodiranja, koje mogu da se koriste da se obave konverzije prikazane na Slikama 1-3 i 11-13. U nekim primerima, polipeptidi sa jednom ili više tačaka mutacije koje omogućavaju specifičnost i/ili aktivnost supstrata polipeptida koje treba modifikovati, koriste se za dobijanje monatina.

Otkrivaju se izolovane i rekombinantne ćelije koje proizvode monatin. Ove ćelije mogu biti ma koje ćelije, kao što su biljne, životinjske, bakterijske, kvasne, algine, arhealne ili fungalne ćelije.

U jednom specifičnom primeru, u otkrivene ćelije spadaju i jedna ili više od sledećih aktivnosti: triptofan aminotransferaza (EC 2.6.1.27), tirozin (aromatični) aminotransferaza (EC 2.6.1.5), multipli supstrat aminotransferaza (EC 2.6.1.-), aspartat aminotransferaza (EC 2.6.1.1), triptofan dehidrogenaza (EC 1.4.1.19), triptofan-fenilpiruvat transaminaza (EC 2.6.1.28), L-amino kiselinska oksidaza (EC 1.4.3.2), triptofan oksidaza (nema EC broja, Hadar/ saradnici, J. Bacteriol125:1096-1104, 1976 i Furuvai saradnici, Biosci Biotechnol Biochem64:1486-93, 2000), D-amino kiselinska dehidrogenaza (EC 1.4.99.1), D-amino kiselinska oksidaza (EC 1.4.3.3), D-alanin aminotransferaza (EC 2.6.1.21), sintaza/liaza (EC 4.1.3.-), kao što je 4-hidroksi-4-metil-2-oksoglutarat aldolaza (EC 4.1.3.17) ili 4-hidroksi-2-oksoglutarat aldolaza (EC 4.1.3.16), sintaza/liaza (4.1.2.-), D-triptofan aminotransferaza (Kohiba i Mito, Zbornik radova sa osmog međunarodnog simpozijuma o vitaminu B6i karbonilnim katalizatorima, Osaka, Japan 1990), fenilalanin dehidrogenaza (EC 1.4.1.20) i/ili glutamate dehidrogenaza (EC 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4).

U jednom drugom primeru, ćelije uključuju jednu ili više, na primer dve ili više, ili tri ili više od sledećih aktivnosti: indollaktat dehidrogenaza (EC 1.1.1.110), R-4-hidroksifenillaktat dehidrogenaza (EC 1.1.1.222), 3-(4)-hidroksifenilpiruvat reduktaza (EC 1.1.1.237), laktat dehidrogenaza (EC 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3), (3-imidazol-5-il) laktat dehidrogenaza (EC 1.1.1.111), laktat oksidaza (EC 1.1.3.-), sintaza/liaza (4.1.3.-) kao što je 4-hidroksi-4-metil-2-oksoglutarat aldolaza (EC 4.1.3.17) ili 4-hidroksi-2-oksoglutarat aldolaza (EC 4.1.3.16), sintaza/liaza (4.1.2.-), triptofan dehidrogenaza (EC 1.4.1.19), triptofan-fenilpiruvat transaminaza (EC 2.6.1.28), triptofan aminotransferaza (EC 2.6.1.27), tirozin (aromatični) aminotransferaza (EC 2.6.1.5), multipli supstrat aminotransferaza (EC 2.6.1.-), aspartat aminotransferaza (EC 2.6.1.1), fenilalanin dehidrogenaza (EC 1.4.1.20), glutamat dehidrogenaza (EC 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4 ), D-amino kiselinska dehidrogenaza (EC 1.4.99.1), D-triptofan aminotransferaza, i/ili D-alanin aminotransferaza (EC 2.6.1.21).

Uz to, otkrivene ćelije mogu da uključuju jednu ili više od sledećih aktivnosti, na primer dve ili više, ili tri ili više od sledećih aktivnosti: triptofan aminotransferazu (EC 2.6.1.27), tirozin (aromatični) aminotransferaza (EC 2.6.1.5), multipli supstrat aminotransferazu (EC 2.6.1.-), aspartat aminotransferazu (EC 2.6.1.1), triptofan dehidrogenazu (EC 1.4.1.19), triptofan-fenilpiruvat transaminazu (EC 2.6.1.28), L-amino kiselinsku oksidazu (EC 1.4.3.2), triptofan oksidazu (noEC broj), D-amino kiselinsku dehidrogenazu (EC 1.4.99.1), D-amino kiselinsku oksidazu (EC 1.4.3.3), D-alanin aminotransferazu (EC 2.6.1.21), indollaktat dehidrogenazu (EC 1.1.1.110), R-4-hidroksifenillaktat dehidrogenazu (EC 1.1.1.222), 3-(4)-hidroksifenilpiruvat reduktazu (EC 1.1.1.237), laktat dehidrogenazu (EC 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3), (3-imidazol-5-il) laktat dehidrogenazu (EC 1.1.1.111), laktat oksidazu (EC 1.1.3.-), sintaza/liazu (4.1.3.-) kao što je 4-hidroksi-4-metil-2-oksoglutarat aldolaza (EC 4.1.3.17) ili 4-hidroksi-2-oksoglutarat aldolaza (EC 4.1.3.16), sintaza/liaza (4.1.2.-), glutamat dehidrogenaza (EC 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4), fenilalanin dehidrogenaza (EC 1.4.1.20), i/ili D-triptofan aminotransferaza.

Monatin može da se proizvodi metodom koja uključuje triptofan i/ili indol-3-mlečnu kiselinu sa prvim polipeptidom, naznačeno time da prvi polipeptid konvertuje triptofan i/ili indol-3-mlečnu kiselinu u indol-3-piruvat (bilo D ili L forma triptofana ili indol-3-mlečne kiseline može da se koristi kao supstrat koji se konvertuje u indol-3-piruvat; stručnjak za ovu oblast će razumeti da polipeptidi koji su odabrani za ovaj korak idealno manifcstuju odgovarjuću specifičnost), stupa u kontakt sa rezultujućim indol-3-piruvatom sa drugim polipeptidom, dok ovaj drugi polipeptid konvertuje indol-3-piruvat u 2-hidroksi 2-(indol-3-ilmetil)-4-keto glutaričnu kiselinu (MP), i povezuje MP sa trećim polipeptidom, dok treći polipeptid konvertuje MP u monatin. U primere polipeptida koji se mogu koristiti za ove konverzije spadaju oni prikazani na Slikama 2 i 3.

Drugi aspekt ovog pronalaska daje sastave kao što su MP, ćelije koje sadrže najmanje dva polipeptida, ili ponekad najmanje tri ili najmanje četiri polipeptida, koji su enkodirani na najmanje jednoj egzogenoj sekvenci nukleinske kiseline.

Ovi i drugi aspekti pronalaska sasvim su očigledni iz sledećeg detaljnog opisa i ilustrativnih primera.

KRATAK OPIS SLIKA

SLIKA 1pokazuje puteve biosinteze koji se koriste da se proizvede monatin i/ili indol-3-piruvat. Jedan put proizvodi indol-3-piruvat preko triptofana, dok drugi prizvodi indol-3-piruvat preko indol-3-mlečne kiseline. Monatin se potom proizvodi preko 2-hidroksi 2-(indol-3ilmetil)-4-keto glutarične kiseline (MP) kao međuproizvoda.

Jedinjenja prikazana u kućicama su supstrati i proizvodi dobijeni preko puteva biosinteze.

Sastavi koji su u blizini strelica su ko- faktori ili reaktanti koji se mogu koristiti tokom konverzije supstrata u proizvod. Koji će se ko-faktor ili reaktant koristiti zavisi od toga koji se polipeptid koristi za određeni korak na putu biosinteze. Ko-faktor PLP (piridoksal 5' - fosfat) može da katalizuje reakcije nezavisno od polipeptida, pa prema tome, samo obezbeđivanje PLP može da omogući progresiju od supstrata do proizvoda.

SLIKA 2je detaljniji prikaz puta biosinteze koji koristi MP međuproizvod. Supstrati za svaki korak na putevima prikazani su u kućicama. Polipeptidi koji omogućavaju konverziju između supstrata navedeni su uz strelice između supstrata. Svaki polipeptid je opisan svojim uobičajenim imenom i brojem enzimske klase (EC).

SLIKA 3daje detaljniji prikaz puta biosinteze konverzije indol-3-mlečne kiseline u indol-3-piruvat. Ovi supstrati su prikazani u kućicama, a polipeptidi koji omogućavaju konverziju između supstrata navedeni su uz strelicu između supstrata. Svaki polipeptid je opisan svojim uobičajenim imenom i brojem enzimske klase (EC).

SLIKA 4pokazuje jednu mogući reakciju za pravljenje MP preko hemijskih sredstava.

SLIKE 5A i 5Bsu hromatogrami koji pokazuju LC/MS identifikaciju monatina proizvednog enzimski.

SLIKA 6 je jedanelektrosprej maseni spektar enzimski sintetizovanog monatina.

SLIKE 7A i 7Bpokazuju hromatograme LC/MS/MS jonske analize ćerke monatina proizvedenog u enzimskoj mešavini.

SLIKA 8 jehromatogram koji pokazuje visoko rezolucijsko merenje mase monatina proizvedenog enzimski.

SLIKE 9A-9Csu hromatogrami koji pokazuju hiralnu separaciju (A) R-triptofana, (B) S-triptofana, i (C) monatina proizvedenog enzimski.

SLIKA 10je grafikon sa stubićima koji pokazuje relativnu količinu monatina proizvedenog u bakterijskim ćelijama po indukciji IPTG. Znak (-) pokazuje otsustvo dodavanja supstrata (nisu dodati ni triptofan, ni piruvat).

SLIKE 11-12su šematski dijagrami koji pokazuju puteve koji se koriste da se pojača prinos monatina koji se dobija od triptofana ili indol-3-piruvata.

SLIKA 13je šematski dijagram koji pokazuju puteve koji se mogu koristiti da se pojača prinos monatina koji se dobija od triptofana ili indol-3-piruvata.

LISTE SEKVENCI

Nukleinske i amino kiselinske sekvence koje su navedene u pratećoj listi sekvenci pokazane su korišćenjem standardnih slovnih skraćenica za nukleotidne baze, i troslovne šifre za amino kiseline. Prikazana je samo jedna traka sekvence nukleinske kiseline, ali se podrazumeva daje komplementarna traka uključena samim pozivanjem na prikazanu traku.

SEQ ID NOS:1 i 2 pokazuju sekvence nukleinskih kiselina odnosno amino kiselina aminotransferaze izSinorhizobium meliloti, ( tatAgen, se u literaturi naziva tirozin ili aromatična aminotransferaza).

SEQ ID NOS:3 i 4 pokazuju sekvence nukleinskih kiselina odnosno amino kiselina tirozin aminotransferaze izRhodobacter sphaeroides(2.4.1), (homologijom satatA(SEQ ID NOS: 1 i 2) za koji genomski softver predviđa daje "aspartat aminotransferaza".

SEQIDNOS:5 i 6 pokazuju sekvence nukleinskih kiselina odnosno amino kiselina aminotransferaze izRhodobacter sphaeroides(35053), (nova, klonirana bazirana na 2.4.1 sekvenci SEQ ID NOS 3 i 4).

SEQIDNOS:7 i 8 pokazuju sekvence nukleinskih kiselina odnosno amino kiselina širokog supstrata aminotransferaze( bsat)izLeishmania major.

SEQIDNOS:9 i 10 pokazuju sekvence nukleinskih kiselina odnosno amino kiselina aromatične aminotransferaze( araT)izBacillus subtilis.

SEQID NOS: 11 i 12 pokazuju nove sekvence nukleinske kiseline odnosno amino kiseline jedne aromatične aminotransferaze( araT) iz Lactobacillus amilovorus(homologijom identifikovane kao aromatična aminotransferaza).

SEQIDNOS:13 i 14 pokazuju sekvence nukleinskih kiselina odnosno amino kiselina multipli supstrat aminotransferaze( msa)izR. sphaeroides(35053) (identifikovane kao multipli supstrat aminotransferaza homologijom sa Pristupnim brojem: AAAE01000093.1, bp 14743-16155 i Pristupnim brojem: ZPO00O5082.1).

SEQID NOS: 15 i 16 pokazuju prajmere koji se koriste da seklonirah, subtilissekvenca D-alanin aminotransferaza( dat).

SEQID NOS: 17 i 18 pokazuju prajmere koji se koriste da se klonira.?,melilotisekvenca

tatA.

SEQIDNOS:19 i 20 pokazuju prajmere koji se koriste da seklonira B. subtilissekvenca aminotransferazearaT.

SEQIDNOS:21 i 22 pokazuju prajmere koji se koriste da se klonirajuRhodobacter sphaeroides(2.4.1 i 35053) sekvence multiple supstrat aminotransferaze.

SEQIDNOS:23 i 24 pokazuju prajmere koji se koriste da se kloniraLeishmania majorsekvencabsat.

SEQ ID NOS: 25 i 26 pokazuju prajmere koji sc koriste da sc kloniraLactobacillus amilovorussekvencaaraT .

SEQID NOS: 27 i 28 pokazuju prajmere koji se koriste da se klonirajuR. sphaeroidessekvence (i 2.4.1 i 35053)tatA.

SEQIDNOS:29 i30pokazuju prajmere koji se koriste da se kloniraE. colisekvencaaspC(genska sekvenca Genbank Pristupni br.: AE000195.1, proteinska sekvenca Genbank Pristupni br.:AAC74014.1).

SEQIDNOS:31 i 32 pokazuju sekvence nukleinskih kiselina odnosno amino kiselina aromatične aminotransferaze( tyrB)izE. coli.

SEQIDNOS: 33i34pokazuju prajmere koji se koriste da se kloniraE. colisekvencatyrB.

SEQ ID NOS: 35-40pokazuje prajmere koji se koriste da kloniraju polipeptide sa 4-hidroksi-2-oksoglutarat aldolaza (KHG) (EC 4.1.3.16) aktivnošću.

SEQID NOS: 41 i 42 pokazuju sekvence nukleinskih kiselina triptofanaze( tna)izE. colii tirozin fenol-liaza( tpl)izCitrobacterfreundii,koje kodiraju za proteine P00913 (GI:401195) odnosno P31013 (GI:401201).

SEQIDNOS:43 - 46 pokazuje prajmere koji se koriste da kloniraju triptofanaze polipeptide i p-tirozinaza (tirozin fenol-liaza) polipeptide.

SEQ ID NOS:47 - 54 pokazuje prajmere koji se koriste da mutiraju triptofanaza polipeptide i p-tirozinaza polipeptide.

SEQ ID NOS:55-64 pokazuje prajmere koji se koriste da kloniraju polipeptide sa 4-hidroksi-4-metil-2-oksoglutarat aldolaza (EC 4.1.3.17) aktivnošću.

SEQ ID NOS:65i 66pokazuju sekvence nukleinskih kiselina odnosno amino kiselina 4-hidroksi-4-metil-2-oksoglutarat aldolaza( proA)izC. testosteroni.

SEQID NOS:67-68 pokazuje prajmere koji se koriste da klonirajuC. testosteroni 4-hidroksi-4-metil-2-oksoglutarat aldolazu( proA)u jednom operonu saE. coli aspCu pET30 Xa/LIC.

SEQ IDNOS: 69-72 pokazuje prajmere koji se koriste da klonirajuE. coli aspCi C.testosteroni proAu pESC-his.

SEQIDNOS: 73-74 pokazuje sekvence koji se dodaju na terminus 5' prajmera koji se koriste da se kloniraju geni koji se ovde otkrivaju.

DETALJNI OPIS NEKOLIKO OBLIKA

Skraćenice i izrazi

Sledeća objašnjenja izraza i metoda se ovde daju da bi se bolje opisao ovaj prikazani

pronalazak, i da bi usmerili stručnjake za ovu oblast kako se u praksi primenjuje ovaj pronalazak. U smislu u kome se ovde koristi reč "obuhvatajući" znači "uključujući" i reči koje se koriste u jednini (engleski neodređeni i određeni član) uključuje i poziv na istu reč u množini, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije. Na primer, pozivanje na "uključujući i protein" uključuje i jedan protein ili više njih, kao i pozivanje na slcdcće: "uključujući ćeliju" obuhvata pozivanje na jednu ćeliju ili više njih, odnosno ekvivalente koji su poznati stručnjacima za ovu oblast, i tako dalje.

Osim ako nije drugačije objašnjeno, svi tehnički i naučni izrazi koji se ovde koriste imaju isto značenje koje im se obično pripisuje od strane stručnjaka za ovu oblast kojima je ovaj pronalazak i namenjen. Iako metode i materijali slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisano mogu da se koriste u praksi ili testiranju ovog pronalaska, mi smo dole opisali odgovarajuće metode i materijale. Ove metode i materijali, kao i primeri su samo ilutrativne prirode i ni na koji način ne ograničavaju sam pronalazak. Ostale osobine i prednosti samog otkrića su očigledni iz sledećg detaljnog opisa i zahteva.

cDNK (komplementarna DNK):Dco DNK koji nema unutrašnje, ne-kodirajuće segmente (introne) i regulatorne sekvence koje određuju transkripcijun. cDNK može da se sintetizuje u laboratoriji reverznom transkripcijom od glasničke RNK ekstrahovane iz ćelija.

Konzervativna supstitucija:Supstitucije jedne ili više amino kiselina (na primer 2, 5, ili 10 reziduuma) ta amino kiselinske reziduume koji imaju slična/ista biohemijska svojstva. Tipično, konzervativne supstitucije imaju neznatnog ili nikakvog dejstva na aktivnost rezultujućeg polipeptida. Na primer, idealno, polipeptid triptofan aminotransferaza uključujući jednu ili više konzervativnih supstitucija zadržava aktivnost triptofan aminotransferaze. Jedan polipeptid može da se proizvede tako da sadrži jednu ili više konzervativnih supstitucija manipulacijom nukleotidne sekvenca koja enkodira taj polipeptid koristeći, na primer, standardne procedure kao što su mutagenza usmerena na lokaciju ili PCR.

Supstitucione varijante su one u kojimaje najmanje jedan reziduum u sekvenci amino kiseline uklonjen i na njegovo mesto insertovan drugi reziduum (ostatak). U primere amino kiselina koje se mogu supstituisati za originalnu amino kiselinu u proteinu i koje se smatraju konzervativnim supstitucijama spadaju: Ala supstituisana sa ser ili thr; arg supstituisana sa gln, his, ili lys; asn supstituisana sa glu, gln, lys, his, asp; asp supstituisana sa asn, glu, ili gln; cys supstituisana sa ser ili ala; gln supstituisana sa asn, glu, lys, his, asp, ili arg; glu supstituisana sa asn, gln lys, ili asp; gly supstituisana sa pro; his supstituisana sa asn, lys, gln, arg, tvr; ile supstituisana sa leu, met, val, phe; leu supstituisana sa ile, met, val, phe; lys supstituisana sa asn, glu, gln, his, arg; met supstituisana sa ile, leu, val, phe; phe supstituisana sa trp, tyr, met, ile, ili leu; ser supstituisana sa thr, ala; thr supstituisana sa ser ili ala; trp supstituisana sa phe, tyr; tyr supstituisana sa his, phe, ili trp; i val supstituisana sa met, ile, leu.

Dodatne informacije o konzervativnim supstitucijama mogu se naći i u sledećoj literaturi (između ostalog) ,Ben-Bassat / saradnici, (./ Bacteriol169:751 -7, 1987), O'Regan/' saradnici, ( Gene77:237-51, 1989), Sahin-Toth ;saradnici, ( Protein Sci.3:240-7, 1994),Hochuli; saradnici,(Bio/Technology 6:1321-5, 1988), WO 00/67796 (Curdi saradnici)i u standardnim udžbenicima genetike i molekularne biologije.

Egzogeni:Izraz "egzogeni" kako se ovde koristi sa pozivanjem na nukleinsku kiselinu i određenu ćeliju odnosi se na svaku nukleinsku kiselinu koja ne potiče od te konkretne ćelije onako kako se ona nalazi u prirodi. Prema tome, nukleinska kiselina koja ne nastaje prirodnim putem smatra se egzogenom za ćeliju kada se jednom uvede u tu ćeliju. Nukleinska kiselina koja nastaje prirodno takođe može biti egzogena za neku određenu ćeliju. Na primer, ceo hromozom izolovan iz ćelije osobe X predstavlja egzogenu nukleinsku kiselinu kada se radi o ćeliji osobe Y kada se taj hromozom uvede u ćeliju osobe Y.

Funkcionalno ekvivalentni:Koji ima ekvivalentne funkciju. U kontekstu jednog enzima, funkcionalno ekvivalentni molekuli uključuju različite molekule koji zadržavaju funkciju enzima. Na primer, funkcionalni ekvivalenti se mogu obezbediti alteracijom sekvence u enzimskoj sekvenci, naznačeno time da peptid sa jednom ili više alteracija sekvenci zadržava funkciju neizmenjenog peptida, odnosno zadržava svoju enzimsku aktivnost. U konkretnom primeru, funkcionalni ekvivalent triptofan aminotransferaze zadržava sposobnost da konvertuje triptofan u indol-3-piruvat.

U primere alteracija sekvenci spadaju, ali to nije konačna lista, konzervativne supstitucije, delecije, mutacije, pomeranja okvira, i insercije. U jednom primeru, dati polipeptid vezuje jedno antitelo, a funkcionalni ekvivalent je polipeptid koji vezuje to isto antitelo. Tako jedan funkcionalni ekvivalent uključuje peptide koji imaju istu specifičnost vezivanja kao i polipeptid, i koji se može koristiti kao reagens umesto polipeptida. U jednom primeru funkcionalni ekvivalent uključuje jedan polipeptid naznačeno time da sekvenca vezivanja bude diskontinuirana, naznačeno time da antitelo vezuje linearni epitop. Prema tome, ako je peptidna sekvenca MPELANDLGL (amino kiseline 1-10 SEQ ID NO: 12) funkcionalni ekvivalent uključuje diskontinuirane epitope, koji mogu da se pojave na sledeći način (<**>=svaki broj interventnih amino kiselina): NH2 -<**.>m<**>P<**>E<**>L<**>A<**>N<**>D<**>L<**>G<**>L-COOH. U ovom primeru, polipeptid je funkcionalno ekvivalentan amino kiselinama 1-10 SEQ ID NO: 12 ako je ova trodimenzinalna struktura ovog polipeptida takva da on može da vezuje monoklonsko antitelo koje vezuje kiseline 1-10 SEQ ID NO: 12.

Hibridizacija:Izraz "hibridizacija" kako se ovde koristi odnosi se na metodu testiranja komplementarnosti nukleotidne sekvence dva molekula nukleinske kiseline na osnovu sposobnosti komplementarne jednostruko upletene DNK i/ili RNK da oformi dupleks molekule. Tehnike hibridizacije nukleinske kiseline mogu da se koriste da se dobije izolovana nukleinska kiselina u okviru koji obuhvata ovaj pronalazak. Ukratko, svaka nukleinska kiselina koja ima određenu homologiju za sekvencu iznetu u SEQ ID NO: 11 može da se koristi kao proba da se identifikuje slična nukleinska kiselina hibridizacijom pod uslovima umerene ili visoke strogosti. Kada se jednom identifikuje, ova nukleinska kiselina onda može da se prečisti, sekvencira, i analizira da se utvrdi da li je obuhvaćena ovim pronalaskom ili ne.

Hibridizacija može da se radi Southern ili Northern analizama da se identifikuje DNK odnosno RNK sekvenca, koja se hibridizuje za probu. Ova proba se onda može obeležiti biotinom, digoksigeninom, nekim polipeptidom, ili radioizotopom kao što je<32>P. DNK ili RNK koje će se analizirati mogu da se elektroforetski separiraju na agaroza ili poliakrilamidnom gelu, prenese na nitrocelulozu, nilon, ili drugu pogodnu membranu, i hibridizuju ovom probom korišćenjem standardnih tehnika dobro poznatim u struci kao što su one opisane u poglavljima 7.39-7.52 Sambrooki saradnici,(1989)Molecular Kloniranje(Molekulsko kloniranje, drugo izdanje), Cold Spring Harbor Laboratorv, Plainvievv, NY. Tipično, proba se sastoji od najmanje oko 20 nukleotida dužine. Na primer, proba koja odgovara kontigioznoj sekvenci od 20 nukleotida kako je navedeno u SEQ ID NO: 11 može da se koristi da se identifikuje identična ili slična nukleinska kiselina. Uz to, mogu se koristiti i probe koje su duže ili kraće od 20 nukleotida.

Ovo otkriće takođe obuhvata i izolovane sekvence nukleinskih kiselina koje su dužina najmanje 12 baza (na pr., najmanje oko 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 100, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, ili 5000 baza dužine) i hibridizuje, pod uslovima hibridizacije, za sens ili antisens traku nukleinske kiseline koja ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 11. Uslovi hibridizacije mogu biti umereno ili veoma strogi.

Za svrhe ovog otkrića, umereno strogi uslovi hibridizacije znače da se hibridizacija obavlja na oko 42°C u rastvoru za hibridizaciju sa sadržajem 25 mM KP04(pH 7.4), 5X SSC, 5X Denhartovog rastvora, 50 ug/mL denaturisane, ultrazvukom tretirane DNK sperme lososa, 50% formamida, 10% Dekstran sulfata, i 1-15 ng/mL probe (oko 5xl0<7>cpm/ug), dok se pranja obavljaju na oko 50°C rastvorom za pranje sa sadržajem 2X SSC i 0.1% natrijum dodecil sulfata.

Veoma strogi uslovi hibridizacije znače da se hibridizacija obavlja na oko 42°C u rastvoru za hibridizaciju sa sadržajem 25 mM KP04(pH 7.4), 5X SSC, 5X Denhartovog rastvora, 50 ug/mL denaturisane, ultrazvukom tretirane DNK sperme lososa, 50% formamida, 10% Dekstran sulfata, i 1-15 ng/mL probe (oko 5xl0<7>cpm/ug), dok se pranja obavljaju na oko 65°C rastvorom za pranje sa sadržajem 0.2X SSC i 0.1% natrijum dodecil sulfata.

Izolovani:Izraz "izolovani" kako se ovde koristi s pozivanjem na nukleinsku kiselinu odnosi se na nukleinsku kiselinu koja nastaje prirodno koja se ne dotiče odmah sa obe sekvence sa kojima je u direktnoj vezi (jedna na tcrminusu 5' a druga na terminusu 3') u prirodno nastalom genomu organizma iz koga je izvedena. Na primer, jedna izolovana nukleinska kiselina može da bude, bez ograničenja, rekombinantni DNK molekuli ma koje dužine, pod uslovom da se jedna od sekvenci nukleinskih kiselina koje se normalno nalaze tako da direktno naležu na bok tog rekombinantnog DNK molekula u prirodno nastalom genomu bude uklonjen ili otsutan. Prema tome, jedna izolovana nukleinska kiselina uključuje, bez ograničenja, rekombinantnu DNK koja postoji kao odvojeni molekul (na pr., cDNK ili genomski DNK fragment koji se proizvodi pomoću PCR ili tretman restrikcije endonukleaze) nezavisno od grugih sekvenci kao i rekombinantnu DNK koja se inkorporiše u vektor, autonomno replicirani plazmid, virus (na pr., retrovirus, adenovirus, ili herpes virus), ili u gcnomsku DNK prokariota ili eukariota. Uz to, izolovana nukleinska kiselina može da uključi i rekombinantni DNK molekul koji je deo hibridne ili fuzione sekvence nukleinske kiseline.

Izraz "izolovani" kako se ovde koristi s pozivanjem na nukleinsku kiselinu uključuje i svaku nukleinsku kiselinu koja ne nastaje prirodno budući da sekvence nukleinskih kiselina koje ne nastaju prirodno se ne nalaze u prirodi i nemaju direktno spajajuće sekvence u genomu koji nastaje prirodno. Na primer, nukleinska kiselina koja ne nastaje prirodno kao sto je nukleinska kiselina proizvedena genetskim inženjeringom smatra se izolovanom nukleinskom kiselinom. Inženjerski proizvedena nukleinska kiselina može da se napravi korišenjem običnog molekulskog kloniranja, ili hemijskim tehnikama sinteze nukleinskih kiselina. Izolovana nukleinska kiselina koja ne nastaje prirodno može biti nezavisna od drugih sekvenci, ili inkorporisana u vektor, autonomono replicirani plazmid, virus (na pr., retrovirus, adenovirus, ili herpes virus), ili genomski DNK prokariota ili eukariota. Uz to, nukleinska kiselina koja ne nastaje prirodno može da uključi molekul nukleinske kiseline koji je deo hibrida ili fuzije sekvence nukleinske kiseline.

Stručnjacima za ovu oblast će biti očigledno da nukleinsku kiselinu koja postoji među stotinama do milionima drugih molekula nukleinske kiseline u, na primer, cDNK ili genomskim bibliotekama ili režnjevima gela sa sadržajem genomskog DNA restrikcionog digesta ne treba smatrati izolovanom nukleinskom kiselinom.

Nukleinska kiselina:Izraz "nukleinska kiselina" kako se ovde koristi obuhvata i RNK i DNK uključujući, bez ograničenja, cDNK, genomsku DNK, i sintetičku (na pr., hemijski sintetizovanu) DNK. Ova nukleinska kiselina može biti jednolančana ili dvolančana. Tamo gde postoje upleteni, nukleinska kiselina može biti u sens traci ili u antisens traci. Uz to, nukleinska kiselina može biti cirkularna ili linearna.

