BRPI0314543B1 - células hospedeiras, dna recombinante, utilização dos mesmos, processos de produção de um polipeptídeo implicado na biossíntese das espiramicinas, de produção de macrolídeos e de produção de espiramicina(s), e micro-organismo transgênico mutante produtor de macrolídeo - Google Patents

Abstract

"polipeptídeos implicados na biossíntese das espiramicinas, seqüências nucleotídicas codificando esses polipeptídeos e suas aplicações". a presente invenção refere-se ao isolamento e à identificação de novos genes da via de biossíntese das espiramicinas e de novos polipeptídeos implicados nessa biossíntese. a invenção é também relativa a um processo de produção desses polipeptídeos. ela é também relativa à utilização desses genes com a finalidade de aumentar as taxas de produção e a pureza da espiramicina produzida. a invenção refere-se notadamente a um microorganismo que produz a espiramicina i, mas que não produz a espiramicina ii e iii e a utilização desse microorganismo. a invenção refere-se também à utilização dos genes da via de biossíntese das espiramicinas para a construção de mutantes que podem levar à síntese de novos antibióticos ou a formas derivadas de espiramicinas. a invenção refere-se ainda às moléculas produzidas graças à expressão desses genes e das composições farmacologicamente ativas de uma molécula produzida graças à expressão desses genes.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CÉLULAS HOSPEDEIRAS, DNA RECOMBINANTE, UTILIZAÇÃO DOS MESMOS, PROCESSOS DE PRODUÇÃO DE UM POLIPEPTÍDEO IMPLICADO NA BIOSSÍNTESE DAS ESPIRAMICINAS, DE PRODUÇÃO DE MACROLÍ-DEOS E DE PRODUÇÃO DE ESPIRAMICINA(S), E MICRO-ORGANISMO TRANSGÊNICO MUTANTE PRODUTOR DE MACROLÍDEO". A presente invenção refere-se ao isolamento e à identificação de novos genes da via de biossíntese das espiramicinas e de novos polipeptí-deos implicados nesse biossíntese. Ela é também relativa à utilização desses genes com a finalidade de aumentar as taxas de produção e a pureza da espiramicina produzida. A invenção refere-se também à utilização desses genes para a construção de mutantes que podem levar à síntese de novos antibióticos ou a formas derivadas de espiramicinas. A invenção refere-se ainda às moléculas produzidas graças à expressão desses genes e enfim composições farmacologi-camente ativas de uma molécula produzida, graças à expressão desses genes.

As Streptomyces são bactérias filamentosas Gram positivo do solo. Elas exercem um papel importante na decomposição e a mineralização das matérias orgânicas graças à grande diversidade das enzimas degradati-vas que elas secretam. Elas apresentam fenômenos de diferenciações mor-fológicas únicas nos procariotes acompanhando-se de uma diferenciação metabólica caracterizada pelo fato de produção de metabólitos secundários apresentando uma extraordinária diversidade de estruturas químicas e de atividades biológicas. Dentre esses metabólitos, encontram-se as piramici-nas produzidas no estado natural pela bactéria Streptomyces ambofaciens. A espiramicina é um antibiótico da família dos macrolídeos útil tanto em medicina veterinária, quanto em medicina humana. Os macrolídeos são caracterizados pela presença de um ciclolactona sobre o qual são en-xertados um açúcar ou vários. Streptomyces ambofaciens produzido no estado natural a espiramicina I, II e III (conforme Figura 1), todavia a atividade antibiótica da espiramicina I é nitidamente superior àquela das espiramicina II e III (Liu et al., 1999). A molécula de espiramicina I é constituída de um macrociclolactônico, denominado platenolídeo e de três açúcares: a forosamina, a micaminose e a micarose (cf/ Figura 1). A atividade antibiótica das espiramicinas é devido a uma inibição da síntese protéica nos procario-tes por um mecanismo que implica a ligação do antibiótico ao ribossoma bacteriano.

Certos compostos membros da família do macrolídeos e possuindo também um ciclolactona deram lugar a utilizações fora do domínio dos antibióticos. Assim, o produto FK506 tem efeitos imunossupressores e oferece perspectivas de aplicação terapêutica no domínio do transplante de órgão, da artrite reumatóide e mais geralmente em patologias ligadas a reações autoimunes. Outros macrolídeos como a avermectina têm atividades inseticidas e anti-helmínticas.

Numerosas vias de biossíntese, referentes aos antibióticos pertencentes a classes variadas, assim como outros metabólitos secundários (para uma revista, Chater K. 1990), foram até hoje estudadas nos Streptomycetes. Todavia, o conhecimento das vias de biossíntese das espiramicinas é apenas muito parcial até hoje. A biossíntese das espiramicinas é um processo complexo que comporta numerosas etapas e implicando numerosas enzimas (Omura et a!., 1979a. Omura et al., 1979b). As espiramicinas pertencem à ampla classe dos poliquetídeos que agrupa moléculas complexas particularmente abundantes nos microorganismos do solo. Essas moléculas são agrupadas não por analogia de estrutura, mas por uma certa similaridade ao nível de etapas de sua via de biossíntese. Com efeito, os poliquetídeos são produzidos por uma série complexa de reações, mas possuem em comum ter em sua via de biossíntese uma série de reações catalisadas por uma enzima ou várias denominadas "poliketides synthases"(PKS). Nas streptomyces ambofaciens, a biossíntese do macrociclolactônico das espiramicinas (platenolídeo) é realizada por uma série de oito módulos codificados por cinco genes PKS diferentes (Kuhstoss S., 1996, patente 5.945.320). As espiramicinas são obtidas a partir desse ciclolactona. Todavia, as diversas etapas e enzimas implicadas na síntese dos açúcares, assim como sua ligação ao ciclolactona e a modificação desse ciclo para a obtenção das espiramicinas continuam ainda desconhecidas até hoje. A patente US 5.514.544 descreve a clonagem de uma seqüência denominada srmR nos streptomyces ambofaciens. Ele representa a hipótese nessa patente que o gene srmR codifica uma proteína reguladora da transcrição dos genes implicados na biossíntese dos macrolídeos.

Em 1987, Richardson e colaboradores (Richardson et al., 1987) mostraram que a resistência a espiramicina de S. ambofaciens é conferida por pelo menos três genes, estes últimos foram denominados srmA, srmB e srmC. A patente US 4.886.757 descreve mais particularmente a caracterização de um fragmento de DNA de S. ambofaciens que contém o gene srmC. Entretanto, a seqüência desse gene não foi divulgada. Em 1990, Richardson e colaboradores (Richardson et al., 1990) estabeleceu a hipótese da existência de três genes de biossíntese da espiramicina próxima de srmB. A patente US 5.098.837 refere-se à clonagem de cinco genes potencialmente implicados na biossíntese da espiramicina. Esses genes foram batizados srmD, srmE, srmF. srmG e srmH.

Uma das dificuldades maiores na produção de compostos, tais como as espiramicinas reside no fato de volumes muito grandes de fermentação são necessários à produção de uma quantidade relativamente pequena de produto. Portanto, é desejável poder aumentar a eficácia de produção dessas moléculas, a fim de diminuir-lhe os custos de produção. A via de biossíntese das espiramicinas é um processo complexo e seria desejável identificar e suprimir as reações parasitas que poderíam existir durante esse processo. A finalidade dessa manipulação é de obter um antibiótico mais puro e/ou uma melhoria da produtividade. A esse respeito, streptomyces ambofaciens produzido no estado natural a espiramicinas l, II e III (conforme Figura 1), todavia a atividade do antibiótico da espiramicina I é nitidamente superior àquela das espiramicina II e III (liu et al., 1999). Seria, portanto, desejável poder dispor de cepas que produzem apenas espiramicinas I.

Em virtude do interesse comercial pelos antibióticos macrolídeos, a obtenção de novos derivados, notadamente de análogos de espira- micinas que têm propriedades vantajosas é intensamente buscada. Seria desejável poder gerar em quantidade suficiente os intermediários de bios-síntese da via de biossíntese das espiramicinas ou dos derivados das espi-ramicinas, notadamente com o objetivo de fabricar antibióticos híbridos derivados das espiramicinas.

Descrição geral da invenção A presente invenção resulta da clonagem de genes cujo produto intervém na biossíntese das espiramicinas. A invenção refere-se, inicialmente, a novos genes da via de biossíntese das espiramicinas e de novos polipeptídeos implicados nessa biossíntese.

Os genes da via de biossíntese e as seqüências codificantes associadas forma clonados e a seqüência de DNA de cada um foi determinada. As seqüências codificantes clonadas serão designadas pela seqüência orfl*c, orfl*c, orf3*c, orff*c, orf5*, orfé*. orf7*c, orf8*t orfl*, orflO*, orfl, orfl, orfl, orf4, orf5, orf6, orfl, or/8, orflc,orflO, orfllc, orfll, orfl3c, orfl4, orfl5c, orfl 6, orfl 7, orfl8, orfl9, orflO, orfllc, orfllc, orfl3c, orfl4c, orfl5c, orfl 6, orfl7, orfl8c, orf!9, orflOc, orfll, orf32c, orfl 3 et orf34c. A função das proteínas codificadas por essas seqüências na via de biossíntese das espiramicinas é desenvolvida na discussão a seguir que é ilustrada pelas Figuras 5, 6 e 8. 1) Um primeiro objeto da invenção refere-se a um polinucleotí-deos codificando um polipeptídeo implicado na biossíntese das espiramicinas caracterizado pelo fato de a seqüência desse polinucleotídeo ser: (a) um das seqüências SEQ ID Nc 3, 5,7, 9, 11, 13, 15, 17, 19,21,23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66,68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111,113,115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 e 149, (b) uma das seqüências constituídas pelas variantes das seqüências (a); (c) uma das seqüências derivadas das seqüências (a) e (b) em razão da degenerescência do código genético. 2) A presente invenção tem também por objeto um polinucleotí-deo que se hibrida em condições de hibridização de forte estringência em pelo menos um dos polinucleotídeos, segundo o parágrafo 1) acima. 3) A invenção refere-se também a um polinucleotídeo que apresenta pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade em nu-cleotídeos compreendendo pelo menos 10,12,15,18, 20 a 25, 30,40, 50, 60, 70, 80, 90, 100; 150,200, 250, 300,350, 400, 450, 500,550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850 ou 1900 nucleotídeos consecutivos de um polinucleotídeo, segundo o parágrafo 1) acima. 4) A invenção refere-se também a um polinucleotídeo segundo o parágrafo 2) ou 3) acima, caracterizado pelo fato de ser isolado a partir de uma bactéria do gênero streptomyces. 5) A invenção refere-se também a um polinucleotídeo, segundo o parágrafo 2), 3) ou 4) acima, caracterizado pelo fato de codificar uma proteína implicada na biossíntese de um macrolídeo. 6) A invenção refere-se também a um polinucleotídeo, segundo o parágrafo 2), 3) ou 4) acima, caracterizado pelo fato de codificar uma proteína que tem uma atividade similar à proteína codificada pelo polinucleotídeo como qual se hibrida ou apresenta a identidade. 7) A invenção refere-se também a um polipeptídeo resultante da expressão de um polinucleotídeo, segundo o parágrafo 1), 2), 3), 4), 5) ou 6) acima. 8) um outro aspecto da invenção refere-se a um polipeptídeo implicado na biossíntese das espiramicinas, caracterizada pelo fato de a se-qüência desse polipeptídeo ser: a) uma das sequências SEQ ID N° 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18,20,22, 24, 26, 27, 29, 31, 32, 33, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 44, 46, 48, 50, 51, 52, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75. 77, 79, 81, 83, 85, 108, 110, 112, 114, 116, 117, 119, 121, 142, 144, 146, 146 e 150, (b) uma das seqüências, tais como definidas em (a) exceto que ao longo dessa sequência um ou vários aminoácidos foram substituídos, inseridos ou deletados, sem afetar as propriedades funcionais; (c) uma das seqüências constituídas pelas variantes das seqüências (a) e (b). 9) Um outro objeto da invenção refere-se a um polipeptídeo que apresenta pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% de identidade em aminoácidos com um polipeptídeo, compreendendo pelo menos 10,15,20, 30 a 40, 50, 60, 70, 80, 90,100,120,140,160,180, 200, 220,240, 260,280,300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 540, 560, 580, 600, 620 ou 640 aminoácidos consecutivos de um polipeptídeo segundo o parágrafo 8) acima. 10) Um outro aspecto da invenção refere-se a um polipeptídeo, segundo o parágrafo 9) acima, caracterizado pelo fato de ser isolado a partir de uma bactéria do gênero streptomyces. 11) um outro aspecto da invenção refere-se a um polipeptídeo, segundo o parágrafo 9) ou 10) acima, caracterizado pelo fato de codificar uma proteína implicada na biossíntese de um macrolídeo. 12) Um outro aspecto da invenção refere-se a um polipeptídeo, segundo o parágrafo 10) ou 11) acima caracterizado pelo fato de ter uma atividade similar àquela do polipeptídeo como qual ele divide a identidade. 13) um outro aspecto da invenção refere-se a um DNA recombi-nante caracterizado pelo fato de compreender pelo menos um polinucleotí-deo, segundo um dos parágrafos 1), 2), 3), 4), 5) ou 6) acima. 14) um outro aspecto da invenção refere-se a um DNA recombi-nante segundo o parágrafo 13) acima, caracterizado pelo fato de esse DNA recombinante estar compreendido em um vetor. 15) Um outro aspecto da invenção refere-se a um DNA recombinante, segundo o parágrafo 14) acima, caracterizado pelo fato de esse vetor ser escolhido dentre os bacteriófagos, os plasmídeos, os fagemidas, os vetores integrativos, os fosmidas, os cosmidas, os vetores navettes, os BAC ou os PAC. 16) Um outro aspecto da invenção refere-se a um DNA recombi-nante, segundo o parágrafo 15) acima, caracterizado pelo fato de ser escolhido dentre pOS49,1, pOS49,11, pOSC49.12, pOS49.14, pOS49.16, pOS49.28, pOS44.1, pOS44.2, pOS44.4, pSPMS, pSPM7, pOS49.67, pOS49.88, pOS49.106, pOS49.120, pOS49.107, pOS49.32, pOS49.43, pOS49.44, pOS49.50, pOS49.99, pSPM17» pSPM21, pSPM502, pSPM504, pSPM507, pSPM508, pSPM509, pSPMl, pBXLllU, pBXL1112, pBXL1113? pSPM520, pSPM521, pSPM522, pSPM523, pSPM524, pSPM525, pSPM527, pSPM528, pSPM34, pSPM35, pSPM36, pSPM37, pSPM38, pSPM39, pSPM40, pSPM41, pSPM42, pSPM43, pSPM44, pSPM45, pSPM47, pSPM48, pSPM50, pSPM51, pSPM52, pSPM53, pSPM55, pSPM56, pSPM58, pSPM72, pSPM73, PSPM515, pSPM519, pSPM74, pSPM75, pSPM79, pSPM83, pSPMl07, pSPM543 e pSPMIOô. 17) Um outro aspecto da invenção refere-se a um vetor de expressão, caracterizado pelo fato de compreender pelo menos uma seqüên-cia de ácido nucléico, codificando um polipeptídeo, segundo o parágrafo 7), 8), 9), 10, 11) ou 12) acima. 18) A invenção é também relativa a um sistema de expressão que compreende um vetor de expressão apropriado e uma célula hospedeira, permitindo a expressão de um ou vários polipeptídeos, segundo parágrafo 7), 8), 9), 10), 11) ou 12) acima. 19) A invenção é também relativa a um sistema de expressão, segundo o parágrafo 18 acima, caracterizado pelo fato de ser escolhido dentre os sistemas de expressão procariotes ou os sistemas de expressão eucariotes. 20) A invenção é também relativa a um sistema de expressão, segundo o parágrafo 19) acima caracterizado pelo fato de ser escolhido dentre os sistemas de expressão na bactéria E. coli, os sistemas de expressão baculovírus, permitindo uma expressão em células de lêvedos, os sistemas de expressão, permitindo uma expressão em células de mamíferos. 21) A invenção é também relativa a uma células hospedeira na qual foi introduzido pelo menos um polinucleotídeo e/ou pelo menos um DNA recombinante e/ou pelo menos um vetor de expressão, segundo um dos pa- rágrafos 1), 2), 3), 4), 5), 6), 13), 14), 15), 16 ou 17) acima. 22) A invenção é também relativa a um processo de produção de um polipeptídeo, segundo o parágrafo 7), 8), 9), 10), 11) ou 12) acima caracterizado pelo fato de esse processo compreender as seguintes etapas: a) inserir pelo menos um ácido nucléico codificando esse polipeptídeo em um vetor apropriado; b) cultivar, em um meio de cultura apropriado, uma célula hospedeira previamente transformada ou transfectada como vetor da etapa a); c) recuperar o meio de cultura acondicionado ou um extrato celular; d) separar e purificar a partir desse meio de cultura ou ainda a partir do extrato celular obtido na etapa c), esse polipeptídeo; e) se for o caso, caracterizar o polipeptídeo que recombina o produto. 23) Um outro aspecto da invenção refere-se a um microorganismo bloqueado em uma etapa da via de biossíntese de pelo menos um ma-crolídeo. 24) Um outro aspecto da invenção refere-se a um microorganismo, segundo o parágrafo 23) acima, caracterizado pelo fato de ser obtido, inativando a função de pelo menos uma proteína implicada na biossíntese desse ou desses macrolídeos em um microorganismo produtor desse ou desses macrolídeos. 25) Um outro aspecto da invenção refere-se a um microorganismo, segundo o parágrafo 24) acima, caracterizado pelo fato de a inativação dessa(s) proteína(s) ser feita por mutagênese no(s) gene(s) codificando essa(s) proteí-na(s) ou por expressão de um ou de vários RNA anti-sentido complementares do RNA ou RNA mensageiros, codificando essa(s) proteína(s). 26) Um outro aspecto da invenção refere-se a um microorganismo, segundo o parágrafo 25) acima, caracterizado pelo fato de a inativação dessa(s) proteína(s) ser feita por mutagênese por irradiação, por ação de agente químico mutagene, por mutagênese dirigida ou por substituição de gene. 27) Um outro aspecto da invenção refere-se a um microorganismo, segundo o parágrafo 25) ou 26) acima, caracterizado pelo fato de a(s) mutagênese(s) ser(em) feita(s) in vitro ou in situ, por supressão, substituição, deleção e/ou adição de uma ou várias bases no(s) gene(s) considerado(s) ou por inativação gênica. 28) Um outro aspecto da invenção refere-se a um microorganismo, segundo o parágrafo 23), 24), 25), 26) ou 27) acima caracterizado pelo fato de esse microorganismo ser uma bactéria do gênero streptomyces. 29) Um outro aspecto da invenção refere-se ao microorganismo, segundo o parágrafo 23), 24), 25), 26), 27) ou 28) acima caracterizado pelo fato de o macrolídeo ser a espiramicina. 30) Um outro aspecto da invenção refere-se a um microorganismo, segundo o parágrafo 23), 24), 25), 26), 27), 28) ou 29) acima, caracterizado pelo fato de esse microorganismo ser uma cepa de S. ambofaciens. 31) Um outro aspecto da invenção refere-se a um microorganismo, segundo o parágrafo 23), 24), 25), 26), 27), 28), 29) ou 30) acima, caracterizado pelo fato de a mutagênese ser feita em pelo menos um gene, compreendendo uma seqüência, de acordo com um dos parágrafos 1), 2), 3), 4), 5) ou 6) acima. 32) Um outro aspecto da invenção refere-se a um microorganismo, segundo o parágrafo 25), 26), 27), 28), 29) ou 30) ou 31) acima, caracterizado pelo fato de a mutagênese ser feita em pelo menos um ou vários genes, compreendendo uma das seqüências correspondentes a uma ou várias das seqüências SEQ ID N° 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 e 149. 33) Um outro aspecto da invenção refere-se a um microorganismo, segundo o parágrafo 25), 26), 27), 28), 29), 30, 31 ou 32) acima, caracterizado pelo fato de a mutagênese consistir na inativação gênica de um gene, compreendendo uma seqüência correspondente à seqüência SEQ ID N° 13. 34) Um outro aspecto da invenção refere-se a uma cepa de streptomyces ambofaciens, caracterizada pelo fato de se tratar de uma cepa escolhida dentre uma das cepas depositadas junto à Coleção Nacional de Culturas de Microorganismos (CNCM), em 10 de julho de 2002 sob o número de registro I-2909, 1-2911, 1-2912, 1-2913, 1-2914, 1-2915, 1-2916 ou 1-2917. 35) Um outro aspecto da invenção refere-se a um processo de preparação de um intermediário de biossíntese de macrolídeo, caracterizado pelo fato de, caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas: a) cultivar, em um meio de cultura apropriado, um microorganismo, segundo um dos parágrafos 23), 24), 25), 26), 27), 28), 29), 30), 31), 32), 33) ou 34) acima; b) recuperar o meio de cultura acondicionado ou um extrato celular; c) separar e purificar a partir desse meio de cultura ou ainda a partir do extrato celular obtido na etapa b), esse intermediário de biossíntese. 36) Um outro aspecto da invenção refere-se a um processo de preparação de uma molécula derivada de um macrolídeo, caracterizado pelo fato de se preparar um intermediário de biossíntese segundo o processo do parágrafo 35) acima e de se modificar o intermediário assim produzido. 37) Um outro aspecto da invenção refere-se a um processo de preparação, segundo o parágrafo 36) acima, caracterizado pelo fato de se modificar esse intermediário por via química, bioquímica, enzimática e/ou microbiológica. 38) Um outro aspecto da invenção refere-se a um processo de preparação, segundo o parágrafo 36) ou 37) acima, caracterizado pelo fato de se introduzir nesse microorganismo um ou vários genes codificando proteínas capazes de modificar o intermediário servindo-se dele como substrato. 39) Um outro aspecto da invenção refere-se a um processo de preparação, segundo o parágrafo 36), 37), ou 38) acima, caracterizado pelo fato de o macrolídeo ser a espiramicina. 40) Um outro aspecto da invenção refere-se a um processo de preparação, segundo o parágrafo 36), 37), 38), ou 39) acima, caracterizado pelo fato de o microorganismo utilizado ser uma cepa de S. ambofaciens. 41) Um outro aspecto da invenção refere-se a um microorganismo, que produz a espiramicina I, mas que não produz espiramicina II e III. 42) Um outro aspecto da invenção refere-se a um microorganismo, segundo o parágrafo 41) acima, caracterizado pelo fato de compreender o conjunto dos genes necessários à biossíntese da espiramicina I, mas que o gene que compreende a seqüência SEQ ID N° 13 ou uma de suas variantes ou uma das seqüências derivadas destas, em virtude da degenerescên-cia do código genético e codificando um polipeptídeo de seqüência SEQ ID N° 14 ou uma de suas variantes não é expressa ou foi tomada inativa. 43) Um outro aspecto da invenção refere-se a um microorganismo, segundo o parágrafo 42) acima, caracterizado pelo fato de essa inativa-ção ser realizada por mutagênese no gene que codifica essa proteína ou pela expressão de um RNA anti-sentido complementar do RNA mensageiro codificando essa proteína. 44) Um outro aspecto da invenção refere-se a um microorganismo, segundo o parágrafo 43) acima, caracterizado pelo fato de essa mutagênese ser feita no promotor desse gene, na seqüência codificante ou em uma seqüência não codificante, de maneira a tornar inativa a proteína codificada ou a impedir sua expressão ou sua tradução. 45) Um outro aspecto da invenção refere-se a um microorganismo, segundo a reivindicação 43) ou 44) acima, caracterizado pelo fato de a mutagênese ser feita por irradiação, por ação de agente químico mutagene, por mutagênese dirigida ou por substituição de gene. 46) Um outro aspecto da invenção refere-se a um microorganismo, segundo o parágrafo 43), 44), ou 45), acima, caracterizado pelo fato de a mutagênese ser feita in vitro ou in situ, por supressão, substituição, dele-ção e/ou adição de uma ou várias bases no gene considerado ou por inati-vação gênica. 47) Um outro aspecto da invenção refere-se a um microorganismo, segundo o parágrafo 41) ou 42) acima, caracterizado pelo fato de esse microorganismo ser obtido expressando-se os genes da via de biossíntese da espiramicinas, sem que estes compreendam o gene que compreende a seqüência correspondente à SEQ ID N° 13 ou uma de suas variantes ou uma das seqüências derivadas desta, em virtude da degeneração do código genético e codificando um polipeptídeo da seqüência SEQ ID N° 14 ou uma de suas variantes. 48) Um outro aspecto da invenção refere-se a um microorganismo, segundo o parágrafo 41), 42), 43), 44), 45), 46), ou 47) acima, caracterizado pelo fato de o microorganismo ser uma bactéria do gênero streptomyces. 49) Um outro aspecto da invenção refere-se a um microorganismo, segundo o parágrafo 41), 42), 43), 44), 45), 46), 47) ou 48) acima, caracterizado pelo fato de o microorganismo ser obtido a partir de uma cepa de partida, produzindo as espiras I, II e III. 50) Um outro aspecto da invenção refere-se a um microorganismo, segundo o parágrafo 41), 42), 43), 44), 45), 46), 47), 48) ou 49) acima, caracterizado pelo fato de ser obtido por mutagênese em um gene que compreende a seqüência correspondente à SEQ ID N° 13 ou uma de suas variantes ou uma das seqüências derivadas destas em razão da degenerescên-cia do código genético e codificando um polipeptídeo de seqüência SEQ ID N° 14 ou uma de suas variantes que têm a mesma função. 51) Um outro aspecto da invenção refere-se a um microorganismo, segundo o parágrafo 41), 42), 43), 44), 45), 46), 47), 48), 49) ou 30) acima, caracterizado pelo fato de esse microorganismo ser obtido a partir de uma cepa de S. ambofaciens que produzindo as espiramicinas I, II e III, na qual é feita uma inativação gênica do gene que compreende a seqüência correspondente à SEQ ID N° 13 ou uma das seqüências derivadas desta em razão da degenerescência do código genético. 52) Um outro aspecto da invenção refere-se a uma cepa de S. ambofaciens, caracterizada pelo fato de se tratar da cepa depositada junto à Coleção Nacional de Culturas de Microorganismos (CNCM) em 10 de julho de 2002, sob o número de registro 1-2910. 53) Um outro aspecto da invenção refere-se a um processo de produção de espiramicina I, caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas: (a) cultivar, em um meio de cultura apropriado, um microorganismo, segundo um dos parágrafos 41), 42), 43), 44), 45), 46), 47), 48), 49), 50), 51) ou 52) acima; (b) recuperar o meio de cultura acondicionado ou um extrato celular; (c) separar e purificar a partir desse meio de cultura ou ainda a partir do extrato celular obtido na etapa b) a espiramicina I. 54) Um outro aspecto da invenção refere-se à utilização de um polinucleotídeo, segundo um dos parágrafo 1), 2), 3), 4), 5), ou 6) acima, para melhorar a produção em macrolídeos de um microorganismo. 55) Um outro aspecto da invenção refere-se a um microorganismo mutante produtor de macrolídeo, caracterizado pelo fato de possuir uma modificação genética em pelo menos um gene que compreende uma sequência, segundo um dos parágrafos 1), 2), 3), 4), 5) ou 6) acima e/ou que superexpressa pelo menos um gene que compreende uma seqüência, segundo um de seus parágrafos 1), 2), 3), 4), 5), ou 6 acima. 56) Um outro aspecto da invenção refere-se a um microorganismo mutante, segundo o parágrafo 55) acima, caracterizado pelo fato de a modificação genética consistir em uma supressão, uma substituição, uma deleção e/ou uma adição de uma ou várias bases no(s) gene(s) considera-do(s) com a finalidade de expressar uma ou proteínas que têm uma atividade superior ou de expressar um nível mais elevado dessa(s) proteína(s). 57) Um outro aspecto da invenção refere-se a um microorganismo mutante, segundo o parágrafo 55) acima, caracterizado pelo fato de a superexpressão do gene considerado ser obtida, aumentando-se o número de cópia desse gene e/ou colocando-se um promotor mais ativo do que o promotor selvagem. 58) Um outro aspecto da invenção refere-se a um microorganismo, segundo o parágrafo 55), ou 57) acima, caracterizado pelo fato de a superexpressão do gene considerado ser obtida, transformando-se um micro- organismo produtor de macrolídeo por uma construção de DNA recombi-nante segundo o parágrafo 13,14 ou 17 acima, permitindo a superexpressão desse gene. 59) Um outro aspecto da invenção refere-se a um microorganismo mutante, segundo o parágrafo 55), 56), 57), ou 58) acima, caracterizado pelo fato de a modificação genética ser feita em um ou vários genes, compreendendo uma de suas seqüências correspondentes a uma ou várias das seqüências SEQ ID N° 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109,111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 e 149 ou uma de suas variantes ou uma das seqüências derivadas destas em razão da degeneres-cência do código genético. 60) Um outro aspecto da invenção refere-se a um microorganismo mutante, segundo o parágrafo 55), 56), 57), 58) ou 59) acima, caracterizado pelo fato de o microorganismo superexpressar um ou vários genes compreendendo uma das seqüências correspondentes a uma ou várias das seqüência SEQ ID N° 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47,49, 53, 60,62,64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 e 149 ou uma de suas variantes ou uma das seqüências derivadas destas em razão da degenerescência do código genético. 61) Um outro aspecto da invenção refere-se a um microorganismo mutante, segundo o parágrafo 55), 56), 57), 58), 59) ou 60) acima, caracterizado pelo fato de esse microorganismo ser uma bactéria do gênero streptomyces. 62) Um outro aspecto da invenção refere-se a um microorganismo mutante, segundo o parágrafo 55), 56), 57), 58), 59), 60) ou 61) acima, caracterizado pelo fato de o marcolídeo ser a espiramicina. 63) Um outro aspecto da invenção refere-se a um microorganismo mutante, segundo o parágrafo 55), 56), 57), 58), 59) 60, 61) ou 62) acima, caracterizado pelo fato de esse microorganismo ser uma cepa de S. ambofaciens. 64) Um outro aspecto da invenção refere-se a um processo de produção de macrolídeos, caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas: a) cultivar, em um meio de cultura apropriado, um microorganismo, segundo um dos parágrafos 55), 56), 57), 58), 59), 60), 61), 62), 63) ou 64) acima; b) recuperar o meio de cultura acondicionado ou um extrato celular; c) separar e purificar a partir desse meio de cultura ou ainda a partir do extrato celular obtido na etapa b), esse(s) macrolídeo(s) produzi-do(s). 65) Um outro aspecto da invenção refere-se a utilização de uma sequência e/ou de um DNA recombinante e/ou de um vetor, segundo um dos parágrafos 1), 2), 3), 4), 5), 6), 7), 8), 9), 10) 11), 12), 13), 14), 15), 16) ou 17) acima, para a preparação de antibióticos híbridos. 66) Um outro aspecto da invenção refere-se à utilização de pelo menos um polinucleotídeo e/ou pelo menos um DNA recombinante e/ou pelo menos um vetor de expressão e/ou pelo menos um polipeptídeo e/ou pelo menos uma célula hospedeira, segundo um dos parágrafos 1), 2), 3), 4), 5), 6), 7), 8), 9), 10), 11), 12), 13), 14), 15), 16), 17) ou 21) acima, para realizar uma ou várias bioconversões. 67) Um outro aspecto da invenção refere-se a um polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de se tratar de um polinucleotídeo complementar de um dos polinucleotídeos, segundo o parágrafo 1), 2), 3), 4), 5) ou 6) acima. 68) Um outro aspecto da invenção refere-se a um microorganismo produtor de pelo menos uma espiramicinas, caracterizado pelo fato de superexpressar: - um gene capaz de ser obtido por amplificação em cadeia por polimerase (PCR), utilizando o par de atrações de seqüência apresentada a seguir: AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3’ (SEQ ED N° 138) e 5’ GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3’ (SEQ ID N° 139) e como matriz o cosmídeo pSPM36 ou o DNA total de streptomyces ambo-faciens; - ou um gene derivado deste em razão da degenerescência do código genético. 69) Um outro aspecto da invenção refere-se a um microorganismo, segundo o parágrafo 68 ou 90 acima, caracterizado pelo fato de uma bactéria do gênero streptomyces. 70) Um outro aspecto da invenção refere-se a um microorganismo, segundo o parágrafo 68, 69, ou 90, caracterizado pelo fato de tratar-se de uma bactéria da espécie Streptomyces ambofaciens. 71) Um outro aspecto da invenção refere-se a um microorganismo, segundo o parágrafo 68, 69, 70 ou 90, caracterizado pelo fato de a su-perexpressão desse gene ser obtida por transferência desse microorganismo por um vetor de expressão. 72) Um outro aspecto da invenção refere-se a uma cepa de Streptomyces ambofaciens, caracterizada pelo fato de se tratar da cepa OSC2/pSPM75(1) ou da cepa OSC2/pSPM75(2) depositada junto à Coleção Nacional de Culturas de Microorganismos (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, 6 de outubro de 2003, sob o número de registro 1-3101. 73) Um outro aspecto da invenção refere-se a um DNA recombi-nante, caracterizado pelo fato de compreender: - um polinucleotídeo capaz de ser obtido por amplificação em cadeia por polimerase, utilizando o par de atrações com a seguinte seqüên-cia: 5’ AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID N° 138) e 5’ GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID N° 139) e como matriz o cosmídeo pSPM36 ou o DNA total de streptomyces ambofaciens; - ou um fragmento de pelo menos 10, 12, 15, 18, 20 à 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900*950,-1000,1050,1100,1150,1200, 1250, 1300,1350, 1400, 1450, 1460,1470, 1480,1490 ου 1500 nucleotídeos consecutivos desse polinucleotídeo. 74) Um outro aspecto da invenção refere-se a um DNA recombi-nante, segundo o parágrafo 73 ou 91, caracterizado pelo fato de se tratar de um vetor. 75) Um outro aspecto da invenção refere-se a um DNA recombi-nante, segundo o parágrafo 73, 74 ou 91, caracterizado pelo fato de se tratar de um vetor de expressão. 76. Um outro aspecto da invenção refere-se a uma célula hospedeira, na qual foi introduzido pelo menos um DNA recombinante, segundo um dos parágrafos 73, 74, 75 ou 91. 77) Um outro aspecto da invenção refere-se a um processo de produção de um polipeptídeo, caracterizado pelo fato de esse processo compreender as seguintes etapas: a) transformar uma célula hospedeira por pelo menos um vetor de expressão, segundo o parágrafo 75; b) cultivar, em um meio de cultura apropriado, essa célula hospedeira; c) recuperar o meio de cultura acondicionado ou um extrato celular; d) separar e purificar, a partir desse meio de cultura ou ainda a partir do extrato celular obtido na etapa c), desse polipeptídeo; e) se for o caso, caracterizara o polipeptídeo recombinante produzido. 78) Um outro aspecto da invenção refere-se a um microorganismo, segundo o parágrafo 51, caracterizado pelo fato de a inativação gênica ser feita por deleção em fase do gene ou de uma parte do gene que compreende a seqüência correspondente à SEQ ID N° 13 ou uma das sequências derivadas desta, em razão da degenerescência do código genético. 79) Um outro aspecto da invenção refere-se a um microorganismo, segundo o parágrafo 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 ou 78, caracterizado pelo fato de superexpressar além disso: - um gene capaz de ser obtido por amplificação em cadeia por polimerase, utilizando o par de atrações da seguinte seqüência: 5'AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3’ (SEQ ID N° 138) e 5'GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3’ (SEQ 1D N° 139) e como matriz o cosmídeo pSPM36 ou o DNA total de streptomyces ambo-faciens, - ou um gene derivado destes, em razão da degenerescência do código genético. 80) Um outro aspecto da invenção refere-se a um vetor de expressão, caracterizado pelo fato de o polinucleotídeo de seqüência SEQ ID N° 47 ou o polinucleotídeo derivado deste, em razão da degenerescência do código genético ser colocado sob o controle de um promotor, permitindo a expressão da proteína codificada por esse polinucleotídeo no streptomyces ambofaciens. 81) Um outro aspecto da invenção refere-se a um vetor de expressão, segundo o parágrafo 80, caracterizado pelo fato de se tratar do plasmídeo pSPM524 ou pSPM525. 82) Um outro aspecto da invenção refere-se a uma cepa de streptomyces ambofaciens transformada por um vetor, segundo um parágrafo 80 ou 81. 83) Um outro aspecto da invenção refere-se a um microorganismo, segundo um dos parágrafos 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 78, 79 ou 92, caracterizado pelo fato de superexpressar, além disso, o gene de seqüência codíficante SEQ ID N° 47 ou de uma seqüência codificante derivada desta em razão da degenerescência do código genético. 84) Um outro aspecto da invenção refere-se a um microorganismo, segundo o parágrafo 83, caracterizado pelo fato de se tratar da cepa SPM502 pSPM525 depositada junto à Coleção Nacional de Culturas de Mi- croorganismos (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, em 26 de fevereiro de 2003, sob o número de registro I-2977. 85) Um outro aspecto da invenção refere-se a um processo de produção de espiramicina(s), caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas: a) cultivar, em um meio de cultura apropriado, um microorganismo, segundo um dos parágrafos 68, 69, 70, 71, 72, 78, 79, 82, 83, 84, 90 ou 92; b) recuperar o meio de cultura acondicionado ou um extrato celular; c) separar e purificar a partir do meio de cultura ou ainda a partir do extrato celular obtido na etapa b), as espiramicinas. 86) Um outro aspecto da invenção refere-se a um polipeptídeo, caracterizado pelo fato de sua seqüência compreender a seqüência SEQ ID N° 112 ou a seqüência SEQ ID N° 142. 87) Um outro aspecto da invenção refere-se a um polipeptídeo, caracterizado pelo fato de sua seqüência corresponder à seqüência traduzida da seqüência codificante: - de um gene capaz de ser obtido por amplificação em cadeia por polimerase (PCR), utilizando o par de atrações da seguinte seqüência: 5'AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3’ (SEQ ID N° 138) e 5'GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGGA 3’ (SEQ ID N° 139) e como matriz o cosmídeo pSPM36 ou o DNA total de streptomyces ambo-faciens; - ou de um gene derivado deste, em razão da degenerescência do código genético. 88) Um outro aspecto da invenção refere-se a um vetor de expressão de um polipeptídeo, segundo o parágrafo 86, 87 ou 93 no streptomyces ambofaciens. 89) Um outro aspecto da invenção refere-se a um vetor de expressão, segundo o parágrafo 88, caracterizado pelo fato de que é do pias- mídeo pSPM75. 90) Um outro aspecto da invenção refere-se a um microorganismo, segundo o parágrafo 68, caracterizado pelo fato de o gene de seqüência codificante SEQ ID N° 141 ou um gene derivado deste em razão da degene-rescência do código genético. 91) Um outro aspecto da invenção refere-se a um DNA recombi-nado, segundo o parágrafo 73, caracterizado pelo fato de o polinucleotídeo capaz de ser obtido por amplificação em cadeia por polimerase ser um polinucleotídeo de seqüência SEQ ID N° 141. 92) Um outro aspecto da invenção refere-se a um microorganismo, segundo o parágrafo 79, caracterizado pelo fato de o gene capaz de ser obtido por amplificação em cadeia por polimerase ser o gene de seqüência codificante SEQ ID N° 141 ou um gene derivado deste em razão da degene-rescência do código genético. 93) Um outro aspecto da invenção refere-se a um polipeptídeo, caracterizado pelo fato de sua seqüência ser SEQ ID N° 142.

