PL208998B1 - Sposób wytwarzania monatyny - Google Patents

Sposób wytwarzania monatyny

Info

Publication number
PL208998B1
PL208998B1 PL373423A PL37342303A PL208998B1 PL 208998 B1 PL208998 B1 PL 208998B1 PL 373423 A PL373423 A PL 373423A PL 37342303 A PL37342303 A PL 37342303A PL 208998 B1 PL208998 B1 PL 208998B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
pyruvate
tryptophan
indole
polypeptide
amino acid
Prior art date
Application number
PL373423A
Other languages
English (en)
Other versions
PL373423A1 (pl
Inventor
Timothy W. Abraham
Douglas C. Cameron
Joseph Dalluge
Paula M. Hicks
Russell J. Hobson
Sara C. Mcfarlan
Jim Millis
John Rosazza
Original Assignee
Cargill
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=29270554&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL208998(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Cargill filed Critical Cargill
Publication of PL373423A1 publication Critical patent/PL373423A1/pl
Publication of PL208998B1 publication Critical patent/PL208998B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12N9/0016—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Indole Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania monatyny. Przedstawiono polipeptydy i szlaki biosyntetyczne, które są użyteczne do wytwarzania indolo-3-pirogronianu, kwasu 2-hydroksy-2-(indol-3-ilometylo)-4-ketoglutarowego (MP) i/lub monatyny.
Pirogronian indolu
Indolo-3-pirogronian jest silnym przeciwutleniaczem, o którym sądzi się, że przeciwdziała stresowi oksydacyjnemu w tkankach, w których występują wysokie stężenia tlenu (Politi i in. Recent advances in Tryptophan Research, pod redakcją G.A.Filippini i in. Plenum Press, New York, 1996, str. 291-8). Pirogronian indolu jest również półproduktem w szlaku wytwarzania kwasu indolilooctowego (IAA), głównego roślinnego hormonu wzrostu auksyny (dyfuzyjny czynnik pobudzający wzrost). IAA jest aktywny w ilościach submikrogramowych w procesach fizjologicznych obejmujących dominację wierzchołkową, tropizmy, wydłużanie pędu, indukowanie podziału komórek kambium oraz inicjację rozwoju korzenia. Syntetyczne auksyny stosuje się w ogrodnictwie do indukcji ukorzeniania oraz pobudzania powstawania i rozwoju owocu.
W wysokich stężeniach, syntetyczne auksyny są skutecznymi herbicydami przeciwko roślinom szerokolistnym. Naturalnie wytwarzane przez fermentację auksyny można uważać za bardziej przyjazne dla środowiska niż herbicydy wytwarzane chemicznie. Sprzedaż regulatorów wzrostu na świecie wyniosła w 1999 roku 0,4 biliona funtów (1,4 biliona dolarów USA).
Niektóre przykłady opisów patentowych dotyczących kwasu indolilooctowego i jego pochodnych obejmują: opis patentowy US 5 843 782, „Micropropagation of rose plants, auxin used in culture medium” i opis patentowy US 5 952 231, „Micropropagation of rose plants”.
Poza zastosowaniami związanymi z roślinami, kwas indolilooctowy jest stosowany w farmaceutyce. Na przykład, opis patentowy US 5 173 497 Method of preparing alpha-oxopyrrolo[2,3-B]indole acetic acids and derivatives, proponuje stosowanie tych związków w leczeniu upośledzenia pamięci związanego z chorobą Alzheimera i otępieniem starczym. Mechanizm działania, zaproponowany w opisie patentowym US 5 173 497, polega na tym, ż e związki te hamują acetylocholinesterazę polipeptydową i powodują wzrost poziomu acetylocholiny w mózgu.
Indolo-3-karbinol wytwarza się z kwasu indolo-3-octowego przez utlenianie katalizowane peroksydazą i można go z łatwością przekształcić w diindolilometan. Odnośnie obu związków donoszono, że eliminują one toksyny i pobudzają wytwarzanie hormonów korzystnych dla zdrowia kobiet.
Pochodne tryptofanu
Stwierdzono, że chlorowany D-tryptofan jest nieodżywczym słodzikiem i istnieje wzrastające zainteresowanie uzyskiwaniem również innych jego pochodnych. Monatyna jest naturalnym słodzikiem, który jest podobny w składzie do aminokwasu tryptofanu. Ekstrahuje się ją z kory korzenia południowo afrykańskiego krzewu, Sclerochiton ilicifolius, i jest ona obiecująca dla przemysłu spożywczego i napojów jako wysoce intensywny słodzik. Niektóre przykłady opisów patentowych dotyczących monatyny obejmują: opis patentowy US 5 994 559, Synthesis of monatin-A high intensity natural sweetener, opis patentowy US 4 975 298, 3-(1-amino-1,3-dicarboxy-3-hydroxy-but-4-yl)-indole compounds, opis patentowy US 5,128,164, Composition for human consumption containing 3-(1-amino-1,3-dicarboxy-3-hydroxy-but-4-yl)-indole compounds oraz opis patentowy US 5,128,482, Process for the production of 3-1-(1-amino-1,3-dicarboxy-3-hydroxy-but-4-yl) indole.
Niektóre z opisanych tu prekursorów monatyny mogą być również użyteczne jako syntetyczne słodziki lub jako półprodukty w syntezie pochodnych monatyny.
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania monatyny obejmujący etapy, w których kontaktuje się tryptofan lub kwas indolo-3-mlekowy z pierwszym polipeptydem, przy czym jeśli kontaktuje się tryptofan z pierwszym polipeptydem, to pierwszy polipeptyd jest wybrany z grupy składającej się z: aminotransferazy tryptofanowej (EC 2.6.1.27),aminotransferazy tyrozynowej (aromatycznej) (EC 2.6.1.5), dehydrogenazy tryptofanowej (EC 1.4.1.19), dehydrogenazy glutaminianowej (EC 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4), dehydrogenazy fenyloalaninowej (EC 1.4.1.20), transaminazy tryptofan fenylopirogronian (EC 2.6.1.28), aminotransferazy asparaginianowej (EC 2.6.1.1), oksydazy L-aminokwasowej (EC 1.4.3.2), dehydrogenazy D-aminokwasowej (EC 1.4.99.1), oksydazy D-aminokwasowej (EC 1.4.3.3), aminotransferazy D-aminokwasowej (D-alaninowej) (EC 2.6.1.21), lub ich kombinacji, natomiast jeśli kontaktuje się kwas indolo-3-mlekowy z pierwszym polipeptydem, to pierwszy polipeptyd jest wybrany z grupy składającej się z: dehydrogenazy indolomleczanowej (EC 1.1.1.110), dehydrogenazy R-4-hydroksyfenylomleczanowej (EC 1.1.1.222), reduktazy 3-(4)-hydroksyfenylopirogroPL 208 998 B1 nianowej (EC 1.1.1.237), dehydrogenazy mleczanowej (EC 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3), dehydrogenazy (3-imidazolo-5-ylo) mleczanowej (EC 1.1.1.111), oksydazy mleczanowej (EC 1.1.3.-) lub ich kombinacji, przy czym pierwszy polipeptyd przekształca tryptofan lub kwas indolo-3-mlekowy w indolo-3-pirogronian; kontaktuje się indolo-3-pirogronian z drugim polipeptydem i źródłem węgla C3, gdzie drugi polipeptyd wybrany jest spośród: glioksylano-liazy 4-hydroksy-2-oksoglutaranu (EC 4.1.3.16), pirogroniano-liazy 4-hydroksy-4-metylo-2-oksoglutaranu (EC 4.1.3. 17) lub ich kombinacji, przy czym drugi polipeptyd przekształca indolo-3-pirogronian i źródło węgla C3 w kwas 2-hydroksy-2-(indol-3-ilometylo)-4-ketoglutarowy; i kontaktuje się kwas 2-hydroksy-2-(indol-3-ilometylo)-4-ketoglutarowy z trzecim polipeptydem, gdzie trzeci polipeptyd wybrany jest spoś ród: aminotransferazy tryptofanowej (EC 2.6.1.27), aminotransferazy tyrozynowej (aromatycznej) (EC 2.6.1.5), dehydrogenazy tryptofanowej (EC 1.4.1.19), transaminazy tryptofan-fenylopirogronian (EC 2.6.1.28), aminotransferazy asparaginianowej (EC 2.6.1.1), dehydrogenazy glutaminianowej (EC 1.4.1.2-4), dehydrogenazy fenyloalaninowej (EC 1.4.1.20), dehydrogenazy D-aminokwasowej (EC 1.4.99.1), aminotransferazy D-aminokwasowej (D-alaninowej) (EC 2.6.1.21), aminotransferazy D-metionina-pirogronian (EC 2.6.1.41), lub ich kombinacji, przy czym trzeci polipeptyd przekształca kwas 2-hydroksy-2-(indol-3-ilometylo)-4-ketoglutarowy w monatynę.
W sposobie wedł ug wynalazku korzystnie stosuje się pierwszy i/lub trzeci polipeptyd, który obejmuje: sekwencję aminokwasową przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 32, numer dostępu w Genbank: NP_388848.1, numer dostępu w Genbank: ZP00005082.1 lub numer dostępu w Genbank: AAC74014.1; sekwencję aminokwasową wykazującą co najmniej 90% identyczność sekwencji z sekwencją przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 32, numer dostępu w Genbank: NP_388848.1, numer dostępu w Genbank: ZP00005082.1 lub numer dostępu w Genbank: AAC74014.1 lub sekwencje aminokwasowe, które różnią się od sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 32, numer dostępu w Genbank: NP_388848.1, numer dostępu w Genbank: ZP00005082.1 lub numer dostępu w Genbank: AAC74014.1 o mniej niż 50 substytucji aminokwasów konserwatywnych, przy czym sekwencja aminokwasowa przekształca tryptofan w indolo-3-pirogronian.
W sposobie wedł ug wynalazku korzystnie stosuje się pierwszy polipeptyd, który obejmuje oksydazę aminokwasową (EC 1.4.3.3) i katalazę (EC 1.11.1.6), przy czym pierwszy polipeptyd przekształca tryptofan w indolo-3-pirogronian.
Korzystnie w sposobie według wynalazku oksydaza aminokwasowa obejmuje oksydazę tryptofanową.
Źródło węgla C3 korzystnie wybiera się z grupy składającej się z pirogronianu, fosfoenolopirogronianu, alaniny, seryny, cysteiny lub ich kombinacji.
Pirogronian korzystnie wytwarza się przez: alaninę i polipeptyd zdolny do transaminacji alaniny; serynę i polipeptyd zdolny do beta-eliminacji seryny; cysteinę i polipeptyd zdolny do beta-eliminacji cysteiny; asparaginian i polipeptyd zdolny do reakcji beta-liazy z aminokwasem dikarboksylowym; mleczan i oksydazę mleczanową (EC 1.1.3.-) dehydrogenazę mleczanową (EC 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3) lub ich kombinacje.
Korzystne jest, że w sposobie według wynalazku ponadto zmniejsza się ilość nadtlenku wodoru wytwarzanego przy przekształcaniu tryptofanu w indolo-3-pirogronian, poprzez kontaktowanie nadtlenku wodoru z katalazą.
W sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się drugi polipeptyd, który obejmuje sekwencję aminokwasowa wybraną z grupy składającej się z: sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID NO: 66, numer dostępu w Genbank: CAC46344, numer dostępu w Genbank: CAB14127.1, numer dostępu w Genbank: AAC74920.1, lub numer dostępu w Genbank: CAC47463.1; sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 90% identyczność sekwencji z sekwencją o numerze identyfikacyjnym SEQ ID NO: 66, numer dostępu w Genbank: CAC46344, numer dostępu w Genbank: CAB14127.1, numer dostępu w Genbank: AAC74920.1 lub numer dostępu w Genbank: CAC47463.1 lub sekwencji aminokwasowej, która różni się od sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID NO : 66, numer dostępu w Genbank: CAC46344, numer dostępu w Genbank: CAB14127.1, numer dostępu w Genbank: AAC74920.1 lub numer dostępu w Genbank: CAC47463.1 o mniej niż 50 substytucji aminokwasów konserwatywnych, przy czym sekwencja aminokwasowa przekształca indolo-3-pirogronian i pirogronian w kwas 2-hydroksy-2-(indol-3-ilometylo)-4-ketoglutarowy.
W sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się trzeci polipeptyd, który stanowi aminotransferaza asparaginianowa, przy czym kwas 2-hydroksy-2-(indol-3-ilometylo)-4-ketoglutarowy kon4
PL 208 998 B1 taktuje się z asparaginianem do uzyskania szczawiooctanu i monatyny. Korzystne jest, że w sposobie według wynalazku ponadto kontaktuje się szczawiooctan z dekarboksylazą.
W sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się trzeci polipeptyd, który stanowi enzym zdolny do redukcyjnej aminacji i polipeptyd, który jest zdolny do recyklingu NAD(P)H.
Korzystne jest jeśli enzym zdolny do redukcyjnej aminacji wybiera się z grupy składającej się z dehydrogenazy glutaminianowej, dehydrogenazy fenyloalaninowej, dehydrogenazy tryptofanowej lub ich kombinacji.
Wynalazek przedstawia kilka dróg biosyntetycznych dla przygotowywania monatyny z glukozy, tryptofanu, kwasu indolo-3-mlekowego, i/lub przez prekursory monatyny, takie jak indolo-3-pirogronian i kwas 2-hydroksy-2-(indol-3-ilometylo)-4-ketoglutarowy. Przedstawiono polipeptydy i sekwencje kwasów nukleinowych, które można stosować do przygotowywania monatyny, indolo-3-pirogronianu oraz kwasu 2-hydroksy-2-(indol-3-ilometylo)-4-ketoglutarowego.
Monatynę można wytwarzać przez indolo-3-pirogronian, kwas 2-hydroksy-2-(indol-3-ilometylo)-4-ketoglutarowy (prekursor monatyny, MP, postać alfa-keto monatyny), kwas indolo-3-mlekowy, tryptofan i/lub glukozę (Fig. 1). Opisano, przedstawione na Figurach 1-3 oraz 11-13 sposoby wytwarzania lub przygotowywania monatyny lub jej półproduktów, które obejmują przekształcanie substratu do pierwszego produktu a następnie przekształcanie pierwszego produktu do drugiego produktu, i tak dalej, dokąd nie powstanie pożądany produkt.
Figury 1-3 i 11-13 przedstawiają potencjalne półprodukty i produkty końcowe w ramkach. Stosując te sposoby można przekształcać jeden produkt w drugi, na przykład, glukozę w tryptofan, tryptofan w indolo-3-pirogronian, indolo-3-pirogronian w MP, MP w monatynę lub kwas indolo-3-mlekowy (indolo-mleczan) w indolo-3-pirogronian. Te przekształcenia można ułatwiać chemicznie lub biologicznie.
Termin przekształcać odnosi się do stosowania albo sposobów chemicznych, albo polipeptydów, w reakcji, która zmienia pierwszy półprodukt w drugi półprodukt.
Termin przekształcanie chemiczne odnosi się do reakcji, które nie są aktywnie ułatwiane przez polipeptydy.
Termin przekształcanie biologiczne odnosi się do reakcji, które są aktywnie ułatwiane przez polipeptydy. Przekształcenia mogą mieć miejsce in vivo lub in vitro. Kiedy wykorzystuje się przekształcenia biologiczne, polipeptydy i/lub komórki można immobilizować na nośnikach, tak jak przez chemiczne wiązanie na nośniakch polimerowych. Przekształcanie można przeprowadzać stosując dowolny reaktor znany specjalistom w tej dziedzinie, na przykład, w reaktorze szarżowym lub ciągłym.
Opisano sposoby, które obejmują kontaktowanie pierwszego polipeptydu z substratem i wytworzenie pierwszego produktu, a następnie kontaktowanie pierwszego wytworzonego produktu z drugim polipeptydem i wytworzenie drugiego produktu, a następnie kontaktowanie drugiego wytworzonego produktu z trzecim polipeptydem i wytworzenie trzeciego produktu, na przykład monatyny. Stosowane polipeptydy i wytwarzane produkty przedstawiono na Figurach 1-3 oraz 11-13.
Przedstawiono polipeptydy i ich sekwencje kodujące, które można stosować do przekształceń przedstawionych na Figurach 1-3 oraz 11-13. W niektórych przykładach, do przygotowywania monatyny stosuje się polipeptydy posiadające jedną lub więcej mutacji punktowych, które umożliwiają modyfikację specyficzności substratowej i/lub aktywności.
Przedstawiono wyizolowane i rekombinowane komórki, które wytwarzają monatynę. Komórki te mogą być dowolnymi komórkami, takimi jak komórki roślinne, zwierzęce, bakteryjne, drożdżowe, glonów, bakterii należących Archeobacteria lub komórki grzybowe.
Komórki te mogą posiadać jedną lub więcej następujących aktywności, na przykład, dwie lub więcej bądź trzy lub więcej z następujących aktywności: aminotransferazy tryptofanowej (EC 2.6.1.27), aminotransferazy tyrozynowej (aromatycznej) (EC 2.6.1.5),aminotransferazy wielosubstratowej (EC 2.6.1.-), aminotransferazy asparaginianowej (EC 2.6.1.1), dehydrogenazy tryptofanowej (EC 1.4.1.19), transaminazy tryptofanfenylopirogronian (EC 2.6.1.28), oksydazy L-aminokwasowej (EC 1.4.3.2), oksydazy tryptofanowej (bez numeru EC, Hadar i in., J. Bacteriol 125:1096-1104, 1976 oraz Furuya i in., Biosci Biotechnol Biochem 64:1486-93, 2000), dehydrogenazy D-aminokwasowej (EC 1.4.99.1), oksydazy D-aminokwasowej (EC 1.4.3.3), aminotransferazy D-alaninowej (EC 2.6.1.21), syntazy/liazy (EC 4.1.3.-), takiej jak aldolaza 4-hydroksy-4-metylo-2-okso-glutaranowa (EC 4.1.3.17) lub aldolaza 4-hydroksy-2-oksoglutaranowa (EC 4.1.3.16), syntazy/liazy (4.1.2.-), aminotransferazy D-tryptofanowej (Kohiba i Mito, Proceedings of the 8th International Symposium on Vitamin B6 and Carbonyl Catalysis, Osaka, Japonia 1990), dehydrogenazy fenyloalaninowej (EC 1.4.1.20) i/lub dehydrogenazy glutaminianowej (EC 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4).
PL 208 998 B1
Komórki mogą posiadać jedną lub więcej, na przykład, dwie lub więcej, bądź trzy lub więcej z następujących aktywności: dehydrogenazy indolomleczanowej (EC 1.1.1.110), dehydrogenazy R-4-hydroksyfenylomleczanowej (EC 1.1.1.222), reduktazy 3-(4)-hydroksyfenylopirogronianowej (EC 1.1.1.237), dehydrogenazy mleczanowej (EC 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3), dehydrogenazy (3-imidazol-5-ilo)mleczanowej (EC 1.1.1.111), oksydazy mleczanowej (EC 1.1.3.-), syntazy/liazy (4.1.3.-), takiej jak aldolaza 4-hydroksy-4-metylo-2-oksoglutaranowa (EC 4.1.3.17) lub aldolaza 4-hydroksy-2-oksoglutaranowa (EC 4.1.3.16), syntazy/liazy (4.1.2.-), dehydrogenazy tryptofanowej (EC 1.4.1.19), transaminazy tryptofanfenylopirogronian (EC 2.6.1.28), aminotransferazy tryptofanowej (EC 2.6.1.27), aminotransferazy tyrozynowej (aromatycznej) (EC 2.6.1.5), aminotransferazy wielosubstratowej (EC 2.6.1.-), aminotransferazy asparaginianowej (EC 2.6.1.1), dehydrogenazy fenyloalaninowej (EC 1.4.1.20), dehydrogenazy glutaminianowej (EC 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4), dehydrogenazy Daminokwasowej (EC 1.4.99.1), aminotransferazy D-tryptofanowej i/lub aminotransferazy D-alaninowej (EC 2.6.1.21).
Ponadto, komórki mogą posiadać jedną lub więcej następujących aktywności, na przykład, dwie lub więcej bądź trzy lub więcej z następujących aktywności: aminotransferazy tryptofanowej (EC 2.6.1.27), aminotransferazy tyrozynowej (aromatycznej) (EC 2.6.1.5), aminotransferazy wielosubstratowej (EC 2.6.1.-), aminotransferazy asparaginianowej (EC 2.6.1.1), dehydrogenazy tryptofanowej (EC 1.4.1.19), transaminazy tryptofanfenylopirogronian (EC 2.6.1.28), oksydazy L-aminokwasowej (EC 1.4.3.2), oksydazy tryptofanowej (bez numeru EC), dehydrogenazy D-aminokwasowej (EC 1.4.99.1), oksydazy D-aminokwasowej (EC 1.4.3.3), aminotransferazy D-alaninowej (EC 2.6.1.21), dehydrogenazy indolomleczanowej (EC 1.1.1.110), dehydrogenazy R-4-hydroksyfenylomleczanowej (EC 1.1.1.222), reduktazy 3-(4)-hydroksyfenylopirogronianowej (EC 1.1.1.237), dehydrogenazy mleczanowej (EC 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3), dehydrogenazy (3-imidazol-5-ilo)mleczanowej (EC 1.1.1.111), oksydazy mleczanowej (EC 1.1.3.-), syntazy/liazy (4.1.3.-), takiej jak aldolaza 4-hydroksy-4-metylo-2-oksoglutaranowa (EC 4.1.3.17) lub aldolaza 4-hydroksy-2-oksoglutaranowa (EC 4.1.3.16), syntazy/liazy (4.1.2.-),dehydrogenazy glutaminianowej (EC 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4), dehydrogenazy fenyloalaninowej (EC 1.4.1.20), i/lub aminotransferazy D-tryptofanowej.
Monatynę wytwarza się sposobem, w którym kontaktuje się tryptofan i/lub kwas indolo-3-mlekowego z pierwszym polipeptydem, gdzie pierwszy polipeptyd przekształca tryptofan i/lub kwas indolo-3-mlekowy w indolo-3-pirogronian (jako substrat, który przekształcany jest w indolo-3-pirogronian, można stosować albo postać D bądź L tryptofanu albo kwas indolo-3-mlekowy; specjalista w tej dziedzinie będzie zdawać sobie sprawę, że polipeptydy wybrane do tego etapu idealnie wykazują właściwą specyficzność), kontaktuje się tak otrzymany indolo-3-pirogronian z drugim polipeptydem, gdzie drugi polipeptyd przekształca indolo-3-pirogronian w kwas 2-hydroksy-2-(indol-3-ilometylo)-4-ketoglutarowy (MP), i kontaktuje się MP z trzecim polipeptydem, gdzie trzeci polipeptyd przekształca MP w monatynę. Przykładowe polipeptydy, które można stosować do tych przekształceń przedstawiono na Fig. 2 i 3.
Sposób według wynalazku może być wykorzystany do otrzymywania kompozycji takich jak MP, komórki, które zawierają co najmniej dwa polipeptydy, lub czasami co najmniej trzy lub co najmniej cztery polipeptydy, które są kodowane przez co najmniej jedną egzogenną sekwencję kwasu nukleinowego.
Wynalazek ilustrują rysunek i przykłady.
Krótki opis figur
FIG. 1 przedstawia szlaki biosyntetyczne wykorzystywane do wytwarzania monatyny i/lub indolo-3-pirogronianu. W jednym szlaku powstaje indolo-3-pirogronian przez tryptofan, podczas gdy w innym powstaje indolo-3-pirogronian przez kwas indolo-3-mlekowy. Następnie wytwarzana jest monatyna przez półprodukt, kwas 2-hydroksy-2-(indol-3-ilometylo)-4-ketoglutarowy (MP) .
Związki przedstawione w ramkach są substratami i produktami wytwarzanymi w szlakach biosyntetycznych.
Kompozycje sąsiadujące ze strzałkami są kofaktorami lub substratami reakcji, które można wykorzystywać podczas przekształcania substratu w produkt. Stosowany kofaktor lub substrat reakcji będzie zależał od polipeptydu stosowanego w określonym etapie szlaku biosyntetycznego. Kofaktor PLP (5'-fosforan pirydoksalu) może katalizować reakcje niezależnie od polipeptydu, i dlatego też, dostarczając jedynie PLP można umożliwić postęp reakcji od substratu do produktu.
FIG. 2 jest bardziej szczegółowym diagramem szlaku biosyntetycznego, który wykorzystuje półprodukt MP. Substraty dla każdego etapu w szlaku przedstawiono w ramkach. Polipeptydy umożliwia6
PL 208 998 B1 jące przekształcanie pomiędzy substratami wymieniono w pobliżu strzałek znajdujących się pomiędzy substratami. Każdy polipeptyd opisano jego nazwą zwyczajową i numerem klasy enzymatycznej (EC).
FIG. 3 przedstawia bardziej szczegółowy diagram szlaku biosyntetycznego przeształcania kwasu indolo-3-mlekowego w indolo-3-pirogronian. Substraty przedstawiono w ramkach, a polipeptydy umożliwiające przekształcanie pomiędzy substratami wymieniono w pobliżu strzałek znajdujących się pomiędzy substratami. Każdy polipeptyd opisano jego nazwą zwyczajową i numerem klasy enzymatycznej (EC).
FIG. 4 przedstawia jedną z możliwych reakcji wytwarzania MP sposobami chemicznymi.
FIG. 5A i 5B przedstawia chromatogram identyfikacji LC/MS monatyny wytworzonej enzymatycznie.
FIG. 6 przedstawia elektrorozpyłowe widmo masowe enzymatycznie zsyntetyzowanej monatyny.
FIG. 7A i 7B przedstawiają chromatograray analiz jonów potomnych LC/MS/MS monatyny wytworzonej w mieszaninie enzymatycznej.
FIG. 8 jest chromatogramem przedstawiającym pomiary masy o wysokiej rozdzielczości monatyny wytworzonej enzymatycznie.
FIG. 9A-9C są chromatogramami przedstawiającymi chiralny rozdział (A) R-tryptofanu, (B) S-tryptofanu, oraz (C) monatyny wytworzonej enzymatycznie.
FIG. 10 jest wykresem słupkowym przedstawiającym względną ilość monatyny wytworzonej w komórkach bakteryjnych po indukcji IPTG. (-) wskazuje brak dodawania substratu (nie dodawano żadnego tryptofanu ani pirogronianu).
FIG. 11-12 są schematycznymi diagramami przedstawiającymi szlaki stosowane do podwyższania wydajności monatyny wytwarzanej z tryptofanu lub indolo-3-pirogronianu.
FIG. 13 jest schematycznym diagramem przedstawiającym szlak, który można stosować do podwyższania wydajności monatyny wytwarzanej z tryptofanu lub indolo-3-pirogronianu.
Lista sekwencji
Sekwencje nukleinowe i aminokwasowe wymienione w załączonej liście sekwencji przedstawiono wykorzystując standardowe skróty literowe dla zasad nukleotydowych oraz trójliterowy kod dla aminokwasów. Przedstawiono tylko jedną nić dla każdej sekwencji kwasu nukleinowego, ale uważa się, że wszelkie odniesienia do przedstawionej nici obejmują nić komplementarną.
Sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 1 i 2 przedstawiają, odpowiednio, sekwencje kwasu nukleinowego i aminokwasową aminotransferazy z Sinorhizobium meliloti, (gen tatA, zwany w literaturze genem aminotransferazy tyrozynowej lub aromatycznej).
Sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 3 i 4 przedstawiają, odpowiednio, sekwencje kwasu nukleinowego i aminokwasową aminotransferazy tyrozynowej z Rhodobacter sphaeroides (2.4.1) (przez homologię z tatA (Sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 1 i 2), na podstawie oprogramowania genomowego przewidywane jako aminotransferaza asparaginianowa).
Sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 5 i 6 przedstawiają, odpowiednio, sekwencje kwasu nukleinowego i sekwencję aminokwasową aminotransferazy z Rhodobacter sphaeroides (35053), (nowe, sklonowane w oparciu o sekwencję 2.4.1 sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 3 i 4).
Sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 7 i 8 przedstawiają, odpowiednio, sekwencje kwasu nukleinowego i sekwencję aminokwasową aminotransferazy o szerokim spektrum substratowym (bsat) z Leishmania major.
Sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 9 i 10 przedstawiają, odpowiednio, sekwencje kwasu nukleinowego i sekwencję aminokwasową aminotransferazy aromatycznej (araT) z Bacillus subtilis.
Sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 11 i 12 przedstawiają, odpowiednio, nowe sekwencje kwasu nukleinowego i sekwencję aminokwasową aminotransferazy aromatycznej (araT) z Lactobacillus amylovorus (przez homologię identyfikowaną jako aminotransferazę aromatyczną).
Sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 13 i 14 przedstawiają, odpowiednio, sekwencje kwasu nukleinowego i sekwencję aminokwasową aminotransferazy wielosubstratowej (msa) z R. sphaeroides (35053) (zidentyfikowaną jako aminotransferazę wielosubstratową przez homologię do sekwencji o numerze dostę pu AAAE01000093.1, 14743-16155 bp oraz o numerze dost ę pu ZP00005082.1).
Sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 15 i 16 przedstawiają startery stosowane do klonowania sekwencji aminotransferazy D-alaninowej B. subtilis (dat).
Sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 17 i 18 przedstawiają startery stosowane do klonowania sekwencji tatA S. meliloti.
PL 208 998 B1
Sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 19 i 20 przedstawiają startery stosowane do klonowania sekwencji aminotransferazy araT B. subtilis.
Sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 21 i 22 przedstawiają startery stosowane do klonowania sekwencji aminotransferazy wielosubstratowej (2.4.1 i 35053) Rhodobacter sphaeroides.
i 24 przedstawiają startery stosowane do klono25 i 26 przedstawiają startery stosowane do klonoSekwencje o numerach identyfikacyjnych: wania sekwencji bsat Leishmania major.
Sekwencje o numerach identyfikacyjnych: wania sekwencji araT Lactobacillus amylovorus.
Sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 27 i 28 przedstawiają startery stosowane do klonowania sekwencji tatA R. sphaeroides (obu 2.4.1 i 35053).
Sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 29 i 30 przedstawiają startery stosowane do klonowania sekwencji aspC E. coli (sekwencja genowa o numerze dostępu w Genbank: AE000195.1, sekwencja białkowa o numerze dostępu w Genbank: AAC74014.1).
Sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 31 i 32 przedstawiają, odpowiednio, sekwencje kwasu nukleinowego i aminokwasową aminotransferazy aromatycznej (tyrB) z E. coli.
Sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 33 i 34 przedstawiają startery stosowane do klonowania sekwencji tyrB E. coli.
Sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 35-40 przedstawiają startery stosowane do klonowania polipeptydów o aktywności aldolazy 4-hydroksy-2-oksoglutaranowej (KHG) (EC 4.1.3.16).
Sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 41 i 42 przedstawiają sekwencje kwasu nukleinowego tryptofanazy (tna) z E. coli i liazy tyrozyno-fenolowej (tpl) z Citrobacter freundii, kodujące białka, odpowiednio, P00913 (GI:401195) i P31013 (GI:401201).
Sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 43-46 przedstawiają startery stosowane do klonowania polipeptydów tryptofanazy i polipepydów β-tyrozynazy (liazy tyrozynofenolowej).
Sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 47-54 przedstawiają startery stosowane do mutowania polipeptydów tryptofanazy i polipepydów β-tyrozynazy.
Sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 55-64 przedstawiają startery stosowane do klonowania polipeptydów o aktywności aldolazy 4-hydroksy-4-metylo-2-oksoglutaranowej (EC 4.1.3.17).
Sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 65 i 66 przedstawiają, odpowiednio, sekwencje kwasu nukleinowego i aminokwasową aldolazy 4-hydroksy-4-metylo-2-oksoglutaranowej (proA) z C. testosteroni.
Sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 67-68 przedstawiają startery stosowane do klonowania aldolazy 4-hydroksy-4-metylo-2-oksoglutaranowej (proA) z C. testosteroni w operonie z aspC E. coli w pET30 Xa/LIC.
Sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 69-72 przedstawiają startery stosowane do klonowania aspC E. coli i proA C. testosteroni w pESC-his.
Sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 73-74 przedstawiają sekwencje dodane do końca 5' starterów stosowanych do klonowania przedstawionych genów.
Poniższe wyjaśnienie terminów pozwoli na lepsze opisanie wynalazku i da wskazówki specjalistom w tej dziedzinie co do stosowania wynalazku w praktyce.
Zawierający oznacza obejmujący a formy w liczbie pojedynczej odnoszą się również do liczby mnogiej, o ile z kontekstu wyraźnie nie wynika inaczej. Na przykład, odniesienie do terminu zawierający białko obejmuje jedno lub wiele takich białek, a odniesienie do terminu zawierający komórkę obejmuje odniesienie do jednej lub więcej komórek i ich równoważników znanych specjalistom w tej dziedzinie, i tak dalej.
O ile nie wyjaśniono inaczej, wszystkie terminy techniczne i naukowe stosowane w opisie mają takie samo znaczenie jak jest to powszechnie rozumiane przez specjalistę w dziedzinie, do której należy wynalazek.
Chociaż w praktycznym stosowaniu lub testowaniu wynalazku można stosować metody i materiały podobne lub równoważne do tych opisanych w opisie, to odpowiednie metody i materiały opisano poniżej. Materiały, metody i przykłady są jedynie ilustracyjne i nie jest zamierzeniem, aby stanowiły one ograniczenie. Inne cechy i zalety wynalazku staną się oczywiste na podstawie poniższego szczegółowego opisu i zastrzeżeń.
cDNA (komplementarny DNA): kawałek DNA pozbawionego wewnętrznych, nie kodujących odcinków (intronów) i sekwencji regulatorowych, które determinują transkrypcję. cDNA można
PL 208 998 B1 syntetyzować w laboratorium przez odwrotną transkrypcję z informacyjnego RNA wyekstrahowanego z komórek.
Podstawienie konserwatywne: Jedno lub więcej podstawień aminokwasowych (na przykład 2, 5 lub 10 reszt) dla reszt aminokwasowych mających podobne właściwości biochemiczne. Zazwyczaj, podstawienia konserwatywne mają mały lub żaden wpływ na aktywność otrzymywanego polipeptydu. Na przykład, idealnie, polipeptyd aminotransferazy tryptofanowej obejmujący jedno lub więcej podstawień konserwatywnych zachowuje aktywność aminotransferazy tryptofanowej. Polipeptyd można wytwarzać tak, aby zawierał jedno lub więcej podstawień konserwatywnych, przez minipulację sekwencją nukleotydową, która koduje ten polipeptyd, stosując na przykład standardowe procedury, takie jak mutageneza ukierunkowana wobec miejsca lub PCR.
Warianty podstawieniowe są wariantami, w których usunięto co najmniej jedną resztę w sekwencji aminokwasowej i w jej miejsce wstawiono inną resztę. Przykłady aminokwasów, które można podstawiać w miejsce oryginalnego aminokwasu w białku i, które uważa się za podstawienia konserwatywne obejmują: ala podstawioną ser lub thr; arg podstawioną gln, his lub lys; asn podstawioną glu, gln, lys, his, asp; asp podstawiony asn, glu lub gln; cys podstawioną ser lub ala; gln podstawioną asn, glu, lys, his, asp, lub arg; glu podstawiony asn, gln lys lub asp; gly podstawioną pro; his podstawioną asn, lys, gln, arg, tyr; ile podstawioną leu, met, val, phe; leu podstawioną ile, met, val, phe; lys podstawioną asn, glu, gln, his, arg; met podstawioną ile, leu, val, phe; phe podstawioną trp, tyr, met, ile lub leu; ser podstawioną thr, ala; thr podstawioną ser lub ala; trp podstawiony phe, tyr; tyr podstawioną his, phe lub trp; oraz val podstawioną met, ile, leu.
Dalsze informacje na temat podstawień konserwatywnych można znaleźć, między innymi, w Ben-Bassat i in., (J. Bacteriol. 169: 751-7, 1987), O'Regan i in., (Gene 11: 237-51, 1989), SahinToth i in., (Protein Sci. 3: 240-7, 1994), Hochuli i in., (Bio/Technology 6:1321-5, 1988), opis patentowy numer WO 00/67796 (Curd i in.) oraz w standardowych podręcznikach genetyki i biologii molekularnej.
Egzogenny: Termin egzogennny, jak stosuje się w opisie odniesieniu do kwasu nukleinowego i okreś lonej komórki, odnosi się do każdego kwasu nukleinowego, który nie pochodzi, w warunkach naturalnych, z tej określonej komórki. A zatem, nie występujący naturalnie kwas nukleinowy uważa się za egzogenny dla komórki po wprowadzeniu go do tej komórki. Kwas nukleinowy, który występuje naturalnie również może być egzogenny dla określonej komórki. Na przykład, cały chromosom wyizolowany z komórki osoby X jest egzogennym kwasem nukleinowym w odniesieniu do komórki osoby Y, jeśli ten chromosom wprowadzi się do komórki Y.
Funkcjonalny równoważnik: Posiadający równoważną funkcję. W kontekście enzymu cząsteczki funkcjonalnie równoważne obejmują różne cząsteczki, które zachowują funkcję enzymu. Na przykład, funkcjonalne równoważniki można zapewniać przez zmiany sekwencji w sekwencji enzymu, przy czym peptyd z jedną lub więcej zmianami sekwencji zachowuje funkcję niezmienionego peptydu tak, że zachowuje on swoją aktywność enzymatyczną. W konkretnym przykładzie, funkcjonalny równoważnik aminotransferazy tryptofanowej zachowuje zdolność do przekształcania tryptofanu w indolo-3-pirogronian.
Przykłady zmian sekwencji obejmują, ale nie są ograniczone, do podstawień konserwatywnych, delecji, mutacji, przesunięć ramek odczytu oraz insercji. W jednym przykładzie, dany polipeptyd wiąże się z przeciwciałem, a funkcjonalnym równoważnikiem jest polipeptyd, który wiąże się z tym samym przeciwciałem. A zatem, funkcjonalny równoważnik obejmuje peptydy, które posiadają taką samą specyficzność wiązania jak polipeptyd i, które można stosować jako reagent w miejsce polipeptydu. W jednym przykł adzie, funkcjonalny równoważ nik obejmuje polipeptyd, w którym sekwencja wiążąca jest nieciągła, przy czym przeciwciało wiąże się z liniowym epitopem. A zatem, jeśli sekwencja peptydu jest MPELANDLGL (1-10 aminokwasów sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 12), to funkcjonalny równoważnik obejmuje epitopy nieciągłe, które mogą przedstawiać się następująco (** = dowolna liczba aminokwasów rozdzielających):
NH2-**-M**P**E**L**A**N**D**L**G**L-COOH.
W tym przykładzie, polipeptyd jest funkcjonalnym równoważ nikiem aminokwasów 1-10 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 12, jeśli struktura trójwymiarowa polipeptydu jest taka, że może on wiązać się z przeciwciałem monoklonalnym, które wiąże się z aminokwasami 1-10 sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 12.
Hybrydyzacja: Termin hybrydyzacja, jak stosuje się w opisie, odnosi się do metody testowania komplementarności sekwencji nukleotydowych dwóch cząsteczek kwasu nukleinowego, opierając się na zdolności komplementarnych jednoniciowych DNA i/lub RNA do tworzenia cząsteczek dupleksu.
PL 208 998 B1
W zakresie wynalazku techniki hybrydyzacji kwasów nukleinowych można stosować do otrzymywania wyizolowanego kwasu nukleinowego. W skrócie, dowolny kwas nukleinowy wykazujący jakąś homologię do sekwencji przedstawionej w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 11 można stosować jako sondę do identyfikacji podobnego kwasu nukleinowego przez hybrydyzację w warunkach od umiarkowanie do wysoce surowych. Po identyfikacji, kwas nukleinowy można następnie oczyszczać, sekwencjonować i analizować w celu określenia, czy wchodzi on w zakres wynalazku.
Hybrydyzację można przeprowadzać przez analizę Southern lub Northern, dla identyfikacji sekwencji, odpowiednio, DNA lub RNA, która hybrydyzuje z sondą. Sondę można znakować biotyną, digoksygeniną, polipeptydem lub izotopem promieniotwórczym, takim jak 32P. Analizowany DNA lub RNA można elektroforetycznie rozdzielać na żelu agarozowym lub poliakryloamidowym, przenosić na nitrocelulozę, nylon lub inną odpowiednią membranę i hybrydyzować z sondą, stosując standardowe techniki dobrze znane w nauce, takie jak te opisane w części 7.39-7.52 Sambrook i in., (1989) Molecular Cloning, wydanie drugie, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY. Zazwyczaj, sonda ma co najmniej 20 nukleotydów długości. Na przykład, sondę odpowiadającą sekwencji 20 ciągłych nukleotydów przedstawionej w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 11 można stosować do identyfikacji identycznego lub podobnego kwasu nukleinowego.
Wynalazek zapewnia również sekwencje wyizolowanego kwasu nukleinowego, które mają co najmniej 12 zasad długości (np. co najmniej około 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 100, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000 lub 5000 zasad długości) i hybrydyzują, w warunkach hybrydyzacji, z sensowną lub antysensowną nicią kwasu nukleinowego, posiadającego sekwencję przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 11. Warunki hybrydyzacji mogą być warunkami o umiarkowanej do wysokiej surowości.
Dla celów tego wynalazku, umiarkowanie surowe warunki hybrydyzacji oznaczają, że hybrydyzację przeprowadza się w temperaturze około 42°C w roztworze hybrydyzacyjnym, zawierającym 25 mM KPO4 (pH 7,4), 5X SSC, 5X roztwór Denharta, 50 μg/ml zdenaturowanego, sonifikowanego DNA nasienia łososia, 50% formamid, 10% siarczan dekstranu i 1-15 ng/ml sondy (około 5x107 cpm/ig), podczas gdy przemywania przeprowadza się w temperaturze około 50°C, stosując roztwór do przemywania zawierający 2X SSC i 0,1% sodowy siarczan dodecylu.
Warunki hybrydyzacji o wysokiej surowości oznaczają, że hybrydyzację przeprowadza się w temperaturze około 42°C w roztworze hybrydyzacyjnym, zawierającym 25 mM KPO4 (pH 7,4), 5X SSC, 5X roztwór Denharta, 50 μg/ml zdenaturowanego, sonifikowanego DNA nasienia łososia, 50% formamid, 10% siarczan dekstranu oraz 1-15 ng/ml sondy (około 5x107 cpm^g), podczas gdy przemywania przeprowadza się w temperaturze około 65°C, stosując roztwór do przemywania zawierający 0,2X SSC i 0,1% sodowy siarczan dodecylu.
Wyizolowany: Termin wyizolowany, jak stosuje się w opisie w odniesieniu do kwasu nukleinowego, dotyczy naturalnie występującego kwasu nukleinowego, który nie jest bezpośrednio ciągły z obiema sekwencjami, z którymi jest bezpośrednio ciągły (jednej po stronie końca 5' i jednej po stronie końca 3') w naturalnie występującym genomie organizmu, z którego pochodzi. Na przykład, wyizolowany kwas nukleinowy może być, bez ograniczeń, cząsteczką rekombinowanego DNA dowolnej długości, z zastrzeżeniem, że jedną z sekwencji kwasu nukleinowego zazwyczaj stwierdzaną jako bezpośrednio flankującą rekombinowaną cząsteczkę DNA w naturalnie występującym genomie usuwa się lub jest ona nieobecna. A zatem, wyizolowany kwas nukleinowy obejmuje, bez ograniczeń, rekombinowany DNA, która istnieje jako odrębna cząsteczka (np. cDNA lub fragment genomowego DNA wytworzone przez PCR lub działanie endonukleazami restrykcyjnymi), niezależnie od innych sekwencji, jak również jako rekombinowany DNA, który włączono do wektora, plazmidu ulegającego autonomicznej replikacji, wirusa (np. retrowirusa, adenowirusa lub herpeswirusa) lub do genomowego DNA prokariota bądź eukariota. Ponadto, wyizolowany kwas nukleinowy może obejmować cząsteczkę rekombinowanego DNA, która jest częścią hybrydowej lub fuzyjnej cząsteczki kwasu nukleinowego.
Termin wyizolowany, jak stosuje się w opisie w odniesieniu do kwasu nukleinowego, dotyczy również dowolnego nie występującego naturalnie kwasu nukleinowego, ponieważ nie występujących naturalnie sekwencji kwasu nukleinowego nie znajduje się w naturze i nie posiadają one bezpośrednich ciągłych sekwencji w naturalnie występującym genomie. Na przykład, niewystępujący naturalnie kwas nukleinowy, taki jak kwas nukleinowy otrzymany technikami inżynierii uważa się za wyizolowany kwas nukleinowy. Otrzymany technikami inżynierii kwas nukleinowy można przygotowywać wykorzystując zwykłe techniki klonowania molekularnego lub techniki chemicznej syntezy kwasu nukleinowego. Wyizolowany nie występujący naturalnie kwas nukleinowy może być niezależny od innych se10
PL 208 998 B1 kwencji, lub włączony do wektora, plazmidu ulegającego autonomicznej replikacji, wirusa (np. retrowirusa, adenowirusa lub herpeswirusa) lub do genomowego DNA prokariota bądź eukariota. Ponadto, wyizolowany kwas nukleinowy może obejmować cząsteczkę rekombinowanego DNA, która jest częścią hybrydowej lub fuzyjnej cząsteczki kwasu nukleinowego.
Dla specjalistów w tej dziedzinie będzie oczywiste, że kwasu nukleinowego występującego wśród setek do milionów innych cząsteczek kwasu nukleinowego w obrębie, na przykład, bibliotek cDNA lub genomowych, bądź żeli zawierających produkty trawienia restrykcyjnego genomowego DNA, nie uważa się za wyizolowany kwas nukleinowy.
Kwas nukleinowy: Termin kwas nukleinowy, jak stosuje się w opisie, obejmuje obydwa kwasy nukleinowe RNA i DNA obejmujące, bez ograniczeń, cDNA, genomowy DNA oraz syntetyczny (np. zsyntetyzowany chemicznie) DNA. Kwas nukleinowy może być dwuniciowy lub jednoniciowy. Jeśli jest jednoniciowy, to kwas nukleinowy może być nicią sensowną lub nicią antysensowną. Ponadto, kwas nukleinowy może być kołowy lub liniowy.