Operabilno povezana:Prva sekvenca nukleinske kiseline je "operabilno povezana" sa drugom sekvencom nukleinske kiseline kad god je prva sekvenca nukleinske kiseline postavljena u funkcionalni odnos sa drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, promoter je operabilno povezan za sekvencu kodiranja ako promoter utiče na transkripciju sekvence kodiranja. Generalno, operabilno povezane DNK sekvence su bliske, i tamo gde je neophodno da se povežu dva regiona polipeptidnog kodiranja, u isti ram za očitavanje.

Peptidne modifikacije:U ovaj pronalazak spadaju i enzimi, kao i njihovi sintetički oblici. Uz to, analozi (ne-peptidni organski molekuli), derivati (hemijski funkcionalnizovani peptidni molekuli dobijeni tako štoi se počinje sa otkrivenom peptidno sekvencom) i varijante (homolozi) koji imaju željenu enzimsku aktivnost mogu da se koriste u gore opisanim metodam. Perptidi koji su ovde opisani uključuju sekvencu amino kiselina, koja može biti bilo L- i/ili D- amino kiseline, koje nastaju prirodno ili na drugi način.

Peptidi se mogu modifikovati različitim hemijskim tehnikama da se proizvedu derivati koji imaju suštinski istu aktivnost aktivnost kao i nemodifikovani peptidi, i opciono imaju druga poželjna svojstva. Na primer, grupe karboksilnih kiselina proteina, bilo karboksil-terminalni ili bočni lanac, može da se obezbedi u obliku soli farmaceutski prihvatljivog katjona ili esterifikovan da se formira C1-C16 ester, ili konvertovan u amid formule NR1R2 naznačeno time da Rl i R2 su svaki nezavisno H ili C1-C16 alkil, ili kombinovani da formiraju jedan heterociklični prsten, kao što je 5- ili 6- člani prsten. Amino grupe peptida, bilo amino-terminalni ili bočni lanac, mogu biti u obliku farmaceutski prihvatljive soli sa dodatkom kiseline, kao što je HC1, HBr, sirćetna, benzoična, toluen sulfonična, maleinska, vinska i druge organske soli, ili može da se modifikuje u C1-C16 alkil ili dialkil amino ili da se dalje konvertuje u amid.

Hidroksilne grupe peptidnih bočnih lanaca mogu da se konvertuju u C1-C16 alkoksi ili u Cl-Cl6 korišćenjem dobro poznatih tehnika. Fenil i fenolni prsten peptidnih bočnih lanaca mogu da budu supstituisani sa jednim ili više halogenih atoma, kao što su F, Cl, Br ili I, ili sa C1-C16 alkil, C1-C16 alkoksi, karboksilnim kiselinama i njihovim estrima, ili amidima takvih karboksilnih kiselina. Metilen grupe peptidnih bočnih lanaca mogu se proširiti na homologne C2-C4 alkilene. Tioli se mogu zaštititi ma kojim od brojnih dobro poznatih protektivnih grupa, kao što su grupe acetamida. Stručnjaci za ovu oblast će prepoznati metode za uvođenje cikličnih struktura u peptide iz ovog pronalaska da odaberu i obezbede konformacijska ograničenja koja dovode do pojačane stabilnosti. Na primer, C- ili N-terminalni cistein se može dodati na peptid, tako da kada se oksidizuje ovaj peptid će sadržati disulfidnu vezu, koja generiše ciklični peptid. Ostale metode za cikliranje peptida uključuju i formiranje tioetera i karboksil- i amino-terminalnih amida i estera.

Peptidomimetički i organomimetički oblici se takođe nalaze u okviru ovog pronalaska, dok trodimenzionalna organizacija hemijskih sastojaka takvih peptido- i organomimetika podražava trodimenzionalnu organizaciju peptidne strukturne osnove i komponente amino kiselinskih bočnih lanaca, što dovodi do takvih peptido- i organomimetica proteina iz ovoig pronalaska koji imaju enzimsku aktivnost koja se može otkriti. Za primenu kompjuterskog modelovanja, farmakofora je jedna idealizovana, trodimenzionalna definicija strukturnih zahteva za biološkom aktivnošću. Peptido- i organomimetici se mogu tako odrediti da odgovarju farmakofori sa tekućim kompjuterskim softverom za modelovanje (korišćenjem kompjuterski asistiranog dizajniranja lekova ili CADD). Vidi kodWalters,'' Computer- Assisted Modeling of Drugs"(Kompjuterski asistirano modelovanje lekova), u Klegerman & Groves (urednici), Pharmaceutical Biotechnologv, 1993, Interpharm Press: Buffalo Grove, IL, str. 165-74 i Ch. 102 u Munson (urednik),Principles of Pharmacology(Principi farmakologije), 1995, Chapman & Hali, za opise i tehnike koje se koriste u CADD. U obim ovog pronalaska uključeni su i mimetici pripremljeni primenom takvih tehnika. U jednom primeru, jedan mimetik podražava enzimsku aktivnost koja se generiše preko enzima ili njegove varijante, fragmenta, ili fuzije.

Probe i prajmeri:Probe i prajmeri nukleinskih kiselina mogu se lako pripremiti na osnovu sekvence amino kiselina i sekvence nukleinskih kiselina koje su ovde date. "Proba" uključuje izolovanu nukleinsku kiselinu sa sadržajem detektabilnog obeleženog ili reporterskog molekula. Kao primere obeležavanja navodimo, pri čemu ovo nije iscrpna lista, radioaktivne izotope, ligande, hemiluminescentne agense i polipeptide. O metodama za obeležavanje i kao vodiču za izbor obleživača koji su primereni različitim namenama govori se u, na primer, Sambrook/' saradnici(ed.),Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Molekulsko kloniranje: laboratorijski priručnik, drugo izdanje), tom 1-3, Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989, i Ausubeli saradnici(ed.)Current Protocols in Molecular Biology(Tekući protokoli u molekularnoj biologiji) , Greene Publishing i Wiley-Interscience, New York (sa periodičnim ažuriranjem), 1987.

"Prajmeri"su tipično molekuli nukleinske kiseline koji imaju deset ili više nukleotida (na pr., molekuli nukleinske kiseline koji imaju između oko 10 nukleotida i oko 100 nukleotida). Jedan prajmer se može anilirati za komplementarni ciljni lanac nukleinske kiseline hibridizacijom nukleinske kiseline da se dobije jedan hibrid između prajmera i ciljnog lanca nukleinske kiseline, a onda se proširi duž ciljnog lanca nukleinske kiseline uz pomoć, na primer, jednog DNK polimeraza polipeptida. Parovi prajmera mogu da se koriste za amplifikaciju sekvence nukleinske kiseline, na primer, pomoću lančane reakcije polimeraza (PCR) ili drugih metoda amplifikacije nukleinske kiseline koje su poznate u struci.

Metode za pripremu i korišćenje proba i prajmera opisane su, na primer, u referentnoj literaturi kao što je Sambrook /saradnici(ed.),Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Molekulsko kloniranje: Laboratorijski priručnik), drugo izdanje, tom 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Ausubel /saradnici(ed.),Current Protocols in Molecular Biology(Tekući protokoli u molekularnoj biologiji), Greene Publishing i Wiley-Interscience, New York (s periodičnim ažuriranjem), 1987; i Innis ;'saradnici(urednici), PCRProtocols: A Guide to Methods and Applications,(Protokoli za PCR: Vodič za metode i primene) Acađemic Press: San Diego, 1990. PCR prajmerski parovi se mogu izvoditi iz poznate sekvence, na primer, korišćenjem kompjuterskih programa predviđenih za te namene, kao što je Prajmer (Verzija 0.5, © 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, Mass.). Stručnjak za ovu oblast će shvatiti da se specifičnost određene probe ili prajmera povećava sa dužinom, ali da proba ili prajmer mogu da se, kada se radi o dužini, kreću od sekvence pune dužine do sekvence kratke kao pet uzastopnih nukleotida. Tako, na primer, jedan prajmer od 20 uzastopnih nukleotida može da anilira za cilj veće specifičnosti od odgovarajućeg prajmera sa samo 15 nukleotida. Prema tome, da bismo dobili veću specifičnost, probe i prajmeri se mogu odabirati tako da obuhvataju, na primer, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750,1800, 1850, 1900, 2000, 2050, 2100, 2150, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2600, 2650, 2700, 2750, 2800, 2850, 2900, 3000, 3050,3100, 3150, 3200, 3250, 3300, 3350, 3400, 3450, 3500, 3550, 3600, 3650, 3700, 3750, 3800, 3850, 3900, 4000, 4050, 4100, 4150, 4200, 4250, 4300, 4350, 4400, 4450, 4500, 4550, 4600, 4650, 4700, 4750, 4800, 4850, 4900, 5000, 5050, 5100, 5150, 5200, 5250, 5300, 5350, 5400, 5450, ili više konsekutivnih nukleotida.

Promoter: Jedan erej kontrone sekvence nukleinske kiseline usmerava transkripciju

nukleinske kiseline. Jedan promoter uključuje neophodne sekvence nukleinskih kiselina uz početno mesto transkripcije, kao što je, u slučaju promotera polimeraza tipa II, jedan TATA element.

Pomoter može da uključi distalni pojačivač ili represorske elemente koji mogu biti locirani čitavih nekoliko hiljada baznih parova od mesta na kome počinje transkripcija.

Prečišćeni: Izraz "prečišćeni" kako se ovde koristi ne iziskuje poptunu čistoću; umesto

toga, ovo je izraz relativnog značenja. Tako, na primer, jedan preparat prečišćenog polipeptida ili nukleinske kiseline može biti i takav da u njemu predmetni polipeptid ili nukleinska kiselina, imaju veću koncentraciju nego što bi taj polipeptid ili nukleinska kiselina imali u svom prirodnom okruženju u jednom organizmu. Na primer, preparat polipeptida može se smatrati prečišćenim ako je sadržaj polipeptida u tom preparatu takav da predstavlja najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 98%, ili 99% ukupnog sadržaja proteina u tom preparatu.

Rekombinantni: Pod "rekombinantnom" nukleinskom kiselinom se podrazumeva ona koja ima (1) sekvencu koja prirodno ne nastaje u tom organizmu u kome je eksprimirana ili (2) sekvenca koja se dobija veštačkom kombinacijom dve, inače odvojene, kraće sekvence. Ova veštačka kombinacija se često postiže hemijskom sintezom, ili još uobičajenije, veštačkom manipulacijom izolovanih segmenata nukleinske kiseline, na pr., tehnikama genetskog inženjeringa.

"Rekombinantni" se koristi i da se opišu molekuli nukleinske kiseline kojima je veštački manipulisano, ali koji sadrže regulatorne sekvence i regione kodiranja koji se nalaze u organizmu iz koga je ta nukleinska kiselina bila izolovana.

Identičnost sekvence: Sličnost između amino kiselinsih sekvenci izražava se u vidu sličnosti između tih sekvenci, što se inače naziva identičnost sekvence. Identičnost sekvence se često meri kao procenat identičnosti (ili slučnosti ili homologije); što je ovaj procenat veći, te sve sekvence su sličnije. Homolozi ili varijante peptida, kao što je SEQ ID NO: 12, poseduju relativno visoki stepen identičnosti sekvence kada se uporede korišćenjem standardnih metoda.

Metode stavljanja sekvenci jedna pored druge za poređenje dobro su poznate u struci. Različiti programi i algoritmi za ovo poređenje opisani su u: Smith i Waterman,Adv. Appl. Math.2:482, 1981; Needleman i Wunsch,J. Mol. Biol.48:443-53, 1970; Pearson i Lipman,Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.85:2444-8, 1988; Higgins i Sharp,Gene73:237-44, 1988; Higgins i Sharp,CABIOS 5:151-3,1989; Corpet i saradnici,Nucleic Kiselina Research16:10881-90, 1988; iAltschul saradnici, Nature Genet.6:119-29, 1994.

Softver NCBIBasic Local Alignment Search Tool (BLAST™)(Altschuli saradnici, J. Mol. Biol.215:403-10, 1990) se može dobiti iz nekoliko izvora, uključujući i Nacionalni centar za biotehnološku informatiku (NCBI, Betezda, MD) i na Internetu, za korišćenje u vezi sa programima za analizu sekvenci blastp, blastn, blastx, tblastn i tblastx.

Varijante peptida se tipično odlikuju posedovanjem najmanje 50% identičnosti sekvence što

se računa po celoj dužini redosleda sa sekvencom amino kiselina korišćenjem programa NCBI Blast 2.0, što je modifikovani blastp podešen za parametre po difoltu. Za poređenje sekvenci amino kiselina koje su duže od oko 30 amino kiselina, koristi se Blast 2 funkcija sekvence korišćenjem difolta BLOSUM62 matriks podešen za parametre po difoltu,( gap existence cost of U, i a per residue gap cost of 1).Kada se porede kraći peptidi( manje od oko 30 amino kiselina),poređenje se obavlja korišćenjem Blast 2 funkcije sekvence, odnosno primenom PAM30 matrice postavljene na prethodno utvrđene parametre( open gap 9, extension gap l penalties).Proteini još veće sličnosti sa referentnim sekvencama pokazaće sve veći procenat identičnosti kaa se procenjuju ovom metodom,

kao što su najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili čak najmanje 99% identičnosti sekvence. Kada se poredi manje od cele sekvence za identičnost sekvence, homolozi i varijante će tipično posedovati najmanje 80% identičnosti sekvence u malom prozoru od 10-20

amino kiselina, i mogu posedovati identičnosti sekvence od najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili 98% zavisno od njihove sličnosti sa referentnom sekvencom. Metode za određivanje identičnosti sekvence u tako uskom prozoru opisane su na vebsajtu koji održava Nacionalni centar za biotehnološku informatiju u Betezdi, Meriland. Stručnjak za ovu oblast će znati da se ovi rasponi identičnosti sekvence samo kao smernice; sasvim je moguće da snažno slični homolozi mogu da se dobiju i izvan rapsona koji se ovako dobija.

Slične metode mogu da se koriste i da se odredi procenat identičnosti sekvence jedne sekvence nukleinske kiseline. U konkretnom primeru, homologna sekvenca se alignira za nativnu sekvencu, a broj podudaranja se određuje brojanjem broja položaja na kojima su u ovim sekvencama prisutni identični ostaci nukleotida ili amino kiselina. Procenat identičnosti sekvence se određuje deljenjem broja preklapanja bilo dužinom sekvence iznetom u identifikovanoj sekvenci (na pr., SEQ

ID NO: 11), ili artikulisanom dužinom (na pr., 100 uzastopnih nukleotida ili amino kiselinskih reziduuma iz sekvence iznete u identifikovanoj sekvenci), posle čega se dobijena vrednost množi sa 100. Na primer, jedna sekvenca nukleinske kiseline koja ima 1166 poklapanja kada se alignira sa sekvencom iznetom u SEQ ID NO: 11 je 75.0 procenata identična sa sekvencom iznetom u SEQ ID NO: 11 (t.j., 1166-^1554<*>100=75.0). Primećuje se daje vrednost procenta identičnosti sekvence zaokružena na najbližu deseticu. Na primer, 75.11, 75.12, 75.13, i 75.14 se zaokružuje na 75.1, dok se 75.15, 75.16, 75.17, 75.18, i 75.19 zaokružuju na 75.2. Primećuje se da će i vrednost dužine uvek biti ceo broj. U jednom drugom primeru, ciljna sekvenca sa sadržajem regiona od 20-nukleotida koji aligniraju sa 20 uzastopnih nukleotida iz identifikovane sekvence kako sledi sadrži jedan region koji deli 75 procenata identičnosti sekvence sa identifkovanom sekvencom (t.j., 15-^20*100=75).

Specifični agens za vezivanje:Jedan agens koji je sposoban da se specifično vezuje za ma koji od polipeptida koji su ovde opisani. Ovde dajemo sledeće primere (a ima ih daleko više): poliklonska antitela, monoklonska antitela, (uključujući humanizovana monoklonska antitela), i fragmenti monoklonskih antitela kao što su Fab, F(ab')2, i Fv fragmenti, kao i svi drugi agensi sposobni za specifično vezivanje za epitope takvih polipeptida.

Antitela na polipeptide koja su ovde data (ili fragmenti, varijante, ili fuzije istih) mogu se koristiti da prečiste ili identifikuju ovakve polipeptide. Amino kiselina i sekvence nukleinskih kiselina koji su ovde dati omogućavaju produkciju specifičnih agenasa za vezivanje koji su bazirani na antitelu koji prepoznaju polipeptide koji su ovde opisani.

Monoklonska ili poliklonska antitela mogu da se produkuju za polipeptide, delove polipeptida, ili njihove varijante. Optimalno, antitela koja se razvijaju protiv jednog ili više epitopa na polipeptidnom antigenu će specifično detektovati taj polipeptid. Odnosno, antitela razvijena protiv jednog specifičnog polipeptida bi prepoznala i vezala taj određeni polipeptid, i ne bi supstancijalno prepoznavala, niti vezivala druge polipeptide. Određivanje da se jedno antitelo specifično vezuje za jedan određeni polipeptid obavlja se jednom od većeg broja standardnih metoda imunoeseja; na primer,tVestern blot(Vidi, na pr., Sambrook/'saradnici(ed.),Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Molekulskokloniranje: Laboratorijski priručnik), drugo izdanje, tom. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).

Da se odredi da jedan specifičan preparat antitela (kao što je preparat proizveden kod miša protiv polipeptida koji ima amino kiselinsku sekvencu iznetu pod SEQ ID NO: 12) specifično detektuje odgovarajući polipeptid (na pr., polipeptid koji ima amino kiselinsku sekvencu iznetu pod SEQ ID NO: 12) pomoću metode Western blot, ukupni ćelijski protein može da se ekstrahuje iz ćelija i separira pomoću SDS-poliakrilamid gel elektroforeze.

Separirani ukupni ćelijski proteini onda mogu da se prenesu na membranu (na pr., nitroceluloznu), i preparat antitela se inkubira sa membranom. Posle pranja membrane da se uklone nespecifično vezana antitela, prisustvo specifično vezanih antitela može da se detektuje korišćenjem sekundarnog antitela (na pr., anti-mišjeg antitela) koje se konjuguje za polipeptid kao što je alkalna fosfataza jer aplikacija 5-bromo-4-hloro-3-indolil fosfat/nitro plavog tetrazolijuma dovodi do produkcije gustog plavo obojenog jedinjenja sa imuno-lokalizovanom alkalnom fosfatazom.

Supstancijalno čisti polipeptidi koji supogodni za upotrebu kao imunogen mogu da se dobiju iz transfektovanih ćelija, transformisanih ćelija, ili ćelija divljeg tipa. Polipeptidne koncentracije u finalnom preparatu mogu da se podese, na primer, koncentracijom na Amicon filter napravi, na nivou od nekoliko mikrograma na mililitar. Uz to, polipeptidi koji se po veličini kreću od polipeptida pune dužine do polipeptida koji imaju samo devet amino kiselinskih ostataka mogu se koristiti kao imunogeni. Takvi polipeptidi mogu se proizvoditi u ćelijskoj kulturi, mogu se hemijski sintetizovati korišćenjem standardnih metoda, ili mogu se dobiti cepanjem velikih polipeptida na manje polipeptide koji se mogu prečišćavati. Polipeptidi koji imaju samo devet amino kiselinskih ostataka u dužini mogu biti imunogeni kada se pojave u imunom sistemu u kontekstu molekula velikog kompleksa histokompatibilnosti Complex (MHC) kao što su molekuli klase I MHC ili klase II MHC. Prema tome, polipeptidi koji imaju najmanje 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350,400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 900,1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, ili više uzastopnih amino kiselinskih reziduuma amino kiselinske sekvence koja se ovde otkriva mogu da se koriste kao imunogeni za produkciju antitela.

Monoklonska antitela na ma koji od polipeptida koji se ovde otkrivaju mogu da se pripreme od mišjih hibridoma u skladu sa klasičnom metodom Kohler & Milstein (Nature 256:495-7, 1975) ili metodama izvedenim iz nje.

Poliklonski antiserum sa sadržajem antitela na heterogene epitope ma kog polipeptida koji je ovde prikazan može da se pripremi imunizacijom odgovarajućih životinja polipeptidom (ili njegovim fragmentom), a može biti nemodifikovan ili modifikovan da se pojača imunogenost. Jedan delotvoran protokol za imunizaciju zečeva može se naći u Vaitukaitis/ saradnici ( J. Clin. Endocrinol. Metab.33:988-91,1971).

Fragmenti antitela mogu se koristiti umesto celih antitela i i lako se mogu eksprimirati u prokariotskim ćelijama domaćina. Metode pravljenja i korišćenja imunologški delotvornih delova monoklonskih antitela, koji se nazivaju i "fragmenti antitela," dobro su poznate i uključuju one koje su opisane kod Better & Horovvitz (Methods Enzvmol. 178:476-96,1989), Glockshuberi saradnici ( Biochemistry29:1362-7,1990), U.S. Pat. No. 5,648,237 ("Ekspresija funkcionalnih fragmenata antitela"), U.S. Pat. No. 4,946,778 ("Molekuli koji se vezuju za jedan polipetidni lanac" -), U.S. Pat. No. 5,455,030 ("Imunoterapija korišćenjem molekula koji se vezuju za jedan polipetidni lanac"), i reference koje su tu citirane.

Transformisan: Jedna "transformisana" ćelija jeste ona ćelija u koju su uvedeni molekuli nukleinske kiseline, na primer, pomoću tehnika molekularne biologije. Transformacija obuhvata sve tehnike kojima molekuli nukleinske kiseline mogu da se uvedu u takvu ćeliju uključujući, ali bez ograničavanja, transfekciju virusnim vektorom, konjugaciju, transformaciju plazmidnim vektorom, i i uvođenje gole DNK elektroporacijom, lipofekcijom, i "pištoljem" za ubrzavanje čestica.

Varijante, fragmenti ili fuzioni proteini: Otkriveni proteini, uključuju varijante, fragmente, i njihove fuzije. DNK sekvence (na primer SEQ ID NO: 11) koje enkodiraju za protein (na primer SEQ ID NO: 12), fuzioni protein, ili fragment ili variantu proteina, mogu se inženjerski manipulisati da se omogući da se protein eksprimira u eukariotskim ćelijama, bakterijama, insektima, i/ili biljkama. Da se obezbedi ekspresija, DNK sekvenca se može izmeniti i operabilno povezati sa drugim regulatornim sekvencama. Finalni proizvod, koji sadrži regulatorne sekvence i taj protein, naziva se vektor. Ovaj vektor se može uvoditi u eukariotske, bakterijske, insektne, i/ili biljne ćelije. Kada se jednom nađe u ćeliji ovaj vektor omogućuje da se proizvodi protein.

Jedan fuzioni protein uključujući i protein, kao što je triptofan aminotransferaza (ili njegova varijanta, polimorfizam, mutant, ili fragment), na primer SEQ ID NO: 12, povezan za druge amino kiselinske sekvence koje ne inhibiraju željenu aktivnost proteina, na primer sposobnost da konvertuje triptofan u indol-3-piruvat. U jednom primeru, druge amino kiselinske sekvence nisu veće dužine od oko 10, 12, 15, 20, 25, 30, ili 50 amino kiselina.

Stručnjak za ovu oblast će znati da sekvenca DNK može da se izmeni na brojne načine, a da pri tome ne utiče na biološku aktivnost enkodiranog proteina. Na primer, PCR može da se koristi da proizvede varijacije u sekvenci DNK koja enkodira protein. Ovakve varijante mogu biti varijante optimmalizovane za preferencu kodona u ćeliji domaćinu koja se koristi da eksprimira ovaj protein, ili druge promene sekvence koje olakšavbaju ekspresiju.

Vektor: Molekuli nukleinske kiseline onako kako su uvedeni u ćeliju, i na taj način produkuju transformisanu ćeliju. Jedan vektor može da uključi sekvence nukleinskih kiselina koje omogućavaju da se repliciraju u toj ćeliji, kao poreklu replikacije. Vektor može i da uključi jedan ili više selektabilnih markerskih gena i druge genetske elemente poznate u struci.

Prikaz puteva biosinteze

Kao stoje pokazano na SLIKAMA 1-3 i 11-13, mnogi putevi biosinteze mogu se iskoristiti da se produkuje monatin ili njegovi međuproizvodi kao što su indol-3-piruvat ili MP. Za konverziju svakog supstrata (glukoza, triptofan, indol-3-mlečna kiselina, indol-3-piruvat, i MP) u svaki proizvod (triptofan, indol-3-piruvat, MP i monatin) može se iskoristiti nekoliko polipeptida. Staviše, ove reakcije se mogu obavitiin vivo, in vitro,ili ili kombinacijomin vivoreakcije iin vitroreakcije, kao što suin vitroreakcije koje uključuju ne-enzimske hemijskea reakcije. Prema tome, SLIKE 1-3 i 11-13 su ilustrativni primeri, i pokazuju brojne raziličite puteve koji se mogu koristiti da se dobiju željeni proizvodi.

Glukoza u triptofan

Mnogi organizmi mogu da sintetizuju triptofan iz glukoze. Konstrukt(i) sa sadržajem gena neophodni da se produkuje monatin, MP, i/ili indol-3-piruvat iz glukoze i/ili triptofana mogu da se kloniraju u takve organizme. Ovde je pokazano da triptofan može da se konvertuje u monatin.

U drugim primerima, jedan organizam se inženjerski manipuliše korišćenjem poznatih polipeptida da se produkuje triptofan, ili prekomerno produkuje triptofan. Na primer, SAD Patent br. 4,371,614 (ovde uključen samim pozivanjem i citiranjem istoga) opisuje jedan sojE. colitransformisan plazmidom sa sadržajem triptofan operona divljeg tipa.

Maksimalni titri triptofana otkriveni u SAD Patentu br. 4,371,614 su oko 230 ppm. Isto tako, WO 8701130 (ovde uključen samim pozivanjem i citiranjem istoga) opisuje jedan sojE. colikoji je genetskim inženjeringom manipulisan da proizvodi triptofan i diskutije o povećanoj

fermentativnoj produkciji L-triptofana. Stručnjaci za ovu oblast će prepoznati da organizmi koji su u stanju da produkuju triptofan iz glukoze su u stanju i da koriste druge ugljenikove i energetske izvore koji se mogu konvertovati u glukozu ili fruktoza-6-fosfat, sa sličnim rezultatima. Kao primere izvora energije i ugljenika i navodimo, ali ovo nije iscrpna lista, saharozu, fruktozu, škrob, celulozu, ili

glicerol.

Triptofan u indol- 3- piruvat

Nekoliko polipeptida može da se koristi da se konvertuje triptofan u indol-3-piruvat. U primere polipeptida spadaju članovi klase enzima (EC) 2.6.1.27, 1.4.1.19, 1.4.99.1, 2.6.1.28, 1.4.3.2, 1.4.3.3, 2.6.1.5, 2.6.1.-, 2.6.1.1, i 2.6.1.21. Ove klase uključuju polipeptid koji se naziva triptofan aminotransferaza (naziva se i L-fenilalanin-2-oksoglutarat aminotransferaza, triptofan transaminaza, 5-hidroksitriptofan-ketoglutaric transaminaza, hidroksitriptofan aminotransferaza, L-triptofan aminotransferaza, L-triptofan transaminaza, i L-triptofan:2-oksoglutarat aminotransferaza) koji konvertuje L-triptofan i 2-oksoglutarat u indol-3-piruvat i L-glutamat; D-triptofan aminotransferaza koja konvertuje D-triptofan i 2-okso kiselina u indol-3-piruvat i jednu amino kiselinu; triptofan dehidrogenaza (koja se naziva i NAD(P)-L-triptofan dehidrogenaza, L-triptofan dehidrogenaza, L-Trp-dehidrogenaza, TDH i L-triptofan:NAD(P) oksidoreduktaza (deaminirajuća)) koja konvertuje L-triptofan i NAD(P) u indol-3-piruvat i NH3i NAD(P)H; D-amino kiselina dehidrogenaza, koja konvertuje D-amino kiseline i FAD u indol-3-piruvat i NH3i FADH2; triptofan-fenilpiruvat transaminaza (koja se naziva i L-triptofan-a-ketoisokaproat aminotransferaza i L-triptofanrfenilpiruvat aminotransferaza) koja konvertuje L-triptofan i fenilpiruvat u indol-3-piruvat i L-fenilalanin; L-amino kiselinska oksidaza (koja se naziva i ofio-amino-kiselinska oksidaza i L-amino-kiselina:kiseonik oksidoreduktaza (deaminirajuća)) koja konvertuje jednu L-amino kiselinu i H20 i 02u 2-okso kiselinu i NH3i H202; D-amino kiselinska oksidaza (koja se naziva i ofio-amino-kiselinska oksidaza i D-amino-kiselina:kiseonik oksidoreduktaza (deaminirajuća)) koja konvertuje a D-amino kiselinu i H20 i 02u 2-okso kiselinu i NH3i H202; i triptofan oksidaza koja konvertuje L-triptofan i H20 i 02u indol-3-piruvat i NH3i H202. Ove klase sadrže i tirozin (aromatični) aminotransferazu, aspartat aminotransferazu, D-amino kiselinu (ili D-alanin) aminotransferazu, i široku (multisupstratnu) aminotransferazu koja ima multiple aktivnosti aminotransferaze, od kojih neke mogu da konvertuju triptofan i 2-okso kiselinu u indol-3-piruvat i jednu amino kiselinu.