Definições gerais O termo "isolado" no sentido da presente invenção designa um material biológico (ácido nucléico ou proteína) que foi subtraído em seu meio ambiente original (o meio ambiente no qual é localizado naturalmente).

Por exemplo, um polinucleotídeo presente no estado natural em uma planta ou um animal não é isolado. O mesmo polinucleotídeo separado dos ácidos nucléicos adjacentes no meio dos quais é naturalmente inserido no genoma da planta ou o animal é considerado como isolado.

Esse polinucleotídeo pode ser incluído em um vetor e/ou esse polinucleotídeo pode ser incluído em uma composição e permanecer, todavia, no estado isolado devido ao fato de o vetor ou a composição não constituir seu meio ambiente natural. O termo purificado não necessita de que o material esteja presente sob uma forma de pureza absoluta, exclusiva da presença de outros compostos. Trata-se antes de tudo de uma definição relativa.

Um polinucleotídeo está no estado "purificado", após purificação do material de partida ou do material natural de pelo menos uma ordem de grandeza, de preferência 2 ou 3, e, preferencialmente 4 ou 5 ordens de grandeza.

Com a finalidade da presente invenção o termo ORF (Open Re-ading Frame, isto é, quadro aberto de leitura) foi empregado para designar em particular a seqüência codificante de um gene.

Com a finalidade da presente descrição, a expressão "seqüência nucleotídica" pode ser empregada para designar indiferentemente um poli-nucleotídeo ou um ácido nucléico. A expressão "seqüência nucleotídica" engloba o próprio material genético e não está, portanto, restrita à informação referente à sua seqüência.

Os termos "ácido nucléico", polinucleotídeo, oligonucleotídeo ou ainda seqüência nucleotídica englobam as seqüências de RNA, de DNA, de ADNc ou ainda seqüências híbridas RNA/DNA além disso, de um nucleotí-deo, indiferentemente sob a forma simples cadeia ou sob a forma de duplex. O termo nucleotídeo designa ao mesmo tempo os nucleotídeos naturais (A, T, G, C), assim como nucleotídeos modificados que compreendem pelo menos uma modificação tal como (1), um análogo de uma purina, (2), um análogo de uma pirimidina, ou (3) um açúcar análogo, exemplos desses nucleotídeos modificados sendo descritos, por exemplo, no pedido PCT N° EO 95/04 064.

Com a finalidade da presente invenção, um primeiro polinucleotídeo é considerado como sendo "complementar" de um segundo polinucleotídeo, quando cada base do primeiro polinucleotídeo é emparelhado à base complementar do segundo polinucleotídeo, cuja orientação é inversa. As bases complementares são A e T (ou A e U), ou C e G. O termo "genes da via de biossíntese das espiramicinas” compreende igualmente os genes reguladores, e os genes conferem a resistência aos microorganismos produtores.

Será entendido por "fragmento" de um ácido nucléico de referência, de acordo com a invenção, uma seqüência nucleotídica de comprimento reduzido em relação ao ácido nucléico de referência e compreenden- do, sobre a parte comum, uma seqüêncía em nucíeotídeos idêntica ao ácido nucléico de referência.

Esse "fragmento" de ácido nucléico, de acordo com a invenção, pode estar, se for o caso, compreendido em um polinucleotídeo maior, do qual ele é constitutivo.

Desses fragmentos, compreendem ou alternativamente consistem em polinucleotídeos de comprimento que vai de 8, 10, 12, 15, 18, 20 a 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850 ou 1900 nucíeotídeos consecutivos de um ácido nucléico, de acordo com a invenção.

Por "fragmento" de um polipeptídeo, de acordo com a invenção, entender-se-á um polipeptídeo cuja sequência de aminoácidos é mais curta do que a do polipeptídeo de referência, e que compreende sobre toda a parte comum com esses polipeptídeos de referência, uma seqüência em aminoácidos idêntica.

Esses fragmentos podem, se for o caso, estar compreendidos no meio de um polipeptídeo maior, do qual eles fazem parte.

Esses fragmentos de um polipeptídeo, de acordo com a invenção, podem ter um comprimento de 10, 15, 20, 30 a 40, 50, 60, 70,80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 540, 560, 580, 600, 620 ou 640 aminoácidos.

Por "condições de hibridização de forte estringência" no sentido da presente invenção, serão entendidas condições de hibridização que desfavorecem a hibridização de filamentos de ácidos nucléicos não homólogos. Condições de hibridizações de forte estringência podem ser, por exemplo, descritas como condições de hibridização no tampão descrito por Church & Gilbert (Church & Gilbert, 1984) a uma temperatura compreendida entre 55°C e 65°C, de maneira preferida a temperatura de hibridização é de 55°C, de maneira ainda mais preferida a temperatura de hibridização é de 60°C e de maneira inteiramente preferida a temperatura de hibridização é de 65°C, seguida de uma ou várias lavagens feita em tampão 2X SSC (o tampão 1X SSC corresponde a uma solução aquosa 0,15M NaCl, 15 mM de citrato de sódio) a uma temperatura compreendida entre 55°C e 65°C, de maneira preferida essa temperatura é de 55°C, de maneira ainda mais preferida essa temperatura é de 60°C e de maneira inteiramente preferida essa temperatura é de 65°C, seguida de uma ou várias lavagens em tampão 0,5X SSC a uma temperatura compreendida entre 55°C e 65°C, de maneira preferida essa temperatura é de 55°C, de maneira ainda mais preferida essa temperatura é de 60°C e de maneira inteiramente preferida essa temperatura é de 65°C. É evidente que as condições de hibridização acima descritas podem ser adaptadas em função do comprimento do ácido nucléico, cuja hibridização é buscada ou do tipo marcação escolhida, segundo técnicas conhecidas do técnico. As condições convenientes de hibridização podem, por exemplo, ser adaptadas, segundo a obra de F. Ausubel et al. (2002).

Por "variante" de um ácido nucléico, de acordo com a invenção, entender-se-á um ácido nucléico que difere de uma ou várias bases em relação ao polinucleotídeo de referência. Um ácido nucléico variante pode ser de origem natural, tal como um variante alélico encontrado naturalmente, ou pode ser também um variante não natural obtido por exemplo por técnicas de mutagênese.

Em geral, as diferenças entre o ácido nucléico de referência e o ácido nucléico variante são reduzidas de tal modo que as seqüências nucle-otídicas do ácido nucléico de referência e do ácido nucléico variante são muito próximas e, em numerosas regiões, idênticas. As modificações de nu-cleotídeos presentes em um ácido nucléico variante podem ser silenciosas, o que significa que elas não alteram as seqüências de aminoácidos codificadas por esse ácido nucléico variante.

Todavia, as mudanças de nucleotídeos em um ácido nucléico variante podem também resultar de substituições, adições, deleções no poli-peptídeo codificado pelo ácido nucléico variante em relação aos peptídeos codificados pelo ácido nucléico de referência. Além disso, modificações de nucleotídeos nas regiões codificantes podem produzir substituições, conservadoras ou não conservadoras na seqüência de aminoácidos.

De preferência, os ácidos nucléicos variantes, de acordo com a invenção, codificam polipeptídeos que conservam sensivelmente a mesma função ou atividade biológica que o polipeptídeo do ácido nucléico de referência ou ainda a capacidade de serem reconhecidos por anticorpos dirigidos contra os polipeptídeos codificados pelo ácido nucléico inicial.

Certos ácidos nucléicos variantes codificarão assim formas mu-tadas dos polipeptídeos cujo estudo sistemático permitirá deduzir relações estrutura atividade das proteínas em questão.

Por variante de um polipeptídeo, de acordo com a invenção, entender-se-á principalmente um polipeptídeo cuja seqüência de aminoácidos contém uma ou várias substituições, adições ou deleções de pelo menos um resíduo de aminoácido, em relação à seqüência de aminoácidos do polipeptídeo de referência, naturalmente que as substituições de aminoácidos podem ser indiferentemente conservadoras ou não conservadoras.

De preferência, os polipeptídeos variantes, de acordo com a invenção, conservam sensivelmente a mesma função ou atividade biológica que o polipeptídeo de referência ou ainda a capacidade de serem reconhecidos por anticorpos dirigidos contra os polipeptídeos iniciais.

Por polipeptídeo tendo uma atividade similar a um polipeptídeo de referência no sentido da invenção, entende-se um polipeptídeo que tem uma atividade biológica próxima, mas não necessariamente idêntica, daquela do polipeptídeo de referência, tal como medido em um teste biológico conveniente à medida da atividade biológica do polipeptídeo de referência.

Por antibiótico híbrido no sentido da invenção entende-se um composto, gerado pela construção de uma via de biossíntese artificial utilizando a tecnologia do DNA recombinante.

Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção tem mais particularmente por objeto novos genes da via de biossíntese das espiramicinas e novos polipeptídeos impli- cados nessa biossíntese, tais como apresentados na descrição detalhada abaixo.

Os genes da via de biossíntese foram clonados e a seqüência de DNA desses genes foi determinada. As sequências obtidas foram analisadas graças ao programa FramePlot (Ishikawa J & Hotta K. 1999). Identificaram-se, dentre as fases abertas de leitura, as fases abertas de leitura que apresentam um uso dos códons típicos de streptomyces. Essa análise mostrou que essa região comporta 44 ORFs, localizadas de ambos lados de cinco genes codificando a enzima "polyketide synthase"(PKS), e apresentando um uso dos códons típico de streptomyces. De ambos lados desses cinco genes codificando a PKS, respectivamente 10 e 34 ORFs foram identificadas a jusante e a montante (a jusante e a montante sendo definidos pela orientação dos 5 genes de PKS todos orientados no mesmo sentido) (conforme Figura 3 e 37). Assim, as 34 fases abertas de leitura desse tipo, ocupando uma região de aproximadamente 41,7 kb (cf SEQ ID N° 1 que apresenta uma primeira região de 31 kb contendo 25 ORFs e SEQ ID N° 140 que apresenta uma região de aproximadamente 12,1 kb, dos quais 1,4 kb se sobrepõem a seqüência precedente (SEQ ID N° 1) e aproximadamente 10,7 kb correspondem à seqüência da seqüência, esta última parte de aproximadamente 10,7 kb contendo 9 ORFs suplementares (dos quais um ORF de seqüência parcial), conforme também Figura 3 e 37 e abaixo) foram identificadas a montante dos 5 genes codificando a PKS e 10 ocupando uma região de aproximadamente 11,1 kb (SEQ ID N° 2 e Figura 3), foram identificadas a jusante dos genes da PKS. Os 10 genes situados a jusante dos 5 genes PKS foram assim denominados orf1*c, orf2*c, orf3*c, orf4*c, orf5*c, orf6*c, orf7*c, orf8*c, or9f*c, orf10*c (SEQ ID N° 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 e 21). O "c" acrescentado no nome do gene significante para ORF em questão que a seqüência codificante é na orientação inversa (o filamento codificando é, portanto, o filamento complementar da seqüência determinada em SEQ ID N° 2 para esses genes). Utilizando a mesma nomenclatura, as 34 ORFs a montante dos genes da PKS foram chamados orf1, orf2, orf3, orf4, orf5, orf6, orf7, orf8, or9fc, orf10, orf11c, orf12, orf13c, orf14, orflõc, orf16, orf17, orf18, orf19, orf20, orf21c, orf22c, orf23c, orf24c, orf25c, orf26, orf27, orf28c, orf29, orf30c, orf31, orf32c e orf34c (SEQ ID N° 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 e 149) (conforme Figuras 3 e 37).

As seqüências protéicas deduzidas dessas fases abertas de leitura foram comparadas com aquelas presentes em diferentes bases de dados graças a diferentes programas: BLAST (Altschul et al., 1990) (Altschul et al., 1997), CD-Search, COGs (Cluster of Orthologous Groups) (esses três programas são acessíveis notadamente junto ao National Center for Biote-chnology Information (NCBI) (Bethesda, Maryland, USA)), FASTA ((Pearson W. R & D.J. Lipman, 1988) e (Pearson W. R„ 1990), BEAUTY (Worley K. C. et al., 1995)), (esses dois programas são acessíveis notadamente junto ao centro de pesquisas INFOBIOGEN, Evry, França). Essas comparações permitiram formular hipóteses sobre a função dos produtos desses genes e identificar aqueles capazes de serem implicados na biossíntese das espira-micinas.

Genes situados a jusante dos genes codificando os PKS

Uma representação esquemática da organização da região é apresentada na Figura 3. Assim conforme será demonstrado abaixo, sobre os 10 genes identificados a jusante dos genes codificando os PKS 9 parecem implicados na biossíntese ou a resistência às espiramicinas. Trata-se dos seguintes 9 genes: orf1*c, orf2*c, orf3*c, orf4*c, orf5*, orf6*, orf7*c, orf8* e orf9*.

Na tabela 1 a seguir são apresentadas as referências à sequência em DNA e em aminoácidos dos 10 genes identificados a jusante dos 5 genes PKS TABELA 1 O "c" acrescentado ao nome do gene indica que a seqüência codificante está na orientação inversa (o filamento codificante é, portanto, o filamento complementar da seqüência determinada em SEQ ID N° 2 para esses genes).

Com a finalidade de determinar a função dos polipeptídeos identificados três tipos de experiências foram feitas: a comparação das seqüên-cias identificadas com seqüências de funções conhecidas, experiências de inativação de genes, conduzindo à produção de cepas mutantes e análises da produção em espiramicinas e em intermediários de biossíntese das espi-ramicinas por essas cepas mutantes.

As seqüências protéicas deduzidas dessas fases abertas de leitura foram inicialmente comparadas com aquelas presentes em diferentes bases de dados, graças a diferentes programas: BLAST (Altschul et al., 1990) (Altschul et al., 1997), CD-search, COGs (Cluster of Orthologus Groups), FASTA (Pearson W.R & D.J. Lipman, 1988) e (Pearson W.R., 1990), BEAUTY (Worley K.C. et al., 1955). Essas comparações permitiram formular hipóteses a respeito da função dos produtos desses genes e identificar aqueles capazes de serem implicados na biossíntese de espiramicina. A tabela 2 mostra as proteínas que apresentam uma elevada similitude com os produtos 10 genes situados a jusante dos 5 genes PKS. ___________________________________Tabela 2___________________________________ * maior similitude de seqüência é associada a um escore BLAST mais elevado (Altschul et al., 1990) Experiências de inativação de genes foram feitas para confirmar esses resultados. Os métodos aplicados consistem em efetuar uma substituição de gene. O gene alvo a interromper é substituído por uma cópia desse gene interrompida por um cassette, conferindo à resistência a um antibiótico (por exemplo a apramicina, a geneticina ou a higromicina). Os cassettes utilizados são contornados de ambos os lados por códons de terminação da tradução em todas as fases de leitura e por terminadores de transcrição ativos em streptomyces. A inserção do cassette no gene alvo pode ser acom- panhada ou não de uma deleção nesse gene alvo. O tamanho das regiões que costeiam o cassette pode ir de algumas centenas a alguns milhares de pares de bases. Um segundo tipo de cassettes pode ser utilizado para a ina-tivação dos genes: cassettes ditos "cassettes excisáveis". Esses cassettes apresentam a vantagem de poderem ser excisados em streptomyces por uma recombinação de sítio específico após terem sido introduzidos no ge-noma de S. ambofaciens. A finalidade é de inativar certos genes em cepas de streptomyces, sem deixar na cepa final marcadores de seleção ou de grandes seqüências de DNA que não pertencem à cepa. Após excisão subsiste unicamente uma curta seqüência de uns trinta pares de bases (denominado sítio "cicatriciar) no genoma da cepa (conforme Figura 10). A utilização desse sistema consiste, em uma primeira etapa, na substituição da cópia selvagem do gene alvo (graças a dois acontecimentos de recombinação homóloga, conforme Figura 9) por uma construção na qual umo cassette excisável foi inserida nesse gene alvo. A inserção desse cassette é acompanhado de uma deleção no gene alvo (conforme Figura 9). Em uma segunda etapa, a excisão do cassette excisável do genoma da cepa é provacada. O cassette excisável funciona graças a um sistema de recombinação sítio específico e tem por vantagem permitir a obtenção de mutantes de streptomyces não portando finalmente gene de resistência. Ficou-se livre também de eventuais efeitos polares sobre a expressão dos genes situados a jusante do ou dos genes inativados (conforme Figura 10). As cepas assim construídas foram testadas para sua produção em espiramicinas. A inativação dos genes orfl*c, orf2*c, orf3*c e orf4*c não foi feita, pois as experiências de comparação de seqüência permitiram determinar que esses genes tinham uma similitude relativamente importante com genes implicados na biossíntese de um antibiótico relativamente próxima. Assim o gene orfTc codifica uma proteína que apresenta uma identidade de 66% (determinada graças ao programa BLAST) com a proteína codificada por gene tylMI que codifica uma N-metiltransferase implicada na biossíntese de tilosina e catalisando a 3-N-metilação durante a produção da micaminose nas streptomyces fradiae (Gandecha, A.R. et al., 1997; Número de acesso GenBankl: CAAA57473; Escore BLAST: 287). Essa similitude com uma proteína implicada na via de biossíntese de um outro antibiótico relativamente próxima e mais particularmente na biossíntese da micaminose sugere que o gene orfTc codifica uma N-metiltransferase responsável por uma N-metilação, quando da biossíntese da forosamina ou da micaminose (conforme Figura 5 e 6). Essa hipótese é reforçada pelo fato de a proteína codificada pelo gene orfTc apresenta uma forte similitude com outras proteínas de função similar em outros organismos (conforme tabela 3). __________________________________TABELA 3_____________________________________ * maior similitude de seqüência é associada a um escore BLASDT mais elevado (Altschul et al., 1990). O gene orf2*c codifica uma proteína que apresenta uma relativa similitude (35% de identidade) com uma proteína codificada pelo gene tylMIH codificando uma NDP hexose 3,4 isomerase implicada na biossíntese da tilosina nas streptomyces fradiae (Gandecha, A.R., et al., 1997; Número de acesso GenBank: CAAS57471; Escore BMAST; 130). Essa similitude com uma proteína implicada na via de biossíntese de um outro antibiótico próximo e mais particularmente na biossíntese da micaminose sugere muito que o gene orf2c codifica uma NDP hexose 3,4 isomerase responsável de isome-rização, quando da biossíntese de um dos açúcares da espiramicina, eventualmente a micaminose (conforme Figura 5 e 6). O gene orf3* codifica uma proteína que apresenta uma relativa forte similitude (59% de identidade) com uma proteína codificada pelo gene tylMIl codificando uma glicosiltransferase implicada na biossíntese da tilosina nas streptomyces fradiae (Gandecha, A.R. et al., 1997; Número de acesso GenBank: CAA57472; Escore BLAST: 448). Essa similitude com uma proteína implicada na via de biossíntese de um outro antibiótico próximo sugere muito que o gene orf*3c codifica uma glicosiltransferase. Essa hipótese é reforçada pelo fato de a proteína codificada pelo gene orf3*c apresenta uma forte similitude com outras proteínas de função similar em outros organismos (conforme tabela 4). _________________________________TABELA 4___________________________________ * Maior similitude de sequência é associada a um escore BLAST mais elevado (Altschul et al., 1990) O gene orf4*c codifica uma proteína que apresenta uma relativa forte similitude com vários crotonil-CoA redutases. Notadamente, a proteína codificada por orf4*c possui uma similitude importante com uma crotonil CoA redutase de streptomyces coelicolor (Redenbach, M et al., 1996; Número de acesso GenBank: NP 630556; Escore BLAST: 772). Essa similitude com uma proteína implicada na via de biossíntese de um outro antibiótico próximo sugere muito que o gene orf4*c codifique também uma crotonil-CoA redutase. Essa hipótese é confirmada pelo fato de a proteína codificada pelo gene orf4* apresentar uma forte similitude com outras proteínas de função similar em outros organismos (conforme tabela 5) TABELA 5 ________ ____________________ * maior similitude de seqüência é associada a um escore BLAST mais elevado (Altschul et al., 1990) O gene orf6* apresenta uma certa similitude como gene mdmB presente nas streptomyces mycarofaciens (Hara et Hutchisnson, 1992; número de acesso GenBank: A42719; Escore BLAST: 489) produtor de antibiótico macrolídeo. Nesse produtor, o gene é implicado na acilação do ciclo-lactona. O gene orf6* codificaria, portanto, uma aciltransferase. Essa hipótese é confirmada pelo fato de a proteína codificada pelo gene orfô* apresentar uma forte similitude com outras proteínas de função similar em outros organismos (conforme tabela 6). ___________________________________Tabela 6__________________________________ * Maior similitude de seqüência é associada a um escore BLAST mais elevado (Altschul et al., 1990) A inativação do gene orfô* foi realizada por uma dele- ção/inserção em fase e foi mostrado que a cepa resultante não produz mais espiramicina II e III, mas unicamente a espiramicina I (Conforme Figura 1). Isto confirma que o gene orf6* está bem implicado na síntese de espiramicina II e III. A enzima codificada por esse gene é responsável pela formação de espiramicina II e III por fixação de um grupo acetila ou butirila sobre o carbono 3. As cepas que não expressam mais a proteína codificada pelo gene orf6* são particularmente interessantes, já que elas não produzem mais espiramicina II e III, mas somente a espiramicinas I. Conforme foi precisado acima, a atividade antibiótica da espiramicina I é nitidamente superior àquela das espiramicina II e III (Liu et al., 1999). O gene orf5* codifica uma proteína que apresenta uma relativa forte similitude com vários O-metiltransferase. Notadamente, a proteína codificada por orf5* possui uma similitude importante com uma O-metiltransferase (EC 2.1.1.) MdmC de streptomyces mycarofaciens (Hara & Hutchinson, 1992; Número de acesso GenBank: B42719; Escore BLAST: 355). Essa similitude com uma proteína implicada na via de biossíntese de um outro antibiótico sugere muito que o gene orf5* codifique também uma O-metiltransferase. O gene orf5* seria implicado na formação de precursores incorporados no ciclolactona. Com efeito, a partir das comparações de se-qüências, o produto gene orf5* é também relativamente próximo de FkbG que é responsável pela metilação do hidroximalonil-ACP a partir (Wu et al., 2000; Hoffmeister et al., 2000; Número de acesso GenBank: AAF86386; Escore BLAST: 247 (Conforme Figura 8). Essa hipótese é confirmada pelo fato de a proteína codificada pelo gene orf5* apresenta uma forte similitude com outras proteínas de função similar em outros organismos (conforme tabela 7). _____________________________ Tabela 7 ______________________________________ * maior similitude de sequência é associada a um escore BLAST mais elevado (Altschul et al., 1990) Graças ao efeito polar da inserção de um cassette não excisado no gene orf6*, pôde ser determinado que o gene orf5* é essencial à via de biossíntese das espiramicinas. Com efeito, a inserção do cassette excisável na parte codificante do gene orf6* acarreta uma parada total da produção em espiramicinas. Todavia, uma vez que o cassette inserido tenha sido excisado (e, portanto, quando só o gene orf6* é inativado, conforme exemplos 14 e 15), encontra-se uma produção em espiramicinas I. Isto mostra que o gene orf5* é essencial à via de biossíntese das espiramicinas, já que sua inativa-ção acarreta uma parada total da produção em espiramicinas. O gene orf5* codifica uma proteína que apresenta uma relativa forte similitude com vários O-metiltransferase. O gene orf5* seria uma O-metil transferase implicada seja diretamente na síntese do platenolídeo, seja na síntese de um precursor metilado (metoximalonil, ver a Figura 8) incorporado no platenolídeo pela PKS. Para verificar essa hipótese, experiências de análise CL/SM e de RMN foram feitas sobre uma cepa de S. ambofaciens de genótipo: orf6*::att1Qhyg+. Nessa cepa o gene orf5* não é expresso por causa do efeito polar de inserção, no gene orf6*, do cassette que contém terminadores de transcrição (conforme exemplo 27). Foi mostrado que essa cepa produz uma molécula cujo espectro UV tem um comportamento similar àquele da espiramicina I, mas o espectro de massa mostra um íon molecular em 829. A diferença de massa de 14 em relação à massa da espiramicina pode ser explicada pela ausência de metil sobre o oxigênio levada pelo carbono N° 4 do ciclolactona (a estrutura desse composto é apresentada na Figura 39). Os resultados obtidos por RMN são compatíveis com essa hipótese. A presença de um composto em 829 permite validar a hipótese do papel de orf5* na biossíntese das espiramicinas. Além disso, o produto correspondente à espiramicinas sem o grupo metila apresenta uma atividade microbi-ológica muito fraca (menor de um fator 10) em relação à espiramicina não modificada, quando testada sobre o microorganismo Micrococcus luteus. O gene orf7*c codifica uma proteína que apresenta uma relativa forte similitude com uma proteína codificada pelo gene mdmA de streptomyces mycarofaciens, este codificando uma proteína implicada na resistência à midecamicina nesse organismo produtor (Hara et al., 1990; Número de acesso GenBank: A60725; Escore BLAST: 380). Essa similitude com uma proteína implicada na via de biossíntese de um outro antibiótico sugere fortemente que o gene orf7*c codifique também uma proteína implicada na resistência a espiramicina. Mais particularmente, a enzima codificada pelo gene orf7*c possui uma atividade metiltransferase e é implicada na resistência a espiramicinas em streptomyces ambofaciens. Foi demonstrado que esse gene confere uma resistência de tipo MLS I, resistência da qual se sabe que é devido à monometilação em posição A2058 do RIMA ribossomal 23S (Pernodet et al., 1996). Essa hipótese é confirmada pelo fato de a proteína codificada pelo gene orf7*c apresentar uma forte similitude com outras proteínas de função similar em outros organismos (conforme tabela 8). __________________________________TABELA 8_____________________________________ * maior similitude de seqüência é associada a um escore BLAST mais elevado (Altschul et al., 1990) O gene οιΐδ* codifica uma proteína que apresenta uma relativa forte similitude com uma proteína de tipo transportador ABC em streptomyces griseus (Campeio, 2002, Número de acesso GenBank: CAC22119; Escore BLAST: 191). Essa similitude com uma proteína de tipo transportador ABC sugere fortemente que o gene orf8* codifique também uma proteína de tipo transportador ABC que pode ser implicada na resistência a espiramicinas. Essa hipótese é confirmada pelo fato de a proteína codificada pelo gene orf8* apresentar uma forte similitude com outras proteínas de função similar em outros organismos (conforme tabela 9). __________________________________TABELA 9____________________________________ * maior similitude de sequência é associada a um Escore BLAST mais elevado (Altschul et al., 1990) O gene orf9* codifica uma proteína que apresenta uma relativa forte similitude com uma proteína de tipo transportador ABC em streptomyces griseus (Campeio, 2002, Número de acesso GenBank: CAC22118; Escore BLAST: 269). Essa similitude com uma proteína de tipo transportador ABC sugere fortemente que o gene orf9* codifique também uma proteína de tipo transportador ABC que pode ser implicada na resistência a espiramicina. Essa hipótese é confirmada pelo fato de a proteína codificada pelo gene orf8* apresentar uma forte similitude com, outras proteínas de função similar em outros organismos (conforme tabela 10). _____________________________TABELA 10_____________________________ * maior similitude de seqüência é associada a um escore BLAST mais elevado (Altschul et ai. , 1990). O gene orf10* codifica uma proteína que apresenta uma relativa forte similitude com uma proteína de função desconhecida. Todavia, genes similares a orf10* são encontrados no meio de vários grupos de genes implicados na biossíntese de antibióticos. Assim, um gene próximo de orf10* é encontrado em S. coelicolor (Redenbach et al., 1996, número de acesso GenBank: NP-627432, escore BLAST: 109). Um gene próximo (CouY) é também encontrado em S. rishiriensis (Wang et al., 2000, número de acesso GenBank"AAG29779, escore BLAST 97).