Połączony w sposób umożliwiający działanie: Pierwsza sekwencja kwasu nukleinowego jest połączona w sposób umożliwiający działanie z drugą sekwencją kwasu nukleinowego jeśli pierwsza sekwencja kwasu nukleinowego jest umieszczona w funkcjonalnej relacji w stosunku do drugiej cząsteczki kwasu nukleinowego. Na przykład, promotor jest połączony w sposób umożliwiający działanie z sekwencją kodują c ą , jeś li promotor wpł ywa na transkrypcję sekwencji kodują cej. Ogólnie rzecz biorąc, sekwencje DNA połączone w sposób umożliwiający działanie są ciągłe i, jeśli jest to konieczne dla połączenia dwóch regionów kodujących polipeptyd, w tej samej ramce odczytu.
Modyfikacje peptydów: wynalazek obejmuje enzymy, jak również ich syntetyczne rozwiązania. Ponadto, w metodach opisanych w opisie można wykorzystywać analogi (niepeptydowe cząsteczki organiczne), pochodne (chemicznie modyfikowane funkcjonalnie cząsteczki peptydowe otrzymane wyjściowo z przedstawionych sekwencji peptydowych) oraz warianty (homologi) wykazujące pożądaną aktywność enzymatyczną. Peptydy przedstawione w opisie, obejmują sekwencje aminokwasów, które mogą być zarówno L- i/lub D-aminokwasami, naturalnie występującymi i innymi.
Peptydy można modyfikować, stosując szereg technik chemicznych, dla wytwarzania pochodnych wykazujących zasadniczą taką samą aktywność jak peptydy niemodyfikowane i, ewentualnie, posiadających inne pożądane właściwości. Na przykład, grupy kwasu karboksylowego białka, niezależnie czy końca karboksylowego czy łańcucha bocznego, można dostarczać w postaci soli farmaceutycznie dopuszczalnego kationu lub zestryfikowane, tak aby tworzyły ester C1-C16, lub przekształcone do amidu o wzorze NR1R2, gdzie R1 i R2 są każdy niezależnie atomem H lub grupą C1-C16 alkilową, albo połączone tak, aby tworzyły pierścień heterocykliczny, taki jak 5- lub 6-członowy pierścień. Grupy aminowe peptydu, niezależnie czy końca aminowego czy łańcucha bocznego, mogą być w postaci farmaceutycznie dopuszczalnych soli addycyjnych z kwasami, takimi jak HCl, HBr, kwas octowy, benzoesowy, toluenosulfonowy, maleinowego, winowego i innych soli organicznych lub można je zmodyfikować do grup C1-C16 alkilo- lub dialkiloaminowych, bądź dalej przekształcać do amidu.
Grupy hydroksylowe łańcuchów bocznych peptydów można przekształcać w grupy C1-C16 alkoksylowe lub C1-C16 estrowe stosując dobrze znane techniki. Pierścienie fenylowe i fenolowe łańcuchów bocznych peptydów można podstawiać jednym lub więcej atomami chlorowca, takimi jak atomy F, Cl, Br lub I, lub grupami C1-C16 alkilową, C1-C16 alkoksylową, kwasami karboksylowymi i ich estrami, bądź amidami takich kwasów karboksylowych. Grupy metylenowe łańcuchów bocznych peptydów można wydłużać do homologicznych grup C2-C4 alkilenowych. Tiole można blokować stosując dowolną spośród dobrze znanych grup blokujących, takich jak grupy acetamidowe. Specjaliści w tej dziedzinie będą również znać metody wprowadzania cyklicznych struktur do peptydów według tego wynalazku w celu selekcjonowania i zapewnienia wymuszonej struktury przestrzennej, która spowoduje wzmocnienie stabilności. Na przykład, do peptydu można dodać C- lub N-końcową cysteinę tak, że jeśli się przeprowadza utlenianie peptyd będzie zawierać wiązanie disiarczkowe, tworząc peptyd cykliczny. Inne metody cyklizacji peptydów obejmują tworzenie tioeterów oraz karboksylo- i aminokońcowych amidów oraz estrów.
W zakres wynalazku wchodzą również rozwią zania obejmują ce peptydomimetyki i organomimetyki, w których trójwymiarowe uporządkowanie chemicznych składowych takich peptydo- i organomimetyków naśladuje trójwymiarowe uporządkowanie szkieletu peptydowego i skład aminokwasowych łańcuchów bocznych, w wyniku czego dla takich peptydo- i organomimetyków białek według tego wynalazku stwierdza się wykrywalną aktywność enzymatyczną. Dla zastosowań modelowania komputerowego, farmakofora jest idealizowaną, trójwymiarową definicją wymagań strukturalnych dla aktywnoPL 208 998 B1 ści biologicznej. Peptydo- i organomimetyki można projektować tak, aby dopasować każdą farmakoforę za pomocą aktualnego oprogramowania modelowania komputerowego (stosując komputerowo wspomagane projektowanie leków czyli CADD), Walters, „Computer-Assisted Modeling of Drugs, in Klegerman i Groves (red.), Pharmaceutical Biotechnology, 1993, Interpharm Press: Buffalo Grove, IL, str. 165-74 i Ch. 102 in Munson (red.), Principles of Pharmacology, 1995, Chapman i Hall, dla zapoznania się z opisami technik stosowanych w CADD. W zakres wynalazku wchodzą również mimetyki przygotowywane z zastosowaniem takich technik. W jednym z przykładów, mimetyki naśladują aktywność enzymatyczną enzymu lub jego warianta, fragmentu bądź fuzji.
Sondy i startery: Kwasy nukleinowe sond i starterów można z łatwością przygotowywać w oparciu o sekwencje aminokwasowe i kwasów nukleinowych przedstawione w opisie. Sonda obejmuje wyizolowany kwas nukleinowy zawierający wykrywalny znacznik lub cząsteczkę reporterową. Przykładowe znaczniki obejmują, ale nie ograniczają się do, izotopów radiaktywnych, ligandów, czynników chemiluminescencyjnych i polipeptydów. Metody znakowania i kierowania wyborem znaczników odpowiednich dla różnych celów omawia się, na przykład, w Sambrook i in. (red.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual wydanie 2, tom. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 oraz Ausubel i in. (red.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (z cyklicznymi aktualizacjami), 1987.
Startery są zazwyczaj cząsteczkami kwasu nukleinowego posiadającymi dziesięć lub więcej nukleotydów (np. cząsteczki kwasu nukleinowego posiadające pomiędzy 10 a 100 nukleotydów). Starter można przyłączać do komplementarnej nici docelowego kwasu nukleinowego przez hybrydyzację z utworzeniem hybrydy pomiędzy starterem a nicią docelowego kwasu nukleinowego a następnie wydłużać wzdłuż nici docelowego kwasu nukleinowego przez, na przykład, polimerazę DNA polipeptydu. Pary starterów można stosować do amplifikacji sekwencji kwasu nukleinowego, na przykład, przez łańcuchową reakcję polimerazy (PCR) lub inne znane w nauce metody amplifikacji kwasów nukleinowych.
Sposoby przygotowywania i stosowania sond i starterów opisuje się, na przykład, w takich pozycjach literaturowych jak Sambrook i in. (red.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd.2, tom 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Ausubel i in. (red.), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (z cyklicznymi aktualizacjami), 1987 oraz Innis i in. (red.), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990. Pary starterów do PCR mogą pochodzić ze znanej sekwencji, na przykład, dzięki zastosowaniu programów komputerowych przeznaczonych do tego celu, takich jak Primer (wersja 0.5, © 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, Mass.).
Dla specjalistów w tej dziedzinie będzie oczywiste, że specyficzność określonej sondy lub startera wzrasta wraz z długością, ale wielkość sondy lub startera może pozostawać w zakresie od sekwencji o pełnej długości do sekwencji tak krótkich, jak pięć kolejnych nukleotydów. A zatem, na przykład, starter o długości 20 kolejnych nukleotydów można przyłączać do celu z wyższą specyficznością niż odpowiadający starter o długości jedynie 15 nukleotydów. A zatem, w celu uzyskania wyższej specyficzności, sondy i startery można wybierać tak, że zawierają, na przykład, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 2000, 2050, 2100, 2150, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2600, 2650, 2700, 2750, 2800, 2850, 2900, 3000, 3050, 3100, 3150, 3200, 3250, 3300, 3350, 3400, 3450, 3500, 3550, 3600, 3650, 3700, 3750, 3800, 3850, 3900, 4000, 4050, 4100, 4150, 4200, 4250, 4300, 4350, 4400, 4450, 4500, 4550, 4600, 4650, 4700, 4750, 4800, 4850, 4900, 5000, 5050, 5100, 5150, 5200, 5250, 5300, 5350, 5400, 5450, lub więcej kolejnych nukleotydów.
Promotor: Szereg sekwencji kontrolnych kwasu nukleinowego, które kierują transkrypcją kwasu nukleinowego. Promotor obejmuje konieczne sekwencje kwasu nukleinowego w pobliżu miejsca startu transkrypcji, takie jak w przypadku promotora polimerazy typu II, element TATA. Promotor może zawierać dystalne elementy wzmacniające lub represorowe, które mogą być położone tak daleko jak kilka tysięcy par zasad od miejsca startu transkrypcji.
Oczyszczony: Termin oczyszczony, jak stosuje się w opisie, nie wymaga absolutnej czystości a raczej, w zamierzeniu, jest terminem względnym. A zatem, na przyk ł ad, oczyszczonym preparatem polipeptydu lub kwasu nukleinowego może być preparat, w którym polipeptyd lub kwas nukleinowy, odpowiednio, jest w wyższym stężeniu niż byłby polipeptyd lub kwas nukleinowy w swoim naturalnym
PL 208 998 B1 środowisku, w obrębie organizmu. Na przykład, preparat polipeptydu można uważać za oczyszczony jeśli zawartość polipeptydu w preparacie stanowi co najmniej 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 98% lub 99% całkowitej zawartości białka preparatu.
Rekombinowany: Rekombinowany kwas nukleinowy jest kwasem nukleinowym posiadającym (1) sekwencję, która nie występuje naturalnie w organizmie, w którym ulega ona ekspresji lub (2) sekwencję wykonaną przez sztuczne połączenie dwóch inaczej rozdzielonych, krótszych sekwencji. To sztuczne połączenie często przeprowadza się przez syntezę chemiczną lub, częściej, przez sztuczną manipulację wyizolowanymi odcinkami kwasów nukleinowych, np. technikami inżynierii genetycznej. Rekombinowany stosuje się również do opisania cząsteczek kwasu nukleinowego, które poddawano sztucznym manipulacjom, ale zawierają te same sekwencje regulatorowe i regiony kodujące, które znajduje się w organizmie, z którego wyizolowano kwas nukleinowy.
Identyczność sekwencji: Podobieństwo pomiędzy sekwencjami aminokwasowymi wyraża się terminem podobieństwo pomiędzy sekwencjami, inaczej określanym jako identyczność sekwencji. Identyczność sekwencji często mierzy się jako procent identyczności (lub podobieństwa lub homologii), im wyższy jest procent, tym większe podobieństwo dwóch sekwencji. Homologi lub warianty peptydu, takiego jak sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 12, wykazują stosunkowo wysoki stopień identyczności sekwencji kiedy przyporządkowuje się je stosując standardowe metody.
Metody przyporządkowywania sekwencji dla ich porównania są dobrze znane w nauce. Różne programy i algorytmy przyporządkowywania opisano w: Smith i Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981; Needleman i Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-53, 1970; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444-8, 1988; Higgins i Sharp, Gene 73: 237-44, 1988; Higgins i Sharp, CABIOS 5: 151-3, 1989; Corpet i in., Nucleic Acids Research 16: 10881-90, 1988 oraz Altschul i in., Nature Genet. 6: 119-29, 1994.
The NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST™) (Altschul i in., J. Mol. Biol. 215: 403-10, 1990) dostępny jest z kilku źródeł, włącznie z National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD) i przez internet, do stosowania w połączeniu z programami do analiz sekwencji blastp, blastn, blastx, tblastn oraz tblastx.
Warianty peptydu zazwyczaj charakteryzują się posiadaniem co najmniej 50% identyczności sekwencji obliczanej na podstawie przyrównania na całej długości sekwencji aminokwasowej z wykorzystaniem NCBI Blast 2.0, gapped blastp z wybranymi parametrami domyś lnymi. Do przyrównywania sekwencji aminokwasowych większych niż około 30 aminokwasów wykorzystuje się funkcję sekwencji Blast 2 z domyślną macierzą BLOSUM62 i wybranymi parametrami domyślnymi (koszt otwarcia luki 11, i koszt powiększenia luki o każdą resztę 1). Do przyrównywania krótkich peptydów (krótszych niż około 30 aminokwasów) wykorzystuje się funkcję sekwencji Blast 2 z użyciem macierzy PAM30 z domyślnym ustawieniem parametrów (kary za otwarcie luki 9, za wydłużenie luki 1). Białka o jeszcze większym podobieństwie do sekwencji referencyjnej, analizowane tą metodą, będą wykazywać wzrastający procent identyczności, tak jak co najmniej 80%, co najmniej 90%, co najmniej 95%, co najmniej 98% lub nawet co najmniej 99% identyczności sekwencji. Gdy porównuje się odcinki mniejsze od pełnej sekwencji w kierunku identyczności sekwencji, homologi i warianty będą zazwyczaj wykazywać co najmniej 80% identyczności sekwencji na obszarze krótkich okien przeszukiwania o dł ugoś ci 10-20 aminokwasów i mogą wykazywać identyczność sekwencji co najmniej 85%, co najmniej 90%, co najmniej 95% lub 98% w zależności od ich podobieństwa do sekwencji referencyjnej. Metody ustalenia identyczności sekwencji, w takich krótkich oknach są opisane na stronie internetowej utrzymywanej przez NCBI w Bethesda, Maryland. Specjalista w tej dziedzinie zrozumie, że te zakresy identyczności sekwencji są podane jedynie jako wskazówki, jest całkiem możliwe, że można odnaleźć znaczące homologi nie spełniające tych kryteriów.
Do ustalenia procentowej identyczności sekwencji kwasu nukleinowego można użyć podobnych metod. W szczególnych przykładach przyrównuje się sekwencję homologiczną i wyjściową i ustala liczbę dopasowań licząc liczbę pozycji, w których w obu sekwencjach występuje identyczny nukleotyd lub reszta aminokwasowa. Procent identyczności sekwencji ustala się dzieląc liczbę dopasowań albo przez długość danej sekwencji w sekwencji zidentyfikowanej (np. sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 11), albo przez określoną długość (np. 100 kolejnych nukleotydów lub reszt aminokwasowych z danej sekwencji w sekwencji zidentyfikowanej) a następnie mnożąc wynik przez 100. Na przykład sekwencja nukleotydowa, która wykazuje 1166 dopasowań po przyrównaniu do sekwencji przedstawionej jako sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 11 jest w 75,0% identyczna z sekwencją przedstawioną jako sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 11 (tj. 1166:1554*100=75,0). Należy zauważyć,
PL 208 998 B1 że procentową identyczność sekwencji zaokrągla się do pierwszej pozycji po przecinku. Na przykład 75,11, 75,12, 75,13 i 75,14 zaokrągla się do 75,1, podczas gdy 75,15, 75,16, 75,17, 75,18 i 75,19 zaokrągla się do 75,2. Należy też zauważyć, że długość to zawsze liczba całkowita. W innym przykładzie, sekwencja docelowa zawierająca 20-nukleotydowy region, który daje się nałożyć na 20 kolejnych nukleotydów z sekwencji zidentyfikowanej, tak jak podano poniżej, zawiera region o 75-procentowej identyczności z tą zidentyfikowaną sekwencją (tj. 15:20*100=75).
20
Sekwencja docelowa: AGGTCGTGTACTGTCAGTCA
Sekwencja zidentyfikowana: ACGTGGTGAACTGCCAGTGA
Specyficznie wiążący czynnik: Czynnik, który jest zdolny do specyficznego wiązania z dowolnym polipeptydem opisanym w wynalazku. Przykłady obejmują, ale nie ograniczają się do przeciwciał poliklonalnych, przeciwciał monoklonalnych (włącznie z humanizowanymi przeciwciałami monoklonalnymi), i fragmentów przeciwciał monoklonalnych, takich jak Fab, F(ab')2, oraz fragmenty Fv, jak również inny czynnik zdolny do specyficznego wiązania z epitopem takich polipeptydów.
Przeciwciała skierowane przeciw polipeptydom dostarczonym w opisie (lub fragmentom, wariantom bądź ich fuzjom) można stosować do oczyszczania lub identyfikowania takich polipeptydów. Sekwencje aminokwasowe i kwasów nukleinowych umożliwiają wytwarzanie specyficznych opartych na przeciwciałach czynników wiążących, które rozpoznają opisane polipeptydy.
Można wytwarzać przeciwciała monoklonalne lub poliklonalne skierowane przeciw polipeptydom, częściom polipeptydów lub ich wariantom. Optymalnie, przeciwciała skierowane przeciw jednemu lub więcej epitopów antygenu polipeptydowego będą specyficznie wykrywać taki polipeptyd. To jest, przeciwciała skierowane przeciw określonemu polipeptydowi będą rozpoznawać i wiązać się z tym określonym polipeptydem i zasadniczo nie będą rozpoznawać i wiązać się z innymi polipeptydami. Oznaczenia, czy przeciwciało specyficznie wiąże się z określonym polipeptydem wykonuje się jedną z wielu standardowych metod oznaczeń immunologicznych, na przykład, blotting Western (Sambrook i in.(red.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wydanie 2, tom 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).
W celu określenia czy dany preparat przeciwciała (taki jak preparat wytworzony w myszy skierowany przeciw polipeptydowi posiadającemu sekwencję aminokwasową przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 12) specyficznie wykrywa właściwy polipeptyd (np. polipeptyd posiadający sekwencję aminokwasową przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 12) metodą blottingu Western, z komórek ekstrahuje się całkowite białko komórkowe i rozdziela przez elektoforezę w żelu poliakryloamidowym z SDS.
Rozdzielone całkowite białko komórkowe przenosi się następnie na membranę (np. nitrocelulozową), i preparat przeciwciała inkubuje się z membraną. Po przemywaniu membrany w celu usunięcia niespecyficznie związanych przeciwciał, można wykrywać obecność specyficznie związanych przeciwciał stosując odpowiednie drugie przeciwciało (np. przeciwciało skierowane przeciw przeciwciałom myszy) skoniugowane z polipeptydem, takim jak fosfataza zasadowa, ponieważ zastosowanie fosforanu 5-bromo-4-chloro-3-indolilu /błękitu nitrotetrazoliowego powoduje powstawanie gęstego związku o barwie niebieskiej w miejscach zlokalizowanych przez kompleks przeciwciało-fosfataza zasadowa.
Zasadniczo czyste polipeptydy odpowiednie do stosowania jako immunogeny można otrzymywać ze stransfekowanych komórek, stransformowanych komórek lub komórek typu dzikiego. Stężenia polipeptydów w ostatecznym preparacie można doprowadzać, na przykład, przez zatężanie na urządzeniu filtrującym Amicon, do poziomu kilku mikrogramów na mililitr. Ponadto, jako immunogeny można wykorzystywać polipeptydy w zakresie wielkości, od polipeptydów pełnej długości do polipeptydów posiadających tak mało, jak dziewięć reszt aminokwasowych. Takie polipeptydy można wytwarzać w hodowlach komórkowych, można syntetyzować chemicznie stosując standardowe metody lub można otrzymywać przez rozszczepianie dużych polipeptydów do mniejszych polipeptydów, które można oczyszczać. Polipeptydy o długości tak małej jak dziewięć aminokwasów mogą być immunogenne kiedy prezentowane są układowi immunologicznemu w kontekście cząsteczki głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC), takiej jak cząsteczka MHC klasy I lub MHC klasy II. Zgodnie z tym, poli14
PL 208 998 B1 peptydy posiadające co najmniej 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 900, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350 lub więcej kolejnych reszt aminokwasowych dowolnej sekwencji aminokwasowej przedstawionej w opisie można stosować jako immunogeny do wytwarzania przeciwciał.
Przeciwciała monoklonalne skierowane przeciw dowolnemu polipeptydowi przedstawionemu w opisie można wytwarzać stosując mysie hybrydomy zgodnie z klasyczną metodą Kohlera i Milsteina (Nature 256: 495-7, 1975) lub metodami pochodnymi.
Poliklonalne surowice odpornościowe, zawierające przeciwciała skierowane przeciw heterogennym epitopom dowolnego przedstawionego w opisie polipeptydu, można przygotowywać immunizując odpowiednie zwierzęta polipeptydem (lub jego fragmentem), który może być niezmodyfikowany lub zmodyfikowany dla wzmocnienia immunogenności. Efektywny protokół immunizacji królików można znaleźć w Vaitukaitis i in. (J. Clin. Endocrinol. Metab. 33: 988-91,1971).
Zamiast pełnych przeciwciał można stosować fragmenty przeciwciał i można łatwo przeprowadzać ich ekspresję w prokariotycznych komórkach gospodarza. Metody przygotowywania i stosowania immunologicznie efektywnych części przeciwciał monoklonalnych, określanych również jako: fragmenty przeciwciał są dobrze znane i obejmują metody opisane w Better i Horowitz (Methods Enzymol. 178: 476-96, 1989), Glockshuber i in. (Biochemistry 29: 1362-7, 1990), US 5 648 237 (Expression of Functional Antibody Fragments), US 4 946 778 (Single Polypeptide Chain Binding Molecules), US 5 455 030 (Immunotherapy Using Single Chain Polypeptide Binding Molecules) oraz cytowane w nich pozycje literaturowe.
Stransformowana: Stransformowana komórka jest komórką, do której wprowadzono cząsteczkę kwasu nukleinowego, na przykład, technikami biologii molekularnej. Transformacja obejmuje wszystkie techniki, którymi można wprowadzać cząsteczkę kwasu nukleinowego do takiej komórki, obejmując, bez ograniczeń, transfekcję wektorem wirusowym, koniugację, transformację wektorem plazmidowym oraz wprowadzanie nagiego DNA przez elektroporację, lipofekcję i wstrzykiwanie cząstek.
Warianty, fragmenty lub białka fuzyjne: przedstawione białka, obejmują ich warianty, fragmenty i fuzje. Sekwencje DNA (na przykład sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 11), która koduje białko (na przykład sekwencję o numerze identyfikacyjnym: 12), białko fuzyjne lub fragment bądź wariant białka, można poddawać zabiegom inżynierii genetycznej dla umożliwienia ekspresji białka w komórkach eukariotycznych, bakteryjnych, owadzich i/lub roślinnych. W celu uzyskania ekspresji, sekwencję DNA można zmieniać i łączyć w sposób umożliwiający działanie z innymi sekwencjami regulatorowymi. Ostateczny produkt, który zawiera sekwencje regulatorowe i białka, określa się jako wektor. Wektor ten można wprowadzać do komórek eukariotycznych, bakteryjnych, owadzich i/lub roślinnych. Po wprowadzeniu do komórki wektor umożliwia wytwarzanie białka.
Białko fuzyjne obejmuje białko, takie jak aminotransferaza tryptofanowa (lub jej wariant, postać polimorficzną, mutanta lub fragment), na przykład, sekwencję o numerze identyfikacyjnym: 12, połączoną z inną sekwencją aminokwasową, która nie hamuje pożądanej aktywności białka, na przykład zdolności do przekształcania tryptofanu w indolo-3-pirogronian. W jednym przykładzie, inne sekwencje aminokwasowe mają długość nie większą niż około 10, 12, 15, 20, 25, 30, lub 50 aminokwasów.
Dla specjalisty w tej dziedzinie będzie oczywiste, że sekwencję DNA można zmieniać na szereg sposobów bez wpływu na aktywność biologiczną kodowanego białka. Na przykład, dla tworzenia wariacji w sekwencji DNA, która koduje białko, można stosować PCR. Takie warianty mogą być wariantami optymalizowanymi pod względem preferencji kodonów w komórce gospodarza wykorzystywanej do ekspresji białka lub z innymi zmianami sekwencji, które ułatwiają ekspresję.
Wektor: Cząsteczka kwasu nukleinowego wprowadzana do komórki, dzięki której powstaje stransformowana komórka. Wektor może obejmować sekwencje kwasu nukleinowego, które umożliwiają jego replikację w komórce, takie jak miejsce początku replikacji. Wektor może również obejmować jeden lub więcej genów markerów selekcyjnych i innych elementów genetycznych znanych w nauce.
Przegląd szlaków biosyntetycznych
Jak pokazano na Fig. 1-3 oraz 11-13, do wytwarzania monatyny lub jej półproduktów, takich jak indolo-3-pirogronian lub MP, można stosować wiele szlaków biosyntetycznych. Do przekształcania każdego z substratów (glukozy, tryptofanu, kwasu indolo-3-mlekowego, indolo-3-piro-gronianu i MP) w każdy produkt (tryptofan, indolo-3-pirogronian, MP i monatynę) można stosować kilka różnych polipeptydów. Ponadto, reakcje te można przeprowadzać in vivo, in vitro, lub poprzez kombinację reakcji
PL 208 998 B1 in vivo oraz reakcji in vitro, tak jak reakcji in vitro, które obejmują nieenzymatyczne reakcje chemiczne. Dlatego też, Fig. 1-3 oraz 11-13 są przykładowe i pokazują wiele różnych szlaków, które można stosować do otrzymywania pożądanych produktów.
Glukoza do tryptofanu
Wiele organizmów może syntetyzować tryptofan z glukozy. Konstrukt(y) zawierający(ce) taki(e) gen(y) konieczny(ne) do wytwarzania monatyny, MP i/lub indolo-3-pirogronianu z glukozy i/lub tryptofanu można klonować w takich organizmach. W opisie pokazano, że tryptofam można przekształcać w monatynę.
W innych przykładach, organizm poddaje się zabiegom inżynierii z wykorzystaniem znanych polipeptydów w celu wytwarzania tryptofanu lub nadprodukcji tryptofanu. Na przykład, opis patentowy US 4 371 614 (włączony jako odnośnik literaturowy) opisuje szczep E. coli stransformowany plazmidem zawierającym operon tryptofanowy typu dzikiego.
Maksymalne miana tryptofanu, ujawnione w US 4 371 614, wynoszą około 230 ppm. Podobnie, WO 87/01130 opisuje szczep E. coli, który poddano zabiegom inżynierii genetycznej w celu wytwarzania tryptofanu i omawia podwyższone fermentacyjne wytwarzanie L-tryptofanu. Specjaliści w tej dziedzinie będą wiedzieć, że organizmy zdolne do wytwarzania tryptofanu z glukozy są również zdolne do wykorzystywania innych źródeł węgla i energii, które mogą być przekształcane w glukozę lub fruktozo-6-fosforan, z podobnymi rezultatami. Przykładowe źródła węgla i energii obejmują sacharozę, fruktozę, skrobię, celulozę lub glicerol.
Tryptofan do indolo-3-pirogronianu
Kilka polipeptydów można stosować do przekształcania tryptofanu do indolo-3-pirogronainu. Przykładowe polipeptydy obejmują przedstawicieli klas enzymów (EC) 2.6.1.27, 1.4.1.19, 1.4.99.1, 2.6.1.28, 1.4.3.2, 1.4.3.3, 2.6.1.5, 2.6.1.-, 2.6.1.1 i 2.6.1.21.
Klasy te obejmują polipeptydy nazywane aminotransferazą tryptofanową (również określane aminotransferazą L-fenyloalanino-2-oksoglutaranową, transaminazą tryptofanową, transaminazą 5-hydroksytryptofanowo-ketoglutarową, aminotransferazą hydroksytryptofanową, aminotransferazą L-tryptofanową, transaminazą L-tryptofanową oraz aminotransferazą L-tryptofan:2-okso-glutaran), która przekształca L-tryptofan i 2-oksoglutaran w indolo-3-pirogronian i L-glutaminian; aminotransferazą D-tryptofanową, która przekształca D-tryptofan i kwas 2-okso w indolo-3-pirogronian i aminokwas; dehydrogenazą tryptofanową (również nazywaną dehydrogenazą NAD(P)-L-tryptofanową, dehydrogenazą L-tryptofanową, L-Trp-dehydrogenazą, TDH oraz oksydoreduktazą L-tryptophan:NAD(P) (deaminującą)), która przekształca L-tryptofan i NAD(P) w indolo-3-pirogronian i NH3 oraz NAD(P)H; dehydrogenazą D-aminokwasową, która przekształca D-amino- kwasy i FAD w indolo-3-pirogronian i NH3 oraz FADH2; transaminazą tryptofano-fenylopirogronianową (nazywaną również aminotransferazą L-tryptofano-a-ketoizokapronianową i aminotransferazą L-tryptofan:fenylopirogronian), która przekształca L-tryptofan i fenylopirogronian w indolo-3-pirogronian i L-fenyloalaninę; oksydazą L-aminokwasową (określaną również oksydazą opio-aminokwasową i oksydoreduktazą L-aminokwas: tlen (deaminującą)), która przekształca L-aminokwas i H2O oraz O2 w kwas 2-okso oraz NH3 i H2O2; oksydazą D-aminokwasową (również określaną oksydazą opio-aminokwasową i oksydoreduktazą Daminokwas: tlen (deaminującą)), która przekształca D-aminokwas oraz H2O i O2 w kwas 2-okso oraz NH3 i H2O2; i oksydazą tryptofanową, która przekształca L-tryptofan oraz H2O i O2 w indolo-3-pirogronian oraz NH3 i H2O2. Klasy te zawierają również aminotransferazę tyrozynową (aromatyczną), aminotransferazę asparaginianową, aminotransferazę D-aminokwasową (lub D-alaninową), oraz szeroką (wielosubstratową) aminotransferazę, która posiada aktywności wielu aminotransferaz, z których niektóre mogą przekształacać tryptofan i kwas 2-okso w indolo-3-pirogronian i aminokwas.
Poniżej w Przykładzie 1 opisano 11 przedstawicieli klasy aminotransferaz, którzy wykazują taką aktywność, włącznie z nową aminotransferazą przedstawioną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 11 i 12. A zatem, wynalazek ujawnia wyizolowany kwas nukleinowy i sekwencje białkowe wykazujące co najmniej 80%, co najmniej 85%, co najmniej 90%, co najmniej 95%, co najmniej 98%, lub nawet co najmniej 99% identyczności sekwencji z sekwencjami o numerach identyfikacyjnych 11 i 12. Wynalazek ten obejmuje również fragmenty i fuzje sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 11 i 12, które zachowują aktywność aminotransferazy lub kodują białko wykazujące aktywność aminotransferazy. Przykładowe fragmenty obejmują co najmniej 10, 12, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500 lub 1000 ciągłych nukleotydów sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 11 lub co najmniej 6, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300 or 350 ciągłych aminokwasów sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 12. Przedstawione sekwencje (oraz ich warianty, fragmenty i fuzje) mogą być częścią wektora. Wektor
PL 208 998 B1 można stosować do transformacji komórek gospodarza wytwarzając zrekombinowane komórki, które mogą produkować indolo-3-pirogronian z tryptofanu, i w pewnych przykładach mogą również produkować MP i/lub monatynę.
Oksydazy L-aminokwasowe (1.4.3.2) są znane i sekwencje można wyizolować z kilku różnych źródeł, takich jak Vipera lebetine (sp P81375), Ophiophagus hannah (sp P81383), Agkistrodon rhodostoma (spP81382), Crotalus atrox (sp P56742), Burkholderia cepacia, Arabidopsis thaliana, Caulobacter cresentus, Chlamydomonas reinhardtii, Mus musculus, Pseudomonas syringae oraz Rhodococcus str. Ponadto, w literaturze opisane są oksydazy tryptofanowe i można je izolować, na przykład, z Coprinus sp. SF-1, kapusty chińskiej z kiłą kapuścianą, Arabidopsis thaliana oraz wątroby ssaków. Jednego z przedstawicieli oksydaz L-aminokwasowych, które mogą przekształcać tryptofan w indolo-3-pirogronian, omówiono poniżej w Przykładzie 3, jak również alternatywne źródła dla klonowania molekularnego. Wiele genów oksydaz D-aminokwasowych dostępnych jest dla klonowania molekularnego w bazach danych.
Dehydrogenazy tryptofanowe są znane i można je izolować, na przykład, ze szpinaku, Pisum sativum, Prosopis juliflora, grochu, jadłoszynu baziowatego, pszenicy, kukurydzy, pomidora, tytoniu, Chromobacterium violaceum oraz Lactobacilli. Znane są sekwencje genowe wielu dehydrogenaz D-aminokwasowych.
Jak przedstawiono na Fig.11-13, jeśli oksydazę aminokwasową, taką jak oksydaza tryptofanowa, stosuje się do przekształcania tryptofanu w indolo-3-pirogronian, można dodać katalazę w celu zmniejszenia lub nawet wyeliminowania obecności nadtlenku wodoru.
Indolo-3-mleczan do indolo-3-pirogronianu
Reakcja, która przekształca indolo-3-mleczan w indolo-3-pirogronian może być katalizowana przez szereg polipeptydów, takich jak przedstawicieli klas polipeptydów 1.1.1.110, 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3, 1.1.1.222, 1.1.1.237, 1.1.3.- lub 1.1.1.111. Klasa polipeptydów 1.1.1.110 obejmuje dehydrogenazy indolomleczanowe (również nazywane oksydoreduktazami kwasu indolomlekowego: NAD+). Klasy 1.1.1.27, 1.1.1.28 i 1.1.2.3 obejmują dehydrogenazy mleczanowe (nazywane również dehydrogenazami kwasu mlekowego, oksydoreduktazą mleczan:NAD+). Klasa 1.1.1.222 zawiera dehydrogenazę (R)-4-hydroksyfenylomleczanową (nazywaną również D-aro-matyczną dehydrogenazą mleczanową, R-aromatyczną dehydrogenazą mleczanową oraz 2-oksy-doreduktazą R-3-(4-hydroksyfenylo)mleczan:NAD(P)+) i klasa 1.1.1.237 zawiera reduktazę 3-(4-hydroksyfenylopirogronianową) (nazywaną również reduktazą hydroksyfenylopirogronianową i oksydoreduktazą 4-hydroksyfenylomleczan:NAD+). Klasa 1.1.3. zawiera oksydazy mleczanowe, a klasa 1.1.1.111 zawiera dehydrogenazy (3-imidazol-5-ilo)mleczanowe (nazywane również oksydoreduktazą (S)-3-(imidazol-5-ilo)mleczan:NAD(P)+). Jest prawdopodobne, że kilka polipeptydów z tych klas umożliwia wytwarzanie indolo-3-pirogronianu z kwasu indolo-3-mlekowego. Przykłady tego przekształcenia są w Przykładzie 2. Do przekształcania kwasu indolo-3-mlekowego w indolo-3-pirogronian można również stosować reakcje chemiczne. Takie reakcje chemiczne obejmują etap utleniania, który można przeprowadzać stosując kilka metod, na przykład: utlenianie na powietrzu z katalizatorem B2 (China Chemical Reporter, v 13, n 28, p 18 (1), 2002), rozcień czonym nadmanganianem i nadchloranem lub nadtlenkiem wodoru w obecnoś ci metalu katalizatora.
Indolo-3-pirogronian do kwasu 2-hydroksy-2-(indol-3-ilornetylo)-4-ketoglutarowego (MP)
Do przekształcania indolo-3-pirogronianu w MP można stosować kilka znanych polipeptydów. Przykładowe klasy polipeptydów obejmują 4.1.3.-, 4.1.3.16, 4.1.3.17 oraz 4.1.2.-. Te klasy obejmują syntazy/liazy węgiel-węgiel, takie jak aldolazy, które katalizują kondensację dwóch substratów będących kwasami karboksylowymi. Klasa peptydów EC 4.1.3.- to syntazy/liazy, które tworzą wiązania węgiel-węgiel wykorzystując substraty oksokwasowe (takie jak indolo-3-pirogronian) jako elektrofile, podczas gdy EC 4.1.2.- to syntazy/liazy, które tworzą wiązania węgiel-węgiel wykorzystując substraty aldehydowe (takie jak aldehyd benzylowy) jako elektrofile.
Na przykład, polipeptyd opisany w EP 1 045 029 (EC 4.1.3.16, glioksylano-liaza 4-hydroksy-2-oksooglutaranu, nazywana również aldolazą 4-hydroksy-2-oksoglutaranu, aldolazą 2-okso-4-hydroksyglutaranu lub aldolazą KHG) przekształca kwas glioksylowy i pirogronian w kwas 4-hydroksy-2-ketoglutarowy, a polipeptyd aldolaza 4-hydroksy-4-metylo-2-oksoglutaranowa (EC 4.1.3.17, nazywana również pirogroniano-liazą 4-hydroksy-4-metylo-2-oksoglutaranu lub aldolazą ProA), kondensuje dwa ketokwasy, takie jak dwa pirogroniany do 4-hydroksy-4-metylo-2-okso-glutaranu. Reakcje wykorzystujące te liazy opisano w opisie.
PL 208 998 B1
Figury 1-2 i 11-13 przedstawiają schematyczne diagramy tych reakcji, w których węgiel 3 (C3) cząsteczki jest połączony z indolo-3-pirogronianem. Wielu przedstawicieli EC 4.1.2.- i 4.1.3.-, zwłaszcza polipeptydów wykorzystujących PLP, może wykorzystywać cząsteczki C3, które są aminokwasami takimi jak seryna, cysteina i alanina, lub ich pochodnymi. Kondensacje aldolowe katalizowane przez reprezentantów EC 4.1.2.- i 4.1.3.- wymagają jako trójwęglowej cząsteczki tego szlaku pirogronianu lub pochodnej pirogronianu. Jednakże, inne związki mogą służyć jako źródła węgla C3 i być przekształcane w pirogronian. Alanina może być poddawana transaminacji do pirogronianu przez wiele, wykorzystujących PLP transaminaz, obejmujących wiele z wymienionych powyżej. Pirogronian i amoniak można otrzymywać przez reakcje beta-eliminacji (takie jak te katalizowane przez tryptofanazę lub β-tyrozynazę) L-seryny, L-cysteiny oraz pochodnych seryny i cysteiny z odpowiednimi grupami opuszczającymi, takich jak O-metylo-L-seryna, O-benzylo-L-seryna, S-metylocysteina, S-benzylocysteina, S-alkilo-L-cysteina, O-acylo-L-seryna i 3-chloro-L-alanina. Asparaginian może służyć jako źródło pirogronianu w reakcjach beta-liazy, w których pośredniczy PLP, takich jak te katalizowane przez tryptofanazę (EC 4.1.99.1) i/lub β-tyrozynazę (EC 4.1.99.2, nazywaną również tyrozyno-fenolową). Szybkość reakcji beta-liazy można podwyższyć przeprowadzając mutagenezę ukierunkowaną wobec miejsca polipeptydów (4.1.99.1-2), jak opisali Mouratou i in. (J. Biol. Chem 274: 1320-5, 1999) oraz jak opisano w Przykładzie 8. Te modyfikacje umożliwiają polipeptydom akceptację dikarboksylowych substratów aminokwasowych. Mleczan może także służyć jako źródło pirogronianu i jest utleniany do pirogronianu przez dodanie dehydrogenazy mleczanowej i utlenionego kofaktora lub oksydazy mleczanowej lub tlenu. Przykłady takich reakcji opisano poniżej.
Na przykład, jak przedstawiono na Figurach 2 i 11-13, jeśli pirogronian stosuje się jako cząsteczkę C3, to aldolazę ProA można skontaktować z indolo-3-pirogronianem.
MP można również wytwarzać stosując reakcje chemiczne, takie jak kondensacje aldolowe przedstawione w Przykładzie 5.
MP do monatyny Przekształcanie MP do monatyny może katalizować jeden lub więcej z: aminotransferaz tryptofanowych (2.6.1.27), dehydrogenaz tryptofanowych (1.4.1.19), dehydrogenaz Daminokwasowych (1.4.99.1), dehydrogenaz glutaminianowych (1.4.1.2-4), dehydrogenazy fenyloalaninowej (EC 1.4.1.20), transaminaz tryptofan-fenylopirogronian (2.6.1.28) lub bardziej ogólnie przedstawiciele rodziny aminotransferaz (2.6.1.-), tak jak aminotransferaza asparaginianowa (EC 2.6.1.1), aminotransferaza tyrozynowa (aromatyczna) (2.6.1.5), aminotransferaza D-tryptofanowa lub aminotransferaza D-alaninowa (2.6.1.21) (Fig. 2). Poniżej opisano (Przykład 1) 11 przedstawicieli klasy aminotransferaz, włącznie z nowym przedstawicielem klasy przedstawionym w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 11 i 12, a reakcje wykazujące aktywność enzymów aminotransferaz i dehydrogenaz przedwstawiono w Przykładzie 7.
Reakcję tę można również przeprowadzać wykorzystując reakcje chemiczne. Aminowanie ketokwasu (MP) przeprowadza się przez redukcyjne aminowanie z wykorzystywaniem amoniaku i cyjanoborowodorku sodowego.
Figury 11-13 przedstawiają dodatkowe polipeptydy, które można stosować do przekształcania MP w monatynę, jak również do zapewniania wyższych wydajności otrzymywania monatyny z indolo-3-pirogronianu lub tryptofanu. Na przykład, jeśli asparaginian stosuje się jako donor grupy aminowej, aminotransferazę asparaginianową można stosować do przekształcania asparaginianu w szczawiooctan (Fig. 11). Szczawiooctan przekształca się w pirogronian i dwutlenek węgla stosując dekarboksylazę, taką jak dekarboksylaza szczawiooctanowa (Fig. 11). Ponadto, jeśli lizynę stosuje się jako donor grupy aminowej, aminotransferazę epsilon lizynową można stosować do przekształcania lizyny w allizynę (Fig. 12). Allizyna ulega spontanicznemu przekształceniu w 6-karboksylan 1-piperydeinowy (Fig. 12). Jeśli do przekształcania MP w monatynę stosuje się polipeptyd zdolny do katalizowania reakcji redukcyjnej aminacji (np., dehydrogenazę glutaminianową), można stosować polipeptyd, który jest zdolny do obiegu NAD(P)H i/lub wytwarzania lotnego produktu (Fig. 13), taki jak dehydrogenaza mrówczanowa.
Dodatkowe uwagi dotyczące projektu szlaków biosyntetycznych
W zależności od tego, jakie polipeptydy stosuje się do wytwarzania indolo-3-pirogronianu, MP i/lub monatyny, wytwarzającym komórkom można dostarczać kofaktory, substraty i/lub dodatkowe polipeptydy dla wzmocnienia tworzenia produktu.
Usuwanie nadtlenku wodoru
Nadtlenek wodoru (H2O2) jest produktem, który jeśli powstaje, może być toksyczny dla komórek-producentów i może uszkadzać wytwarzane polipeptydy lub półprodukty. Opisana powyżej oksy18
PL 208 998 B1 daza L-aminokwasowa wytwarza H2O2 jako produkt. Dlatego też, jeśli stosuje się oksydazę L-aminokwasową, powstający H2O2 można usuwać lub obniżać jego poziomy dla zmniejszenia potencjalnych uszkodzeń komórki lub produktu.
Do zmniejszania poziomu H2O2 w komórce stosuje się katalazę (Fig. 11-13). W komórceproducencie może zachodzić ekspresja genu lub sekwencji cDNA, która koduje katalazę (EC 1.11.1.6), katalizującą rozkład nadtlenku wodoru do wody i tlenu w postaci gazu. Na przykład, ekspresja katalazy może zachodzić z wektora, którym stransfekowano komórkę-producenta. Przykłady katalaz, które można stosować obejmują, ale nie są ograniczone do: tr|Q9EV50 (Staphylococcus xylosus), tr|Q9KBE8 (Bacillus halodurans), tr|Q9URJ7 (Candida albicans), tr|P77948 (Streptomyces coelicolor), tr|Q9RBJ5 (Xanthomonas campestris) (numery dostępu SwissProt). Reaktory biokatalityczne wykorzystujące oksydazę L-aminokwasową, oksydazę D-aminokwasową lub oksydazę tryptofanową mogą również zawierać polipeptyd katalazy.
Modulacja dostępności PLP (pyridoksalo-5'-fosforanu)
Jak przedstawiono na Fig. 1, PLP można wykorzystywać w jednym lub więcej opisywanych w opisie etapów biosyntetycznych. Stężenie PLP można uzupełniać tak, aby PLP nie stanowił ograniczenia dla całkowitej wydajności reakcji.
Szlak biosyntetyczny witaminy B6 (prekursora PLP) zbadano dokładnie w E. coli, a niektóre z biał ek skrystalizowano (Laber i in., FEBS Letters, 449: 45-8, 1999). Dwa z genów (epd lub gapB i serC) wymagane są w innych szlakach metabolicznychm podczas gdy trzy geny (pdxA, pdxB i pdxJ) są unikalne dla biosyntezy fosforanu pirydoksalu. Jednym z materiał ów wyjś ciowych szlaku w E. coli jest 1-deoksy-D-ksylulozo-5-fosforan (DXP). Synteza tego prekursora ze zwykłych 2 i 3 węglowych metabolitów centralnych katalizowana jest przez polipeptyd syntazę 1-deoksy-D-ksylulozo-5-fosforanową (DSX). Innym prekursorem jest pochodna treoniny utworzona z 4-węglowego cukru, 4-fosforanu D-erytrozy. Genami wymaganymi do przekształcania w fosfo-4-hydroksylo-L-treoninę (HTP) są epd, pdxB, i serC. Ostatnią reakcją dla tworzenia PLP jest kompleksowa wewnątrzcząsteczkowa kondensacja i reakcja zamykania pierścienia pomiędzy DXP i HTP, katalizowana przez produkty genów pdxA i pdxJ.
Jeśli PLP staje się ograniczającym czynnikiem odżywczym podczas fermentacji prowadzącej do wytwarzania monatyny, podwyższoną ekspresję jednego lub więcej genów szlaku w produkujących komórkach gospodarza można wykorzystywać do podwyższania wydajności wytwarzania monatyny. Organizm gospodarza może zawierać wielokrotne kopie swoich natywnych genów szlaku lub kopie nienatywnych genów szlaku można wprowadzać do genomu organizmu. Dodatkowo, wielokrotne kopie genów szlaku można klonować w organizmie gospodarza.