Jedanaest članova klase aminotransferaza koji imaju takvu aktivnost opisani su dole u Primeru 1, uključujući i jednu novu aminotransferazu prikazanu u SEQ ID NOS: 11 i 12. Prema tome, ovo otkriće daje izolovanu nukleinsku kiselinu i sekvence proteina koje imaju najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili čak najmanje 99% identičnosti sekvence sa SEQ ID NOS: 11 i 12. Ovim otkrićem su obuhvaćeni i fragmenti i fuzije SEQ ID NOS: 11 i 12 koji zadržavaju aktivnost aminotransferaza ili kodiraju protein koji ima aktivnost aminotransferaza. U primere ovih fragmenta spadaju, ali nisu njima ograničeni, i najmanje 10, 12, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500, ili 1000 bliskih nukleotida SEQ ID NO: 11 ili najmanje 6, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300 ili 350 bliskih amino kiselinas SEQ ID NO: 12. Otkrivene sekvence (i varijante, fragmenti, i njihove fuzije) mogu biti deo vektora. Ovaj vektor može da se koristi da se transformišu ćelije domaćina i na taj način proizvedu rekombinantne ćelije koje mogu da produkuju indol-3-piruvat iz triptofana, i u nekim primerima mogu dalje da produkuju MP i/ili monatin. L-amino kiselina oksidaze (1.4.3.2) su poznate, i sekvence mogu biti izolovane iz nekoliko različitih izvora, kao što suVipera lebetine(sp P81375),Ophiophagus hannah(sp P81383),Agkistrodon rhodostoma(spP81382),Crotalus atrox(sp P56742),Burkholderia cepacia, Arabidopsis

thaliana, Caulobacter cresentus, Chlamydomonas reinhardtii, Mus musculus, Pseudomonas

syringae,iRhodococcusstr. Uz to, triptofan oksidaze su opisane u literaturi i mogu biti izolovane, na primer, izCoprinussp. SF-1, kineskog kupusa sa bolešću kile,Arabidopsis thaliana,i jetre sisara. Jedan član klase L-amino kiselina oksidaze koji može da konvertuje triptofan u indol-3-piruvat je detaljnije opisan dole u Primeru 3, a opisani su i alternativni izvori za molekulsko kloniranje.

Triptofan dehidrogenaze su poznate, i mogu biti izolovane, na primer, iz spanaća,Pisum sativum, Prosopis juliflora,graška, meskita (mahunasti plod), pšenice, kukuruza, paradajza, duvana,Chromobacterium violaceum,iLactobacilli.Poznate su mnoge genske sekvence D-amino kiselina dehidrogenaze.

Kao što je pokazano na SLIKAMA 11-13, ako jedna amino kiselinska oksidaza, kao što je triptofan oksidaza, se koristi da se konvertuje triptofan u indol-3-piruvat, katalaza može da se doda da se redukuje ili čak eliminiše prisustvo vodonik peroksida.

Indol- 3- laktat u indol- 3- piruvat

Reakcija koja konvertuje indol-3-laktat u indol-3-piruvat može da se katalizuje nizom polipeptida, kao što su članiv sledećih klasa polipeptida: 1.1.1.110, 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3, 1.1.1.222, 1.1.1.237, 1.1.3.-, ili 1.1.1.111. Klasa polipeptida 1.1.1.110 uključuje indollaktat dehidrogenaze (koja se naziva i indolmlečna kiselina: NAD<+>oksidoreduktaza). Klase 1.1.1.27, 1.1.1.28, i 1.1.2.3 uključuju laktat dehidrogenaze (koja se naziva i mlečna kiselina dehidrogenaze, laktat: NAD<+>oksidoreduktaza). Klasa 1.1.1.222 sadrži (R)-4-hidroksifenillaktat dehidrogenazu (koja se naziva i D-aromatična laktat dehidrogenaza, R-aromatična laktat dehidrogenaza, i R-3-(4-hidroksifenil)laktat:NAD(P)<+>2-oksidoreduktaza) i klasa 1.1.1.237 sadrži 3-(4-hidroksifenilpiruvat) reduktazu (koja se naziva i hidroksifenilpiruvat reduktaza i 4-hidroksifenillaktat: NAD<+>oksidoreduktaza). Klasa 1.1.3.- sadrži laktat oksidaze, a klasa 1.1.1.111 sadrži (3-imidazol-5-il) laktat dehidrogenaze (koja se naziva i (S)-3-(imidazol-5-il)laktat:NAD(P)<+>oksidoreduktaza). Verovatno je da nekoliko polipeptida u ovim klasama omogućavaju produkciju indol-3-piruvata iz indol-3-mlečne kiseline. Primeri ove konverzije dati su u Primeru 2.

Hemijska reakcije može da se koristi i da se konvertuje indol-3-mlečna kiselina u indol-3-piruvat. Ovakva hemijska reakcije uključuje korak oksidacije koji se može postići korišćenjem nekoliko metoda, na primer: vazdušna oksidacija korišćenjem B2 katalizatora( China Chemical Reporter,v 13, n 28, str. 18 (1), 2002), razblaženim permanganatom i perhloratom, ili vodonik peroksidom u prisustvu katalizatora metala.

Indol- 3- piruvat u 2- hidroksi 2-( indol- 3ilmetil)- 4- keto glutaričnu kiselinu ( MP)

Nekoliko poznatih polipeptida može da se koristi da se konvertuje indol-3-piruvat u MP. U egzemplarne primere klasa polipeptida spadaju 4.1.3.-, 4.1.3.16, 4.1.3.17, i 4.1.2.-. Ove klase uključuju ugljenik-ugljenik sintazae/liaze, kao što su aldolaze koje katalizuju kondenzaciju dva supstrata karboksilne kiseline. Peptidna klasa EC 4.1.3.- predstavlja sintaze/liaze koje formiraju ugljenik-ugljenik veze korišćenjem okso-kiselinskih supstrata (kao što je indol-3-piruvat) kao elektrofil, dok su EC 4.1.2.- sintaze/Iiaze koje formiraju ugljenik-ugljenik veze korišćenjem aldehidnog supstrata (kao što je benzaldehid) kao elektrofil.

Na primer, polipeptid opisan u EP 1045-029 (EC 4.1.3.16, 4-hidroksi-2-oksoglutarat glioksilat-liaza koja se naziva i 4-hidroksi-2-oksoglutarat aldolaza, 2-okso-4-hidroksigIutarat aldolaza ili KHG aldolaza) konvertuje glioksiličnu kiselinu i piruvat u 4-hidroksi-2-ketoglutaričnu kiselinu, i polipeptid 4-hidroksi-4-metil-2-oksoglutarat aldolazi (EC 4.1.3.17, koja se naziva i 4-hidroksi-4-metil-2-oksoglutarat piruvat-liaza ili ProA aldolaza), kondenzuje dve keto-kiseline kao što su dva piruvata u 4-hidroksi-4-metil-2-oksoglutarat. Reakcije koje kmoriste ove liaze ovde su opisane.

SLIKE 1-2 i 11-13 pokazuju shematski dijagram ovih reakcija u kojima su 3-ugljenik (C3) molekuli kombinovani sa indol-3-piruvatom. Mnogi članovi EC 4.1.2.- i 4.1.3.-, posebno PLP-koji koriste polipeptide, mogu da koriste i C3 molekule koji su amino kiseline kao što su serin, cistein, i alanin, ili njihovi derivati. Aldol kondenzacije katalizovane predstavnicima EC 4.1.2.- i 4.1.3.-iziskuju tri ugljenikova molekula ovog puta da budu piruvat ili derivat piruvata. Međutim, i druga jedinjenja mogu da služe kao izvor C3 ugljenika i da budu konvertovana u piruvat. Alanin može da se transaminira od strane mnogih transaminaza koje koriste PLP, uključujući mnoge od gore pomenutih, da daju piruvat. Piruvat i amonijak mogu se dobiti pomoću beta-eliminacione reakcije (kao što su one koje se katalizuju pomoću triptofanase ili (3-tirozinaze) L-serina, L-cisteina, i derivata serina i cisteina sa dovoljno grupa koje odlaze, kao što su O-metil-L-serin, O-benzil-L-serin, S-metilcistein, S-benzilcistein, S-alkil-L-cistein, O-acil-L-serin, i 3-hloro-L-alanin. Aspartat može da služi kao izvor piruvata u PLP-posredovanim reakcijama beta-liaza kao što su one koje se katalizuju pomoću triptofanase (EC 4.1.99.1) i/ili P-tirozinaze (EC 4.1.99.2, koja se naziva i tirozin-fenol liaza). Brzina beta -liaza reakcije može da se poveća obavljanjem mutagensis usmerene na dato mesto na (4.1.99.1-2) polipeptide kao što su to opsiali Mouratoui saradnici ( J. Biol. Chem274:1320-5, 1999) i u Primeru 8. Ove modifikacije omogućavaju polipeptidima da prihvate supstrate dikarboksilne amino kiseline. Laktat može da služii kao izvor piruvata, i biva oksidisan u piruvat uz dodatak laktat dehidrogenaze i oksidizovanog ko-faktora ili laktat oksidaze i kiseonika. Primeri za ove reakcije opisani su dole. Na primer, kao što je pokazano na SLICI 2 i SLIKAMA 11-13, ProA aldolaza može da se kontaktira sa indol-3-piruvatom kada se piruvat koristi kao C3 molekuli.

MP može da se generiše i korišćenjem hemijskih reakcija, kao što su kondenzacije aldola opisane u Primeru 5 5.

MP u monatin

Konverzija MP u monatin može da se katalizuje pomoću jednog ili više od sledećih: triptofan aminotransferaze (2.6.1.27), triptofan dehidrogenaze (1.4.1.19), D-amino kiselinske dehidrogenaze (1.4.99.1), glutamat dehidrogenaze (1.4.1.2-4), fenilalanin dehidrogenaze (EC 1.4.1.20), triptofan-fenilpiruvat transaminaze (2.6.1.28), ili opštije, članova porodice aminotransferaza (2.6.1.-) kao što su aspartat aminotransferaza (EC 2.6.1.1), tirozin (aromatični) aminotransferaza (2.6.1.5), D-triptofan aminotransferaza, ili D-alanin (2.6.1.21) aminotransferaza (SLIKA 2). Jedanaest članova klase aminotransferaza opisane su dole (Primer 1), uključujući jedan novi član klase prikazan kao SEQ ID NOS: 11 i 12, i reakcije koje pokazuju aktivnost enzima aminotransferaza i dehidrogenaza prikazani su u Primeru 7.

Ova reakcija se može obaviti i korišćenjem hemijske reakcije. Aminacija keto kiselina (MP) obavlja se reduktivnom aminacijom korišćenjem amonijaka i natrijum cijanoborohidrida.

SLIKE 11-13 pokazuju dodatne polipeptide koji mogu da se koriste da se konvertuje MP u monatin, kao i da obezbedi povećani prionos monatina iz indol-3-piruvata ili triptofana. Na primer, ako se aspartat koristi kao amino donor, aspartat aminotransferaza može da se koristi da se aspartat konvertuje u oksaloacetat (SLIKA 11). Ovaj oksaloacetat se konvertuje u piruvat i ugljenik dioksid dekarboksilazom, kao što je oksaloacetat dekarboksilaza (SLIKA 11). Uz to, ako se lizin koristi kao amino donor, lizin epsilon aminotransferaza može da se koristi da se konvertuje lizin u allizin (SLIKA 12). Ovaj allizin se spontano konvertuje u 1-piperidein 6-karboksilat (SLIKA 12). Ako se polipeptid sposoban da katalizuje reduktivne reakcije aminacije (na pr., glutamat dehidrogenaza) koristi da se MP konvertuje u monatin, može da se koristi polipeptid koji može da reciklira NAD(P)H i/ili produkule isparljivi proizovd (SLIKA 13), kao što je format dehidrogenaza.

Dodatna razmatranja u osmišljavanju puteva biosinteze

Zavisno od toga koji se polipeptidi koriste da se generiše indol-3-piruvat, MP i/ili monatin, ko-faktori, supstrati, i/ili dodatni polipeptidi mogu da se obezbede produkcijom ćelija da se pojača produkcija proizvoda.

Uklanjanje vodonik peroksida

Vodonik peroksid (H202) je proizvod koji, ako se generiše, može da bude toksičan za produkcione ćelije i može da ošteti polipeptide ili produkovane međuproizvode. L-amino kiselina oksidaza koja je gore opisana generiše H202kao proizvod. Prema tome, ako se koristi L-amino kiselina oksidaza, dobijeni H202može da se ukloni, ili da se njegovi nivoi smanje da se umanji potencijalno oštećenje ćelija ili produkata.

Katalaze mogu da se koriste da se smanji nivo H202u ćeliji (SLIKE 11-13). Produkciona ćelija može da eksprimira gen ili cDNK sekvencu koja enkodira katalazu (EC 1.11.1.6), što katalizuje razgradnju vodonik peroksida u vodu i gas kiseonik. Na primer, katalaza može da se eksprimira iz vektora transfektovanog u produkcionu ćeliju. U primere katalaza koje mogu da se koriste spadaju, ali ovo nije iscrpna lista: tr|Q9EV50( Staphilococcus xilosus),tr|Q9KBE8( Bacillus halodurans),tr|Q9URJ7( Candida albicans),tr|P77948( Streptomyces coelicolor),tr|Q9RBJ5( Xanthomonas campestris) ( SwissProtPristupni br.). Biokatalitički reaktori koji koriste L-amino kiselina oksidazu, D-amino kiselina oksidazu, ili triptofan oksidazu takođe mogu da sadrže polipeptid katalazu.

Modulacija dostupnosti PLP ( piridoksal- S '- fosfat)

Kao što je pokazano na SLICI 1, PLP može da se koristi u jednom ili više koraka biosinteze koji su ovde opisani. Koncentracija PLP može da se dopuni tako da PLP ne postane ograničenje u ukupnoj efikasnosti reakcije.

Put biosinteze za vitamin B6(the prekursor of PLP) detaljno je ispitivanu E. colii neki od proteina su kristalizovani (Labersaradnici, FEBS Letters,449:45-8, 1999). Dva od ovih gena( epd ili gapBiserC)su potrebna u drugim metaboličkim putevima, dok su tri gena( pdxA, pdxB, i pdxJ)specifična za biosintezu piridoksal fosfata. Jedan od početnih materijala u putuE. coli jeste1-deoksi-D-ksiluloza-5-fosfat (DXP). Sinteza ovog prekursora iz zajedničkih 2 i 3 ugljenik centralnih metabolita katalizuje se pomoću polipeptida l-deoksi-D-ksiluloza-5-fosfat sintazu (DSX). Drugi prekursor je treoninski derivat koji se formira iz 4-ugljenik šećera, D-eritroza 4-fosfata. Za konverziju u fosfo-4-hidroksil-L treonin (HTP) potrebni su sledeći geniepd, pdxB,iserC.Poslednja reakcija za formiranje PLP jeste kompleksna intramolekularna kondenzacija i reakcija zatvaranja prstena između DXP i HTP, koja sc katalizuje genskimproizvodima pdxAipdxj.

Ako PLP postane limitirajući nutrijent tokom fermentacije da se produkuje monatin, povećana ekspresija jednog ili više gena puta u produkciji ćelija domaćina može da se koristi da se poveća prinos monatina. Organizam domaćina može da sadrži brojne kopije gena svog nativnog puta ili kopije gena svog ne-nativnog puta koji se mogu inkorporisati u genom organizma. Uz to, brojne kopije gena puta spašavanja mogu da se kloniraju u organizam domaćina.

Jedan put spašavanja se konzervira u svim organizmima i reciklira brojne derivate vitamina B6u aktivnu formu PLP. Polipeptidi uključeni u ovaj putsu pdxK \ dmm, pdxHoksidaza, i pdxYkinaza. Prekomerna ekspresija jednog ili više ovih gena može da poveća dostupnost PLP.

Nivoi vitamina B6mogu da se podignu eliminacijom ili represijom metaboličke regulacije nativog puta biosinteze gena u organizmu domaćina. PLP represira polipeptide uključene u biosintezu prekursora treoninskog derivata u bakterijeFlavobacterium sp.soja 238-7. Ovaj bakterijski soj, oslobođen metaboličke kontrole, prekomerno produkuje derivate piridoksala i može da ekskretuje do 20 mg/L PLP. Genetička manipulacija organizma domaćina koji produkuje monatin će na sličan način omogućiti da dođe do povećane produkcije PLP bez prekomerne ekspresije gena puta biosinteze.

Korišćenje amonijaka

Reakcije triptofanaze mogu biti vođene u pravcu sinteze (produkcije triptofana iz indola) tako što će amonijak biti dostupniji ili uklanjanjem vode. Reduktivne reakcije aminacije, kao što su one koje su katalizovane glutamat dehidrogenazom, takođe mogu biti vođene viškom amonijaka.

Amonijak se može obezbediti u vidu amonijum karbonata ili amonijum fosfatne soli u karbonatom ili fosfatom puferovanom sistemu. Amonijak se može dobiti i u vidu amoni jum piruvata ili amonijum formata. Alternativno, amonijak se može obezbediti ako se reakcija kuplira sa reakcijom koja generiše amonijak, kao što su glutamat dehidrogenaza ili triptofan dehidrogenaza. Amonijak može da se generiše dodavanjem prirodnih supstrata EC 4.1.99.- (tirozin ili triptofan), koji će se hidrolizovati u fenol ili indol, piruvat i NH3. Ovo takođe omogućava povećani prinos sintetičkog proizvoda veći od normalne ravnotežne količine tako što se omogućava da enzim hidrolizuje svoj preferirani supstrat.

Uklanjanje proizvoda i sporednih proizvoda

Konverzija triptofana u indol-3-piruvat preko triptofan aminotransferaze može loše da utiče na brzinu produkcije indol-3-piruvata jer ova reakcija produkuje glutamat i iziskuje ko-supstrat 2-oksoglutarat (a-ketoglutarat). Glutamat može da dovede do inhibicije aminotransferaza, a ova reakcija će da potroši velike količine ko -supstrata. Staviše, visoke koncentracije glutamata su pogubne za nishodni proces separacije.

Polipeptid glutamat dehidrogenaza (GLDH) konvertuje glutamat u 2-oksoglutarat, i tako recirkuliše ko-supstrat u reakciji koju katalizuje triptofan aminotransferaza. GLDH takođe generiše redukujuće ekvivalente (NADH ili NADPH) koji mogu da se koriste da generišu energiju za ćeliju (ATP) u aerobnim uslovima. Korišćenje glutamata od strane GLDH takođe redukuje formiranje sporednih proizvoda formation. Uz to, ova reakcija generiše amonijak, koji može da služi kao izvor azota za ćeliju ili kao supstrat u reduktivnoj aminaciji za finalni korak koji je prikaza na SLICI 1. Prema tome, produkciona ćelija koja prekomerno eksprimira GLDH polipeptid može da se koristi da poveća prinos i smanji troškove podloge i/ili procesa separacije.

Na putu od triptofana do monatina, amino donor iz trećeg koraka (na pr., glutamat ili aspartat) može natrag da se konvertuje u amino akceptor koji je potreban za korak 1 (na pr., 2-oksoglutarat ili oksaloacetat), ako se koristi aminotransferaza odgovarajuće klase enzima. Korišćenje dve odvojene transaminaze za ovaj put, u kome supstrat jedne od transaminaza ne inhibira kompetitivno aktivnost druge transaminaze, može da poveća efikasnost ovog puta.

Mnoge od reakcija u opisanim putevima su reverzibilne i, prema tome, postići će ravnotežu između supstrata i produkata. Prinos ovog puta se može povećati kontinuiranim uklanjanjem produkata iz polipeptida. Na primer, sekrecija monatina u čorbu za fermentaciju korišćenjem permeaze ili drugog transportnog proteina, ili selektivna kristalizacija monatina iz biokatalitičkog reaktorskog toka sa istovremenim recikliranjem supstrata povećeće prinos reakcije.

Uklanjanje sporednih proizvoda dodatnim enzimskim reakcijama ili supstitucijom amino donorskih groupa je drugi način da se poveća prinos reakcije. O nekoliko drugih primera detaljnije će biti reči u Primeru 13 i biće ilustrovani na SLIKAMA 11-13. Idealno se produkuje sporedni proizvod koji nije na raspolaganju za reakciju u suprotnom pravcu, ni promenom faze (evaporacijom, niti spontanom konverzijom u nereaktivni krajnji proizvod, kao što je ugljen dioksid.

Modulacija objedinjenih supstrata

Objedinjeni indoli mogu da se moduliraju povećanom produkcijom prekursora triptofana i/ili izmenom kataboličkih puteva koji uključuju indol-3-piruvat i/ili triptofan. Na primer, produkcija indol-3-sirćetne kiseline od indol-3-piruvata može da se redukuje ili eliminiše funkcionalnom delecijom gena koji kodira za EC 4.1.1.74 u ćeliji domaćina. Produkcija indola iz triptofana može da se redukuje ili eliminiše funkcionalnom delecijom gena koji kodiraju EC 4.1.99.1 u ćeliji domaćina. Alternativno, višak indola može da se koristi kao supstrat uin vitroiliin vivoprocesu u kombinaciji sa povećanim količinama gena koji kodiraju za EC 4.1.99.1 (Kavvasakii saradnici, J. Ferm. i Bioeng.,82:604-6, 1996). Genetičke modifikacije mogu da se izvrše tako da se poveća nivo međuproizvoda kao što su D-eritroza-4-fosfat i horizmat.

Produkcija triptofana se reguliše u većini organizama. Jedan od mehanizama je preko povratne inhibicije nekih enzima na putu; kako nivoi triptofana rastu, brzina produkcije triptofana opada. Tako, kada se koristi ćelija domaćina, inženjerski manipulisana da produkuje monatin preko međuproizvoda triptofana, može da se koristi organizam koji nije osetljiv na koncentracije triptofana. Na primer, sojCatharanthus roseuskoji je rezistentan na inhibiciju rasta raznim analozima triptofana odabran je ponovljenim izlaganjima visokim koncentracijama 5-metiltriptofana (Schallenberg i Berlin,Z Naturforsch34:541-5, 1979). Rezultujuća aktivnost triptofan sintaze ovog soja bila je manje pogođena inhibicijom proizvoda, verovatno zbog posledica mutacija gena. Isto tako, može se optimalizovati ćelija domaćina koja se koristi za produkciju monatina.

Produkcija triptofana može se optimalizovati korišćenjem direktne evolucije da se razviju polipeptidi koji su manje senzitivni na inhibiciju proizvoda. Na primer, skrining može da se obavlja na pločama bez sadržaja triptofana u podlozi, ali sa visokim nivoima triptofanskih analoga koji se ne mogu metabolizovati. U.S. Patenti br. 5,756,345; 4,742,007; i 4,371,614 opisuju metode koje se koriste da se poveća produktivnost i u jednom fermentacionom organizmu. Poslednji korak biosinteze triptofana jeste dodatak serina u indol; prema tome dostupnost i raspoloživost serina se može povećati da se poveća produkcija triptofana.

Količina monatina koji produkuje fermentacioni organizam može se povećati povećamjem količine piruvata koji produkuje organizam domaćina. Neke kvasnice, kao što suTrichosporon cutaneum(Wangi saradnici, Lett. Appl_ . Microbiol.35:338-42, 2002) iTorulopsis glabrata (Li i saradnici, Appl Microbiol. Biotechnol. 57:451- 9,2001) prekomerno produkuju piruvat i mogu se koristiti da se vežba Metoda koja je ovde opisana. Uz to, genetičke modifikacije mogu da se izvrše na organizmima da se unapredi produkcija piruvične kiseline, kao što su one u sojuE. coli W1485//jp2(Kawasakii saradnici, J Ferm. i Bioeng.82:604-6, 1996).

Kontrolisanje hiralnosti

Profil ukusa monatina može se izmeniti kontrolisanom stereohemijom (hiralnošću) molekula. Na primer, različiti izomeri monatina mogu biti poželjni u različitim mešavinama i koncentracijama za različite sisteme hrane. Hiralnost se može kontrolisati kombinacijom pH i polipeptida.

Racemizacija na položaju C-4 monatina (vidi obeležene molekule gore) može da nastane deprotonacijom i reprotonacijom alfa ugljenika, koji može da nastane pomeranjem pH ili reakcijom sa ko-faktorom PLP. U jednom mikroorganizmu, malo je verovatno da se pH može pomerati dovoljno da izazove racemizaciju, ali PLP ima dovoljno. Metode za kontrolu hiralnosti sa polipeptidima zavise od puta biosinteze koji koriste za produkciju monatina.

Kada se monatin formira koristeći put prikazan na SLICI 2, sledeće treba uzeti u obzir. U jednoj biokatalitičkoj reakciji, hiralnost ugljenika-2 određuje se enzimom koji konvertuje indol-3-piruvat u MP. Multipli enzimi (na pr. od EC 4.1.2.-, 4.1.3.-) mogu da koncentruju indol-3-piruvat u MP, pa tako može da se izabere enzim koji stvara željeni izomer. Alternativno, enantiospecifičnost enzima koji konvertuje indol-3-piruvat u MP može da se modifikuje korišćenjem usmerene evolucije ili se inženjenrski mogu obezbediti katalitička antitela da se katalizuje željena reakcija. Kada se jednom proizvede MP (bilo enzimski ili hemijskom kondenzacijom), amino grupa može da se doda stereospecifično korišćenjem jedne transaminaze, kao što su one koje su ovde opisane. Može se generisati bilo R ili S konfiguracija ugljenika-4 zavisno od toga da li se koristi D- ili L- aromatična kiselina aminotransferaza. Većina aminotransferaza su specifične za L-izomer, međutim D-triptofan aminotransferaze postoje u nekim biljkama (Kohiba i Mito, Zbirka radova sa osmog međunarodnog simpozijuma o Vitaminu B6i katalizi karbonila, Osaka, Japan 1990). Staviše, identifikovane su D-alanin aminotransferaze (2.6.1.21), D-metionin-piruvat aminotransferaze (2.6.1.41) i obe, (R)-3-amino-2-metilpropanoat aminotransferaza (2.6.1.61) i (S)-3-amino-2-metilpropanoat aminotransferaza (2.6.1.22). Neke aminotransferaze mogu samo da prihvate supstrat za ovu reakciju sa određenom konfiguracijom na C2 ugljeniku. Prema tome, čak i ako konverzija u MP nije stereospecifična, stereohemija finalnog produkta može da se kontorliše odgovarajućom selekcijom transaminaza. Budući da su ove reakcije reverzibilne, nereagovani MP (neželjeni izomer) može da se reciklira nazad u svoje sastavne delove, pa se može reformisati racemijska mešavina MP.

Aktivacija supstrata

Fosforilisani supstrati, kao što su fosfoenolpiruvat (PEP), mogu da se koriste za reakcije koje se ovde otkrivaju. Fosforilizovani supstrati mogu biti energijski pogodniji, pa, prema tome, mogu da se koriste da se poveća brzina reakcije ili/i pribr. U kondenzacijama aldola, dodatak fosfatne groupe stabilizuje enol tautomer nukleofilnog supstrata, čineći ga reaktivnijim. U drugim reakcijama, jedan fosforilisani supstrat često daje bolju grupu koja odlazi. Isto tako, supstrati se mogu aktivirati konverzijom u derivate CoA ili derivate pirofosfata.

Primer 1

Kloniranje i ekspresija triptofan aminotransferaza

Ovaj primer opisuje metode koje su korišćene da se kloniraju triptofan aminotransferaze, što može da se koristi da se konvertuje triptofan u indol-3-piruvat.

Opis eksperimenta

Jedanaest gena koji kodiraju aminotransferaze klonirani suu E. coli.Ovi geni su biliBacillus subtilisD-alanin aminotransferaza( dat,Genbank Pristupni br. Y14082.1 bp 28622-29470 i Genbank Pristupni br. NP 388848.1, nukleinska kiselinska sekvenca odnosno amino kiselinska sekvenca,),Sinorhizobium meliloti(koja se naziva iRhi- obium meliloti)tirozin aminotransferaza( tatA,SEQ ID NOS: 1 i 2, nukleinska kiselinska sekvenca odnosno amino kiselinska sekvenca),Rhodobacter sphaeroidesstrain 2.4.1 tirozin aminotransferaza( tatAasertovan homologijom, SEQ ID NOS: 3 i 4, nukleinska kiselinska sekvenca odnosno amino kiselinska sekvenca),R. sphaeroides35053 tirozin aminotransferaza (asertovan homologijom, SEQ ID NOS: 5 i 6, nukleinska kiselinska sekvenca odnosno amino kiselinska sekvenca),Leishmania majorširoki supstrat aminotransferaze( bsat,asertovan homologijom do peptidnih fragmenata izL. mexicana,SEQ ID NOS: 7 i 8, nukleinska kiselinska sekvenca odnosno amino kiselinska sekvenca,),Bacillus subtilisaromatična aminotransferaza( araT,asertovan homologijom, SEQ ID NOS: 9 i 10, nukleinska kiselinska sekvenca odnosno amino kiselinska sekvenca),Lactobacillus amilovorusaromatična aminotransferaza( araT asertovanhomologijom, SEQ ID NOS: 11 i 12, nukleinska kiselinska sekvenca odnosno amino kiselinska sekvenca,),R. sphaeroides35053 multipli supstrat aminotransferaza (asertovan homologijom, SEQ ID NOS: 13 i 14, nukleinska kiselinska sekvenca odnosno amino kiselinska sekvenca,),Rhodobacter sphaeroidesstrain 2.4.1 multipli supstrat aminotransferaza( msaasertovan homologijom, Genbank Pristupni br. A A AEO 1000093.1, bp 14743-16155 i Genbank Pristupni br. ZP00005082.1, nukleinska kiselinska sekvenca odnosno amino kiselinska sekvenca),Escherichia coliaspartat aminotransferaza( aspC,Genbank Pristupni br. AE000195.1 bp 2755-1565 i Genbank Pristupni br. AAC74014.1, nukleinska kiselinska sekvenca odnosno amino kiselinska sekvenca), iE. colitirozin aminotransferaza( tyrB,SEQ ID NOS: 31 i 32, nukleinska kiselinska sekvenca odnosno amino kiselinska sekvenca).