Genes situados a montante dos genes codificando os PKS

Na seqüência de DNA situada a montante dos genes codificando os PKS (a jusante e a montante sendo definido pela orientação dos 5 genes de PKS todos orientados no mesmo sentido) (conforme Figura 3), 34 ORFs foram identificados (conforme acima). Assim, as 34 fases abertas de leitura desse tipo, ocupando uma região de aproximadamente 41,7 kb (conforme SEQ ID N° 1 que apresenta uma primeira região de aproximadamente 31 kb contendo 25 ORFs e a SEQ ID N° 140 apresentando uma região de aproximadamente 12,1 kb, dos quais 1,4 kb se sobrepõem a seqüência precedente (SEQ ID N° 1) e aproximadamente 10,7 kb correspondem ao sítio da seqüência), esta parte de aproximadamente 10,7 kb, contendo 9 ORFs suplementares (das quais um ORF de seqüência parcial), conforme também Figura 3 e 37 e abaixo). Uma representação esquemática da organização da re- gião está presente na Figura 3 e 37. Os 34 genes identificados foram chamados: orf1, orf2, orf3, orf4, orf5, orf6, orf7, orf8, orf9c, orf10, orf11c, orf12, orf13c, orf15, orf15c, orf16, orf17, orf18, orf19, orf20, orf21c, orf22c, orf23c, orf24c, orf25c, orf26, orf27, orf28c, orf29, orf30c, orf31, orf32c, orf33 e orf34c.

Na tabela 11a seguir são apresentadas as referências à se-qüência em DNA e em aminoácidos dos 34 genes identificados a montante dos 5 genes PKS. TABELA 11 1. O "c" acrescentado no nome do gene indica que a seqüência codificante está na orientação inversa (o filamento codificante é, portanto, o filamento complementar da seqüência determinada em SEQ ID N° 1 ou SEQ ID N° 140 para esses genes). 2. Quando várias seqüências protéicas são indicadas para uma única orf, as proteínas correspondentes são provenientes de vários sítios possíveis de acionamento da tradução.

Com a finalidade de determinar a função dos polipeptídeos identificados na tabela 11 acima, três tipos de experiências foram feitas: a comparação da identidade das seqüências identificadas com seqüências de funções conhecidas, experiências de inativação de genes e análises da produção en espiramicinas dessas cepas mutantes.

As seqüências protéicas deduzidas dessas fases abertas de lei- tura foram inicialmente comparadas com aquelas presentes em diferentes bases de dados graças a diferentes programas: BLAST (Altschul et al., 1990) (Altschul et al., 1997), CD-search, COGs (Cluster of Orthologous Groups), FASTA (Pearson W. R & D.J. Lipman, 1988) e (Pearson W.R., 1990), BEAUTY (Worley K.C. et al., 1995)), (conforme acima). Essas comparações permitiram formular hipóteses sobre a função dos produtos desses genes e de identificar aqueles capazes de serem implicados na biossíntese de espiramicinas. A tabela 12 mostra as proteínas que apresentam uma forte similitude com os 34 genes situados a montante dos 5 genes PKS. _______________TABELA 12___________ * maior similitude de seqüência é associada a um açúcar BLAST mais elevado (Altschul et al., 1990).

Experiências de inativação de genes foram feitas para confirmar esses resultados. Os métodos aplicados consistem em fazer uma substituição de gene. O gene alvo a interromper é substituído por uma cópia desse gene interrompido por um cassette, conferindo a resistência a um antibiótico (por exemplo, a apramicina ou higromicina). Os cassettes utilizados são contornados de ambos os lados por códons de terminação da tradução em todas as fases de leitura e por terminadores de transcrição ativos em streptomyces. A inserção do cassette no gene alvo pode ser acompanhada ou não de uma deleção nesse gene alvo. O tamanho das regiões que contornam o cassette pode ir de algumas centenas a vários milhares de pares de bases. Um segundo tipo de cassettes pode ser utilizado para a inativação de genes: cassettes ditos "cassettes excisáveis"(conforme acima). As cepas assim construídas foram testadas para sua produção em espiramicinas O gene orf1 codifica uma proteína que apresenta uma relativa forte similitude com vários citocromo P450. Notadamente, a proteína codificada por orf1 possui uma similitude importante com a proteína codificada pelo gene tyll implicada na biossíntese de tilosina em streptomyces fradiae (Merson-D994; Davies, L.A. et al., 1994; Número de acesso GenBank: S49051; Escore BLAST: 530). Essa similitude com uma proteína implicada na via de biossíntese de um outro antibiótico próximo sugere fortemente que o gene orf1 codifica também um citocromo P450. Essa hipótese é confirmada pelo fato de a proteína codificada pelo gene orf1 apresentar uma forte similitude com outras proteínas de função similar em outros organismos (conforme tabela 13). TABELA 13 * maior similitude de seqüência é associada a um escore BLAST mais elevado (Altschul et al., 1990) O gene orf2 codifica uma proteína que apresenta uma relativa forte similitude com uma dTDP-6-deóxi-3,4-ceto-hexulose isomerase de Aneurinibacillus thermoaerophilus (Pfoestl, A. et al., 2003, Número de aces- so GenBank: AAO06351; Escore BLAST: 118). Essa similitude sugere fortemente que o gene orf2 codifica uma isomerase responsável pela reação de isomerização necessária à biossíntese de um dos açúcares presentes na molécula de espiramicina, esse açúcar podendo ser a micarose (conforme Figura 5). A inativação do gene orf2 foi feita. Pôde ser mostrado que a cepa resultante não produz mais espiramicinas. Isto confirma que o gene orf2 é bem implicado na biossíntese das espiramicinas. O gene orf3 codifica uma proteína que apresenta uma relativa forte similitude com várias aminotransferases. Notadamente, a proteína codificada por orf3 possui uma similitude importante com uma aminotransfera-se de Streptomyces antibioticus implicada na biossíntese da oleandomicina (Draeger, G. et al. 1999; Número de acesso GenBank: AAF59939; Escore BLAST: 431). Essa similitude com uma proteína implicada na via de biossíntese de um outro antibiótico próximo sugere fortemente que o gene orf3 codifica uma 3 amino-transferase responsável pela reação de transaminação necessária à biossíntese de um dos açúcares aminados das espiramicinas (conforme Figura 5). Essa hipótese é confirmada pelo fato de a proteína codificada pelo gene orf3 apresentar uma forte similitude com outras proteínas de função similitude em outros organismos (conforme tabela 15). _________________________________TABELA 15 ________________________ * Maior similitude de sequência é associada a um escore BLAST mais elevado (Altschul et al., 1990) A inativação do gene orf3 foi realizada. Foi possível assim mostrar que a cepa resultante não produz mais espiramicinas. Isto confirma que o gene orf3 é bem implicado na biossíntese das espiramicinas. isto confirma que o gene orf3 é bem implicado na biossíntese das espiramicinas. A enzima codificada por esse gene é, portanto, bem responsável por uma etapa de bioconversão essencial à biossíntese das espiramicinas. A produção de espiramicinas pode ser complementada pela expressão da proteína TylB de S. fradiae (cf exemplo 23). Isto demonstra que o gene orf3 codifica uma 3 ami-no-transferase responsável pela reação de transaminação necessária à biossíntese da micaminose (conforme Figura 5). Como a micaminose é o primeiro açúcar a ser fixado sobre o platenolídeo, é esperado que a cepa interrompida em orf3 (OS49.67) acumule o platenolídeo.

Os intermediários de biossíntese da cepa interrompida no gene orf3 foram estudados (conforme exemplo 20). Essas experiências permitiram demonstrar que essa cepa produz duas formas de platenolídeo: o platenolídeo A e o platenolídeo B, a estrutura deduzida dessas duas moléculas foi apresentada na Figura 36. Essa cepa produz também o platenolídeo A + micarose e o platenolídeo B + micarose (conforme exemplo 20 e Figura 40). Esses compostos comportam um açúcar, mas não comportam micaminose. Além disso, caso sejam comparados a espiramicinas (conforme Figura 1), esses compostos comportam micarose no lugar da micaminose. Esses resultados estão em acordo com a implicação do produto do gene orf3 na biossíntese da micaminose e seu papel como 3 amino-transferase da reação de transaminação necessária à biossíntese da micaminose (conforme Figura 5). Pode-se observar que a especificidade de glicosilação não parece absoluta, já que se acham moléculas com a micarose fixada na posição normalmente ocupada pela micaminose (conforme Figura 40). O gene orf4 codifica uma proteína que apresenta uma relativa forte similitude com várias NDP-glicose sintetases. Notadamente, a proteína codificada por orf4 possui uma similitude importante com uma alfa-D-glicose-1-fosfato timidililtransferase de streptomyces venezuelae (Xue Y et al., 1998; Número de acesso GenBank: AAC68682; Escore BLAST 404). Essa similitude com uma proteína implicada na via de biossíntese de um outro antibiótico próximo sugere fortemente que o gene orf4 codifica uma NDP-glicose sintetase responsável pela síntese do NDP-glicose necessária à biossíntese dos três açúcares atípicos incorporados na molécula de espiramicina (conforme Figuras 4, 5 e 6). Essa hipótese é confirmada pelo fato de a proteína codificada pelo gene orf4 apresentar uma forte similitude com outras proteínas de função similitude em outros organismos (conforme tabela 16). ________________________________TABELA 16____________________________________ * maior similitude de seqüência é associada a um escore BLAST mais elevado (Altschul et al., 1990). O gene orf5 codifica uma proteína que apresenta uma relativa forte similitude com glicose desidratases. Notadamente, a proteína codificada por orf5 possui uma similitude importante com uma dTDP-glicose 4,6-desidratase de streptomyces tenebrarius (Li.T.B. et al., 2001; Número de acesso GenBank: AAG18457, Escore BLAST: 476). Essa similitude com uma proteína implicada na via de biossíntese de um outro antibiótico próximo sugere fortemente que o gene orf5 codifique uma NDP glicose desidrata-se necessária à biossíntese dos três açúcares atípicos incorporados na molécula de espiramicinas (conforme Figura 4, 5 r 6). Essa hipótese é confirmada pelo fato de a proteína codificada pelo gene orf5 apresentar uma forte similitude com outras proteínas de função similar em outros organismos (conforme tabela 17) TABELA 17 * maior similitude de seqüência é associada a um escore BLAST mais elevado (Altschul et al., 1990). O gene orf6 codifica uma proteína que apresenta uma relativa forte similitude com várias tioesterases. Notadamente, a proteína codificada por orf6 possui uma similitude importante com uma tioesterase de streptomyces avermitilis (Omura, S. et al., 2001; Número de acesso GenBank: BAB69315; Escore BLAST: 234). Essa similitude com uma proteína implicada na via de biossíntese de um outro antibiótico próximo sugere fortemente que o gene orf6 codifique também uma tioesterase. Essa hipótese é confirmada pelo fato de a proteína codificada pelo gene orf6 apresentar uma forte similitude com outras proteínas de função similitude em outros organismos (conforme tabela 18). _______________________________TABELA 18 ___________________________ * maior similitude de seqüência é associada a um escore BLAST mais elevado (Altschul et al., 1990). O gene orf7 codifica uma proteína que apresenta uma relativa forte similitude com várias hexoses desidratases. Notadamente, a proteína codificada por orf7 possui uma similitude importante com uma dNTP hexose 2,3-desidratase (codificada pelo gene TylCVI) de streptomyces fradiae implicada na biossíntese da tilosina (Merson-Davies, L.A. et al., 1994; Número de acesso GenBank: AAF29379; Escore BLAST: 461). Essa similitude com uma proteína implicada na via de biossíntese de um outro antibiótico próximo sugere fortemente que o gene orf7 codifique também uma hexose 2-3 desi-dratase necessária à biossíntese de dois açúcares atípicos incorporados na molécula de espiramicinas (conforme Figura 4 e 6). Essa hipótese é confirmada pelo fato de a proteína codificada pelo gene orf7 apresentar uma forte similitude com outras proteínas de função similar em outros organismos (conforme tabela 19). _______________________________TABELA 19 __________________________ * maior similitude de seqüência é associada a um escore BLAST mais elevado (Altschul et al., 1990). O gene orf8 codifica uma proteína que apresenta uma relativa forte similitude com várias aminotransferases. Notadamente, a proteína codificada por orf8 possui uma similitude importante com uma aminotransfera-se provavelmente implicada na biossíntese da forosamina em Saccharopo-lyspora spinosa (Waldron, C. et al., 2001; Número de acesso GenBank: AAG23279; escore BLAST: 465). Essa similitude com uma proteína implicada na via de biossíntese de um outro antibiótico próximo, sugere fortemente que o gene orf8 codifique uma 4 amino-transferase responsável pela reação de transaminação necessária à biossíntese da forosamina (conforme Figura 6). Essa hipótese é confirmada pelo fato de a proteína codificada pelo gene orf8 apresentar uma forte similitude com outras proteínas de função similar em outros organismos (conforme tabela 20). _______________________________TABELA 20 ___________________ * maior similitude de seqüência é associada a um escore BLAST mais elevado (Altschul et al., 1990). A inativação do gene orf8 foi realizada. Pôde assim ser mostrado que a cepa resultante não produz mais espiramicinas. Isto confirma que o gene orf8 é bem implicado na biossíntese das espiramicinas. A enzima codificada é, portanto, bem responsável por uma etapa de biossíntese essencial à biossíntese das espiramicinas. A validação da hipótese do papel exercido pelo produto do gene orf8 na biossíntese da forosamina é fornecida pelo fato de um mutante inativado pelo gene orf8 produto da forocidina, esse mutante sendo, portanto, bloqueado no estágio da forocidina e não produz neo-espiramicina (conforme Figura 7 e Exemplo 25). Esses resultados estão em acordo com uma implicação do produto do gene orf8 na biossíntese de forosamina (conforme Figura 6). O gene orf9c foi identificado nas streptomyces ambofaciens e foi designado srmX por Geistlich et al. (Geistlich, M. et al., 1992). A similitude da proteína codificada por esse gene com vários metiltransferases implicadas na via de biossíntese de outros antibióticos próximos sugere fortemente que o gene or9c codifica uma metiltransferase responsável pela reação de meti-lação necessária à biossíntese da micaminose ou da forosamina (conforme Figuras 5 e 6). Essa hipótese é confirmada pelo fato de a proteína codificada pelo gene orf9c apresentar uma forte similitude com outras proteínas de função similitude em outros organismos (conforme tabela 21). _________________________________TABELA 21____________________________________ * maior similitude de seqüência é associada a um escore BLAST mais elevado (Altschul et al., 1990) O gene orf10 foi identificado nas streptomyces ambofaciens e foi designado srmR por Geistlich et al. (Geistlich, M. et al., 1992). A proteína codificada por esse gene é implicada na regulagem da via de biossíntese das espiramicinas nas streptomyces ambofaciens. A inativação do gene orflO foi realizada. Foi possível assim mostrar que a cepa resultante não produz mais espiramicinas. Isto confirma que o gene orflO é bem implicado na biossíntese das espiramicinas. A proteína codificada por esse gene é, portanto, bem essencial à biossíntese das espiramicinas.

Por outro lado, o ponto de acionamento da tradução de orf10 foi determinado e pôde ser mostrado que a superexpressão desse gene acarreta uma melhoria da produção em espiramicinas. O sítio de acionamento da tradução corresponde a um ATG situado a montante do ATG proposto por Geistlich et al. (Geistlich, M. et al., 1992). Foi além disso demonstrado que essa extremidade 5’é essencial à função de OrflO, já que um mensageiro truncado em 5’ é inativo (conforme exemplo 17). Para se obter o efeito buscado sobre a produção em espiramicinas, é, portanto, essencial que a superexpressão de orflO seja realizada tomando-se o cuidado de não expressar um mensageiro truncado em 5’ de orflO. O gene orf11c foi identificado nas streptomyces ambofaciens e foi designado srmB por Geistlich et al. (Geistlich, M. et al., 1992) e Schoner et al. (Schoner B et al., 1992). A proteína codificada por esse gene é implicada na resistência a espiramicina nas streptomyces ambofaciens e é um transportador de tipo ABC. O gene orf12 codifica uma proteína que apresenta uma relativa forte similitude com várias hexoses desidratases. Notadamente, a proteína codificada pororf12 possui uma similitude importante com uma NDP-hexose 3,4-desidratase codificada pelo gene UrdQ de streptomyces fradiae e implicada na biossíntese da urdamicina (Hoffmeister.D. et al., 2000; Número de acesso GenBank: AAF72550; Escore BLAST: 634). Essa similitude com uma proteína implicada na via de biossíntese de um outro antibiótico próximo sugere fortemente que o gene orf12 codifica uma 3,4 desidratase responsável pela reação de desidratação necessária à biossíntese da forosamina (conforme Figura 6).Essa hipótese é confirmada pelo fato de a proteína codificada pelo gene orf12 apresentar uma forte similitude com outras proteínas de função similar em outros organismos (conforme tabela 22). TABELA 22 * maior similitude de sequência é associada a um escore BLAST mais elevado (Altschul et al., 1990) A inativação do gene orf12 foi feita. Pôde ser mostrado que a cepa resultante não produz mais espiramicinas. Isto confirma que o gene orf12 é bem implicado na biossíntese da espiramicina. A enzima codificada por esse gene é, portanto, bem responsável por uma etapa de bioconversão essencial à biossíntese da espiramicina. A validação da hipótese do papel exercido por Orf12 na biossíntese da forosamina é fornecida pelo fato de um mutante inativado para o gene orf12 não produzir mais forosamina. Ele produz, todavia, uma pequena quantidade de forocidina. Esse mutante é, portanto, bloqueado no estágio da forocidina e não produz neo-espiramicina (conforme Figura 7 e exemplo 26). Esse mutante produz, além disso, um composto de estrutura apresentada na Figura 38. Este último composto comporta dois açúcares, a micaminose e a micarose, mas não comporta fo- rosamina. Além disso, caso se compare à estrutura da espiramicina (conforme Figura 1), esse composto comporta o açúcar micarose no lugar esperado da forosamina. Esses resultados estão em acordo com a implicação do produto do gene orf12 na biossíntese da forosamina (conforme Figura 6). Pode-se observar que a especificidade de glicosilação não é absoluta, já que se observam moléculas nas quais a micarose é fixada na posição normalmente ocupada pela forosamina (ver a Figura 38). O gene orf13c codifica uma proteína que apresenta uma relativa forte similitude com uma proteína de função desconhecida nas streptomyces coelicolor. Essa proteína foi chamada SC4H2.17 (número de acesso Gene-Bank: T35116; Escore BLAST: 619). A proteína codificada pelo gene orf13c apresenta também uma forte similitude com outras proteínas de outros organismos (conforme tabela 23) _______________________________TABELA 23____________________________ * maior grande similitude de seqüência é associada a um Escore BLAST mais elevado (Altschul et al., 1990).