Jeden ze szlaków, który jest konserwatywny we wszystkich organizmach zapewnia obieg różnych pochodnych witaminy B6 do aktywnej postaci PLP. Polipeptydami zaangażowanymi w tym szlaku są kinaza pdxK, oksydaza pdxH i kinaza pdxY. Nadekspresja jednego lub więcej z tych genów może podwyższać dostępność PLP.
Poziomy witaminy B6 można podwyższać przez eliminację lub represję metabolicznej regulacji genów natywnego szlaku biosyntetycznego w organizmie gospodarza. PLP hamuje polipeptydy zaangażowane w biosyntezę pochodnej prekursora treoniny w bakterii Flavobacterium sp. szczep 238-7. Ten szczep bakteryjny, wolny od kontroli metabolicznej, wykazuje nadprodukcję pochodnych pirydoksalu i może wydzielać do 20 mg/litr PLP. Genetyczna manipulacja organizmu gospodarza wytwarzającego monatynę w podobny sposób będzie umożliwiać podwyższone wytwarzanie PLP bez nadekspresji genów szlaku biosyntetycznego.
Zużytkowanie amoniaku
Reakcje tryptofanazy można ukierunkowywać na drogę syntetyczną (wytwarzanie tryptofanu z indolu) przez zwię kszanie dostę pnoś ci amoniaku lub usuwanie wody. Reakcje redukcyjnej aminacji, takie jak te katalizowane przez dehydrogenazę glutaminianową, również można ukierunkowywać przez nadmiar amoniaku.
Amoniak można czynić dostępniejszym w postaci soli, węglanu amonowego lub fosforanu amonowego, w układzie buforowanym węglanami lub fosforanami. Amoniak można również dostarczać jako pirogronian amonowy lub mrówczan amonowy. Alternatywnie, amoniak można dostarczać jeśli reakcja sprzężona jest z reakcją, w której powstaje amoniak, taką jak dehydrogenazy glutaminianowej lub dehydrogenazy tryptofanowej. Amoniak można wytwarzać przez dodanie naturalnych substratów EC 4.1.99.- (tyrozyny lub tryptofanu), które będą hydrolizowane do fenolu lub indolu, pirogronianu
PL 208 998 B1 i NH3. Pozwala to również na podwyższenie wydajności produktu syntetycznego ponad normalną równowagową ilość przez umożliwienie enzymowi hydrolizy jego preferowanego substratu.
Usuwanie produktów i produktów ubocznych
Przekształcanie tryptofanu do indolo-3-pirogronianu przez aminotransferazę tryptofanową może niekorzystnie wpływać na szybkość wytwarzania indolo-3-pirogronianu, ponieważ w wyniku reakcji powstaje glutaminian i wymaga ona ko-substratu 2-oksoglutaranu (α-ketoglutaranu). Glutaminian może powodować hamowanie aminotransferazy, i reakcja będzie zużywać duże ilości ko-substratu. Ponadto, wysokie stężenia glutaminianu są niekorzystne dla dalszych procesów rozdzielania.
Polipeptyd dehydrogenaza glutaminianowa (GLDH) przekształca glutaminian w 2-oksoglutaran, w ten sposób zapewniając obieg ko-substratu w reakcji katalizowanej przez aminotransferazę tryptofanową. GLDH wytwarza również równoważniki redukujące (NADH lub NADPH), które można stosować do wytwarzania energii dla komórki (ATP) w warunkach tlenowych. Wykorzystywanie glutaminianu przez GLDH zmniejsza również tworzenie produktu ubocznego. Ponadto, w reakcji powstaje amoniak, który służy jako źródło azotu dla komórki lub jako substrat w redukcyjnej aminacji etapu końcowego przedstawionego na Fig. 1. Dlatego też, komórki produkujące, w których zachodzi nadekspresja polipeptydu GLDH można stosować do podwyższania wydajności i zmniejszania kosztów podłoża i/lub procesów rozdzielania.
W szklaku prowadzącym od tryptofanu do monatyny, donor grupy aminowej etapu trzeciego (np. glutaminian lub asparaginian) można przekształcać z powrotem w akceptor grupy aminowej, wymagany dla etapu 1 (np. 2-oksoglutaran lub szczawiooctan), jeśli stosuje się aminotransferazę z odpowiedniej klasy enzymów. Stosowanie dwóch odrębnych transaminaz dla tego szlaku, w którym substrat jednej transaminazy nie hamuje współzawodniczo aktywności drugiej transaminazy, może podwyższać wydajność tego szlaku.
Wiele reakcji w opisanych szlakach jest odwracalnych i dlatego też będzie osiągany stan równowagi między substratami a produktami. Wydajność szlaku można podwyższać przez ciągłe usuwanie produktów od polipeptydów. Na przykład, wydzielanie monatyny do brzeczki fermentacyjnej z wykorzystaniem permeazy lub innego białka transportowego, bądź selektywna krystalizacja monatyny ze strumienia reaktora biokatalicznego z jednoczesnym wprowadzaniem w obieg substratów będzie podwyższać wydajność reakcji.
Usuwanie produktów ubocznych przez dodatkowe reakcje enzymatyczne lub przez podstawienia aminowych grup donorowych jest kolejną drogą podwyższnia wydajności reakcji. Kilka przykładów omówiono w Przykładzie 13 i przedstawiono na Figurach 11-13. Idealnie, wytwarzany produkt uboczny jest niedostępny do reakcji przebiegającej w przeciwnym kierunku, albo dzięki zmianie fazy (odparowywanie), albo dzięki spontanicznemu przekształcaniu w niereaktywny produkt końcowy, taki jak dwutlenek węgla.
Modulacja puli substratów
Pulę indolu można modulować przez podwyższanie wytwarzania prekursorów tryptofanu i/lub zmianę szlaków katabolicznych, obejmujących indolo-3-pirogronian i/lub tryptofan. Na przykład, wytwarzanie kwasu indolo-3-octowego z indolo-3-pirogronianu można zmniejszać lub eliminować przez funkcjonalną delecję genu kodującego dla EC 4.1.1.74 w komórce gospodarza. Wytwarzanie indolu z tryptofanu można zmniejszać lub eliminować przez funkcjonalną delecję genu kodującego dla EC 4.1.99.1 w komórce gospodarza. Alternatywnie, nadmiar indolu można wykorzystywać jako substrat w procesie in vitro lub in vivo w połączeniu z podwyższonymi ilościami genu kodującego dla EC 4.1.99.1 (Kawasaki i in., J. Ferm. and Bioeng., 82: 604-6, 1996). W celu podwyższania poziomu półproduktów, takich jak D-erytrozo-4-fosforan i chorismat można przeprowadzać genetyczne modyfikacje.
Wytwarzanie tryptofanu jest regulowane w większości organizmów. Jednym z mechanizmów jest hamowanie przez sprzężenie zwrotne pewnych enzymów w szlaku, kiedy poziom tryptofanu wzrasta, szybkość wytwarzania tryptofanu maleje. A zatem, jeśli stosuje się komórkę gospodarza zmodyfikowaną technikami inżynierii tak, aby wytwarzała monatynę przez tryptofan jako półprodukt, można stosować organizm, który nie jest wrażliwy na stężenia tryptofanu. Na przykład, wyselekcjonowano szczep Catharanthus roseus, który jest oporny na hamowanie wzrostu przez różne analogi tryptofanu przez powtarzaną ekspozycję na wysokie stężenia 5-metylo-tryptofanu (Schallenberg i Berlin, Z Naturforsch 34: 541-5, 1979). Uzyskana aktywność syntazy tryptofanowej szczepu była mniej podatna na hamowanie przez produkt, prawdopodobnie z powodu mutacji w genie. Podobnie, można optymalizować komórkę gospodarza stosowaną do wytwarzania monatyny.
PL 208 998 B1
Wytwarzanie tryptofanu można optymalizować przez stosowanie ukierunkowanej ewolucji dla uzyskania polipeptydów, które są mniej wrażliwe na hamowanie przez produkt. Na przykład, przeszukiwanie można przeprowadzać na płytkach nie zawierających tryptofanu w podłożu, ale z wysokimi poziomami niemetabolicznych analogów tryptofanu. Opisy patentowe US 5 756 345; US 4 742 007 i US 4 371 614 opisują metody stosowane do podwyższania produktywności tryptofanu w organizmach fermentacyjnych. Ostatnim etapem biosyntezy tryptofanu jest dodawanie seryny do indolu; dlatego dla zwiększenia wytwarzania tryptofanu można podwyższać dostępność seryny.
Ilość monatyny wytwarzanej przez organizm fermentacyjny można podwyższać przez zwiększanie ilości pirogronianu wytwarzanego przez organizm gospodarza. Pewne drożdże, takie jak Trichosporon cutaneum (Wang i in., Lett. Appl. Microbiol. 35: 338-42, 2002) i Torulopsis glabrata (Li i in., Appl Microbiol. Biotechnol. 57: 451-9, 2001) wytwarzają podwyższone ilości pirogronianu i można je stosować w praktycznym wykorzystywaniu metod przedstawionych w opisie. Ponadto, dla pobudzania wytwarzania kwasu pirogronowego można przeprowadzać modyfikacje genetyczne organizmu, takie jak te w szczepie W1485lip2 E. coli (Kawasaki i in., J. Ferm. and Bioeng. 82: 604-6, 1996).
Kontrolowanie chiralności
Profil smaku monatyny można zmieniać przez kontrolowanie stereochemii (chiralności) cząsteczki. Na przykład, różne izomery monatyny mogą być pożądane w różnych stężeniach mieszanek dla różnych układów żywności. Chiralność można kontrolować przez kombinację kontrolowania pH i polipeptydów.
Racemizację monatyny w pozycji C-4 (patrz ponumerowana cząsteczka powyżej) można przeprowadzać przez deprotonowanie i ponowne protonowanie węgla alfa, które mogą zachodzić w wyniku przesunięcia pH lub reakcji z kofaktorem PLP.
W mikroorganizmie nie jest możliwa zmiana pH ale PLP występuje obficie. Metody kontrolowania chiralności z zastosowaniem polipeptydów zależą od wykorzystywanej drogi biosyntetycznej do wytwarzania monatyny.
Kiedy monatyna jest wytwarzana z wykorzystaniem szlaku przedstawionego na Fig. 2, rozważać można poniższe okoliczności. W reakcji biokatalitycznej, chiralność węgla-2 determinowana jest przez enzym, który przekształca indolo-3-pirogronian w MP. Wiele enzymów (np. z EC 4.1.2.-, 4.1.3.-) może przekształcać indolo-3-pirogronian w MP, a zatem, można wybrać enzym, który tworzy pożądany izomer. Alternatywnie, enancjospecyficzność enzymu, który przekształca indolo-3-pirogronian w MP można modyfikować przez ukierunkowaną ewolucję lub można tworzyć przeciwciała katalityczne dla katalizowania pożądanej reakcji. Po wytworzeniu MP (albo enzymatycznie albo przez kondensację chemiczną), można dodać stereospecyficznie grupę aminową stosując transaminazę, taką jak te opisane. Można utworzyć albo konfigurację R albo S węgla-4, w zależności od tego czy stosuje się aminotransferazę D- czy L- aminokwasu aromatycznego. Większość aminotransferaz jest specyficznych dla izomeru L, jednakże aminotransferazy D-tryptofanowe występują w pewnych roślinach (Kohiba i Mito, Proceedings of the 8th International Symposium on Vitamin B6 and Carbonyl Catalysis, Osaka, Japonia 1990). Ponadto, zidentyfikowano aminotransferazy D-alaninowe (2.6.1.21), aminotransferazy D-metionino-pirogronianowe (2.6.1.41) oraz obie aminotransferazy: aminotransferazę (R)3-amino-2-metylopropionianową (2.6.1.61) oraz aminotransferazę (S)-3-amino-2-metylopropionianową (2.6.1.22).
PL 208 998 B1
Niektóre aminotransferazy mogą akceptować jedynie substrat dla tej reakcji z określoną konfiguracją przy węglu C2. Dlatego też, nawet jeśli przekształcanie do MP nie jest stereospecyficzne, stereochemię końcowego produktu można kontrolować przez właściwy wybór transaminazy. Ponieważ reakcje są odwracalne, nieprzereagowany MP (niepożądany izomer) można z powrotem wprowadzić w obieg do jego składowych i można ponownie tworzyć mieszaninę racemiczną MP.
Aktywacja substratów
Fosforylowane substraty, takie jak fosfoenolopirogronian (PEP), można stosować w reakcjach przedstawionych w opisie. Fosforylowane substraty mogą być korzystniejsze energetycznie i dlatego można je stosować do podwyższania szybkości i/lub wydajności reakcji. W kondensacji aldolowej, dodatek grupy fosforanowej stabilizuje tautomer enolowy substratu nukleofilowego, czyniąc go bardziej reaktywnym. W innych reakcjach, fosforylowany substrat często zapewnia lepszą grupę opuszczającą. Podobnie substraty można aktywować przez przekształcanie do pochodnych CoA lub pochodnych pirofosforanowych.
P r z y k ł a d 1
Klonowanie i ekspresja aminotransferaz tryptofanowych
Przykład ten opisuje metody użyte do klonowania aminotransferaz tryptofanowych, które można wykorzystać do przekształcania tryptofanu w indolo-3-pirogronian.
Schemat eksperymentu
Sklonowano 11 genów kodujących aminotransferazy w E. coli. Te geny to gen aminotransferazy D-alaninowej Bacillus subtilis (dat, numer dostępu w Genbank Y14082.1 bp 28622-2947 i numer dostę pu w Genbank NP_388848.1, odpowiednio sekwencje nukleotydowa i aminokwasowa), aminotransferazy tyrozynowej Sinorhizobium meliloti (zwanego również Rhizobium meliloti) (tatA, sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 1 i 2, odpowiednio sekwencje nukleotydowa i aminokwasowa), aminotransferazy tyrozynowej szczepu 2.4.1 Rhodobacter sphaeroides (tatA ustalony na podstawie homologii, sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 3 i 4, odpowiednio sekwencje nukleotydowa i aminokwasowa), aminotransferazy o szerokim spektrum substratowym Leishmania major (bsat, ustalony na podstawie homologii z fragmentami peptydowymi z L. mexicana, sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 7 i 8, odpowiednio sekwencje nukleotydowa i aminokwasowa), aminotransferazy aromatycznej Bacillus subtilis (araT, ustalony na podstawie homologii, sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 9 i 10, odpowiednio sekwencje nukleotydowa i aminokwasowa), aminotransferazy aromatycznej Lactobacillus amylovorus (araT ustalony na podstawie homologii, sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 11 i 12, odpowiednio sekwencje nukleotydowa i aminokwasowa), aminotransferazy wielosubstratowej R. sphaeroides 35053 (ustalona na podstawie homologii, sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 13 i 14, odpowiednio sekwencje nukleotydowa i aminokwasowa), aminotransferazy wielosubstratowej szczepu 2.4.1 Rhodobacter sphaeroides (msa, ustalony na podstawie homologii, numer dostępu w Genbank AAAE01000093.1, bp 14743-16155 i numer dostępu w Genbank ZP00005082.1, odpowiednio sekwencje nukleotydowa i aminokwasowa), aminotransferazy asparaginianowej Escherichia coli (aspC, numer dostępu w Genbank AE000195.1 bp 2755-1565 i numer dostępu w Genbank AAC74014.1, odpowiednio sekwencje nukleotydowa i aminokwasowa) i aminotransferazy tyrozynowej E. coli (tyrB, sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 31 i 32, odpowiednio sekwencje nukleotydowa i aminokwasowa).
Geny klonowano, przeprowadzano ich ekspresję i badano aktywność w przekształcaniu tryptofanu do indolo-3-pirogronianu, równolegle z enzymami dostępnymi komercyjnie. Wszystkie 11 klonów wykazywało aktywność.
Identyfikacja szczepów bakteryjnych, które mogą zawierać polipeptydy o pożądanej aktywności
W bazie NCBI (National Center for Biotechnology Information) nie ma genów oznaczonych jako aminotransferazy tryptofanowe. Jednakże zidentyfikowano organizmy posiadające tą aktywność enzymatyczną. Aktywność aminotransferazy L-tryptofanowej (TAT) oznaczono w ekstraktach komórkowych lub oczyszczonym białku z następujących źródeł: izolat Rhizobacterium z Festuca octoflora, mitochondriów i cytozolu groszku, komórek nowotworu typu crown-gall słonecznika, Rhizobium leguminosarum biowar trifoli, Erwinia herbicola pv gypsophilae, Pseudomonas syringae pv. savastanoi, Agrobacterium tumefaciens, Azospirillum lipferum i brasilense, Enterobacter cloacae, Enterobacter agglomerans, Bradyrhizobium elkanii, Candida maltosa, Azotobacter vinelandii, mózgu szczura, wątroby szczura, Sinorhizobium meliloti, Pseudomonas fluorescens CHAO, Lactobacillus lactis, Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticus, kiełków pszenicy, jęczmienia, Phaseolus aureus (fasoli mung),
PL 208 998 B1
Saccharomyces uvarum (carlsbergensis), Leishmania sp., kukurydzy, pędów pomidora, roślin groszku, tytoniu, świni, Clostridium sporogenes i Streptomyces griseus.
Izolacja genomowego DNA do klonowania
S. meliloti (ATCC numer 9930) hodowano w podłożu TY w temperaturze 25°C, pH 7,2. Komórki hodowano do gęstości optycznej, przy długości fali 600 nm (OD600), równej 1,85 i 2% inokulum użyto do izolacji genomowego DNA. Izolację genomowego DNA przeprowadzono z użyciem zestawu Qiagen Genomic tip 20/G (Valencia, CA).
Bacillus subtilis 6051 (ATCC) hodowano w temperaturze 30°C w podłożu odżywczym Bereto (Difco; Detroit, MI). Do izolacji genomowego DNA użyto metody Qiagen Genomie tip 20/G z następującymi modyfikacjami: stężenia proteinazy K i lizozymu zwiększono dwukrotnie, a czasy inkubacji zwiększono 2-3 krotnie.
Genomowe DNA Leishmania major ATCC 50122, 17 ng/il w buforze TE pH 8,0, uzyskano od IDI, Inc. (Quebec, Kanada).
DNA genomowe z Rhodobacter sphaeroides 2.4.1 (dostarczonego przez profesora Sam Kaplan, Unversity of Texas, Houston), R. sphaeroides 35053 (numer ATCC) i L. amylovorus wyizolowano standardową ekstrakcją fenolem. Komórki zebrano w późnej fazie logarytmicznej, zawieszono w buforze TEN (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl) i lizowano dodając 0,024 ml laurylo-sarkozyny sodowej na ml zawiesiny komórek. Po co najmniej trzykrotnej ekstrakcji równą objętością fenolu nasyconego buforem TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA) roztwór DNA ekstrahowano jeden raz mieszaniną chloroform:oktanol 9:1 i trzy razy chloroformem. DNA wytrącano przez dodanie 0,1 objętości 3 M octanu sodu, pH 6,8 i 2 objętości etanolu. Precypitat zebrano poprzez wirowanie i przemyto jeden raz 70% etanolem. Na koniec DNA rozpuszczono w 0,10 ml wody destylowanej.
Genomowe DNA Escherichia coli izolowano ze szczepu DH10B (Invitrogen) przy użyciu zestawu Qiagen Genomic-tip™ (500/G). Z 30 ml szczepu hodowanego w LB do OD650 1,83 uzyskano 0,3 mg oczyszczonego DNA. Oczyszczone DNA rozpuszczono w buforze do elucji (EB) Qiagen w stężeniu 0,37 μη/μ!.
Protokół reakcji łańcuchowej polimerazy
Startery zaprojektowano, by miały końce kompatybilne z wektorem pET 30 Xa/LIC (Novagen, Madison, WI). Wektor pET ma 12-nukleotydowy jednoniciowy koniec po stronie 5' od miejsca Xa/LIC i 15-nukleotydowy jednoniciowy koniec po stronie 3' od miejsca Xa/LIC. Plazmid jest zaprojektowany do klonowania niezależnego od ligacji z N-końcowymi znacznikami His i S i ewentualnym C-końcowym znacznikiem His. Miejsce rozpoznawane przez proteazę Xa (IEGR) jest położone bezpośrednio przed kodonem start klonowanego genu, dzięki czemu można usunąć znaczniki białka fuzyjnego.
Przy projektowaniu starterów do końców 5' sekwencji specyficznych dla danego organizmu dodano następujące sekwencje: starter w kierunku do przodu, 5' GGTATTGAGGGTCGC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 73); starter odwrotny: 5' AGAGGAGAGTTAGAGCC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 74).
Startery dat Bacillus subtilis: N-końcowy: 5'-GGTATTGAGGGTCGCATGAAGGTTTTAGTCAATGG-3' i C-końcowy: 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTATGAAATGCTAGCAGCCT-3' (sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 15 i 16).
Startery tatA Sinorhizobium meliloti: N-końcowy: 5'-GGTATTGAGGGTCGCATGTTCGACGCCCTCGCCCG i C-końcowy: 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGAGACTGGTGAACTTGC (sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 17 i 18).
Startery araT Bacillus subtilis: N-końcowy: 5'-GGTATTGAGGGTCGCATGGAACATTTGCTGAATCC i C-końcowy: 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTAAACGCCGTTGTTTATCG (sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 19 i 20).
msa Rhodobacter sphaeroides (zarówno 2.4.1 jak i 35053): N-końcowy: 5'-GGTATTGAGGGTCGCATGCGCGAGCCTCTTGCCCT i C-końcowy: 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGCCGGGGAAGCTCCGGG (sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 21 i 22).
bsat Leishmania major: N-końcowy: 5'-GGTATTGAGGGTCGCATGTCCACGCAGGCGGCCAT i C-końcowy: 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCACTCACGATTCACATTGC (sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 23 i 24).
PL 208 998 B1 araT Lactobacillus amylovorus: N-końcowy: 5'-GGTATTGAGGGTCGCATGCCAGAATTAGCTAATGA i C-końcowy: 5'-AGAGGAGAGTTAGA- GCCTTATTCGTCCTCTTGTAAAA (sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 25 i 26).
tatA Rhodobacter sphaeroides (oba szczepy - 2.4.1 i 35053): N-końcowy: 5'-GGTATTGAGGGTCGCATGCGCTCTACGACGGCTCC i C-końcowy: 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGCCGCGCAGCACCTTGG (sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 27 i 28).
aspC Escherichia coli: N-końcowy: 5'-GGTATTGAGGGTCGCATGTTTGAGAACATTACCGC-3' i C-koń cowy: 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACAGCACTGCCACAATCG-3' (sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 29 i 30).
tyrB Escherichia coli: N-końcowy: 5'-GGTATTGAGGGTCGCGTGTTTCAAAAAGTTGACGC i C-końcowy: 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACATCACCGCAGCAAACG-3' (sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 33 i 34).
Gen pochodzący z S. meliloti (tatA) amplifikowano przy użyciu następującego protokołu PCR.
W mieszaninie reakcyjnej o objętości 50 μ|, z buforem Expand™ 1x i Mg, użyto 0,1-0,5 μg matrycy, 1,5 μΜ każdego startera, 0,4 μM każdego z dNTP, 3,5 jednostki Expand High Fidelity Polymerase (Roche, Indianapo|is, IN). Wykorzystany program termocyk|era obejmował „gorący start w temperaturze 96°C przez 5 minut, a po nim 29 powtórzeń następujących etapów: temperatura 94°C przez 30 sekund, temperatura 55°C przez 2 minuty i temperatura 72°C przez 2,5 minuty. Po 29 powtórzeniach próbkę utrzymywano przez 10 minut w temperaturze 72°C, a następnie przechowywano w temperaturze 4°C. W wyniku zastosowania tego protokółu PCR powstał produkt o długości 1199 bp.
Sekwencje genów pochodzących z R. sphaeroides (msa i tatA), L. amylovorus araT i Bacillus araT amplifikowano przy użyciu następującego protokołu PCR. Do mieszaniny reakcyjnej o objętości 50 μl użyto 0,1 - 0,5 μg matrycy, 1,5 μM każdego startera, 0,4 μM każdego z dNTP, 3,5 jednostki Expand High Fidelity Polymerase (Roche, Indianapolis, IN) oraz bufor Expand™ 1 x z Mg. Wykorzystany program termocyklera obejmował „gorący start w temperaturze 96°C przez 5 minut, a po nim 29 powtórzeń następujących etapów: temperatura 94°C przez 30 sekund, temperatura 40-60°C przez 1 minutę i 45 sekund (gradientowy termocykler) i temperatura 72°C przez 2 minuty i 15 sekund. Po 29 powtórzeniach próbkę utrzymywano przez 10 minut w temperaturze 72°C, a następnie przechowywano w temperaturze 4°C.
Dla genu msa R. sphaeroides temperatury renaturacji 42°C i 48 °C pozwoliły wytworzyć wiele produktów i wyraźny prążek o wielkości około 1464 bp. Dla araT L. amylovorus przy temperaturach renaturacji 42°C, 48°C i 56°C powstawały pojedyncze produkty tworzące intesywne prążki o wielkości 1173 bp. Dla araT B. subtilis temperatury renaturacji 40°C, 45°C, 50°C i 55°C powodowały powstawanie pojedynczych intensywnych produktów (1173 bp) zarówno z genomowego DNA jak i kolonii. Dla bsat L. major temperatura renaturacji 55°C dała najczystszy produkt (1239 bp). Dla genów tatA Rhodobacter temperatury renaturacji 50-55°C dały czyste produkty o właściwej wielkości (1260 bp). Dla obu genów E. coli i genu dat B. subtilis użyto temperatury renaturacji 55-60°C, a czas renaturacji skrócono do 45 sekund. Uzyskano czyste produkty o odpowiedniej wielkości (około 1,3 kb dla genów E. coli, 850 bp dla genu dat).
Klonowanie
Produkty PCR oczyszczano z 0,8% i 1% żelu agarozowego w buforze TAE przy użyciu zestawu Qiagen (Valencia, CA) do ekstrakcji z żelu. Ilości produktów PCR oznaczano przez porównywanie do standartów w żelu agarozowym, a następnie traktowano polimerazą DNA faga T4 według protokołu zalecanego przez producenta do klonowania niezależnego od ligacji (Novagen, Madison, WI).
W skrócie, około 0,2 pmol oczyszczonego produktu PCR traktowano 1 jednostką polimerazy DNA faga T4 w obecności dGTP przez 30 minut w temperaturze 22°C. Polimerazą usuwa kolejne zasady z końca 3' produktu PCR. Gdy polimeraza natrafi na resztę guaninową aktywność 5'-3' polimerazy przeciwdziała aktywności egzonukleolitycznej i skutecznie uniemożliwia dalsze odtrawianie. To tworzy jednoniciowe końce kompatybilne z wektorem pET Xa/LIC. Polimerazę inaktywuje się przez inkubację w temperaturze 75°C przez 20 minut.
Wektor i zmodyfikowaną wstawkę łączono przez renaturację według zaleceń Novagen. Około 0,02 pmol zmodyfikowanej wstawki i 0,01 pmol wektora inkubowano przez 5 minut w temperaturze 22°C, dodano 6,25 mM EDTA (stężenie końcowe) i powtórzono inkubację w temperaturze 22°C. Mieszninę reakcyjną po reakcji łączenia (1 μ!) dodawano do komórek kompetentnych NovaBlue™ singles (Novagen, Madison, WI) i inubowano w lodzie przez 5 minut. Po wymieszaniu komórki transformowano za pomocą szoku cieplnego w temperaturze 42°C przez 30 sekund. Komórki przeniesiono
PL 208 998 B1 do lodu na 2 minuty, dodawano do nich 250 μl podłoża SOC o temperaturze pokojowej i inkubowano przez 30 minut w temperaturze 37°C z wytrząsaniem przy 225 obrotach na minutę. Komórki wysiewano na szalki z podłożem LB zawierającym kanamycynę (25-50 μg/ml).
DNA plazmidowe izolowano przy użyciu zestawu Qiagen spin miniprep i poszukiwano właściwych wstawek za pomocą trawienia enzymami restrykcyjnymi XhoI i Xbal. Sekwencje plazmidów, które wydawały się mieć odpowiednią wstawkę potwierdzano sekwencjonowaniem DNA metodą terminacji łańcucha dideoksynukleotydami.
Sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 1-14 i 31-32 przedstawiają sekwencje nukleotydowe i odpowiadające im sekwencje aminokwasowe rekombinowanych aminotransferaz. Jakiekolwiek zmiany w stosunku do sekwencji z Genbank były albo milczące, albo prowadziły do konserwatywnych podstawień w sekwencji białka. Sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 11 i 12 są nowymi sekwencjami.
Ekspresja genu i oznaczenia
DNA plazmidowe zweryfikowane przez sekwencjonowanie subklonowano w gospodarzach ekspresyjnych E. coli BLR(DE3) i BL21(DE3) (Novagen, Madison, WI). Prowadzono hodowle, a następnie przy użyciu zestawu Qiagen miniprep izolowano plazmidy i analizowano przez trawienie restrykcyjne dla potwierdzenia identyczności.
Początkowo prowadzono indukcję araT L. amylovorus, araT B. subtilis i tatA S. meliloti zarówno w komórkach BLR(DE3) jak i BL21(DE3). Poszukiwanie optymalnego czasu indukcji przeprowadzaono w hodowlach prowadzonych do uzyskania gęstości optycznej OD600 = 0,5-0,8 w podłożu LB zawierającym kanamycynę (30 mg/l) i indukowano z 1mM IPTG (tiogalaktozydem izopropylu). Próbki pobierano w czasach 0, 1, 2 i 4 godziny po indukcji. Komórki z 2 ml hodowli zawieszano w 0,10 ml 120 mM Tris-HCl, pH 6,8 zawierającego 10% sól sodową siarczanu dodecylu, 10% 2-merkaptoetanol i 20% glicerol, ogrzewano w temperaturze 95°C przez 10 minut, schładzano i rozcieńczano 0,10 ml H2O. Część tych próbek całkowitego białka komórkowego analizowano w żelu gradientowym 4-15% SDS-PAGE. Nie wykryto żadnych znaczących różnic w ilości uzyskanego w wyniku ekspresji białka pomiędzy 2 i 4 godziną od indukcji, ani pomiędzy komórkami BLR(DE3) i BL21(DE3).
Ekstrakty komórkowe przygotowywano również z próbki 2 ml hodowli po 4 godzinach przez zawieszenie osadu komórek w 0,25 ml odczynnika Novagen BugBuster™ zawierającego 0,25 μl nukleazy benzonazowej, inkubację przez 20 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym wytrząsaniem i wirowanie przy 16 000 x g dla usunięcia resztek komórek. Supernatanty (ekstrakty komórkowe) nakładano na żele gradientowe 4-15% dla analizy rozpuszczalnych białek komórkowych.
Trzy klony: araT L.amylovorus (sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 11 i 12), araT B. subtilis (sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 9 i 10) i tatA S. meliloti (sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 1 i 2) wykazywały rozpuszczalne białko, które odpowiadało właściwej wielkości (około 45 kDa). Produkt genu araT B. subtilis ulegał nadekspresji na najwyższym poziomie i/lub był bardziej rozpuszczalny niż produkty pozostałych dwu genów.
W następnych metodach ekspresji, plazmidowe DNA z pozytywnych klonów subklonowano do szczepu BL21(DE3) ze względu na lepszy wzrost tego gospodarza. Indukcję powtarzano przy użyciu 1 mM IPTG w kulturach hodowanych w podłożu LB zawierającym 50 mg/l kanamycyny, gdy OD600 osiągnęło wartość wynoszącą w przybliżeniu 0,8. Komórki zbierano po 4 godzinach hodowli w temperaturze 37°C, odwirowywano przy 3000 obrotów na minutę przez 10 minut (w temperaturze 4°C), przemywano buforem TEGGP (50 mM tris-HCl (pH 7,0), 0,5 mM EDTA, 100 mg/ml glutationu, 5% glicerol z kompletnym koktailem inhibitorów proteaz Roche) i zamrażano błyskawicznie w etanolu o temperaturze -80°C.
Próbki ponownie zawieszano w 5 ml/g mokrej masy komórkowej w odczynniku BugBuster™ (Novagen), zawierającym 5 nl/ml koktailu inhibitorów proteazy zestaw #3 (Calbiochem-Novabiochem Corp. San Diego, CA) i 1 nl/ml nukleazy benzonazowej. Próbki inkubowano przez 20 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce obrotowej. Nierozpuszczalne resztki komórek usuwano przez wirowanie przy 16 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4°C.
Ekstrakty komórkowe analizowano techniką SDS-PAGE i oznaczano aktywność aminotransferazy tryptofanowej mierząc wytwarzanie kwasu indolo-pirogronowego za pomocą następującego protokołu. Reakcje w obętości jednego mililitra prowadzono w roztworze 50 mM tetraboranu sodowego (pH 8,5), 0,5 mM EDTA, 0,5 mM arsenianu sodowego, 50 μM fosforanu pirydoksalu, 5 mM α-ketoglutaranu i 5 mM L-tryptofanu. Reakcje inicjowano przez dodanie bezkomórkowych ekstraktów lub oczyszczonego enzymu i inkubowano przez 30 minut w temperaturze 30°C. Reakcję zatrzymywano
PL 208 998 B1 dodając 20% TCA (200 μΐ) i wytrącone białko usuwano przez wirowanie. Mierzono absorpcję przy długości fali 327 nm i porównywano z krzywą standartową dla świeżo przygotowanego indolo-3-pirogronianu w buforze reakcyjnym. Prowadzono również reakcje kontrolne bez substratu lub przy użyciu bezkomórkowych ekstraktów transformowanych samym plazmidem pET30a.
Z powodu tła wynikającego z obecności natywnych aminotransferaz E. coli w ekstraktach komórkowych, rekombinowane białka oczyszczano przy użyciu kolumienek His-Bind według protokołu producenta (Novagen, Madison, WI). Frakcje eluatu odsalano na kolumnach PD-10 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) i eluowano w 50 mM Tris, pH 7,0. Oczyszczone białka analizowano przez SDS-PAGE i używano do oznaczeń aktywności aminotransferazy.
Wyniki dotyczące indukcji 1 mM IPTG w temperaturze 37°C (4 godziny) wykazują, że bsat L. major, tatA S. meliloti, aspC E. coli i oba klony tatA R. sphaeroides wykazują znaczące poziomy aktywności aminotransferazy tryptofanowej. Białko araT B. subtilis ulegało nadekspresji, było rozpuszczalne, ale miało niewielką aktywność enzymatyczną. Produkt genu araT L. amylovorus wydawał się występować w ekstraktach komórkowych w formie rozpuszczalnej, ale oczyszczanie przy użyciu kolumienki His-Bind dostarczało jedynie niewielkich ilości białka o odpowiedniej masie cząsteczkowej. Produkt genu msa był nierozpuszczalny i dalsze eksperymenty z ekspresją prowadzono w temperaturze 24°C, aby zminimalizować tworzenie ciałek inkluzyjnych. Użyto kilku stężeń IPTG pomiędzy 10 μM i 1 mM, aby zmaksymalizować ilość rozpuszczalnego białka.
Tablica 1 podaje aktywności właściwe wyrażone w mikrogramach indolo-3-pirogronianu (I3P) wytwarzanego na miligram białka na minutę. W niektórych wypadkach bardzo małe ilości rekombinowanego białka wykazywały wysoką aktywność powyżej efektywego liniowego zakresu oznaczenia. W takich przypadkach wartość aktywności właściwej poprzedza znak „>.
T a b l i c a 1:
Aktywności właściwe klonów mierzone dla ekstraktów komórkowych (CE) i oczyszczonych białek (P) oraz dla komercyjnych enzymów
Enzym Aktywność właściwa (pg I3P/mg białka/minutę) Uwagi
1 2 3
bsat L. major CE >49,3
bsat L. major P >4280
tatA S. meliloti CE >28,6
tatA S. meliloti P >931
tatA 2.4.1 CE >41,2
tatA 2.4.1 P 1086
tatA 35053 CE >62,3
tatA 35053 P >486
araT L. amylovorus CE 1,26
araT L. amylovorus P 0 niewiele białka po oczyszczaniu na kolumience His-Bind
araT B. subtilis CE 0 niewykrywalne
araT B. subtilis P 1,5-4,5
msa 2.4.1 CE 2,05 bardzo mało rozpuszczalnego białka
msa 2.4.1 P 0 brak białka po oczyszczaniu na kolumience His-Bind
msa 35053 CE 3,97 bardzo mało rozpuszczalnego białka
msa35053 P 0 brak białka po oczyszczaniu na kolumience His-Bind
aspC E. coli (P) 800
PL 208 998 B1 cd. tablicy
1 2 3
tyrB E. coli (P) 1 niezbyt rozpuszczalne
D-aminotransferaza B. subtilis (P) 2,7 przy użyciu D-tryptofanu jako substratu
Transaminaza o szerokim spektrum 22 Sigma nr kat. T 7684
Świńska typu II-A 1,5 Sigma G7005
Świńska typu I 1 Sigma G2751
Przyrównanie wszystkich sklonowanych rekombinowanych białek pokazuje, że nie ma zbyt wielu obszarów wysokokonserwowanych w sekwencjach araT, tatA, bsat i msa.
Przyrównanie białek rekombinowanych o najwyższych aktywnościach: homologów produktu genu tatA Rhodobacter, aminotransferazy o szerokim spektrum substratowym L. major i aminotransferazy tyrozynowej Sinorhizobium meliloti wykazuje kilka regionów konserwowanych, chociaż na poziomie białka wykazują one jedynie około 30-43% identyczności. Dostępność aminotransferazy D-specyficznej (D-alaninowej) o szerokim spektrum może być użyteczna w produkcji innych stereoizomerów monatyny.
P r z y k ł a d 2
Konwersja indolo-3-mleczanu w indolo-3-pirogronian
Jak przedstawiono na Figurach 1 i 3 do wytwarzania indolo-3-pirogronianu można wykorzystywać kwas indolo-3-mlekowy. Konwersja kwas mlekowy - pirogronian jest reakcją odwracalną, podobnie jak konwersja indolo-3-pirogronian indolo-3-mleczan. Zazwyczaj mierzy się utlenianie indolomleczanu ze względu na wysokie tło przy długości fali 340 nm pochodzące od indolo-3-pirogronianu.
Standardowa mieszanina reakcyjna zawierała 100 mM fosforan potasu, pH 8,0, 0,3 mM NAD+, 7 jednostek dehydrogenazy mleczanowej (LDH) (Sigma-L2395, St. Louis, MO) i 2 mM substrat w 0,1 ml. Oznaczenia przeprowadzano w dwóch powtórzeniach w przejrzystej dla promieniowania UV płytce do mikromiareczkowania przy użyciu czytnika płytek Molecular Devices SpectraMax Plus. Polipeptyd i bufor mieszano i przenoszono do studzienek zawierających kwas indolo-3-mlekowy i NAD+ i po krótkim mieszaniu co 9 sekund mierzono absorpcję przy długości fali 340 nm. Reakcję prowadzono przez 5 minut w temperaturze 25°C. Wzrost absorpcji przy długości fali 340 nm odpowiada wytwarzaniu NADH z NAD+. Przeprowadzono niezależne pomiary kontrolne bez NAD+ i bez substratu. D-LDH z Leuconostoc mesenteroides (Sigma, numer katalogowy L2395) wydawała się wykazywać wyższą aktywność wobec substratów będących pochodnymi indolowymi niż L-LDH z Bacillus stearothermophilus (Sigma, numer katalogowy L5275).
Podobne metody wykorzystano z kwasem D-mlekowym i NAD+ lub NADH i pirogronianem, naturalnymi substratami plipeptydów D-LDH. Vmax dla redukcji pirogronianu była 100-1000-krotnie wyższa niż Vmax utleniania mleczanu. Vmax reakcji utleniania indolo-3-pirogronianu przez D-LDH była około 5 razy niższa od tej dla kwasu mlekowego. Obecność indolo-3-pirogronianu oznaczano również mierząc zmiany absorpcji przy długości fali 327 (pochodna enolo-boranowa) używając 50 mM buforu boranu sodowego zawierającego 0,5 mM EDTA i 0,5 mM arsenian sodowy. Zarówno dla polipeptydów L jak i D-LDH obserwowano małe, ale powtarzalne zmiany w absorpcji w porównaniu z kontrolami negatywnymi.
Ponadto dehydrogenazy mleczanowe o szerokim spektrum (enzymy o aktywności związanej z EC 1.1.1.27, EC 1.1.1.28 i/lub EC 1.1.2.3) można klonować i wykorzystywać do wytwarzania indolo-3-pirogronianu z kwasu indolo-3-mlekowego. Źródłami dehydrogenaz o szerokiej specyficzności mogą być E. coli, Neisseria gonorrhoeae i Lactobacillus plantarum.
Alternatywnie, indolo-3-pirogronian można wytwarzać przez poddawanie indolo-3-mleczanu działaniu ekstraktów komórkowych z Clostridium sporogenes, które zawierają dehydrogenazę indolomleczanową (EC 1.1.1.110); ekstraktów komórkowych Trypanosoma cruzi epimastogotes, które zawierają dehydrogenazę p-hydroksyfenylomleczanową (EC 1.1.1.222), o której wiadomo, że wykazuje aktywność wobec indolo-3-pirogronianu; lub ekstraktów komórkowych Pseudomonas acidovorans lub E. coli, które zawierają dehydrogenazę imidazol-5-ilomleczanową (EC 1.1.1.111); Coleus blumei, które zawierają reduktazę hydroksyfenylopirogronianową (EC 1.1.237); lub Candida maltosa, które zawierają dehydrogenazę D-aromatyczno mleczanową (EC 1.1.1.222). Pozycje literaturowe opisujące
PL 208 998 B1 te aktywności obejmują: Nowicki i in. (FEMS Microbiol Lett 71: 119-24, 1992), Jean i DeMoss (Canadian J. Microbiol. 14 1968), Coote i Hassall [Biochem. J. 111: 237-9, 1969), Cortese i in. (CR. Seances Soc. Biol. Fil. 162: 390-5, 1968), Petersen i Alfermann (Z. Naturforsch. C: Biosci. 43: 501-4, 1988) i Bhatnagar i in. (J. Gen. Microbiol 135: 353-60, 1989). Dodatkowo, oksydazę mleczanową, taką jak ta pochodząca z Pseudomonas sp. (Gu i in. J. Mol. Catalysis B: Enzymatic: 18: 299-305, 2002) można wykorzystywać do utleniania indolo-3-mleczanu do indolo-3-pirogronianu.
P r z y k ł a d 3
Konwersja L-tryptofanu w indolo-3-pirogronian przy użyciu oksydazy L-aminokwasowej
Przykład ten opisuje metody wykorzystywane do przekształcania tryptofanu w indolo-3-pirogronian za pomocą oksydazy (EC 1.4.3.2), jako alternatywę dla wykorzystywania aminotransferaz tryptofanowych opisanego w Przykładzie 1. Oksydazę L-aminokwasową oczyszczono z Crotalus durissus (Sigma, St. Louis, MO, numer katalogowy A-2805). Numery dostępu oksydaz L-aminokwasowych do klonowania obejmują: CAD21325.1, AAL14831, NP_490275, BAB78253, A38314, CAB71136, JE0266, T08202, S48644, CAC00499, P56742, P81383, 093364, P81382, P81375, S62692, P23623, AAD45200, AAC32267, CAA88452, AP003600 i Z48565.
Reakcje prowadzono w probówkach mikrowirówkowych w objętości całkowitej 1 ml, inkubując je z wytrząsaniem przez 10 minut w temperaturze 37°C. Mieszanina reakcyjna zawierała 5 mM L-tryptofan, 100 mM bufor z fosforanu sodowego pH 6,6, 0,5 mM arenian sodowy, 0,5 mM EDTA, 25 mM tetraboran sodowy, 0,016 mg katalazy (83 jednostki, Sigma C-3515), 0,008 mg FAD (Sigma) i 0,005-0,125 jednostek oksydazy L-aminokwasowej. Kontrole negatywne zawierały wszystkie składniki z wyjątkiem tryptofanu, a ślepa próba zawierała wszystkie składniki z wyjątkiem oksydazy. Katalaza służyła do usuwania nadtlenku wodoru tworzonego podczas oksydacyjnej deaminacji. Tetraboran sodowy i arsenian wykorzystywano do stabilizacji enolo-boranowej formy indolo-3-pirogronianu, która wykazuje maksimum absorpcji przy długości 327 nm. Standardy indolo-3-pirogronianu przygotowano w stężeniach 0,1-1 mM w mieszaninie reakcyjnej.
Zakupiona oksydaza L-aminokwasowa wykazywała aktywność właściwą 540 μg wytworzonego indolo-3-pirogronianu na minutę na miligram białka. Jest to ten sam rząd wielkości jak dla aktywności właściwych aminotransferaz tryptofanowych.
P r z y k ł a d 4
Konwersja indolo-3-pirogronianu w kwas 2-hydroksy-2-(indol-3-ilometylo)-4-ketoglutarowy za pomocą aldolazy
Przykład ten opisuje metody, które można wykorzystywać do konwersji indolo-3-pirogronianu w kwas 2-hydroksy-2-(indol-3-ilometylo)-4-ketoglutarowy, prekursor monatyny (MP) przy użyciu aldolazy (liazy) (Fig 2). Kondensacje aldolowe to reakcje tworzące wiązania węgiel-węgiel pomiędzy węglem β aldehydu lub ketonu i węglem karbonylowym innego aldehydu lub ketonu. Na węglu sąsiadującym z grupą karbonylową jednego substratu powstaje karboanion, który służy jako nukleofil atakujący węgiel karbonylowy drugiego substratu (węgiel elektrofilowy). Najczęściej substratem elektrofilowym jest aldehyd, więc większość aldolaz należy do kategorii EC 4.1.2. Dość często substratem nukleofilowym jest pirogronian. Rzadziej aldolazy katalizują kondensację pomiędzy dwoma ketokwasami lub dwoma aldehydami.
Jednakże zidentyfikowano aldolazy katalizujące kondensację dwóch kwasów karboksylowych. Na przykład europejski opis patentowy numer 1045-029 opisuje wytwarzanie kwasu L-4-hydroksy-2-ketoglutarowego z kwasu glioksalowego i pirogronianu przy użyciu hodowli Pseudomonas (EC 4.1.3.16). Ponadto, aldolaza 4-hydroksy-4-metylo-2-oksoglutaranowa (pirogroniano-liaza 4-hydroksy-4-metylo-2-oksoglutaranu, EC 4.1.3.17) może katalizować kondensację dwóch ketokwasów. Dlatego podobne polipeptydy aldolaz zastosowano do katalizowania kondensacji indolo-3-pirogronianu z pirogronianem.
Klonowanie
Pirogroniano-liazy 4-hydroksy-4-metyl-2-oksoglutaranu (aldolaza ProA, EC 4.1.3.17) i glioksylano-liaza 4-hydroksy-2-oksoglutaranu (aldolaza KHG, EC 4.1.3.16) katalizują reakcje bardzo podobne do reakcji aldolazy przedstawionej na Fig. 2. Zaprojektowano startery z końcami kompatybilnymi z wektorem pET30 Xa/LIC (Novagen, Madison, WI). Zostały one opisane powyżej w Przykładzie 1.
Do klonowania w pET30 Xa/LIC zaprojektowano następujące startery:
1. Gen proA Pseudomonas straminea (numer dostępu w Genbank: 12964663 wersja 12964663) i gen proA Comamonas testosteroi (sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 65-66, odpowiednio sekwencje nukleotydowa i aminokwasowa): starter w kierunku do przodu 5'-GGTA28
PL 208 998 B1
TTGAGGGTCGCATGTACGAACTGGGAGTTGT-3' i starter odwrotny 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTAGTCAATATATTTCAGGC-3' (sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 55 i 56).