Ovi geni su klonirani, eksprimirani, i testirani na aktivnost u konverziji triptofana u indol-3-piruvat, uz komerecijalno dostupne enzime. Svih jedanaest klonova je imalo aktivnost.

Identifikacija bakterijskih sojeva koji mogu da sadrže polipetide sa željenom aktivnošću

Nijean gen iz NCBI (National Center for Biotechnologv Information -Nacionalni centar za biotehnološke informacije)nije opisan kao triptofan aminotransferaza. Međutim, organizami koji poseduju ovu enzimsku aktivnost su identifikovani. Aktivnost L-triptofan aminotransferaze (TAT) izmerena je ili u ćelijskim ekstraktima ili iz prečišćeni proteina iz sledećih izvora: Rizobakterijski izolata izFestuca octoflora,mitochondria i citosol graška, ćelije krunice suncokreta,Rhizobium leguminosarumbiovartrifoli, Envinia herbicolapv gvpsophilae,Pseudomonas syringaepv. savastanoi,Agrobacterium tumefaciens, Azospirillum lipferum&brasilense, Enterobacter cloacae,

Enterobacter agglomerans, Bradyrhizobium elkanii, Candida maltosa, Azotobacter vinelandii,

mozga pacova, jetre pacova,Sinorhizobium meliloti, Pseudomonas fluorescensCHAO,Lactococcus lactis, Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticus,semenki pšenice, ječma,Phaseolus aureus(mung bean),Saccharomyces uvarum(carlsbergensis),Leishmaniasp., kukuruza, izdanaka paradajza, zasada graška, duvana, svinje,Clostridium sporogenes,iStreptomyces griseus.

Izolovanje genomske DNK za kloniranje

S. meliloti(ATCC broj 9930) gajenje u podlozi TY na 25°C, pH 7.2. Ćelije su gajene do optičke gustine na 600 nm (OD60o) od 1.85 i 2% inokulum je korišćen za genomske preparate DNK. Komplet Qiagen genomic tip 20/G kit (Valencia, CA) korišćenje za ovu genomsku izolaciju DNK.

Bacillus subtilis6051 (ATCC) je gajen na 30°C u čorbi Bereto Nutrient (Difco; Detroit, MI). Qiagen protocol za genomski tip 20/G korišćen nje da se izoluje genomska DNK sa sledećim promenama: koncentracije proteinaze K i lizozima su udvostručene, a vreme inkubacije je povećano 2-3 puta.

IDI, Inc. (Quebec, Canada) je obezbedioLeishmania majorATCC 50122 genomsku DNK u TE puferu pH 8.0, 17 ng/uL.

Rhodobacter sphaeroides 2. 4A(koje je obezbedio Profesor Sam Kaplan, Univerzitet Teksas, Hjuston),R. sphaeroides35053 (ATCC broj), iL. amilovorusgenomska DNK je pripremljena standardnom ekstrakcijom fenola. Ćelije su ubirane u poznoj log fazi, ponovo suspendovane u TEN puferu (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl), i lizirane dodavanjem 0.024 mL natrijum lauril sarkozina na mL ćelija suspenzije. Posle ekstrahovanja najmanje tri puta sa jednakom zapreminom fenola saturisanog TE puferom (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA), rastvor DNK je ckstrahovan jednom 9:1 hloroform:oktanol i tri puta sa hloroformom. DNKjetaložen dodavanjem 0.1 zapremine 3 M natrijum acetat, pH 6.8 i 2 zapremine etanola. Ovaj precipitat je ohlađen centrifugiranjem i opran je jednom sa 70% etanola. I na kraju DNK je rastvaran u 0.10 mL destilovane vode.

Genomska DNKEscherichia coli jeizolovana iz soja DH10B (Invitrogen) i pripremljena korišćenjem kompleta Qiagen Genomic-tip™ (500/G). 0.3 mg prečišćene DNK dobijeno je od 30 L ovog soja gajenog LB na OD6soof 1.87. Ova prečišćena DNK rastvorena je u Qiagen elucionom puferu (EB) pri koncentraciji od 0.37 ug/uL.

Protokol za lančanu reakciju polimeraza

Prajmeri su osmišljeni s odgovarjućim vepanjem za pET 30 Xa/LIC vektor (Novagen, Madison, WI). Ovaj pET vektor ima 12 bazno jednostruko, jednolančano vešanje na strani 5' mesta Xa/LIC i 15- bazno jednostruko, jednolančano vešanje na strani 3' mesta Xa/LIC. Ovaj plazmid je osmišljen za ligaciju nezavisnog kloniranja, sa N-terminal His i S-tagovima i opcionalnim C-terminal His-tagom. Ovo Xa mesto prepoznavanja proteazc (IEGR) nalazi se direktno ispred početka kodona gena koji nas interesuje, tako da tagovi fuzionih proteina mogu da se uklone.

Sledeće sekvence su dodate na krajeve 5' sekvence specifične za organizam kada se osmišljavaju prajmeri: prednji prajmer, 5' GGTATTGAGGGTCGC (SEQ ID NO: 73); reverzni prajmer: 5' AGAGGAGAGTTAGAGCC (SEQ ID NO: 74).

Bacillus subtilis datprajmeri: N term: 5'-

Sinorhizobium meliloti tatAprajmeri: N term: 5'- Bacillus subtilis araT prajmeri:N term: 5'- Rhodobacter sphaeroides msa(oba, i 2.4.1 .i 35053): N term: 5'- Leishmania major bsat:N term: 5'- Lactobacillus amilovorus araT:N term: 5'- Rhodobacter sphaeroides tatA (oba, i2.4.1 i sojevi 35053): N term: 5'- Escherichia coli aspC:N term: 5'- Escherichia coli tyrB:N term: 5'-

Ovaj gen izveden izS. meliloti ( tatA)amplifikovan je korišćenjejm PCR protokola. U reakciji 50 uL sa 0.1-0.5 ug templata, 1.5 uM svakog prajmera, korišćeni su i 0.4 mM dNTP, 3.5 U

ExpandHigh Fidelity Polimeraza(Roche, Indianapolis, IN), i IX Expand™ pufer sa Mg. Termociklerski program koji je korišćen podrazumevao je vreli početak na 96°C tokom 5 minuta, posle čega sledi 29 repeticija sledećih koraka: 94°C tokom 30 sekundi, 55°C tokom 2 minuta, i 72°C tokom 2.5 minuta. Posle 29 repeticija uzorak se održava na 72°C tokom 10 minutes i potom čuva na 4°C. Ovaj PCR protokol dao je kao proizvod 1199 bp.

Sekvence gena izvedenih izR. sphaeroides ( msa i tatA), L. amilovorus araT,iBacillus araTamplifikovane su korišćenjem PCR protokola. U reakciji sa 50 uL, 0.1-0.5 ug templat, dodato je po 1.5 uM svakog od prajmera, 0.4 mM od dNTP, 3.5 UExpandHigh Fidelity<m>Polimeraza,i IXExpand™pufer sa Mg., Korišćeni termociklerski program je uključio vreli početak na 96°C tokom 5 minuta, posle čega sledi 29 ponovaka sa sledećim koracima: 94°C tokom 30 sekundi, 40-60°C tokom 1 minute, 45 sekundi (gradijent termociklera) i 72°C tokom 2 minuta, 15 sekundi. Posle 29 repeticija, uzorak se održava na 72°C tokom 10 minuta i i onda se čuva na 4°C.

Za svaki genR. sphaeroides msatemperature aniliranja od 42°C i 48°C produkuju multiple proizvode, ali daju jasnu traku na približno 1464 bp. SaL. amilovorus araT,temperature aniliranja od 42°C, 48°C, i 56°C produkuju pojedinačne proizvode, ali daju intenzivne trake na 1173 bp. ZaB. subtilis araT,temperature aniliranja od 40°C, 45°C, 50°C, 55°C daju pojedinačne intenzivne proizvode (1173 bp), i iz genomske DNK i kolonija. ZaL. major bsat,temperature aniliranja od 55°C dala je najčistiji proizvod (1239 bp). ZaRhodobacter tatAgene, temperature aniliranja od 50-55°C dale su čiste proizvode korektne veličine (1260 bp). Za oba, i zaE. coligene i zaB. subtilis datgen, korišćene su temperature aniliranja od 55-60°C , a vreme aniliranja je skraćeno na 45 sekundi. Dobili smo čiste proizvode korektne veličine (1.3 kb zaE. coligene, 850 bp zadatgen).

Kloniranje

Proizvodi PCR su gelom prečišćeni sa 0.8 ili 1% TAE-agarose gela korišćenjem kompleta Cuagen za ekstrakciju na gelu (Valencia, CA). Proizvodi PCR su kvantifikovani poređenjem sa standardima na agaroza gelu, a onda su tretirani T4 DNA polimerazom postupajući po protokolu i preporuci proizvođača za kloniranje nezavisno od ligacije{ Ligation Independent Cloning,Novagen, Madison, WI).

Ukratko, približno 0.2 pmol prečišćenog PCR proizvoda tretirano je sa 1 U T4 DNK polimeraze u prisustvu dGTP tokom 30 minuta na 22°C. Ova polimeraza uklanja sukcesivne baze sa kraja 3' PCR proizvoda. Kada polimeraza naiđe na guaninski reziduum, aktivnost enzima polimeraza 5' do 3' suprotstvalja se egzonukleaznoj aktivnosti da se delotvrono spreči dalja ekscizija. Ovo dovodi do jednolančanog vešanja koje je kompatibilno sa vektorom pET Xa/LIC vektor. Ova polimeraza se inaktivira inkubacijom na 75°C tokom 20 minuta.

Ovaj vektor i tretirani insert (umetak) se aniliraju kako to preporučuje Novagen. Približno 0.02 pmol tretiranog inserta i 0.01 pmol vektora inkubiraju se 5 minuta na 22°C, dodaje se 6.25 mM EDTA (finalna koncentracija), i inkubacija na 22°C se ponavlja. Reakcija aniliranja (1 uL) se dodaje u NovaBlue™ singles kompetentne ćelije (Novagen, Madison, WI), i inkubira na ledu tokom 5 minuta. Posle mešanja, ove ćelije se transformišu toplotnim udarom 30 sekundi na 42°C. Ove ćelije se postavljaju na led tokom 2 minuta, i omogućava im se da se oporave u 250 uL SOC na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta na 37°C sa mućkanjem na 225 rpm. Ćelije se postavljaju na LB ploče sa sadržajem kanamicina (25-50 ug/mL).

Plazmid DNK je prečišćen korišćenjem kompletaQiagen spin miniprepsa obavljanjem skrininga da se utvrdi korektna insercija restrikcionom digestijomsa Xho\iXba\.Sekvence plazmida koje se pojave sa korektnim insertima se potvrđuju dideoksi završetkom lanca DNK sekvence.

SEQ ID NOS: 1-14 i 31-32 pokazuje nukleotid i odgovarajuće amino kiselinske sekvence rekombinantnih aminotransferaza. svaka promena Genbank sekvence je ili nema ili je generisala konzervativne supstitucije u proteinskoj sekvenci. SEQ ID NOS: 11 i 12 su nove sekvence.

Ekspresija gena i analiza

Plazmid DNA, verifikovan analizom sekvence, supkloniran je uE. coliekspresionog domaćina BLR(DE3) ili BL21(DE3) (Novagen, Madison, WI). Ove kulture su gajene i plazmidi su izolovani korišćenjem kompleta Qiagen miniprep, i analirane restrikcionom digestijom da se potvrdi identitet.

Indukcija je inicijalno rađena saL. amilovorus araT, B. subtilis araT,iS. meliloti tatAu ćelijama BLR(DE3) i BL21(DE3). Jedna studija vremenskog toka obavljena je sa kulturama koje su gajene u LB sa sadržajem kanamicina (30 mg/L) do OD60ood 0.5-0.8 i indukovano sa 1 mM IPTG (izopropil thogalakatozida) i uzoraka 0,1,2, i 4 sati posle indukcije. Ćelije su iz 2.0 mL bile ponovo suspendovane u 0.10 mL 120 mM Tris-HCl, pH 6.8 sa sadržajem 10% natrijum dodecil sulfata, 10% 2-merkaptoetanola, i 20% glicerola, zagrevano na 95°C tokom 10 min, i ohlađeno, i razblaženo sa 0.10 mL H2O. Alikvoti ovih uzoraka totalnih ćelijskih proteina analizirani su pomoću SDS-PAGE korišćenjem 4-15% gradijentnog gela. Nije bilo signifikantnih razlika u količini eksprimiranog proteina između 2 sata i 4 sata indukcije, niti između BLR(DE3) i BL21(DE3) ćelija.

Ekstrakti ćelija su takođe pripremljeni iz uzoraka dobijenih posle 4 sata suspenzijom peleta ćelija od 2 mL kulture u 0.25 mL Novagen BugBuster™ reagensa sa sadržajem 0.25 uL benzonaze nukleaze, inkubiranjem na sobnoj temperaturi tokom 20 minuta blagim mućkanjem i centrifugiranjem na 16,000 x g da se ukloni ćelijski debris. Supernatanti (ćelijski extrakti) su naneti na 4-15% gradijentne gelove za analizu ćelijskih solubilnih proteina.

Ova tri klona,( L. amilovorus araT( SEQID NOS: 11 i 12),B. subtilis araT( SEQID NOS: 9 i 10), iS. meliloti tatA(SEQ ID NOS: 1 i 2) su pokazala solubilni protein koji je odgovarao korektnoj veličini (približno 45 kDa).B. subtilis araTgenskiprodukt bio je prekomerno eksprimiran na najvišem nivou i/ili je bio rastvorljiviji od preostala dva genska produkta.

U narednim metodama ekspresije, plazmid DNA iz pozitivnih klona bio je supkloniran u BL21(DE3) zbog boljih karakteristika rasta njegovog domaćina. Indukcija je ponavljana korišćenjem 1 mM IPTG sa kulturama gajenim u LB sa sadržajem kanamicina na 50 mg/L, indukujući kada bi OD60odostigla približno 0.8. Ćelije su ubirane posle 4 sata rasta na 37°C, centrifugirane na 3000 rpm tokom 10 minuta (4°C), isspirane sa TEGGP puferom (50 mM Tris-HCl (pH 7.0), 0.5 mM EDTA, 100 mg/L glutationa, 5% glicerola, sa Roche koktelom za kompletnu inhibiciju proteaze), i naglo zamrznuti na -80°C u etanolu.

Uzorci su ponovo suspendovani u 5 mL/g težine mokrih ćelija BugBuster™ (Novagen) reagensa sa sadržajem 5 uL/mL koktela inhibitora proteaze komplet #3 (Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego, CA) i 1 uL/mL benzonaza nukleaze. Uzorci su inkubirani na sobnoj temperaturi tokom 20 minuta na orbitalnom šejkeru. Insolubilni ćelijski debris je uklonjen centrifugacijom na 16,000 X g tokom 20 minuta na 4°C.

Ćelijski ekstrakti su analizirani pomoću SDS-PAGE, i određivana je aktivnost triptofan aminotransferaza praćenjem produkcije indol-piruvične kiseline koristeći sledeći protokol. Jedan mL reakcije prenet je u 50 mM natrijum tetraborata (pH 8.5), 0.5 mM EDTA, 0.5 mM natrijum arsenata, 50 u,M piridoksal fosfata, 5 mM a-ketoglutarata, i 5 mM L-triptofana. Ove reakcije su započete dodavanjem ekstrakta bez sadržaja ćelija ili prečišćenih enzima i inkubirani su 30 minutes na 30°C. 20% TCA (200 (iL) je dodato da se reakcija zaustavi, i nataloženi protein je uklonjen centrifugiranjem. Absorbanca na 327 nm je izmerena i upoređena sa standardnom krivom sveže pripremljenog indol-3-piruvata u puferu za esej. Kontrolne reakcije bez supstrata triptofana ili korišćenjem ekstrakta bez sadržaja ćelija iz klona transfoprmisanih sa samim pET30a takođe su obavljene.

Zbog osnove iznativneE. coliaminotransferaze u ekstraktima ćelija, rekombinantni proteini su bili prečišćeni korišćenjem His-Bind punjenja poštujući protokol propisan od strane proizvođača (Novagen, Madison, WI). Frakcije eluenta su de-saltirane na PD-10 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) koloni i eluirane u 50 mM Tris, pH 7.0. Prečišćeni proteini su analizirani pomoću SDS-PAGE i u njima je određivana aktivnost aminotransferaza.

Rezultati indukcije na 37°C uz pomoć 1 mM IPTG (4 sata) pokazuju daL. major bsat, S. meliloti tatA, E. coli aspC,i obaR. sphaeroides tatAklona imaju signifikantne nivoe aktivnosti triptofan aminotransferaza.araTprotein dobijen izB. subtilisje bio prekomerno eksprimiran i solubilan, ali je pokazao malu enzimsku aktivnost. Genski proizvodL. amilovorus araTse pokazao rastvorljivim u ekstraktu ćelija ali je purifikacija korišćenjem jednog punjenja His-Bind dovela do sasvim male količine proteina odgovarajuće molekulske težine. Genski proizvodmsasu bili nerastvorljivi, pa su dodatni eksperimenti sa ekspresijom rađeni na temperaturi od 24°C da se na najmanju meru svede formiranje inkluzionih tela. Nekoliko koncentracija IPTG između 10 uM i 1 mM iskorišćene su da se na najveću meru podigne koncentracija rastvorljivih proteina.

Tabela 1 navodi specifične aktivnosti merene u mikrogramima indol-3-piruvata (I3P) formiranih na miligram proteina u minuti. U nekim slučajevima, veoma male količine rekombinantnih proteina pokazale su visoke nivoe aktivnosti iznad efektivnog liearnog raspona eseja. U ovim slučajevima znak '>' prethodi broju koji označava specifičnu aktivnost.

Tabela 1: Specifične aktivnosti klona u ekstraktima ćelija ( CE) i prečišćenim ( P) i

komercijalnim enzimima

Aligniranje kojim se porede svi klonirani rekombinantni proteini ilustruje da nema mnogo visoko očuvanih oblasti izmeđuaraT, tatA, bsat,imsa sekvence.Jedan redosled (alignacija) rekombinantnih proteina najveće aktivnosti: homolozi genskog prodizvodaRhodobacter tatA, L. glavniširoki supstrat aminotransferaza, iSinorhizobium melilotitirozin aminotransferaza pokazali su nekoliko očuvanih regina, međutim oni su samo približno 30-43% identični na nivou proteina . Dostupnost širokom spektra, D-specifične (D-alanin) aminotransferaze može da bude korisno u produkciji drugih stereoizomera monatina.

Primer 2

Konverzija Indol-3-laktata u Indol-3-piruvat

Kao što je pokazano na SLIKAMA 1 i 3, indol-3-mlečna kiselina može da se koristi da se proizvede indol-3-piruvat. Konverzija između mlečne kiseline i piruvata je jedna reverzibilna reakcija, kao što je konverzija između indol-3-piruvata i indol-3-laktata. Ova oksidacija indol-laktata tipično je praćena zbog visoke količine pozadine na 340 nm od indol-3-piruvata.

Standardna mešavina za esej sadržala je 100 mM kalijum fosfata, pH 8.0, 0.3 mM NAD<+>, 7 jedinica laktat dehidrogenaze (LDH) (Sigma-L2395, St. Louis, MO), i 2 mM supstrata u 0.1 mL. Ovaj esej je rađen u duplikatu u jednoj U V-transparentnoj ploči za mikrotitraciju, korišćenjemMolecular Devices SpectraMax Plusčitača ploče. Polipeptid i pufer su pomešani i pipetirani u udubljenja sa sadržajem indol-3-mlečne kiseline i NADf 1 apsorbanca na 340 nm za svako udubljenje očitavana je intervalima od 9 sekundi posle kraćeg mešanja. Ova reakcija je održavana na 25°C tokom 5 minuta. Povećanje apsorbance na 340 nm prati produkcija NADH iz NAD<+.>Odvojene negativne kontrole su rađene bez NAD<+>i bez supstrata. D-LDH izLeuconostoc mesenteroides(Sigma kataloški broj L2395) se pokazala da ispoljava više aktivnosti sa supstratima indol-derivata nego L-LDH izBacillus stearothermophilus(Sigma kataloški broj L5275).

Slične metode su iskorišćene sa D-mlečnom kiselinom i NAD+ ili NADH i piruvatom, prirodnim supstratima D-LDH polipeptida. Vmax za redukciju piruvata iznosilo je 100-1000 puta više nego Vmaxza oksidaciju laktata. Vmax za oksidacijsku reakciju indol-3-lactične sa D-LDH bila je jedna petina one koja je bila potrebna za mlečnu kiselinu. Prisustvo indol-3-piruvata je takođe mereno prateći promenu absorbance na 327 (derivat enol-borat) korišćenjem 50 mM natrijum boratskog pufera sa sadržajem 0.5 mM EDTA i 0.5 mM natrijum arsenata. Primećene su male, ali ponovljive promene absorbance u poređenju sa negativnjim kontrolma za L i D-LDH polipeptide.

Uz to, široka specifičnost laktat dehidrogenaza (enzima čija je aktivnost povezana sa EC 1.1.1.27, EC 1.1.1.28, i/ili EC 1.1.2.3), može da se klonira i koristi da se dobije indol-3-piruvat iz indol-3-mlečne kiseline. Izvori dehidrogenaza široke specifičnosti uključujuE. coli, Neisseria gonorrhoeae,iLactobacillus plantarum.

Alternativno, indol-3-piruvat može da se produkuje dovodeći u kontakt indol-3-laktat sa ćelijskim ekstraktima izClostridium sporogeneskoji sadrže indollaktat dehidrogenazu (EC 1.1.1.110); iliTrypanosoma cruzi epimastigotesćelijskim ekstraktima koji sadrže/»-hidroksifenilaktat dehidrogenazu (EC 1.1.1.222) za koje se zna da poseduju aktivnost na indol-3-piruvat; iliPseudomonas kiselinaovoransiliE. colićelijskim ekstraktima, koji sadrže imidazol-5-il laktat dehidrogenazu (EC 1.1.1.111); iliColeus blumei,koji sadrži hidroksifenilpiruvat reduktazu (EC 1.1.1.237); iliCandida maltosakoja sadrži D-aromatični laktat dehidrogenazu (EC 1.1.1.222). Reference koje opisuju takve aktivnosti uključuju, Nowicki/ saradnici ( FEMS Microbiol Lett

71:119-24, 1992), Jean i DeMoss (Ca/jcdra«./. Microbiol. 14 1968, Coote i Hassall [ Biochem. J.111: 237-9, 1969), Cortesei saradnici ( C. R. Seances Soc. Biol. Fil.162 390-5, 1968), Petersen i Alfermann (Z.Naturforsch. C: Biosci.43 501-4, 1988), i Bhatnagari saradnici ( J. Gen Microbiol135:353-60,1989). Uz to,laktat oksidaza kao što su one iz Pseudomonas sp. (Gu ;' saradnici i.Mol. Catalvsis B: Enzvmatic: 18:299-305, 2002), može da se koristi za oksidaciju indol-3-mlečne u indol-3-piruvat.

Primer 3

Konverzija L-triptofana u Indol-3-piruvat korišćenjem L-amino kiselinske oksidaze

Ovaj primer opisuje metode koje se koriste da se konvertuje triptofan u indol-3-piruvat preko oksidaze (EC 1.4.3.2), kao alternativu korišćenju triptofan aminotransferaze kao stoje opisano u Primeru 1. L-amino kiselinska oksidaza je prečišćena izCrotalus durissus(Sigma, St. Louis, MO, kataloški broj A-2805). Pristupni brojevi L-amino kiselinskih oksidaza za molekulsko kloniranje uključuju: CAD21325.1, AAL14831, NP 490275, BAB78253, A38314, CAB71136, JE0266, T08202, S48644, CAC00499, P56742, P81383, 093364, P81382, P81375, S62692, P23623, AAD45200, AAC32267, CAA88452, AP003600, i Z48565.

Reakcije su obavljane u epruvetama za mikrocentrifugiranje sa ukupnom zapreminom od 1 mL, inkubirane tokom 10 minutes dok su mućkane na 37°C. Ova reakcijska mešavina sadrži 5 mM L-triptofana, 100 mM natrijum fosfat pufera pH 6.6, 0.5 mM natrijum arsenata, 0.5 mM EDTA, 25 mM natrijum tetraborata, 0.016 mg katalaza (83 U, Sigma C-3515), 0.008 mg FAD (Sigma), i 0.005-0.125 jedinica L-amino kiselinske oksidaze. Negativne kontrole su sadržale sve komponente osim triptofana, i slepe probe su sadržale sve komponente osim oksidaze. Katalaza je korišćena da se ukloni vodonik peroksid formiran tokom oksidativne deaminacije. Natrijum tetraborat i arsenat su korišćeni da se stabilizuje enol-borat iz indol-3-piruvata, što pokazuje maksimalnu absorbancu na 327 nm. Indol-3-piruvat standardi su pripremljeni u koncentracijama od 0.1-1 mM u reakcijskoj mešavini.

Kupljena L-amino kiselinska oksidaza imala je specifičnu aktivnost od 540 (ig indol-3-piruvata formiranog na minut na mg proteina. Ovo je isti red veličine kao i specifična aktivnost enzima triptofan aminotransferaza.

Primer 4

Konvertovanje Indol-3-piruvata u 2-hidroksi 2-(indol-3-ilmetil)-4-keto glutaričnu kiselinu sa

aidolazom

Ovaj primer opisuje metode koje se mogu koristiti da se konvertuje indol-3-piruvat u 2-hidroksi 2-(indol-3-ilmetil)-4-keto glutaričnu kiselinu monatin prekursor (MP) korišćenjem jedne aldolaze (liaza) (SLIKA 2). Kondenzacije aldola su reakcije koje stvaraju veze ugljenik-ugljenik između P-ugljenik aldehida ili ketona i karbonil ugljenika drugog aldehida ili ketona. Karbanion se stvara na ugljeniku koji je uz karbonil grupu jednog supstrata, i služi kao nukleofil koji napada karbonil ugljenik drugog supstrata (elektrofilni ugljenik). Najčešće, ovaj elektrofilni supstrat je aldehid, pa zato najveći broj aldolaza spada u kategoriju EC 4.1.2.-. Vrlo često, ovaj nukleofilni supstrat je piruvat. Manje je često da aldolaze katalizuju kondenzaciju između dve keto-kiseline ili dva aldehida.

Međutim, identifikovane su aldolaze koje koje katalizuju kondenzaciju dve karboksilne kiseline. Na primer, EP 1045-029 opisuje produkciju L-4-hidroksi-2-ketoglutarične kiseline iz

glioksilične kiseline i piruvata korišćenjem kulturePseudomonas(EC 4.1.3.16). Uz to, 4-hidroksi-4-metil-2-oksoglutarat aldolaza (4-hidroksi-4-metil-2-oksoglutarat piruvat liaza, EC 4.1.3.17) može da katalizuje kondenzaciju dve keto kiseline. Prema tome, slični aldolaza polipeptidi korišćeni su da se katalizuje kondenzacija indol-3-piruvata sa piruvatom.

Kloniranje

4-Hidroksi-4-metil-2-oksoglutarat piruvat liaze (ProA aldolaza, EC 4.1.3.17) i 4-hidroksi-2-oksoglutarat glioksilate-liaza (KHG aldolaza, EC 4.1.3.16) katalizuju reakcije veoma slične aldolaza reakciji prikazanoj na SLICI 2. Prajmeri su osmišljeni sa odgovarajućim vešanjem za pET30 Xa/LIC vektor (Novagen, Madison, WI). Osmišljavanje ovih prajmera je opisano gore u Primeru 1.

Sledeći prajmeri su dizajnirani za pET30 Xa/LIC kloniranje:

1.Pseudomonas stramineaproAgen (Genbank Pristupni br.: 12964663 Verzija: 12964663) iComamonas testosteroni proAgene (SEQ ID NOS: 65-66, nukleinska kiselinska sekvenca odnosno amino kiselinska sekvenca) prednji 5'-GGTATTGAGGGTCGCATGTACGAACTGGGAGTTGT-3' i reverzni 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTAGTCAATATATTTCAGGC-3' (SEQ ID NOS: 55 i 56).2. Sinorhizobium meliloti1021 SMc00502 gen (homologza proA,Genbank Pristupni Br.: 15074579 i CAC46344, nukleinska kiselinska sekvenca, odnosno amino kiselinska sekvenca) prednji 5'- 3. Sphingomonas sp. LB126 fldZ gen (Genbank Pristupni br.:7573247 Verzija: 7573247, kodovi za putativnu acil transferazu) prednji 5'- 4. Arthrobacter keyseripcmE gen (Genbank Pristupni br.: AF331043 Verzija: AF331043.1, kodovi za oksalocitramalat aldolazu) prednji 5'- 5. Versiniapestis strainC092 YPO0082 gen (Genbank Pristupni br.: 15978115 Verzija: 15978115, kodovi za moguću transferazu) prednji 5'- 6. Bacillus subtilis khg gen (Genbank Pristupni Br. Z99115.1GL2634478, 126711-127301and CAB14127.1, nukleinska kiselinska sekvenca,odnosno amino kiselinska sekvenca,) 7. E. coli khg gen(Genbank Pristupni Br..AE000279.1 1331-1972 i AAC74920.1, nukleinska kiselina, odnosno amino kiselinska sekvenca) prednji 5'- 8. 5.meliloti khg gen (Genbank Pristupni Br. AL591792.1GI: 15075850, 65353-64673 i CAC47463.1, nukleinska kiselina, odnosno amino kiselinska sekvenca) prednji 5'-

Genomska DNK iz organizama opisanih u 1-2 i 6-8, gore, je prečišćena korišćenjem Protokola Qiagen genomski-tip. Korišćenjem sličnih tehnika genomska DNK iz organizama opisanih u 3-5 može biti prečišćena.