Nenhuma função precisa foi assinada nas proteínas próxima daquela codificada por orf13c. A inativação do gene orf13c foi realizada com a finalidade de estudar a função desse gene na via de biossíntese das espira- micinas nas streptomyces ambofaciens. Pôde ser mostrado que a cepa resultante produz espiramicinas. Isto indica que o gene orf13c não é essencial à biossíntese das espiramicinas e que não é essencial à sobrevida da bactéria. A enzima codificada por esse gene não é, portanto, responsável por uma etapa de bioconversão essencial à biossíntese das espiramicinas. O gene orf14 codifica uma proteína que apresenta uma relativa forte similitude com uma redutase putativa (Redenbach, M. et al., 1996; Ben-tley et al., 2002; número de acesso GenBank: CAB90862; Escore BLAST: 147). A inativação do gene orf14 foi feita. Pôde assim ser mostrado que a cepa resultante não produz mais espiramicinas. Isto confirma que o gene orf14 é bem implicado na biossíntese das espiramicinas. A enzima codificada por esse gene é, portanto, bem responsável por uma etapa de bioconversão essencial à biossíntese das espiramicinas. Os intermediários de biossíntese da cepa interrompida no gene orf14 foram estudados (conforme exemplo 20). Essas experiências permitiram demonstrar que essa cepa produz platenolídeo A, mas não produz platenolídeo B (conforme Figura 36). O gene orf15c codifica uma proteína que apresenta uma relativa forte similitude com várias ceto-redutases. Notadamente, a proteína codificada por orf15c possui uma similitude importante com uma 3-ceto-redutase nas streptomyces antibioticus (Número de acesso GenBak: T51102, Escore BLAST: 285). Essa similitude sugere fortemente que o gene orf15c codifica uma 3 ceto-redutase responsável pela reação de redução necessária à biossíntese da forosamina (conforme Figura 6).Essa hipótese é confirmada pelo fato de a proteína codificada pelo gene orf15c apresentar uma forte similitude com outras proteínas de função similitude em outros organismos (conforme tabela 24). ______________________________TABELA 24______________________________ * maior similitude de seqüência é associada a um Escore BLAST mais elevado (Altschul et al., 1990). O gene orf16 codifica uma proteína que apresenta uma relativa forte similitude com várias isomerases. Notadamente, a proteína codificada por orf16 possui uma similitude importante com uma NDP hexose 3,4 isome-rase nas streptomyces fradiae (Gandecha et al., 1997; Número de acesso GenBak: CAA57471, Escore Blast: 209). Essa similitude sugere fortemente que o gene orf16 codifique uma proteína implicada na biossíntese de um dos açúcares da espiramicina (conforme Figuras 5 e 6). Essa hipótese é confirmada pelo fato de a proteína codificada pelo gene orf16 apresentar uma forte similitude com outras proteínas de função similar em outros organismos (conforme tabela 25). TABELA 25 * maior similitude de seqüência é associada a um Escore BLAST mais elevado (Altschul et al., 1990) O gene orf17 codifica uma proteína que apresenta uma relativa forte similitude com várias glicosil transferases. Notadamente, a proteína codificada por orf17 possui uma similitude importante com uma glicosil transferase de streptomyces venezuelae (Xue,Y. et al., 1998; Número de acesso GenBank: AAC68677; Escore BLAST: 400). A similitude da proteína codificada pelo gene orf17 com várias glicosil transferases implicadas na via de biossíntese de outros antibióticos próximos sugere fortemente que esse gene codifique também uma glicosil transferase. Essa hipótese é confirmada pelo fato de a proteína codificada pelo gene orf17 apresentar uma forte similitude com outras proteínas de função similitude em outros organismos (conforme tabela 26). TABELA 26 * maior similitude de seqüência é associada a um Escore BLAST mais elevado (Altschul et al., 1990) O gene orf18 codifica uma proteína que apresenta uma relativa forte similitude com várias glicosil transferases. Notadamente, a proteína codificada por orf18 possui uma similitude importante com uma glicosil transferase de streptomyces rishiriensis (Wang et al., 2000; Número de acesso GenBank: AAG29785; Escore BLAST: 185). A similitude da proteína codificada pelo gene orf18 com várias glicosil transferases implicadas na via de biossíntese de outros antibióticos próximos sugere fortemente que esse gene codifique também uma glicosil transferase. Essa hipótese é confirmada pelo fato de a proteína codificada pelo gene orf18 apresenta uma forte similitude com outras proteínas de função similar em outros organismos (conforme tabela 27). _______________________________TABELA 27_________________________________ * maior similitude de sequência é associada a um Escore BLAST mais elevado (Altschul etal., 1990). O gene orf19 codifica uma proteína que apresenta uma relativa forte similitude com várias ceto-redutases. Notadamente, a proteína codificada por orf19 possui uma similitude importante com um NDP-hexose 4-ceto-redutase (TylCIV) de streptomyces fradiae (Bate et aí., 2000; Número de acesso GenBank: AAD41822; Escore BLAST: 266). A similitude da proteína codificada pelo gene orf19 com essa ceto-redutase implicada na via de biossíntese de um antibiótico próximo sugere fortemente que esse gene codifique também uma 4-ceto-redutase responsável pela reação de redução necessária à biossíntese da micarose (conforme Figura 4). Essa hipótese é confirmada pelo fato de a proteína codificada pelo gene orf19 apresenta uma forte similitude com outras proteínas de função similar em outros organismos (conforme tabela 28). TABELA 28 * maior similitude de seqüência é associada a um Escore BLAST mais elevado (Altschul et a!., 1990). O gene orf20 codifica uma proteína que apresenta uma relativa forte similitude com várias hexose redutases. Notadamente, a proteína codificada por orf20 possui uma similitude importante como gene EryBII da Sac-charopolyspora erythraea que codifica uma dTDP-4-ceto-L-6-deóxi-hexose 2,3-redutase (Summers, R.G., et al. , 1997), Número de acesso GenBank: AAB84068; Escore BLAST: 491). A similitude da proteína codificada pelo gene orf20 com várias hexose redutases implicadas na via de biossíntese de outros antibióticos próximos sugere fortemente que esse gene codifica uma 2-3 redutase responsável pela reação de redução necessária à biossíntese da micarose (conforme Figura 4). Essa hipótese é confirmada pelo fato de a proteína codificada pelo gene orf20 apresentar uma forte similitude com outras proteínas de função similar em outros organismos (conforme tabela 29). _______________________________TABELA 29_______________________ * maior similitude de seqüência é associada a um Escore BLAST mais elevado (Altschul et al., 1990). O gene orf21c codifica uma proteína que apresenta uma relativa forte similitude com várias hexose metiltransferases. Notadamente, a proteína codificada por orf21c possui uma similitude importante como gene TylCIII de streptomyces fradiae que codifica uma NDP-hexose 3-C-metiltransferase (Bate,N et al., 2000; Número de acesso GenBank: AAD41823; Escore BLAST: 669). A similitude da proteína codificada pelo gene orf21c com várias hexose metiltransferases implicadas na via de biossíntese de outros antibióticos próximos sugere fortemente que esse gene codifique uma hexose metiltransferase responsável pela reação de metilação necessária à biossíntese da micarose (conforme Figura 4). Essa hipótese é confirmada pelo fato de a proteína codificada pelo gene orf21c apresentar uma forte similitude com outras proteínas de função similar em outros organismos (conforme tabela 30). TABELA 30 * maior similitude de sequência é associada a um Escore BLAST mais elevado (Altschul et al., 1990). O gene orf22c codifica uma proteína que apresenta uma relativa forte similitude com a proteína codificada pelo gene fkbH de streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus que codifica uma enzima implicada na biossíntese da metoximalonila (Wu,K. et al., 2000; Número de acesso GenBank: AAF86387; Escore BLAST: 463). A similitude da proteína codificada pelo gene orf22c com essa proteína implicada na via de biossíntese de um outro macrolídeo próximo sugere fortemente que esse gene codifique também uma enzima implicada na biossíntese da metoximalonila nas streptomyces ambofaciens (conforme Figura 8). O gene orf23c codifica uma proteína que apresenta uma relativa forte similitude com a proteína codificada pelo gene fkbl de streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus que codifica um acil CoA desidrogenase implicada na biossíntese da metoximalonila (Wu,K. et al., 2000; Número de acesso GenBank: AAF86388; Escore BLAST: 387). A similitude da proteína codificada pelo gene orf23c com várias acil CoA desidrogenases implicadas na via de biossíntese de outros antibióticos próximos sugere fortemente que esse gene codifique uma acil CoA desidrogenase implicada na biossíntese da metoximalonila (conforme Figura 8). Essa hipótese é confirmada pelo fato de a proteína codificada pelo gene orf23c apresentar uma forte similitude com outras proteínas de função similar em outros organismos (conforme tabela 31). _______________________________TABELA 31_________________________________ * maior similitude de seqüência é associada a um Escore BLAST mais elevado (Altschul et ai., 1990) O gene orf24c codifica uma proteína que apresenta uma relativa forte similitude com a proteína codificada pelo gene fkbJ de streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus que codifica a proteína de ligação do grupos acila (Acil Carrier Protein (ACP)) implicada na biossíntese da metoxi-malonila (Wu,K. et al., 2000; Número de acesso GenBank: AAF86389; Escore BLAST: 87). Similitude da proteína codificada pelo gene orf24c com essa proteína implicada na via de biossíntese de um outro macrolídeo próximo sugere fortemente que esse gene codifique uma proteína implicada na biossíntese da metoximalonila nas streptomyces ambofaciens (conforme Figura 8). O gene orf25c codifica uma proteína que apresenta uma relativa forte similitude com a proteína codificada pelo gene fkbK de streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus que codifica uma acil CoA desidrogenase implicada na biossíntese da metoximalonila (Wu,K. et al., 2000; Número de acesso GenBank: AAF86390; Escore BLAST: 268). A similitude da proteína codificada pelo gene orf25c com vários acil CoA desidrogenases implicadas na via de biossíntese de outros antibióticos próximos sugere fortemente que esse gene codifica uma acil CoA desidrogenase implicada na biossíntese da metoximalonila (conforme Figura 8). Essa hipótese é confirmada pelo fato de a proteína codificada pelo gene orf25c apresenta uma forte similitude com outras proteínas de função similar em outros organismos (conforme tabela 32). TABELA 32 * maior similitude de seqüência é associada a um Escore BLAST mais elevado (Altschul et al., 1990) O gene orf26 codifica uma proteína que apresenta uma identidade de 65% (determinada graças ao programa BLAST) com a proteína codificada pelo gene tylCV que codifica uma micarosil transferase implicada na biossíntese de tilosina nas streptomyces fradiae (Bate, N. et al., 2000; Número de acesso GenBank: AAD41824, Escore BLAST: 471). Mais particularmente, TylCV é uma glicosil-transferase que liga a molécula de micarose, quando da síntese da tilosina. Essa similitude com uma proteína na via de biossíntese de um outro antibiótico relativamente próximo e mais particularmente na transferência da micarose, sugere que o gene orf26 codifica uma glicosil transferase. Essa hipótese é confirmada pelo fato de a proteína codificada pelo gene orf26 apresentar uma forte similitude com outras proteínas de função similar em outros organismos (conforme tabela 33). ________________________________TABELA 33_________________________________ * maior similitude de sequência é associada a um Escore BLAST mais elevado (Altschul et al., 1990). O gene orf27 codifica uma proteína que apresenta uma identidade de 70% (determinada graças ao programa BLAST) com a proteína codificada pelo gene tylCVII que codifica uma NDP-hexose 3,5- (ou 5-)epimerase implicada na biossíntese de tilosina nas streptomyces fradiae (Bate.N. et al., 2000; Número de acesso GenBank: AAD41825, Escore BLAST: 243). Mais particularmente, TylCVII é uma hexose 3,5- (ou 5-) epimerase implicada na biossíntese da micarose. Essa similitude com uma proteína implicada na via de biossíntese da micarose, sugere que o gene orf27 codifica uma epimerase. Essa hipótese é confirmada pelo fato de a proteína codificada pelo gene orf27 apresentar uma forte similitude com outras proteínas de função similar em outros organismos (conforme tabela 34). Uma análise das seqüências próximas obtidas graças ao programa BLAST sugere fortemente que o gene orf27 codifique uma 5 epimerase responsável da reação de epimerização necessária à biossíntese da micarose (conforme Figura 4). TABELA 34 * maior similitude de sequência é associada a um Escore BLAST mais elevado (Altschul et al., 1990). A seqüência de orf28c foi em uma primeira etapa determinada de maneira parcial, já que a seqüência de uma região de aproximadamente 450 pares de bases só foi determinada após nova seqüenciação (essa região é simbolizada por "N" na seqüência incompleta SEQ ÍD N° 106). A seqüência parcial dessa ORF (SEQ ID N° 111) foi todavia utilizada para a análise com os diferentes programas informáticos conforme explicado acima. Assim, pôde ser determinado que o gene orf28c codifique uma proteína que apresenta uma identidade de 64% sobre a seqüência determinada (SEQ ID N° 112, que é a seqüência parcial da proteína Orf28c) (determinada graças ao programa BLAST) com a proteína codificada pelo gene acyB2 que codifica uma proteína reguladora implicada na biossíntese de carbomicina nas streptomyces thermotolerans (Arisawa,A., et al. 1993; Número de acesso GenBank: JC2032, Escore BLAST: 329). Essa similitude com uma proteína implicada na via de biossíntese de um antibiótico relativamente próximo sugere que o gene orf28c codifique uma proteína reguladora implicada próxima sugere que o gene orf28c codifique uma proteína reguladora implicada na biossíntese das espiramicinas. Essa hipótese é confirmada pelo fato de a proteína codificada pelo gene orf28c apresentar também uma forte similitude com a proteína TylR que é uma proteína reguladora implicada na biossíntese de tilosina nas streptomyces fradiae (Bate.N. et al., 1999); Número de aces- so GenBank: AAF29380, Escore BLAST; 167). O gene orf28c pôde ser amplificado graças a oligonucleotídeos situados de ambos os lados da seqüência não determinada e subclonado em um vetor de expressão. Pôde assim ser demonstrado que a superex-pressão do gene orf28c aumenta significativamente a produção em espira-micinas da cepa OSC2 (conforme exemplo 24). Isto demonstra que a super-expressão de orf 28c leva a um aumento da produção em espiramicinas e confirma seu papel como regulador da via de biossíntese das espiramicinas. A seqüência parcial de orf28c foi completada na seqüência e a região que falta de aproximadamente 450 pares de bases foi determinada (conforme SEQ ID N° 140 e SEQ ID N° 141). A seqüência completa dessa ORF (SEQ ID N° 141) foi utilizada para a análise com os diferentes programas informáticos conforme explicado acima. Pôde assim ser determinado que o gene orf28c codifique uma proteína que apresenta uma identidade de 69% na seqüência determinada (SEQ ID N° 142, que é a seqüência completa da proteína Orf28c) (determinada graças ao programa BLAST) com a proteína codificada pelo gene acyB2 que codifica uma proteína reguladora implicada na biossíntese de carbomicina nas streptomyces thermotolerans (Arsawa, A., et al., 1993; Número de acesso GenBank: JC2032, Escore BLAST: 451). Essa similitude com uma proteína implicada na regulagem da biossíntese de um antibiótico relativamente próxima sugere que o gene orf28c codifique uma proteína reguladora implicada na biossíntese das espiramicinas. Essa hipótese é confirmada pelo fato de a proteína codificada pelo gene orf28c apresenta também uma forte similitude com a proteína TylR que é uma proteína reguladora implicada na regulagem da biossíntese de tilosina nas streptomyces fradiae (Bate.N. et al., 1999; Número de acesso GenBank: AAF29380, Escore BLAST: 224). Os resultados da superexpres-são desse gene (conforme exemplo 24) confirmam seu papel como regulador da via de biossíntese das espiramicinas. A inativação do gene orf28c foi feita. Pôde assim ser mostrado que a cepa resultante não produz mais espiramicinas. Isto confirma que o gene orf28c está bem implicado na biossíntese das espiramicinas e é es- sencial à biossíntese das espiramicinas. Esses resultados associados aos resultados da superexpressão desse gene (Conforme exemplo 24) estão em acordo com um papel de ativador essencial à biossíntese das espiramicinas de Orf28c. O gene orf29 codifica uma proteína que apresenta uma identidade de 31% (determinada graças ao programa BLAST) com uma provável glicosil hidrolase localizada no grupo de genes implicado na biossíntese de sorafen A (um antifúngico da classe dos poliquetídeos) no Sorangium cellu-losum (Ligon, J. et al., 2002; Número de acesso GenBank: AAK19890, Escore BLAST: 139). Essa similitude com uma proteína implicada na via de biossíntese de uma molécula relativamente próxima sugere que o gene orf29 codifique uma proteína que tem uma atividade glicosil hidrolase. Essa hipótese é confirmada pelo fato de a proteína codificada pelo gene orf29 apresentar uma forte similitude com outras proteínas de função similar em outros organismos (conforme tabela 35). Uma análise da seqüência da proteína codificada por orf29, graças ao programa CD-search (conforme acima) sugere também que o gene orf29 codifique uma glicosil hidrolase. TABELA 35 * maior similitude de seqüência é associada a um escore BLAST mais elevado (Altschul et al., 1990). A análise da seqüência protéica deduzida do orf29 pelo programa SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SianalP/) (Nielsen.H. et al., 1997) mostra que essa proteína possui uma seqüência sinal C-terminal com um sítio de corte predito entre as posições 30 e 31 (QSA/QA). Pode-se predizer que essa proteína é extracelular. Ela poderia, enquanto glicosil- hidrolase, ter um papel na reativação da espiramicina inativada por glicosila-ção pelas glicosil-transferases GimA e/ou GimB (Gourmelen et al., 1998). O gene orf30c codifica uma proteína que apresenta uma identidade de 31% (determinada graças ao programa BLAST) com uma epimera-se de açúcar-nucleosídeo-difosfato de Corynebacterium glutamicum (Número de acesso GenBank: NP-600590, Escore BLAST: 89). Essa similitude sugere que o gene orf30c codifica uma epimerase. Essa hipótese é confirmada pelo fato de uma análise da seqüência graças ao programa CD-search (conforme acima) sugere também que o gene orf30c codifique uma epimerase. O orf30c apresenta dois códons de iniciações possíveis (conforme SEQ ID N° 115) que dão duas proteínas possíveis de 345 e 282 aminoá-cidos respectivamente (SEQ ID N° 116 e 117). Todavia, o uso de códons é típico de streptomyces somente a partir do segundo ATG, além disso, a seqüência protéica deduzida da seqüência entre o primeiro ATG e o segundo não se alinha com as seqüências próximas identificadas, enquanto que a seqüência protéica a mais curta (a partir do segundo ATG: SEQ ID N° 144) se alinha bem com o começo dessas proteínas. Pode-se, portanto, deduzir daí que o segundo ATG seja o bom códon de iniciação e que a seqüência desse orf seja, portanto, aquele apresentado em SEQ ID N° 143 que uma vez traduzido corresponde à proteína de seqüência SEQ ID N° 144. O gene orf31 codifica uma proteína que apresenta uma identidade de 52% (determinada graças ao programa BLAST) com uma óxido-redutase nas streptomyces coelicolor (Número de acesso GenBank: NP_631148, Escore BLAST: 261). Essa similitude sugere que o gene orf31 codifique uma redutase. Essa hipótese é confirmada pelo fato de uma análise da seqüência, graças ao programa CD-search (conforme acima) sugerir também que o gene orf31 codifique uma redutase. Essa hipótese é também confirmada pelo fato de a proteína codificada pelo gene orf31 apresentar uma forte similitude com outras proteínas de função similar em outros organismos (conforme tabela 36). TABELA 36 * maior similitude de seqüência é associada a um Escore BLAST mais elevado (Altschul et al., 1990). A inativação do gene orf3 foi realizada. Pôde assim ser mostrado que a cepa resultante não produz espiramicinas. Isto confirma que o gene orf31 é bem implicado na biossíntese das espiramicinas. A enzima codificada por esse gene é, portanto, responsável de uma etapa de bioconversão essencial à biossíntese das espiramicinas. A seqüência de orf32c foi inicialmente determinada de maneira parcial (cf exemplo 19), já que a seqüência codificante em 5’ foi determinada apenas em uma segunda etapa. A seqüência parcial dessa orf (SEQ ID N° 120) foi todavia utilizada para análise com os diferentes programas informáticos conforme explicado acima. Pôde assim ser determinado que o gene orf32c codifica uma proteína que apresenta uma identidade de 47% sobre a seqüência determinada (SEQ ID N° 121, que é a seqüência parcial da proteína Orf32c) (determinada graças ao programa BLAST) com uma proteína reguladora da família GntR nas streptomyces coelicolor (Número de acesso GenBank: NP_625576, Escore BLAST: 229). Essa similitude sugere que o gene orf32c codifique um regulador transcripcional da família GntR. Essa hipótese é confirmada pelo fato de a proteína codificada pelo gene orf32c apresentar uma forte similitude com outras proteínas de função similar em outros organismos. A seqüência parcial de orf32c foi completada pela seqüência e a região que falta foi determinada (conforme SEQ ID N° 140 e SEQ ID N° 145). A seqüência completa dessa orf codifica uma proteína que apresenta uma identidade de 44% (determinada graças ao programa BLAST) com uma proteína reguladora da família GntR nas streptomyces avermitilis (Número de acesso GenBank: NP_824604, Escore BLAST: 282). Essa similitude sugere que o gene orf32c codifica um regulador transcripcional da família GntR. Essa hipótese é confirmada pelo fato de a proteína codificada pelo gene orf32c apresentar uma forte similitude com outras proteínas de função similar em outros organismos (conforme tabela 37). TABELA 37 * maior similitude de seqüência está associada a um Escore BLAST mais elevado (Altschul et al., 1990). A inativação do gene orf32c foi feita com a finalidade de estudar a função desse gene na via de biossíntese das espiramicinas em streptomyces ambofaciens. Pôde ser mostrado que a cepa resultante produz espiramicinas. Isto indica que o gene orf32c não é essencial à biossíntese das espiramicinas e que não é essencial à sobrevida da bactéria. O gene orf33 codifica uma proteína que apresenta uma identidade de 49% (determinada graças ao programa BLAST) com uma proteína hipotética de Xanthomonas campestris (Número de acesso GenBank: NP_635564, Escore BLAST: 54). A seqüência de orf34c é parcial. Com efeito, as comparações feitas entre o produto dessa orf e os bancos de dados sugerem que a parte C-terminal dessa proteína não está no produto deduzido da seqüência nu-cleotídica e, portanto, que essa orf seria mais longa e continuaria fora da região seqüenciada. A seqüência parcial dessa ORF foi, todavia, utilizada para a análise com os diferentes programas informáticos conforme explicado acima. Pôde ser determinado que o gene orf34c codifica uma proteína que apresenta uma identidade de 91% sobre a seqüência determinada (SEQ ID N° 150, que é a seqüência parcial da proteína Orf34c) (determinada graças ao programa BLAST) com uma arabinofuranosidase em streptomyces coeli-color (Bentley et al., 2002; Número de acesso GenBank: NP_630049, Escore BLAST: 654). Em S. coelicolor o gene que codifica essa arabinofuranosidase não parece implicado na biossíntese de matabólito secundário. Em S. am-bofaciens, esse gene não é, portanto, provavelmente implicado na biossíntese de espiramicina. A presente invenção tem também por objeto dos polinucleotí-deos que se hibridam em condições de hibridização de forte estringência a pelo menos um dos polinucleotídeos de seqüência SEQ ID N° 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 e 149 ou uma de suas variantes ou uma das seqüências derivadas desta, em virtude da degenerescência do código genético. Preferencialmente, esses polinucleotídeos são isolados a partir de uma bactéria do gênero streptomyces, mais preferencialmente, esses polinucleotídeos codificam proteínas implicadas na biossíntese de um macrolídeo e ainda mais preferencialmente esses polinucleotídeos codificam uma proteína que tem uma atividade similar à proteína codificada pelos polinucleotídeos com os quais eles se hibridam. As condições de hibridização de forte estringência podem ser definidas como condições de hibridização, desfavorecendo a hibridização de filamentos de ácidos nucléicos não homólogos. Condições de hibridizações de forte estringência podem ser, por exemplo, descritas como condições de hibridização no tampão descrito por Church & Gilbert (Church & Gilbert, 1984) a uma temperatura compreendida entre 55°C e 65°C, de maneira preferida a temperatura de hibridização é de 55°C, de maneira ainda mais preferida a temperatura de hibridização é de 60°C e de maneira inteiramente preferida a temperatura de hibridização é de 65°C, seguida de uma ou várias lavagens feitas em tampão 2X SSC a uma temperatura compreendida entre 55°C e 65°C, de maneira preferida essa temperatura é de 55°C, de maneira ainda mais preferida essa temperatura é de 60°C e de maneira inteiramente preferida essa temperatura é de 65°C, seguida de uma ou várias lavagens em tampão 0.5X SSC a uma temperatura compreendida entre 55°C e 65°C, de maneira preferida essa temperatura é de 55°C, de maneira ainda mais preferida essa temperatura é de 60°C e de maneira inteiramente preferida essa temperatura é de 65°C. As condições de hibridização acima descritas podem ser adaptadas em função da extensão do ácido nucléico, cuja hibridização é buscada ou do tipo de marcação escolhido, segundo técnicas conhecidas do técnico. As condições convenientes de hibridização podem, por exemplo, ser adaptadas, segundo a obra de F. Ausubel et al., 2002. A invenção refere-se também a um polinucleotídeo que tem pelo menos 70%, de forma mais preferida 80%, de forma mais preferida 85%, de forma ainda mais preferida 90%, de forma ainda mais preferida 95%, e de maneira inteiramente preferida 98% de identidade em nucleotídeos com um polinucleotídeo que compreende pelo menos 10, 12, 15, 18, 20 a 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850 ou 1900 nucleotídeos consecutivos de um polinucleotídeo escolhido no grupo constituído de seqüêneias nucleotídicas SEQ ID N° 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 2S, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74,76, 78, 80,82, 84,107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 e 149 ou de uma de suas variantes ou uma das seqüêneias derivadas destas em razão da degenerescência do código genético, ou um polinucleotídeo de seqüência complementar. Preferencialmente, esses polinucleotí-deos são isolados a partir de uma bactéria do gênero streptomyces, mais preferencialmente, esses polinucleotídeos codificam proteínas implicadas na biossíntese de um macrolídeo e ainda mais preferencialmente esses polinucleotídeos codificam proteínas que têm atividades similares às proteínas codificadas pelos polinucleotídeos com os quais eles apresentam a identidade. De forma inteiramente preferida, um polinucleotídeo, de acordo com a invenção, é escolhido no grupo constituído das seqüências nucleotídicas SEQ ID N° 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107,109, 111,113, 115, 118, 120,141, 143,145, 147 e 149 ou um polinucleotídeo de seqüência complementar. O alinhamento ótimo das seqüências para a comparação pode ser realizado de maneira informática com o auxílio de algoritmos conhecidos, por exemplo, os do pacote FASTA (Pearson W. R. & D. J. Lipman,1988) e (Pearson W. R., 1990), acessível notadamente junto ao centro de pesquisas INFOBIOGEN, Evry, França. A título de ilustração, a percentagem de identidade de seqüência poderá ser determinada com o auxílio do software LFASTA (Chao K. -M. et al., 1992) ou LALIGN (Huang X. e Miller W., 1991). Os programas LFASTA e LALIGN fazem parte do pacote FASTA. LALIGN volta aos alinhamentos sítios ótimos: esse programa é mais rigoroso, mas também mais lento do que LFASTA.

Um outro aspecto da invenção refere-se a um polipeptídeo resultante da expressão de uma seqüência de ácido nucléico, tal como definida acima. Preferencialmente, os polipeptídeos, de acordo com a invenção, apresentam pelo menos 70%, de forma mais preferida 80%, de forma mais preferida 85%, de forma ainda mais preferida 90%, de forma ainda mais preferida 95% e de maneira inteiramente preferida 98% de identidade em aminoácidos com um polipeptídeo, compreendendo pelo menos 10, 15, 20, 30 a 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 540, 560, 580, 600, 620 08 640 aminoácidos consecutivos de um polipeptídeo escolhido dentre SEQ ID N° 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 29, 31, 32,33, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 44, 46, 48, 50, 51, 52, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73,75, 77, 79, 81, 83, 85,108,110, 112, 114,116,117,119,121, 142,144, 146, 148 e 150 ou uma dessas sequências exceto ao longo dessa seqüência um ou vários aminoácidos foram substituídos, inseridos ou deletados, sem afetar as propriedades funcionais ou uma das variantes dessas seqüências. Preferencialmente, os polipeptídeos, de acordo com a invenção, são expressos no estado natural por uma bactéria do gênero streptomyces, mais preferencialmente, esses polipeptídeos são implicados na biossíntese de um macrolídeo e ainda mais preferencialmente esses polipeptídeos têm uma atividade similar àquela do polipeptídeo como qual ele divide a identidade. De forma preferida, um polipeptídeo, de acordo com a invenção, é escolhido no grupo constituído das seqüências polipeptídicas SEQ ID N° 4, 6, 8, 10, 12,14, 16,18, 20, 22, 24, 26, 27, 29, 31, 32, 33, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 44, 46, 48, 50, 51, 52, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 63, 65,67,69, 71,73, 75, 77,79,81, 83, 85, 108, 110, 112, 114, 116, 117, 119, 121, 142, 144, 146, 148 e 150 ou uma dessas seqüências exceto que ao longo dessa seqüência um ou vários aminoácidos foram substituídos, inseridos ou deletados sem afetar as propriedades funcionais ou umas variantes dessas seqüências. De forma inteiramente preferida, um polipeptídeo, de acordo com a invenção, é escolhido no grupo constituído das seqüências polipeptídicas SEQ ID N° 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 29, 31, 32, 33, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 44, 46, 48, 50, 51, 52, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61,63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 108, 110, 112, 114, 116, 117, 119, 121, 142, 144, 146, 148 e 150. O alinhamento ótimo das seqüências para a comparação pode ser realizado de maneira informática como auxílio de algoritmos conhecidos, por exemplo aqueles do pacote FASTA (Pearson W.R. & D.J. Lipman, 1988) e (Pearson W.R., 1990), acessível notadamente junto ao centro de pesquisas INFOBIOGEN, Evry, França. A título de ilustração, a percentagem de identidade de seqüência poderá ser determinada com o auxílio do software LFASTA (Chao K.M. et al„ 1992) ou LALIGN (Huang X. e Miller W., 1991), utilizando os parâmetros por defeito, tal como definido pelo centro de pes- quisas INFOBIOGEN, Evry, França. Os programas LFASTA E LALIGN fazem parte do pacote FASTA. LALIGN retorna os alinhamentos sítios ótimos: esse programa é mais rigoroso, mas também mais lento do que LFASTA.

Um outro aspecto da invenção refere-se a um DNA recombi-nante que compreende pelo menos um polinucleotídeo, tal como descrito acima. Preferencialmente, esse DNA recombinante é um vetor. Ainda mais preferencialmente, o vetor é escolhido dentre os bacteriófagos, os plasmí-deos, os fagemídeos, os vetores integrativos, os fosmídeos, os cosmídeos, os vetores navettes, os BAC (Bacterial Artificial Chromosome) ou os PAC (P1-derived Artificial Chromosome). A título ilustrativo, podem-se citar como bacteriófagos os fagos lambda e M13. Como plasmídeos, poder-se citar os plasmídeos que se replicam em E.Coli por exemplo pBR322 e seus derivados, pUC18 e seus derivados, pUC19 e seu derivados, pGB2 e seus derivados (Churchward G. et al., 1984), pACYC177 (número de acesso GenBank: X06402) e seus derivados, paCYC184 (número de acesso GenBank: X06403) e seus derivados. Pode-se também citar os plasmídeos que se replicam em streptomyces como, por exemplo, plJ101 e seus derivados, pSG5 e seus derivados, SLP1 e seus derivados, SCP2* e seus derivados (Kieser et al. 2000). Como fagenídeos, podem-se citar a título ilustrativo pBluescript II e seus derivados (comercializados notadamente pela sociedade Stratage-ne (LaJolla, Califórnia, USA)), pGEM-T e seus derivados (comercializados pela sociedade PROMEGA (Madison Wisconcin, USA)), λΖΑΡΙΙ e seu derivados (comercializados notadamente pela sociedade Stratagene (LaJolla, Califórnia, USA)). Como vetores integrativos, podem-se citar a título ilustrativo, os vetores integrativos nas streptomyces como, por exemplo, aqueles derivados de SLP1 (Kieser et al, 2000), aqueles derivados de pSAM2 (Kieser et al., 2000), os vetores que utilizam os sistemas de integração dos fagos PhiC31 (Kieser et al., 2000) (Por exemplo pSET152 (Bierman et al., 1992) ou de VWB (Van Mellaert L, et al., 1998), assim como os vetores que utilizam o sistema de integração de IS117 (Kieser et al. 2000). Como fosmídeos, podem-se citar, a título ilustrativo, o fosmídeo pFOS1 (comercializado pela sociedade New England Biolabs Inc., Beverly, Massachussets, USA) e seu de- rivados. Como cosmídeos, podem-se citar a título ilustrativo o cosmídeo Su-perCos e seus derivados (comercializados notadamente pela sociedade Stratagene (LaJolla, Califórnia, USA)), o cosmídeo pWED15 (Whahl et al., 1987) e seu derivados. Como vetores navettes, podem-se citar, a título ilustrativo, os plasmídeos navettes E.Coli/ streptomyces como, por exemplo plJ903 e seu derivados, a série dos plasmídeos pUWL, pCAO106, pWHM3, pOJ446 e seus derivados (Kieser et al., 2000), os BAC navettes E.coli / streptomyces como, por exemplo, aqueles descritos no pedido de patente WO 01/40497. Como BAC (Bacterial Artificial Chromosome) pode-se citar a título ilustrativo o BAC pBeloBACH (número de acesso GenBank: U51113). Como PAC (P1-derived Artifical Chromosome), pode-se citar a título ilustrativo o vetor pCYPAC6 (número de acesso GenBank: AF133437). De forma inteiramente preferida, um vetor, de acordo com a invenção, é escolhido dentre pOS49.í, pOS49.ll» pOSC49.12, pOS49.14, pOS49.16, pOS49.28, pOS44.l, pOS44.2, pOS44.4, pSPM5, pSPM7, pOS49.67, pOS49.88, pOS49.10ó, pOS49.120, pOS49.107» pOS49.32, pOS49.43, pOS49.44. pOS49.50, pOS49.99, pSPM17, pSPM21, p»PM502, pSPM504, pSPM507, pSPMSOS, pSPM509, pSPMl, pBXLllll, pBXL1112, pBXLtllS, pSPM520, pSPM521, pSPM522, pSPM523, pSPM524, pSPM52S, pSPM527, pSPM528, pSPM34, pSPM35, pSPM36, pSPM37, pSPM38, pSPM39, pSPM40, pSPM41, pSPM42, pSPM43, pSPM44, pSPM45, pSPM47, pSPM48, pSPMSO, pSPMSl, pSPM52, pSPM53» pSPM.55, pSPM5ó, pSPM58, pSPM72, pSPM73, pSPMSIS, pSPM519, pSPM74, pSPM75, pSPM79, pSPMS3, pSPM107, pSPM543 e pSPM106.

Um outro aspecto da invenção refere-se a um sistema de expressão que compreende um vetor de expressão apropriado e uma célula hospedeira que permite a expressão de um ou vários polipeptídeos, tais como descritos acima em um sistema biológico. Os vetores de expressão, de acordo com a invenção, compreendem uma sequência de ácido nucléico codificando um ou vários polipeptídeos, tais como descritos acima e podem ser destinados à expressão dos diferentes polipeptídeos, de acordo com a invenção em diversas células hospedeiras bem conhecidas do técnico. A título de exemplo, podem-se citar os sistemas de expressão procariota, como os sistemas de expressão na bactéria E coli, os sistemas de expressão eucariotas, como os sistemas de expressão baculovírus, que permitem uma expressão em células de insetos, os sistemas de expressão que permitem uma expressão em células de lêvedos, os sistemas de expressão que permitem uma expressão em células de mamíferos, notadamente células humanas. Os vetores de expressão utilizáveis nesses sistemas são bem conhecidos do técnico, no que refere-se às células procariotas, podem-se citar, a título ilustrativo, os vetores de expressão em E. coli, por exemplo, da família pET, comercializados pela sociedade Stratagene (LaJolla, Califórnia, USA), os vetores da família GATEWAY, comercializados pela sociedade In-vitrogen (Carlsbad, Califórnia, USA), os vetores da família pBAD, comercializados pela sociedade Invitrogen (Carlsbad, Califórnia, USA), os vatores da família pMAL, comercializados pela sociedade New England Bioloabs Inc. (Beverly, Massachussets, USA), os vetores de expressão indutíveis pela ramnose citados na publicação Wilms B et al., 2001 e seus derivados, podem-se também citar os vetores de expressão nos streptomyces, como, por exemplo os vetores plJ4123, plJ6021, pPM927, pANT849, pANT850, pANT851, pANT1200, pANT1201, pANT1202 e seu derivados (Kieser et al., 2000). No que refere-se às células de lêvedos, pode-se citar a título ilustrativo o vetor pESC comercializado pela sociedade Stratagene (LaJolla, Califórnia, USA). No que refere-se ao sistema de expressão baculovírus, permitindo a expressão em células de insetos, pode-se citar a título ilustrativo o vetor BacPAK6 comercializado pela sociedade BD Biosciences Clontech, (Paio Alto, Califórnia USA). No que refere-se às células de mamíferos, podem-se citar a título ilustrativo vetores que compreendem o promotor dos genes precoces do vírus CMV (citomegalovírus) (por exemplo, o vetor pCMV e seus derivados comercializados pela sociedade Stratagene (LaJolla, Califórnia, USA) ou o promotor dos genes imediatos (promotor imediato SV40) do vírus simiano vacuolisante SV40 (por exemplo, o vetor pSG5 comercializado pela sociedade Stratagene (LaJolla, Califórnia, USA). A invenção é também relativa a um processo de produção de um polipeptídeo, tal como descrito acima, esse processo compreendendo as seguintes etapas: a) inserção de um ácido nucléico codificando esse polipeptídeo em um vetor apropriado; b) cultivo, em um meio de cultura apropriado, de uma célula hospedeira previamente transformada ou transfeita com o vetor da etapa a); c) recuperação do meio de cultura condicionado ou um extrato celular, por exemplo, por sonicação ou por choque osmótico; d) separação e purificação, a partir desse meio de cultura, ou ainda a partir do extrato celular obtido na etapa c), desse polipeptídeo; e) se for o caso, caracterização do polipeptídeo recombinante produzido.

Um polipeptídeo recombinante, de acordo com a invenção, pode ser purificado por passagem sobre uma série apropriada de colunas de cro-matografia, segundo os métodos conhecidos do técnico, e descritos, por exemplo, em F. Ausubel et al.(2002). Pode-se citar, a título ilustrativo, a técnica do "Tag-Histidine", que consiste em acrescentar uma curta seqüência polihistadina ao polipeptídeo a ser produzido, este podendo, em seguida, ser purificado sobre coluna de níquel. Um polipeptídeo, de acordo com a invenção, pode ser igualmente preparado pelas técnicas de síntese in vitro. A título ilustrativo dessas técnicas, um polipeptídeo, de acordo com a invenção, poderá ser preparado graças ao sistema "rapid translation system (RTS)", comercializado notadamente pela sociedade Roche Diagnostics France S.A., Meyland, França.

Um outro aspecto da invenção refere-se a células hospedeiras, nas quais foi introduzido pelo menos um polinucleotídeo e/ou pelo menos um DNA recombinante e/ou pelo menos um vetor de expressão, de acordo com a invenção.