2. Gen SMc00502 Sinorhizobium meliloti 1021 (homologiczny z proA, numery dostępu w Genbank: 15074579 i CAC46344, odpowiednio sekwencje nukleotydowa i aminokwasowa): starter w kierunku do przodu 5'-GGTATTGAGGGTCCATGAGCGTGGTTCACCGGAA-3' i starter odwrotny 5'AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAATCGATATATTTCAGTC-3' (sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 61 i 62).
3. Gen fldZ Sphingomonas sp. LB126 (numer dostępu w Genbank: 7573247 wersja 7573247, kodujący przypuszczalną transferazę acylową): starter w kierunku do przodu 5'-GGTATTGAGGGTCGCATGTCCGGCATCGTTGTCCA-3' i starter odwrotny 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCA-GACATATTTCAGTCCCA-3' (sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 57 i 58).
4. Gen pcmE Arthrobacter keyseri (numer dostępu w Genbank: AF331043 wersja AF331043.1, kodujący aldolazę szczawianocytrynianojabłczanową): starter w kierunku do przodu 5'-GGTATTGAGGGTCGCATGCGACTGAACAACCTCGG-3' i starter odwrotny 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGTTCTCCACGTATTCCA-3' (sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 59 i 60).
5. Gen YPO0082 Yersinia pestis szczep CO92 (numer dostępu w Genbank: 15978115 wersja 15978115 kodujący przypuszczalną transferazę): starter w kierunku do przodu 5'-GGTATTGAGGGTCGCATGAGCCTGGTTAATATGAA-3' i starter odwrotny 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTATGACTTTAACGCGTTGA-3' (sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 63 i 64).
6. Gen khg Bacillus subtilis (numery dostępu w Genbank: Z99115.1 GI:2634478, 126711-127301 i CAB14127.1, odpowiednio sekwencje nukleotydowa i aminokwasowa): starter w kierunku do przodu 5'-GGTATTGAGGGTCGCATGGAGTCCAAAGTCGTTGA-3' i starter odwrotny 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACACTTGGAAAACAGCCT-3' (sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 35 i 36).
7. Gen khg E. coli (numery dostępu w Genbank: AE000279.1 1331-1972 i AAC74920.1, odpowiednio sekwencje nukleotydowa i aminokwasowa): starter w kierunku do przodu 5'-GGTATTGAGGGTCGCATGAAAAACTGGAAAACAAG-3' i starter odwrotny 5'-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACAGCTTAGCGCCTTCTA-3' (sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 37 i 38).
8. Gen khg S. meliloti (numery dostępu w Genbank: AL591792.1 GI:15075850, 65353-64673 i CAC47463.1, odpowiednio sekwencje nukleotydowa i aminokwasowa): starter w kierunku do przodu 5'-GGTATTGAGGGTCGCATGCGAGGGGCATTATTCAA-3' i starter odwrotny 5'-AGA-GGAGAGTTAGAGCCTCAGCCCTTGAGCGCGAAG-3' (sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 39 i 40).
DNA genomowe organizmów opisanych powyżej w punktach 1-2 i 6-8 oczyszczono wykorzystując protokół Qiagen Genomic-tip. W podobny sposób można oczyszczać genomowe DNA organizmów opisanych w punktach 3-5.
Pseudomonas straminea (ATCC 33636) hodowano w temperaturze 30°C w bulionie odżywczym z hydroksybenzoesanem. Comamonas testosteroni (ATCC 49249) hodowano w temperaturze 26°C w bulionie odżywczym z hydroksybenzoesanem. Sphingomonas sp. LB126 (Flemish Institute for Technological Research, VITO, B-2400 Mol, Belgia) hodowano według metody opisanej przez Wattiau i in. (Research in Microbiol. 152: 861-72, 2001). Arthrobacter keyseri (Gulf Ecology Division, National Health and Environmental Effects Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, Gulf Breeze FL 32561, USA) hoduje się według protokołu opisanego przez Eaton (J. Bacteriol. 183: 36893703, 2001). Sinorhizobium meliloti 1021 (ATCC 51124) hodowano w temperaturze 26°C w podłożu ATCC TY i podłożu hydroksybenzoesanowym. Szczep CO92 Yersinia pestis (ATCC) hodowano w temperaturze 26°C w podłożu ATCC 739, agar z końską krwią. Bacillus subtilis 6051 (ATCC) hodowano w temperaturze 30°C w podłożu Bereto (Difco, Detroit, MI). Genomowe DNA E. coli izolowano ze szczepu DH10B (Invitrogen) jak opisano w Przykładzie 1.
Protokoły PCR, klonowania i selekcji opisane w Przykładzie 1 stosowano również do klonowania sekwencji proA C. testosteroni i S.meliloti, jak również sekwencji khg E. coli, B. subtilis i S. meliloti. Te same metody można stosować do klonowania innych sekwencji opisanych powyżej.
Pozytywne klony zsekwencjonowano za pomocą sekwencjonowania metodą terminacji łańcucha dideoksynukleotydami (Seqwright, Houston, TX) przy użyciu starterów S-tag i T7 terminator (Novagen) i starterów wewnętrznych z Integrated DNA technologies, Inc. (Coralville, IA).
PL 208 998 B1
Ekspresja i oznaczenia aktywności
Plazmidowe DNA (zweryfikowane przez analizę sekwencyjną) subklonowano do gospodarza ekspresyjnego BL21(DE3) (Novagen). Kultury hodowano w podłożu LB z 50 mg/l kanamycyny, izolowano plazmidy przy użyciu zestawu Qiagen spin plasmid miniprep, a następnie analizowano porzez trawienie enzymami restrykcyjnymi dla potwierdzenia identyczności. Eksperymenty z indukcją prowadzono na konstruktach w BL21(DE3) hodowanych w podłożu LB zawierającym 50 mg/l kanamycyny w temperaturze 37°C. Ekspresję białka indukowano używając 0,1 mM IPTG, gdy OD600 osiągało około 0,6. Komórki hodowano przez 4 godziny w temperaturze 30°C i zbierano poprzez wirowanie. Następnie komórki poddawano lizie przy użyciu odczynnika Bugbuster™ (Novagen) i rekombinowane białka ze znacznikiem His oczyszczano przy użyciu kolumienek His-Bind, jak opisano wyżej (Przykład 1). Oczyszczone białka odsalano na jednorazowych kolumnach PD-10 i eluowano buforem 50 mM TrisHCl, pH 7,3 z 2 mM MgCl2.
Białka analizowano przez SDS-PAGE w żelach gradientowych 4-15%, aby ustalić poziom rozpuszczalnego białka o masie cząsteczkowej przewidywanej dla rekombinowanego białka fuzyjnego.
Aktywność białek oznaczano używając indolo-3-pirogronianu i pirogronianu sodowego jako substratów. Mieszanina reakcyjna zawierała 100 mM Tris-HCl (pH 7 - pH 8,9), 0-8 mM MgCl2, mM fosforan potasowy (pH 8) i 6 mM stężenie każdego z substratów w 1 ml. Reakcję rozpoczynano dodając różne ilości polipeptydu (na przykład od 10 do 100 μg), inkubowano w temperaturze 25-37°C przez 30 minut, filtrowano i zamrażano w -80°C.
Wyniki oznaczeń aktywności produktów genu proA
Zarówno konstrukty z genem proA C. testosteroni jak i SMc00502 S. meliloti wykazywały wysokie poziomy ekspresji po indukcji IPTG. Jak wykazała analiza całkowitego białka oraz ekstraktów komórkowych w SDS-PAGE rekombinowane białka były wysoce rozpuszczalne. Produkt genu C. testosteroni został wyizolowany z czystością >95%. Ponieważ ilość produktu genu S. meliloti po oczyszczaniu na kolumience His-Bind była bardzo niewielka, do oznaczeń aktywności enzymatycznej użyto ekstraktu komórkowego.
Obie rekombinowane aldolazy katalizowały tworzenie MP z indolo-3-pirogronianu i pirogronianu. Do aktywności enzymatycznej potrzebne były zarówno diwalentny magnez jak i fosforan potasowy. Gdy brakowało indolo-3-pirogronianu, pirogronianu lub fosforanu potasowego nie wykrywano produktu. Również w nieobecności enzymu powstawała niewielka ilość produktu (zazwyczaj jeden rząd wielkości mniejsza niż w obecności enzymu).
Szczyt produktu eluował z kolumny odwrotnej fazy C18 nieco później niż standard indolo-3-pirogronianu. Spektrum masowe tego szczytu wykazywało indukowany przez kolizję rodzicielski jon ([M+H]+) o wartości 292.1, jon rodzicielski spodziewany dla produktu MP. Główne fragmenty pochodne obecne w spektrum masowym obejmują te o m/z=158 1H-indolo-3-karbaldehydowy jon karboniowy), 168 (3-buta-1,3-dienylo-1H-indolowy jon karboniowy), 274 (292 -H2O), 256 (292 - 2 H2O), 238 (292 - 3 H2O), 228 (292 - CH4O3) i 204 (utrata pirogronianu). Produkt wykazywał również charakterystykę widma UV taką jak inne związki zawierające indol, takie jak tryptofan, z Xmax 279-280 i małym ramieniem przy około 290 nm.
Ilość MP wytwarzanego przez aldolazę C. testosteroni rosła wraz ze wzrostem temperatury reakcji od temperatury pokojowej do 37°C oraz ze wzrostem ilości substratu i ilości magnezu. Aktywność syntetyczna enzymu malała wraz ze wzrostem pH, maksymalą ilość produktu otrzymywano w pH 7. Według tryptofanu jako standardu, ilość MP tworzonego w standardowym oznaczeniu przy użyciu 20 μg oczyszczonego białka wynosiła około 10-40 μg na jeden ml mieszaniny reakcyjnej.
Ze względu na wysoki poziom homologii sekwencji kodujących aldolazę ProA w S. meliloti i C. testosteroni z innymi genami opisanymi powyżej należy się spodziewać, że wszystkie rekombinowane produkty genów mogą katalizować tę reakcję. Ponadto można się spodziewać, że wszystkie aldolazy, które mają treoninę (T) w pozycjach 59 i 87, argininę (R) w pozycji 119, asparaginian (D) w pozycji 120 i histydynę (H) w pozycjach 31 i 71 (według numeracji dla C. testosteroni) będą wykazywać podobną aktywność.
Wyniki oznaczeń aktywności dla poduktów genu khg
Zarówno konstrukt genu khg z B. subtilis jak i z E. coli wykazują wysokie poziomy ekspresji białka po indukcji IPTG, podczas kiedy khg S. meliloti wykazuje niski poziom ekspresji. Sądząc z analizy całkowitego białka oraz ekstraktów komórkowych w SDS-PAGE rekombinowane białka są wysoce rozpuszczalne. Produkty genu khg B. subtilis i E. coli wyizolowano z czystością >95%; wydaj30
PL 208 998 B1 ność oczyszczania przez powinowactwo produktu genu z S. meliloti na kolumience His-Bind nie była równie wysoka.
Nie ma dowodów, że do aktywności tego enzymu konieczne są magnez i fosforan. Jednakże, dane literaturowe opisują oznaczenia wykonane w buforze fosforanowym i zauważono, że enzym jest bifunkcjonalny i wykazuje aktywność wobec ufosforylowanych substratów, takich jak 2-keto-3-deoksy-6-fosfoglukonian (KDPG). Oznaczenia enzymatyczne prowadzono, tak jak opisano powyżej i w niektórych wypadkach pominięto fosforan. Wyniki wskazują, że rekombinowane aldolazy KHG wytwarzały MP, ale nie były tak aktywne jak aldolazy ProA. W niektórych wypadkach poziom MP wytwarzanego przez KHG był niemal identyczny, jak ilości wytwarzane w obecności samego magnezu i fosforanu. Fosforan nie wydawał się zwiększać aktywności KHG. Według SRM enzym z Bacillus wykazywał najwyższą aktywność, około 20-25% wyższą niż magnez i fosforan osobno (patrz Przykład 10). Enzym z Sinorhizobium wykazywał najniższą aktywność, co może być związane z problemami z fałdowaniem i rozpuszczalnością zauważonymi podczas ekspresji. Wszystkie trzy enzymy mają kwas glutaminowy w miejscu aktywnym (pozycja 43 według numeracji białka B. subtilis), jak również lizynę konieczną do utworzenia zasady Shiffa z pirogronianem (pozycja 130); jednakże enzym z B. subtilis ma w pozycji 47, miejscu aktywnym, treoninę a nie argininę. KHG B. subtilis jest mniejszy i wydaje się tworzyć zgrupowanie z innymi enzymami posiadającymi treoninę w miejscu aktywnym, a nie z enzymami z S. meliloti i E. coli. Różnice w miejscu aktywnym mogą być przyczyną większej aktywności enzymu z B. subtilis.
Poprawa aktywności aldolazy
Katalityczne przeciwciała mogą być równie wydajne co naturalne aldolazy, akceptują szerokie spektrum substratów i mogą być wykorzystywane do katalizowania reakcji przedstawionej na Fig. 2.
Aldolazy można również ulepszać na drodze ukierunkowanej ewolucji, tak jak to zostało opisane dla aldolazy KDPG (wysoce homologicznej z opisaną powyżej KHG) poddanej ewolucji za pomocą tasowania DNA i PCR podatnego na błędy, w celu wyeliminowania zależności od fosforanu i odwrócenia selektywności wobec enancjomerów. Polipeptydy aldolazy KDPG są użyteczne w reakcjach biochemicznych ponieważ są wysoce specyficzne wobec substratu-donora (w tym przypadku pirogronianu), ale względnie elastyczne jeśli chodzi o substrat-akceptor (tj. indolo-3-pirogronian) (Keller i Wong, Nature 409: 232-9, 2001). Aldolaza KHG posiada aktywność kondensacji pirogronianu z wieloma kwasami karboksylowymi. Uważa się, że ssacze wersje aldolaz KHG mają szerszą specyficzność niż enzymy bakteryjne, w tym wyższą aktywność wobec 4-hydroksy-4-metylo-2-oksoglutaranu i tolerowanie obu stereoizomerów 4-hydroksy-2-keto-glutaranu. Enzymy bakteryjne wydają się wykazywać 10-krotną preferencję dla izomeru R. W bazach danych genomowych znajduje się niemal 100 homologów KHG, a aktywność wykazano u Pseudomonas, Paracoccus, Providencia, Sinorhizobium, Morganella, E. coli i w tkankach ssaków. Enzymy te można wykorzystać jako punkt wyjściowy do modyfikacji specyficzności wobec enancjomerów pożądanej do wytwarzania monatyny.
Aldolazy wykorzystujące pirogronian i inny substrat, który jest ketokwasem i/lub ma dużą grupę hydrofobową, jak indol, mogą zostać poddane „ewolucji, aby polepszyć specyficzność polipeptydu, prędkość i selektywność. Poza zaprezentowanymi tu aldolazami KHG i ProA, przykłady takich enzymów obejmują, choć nie ograniczają się do: aldolazy KDPG i polipeptydów pokrewnych (KDPH), hydratazy-aldolazy transkarboksybenzalopirogronianowej z Nocardioides st, aldolazy 4-(2-karboksyfenylo)-2-oksobut-3-enianowej (aldolazy 2'-karboksybenzalopirogronianowej), która prowadzi kondensację pirogronianu i 2-karboksybenzaldehydu (substratu zawierającego pierścień aromatyczny); hydratazy-aldolazy trans-O-hydroksybenzylidenopirogronianowej z Pseudomonas putida i Sphingomonas aromaticovorans, która jako substraty wykorzystuje również pirogronian i aldehyd zawierający grupę aromatyczną; aldolazy 3-hydroksyasparaginianowej (glioksylano-liazy erytro-3-hydroksy-L-asparaginianowej), która wykorzystuje jako substraty 2-oksokwasy i występuje przypuszczalnie u Micrococcus denitrificans; aldolazy benzoinowej (liazy benzaldehydowej), która wykorzystuje substraty zawierające grupy benzylowe; aldolazy dihydroneopterynowej; benzaldehydo-liazy L-treo-3-fenyloserynowej (aldolazy fenyloserynowej), która prowadzi kondensację glicyny z benzaldehydem; aldolazy 4-hyroksy-2-oksywalerianowej, aldolazy 1,2-dihydroksybenzylopirogronianowej i aldolazy 2-hydroksybenzylo-pirogronianowej.
Polipeptyd o pożądanej aktywności można wyselekcjonować przez przeszukiwanie badanych klonów za pomocą poniższych metod. Auksotrofy tryptofanowe transformuje się wektorami niosącymi badane klony w kasecie ekspresyjnej i hoduje się je w podłożu zawierającym małe ilości monatyny lub MP. Ponieważ reakcje katalizowane przez aminotransferazy i aldolazy są odwracalne, komórki są
PL 208 998 B1 zdolne do wytwarzania tryptofanu z mieszaniny racemicznej monatyny. Podobnie, organizmy (zarówno rekombinowane jak i typu dzikiego) można selekcjonować na podstawie zdolności do wykorzystania MP lub monatyny jako źródła węgla i energii. Jednym ze źródeł aldolaz są biblioteki ekspresyjne różnych szczepów Pseudomonas i Rhizobacterium. Bakterie rodzaju Pseudomonas wykazują wiele niezwykłych szlaków katabolicznych służących degradacji związków aromatycznych, a także zawierają wiele aldolaz, podczas gdy bakterie rodzaju Rhizobium zawierają aldolazy, rozwijają się w ryzosferach roślin i posiadają wiele genów opisanych przy konstruowaniu szlaku biosyntetycznego monatyny.
P r z y k ł a d 5
Chemiczna synteza prekursora monatyny
Przykład 4 opisywał metodę wykorzystania aldolazy do konwersji indolo-3-pirogronianu w kwas 2-hydroksy-2-(indol-3-ilometylo)-4-ketoglutarowy, prekursora monatyny (MP). Ten przykład opisuje alternatywną metodę chemicznej syntezy MP.
MP powstaje przy wykorzystaniu typowej reakcji kondensacji typu aldolowego (Fig. 4). W skrócie, typowa reakcja typu aldolowego obejmuje wytworzenie karbanionu estru pirogronianowego przy użyciu silnej zasady, takiej jak LDA (diizopropyloamidu litowego), heksametylodisilazanu litowego lub butylu litowego. Wytworzony karbanion reaguje z indolo-pirogronianem tworząc sprzęgnięty produkt.
Grupy blokujące, które mogą zostać wykorzystane do ochrony azotu indolu obejmują, choć nie są ograniczone do grupy: t-butyloksykarbonylowej (Boc) i benzyloksykarbonylowej (Cbz). Grupy blokujące kwas karboksylowy obejmują, choć nie są ograniczone do: estrów alkilowych (na przykład estrów metylowych, etylowych, benzylowych). Gdy wykorzystuje się takie grupy zabezpieczające, nie można kontrolować stereochemii tworzonego produktu. Jednakże, gdy R2 i/lub R3 są chiralnymi grupami zabezpieczającymi (Fig. 4), takimi jak (S)-2-butanol, mentol lub chiralna amina, może to faworyzować powstawanie jednego z enancjomerów MP w stosunku do drugiego.
P r z y k ł a d 6
Konwersja tryptofanu lub indolo-3-pirogronianu w monatynę
Proces in vitro wykorzystujący dwa enzymy, aminotransferazę i aldolazę, wytwarza monatynę z tryptofanu i pirogronianu. W pierwszym etapie alfa-ketoglutaran służy jako akceptor grupy aminowej z tryptofanu w reakcji transaminacji tworzącej indolo-3-pirogronian i glutaminian. Aldolaza katalizuje drugą reakcję, w której pirogronian reaguje z indolo-3-pirogronianem w obecności Mg2+ i fosforanu, tworząc alfa-keto pochodną monatyny (MP), kwas 2-hydroksy-2-(indol-3-ilo-metylo)-4-ketoglutarowy. Przeniesienie grupy aminowej z glutaminianu powstałego w pierwszej reakcji tworzy pożądany produkt, monatynę. Dzięki oczyszczeniu i charakteryzacji produktu ustalono, że wytworzony izomer to S,S-monatyna. Opisane zostały alternatywne substraty, enzymy i warunki, jak również ulepszenia poczynione w tym procesie.
Enzymy
Aldolazę, pirogroniano-liazę 4-hydroksy-4-metylo-2-oksyglutaranu (aldolaza ProA, gen proA) (EC 4.1.3.17) z Comamonas testosteroni sklonowano, przeprowadzano jej ekspresję i oczyszczono, jak opisano w Przykładzie 4. Glioksylano-liazy 4-hydroksy-2-oksyglutaranu (aldolazy KHG) (EC 4.1.3.16) z B. subtilis, E. coli i S. meliloti sklonowano, przeprowadzono ich ekspresję i oczyszczono, tak jak opisano w Przykładzie 4.
Aminotransferazy użyte wraz z aldolazami do wytwarzania monatyny to aminotransferaza L-asparaginianowa kodowana przez gen aspC E. coli, aminotransferaza tyrozynowa kodowana przez gen tyrB E. coli, enzym TatA S. meliloti, aminotransferaza o szerokim spektrum substratowym kodowana przez gen bsat L. major oraz transaminaza glutaminianowo-szczawiooctowa ze świńskiego serca (Typ Ila). Klonowanie, ekspresję i oczyszczanie nie-ssaczych białek opisano w Przykładzie 1. Transaminazę glutamininowo-szczawiooctową z serca świni (typ Ila) uzyskano z Sigmy (nr kat. G7005).
Metoda stosowania aldolazy ProA i aminotransferazy L-asparaginianowej
Mieszanina reakcyjna zawierała 50 mM octan amonowy, pH 8,0, 4 mM MgCl2, 3 mM fosforan potasowy, 0,05 mM fosforan pirydoksalu, 100 mM pirogronian amonowy, 50 mM tryptofan, 10 mM alfa-ketoglutaran, 160 mg rekombinowanej aldolazy ProA C. testosteroni (nieoczyszczony ekstrakt komórkowy, ~30% aldolazy), 233 mg rekombinowanej aminotransferazy L-asparaginianowej E. coli (nieoczyszczony ekstrakt komórkowy, ~40% aminotransferazy) w jednym litrze. Wszystkie składniki z wyjątkiem enzymów zmieszano razem i inkubowano w temperaturze 30°C aż do rozpuszczenia tryptofanu. Następnie dodano enzymy i roztwór reakcyjny inkubowano w temperaturze 30°C z łagodnym wytrząsaniem (100 obrotów na minutę) przez 3,5 godziny. W 0,5 i 1 godzinie po dodaniu enzymów dodawano do reakcji tryptofan w formie stałej (za każdym razem 50 milimoli). Nie cały do32
PL 208 998 B1 dany tryptofan rozpuścił się, ale stężenie utrzymywano na poziomie 50 mM lub wyższym. Po 3,5 godzinach odfiltrowano nierozpuszczony tryptofan. Analiza mieszaniny reakcyjnej przy użyciu LC/MS przy wykorzystaniu zdefiniowanej ilości tryptofanu jako standardu wykazała, że stężenie tryptofanu w roztworze wynosiło 60,5 mM, a stężenie monatyny 5,81 mM (1,05 g).
Do oczyszczenia produktu finalnego wykorzystano następujące metody. 90% klarownego roztworu nałożono na kolumnę ze złożem AG50W-X8 BioRad (225 ml, pojemność wiązania 1,7 meq/ml). Kolumnę przemyto wodą, zbierając 300 ml frakcje, aż absorpcja przy długości fali 280 nm wynosiła <5% pierwszej frakcji. Następnie kolumnę eluowano 1 M octanem amonowym, pH 8,4 zbierając 4 frakcje 300 ml. Wszystkie 4 frakcje zawierały monatynę i zostały zagęszczone do 105 ml przez odparowanie, przy użyciu wyparki rotacyjnej w łaźni z ciepłą wodą. Podczas zmniejszania się objętości powstawał precypitat, który został odfiltrowany w trakcie procesu odparowywania.
Analiza frakcji z kolumny przy użyciu LC/MS wykazała, że 99% tryptofanu i monatyny związało się z kolumną. Precypitat wytworzony podczas procesu odparowania zawierał >97% tryptofanu i <2% monatyny. Proporcja tryptofanu do produktu w supernatancie wynosiła około 2:1.
Supernatant (7 ml) nałożono na kolumnę ze 100 ml złoża Fast Flow DEAE Sepharose (Amersham Biosciences) uprzednio przekształconego do formy octanowej przez przemycie 0,5 litra 1 M NaOH, 0,2 litra wody, 1,0 litrem 1,0 M octanu amonu, pH 8,4 i 0,5 litra wody. Supernatant nakładano przy szybkości przepływu <2 ml/min i kolumnę przemywano wodą przy przepływie 3-4 ml/min aż absorpcja przy długości fali 280 nm wynosiła ~0. Monatynę eluowano 100 mM octanem amonowym, pH 8,4 zbierając 4 frakcje o objętości 100 ml.
Analiza frakcji wykazała, że stosunek tryptofanu do monatyny we frakcjach przesączu wynosił 85:15, a we frakcjach eluatu 7:93. Zakładając, że współczynnik ekstynkcji monatyny przy długości fali 280 nm jest taki sam jak tryptofanu, frakcje eluatu zawierały 0,146 milimola produktu.
Ekstrapolacja do całego 1 litra mieszaniny reakcyjnej daje ~2,4 milimola (-710 mg) monatyny, przy wydajności 68%.
Frakcje eluatu z kolumny DEAE Sepharose odparowano do <20 ml. Próbkę produktu oczyszczano dalej nakładając na preparatywną kolumnę odwrotnej fazy C8 wykorzystując te same warunki chromatografii, jak te opisane w Przykładzie 10 do charakteryzacji monatyny w skali analitycznej. Oprogramowanie Waters Fractionlynx™ zostało wykorzystane do włączania automatycznego zbierania frakcji zawierających monatynę w oparciu o wykrycie jonu m/z = 293. Frakcję z kolumny C8 zawierającą odpowiedni uprotonowany jon cząsteczkowy monatyny zebrano, odparowano całkowicie i rozpuszczono w małej objętości wody. Frakcję tę wykorzystano do charakteryzacji produktu.
Powstały produkt charakteryzowano przy użyciu następujących metod.
Spektroskopia w zakresie UV/widzialnym.
Pomiary spektrofotometryczne monatyny wytworzonej enzymatycznie w zakresie UV/widzialnym prowadzono przy użyciu spektrofotometru Cary 100 Bio UV/visible. Oczyszczony produkt wykazywał maksimum absorpcji przy długości fali 280 nm z ramieniem przy 288 nm, charakterystyczne dla związków zawierających indol.
Analiza LC/MS. Analizę mieszanin zawierających monatynę, a pochodzących z biochemicznych reakcji in vitro prowadzono, tak jak opisano w Przykładzie 10. Typową analizę LC/MS monatyny w mieszaninie syntezy enzymatycznej in vitro przedstawia Fig 5. Dolna część Fig. 5 przedstawia chromatogram wybranego jonu odpowiadającego uprotonowanemu jonowi cząsteczkowemu monatyny przy m/z = 293.
Ta identyfikacja monatyny w mieszaninie została potwierdzona przez spektrum masowe przedstawione na Fig. 6. Analiza oczyszczonego produktu przy użyciu LC/MS wykazuje pojedynczy szczyt dla jonu cząsteczkowego 293 i absorpcji przy długości fali 280 nm. Spektrum masowe było identyczne z tym przedstawionym na Fig. 6.
Analiza MS/MS. Jak opisano w Przykładzie 10 na monatynie prowadzono również eksperymenty techniką LC/MS/MS. Spektrum masowe jonów rozpadowych monatyny przedstawiono na Fig. 7. Dokonano wstępnego przypisania struktur wszystkim jonom rozpadowym oznaczonym na Fig. 7. Dotyczy to jonów rozpadowych o m/z = 275 (293 - H2O), 257 (293 - (2 x H2O)), 230 (275 - COOH), 212 (257 - COOH), 168 (jon karboniowy 3-buta-1,3-dienylo-1H-indolu), 158 (jon karboniowy 1H-indolo-3-karbaldehydu), 144 (jon karboniowy 3-etylo-1H-indolu), 130 (jon karbonowy 3-metyleno-1H-indolu) i 118 (jon karboniowy indolu). Wiele z nich jest identycznych z tymi otrzymanymi dla MP (Przykład 4), czego należy się spodziewać po pochodnych z grupy indolowej. Niektóre są o 1 jednostkę masową cięższe niż te uzyskane dla MP, ze względu na obecność grupy aminowej w miejsce ketonowej.
PL 208 998 B1
Analiza MS o wysokiej rozdzielczości. Fig. 8 przedstawia spektrum masowe uzyskane dla oczyszczonej monatyny przy użyciu hybrydowego spektrometru masowego kwadrupolowego z analizatorem czasu przelotu Applied Biosystems-Perkin Elmer Q-Star. Zmierzona masa uprotonowanej monatyny przy użyciu tryptofanu jako wewnętrznego standardu kalibracyjnego wynosiła 293,1144. Masa uprotonowanej monatyny obliczona w oparciu o skład pierwiastkowy C14H17N2O5 wynosi 293, 1137. Oznacza to błąd w ustaleniu masy mniejszy niż 2 części na milion (ppm), dostaczając ostatecznego dowodu na skład pierwiastkowy monatyny wytworzonej enzymatycznie.
Spektroskopia NMR. Badania NMR przeprowadzono przy użyciu urządzenia Varian Inova 500 MHz. Próbkę monatyny (~3 mg) rozpuszczono w 0,5 ml D2O. Początkowo rozpuszczalnik (D2O) użyto jako wewnętrzną referencję przy 4,78 ppm. Ponieważ szczyt dla wody był duży, NMR 1H prowadzono przy supresji szczytu dla wody. Następnie, ze względu na szerokość szczytu dla wody, jako szczytu odniesienia używano protonu C-2 monatyny, dla którego przyjęto opublikowaną wartość 7,192 ppm.
W przypadku NMR 13C początkowy eksperyment z kilkuset skanami wskazywał, że próbka była zbyt rozcieńczona, by uzyskać odpowiednie spektrum 13C w przydzielonym czasie. Dlatego przeprowadzono eksperyment z heterojądrową wielokrotną spójnością kwantową (HMQC), który umożliwił korelację wodorów i węgli do których były one dołączone, jak również dostarczył informacji o chemicznych przesunięciach węgli.
Podsumowanie danych dotyczących 1H i HMQC przedstawiają Tablice 2 i 3. Porównanie danych NMR z wartościami opublikowanymi wskazuje, że monatyna wytworzona enzymatycznie miała formę (S,S), (R,R), lub była mieszaniną obu.
Chiralna analiza LC/MS. Aby ustalić, czy monatyna wytworzona in vitro była jednym izomerem, czy mieszaniną enancjomerów (R,R) i (S,S) przeprowadzono chiralną analizę LC/MS przy użyciu oprzyrządowania opisanego w Przykładzie 10.
Chiralny rozdział w LC wykonano przy użyciu chiralnej kolumny chromatograficznej Chirobiotic T (Advanced Separation Technology) w temperaturze pokojowej. Rozdział i detekcję oparte na opublikowanych protokołach producenta zoptymalizowano dla izomerów R- (D) i S- (L) tryptofanu. Faza ruchoma LC składała się z A) wody zawierającej 0,05% (obj./obj.) kwas trifluorooctowy; B) metanol zawierający 0,05% (obj./obj.) kwas trifluorooctowy. Elucja była izokratyczna przy 70% A i 30%B. Szybkość przepływu wynosiła 1,0 ml/minutę, a absorpcję PDA monitorowano od długości fali od 200 nm do 400 nm. Parametry sprzętowe użyte do chiralnej analizy LC/MS tryptofanu i monatyny były identyczne z tymi opisanymi w Przykładzie 10 dla analizy LC/MS. Użyto zbioru spektrów masowych dla regionu m/z 150-400. Chromatogramy selekcjonowanych uprotonowanych jonów cząsteczkowych ([M + H]+ = 205 dla R- i S-tryptofanu i [M + H]+ = 293 dla monatyny) umożliwiły bezpośrednią identyfikację tych analitów w mieszaninach.
Chromatogramy R- i S-tryptofanu i monatyny, rozdzielonych w chiralnej chromatografii i monitorowane przy użyciu MS przedstawiono na Fig. 9. Pojedynczy szczyt w chromatogramie monatyny wskazuje, że składnik ten występuje jako pojedynczy izomer o czasie retencji niemal identycznym jak S-tryptofan.
PL 208 998 B1
Cargill Vleggaar i in. 1 Takeshi i in. 2
Atom δΗ J (HH) Hz δH J (HH) Hz δH J (HH) Hz
2 7,192 (1H,s) 7,192 (s) 7,18 (s)
4 7,71(d) 7,99 7,686 (d) 7,9 7,67 (d) 8,0
5 7,104 (dd) 7,99 7,102 (dd) 8,0, 8,0 7,11 (dd) 7,5, 7,5
6 7,178 (dd) * 7,176 dd) 8,0, 8,0 7,17 (dd) 7,5, 7,5
7 7,439 (d) 7,99 7,439 (d) 8,1 7,43 (d) 8,0
10a 3,242(d) 14,5 3,243 (d) 14,3 3,24 (d) 14,5
10b 3,033(d) 14,5 3,051 (d) 14,3 3,05 (d) 14,5
2,626 (dd) 15,5, 1,5 2,651 (dd) 2,006 (dd) 15,3, 1,7 2,62 (dd) 15,5, 1,8 15,5
2,015 (dd) 15,0 12,0 15,3, 11,7 2,01 (dd) 12,0
13 3,571 (dd) 10,75*, 1,5 3,168 (dd) 11,6 1,8 3,57 (dd) 12,0, 1,8
1Vleggaar i in. (J.C.S. Perkin Trans. 1: 3095-8, 1992). 2 Takeshi i Shusuke (JP2002060382, 2002-02-26).
T a b l i c a 3: Dane NMR dla 13C (ze spektrum HMQC)
Cargill Vleggaar i in.1
Atom δc δc
2 126,1 126,03
3 * 110,31
4 120,4 120,46
5 120,2 120,25
6 122,8 122,74
7 112,8 112,79
8 * 137,06
9 * 129,23
10a 36,4 36,53
12 39,5 39,31
13 54,9 54,89
14 * 175,30
15 181,18
1Vleggaar i in. (J.C.S. Perkin Trans. 1: 3095-8, 1992).
Polarymetria. Skręcalność optyczną mierzono na polarymetrze Rudolph Autopol III. Przygotowywano roztwór monatyny w wodzie o stężeniu 14,6 mg/ml. Dla roztworu 1 g/ml spodziewana skrę20 calność specyficzna ([a]D ) w przypadku S,S monatyny wynosi -49,6 (Vleggaar i in.). Obserwowana
[a]D dla oczyszczonej wytworzonej enzymatycznie monatyny wynosiła -28,1, co wskazuje, że jest to izomer S,S.
PL 208 998 B1
Ulepszenia
Zoptymalizowano warunki reakcji, w tym stężenia reagentów i enzymów, co w opisanych poniżej mieszaninach przynosiło wydajność 10 mg/ml:
mM octan amonu pH 8,3, 2 mM MgCl2, 200 mM pirogronian (sól sodowa lub amonowa), 5 mM alfa-ketoglutaran (sól sodowa), 0,05 mM fosforan pirydoksalu, odpowietrzona woda do objętości 1 ml po uwzględnieniu objętości enzymów, 3 mM fosforan potasowy, 50 pg/ml rekombinowanej aldolazy ProA (ekstrakt komórkowy; całkowite stężenie białka 167 pg/ml), 1000 pg/ml aminotransferazy L-asparaginianowej kodowanej przez gen aspC E. coli (ekstrakt komórkowy; całkowite stężenie białka 2500 pg/ml) i tryptofan w formie stałej do stężenia >60 mM (roztwór nasycony; częściowo nierozpuszczony podczas reakcji). Mieszaninę inkubowano w temperaturze 30°C przez 4 godziny z delikatnym mieszaniem.
Zmiany
Stężenie alfaketoglutaranu można obniżyć do 1 mM i uzupełnić 9 mM asparaginianem uzyskując zbliżoną wydajność monatyny. W pierwszym etapie można wykorzystać alternatywne akceptory aminokwasowe takie jak szczawiooctan.
Podobną wydajność monatyny uzyskano stosując w miejsce aminotransferazy L-asparaginianowej E. coli aminotransferazę o szerokim spektrum substratowym z L. major. Jednakże, w analizie LC-MS wykrywano drugi niezidentyfikowany produkt (3-10% głównego produktu) o masie cząsteczkowej 292. Gdy jako aminotransferazy używano enzymu kodowanego przez tyrB E. coli, kodowanego przez tatA S. meliloti lub transaminazy glutaminianowo-szczawiooctowej z serca świni (typ II), uzyskiwano stężenia monatyny 0,1 - 0,5 mg/ml. Gdy reakcję rozpoczyna się od indolo-3-pirogronianu, jako ostatni etap można za pomocą dehydrogenazy glutaminianowej i NADH przeprowadzić redukcyjną aminację (jak w Przykładzie 7).
Do enzymatycznego wytwarzania monatyny używano również aldolaz KGH z B. subtilis, E. coli i S. meliloti wraz z aminotransferazą L-asparaginianową E. coli. Używano następujących warunków reakcji: 50 mM NH4-OAc pH 8,3, 2 mM MgCl2, 200 mM pirogronian, 5 mM glutaminian, 0,05 mM fosforan pirydoksalu, odpowietrzona woda do ostatecznej objętości 0,5 ml, po uwzględnieniu objętości dodawanych enzymów, 3 mM fosforan potasowy, 20 pg/ml rekombinowanej aldolazy KGH B. subtilis (oczyszczonej), około 400 pg/ml aminotransferazy L-asparaginianowej E. coli (AspC) nieoczyszczonej z ekstraktu komórkowego i 12 mM indolo-3-pirogronian. Reakcje inkubowano przez 30 minut w temperaturze 30°C z wytrząsaniem. Ilość monatyny otrzymywanej przy użyciu enzymu z B. subtilis wynosiła 80 ng/ml i wzrastała wraz z rosnącymi ilościami aldolazy. Kiedy indolo-3-pirogronian zastąpiono nasycającymi ilościami tryptofanu i 5 mM alfa-ketoglutaranem, produkcja monatyny wzrosła do 360 ng/ml. Reakcje powtórzono z 30 pg/ml każdego z trzech enzymów KHG w 50 mM Tris pH 8,3 i nasycającymi ilościami tryptofanu i prowadzono przez godzinę, aby polepszyć detekcję. Podobnie jak w Przykładzie 4, enzym z Bacillus miał najwyższą aktywność wytwarzając około 4000 ng/ml monatyny. KHG E. coli wytwarzał 3000 ng/ml monatyny, a enzym S. meliloti wytwarzał 2300 ng/ml.
P r z y k ł a d 7
Konwersja MP - monatyna
Aminację MP prowadzącą do monatyny mogą katalizować aminotransferazy takie jak te zidentyfikowane w Przykładach 1 i 6 lub dehydrogenazy wymagające redukującego kofaktora, takiego jak NADH lub NADPH. Reakcje te są odwracalne i można je mierzyć w obu kierunkach. Gdy używa się dehydrogenazy, w dużej mierze można kontrolować kierunkowość za pomocą stężenia soli amonowych.
Aktywność dehydrogenazy. Oksydacyjną deaminację monatyny monitorowano śledząc wzrost absorpcji przy długości fali 340 nm, gdy NAD(P)+ był przekształcany do bardziej absorbującego NAD(P)H. Monatynę wytwarzano enzymatycznie i oczyszczano, tak jak opisano w Przykładzie 6.
Typowa mieszanina reakcyjna zawierała 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 do 8,9, 0,33 mM NAD+ lub NADP+, 2 do 22 jednostek dehydrogenazy glutaminianowej (Sigma) i 10-15 mM substratu w 0,2 ml. Oznaczenia prowadzono w dwóch powtórzeniach przy użyciu przezroczystej dla światła UV płytki do mikromiareczkowania w czytniku płytek SpectraMax Plus. Mieszaninę enzymu, buforu i NAD(P)+ przenoszono do studzienek zawierających substrat i po krótkim mieszaniu co 10 sekund monitorowano wzrost absorpcji przy długości fali 340 nm. Reakcję inkubowano w temperaturze 25°C przez 10 minut. Negatywne kontrole prowadzono bez dodawania substratu, a jako pozytywną kontrolę używano glutaminian. Dehydrogenaza glutaminianowa typu III z wątroby bydlęcej (Sigma nr kat.
PL 208 998 B1
G-7882) katalizowała przemianę monatyny do prekursora monatyny z szybkością około sto razy mniejszą od przemiany glutaminianu do alfa-ketoglutaranu.
Aktywność transaminazy. Oznaczenia aminotransferaz monatyny prowadzono dla aminotransferazy asparaginianowej (AspC) z E. coli, aminotransferazy tyrozynowej (TyrB) z E. coli, aminotransferazy o szerokim spektrum substratowym (BSAT) z L. major i dwu świńskich aminotransferaz glutaminianowo-szczawiooctanowych dostępnych komercyjnie, opisanych w Przykładzie 1. Jako akceptor grup aminowych testowano zarówno szczawiooctan jak i alfa-ketoglutaran. Mieszanina do oznaczeń zawierała (w 0,5 ml) 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,05 mM PLP, 5 mM akceptor grup aminowych, 5 mM monatynę i 25 μg aminotransferazy. Oznaczenia inkubowano przez 30 minut w temperaturze 30°C i reakcje zatrzymywano dodając 0,5 ml alkoholu izopropylowego. Utratę monatyny monitorowano za pomocą LC/MS (Przykład 10). Najwyższą aktywność zaobserwowano z BSAT L. major i szczawiooctanem jako akceptorem grup aminowych, nieco niższą z tym samym enzymem i alfa-ketoglutaranem jako akceptorem grup aminowych. Względna aktywność ze szczawiooctanem wyglądała następująco: BSAT > AspC > świński typ Ila > świński typ I = TyrB. Względna aktywność z alfa-ketoglutaranem wyglądała następująco: BSAT > AspC > świński typ I > świński typ Ila > TyrB.
P r z y k ł a d 8
Wytwarzanie monatyny z tryptofanu i źródeł C3 innych niż pirogronian
Jak pisano powyżej w Przykładzie 6, indolo-3-pirogronian lub tryptofan można przekształcać w monatynę wykorzystując pirogronian jako cząsteczkę C3. Jednakże, w niektórych przypadkach, pirogronian może nie być odpowiednim surowcem. Na przykład, pirogronian może być droższy niż inne źródła węgla C3 lub dodany do podłoża może źle wpływać na fermentację. Wiele enzymów PLP może prowadzić transaminację alaniny do pirogronianu.
Enzymy podobne do tryptofanaz przeprowadzają reakcje beta-eliminacji z większymi prędkościami niż inne enzymy PLP, takie jak aminotransferazy. Enzymy tej klasy (4.1.99.-) mogą wytwarzać amoniak i pirogronian z aminokwasów takich jak L-seryna, L-cysteina i pochodne seryny i cysteiny z odpowiednimi grupami opuszczającymi, takie jak O-metylo-L-seryna, O-benzylo-L-seryna, S-metylocysteina, S-benzylocysteina, S-alkilo-L-cysteina, O-acylo-L-seryna, 3-chloro-L-alanina.
Procesy służące produkcji monatyny przy wykorzystaniu enzymów EC 4.1.99.- można usprawnić przez mutacje β-tyrozynazy (TPL) lub tryptofanazy według metody Mouratou i in. (J. Biol. Chem 274: 1320-5, 1999). Mouratou i in. opisują możliwość przekształcenia β-tyrozynazy w β-liazę aminokwasów dikarboksylowych, której nie opisano w naturze. Zmianę w specyficzności osiągnięto zamieniając walinę (V) w pozycji 283 na argininę (R) i argininę (R) w pozycji 100 na treoninę (T). Te zmiany aminokwasowe powodują, że liaza akceptuje aminokwasy dikarboksylowe (takie jak asparaginian) w reakcji deaminacji hydrolitycznej. Dlatego też, asparaginian można również wykorzystywać jako źródło pirogronianu do następnego etapu, reakcji kondenasacji aldolowej.
Ponadto, komórki lub reaktory enzymatyczne można zaopatrywać w mleczan i enzym przekształcający mleczan do pirogronianu. Przykładami enzymów zdolnych do przeprowadzania takiej reakcji są dehydrogenaza mleczanowa i oksydaza mleczanowa.
Izolacja genomowego DNA
Polipeptydy tryptofanaz zostały już opisane, na przykład przez Mouratou i in. (JBC 274: 1320-5, 1999). Aby wyizolować geny kodujące tryptofanazę, jako matrycę w PCR wykorzystano genomowy DNA z E. coli DH10B, podobnie jak opisano w Przykładzie 1.
Gen liazy tyrozynowo-fenolowej wyizolowano z C. freundii (numer katalogu ATCC 8090, oznaczenie ATCC 13316; NCTC 9750) hodowanej na agarze odżywczym (Difco 0001) i bulionie odżywczym (Difco 0003) w temperaturze 37°C do OD 2,0. Genomowy DNA oczyszczano przy użyciu zestawu Qiagen Genomic-tip™ 100/G.
Amplifikacja sekwencji kodujących za pomocą PCR
Startery zaprojektowano z kompatybilnymi końcami dla wektora pET 30 Xa/LIC (Novagen, Madison, WI), jak opisano w Przykładzie 1.
tna E. coli (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 41). N-końcowy starter do klonowania w pET30 Xa/LIC: 5'-GGT ATT GAG GGT CGC ATG GAA AAC TTT AAA CAT CT-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 43). C-końcowy starter do klonowania w pET30 Xa/LIC: 5'-AGA GGA GAG TTA GAG CCT TAA ACT TCT TTA AGT TTT G-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 44).
PL 208 998 B1 tpl C. freundii (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 42). N-końcowy starter do klonowania w pET30 Xa/LIC: 5'-GGT ATT GAG GGT CGC ATGAATTATCCGGCAGAACC-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 45). C-końcowy starter do klonowania w pET30 Xa/LIC: 5'-AGA GGA GAG TTA GAG CCTTAGATGTAATCAAAGCGTG-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 46).
Do wszystkich reakcji PCR używano Eppendorf Mastercycler™ Gradient 5331 Thermal Cycler. Do 50 μl dodawano 0,5 μg matrycy (genomowego DNA), 1,0 μΜ każdego startera, 0,4 mM każdego dNTP, 3,5 jednostki polimerazy Expand High Fidelity (Roche), 1x bufor Expand z Mg i 5% DMSO (końcowe stężenie). Używano następującego programu termocyklera PCR: gorący start w temperaturze 96°C (5 minut), temperatura 94°C - 30 sekund, temperatura 40-60°C 1 minuta 45 sekund, temperatura 72°C - 2 minuty 15 sekund, 30 powtórzeń. Ostatni etap polimeryzacji trwał 7 minut, a następnie próbki utrzymywano w temperaturze 4°C.
Klonowanie
Do identyfikacji odpowiednich klonów używano metod klonowania i identyfikacji pozytywnych klonów opisanych dokładnie powyżej w Przykładzie 1.
Ekspresja genów i oznaczenia aktywności
Plazmidowy DNA (zweryfikowany przez analizę sekwencji) subklonowano do gospodarza ekspresyjnego BL21(DE3) (Novagen). Aby potwierdzić identyczność plazmidów kultury hodowano w podłożu LB z 30 mg/l kanamycyny, izolowano plazmidy przy użyciu zestawu Qiagen miniprep i analizowano za pomocą trawienia enzymami restrykcyjnymi.
Eksperymenty z indukcją przeprowadzono w gospodarzu ekspresyjnym BL21(DE3). Konstrukty hodowano w temperaturze 37°C w podłożu LB zawierającym 50 mg/l kanamycyny. Ekspresję białka indukowano przy pomocy 0,1 mM IPTG, gdy OD600 hodowli osiągnęło około 0,6. Komórki hodowano przez 4 godziny w temperaturze 30°C i zbierano przez wirowanie. Następnie komórki lizowano w proporcji 5 ml/g mokrej masy komórkowej odczynnikiem BugBuster™ (Novagene) zawierającym 5 nl/ml koktailu inhibitorów proteaz, zestaw III (Calbiochem) i 1 nl/ml nukleazy benzonazowej (Novagen). Zawierające znaczniki His rekombinowane białka oczyszczano przy użyciu kolumienek His-Bind, jak opisano powyżej w Przykładzie 1. Oczyszczone białka odsalano na kolumnie PD-10 (Sephadex G25, Amersham Biosciences) i eluowano buforem 100 mM Tris-Cl, pH 8,0. Białka analizowano metodą SDS-PAGE w żelach gradientowych 4-15%, aby ustalić poziom rozpuszczalnego białka o masie cząsteczkowej przewidywanej dla rekombinowanego białka fuzyjnego.
Mutageneza
Niektórzy przestawiciele polipeptydów klasy 4.1.99.-(tryptofanaza i β-tyrozynaza) prowadzą reakcję beta-liazy z asparaginianem lub podobnymi aminokwasami bez żadnej modyfikacji. Jednakże, niektórzy przedstawiciele tej klasy mogą wymagać mutagenezy, aby mogły wykorzystywać substraty i/lub tworzyć produkty. Ponadto, w niektórych przypadkach polipeptydy, które są zdolne do przeprowadzenia konwersji mogą być bardziej zoptymalizowane dzięki mutagenezie.
Mutagenezę ukierunkowaną wobec miejsca przeprowadzano w oparciu o analizę struktury trójwymiarowej polipeptydów wiążących PLP. Poniżej przedstawiono dwa przykłady zmiany specyficzności substratowej polipeptydów.
Przykład 1, mutageneza tryptofanazy