Pseudomonas straminea(ATCC 33636) je gajen na 30°C u hranljivoj čorbi i hidroksibenzoatnoj podlozi.Comamonas testosteroni(ATCC 49249) je gajen na 26°C u hranljivoj čorbi i hidroksibenzoatnojpodlozi. Sphingomonassp. LB 126 (Flamanski institut za tehnološka istraživanja,VITO, B-2400 Mol, Belgija) gaji se u skladu sa metodom koju su opisali Wattiau ;saradnici ( Research in Microbiol.152:861-72, 2001).Arthrobacter keyseri(Gulf Ecologv Division,

Nacionalna laboratorija za zdravstvena i ekološka istraživanja i dejstva; Američka agencija za

zaštitu živtotne sredine,National Health i Environmental Effects Research Laboratorv, U.S. Environmental Protection Agencv, Gulf Breeze, FL 32561, USA) je gajen u skladu sa protokolom koji je opisaoEaton ( J. Bacteriol.183:3689-3703,2001).Sinorhizobium meliloti 1021 (ATCC51124) je gajen na 26°C u podlozi ATCC TY i hidroksibenzoatnoj podlozi. SojYersiniapestisC092 (ATCC) gajenje na 26°C u podlozi ATCC 739 agaru konjske krvi.Bacillus subtilis6051 (ATCC) je gajen na 30°C Bereto hranljivoj čorbi (Difco; Detroit, MI).E. coligenomska DNK je izolovana iz soja DH10B (Invitrogen) kako je opisano u Primeru br. 1.

PCR, kloniranje, i protokoli skeniranja koji su opisani u Primeru 1 korišćeni su i da se klonirajuC. testosteroniiS. meliloti proAsekvence, kao iE. coli, B. subtilis,iS. meliloti khgsekvence. Ove iste metode mogu da se koriste da se kloniraju i druge sekvence koje su gore opisane.

Pozitivni kloni su sekvencirani korišćenjem sekvenciranja dideoksi lančanog završetka (Seqwright, Houston, TX) sa S-tag i T7 terminator prajmerima (Novagen), i internim prajmerima dobijenim od Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA).

Eseji ekspresije i aktivnosti

Plazmid DNK (verifikovan analizom sekvence) supkloniran je u domaćina ekspresije BL21(DE3) (Novagen). Ove kulture su gajene u podlozi LB sa 50 mg/L kanamicina, dok su plazmidi izolovani korišćenjem kompletaQiagen spin plazmid miniprepi potom analizirani restrikcionom digestijom da se potvrdi identitet. Indukcioni eksperimenti su rađeni sa BL21(DE3) konstruktima koji su gajeni u podlozi LB sa sadržajem 50 mg/L kanamicina na 37°C. Proteinska ekspresija je indukovana korišćenjem 0.1 mM IPTG pošto je OD60odostigao približno 0.6. Ove ćelije su gajene tokom 4 sata na 30°C i ubrane centrifugiranjem. Ove su ćelije onda lizirane korišćenjem Bugbuster™ reagensa (Novagen) a Ilis-tag rekombinantni proteini su prečišćeni korišćenjem His-Bind punjenja kako je to već gore opisano (Primer 1). Prečišćeni proteini su de-saltirani na PD-10 kolonama za jednokratnu upotrebu i eluirani u 50 mM Tris-HCl puferu, pH 7.3 sa 2 mM MgCl2.

Ovi proteini su analizirani pomoću SDS-PAGE na 4-15% gradient gelu da se detektuju nivoi solubilnih proteina na predviđenom MW e rekombinantnog fuzionog proteina.

Ovi proteini su analizirani da im se utvrdi aktivnost korišćenjem indol-3-piruvata i natrijum piruvata kao supstrata. Mešavina za esej je sadržala 100 mM Tris-HCl (pH 7-pH 8.9), 0-8 mM MgCI2, 3 mM kalijum fosfata (pH 8), i 6 mM od svakog od supstrat u 1 mL. Ova reakcija je započeta dodavanjem različitih količina polipeptida (na primer od 10 do 100 |ig), i inkubirana je na 25°C-37°C tokom 30 minuta, filtriran i potom zamrznuta na -80 °C.

Rezultati aktivnosti sa genskim produktimaproA

Oba, t.j. iC. testosteroni proAiS. meliloti SMc00502genski konstrukti imali su visoke nivoe ekspresije kada su indukovani pomoću IPTG. Ovi rekombinantni proteini su bili visoko solubilni, kao stoje određeno pomoću SDS-PAGE analize ukupnih proteina i uzoraka ćelijskih ekstrakata. Genski produktC. testosteroni jeprečišćen do čistoće > 95%. Budući daje prinos genskog produktaS. melilotibio veoma nizak posle afinitetne purifikacije korišćenjem punjenja His-Bind, ćelijski ekstrakt je iskorišćen za enzimski esej.

Obe rekombinantne aldolaze katalizovale su formaciju MP iz indol-3-piruvata i piruvata. Za enzimsku aktivnost bilo je neophodno prisustvo oba divalentna magnezijum i kalijum fosfata. Nijedan od ovih proizvoda nije se pojavljivao kada je bio odsutan ma koji od sledećih: indol-3-piruvat, piruvat, ili kalijum fosfat. Dobijena je i mala količina ovog proizvoda u odsustvu enzima (tipično tipično jedan red veličine manje nego kada je enzim bio prisutan).

Vršna vrednost proizvoda eluiranaje iz kolone reverzne faze C18 malo kasnije od indol-3-piruvat standarda, masena spektrometrija ove vršne vrednosti pokazala je kolizijom indukovani roditeljski jon ([M + H]+) od 292.1, i to roditeljski jon koji je očekivan za proizvod MP. Glavni kćerinski fragmenti koji su prisutni u masenom spektru uključili su one sa m/z =158 (l//-indol-3-karbaldehid karbonijum jon), 168 (3-buta-l,3-dieniI-l//-indol carbonijum jon), 274 (292 - H20), 256 (292 - 2 H20), 238 (292 - 3 H20), 228 (292 - CH403), i 204 (gubitak piruvata). Ovaj proizvod je takođe ispoljavao UV spektar koji se odlikuje drugačijim indol-sa sadržajem jedinjenja kao što su triptofan, sa Xmaxof 279-280 i malim porastom (u vidu ramena) od 290 nm.

Količina MP koju produkujeC. testosteronialdolaza povećava se sa porastom u temperaturi reakcije sa sobne temperature do 37°C, količinom supstrata, i količinom magnezijuma. Sintetska aktivnost ovog enzima opada sa porastom pH, gde je najveća količina proizvoda zabeležena na pH 7. Na osnovu triptofanskog standarda, količina MP koja se proizvodi u uslovima standardnog eseja korišćenjem 20 u.g prečišćenog proteina iznosila je približno 10-40 u.g na 1 mL reakcije.

Zbog visokog stepena homologijeS. meliloti i C. testosteroniProA aldolaza kodirajuće sekvence sa drugim genima koji su gore opisani, očekuje se da svi proizvodi rekombinantnih gena mogu da katalizuju ovu reakciju. Staviše, očekuje se da će aldolaze koje imaju treonin (T) na pozicijama 59 i 87, arginin (R) na 119, aspartat (D) na 120, i histidin (H) na 31 i 71, (zasnovano na sistemu brojanja zaC. testosteroni)imati sličnu aktivnost.

Rezultati aktivnosti sa genskim proizvodimakhg

Oba, iB. subtilisiE. coli khggenski konstrukti su imali visoke nivoe ekspresije proteina kada su indukovani sa IPTG, dok jeS. meliloti khgimao niži nivo ekspresije. Ovi rekombinantni proteini su bili visoko solulbilni, kako je to procenjeno analizom SDS-PAGE ukupnih proteina i ćelijskih ekstrakata. Genski produktiB. subtilisiE. coli khgsu prečišćeni do čistoće od > 95%; prinos genskog proizvodaS. melilotinije bio tako visok kao posle afinitetne purifikacije korišćenjem punjenja His-Bind.

Nema dokaza da su magnezijum i fosfat potebni za aktivnost za ovaj enzim. Međutim, literaturni podaci ukazuju na obavljanje eseja u puferu natrijum fosfata, kao i daje ovaj enzim navodno bifunkcionalni i ima aktivnost na fosforilisane supstrate kao što su 2-keto-3-deoksi-6-fosfoglukonate (KDPG). Ovi enzimski eseji su obavljani kako je gore napisano, i u nekim slučajevima fosfat je preskočen. Rezultati ukazuju da rekombinantne KHG aldolaze produkuju MP, ali nisu tokiko aktivne kao ProA aldolaze. U nekim slučajevima nivo MP koji produkuje KHG bio je skoro identičan količini koji su produkovali sami magnezijum i fosfati. Nije se pokazalo da fosfat povećava aktivnosti KHG.Bacillusenzim je imao najveću aktivnost, približno 20-25% veću aktivnost nego sami magnezijum i fosfat, kako je to utvrđeno pomoću SRM (vidi Primer 10).Sinorhizobiumenzim je imao najmanju količinu aktivnosti, što može biti praćeno savijanjem i problemima sa rastvorljivošću koji su primećeni u ekspresiji. Sva ova tri enzima imaju aktivnu lokaciju glutamata (pozicija 43 uB. subtilisbrojčanom sistemu) kao i lizina koji je potreban za formiranje Shiff baze sa piruvatom (pozicija 130); međutim,B. subtilisenzim sadrži treonin na poziciji 47, aktivni reziduum na tom mestu, a ne arginine.B. subtilisKHG je manji i i izgleda kao da je u grupi (klasteru) odvojenom od enzimaS. meliloti i E. coli,gde drugi enzimi imaju aktivno mesto za treonin. Ove razlike u aktivnom mestu mogu da budu razlog za pojačanu aktivnost enzimaB.

subtilis.

Unapređenje aktivnosti aldolaza

Katalitička antitela mogu biti efektivna kao i prirodne aldolaze, osim širokog spektra supstrata, i može da se koristi da se katalizuje reakcija pokazana na SLICI 2.

Aldolaze mogu takođe da se unaprede usmerenom evolucijom, na primer kao što je prethodno opisano za KDPG aldolazu (visoko homologno za KHG kako je gore opisano) koja evolvira preko DNK razmeštanja i PCR sklonim greškama da se uklone zahtevi za fosfat i da se obrne enantioselektivnost. KDPG aldolaza polipeptidi su korisni za biohemijske reakcije jer su visoko specifični za donorski supstrat (ovde je to piruvat), ali su relativno fleksibilni kada se radi o supstratu akceptora (t.j. indol-3-piruvat) (Koeller & Wong,Nature409:232-9, 2001). KHG aldolaza poseduje aktivnost za kondenzaciju piruvata sa velikim brojem karboksilnih kiselina. Smatra se da sisarske verzije KHG aldolaza imaju širu specifičnost od bakterijskih verzija, uključujući veću aktivnost na 4-hidroksi 4-metil 2-oksoglutaratu i prihvatanje oba stereoizomera f 4-hidroksi-2-ketoglutarata. Pokazalo se da bakterijski izvori imaju dcsetostuko veću sklonost (preferencu) za a 10-R izomer. Postoji skoro 100 KHG homologa na raspolaganju u genomskim bazama podataka, i aktivnost im je pokazana uPseudomonas, Paracoccus, Providencia, Sinorhizobium, Morganella, E. coli, itkivima sisara. Ovi enzimi mogu da se koriste kao početna tačka za podešavanje enantiospecifičnosti koja je željena za produkciju monatina.

Aldolaze koje koriste piruvat i drugi supstrat koji je ili keto kiselina i/ili ima veliku hidrofobnu grupu kao što je indol mogu da se "razvijaju" da se prilagode specifičnosti polipeptida brzini i selektivnosti. Uz to KHG i ProA aldolaze kako su ovde prikazani, pokazuju da u primere ovih enzima spadaju, ali da ni ovo nije iscrpna lista: KDPG aldolaza i srodni polipeptidi (KDPH); transkarboksibenzalpiruvat hidrataza-aldolaza odNocardioidesst; 4-(2-karboksifenil)-2-oksobut-3-enoate aldolaza (2'-karboksibenzalpiruvat aldolaza) koji kondenzuje piruvat i 2-karboksibenzaldehid (jedan aromatični prsten-sa sadržajem supstrata); trans-O-hidroksibenzilidenepiruvat hidrataza-aldolaza izPseudomonas putidaiSphingomonas aromatic niivorans,vvhich takođe utilizes piruvat i an aromatični-sa sadržajem aldehid as supstrats; 3-hidroksiaspartate aldolaza (eritro-3-hidroksi-L-aspartate glioksilate liaza), koji koristi 2-okso kiseline kao supstrate i smatra se da se nalazi u organizmuMicrococcus denitrificans;benzoin aldolaza (benzaldehid liaza), koji koristi supstrate sa sadržajem benzil grupa; dihidroneopterin aldolaza; L-treo-3-fenilserin benzaldehid-liaza (fenilserin aldolaza) koji kondenzuje glicin sa benzaldehidom; 4-hidroksi-2-oksovalerate aldolaza; 1,2-dihidroksibenzilpiruvat aldolaza; i 2-hidroksibenzalpiruvat aldolaza.

Jedan polipeptid koji ima željenu aktivnost može da se selektuje skriningom klona koji nas zanimaju korišćenjem sledećih metoda. Triptofan auksotrofi se transforišu vektorima koji nose klone koji nas zanimaju na ekspresionoj kaseti i gaje se na podlozi sadržajem malih količina monatina ili MP. Budući da su reakcije aminotransferaza i aldolaza reverzibilne, ove ćelije mogu da produkuju triptofan iz racemijske mešavine monatina. Isto tako, organizmi (i rekombinantni i divljeg tipa) mogu da se podvrgnu skriningu da se utvrdi njihova sposobnost da koriste MP ili monatin kao izvore ugljenika i energije. Jedan izvor ciljnih aldolaza jeste ekspresija biblioteka različitih sojevaPseudomonas irhizobakterija. Pseudomonasi imaju mnogo neuobičajenih kataboličkih puteva za degradaciju aromatičnih molekula, a oni takođe sadrže mnoge aldolaze; dok rizobakterije sadrže aldolaze, i poznato je da gaje biljne rizosfere, i imaju mnoge od gena koji su opisani kao sastavni delovi puta biosinteze za monatin.

Primer5

Hemijska sinteza monatinskog prekursora

Primer 4 opisuje metodu korišćenja aldolaze da se konvertuje indol-3-piruvat u 2-hidroksi 2-(indol-3-ilmetil)-4-keto glutarična kiselina monatin prekursor (MP). Ovaj primer opisuje jednu alternativnu metodu hemijske sinteze MP.

MP se formira korišćenjem tipične kondenzacije aldolskog tipa (SLIKA 4). Ukratko, tipična reakcija aldolskog tipa uključuje generisanje karbaniona u piruvatski ester korišćenjem snažne baze kao što su LDA (litijum diisopropilamid), litijum heksametildisilazan ili butil litijum. Karbanion koji se generiše reaguje sa indol-piruvatom da se oformi kuplirani proizvod.

Zaštitne grupe koje mogu da se koriste za zaštitu indol azota obuhvataju, ali nisu ograničene sledećim: t-butiloksikarbonil (Boe), i benziloksikarbonil (Cbz). Blokirajuće grupa za karboksilne kiseline obuhvataju, ali nisu ograničene: alkil esters (na primer, metil, etil, benzil esteri). Kada se koriste takve protektivne grupe, nije moguće da se kontroliše stereohemijna produkata koji se dobiju. Međutim, ako su R2 i/ili R3 hiralne zaštitne grupe (SLIKA 4), kao što su (S)-2-butanol, mentol, ili jedan hiralni amin, ovo može da podstakne formaciju jednog MP enantiomera na uštrb drugoga.

Primer 6

Konverzija triptofana ili indol-3-piruvata u monatin

Jedanin vitroproces koji koristi dva enzima, jednu aminotransferazu i jednu aldolazu, produkovao je monatin iz triptofana i piruvata. U prvom koraku alfa-ketoglutarat je bio akceptor ove amino grupe iz triptofana u reakciji transaminacije generišući indol-3-piruvat i glutamate. Jedna aldolaza je katalizovala drugu reakciju u kojoj je piruvat regovan sa indol-3-piruvatom, u prisustvu Mg<2+>i fosfata, generišući alfa-keto derivat monatina (MP), 2-hidroksi-2-(indol-3-ilmetil)-4-ketoglutaričnu kiselinu. Transfer amino grupe iz glutamata formiranog u prvoj reakciji doveo je do proizvodnje željenog produkta, monatina. Purifikacija i karakterizacija ovog proizvoda utvrdila je da je izomer koji je formiran bio S,S-monatin. Alternativni supstrati, enzimi, i uslovi su opisani, jednako kao i poboljšanja koja su dobjena za ovaj proces.

Enzimi

Aldolaza, 4-hidroksi-4-metil-2-oksoglutarat piruvat liaza (ProAaldolaza, proAgen) (EC 4.1.3.17) izComamonas testosteroni jeklonirana, eksprimirana i prečišćena kao što je opisno u Primeru 4. KHG aldolaza, 4-hidroksi-2-oksoglutarat glioksilat liaza (EC 4.1.3.16) izB. subtilis, E. coli, i S. melilotisu klonirane, eksprimirane i prečišćene kao što je opisno u Primeru 4.

Aminotransferaze koje su korišćene u sprezi sa aldolazama da se proizvede monatin bile su L-aspartat aminotransferaza enkodirana pomoćuE. coli aspCgena, e tirozin aminotransferaza enkodirana pomoćuE. coli tyrBgene,c S. melilotiTatA enzim, široki supstrat aminotransferaza enkodirana pomoćuL. major bsatgena, ili glutamic-oksalosirćetna transaminaza iz srca svinje (Tip Ha). Ovo kloniranje, ekspresija i purifikacija ne-sisarskih proteina opisani su Primeru 1. Glutamična-oksalosirćetna transaminaza iz srca svinje (tip Ha) dobijena je iz firme Sigma (# G7005).

Metoda korišćenjem ProA aldolaza i L- aspartat aminotransferaza

Reakciona mešavina sadržavala je 50 mM amonijum acetata, pH 8.0,4 mM MgCl2,3 mM kalijum fosfata, 0.05 mM piridoksal fosfata, 100 mM amonijum piruvata, 50 mM triptofana, 10 mM alfa-ketoglutarata, 160 mg rekombinantneC. testosteroniProA aldolaze (neprečišćeni ćelijski ekstrakt, -30% aldolaza), 233 mg rekombinantneE. coliL-aspartat aminotransferaze (neprečišćeni ćelijski ekstrakt,~40% aminotransferaze) u jednom litru. Sve komponente osim enzima skupa su promešane i inkubirane na 30°C dok se triptofan nije rastvorio. Ovi enzimi su dodati i reakciona mešavina je inkubirana na 30°C blagim mućkanjem (100 rpm) tokom 3.5 sata. Pola sata i 1 sat po dodavanju enzima alikvoti čvrstog triptofana (svaki po 50 mmola) dodati su u reakciju. Sav dodati triptofan se nije rastvorio, ali je koncentracija održavana na 50 mM ili većoj. Posle 3.5 sata, čvrsti triptofan je isfiltriran. Analiza reakcione mešavine pomoću LC/MS korišćenjem definisane količine triptofana kao standarda pokazala je daje koncentracija triptofana u rasstvoru bila 60.5 mM a koncentracija monatina bila je 5.81 mM (1.05 g).

Sledeće metode iskorišćene su da se prečisti final proizvod. Devedeset procenata bistrog rastvora je naneto na kolonu BioRad AG50W-X8 smole (225 mL; kapacitet vezivanja 1.7 meq/mL). Ova kolona je oprana vodom, prikupljajući frakcije od 300 mL sve dok apsorbanca na 280 nm nije bila <5% od prvog protoka kroz frakciju. Ova kolona je onda eluirana sa 1 M amonijum acetata, pH 8.4, prikupljajući frakcije od 4 300-mL. Sve 4 frakcije su sadržavale monatin i evaporisane su do 105 mL korišćenjem jednog roto-evaporatora u mlakom vodenom kupatilu. Kako se zapremina smanjivala, formirao se talog i isfiltriran je tokom procesa evaporacije.

Analiza frakcija kolone LC/MS pokazala je da je 99% triptofana i monatina vezano za kolonu. Talog koji se formirao tokom procesa evaporacije sadržao je >97% triptofana i <2% monatina. Odnos triptofana i proizvoda u supernatantu iznosio je približno 2:1.

Supernatant (7 ml) nanet je na 100 mL Fast Flow DEAE Sepharose (Amersham Biosciences) kolonu koja je prethodno konvertovana u oblik acetata pranjem sa 0.5 L 1 M NaOH, 0.2 L vode, 1.0 L 1.0 M amonijum acetate, pH 8.4, i 0.5 L vode. Ovaj supernatant je nanet na <2 mL/min i kolona je oprana vodom 3-4 mL/min sve dok apsorbanca na 280 nm nije dostigla vrednost~0. Monatin je eluiran sa 100 mM amonijum acetata, pH 8.4, prikupljanjem frakcija od 4 100-mL.

Analiza frakcija je pokazala daje odnos triptofana i monatina u protoku kroz frakcije iznosio 85:15, a odnos u frakcijama eluenata bio je 7:93. Pod pretpostavkoim daje koeficijent ekstinkcije monatina na 280 nm isti kao i triptofana, frakcije eluenta su sadržavale 0.146 mmola proizvoda. Ekstrapolacija do pune količine od 1 L reakcije dala bi -2.4 mmola (-710 mg) monatina, za prinos od 68%.

Frakcije eluenta iz koloneDEAE Sepharoseevaporisane su do <20 mL. Jedan alikvot proizvoda dodatno je prečišćen nanošenjem na C8preparativne kolone reverzne-faze korišćenjem istih hromatografskih uslova kao što su oni koji su opisanu u Primeru 10 za karakterizaciju monatina na analitičkoj vagi.Softver Waters Fractionlynx™ jeupotrebljen da se pokrene automatsko prikupljenje frakcija monatina bazira se na detekcijimlz= 293 jon. Prikupljena je ova frakcija iz kolone Cg sa odgovarajućim protonatiranim molekularnim jonom za monatin, uparena do suvog, i i potom rastvorena u maloj količini vode. Ova frakcija je iskorišćena za karakterizaciju proizvoda.

Rezultujući proizvod je karakterizovan korišćenjem sledećih metoda.

UV/Vidljiva Spektroskopija.Merenja enzimski produkovanog monatina UV/vidljivom spektroskopijom obavljena su korišćenjem Cary 100 Bio UV/vidljivog spektrofotometra. Ovaj prečišćeni proizvod, rastvoren u vodi, pokazao je apsorpcioni maksimum od 280 nm sa krivinom na 288 nm, čije su karakteristike tipične za indol sa sadržajem jedinjenja.

Analiza LC/MS.Analize mešavina monatina izvedene izin vitrobiohemijske reakcije bile su obavljene kao što je opisano u Primeru 10. Jedna tipična LC/MS analiza monatina uin vitroenzimskoj sintetskoj mešavini je ilustrovana na SLICI 5. Donji deo SLIKE 5 ilustruje odabrani jonski hromatogram za protonatirani molekularni jon monatina nam/ z =293. Ova identifikacija monatina u mešavini podržana je i potvrđena masenom spektrometrijom ilustrovanom na SLICI 6. Analiza prečišćenog proizvoda pomoću LC/MS popkazala je samo jedan šiljak sa molekularnim jonom od 293 i apsorbancom na 280 nm. Maseni spektar je bio identičan kao i onaj pokazan na SLICI 6.

Analiza MS/MS.LC/MS/MS kćerinski jonski eksperimenti, kao što je opisano u Primeru 10, takođe su obavljeni na monatinu. Maseni spektar kćerinskog jona monatina ilustrovan je na SLICI 7. Izvršeno je provizorno strukturno raspoređivanje svih fragmentnih jona obeleženih na SLICI 7. Ovde spadaju fragmenti jonam/ z= 275 (293 - H20), 257 (293-(2 x H20)), 230 (275-C00H),212 (257-C00H), 168 (3-buta-l,3-dienil-l//-indoI karbonijum jon), 158 (l//-indol-3-carbaldehid karbonijum ion), 144 (3-ethl-l//-indol karbonijum jon), 130 (3-metilen-l//-indol karbonijum ion), i 118 (indol karbonijum jon). Mnogi od njih su oni isti koji su dobijeni u MP (Primer 4), kao što je i očekivano ako se izvode iz indolnog dela molekula. Neku su 1 masenu jedinicu viši od onih koji se viđaju za MP, zbog prisustva amino grupe umesto keton<.

MSanaliza visoke rezolucije.SLIKA 8 ilustruje maseni spektar koji je dobijen za prečišćeni monatin korišćenjemAppliedBiosystems- Perkin Elmer Q- Star hibrid quadrupole/ time- of-flightmasenog spektrometra. Izmerena masa za protonatirani monatin korišćenjem triptofana kao internog standarda za kalibraciju mase iznosila je 293.1144. Izračunata masa protonatiranog monatina zasnovana na ovakvom sastavu elemenata C|4H|7N20siznosila je 293.1137. Ovo predstavlja grešku merenja mase manju od 2 dela na milion (ppm), čime se daje definitivni zaključak0tome kakav je elementarni sastav monatina koji je proizveden enzimski.

NMR Spektroskopija.NMR eksperimenti su rađeni naVarian Inova500 MHz instrumentu. Uzorak monatina (~3 mg) rastvoren je u 0.5 ml D20. Inicijalno, rastvarač (D20) je korišćen kao interna referenca na 4.78 ppm. Budući daje maksimalna vrednost (šiljak) za vodu bila visoka, 'H-NMR je rađen sa supresijom šiljka za vodu. Posle toga, zbog širine šiljka vode, kao referntni šiljak je korišćen C-2 proton monatina, i postavljen na objavljenoj vrednosti od 7.192 ppm.

Za<l3>C-NMR, inicijalno rađenih nekoliko stotina snimaka je ukazalo na to daje uzorak bio previše razblažen da bi se dobio adekvatni spektar<l3>C u utvrđenom vremenu. Prema tome, obavljen je eksperiment heteronuklearne multiple kvantumske koherencije (HMQC) čime je omogućena korelacija vodonika i ugljenika za koje su bili spojeni, i takođe dobijane su informacije o hemijskim pomeranjima ugljenika.

Zbir podataka o 'H i HMQC prikazanje na Tabelama 2 i 3. Poređenjem sa objavljenim vrednostima, NMR su pokazali daje enzimski proizvedeni monatin bio bilo (S,S), (R,R), ili mešavina 1 jednog i drugog.

Hiralna LC/MS analiza.Da bi se utvrdilo daje monatin koji je produkovanin vitro jedanizomer, a ne mešavina (R,R) i (S,S) enantiomera, hiralne LC/MS analize su sprovedene korišćenjem instrumenata koji su opisani u Primeru 10.

Hiralne LC separacije su obavljene korišćenjemChirobiotic T ( AdvancedSeparations Technology)hiralne hromatograske kolone na sobnoj temperaturi. Separacija i detekcija, bazirani na objavljenim protokolima prodavca, optimalizovani su za R- (D) i S- (L) izomere triptofana. LC mobilna faza sastojala se od A) vode sa sadržajem 0.05% (v/v) trifluorosirćetne kiseline; B) metanola sa sadržajem 0.05% (v/v) trifluorosirćetne kiseline. Elucija je bila izokratska na 70% A i

30% B. Brzina protoka bila je 1.0 mL/min, i PDA apsorbanca bila je praćena na 200 nm do 400 nm. Parametri instrumenata koji su korišćeni za hiralnu LC/MS analizu triptofana i monatina su identični onima koji su opisani u Primeru 10 za LC/MS analizu. Iskorišćeno je prikupljanje masenih spektara za regionm/ z150-400. Odabrani jonski hromatogrami za protonatirane molekularne jone ([M + H]<+>= 205 za oba, R- i S-triptofan i [M + H]<+>= 293 za monatin) omogućavali su direktnu identifikaciju oviha analiziranih komponenti u mešavinama.

Hromatogrami R- i S-triptofan i monatin, separirani hiralnom hromatografijom i posmatrani i praćeni pomoću MS, prikazani su na SLICI 9. Samo jedna vršna vrednost (šiljak) na hromatogramu monatina ukazuje na to daje ta komponenta jedan izomer, sa retencionim vremenom skoro identičnim S-triptofanu.

PolarimetrijaOptička rotacija merena je na Rudolph Autopol III polarimetru. Monatin je pripreman u vidu 14.6 mg/mL rastvora u vodi. Očekivana specifična rotacija ([o:]d<20>) za S,S monatin (oblik soli) je -49.6 za 1 g/mL rastvora u vodi (Vleggaaret al).Zabeležena vrednost [a]o<20>iznosila je -28.1 za prečišćeni, enzimski produkovani monatin ukazujući na to da se radi o S, S izomeru.

Poboljšanja

Uslovi reakcije, uključujući koncentracije reagensa i enzima, optimalizovani su i dobijen je prinos od 10 mg/mL korišćenjem sledeće mešavine reagensa: 50 mM amonijum acetata pH 8.3, 2 mM MgCl2, 200 mM piruvata (natrijumova ili amonijumova so),

5 mM alfa-ketoglutarata (natrijumova so), 0.05 mM piridoksal fosfata,

Deaerisana voda da se postigne finalna zapremina 1 mL po dodavanju enzima,

3 mM kalijum fosfata, 50 u.g/mL rekombinantne ProA aldolaze (ćelijski ekstrakt; ukupna koncentracija proteina od 167 u,g/mL), 1000 u,g/mL L-aspartat aminotransferaze enkodirane pomoćuE. coli aspCgena (ćelijski ekstrakt; ukupna koncentracija proteina od 2500 u.g/mL), i čvrsti triptofan da se dobije koncentracija od > 60 mM (saturisana; određena količina nerastvorenog tokom cele reakcije). Ova mešavina je inkubirana na 30°C tokom 4 sata blagim mešanjem ili mućkanjem.