Um outro aspecto da invenção refere-se a microorganismos bloqueados em uma etapa da via de biossíntese de pelo menos um macrolídeo. O interesse reside, por um lado, no estudo da função das proteínas mutadas e, por outro lado, na realização de microorganismos que produzem interme- diários de biossíntese. Esses intermediários podem ser modificados, eventualmente após separação, seja por acréscimos de componentes particulares nos meios de produção, seja por introdução nos microorganismos assim mutados de outros genes codificando proteínas capazes de modificar o intermediário que serve, aí, como substrato. Esses intermediários podem assim ser modificados por via química, bioquímica, enzimática e/ou microbioló-gica. Os microorganismos bloqueados em uma etapa da via de biossíntese de macrolídeos podem ser obtidos ativando-se a função de uma ou várias proteínas implicadas na biossíntese desse(s) macrolídeo(s) em microorganismos produtores desse(s) macrolídeo(s). Conforme as proteínas inativa-das, pode-se ainda obter microorganismos bloqueados em diferentes etapas da via de biossíntese dos macrolídeos. A inativação dessa(s) proteína(s) pode ser feita por qualquer método conhecido do técnico, por exemplo por mutagênese no(s) gene(s) codificando essa(s) proteína(s) ou pela expressão de um ou vários RNA anti-sentido complementares do RNA ou dos RNA mensageiros codificando essa(s) proteína(s). A mutagênese pode, por exemplo, ser feita por irradiação, por ação de agente químico mutágeno, por mutagênese dirigida, por substituição de gene ou qualquer outro método conhecido do técnico. As condições convenientes dessa mutagênese podem, por exemplo, ser adaptadas segundo o ensinamento contido nas obras de Kieser, T et al (2000) e Ausubel et al., (2002). A mutagênese pode ser feita in vitro, in situ, por supressão, substituição, deleção e/ou adição de uma ou várias bases no gene considerado ou por inativação gênica. Essa mutagênese pode ser feita em um gene que compreende uma sequência tal como descrita acima. Preferencialmente, os microorganismos bloqueados em uma etapa da via de biossíntese de macrolídeos são bactérias do gênero streptomyces. Mais preferencialmente, a inativação da função de uma ou várias proteínas implicadas na biossíntese do(s) macrolídeo(s) em questão é feita por mutagênese. Ainda mais preferencialmente, o macrolídeo em questão é a espiramicina e os microorganismos nos quais são feitas a ou as mutagêneses são cepas de S. ambofaciens. Mais preferencialmente, a mutagênese é feita em um ou vários genes que compreendem uma das se- qüências correspondentes a uma ou várias das seqüências SEQ ID N° 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80,82, 84, 107, 109, 111,113,115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 e 149. De forma preferida, a ou as mutagêne-ses são feitas por inativação gênica. De forma inteiramente preferida, a mu-tagênese consiste na inativação gênica de um gene que compreende uma seqüência correspondente à sequência SEQ ID N° 13. A título ilustrativo, os seguintes microorganismos podem ser citados a título de exemplo desses microorganismos: OS49.16 (otf3Ohyg, cf. exemple 2), OS49.67 (orfidélétion en phase, cf. exemple 6), OS49.107 (orfSy. £2hyg, cf. exemple 7), OS49.50 (orflO:: ílhyg, cf. exemple 8), SPM21 lprf2::at.tSDaac-, cf. exemple 10), SPM22 (orJ2::att3 délétion en phase, cf. exemple 10), SPM501 {orf6*::attlQhygJri cf. exemple 14), : SPM502 (orf6*::attl délétion en phase, cf. exemple 14), SPM507 {orfl2::atí3I2aac-, cf. exemple 11), SPM508 (orfl3c::aít3í2aaccf. exemple 12), SPM509 {prfl4::att30aac-t cf. exemple 13), SPM107 (orf28c::att3aac+, cf. exemple 29), SPM543 (orJ3l::att3aac+, cf. exemple 30), SPM106 (orJ32c::att3aac+, cf. exemple 31). exemple = exemplo délétion en phase = deleção em fase aquosa Um outro aspecto da invenção refere-se a um processo de preparação de um intermediário de biossíntese de macrolídeo utilizando microorganismos bloqueados em uma etapa da via de biossíntese de macrolí-deos, tais como descritos acima. O processo consiste em cultivar, em um meio de cultura apropriado, um microorganismo bloqueado em uma etapa da via de biossíntese de macrolídeos, tais como descritos acima, recuperar o meio de cultura acondicionado ou um extrato celular, por exemplo por soni-cação ou por choque osmótico, separar e purificar a partir do meio de cultura ou ainda a partir do extrato celular obtido na etapa precedente, esse intermediário de biossíntese. As condições de cultura desses microorganiosmos poderão ser determinadas, segundo técnicas bem conhecidas do técnico. O meio de cultura poderá, por exemplo, ser o meio MP5 ou o meio SL11 para as streptomyces e notadamente para streptomyces ambofaciens (Pernodet et al., 1993). O técnico poderá notadamente se referir à obra de Kieser et al. (2000) no que refere-se à cultura das streptomyces. O intermediário produzido pode ser recuperado por quaisquer técnicas conhecidas do técnico. O técnico poderá se referir, por exemplo, às técnicas ensinadas na patente americana US 3.000.785 e, mais particularmente, aos métodos de extração das espiramicinas descritas nessa patente.

Um outro objeto da invenção refere-se a um processo de preparação de uma molécula derivada de um macrolídeo utilizando os microorganismos bloqueados em uma etapa da via de biossíntese desse macrolídeo, tais como descritos acima. O processo consiste em obter um intermediário de biossíntese, segundo o processo acima e em modificar o intermediário assim produzido, eventualmente após separação do meio de cultura. As condições de cultura desses microorganismos poderão ser determinadas segundo técnicas bem conhecidas do técnico. O meio de cultura poderá, por exemplo, ser o meio MP5 ou o meio SL11 para as streptomyces e notadamente para streptomyces ambofaciens (Pernodet et al., 1993). O técnico poderá notadamente se referir à obra de Kieser et al. 2000, no que refere-se à cultura das streptomyces. Os intermediários produzidos podem ser modificados, eventualmente após separação, seja por acréscimo de componentes apropriados nos meios de produção, seja por introdução nos microorganismos de outros genes codificando proteínas capazes de modificar nos microorganismos de outros genes codificando proteínas capazes de modificar o intermediário servindo-se dele como substrato. Esses intermediários podem assim ser modificados por via química, bioquímica, enzimática e/ou microbi-ológica. Mais preferencialmente, o macrolídeo em questão é a espiramicina e os microorganismos nos quais são feitas as mutagêneses são cepas de S. ambofaciens. A invenção é também relativa a um microorganismo que produz a espiramicinas I, mas não produz espiramicina II e III. Esse microorganismo compreende o conjunto dos genes necessários à biossíntese da espiramicina I, mas não produz espiramicina II e III, pois o gene que compreende a seqüência correspondente à SEQ ID N° 13 ou uma de suas variantes ou uma das seqüências derivadas daquelas em razão da degenerescência do código genético e codificando um polipeptídeo de seqüência SEQ ID N° 14 ou uma de suas variantes não é expressa ou foi tornado inativo. A inativação dessa proteína pode ser feita por qualquer método conhecido do técnico, por exemplo por mutagênese no gene que codifica essa proteína ou pela expressão RNA anti-sentido complementar do RNA mensageiro codificando essa proteína, naturalmente que se a expressão de orf5* for afetada por essa manipulação será necessário proceder a uma outra modificação para que o gene orf5* seja corretamente expresso. A mutagênese pode ser feita na seqüência codificante ou em uma seqüência não codificante, de maneira a tornar inativa a proteína codificada ou a impedir sua expressão ou sua tradução. A mutagênese pode ser feita por mutagênese dirigida, por substituição de gene ou qualquer outro método conhecido do técnico. As condições convenientes dessa mutagênese podem, por exemplo, ser adaptadas, segundo o ensinamento contido nas obras de Kieser,T et al (2000) e Ausubel et al., 2002. A mutagênese pode ser feita in vitro ou in situ, por supressão, substituição, deleção e/ou adição de uma ou várias bases no gene considerado ou por inativação Gênica. O microorganismo pode ser também obtido, expressando-se os genes da via de biossíntese da espiramicina, sem que estes compreendam o gene que compreende a seqüência SEQ ID N° 13 ou uma de suas variantes ou uma das seqüências derivadas destas, em razão da degenerescência do código genético e codificando um polipeptídeo de seqüência SEQ ID N° 14 ou uma de suas variantes. Preferencialmente, o microorganismo é uma bactéria do gênero streptomyces. Mais preferencialmente, o microorganismo que produz a espiramicinas I, mas que não produz a espiramicina II e III é obtido a partir de um microorganismo de partida, produzindo espiramicinas I, II e III. Ainda mais preferencialmente, o microorganismo é obtido por mutagêneses em um gene que compreende a seqüência correspondente à SEQ ID N° 13 ou uma de suas variantes ou uma das seqüências derivadas destas, em razão da degenerescência do código genético e codificando um polipeptídeo de SEQ ID N° 14 ou uma de suas variantes que tem a mesma função. Ainda mais preferencialmente, essa mutagênese é feita por inativação gênica. De maneira preferida, o microorganismo é obtido a partir de uma cepa de S.ambofaciens que produz espiramicinas I, II e III na qual é feita uma inativação gênica do gene que compreende a seqüência correspondente à SEQ ID N° 13 ou uma das seqüências derivadas desta, em razão da degenerescência do código genético. De maneira inteiramente preferida, a invenção gênica é feita por deleção em fase do gene ou de uma parte do gene que compreende a seqüência correspondente à SEQ ID N°13 ou uma das seqüências derivadas desta em virtude da degenerescência do código genético. A título ilustrativo, a cepa SPM502 (orf6*::attl, conforme exemplo 14) pode ser citada como um microorganismo que produz a espiramicinas I, mas que não produz espiramicina II e III. A invenção é também relativa a um microorganismo que produz a espiramicinas I, mas que não produz espiramicina II e III, tal como descrito acima, caracterizado pelo fato de superexpressar, além disso: - um gene capaz de ser obtido por amplificação em cadeia por polimerase, utilizando o par de atrações da seguinte seqüência: 5'AAGCTTGTGTGCCCGGTGT ACCTGGGG AGC 3’ (SEQ ED N° 138) e 5'GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3’ (SEQ ID N° 139) e como matriz o cosmídeo pSPM36 ou o DNA total de streptomyces ambo-faciens, mais preferencialmente trata-se do gene de seqüência codificante SEQ ID N° 141; - ou um gene derivado destes em razão da degenerescência do código genético.

Um exemplo de seqüência desse gene é dado em SEQ ID N° 111 (DNA), todavia essa seqüência é parcial, já que ela não compreende a parte 3’ da seqüência codificante correspondente. A tradução em proteína dessa parte de seqüência codificante é dada em SEQ ID N° 112. O técnico poderá facilmente completá-la, notadamente utilizando o ensinamento apresentado no exemplo 24. A seqüência indeterminada em SEQ ID N° 111 foi determinada em uma segunda etapa e a seqüência completa dessa orf (orf28c) é dada em SEQ ID N° 141. A tradução em proteína dessa seqüência codificante é dada em SEQ ID N° 142. É apresentado no exemplo 24 um método para clonar o gene orf28c e para fabricar um vetor de expressão que permite a expressão de orf28c. É também mostrado nesse exemplo que a superexpressão do gene orf28c na cepa OSC2 leva à melhoria da produção em espiramicinas dessa cepa. A superexpressão do gene orf28c pode ser obtida aumentando-se o número de cópias desse gene e/ou colocando-se um promotor mais ativo que o promotor primitivo. De forma preferida, a superexpressão desse gene é obtida, fornecendo no microorganismo uma construção de DNA recombinante, permitindo a superexpressão desse gene. De forma preferida, essa construção de DNA recombinante aumenta o número de cópia desse gene e permite obter uma superexpressão desse gene. Nessa construção de DNA recombinante, a seqüência codificante do gene pode ser colocada sob o controle de um promotor mais ativo que o promotor primitivo. Pode-se citar a título de ilustração o promotor ptrc ativo em streptomyces ambofaciens (Amann, E et al., 1988), assim como o promotor ermE*.

Assim, de forma preferida, a ou as cópias do gene orf28c (é) são colocadas sob o controle do promotor ermE*, como é o caso na construção pSPM75 (conforme exemplo 24). A invenção é também relativa a um microorganismo que produz espiramícina I, mas que não produz espiramícina II e III, tal como descrito acima, caracterizado pelo fato de superexpressar, além disso, o gene de seqüência codificante SEQ ID N° 47 ou de uma seqüência codificante derivada desta em razão da degenerescência do código genético. Preferencialmente, esse microorganismo é caracterizado pelo fato de se tratar a cepa SPM502 pSPM525 depositada junto à Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25, rue du Docteir Roux 75724 Paris Cedex 15, France, aos 26 de fevereiro de 2003, sob o número de registro I-2977. A invenção é também relativa a um processo de produção de espiramicinas I, o processo consiste em cultivar em um meio de cultura apropriado um microorganismo que produz a espiramicinas I, mas que não produz espiramicina II e III, tal como descrito acima, recuperar o meio de cultura acondicionado ou um extrato celular, separar e purificar a partir desse meio de cultura ou ainda a partir do extrato celular obtido na etapa precedente a espiramicina I. As condições de cultura desse microorganismo poderão ser determinadas segundo técnicas bem conhecidas do técnico. O meio de cultura poderá, por exemplo, ser o meio MP5 ou o meio SL11 para as streptomyces e notadamente para streptomyces ambofaciens (Pernodet et al., 1993). O técnico poderá notadamente se referir à obra de Kieser et aí. 2000 no que refere-se à cultura das streptomyces. A espiramicina I produzida pode ser recuperada por quaisquer técnicas conhecidas do técnico. O técnico poderá se referir, por exemplo, às técnicas ensinadas na patente americana US 3.000.785 e, mais particularmente, aos métodos de extração das espiramicinas descritas nessa patente.

Um outro aspecto da invenção refere-se à utilização de uma se-qüência nucleotídica, de acordo com a invenção, para melhorar a produção em macrolídeos de um microorganismo. Assim, a invenção refere-se a um microorganismo mutante produtor de macrolídeo, caracterizado pelo fato de possuir uma modificação genética em pelo menos um gene que compreende uma sequência, tal como definida acima e/ou pelo fato de superexprimir pelo menos um gene que compreende uma seqüência, tal como definida acima. A modificação genética pode consistir em uma supressão, uma substituição, uma deleção e/ou uma adição de uma ou várias bases no ou nos genes considerados com o objetivo de exprimir uma ou algumas proteínas tendo uma atividade superior ou de exprimir um nível mais elevado dessa ou dessas proteínas. A superexpressão do gene considerado pode ser obtida au-mentando-se o número de cópias desse gene e/ou colocando-se um promotor mais ativo do que o promotor primitivo. Podem-se citar, a título de ilustração, o promotor ptrc ativo em streptomyces ambofaciens (Amann, E. et al., 1988) bem como o promotor ermE* (Bibb et al., 1985), (Bibb et al., 1994). Assim, a superexpressão do gene considerado pode ser obtida empregando-se, em um microorganismo produtor do macrolídeo considerado, uma cons- trução de DNA recombinante, segundo a invenção, permitindo a superex-pressão desse gene. Com efeito, certas etapas da biossíntese dos macrolí-deos são limitadoras e casos e expresse uma ou várias proteínas mais ativas ou um nível de expressão mais importante da(s) proteína(s) primitiva(s) implicada(s) nessas etapas limitadoras, pode-se melhorar a produção do(s) macrolídeo(s) referido(s). Um aumento da taxa de produção da tilosina foi, por exemplo, obtida nas streptomyces fradiae por duplicação do gene codificando uma metil transferase limitadora que converte a macrocina em tilosina (Baltz R, 1997). A obtenção da expressão de uma proteína mais ativa pode ser obtida notadamente por mutagênese, o técnido poderá, por exemplo, se referir a esse respeito à obra de F.Ausubel et al. (2002). Preferencialmente, esses microorganismos mutantes melhorados para sua produção em macro-lídeos são bactérias do gênero streptomyces. Mais preferencialmente, o ma-crolídeo em questão é a espiramicina e os microorganismos nos quais é/são feita(s) a(s) mutagênese(s) são cepas de S.ambofaciens. Mais preferencialmente, a modificação genética é feita em um ou vários genes que compre-ende(m) uma das seqüências correspondendo a uma ou várias das sequências SEQ ID N° 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19,21,23,25, 28,30, 34,36,40,43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84,107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 e 149, ou uma de suas variantes ou uma das seqüências derivadas desta em razão da degenerescência do código genético. De forma preferida, o microorganismo superexpressa um ou vários genes que compreende(m) uma das seqüências correspondentes a uma ou várias das seqüências SEQ ID N° 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 107, 109, 111, 113, 115, 118, 120, 141, 143, 145, 147 e 149, ou uma de suas variantes ou uma das seqüências derivadas desta em razão da degenerescência do código genético. De forma preferida, o microorganismo superexpressa o gene que compreende uma seqüência correspondente à SEQ ID N° 111 ou 141, ou uma de suas variantes ou uma das seqüências derivadas destas em razão da degenerescência do código gené- tico. A seqüência determinada em SEQ ID N° 111 é parcial, todavia, o técnico poderá facilmente completá-la, notadamente utilizando o ensinamento apresentado no exemplo 24. A seqüência indeterminada em SEQ ID N° 111 foi determinada em uma segunda etapa e a seqüência completa dessa orf (orf28c) é dada em SEQ ID N° 141. A tradução em proteína dessa seqüência codificante é dada em SEQ ID N° 142. É assim apresentado o exemplo 24 um método para clonar o gene orf28c e para fabricar um vetor de expressão que permite a expressão de orf28c. É também mostrado nesse exemplo que a superexpressão do gene orf28c na cepa OSC2 conduz à melhoria da produção em espiramicinas dessa cepa. A superexpressão do gene orf28c pode ser obtida, aumentando-se o número de cópias desse gene e/ou colocando-se um promotor mais ativo que o promotor primitivo. De forma preferida, a superexpressão do gene orf28c é obtida, fornecendo-se no microorganismo uma construção de DNA recombinante, permitindo a superexpressão desse gene. De forma preferida, essa construção de DNA recombinante aumenta o número de cópia do gene orf28c e permite obter uma superexpressão do gene orf28c. Nessa construção de DNA recombinante, a seqüência codificante de orf28c pode ser colocada sob o controle de um promotor mais ativo do que o promotor primitivo. Pode-se citar a título de ilustração o promotor ptrc ativo nos streptomyces ambofaciens (Amann, E. et al., 1988), assim como o promotor ermE*. Assim, de forma preferida, a(s) cópia(s) do gene orf28c fornecido é/são colocada(s) sob o controle do promotor ermE*, como é o caso na construção pSPM75 (conforme exemplo 24).

Um outro aspecto da invenção refere-se a um processo de produção de macrolídeos, utilizando os microorganismos descritos no parágrafo precedente. Esse processo consiste em cultivar em um meio de cultura apropriado um microorganismo definido no parágrafo precedente, recuperar o meio de cultura acondicionado ou um extrato celular, separar e purificar a partir desse meio de cultura ou ainda a partir do extrato celular obtido na etapa precedente o(s) macrolídeo(s) produzido(s). As condições de cultura desse microorganismos poderão ser determinadas segundo técnicas bem conhecidas do técnico. O meio de cultura poderá, por exemplo, ser o meio ΜΡ5 ou o meio SL11 para as streptomyces e notadamente para streptomyces ambofaciens (Pernodet et al., 1993). O técnico poderá notadamente se referir à obra de Kieser et al., 2000, no que refere-se à cultura das streptomyces. O(s) macrolídeo(s) produzido(s) pode(m) ser recupera-do(s) por quaisquer técnicas conhecidas do técnico. O técnico poderá se referir, por exemplo, às técnicas ensinadas na patente americana US 3.000.785 e, mais particularmente, aos métodos de extração das espiramici-nas descritas nessa patente. Preferencialmente, os microorganismos utilizados nesse processo são bactérias do gênero streptomyces. Mais preferencialmente, o macrolídeo em questão é a espiramicina e os microorganismos mutantes melhorados para sua produção em espiramicinas são cepas de S.ambofaciens.

Um outro aspecto da invenção refere-se à utilização de uma se-qüência e/ou de um vetor, de acordo com a invenção, para a preparação de antibióticos híbridos. Com efeito, os polinucleotídeos, segundo a invenção, podem servir para a obtenção de microorganismos que expressam uma ou várias proteínas mutantes que dão lugar a uma modificação na especificidade do substrato ou ainda ser expressos em múltiplos microorganismos produtores de antibióticos com a finalidade de gerar antibióticos híbridos. Assim, os polinucleotídeos, segundo a invenção, podem permitir, por transferência dos genes entre microorganismos produtores, fabricar antibióticos híbridos que têm propriedades farmacologicamente interessantes (Hopwood et al., 1985a, Hopwood et al., 1985b, Hutchinson et al., 1989). O princípio pelo qual a engenharia genética pode levar à produção de antibióticos híbridos foi inicialmente proposto por Hopwood (Hopwood 1981). Foi assim proposto que as enzimas que participam da biossíntese de antibióticos aceitam freqüen-temente substratos ligados estruturalmente, mas diferentes de seu substrato natural. Geralmente, é admitido (Hopwood 1981, Hutchinson 1988, Robinson 1988) que as enzimas codificadas pelos genes da via de biossíntese de antibióticos têm uma especificidade de substrato menos estrito que as enzimas do metabolismo primário. Pôde assim ser mostrado que um grande número de substratos não naturais são transformados por microorganismos produto- res de antibiótico, seus mutantes ou enzimas purificadas da via de biossínte-se desses antibióticos (Hutchinson 1988). Utilizando-se esse ensinamento, o técnico poderá construir microorganismos que expressam uma ou várias proteínas mutantes que dão lugar a uma modificação na especificidade do substrato com a finalidade de gerar antibióticos híbridos. A invenção refere-se também à utilização de pelo menos um po-linucleotídeo e/ou pelo menos um DNA recombinante e/ou pelo menos um vetor de expressão e/ou pelo menos um polipeptídeo e/ou pelo menos uma célula hospedeira, segundo a invenção, para realizar uma ou várias biocon-versões. Assim, a invenção permite construir cepas bacterianas ou fúngicas nas quais se expressa, sob o controle de sinais de expressão apropriados, uma ou várias proteínas, de acordo com a invenção. Essas cepas podem, então, ser utilizadas para realizar uma ou bioconversões. Essas bioconver-sões podem ser feitas seja com o auxílio de células totais, seja como auxilio de extratos acelulares dessas células. Essas bioconversões podem permitir transformar uma molécula em uma forma derivada com uma enzima de uma via de biossíntese. Por exemplo, Carreras et al. Descreve a utilização de cepa de Saccharopolyspora erythraea e de streptomyces coelicolor para a produção de novos derivados de eritromicinas (Carreras et al., 2002). Walczar et al. Descreve a utilização de uma P450 monooxigenase de streptomyces para a bioconversão de desacetiladriamicina (um análogo da antraciclina) em novas antraciclinas (Walczar et al, 2001). Olonao et al. Descreve a utilização de uma cepa de streptomyces lividans modificada pela bioconversão de rodomicinona-epsilom em rodomicina D (Olonao et al., 1999). O técnico poderá aplicar esse princípio a qualquer intermediário de biossíntese. A invenção refere-se também a um DNA recombinante caracterizado pelo fato de compreender: - um polinucleotídeo capaz de ser obtido por amplificação em cadeia por polimerase, utiiizando-se o par de atrações da seguinte seqüên-cia: 5AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3’ (SEQ ID N° 138) e 5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3’ (SEQ ID N° 139) e como matriz o cosmídeo pSPM36 ou o DNA total de streptomyces ambo-faciens, mais preferencialmente trata-se de um polinucleotídeo de seqüência SEQ ID N° 141; - um fragmento de pelo menos 10, 12, 15, 18, 20 a 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350,400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1460, 1470, 1480, 1490 ou 1500 nucleotídeos consecutivos desse polinucleotídeos.

Preferencialmente, esse DNA recombinante é um vetor. Ainda mais preferencialmente, o vetor é escolhido dentre os bacteriófagos, os plasmídeos, os fagemídeos, os vetores integrativos, os fosmídeos, os cos-mídeos, os vetores navettes, os BAC (Bacterial Artificial Chromosome) ou os PAC (P1-derived Artificial Chromosome). A título ilustrativo, podem-se citar os plasmídeos que se replicam em E.coli, por exemplo pBR322 e seus derivados, pUC18 e seus derivados, pUC19 e seus derivados, pGB2 e seus derivados (Churchward G. et al., 1984), pACYC177 (número de acesso GenBank: X06402) e seus derivados, pACYC 184 (número de acesso GenBank: X06403) e seus derivados. Podem-se também citar os plasmídeos que se replicam em streptomyces como, por exemplo, plJ101 e seus derivados, pSG5 e seus derivados, SLP1 e seus derivados, SCP2* e seus derivados (Kieser et al. 2000). Como fagemídeos podem-se citar a título ilustrativo pBluescript II e seus derivados (comercializados notadamente pela sociedade Strategene (LaJolla, Californie, USA)), pGEM-T e seus derivados (comercializado pela sociedade Promega (Madison, Wisconcin, USA)), λΖΑΡΙΙ e seus derivados (comercializados notadamente pela sociedade Stratagene (LaLolla, Califórnia, USA)). Como vetores integrativos, podem-se citar, a título ilustrativo, os vetores integrativos em streptomyces como, por exemplo, aqueles derivados de SLP1 (Kieser et al., 2000), aqueles derivados de pSAM2 (Kieser et al., 2000), os vetores utilizando os sistemas de integração dos fágios PhiC31 (Kieser et al., 2000) (por exemplo pSET152 (Bierman et al., 1992)) ou de VWB (Van Mellaert L, et al. 1998), assim como os vetores que utilizam o sistema de integração de IS117 (Kieser et al., 2000). Como fosmídeos podem-se citar a título ilustrativo o fosmídeo pFOS1 (comercializado pela sociedade New England Biolabs Inc., Beverly, Massachussetts, USA) e seus derivados. Como cosmídeos, podem-se citar a título ilustrativo o cosmídeo SuperCos e seus derivados (comercializados notadamente pela sociedade Stratagene (LaJolla, Califórnia, USA)), o cosmídeo pWED15 (Wahl et al., 1987) e seus derivados. Como vetores navettes, podem-se citar a título ilustrativo os plasmídeos navettes E.coli / streptomyces como, por exemplo, plJ903 e seu derivados, a série dos plasmídeos pUWL, pCAO106, pWHM3, pOJ446 e seu derivados (Kieser et al. 2000), os BAC navettes E.coli / streptomyces como, por exemplo, aqueles descritos no pedido de patente WO 01/40497. Como BAC (Bacterial Artificial Chromosome), pode-se citar, a título ilustrativo, o BAC pBeloBACH (número de acesso GenBank: U51113). Como PAC (P1-derived Artificial Chromosome), pode-se citar a título ilustrativo o vetor pCYPAC6 (número de acesso GenBank: AF133437). Mais preferencialmente, esse DNA recombinante é um vetor de expressão. Os vetores de expressão utilizáveis em diferentes sistemas de expressão são bem conhecidos do técnico, no que refere-se às células pro-cariotas, podem-se citar a título ilustrativo os vetores de expressão em E.coli por exemplo, da família pET comercializados pela sociedade Stratagene (LaJolla, Califórnia, USA), os vetores da família GATEWAY comercializados pela sociedade Invitrogen (Carlsbad, Califórnia, USA), os vetores da família pMAL comercializados pela sociedade New England Biolabs Inc. (Beverly, Massachussetts, USA), os vetores de expressão indutíveis pela ramnose citados na publicação Wilms B et al., 2001 e seu derivados, podem-se citar os vetores de expressão em streptomyces como, por exemplo, os vetores PÍJ4123, pIJ6021, pPM927, pANT849, pANT 850, pANT 851, pANT1200, pANT1201, pANT1202 e seus derivados (Kieser et al., 2000). No que refere-se às células de lêve- dos, pode-se citar a título ilustrativo o vetor pESC comercializado pela sociedade Stratagene (LaJolla, Califórnia, USA). No que refere-se ao sistema de expressão baculovírus permitindo uma expressão em células de insetos, pode-se citar, a título ilustrativo, o vetor BacPAK 6 comercializado pela sociedade BD Biosciences Clontech, (Paio Alto, Califórnia, USA). No que refere-se às células de mamíferos, podem-se citar a título ilustrativo vetores que compreendem o promotor dos genes precoces do vírus CMV (Citomegaloví-rus) (Por exemplo o vetor pCMV e seu derivados comercializados pela sociedade Stratagene (LaJolla, Califórnia, USA) ou o promotor dos genes imediatos (SV40 early promoter) do vírus simiano vaculoisante SV40 (por exemplo, o vetor pSG5 comercializado pela sociedade Stratagene (LaJolla, Califórnia, USA). Um outro aspecto da invenção refere-se às células hospedeiras na qual foi introduzido pelo menos um DNA recombinante descrito nesse parágrafo.

Um outro aspecto da invenção refere-se a um processo de produção de um polipeptídeo, caracterizado pelo fato de esse processo compreender as seguintes etapas: a) transformar uma célula hospedeira por pelo menos um vetor de expressão, tal como descrito no parágrafo acima; b) cultivar, em um meio de cultura apropriado, essa célula hospedeira; c) recuperar o meio de cultura acondicionado ou um extrato celular; d) separar e purificar a partir desse meio de cultura ou ainda a partir do extrato celular obtido na etapa c), esse polipeptídeo; e) se foro caso, caracterizar o polipeptídeo recombinante produzido. O polipeptídeo recombinante assim produzido pode ser purificado por passagem sobre uma série apropriada de colunas de cromatografia, segundo os métodos conhecidos do técnico e descritos, por exemplo, em F. Ausubel et al (2002). Pode-se citar a título indicativo a técnica do "Tag-Histidine" que consiste em acrescentar uma curta seqüência polihistidina ao polipeptídeo a produzir, podendo este em seguida ser purificado sobre coluna de níquel. Esse polipeptídeo pode também ser preparado pelas técnicas de síntese in vitro. A título dessas técnicas, o polipeptídeo poderá ser preparado graças ao sistema "rapid translation system (RTS)", comercializado notadamente pela sociedade Roche Diagnostics France S.A., Meylan, Fran-ce.

Um outro aspecto da invenção refere-se a um microorganismo produtor de pelo menos uma espiramicinas, caracterizado pelo fato de su-perexpressar: - um gene capaz de ser obtido por amplificação em cadeia por polimerase (PCR), utilizando o par de atrações da seguinte seqüência: 5'AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3’ (SEQ ID N° 138) e 5’GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3’ (SEQ ID N° 139) e como matriz o cosmídeo pSPM36 ou o DNA total de streptomyces ambo-faciens, mais preferencialmente trata-se do gene de seqüência codificante SEQ ID N° 141; - ou um gene derivado destes em razão da degenerescência do código genético.

Um exemplo de seqüência desse gene é dado em SEQ ID N° 111 (DNA), todavia essa seqüência é parcial, já que ela não compreende a parte 3’ da seqüência codificante correspondente. A tradução em proteína dessa parte de seqüência codificante é dada em SEQ ID N° 112. O técnico poderá facilmente completá-la utilizando o ensinamento apresentado no exemplo 24. Assim é apresentado nesse exemplo um método para clonar o gene orf28c e para fabricar um vetor de expressão que permita a expressão de orf28c. É também mostrado nesse exemplo que a superexpressão do gene orf28c na cepa OSC2 leva à melhoria da produção em espiramicinas dessa cepa. De forma preferida, o microorganismo superexpressa: - um gene capaz de ser obtido por amplificação em cadeia por polimerase (PCR), utilizando o par de atrações da seguinte seqüência: 5AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3’ (SEQ ID N° 138) e 5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3’ (SEQ ID N° 139) e como matriz o cosmídeo pSPM36 ou o DNA total de streptomyces ambo-faciens, mais preferencialmente trata-se do gene de seqüência codificante SEQ ID N° 141; - ou um gene derivado deste em razão da degenerescência do código genético e uma bactéria do gênero streptomyces, de maneira ainda mais preferida, trata-se de uma bactéria da espécie streptomyces ambofaciens. De forma preferida, a superexpressão desse gene é obtida por transformação desse microorganismo por um vetor de expressão, de maneira inteiramente preferida, a cepa de microorganismo por um vetor de expressão, de maneira inteiramente preferida, a cepa de microorganismo é a cepa OSC2/pSPM75 (1) ou da cepa OSC2/pSPM75 (2) depositada junto à Collection Nationale de Cultures de microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, em 6 de outubro de 2003, sob o número de registro 1-3101.