Protokół mutagenezy przedstawiony poniżej wprowadził do sekwencji aminokwasowej dwie mutacje punktowe. Pierwsza mutacja punktowa zamieniła argininę (R) w pozycji 103 na treoninę (T), a druga mutacja punktowa zamieniła walinę (V) w pozycji 299 na argininę (R) (numeracja według dojrzałego białka E. coli). Eksperymenty z mutagenezą przeprowadzono w ATG Laboratories (Eden Praire, MN). Mutacje wprowadzono kolejno za pomocą reakcji PCR fragmentów genu. Złożenie genu przeprowadzono również za pomocą PCR. Startery do zamiany argininy (R) 103 na treoninę (T):
5'-CCAGGGCACCGGCGCAGAGCAAATCTATATT-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 47) i 5'-TGCGCCGGTGCCCTGGTGAGTCGGAAATGGT-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 48).
Startery do zamiany waliny (V) 299 na argininę (R):
5' -TCCTGCACGCGGCAAA-GGGTTCTGCACTCGGT-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 49) i 5'-CTTTGCCGCGTGCAGGAAGGCTT-CCCGACA-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 50).
PL 208 998 B1
Mutanty selekcjonowano za pomocą trawienia eznymami restrykcyjnymi XbaI/HindIII i SphI i potwierdzono przez sekwencjonowanie.
Przykład 2, mutageneza liazy tyrozynowo-fenolowej (β-tyrozynazy)
Do sekwencji aminokwasowej liazy tyrozynowo-fenolowej wprowadzono dwie mutacje punktowe. Mutacje te zamieniły argininę (R) w pozycji 100 na treoninę (T) i walinę (V) w pozycji 283 na argininę (R) (w sekwencji dojrzałego białka C. freundii).
Startery do konwersji R100T były następujące:
5'-AGGGGACCGGCGCAGAAAACCTGTTATCG-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 51 i 5'-AGGGGACCGGCGCAGAAAACCTGTTATCG-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 52).
Startery do konwersji V283R były następujące:
5'-GTTAGTCCGCGTCTACGAAGGGATGCCAT-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 53) i 5'-GTAGACGCGGACTAACTCTTTGGCAGAAG-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 54).
Zastosowano metody opisane powyżej, a klony selekcjonowano trawieniem KpnI/SacI i trawieniem Bstl. Sekwencje zweryfikowano za pomocą sekwencjonowania metodą terminacji łańcucha dideoksynukleotydami. Rekombinowane białko wytwarzano, tak jak opisano powyżej dla enzymów typu dzikiego.
Mieszanina reakcyjna składała się z 50 mM Tris-Cl pH 8,3, 2 mM MgCl2, 200 mM źródła węgla C3, 5 mM soli sodowej alfa-ketoglutaranu, 0,05 mM fosforanu pirydoksalu, odpowietrzonej wody, do końcowej objętości 0,5 ml po uwzględnieniu dodawanych enzymów, 3 mM fosforanu potasowego pH 7,5, 25 μg nieoczyszczonej aldolazy ProA C. testosteroni przygotowanej jak w Przykładzie 4, 500 μg nieoczyszczonej aminotransferazy L-asparaginianowej (AspC) przygotowanej jak w Przykładzie 1 i tryptofanu w formie stałej do stężenia >60 mM (roztwór nasycony, pewna ilość pozostała nierozpuszczona podczas reakcji). Mieszaninę reakcyjną inkubowano przez 30 minut w temperaturze 30°C z mieszaniem. Jako źródeł węgla 3 dodawano seryny, alaniny i asparaginianu. Oznaczenia prowadzono z i bez dodatkowych enzymów PLP (oczyszczonych), zdolnych do przeprowadzania reakcji beta-eliminacji i beta-liazy (tryptofanaza (TNA), podwójny mutant tryptofanazy, (β-tyrozynaza (TPL)). Wyniki przedstawia Tablica 4:
T a b l i c a 4:
Wytwarzanie monatyny przy wykorzystaniu alternatywnych źródeł węgla C3
Źródło węgla C3 Dodatkowy enzym PLP Aktywność względna
brak brak 0%
pirogronian brak 100%
seryna brak 3%
seryna 11 μg TNA typu dzikiego (1 jednostka) 5,1%
seryna 80 μg podwójnego mutanta TNA 4,6%
alanina brak 32%
alanina 11 μg TNA typu dzikiego 41,7%
alanina 80 μg zmutowanego TNA 43,9%
asparaginian 110 μg TNA typu dzikiego (10 jednostek) 7,7%
asparaginian 5 jednostek TPL typu dzikiego (nieoczyszczonego) 5,1%
asparaginian 80 μg zmutowanego TNA 3,3%
Identyfikację monatyny wytwarzanej z alaniny i seryny jako 3-węglowych źródeł węgla potwierdzono analizą skanów z LC/MS/MS, i stwierdzono, że jest identyczna ze scharakteryzowaną monatyną wytworzoną w Przykładzie 6. Najlepszą z tesowanych alternatyw była alanina, transaminowana przez enzym AspC. Ilość wytwarzanej monatyny została zwiększona przez dodanie tryptofanazy, której dodatkową aktywnością jest transaminacja. Ilość monatyny wytwarzanej z seryną jako źródłem węgla wzrosła niemal dwukrotnie po dodaniu enzymów tryptofanazowych, chociaż w porównaniu z aminotransferazą dodano tylko jedną piątą tryptofanazy. AspC sama jest zdolna w pewnym stopniu do aktywności beta-eliminacji. Wyniki uzyskane dla asparaginianu wskazują, że aktywność tryptofanazy w stosunku do asparaginianu nie wzrasta przy tych samych mutacjach co te sugerowane uprzednio
PL 208 998 B1 dla β-tyrozynazy. Można się spodziewać, że zmutowana β-tyrozynaza będzie miała wyższą aktywność w produkcji monatyny.
P r z y k ł a d 9
Chemiczna synteza monatyny
Dodanie alaniny do kwasu indolo-3-pirogronowego daje monatynę i reakcja ta można przeprowadzać syntetycznie z odczynnikiem Grignarda lub organicznym litem.
Na przykład do 3-chloro lub 3-bromo-alaniny zablokowanej odpowiednio przy grupach aminowej i karboksylowej, dodaje się w warunkach bezwodnych magnez. Następnie dodaje się indolo-3-pirogronian (odpowiednio zablokowany) dając sprzężony produkt, po czym usunięcie grup blokujących daje monatynę. Do grup blokujących, które są szczególnie użyteczne należy THP (eter tetrahydropiranylowy), który można łatwo przyłączyć i usunąć.
P r z y k ł a d 10
Wykrywanie monatyny i MP
Przykład ten opisuje metody wykorzystywane do wykrywania obecności monatyny lub jej prekursora kwasu 2-hydroksy-2-(indol-3-ilornetylo)-4-ketoglutarowego.
Analiza LC/MS
Analizę mieszanin alfa-ketokwasowej formy monatyny (prekursora monatyny, MP) i monatyny otrzymanej w wyniku reakcji biochemicznych in vitro i in vivo prowadzono przy użyciu wyposażenia Waters/Micromass do chromatografii cieczowej - tandemowej spektrometrii masowej (LC/MS/MS) obejmującego chromatograf Waters 2690 z monitorem absorbancji Waters 996 Photo-Diode Array (PDA) umieszczony pomiędzy chromatografem a potrójnym kwadrupolowym spektrometrem masowym Micromass Quatro Ultima. Do rozdziału w LC używano kolumny do chromatografii odwrotnej fazy Supelco Discovery C18, 2,1 mm x 150 mm lub kolumny do chromatogarfii odwrotnej fazy Xterra MS C8, 2,1 mm x 250 mm w temperaturze pokojowej. Faza ruchoma LC składała się z (A) wody zawierającej 0,05% (obj./obj.) kwas trifluorooctowy i B) metanol zawierający 0,05% (obj./obj.) kwas trifluorooctowy.
Prowadzono elucję gradientem liniowym 5% B do 35% B, 0-9 minut, 35% B do 90% B, 9-16 minut, izokratyczną przy 90% B, 16-20 minut, liniowym gradientem 90% B do 5% B, 20-22 minut, z 10 minutowym etapem równoważenia pomiędzy frakcjonowaniami. Szybkość przepływu wynosiła 0,25 ml/minutę, a absorpcję w PDA monitorowano przy długości fali 200 nm do 400 nm. Wszystkie parametry ESI-MS zoptymalizowano i wyselekcjonowano w oparciu o powstawanie uprotonowanych jonów cząsteczkowych ([M + H]+) badanych analitów i powstawanie charakterystycznych jonów fragmentacyjnych.
Przy analizie monatyny w LC/MS używano następujących parametrów instrumentu: kapilara: 3,5 kV, stożek: 40 V; Hex 1: 20 V; apertura: 0 V; Hex 2: 0 V; temperatura źródła: 100°C; temperatura desolwacji: 350°C; gaz do desolwacji 500 l/h; gaz na stożku: 50 l/h; rozdzielczość przy niskich masach (Q1): 15,0; rozdzielczość przy wysokich masach (Q1): 15,0; energia jonu: 0,2; wejście 50V; energia kolizji: 2; wyjście: 50V; rozdzielczość niskich mas (Q2): 15; rozdzielczość wysokich mas (Q2): 15; energia jonu (Q2): 3,5; powielacz: 650. Niepewność podanych proporcji masa/ładunek (m/z) i mas cząsteczkowych +/- 0,01%. Wstępną detekcję alfa-keto kwasowej formy monatyny (MP) i monatyny w mieszaninach uzyskano monitorując za pomocą LC/MS i zbierając spektra masowe w regionie m/z 150-400. Bezpośrednią identyfikację tych analitów w mieszaninach umożliwiły chromatogramy wybranych jonów dla uprotonowanych jonów cząsteczkowych ([M + H]+ = 293 dla monatyny).
Analiza MS/MS
Eksperymeny na monatynie z jonem rozpadowym w LC/MS/MS przeprowadzano w następujący sposób. Analiza jonu rozpadowego obejmuje przeprowadzenie badanego jonu rodzicielskiego (np. m/z = 293 dla monatyny) z pierwszego analizatora masowego (Q1) do komory kolizyjnej spektrometru masowego, gdzie wprowadza się argon chemicznie rozbijający jon rodzicielski do jonów rozpadowych. Te jony rozpadowe wykrywa się następnie w drugim analizatorze masowym (Q2) i można je wykorzystać do potwierdzenia identyfikacji strukturalnej jonu rodzicielskiego.
Do analizy monatyny w LC/MS/MS wykorzystano następujące parametry instrumentu: kapilara: 3,5 kV; stożek: 40 V; Hex 1: 20V, apertura: 0 V; Hex 2: 0 V; temperatura źródła: 100°C; temperatura desolwacji: 350°C; gaz desolwacji 500 l/h; gaz stożka: 50 l/h; rozdzielczość niskich mas (Q1): 13,0; rozdzielczość wysokich mas (Q1): 13,0; energia jonu: 0,2; wejście: - 5 V; energia kolizji: 14; wyjście: 1 V; rozdzielczość niskich mas (Q2): 15; rozdzielczość wysokich mas (Q2: 15; energia jonu (Q2): 3,5; powielacz: 650.
PL 208 998 B1
Wysokoprzepustowa analiza monatyny
Wysokoprzepustową analizę (<5 min/próbkę) mieszanin monatyny otrzymanych z reakcji in vitro lub in vivo prowadzono używając wyposażenia opisanego powyżej i takich samych parametrów jakie opisano dla LC/MS/MS. Rozdziały w LC prowadzono używając chromatografii na C8 Waters Xterra MS (2,1 mm x 50 mm) w temperaturze pokojowej z elucją izokratyczną w wodnym roztworze 15% MeOH, 0,25% kwasu octowego przy szybkości przepływu 0,3 ml/minutę. Detekcję monatyny w roztworze prowadzono przy użyciu selektywnego monitorowania reakcji (SRM) - tandemowej spektroskopii masowej. Obejmowała ona monitorowanie indukowanego kolizją przejścia specyficznego jonu rodzicielskiego ([M + H]+ = 293,1) do jonu rozpadowego (np. jon rozpadowy przy m/z = 168,1, tymczasowo zidentyfikowany jako jon karboniowy 3-buta-1,3-dienylo-1H-indolu), aby zmaksymalizować czułość, wybiórczość i przepustowość wykrywania monatyny. Równolegle zbierano dane dotyczące absorpcji w PDA dla dalszej weryfikacji identyfikacji monatyny.
P r z y k ł a d 11
Wytwarzanie monatyny w bakteriach
Przykład ten opisuje metody wykorzystywane do wytwarzania monatyny w komórkach E. coli. Specjalista w tej dziedzinie będzie rozumiał, że podobne metody można wykorzystywać do wytwarzania monatyny w innych komórkach bakteryjnych. Poza tym, można wykorzystywać wektory zawierające inne geny ze szlaku syntezy monatyny (Fig. 2).
Podłoże Trp-1 z glukozą, podłoże minimalne wykorzystywane do zwiększonej produkcji tryptofanu w komórkach E. coli (Zeman i in. Folia Microbiol. 35: 200-4, 1990), przygotowywano w sposób następujący. Do 700 ml wody o specjalnej czystości dodano następujące odczynniki: 2 g (NH4)2SO4, 13,6 g KH2PO4, 0,2 g MgSO4^H2O, 0,01 g CaCl22H2O i 0,5 mg FeSO47H2O. pH doprowadzono do 7,0, objętość powiększono do 850 ml i podłoże sterylizowano w autoklawie. 50% roztwór glukozy przygotowano osobno i wysterylizowano przez filtrację. Aby uzyskać 1 l objętości końcowej do podłoża podstawowego (850 ml) dodawano 40 ml roztworu glukozy.
Roztwór L-tryptofanu 10 g/l przygotowano w 0,1 M fosforanie sodowym pH 7 i sterylizowano przez filtrację. Do hodowli dodawano zwykle jedną dziesiątą objętości, jak opisano dokładnie poniżej. Przygotowano również 10% roztwór pirogronianiu sodowego i wysterylizowano przez filtrację. Zwykle używano 10 ml na litr hodowli. Przygotowano roztwory podstawowe ampicyliny (100 mg/ml), kanamycyny (25 mg/ml) i IPTG (840 mM), wysterylizowano przez filtrację i przechowywano przed użyciem w temperaturze -20°C. Tween 20 (monolaurynian polioksyetyleno 20-sorbitanu) używano w końcowym stężeniu 0,2% (obj./obj.). Ampicylinę używano w stężeniach końcowych nie-letalnych, zazwyczaj 1-10 μg/ml.
E. coli BL21(DE3): C. testosteroni proA/pET30 Xa/LIC (opisany w Przykładzie 4) posiewano na szalki z podłożem LB zawierającym 50 μg/ml kanamycyny. Pojedynczą kolonią szczepiono nocne hodowle (5 ml), które prowadzono w temperaturze 30°C w podłożu LB z kanamycyną. Zazwyczaj do indukcji w podłożu tr-1 + glukoza używano inokulum 1 do 50. Dodawano świeżo przygotowany antybiotyk do stężenia końcowego 50 mg/l. Do czasu indukcji prowadzono hodowle wytrząsane w temperaturze 37°C.
Co godzinę pobierano próbkę komórek aż uzyskano OD600 0,35-0,8. Wtedy komórki indukowano 0,1 mM IPTG, a temperaturę obniżono do 34°C. Pobierano próbki (1 ml) przed indukcją (punkt czasowy zero) i odwirowano przy 5000 x g. Supernatant zamrażono w temperaturze -20°C do analizy LC/MS. Cztery godziny po indukcji pobierano kolejną próbkę o objętości 1 ml i odwirowywano, aby oddzielić podłoże od osadu komórek. Tryptofan, pirogronian sodowy, ampicylinę i Tween dodawano, tak jak opisano powyżej.
Komórki hodowano przez 48 godzin po indukcji i pobierano kolejną próbkę o objętości 1 ml przetworzoną, tak jak opisano powyżej. Po 48 godzinach dodano kolejną porcję tryptofanu i pirogronianu. Po około 70 godzinach hodowli (po indukcji) odwirowano całą objętość przez 20 minut w temperaturze 4°C przy 3500 obrotów na minutę. Supernatant dekantowano i zamrażano, w temperaturze -80°C, zarówno podłoże jak i komórki. Próbki podłoża filtrowano i analizowano przez LC/MS. Monitorowano wysokości i powierzchnie szczytów [M + H]+ = 293, tak jak opisano w przykładzie 10. Odejmowano poziom tła dla samego podłoża. Dane normalizowano również na wzrost hodowli uwzględniając proporcję wysokości szczytu [M + H]+ = 293 do gęstości optycznej hodowli przy długości fali 600 nm.
Wyższe poziomy monatyny były wytwarzane gdy pirogronian, ampicylinę i Tween dodawano 4 godziny po indukcji, a nie w momencie indukcji. Inne dodatki takie jak PLP, dodatkowy fosforan lub dodatkowy MgCl2 nie zwiększały produkcji monatyny. Wyższą wydajność monatyny uzyskiwano, gdy
PL 208 998 B1 używano tryptofan zamiast indolo-3-pirogronianu i kiedy tryptofan dodawano po indukcji, a nie przy szczepieniu lub w momencie indukcji. Przed indukcją i 4 godziny po indukcji (w czasie dodawania substratu) zazwyczaj nie było wykrywalnego poziomu monatyny w brzeczce fermentacyjnej, ani w ekstraktach komórkowych. Jako negatywnych kontroli użyto komórek z samym wektorem pET30a lub kultur, do których nie dodano tryptofanu i pirogronianu. Rodzicielski skan MS wskazywał, że składnik o (m+1)/z = 293 nie pochodził z większych cząsteczek, a skany fragmentów (wykonane jak w Przykładzie 10) były bardzo podobne co dla monatyny wytworzonej in vitro.
Wpływ Tween 20 badano używając końcowych stężeń Tween-20 0,2% i 0,6% (obj./obj.). Najwyższą ilość monatyny w wytrząsanych kolbach uzyskano przy 0,2% Tween. Testowano stężenia ampicyliny od 0 do 10 μg/ml. Ilość monatyny w brzeczce komórkowej wzrastała znacznie (2,5 x) przy wzroście stężenia ampicyliny od 0 do 1 μg/ml i wzrastała 1,3 x przy wzroście stężenia ampicyliny od 1 do 10 μg/ml.
Typowe wyniki eksperymentu z krzywą czasową przedstawia Fig. 10. Ilość monatyny wydzielanej do brzeczki hodowlanej wzrastała nawet przy uwzględnieniu wzrastającej gęstości hodowli. Wykorzystując molowy współczynnik ekstynkcji dla tryptofanu, ilość monatyny w brzeczce oszacowano na poniżej 10 μg/ml. Ten sam eksperyment powtórzono z komórkami zawierającymi wektor bez wstawki proA. Uzyskano wiele wartości ujemnych, co wskazuje, że wysokość szczytu przy m/z = 293 była w tych hodowlach niższa niż w samym podłożu (Fig. 10). Wartości były zawsze niższe, gdy brak było tryptofanu i pirogronianu, co wskazuje, że wytwarzanie monatyny było wynikiem reakcji enzymatycznej katalizowanej przez aldolazę.
Produkcję monatyny w komórkach bakteryjnych in vivo powtórzono w wytrząsanych kolbach o pojemności 800 ml i w fermentorze. Przy użyciu chromatografii jonowymiennej i preparatywnej chromatografii odwrotnej fazy oczyszczono 250 ml próbkę monatyny (z podłoża po usunięciu komórek). Próbkę odparowano i poddano analizie masowej o wysokiej rozdzielczości (opisanej w Przykładzie 6). MS wysokiej rozdzielczości wykazał, że wytworzony metabolit to monatyna.
Oznaczenia in vitro wskazują, że poziom aminotransferazy powinien być wyższy niż aldolazy (patrz Przykład 6), dlatego aby zwiększyć ilość wytwarzanej monatyny prowadzono nadekspresję aminotransferazy asparaginianowej z E. coli wraz z genem aldolazy. Zaprojektowano startery, aby wprowadzić proA C. testosteroni do wspólnego operonu z aspC/pET30 Xa/LIC:
starter 5': ACTCGGATCCGAAGGAGATATACATATGTACGAACTGGGACT (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 67) i starter 3': CGGCTGTCGACCGTTAGTCAATATATTTCAGGC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 68). Starter 5' zawiera miejsce BamHI, a starter 3' zawiera miejsce SalI do klonowania. Reakcję PCR prowadzono tak jak opisano w Przykładzie 4 i oczyszczono produkt z żelu. Konstrukt aspC/pET30 Xa/LIC, podobnie jak produkt PCR trawiono BamHI i SalI. Produkty trawienia oczyszczono używając Qiagen spin column. Produkt PCR proA ligowano z wektorem używając zestawu Roche rapid DNA Ligation (Indianapolis, IN) zgodnie z zaleceniami producenta. Chemiczną transformację przeprowadzono przy użyciu Novablues Singles (Novagen), tak jak opisano w Przykładzie 1. Kolonie hodowano na podłożu LB zawierającym 50 mg/l kanamycyny i oczyszczono DNA plazmidowe przy użyciu zestawu Qiagen spin miniprep. Klony selekcjonowano przez trawienie enzymami restrykcyjnymi i sekwencję potwierdzono w Seqwright (Houston, TX). Konstrukty subklonowano do BLR(DE3), BLR(DE3)LysS, BL21(DE3) i BL21(DE3)pLys (Novagen). Konstrukt proA/pET30Xa/LIC transformowano również do BL21(DE3)pLysS.
Wstępne porównania próbek z wytrząsanych kolb przy standartowych warunkach opisanych powyżej wykazały, że dodanie drugiego genu (aspC) siedmiokrotnie poprawiło ilość wytwarzanej monatyny. Aby przyspieszyć wzrost użyto szczepów gospodarza pochodzących z BL21(DE3). Klony proA i klony z dwugenowym operonem indukowano w podłożu Trp-1, jak wyżej, w przypadku gospodarzy z pLysS do podłoża dodano również chloramfenikol (34 mg/l). Doświadczenia z wytrząsanymi kolbami wykonywano z i bez dodatku 0,2% Tween-20 i 1 mg/l ampicyliny. Ilość monatyny w podłożu obliczano używając jako standartu oczyszczonej monatyny wytworzonej in vitro. Analizy SRM przeprowadzano, tak jak opisano w Przykładzie 10. Komórki pobierano w czasach 0, 4 godziny, 24 godziny, 48 godzin, 72 godziny i 96 godzin hodowli.
Wyniki w Tablicy 5 pokazują maksymalne ilości wyprodukowane w brzeczce hodowlanej. W większości wypadków konstrukt z dwoma genami dawał wyższe wartości niż konstrukt z samym proA. Szczepy pLysS, których osłony komórkowe są mniej szczelne, dawały większe ilości wydzielanej monatyny, pomimo, że szczepy te zazwyczaj rosną wolniej. Dodatek Tween i ampicyliny był korzystny.
PL 208 998 B1
T a b l i c a 5:
Ilość monatyny wytworzonej przez bakterie E. coli
Konstrukt Gospodarz Tween + Ampicylina pg/ml monatyny Czas
proA BL21 (DE3) - 0,41 72 godziny
proA BL21 (DE3) + 1,58 48 godzin
proA BL21 (DE3)pLysS - 1,04 48 godzin
proA BL21 (DE3)pLysS + 1,60 48 godzin
aspC:proA BL21 (DE3) - 0,09 48 godzin
aspC:proA BL21 (DE3) + 0,58 48 godzin
aspC:proA BL21 (DE3)pLysS - 1,39 48 godzin
aspC:proA BL21 (DE3)pLysS + 6,68 48 godzin
P r z y k ł a d 12
Wytwarzanie monatyny w drożdżach
Przykład ten opisuje metody stosowane do wytwarzania monatyny w komórkach eukariotycznych. Specjalista w tej dziedzinie będzie rozumiał, że podobne metody można wykorzystywać do wytwarzania monatyny w dowolnych odpowiednich komórkach. Ponadto, oprócz genów opisanych w tym przykładzie lub zamiast nich można wykorzystać inne geny (np. te wymienione na Fig. 2).
Do klonowania i ekspresji genów aspC E. coli i proA C. testosteroni w Saccharomyces cerevisiae stosowano pESC Yeast Epitope Tagging Vector System (Stratagene, La Jolla, CA). Wektory pESC zawierają dwa promotory, GAL1 i GAL10, na przeciwnych niciach, z dwoma odrębnymi miejscami wielokrotnego klonowania, co umożliwia ekspresję dwóch genów w tym samym czasie. Wektor pECS-His zawiera również gen His3 dla komplementacji auksotrofii histydynowej w gospodarzu (YPH500). Promotory GAL1 i GAL10 są hamowane przez glukozę i indukowane przez galaktozę; sekwencję Kozak stosuje się dla optymalnej ekspresji w drożdżach. Plazmidy pESC są wektorami wahadłowymi, umożliwiającymi na wytwarzanie początkowego konstruktu w E. coli (z genem bla dla selekcji); jednakże, w miejscach wielokrotnego klonowania, nie ma żadnych miejsc wiążących rybosomy bakteryjne.
Do klonowania w pESC-His zaprojektowano następujące startery (miejsca restrykcyjne podkreślono, sekwencję Kozak podano pogrubioną czcionką): aspC (BamHI/SalI), GAL1: 5'-CGCGGATCCATAATGGTTGAGAACATTACCG-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 69) i 5'-ACGCGTCGACTTACAGCACTGCCACAATCG-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 70). proA (EcoRI/Notl), GAL10: 5'-CCGGAATTCATAATGGTCGAACTGGGAGTTGT-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 71) i 5'-GAATGCGGCCGCTTAGTCAATATATTTCAGGCC-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 72).
Drugi kodon dla obu dojrzałych białek został zmieniony z aminokwasu aromatycznego na walinę ze względu na wprowadzenie sekwencji Kozak. Wybrane geny zamplifikowano wykorzystując, jako matrycę, miniizolację DNA pET 30 XA/LIC z klonów opisanych w Przykładzie 1 i Przykładzie 4. Reakcję PCR przeprowadzono w termocyklerze gradientowym Eppendorf Master cycler w objętości 50 μl i z następującym protokołem: 1,0 μl matrycy, 1,0 μM każdego startera, 0,4 mM każdego dNTP, 3,5 jednostki polimerazy Expand High Fidelity Polymerase (Roche, Indianapolis, 1N) i 1 x bufor Expand™ z Mg. Wykorzystany program termocyklera składał się z „gorącego startu w temperaturze 94°C przez 5 minut, a po nim 29 powtórzeń następujących etapów: temperatura 94°C przez 30 sekund, temperatura 50°C przez 1 minutę i 45 sekund i temperatura 72°C przez 2 minuty i 15 sekund. Po 29 powtórzeniach próbkę utrzymywano w temperaturze 72°C przez 10 minut, a następnie przechowywano w temperaturze 4°C. Produkty reakcji PCR oczyszczano przez rozdział w 1% żelu TAE-agaroza, a następnie odzyskiwano przy użyciu zestawu QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA).
DNA wektora pESC-His (2,7 μg) trawiono BamHI/Sall i oczyszczano z żelu, jak opisano wyżej. Produkt PCR genu aspC trawiono BamHI/SalI i oczyszczano przy użyciu QIAquick PCR Purification Column. Ligacje prowadzono przy użyciu zestawu Roche Rapid DNA Ligation Kit według zaleceń producenta. Odsolone produkty ligacji poddawano elektroporacji do 40 μl kompetentnych komórek Electromax DH10B (Invitrogen) w 0,2 cm jednorazowej kuwecie Biorad przy użyciu Biorad gene Pulser II z kontrolerem impulsu, zgodnie z zaleceniami producenta. Po godzinnej rewitalizacji komórek w 1 ml podłoża SOC, transformanty wysiewano na podłoże LB zawierające 100 μg/ml ampicyliny.
PL 208 998 B1
Izolacje plazmidowego DNA klonów wykonywano przy użyciu zestawów QIAprep Spin Miniprep Kit. DNA plazmidowe przeszukiwano przez trawienia enzymami restrykcyjnymi i sekwencjonowano (Seqwright) dla potwierdzenia, używając starterów zaprojektowanych dla wektora.
Klon aspC/pESC-His trawiono EcoRI i Natl, podobnie jak produkt PCR genu proA. DNA oczyszczano i ligowano, jak opisano wyżej. Dwugenowy konstrukt transformowano do komórek DH10B i selekcjonowano za pomocą trawienia enzymami restrykcyjnymi i sekwencjonowania DNA.
Konstrukt transformowano do szczepu S. cerevisiae YPH500 przy użyciu zestawu S.c. EasyComp™ Transformation Kit (Invitrogen). Mieszaniny transformacyjne wysiewano na podłoże minimalne SC-His (instrukcja Invitrogen dla pYES2) zawierające 2% glukozę. Pojedyncze kolonie drożdży sprawdzano na obecność genów proA i aspC za pomocą kolonijnego PCR, wykorzystując startery opisane powyżej. Odwirowane komórki (2 pl) zawieszano w 20 pl buforu Y-Lysis Buffer (Zymo Research), zawierającego 1 pl zymolazy i ogrzewano przez 10 minut w temperaturze 37°C. 4 pl tej zawiesiny wykorzystywano następnie w 50 pl reakcji PCR przy użyciu, opisanych powyżej, mieszaniny reakcyjnej i programu.
ml hodowle prowadzono przez noc na podłożu SC-His z glukozą w temperaturze 30°C przy 225 obrotach na minutę. Komórki stopniowo przyzwyczajano do wzrostu na rafinozie, aby zminimalizować okres fazy lag przed indukcją za pomocą galaktozy. Po około 12 godzinach hodowli mierzono absorbancję przy długości fali 600 nm i odwirowano odpowiednią ilość komórek by zapewnić OD 0,4 w nowym podłożu SC-His. Kolejno używano następujących źródeł węgla: 1% rafinoza + 1% glukoza, 0,5% glukoza + 1,5% rafinoza, 2% rafinoza i w końcu 1% rafinoza + 2% galaktoza do indukcji.
Po około 16 godzinach hodowli w podłożu indukcyjnym, 50 -ml hodowle dzielono na dwie części, po 25 ml każda, i do jednej z nich dodawano następujące składniki (stężenia końcowe) : 1 g/l tryptofanu, 5 mM fosforan sodowy pH 7,1, pg/l pirogronianu sodowego, 1 mM MgCl2. Jako negatywne kontrole zebrano próbki brzeczki i osadu komórek z podłoża nieindukcyjnego i z 16-godzinnych hodowli przed dodaniem substratów dla szlaku syntezy monatyny. Poza tym jako dodatkową kontrolę negatywną użyto konstruktów zawierających jedynie funkcjonalny gen aspC (i skrócony gen proA). Komórki hodowano do 69 godzin po indukcji. Czasami komórki drożdży indukowano przy niższym OD i hodowano zaledwie 4 godziny przed dodaniem tryptofanu i pirogronianu. Jednakże, te substraty do syntezy monatyny wydają się hamować wzrost i ich dodanie przy wyższym OD było bardziej efektywne.
Osad komórek z hodowli lizowano 5 ml YeastBuster™ + 50 pl THP (Novagen) na gram (mokrej masy) komórek według protokołu producenta dodając inhibitorów proteaz i nukleazy benzonazy, tak jak opisano w poprzednich przykładach. Brzeczkę hodowlaną i ekstrakty komórkowe filtrowano i analizowano za pomocą SRM, tak jak opisano w Przykładzie 10. Przy użyciu tej metody nie wykryto monatyny w próbkach brzeczki, co wskazywało, że w tych warunkach komórki nie wydzielają monatyny. Pompa protonowa może w tych warunkach być niewystarczająca lub ogólny system transportu aminokwasów może być nasycony przez tryptofan. Ekspresja białka była poniżej poziomu, przy którym można wykryć zmiany za pomocą SDS-PAGE.
Gdy do podłoża dodano tryptofanu i pirogronianu monatynę wykrywano przejściowo (około 60 pg/ml) w ekstraktach komórkowych hodowli z dwoma funkcjonalnymi genami. Monatyny nie wykrywano w żadnym ekstrakcie komórkowym pochodzącym z kontroli negatywnych. Oznaczenia monatyny in vitro przeprowadzano w dwóch powtórzeniach przy 4,4 mg/ml całkowitego białka (około dwukrotnie więcej niż ilość zwykle używana w przypadku ekstraktów komórkowych z E. coli) wykorzystując zoptymalizowane oznaczenie opisane w Przykładzie 6. Inne oznaczenia przeprowadzano z dodatkiem 32 pg/ml aldolazy ProA C. testosteroni lub 400 pg/ml aminotransferazy AspC, aby ustalić który z enzymów jest ograniczający w ekstraktach komórkowych. Kontrole negatywne prowadzono bez dodawania enzymu lub dodając jedynie aminotransferazę AspC (do pewnego stopnia kondensacja aldolowa może zachodzić bez enzymu). Kontrole pozytywne prowadzono z częściowo oczyszczonymi enzymami (30-40%) używając 16 pg/ml aldolazy i 400 pg/ml aminotransferazy.
Wyniki uzyskane in vitro analizowano w SRM. Analiza ekstraktów komórkowych wykazała, że tryptofan był efektywnie transportowany do komórek, gdy dodano go do podłoża po indukcji, dzięki czemu jego poziom był o dwa rzędy wielkości wyższy niż tam gdzie nie dawano dodatkowo tryptofanu. Wyniki analizy monatyny uzyskanej in vitro przedstawia Tablica 6 (liczby oznaczają ng/ml).
PL 208 998 B1
T a b l i c a 6:
Wytwarzanie monatyny w ekstraktach komórkowych drożdży.
konstrukt aspC + aldolaza +AspC konstrukt dwugenowy + aldolaza + AspC
represja (podłoże z glukozą) 0 888,3 173,5 0 465,2 829
indukcja 24 godziny 0 2832,8 642,4 0 1375,6 9146,6
indukcja 69 godzin 0 4937,3 340,3 71,9 1652,8 23693,5
indukcja 69 godzin + substrat 0 556,9 659, 1 21,9 755,6 16688,2
kontrola + (oczyszczony enzym) 21853 21853
kontrola - (brak enzymu) 0 254,3 0 254,3
Pozytywne wyniki uzyskano dla ekstraktów komórkowych z pełnym dwugenowym konstruktem z substratem dodanym do podłoża i bez. Wyniki te, porównane z kontrolami pozytywnymi, wskazują, że enzymy ulegały ekspresji w drożdżach na poziomie zbliżonym do 1% całkowitego białka. Ilość monatyny wytwarzanej, gdy oznaczano ekstrakt komórkowy z konstruktu aspC (ze skróconym proA) z dodatkiem aldolazy była znacznie wyższa, niż gdy oznaczenia prowadzono dla samego ekstraktu i wskazywała, że rekombinowana aminotransferaza AspC stanowi około 1-2% całkowitego białka drożdży. Ekstrakty komórkowe nieindukowanych hodowli oznaczane z dodatkiem aldolazy wykazywały niską aktywność ze względu na obecność w komórkach natywnych aminotransferaz. Aktywność dla ekstraktów z nieindukowanych hodowli, mierzona w obecności aminotransferazy AspC, wzrastała do poziomu monatyny produkowanej przez negatywną kontrolę z AspC (około 200 ng/ml). Inaczej jest w przypadku ekstraktów komórkowych z konstruktów dwugenowych, gdzie aktywność rośnie bardziej po dodaniu aminotransferazy niż po dodaniu aldolazy. Ponieważ oba geny powinny ulegać ekspresji na tym samym poziomie, wskazuje to, że ilość produkowanej monatyny jest wyższa, gdy poziom aminotransferazy jest wyższy niż aldolazy, zgodnie z wynikami przedstawionymi w Przykładzie 6.
Dodanie pirogronianu i tryptofanu nie tylko hamuje wzrost komórek, ale najwyraźniej hamuje również ekspresję białka. Dodanie plazmidu pESC-Trp można wykorzystać do usunięcia auksotrofii dla tryptofanu komórek gospodarza YPH500, zapewniając sposób na dostarczanie tryptofanu przy mniejszym wpływie na wzrost, ekspresję i sekrecję.
P r z y k ł a d 13
Poprawa procesów enzymatycznych za pomocą reakcji sprzężonych
W teorii, jeśli nie występują reakcje poboczne ani degradacja substratów lub półproduktów, to maksymalna ilość wytworzonego produktu z reakcji enzymatycznej przedstawionej na Fig. 1 jest wprostproporcjonalna do stałych równowagi każdej reakcji oraz stężeń tryptofanu i pirogronianu. Tryptofan nie jest substratem dobrze rozpuszczalnym, a stężenia pirogronianu przekraczające 200 nM wydają się mieć negatywny wpływ na wydajność (patrz Przykład 6).
Ideałem jest maksymalizacja stężenia monatyny wobec substratów, umożliwiająca obniżenie kosztów rozdziału. Można prowadzić fizyczny rozdział tak, że monatynę usuwa się z mieszaniny reakcyjnej, zapobiegając przed reakcją przebiegającą w kierunku przeciwnym. Następnie, można regenerować surowce i katalizatory. Ze względu na podobieństwo monatyny do kilku odczynników i półproduktów pod względem wielkości, ładunku i hydrofobowości, fizyczny rozdział byłby trudny, chyba że znaleziono by wysoko specyficzne oddziaływania z monatyną (np. do techniki chromatografii powinowactwa). Jednakże reakcje syntezy monatyny mogą zostać sprzężone z innymi reakcjami, tak że równowaga układu przesunie się w kierunku wytwarzania monatyny. Poniżej podane są przykłady procesów poprawiających wydajność otrzymywania monatyny z tryptofanu lub indolo-3-pirogronianu.
Reakcje sprzężone z wykorzystaniem dekarboksylazy szczawiooctanowej (EC 4.1.1.3)
Fig. 11 ilustruje tę reakcję. Wykorzystuje się oksydazę tryptofanową i katalazę, aby przesunąć równowagę w stronę wytwarzania indolo-3-pirogronianu. Katalazy używa się w nadmiarze, żeby nie pozostawał nadtlenek wodoru zdolny do reakcji w odwrotnym kierunku lub do uszkodzePL 208 998 B1 nia enzymów bądź półproduktów. Podczas reakcji katalazy regenerowany jest tlen. Alternatywnie jako substrat można stosować indolo-3-pirogronian.
Jako donor grupy aminowej do aminacji MP stosuje się asparaginian i wykorzystuje się aminotransferazę asparaginianową. W idealnym układzie, używa się aminotransferaz, które mają niską specyficzność dla reakcji tryptofan/indolo-3-pirogronian w porównaniu do reakcji MP do monatyny, tak że asparaginian nie jest wykorzystywany do ponownej aminacji indolo-3-pirogronianu. W celu przekształcenia szczawiooctanu do pirogronianu i dwutlenku węgla można dodać dekarboksylazy szczawiooctanowej (z Pseudomonas sp.). Ponieważ CO2 jest lotny, nie jest dostępny do reakcji z enzymami, zmniejszając lub nawet eliminując reakcję przeciwną. Pirogronian wyprodukowany w tym etapie można również wykorzystywać w reakcji kondensacji aldolowej. Można stosować inne dekarboksylazy, a wiadomo, że ich homologii występują w Actinobacillus actinomycetemcomitans, Aquifex aeolicus, Archaeoglobus fulgidus, Azotobacter vinelandii, Bacteroides fragilis, kilku gatunkach Bordetella, Campylobacter jejuni, Chlorobium tepidum, Chloroflexus aurantiacus, Enterococcus faecalis, Fusobacterium nucleatum, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophila, Magnetococcus MC-1, Mannheimia haemolytica, Methylobacillus flagellatus KT, Pasteurella multocida PM70, Petrotoga miotherma, Porphyromonas gingivalis, kilka gatunkach Pseudomonas, kilku gatunkach Streptococcus, Thermochromatium tepidum, Thermotoga maritima, Treponema pallidum i kilka gatunkach Vibrio.
Oznaczenia aminotransferazy tryptofanowej przeprowadzono z aminotransferazą asparaginianową (AspC) z E. coli, aminotransferazą tyrozynową (TyrB) z E. coli, aminotransferazą o szerokim spektrum substratowym (BSAT) z L. major i dwoma świńskimi aminotransferazami glutaminiano-szczawiooctowymi dostępnymi komercyjnie, tak jak opisano w Przykładzie 1. Jako akceptor grupy aminowej testowano zarówno szczawiooctan jak i alfa-ketoglutaran. Porównywano stosunki aktywności dla monatyny (Przykład 7) z aktywnością dla tryptofanu, aby ustalić który z enzymów ma najwyższą specyficzność dla reakcji aminotransferazy monatyny. Wyniki te wskazują, że enzymem o najwyższej specyficzności dla reakcji monatyny w porównaniu z reakcją z tryptofanem jest aminotransferaza glutaminiano-szczawiooctowa typu II-A ze świni, GOAT (Sigma G7005). Specyficzność ta nie zależała od użytego akceptora grupy aminowej. Dlatego też ten enzym został użyty do reakcji sprzężonych z dekarboksylazą szczawiooctanową.
Typowa reakcja rozpoczynająca się od indolo-3-pirogronianu obejmowała (stężenia końcowe) 50 mM Tris-Cl pH 7,3, 6 mM indolo-3-pirogronian, 6 mM pirogronian sodowy, 6 mM asparaginian, 0,05 mM PLP, 3 mM fosforan potasowy, 3 mM MgCl2, 25 μg/ml aminotransferazy, 50 μg/ml aldolazy ProA C. testosteroni i 3 jednostki/ml dekarboksylazy (Sigma O4878). Reakcje prowadzono w temperaturze 26°C przez 1 godzinę. W niektórych przypadkach, nie dodawano dekarboksylazy lub zamiast asparaginianu dodawano alfa-ketoglutaranu (takie reakcje służyły jako negatywne kontrole). Opisane powyżej aminotransferazy były również testowane w miejsce GOAT, aby potwierdzić wcześniejsze eksperymenty dotyczące specyficzności. Próbki filtrowano i analizowano za pomocą LC/MS, tak jak opisano w Przykładzie 10. Wyniki pokazują, że GOAT wytwarzała największe ilości monatyny na mg białka, przy najniższych ilościach tryptofanu powstającego jako produkt uboczny. Ponadto uzyskiwano 2-3 krotny przyrost po dodaniu dekarboksylazy. Enzym AspC z E. coli również wytwarzał duże ilości monatyny w porównaniu z innymi aminotransferazami.
Produkcję monatyny zwiększano przez: 1) okresowe dodawanie 2 mM dodatków indolopirogronianu, pirogronianu i asparaginianu (co pół godziny do godziny), 2) prowadzenie reakcji w środowisku beztlenowym lub z odgazowanymi buforami, 3) wydłużenie reakcji przez noc, oraz 4) używanie świeżo przygotowanej dekarboksylazy, która nie była wielokrotnie rozmrażana-zamrażana. Dekarboksylazę hamowały stężenia pirogronianu wyższe od 12 mM. Przy stężeniach indolo-3-pirogronianu wyższych niż 4 mM przyśpieszały się reakcje uboczne z indolo-3-pirogronianem. Ilość indolo-3-pirogronianu wykorzystaną w reakcji można zwiększyć, jeśli zwiększy się również ilość aldolazy. Stwierdzono, że wysoki poziom fosforanu (50 mM) i asparaginianu (50 mM) hamuje dekarboksylazę. Ilość dodanej dekarboksylazy można było zmniejszyć do 0,5 jednostki/ml bez zmniejszenia produkcji monatyny w 1-godzinnej reakcji. Ilość wytwarzanej monatyny wzrosła, gdy temperaturę podniesiono z 26°C do 30°C i z 30°C do 37°C; jednakże w temperaturze 37°C przyspieszone zostały również uboczne reakcje indolo-3-pirogronianu. Ilość powstającej monatyny wzrastała wraz ze wzrostem pH od 7 do 7,3 i była stosunkowo stabilna w pH od 7,3 do 8,3.
Typowa reakcja rozpoczynająca się od tryptofanu zawierała (stężenia końcowe) 50 mM Tris-Cl pH 7,3, 20 mM tryptofan, 6 mM asparaginian, 6 mM pirogronian sodowy, 0,05 mM PLP,
PL 208 998 B1 mM fosforan potasowy, 3 mM MgCl2, 25 μg/ml aminotransferazy, 50 μg/ml aldolazy ProA
C. testosteroni, 4 jednostki/ml dekarboksylazy, 5-200 milijednostek/ml oksydazy L-aminokwasowej (Sigma A-2805), 168 jednostek/ml katalazy (Sigma C-3515) i 0,008 mg FAD. Reakcje przeprowadzano przez 30 minut w temperaturze 30°C. Przy dodaniu dekarboksylazy obserwowano poprawę. Największa ilość monatyny powstawała, gdy użyto 50 milijednostek/ml oksydazy. Poprawa była podobna do obserwowanej, gdy jako substrat używano indolo-3-pirogronian. Ponadto, ilość powstającej monatyny wzrastała, gdy 1) poziom tryptofanu był niski (tj. poniżej Km enzymu aminotransferazy, a przez to poniżej stężenia, przy którym współzawodniczyłby z MP o miejsce aktywne) i 2) stosunek oksydazy do aldolazy i aminotransferazy utrzymywano na niskim poziomie, tak że nie gromadził się indolo-3-pirogronian.
Niezależnie od tego, czy reakcję rozpoczynano od indolo-3-pirogronianu, czy od tryptofanu ilość monatyny wytwarzanej w oznaczeniach przy czasie inkubacji 1-2 godzin rosła, gdy używano 2-4 razy więcej wszystkich enzymów, przy utrzymaniu tych samych proporcji. Przy użyciu obu substratów uzyskiwano stężenie monatyny około 1 mg/ml. Ilość powstałego tryptofanu, gdy rozpoczynano od indolo-3-pirogronianu była zazwyczaj poniżej 20% ilości produktu, co pokazuje korzyść z zastosowania reakcji sprzężonych. Przy dalszej optymalizacji i kontroli stężeń półproduktów i reakcji ubocznych można znacznie zwiększyć produktywność i wydajność.
Reakcje sprzężone wykorzystujące aminotransferazę epsilon lizynową (EC 2.6.1.36)
Aminotransferazę epsilon lizynową (L-lizyno 6-transaminazę) znaleziono w kilku organizmach, w tym u Rhodococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Nocardia, Flavobacterium, Candida utilis i Streptomyces. Organizmy wykorzystują ją w pierwszym etapie syntezy pewnych antybiotyków beta-laktamowych (Rius i Demain, J. Microbiol. Biotech., 7: 95-100, 1997). Enzym ten przekształca lizynę do 6-semialdehydu L-2-aminoadypinianowego (allizyny) przez transaminację C-6 lizyny z udziałem PLP wykorzystując alfa-ketoglutaran jako akceptor grupy aminowej. Allizyna jest nietrwała i spontanicznie ulega dehydratacji wewnątrzcząsteczkowej prowadzącej do 1-piperydyno-6-karboksylanu, cząsteczki cyklicznej. To skutecznie hamuje jakiekolwiek reakcje odwrotne. Schemat reakcji przedstawia Fig. 12. Można również wykorzystywać alternatywny enzym, 6-transaminazę lizyno-pirogronianową (EC 2.6.1.71).
Typowa reakcja obejmowała w 1 ml: 50 mM Tris-HCl pH 7,3, 20 mM indolo-3-pirogronian, 0,05 mM PLP, 6 mM fosforan potasowy pH 8, 2-50 mM pirogronian sodowy, 1,5 mM MgCl2, 50 mM lizynę, 100 μg aminotransferazy (aminotransferazy epsilon lizynowej LAT-101, BioCatalytics Pasadena, CA) i 200 μg aldolazy ProA C. testosteroni. Ilość wytwarzanej monatyny rosła ze wzrostem stężenia pirogronianu. Maksymalna ilość w tych warunkach reakcji (przy 50 mM pirogronianie) była 10-krotnie wyższa niż ta obserwowana przy sprzężonych reakcjach wykorzystujących dekarboksylazę szczawiooctanową (około 0,1 mg/ml).
Szczyt o [M + H]+ = 293 eluował w czasie przewidywanym dla monatyny i spektrum masowe zawierało kilka z fragmentów obserwowanych w innych procesach enzymatycznych. Nieco wcześniej niż obserwowany czas elucji S,S monatyny wytwarzanej w Przykładzie 6 eluował drugi szczyt o spodziewanym stosunku masy do ładunku (293), co może wskazywać na obecność innego izomeru monatyny. Ten enzym wytwarzał bardzo mało tryptofanu. Jednakże, najprawdopodobniej wykazuje on pewną aktywność wobec pirogronianu (tworząc alaninę jako produkt uboczny). Wiadomo również, że enzym jest nietrwały. Można dokonać ulepszeń wykorzystując doświadczenia z ukierunkowaną ewolucją, aby poprawić stabilność, zmniejszyć aktywność wobec pirogronianu i zwiększyć aktywność wobec MP. Reakcje te można również sprzęgać z oksydazą L-aminokwasową/katalazą, jak opisano powyżej.
Inne reakcje sprzężone
Inną reakcję sprzężoną, która może poprawić wydajność uzyskiwania monatyny z tryptofanu lub indolo-pirogronianu przedstawiono na Fig. 13. Dehydrogenaza mrówczanowa (EC 1.2.1.2 lub 1.2.1.43) jest powszechnie występującym enzymem. Niektóre dehydrogenazy mrówczanowe wymagają NADH, podczas gdy inne mogą wykorzystywać NADPH. Dehydrogenaza glutaminianowa katalizowała przemianę pomiędzy prekursorem monatyny a monatyną w poprzednich przykładach, przy wykorzystaniu buforów opartych na grupach amonowych. Obecność mrówczanu amonowego i dehydrogenazy mrówczanowej stanowi efektywny system regeneracji kofaktorów, a wytwarzanie dwutlenku węgla jest efektywnym sposobem zmniejszania prędkości reakcji przeciwnej (Bommarius i in., Biocatalysis 10: 37, 1994 i Galkin i in. Appl. Environ. Microbiol. 63: 4651-6, 1997). W dodatku, w buforze reakcyjnym można rozpuścić duże ilości mrówczanu amonowego. Wydajność wyPL 208 998 B1 twarzania monatyny przez reakcje dehydrogenazy glutaminianowej (lub podobne aminacje redukujące) można poprawiać przez dodanie dehydrogenazy mrówczanowej i mrówczanu amonowego.