Supstitucije

Koncentracija alfa-ketoglutarata može da se redukuje do 1 mM i dodaje se suplement od 9 mM aspartata sa ekvivalentnim prinosom monatina. Alternativni amino kiselinski akceptori kao što su oksaloacetati mogu da se koriste u prvom koraku,.

Kada je korišćena rekombinantnaL. majorširoko supstratna aminotransferaza umestoE. coliL-aspartate aminotransferaza, postignut je sličan prinos monatina. Međutim, jedan drugi

neidentifikovani proizvod (3-10% glavnog proizvoda) molekularne mase od 292 takođe je detektovan pomoću analize LC-MS. Koncentracije monatina od 0.1-0.5 mg/mL produkovane su kada jeE. coli tyrBencodirani enzim,S. meliloti tat Aencoded enzim ili glutamična-oksalosirćetna transaminaza iz srca svinje (tip Ha) dodata kao aminotransferaza. Kada se započinje ova reakcija od indol-3-piruvata, reduktivna aminacija može da se obavi za poslednji korak sa glutamate dehidrogenazom i NADH (kao u Primeru 7).

KHG aldolaze izB. subtilis, E. coli, i S. melilotisu takođe korićene saE. coliL-aspartat aminotransferazom da se monatin produkuje enzimski. Korišćeni su sledeći uslovi reakcije: 50 mM NH4-OAc pH 8.3, 2 mM MgCl2,200 mM piruvat, 5 mM glutamat, 0.05 mM piridoksal fosfat, deaerisana voda da se postigne finalna zapremina od 0.5 mL po dodavanju enzima, 3 mM kalijum fosfata, 20 ng/mL of rekombinantneB. subtilisKHG aldolaze (prečišćene), ca. 400 u.g/mLof E. coliL-aspartat aminotransferaza (AspC) neprečišćeni iz ćelijskog ekstrakta, i 12 mM indol-3-piruvat. Ove reakcije su inkubirane na 30°C tokom 30 minuta mućkanjem. Količina monatina proizvedenog korišćenjemB. subtilisenzima iznosila je 80 ng/mL, i povećavala se s povećanjem količine aldolaze. Ako su indol-3-piruvat i glutamat zamenjeni zasićujućim količinama triptofana i 5 mM alfa-ketoglutarata, produkcija monatina povećana je do 360 ng/mL. Reakcije su ponavljane sa 30 u,g/mL svakoga od tri KHG enzima u 50 mM Tris pH 8.3, sa zasićujućim količinama triptofana i omogućeno je da se nastave tokom jednog sata u cilju pojačanja detekcije. EnzimBacillus jeimao najveću aktivnost kao u Primeru 4, produkujući približno 4000 ng/mL monatina.E. coliKHG je produkovao 3000 ng/mL monatina, a enzimS. meliloti jeprodukovao 2300 ng/mL.

Primer 7

Interkonverzija između MP i monatina

Aminacija MP da se oformi monatin može da se katalizuje pomoću aminotransferaza kao što su one identifikovane u Primerima 1 i 6, ili pomoću dehidrogenaza koje iziskuju redukujući ko-faktor kao što je NADH ili NADPH. Ove reakcije su reverzibilne i mogu se meriti u oba pravca. Pravac, kada se koristi enzim dehidrogenaza, može u mnogome da se kontroliše koncentracijom amonijumovih soli.

Aktivnost dehidrogenaza.Oksidativna deaminacija monatina praćena je narednim povećanjem apsorbance na 340 nm budući daje NAD(P)+ bila konvertovana u hromoforični NAD(P)H. Monatin je enzimski produkovan i prečišćen kao što je opisano u Primeru 6.

Tipična mešavina za esej sadržala je 50 mM Tris-HCl, pH 8.0 do 8.9, 0.33 mM NAD<+>ili

NADP<+>, 2 do 22 jedinice glutamat dehidrogenaze (Sigma), i 10-15 mM supstrat u 0.2 mL. Ovaj esej je rađen u duplikatu u ploči za mikrotitraciju koja je prozirna za UV-svetlo na čitaču ploče Molecular Devices SpectraMax Plus. Mešavine ovog enzima, pufera, i NAD(P)<+>pipetirane su u udubljenja sa sadržajem ovog supstrata i povećanje apsorbance na 340 nm praćeno je u intervalima od po 10 kundi posle kraćeg mešanja. Ova reakcija je inkubirana na 25°C tokom 10 minuta. Negativne kontrole su urađene bez dodavanja supstrata, a glutamat je korišćen kao pozitivna kontrola. Glutamat dehidrogenaza tipa III iz jetre goveda (Sigma # G-7882) katalizovala je konverziju monatina u monatinski prekursor brzinom konverzije od približno jedne stotine brzine konverzije glutamata u alfa-ketoglutarat.

Aktivnost transaminacije.Eseji monatin aminotransferaza obavljeni su sa aspartat aminotransferazom (AspC) izE. coli,tirozin aminotransferazom (TyrB) izE. coli,širokom supstrat aminotransferazom (BSAT) izL. major,i dve komercijalno dostupne svinjske glutamat-oksaloacetat aminotransferaze kao što je opisano u Primeru 1. Oba, i oksaloacetat i alfa-ketoglutarat su testirani kao amino akceptori. Mešavina za esej je sadržala (u 0.5 mL) 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.05 mM PLP, 5 mM amino akceptora, 5 mM monatina, i 25 u.g of aminotransferaze. Ovi eseji su inkubirani na 30°C tokom 30 minuta, i ove reakcije zaustavljene dodavanjem 0.5 mL izopropil alkohola. Gubitak monatina praćenje pomoću LC/MS (Primer 10). Najveća količina aktivnosti zabeležena je saL. majorBSAT sa oksaloacetatom kao amino akceptorom, posle čega je sledio isti enzim sa alfa-ketoglutaratom kao amino akceptorom. Ova relativna aktivnost sa oksaloacetatom iznosila je: BSAT

> AspC > svinjski tip Ha > svinjski tip I =TyrB. Ova relativna aktivnost sa alfa-ketoglutaratom iznosila je: BSAT > AspC > svinjski tip I > svinjski tip Ha > TyrB.

Primer 8

Produkcija monatina iz triptofana i C3 izvora osim piruvata

Kao što je gore opisano u Primeru 6, indol-3-piruvat ili triptofan mogu da se konvertuju u monatin korišćenjem piruvata kao C3 molekula. Međutim, u nekim okolnostima, piruvat ne mora da bude poželjan sirovinski materijal. Na primer, piruvat može biti skuplji od drugih izvora C3 ugljenika, ili može imati neželjena dejstva na fermentacije ako se doda u podlogu. Alanin može da bude transaminiran pomoću mnogih PLP-enzima da se produkuje piruvat.

Enzimi slični triptofanazi obavljaju reakcije beta-eliminacije većom brzinom od drugih PLP enzima kao što su aminotransferaze. Enzimi iz ove klase (4.1.99.-) mogu da produkuju amonijak i piruvat iz amino kiselina kao što su L-serin, L-cistein, i derivati serina i cisteina sa drobrim grupama koje odlaze kao što su O-metil-L-serin, O-benzil-L-serin, S-metilcistein, S-benzilcistein, S-alkil-L-cistein, O-acil-L-serin, 3-hloro-L-alanin.

Procesi da se produkuje monatin korišćenjem EC 4.1.99.- polipeptida mogu da se poboljšaju mutacijom p-tirozinaze (TPL) ili triptofanaze koristeći principe opisane kao metoda Mouratoui saradnici ( J. Biol. Chem274:1320-5, 1999). Mouratou /saradniciopisuju sposobnost da se konvertuje p-tirozinaza u dikarboksilnu amino kiselinu p-liazu, za koju nije zabeleženo da se pojavljuje u prirodi. Promena specifičnosti postizana je konverzijom valina (V) 283 u arginin (R) i arginina (R) 100 u treonin (T). Ove amino kiselinske promene omogućavaju da liaza prihvati dikarboksilne amino kiseline za reakcija hidrolitičke deaminacije (kao što je aspartat). Aspartat, prema tome, može takođe da se koristi kao izvor piruvata za potonje reakcije kondenzacije aldola.

Uz to, ćelije ili enzimski reaktori mogu da se snabdevaju laktatom i jednim enzimom koji konvertuje laktat u piruvat. U primerene enzima koji su u stanju da katalizuju ovu reakciju spadajulaktat dehidrogenaza i laktat oksidaza.

Izolacija genomske DNK

O triptofanaza polipeptidima već su prethodno pisali, na primer, Mouratou/ saradnici ( JBC274:1320-5, 1999). Da se izoluju geni koji enkodiraju triptofanaza polipeptide, genomska DNK izE. coliDH10B korišćena je kao obrazac (templat) PCR kao što je opisano u Primeru 1.

Ovaj gen za tirozin-fenol liazu izolovan je izC. freundii(ATCC kataloški broj 8090, Designation ATCC 13316; NCTC 9750) i gajen na Nutrient agaru (Difco 0001) i u hranljivoj čorbi (Difco 0003) na 37°C do OD od 2.0. Ova genomska DNK je prečišćena korišćenjem kompleta Oiagen Genomic-tip ™ 100/G.

PCR amplifikacije sekvence kodiranja

Prajmeri su osmišljeni sa kompatibilnim vešanjem za pET 30 Xa/LIC vektor (Novagen, Madison, WI) kao što je gore opisano u Primeru 1.

E. coli tna(SEQ ID NO: 41). N-terminalni prajmer za pET30 Xa/LIC kloniranje: 5'-GGT ATT GAG GGT CGC ATG GAA AAC TTT AAA CAT CT-3' (SEQ ID NO: 43). C-terminalni prajmer za pET30 Xa/LIC kloniranje: 5'-AGA GGA GAG TTA GAG CCT TAA ACT TCT TTA AGT TTT G-3' (SEQ ID NO: 44).

C. freundii tpl(SEQ ID NO: 42). N-terminalni prajmer za pET30 Xa/LIC kloniranje: 5'-GGT ATT GAG GGT CGC ATGAATTATCCGGCAGAACC-3' (SEQ ID NO: 45). C-terminalni prajmer za pET 30 Xa/LIC kloniranje: 5'-AGA GGA GAG TTA GAG

CCTTAGATGTAATCAAAGCGTG-3' (SEQ ID NO: 46).

Eppendorf Mastercvcler™ Gradient 5331 Thermal Cycler ] zkorišćen za sve PCR reakcije. U 50 p.L dodaje se 0.5 u.g templata (genomska DNK), 1.0 u,M svakog prajmera, po 0.4 mM od dNTP, 3.5U Expand High Fidelity Polimeraze ( Roche),IX Expand pufera sa Mg, i 5%DMSO(finalna koncentracija). Termociklerski PCR program je korišćen na sledeći način: 96°C vreli početak (5 minuta), 94°C - 30 sekundi, 40-60°C - 1 minut 45 sekundi, 72°C - 2 minuta 15 sekundi; 30 ponovaka. Finalni korak polimerizacije trajao je 7 minuta, i uzorci su čuvani na 4°C.

Kloniranje

Kloniranje i pozitivne procedure identifikacije klona koje su detaljno opisane gore u Primeru 1 iskorišćene su i da se identifikuju odgovarajući kloni.

Ekspresija gena i esej aktivnosti

Plazmid DNK (verifikovan analizom sekvence) je supkloniran u domaćinu ekspresije BL21(DE3) (Novagen). Ove kulture su gajene u podlozi LB sa 30 mg/L kanamicina, a plazmidi su izolovani korišćenjem kompletaQiagen miniprep,i analizirani restrikcionom digestijom da se potvrdi identitet.

Indukcioni eksperimenti su rađeni sa BL21(DE3) domaćinom ekspresije, konstrukti su gajeni u podlozi LB sa sadržajem 50 mg/L kanamicina na 37°C. Proteinska ekspresija je indukovana korišćenjem 0.1 mM IPTG pošto je vrednost OD60oove kulture dostigla približno 0.6. Ove ćelije su gajete tokom 4 sata na 30°C i pokupljene centrifugiranjem. Zatim su ove ćelije lizirane u 5 mL/g težine mokrih ćeliuja BugBuster™ (Novagen) reagensom sa sadržajem 5 u.L/mL proteaza inhibitor koktel kompleta #111 (Calbiochem) i 1 u.L/mL benzonaza nukleaze (Novagen), a His-tagovani rekombinantni proteini su bili prečišćeni korišćenjem His-Bind punjenja kao što je gore opisano u Primeru 1. Prečišćeni proteini su desaltirani na PD-10 (G25 Sephadex, Amersham Biosciences) koloni i eluirani u 100 mM Tris-CI puferu, pH 8.0. Ovi proteini su analizirani pomoću SDS-PAGE na 4-15% gradient gelovima da se provere nivoi solubilnih proteina na predviđenoj MW rekombinantnog fuzionog proteina.

Mutageneza

Neki članovi klase polipeptida 4.1.99.- (triptofanaza i p-tirozinaza) će obaviti beta-liaza reakciju sa aspartatom ili sličnim amino kiselinama bez ikakvih modifikacija. Međutim, nekim članovima ove grupe može biti potrebno da budu mutagenizovani da bi se omogućila upotreba supstrata i/ili stvaranje proizvoda. Štaviše, u nekim slučajevima polipeptidi koji mogu da obave konverziju mogu da se dalje optimizuju pomoću mutageneze.

Mutageneza usmerena na jednu lokalciju obavljena je na bazi 3D strukturne analize PLP-vezujućih polipeptida. Dva primera za izmenu specifičnosti supstrata polipeptida prikazana su u tekstu dole.

Mutageneza triptofanaze,

Primerl

Protokol za mutagenezu koji je dat dole, uvodi dve tačke za mutaciju u obezbeđenoj amino kiselinskoj sekvenci. Mutacija u prvoj tačci promenila je arginin (R) na poziciji 103 u treonin (T) a mutacija u drugoj tačci promenila je valin (V) na poziciji 299 u arginin (R) (sistem brojanja zaE. colizreli protein). Eksperimenti sa mutagenezom obavljani su u ATG Laboratories (Eden Prairie, MN). Mutacije su uvođene sekvencijalno pomoću PCR genskih fragmenata i pomoću ponovnog sklapanja ovih fragmenata, stoje opet postignuto tehnikom PCR. Prajmeri za konverziju arginina (R)103 u treonin (T): 5-CCAGGGCACCGGCGCAGAGCAAATCTATATT-3' (SEQ ID NO: 47) i 5'-TGCGCCGGTGCCCTGGTGAGTCGGAATGGT-3' (SEQ ID NO: 48).

Prajmeri za konverziju valina (V)299 u arginin (R): 5'-

Mutanti su skrinovani restrikcionom digestijom sa Xba I/HindIII i Sphl, i verifikovani sekvencioniranjem.

Mutageneza Tirozin Fenol Liaze ( fi- tirozinaza) Primer 2

Mutacije u dve tačke su izvršene na tirozin fenol liaza amino kiselinskoj sekvenci. Ove mutacije su konvertovale arginin (R) na poziciji 100 u treonin (T) i valin (V) na poziciji 283 u arginin (R) (uC. freundiizreloj proteinskoj sekvenci).

Prajmeri za R100T konverziju bili su: 5'-

Korišćene su sve metode kao stoje gore opisano, i klonovi su podvrgnuti skriningu digestijom KpnI/SacI d, i digestijom BstX I n. Ove sekvence su verifikovane sekvenciranjem završetka dideoksi lanca. Rekombinantni protein je produkovan kao što je gore opisano za enzime divljeg tipa.

Ova reakciona mešavina sastojala se od 50 mM Tris-Cl pH 8.3, 2 mM MgCl2,200 mM C3 izvora ugljenika, 5 mM alfa-ketoglutarata, natrijumove soli, 0.05 mM piridoksal fosfata, deaerisane vode da se postigne finalna zapremina od 0.5 mL po dodavanju enzima, 3 mM kalijum fosfata pH 7.5, 25ngsirove rekombinantneC. testosteroniProA aldolaze onako kako je pripremljena u Primeru 4, 500 u.g sirone L-aspartate aminotransferaze (AspC) kako je pripremljena u Primeru 1, i solidnog (čvrstog) triptofana da se dobije koncentr. Ova reakciona mešavina je inkubirana na 30°C tokom 30 minuta uz mešanje. Serin, alanin, i aspartat su ovde korišćeni kao izvori C3-ugljenika. Eseji su rađeni sa i bez sekundarnih PLP enzima (prečišćeni) koji su u stanju da obavljaju beta-eliminaciju i beta-1 iaza reakcije (triptofanaza (TNA), dvostruka mutant triptofanaza, (3-tirozinaza (TPL)). Rezultati su prikazani na Tabeli 4:

Ovaj monatin koji je produkovan iz alanina i serina kao izvora 3-ugljenika verifikovan je LC/MS/MS analizom skeniranja kćerinskog fragmenta, i bio je identičan karakterizovanom monatinu koji je produkovan u Primeru 6. Alanin je bio najbolja alternativa od svih koje su testirane, i bio je transaminiran pomoću AspC enzima. Količina monatina koja je proizvedena uvećana je dodavanjem triptofanaze, koji je u stanju da obavlja transaminaciju kao svoju sekundarnu aktivnost. Količina monatina koji je proizveden koristeći serin kao izvor ugljenika skoro je udvostručena dodavanjem enzima triptofanaze, iako je dodata samo jedna petina količine triptofanaze u poređenju sa aminotransferazom. AspC je u stanju da samostalno vrši određenu količinu beta-eliminacione aktivnosti. Rezultati sa aspartatom ukazuju na to da se aktivnost triptofanaze na aspartate ne povećava sa istim mutacijama usmerenim na mesto kao što je prethodno sugerisano kada se radilo o P-tirozinazi. Učekuje se da mutant P-tirozinaza ima veću aktivnost za produkciju monatina.

Primer 9

Hemijska sinteza monatina

Dodavanje alanina u indol-3-piruvičnu kiselinu produkuje monatin, i ova reakcija može da se obavlja sintetički sa Grignardom ili organolitijumskim reagensom.

Na primer, u 3-hloro- ili 3-bromo-alanin koji je primereno blokiran na karboksil i amino grupama, dodaje se magnezijum u anhidrovanim uslovima. Indol-3-piruvat (primereno blokiran) se onda dodaje da se formira kuplirani proizvod, posle čega sledi uklanjanje protektivnih grupa da se formira monatin. Protektivne grupe koje su posebno korisne uključuju THP (tetrahidropiranil eter) koji se lako i spaja i uklanja.

Primer 10

Detekcija monatina i MP

Ovaj primer opisuje metode koje se koriste da se detektuje prisustvo monatina, ili njegovog prekursora 2-hidroksi 2-(indol-3-ilmetil)-4-keto glutarične kiseline.

Analiza LC/ MS

Analize mešavina za alfa-keto kiselisku formu monatina (monatinski prekursor, MP) i monatin dobijen izin vitroiliin vivobiohemijske reakcije obavljane su korišćenjem jednog tandemskog instrumenta t.j. Waters/Micromass tečne hromatografije sa masenom spektrometrijom (LC/MS/MS) uključujući Waters 2690 tečni hromatograf sa Waters 996 F-Dioda Erej (PDA) monitorom apsorbance koji se postavljaju u seriji između ovog hromatografa iMicromass Quattro Ultima triple guadrupolemasenog spektrometra. LC separacije su obavljene korišćenjemSupelco DiscoveijC|8hromatografija sa kolonom obrnute faze, 2.1 mm x 150 mm, ili jedneXterra MS C%hromatografija sa kolonom obrnute faze, 2.1mm x 250 mm, na sobnoj temperaturi. LC mobilna faza se sastojala od A) vode sa sadržajem 0.05% (v/v) trifluorosirćetne kiseline i B) metanola sa sadržajem 0.05% (v/v) trifluorosirćetne kiseline.

Elucija gradijenta bila je linearna od 5% B do 35% B, 0-9 min, linearna od 35% B do 90% B, 9-16 min, izokratična na 90% B, 16-20 min, linearna od 90% B do 5% B, 20-22 min, sa 10 minutnim periodom ponovnog uspostavljanja ravnoteže između dva. Brzina protoika iznosila je 0.25 mL/min, a PDA apsorbanca je praćena od 200 nm do 400 nm. Svi parametri ESI-MS bili su optimalizovani i i odabrani na osnovu generisanja protonatiranih molekularnih jona ([M + H]<+>) analitičkih delova koji nas interesuju, i produkcije karakterističnih jonskih fragmenata.

Sledeći parametri instrumenata korišćeni su za LC/MS analizu monatina: Kapilarni: 3.5 kV; Konusni: 40 V; Hex 1: 20 V; Otvor: 0 V; Hex 2: 0 V; Izvorna temperatura: 100°C; Desolvaciona temperatura: 350°C; Desolvacioni gas: 500 L/h; Konusni gas: 50 L/h; Niska masena rezolucija (Ql): 15.0; Visoka masena rezolucija (Ql): 15.0; jonska energija: 0.2; Ulaz: 50V; Koliziona energija: 2; Izlaz: 50V; Niska masena rezolucija (Q2): 15; Visoka masena rezolucija (Q2): 15; jonska energija (Q2): 3.5; Multiplikator : 650. Neizvesnosti kada se radi o zabeleženim koeficijentima masa/naelektrisanje( m/ z)i molekularnih masa su + 0.01%. Inicijalna detekcija alfa-keto kiselinske forme monatina (MP) i monatina u mešavinama postizana je pomoću LC/MS monitoringa sa prikupljanjem masenih spektara za taj regionm/ z150-400. Odabrani jonski hromatogrami za protonatirane molekularne jone ([M + H]<+>= 292 za MP, |M + H]<+>= 293 za monatin) omogućavali su direktnu identifikaciju ovih analita u mešavinama.

Analiza MS/ MS

LC/MS/MS eksperimenti sa kćerinskim jonima obavljani su na monatinu na sledeći način. Jedna analiza kćerinskog jona obuhvata transmisiju roditeljskog jona (na pr.,m/ z= 293 za monatin) koji nas intersuje za prvi maseni analizator (Ql) u kolizionu ćeliju masenog spektrometra, gde se uvodi argon i hemijski disocira roditelj u jonske fragmente (kćerinske jone). Ovi jonski fragmenti se onda detektuju drugim masenim analizatorom (Q2), i može da se koristi da se potvrdi strukturni raspored roditeljskog jona.

Sledeći parametri instrumentata su korišćeni za LC/MS/MS analizu monatina: Kapilarni: 3.5 kV; Konusni: 40 V; Hex 1: 20 V; Otvor 0 V; Hex 2: 0 V; Izvorna temperatura: 100 °C; Desolvaciona temperatura: 350 °C; Desolvacioni gas: 500 L/h; Konusni gas: 50 L/h; Niska masena rezolucija (Ql): 13.0; Visoka masena rezolucija (Ql): 13.0; jonska energija: 0.2; Ulaz: -5 V; Koliziona energija: 14; Izlaz: IV; Niska masena rezolucija (Q2): 15; Visoka masena rezolucija (Q2): 15; jonska energija (Q2): 3.5; Multiplikator: 650.

Određivanje monantima sa visokom propusnom moći

Analize visoke propusne moći (< 5 min/uzorak) mešavina za monatin izvedenih izin vitroiliin vivoreakcije obavljane su korišćenjem instrumenata koji su gore opisani, i istih parametara koji su opisani za LC/MS/MS. LC separacije su obavljane korišćenjem Waters Xterra MS C8(2.1mm x 50 mm) hromatografije na sobnoj temperaturi sa izokratskom elucijuom u 15% vodenog MeOH, 0.25% sirćetne kiseline pri brzini protoka od 0.3 mL/min. Detekcija monatina u ovim mešavinama postignuta je korišćenjem praćenja odabranih reakcija (SRM) i tandem masenom spektrometrijom. Ovo je uključivalo monitoring specifičnog koliziono indukovanog roditeljskog jona ([M + H]+ = 293.1) sa kćerinskim jonom (na pr., fragmentni jon na m/z = 168.1, tentativno određen kao 3-buta-l,3-dienil-l//-indol karbonijum jon) sa prelazima da se maksimalno poveća senzitivnost i brzina prolaza za detekciju monatina. Podaci PDA apsorbance u paralelno prikupljani za dodatnu verifikaciju identiteta monatina.

Primer 11

Produkcija monatina u bakterijama

Ovaj primer opisuje metode koje se koriste za produkciju monatina u ćelijamaE. coli.Stručnjaci za ovu oblast će razumeti da slične metode mogu da se koriste da se proizvede monatin i u drugim bakterijskim ćelijama. Uz to, mogu da se koriste vektori sa sadržajem drugih gena na putu sinteze monatina (SLIKA 2).

Trp-1 + glukoza medium, kao minimalna podloga koja je korišćena da se poveća produkcija triptofana u ćelijamaE. coli(Zemani saradnici Folia Microbiol.35:200-4, 1990), pripremljen je na sledeći način. U 700 mL nanočiste vode dodati su sledeći rcagnesi: 2 g (NH4)2S04, 13.6 g KH2PO4, 0.2 g MgSO4.7H20, 0.01 g CaCl2.2H20, i 0.5 mg FeSO4.7H20. pH je podešen na 7.0, a zapremina je povećana na 850 mL, pa je podloga stavljena u autoklav. Odvojeno je pripremljen je rastvor 50% glukoze, i sterilno filtriran. Četrdeset mL je dodato u osnovnu podlogu (850 mL) da se dobije finalna zapremina od 1 L.

Količina od 10 g/L L-triptofan rastvora pripremljna je u 0.1 M natrijum fosfata pH 7, i sterilno filtrirana. Jedna desetina ove zapremine je tipično dodata u kulture kako je već dole detaljnije oipisano. Rastvor 10% natrijum piruvata je takođe pripremljen i sterilno filtriran. Jedan alikvot od 10 mL je tipično korišćen na litar kulture. Rezerve ampicilina (100 mg/mL), kanamicina (25 mg/mL) i IPTG (840 mM) su pripremljene, sterilno filtrirane i čuvane na -20°C pre upotrebe. Tvveen 20 (polioksietilen 20-Sorbitan monolaurat) je koiršćen pri finalnoj koncentraciji od 0.2%

(vol/vol). Ampicilin je korišćen u ne-letalnim koncentracijama, tipično u finalnoj koncentraciji od 1-10 p.g/mL.

Sveže ploče sa£.coliBL21(DE3)::C.testosteroniproA/ pET30 Xa/LIC (opisane u Primeru 4) pripremljene su na podlozi LB sadržajem 50 |ig/mL kanamicina. Kulture ostavljene preko noći (5 mL) inokulirane su iz jedne kolonije i gajene na 30°C u podlozi LB sa kanamicinom. Tipično je korišćeno 1 do 50 inokuluma za indukciju u podlozi trp-1 + glukoza. Sveži antibiotik je dodavan u finalnu koncentraciju od 50 mg/L. Bočice za mućkanje su gajene na 37°C pre indukcije.

Ćelije su uzorkovane svaki sat sve dok nije dobijena OD6oood 0.35-0.8. Ćelije su potom indukovane sa 0.1 mM IPTG, a temperatura je smanjena na 34 °C. Uzorci (1 ml) su bili klonirani pre indukcije (nulta vremenska tačka) i centrifugirani na 5000 x g. Ovaj supernatant je zamrznut na - 20°C za analizu LC/MS. Četiri sata posle indukcije, uzet je još jedan uzorak od 1 mL, i centrifugiran da se odvoji ćorba od ćelijskog peleta. Triptofan, natrijum piruvat, ampicilin, i Tvveen su dodavani kao što je gore opisano.

Ove ćelije su gajene tokom 48 sata posle indukcije, pa je uzet još 1 mL uzorka i pripremljen kao što je gore navedeno. Posle 48 sati, dodati su još po jedan alikvot triptofana i piruvata. Ukupna zapremine ove kulture je onda centrifugirana posle približno 70 sati rasta (posle indukcije), u trajanju od 20 minuta na 4°C i 3500 rpm. Ovaj supernatant je dekantovan, pa su i čorba i ćelije zamrznuti na-80°C. Frakcije čorbe su filtrirane i analizirane pomoću LC/MS. Visine i površine |M+H]<+>= 293 šiljaka su praćene kao što je opisano u Primeru 10. Pozadinski nivoi podloge su oduzimani. Ovi podaci su takođe normalizovani za ćelijski rast tako što je u grafikon ucrtavana visina [M+H]<+>= 293 šiljka podeljena sa optičkom gustinom kulture na 600 nm.

Viši nivoi monatina su produkovani kada su piruvat, ampicillin, i Tvveen dodavani 4 sata posle indukcije umesto za vreme iste. Drugi aditivi, kao što su PLP, dodatni fosfat, ili dodavanje

MgCb nije povećavalo produkciju monatina. Viši titri monatina dobijeni su kada je triptofan korišćen umesto indol-3-piruvata, i kada je triptofan dodavan posle indukcije umesto za vreme inokulacije ili za vreme indukcije. Pre indukcije, i 4 sata posle indukcije (u vreme kada se dodaje supstrat), tipično nije bilo nivoa monatina koji bi se mogli otkriti u fermentacijskoj čorbi ili ćelijskim ekstraktima. Negativne kontrole su rađene korišćenjem ćelija sa samo pET30a vektorom, kao i sa kulturama u koje nisu dodavani triptofan i piruvat. Skenirani roditeljski MS je pokazao da jedinjenje sa (m+l)/z = 293 nije izvedeno iz većih molekula, a skenovi kćerinskih supstanci (obavljeni kao u Primeru 10) bili su slični monatinu proizvedenomin vitro.