Um outro aspecto da invenção refere-se a um processo de produção de espiramicinas, utilizando os microorganismos descritos no parágrafo precedente. Esse processo consiste em cultivar em um meio de cultura apropriado um microorganismo definido no parágrafo precedente, recuperar o meio de cultura acondicionado ou um extrato celular, separar e purificar a partir desse meio de cultura ou ainda a partir do extrato celular obtido na etapa precedente a(s) espiramicina(s) produzida(s). As condições de cultura desses microorganismos poderão ser determinadas, segundo técnicas bem conhecidas do técnico. O meio de cultura poderá, por exemplo, ser o meio MP5 ou o meio SL11 para as streptomyces e notadamente para streptomyces ambofaciens (Pernodet et ai., 1993). O técnico poderá notadamente se referir à obra de Kieser et al. 2000, no que refere-se à cultura das streptomyces. A(s) espiramicina(s) produzida(s) pode(m) ser recupera-da(s) por quaisquer técnicas conhecidas do técnico. O técnico poderá se referir, por exemplo, às técnicas ensinadas na patente americana US 3.000.785 e mais particularmente aos métodos de extração das espiramici-nas descritas nessa patente. Preferencialmente,os microorganismos utilizados nesse processo são bactérias do gênero streptomyces. Mais preferencialmente, os microorganismos são cepas de S.ambofadens.

Um outro aspecto da invenção refere-se a um vetor de expressão caracterizado pelo fato de o polinucleotídeo de seqüência SEQ ID N° 47 ou um polinucleotídeo derivado deste em razão da degenerescência do código genético é colocado sob o controle de um promotor que permite a expressão da proteína codificada por esse polinucleotídeo em streptomyces ambofaciens. Exemplos de vetores de expressão utilizáveis em streptomyces foram dados acima. Preferencialmente, esse vetor de expressão é caracterizado pelo fato de se tratar do plasmídeo pSPM524 ou PSPM525.

Um outro aspecto da invenção refere-se a uma cepa de streptomyces ambofaciens transformada por um vetor definido no parágrafo precedente.

Um outro aspecto da invenção refere-se a um polipeptídeo caracterizado pelo fato de sua seqüência compreender a seqüência SEQ ID N° 112. A invenção é também relativa a um polipeptídeo caracterizado pelo fato de sua seqüência corresponder à seqüência traduzida pela seqüência codifi-cante: - de um gene capaz de ser obtido por amplificação em cadeia por polimerase (PCR), utilizando o par de atrações da seguinte seqüência: 5'AAGCTTGTGTGCCGGGTGTACCTGGGG AGC 3’ (SEQ ID N° 138) e 5' GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3’ (SEQ ID N° 139) e como matriz o cosmídeo pSPM36 ou o DNA total de streptomyces ambofaciens, mais preferencialmente se trata do gene de seqüência codificante SEQ ID N° 141; - ou de um gene derivado deste em razão da degenerescência do código genético.

Preferencialmente, esses polipeptídeos são expressos no estado natural por uma bactéria do gênero streptomyces, mais preferencialmente, esses polipeptídeos são implicados na biossíntese das espiramicinas.

Um outro aspecto da invenção refere-se a um vetor de expressão, permitindo a expressão de um polipeptídeo, tal como definido no parágrafo precedente em streptomyces ambofaciens. Exemplos de vetores de expressão utilizáveis em streptomyces foram dados acima. Preferencialmente, o vetor de expressão em questão é o plasmídeo pSPM75.

LISTA DAS FIGURAS

Figura 1: estrutura química das espiramicinas I, II e III.

Figura 2: cosmídeos utilizados para a seqüenciação da região.

Figura 3: organização de um grupo de genes implicados na via de biossíntese das espiramicinas.

Figura 4: via de biossíntese proposta da micarose.

Figura 5: via de biossíntese proposta da micaminose.

Figura 6: via de biossíntese proposta da forosamina.

Figura 7: ordem preferencial de acréscimo dos açúcares na molécula de espiramicina e intermediários.

Figura 8: via de biossíntese proposta do metoximalonila em S.ambofaciens. Essa via é proposta por analogia com a biossíntese da metoximalonila em streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus (Wu,K. et al. 2000).

Figura 9: etapas que levam à inativação de um gene: a) clonagem do gene alvo em um vetor que se replica em E.coli, mas não nas streptomyces; B) inserção do cassette de resistência no gene alvo (Por clonagem ou recombinação entre curtas seqüências idênticas); C) introdução do plasmídeo em streptomyces ambofaciens (por transformação ou conjugação com E.coli) e seleção dos clones que integraram a cassette, depois alvo de crivação de clones que perderam a parte vetor para ter uma substituição de gene; D) região do cromossoma da cepa mutante na qual o gene alvo é inativado por substituição de gene.

Figura 10: etapas opcionais de acordo com a inativação de um gene, segundo o método descrito na Figura 9, podendo ser conduzidas caso umo cassette excisável tenha sido empregada para interromper o gene alvo: E) introdução na cepa mutante do plasmídeo pOSV508 portando os genes xis e int de pSAM2, cujos produtos vão permitir excisão eficaz por recombinação específica de sítios entre as seqüências attL e attR contornando a cassette; F) obtenção de clones que perderam o cassette excisável e sensíveis ao antibiótico à qual o cassette conferiría a resistência; G) após crescimento e esporulação sobre meio sólido sem antibiótico o plasmídeo pOSV508 é perdido à alta freqüência. Pode-se assim obter clones sensíveis ao tiostrepton nos quais o gene alvo contém uma de-leção em fase. A seqüência do gene alvo deletado pode ser controlada por amplificação PCR e seqüenciação do produto PCR.

Figura 11: amplificação do cassette excisável com a finalidade de utilizá-la para uma experiência de recombinação homólogo. A técnica de recombinação homóloga, graças a curtas seqüências homólogas foi descrita por (Chaveroche et al., 2000). Os 39 ou 40 deóxi-nucleotídeos situados na extremidade 5’desses oligonucleotídeos comportam uma seqüência correspondente a uma seqüência do gene a inativar e os 20 deóxi-nucleotídeos situados no máximo em 3’ correspondem à seqüência de uma das extremidades do cassette excisável.

Figura 12: obtenção de uma construção para a inativação de um gene alvo, graças à técnica descrita por (Chaveroche et al., 2000).

Figura 13: cartão do plasmídeo pWHM3. Strepto ori: origem de replicação streptomyces.

Figura 14: Cartão do plasmídeo pOSV508.

Figura 15: exemplo de estrutura de umo cassette excisável;. Esta é constituída do cassette Qhyg (Blondelet-Rouault et al., 1997) contornada dos lados attR e attL (Raynal et al., 1998), entre os quais um acontecimento de recombinação permitirá a excisão da cassette, graças à expres- são dos genes xis e int.

Figura 16: cartão do plasmídeo pBXL1111.

Figura 17: Cartão do plasmídeo pBXL1112.

Figura 18: teste microbiológico de produção de espiramicina, baseado na sensibilidade de uma cepa de Micrococcus luteus à espiramicina. A cepa de Micrococus luteus utilizada é uma cepa naturalmente sensível à espiramicina, mas resistente à congocidina. As diferentes cepas de streptomyces a testar foram cultivadas em erlenmeyers de 500 ml contendo 70 ml de meio MP5, inoculados a uma concentração inicial de 2.5 106 espo-ras/ml e colocadas para impulsionar a 27 °C sob agitação orbital de 250 rpm. Retiradas de mostos de fermentação foram feitas após 48, 72 e 96 horas de cultura e centrifugados. Uma diluição a um décimo do sobrenadante em meio de cultura estéril e utilizada para o teste. A cepa indicadora de Micrococcus luteus resistente à congodicina, mas sensível à espiramicina (Gour-melen et al., 1998) foi cultivada na caixa quadrada de 12x12 cm. Discos em papel Whatman AA foram embebidos com 70 μΙ da diluição com um décimo do sobrenadante e depositados sobre a superfície da caixa. Discos embebidos com uma solução de espiramicina de diferentes concentrações (2-4-8 pg/ml em meio de cultura MP5) são utilizados como faixa de aferição. As caixas são incubadas a 37°C, durante 24 a 48 horas. Se o disco contiver espiramicina, esta se espalha no agar e inibe o aumento da cepa indicadora de Micrococcus luteus. Essa inibição cria um "halo" em torno do disco, esse halo refletindo a zona na qual a cepa de Micrococcus luteus não cresceu. A presença desse halo é, portanto, uma indicação da presença de espiramici-nas e permite determinar se a cepa de S.ambofaciens em questão é produtora ou não-produtora de espiramicina. Uma comparação com os diâmetro de inibição obtidos para a faixa de aferição permite obter uma indicação da quantidade de espiramicina produzida por essa cepa.

Figura 19: cromatograma CLHP do sobrenadante filtrado do meio de cultura da cepa OSC2.

Figura 20: cromatograma CLHP do sobrenadante filtrado do meio de cultura de cepa SPM501.

Figura 21: cromatograma CLHP do sobrenadante filtrado do meio de cultura de cepa SPM502.

Figura 22: cromatograma CLHP do sobrenadante filtrado do meio de cultura de cepa SPM507.

Figura 23: cromatograma CLHP do sobrenadante filtrado do meio de cultura de cepa SPM508.

Figura 24: cromatograma CLHP do sobrenadante filtrado do meio de cultura de cepa SPM509.

Figura 25: alinhamento da proteína Orf3 (SEQ ID N° 29) com a proteína TylB (SEQ ID N° 87) de S.fradiae realizado graças ao programa FASTA.

Figura 26: alinhamento da proteína MdmA de S.mycarofaciens (SEQ ID N° 88) com a proteína SMD (SEQ ID N° 16) realizado graças ao programa FASTA.

Figura 27. Exemplo de seqüências dos sítios residuais após ex-cisão do cassette excisável. A grosso modo, é indicado o sítio att26 mínimo, tal como definido em Raynal at al., 1998. A seqüência da fase 1 (att1) de 33 nucleotídeos é apresentada em SEQ ID N° 104, a seqüência da fase 2 (att2) de 34 nucleotídeos é apresentada em SEQ ID N° 105, a seqüência da fase 3 (att3) de 35 nucleotídeos é apresentada em SEQ ID N° 95.

Figura 28: representação esquemática do gene orf10, localização das atrações PCR utilizadas e construção obtida com cada par de atrações.

Figura 29: construção do cassette pac-oritT;

Figura 30: Cartão do cosmídeo pWED2.

Figura 31: representação esquemática do grupo de genes implicados na via de biossíntese das espiramicinas e da localização das três sondas utilizadas para isolar os cosmídeos do banco de DNA genômico da cepa OSC2 de streptomyces ambofaciens em E. coli (conforme exemplo 19).

Figura 32: localização dos enxertos dos cosmídeos isolados do banco de DNA genômico da cepa OSC2 de streptomyces ambofaciens em E.coli (conforme exemplo 19). Novo banco de DNA cosmídico.

Figura 33: sob clonagem do fragmento Pstl-Pstl do cosmídeo pSPM36 (enxerto do plasmídeo (pSPM58), sob clonagem do fragmento Stul-Stul do cosmídeo pSPM36 (enxerto do plasmídeo pSPM72) e sob clonagem de um fragmento EcoRI-StuI (enxerto do plasmídeo pSPM73).

Figura 34: localização das fases abertas de leitura identificadas no enxerto Pstl-Pstl do plasmídeo pSPM58 e no enxerto EcoRI-StuI do plasmídeo pSPM73.

Figura 35: superposição dos cromatogramas CLHP que flutua filtrado do meio de cultura da cepa OS49.67 realizados a 238 e 280 nm (no alto) e espectros UV das moléculas purificadas em 33,4 minutos e 44,8 minutos (em baixo).

Figura 36: estrutura molecular das moléculas platenolídeo A e platenolídeo B.

Figura 37: organização do grupo de genes implicados na via de biossíntese das espiramicinas.

Figura 38: estrutura molecular de um intermediário de biossíntese produzido pela cepa SPM507.

Figura 39: estrutura de um intermediário de biossíntese produzido por uma cepa de S. ambofacienes de genótipo orfô*: att1Qhyg+ obtida a partir de uma cepa superproduzindo as espiramicinas. A inserção do cassette att1Qhyg+ em orf6* exerce um efeito polar, impedindo a expressão de orf5*.

Figura 40: estrutura molecular das moléculas platenolídeo A + micarose e platenolídeo B + micarose produzidas pela cepa OS49.67.

Figura 41: sob clonagem de um fragmento Pstl-Pstl do cosmídeo pSPM36 (enxerto do plasmídeo (pSPM79)), localização das fases abertas de leitura identificadas no enxerto Pstl-Pstl do plasmídeo pSPM79 e localização da sequência SEQ ID N° 140. A presente invenção é ilustrada com o auxílio dos exemplos que se seguem, que devem ser considerados como ilustrativos e não limitativos.

Em resumo, os genes da via de biossíntese das espiramicinas foram isolados a partir de um banco de DNA genômico de streptomyces am-bofaciens. Esse banco foi obtido por digestão parcial do DNA genômico de streptomyces ambofaciens, pela enzima de restrição BamHI. Largos fragmentos de DNA, de 35 a 45 kb em média, foram clonados no cosmídeo pWED1 (Gourmelen et al., 1998) derivado do cosmídeo pWED15 (Wahl et al., 1987). Esses cosmídeos foram introduzidos em E.Coli, graças a partículas fágicas. O banco assim obtido foi hibridizado com uma sonda (de se-qüência SEQ ID N° 86) correspondente a uma parte do gene tylB de S.fradiae (merson-Davies & Cundliffe, 1994, número de acesso GenBank: U08223). Após hibridização, um cosmídeo em 4 que se hibrida com a sonda foi particularmente selecionado. Esse cosmídeo chamado pOS49.1 foi em seguida digerido por Saci e um fragmento de 3,3 kb contendo a região, o qual se hibrida com a sonda, foi clonado no vetor pUC19 e seqüenciado. Quatro fases abertas de leituras foram identificadas e uma dentre elas codifica uma proteína (SEQ ID N° 29) apresentando fortes similitudes de se-qüência com a proteína TylB de S. fradiae (SEQ ID N° 87) (conforme Figura 25). Esse gene foi chamado orf3 (SEQ ID N° 28) e foi inativado em S. ambofaciens. Pôde ser demonstrado que os clones inativados no gene orf3 não produzem mais espiramicinas. Isto mostra a implicação do gene orf3 ou de genes situados a jusante na biossíntese das espiramicinas.

Uma vez conseguida essa confirmação, uma região maior do cosmídeo pOS49.1 foi seqüenciada, de ambos os lados do fragmento Saci anteriormente estudado. Assim, a partir do cosmídeo pOS49.1, a seqüência de uma região que comporta sete fases abertas de leitura inteiras e duas outras incompletas, situadas de ambos os lados dessas sete fases abertas completas, pôde ser obtida. Graças a uma pesquisa nas bases de dados, pôde ser mostrado que uma das fases abertas de leitura incompleta correspondia ao locus srmG (região codificando uma enzima denominada "polyke-tide synthase" (PKS)). Os genes correspondentes foram clonados por Bur-gett S. et al. Em 1996 (Patente US 5.945.320). Por outro lado, as outars fases abertas de leitura, as sete ORFs inteiras denominadas: orf1, orf2, orf3, orf4, orf5, orf6, orf7 (SEQ ID N° 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40) e o começo da oitava ORF denominado orf8 (seqüência ID N° 43) não foram encontradas nas bases de dados.

Na segunda etapa e com a finalidade de clonar outros genes implicados na biossíntese das espiramicinas, outros cosmídeos comportando fragmentos do genoma S. ambofaciens nessa mesma região foram isolados. Por isto uma nova série de hibridizações foi feita utilizando três sondas. A primeira sonda corresponde a um fragmento de DNA de 3,7kb, contendo orf1, orf2 e o começo de orf3, subclonado a partir de pOS49.1. A segunda sonda corresponde a um fragmento de 2 kb de DNA, contendo uma parte de orf7 e uma parte de orf8 e subclonado a partir de pOS49.1. Uma terceira sonda foi também utilizada. Esta corresponde a um fragmento de DNA de 1.8 kb contendo o gene srmD. O gene srmD é um gene isolado de S.ambofaciens capaz de conferir a resistência a espiramicinas. Com efeito, trabalhos anteriores permitiram a clonagem de vários determinantes de resistência de S.ambofaciens, conferindo a resistência a espiramicinas a uma cepa de S.griseofuscus (cepa sensível à espiramicinas) (Pernodet et al., 1993) (Pernodet et al., 1999). Para o isolamento de genes de resistências, um banco cosmídico do DNA genômico da cepa S.ambofaciens fora realizada no cosmídeo pKC505 (Richardson MA et al., 1987). Esse "pool" de cosmídeos fora introduzido em S.griseofuscus, naturalmente sensível à espiramicinas. Cinco cosmídeos capazes de conferir a resistência à apramicina e a espiramicinas em S. griseofuscus foram assim obtidos. Dentre esses 5 cosmídeos, um cosmídeo denominado pOS44.1 possui em seu enxerto o gene srmD que codifica uma proteína que apresenta uma certa similitude com a proteína codificada pelo gene mdmA de streptomyces mycarofaciens e implicada na resistência à midecamicina nesse organismo produtor (Hara et al., 1990, número de acesso genBank: A60725) (Figura 26). A terceira sonda utilizada para localizar os genes de biossíntese de espiramicina foi um enxerto de aproximadamente 1.8kb, compreendendo o gene srmD.

Essas três sondas foram utilizadas para hibridar o banco de DNA genômico descrito acima e permitiram escolher dois cosmídeos (pSPM7 e pSPM5) capazes de conter os enxertos os mais longos e não tendo faixas comuns. O cosmídeo pSMP5 se hibridizava com a primeira e a segunda sondas, mas não se hibridizava com a terceira sonda, enquanto que o cosmídeo pSPM7 se hibridizava com a terceira sonda somente. Esses dois cosmídeos foram seqüenciados na totalidade pela técnica da seqüenci-ação às cegas ("shotgun sequencing"). As seqüências dos enxertos desses dois cosmídeos: pSPM7 e pSPM5 puderam ser ligados, pois embora não se sobrepondo, cada um dos enxertos compreendia uma seqüência conhecida em uma de suas extremidades. Com efeito, cada um desses enxertos comportava um fragmento da seqüência de um dos genes codificando uma enzima denominada "polyketide synthase" (PKS). Esses 5 genes foram clona-dos por Burgett S. et al. em 1996 (Patente americana US 5.945.320) (conforme Figura 2). Assim, pôde ser determinado uma seqüência única de DNA genômico de S.ambofadens. Uma seqüência de 30943 nucleotídeos partindo, em 5’, de um sítio EcoRI situado no primeiro gene PKS e que vai até um sítio BAMHI em 3’é apresentada em SEQ ID N° 1. Essa seqüência corresponde à região a montante dos genes da PKS (conforme Figura 2 e 3). Uma segunda região de 11171 nucleotídeos, partindo de um sítio Pstl em 5’e indo até um sítio BstEII em 3’ situado no quinto gene da PKS é apresentada em SEQ ID N° 2. Essa região é a região a jusante dos genes da PKS (a jusante e a montante definidos pela orientação dos 5 genes de PKS todos orientados no mesmo sentido) (conforme Figuras 2 e 3).

Em uma terceira etapa e com a finalidade de clonar outros genes implicados na biossíntese das espiramicinas, outros cosmídeos que comportam fragmentos do genoma de S.ambofaciens nessa mesma região foram isolados (conforme exemplo 18 e 19). EXEMPLO 1: Construção de um banco de DNA genômico da cepa ATCC23877 de streptomyces ambofaciens em E.Coli 1.1. Extração do DNA genômico da cepa ATCC23877 de streptomyces ambofaciens. A cepa ATCC23877 de streptomyces ambofaciens (acessível notadamente junto à Amer ican Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, Virginie, USA), sob o número 23877, foi cultivada em meio YEME (Yeast Extract-Malt Extract) (Kieser, T., et al., 2000) e o DNA genômico dessa cepa foi extraído e purificado segundo as técnicas padrões de lise e precipitação (Kieser Τ . et al., 2000). 1.2. Construção do banco de DNA genômico O DNA genômico da cepa ATCC23877 de streptomyces ambo-faciens \a\ como isolado acima foi digerido parcialmente pela enzima de restrição BamH de maneira a serem obtidos fragmentos de DNA de tamanho compreendido entre aproximadamente 35 e 45 kb. Esse fragmentos foram clonados no cosmídeo pWED1 (Gournelen et al., 1998) digerido previamente por BamHI. O cosmídeo pWED1 é derivado do cosmídeo pWE15 (Wahl, et al., 1987) por deleção do fragmento Hpal-Hpal de 4.1 kb contendo o módulo de expressão ativo nos mamíferos (Gourmelen et al., 1998). A mistura de ligação foi em seguida encapsidada in vitro em partículas de fagos lambda graças ao sisteam "Pacotene® Lambda DNA packaging system" comercializado pela sociedade Promega, segundo recomendações do fabricante. As partículas fágicas obtidas foram utilizadas para infectar a cepa SURE® de E.coli comercializada pela sociedade Stratagene (LaJolla, Califórnia, USA). A seleção dos clones foi feita sobre meio LB + ampicilina (50 pg/ml), já que o cosmídeo pWED1 confere a resistência à ampicilina. EXEMPLO 2: isolamento e caracterização de genes implicados na biossínte-se de espiramicinas em streptomyces ambofaciens 2.1 Hibridização sobre coluna dos clones de E.coli do banco genômico de streptomyces ambofaciens ATCC23877 Aproximadamente 2000 clones de E.coli do banco obtido acima foram transferidos sobre filtro para hibridização sobre colônias. A sonda utilizada para a hibridização é um fragmento Nael-Nael de DNA (SEQ ID N° 86), comportando uma parte do gene tylB de streptomyces fradiae. Esse fragmento corresponde aos nucleotídeos 2663 a 3702 do fragmento de DNA descrito por Merson-Davies, L.A. & Cundliffe E. (Merson-Davies, L.A. & Cun-dliffe E., 1994, número de acesso genBank: U08223), no qual a seqüência codificante do gene tylB corresponde aos nucleotídeos 2677 a 3843. O fragmento Nael-Nael de DNA portando uma parte do gene TylB de streptomyces fradiae (SEQ ID N° 86( foi marcada com 32P pela técnica do "random piming” (Kit comercializado pela sociedade Roche) e utili- zado como sonda para a hibridização dos 2000 clones do banco, transferidos sobre filtro. As memebranas utilizadas são memebranas nylon Hybond N comercializados pela sociedade Amersham (Amersham Biosciences, Orsay, França) e a hibridização foi feita a 55°C no tampão descrito por Church & Gilbert )Church & Gilbert, 1984). Uma lavagem foi feita em 2XSSC a 55°C, durante 15 minutos e duas lavagens sucessivas em 0.5X SSC foram em seguida efetuados a 55°C, com uma duração de 15 minutos cada uma. Nessas condições de hibridização e de lavagem, 4 clones dentre os 2000 hibridados apresentavam um forte sinal de hibridização. Esses 4 clones foram cultivados em meio LB+ ampicilina (50 pg/ml) e os 4 cosmídeos correspondentes foram extraídos por lise alcalina padrão (Sambrook et al., 1989). Foi em seguida verificado que a hibridização era bem devido a um fragmento de DNA presente no enxerto desses quatro cosmídeos. Para isso, os cosmídeos foram digeridos independentemente por várias enzimas (BamHI, Pstl e Saci). Os produtos de digestões foram separados sobre gel de agarose, transferidos sobre membrana Nylon e hibridados pelo fragmento Nael-Nael de DNA comportando uma parte do gene tylB de streptomyces fradiae (conforme acima) nas mesmas condições que acima. Os quatro cosmídeos puderam ser validados e um desses cosmídeos foi mais particularmente retido e foi nomeado pOS49.1. 2.2 Verificação da implicação da região identificada e seqüenciação do enxerto do cosmídeo pOS49.1 Vários fragmentos do enxerto do cosmídeo pOS49.1 foram sub-clonados e suas seqüências foram determinadas. O cosmídeo pOS49.1 foi digerido pela enzima Saci e foi mostrado por Southern blot, nas condições descritas anteriormente, que um fragmento de 3,3 kb contém a região que se hibrida com a sonda tylB. Esse fragmento de 3,3 kb foi isolado por eletroe-leução a partir de um gel de agarose 0,8%, depois clonado no vetor pUC19 (número de acesso GenBank M77789) e seqüenciado. O plasmídeo assim obtido foi denominado pOS49.11. Quatro fase abertas de leitura que apresentam um uso de códons típico de streptomyces puderam ser identificadas nesse fragmento (duas completas e duas truncadas), graças ao programa FramePlot (Ishikawa J & Hotta K., 1999). Comparações de seqüências graças ao programa FASTA (conforme (Pearson W.R & D.J. Lipman, 1988) e (Pearson W.R., 1990), acessível notadamente junto ao centro de pesquisas INFOBIOGEN, Evry, França) permitiram mostrar que a proteína deduzida de uma dessas 4 fases abertas de leitura apresenta fortes similitude de se-qüência com a proteína TylB (SEQ ID N° 87; Número de acesso GenBank: U08223) de S.fradiae (conforme Figura 25). Essa proteína foi denominada Orf3 (SEQ ID N° 29).

Com a finalidade de testar se o gene correspondente (o gene orf3 (SEQ ID N° 28)) era implicado na biossíntese das espiramicinas em S. ambofaciens, esse gene foi interrompido por umo cassette Ω hyg (Blon-delet-Rouault M-H. et al., 1997, número de acesso GenBank: X99315). Para isso, o plasmídeo pOS49.11 foi digerido pela enzima Xhol e o fragmento contendo as quatro fases abertas de leitura (duas completas e duas truncadas, das quais orf3 em inteiro) foi subclonado ao nível do sítio Xhol do vetor pBC SK + comercializado pela sociedade Stratagene (LaJolla, Califórnia, USA). O plasmídeo assim obtido foi denominado pOS49.12. Com a finalidade de inativar orf3, um fragmento PmlI-BstEII interno em orf3 foi substituído pelo cassette Qhyg por clonagem extremidade livre nesse último plasmídeo. Para isso, o plasmídeo pOS49.12 foi digerido pelas enzimas Pmll e BstEII cujo sítio único se acha na seqüência codificante do gene orf3. As extremidades do fragmento correspondente ao vetor foram extremidades livres por um tratamento pela enzima de Klenow (grande fragmento da DNA polimera-se I). O cassette Qhyg foi obtida por digestão pela enzima BamHI do plasmídeo pHP45 Qhyg (Blondelet-Rouault et al., 1997, número de acesso GenBank: X99315). O fragmento correspondente à cassette Qhyg foi recuperado sobre gel de agarose e suas extremidades foram tornadas extremidades livres por um tratamento pela enzima de Klenow. Os dois fragmentos extremidades livres assimobtidos (o cassette Qhyg e o plasmídeo pOS49.12) foram ligados e o produto de ligação foi utilizado para a transformação de bactérias E.coli. O plasmídeo assim obtido foi denominado pOS49.14 e contém o gene orf3 interrompido pelo cassette Qhyg. O enxerto do plasmídeo pOS49.14, sob a forma de um fragmento Xhol-Xhol, cujas extremidades foram tomadas não coesivas por um tratamento pela enzima de Klenow, foi clonado ao nível do sítio EcoRV do plasmídeo pOJ260 (o plasmídeo pOJ260 é um plasmídeo conjugativo capaz de se replicar em E.Coli, mas incapaz de se replicar em S.ambofaciens (Bierman, M. et ai.., 1992). Esse plasmídeo confere a resistência à apramici-na em E. Coli et streptomyces). O plasmídeo obtido (enxerto do plasmídeo pOS49.14 clonado no plasmídeo pOJ260) foi denominado pOS49.16. Este foi transferido na cepa ATCC23877 de S.ambofaciens por conjugação como auxílio da cepa conjugativa E.coli S17-1, conforme descrito por Mazodier et al., (Mazodier et al., 1989). A cepa E.coli S17-1 é derivada da cepa E.coli 294 (Simon et al., 1983) (Simon, et al., 1986). Clones transconjugantes que possuem o marcador de resistência à higromicina portadopelo cassette Dhyg e que perdeu o marcador de resistência à apramicina portadopelo vetor pOJ260 puderam ser obtidos. Para isso, após conjugação, os clones selecionados por sua resistência à hidromicina. Os clones resistentes à higromicina são em seguida repicados respectivamente sobre meio com higromicina (antibiótico B) se sobre meio com apramicina (antibiótico B) e sobre meio com apramicin (antibiótico A) (conforme Figura 9). Os clones resistentes à higromicina (HygR) e sensíveis à apramicina (ApraS) são em princípio aqueles em que um duplo acontecimento de recombinação se produziu e que possuem, portanto, o gene orf3 interrompido pelo cassette Ohyg. A substituição da cópia primitiva de orf3 pela cópia interrompida foi verificada por duas hibridizações sucessivas. Assim, o DNA total dos clones obtidos foi digerido por diferentes enzimas, separado sobre gel de agarose, transferido sobre membrana e hibridizado com uma sonda correspondente à cassette Ωί^ (conforme acima) para verificar a presença do cassette no DNA genô-mico dos clones obtidos. Uma segunda hibridização foi feita, utilizando-se como sonda o enxerto Xhol-Xhol do plasmídeo pOS49.11 contendo as quatro fases abertas de leitura (duas completas e duas truncadas, das quais orf3 por completo). A verificação do genótipo pode também ser realizado por qualquer método conhecido do técnico e notadamente por PCR, utilizando oligonucleotídeos apropriados e seqüenciação do produto de PCR. Um dos clones orf3:: Ohyg assim obtido e cujo genótípo foi verificado, foi escolhido e denominado OS49.16. A produção em espiramicina do clone OS49.16 assim obtido foi testada, graças ao teste de produção descrito mais abaixo (conforme exemplo 15). Pôde assim ser demonstrado que essa cepa não produz mais espiramicina, confirmando a implicação de orf3 e/ou genes situados a jusante como, por exemplo orf4, na biossíntese das espiramicinas.