Inne sposoby można wykorzystać do zmiany równowagi w kierunku wytwarzania monatyny. Na przykład, gdy jako donor aminokwasu w konwersji MP do monatyny aminotransferazą omegaaminokwasową (EC 2.6.1.18) wykorzystuje się aminopropan, tak jak opisano w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach 5 360 724 i 5 300 437, jednym z powstających produktów jest aceton, produkt bardziej lotny niż substrat, aminopropan. Okresowo można podnosić temperaturę na krótkie okresy czasu, aby usunąć aceton i polepszyć równowagę. Temperatura wrzenia acetonu, 47°C, użyta przez krótki czas prawdopodobnie nie zniszczy półproduktów. Większość aminotransferaz, które wykazują aktywność wobec alfa-ketoglutaranu, wykazują również aktywność wobec prekursora monatyny. Podobnie, gdy wykorzystuje się aminotransferazy glioksylan/kwas aromatyczny (EC 2.6.1.60) z glicyną, jako donorem grup aminowych, powstaje glioksylan, który jest stosunkowo nietrwały i ma znacznie obniżony punkt wrzenia w stosunku do glicyny.
P r z y k ł a d 14
Ekspresja rekombinacyjna
Dzięki powszechnie dostępnym sekwencjom cDNA i aminokwasowym enzymów oraz enzymom i sekwencjom przedstawionym w opisie, takim jak sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 11 i 12, jak również ich wariantom, mutantom, fragmentom i fuzjom, możliwa staje się ekspresja i oczyszczanie dowolnego białka, takiego jak enzym przy zastosowaniu standardowych technik laboratoryjnych. Specjalista w tej dziedzinie będzie rozumiał, że enzymy i ich fragmenty można wytwarzać w formie rekombinowanej w dowolnym rodzaju komórek, czy organizmie i, że można je oczyszczać przed użyciem, np. przed wytwarzaniem sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 12 i jej pochodnych.
Metody wytwarzania białek rekombinowanych są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie. Dlatego też zakres wynalazku obejmuje ekspresję dowolnego białka lub jego fragmentu, takiego jak enzym, w formie rekombinowanej. Na przykład US 5 342 764 Johnsona i in.; US 5 846 819 Pauscha i in., US 5 876 969 Fleer i in. oraz Sambrook i in. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989, rozdział 17).
W skrócie, część, całość lub wariant sekwencji cDNA, które kodują białko lub peptyd można zligować z wektorem ekspresyjnym, takim jak bakteryjny lub eukariotyczny wektor ekspresyjny. Białka i/lub peptydy można wytwarzać umieszczając przed sekwencją cDNA promotor. Przykłady promotorów obejmują, ale nie ograniczają się do promotorów lac, trp, tac, trc, głównych regionów operatorowych i promotorowych faga lambda, regionu kontrolujący białko płaszcza fd, promotorów wczesnego i późnego SV40, promotorów pochodzących z wirusa polyoma, adenowirusa, retrowirusa, bakulowirusa i wirusa małpiego, promotora kinazy 3-fosfoglicerynowej, promotorów drożdżowej kwaśnej fosfatazy, promotora drożdżowego czynnika rozrodczego alfa i ich kombinacji.
Wektory odpowiednie do wytwarzania nienaruszonych natywnych białek obejmują pKC30 (Shimitake i Rosenberg, 1981, Nature 292: 128), pKK177-3 (Mann i Brosius, 1985, Gene 40: 183) i pET-3 (Studier i Moffatt, 1986, J. Mol. Biol. 189: 113). Sekwencję DNA można przenieść do innego wektora do klonowania, takiego jak inne plazmidy, bakteriofagi, kosmidy, wirusy zwierzęce i sztuczne chromosomy drożdży (YAC) (Burke i in., 1987, Science 236: 806-12). Wektory te można wprowadzać do różnych gospodarzy, w tym komórek somatycznych i do prostych lub złożonych organizmów, takich jak bakterie, grzyby (Timberlake i Marshall, 1989, Science 244:1313-7), bezkręgowce, rośliny (Gasser i Fraley, 1989, Science 244:1293) i ssaki (Pursel i in., 1989, Science 244: 1281-8), które stają się transgeniczne przez wprowadzenie heterologicznego cDNA.
Aby uzyskać ekspresję w komórkach ssaczych, sekwencję cDNA można zligować z heterologicznymi promotorami, takimi jak promotor małpiego wirusa SV40 w wektorze pSV2 (Mulligan i Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072-6) i wprowadzać do komórek takich jak małpie komórki COS-1 (Gluzman, 1981, Cell 23: 175-82), aby uzyskać ekspresję przejściową lub stałą. Stabilną integrację konstruktu z genem chimerycznym można utrzymać w komórkach ssaczych poprzez selekcję biochemiczną, np. za pomocą neomycyny (Southern i Berg, 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1: 327-41) i kwasu mykofenolowego (Mulligan i Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072-6).
Przeniesienie DNA do komórek euariotycznych, takich jak ludzkie lub inne ssacze, jest konwecjonalną techniką. Wektory wprowadza się do komórek biorcy jako czyste DNA (transfekeja) na przykład poprzez precypitację fosforanem wapnia (Graham i vander Eb, 1973, Virology 52: 466), fosforanem strontu (Brash i in., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 2013), elektroporację (Neumann
PL 208 998 B1 i in., 1982, EMBO J. 1: 841), lipofekcję (Felgner i in., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413), traktowanie DEAE dekstranem (McCuthan i in., 1968, J. Natl. Cancer Inst. 41: 351), mikroiniekcję (Mueller i in., 1978, Cell 15: 579), fuzję protoplastów (Schafner, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 11: 2163-7) lub pistolet genowy (Klein i in., 1987, Nature 327: 70). Alternatywnie cDNA można wprowadzać za pomocą infekcji wektorami wirusowymi, na przykład retrowirusami (Bernstein i in., 1985, Gen. Engrg. 7:235), adenowirusami (Ahmad i in., 1986, J. Virol. 57 : 267) lub herpeswirusami (Spaete i in., 1982, Cell 30: 295).
LISTA SEKWENCJI <110> Cargill, Incorporated <120> Polipeptydy i szlaki biosyntetyczne <130> 6682-65741 <150> 60/374,831 <151> 2002-04-23 <160> 74 <170> Patentin wersja 3.1 <210> 1 <211> 1170 <212> DNA <213> Sinorhizobium meliloti <400> 1
atgttcgacg ccctcgcccg ccaagccgac gatcccttgc ttttcctgat cggcctgttc 60
aggaaggatg agcgccccgg aaaggtcgat ctcggcgtag gagtctatcg cgacgagacc 120
ggacgcacgc cgatcttccg ggccgtcaag gcggcggaaa agcggcttct cgaaacacag 180
gacagcaagg cctatatcgg ccccgaaggg gacctcgtct ttctcgatcg gctetgggaa 240
ctcgtcggcg gcgacacgat cgagcggagc catgttgcgg gcgtccagac gcccggcggc 300
tccggcgcgc tccgtttggc ggcggacctc atcgcccgca tgggcggccg aggcatctgg 360
ctcgggctgc cgagctggcc gaaccacgcg ccgatcttca aggcggccgg gctcgatatc 420
gccacctacg acttcttcga cattccgtcg cagtcggtca tcttcgataa tctggtgagc 480
gcgctggaag gcgccgcatc cggcgatgcg gtgctgctgc atgcaagctg ccacaacccg 540
accggcggcg tcctgagcga agcacaatgg atggagatcg ccgcgctggt ggccgagcgc 600
ggcctgctgc cgctcgtcga tctcgcctat caggggttcg gccgcggcct cgaccaggat 660
gtcgcgggcc tccggcatct tctcggcgtg gtcccggaag cgctcgtcgc ggtttcctgc 720
tcgaagtcct tcgggcttta tcgcgagcgc gcgggcgcga tcttcgcgcg gaccagctcg 780
actgcctcgg cggacagggt gcgctcaaac ctcgcgggcc tcgcacgcac cagctattcc 840
atgccgccgg atcacggcgc agccgtcgtg cggacgatcc ttgacgaccc ggaactcagg 900
cgcgactgga cggaggagct cgagacgatg cggctcagga tgacgggcct ccggcggtcg 960
cttgccgagg gactccgcac ccgctggcag agcctcggcg cagtcgccga tcaggagggc 1020
atgttctcca tgctgccgct ttccgaagcg gaggttatgc ggctcaggac cgagcacggc 1080
atctatatgc cggcatccgg ccgcatcaac atcgccgggc tgaagacggc ggaagccgcc 1140
gagattgccg gcaagttcac cagtctctga 1170
<210> 2 <211> 389
PL 208 998 B1 <212> białko <213> Sinorhizobium meliloti <400> 2
Met Phe Asp Ala Leu Ala Arg Gin Ala Asp Asp Pro Leu Leu Phe Leu 15 10 15
Ile Gly Leu Phe Arg Lys Asp Glu Arg Pro Gly Lys Val Asp Leu Gly 20 25 30
Val Gly Val Tyr Arg Asp Glu Thr Gly Arg Thr Pro Ile Phe Arg Ala 35 40 45
Val Lys Ala Ala Glu Lys Arg Leu Leu Glu Thr Gin Asp Ser Lys Ala 50 55 60
Tyr Ile Gly Pro Glu Gly Asp Leu Val Phe Leu Asp Arg Leu Trp Glu 65 70 75 80
Leu Val Gly Gly Asp Thr Ile Glu Arg Ser His Val Ala Gly Val Gin 85 90 95
Thr Pro Gly Gly Ser Gly Ala Leu Arg Leu Ala Ala Asp Leu Ile Ala 100 105 110
Arg Met Gly Gly Arg Gly Ile Trp Leu Gly Leu Pro Ser Trp Pro Asn 115 120 125
His Ala Pro Ile Phe Lys Ala Ala Gly Leu Asp Ile Ala Thr Tyr Asp 130 135 140
Phe Phe Asp Ile Pro Ser Gin Ser Val Ile Phe Asp Asn Leu Val Ser 145 150 155 160
Ala Leu Glu Gly Ala Ala Ser Gly Asp Ala Val Leu Leu His Ala Ser 165 170 175
Cys His Asn Pro Thr Gly Gly Val Leu Ser Glu Ala Gin Trp Met Glu 180 185 190
Ile Ala Ala Leu Val Ala Glu Arg Gly Leu Leu Pro Leu Val Asp Leu 195 200 205
Ala Tyr Gin Gly Phe Gly Arg Gly Leu Asp Gin Asp Val Ala Gly Leu 210 . 215 220
Arg His Leu Leu Gly Val Val Pro Glu Ala Leu Val Ala Val Ser Cys 225 230 235 240
PL 208 998 B1
Ser Lys Ser Phe Gly Leu Tyr Arg Glu Arg Ala Gly Ala Ile Phe Ala 245 250 255
Arg Thr Ser Ser Thr Ala Ser Ala Asp Arg Val Arg Ser Asn Leu Ala 260 265 270
Gly Leu Ala Arg Thr Ser Tyr Ser Met Pro Pro Asp His Gly Ala Ala 275 280 285
Val Val Arg Thr Ile Leu Asp Asp Pro Glu Leu Arg Arg Asp Trp Thr 290 295 300
Glu Glu Leu Glu Thr Met Arg Leu Arg Met Thr Gly Leu Arg Arg Ser 305 310 315 320
Leu Ala Glu Gly Leu Arg Thr Arg Trp Gin Ser Leu Gly Ala Val Ala 325 330 335
Asp Gin Glu Gly Met Phe Ser Met Leu Pro Leu Ser Glu Ala Glu Val 340 345 350
Met Arg Leu Arg Thr Glu His Gly Ile Tyr Met Pro Ala Ser Gly Arg 355 360 365
Ile Asn Ile Ala Gly Leu Lys Thr Ala Glu Ala Ala Glu Ile Ala Gly 370 375 380
Lys Phe Thr Ser Leu 385
<210> 3
<211> 1260 <212> DNA <213> Rhodobacter sphaeroides
<400> 3 atgcgctcta cgacggctcc tggtccgagt ggggcatgta tgacgatctc aaggtcgcga 60
aaggatgacg aaggaatgct gaccgccctg aagccgcagc ccgcggacaa gatcctgcaa 120
ctgatccaga tgttccgcga ggatgcgcgc gcggacaaga tcgatctggg cgtgggcgtc 180
tacaaggacc cgaccgggct caccccggtc atgcgggccg tgaaggcggc cgagaagcgg 240
ctctgggagg tcgagaccac caagacctac accggccttg ccgacgagcc ggcctacaat 300
gccgcgatgg cgaagctgat cctcgcgggc gcggtcccgg ccgaccgggt ggcctcggtc 360
gccacccccg gcggcacggg cgcggtgcgt caggcgctcg agctgatccg catggcctcg 420
cccgaggcca ccgtctggat ctcgaacccg acctggccga accatctgtc gatcgtgaaa 480
tatctcggca tcccgatgcg ggaataccgc tatttcgacg ccgagaccgg cgccgtcgat 540
PL 208 998 B1
gccgagggca tgatggagga tctggcccag gtgaaggcgg gcgacgtggt gctgctgcac 600
ggctgctgcc acaacccgac cggcgccaac ccgaacccgg tgcagtggct ggccatctgc 660
gagagcctgg cccggacagg cgcggtgccg ctgatcgacc tcgcctatca gggcttcggc 720
gacgggctcg agatggatgc ggcggcgacg cggcttctgg ccaccagact gcccgaggtg 780
ctgatcgcgg cctcctgctc gaagaacttc ggcatctacc gcgagcgcac gggcatcctg 840
atcgccatcg gcgaggcggc gggccggggc acggtgcagg ccaacctcaa cttcctgaac 900
cggcagaact actccttccc gccggaccat ggcgcgcggc tcgtgaccat gatcctcgag 960
gacgagacgc tgagcgccga ctggaaggcg gaactcgagg aggtgcggct caacatgctg 1020
acactgcgcc gccagcttgc cgatgcgctg caggccgaga ccggctcgaa ccgcttcggc 1080
ttcgtggccg agcatcgcgg catgttctcg cgcctcggga tcacgcocgc cgaggtggag 1140
cggctgcgga ccgagcacgg ggtctacatg gtgggcgatt cgcggctgaa catcgcgggg 1200
ctgaaccgga cgaccgtgcc ggtgctggcg cgcgcggtgg ccaaggtgct gcgcggctga 1260
<210> 4 <211> 419 <212> białko <213> Rhodobacter sphaeroides <400> 4
Met 1 Arg Ser Thr Thr 5 Ala Pro Gly Pro Ser 10 Gly Ala Cys Met Thr 15 Ile
Ser Arg Ser Arg Lys Asp Asp Glu Gly Met Leu Thr Ala Leu Lys Pro
20 25 30
Gin Pro Ala Asp Lys Ile Leu Gin Leu Ile Gin Met Phe Arg Glu Asp
35 40 45
Ala Arg Ala Asp Lys Ile Asp Leu Gly Val Gly Val Tyr Lys Asp Pro
50 55 60
Thr Gly Leu Thr Pro Val Met Arg Ala Val Lys Ala Ala Glu Lys Arg
65 70 75 80
Leu Trp Glu Val Glu Thr Thr Lys Thr Tyr Thr Gly Leu Ala Asp Glu
85 90 95
Pro Ala Tyr Asn Ala Ala Met Ala Lys Leu Ile Leu Ala Gly Ala Val
100 105 110
Pro Ala Asp Arg Val Ala Ser Val Ala Thr Pro Gly Gly Thr Gly Ala
115 120 125
PL 208 998 B1
Val Arg Gin Ala Leu Glu Leu Ile Arg Met Ala Ser Pro Glu Ala Thr 130 135 140
Val Trp Ile Ser Asn Pro Thr Trp Pro Asn His Leu Ser Ile Val Lys 145 150 155 160
Tyr Leu Gly Ile Pro Met Arg Glu Tyr Arg Tyr Phe Asp Ala Glu Thr 165 170 175
Gly Ala Val Asp Ala Glu Gly Met Met Glu Asp Leu Ala Gin Val Lys 180 185 190
Ala Gly Asp Val Val Leu Leu His Gly Cys Cys His Asn Pro Thr Gly 195 200 205
Ala Asn Pro Asn Pro Val Gin Trp Leu Ala Ile Cys Glu Ser Leu Ala 210 215 220
Arg Thr Gly Ala Val Pro Leu Ile Asp Leu Ala Tyr Gin Gly Phe Gly 225 230 235 240
Asp Gly Leu Glu Met Asp Ala Ala Ala Thr Arg Leu Leu Ala Thr Arg 245 250 255
Leu Pro Glu Val Leu Ile Ala Ala Ser Cys Ser Lys Asn Phe Gly Ile 260 265 270
Tyr Arg Glu Arg Thr Gly Ile Leu Ile Ala Ile Gly Glu Ala Ala Gly 275 280 285
Arg Gly Thr Val Gin Ala Asn Leu Asn Phe Leu Asn Arg Gin Asn Tyr 290 295 300
Ser Phe Pro Pro Asp His Gly Ala Arg Leu Val Thr Met Ile Leu Glu 305 310 315 320
Asp Glu Thr Leu Ser Ala Asp Trp Lys Ala Glu Leu Glu Glu Val Arg 325 330 335
Leu Asn Met Leu Thr Leu Arg Arg Gin Leu Ala Asp Ala Leu Gin Ala 340 345 350
Glu Thr Gly Ser Asn Arg Phe Gly Phe Val Ala Glu His Arg Gly Met 355 360 365
Phe Ser Arg Leu Gly Ile Thr Pro Ala Glu Val Glu Arg Leu Arg Thr 370 375 380
PL 208 998 B1
Glu His Gly Val Tyr Met Val Gly Asp Ser Arg Leu Asn Ile Ala Gly
385 390 395 400
Leu Asn Arg Thr Thr Val Pro Val Leu Ala Arg Ala Val Ala Lys Val
405 410 415
Leu Arg Gly <210> 5 <211> 1260 <212> DNA <213> Rhodobacter sphaeroides <400> 5
atgcgctcta cgacggctcc tggtccgagt ggggcatgta tgacgatctc aaggtcgcga 60
aaggatgacg aaggaatgct gaccgccctg aagccgcagc ccgcggacaa gatcctgcaa 120
ctgatccaga tgttccgcga ggatgcgcgc gcggacaaga tcgatctggg cgtgggcgtc 180
tacaaggacc cgaccgggct caccccggtc atgcgggccg tgaaggccgc cgagaagcgg 240
ctctgggagg tcgagaccac caagacctac accggccttg ccggcgagcc cgcctacaat 300
gccgcgatgg cgaagctgat cctcgcaggc gcggtcccgg ccgaccgggt ggcctcggtc 560
gccacccccg gcggcacggg cgcggtgcgt caggcgctcg agctgatccg catggcctcg 420
cccgaggcca ctgtctggat ctcgaacccg acctggccga accatctgtc gatcgtgaaa 480
tatcteggca tcccgatgcg ggaataccgc tatttcgacg ccgagaccgg cgccgtcgat 540
gccgagggct tgatggagga tctggcccag gtgaaggcgg gcgacgtggt gctgctgcac 600
ggctgctgcc acaacccgac cggcgccaac ccgaacccgg tgcagtggct ggccgtctgc 660
gagagcctgg cccggacagg cgcggtgccg ctgatcgacc tcgcctatca gggcttcggc 720
gacgggctcg agatggatgc ggcggcgacg cggcttctgg ccaccagact gcccgaggtg 780
ctgatcgcgg cctcctgctc gaagaacttc ggcatetacc gcgagcgaac gggcatcctg 840
atcgccatcg gcgaggcggc gggccggggc acggtgcagg ccaacctcaa cttcctgaac 900
cggcagaact actccttccc gccggaccat ggcgcgcggc tcgtgaccat gatcctcgag 960
gacgagacgc tgagcgccga ctggaaggcg gaactcgagg aggtgcggct caacatgctg 1020
acgctgcgcc gccagcttgc cgatgcgctg caggccgaga ccggctcgaa ccgcttcggc 1080
ttcgtggccg agcatcgcgg catgttctcg cgcctcggga tcacgcccgc cgaggtggag 1140
cggctgcgga ccgagcacgg ggtctacatg gtgggcgatt cgcggctgaa catcgcgggg 1200
ctgaaccgga cgaccgtgcc ggtgctggcg cgcgcggtgg ccaaggtgct gcgcggctga 1260
<210> 6 <211> 419
PL 208 998 B1 <212> białko <213> Rhodobacter sphaeroides <400> 6
Met Arg Ser Thr Thr Ala Pro Gly Pro Ser Gly Ala Cys Met Thr Ile 15 10 15
Ser Arg Ser Arg Lys Asp Asp Glu Gly Met Leu Thr Ala Leu Lys Pro 20 25 30
Gin Pro Ala Asp Lys Ile Leu Gin Leu Ile Gin Met Phe Arg Glu Asp 35 40 45
Ala Arg Ala Asp Lys Ile Asp Leu Gly Val Gly Val Tyr Lys Asp Pro 50 55 60
Thr Gly Leu Thr Pro Val Met Arg Ala Val Lys Ala Ala Glu Lys Arg 65 70 75 80
Leu Trp Glu Val Glu Thr Thr Lys Thr Tyr Thr Gly Leu Ala Gly Glu 85 90 95
Pro Ala Tyr Asn Ala Ala Met Ala Lys Leu Ile Leu Ala Gly Ala Val 100 105 110
Pro Ala Asp Arg Val Ala Ser Val Ala Thr Pro Gly Gly Thr Gly Ala 115 120 125
Val Arg Gin Ala Leu Glu Leu Ile Arg Met Ala Ser Pro Glu Ala Thr 130 135 140
Val Trp Ile Ser Asn Pro Thr Trp Pro Asn His Leu Ser Ile Val Lys 145 150 155 160
Tyr Leu Gly Ile Pro Met Arg Glu Tyr Arg Tyr Phe Asp Ala Glu Thr 165 170 175
Gly Ala Val Asp Ala Glu Gly Leu Met Glu Asp Leu Ala Gin Val Lys 180 185 190
Ala Gly Asp Val Val Leu Leu His Gly Cys Cys His Asn Pro Thr Gly 195 200 205
Ala Asn Pro Asn Pro Val Gin Trp Leu Ala Val Cys Glu Ser Leu Ala 210 215 220
Arg Thr Gly Ala Val Pro Leu Ile Asp Leu Ala Tyr Gin Gly Phe Gly 225 230 235 240
PL 208 998 B1
Asp Gly Leu Glu Met Asp Ala Ala Ala 245 Thr 250 Arg Leu Leu Ala Thr 255 Arg
Leu Pro Glu Val Leu Ile Ala Ala Ser Cys Ser Lys Asn Phe Gly Ile
260 265 270
Tyr Arg Glu Arg Thr Gly Ile Leu Ile Ala Ile Gly Glu Ala Ala Gly
275 280 285
Arg Gly Thr Val Gin Ala Asn Leu Asn Phe Leu Asn Arg Gin Asn Tyr
290 295 300
Ser Phe Pro Pro Asp His Gly Ala Arg Leu Val Thr Met Ile Leu Glu
305 310 315 320
Asp Glu Thr Leu Ser Ala Asp Trp Lys Ala Glu Leu Glu Glu Val Arg
325 330 335
Leu Asn Met Leu Thr Leu Arg Arg Gin Leu Ala Asp Ala Leu Gin Ala
340 345 350
Glu Thr Gly Ser Asn Arg Phe Gly Phe Val Ala Glu His Arg Gly Met
355 360 365
Phe Ser Arg Leu Gly Ile Thr Pro Ala Glu Val Glu Arg Leu Arg Thr
370 375 380
Glu His Gly Val Tyr Met Val Gly Asp Ser Arg Leu Asn Ile Ala Gly
385 390 395 400
Leu Asn Arg Thr Thr Val Pro Val Leu Ala Arg Ala Val Ala Lys Val
405 410 415
Leu Arg Gly <210> 7 <211> 1239 <212> DNA <213> Leishmania major <400> 7
atgtccatgc aggcggccat gaccacggcg gagcgctggc agaagattca ggcacaagct 60
cccgatgtca tcttcgatct cgcaaaacgc gccgccgctg ccaagggccc caaggccaac 120
ctcgtcattg gtgcctaccg cgaogagcag ggccgtccct atccgctacg cgtggtccgc 180
aaggctgagc agcttctctt ggacatgaat ctcgactacg agtacctacc catotcgggc 240
taccagccct tcatcgatga ggcggtaaag attatctacg gcaataccgt cgagctggag 300
PL 208 998 B1
aacctggttg cggtgcagac gctgagcggg accggtgctg tctctctcgg ggcgaagctg 360
ctgactcgcg tcttcgacgc tgagacgacg cccatctacc tttccgaccc cacgtggccc 420
aaccactacg gcgtcgtgaa ggctgctggc tggaagaaca tctgcacgta cgcctactac 480
gaccocaaga cggtcagcct gaatttcgag ggcatgaaga aagacattct ggcggcgccg 540
gacggctccg tgttcattct gcaccagtgc gcgcacaacc ccaccggcgt ggacccgtcg 600
caggagcagt ggaacgagat cgcgtcactg atgctggcca agcaccatca ggtgttcttc 660
gactccgcct accaaggcta tgcgagcggo agcctcgaca cggacgcgta tgctgcccgc 720
ctgtttgccc gccgcggcat cgaggtactg ctggcgcagt cgttctccaa gaacatgggc 780
ttgtacagcg agcgtgcagg oacgctgtcg ctgctcctca aggacaagac gaagcgcgcg 840
gatgtaaaga gcgtgatgga ttcgctgatc cgtgaggagt acacgtgccc cccagcccac 900
ggtgcccgct tagcccacot aatcctgagc aacaacgaac tgcgaaagga gtgggaggca 960
gagctatcag ccatggcaga gcgcatccgt acgatgogoc gcaccgtgta cgacgagctg 1020
ctgcgcctgc agacgcccgg gagctgggaa catgtcatta accagattgg catgttttcc 1080
ttcctcgggc tgtcaaaggc gcagtgcgaa tactgccaaa accacaacat cttcatcaca 1140
gtgtcgggcc gcgctaacat ggcaggtctg acgcatgaga cggcgctgat gctagcacag 1200
acgatcaacg atgctgtgcg caatgtgaat cgtgagtga 1239
<210> 8 <211> 412 <212> białko <213> Leishmania major
<400> 8
Met Ser Met Gin Ala Ala Met Thr Thr Ala Glu Arg Trp Gin Lys Ile
1 5 10 15
Gin Ala Gin Ala Pro Asp Val Ile Phe Asp Leu Ala Lys Arg Ala Ala
20 25 30
Ala Ala Lys Gly Pro Lys Ala Asn Leu Val Ile Gly Ala Tyr Arg Asp
35 40 45
Glu Gin Gly Arg Pro Tyr Pro Leu Arg Val Val Arg Lys Ala Glu Gin
50 55 60
Leu Leu Leu Asp Met Asn Leu Asp Tyr Glu Tyr Leu Pro Ile Ser Gly
65 70 75 80
Tyr Gin Pro Phe Ile Asp Glu Ala Val Lys Ile Ile Tyr Gly Asn Thr
85 90 95
PL 208 998 B1
PL 208 998 B1
<210> 9 <211> 1182 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 9
atggaacatt tgctgaatcc gaaagcaaga gagatcgaaa tttcaggaat acgcaaattc 60
tcgaatcttg tagcccaaca cgaagacgtc atttcactta caatcggcca gcctgatttt 120
ttcacaccgc atcatgtgaa agctgccgca aaaaaagcca ttgatgaaaa cgtgacgtca 180
tatactccga atgccggcta cctggagctg agacaagctg tgcagcttta tatgaagaaa 240
aaagcggatt tcaactatga tgctgaatct gaaattatca tcacaacagg cgcaagccaa 300
gccattgatg ctgcattccg gacgatttta tctcccggtg atgaagtcat tatgccaggg 360
cctatttatc cgggctatga acctattatc aatttgtgcg gggccaagcc tgtcattgtt 420
gatactacgt cacacggctt taagcttacc gcccggctga ttgaagatgc tctgacaccc 480
aacaccaagt gtgtcgtgct tccttatccg tcaaacccta ccggcgtgac tttatctgaa 540
gaagaactga aaagcatcgc agctctctta aaaggcagaa atgtcttcgt attgtctgat 600
gaaatataca gtgaattaac atatgacaga ccgcattact ccatcgcaac ctatttgcgg 660
gatcaaacga ttgtcattaa cgggttgtca aaatcacaca gcatgaccgg ttggagaatt 720
ggatttttat ttgcaccgaa agacattgca aagcacattt taaaggttca tcaatacaat 780
gtgtcgtgcg cctcatccat ttctcaaaaa gccgcgcttg aagctgtcac aaacggcttt 840
gacgatgcat tgattatgag agaacaatac aaaaaacgtc tggactatgt ttatgaccgt 900
cttgtttcca tgggacttga cgtagttaaa ccgtccggtg cgttttatat cttcccttct 960
attaaatcat ttggaatgac ttcatttgat tttagtatgg ctcttttgga agacgctggc 1020
gtggcactcg tgccgggcag ctcgttctca acatatggtg aaggatatgt aaggctgtct 1080
tttgcatgct caatggacac gctgagagaa ggcctagacc gtttagaatt atttgtatta 1140
aaaaaacgtg aagcaatgca gacgataaac aacggcgttt aa 1182
PL 208 998 B1 <210> 10 <211> 393
<212> białko <213> Bacillus subtilis
<400> 10 Leu Leu 5 Asn Pro Lys Ala Arg 10 Glu Ile Glu Ile Ser 15 Gly
Met 1 Glu His
Ile Arg Lys Phe Ser Asn Leu Val Ala Gin His Glu Asp Val Ile Ser
20 25 30
Leu Thr Ile Gly Gin Pro Asp Phe Phe Thr Pro His His Val Lys Ala
35 40 45
Ala Ala Lys Lys Ala Ile Asp Glu Asn Val Thr Ser Tyr Thr Pro Asn
50 55 60
Ala Gly Tyr Leu Glu Leu Arg Gin Ala Val Gin Leu Tyr Met Lys Lys
65 70 75 80
Lys Ala Asp Phe Asn Tyr Asp Ala Glu Ser Glu Ile Ile Ile Thr Thr
85 90 95
Gly Ala Ser Gin Ala Ile Asp Ala Ala Phe Arg Thr Ile Leu Ser Pro
100 105 110
Gly Asp Glu Val Ile Met Pro Gly Pro Ile Tyr Pro Gly Tyr Glu Pro
115 120 125
Ile Ile Asn Leu Cys Gly Ala Lys Pro Val Ile Val Asp Thr Thr Ser
130 135 140
His Gly Phe Lys Leu Thr Ala Arg Leu Ile Glu Asp Ala Leu Thr Pro
145 150 155 160
Asn Thr Lys Cys Val Val Leu Pro Tyr Pro Ser Asn Pro Thr Gly Val
165 170 175
Thr Leu Ser Glu Glu Glu Leu Lys Ser Ile Ala Ala Leu Leu Lys Gly
180 185 190
Arg Asn Val Phe Val Leu Ser Asp Glu Ile Tyr Ser Glu Leu Thr Tyr
195 200 205
Asp Arg Pro His Tyr Ser Ile Ala Thr Tyr Leu Arg Asp Gin Thr Ile
210 215 220
PL 208 998 B1
Val 225 Ile Asn Gly Leu Ser 230 Lys Ser His Ser Met 235 Thr Gly Trp Arg Ile 240
Gly Phe Leu Phe Ala Pro Lys Asp Ile Ala Lys His Ile Leu Lys Val
245 250 255
His Gin Tyr Asn Val Ser Cys Ala Ser Ser Ile Ser Gin Lys Ala Ala
260 265 270
Leu Glu Ala Val Thr Asn Gly Phe Asp Asp Ala Leu Ile Met Arg Glu
275 280 285
Gin Tyr Lys Lys Arg Leu Asp Tyr Val Tyr Asp Arg Leu Val Ser Met
290 295 300
Gly Leu Asp Val Val Lys Pro Ser Gly Ala Phe Tyr Ile Phe Pro Ser
305 310 315 320
Ile Lys Ser Phe Gly Met Thr Ser Phe Asp Phe Ser Met Ala Leu Leu
325 330 335
Glu Asp Ala Gly Val Ala Leu Val Pro Gly Ser Ser Phe Ser Thr Tyr
340 345 350
Gly Glu Gly Tyr Val Arg Leu Ser Phe Ala Cys Ser Met Asp Thr Leu
355 360 365
Arg Glu Gly Leu Asp Arg Leu Glu Leu Phe Val Leu Lys Lys Arg Glu
370 375 380
Ala Met Gin Thr Ile Asn Asn Gly Val
385 390
<210> 11 <211> 1176 <212> DNA <213> Lactobacillus amylovorus <400> 11
atgccagaat tagctaatga tttaggatta agcaaaaaga tcactgatgt aaaagcttca 60
ggaattagaa tctttgataa caaagtttca gctattcctg gcattatcaa attgactttg 120
ggtgaaccag atatgaatac tcctgagcat gttaagcaag cggctattaa gaatattgca 180
gataatgatt cacactatgc tccacaaaag ggaaagcttg aattaagaaa agctatcagt 240
aaatatttga aaaagattac .tggaattgaa tatgatccag aaacagaaat cgtagtaaca 300
gttggtgcaa ctgaagcaat taacgctacc ttgtttgcta ttactaatcc gggtgacaag 360
gttgcaattc ctacgccagt cttttctcta tattggcccg tggctacact tgctgatgcc 420
PL 208 998 B1
gattatgttt tgatgaatac tgcagaagat ggttttaagt taacacctaa gaagttagaa 480
gaaactatca aagaaaatcc aacaattaaa gcagtaattt tgaattatcc aactaaccca 540
actggtgttg aatatagcga agatgaaatt aaagctttgg ctaaggtaat taaagataat 600
catctgtacg taattaccga tgaaatttac agtactttga cttacggtgt aaaacacttt 660
tcaattgcca gcttaattcc agaaagagca atttatatct ctggtttatc taaatcacat 720
gcgatgactg gttatcgttt aggctatgtt gccggacctg caaaaattat ggcagaaatt 780
ggtaaagttc atggccttat ggtgacgact acgacggatt catcacaagc tgccgcaatt 840
gaagcacttg aacacggact tgatgaccct gagaaatata gggaagttta tgaaaagcgt 900
cgtgactatg ttttaaagga attagccgag atagagatgc aagcagttaa gccagaaggt 960
gcattttata tctttgctaa aattccagct aagtatggca aagacgatat gaaatttgcc 1020
ttggatttag cttttaaaga aaaagtgggt atcactccag gtagtgcatt tggtcctggt 1080
ggtgaaggtc atattagatt atcttatgca tcaagtgatg aaaacttgca tgaggcaatg 1140
aagcgaatga agaaagtttt acaagaggac gaataa 1176
<210> 12 <211> 391 <212> białko <213> Lactobacillus amylovorus <400> 12
Met 1 Pro Glu Leu Ala 5 Asn Asp Leu Gly Leu 10 Ser Lys Lys Ile Thr 15 Asp
Val Lys Ala Ser Gly Ile Arg Ile Phe Asp Asn Lys Val Ser Ala Ile
20 25 30
Pro Gly Ile Ile Lys Leu Thr Leu Gly Glu Pro Asp Met Asn Thr Pro
35 40 45
Glu His Val Lys Gin Ala Ala Ile Lys Asn Ile Ala Asp Asn Asp Ser
50 55 60
His Tyr Ala Pro Gin Lys Gly Lys Leu Glu Leu Arg Lys Ala Ile Ser
65 70 75 80
Lys Tyr Leu Lys Lys Ile Thr Gly Ile Glu Tyr Asp Pro Glu Thr Glu
85 90 95
Ile Val Val Thr Val Gly Ala Thr Glu Ala Ile Asn Ala Thr Leu Phe
100 105 110
Ala Ile Thr Asn Pro Gly Asp Lys Val Ala Ile Pro Thr Pro Val Phe
115 120 125
PL 208 998 B1
Ser Leu Tyr Trp Pro Val Ala Thr Leu Ala Asp Ala Asp Tyr Val Leu 130 135 140
Met Asn Thr Ala Glu Asp Gly Phe Lys Leu Thr Pro Lys Lys Leu Glu 145 150 155 160
Glu Thr Ile Lys Glu Asn Pro Thr Ile Lys Ala Val Ile Leu Asn Tyr 165 170 175
Pro Thr Asn Pro Thr Gly Val Glu Tyr Ser Glu Asp Glu Ile Lys Ala 180 185 190
Leu Ala Lys Val Ile Lys Asp Asn His Leu Tyr Val Ile Thr Asp Glu 195 200 205
Ile Tyr Ser Thr Leu Thr Tyr Gly Val Lys His Phe Ser Ile Ala Ser 210 215 220
Leu Ile Pro Glu Arg Ala Ile Tyr Ile Ser Gly Leu Ser Lys Ser His 225 230 235 240
Ala Met Thr Gly Tyr Arg Leu Gly Tyr Val Ala Gly Pro Ala Lys Ile 245 250 255
Met Ala Glu Ile Gly Lys Val His Gly Leu Met Val Thr Thr Thr Thr 260 265 270
Asp Ser Ser Gin Ala Ala Ala Ile Glu Ala Leu Glu His Gly Leu Asp 275 280 285
Asp Pro Glu Lys Tyr Arg Glu Val Tyr Glu Lys Arg Arg Asp Tyr Val 290 295 300
Leu Lys Glu Leu Ala Glu Ile Glu Met Gin Ala Val Lys Pro Glu Gly 305 310 315 320
Ala Phe Tyr Ile Phe Ala Lys Ile Pro Ala Lys Tyr Gly Lys Asp Asp 325 330 335
Met Lys Phe Ala Leu Asp Leu Ala Phe Lys Glu Lys Val Gly Ile Thr 340 345 350
Pro Gly Ser Ala Phe Gly Pro Gly Gly Glu Gly His Ile Arg Leu Ser 355 360 365
Tyr Ala Ser Ser Asp Glu Asn Leu His Glu Ala Met Lys Arg Met Lys 370 375 380
PL 208 998 B1
Lys Val Leu Gin Glu Asp Glu 385 390 <210> 13 <211> 1413 <212> DNA <213> R. sphaeroides <400> 13
atgcgcgagc ctcttgccct cgagatcgac ccgggccacg gcggcccgct gttcctcgcc 60
atcgccgagg cgatcaccct cgacatcacc cgcgggcggc tgaggcccgg agcgagactg 120
cccggcacac gcgcgctggc gcgggcgctc ggcgtgcatc gcaacacggt ggatgccgcc 180
tatcaggagt tgctgaccca gggctggctg caggccgagc ccgcgcgggg capcttcgtg 240
gcgcaggatc tgccgcaggg gatgctggtg cacaggcccg cgcccgcgcc ggtcgagccg 300
gtcgcgatgc gcgcggggct cgccttctcc gatggcgcgc cggaccccga gctggtgccc 360
gacaaggcgc tggcgcgggc ctttcgccgg gcgctcctgt cgcccgcctt ccgcgccgga 420
gcggattacg gcgatgcccg cggcacctcc tcgctgcggg aggcgctggc agcctatctc 480
gcctcggacc ggggcgtggt cgcggatcct gcgcggctgc tgatcgcgcg gggcagccag 540
atggcgctgt tcctggtagc ccgggcggcg ctggcgccgg gagaggcgat cgcggtcgag 600
gagccgggct atccgctggc ctgggaggcg ttccgcgcag cgggagcgga ggtgcgcggc 660
gtgccggtgg atggcggcgg cctcaggatc gacgcgctcg aggccgcgct ggcccgggat 720
ccgcgaatcc gggcggtcta tgtcacgccc catcaccagt atccgacgac cgtcaccatg 780
ggcgcggcgc ggcggttgca gcttctggaa ctggcagagc gccaccggct cgcgctgatc 840
gaggacgact acgaccacga ataccgcttc gagggccgtc cggtgctgcc gctggctgcc 900
cgcgcgccgg aaggtctgcc gctgatctat gtgggctcgc tgtcgaaact gctctcgccc 960
ggtatccggc tgggatacgc gctggcgccc gagcggctgc tgacccgcat ggccgcggcg 1020
cgcgccgcca tcgaccggca gggcgacgcg ccgctcgagg cggcgctggc cgagctgatc 1080
cgcgacggcg atctgggccg tcatgcccgc aaggcgcgca gggtctaccg ggcgcggcgg 1140
gatctgctgg cggagcgtct cacggcgcag ctggccgggc gcgccgcctt cgatctgccg 1200
gccgggggcc tcgcgctgtg gctgcgctgc gcgggcgtct cggccgagac ctgggccgaa 1260
gccgcagggc aggcggggct cgccctgctg ccgggcacgc gcttcgcgct ggagagcccg 1320
gcgccgcagg ccttccggct gggctatgcg gcgctggacg aggggcagat cgcccgggcg 1380
gtggagatcc tcgcccggag cttccccggc tga 1413
<210> 14 <211> 470 <212> białko
PL 208 998 B1 <213> R. sphaeroides <400> 14
Met Arg Glu Pro Leu Ala Leu Glu Ile Asp Pro Gly His Gly Gly Pro 15 10 15
Leu Phe Leu Ala Ile Ala Glu Ala Ile Thr Leu Asp Ile Thr Arg Gly 20 25 30
Arg Leu Arg Pro Gly Ala Arg Leu Pro Gly Thr Arg Ala Leu Ala Arg 35 40 45
Ala Leu Gly Val His Arg Asn Thr Val Asp Ala Ala Tyr Gin Glu Leu 50 55 60
Leu Thr Gin Gly Trp Leu Gin Ala Glu Pro Ala Arg Gly Thr Phe Val 65 70 75 80
Ala Gin Asp Leu Pro Gin Gly Met Leu Val His Arg Pro Ala Pro Ala 85 90 95
Pro Val Glu Pro Val Ala Met Arg Ala Gly Leu Ala Phe Ser Asp Gly 100 105 110
Ala Pro Asp Pro Glu Leu Val Pro Asp Lys Ala Leu Ala Arg Ala Phe 115 120 125
Arg Arg Ala Leu Leu Ser Pro Ala Phe Arg Ala Gly Ala Asp Tyr Gly 130 135 140
Asp Ala Arg Gly Thr Ser Ser Leu Arg Glu Ala Leu Ala Ala Tyr Leu 145 150 155 160
Ala Ser Asp Arg Gly Val Val Ala Asp Pro Ala Arg Leu Leu Ile Ala 165 170 175
Arg Gly Ser Gin Met Ala Leu Phe Leu Val Ala Arg Ala Ala Leu Ala 180 185 190
Pro Gly Glu Ala Ile Ala Val Glu Glu Pro Gly Tyr Pro Leu Ala Trp 195 200 205
Glu Ala Phe Arg Ala Ala Gly Ala Glu Val Arg Gly Val Pro Val Asp 210 215 220
Gly Gly Gly Leu Arg Ile Asp Ala Leu Glu Ala Ala Leu Ala Arg Asp 225 230 235 240
PL 208 998 B1
Pro Arg Ile Arg Ala Val Tyr Val Thr Pro His His Gin Tyr Pro Thr 245 250 255
Thr Val Thr Met Gly Ala Ala Arg Arg Leu Gin Leu Leu Glu Leu Ala 260 265 270
Glu Arg His Arg Leu Ala Leu Ile Glu Asp Asp Tyr Asp His Glu Tyr 275 280 285
Arg Phe Glu Gly Arg Pro Val Leu Pro Leu Ala Ala Arg Ala Pro Glu 290 295 300
Gly Leu Pro Leu Ile Tyr Val Gly Ser Leu Ser Lys Leu Leu Ser Pro 305 310 315 320
Gly Ile Arg Leu Gly Tyr Ala Leu Ala Pro Glu Arg Leu Leu Thr Arg 325 330 335
Met Ala Ala Ala Arg Ala Ala Ile Asp Arg Gin Gly Asp Ala Pro Leu 340 345 350
Glu Ala Ala Leu Ala Glu Leu Ile Arg Asp Gly Asp Leu Gly Arg His 355 360 365
Ala Arg Lys Ala Arg Arg Val Tyr Arg Ala Arg Arg Asp Leu Leu Ala 370 375 380
Glu Arg Leu Thr Ala Gin Leu Ala Gly Arg Ala Ala Phe Asp Leu Pro 385 390 395 400
Ala Gly Gly Leu Ala Leu Trp Leu Arg Cys Ala Gly Val Ser Ala Glu 405 410 415
Thr Trp Ala Glu Ala Ala Gly Gin Ala Gly Leu Ala Leu Leu Pro Gly 420 425 430
Thr Arg Phe Ala Leu Glu Ser Pro Ala Pro Gin Ala Phe Arg Leu Gly 435 440 445
Tyr Ala Ala Leu Asp Glu Gly Gin Ile Ala Arg Ala Val Glu Ile Leu 450 455 460
Ala Arg Ser Phe Pro Gly 465 470 <210> 15 <211> 35 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna
PL 208 998 B1
<210> 20 <211> 37 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> starter
PL 208 998 B1 <400> 20 agaggagagt tagagcctta aacgccgttg tttatcg 37 <210> 21 <211> 35 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> starter <400> 21 ggtattgagg gtcgcatgcg cgagcctctt gccct 35 <210> 22 <211> 37 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> starter <400> 22 agaggagagt tagagcctca gccggggaag ctccggg 37 <210> 23 <211> 35 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> starter <400> 23 ggtattgagg gtcgcatgtc cacgcaggcg gccat 35 <210> 24 <211> 37 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> starter <400> 24 agaggagagt tagagcctca ctcacgattc acattgc 37 <210> 25 <211> 35 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> starter .
<400> 25 ggtattgagg gtcgcatgcc agaattagct aatga 35
PL 208 998 B1
<210> 31 <211> 1194 <212> DNA <213> Ε. coli
PL 208 998 B1 <400> 31
gtgtttcaaa aagttgacgc ctacgctggc gacccgattc ttacgcttat ggagcgtttt 60
aaagaagacc ctcgcagcga caaagtgaat ttaagtatcg gtctgtacta caacgaagac 120
ggaattattc cacaactgca agccgtggcg gaggcggaag cgcgcctgaa tgcgcagcct 180
catggcgctt cgctttattt accgatggaa gggcttaact gctatcgcca tgccattgcg 240
ccgctgctgt ttggtgcgga ccatccggta ctgaaacaac agcgcgtagc aaccattcaa 300
acccttggcg gctccggggc attgaaagtg ggcgcggatt tcctgaaacg ctacttcccg 360
gaatcaggcg tctgggtcag cgatcctacc tgggaaaacc gcgtagcaat attcgccggg 420
gctggattcg aagtgagtac ttacccctgg tatgacgaag cgactaacgg cgtgcgcttt 480
aatgacctgt tggcgacgct gaaaacatta cctgcccgca gtattgtgtt gctgcatcca 540
tgttgccaca acccaacggg tgccgatctc actaatgatc agtgggatgc ggtgattgaa 600
attctcaaag cccgcgagct tattccattc ctcgatattg cctatcaagg atttggtgcc 660
ggtatggaag aggatgccta cgctattcgc gccattgcca gcgctggatt acccgctctg 720
gtgagcaatt cgttctcgaa aattttctcc ctttacggcg agcgcgtcgg cggactttct 780
gttatgtgtg aagatgccga agccgctggc cgcgtactgg ggcaattgaa agcaacagtt 840
cgccgcaact actccagccc gccgaatttt ggtgcgcagg tggtggctgc agtgctgaat 900
gacgaggcat tgaaagccag ctggctggcg gaagtagaag agatgcgtac tcgcattctg 960
gcaatgogtc aggaattggt gaaggtatta agcacagaga tgccagaacg caatttcgat 1020
tatctgctta atcagcgcgg catgttcagt tataccggtt taagtgccgc tcaggttgac 1080
cgactacgtg aagaatttgg tgtctatctc atcgccagcg gtcgcatgtg tgtcgccggg 1140
ttaaatacgg caaatgtaca acgtgtggca aaggcgtttg ctgcggtgat gtaa 1194
<210> 32 <211> 397 <212> białko <213> Ε. coli <400> 32
Val Phe Gin Lys Val Asp Ala Tyr Ala Gly Asp Pro Ile Leu Thr Leu 15 10 15
Met Glu Arg Phe Lys Glu Asp Pro Arg Ser Asp Lys Val Asn Leu Ser 20 25 30
Ile Gly Leu Tyr Tyr Asn Glu Asp Gly Ile Ile Pro Gin Leu Gin Ala 35 40 45
Val Ala Glu Ala Glu Ala Arg Leu Asn Ala Gin Pro His Gly Ala Ser 50 55 60
PL 208 998 B1
Leu Tyr Leu Pro Met Glu Gly Leu Asn Cys Tyr Arg His Ala Ile Ala 65 70 75 80
Pro Leu Leu Phe Gly Ala Asp His Pro Val Leu Lys Gin Gin Arg Val 85 90 95
Ala Thr Ile Gin Thr Leu Gly Gly Ser Gly Ala Leu Lys Val Gly Ala 100 105 110
Asp Phe Leu Lys Arg Tyr Phe Pro Glu Ser Gly Val Trp Val Ser Asp 115 120 125
Pro Thr Trp Glu Asn Arg Val Ala Ile Phe Ala Gly Ala Gly Phe Glu 130 135 140
Val Ser Thr Tyr Pro Trp Tyr Asp Glu Ala Thr Asn Gly Val Arg Phe 145 150 155 160
Asn Asp Leu Leu Ala Thr Leu Lys Thr Leu Pro Ala Arg Ser Ile Val 165 170 175
Leu Leu His Pro Cys Cys His Asn Pro Thr Gly Ala Asp Leu Thr Asn 180 185 190
Asp Gin Trp Asp Ala Val Ile Glu Ile Leu Lys Ala Arg Glu Leu Ile 195 200 205
Pro Phe Leu Asp Ile Ala Tyr Gin Gly Phe Gly Ala Gly Met Glu Glu 210 215 220
Asp Ala Tyr Ala Ile Arg Ala Ile Ala Ser Ala Gly Leu Pro Ala Leu 225 230 235 240
Val Ser Asn Ser Phe Ser Lys Ile Phe Ser Leu Tyr Gly Glu Arg Val 245 250 255
Gly Gly Leu Ser Val Met Cys Glu Asp Ala Glu Ala Ala Gly Arg Val 260 265 270
Leu Gly Gin Leu Lys Ala Thr Val Arg Arg Asn Tyr Ser Ser Pro Pro 275 280 285
Asn Phe Gly Ala Gin Vąl Val Ala Ala Val Leu Asn Asp Glu Ala Leu 290 295 300
Lys Ala Ser Trp Leu Ala Glu Val Glu Glu Met Arg Thr Arg Ile Leu 305 310 315 320
PL 208 998 B1
<210> 36
<211> 37
<212> DNA
<213> Sekwencja sztuczna
<220>
PL 208 998 B1
PL 208 998 B1
ctggatagcg aagatgtttt tatcgattta ctgaccgaca gcggcaccgg ggcggtgacg 180
cagagcatgc aggctgcgat gatgcgcggc gacgaagcct acagcggcag tcgtagotac 240
tatgcgttag ccgagtcagt gaaaaatatc tttggttatc aatacaccat tccgactcac 300
cagggccgtg gcgcagagca aatctatatt ccggtactga ttaaaaaacg cgagcaggaa 360
aaaggcctgg atcgcagcaa aatggtggcg ttctctaact atttctttga taccacgcag 420
ggccatagcc agatcaacgg ctgtaccgtg cgtaacgtct atatcaaaga agccttcgat 480
acgggcgtgc gttacgactt taaaggcaac tttgaccttg agggattaga acgcggtatt 540
gaagaagttg gtccgaataa cgtgccgtat atcgttgcaa ccatcaccag taactctgca 600
ggtggtcagc cggtttcact ggcaaactta aaagcgatgt acagcatcgc gaagaaatac 660
gatattccgg tggtaatgga ctccgcgcgc tttgctgaaa acgcctattt catcaagcag 720
cgtgaagcag aatacaaaga ctggaccatc gagcagatca cccgcgaaac ctacaaatat 780
gcogatatgc tggcgatgtc cgccaagaaa gatgcgatgg tgccgatggg cggcctgctg 840
tgcatgaaag acgacagctt ctttgatgtg tacaccgagt gcagaaccct ttgcgtggtg 900
caggaaggct tcccgacata tggcggoctg gaaggcggcg cgatggagcg tctggcggta 960
ggtctgtatg acggoatgaa tctcgactgg ctggcttatc gtatcgcgca ggtacagtat 1020
ctggtcgatg gtctggaaga gattggcgtt gtctgccagc aggcgggcgg tcacgcggca 1080
ttcgttgatg ccggtaaact gttgccgcat atcccggcag accagttccc ggcacaggcg 1140
ctggcctgcg agctgtataa agtcgccggt atccgtgcgg tagaaattgg ctctttcctg 1200
ttaggccgcg atccgaaaac cggtaaacaa ctgccatgcc cggctgaact gctgcgttta 1260
accattccgc gcgcaacata tactcaaaca catatggact tcattattga agcctttaaa 1320
catgtgaaag agaacgcggc gaatattaaa ggattaacct ttacgtacga acogaaagta 1380
ttgcgtcact tcaccgcaaa acttaaagaa gtttaa 1416
<210> 42 <211> 1371 <212> DNA <213> Citrobacter freundii <400> 42
atgaattatc cggcagaacc cttccgtatt aaaagcgttg aaactgtatc tatgatcccg 60
cgtgatgaac gcctcaagaa aatgcaggaa gcgggttaca atactttcct gttaaattcg 120
aaagatattt atattgacct gctgacagac agtggcacta acgcaatgag cgacaagcag 180
tgggccggaa tgatgatggg tgatgaagcg tacgcgggca gcgaaaactt ctatcatctg 240
gaaagaaccg tgcaggaact gtttggcttt aaacatattg ttccgactca ccaggggcgt 300
ggcgcagaaa acctgttatc gcagctggct attaaacctg ggcaatatgt tgccgggaat 360
atgtatttca ctaccacccg ttatcaccag gaaaaaaatg gtgcggtgtt tgtcgatatc 420
PL 208 998 B1
gttcgtgacg aagcgcacga tgccggtctg aatattgcgt ttaaaggtga tatcgatctt 480
aaaaaattac aaaagctgat tgatgaaaaa ggcgcagaga atattgcgta tatctgcctg 540
gcggtgacgg ttaacctcgc gggcggccaa ccggtctcga tggctaacat gcgtgcggtg 600
cgtgaactga cagaagcgca tggcattaaa gtgttctacg acgctacccg ctgcgtagaa 660
aacgcctact ttatcaaaga gcaagagcag ggctttgaga acaagagcat cgccgagatc 720
gtgcatgaga tgttcagcta cgccgacggt tgtaccatga gtggtaaaaa agactgtctg 780
gtgaacatcg gcggcttcct gtgcatgaac gatgacgaaa tgttctcttc tgccaaagag 840
ttagtcgtgg tctacgaagg gatgccatct tacggcggcc tggccggacg tgatatggaa 900
gcgatggcga ttggcctgcg tgaagccatg cagtacgaat atattgagca ccgcgtgaag 960
caggttcgct acctgggcga taagctgaaa gccgctggcg taccgattgt tgaaccggta 1020
ggcggtcacg cggtattcct cgatgcgcgt cgcttctgcg agcatctgac gcaagatgag 1080
ttcccggcac aaagtctggc tgccagcatc tatgtggaaa ccggcgtgcg cagtatggag 1140
cgcggaatta tctctgcggg ccgtaataac gtgaccggtg aacaccacag accgaaactg 1200
gaaaccgtgc gtctgactat tccacgtcgt gtttatacct acgcacatat ggatgttgtg 1260
gctgacggta ttattaaact ttaccagcac aaagaagata ttcgcgggct gaagtttatt 1320
tacgagccga agcagttgcg tttctttact gcacgctttg attacatcta a 1371
<210> 43 <211> 35 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna
<220>
<223> starter
<400> 43
ggtattgagg gtcgcatgga aaactttaaa catct 35
<210> 44
<211> 37
<212> DNA
<213> Sekwencja sztuczna
<220>
<223> starter
<400> 44
agaggagagt tagagcctta aacttcttta agttttg 37
<210> 45 .
<211> 35 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
PL 208 998 B1
PL 208 998 B1
<210> 56 <211> 37
PL 208 998 B1
PL 208 998 B1 <223> starter <400> 61 ggtattgagg gtcgcatgag cgtggttcac cggaa 35 <210> 62 <211> 37 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> starter <400> 62 agaggagagt tagagcctca atcgatatat ttcagtc 37 <210> 63 <211> 35 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> starter <400> 63 ggtattgagg gtcgcatgag cctggttaat atgaa 35 <210> 64 <211> 37 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> starter <400> 64 agaggagagt tagagcctta tgactttaac gcgttga 37 <210> 65 <211> 684 <212> DNA <213> C. testosteroni <400> 65
atgtacgaac tgggagttgt ctaccgcaat atccagcgcg ccgaccgcgc tgctgctgac 60
ggcctggccg ccctgggctc cgccaccgtg cacgaggcca tgggccgcgt cggtctgctc 120
aagccctata tgcgccccat ctatgccggc aagcaggtct cgggcaccgc cgtcacggtg 180
ctgctgcagc ccggcgacaa ctggatgatg catgtggctg ccgagcagat tcagcccggc 240
gacatcgtgg tcgcagccgt caccgcagag tgcaccgacg gctacttcgg cgatctgctg 300
gccaccagct tccaggcgcg .cggcgcacgt gcgctgatca tcgatgccgg cgtgcgcgac 360
gtgaagacgc tgcaggagat ggactttccg gtctggagca aggccatctc ttccaagggc 420
acgatcaagg ccaccctggg ctcggtcaac atccccatcg tctgcgccgg catgctggtc 480
PL 208 998 B1 acgcccggtg acgtgatcgt ggccgacgac gacggcgtgg tctgcgtgcc cgccgcgcgt 540 gccgtggaag tgctggccgc cgcccagaag cgtgaaagct tcgaaggcga aaagcgcgcc 600 aagctggcct cgggcatcct cggcctggat atgtacaaga tgcgcgagcc cctggaaaag 660
gccggcctga aatatattga ctaa
<210> 66
<211> : 227
<212> białko
<213> i 3. testosteroni
<400> 66
Met Tyr Glu Leu Gly Val Val Tyr Arg Asn Ile Gin Arg Ala Asp Arg
1 5 10 15
Ala Ala Ala Asp Gly Leu Ala Ala Leu Gly Ser Ala Thr Val His Glu
20 25 30
Ala Met Gly Arg Val Gly Leu Leu Lys Pro Tyr Met Arg Pro Ile Tyr
35 40 45
Ala Gly Lys Gin Val Ser Gly Thr Ala Val Thr Val Leu Leu Gin Pro
50 55 60
Gly Asp Asn Trp Met Met His Val Ala Ala Glu Gin Ile Gin Pro Gly
65 70 75 80
Asp Ile Val Val Ala Ala Val Thr Ala Glu Cys Thr Asp Gly Tyr Phe
85 90 95
Gly Asp Leu Leu Ala Thr Ser Phe Gin Ala Arg Gly Ala Arg Ala Leu
100 105 110
Ile Ile Asp Ala Gly Val Arg Asp Val Lys Thr Leu Gin Glu Met Asp
115 120 125
Phe Pro Val Trp Ser Lys Ala Ile Ser Ser Lys Gly Thr Ile Lys Ala
130 135 140
Thr Leu Gly Ser Val Asn Ile Pro Ile Val Cys Ala Gly Met Leu Val
145 150 155 160
Thr Pro Gly Asp Val Ile Val Ala Asp Asp Asp Gly Val Val Cys Val
165 170 175
Pro Ala Ala Arg Ala Val Glu Val Leu Ala Ala Ala Gin Lys Arg Glu
180 185 190
PL 208 998 B1
Ser Phe Glu Gly Glu Lys Arg Ala Lys Leu Ala Ser Gly Ile Leu Gly
195
200
205
Leu Asp Met Tyr Lys Met Arg Glu Pro Leu Glu Lys Ala Gly Leu Lys
210
215
220
Tyr Ile Asp 225 <210> 67 <211> 42 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> starter <400> 67 actcggatcc gaaggagata tacatatgta cgaactggga ct 42 <210> 68 <211> 33 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> starter <400> 68 cggctgtcga ccgttagtca atatatttca ggc <210> 69 <211> 31 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> starter <400> 69 cgcggatcca taatggttga gaacattacc g 31 <210> 70 <211> 30 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> starter <400> 70 acgcgtcgac ttacagcact gccacaatcg <210>
<211>
<212>
<213>
DNA
Sekwencja sztuczna
PL 208 998 B1 <220>
<223> starter <400> 71 ccggaattca taatggtcga actgggagtt gt 32 <210> 72 <211> 33 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> starter <400> 72 gaatgcggcc gcttagtcaa tatatttcag gcc 33 <210> 73 <211> 15 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> starter <400> 73 ggtattgagg gtcgc 15 <210> 74 <211> 17 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> starter <400> 74 agaggagagt tagagcc 17