Dejstvo Tvveena ispitivano je korišćenjem 0, 0.2% (vol/vol), i 0.6% finalnih koncentracija Tween-20. Najveća količina monatina produkovana je bočicama sa mućkanjem sa 0.2% Tvveena. Ampicilinska koncentracija se kretala između 0 i 10 u.g/mL. Količina monatina u ćelijskoj čorbi povećavala se brzo (2.5 X) između 0 i 1 u.g/mL, i povećala se 1.3 X kada je koncentracija ampicilina povećana sa 1 do 10 u.g/mL.

Vremensko trajanje eksperimenta koji pokazuje tipične rezultate prikazano je na SLICI 10. Količina monatina koji se sekretuje u ćelijsku čorbu se povećala, čak i kada su vrednosti normalizovane za ćelijski rast. Korišćenjem molarnog koeficijenta ekstinkcije za triptofan, količina monatina u čorbi je procenjena na vrednost manju od 10 u.g/mL. Isti ovaj eksperiment je ponovljen sa ćelijama sa sadržajem vektorabez proAinserta. Mnogi od ovih brojeva su bili negativni, ukazujući daje maksimalni šiljak koji nastraje na m/z=293 bio manji u ovim kulturama nego u samoj podlozi (SLIKA 10). Ovi brojevi su bili konzistentno niži kada su triptofan i piruvat bili odsutni, čime je opet pokazano daje produkcija monatina rezultat enzimske reakcije koja se katalizuje enzimom aldolaza.

In vivoprodukcija monatina u bakterijskim ćelijama ponovljena je u eksperimentima u bočicama za mućkanje od 800 mL i u fermentorima. Uzorak monatina od 250 mL (u čorbi bez sadržaja ćelija) bio je prečišćen hromatografijom sa anjonskom izmenom i i preparativnom tečnom hromatografijom reverzne faze. Ovaj uzorak je evaporisan, i podvrgnut analizi mase visoke rezolucije (a što je opisano u Primeru 6). MS visoke rezolucije je ukazala daje ovaj proizvedeni metabolit zapravo monatin.

In vitroeseji su pokazali daje potrebno da aminotransferaza bude prisutna u višim nivoima nego aldolaza (vidi Primer 6), prema tome aspartat aminotransferaza izE. colije bila prekomerno eksprimirana u kombinaciji sa aldolaza genom da se poveća količina proizvedenog monatina. Osmišljeni su prajmeri da se uvedeC. testosteroni proAu operon sa£«pC/pET30Xa/LIC, i to na sledeći način: prajmer 5': ACTCGGATCCGAAGGAGATATACATATGTACGAACTGGGACT (SEQ ID NO: 67) i prajmer 3': CGGCTGTCGACCGTTAGTCAATATATTTCAGGC (SEQ ID NO: 68). Prajmer 5' sadrži jedno mesto BamHI, prajmer 3' sadrži mesto Sali za kloniranje. Urađen je i PCR kao što je opisano u Primeru 4, i gel je prečišćen. KonstruktaspC/ pE730Xa/LIC je digestiran sa BamHI i Sali, kao što je to urađeno i sa PCR produktom. Ovi digestati su prečišćeni korišćenjem kolone Qiagen spin.Produkt proAPCR je ligiran za vektor korišćenjem kompleta Roche Rapiđ DNA Ligation (Indianapolis, IN) u skladu sa uputstvima koje daje proizvođač. Hemijske transformacije su rađene korišćenjemNovablues Singles(Novagen) kao što je opisano u Primeru 1. Kolonije su rađene u podlozi LB sa sadržajem 50 mg/L kanamicina a plazmid DNK je prečišćen korišćenjem kompletaQiagen spin miniprep.Klonovi su podvrgnuti skriningu analizom restriktivne digestije pa je sekvenca potvrđenapomoću Seqwright(Houston, TX). Ovi konstrukti su supklonirani u BLR(DE3), BLR(DE3)pLysS, BL21(DE3) i BL21(DE3)pLysS (Novagen). KonstruktproA/ pET30Xa/LIC je takođe transformisan u BL21(DE3)pLysS.

Inicijalna poređenja uzoraka BLR(DE3) iz bočica za mućkanje u standardnim uslovima koji su gore opisani pokazala su daje dodatak drugog gena( aspC)poboljšao proizvedenu količinu monatina sedam puta. Da se ubrza rast, korišćeni su sojevi domaćina izvedeni iz BL21(DE3)-.Kolonovi proAi dva gen operon klona su indukovani u podlozi Trp-1 kao što je gore opisano, gde je domaćinima pLysS u podlogu dodat i hloramfenikol (34 mg/L). Eksperimenti sa bočicama za mućkanje su obavljani uz dodatak i bez dodatka 0.2% Tween-20 i 1 mg/L ampicilina. Količina m monatina u čorbi izračunavana je korišćenjemin vitroprodukovanog prečišćenog monatina kao standarda. Analize SRM obavljane su kao što je opisano u Primeru 10. Ćelije su uzorkovane u nultoj tačci, posle 4 sata, 24 sata, 48 sati, 72 sati, i 96 sati rasta.

Rezultati su prikazani na Tabeli 5 i to su prikazane najveće količine koje su proizvedene u kulturi u čorbi. U najvećem broju slučajeva, dva genska konstrukta su davala veće vrednosti od samog konstruktaproA.Sojevi pLysS, koji bi trebali da imaju ćelijske omotače koji su propustljiviji, imali su veću količinu sekretovanog monatina, uprkos činjenici da ti sojevi rastu sporije. Dodavanje Tvveena i ampicilina imalo je blagotvrono dejstvo.

Primer 12

Produkcija monatina u kvascu

Ovaj primer opisuje metode koje su korišćene da se produkuje monatin u eukariotskim ćelijama. Stručnjaci za ovu oblast će razumeti da slične metode mogu da se koriste da se monatin produkuje u ma kojoj ćeliji koja nam je od interesa. Uz to, mogu da se koriste i drugi geni (na pr., oni koji su navedeni na SLICI 2) sa tim, ili alternativno onim metodama koje su prikazane u ovom primeru.

Sistem pESCYeast Epitope Tagging Vektor(Stratagene, La Jolla, CA) je korišćen da se eksprimiraju i klonirajuE. coli aspCiC. testosteroni proAgeni uSaccharomyces cerevisiae.Vektori pESC sadrže i GALI i GAL 10 promotere na suprotnim trakama, sa dva jasno razgraničena multipla mesta za kloniranje, čime se omogućava ekspresija dva gena istovremeno. Vektor pESC-His takođe sadržiHis3gen za komplementaciju histidinske auksotrofije u domaćinu (YPH500). Promoteri GALI i GAL10 su represirani glukozom, a indukovani galaktozom; Kozak sekvenca je iskorišćena za optimalnu ekspresiju u kvascu. Plazmidi pESC su pokretni vektori, koji omogućavaju da se inicijalni konstrukt napravi uE. coli(sablagenom za selekciju); međutim, nisu prisutna mesta vezivanja bakterijskih ribozoma na multiplim mestima za kloniranje.

Sledeći prajmeri su namenjeni za kloniranje u pESC-His (restrikciona mesta su podvučena, a sekvenca Kozak je napisana masnim slovima):aspC ( BamHVSall), GALI:5'-

Drugi kodon za oba zrela proteina promenjen je sa aromatične amino kiseline u valin zbog uvođenja sekvence Kozak. Geni od interesa su amplifikovani korišćenjem pET30 Xa/LIC miniprep DNK od klonova opisanim u Primeru 1 i Primeru 4 kao obrascu. PCR je rađen korišćenjem aparataEppendorf Master cycler gradient thermocycleri sledećeg protkola za reakciju 50 uL: 1.0 pL templata, po 1.0 u.M od svakog prajmera, po 0.4 mM od svakog dNTP, 3.5 UExpandHigh Fidelity Polimeraze(Roche, Indianapolis, IN), ilXExpand<m>pufera sa Mg. Ovaj korišćeni termociklerski program sastojao se od početka na visokoj temperaturi, t.j. 94°C u trajanju od 5 minuta, posle čega sledi 29 ponavljanja sledećih koraka: 94°C u tajanju od 30 sekundi, 50°C u trajanju od 1 minuta 45 sekundi, i 72°C u trajanju od 2 minuta 15 sekundi. Posle 29 ponavljanja ovaj uzorak je održavan na 72°C u trajanju od 10 minuta a potom čuvan na 4°C. Produkti PCR su bili prečišćeni pomoću separacije na 1% TAE-agaroza gelu posle čega je sledilo ubiranje korišćenjem kompletaQIAquick Gel Extraction(Qiagen, Valencia, CA).

pESC-His vektor DNK (2.7 p.g) digestiran je saBamHVSalli prečišćen gelom kao što je to gore opisano.aspC PCRprodukt je digestiransaBamHl/ Salli prečišćen saQIAquick PCRkolonom za prečišćavanje. Ligacije su urađene sa kompletomRoche Rapid DNA Ligation prateći protokol iuputstva proizvođača. Desaltirane ligacije su elektroporisane u 40 u.1 Electromax DH10B kompetentnih ćelija (Invitrogen) u 0.2 cm Biorad kiveti za jednokratnu upotrebu korišćenjem Biorad Gene Pulsera II sa kontrolom pulsa, prateći protokol i uputstva. Posle 1 sat oporavka u 1 mL podloge SOC, transformanti su postavljeni na ploče sa podlogom LB sa sadržajem 100 ug/mL ampicilina. Preparati plazmid DNK za klonove pravljeni su korišćenjem kompletaQlAprep Spin Miniprep.Plazmid DNK je podvrgnuta skriningu restrikcionom digestijom, a onda je sekvencirana (Seqwright) za verifikaciju korišćenjem prajmers koji su osmišljeni za taj vektor.

KlonaspC/pESC-His je digestiran saEcoRl i Noti,kao što je to bio slučaj i sa theproAPCR produktom. DNK je prečišćena kao gore, i ligirana kao gore. Ova dva genska konstrukta su transformisana u DH10B ćelije i podvrgnuta skriningu restrikcionom digestijom i DNK sekvenciranjem.

Ovaj konstrukt je transformisan u sojS. cerevisiaeYPH500 korišćenjem kompleta S.c.EasyComp™ Transformation(Invitrogen). Transformacione reakcije su postavljene u podlogu SC-His minimal (Invitrogen pYES2 manual) sa sadržajem 2% glukoze. Individualne kolonije kvasca su podvrgnute skriningu na prisustvogena proAiaspCkolonijom PCR korišćenjem PCR prajmera kako je i gore opisano. Peletirane ćelije (2 u.1) su suspendovane u 20 u.L Y-Lysis Pufera (Zymo Research) sa sadržajem 1 p.1 zimolaze i zagrevane do 37°C u trajanju od 10 minuta. Četiri p.L ove suspenzije je tada iskorišćeno u 50 u.L PCR reakcije korišćenjem PCR reakcione mešavine i programa koji je gore opisan.

Pet mL kulture gajeno je preko noći na SC-His + glukoza na 30°C i 225 rpm. Ove ćelije su postepeno podešene za rast na raflnozi da bi se na najmanju meru sveo prazan period pre indukcije korišćenjem galaktoze. Posle približno 12 sati rasta, obavljena su merenja apsorbance na 600 nm, i odgovarajuće zapremine ćelija su svedene pa onda ponovo suspendovane na OD od 0.4 u svežoj podlozi SC-His. Sekvencijalno su korišćeni sledeći izvori ugljenika: 1% rafinoza + 1 % glukoza, 0.5% glukoza + 1.5% rafinoza, 2% rafinoza, i konačno 1% rafinoza + 2% galaktoze za indukciju.

Posle približno 16 sati rasta u podlozi za indukciju, 50 mL kultura su podeljeni u duplikatu u 25 mL kultura, pa je sledeće dodavano samo u jedan od tih duplikata: (finalne koncentracije) 1 g/L L-triptofana, 5 mM natrijum fosfata pH 7.1,1 g/L natrijum piruvata, 1 mM MgCl2. Uzorci čorbi i ćelijskih peleta iz podloge za indukciju, i iz kultura posle 16 sati pre dodavanja supstrata za monatinski put, sačuvani su kao negativne kontrole. Uz to, konstrukti sa sadržajem samo funkcionalnogaspCgena (u razgranatomproAgenu) korišćenje kao još jedna negativna kontrola. Ove ćelije su ostavljene da rastu u ukupnom trajanju od 69 sati posle indukcije. Povremeno su i kvasne ćelije indukovane pri nižoj vrednosti OD, i gajene samo 4 sata pre dodavanja triptofana i piruvata. Međutim, izgleda da ovi supstrati monatina inhibiraju rast i pa je dodavanje OD veće vrednosti bilo delotvornije.

Peleti ćelija iz kultura su lizirani su sa 5 mL YeastBuster™ + 50 (xl THP (Novagen) po gramu (mokre težine) ćelija prateći protokol koji daje proizvođač, uz dodatak inhibitora proteaze i benzonaze nukleaza kako je to opisano u prethodnim primerima. Čorba kulture i ćelijski ekstrakti su filtrirani i analizirani pomoću SRM kao što je opisano u Primeru 10. Korišćenjem ovih metoda, monatin nije detektovan u uzorcima čorbe, što govori da ćelije nisu mogle da sekretuju monatin u ovim uslovima. Pokretačka snaga protona može da bude nedovoljna pod ovim uslovima ili opšti amino kiselinski transporteri mogu biti zasićeni triptofanom. Proteinska ekspresija nije bila na nivou koji bi omogućavao detekciju promena korišćenjem SDS-PAGE.

Monatin je mogao da se detektuje (približno 60 p.g/mL) prolazno u ekstraktima ćelija kulture sa dva funkcionalna gena, kada su u podlogu dodavani triptofan i piruvat. Monatin nije detektovan ni u jednom od ćelijskih ekstrakata negativnih kontrola.In vitroeseji za monatin su obavljani u duplikatu sa 4.4 mg/mL ukupnih proteina (otprilike dvostruko od onoga što se tipično koristi za ćelijske ekstrakteE. coli)korišćenjem optimalizovanog eseja opisanog u Primeru 6. Ostali eseji su obavljani uz dodatak bilo 32 u,g/mLC. testosteroniProA aldolaze ili 400 u,g/mL AspC aminotransferaze, da se utvrdi koji enzim je limitarjući u ćelijskom ekstraktu. Negativne kontrole su obavljane bez dodatka enzima, ili uz dodatak samo AspC aminotransferaze (kondenzacija aldola može u određenoj meri da nastane i bez enzima). Pozitivne kontrole su rađene sa delimično čistim enzimima (30-40%), korišćenjem 16 p.g/mL aldolaze i 400 u.g/mL aminotransferaze.

In vitrorezultati su analizirani pomoću SRM. Ova analiza ćelijskih ekstrakata pokazala je daje triptofan delotvorno transportovan u ove ćelije kada je u podlogu dodavan posle indukcije, što je dovodilo do toga da nivoi triptofana budu za dva reda veličine veći od onih u kojima nije bilo dodatnog dodavanja triptofana. Rezultatiin vitroanalize monatina prikazani su na Tabeli 6 (brojevi pokazuju ng/mL).

Pozitivni rezulti su dobijeni sa punim ćelijskim ekstraktima dvogenskog konstrukta gde se u podlogu za rast dodaje supstrat i tamo gde se suptrat ne dodaje. Ovi rezultati, u poređenju sa pozitivnim kontrolama ukazuju na to da su enzimi eksprimirani na nivoima od blizu 1% ukupnih proteina u kvascu. Količina monatina koji se proizvede kada je ćelijski ekstraktaspCkonstrukta (sarazgranatim proA)testiran sa aldolazom bila je signifikantno veća nego kada su ćelijski ekstrakti sami procenjivani, i ukazuje na to da rekombinantna AspC aminotransferaza obuhvata približno 1-2% ukupnog proteina kvasca. Ćelijski ekstrakti neindukovanih kultura su imali malu količinu aktivnosti kada su eseji rađeni zajedno sa aldolazom zbog prisustva nativnih aminotransferaza u ovim ćelijama. Kada su eseji rađeni sa AspC aminotransferazom, aktivnost ovih ekstrakata iz neindukovanih ćelija povećavala se sa količinom monatina koji su produkovale negativne kontrole sa AspC (ca. 200 ng/ml). Za razliku od ovoga, aktivnost zabeležena kada su eseji rađeni sa ćelijskim ekstraktom sa dvogenskim konstruktom povećavala se više kada je kao suplemcnt dodavana aminotransferaza nego aldolaza. Budući da oba gena treba da se eksprimiraju na istom nivou, ovo govori da količina proizvedenog monatina biva maksimalizovana kada je nivo aminotransferaza veći od nivoa aldolaza, u skladu sa rezultatima koji su pokazani u Primeru 6.

Dodavanje piruvata i triptofana ne samo da inhibira rast ćelija, već izgleda i da inhibira proteinsku ekspresiju. Dodavanje pESC-Trp plazmida može da se koristi da se koriguje triptofanska auksotrofija YPH500 ćelija domaćina, da se obezbedi način da se doda triptofan sa manjim brojem dejstava na rast, ekspresiju, i sekreciju.

Primer 13

Poboljšanje enzimskihprocesakorišćenjem kupliranih reakcija

U teoriji, ako nema pobočnih reakcija ili ako dođe do degradacije supstrata ili međuproizvoda, maksimalna količina formiranog proizvoda iz enzimske reakcije koja je ilustrovana na SLICI 1 je direktno proporcionalna konstantama ravnoteće svake od reakcija, i koncentracijama triptofana i piruvata. Triptofan nije visoko solubilan supstrat, i koncentracije piruvata veće od 200 mM izgleda da imaju negativno dejstvo na prinos (vidi Primer 6).

Idealno, koncentracija monatina se maksimalno povećava u odnosu na supstrate, da bi se smanjila cena separacije. Fzičko odvajanje se može obaviti tako da monatin bude uklonjen iz reakcione mešavine, čime se sprečava da dođe do reverzne reakcije. Sirovi materijali i katalizatori onda mogu da se regenerišu. Zbog sličnosti monatina u veličini, naelektrisanju, i hidrofobičnosti sa nekolicinom reagenasa i međuproizvoda, fizička separacija bi bila teška osim ako nema velike količine afiniteta za monatin (kao što je tehnika afinitetne hromatografije). Međutim, monatinske reakcije se mogu kuplirati sa drugim reakcijama kao što su one u kojima se sistem ravnoteže pomera ka produkciji monatina. Dole dajemo različite primere procesa za poboljšanje prinosa monatina koji se dobija iz triptofana ili indol-3-piruvata.

Kuplirane reakcije korišćenjem oksaloacetat dekarboksilaze ( EC 4. 1. 1. 3)

SLIKA 11 predstavlja ilustraciju ove reakcije. Triptofan oksidaza i katalaza se koriste da vode ovu reakciju u pravcu produkcije indol-3-piruvata. Katalaza se koristi u višku tako da vodonik peroksid ne bide na raspolaganju da reaguje u reverznom pravcu ili da ošteti enzime ili međuproizvode. Kiseonik se regeneriše tokom reakcije katalaze. Alternativno, indol-3-piruvat može da se koristi kao supstrat.

Aspartat is used kao jedan amino donor za aminaciju MP, a koristi se jedna aspartat

aminotransferaza. Idealno, aminotransferaza koja ima nisku specifičnost za triptofan/indol-3-piruvat reakciju u poređenju sa MP prema monatinskoj reakciji koristi se tako da se ne upotrebljava aspartat da se postigne reaminacija indol-3-piruvata. Oksaloacetat dekarboksilaza (izPseudomonas sp.)može da se dodaje da se konvertuje oksaloacetat u piruvat i ugljen dioksid. Budući daje CO2 volatilan, on nije na raspolaganju za reakciju sa enzimima, jer smanjuje, ili čak sprečava reverzne reakcije. Piruvat koji je produkovan u ovom koraku može da se koristi za reakciju kondenzacije aldoal. Mogu da se koriste i drugi enzimi dekarboksilaze, a poznato je da postoje homolozi uActinobacillus

actinomycetemcomitans, Aquifex aeolicus, Archaeoglobus fulgidus, Azotobacter vinelandii,

Bacteroides fragilis,nekoliko sojevaBordetella, Campilobacter jejuni, Chlorobium tepidum,

Chloroflexus aurantiacus, Enterococcus faecalis, Fusobacterium nucleatum, Klebsiella pneumoniae,

Legionella pneumophila, Magnetococcus MC- 1, Mannheimia haemolytica, Metilobacillus flagellatus

KT, Pasteurella multocidaPm70,Petrotoga miotherma, Porphyromonas gingivalis,nekoliko sojevaPseudomonas,nekoliko sojevaPirococcus, Rhodococcus,nekolikosojeva Salmonella,nekoliko

sojevaStreptococcus, Thermochromatium tepidum, Thermotoga maritima, Treponema pallidum,i nekoliko sojevaVibrio.

Eseji triptofan aminotransferaza obavljeni su sa aspartat aminotransferazom (AspC) izE. coli,tirozin aminotransferazom (TyrB)iz£. coli,široko supstratnom aminotransferazom (BSAT) izL. major,i dve komercijalno dostgupne svinjske glutamat-oksaloacetat aminotransferaze kao što je opisano u Primeru 1. I oksaloacetat i alfa-ketoglutarat su testirani kao amino akceptor. Poređenje koeficijent aktivnosti korišćenjem monatina (Primer 7) u poređenju sa aktivnošću korišćenjem triptofana, da se odredi koji enzim ima najveću specifičnost za reakciju monatin aminotransferaze. Ovi rezultati ukazuju da enzim s najvećom specifičnošću za monatinsku reakciju u poređenju sa triptofanskom reakcijom jeste svinska tip II-A glutamat-oksaloacetat aminotransferaza, GOAT (Sigma G7005). Ova specifičnost je bila nezavisna odtoga koji se amino akceptor koristi. Prema tome, ovaj enzim se koristio za kuplirane reakcije sa oksaloacetat dekarboksilasom.

Tipična reakcija koja počinje od indol-3-piruvata uključila je (finalne koncentracije) 50 mM Tris-Cl pH 7.3, 6 mM indol-3-piruvata, 6 mM natrijum piruvata, 6 mM aspartata, 0.05 mM PLP, 3 mM kalijum fosfata, 3 mM MgCl2, 25 ug/mL aminotransferaze, 50 (ig/mLC. testosteroniProA aldolaze, i 3 Units/mL dekarboksilaze (Sigma 04878). Ovim reakcijama je omogućeno da se odvijaju jedan sat na 26°C. U nekim slučajevima, dekarboksilasa je izostavljena ili je aspartat supstituisan sa alfa-ketoglutaratom (kao negativnim kontrolama). Enzimi aminotransferaze koji su gore opisani bili su takođe testirani umesto GOAT da se potvrde raniji eksperimenti o specifičnosti. Uzorci su bili filterisani i analizirani pomoću LC/MS kao što je opisano u Primeru 10. Ovi rezultati pokazuju daje GOAT enzim produkovao najveću količinu monatina po mg proteina, sa najmanjom količinom triptofana koja je produkovana kao sporedni proizvod. Uz to, postignuta je i 2-3-struka korist od toga što je dodat i enzim dekarboksilaza. EnzimE. coliAspC je takođe produkovao velike količine monatina u poređenju sa drugim aminotransferazama.

Produkciju monatina povećavali su: 1) periodično dodavanje 2 mM dodataka indol-piruvata, piruvata, i aspartata (na svakih pola sata do sat), 2) obavljanje ove reakcije u anaerobnom okruženju ili sa degasiranim puferima, 3) omogućavanje da se reakcije nastave i preko noći, i 4) korišćenjem sveže pripremljene dekarboksilaze koja nije bila više puta zamrzavana pa odmrzavana. Ova dekarboksilaza je inhibitrana koncentracijama piruvata većim od 12 mM. Pri koncentracijama indol-3-piruvata većim od 4 mM, sporedne reakcije sa indol-3-piruvatom su bile ubrzane. Količina indol-3-piruvata koja se koristi u reakciji mogla bi biti povećana ako bi količina aldolaze takođe bila uvećana. Pokazalo se da visoki nivoi fosfata (50 mM) i aspartata (50 mM) imaju inhibitorno dejstvo na enzim dekarboksilazu. Količina enzima dekarboksilaza koja se ddoaje mogla bi da se smanji na 0.5 U/mL bez smanjenja u produkciji monatina u reakciji koja traje jedan sat. Količina produkovanog monatina povećavala se kada je temperatura povećana od 26°C do 30°C i sa 30°C na 37°C; međutim, na 37°C sporedne reakcije indol-3-piruvata su takođe bile ubrzane. Količina produkovanog monatina povećavala se kada je vrednost pH rastla sa 7 do 7.3, i bila je relativno stabilna pri vrednostima pH 7.3-8.3.

Tipična reakcija koja počinje sa triptofanom uključivala je (finalne koncentracije) 50 mM Tris-Cl pH 7.3, 20 mM triptofana, 6 mM aspartata, 6 mM natrijum piruvata, 0.05 mM PLP, 3 mM kalijum fosfata, 3 mM MgCl2, 25 ug/mL aminotransferaze, 50 ug/mLC. testosteroniProA aldolaze, 4 jedinice/mL dekarboksilaze, 5-200 mU/mL L-amino kiselinske oksidaze (Sigma A-2805), 168 U/mL katalaze (Sigma C-3515), i 0.008 mg FAD. Reakcije su trajale po 30 minuta na 30°C. Poboljšanje je zabeleženo sa dodatkom dekarboksilaza. Najveća količina monatina produkovana je kada je korišćeno 50 mU/mL oksidaze. Poboljšanja su bila slična onima zabeleženim kada je kao supstrat korišćen indol-3-piruvat. Uz to, količina produkovanog monatina povećavala se kada 1) je nivo triptofana bio nizak (t.j., ispod vrednosti Kmenzima aminotransferaza i prema tome nesposoban da uđe u kompeticiju sa MP na aktivnom mestu), i 2) odnos oksidaze prema aldolazi i aminotransferazi održavanje na nivou tako da nije moglo doći do nagomilavanja indol-3-piruvata.

Bilo da se počinje sa indol-3-piruvatom ili triptofanom, količina monatina produkovana u esejima sa vremnima inkubacije od 1-2 sata povećavala se 2-4 puta kada su količine svih enzima koje su se koristile dok su održavale isti enzimski odnos. Korišćenjem bilo kog od supstrata, postignute su koncentracije od približno 1 mg/mL monatina. Količina produkovanog triptofana ako se započinje od indol-piruvata bila je tipično manja od 20% od količine proizvoda, čime se pokazuje korist od korišćenja kuplirane reakcije. Sa dodatnom optimizacijom i kontrolom koncentracija međuproizvoda i pobočnih reakcija, produktivnost i prinos se u mnogome mogu poboljšati.

Kuplirane reakcije korišćenjem lizin epsilon aminotransferaze ( EC2. 6. 1. 36)

Lizin epsilon aminotransferaza (L-Lizin 6-transaminaza) se nalazi u nekoliko organizama, uključujućiRhodococcus, Mycobacterium, Streptomyces, Nocardia, Flavobacterium, Candida utilis,iStreptomyces.Ovi organizami je koriste kao prvi korak u produkciji nekih beta-laktamskih antibiotika (Rius i Demain,J. Microbiol. Bioteck,7:95-100, 1997). Ovaj enzim konvertuje lizin u L-2-aminoadipat 6-semialdehid (alizin), pomoću PLP-posredovane transaminacije C-6 lizina, pri čemu se koristi alfa-ketoglutarat kao amino akceptor. Alizin je nestabilan i spontano trpi intramolekularnu dehidrataciju da se oformi 1-piperidein 6-karboksilat, odnosno jedan ciklični molekul. Ovo delotvorno inhibira svaku reverznu reakciju, pa se one ne odvijaju. Ove reakcione sheme su prikazane na SLICI 12. Može se korstiti i jedan alternativni enzim, lizin-piruvat 6-transaminaza (EC 2.6.1.71).

Jedna tipična reakcija sadržana u 1 mL: 50 mM Tris-HCl pH 7.3, 20 mM indol-3-piruvata, 0.05 mM PLP, 6 mM kalijum fosfata pH 8, 2-50 mM natrijum piruvata, 1.5 mM MgCl2, 50 mM lizina, 100u.gaminotransferaze (lizin epsilon aminotransferaza LAT-101, BioCatalytics Pasadena, CA), i 200 u.gC. testosteroniProA aldolaze. Količina proizvedenog monatina povećava se sa povećanjem koncentracija piruvata. Maksimalna količina dobijena korišćenjem ovih uslova reakcija (pri 50 mM piruvata) bila je desetostruko manja od one koja je zabeležea sa kupliranom reakcijom korišćenjem oksaloacetat dekarboksilaze (približno 0.1 mg/mL).

Šiljak postignut sa [M+H]<+>= 293 eluirao je u očekivano vreme za monatin i maseni spektar koji se sadržavao nekoliko istih fragmenata zabeleženih sa drugim enzimskim processima. Drugi šiljak, sa korektnim odnosom mase i naelektrisanja (293) eluirao je neznantno ranije nego što se tipično zapaža za S,S monatin koji je produkovan u Primeru 6, i može da ukaže na prisustvo još jednog izomera monatina. Ovaj enzim je produkovao izuzetno malu količinu triptofana. Međutim, verovatno postoji određena aktivnost na piruvat (koji produkuje alanin kao sporedni proizvod). Takođe, pozanto je daje ovaj enzim nestabilan. Poboljšanja se mogu obezbediti tako što se obavljaju eksperimenti da se usmeri elucija u cilju poboljšanja stabilnosti, smanjenja aktivnosti sa piruvatom, i povećanjem aktivnosti sa MP. Ove reakcije takođe mogu da se kupliraju sa L-amino kiselinskom oksidazom/katalazom kao što je gore opisano.