Uma vez essa confirmação obtida, uma região maior do cosmí-deo pOS49.1 foi seqüenciada, de ambos os lados do fragmento Saci anteriormente estudado. Assim, a partir do cosmídeo pOS49.1, a sequência de uma região que comporta sete fases abertas de leitura completas e duas outras incompletas, situadas de ambos os lados dessas sete fases abertas completas, pôde ser obtida. Graças a uma pesquisa nas bases de dados, pôde ser mostrado que uma das fases abertas de leitura incompleta correspondia ao locus srmG (região codificando uma enzima denominada "polyke-tide synthase"(PKS)). Os genes correspondentes foram clonadas por Burgett S. et al., em 1996 (Patente americana US 5.945.320). Por outro lado, as outras fases abertas de leitura: as sete ORFs completas denominadas: orf1, orf2, orf3, orf4, orf5, orf6, orf7 (SEQ ID N° 23, 25, 28, 30, 34, 36 e 40) e o começo da oitava ORF denominada orf8 (a seqüência completa dessa orf é dada em SEQ ID N° 43) não foram encontradas nas bases de dados. EXEMPLO 3: isolamento e caracterização de outros genes implicados na biossíntese de espiramicinas nas streptomyces ambofaciens Em uma segunda etapa e com a finalidade de clonar outros genes implicados na biossíntese das espiramicinas, outros cosmídeos que comportam fragmentos do genoma de S.ambofaciens nessa mesma região foram isolados. Para isso, procedeu-se a uma nova série de hibridizações sobre colônias, utilizando três sondas: - a primeira sonda utilizada corresponde a um fragmento de DNA BamHI-Pstl de 3,7kb, contendo um fragmento do gene da PKS (Os genes correspondentes à PKS foram clonados por Burgett Set al., em 1996 (Pa- tente americana US 5.945.320), orf1, orf2 e o começo de orf3, subclonado a partir de pOS49.1 e que vai de um locai BamHl situado 1300 pares de bases a montante do sítio EcoRI definindo a posição 1 de SEQ ID N° 1, até o loacl Pstl situado em posições 2472 (SEQ ID N° 1). Esse fragmento BamHI-Pstl foi subclonado a partir de pOS49.1 no plasmídeo pBC SK+, o que permitiu obter o plasmídeo pOS49.28; - a segunda sonda utilizada corresponde a um fragmento de DNA Pstl-BamHI de aproximadamente 2kb, contendo um fragmento de orf7 e de orf8, subclonado a partir de pOS49.1 e que vai de um sítio Pstl situado em posição 6693 de SEQ ID N° 1 até o sítio BamHl situado em posição 8714 de SEQ ID N° 1. Esse fragmento Pstl-BamHI foi subclonado a partir de pOS49.1 no plasmídeo pBC SK+, que permitiu obter o plasmídeo pOS49.76; - uma terceira sonda foi também utilizada. Esta corresponde a um fragmento de DNA de 1.8kb EcoRI-Hindlll contendo o gene srmD. O gene srmD é um gene isolado de S.ambofaciens capaz de conferir a resistência à espiramicina. Com efeito, trabalhos anteriores permitiram a clonagem de vários determinantes de resistência de S.ambofaciens, conferindo a resistência à espiramicina a uma cepa de S. griseofuscus (cepa sensível à espiramicina) (Pernodet et al., 1993) (Pernodet et al., 1999). Para isolar genes de resistência, um banco cosmídico do DNA genômico da cepa S.ambofaciens ATCC23877 fora realizada no cosmídeo pKC505 (Ri-chardson MA et al., 1987). Para isso o DNA genômico da cepa S.ambofaciens ATCC23877 fora digerido parcialmente por Sau3AI, de maneira a serem obtidos fragmentos de tamanho compreendido entre aproximadamente 30 e 40 kb. O DNA genômico assim digerido (3 pg) fora ligado com 1 pg do pKC505 previamente digerido pela enzima BamHl (pernodet et al., 1999). A mistura de ligação fora em seguida encapsidado in vitro em partículas fágicas. As partícuals fágicas obtidas foram utilizadas para infectar a cepa de E.coli HB101 (acessível notadamente junto ao American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, Virginie, USA), sob o número 33694). Aproximadamente 20000 clones de E.coli resistente à apramicina foram reunidos e os cosmídeo desses clones foram extraídos. Esse "pool" de cosmí- deos foi introduzido por transformação de protoplastos na cepa DSM 10191 de S. griseofuscus (Cox KL & Baltz RH, 1984), naturalmente junto à German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ), (Braunschwieg, Alemanha), sob o número DSM 10191). Os transformadores foram selecionados sobre um meio contendo a apramicina. 1300 dos clones que crescem sobre o meio que contém a apramicina foram transferidos sobre o meio que contém 5 μg/ml de espiramicina. Vários clones resistentes à apramicina cresceram também sobre o meio que contém a espiramicina e os cosmídeos dessas colônias foram extraídos e utilizados para transformar E.coli e S.griseofuscus (Pernodet et al,, 1999). Cinco cosmídeos capazes de conferir a resistência à apramicina em E.coli e a co-resistência à apramicina e a espiramicina nas S. griseofuscus foram assim obtidos. Dentre esses 5 cosmídeos, foi determinado que um cosmídeo denominado pOS44.1 possui em seu enxerto um gene (SEQ ID N° 15) que codifica uma proteína (SEQ ID N° 16) que apresenta uma certa similitude com uma proteína codificada pelo gene mdmA de streptomyces mycarofaciens (SEQ ID N° 88), esse gene foi denominado srmD (conforme alinhamento apresentado na Figura 26 realizado graças ao programa FASTA (conforme (Pearson W.R. & D.J. Lipman, 1988) e (Pearson W.R., 1990), acessíveis notadamente junto ao centro de pesquisas INFOBIOGEN, Evry, França).

Para isolar o determinante de resistência contido no plasmídeo pOS44.1, este foi digerido parcialmente pela enzima de restrição Sau3AI, de maneira a serem obtidos fragmentos do tamanho de aproximadamente 1,5 a 3 kb, esses fragmentos foram ligados no vetor PIJ486 linearizado pela enzima BamHI (Ward et al., 1986). Um plasmídeo foi selecionado por sua capacidade de conferir a resistência a espiramicina na cepa DSM 10191 de S.griseofuscus (Rao RN et al., 1987), naturalmente sensível à espiramicina (conformeacima). Para isso, o "pool" de plasmídeos correspondentes aos fragmentos Sau3AI de pOS44.1 ligados no vetor plJ486 (conforme acima), foi introduzido por transformação de protoplastos na cepa DSM 10191 e os transformadores foram selecionados por sua resistência ao tiostrepton (devi- do ao gene tsr portado por plJ486). Os clones que cresceram no meio que contém o tiostrepton foram transferidos sobre o meio que contém a espira-micina. Vários clones resistentes ao tiostrepton cresceram também sobre meio que contém a espiramicina e os plasmídeos dessas colônias foram extraídos. Um plasmídeo que confere a resistência e que contém um enxerto de próxima 1.8 kb foi selecionado e denominado pOS44.2. Esse enxerto de 1.8 kb pode ser tirado facilmente , graças a um sítio Hindlll e um sítio EcoRI presentes no vetor de ambos os lados do enxerto. Esse enxerto de 1.8kb Hindlll-EcoRI foi seqüenciado e o gene de resistência que ele contém foi denominado srmD. Esse fragmento que contém o gene srmD pôde assim ser facilmente subclonado no vetor pUC19 (número de acesso GenBank M77789) aberto por EcoRI-Hindlll, o plasmídeo obtido foi denominado pOS44.4. O enxerto de 1,8kb Hindlll-EcoRI, contendo o gene srmD, desse plasmídeo foi utilizado como sonda para localizar os genes de biossíntese de espiramicina (conforme abaixo).

Uma amostra de uma cepa Escherichia Coli DH5alfa contendo o plasmídeo pOS44.4 foi depositado junto à Collection Nationale de Cultures de microorganismos (CNCM) Institut pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, 10 de julho de 2002 sob o número de registro 1-2918.

Aproximadamente 2000 clones do banco, obtidos acima (conforme exemplo 1) foram transferidos sobre filtro para hibridização sobre colônias segundo as técnicas clássicas (Sambrook et al., 1989).

As três sondas descritas acima foram marcadas com 32P pela técnica do "random priming" (Kit comercializado por Roche) e utilizadas para a hibridização foi feita a 65°C no tampão descrito por Church & Gilbert (Church & Gilbert, 1984). Uma lavagem foi feita em 2XSSC a 65°C durante 15 minutos e duas lavagens sucessivas foram em seguida feitas em 0,5 X SSC a 65°C, de uma duração de 15 minutos cada uma. Nessas condições de hibridização e de lavagem, 16 clones dentre os 2000 hibridados apresentavam um, forte sinal de hibridização com pelo menos uma das sondas. Todavia, nenhum cosmídeo não era hibridizado com as três sondas. Os 16 cosmídeos foram extraídos e digeridos pela enzima de restrição BamHI. A comparação dos perfis de restrição desses diferentes cosmídeos entre si levou a escolher dois cosmídeo capazes de conter os enxertos os mais longos da região e não tendo faixas comuns. Assim, dois cosmídeos um denominado pSPM5 e o outro pSPM7 foram escolhidos. O cosmídeo pSPM5 se hibridizava com as sondas orfl a orf4 e a sonda orf8, mas não se hibridizava com a sonda srmD. pSPM7 se hibridizava somente com a sonda srmD e não com as duas outras sondas.

Esses dois cosmídeos forams seqüenciados na totalidade pela técnica de seqüenciação às cegas ("shotgun sequencing"). As seqüências dos enxertos desses dois cosmídeos: pSPM7 e pSPM5 puderam ser ligadas, pois embora não se sobreponham, cada um dos enxertos compreendia uma seqüência conhecida de um dos genes que codificam uma enzima denominada "polyketide synthase”, (PKS). Esses 5 genes foram clonados por Bur-gett S. et al. em 1996 (Patente US 5.945.320) (Conforme Figura 2). Assim, pôde ser determinado uma seqüência única de DNA genômico de S.ambofaciens. Uma seqüência de 30943 nucleotídeos partindo em 5’ de um sítio EcoRI situado no primeiro gene PK5 e indo até um sítio BamHI em 3’ é apresentada em SEQ ID N° 1. Essa seqüência corresponde à região a montante dos genes da PKS (conforme Figura 2 e 3). Uma segunda região de 11171 nucleotídeos, partindo de um sítio Pstl em 5’ e que vai até um sítio Ncol em 3’ situado no quinto gene da PKS é apresentada em SEQ ID N° 2. Essa segunda região é a região a jusante dos genes da PKS (a jusante e a montante sendo definido pela orientação dos 5 genes de pKS todos orientados no mesmo sentido) (Conforme Figuras 2 e 3). EXEMPLO 4: análise das seqüências nucleotídicas, determinação das fases abertas de leitura e caracterização dos genes implicados na biossíntese das espiramicinas.

As seqüências obtidas foram analisadas graças ao programa FramePlot (Ishikawa J & Hotta K. 1999). Isto permitiu identificar, dentre as fases abertas de leitura as fases abertas de leitura que apresentam um uso dos códons típico de streptomyces. Essa análise permitir determinar que essa região comporta 35 ORFs localizadas de ambos os lados de cinco gene que codificam a enzima "polyketide synthase” (PKS). Respectivamente 10 e 25 ORFs foram identificadas a jusante e a montante desses genes (a jusante e a montante sendo definidos pela orientação dos 5 genes de PKS todos orientados no mesmo sentido) (conforme Figura 3). Assim, as 25 fases abertas de leitura desse tipo, ocupando uma região de aproximadamente 31 kb (SEQ ID N° 1 e Figura 3) foram identificadas a montante dos 5 genes codificando a PKS e 10 ocupando uma região de aproximadamente 11,1 kb (SEQ ID N° 2 e Figura 3) foram identificadas a jusante dos genes da PKS.

Os genes da região a montante foram denominados orfl, orfl, οφ, orf4, οφ, orfS, orfl, orf8, orf9c, orflO, orfllc, orfl2, orfl3c, orfl4, orfl5c, orfl6, orfl 7, orfl8, orfl9, orflO, orfllc, orfllc, orf23c, orfl4c e orflSc (SEQ ID N° 23, 25, 28, 30, 34, 36, 40, 43, 45, 47, 49, 53, 60, 62, 64, 66, 68, 70,72, 74, 76, 78, 80, 82 e 84).

Os genes da região a jusante foram denominados orfl*c, orfl*c, otf3*c, orf4*c, οφ* οφ* orf7*c, orf8* οφ* <w#0*(SEQ ID N° 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 e 21). O "c" acrescentado ao nome do gene significando para a ORF em questão que a sequência codificante está na orientação inversa (o filamento codifi-cante é, portanto, o filamento complementar da sequência dada em SEQ ID N° 1 ou SEQ ID N° 2 para esses genes) (conforme Figura 3).

As seqüências protéicas deduzidas dessas fases abertas de leitura foram comparadas com aquelas presentes em diferentes bases de dados graças a diferentes programas: BLAST (Altschul et al., 1990) (Altschul et al., 1997), CD-search, COGs (Cluster of Orthologous Groups) (esses três programas são acessíveis notadamente junto ao National Center for Biote-chnology Information (NCBI) (Bethesda, Maryland, USA), FASTA (Pearson W.R & D.J. Lipman, 1988) e (Pearson W.R., 1990), BEAUTY (Worley K.C. et al., 1995), (esses dois programas são acessíveis notadamente junto ao centro de pesquisas INFOBIOGEN, Evry, França). Essas comparações permitiram formular hipóteses sobre a função dos produtos desses genes e identificar aqueles capazes de serem implicados na biossíntese de espiramicina. EXEMPLO 5: inativação de gene: princípio da construção de uma cepa de streptomyces ambofaciens interrompida Os métodos aplicados consistem em efetuar uma substituição de gene. O gene alvo a interromper é substituído por uma cópia desse gene interrompida por uma cassette, conferindo a resistência a um antibiótico (por exemplo, a apramicina ou a higromicina), conforme ilustrado na Figura 9. As cassettes utilizadas são contornadas de ambos os lados por códons de terminação da tradução em todas as fases de leitura e por terminadores de transcrição ativos nas streptomyces. A inserção do cassette no gene alvo pode ser acompanhada ou não de uma deleção nesse gene alvo. O tamanho das regiões que contornam o cassette pode ir de algumas centenas a vários milhares de pares de bases.

As construções necessárias à inativação do gene pelo cassette foram obtidas em E. coli, organismo de referência para a obtenção de construções de DNA recombinante. O gene interrompido foi obtido em um plas-mídeo que se replica em E. coli, mas não podendo se replicar nas streptomyces.

As construções foram em seguida subclonados em vetores para permitir a transformação e a inativação do gene desejado nas S. ambofaciens. Para isso, dois plasmídeos foram utilizados: . pOJ260 (Bierman M. et al., 1992) (conforme exemplo 2) que confere a resistência à apramicina nas E. coli e streptomyces e que foi empregado, quando o gene alvo foi interrompido por umo cassette que confere a resistência à higromicina. . pOSK 1205 (4726pb). Esse plasmídeo deriva do plasmídeo pBK-CMV (comercializado pela sociedade Stratagene (LaJolla, Califórnia, USA), no qual um fragmento Avrll contendo a seqüência que codifica resistência à Neomicina/Canamicina foi substituída por uma seqüência que codifica a resistência à higromicina, conservando o promotor P SV40. Para isso, o plasmídeo pHP45-Qhyg (Blondelet-Rouault et al., 1997) foi digerido pelas enzimas Notl e Pflml e o fragmento conferindo a resistência à higromicina foi subclonado ao nível do sítio Avrll do vetor pBK-CMV, depois que todas as extremidades tenham sido tornadas extremidade livre por tratamento com enzima de Klenow. Em pOSK1205, o cassette que confere a resistência à hi-gromicina é precedida do promotor pSV40. Esse plasmídeo confere a resistência à higromicina em E. coli e streptomyces e foi empregado quando gene alvo foi interrompido por umo cassette que confere a resistência à apramicina.

As cassettes foram introduzidas no gene alvo seja por clonagem, utilizando sítios de restrição presentes no gene alvo, seja por recombinação entre curtas seqüências idênticas conforme descrito,por exemplo, por Cha-veroche et al (Chaveroche MK et al., 2000). O plasmídeo que porta o gene interrompido pelo cassette pode sem ser introduzido nas streptomyces ambofaciens, por exemplo por conjugação entre E. coli e streptomyces (Mazodier P. et al., 1989). Essa técnica foi utilizada no caso de o vetor de base ser o vetor pOJ260. Uma segunda técnica pode ser aplicada: a técnica da transformação de protoplastos após desnaturação por tratamento alcalino do DNA (kieser, T. et al., 2000), para aumentar a freqüência de recombinação conforme descrito, por exemplo, por Oh & Chater (Oh & Chater, 1997). Essa técnica foi utilizada no caso de o vetor de base ser pOJ260 ou pOSK1205 (conforme abaixo). Os transformadores são selecionados com o antibiótico correspondente à cassette presente no gene alvo (conforme Figura 9, antibiótico B). Seleciona-se assim uma mistura de clones dentre os quais houve integração por um só ou por dois acontecimentos de recombinação. Em uma segunda etapa, buscam-se os clones sensíveis ao antibiótico para o qual o gene de resistência está presente no vetor (fora do cassette de recombinação) (conforme Figura 9, antibiótico A). Podem-se assim selecionar os clones para os quais houve em princípio dois acontecimentos de recombinação que chegam à substituição do gene selvagem pela cópia interrompida pela cassette. Essas etapas foram esquematizadas na Figura 9. Várias cassettes podem ser utilizadas para a interrupção dos genes alvos. Pode-se, por exemplo, utilizar o cassette Qhyg que confere a resistência à higromicina (Blondelet-Rouault et al., 1997, número de acesso GenBank: X99315). EXEMPLO 6: construção de uma cepa de streptomyces ambofaciens interrompida em fase no gene orf3 O gene orf3 fora interrompido pelo cassette Qhyg (conforme exemplo 2.2) e pôde ser demonstrado que uma cepa orf3::Qhyg não produz mais espiramicina, confirmando a implicação de um ou vários genes da região clonada na biossíntese das espiramicinas (conforme exemplo 2.2). Considerando-se a sua orientação, uma cotranscrição das ORFs 1 a 7 é provável (conforme Figura 3) e o fenótipo observado (não-produtor de espiramicinas) pode ser devido à inativação de um ou vários genes co-transcritos com orf3. Para confirmar a implicação de orf3 na biossíntese de espiramicinas, uma nova inativação do gene orf3 foi feita, está sendo realizada em fase. Para isso, um fragmento Dralll interno à orf3 de 504 pares de bases foi de-letado. Um fragmento de DNA obtido a partir de pOS49.1, indo do sítio Eco-Rl situado em posição 1 (SEQ ID N° 1) até o sítio SaCI situado em posição 5274 (SEQ ID N° 1) e que comporta uma deleção entre os dois sítios Dralll nas posições 2563 e 3067 (504 nucleotídeos retirados) foi clonado no plas-mídeo pOJ260 (Bierman M. et al., 1992). O plasmídeo assim obtido foi denominado pOS49.67. O enxerto de pOS49.67 é, portanto, constituído por um fragmento de DNA de S. ambofaciens contendo os genes orf1, orf2, orf3 com a deleção em fase, orf4 e uma parte de orf5. O vetor no qual esse enxerto foi subclonado é pOJ260, o plasmídeo pOS49.67 confere portanto a resistência à apramicina e foi introduzido por transformação de protoplastos na cepa OS49.16 (conforme exemplo 2). A cepa OS49.16 sendo resistente à higro-micina, transformadores hygR e apraR foram obtidos. Após duas passagens desses clones sobre meio não seletivo, os clones sensíveis à apramicina e à higromicina (apraS e hygS) foram buscados. Em certos desses clones, se espera com efeito que um acontecimento de recombinação entre seqüências homólogas leva à substituição da cópia de orf3 interrompida pelo cassette Qhyg (contido no genoma da cepa OS49.16) pela cópia de orf3 com a deleção em fase presente sobre o vetor. Os clones resultantes dessa recombinação são esperados como apraS e hygS, após a eliminação das seqüên- cias do vetor. O genótipo das cepas assim obtidas pode ser verificado por hibridização ou por PCR e seqüenciação do produto de PCR (para verificar que só uma cópia de orf3 deletada em fase está presente no genoma dos clones obtidos). Clones que não têm a cópia de orf3 com uma deleção em fase foram assim obtidos e seu genótipo foi verificado. Um clone que apresenta as características buscadas foi mais particularmente selecionado e foi chamado OS49.67.

Uma amostra da cepa OS49.67 foi depositada junto à Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Instituí Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, aos 10 de julho de 2002 sob o número de registro 1-2916. EXEMPLO 7: construção de uma cepa de streptomyces ambofaciens interrompida no gene orf8.

Para realizar a inativação do gene orf8, uma construção na qual o cassette Qhyg foi introduzida na seqüência codificante de orf8 foi obtida. Para isto, o plasmídeo pOS49.88 foi inicialmente construído. O plasmídeo pOS49.88 é derivado do plasmídeo pUC19 (número de acesso GenBank M77789) por inserção de um fragmento de 3.7 kb (fragmento Pstl-EcoRI obtido a partir do cosmídeo pSPM5), contendo o fim de orf7, orf8 e o começo de orf9, clonado nos sítios Pstl-Eco RI de pUC19. O cassette ííhyg (sob a forma de um fragmento BamHI, tornado extremidade livre por tratamento à enzima de Klenow) foi clonada ao nível do sítio único Sall de pOS49.88 situado em orf8, depois que todas as extremidades tenham sido tornadas extremidade livre por tratamento à enzima de Klenow. A clonagem sendo extremidade livre, dois tipos de plasmídeos foram obtidos, segundo o sentido de inserção da cassette: pOS49.106 no qual os genes hyg e orf8 estão na mesma orientação e pOS49.120 no qual os genes hyg e orf8 estão nas orientações opostas. O enxerto do plasmídeo pOS49.106 foi em seguida subclonado no plasmídeo pOJ260 para dar pOS49.107. Para isso, o plasmídeo pOS49.106 foi digerido pela enzima Asp7181 e as extremidades foram tornadas extremidade livre por tratamento com enzima de Klenow, esse produto de digestão foi redigerido pela enzima Pstl e o fragmento contendo o gene orf8 no qual o cassette Ohyg foi inserida, foi clonado no vetor pOJ260 (conforme acima). Para isso, o vetor pOJ260 foi digerido pelas enzimas EcoRV e Pstl e utilizado para a ligação. Essa manipulação permite, portanto, obter uma ligação orientada, já que cada um dos dois fragmentos é extremidade livre de um lado e Pstl do outro. O plasmídeo obtido foi chamado pOS49.107. O plasmídeo pOS49.107 foi introduzido na cepa ATCC23877 de S.ambofaciens por transformação de protoplastos (Kieser, T. et al., 2000). Após transformação dos protoplastos, os clones são selecionados por sua resistência à higromicina. Os clones resistentes à higromicina são em seguida repicados respectivamente sobre meio com higromicina (antibiótico B) e sobre meio com apramicina (antibiótico A) (conforme Figura 9). Os clones resistentes à higromicina (HygR) e sensíveis à apramicina (ApraS) são em princípio aqueles nos quais um duplo acontecimento de cruzamento se produziu e que possuem o gene orf8 interrompido pelo cassette Ohyg. A substituição da cópia primitiva de orf8 pela cópia interrompida pelo cassette Qhyg foi verificada por Southern Blot. Assim, o DNA total dos clones obtidos, foi digerido por várias enzimas, separado sobre gel de agarose, transferido sobre membrana e hibridizado com uma sonda correspondente à cassette -nhyg para verificar a presença do cassette no DNA genômico dos clones obtidos. Uma segunda hibridização foi feita utilizando-se como sonda o enxerto Pstl-EcoRI, contendo o fim de orf7, orf8 e o começo de orf9 de um tamanho de aproximadamente 3,7 kb do plasmídeo pOS49.88. A verificação do genótipo pode ser realizada por qualquer método conhecido do técnico e notadamente por PCR, utilizando os oligonucleotídeos apropriados e se-qüenciação do produto de PCR.

Um clone orf8::Qhyg foi escolhido e denominado OS49.107. Uma amostra da cepa OS49.107 foi depositado junto à Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteir, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, aos 10 de julho de 2002, sob o número de registro 1-2917. EXEMPLO 8: Construção de uma cepa de streptomyces ambofaciens inter- rompida no gene orf10 Um fragmento de DNA de 1,5 kb interno ao gene orf10 foi obtido por pCR, utilizando como matriz, o DNA genômico de S.ambofaciens e as seguintes atrações: SRMRl 5' CTGCCAGTCCTCTCCCAGCAGTACG 3' (SEQ ID H« 89) SRMR2 : 5' TGAAGCTGGACGTCTCCTA.CGTCGG 3' (SEQ XD N“ 90) Esse fragmento de DNA proveniente da PCR foi clonado no vetor pCR2.1 comercializado pela sociedade Invitrogen (Carlsbad, Califórnia, USA). O plasmídeo assim obtido foi denominado pOS49.32. O cassette Qhyg (sob a forma de um fragmento BamHI, conforme acima) foi clonada ao nível do sítio único BstEII interno ao fragmento do gene orf10, depois que todas as extremidades tenham sido tornadas extremidade livre por tratamento com a enzima de Klenow. A clonagem sendo extremidade livre, dois tipos de plasmídeos foram obtidos, segundo o sentido de inserção da cassette: pOS49.43 no qual os genes hyg e orf10 estão na mesma orientação e pOS49.44 no qual os genes hyg e orf10 estão em orientações opostas. O enxerto do plasmídeo pOS49,43 for transferido (sob a forma de um fragmento Asp7181-Xbal, cujas extremidades foram tornadas extremidade livre por tratamento com a enzima de Klenow) no sítio EcoRV do plasmídeo pOJ260, o que permitiu obter o plasmídeo pOS49.50. O plasmídeo pOS49.50 contendo o fragmento do gene orf10 interrompido pelo cassette Qhyg foi introduzido na cepa ATCC23877 de streptomyces ambofaciens. Após transformação, os clones são selecionados por sua resistência à hi-gromicina. Os clones resistentes à higromicína (antibiótico B) e sobre meio com apramicina (antibiótico A) (conforme Figura 9). Os clones resistenets à higromicína (HygR) e sensíveis à apramicina (Apras) são em princípio aqueles nos quais um duplo acontecimento de cruzamento ocorreu e que possuem o gene orf10 interrompido pelo cassette Qhyg. Clones que possuíam o gene orf10 interrompido pelo cassette Qhyg. Clones que possuíam o marcador de resistência à higromicína portado pelo cassette e que perderam o marcador de resistência à apramicina portado pelo vetor pOJ260 foram assim obtidos. O acontecimento de substituição da cópia primitiva de orflOpela cópia interrompida orf10:: -Qhyg foi verificado por Southern Blot. Assim, o DNA genômico total dos clones obtidos, foi digerido por várias enzimas, separado sobre gel de agarose, transferido sobre membrana e hibri-dizado com uma sonda correspondente à cassette Qhyg para verificara presença do cassette no DNA genômico dos clones obtidos. Uma segunda hi-bridização foi feita, utilizando como sonda o produto PCR de 1,5 kb interna ao gene orf10 (conforme acima).

Um clone que apresenta as características esperadas (orf10::Qhyg) foi mais particularmente selecionado e denominado OS49.50. Pôde, com efeito, ser verificado, graças às duas hibridizações, que o cassette Qhyg estava bem presente no genoma desse clone e que se obtém o perfil de digestão esperado no caso de uma substituição, após um duplo acontecimento de recombinação, do gene primitivo pela cópia interrompida pelo cassette nhyg no genoma desse clone. A verificação do genótipo pode também ser realizada por qualquer método conhecido do técnico e notada-mente por PCR, utilizando os oligonucleotídeos apropriados e seqüenciação do produto de PCR. EXEMPLO 9: inativação de genes: princípio da construção de uma cepa de streptomyces ambofaciens interrompida segundo a técnica dos "cassettes excisáveis" (conforme Figura 9 e 10) Um segundo tipo de cassettes pode ser utilizado para a inativação de genes: as cassettes ditas cassettes excisáveis. Essas cassettes apresentam a vantagem de poder ser excisadas nas streptomyces por um acontecimento de recombinação específica de sítio, após terem sido introduzidas no genoma de S.ambofaciens. A finalidade é de inativar certos genes em cepas de streptomyces, sem deixar na cepa final de marcadores de seleção ou de grandes seqüências de DNA que não pertencem à cepa. Após excisão subsiste unicamente uma curta seqüência de aproximadamente trinta pares de bases (denominada sítio "cicatriciar) no genoma da cepa (conforme Figura 10). A utilização desse sistema consiste, em uma primeira etapa, na substituição da cópia primitiva do gene alvo (graças a dois acontecimentos de recombinação homóloga, conforme Figura 9) por uma construção na qual umo cassette excisável foi inserida nesse gene alvo. A inserção d Esse cassette é acompanhada de uma deleção no gene alvo (conforme Figura 9). Em uma segunda etapa, a excisão do cassette excisável do genoma da cepa é provocada. O cassette excisável funciona graças a um sistema de recombinação específica de sítio e tem por vantagem permitir a obtenção de mu-tantes de streptomyces não portando finalmente gene de resistência. Fica-se também livre de eventuais efeitos polares sobre a expressão dos genes situados a jusante do(s) gene(s) inativado(s) (conforme Figura 10). O emprego de cassettes excisáveis foi descrito e utilizado em numerosos organismos cujas células de mamífero, de lêvedos e em E.coli (Bayleu et al., 1992; Brunelli et Pall, 1993; Camilli et al., 1994; Dale et Ow, 1991; Russel et al., 1992; Lakso et al., 1992). Esses cassettes excisáveis utilizam todas a recombinase específica de sítio Cre, agindo sobre os sítios lox. Esse sistema de recombinação provém do bacteriófago P1.

Para a construção de um sistema de tipo "cassette excisável" em streptomyces, foi tirado partido do sistema de recombinação específica de sítio descrito para o elemento genético móvel pSAM2 de streptomyces ambofaciens (Boccard et aí., 1989a e b). O sistema utilizado consiste em uma primeira etapa em construir um vetor recombinante que comporta o gene a interromper no qual é inserida umo cassette excisável. A inserção no gene alvo do cassette excisável é acompanhada de uma deleção no gene alvo. Ela pode ser realizada por clonagem, utilizando sítios de restrição presentes no gene alvo ou por recombinação entre curtas sequências idênticas conforme descrito por exemplo por Chaveroche et al. (Chaveroche MK et al., 2000). O cassette excisável pode ser construída, utilizando-se por exemplo o cassette Qhyg (Blondelet Rouault et al., 1997). Esse cassette foi contornado por seqüências attR e attL que contornam normalmente a cópia integrada de pSAM2 (conforme Figura 15). As seqüências attL e attR contêm todos os sítios necessários à recombinação sítio-específico, permitindo a excisão de pSAM2 ou de qualquer fragmento de DNA situado entre essas duas regiões (Sezonov et al., 1997, Raynal et al., 1998). A construção dEsse cassette não está evidentemente limitada à utilização de umo cassette Qhyg, mas outras cassettes de resistências podem servir de base à construção dEsse cassette (por exemplo, o cassette Qaac ou Qvyh (Blondelet Rouault et al., 1997).

Após a obtenção dessa construção, a cepa de streptomyces é transformada como plasmídeo recombinante. Os transformadores são em seguida selecionados com o antibiótico correspondente à cassette presente no gene alvo (conforme Figura 9, antibiótico B, trata-se, por exemplo, de uma seleção pela higromicina, caso o cassette excisável derive do cassette Ohyg). Seleciona-se assim uma mistura de clones dentre os quais houve integração por um só ou por dois acontecimentos de recombinação. Em uma segunda etapa, buscam-se os clones sensíveis ao antibiótico para os quais o gene de resistência está presente no vetor (fora do cassette de recombinação) (conforme Figura 9, antibiótico A). Podem-se assim selecionar os clones para o qual houve em princípio dois acontecimentos de recombinação que chega à substituição do gene primitivo pela cópia interrompida pela cassette. Essas etapas estão esquematizadas na Figura 9, o genótipo dos clones assim obtidos é verificado por Southern Blot e uma cepa que apresenta as características desejadas (a substituição do gene primitivo pela cópia interrompida pelo cassette excisável) é selecionada.