Claims (12)

1. Sposób wytwarzania monatyny, znamienny tym, że obejmuje etapy, w których: kontaktuje się tryptofan lub kwas indolo-3-mlekowy z pierwszym polipeptydem, przy czym jeśli kontaktuje się tryptofan z pierwszym polipeptydem, to pierwszy polipeptyd jest wybrany z grupy składającej się z: aminotransferazy tryptofanowej (EC 2.6.1.27), aminotransferazy tyrozynowej (aromatycznej) (EC 2.6.1.5), dehydrogenazy tryptofanowej (EC 1.4.1.19), dehydrogenazy glutaminianowej (EC 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4), dehydrogenazy fenyloalaninowej (EC 1.4.1.20), transaminazy tryptofan-fenylopirogronian (EC 2.6.1.28), aminotransferazy asparaginianowej (EC
2.6.1.1) , oksydazy L-aminokwasowej (EC 1.4.3.2), dehydrogenazy D-aminokwasowej (EC
1.4.99.1) , oksydazy D-aminokwasowej (EC 1.4.3.3), aminotransferazy D-aminokwasowej (D-alaninowej) (EC 2.6.1.21), lub ich kombinacji,
PL 208 998 B1 natomiast jeśli kontaktuje się kwas indolo-3-mlekowy z pierwszym polipeptydem, to pierwszy polipeptyd jest wybrany z grupy składającej się z: dehydrogenazy indolomleczanowej (EC 1.1.1.110), dehydrogenazy R-4-hydroksyfenylomleczanowej (EC 1.1.1.222), reduktazy 3-(4)-hydroksyfenylopirogronianowej (EC 1.1.1.237), dehydrogenazy mleczanowej (EC 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3), dehydrogenazy (3-imidazolo-5-ylo) mleczanowej (EC 1.1.1.111), oksydazy mleczanowej (EC 1.1.3.-) lub ich kombinacji, przy czym pierwszy polipeptyd przekształca tryptofan lub kwas indolo-3-mlekowy w indolo-3-pirogronian;
kontaktuje się indolo-3-pirogronian z drugim polipeptydem i źródłem węgla C3, gdzie drugi polipeptyd wybrany jest spośród: glioksylano-liazy 4-hydroksy-2-oksoglutaranu (EC 4.1.3.16), pirogroniano-liazy 4-hydroksy-4-metylo-2-oksoglutaranu (EC 4.1.3. 17) lub ich kombinacji, przy czym drugi polipeptyd przekształca indolo-3-pirogronian i źródło węgla C3 w kwas 2-hydroksy-2-(indol-3-ilometylo)-4-ketoglutarowy;
i kontaktuje się kwas 2-hydroksy-2-(indol-3-ilometylo)-4-ketoglutarowy z trzecim polipeptydem, gdzie trzeci polipeptyd wybrany jest spośród: aminotransferazy tryptofanowej (EC 2.6.1.27), aminotransferazy tyrozynowej (aromatycznej) (EC 2.6.1.5), dehydrogenazy tryptofanowej (EC 1.4.1.19), transaminazy tryptofan-fenylopirogronian (EC 2.6.1.28), aminotransferazy asparaginianowej (EC 2.6.1.1), dehydrogenazy glutaminianowej (EC 1.4.1.2-4), dehydrogenazy fenyloalaninowej (EC 1.4.1.20), dehydrogenazy D-aminokwasowej (EC 1.4.99.1), aminotransferazy D-aminokwasowej (D-alaninowej) (EC 2.6.1.21), aminotransferazy D-metionina-pirogronian (EC 2.6.1.41), lub ich kombinacji, przy czym trzeci polipeptyd przekształca kwas 2-hydroksy-2-(indol-3-ilo-metylo)-4-ketoglutarowy w monatynę.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się pierwszy i/lub trzeci polipeptyd, który obejmuje:
sekwencję aminokwasową przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 32, numer dostępu w Genbank: NP_388848.1, numer dostępu w Genbank: ZP00005082.1 lub numer dostępu w Genbank: AAC74014.1;
sekwencję aminokwasową wykazującą co najmniej 90% identyczność sekwencji z sekwencją przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 32, numer dostępu w Genbank: NP_388848.1, numer dostępu w Genbank: ZP00005082.1 lub numer dostępu w Genbank: AAC74014.1 lub sekwencje aminokwasowe, które różnią się od sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 32, numer dostępu w Genbank: NP_388848.1, numer dostępu w Genbank: ZP00005082.1 lub numer dostępu w Genbank: AAC74014.1 o mniej niż 50 konserwatywnych substytucji aminokwasów, przy czym sekwencja aminokwasowa przekształca tryptofan w indolo-3-pirogronian.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się pierwszy polipeptyd, który obejmuje oksydazę aminokwasową (EC 1.4.3.3) i katalazę (EC 1.11.1.6), przy czym pierwszy polipeptyd przekształca tryptofan w indolo-3-pirogronian.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się oksydazę aminokwasową, która obejmuje oksydazę tryptofanową.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że źródło węgla C3 wybiera się z grupy składającej się z pirogronianu, fosfoenolopirogronianu, alaniny, seryny, cysteiny lub ich kombinacji.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że pirogronian wytwarza się przez: alaninę i polipeptyd zdolny do transaminacji alaniny; serynę i polipeptyd zdolny do beta-eliminacji seryny; cysteinę i polipeptyd zdolny do beta-eliminacji cysteiny; asparaginian i polipeptyd zdolny do reakcji beta-liazy z aminokwasem dikarboksylowym; mleczan i oksydazę mleczanową (EC 1.1.3.-); dehydrogenazę mleczanową (EC 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3); lub ich kombinacje.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ponadto zmniejsza się ilość nadtlenku wodoru wytwarzanego przy przekształcaniu tryptofanu w indolo-3-pirogronian, poprzez kontaktowanie nadtlenku wodoru z katalazą.
8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się drugi polipeptyd, który obejmuje sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z:
PL 208 998 B1 sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID NO: 66, numer dostępu w Genbank: CAC46344, numer dostępu w Genbank: CAB14127.1, numer dostępu w Genbank: AAC74920.1, lub numer dostępu w Genbank: CAC47463.1;
sekwencji aminokwasowej wykazującej co najmniej 90% identyczność sekwencji z sekwencją o numerze identyfikacyjnym SEQ ID NO: 66, numer dostępu w Genbank: CAC46344, numer dostępu w Genbank: CAB14127.1, numer dostępu w Genbank: AAC74920.1 lub numer dostępu w Genbank: CAC47463.1 lub sekwencji aminokwasowej, która różni się od sekwencji o numerze identyfikacyjnym SEQ ID NO : 66, numer dostępu w Genbank: CAC46344, numer dostępu w Genbank: CAB14127.1, numer dostępu w Genbank: AAC74920.1 lub numer dostępu w Genbank: CAC47463.1 o mniej niż 50 konserwatywnych substytucji aminokwasów, przy czym sekwencja aminokwasowa przekształca indolo-3-pirogronian i pirogronian w kwas 2-hydroksy-2-(indol-3-ilometylo)-4-ketoglutarowy.
9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się trzeci polipeptyd, który stanowi aminotransferaza asparaginianowa, przy czym kwas 2-hydroksy-2-(indol-3-ilometylo)-4-ketoglutarowy kontaktuje się z asparaginianem do uzyskania szczawiooctanu i monatyny.
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że ponadto kontaktuje się szczawiooctan z dekarboksylazą.
11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się trzeci polipeptyd, który stanowi enzym zdolny do redukcyjnej aminacji i polipeptyd, który jest zdolny do recyklingu NAD(P)H.
12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że enzym zdolny do redukcyjnej aminacji wybiera się z grupy składającej się z dehydrogenazy glutaminianowej, dehydrogenazy fenyloalaninowej, dehydrogenazy tryptofanowej lub ich kombinacji.
PL373423A 2002-04-23 2003-04-23 Sposób wytwarzania monatyny PL208998B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US37483102P 2002-04-23 2002-04-23