Druge reakcije kupliranja

Još jedna reakcija kupliranja može da poboljša prinos monatina iz triptofana ili indol-piruvata i ona je prikazana na SLICI 13. Format dehidrogenaza (EC 1.2.1.2 ili 1.2.1.43) je jedan obični enzim. Neke format dehidrogenaze iziskuju NADH dok druge mogu da koriste NADPH. Glutamat dehidrogenaza je katalizovala interkonverziju između monatinskog prekursora i monatina u prethodnim primerima, korišćenjem pufera na bazi amonijuma. Prisustrvo amonijum formata i format dehidrogenaze je jedan delotvoran sistem za regeneraciju ko-faktora, a produkcija ugljen dioksida je delotvoran način da se smanje brzina reverzne reakcije (Bommariusi saradnici, Biocatalysis10:37, 1994 i Galkini saradnici Appl. Environ. Microbiol.63:4651-6, 1997). Uz to, velike količine amonijum formata mogu da se rastvore u puferu reakcije. Prinos monatina koji se dobija pomoću reakcije glutamat dehidrogenazom (ili sličnim reduktivnim aminacijama) može da se poboljša dodavanjem format dehidrogenaze i amoni jum formata.

I drugi procesi mogu da se koriste sa se uspostavi ravnoteža ka produkciji monatina. Na primer, ako se kao amino kiselinski donor koristi aminopropan u konverziji MP u monatin sa omega-amino kiselinskom aminotransferazom (EC 2.6.1.18) kao što su one opisane u SAD patentima 5,360,724 i 5,300,437, jedan od rezultujućih produkata bi bio aceton, još volatilniji proizvod od supstrata, aminopropana. Temperatura može da se podiže periodično na kraće periode da se ispere aceton, i na taj način se ublaži ravnoteža. Aceton ima tačku ključanja od 47°C, a nije verovatno da ta temperatura može da degradira međuproizvode ako se kroisti za kraće vremenske peirode. Većina aminotransferaza koje imaju aktivnost na alfa-ketoglutarat takođe imaju aktivnost na monatinski prekursor. Isto tako, ako se glioksilat/aromatična kiselinska aminotransferaza (EC 2.6.1.60) koristi sa glicinom kao amino donor, glioksilat se proizvodii, a on je relativno nestabilan i ima veoma smanjenu tačku ključanja u poređenju sa glicinom.

PRIMER 14

Rekombinantna ekspresija

Budući da u prodaji postoje i enzim cDNK i amino kiselinske sekvence, kao i enzimi i sekvence koji su ovde opisani, kao što su SEQ ID NOS: 11 i 12, kao i njihove varijante, polimorfizmi, mutanti, fragmenti i fuzije, omogućavaju se ekspresija i purifikacija svakog proteina, kao što su enzimi, standardnim laboratorijskim tehnikama. Stručnjaci za ovu oblast će razumeti da enzimi i njihovi fragmenti mogu da se produkuju rekombinantno u svakoj ćeliji ili organizmu od interesa, i prečišćeni pre upotrebe, na primer pre produkcije SEQ ID NO: 12 i njegovih derivata.

Metode za produkciju rekombinantnih proteina su dobro poznate u struci. Prema tome, obim ovoga otkrića uključuje rekombinantnu ekspresiju svakog proteina ili njegovog fragmenta, kao što je neki enzim. Na primer, vidi patent SAD br.: 5,342,764 autora Johnson/saradnici;patent SAD br.: 5,846,819 autora Pauschi saradnici;vidi patent SAD br.: 5,876,969 autora Fleeri saradnicii Sambrook ;'saradnici ( Molekularno kloniranje: Laboratorijski priručnik,Cold Spring Harbor, New York, 1989, Ch. 17).

Ukratko, delimične, cele ili varijante cDNK sekvence, koje nekodiraju za protein ili peptide, mogu da se ligiraju u ekspresioni vektor, kao što je neki bakterijski ili eukariotski vektor ekspresije. Proteini i/ili peptidi mogu da se produkuju tako što će se jedan promoter postaviti ushodno od cDNK sekvence. U primere promotera spadaju, ali ovo nije iscrpna lista:lac, trp, tac, trc,glavni operatorski i promoterski regioni faga lambda, kontrolni region fd protein oblaganja, rani i pozni promoteri SV40, promoteri izvedeni iz polioma, adenovirusa, retrovirusa, bakulovirusa i majmunskih virusa, promoter za 3-fosfoglicerat kinazu, promoteri za kvasno kiselu fosfatazu, promoter kvasnog alfa-mating faktora i njihove kombinacije.

Vektori pogodni za produkciju intaktnih nativnih proteina uključuju pKC30 (Shimatake i Rosenberg,1981, Nature292:128), pKK177-3 (Amann i Brosius, 1985,Gene40:183) i pET-3 (Studier i Moffatt,1986, J. Mol. Biol.189:113). Neka DNK sekvenca se može preneti na druga sredstva za kloniranje, kao što su drugi plazmidi, bakteriofagi, kozmidi, životinjski virusi i kvasni veštački hromozomi (YACs) (Burke;' saradnici, 1987, Science236:806-12). Ovi vektori mogu da se uvode u čitav niz različitih domaćina uključujući somatske ćelije, i jednostavne ili složene organizme, kao što su bakterije, gljive (Timberlake i Marshall, 1989,Science244:1313-7), beskičmenjaci, biljke (Gasser i Fralev, 1989,Science244:1293), i sisari (Pursel; saradnici,1989,Science244:1281-8), koji postaju transgeni uvođenjem heterologne cDNK.

Za ekspresiju u ćelijama sisara, cDNK sekvenca može da se ligira za heterologne promotere, kao što su majmunski virus SV40, promoter u pSV2 vektoru (Mulligan i Berg, 1981,Proc. Natl. Acad. Sci. USA78:2072-6), i uvedeni u ćelije, kao što su majmunske COS-1 ćelije (Gluzman, 1981,Ćelija23:175-82), da se postigne prilazna ili dugoročna ekspresija. Stabilna integracija himernog genskog konstrukta može da se održava u ćelijama sisara biohemijskom selekcijom, kao što je neomicin (Southern i Berg,1982, J. Mol. Appl. Genet.1:327-41) i mikoenolna kiselina (Mulligan i Berg, 1981,Proc. Natl. Acad. Sci. USA78:2072-6).

Transfer DNK u eukariote, kao što su humane ćelije ili ćelije drugih sisara, predstavlja jednu konvencionalnu tehniku. Ovi vektori se uvode u ćelije recipijenta kao čista DNK (transfekcija) pomoću, na primer, precipitacije kalcijum fosfatom (Graham i vander Eb, 1973,Virology52:466) stroncijum fosfatom (Brashi saradnici,1987,Mol. Ćelija Biol.7:2013), elektroporacijom (Neumanni saradnici,1982,EMBO J.1:841), lipofekcijom (Felgneri saradnici,1987,Proc. Natl. Acad. Sci USA84:7413), DEAE dekstranom (McCuthani saradnici, 1968, J. Natl. Cancer Inst.41:351), mikroinjekcijom (Mueller/' saradnici,1978,Ćelija15:579), fuzijom protoplasta (Schafner, 1980,Proc. Natl. Acad. Sci. USA77:2163-7), ili prenosom peleta (Klein/' saradnici,1987,Nature327:70). Alternativno, cDNK se može uvoditi infekcijom vektorima virusa, na primer retrovirusima (Bernstein/ saradnici,1985,Gen. Engrg.7:235) kao što su adenovirusi (Ahmadi saradnici, 1986, J. Virol.57:267) ili Herpes (Spaete; saradnici,1982,Ćelija30:295).

U svetlu mnoguh mogućih oblika na koje se principi ovog otkrića mogu primeniti, treba prihvatiti da ovi ilustrovani oblici predstavljaju samo specifične primere otkrića, i nikako ih ne treba smatrati ograničenjima obima samog otkrića. Umesto toga, obim samog otkrića je u skladu sa sledećim zahtevima: Mi, prema tome našim pronalskom smatramo sve što spada u obim i što je u duhu naših zahteva.

Claims (57)

1. Metoda za produkciju monatina uključujući konverziju glukoze u monatin.

2. Metoda za produkciju monatina, uključujući konverziju triptofana i/ili indol-3-mlečne kiseline u monatin, naznačeno time da ova metoda obuhvata: kontakt triptofana ili indol-3-mlečne kiseline sa prvim polipeptidom, naznačeno time da taj prvi polipeptid konvertuje triptofan ili indol-3-mlečnu kiselinu u indol-3-piruvat; kontakt indol-3-piruvata sa drugim polipeptidom i izvorom C3 ugljenika, naznačeno time da taj drugi polipeptid konvertuje indol-3-piruvat i izvor C3 ugljenika u 2-hidroksi 2-(indol-3-iImetil)-4-keto glutaričnu kiselinu; i kontakt 2-hidroksi 2-(indol-3ilmctil)-4-keto glutarične kiseline sa trećim polipeptidom, naznačeno time da taj treći polipeptid konvertuje e 2-hidroksi 2-(indol-3ilmetil)-4-keto glutaričnu kiselinu u monatin.

3. Metoda iz zahteva 2, naznačeno time da ovaj prvi polipeptid bude odabran iz grupe koja se sastoji od triptofan aminotransferaze (EC 2.6.1.27), triptofan dehidrogenaze (EC 1.4.1.19), tirozin (aromatični) aminotransferaze (EC 2.6.1.5), triptofan-fenilpiruvat transaminaze (EC 2.6.1.28), multipli supstrat aminotransferaze (EC 2.6.1.-), aspartat aminotransferaze (EC 2.6.1.1), triptofan oksidaze, L-amino kiselinske oksidaze (EC 1.4.3.2), D-amino kiselinske dehidrogenaze (EC 1.4.99.1), D-amino kiselinske oksidaze (EC 1.4.3.3), D-triptofan aminotransferaze, D-alanin aminotransferaze (EC 2.6.1.21), glutamat dehidrogenaze (EC 1.4.1.2-4), fenilalanin dehidrogenaze (EC 1.4.1.20), i njihovih kombinacija, i naznačeno time da prvi polipeptid konvertuje triptofan u indol-3-piruvat.

4. Metoda iz zahteva 2, naznačeno time da prvi polipeptid bude odabran iz grupe koja se sastoji od indollaktat dehidrogenaze (EC 1.1.1.110), R-4-hidroksifenillaktat dehidrogenaze (EC 1.1.1.222), 3-(4)-hidroksifenilpiruvat reduktaze (EC 1.1.1.237), laktat dehidrogenaze (EC 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3), (3-imidazol-5-il) laktat dehidrogenaze (EC 1.1.1.111), i laktat oksidaze (EC 1.1.3.-), ili njihove kombinacije, i naznačeno time da prvi polipeptid konvertuje indol-3-mlečnu kiselinu u indol-3-piruvat.

5. Metoda iz zahteva 2 ili 3, naznačeno time da prvi i/ili treći polipeptid obuhvata: jednu amino kiselinsku sekvencu pokazanu na SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10,12, 14, 32, Genbank Pristupni broj: NP_388848.1, Genbank Pristupni broj: ZP00005082.1, ili Genbank Pristupni broj: AAC74014.1; jednu amino kiselinsku sekvencu uključujući najmanje 90% identičnosti sekvence sa sekvencom pokazanom u SEQ ID NO:2, 4, 6, 8,10, 12, 14, 32, Genbank Pristupni broj: NP 388848.1, Genbank Pristupni broj: ZP00005082.1, ili Genbank Pristupni broj: AAC74014.1; ili amino kiselinske sekvence koje se razlikuju od SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 32, Genbank Pristupni broj: NP 388848.1, Genbank Pristupni broj: ZP00005082.1, ili Genbank Pristupni broj: AAC74014.1 za manje od 50 konzervativnih amino kiselinskih supstitucija, naznačeno time da ta amino kiselinska sekvenca konvertuje triptofan u indol-3-piruvat.

6. Metoda iz zahteva 2, naznačeno time da drugi polipeptid bude jedan EC 4.1.2.- ili EC 4.1.3.-enzim.

7. Metoda iz zahteva 6, naznačeno time da EC 4.1.3.- enzim bude 4-hidroksi-2-oksoglutarat glioksilat-liaza (EC 4.1.3.16), 4-hidroksi-4-metil-2-oksoglutarat piruvat-liaza (EC 4.1.3.17) ili njihova kombinacija.

8. Metoda iz zahteva 2, naznačeno time da treći polipeptid bude odabran iz grupe koja se sastoji od tirozin (aromatični) aminotransferaze (EC 2.6.1.5), triptofan dehidrogenaze (EC 1.4.1.19), triptofan-fenilpiruvat transaminaze (EC 2.6.1.28), triptofan aminotransferaze (EC 2.6.1.27), aspartat aminotransferaze (2.6.1.1), D-alanin aminotransferaze (EC 2.6.1.21), D-triptofan aminotransferaze, glutamat dehidrogenaze (EC 1.4.1.2-4), fenilalanin dehidrogenaze (EC 1.4.1.20), multipli supstrat aminotransferaze (EC 2.6.1.-), D-amino kiselinske dehidrogenaze (EC 1.4.99.1), i njihove kombinacije.

9. Metoda iz zahteva 2, naznačeno time da prvi polipeptid obuhvata jednu amino kiselinsku oksidazu (EC 1.4.3.-) i katalazu (EC 1.11.1.6), i naznačeno time da prvi polipeptid konvertuje triptofan u indol-3-piruvat.

10. Metoda iz zahteva 9, naznačeno time da ova amino kiselinska oksidaza obuhvata jednu triptofan oksidazu.

11. Metoda iz zahteva 2, naznačeno time da izvor C3 ugljenika bude odabran iz grupe koja se sastoji od piruvata, fosfoenolpiruvata, alanina, serina, cisteina, ili njihove kombinacije.

12. Metoda iz zahteva 11, naznačeno time da ovaj piruvat produkuje alanin i jedan polipeptid koji može da vrši transaminaciju alanina; serin i polipeptid koji je sposoban za beta-eliminciju serina; cistein i polipeptid koji je sposoban za beta-eliminciju cisteina; aspartat i polipeptid koji je sposoban za beta-liaza reakcije sa dikarboksilinom amino kiselinom; laktat i laktat oksidaza (EC 1.1.3.-) ili laktat dehidrogenaza (EC 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3); ili njihova kombinacija.

13. Metoda iz zahteva 2, naznačeno time da ova metoda dalje obuhvata redukujući količinu vodonik peroksida produkovanu kada se triptofan konvertuje u indol-3-piruvat, tako što kontaktira vodonik peroksid sa katalazom.

14. Metoda iz zahteva 2, naznačeno time da drugi polipeptid obuhvata jednu amino kiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od: SEQ ID NO: 66, Genbank Pristupni broj: CAC46344, Genbank Pristupni broj: CAB14127.1, Genbank Pristupni broj: AAC74920.1, ili Genbank Pristupni broj: CAC47463.1; jednu amino kiselinsku sekvencu uključujući najmanje 90% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 66, Genbank Pristupni broj: CAC46344, Genbank Pristupni broj: CAB14127.1, Genbank Pristupni broj: AAC74920.1, ili Genbank Pristupni broj: CAC47463.1; ili amino kiselinsku sekvencu koja se razlikuje od SEQ ID NO: 66, Genbank Pristupni broj: CAC46344, Genbank Pristupni broj: CAB14127.1, Genbank Pristupni broj: AAC74920.1, ili Genbank Pristupni broj: CAC47463.1 za manje od 50 konzervativnih amino kiselinskih supstitucija, naznačeno time da ova amino kiselinska sekvenca konvertuje indol-3-piruvat i piruvat u MP.

15. Metoda iz zahteva 8, naznačeno time da treći polipeptid obuhvata jednu aspartat aminotransferazu, naznačeno time da 2-hidroksi 2-(indol-3-ilmctil)-4-keto glutarična kiselina bude u kontaktu sa aspartatom da se produkuje oksaloacetat i monatin.

16. Metoda iz zahteva 15, dalje uključujući kontakt oksaloacetata sa dekarboksilazom.

17. Metoda iz zahteva 2, naznačeno time da treći polipeptid obuhvata lizin epsilon aminotransferazu, i naznačeno time da 2-hidroksi 2-(indol-3-ilmetil)-4-keto glutarična kiselina dalje stupa u kontakt sa lizinom.

18. Metoda iz zahteva 2, naznačeno time da treći polipeptid obuhvata jedan enzim koji ima reduktivnu aminacijsku aktivnost i polipeptid koji je u stanju da reciklira NAD(P)H.

19. Metoda iz zahteva 18, naznačeno time da ovaj enzim koja ima reduktivnu aminacionu aktivnost bude odabran iz grupe koja se sastoji od glutamat dehidrogenaze, fenilalanin dehidrogenaze, triptofan dehidrogenaze, ili njihove kombinacije.

20. Metoda iz zahteva 18, naznačeno time da ovaj polipeptid koji je u stanju da reciklira NAD(P)H dalje proizvodi jedan volatilni proizvod.

21. Metoda iz zahteva 20, naznačeno time da ovaj polipeptid koji je u stanju da reciklira NAD(P)H i dalje proizvodi jedan volatilni proizvod obuhvata format dehidrogenazu, i naznačeno time da taj proizvedeni volatilni proizvod bude is ugljen dioksid.

22. Metoda iz zahteva 2, naznačeno time da ova metoda obuhvata konvertovanje indol-3-mlečne kiseline u monatin.

23. Metoda iz zahteva 2, gde se proizvodi najmanje 10 g/L monatina.

24. Metoda za produkciju monatina uključujući konverziju indol-3-piruvata u monatin.

25. Metoda za produkciju monatina uključujući konverziju triptofana u monatin.

26. Ćelija sposobna za produkciju monatina, naznačeno time da ta ćelija obuhvata najmanje jednu egzogenu nukleinsku kiselinsku sekvencu koja enkodira najmanje jedan polipeptid, naznačeno time da najmanje jedan polipeptid konvertuje prvi međuproizvod u ovom putu da pretvori monatin u drugi međuproizvod ili u monatin.

27. Ćelija iz zahteva 26, naznačeno time da najmanje jedan polipeptid bude odabran iz grupe koja se sastoji od: triptofan aminotransferaze (EC 2.6.1.27), triptofan dehidrogenaze (EC 1.4.1.19), tirozin (aromatični) aminotransferaze (EC 2.6.1.5), triptofan-fenilpiruvat transaminaze (EC 2.6.1.28), multipli supstrat aminotransferaze (EC 2.6.1.-), triptofan oksidaze, L-amino kiselina oksidaze (EC 1.4.3.2), aspartat aminotransferaze (EC 2.6.1.1), D-amino kiselinske dehidrogenaze (EC 1.4.99.1), D-amino kiselinske oksidaze (EC 1.4.3.3), D-alanin aminotransferaze (EC 2.6.1.21), D-triptofan aminotransferaze, indollaktat dehidrogenaze (EC 1.1.1.110), R-4-hidroksifenillaktat dehidrogenaze (EC 1.1.1.222), 3-(4)-hidroksifenilpiruvat reduktaze (EC 1.1.1.237), laktat dehidrogenaze (EC 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3), (3-imidazol-5-il) laktat dehidrogenaze (EC 1.1.1.111), laktat oksidaze (EC 1.1.3.-), sintaza/liaze (4.1.2.-), sintaza/liaze (4.1.3.-), fenilalanin dehidrogenaze (EC 1.4.1.20), glutamat dehidrogenaze (EC 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4), i njihove kombinacije.

28. Ćelija iz zahteva 27, naznačeno time da najmanje jedan polipeptid bude odabran iz grupe koja se sastoji od: triptofan aminotransferaze (EC 2.6.1.27), triptofan dehidrogenaze (EC 1.4.1.19), tirozin (aromatični) aminotransferaze (EC 2.6.1.5), triptofan-fenilpiruvat transaminaze (EC 2.6.1.28), multipli supstrat aminotransferaze (EC 2.6.1.-), aspartat aminotransferaze (EC 2.6.1.1), triptofan oksidaze, L-amino kiselina oksidaze (EC 1.4.3.2), D-amino kiselinske dehidrogenaze (EC 1.4.99.1), D-amino kiselinske oksidaze (EC 1.4.3.3), D-alanin aminotransferaze (EC 2.6.1.21), D-triptofan aminotransferaze, sintaza/liaze (EC 4.1.3.-), sintaza/liaze (4.1.2.-), fenilalanin dehidrogenaze (EC 1.4.1.20), glutamat dehidrogenaze (EC 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4) i nihove kombinacije.

29. Ćelija iz zahteva 27, naznačeno time da najmanje jedan polipeptid obuhvata aktivnost odabranu iz grupe koja sobuhvata sledeće: indollaktat dehidrogenaza (EC 1.1.1.110), R-4-hidroksifenillaktat dehidrogenaza (EC 1.1.1.222), 3-(4)-hidroksifcnilpiruvat reduktaza (EC 1.1.1.237), laktat dehidrogenaza (EC 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3), (3-imidazol-5-il) laktat dehidrogenaza (EC 1.1.1.111), laktat oksidaza (EC 1.1.3.-), sintaza/liaza (4.1.2.-), sintaza/liaza (4.1.3.-), triptofan dehidrogenaza (EC 1.4.1.19), triptofan-fenilpiruvat transaminaza (EC 2.6.1.28), triptofan aminotransferaza (EC 2.6.1.27), tirozin (aromatični) aminotransferaza (EC 2.6.1.5), multipli supstrat aminotransferaza (EC 2.6.1.-), aspartat aminotransferaza (EC 2.6.1.1), glutamat dehidrogenaza (EC 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4), fenilalanin dehidrogenaza (EC 1.4.1.20), D-triptofan aminotransferaza, D-amino kiselinska dehidrogenaza (EC 1.4.99.1), D-alanin aminotransferaza (EC 2.6.1.21) i njihova kombinacija.

30. Ćelija iz zahteva 27, naznačeno time da sintaza/liaza (EC 4.1.3.-) obuhvata 4-hidroksi-2-oksoglutarat aldolazu (EC 4.1.3.16) ili 4-hidroksi-4-metil-2-oksoglutarat aldolazu (EC 4.1.3.17).

31. Rekombinantna ćelija iz zahteva 26, naznačeno time da ta ćelija bude bakterijska ćelija.

32. Rekombinantna ćelija iz zahteva 26, naznačeno time da ta ćelija bude kvasna ćelija.

33. Ćelija iz zahteva 27, naznačeno time da ta ćelija obuhvata jedan ili više polipeptida koji su enkodirani na najmanje jednu egzogenu nukleinsku kiselinsku sekvencu, naznačeno time da ti polipeptidi obuhvataju odabrane iz grupa koje se sastoje od: katalaze, oksaloacetat dekarboksilaze, lizin epsilon aminotransferaze, i format dehidrogenaze.

34. Jedan polipeptid uključujući jednu amino kiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se satoji od Genbank Pristupni broj: P00913), Genbank Pristupni broj: NP 290344, Genbank Pristupni broj: CAA34096, Genbank Pristupni broj: NP 246359, Genbank Pristupni broj: AAB96579, Genbank Pristupni broj: NP 232561, Genbank Pristupni broj: Q59342, Genbank Pristupni broj: P28796Genbank Pristupni broj: 1 AX4_A, Genbank Pristupni broj: BAA34638, Genbank Pristupni broj: P31014, Genbank Pristupni broj: P31015, Genbank Pristupni broj: NP 280989, Genbank Pristupni broj: AAC33284, Genbank Pristupni broj: NP_147838, Genbank Pristupni broj: AAF63441, ili Genbank Pristupni broj: AAA24679, gde ti amino kiselinski reziduumi na poziciji 103 i 299 u odnosu na Genbank Pristupni broj: NP 418164 budu promenjeni da se proširi specifičnost polipeptida da prihvati supstrate dikarboksilne amino kiseline.

35. Polipeptid iz zahteva 34, gde promena u amino kiselinskoj sekvenci biva odabrana iz grupe koja se sastoji od: arginina 103 promenjenog u treonin, arginina 103 promenjenog u treonin i valina 299 u arginine; i valina 299 u arginine.

36. Polipeptid uključujući jednu amino kiselinsku sekvencu odabran iz grupe koja se sastoji od sledećeg: Genbank Pristupni broj: 2TPLA, Genbank Pristupni broj: P31012, Genbank Pristupni broj: P31013, A49493, Genbank Pristupni broj: P31011, Genbank Pristupni broj: AAB24234, Genbank Pristupni broj: 1TPLA,, Genbank Pristupni broj: 1TPLB, Genbank Pristupni broj: NP_245748, Genbank Pristupni broj: AAB41499, Genbank Pristupni broj: Q08897, Genbank Pristupni broj: T45297, i Genbank Pristupni broj: AAA71928, gde amino kiselinski reziduumi na pozicijama 100 i 283 u odnosu na Genbank Pristupni broj: X66978 bivaju promenjeni da se proširi specifičnost polipeptida da prihvati supstrate dikarboksilne kiseline amino kiselina.

37. Polipeptid iz zahteva 36, gde promena u ovoj amino kiselinskoj sekvenci biva odabrana iz grupe koja se sastoji od: arginina 100 promenjenog u treonin, arginina 100 promenjenog u treonin i valina 283 u arginine; i valina 283 u arginine.

38. Polipeptid iz zahteva 34 ili 36, naznačeno time da ovaj supstrat bude aspartat.

39. Metoda pravljenja monatina uključujući reagovanje najmanje jednog alaninskog derivata blokiranog na karboksilnim i amino grupama, i najmanje jednog indol-3-piruvat derivata blokiranog na karboksilnoj grupi.

40. Metoda pravljenja monatina u skladu sa zahtevom 39, naznačeno time da derivat alanina bude 3-hloro-alanin ili 3-bromo-alanin, i naznačeno time da indol-3-piruvat bude reagovan sa derivatom alanina u Grignard ili organolitijumskoj reakciji.

41. Metoda pravljenja monatina uključujući konverziju supstrata odabranog iz grupe koja se sastoji od triptofana, indol-3-mlečne kiseline, indol-3-piruvata, i 2-hidroksi 2-(indol-3-ilmetil)-4-keto glutarične kiseline, do jednog ili više međuproizvoda, naznačeno time da se napravi monatin.

42. Metoda iz zahteva 41, naznačeno time da se najmanje jedan od produkata međuproizvoda bude konvertovan preko hemijske reakcije.

43. Metoda iz zahteva 41, naznačeno time da najmanje jedan od produkata međuproizvoda bude konvertovan preko polipeptida.

44. Jedna izolovana nukleinska kiselina uključujući najmanje 90% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: U.

45. Izolovana nukleinska kiselina iz zahteva 44, naznačeno time da ova nukleinska kiselina obuhvata SEQ IDNO: 11.

46. Izolovana nukleinska kiselina iz zahteva 44, naznačeno time da ova nukleinska kiselina obuhvata najmanje 20 uzastopnih nukleotida SEQ ID NO: 11.

47. Jedan vektor uključujući e izolovanu nukleinsku kiselinu iz zahteva 44.

48. Rekombinantna ćelija uključujući vektor iz zahteva 47.

49. Jedan izolovani protein enkodiran pomoću izolovane nukleinske kiseline iz zahteva 44.

50. Izolovani protein iz zahteva 49, naznačeno time da ovaj protein obuhvata sekvencu koja ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO: 12.

51. Izolovani protein iz zahteva 50, naznačeno time da taj protein obuhvata SEQ ID NO: 12.

52. Metoda za produkciju monatina uključujući konverziju 2-hidroksi 2-(indol-3-ilmetil)-4-keto glutarične kiseline u monatin.

53. Metoda iz zahteva 52, naznačeno time da ova metoda dalje obuhvata detekciju 2-hidroksi 2-(indol-3-ilmetil)-4-keto glutarične kiseline masenom spektrometrijom.

54. Kompozicija uključujući 2-hidroksi 2-(indol-3-ilmetil)-4-keto glutaričnu kiselinu.

55. Metoda iz zahteva 2, naznačeno time da triptofan bude produkovan iz indola korišćenjem polipeptida izEC 4.1.99.1.

56. Metoda za produkciju monatin uključujući reagovanje triptofana sa jednim ili više polipeptida.

57. Metoda iz zahteva 56, naznačeno time da jedan ili više polipeptida bude odabran iz grupe koja se sastoji od : triptofan aminotransferaze (EC 2.6.1.27), triptofan dehidrogenaze (EC 1.4.1.19), tirozin (aromatični) aminotransferaze (EC 2.6.1.5), triptofan-fenilpiruvat transaminaze (EC 2.6.1.28), multipli supstrat aminotransferazw(EC 2.6.1.-), aspartat aminotransferaze (EC 2.6.1.1), triptofan oksidaze, L-amino kiselinske oksidaze (EC 1.4.3.2), D-amino kiselinske dehidrogenaze (EC 1.4.99.1), D-amino kiselinske oksidaze (EC 1.4.3.3), D-alanin aminotransferaze (EC 2.6.1.21), D-triptofan aminotransferaze, sintaza/liaze (EC 4.1.3.-), sintaza/liaze (4.1.2.-), fenilalanin dehidrogenaze (EC 1.4.1.20), glutamat dehidrogenaze (EC 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4) njihovu kombinaciju.