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL373423A1 PL373423A1 (pl) 2005-08-22
PL208998B1 true PL208998B1 (pl) 2011-07-29

Family

ID=29270554

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL386514A PL208481B1 (pl) 2002-04-23 2003-04-23 Sposób wytwarzania monatyny
PL373423A PL208998B1 (pl) 2002-04-23 2003-04-23 Sposób wytwarzania monatyny

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL386514A PL208481B1 (pl) 2002-04-23 2003-04-23 Sposób wytwarzania monatyny

Country Status (24)

Country Link
US (1) US20040063175A1 (pl)
EP (2) EP1503985B1 (pl)
JP (3) JP2005523696A (pl)
KR (1) KR100902813B1 (pl)
CN (1) CN100516043C (pl)
AT (1) ATE491803T1 (pl)
AU (2) AU2003263097A1 (pl)
BR (1) BRPI0309527B1 (pl)
CA (1) CA2483126C (pl)
CO (1) CO5631430A2 (pl)
DE (1) DE60335361D1 (pl)
EA (1) EA009284B1 (pl)
EC (1) ECSP045381A (pl)
ES (1) ES2356132T3 (pl)
GE (1) GEP20084387B (pl)
IL (1) IL164548A0 (pl)
MX (1) MXPA04010522A (pl)
NO (1) NO20045029L (pl)
NZ (2) NZ555884A (pl)
PL (2) PL208481B1 (pl)
RS (1) RS92604A (pl)
SG (1) SG146453A1 (pl)
WO (1) WO2003091396A2 (pl)
ZA (1) ZA200408379B (pl)

Families Citing this family (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7297800B2 (en) * 2001-12-27 2007-11-20 Ajinomoto Co., Inc. Process of producing glutamate derivatives
JP4196832B2 (ja) 2001-12-27 2008-12-17 味の素株式会社 グルタミン酸化合物及びそれらの製造中間体の製造方法並びにそのための新規中間体
CN100549182C (zh) * 2001-12-27 2009-10-14 味之素株式会社 谷氨酸衍生物的制备方法
US7572607B2 (en) * 2002-04-23 2009-08-11 Cargill, Incorporated Polypeptides and biosynthetic pathways for the production of monatin and its precursors
US8372989B2 (en) 2002-04-23 2013-02-12 Cargill, Incorporated Polypeptides and biosynthetic pathways for the production of monatin and its precursors
RU2307871C2 (ru) * 2002-08-26 2007-10-10 Адзиномото Ко., Инк. НОВАЯ АЛЬДОЛАЗА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЗАМЕЩЕННЫХ α-КЕТОКИСЛОТ
AU2003263031A1 (en) * 2002-09-20 2004-04-08 Diversa Corporation Chemoenzymatic methods for the synthesis of statins and stain intermediates
AU2003289264A1 (en) * 2002-12-09 2004-06-30 Ajinomoto Co., Inc. Mutant d-aminotransferase and process for producing optically active glutamic acid derivative using the same
WO2005001105A1 (ja) * 2003-06-26 2005-01-06 Ajinomoto Co., Inc. モナティンの製造方法
WO2005014839A2 (en) * 2003-08-01 2005-02-17 Cargill, Incorporated Monatin tabletop sweetener compositions and methods of making same
WO2005016022A1 (en) * 2003-08-14 2005-02-24 Cargill, Incorporated Chewing gum compositions comprising monatin and methods of making same
WO2005020721A1 (en) * 2003-08-25 2005-03-10 Cargill, Incorporated Beverage compositions comprising monatin and methods of making same
EP1678313B1 (en) * 2003-10-21 2011-02-16 Cargill, Incorporated Production of monatin and monatin precursors
CA2506247C (en) 2004-06-07 2012-02-21 Ajinomoto Co., Inc. Novel aldolase, and method for producing optically active ihog and monatin
JP4797452B2 (ja) * 2004-06-07 2011-10-19 味の素株式会社 新規アルドラーゼ並びに光学活性ｉｈｏｇ及びモナティンの製造方法
US7180370B2 (en) * 2004-09-01 2007-02-20 Micron Technology, Inc. CMOS amplifiers with frequency compensating capacitors
US8158389B2 (en) * 2005-04-20 2012-04-17 Cargill, Incorporated Products and methods for in vivo secretion of monatin
US8153405B2 (en) * 2005-04-20 2012-04-10 Cargill, Incorporated Products and methods for in vivo secretion of monatin
US8076108B2 (en) 2005-04-26 2011-12-13 Cargill, Incorporated Polypeptides and biosynthetic pathways for the production of stereoisomers of monatin and their precursors
US7582455B2 (en) * 2005-04-26 2009-09-01 Cargill, Incorporated Polypeptides and biosynthetic pathways for the production of stereoisomers of monatin and their precursors
EP2361976B1 (en) 2005-04-26 2016-05-25 Cargill, Incorporated Polypeptides and biosynthetic pathways for the production of stereoisomers of monatin and their precursors
AU2007223086B2 (en) 2006-03-07 2013-09-26 Basf Enzymes Llc Aldolases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
MX2008011477A (es) * 2006-03-07 2008-09-23 Cargill Inc Aldolasas, acidos nucleicos que las codifican y metodos para hacerlas y usarlas.
WO2007140195A2 (en) 2006-05-24 2007-12-06 Cargill, Incorporated Methods and systems for increasing production of equilibrium reactions
US20090198072A1 (en) * 2006-05-24 2009-08-06 Cargill, Incorporated Methods and systems for increasing production of equilibrium reactions
CN101239941B (zh) * 2007-02-08 2012-02-29 味之素株式会社 光学活性化合物的制造方法
CN102027117B (zh) 2007-08-24 2012-11-07 味之素株式会社 新的氧化酶基因及使用该基因生产3-吲哚-丙酮酸的方法
US8367847B2 (en) * 2007-10-01 2013-02-05 Cargill, Incorporated Production of monatin enantiomers
US8076107B2 (en) 2007-10-01 2011-12-13 Cargill, Incorporated Production of monatin stereoisomers
US8003361B2 (en) * 2007-10-01 2011-08-23 Cargill Incorporated Production of monatin enantiomers
CA2726928A1 (en) * 2008-01-03 2009-07-16 Cargill, Incorporated Aminotransferase and oxidoreductase nucleic acids and polypeptides and methods of using
CN104651381A (zh) 2008-01-03 2015-05-27 巴斯夫酶有限责任公司 转移酶和氧化还原酶、编码它们的核酸以及其制备和应用方法
US20120076899A1 (en) 2009-05-28 2012-03-29 Cargill, Incorporated Shelf stable monatin sweetened beverage
CN102686391A (zh) 2009-12-30 2012-09-19 嘉吉公司 聚合物及制备和使用聚合物的方法
US8445226B2 (en) * 2010-02-01 2013-05-21 Microbios, Inc. Process and composition for the manufacture of a microbial-based product
WO2012037413A2 (en) 2010-09-15 2012-03-22 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Systems and methods for biotransformation of carbon dioxide into higher carbon compounds
EP2479272A4 (en) 2010-10-14 2013-11-20 Ajinomoto Kk PROCESS FOR THE PRODUCTION OF MONATIN
WO2012135389A2 (en) 2011-03-28 2012-10-04 The Regents Of The University Of California Host cells and methods for oxidizing aromatic amino acids
WO2012147674A1 (ja) * 2011-04-25 2012-11-01 味の素株式会社 モナティンの製造方法
GB201412545D0 (en) * 2014-07-15 2014-08-27 Univ Manchester The And Manchester Metropolitan University Enzymatic processes and uses
CN112931181A (zh) * 2021-01-28 2021-06-11 西北农林科技大学 一种抗根肿病橙色大白菜新种质的选育方法
CN118666972A (zh) * 2023-03-14 2024-09-20 中国科学院微生物研究所 一类抗菌肽及其在防治柑橘黄龙病中的应用

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3002889A (en) * 1960-06-20 1961-10-03 Kyowa Hakko Kogyo Kk Method of producing l-glutamic acid
US3128237A (en) * 1961-02-24 1964-04-07 Ajinomoto Kk Process for producing l-glutamic acid by bacterial fermentation
US4371614A (en) 1980-08-22 1983-02-01 Ajinomoto Co., Inc. E.Coli bacteria carrying recombinant plasmids and their use in the fermentative production of L-tryptophan
IL67510A (en) * 1981-12-17 1988-08-31 Kyowa Hakko Kogyo Kk Recombinant vector plasmids autonomously replicable in microorganisms belonging to the genus corynebacterium or brevibacterium and process for the production thereof
JPS60176593A (ja) 1984-02-22 1985-09-10 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Ｌ−トリプトフアンの製造法
US5264550A (en) 1985-04-15 1993-11-23 Scios Nova Inc. Human anti-inflammatory phospholipase inhibitor protein
EP0232262A4 (en) 1985-08-15 1989-09-19 Stauffer Chemical Co TRYPTOPHANE GENERATING MICROORGANISM.
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
GB2205834B (en) * 1987-06-15 1990-10-31 South African Inventions 3-(1-amino-1,3-dicarboxy-3-hydroxy-but-4-yl)-indole compounds
US5300437A (en) 1989-06-22 1994-04-05 Celgene Corporation Enantiomeric enrichment and stereoselective synthesis of chiral amines
ATE104961T1 (de) 1990-01-19 1994-05-15 Technology Finance Corp Verfahren zur herstellung von 3-(1-amino-1,3dicarboxy-3-hydroxy-but-4-yl)-indol.
US5173497A (en) 1990-05-17 1992-12-22 Hoechst-Roussel Pharmaceuticals Incorporated Alpha-oxopyrrolo[2,3-B]indole acetic acids, esters, amides and related analogs
US7018809B1 (en) 1991-09-19 2006-03-28 Genentech, Inc. Expression of functional antibody fragments
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
US5360724A (en) * 1992-12-18 1994-11-01 Celgene Corporation Process for the preparation of chiral 1-aryl-2-aminopropanes
US5691188A (en) * 1994-02-14 1997-11-25 American Cyanamid Company Transformed yeast cells expressing heterologous G-protein coupled receptor
JP3698742B2 (ja) 1994-03-01 2005-09-21 協和醗酵工業株式会社 光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の製造法
WO1996006926A1 (fr) * 1994-08-30 1996-03-07 Ajinomoto Co., Inc. Procede pour produire de la l-valine et de la l-leucine
US5985617A (en) * 1997-02-18 1999-11-16 Liao; James C. Microorganisms and methods for overproduction of DAHP by cloned PPS gene
CA2199853C (en) * 1994-09-16 2009-03-24 James C. Liao Microorganisms and methods for overproduction of dahp by cloned pps gene
US5843782A (en) 1995-02-09 1998-12-01 Novaflora, Inc. Micropropagation of rose plants
GB2304718B (en) * 1995-09-05 2000-01-19 Degussa The production of tryptophan by the bacterium escherichia coli
CA2234412C (en) * 1997-06-09 2008-09-02 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method for producing optically active compound
US5994559A (en) * 1998-08-06 1999-11-30 The Board Of Governors For Higher Education, State Of Rhode Island And Providence Plantations Synthesis of monatin-A high intensity natural sweetener
WO2000067796A1 (en) 1999-05-07 2000-11-16 Genentech, Inc. Treatment of autoimmune diseases with antagonists which bind to b cell surface markers
US6428504B1 (en) * 2000-04-06 2002-08-06 Varian Medical Systems, Inc. Multipurpose template and needles for the delivery and monitoring of multiple minimally invasive therapies
JP2002060382A (ja) * 2000-08-22 2002-02-26 Ajinomoto Co Inc モナティンの立体異性体及びその使用、並びにモナティン類の製造方法及びそのための中間体
JP3713224B2 (ja) * 2001-08-10 2005-11-09 株式会社三栄水栓製作所 水栓取替方法
CN100549182C (zh) 2001-12-27 2009-10-14 味之素株式会社 谷氨酸衍生物的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
SG146453A1 (en) 2008-10-30
KR100902813B1 (ko) 2009-06-12
AU2010201699A1 (en) 2010-05-20
CN100516043C (zh) 2009-07-22
ZA200408379B (en) 2006-05-31
JP5351230B2 (ja) 2013-11-27
JP2010004896A (ja) 2010-01-14
NZ535297A (en) 2008-05-30
EP1503985A2 (en) 2005-02-09
EA200401228A1 (ru) 2006-04-28
WO2003091396A2 (en) 2003-11-06
IL164548A0 (en) 2005-12-18
KR20080056274A (ko) 2008-06-20
BR0309527A (pt) 2005-06-28
JP2011250806A (ja) 2011-12-15
PL373423A1 (pl) 2005-08-22
NZ555884A (en) 2008-10-31
EP1503985B1 (en) 2010-12-15
JP2005523696A (ja) 2005-08-11
EP2354240A1 (en) 2011-08-10
NO20045029L (no) 2005-01-04
ATE491803T1 (de) 2011-01-15
CA2483126C (en) 2014-05-20
AU2010201699B2 (en) 2013-02-07
PL208481B1 (pl) 2011-05-31
WO2003091396A3 (en) 2004-03-11
BRPI0309527B1 (pt) 2015-08-18
US20040063175A1 (en) 2004-04-01
CN1656068A (zh) 2005-08-17
ECSP045381A (es) 2005-01-03
GEP20084387B (en) 2008-06-10
RS92604A (sr) 2007-09-21
CA2483126A1 (en) 2003-11-06
EP2354240B1 (en) 2016-07-06
DE60335361D1 (de) 2011-01-27
AU2003263097A1 (en) 2003-11-10
MXPA04010522A (es) 2004-12-13
CO5631430A2 (es) 2006-04-28
JP4988803B2 (ja) 2012-08-01
ES2356132T3 (es) 2011-04-05
EA009284B1 (ru) 2007-12-28
EP1503985A4 (en) 2006-11-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2354240B1 (en) Polypeptides and biosynthetic pathways
US9034610B2 (en) Polypeptides and biosynthetic pathways for the production of monatin and its precursors
US8440434B2 (en) Polypeptides and biosynthetic pathways for the production of monatin and its precursors
KR100906179B1 (ko) 폴리펩티드 및 생합성 경로

Legal Events

Date Code Title Description
VDSO Invalidation of derivated patent or utility model

Ref document number: 386516

Country of ref document: PL

Kind code of ref document: A1

Ref document number: 386515

Country of ref document: PL

Kind code of ref document: A1