Em uma segunda etapa, a cepa selecionada acima, é transformada por um plasmídeo que permite a expressão dos genes xis e int que são ambos necessários à recombinação específica de sítio entre os sítios attR e attL. Essa recombinação acarreta a retirada do cassette excisável do genoma da cepa, graças a um acontecimento de recombinação (conforme Figura 10) (Raynal et al., 1998). É interessante escolher o vetor que porta os genes xis e int dentre os vetores relativamente instáveis nas streptomyces (por exemplo derivado do vetor streptomyces pWHM3, (Vara et al., 1989), isto permite obter uma cepa que tendo perdido este vetor após alguns ciclos de esporulação na ausência de pressão de seleção.

Para excisar a cassette, pode-se por exemplo utilizar o plasmídeo pOSV508 (conforme Figura 14) que é introduzido por transformação de protoplastos na cepa de S.ambofaciens contendo um gene interrompido pelo cassette excisável. O plasmídeo pOSV508 é derivado do plasmídeo pWHM3 (Vara J. et al., 1989) (conforme Figura 13), no qual foram acrescentados os genes xis e int de pSAM2 (Boccard F. et al., 1989b) colocado sob o controle dopromotor ptrc (Amann, E. et al., 1988). Os genes xis e int colocados sob o controle do promotor ptrc foram subclonados no plasmídeo pWHM3 a partir do plasmídeo pOSint3 (Raynal et al., 1998) (conforme Figura 14). A introdução na cepa mutante doplas pOSV508 portando os genes xis e int de pSAM2 vai permitir a excisão eficaz por recombinação específica de sítio do cassette excisável entre os sítios attL e attR contornando Esse cassette (Raynal A. et al., 1998) (figura 10). Dentre os transformadores, selecionados por sua resistência ao tiostrepton devido ao gene tsr portado por pOSV508, escolhem-se aqueles tornados sensíveis ao antibiótico ao qual a presença do cassette confere a resistência (conforme Figura 10). A excisão é eficaz e foi observado que mais de 90% dos transformadores são desse tipo. Após um ou vários ciclos de aumento e esporulação sobre um meio sólido desprovido de tiostrepton. São obtidos clones que perderam o plasmídeo pOSV508. Esses clones são notáveis por sua sensibilidade ao tiostrepton. A seqüência do gene alvo deletado pode ser verificada por PCR e seqüencia-ção do produto PCR.

Finalmente, a cepa resultante porta ao nível do gene inativado (deleção interna por exemplo) um sítio att "cicatricial" correspondente ao sítio attB mínimo (Raynal et al., 1998), proveniente da recombinação entre os sítios attR e attL. Esse sítio attB mínimo que subsiste é semelhante àquele presente naturalmente nas cepas de streptomyces ambofaciens, streptomyces pristinaespiraiis e streptomyces lividans (Sezonov et al., 1997). O gene que se quer inativar pode ser cotranscrito com outros genes situados a jusante. Para evitar que a inativação de um dos genes tenha um efeito polar sobre a expressão dos genes a jusante no operon, é importante conseguir uma deleção em fase após excisão da cassette. O sistema das cassette excisáveis, tal como descrito acima permite responder a essa exigência. O técnico poderá, com efeito, facilmente construir três cas- sette excisáveis distintas, estas deixando após excisão uma seqüência de 33, 34 ou 35 nucleotídeos respectivamente, sem códon de para-da/terminação, independentemente da fase de leitura. Conhecendo-se a seqüência do gene alvo e o tamanho da deleção associada à inserção do cassette , é possível escolher entre essas três cassette excisáveis, de forma que a excisão leve a uma deleção em fase. Nos 33, 34 ou 35 nucleotídeos acrescentados, 26 correspondem à seqüência attB mínima (conforme Figura 27).

No caso do presente pedido, dois cassettes excisáveis foram utilizadas. Esses dois cassettes são os seguintes: attlOhyg+ (SEQ ID N° 91) e att3Qaac- (SEQ ID N° 92), essas cassettes deixam respectivamente 33 e 35 nucleotídeos após excisão. Elas comportam respectivamente o cassette Qhyg ou o cassette Qaac, os sinais + e - correspondendo à orientação do cassette de resistência. Essas duas cassettes foram construídas e clonadas ao nível do sítio EcoRV do vetor pBC SK+, cujo sítio Hindlll foi suprimido previamente. Os plasmídeos obtidos foram chamados patt1Qhyg+ e patt3Haac- respectivamente, As cassettes excisáveis podem ser facilmente tiradas por uma digestão do plasmídeo por EcoRV. EXEMPLO 10: construção de uma cepa de streptomyces ambofaciens interrompida no gene orf2 A inativação do gene orf2 foi realizada graças à técnica das cassettes excisáveis (conforme acima). A cepa de partida utilizada é a cepa streptomyces ambofaciens OSC2 que deriva da cepa ATCC23877. Todavia, a cepa OSC2 difere da cepa ATCC23877 pelo fato de ter perdido o elemento genético móvel pSAM2 (Boccard et al., 1989a e b). Esse elemento móvel pode ser perdido de maneira espontânea durante a protoplastização (ação do lisozima para digerir a parede bacteriana e fragmentar o micélio (Kieser et al., 2000) e da regeneração dos protoplastos da cepa ATCC23877. Para selecionar os clones que perderam o elemento pSAM2, foi colocado um alvo, baseado na repressão do gene pra pelo repressor de transcrição Kor-SA (Sezonov et al., 1995) (Sezonov G. et al., 2000). Para isto, um fragmento de DNA contendo o promotor do gene pra colocado a montante do gene aph (conferindo a resistência à canamicina e desprovido de seu próprio promotor) foi clonado no vetor instável pWHM3Hyg, este derivado do plasmídeo pWHM3 (Vara et al., 1989) no qual o gene tsr foi substituído pelo gene hyg (conferindo a resistência à higromicina). O plasmídeo assim obtido foi denominado pOSV510. A cepa ATCC23877 foi transformada após protoplastiza-ção pelo plasmídeo pOSV510. O promotor pra é um promotor reprimido pelo repressor KorSa, o gene que codifica este ficando situado no meio do elemento móvel pSAM2 (Sezonov G et al., 2000). Após transformação pelo plasmídeo pOSV510, as bactérias transformadas são selecionadas por sua resistência à canamicina (devido ao gene aph portado por pOSV510). Os clones que perderam o elemento integrativo pSAM2 perderam o repressor KorSA e o promotor Pra não é, portanto, mais reprimido e permite a expressão do gene de resistência à canamicina aph. Uma seleção pela canamicina, após transformação pelo plasmídeo pOSV510 permite, portanto, selecionar os clones que perderam o elemento integrativo pSAM2 (e portando KorSA) e possuindo o plasmídeo pOSV510. O plasmídeo pOSV510 sendo instável, após alguns ciclos de esporulação sem antibiótico, clones isolados são repi-cados sobre meio com canamicina e sobre meio sem antibiótico. Os clones sensíveis à canamicina e à higromicina perderam pOSV510. A perda do elemento pSAM2 foi verificada por hibridização e PCR. Um clone que apresenta as características desejadas foi selecionado e foi denominado OSC2.

Uma amostra da cepa OSC2 foi depositada junto à Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, em 10 de julho de 2002 sob o número de registro I-2908. A inativação do gene orf2 foi realizada graças à técnica das cassettes excisáveis (conforme acima e Figura 10). Para isto, um enxerto de 4,5 kb, cuja seqüência parte dolocal EcoRI situado em posição 1 até o sítio Ba-mHI situado em posição 4521 (SEQ ID N° 1) foi subclonado ao nível dos sítios EcoRI e BamHI do plasmídeo pUC19 (número de acesso GenBank M77789), apartir do cosmídeo pSPM5. O plasmídeo assim obtido foi denominado pOS49.99.

Esse plasmídeo foi introduzido na cepa E.coli KS272 que continha o plasmídeo pKOBEG (Chaveroche et al., 2000) (cf Figura 12).

Em paralelo, o cassette excisável att3Qaac- (SEQ ID N° 92, cf, acima) foi amplificada por PCR, utilizando como matriz oplas pOSK1102 (O plasmídeo pOSK1102 é umplas derivado do vetor pGP704Not (Chaveroche et al., 2000) (Miller VL & Mekalanos JJ, 1988) no qual o cassette οΜβΩβθϋ-foi clonada como um fragmento EcoRV no sítio único EcoRV de pGP704Not) e com o auxílio das seguintes atrações: ORF2A 5’ CCCGCGCGGCAGCCTCTCCGTGA.TCGAGTCCGGCG'ÍGACCATCGCGCGCGCTTCGTTCGG-3 * (SEQ ID N° 93) ORF2B 5 * GCTCCGTGCGTCATGCAGGAAGGTGTCGTAGTCGCGGTAGATCTGCCTCTTCGTCCCGAA-3 ’ (SEQ ID N° 94) Os 40 deóxi-nucleotídeos situados na extremidade 5’ desses oligonucleotídeos comportam uma seqüência correspondente a uma sequência no gene alvo (orf2 no caso presente) e os 20 deóxi-nucleotídeos situados além disso em 3’(representado em forte acima) correspondem à seqüência de uma das extremidades do cassette excisável att3Qaac- (conforme Figura 11). O produto de PCR assim obtido foi utilizado para transformar a cepa E.coli contendo os plasmídeos pKOBEG e pOS49.99 conforme descrito (Chaveroche et al., 2000) (conforme Figura 12). Assim, as bactérias foram transformadas por eletroporação e selecionadas por sua resistência à apra-micina. Os plasmídeos dos clones obtidos foram extraídos e digeridos por várias enzimas de restrição, com a finalidade de verificar que o perfil de digestão obtido corresponde ao perfil esperadao se houver inserção do cassette (att3Qaac-) no gene alvo (orf2), isto é, se tiver tido recombinação homóloga entre as extremidades doproduto PCR e o gene alvo (Chaveroche et al., 2000). A verificação daconstrução pode também ser realizada por qualquer método conhecido do técnico e notadamente por PCR, utilizando os oligonucleotídeos apropriados e seqüenciação do produto de PCR. Um clone cujo plasmídeo possui operfil esperado foi selecionado e o plasmídeo correspondente foi denominado pSPM17. Esse plasmídeo deriva de pOS49.99 no qual orf2 é interrompida pelo cassette apramicina (conforme Figura 12). A inserção do cassette é acompanhada de uma deleção em orf2, entre os nucleotídeos 211 e 492 da parte codificante de orf2. O plasmídeo pSPM17 foi digerido pela enzima EcoRI, depois as extremidades foram tornadas extremidade livre por tratamento com a enzima de Klenow, esse produto de digestão foi em seguida digerido pela enzima Xbal e o enxerto que contém o gene orf2 deletado foi clonado no vetor pOSK1205 (conforme acima). Para isso, o vetor pOSK1205 foi digerido pela enzima Xbal e o enxerto contendo o gene orf2 deletado foi clonado no vetor pOSK1205 (conforme acima). Para isto, o vetor pOSK1205 foi digerido pela enzima BamHI, depois as extremidades foram tornadas extremidade livre por tratamento com a enzima de Klenow, esse produto foi em seguida digerido pela enzima Xbal, e utilizado para a ligação como enxerto obtido a partir de pSPM17 conforme acima. Essa manipulação permite, portanto, obter uma ligação orientada, já que cada um dos dois fragmentos é extremidade livre de um lado e Xbal do outro. O plasmídeo assim obtido foi denominado pSPM21, ele porta um gene de resistência à higromicina (parte vetor) e um enxerto no qual o gene orf2 deletado é substituído pelo cassette att3Qaac-. O vetor pSPM21 foi introduzido na cepa streptomyces ambofaci-ens OSC2 (cf acima) por transformação de protoplastos (Kieser, T. et al., 2000). Após transformação, os clones são selecionados por sua resistência à apramicina. Os clones resistentes à apramicina são em seguida repicados respectivamente sobre o meio com apramicina (antibiótico B) e sobre meio com higromicina (antibiótico A) (conforme Figura 9). Os clones resistentes à apramicina (ApraR) e sensíveis à higromicina (HygS) são em princípio aqueles nos quais um duplo acontecimento decruzamento ocorreu e que possuem o gene orf2 interrompido pelo cassette att30aac-. Esses clones foram selecionados e a substituição da cópia primitiva de orf2 pela cópia interrompida pelo cassette foi verificada. A presença do cassette att3Daac- foi verificada por PCR sobre colônia. Uma hibridização foi também feita. Para isto, o DNA total dos clones obtidos foi digerido por várias enzimas, separado sobre gem de agarose, transferido sobre membrana e hibridizada com uma sonda de 3 kb correspondente a um fragmento EcoRI-BamHI do enxerto do plasmídeo pOS49.99 (conforme acima). A verificação do genótipo pode também ser realizada por qualquer método conhecido do técnico e notadamente por PCR, utilizando os oligonucleotídeos apropriados e se-qüenciação doproduto de PCR.

Um clone que apresenta as características esperadas foi selecionado e denominado SPM21. Pôde ser verificado graças à PCR e à hibridi-zação que a cassete att3Qaac- estava bem presente no genoma desse clone e que se obtém bem o perfil de digestão esperado no caso de uma substituição, após um duplo acontecimento de recombinação, do gene primitivo pela cópia interrompida pela cassette att3naac- no genoma desse clone. Esse clone possui, portanto, o genótipo: orf2::att3Haac-.

Uma amostra da cepa SPM21 foi depositada junto à Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, em 10 de julho de 2002 sob o número de registro 1-2914. A cepa SPM21 foi transformada pelo vetor pOSV508 por transformação de protoplastos para provocar a excisão do cassette (conforme Figura 14). O plasmídeo pOSV508 é derivado do plasmídeo pWHM3 (Vara J. et al., 1989) (conforme Figura 13) no qual foram acrescentados os genes xis e int de pSAM2 (Boccard F. et al., 1989b) colocado sob o controle do-promotor ptrc (Amann, E. et al., 1988) (conforme Figura 14). A introdução na cepa SPM21 do plasmídeo pOSV508 portando os genes xis e int de pSAM2 permite a excisão eficaz por recombinação específica de sítio do cassette excisável entre os sítios attL e attR contornando Esse cassette (Raynal A. et al., 1998) (figura 10). Dentre os transformadores selecionados por sua resistência ao tiostrepon devido ao gene tsr portado por pOSV508, escolhem-se aqueles tornados sensíveis à apramicina cujo gene de resistência é portado pelo cassette att3Qaac-, a excisão acarreta com efeito a perda desse gene de resistência (conforme Figura 10). O plasmídeo pOSV508 é instável e após duas passagens sucessivos sobre meio, sem antibiótico, clones isolados são repicados sobre meio com tiostrepton e sobre meio sem tiostrep- ton. Os clones sensíveis ao tiostrepton perderam pOSV508. Foi verificado que a excisão do cassette chega bem a uma deleção em fase no gene orf2 por pCR e seqüenciação do produto PCR, a excisão do cassette deixa, com efeito, uma seqüência "cicatricial" att3 característica (que é similar ao sítio attB de origem, após recombinação entre os sítios attL e attR): 5' ATGGCGCGCGCTTGGTTCGGGACGAAGAGGTAGAT 3' (SEQID N° 95). A cepa assim obtida e possuindo o genótipo desejado (orf2::att3) foi denominado SPM22.

Uma amostra da cepa SPM22 foi depositada junto à Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, em 10 de julho de 2002 sob o número de registro 1-2915. EXEMPLO 11: construção de uma cepa de streptomyces ambofaciens interrompida no gene orf12 Para a inativação de orf12, orf13c e orf14 um mesmo plasmídeo de partida (pSPM504) foi empregado para introduzir em diferentes posições umo cassette de tipo cassette excisável. Esse plasmídeo possui um enxerto de 15,1 kb que corresponde à região orf7 à região orf17. Para construir esse plasmídeo um fragmento Bg/ll e 15,a kb, proveniente da digestão do cosmí-deo pSPM7 (conforme acima) foi clonado no plasmídeo pMBL18 (Nakano et al., 1995) digerido por BamHI. As extremidades BamHI e BG/II sendo compatíveis, obtém-se após ligação, o plasmídeo pSPM502. A totalidade do enxerto de pSPM502, obtém-se após ligação, o plasmídeo pSPM502. A totalidade do enxerto de pSPM502 foi em seguida subclonado (sob a foram de um fragmento Hindlll/Nhel) no plasmídeo pOSK1205 (digerido por Hin-dlll/Nhel), o que permitiu obter o plasmídeo pSPM504.

Esse plasmídeo foi introduzido na cepa E.Coli KS272 que continha já o plasmídeo pKOBEG (Chaveroche et al., 2000) (conforme Figura 12).

Em paralelo, o cassette excisável att3£2aac- foi amplificada por PCR, utilizando como matriz o plasmídeo pOSK1102 (o plasmídeo pOSK1102 é um plasmídeo derivado do vetor pGP704Not (Chaverote et al., 2000) (Miller VL & Mekalanos JJ, 1988) no qual o cassette att3Qaac- foi clo-nada como fragmento EcoRV no sítio único EcoRV de pGP704Not), as atrações utilizadas são as seguintes: EDRB : 5' CGGGATGATCGCTTGTCCGGCGGCCGGATGCCTAGCCTCATCGCGCGCGCTTCGTTCGG 3' <SEQ XD N° 96) EDR9 : 5 ' CCCGATCCAGAACGTCTGGTCGGTGATCAGGTCGCTGTTCATCTGCCTCTTCGTCCCGAA 3 ' (SEQ ID N° 97) Os 40 (somente 39 para EDR8) deóxi-nucleotídeos situados na extremidade 5’ desses oligonucleotídeos comportam uma seqüência correspondente a uma seqüência no gene alvo (orf12 no caso presente) e os 20 deóxi-nucleotídeos situados além disso em 3’(figurado em cheio acima) correspondem à seqüência de uma das extremidades do cassette excisável att3Qaac- (conforme Figura 11). O produto de PCR assim obtido foi utilizado para transformar a cepa E. coli KS272 contendo os plasmídeo pKOBEG e pSPM504 (conforme acima), conforme descrito por Chaveroche et al. (Chaveroche et al., 2000) (conforme Figura 12 para o princípio, o plasmídeo pOS49.99 deve ser substituído pelo plasmídeo pSPM504 e o plasmídeo obtido não é mais pSPM17, mas pSPM507). Assim, as bactérias foram transformadas por eletroporação por esse produto de PCR e os clones foram selecionados por sua resistência à apramicina. Os plasmídeos dos clones obtidos foram extraídos e digeridos por várias enzimas de restrição, com a finalidade de verificar que o perfil de digestão obtido corresponde ao perfil esperado, caso tenha havido inserção do cassette (att30aac-) no gene alvo (orf12), isto é, se tiver tido recombina-ção homólogo entre as extremidades do produto PCR e o gene alvo (Chaveroche et al., 2000). A verificação da construção pode também ser realizada por qualquer método conhecido do técnico e notadamente por PCR, utilizando os oligonucleotídeos apropriados e seqüenciação do produto de PCR. Um clone cujo plasmídeo possui um perfil esperado foi selecionado e o plasmídeo correspondente foi denominado pSPM507. Esse plasmídeo derivada de pSPM504 no qual orf12 é interrompida pelo cassette att3Haac-(conforme Figura 12). A inserção do cassette é acompanhada de um dele- ção no gene orf12 é interrompida pelo cassette att3Qaac- (conforme Figura 12). A inserção do cassette é acompanhada de uma deieção no gene orf12, a interrupção começa ao nível do trigésimo códon de orf12. Resta após o cassette os 46 últimos codons de orf12. O vetor pSPM507 foi introduzido na cepa streptomyces ambofa-ciens OSC2 (conforme acima) por transformação de protoplastos (Kieser, T. et al., 2000). Após transformação, os clones são selecionados por sua resistência à apramicina. Os clones resistentes à apramicina são em seguida repicados respectivamente sobre meio com apramicina (antibiótico A) (conforme Figura 9). Os clones resistentes à apramicina (antibiótico B) e sobre meio com higromicina (antibiótico A) (conforme Figura 9). Os clones resistentes à apramicina (ApraR) e sensíveis à higromicina (HygS) são em princípio aqueles nos quais um duplo acontecimento de cruzamento ocorreu e que possuem o gene orf12 interrompido pelo cassette att3 Oaac-. Esses clones foram mais particularmente selecionados e a substituição da cópia primitiva de orf12 pela cópia interrompida pelo cassette foi verificada por hibridização. Assim, o DNA total dos clones obtidos, foi digerido por várias enzimas, separado sobre gel de agarose, transferido sobre membrana e hibridizado com uma sonda correspondente à cassette att3Qaac- para verificar a presença do cassette no DNA genômico dos clones obtidos. Uma segunda hibridização foi feita, utilizando-se como sonda um fragmento de DNA obtido por PCR e correspondendo a uma parte muito ampla da sequência codificante do gene orf12. A verificação do genótipo pode também ser realizada por qualquer método conhecido do técnico e notadamente por pCR, utilizando oligo-nucleotídeos apropriados e seqüenciação do produto de PCR.

Um clone que apresenta as características esperadas (orf12::att3naac-) foi mais particularmente selecionado e denominado SPM507. Pôde com efeito ser verificado graças às duas hibridizações que o cassette 3Κ3Ω830- estava bem presente no genoma desse clone e que se obtém bem o perfil de digestão esperado no caso de uma substituição, após um duplo acontecimento de recombinação, do gene primitivo pela cópia in- terrompida pelo cassette att3Qaac- no genoma desse clone. Esse clone possui, portanto, o genótipo: orf12::att3naac- e foi denominado SPM507. É inútil proceder à excisão do cassette para o estudo do efeito da inativação de orf12, considerando-se a orientação dos genes (conforme Figura 3). Com efeito, o fato de o orf13c seja orientado em sentido oposto ao orf12 mostra que esses genes não são co-transcritos. A utilização de umo cassette exci-sável permite, ao contrário, ter a possibilidade de se livrar do marcador de seleção a qualquer momento, notadamente por transformação pelo plasmí-deo pOSV508. Uma amostra da cepa SPM507 foi depositado junto à Collec-tion Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, em 10 de julho de 2002 sob o número de registro 1-2911. EXEMPLO 12: Construção de uma cepa de streptomyces ambofaciens interrompida no gene orf13c A cassette excisável att30aac- foi amplificada por PCR, utilizando como matriz o plasmídeo pOSK1102 (conforme acima) como auxílio das seguintes atrações: EDR3 :5' ACCGGGGCGGTCCTCCCCTCCGGGGCGTCACGGCCGCGGAATCTGCCTCTTCGTCCCGAA 3 ' (SEQ ID N° 98) EDR4:5' CACGCAGCGAGCCGACGCACTGATGGA.CGACACGATGGCC&TCGCGCGCGCTTCGTTCGG 3' {SEQ ID N° 99) Os 40 deóxi-nucleotídeos situados na extremidade 5’ desses oligonucleotídeos comportam uma seqüência correspondente a uma se-qüência no gene alvo (orf13c no caso presente) e os 20 deóxi-nucleotídeos situados além disso em 3’(figurado a grosso modo acima) correspondem à seqüência de uma das extremidades do cassette excisável att3Qaac- (conforme Figura 11). O produto de PCR assim obtido foi utilizado para transformar a cepa E.coli KS272 contendo os plasmídeos pKOBEG e pSPM504 (conforme acima), conforme descrito por Chaveroche et al. (Chaveroche et al., 2000) (conforme Figura 12 para o princípio, o plasmídeo pOS49.99) deve ser substituído pelo plasmídeo pSPM504 e o plasmídeo obtido não é mais pSPM17, mas pSPM508). Assim, as bactérias foram transformadas por ele- troporação pelo produto de PCR e os clones foram selecionados por sua resistência à apramicina. Os plasmídeo dos clones obtidos foram extraídos e digeridos por várias enzimas de restrição, com a finalidade de verificar se o perfil de digestão obtido corresponde ao perfil esperado, caso tenha havido a inserção do cassette (att3Qaac-) no gene alvo (orf13c), isto é, se tiver tido recombinação homóloga entre as extremidades do produto PCR e o gene alvo (Chaveroche et al., 2000). A verificação da construção pode também ser realizada por qualquer método conhecido do técnico e notadamente por PCR, utilizando os oligonucleotídeos apropriados e seqüenciação do produto de PCR. Um clone cujo plasmídeo possui o perfil esperado foi selecionado e o plasmídeo correspondente foi denominado pSPM508. Esse plasmídeo deriva de pSPM504 no qual orf13c é interrompida pelo cassette apramicina (conforme Figura 12). A inserção do cassette é acompanhada de uma dele-ção no gene orf13c, a interrupção começa ao nível do sexto códon de prf13c. Resta após o cassette os 3 últimos códons de orf13c. O vetor pSPM508 foi introduzido na cepa streptomyces ambofa-ciens OSC2 (conforme acima) por transformação de protoplastos (Kieser, T. et al., 2000). Após transformação, os clones são selecionados por sua resistência à apramicina. Os clones resistentes à apramicina são em seguida repicados respectivamente sobre meio com apramicina (antibiótico B) e sobre meio com higromicina (antibiótico A) (conforme Figura 9). Os clones resistentes à apramicina (ApraR) e sensíveis à higromicina (HygS) são em princípios aqueles nos quais um duplo acontecimento de cruzamento ocorreu e que possuem o gene orf13c interrompido pelo cassette 8Α:3Ω33σ-. Esses clones foram mais particularmente selecionados e a substituição da cópia primitiva de orf13c pela cópia interrompida pelo cassette foi verificado por hibridização. Assim, o DNA total dos clones obtidos, foi digerido por várias enzimas, separado sobre gel de agarose, transferido sobre membrana e hi-bridizado com uma sonda correspondente à cassette att3Qaac- para verificar a presença do cassette no DNA genômica dos clones obtidos. Uma segunda hibridização foi feita, utilizando como sonda um produto de PCR correspondente a uma sequência que contorna uma centena de pares de base a montante e a jusante da seqüência codificante de orf13c. A verificação do genótipo pode também ser realizada por qualquer método conhecido do técnico e notadamente por PCR, utilizando-se oligonucleotídeos apropriados e seqüenciação do produto de PCR.

Um clone que apresenta as características esperadas (orf13c::att3Qaac-> foi mais particularmente selecionado e denominado SPM508. Pôde, com efeito, ser verificado, graças às duas hibridizações que o cassette att3Qaac- estava bem presente no genoma desse clone e que se obtém bem o perfil de digestão esperado no caso de uma substituição, após um duplo acontecimento de recombinação, do gene primitivo pela cópia interrompida pelo cassette att3naac- no genoma desse clone. Esse clone possui, portanto, o genótipo: orf13c::att30aac- e foi nomeado SPM508. É inútil proceder a excisão do cassette para o estudo do efeito da inativação de orf13c, considerando-se a orientação dos genes (conforme Figura 3), o fato de orf14 seja orientado em sentido oposto à orf13c mostra que esse genes não são co-transcritos. A utilização de umo cassette excisável permite, ao contrário, ter a possibilidade de se livrar do marcador de seleção a qualquer momento. Uma amostra da cepa SPM508 foi depositada junto à Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, em 10 de julho de 2002 sob o número de registro 1-2912. EXEMPLO 13: construção de uma cepa de streptomyces ambofaciens interrompida no gene orf14 O cassette excisável att30aac- foi amplificada por pCR, utilizando como matriz o plasmídeo pOSK1102 (conforme acima) com o auxílio das seguintes atrações: EDR5: 5'GGGCGTGAAGCGGGCGAGTGTGGATGTCATGCGAGTACTCATCGCGCQCQCTTCaTTCQO 3 ' (SEQ ID N° 100) EDR6 : 5' CGGGAAACGGCGTCGCACTCCTCGGGGGCCGCGTCAGCCCATCTGCCTCTTCGTCCCGAA 3' (SEQ XD N° 101) Os 40 deóxi-nucleotídeos situados na extremidade 5’ desses oligonucleotídeos comportam uma seqüência correspondente a uma se- qüência no gene alvo (orf14 no caso presente) e os 20 deóxi-nucleotídeos situados, além disso, em 3’(figurado a grosso modo acima) correspondem à seqüência de uma das extremidades do cassette excisável att3Qaac- (conforme Figura 11). O produto de PCR assim obtido foi utilizado para transformar a cepa E.coli KS272, contendo os plasmídeo pKOBEG e pSPM504 (conforme acima), conforme descrito por Chaveroche et al. (Chaveroche et al., 2000) (conforme Figura 12 para o princípio, o plasmídeo pOS49.99 deve ser substituído pelo plasmídeo pSPM504 e o plasmídeo obtido não é mais pSPM17, mas pSPM509). Assim, as bactérias foram transformadas por eletroporação pelo produto de PCR e os clones foram selecionados por sua resistência à apramicina. Os plasmídeos dos clones obtidos foram extraídos e digeridos por várias enzimas de restrição, com a finalidade de verificar se o perfil de digestão obtido corresponde ao perfil esperado, caso tenha havido inserção do cassette (att30aac-) no gene alvo (orf14), isto é, se houve recombinação homóloga entre as extremidades do produto PCR e o gene alvo (Chaveroche et al., 2000). A verificação da construção pode também ser realizada por qualquer método conhecido do técnico e notadamente por PCR, utilizando os oligonucleotídeos apropriados e seqüenciação do produto de PCR. Um clone, cujo plasmídeo possui o perfil esperado, foi selecionado e o plasmídeo correspondente foi denominado pSPM509. Esse plasmídeo deriva de pSPM504 no qual orf14 é interrompido pelo cassette apramicina (conforme Figura 12). A inserção do cassette é acompanhada de uma deleção no gene orf14, a interrupção começa no nível do quarto códon de orf14. Resta após o cassette o último códon de orf14. O vetor pSPM509 foi introduzido na cepa streptomyces ambofa-ciens OSC2 (conforme acima) por transformação de protoplastos (Kieser, t. et al., 2000). Após transformação, os clones são selecionados por sua resistência à apramicina. Os clones resistentes à apramicina são em seguida repicados, respectiva mente sobre meio com apramicina (antibiótico B) e sobre meio com higromicina (antibiótico A) (conforme Figura 9). Os clones resistentes à apramicina (ApraR) e sensíveis à hiogromicinas (HygS) são em princípio aqueles nos quais um duplo acontecimento de cruzamento ocorreu e que possuem o gene orf14 interrompido pelo cassette att3Qaac-. Esses clones foram mais particularmente selecionados e a substituição da cópia primitiva de orf14 pela cópia interrompida pelo cassette foi verificada por hi-bridização. Assim, o DNA total dos clones obtidos foi digerido por várias enzimas, separado sobre gel de agarose, transferido sobre membrana e hibri-dizado com uma sonda correspondente à cassette att3Qaac- para verificar a presença do cassette no DNA genômico dos clones obtidos. Uma segunda hibridização foi feita, utilizando como sonda uma produto de PCR, correspondendo a uma seqüência que ultrapassa uma centena de pares de base a montante e a jusante da seqüência codificante de orf14. A verificação do genótipo pode também ser realizada por qualquer método conhecido do técnico e notadamente por PCR, utilizando oligonucleotídeos apropriados e se-qüenciação do produto de PCR.

Um clone que apresenta as características esperadas (orf14::att3Qaac-) foi mais particularmente selecionado e denominado SPM509. Pôde com efeito ser verificado, graças às duas hibridizações, que o cassette att3naac- estava presente no genoma desse clone e que se obtém o perfil de digestão esperado no caso de uma substituição, em conse-qüência de um duplo acontecimento de recombinação, do gene primitivo pela cópia interrompida pelo cassette att3Qaac- no genoma desse clone. Esse clone possui, portanto, o genótipo: orf14::att4 e foi denominado SPM509. É inútil proceder à excisão do cassette para o estudo do efeito da inativação de orf14, considerando-se a orientação dos genes (conforme Figura 3), o fato de orflõc ser orientado em sentido oposto ao orf14 mostra que esses genes não são co-transcritos. A utilização de umo cassette exci-sável; permite, ao contrário, ter a possibilidade de se livrar do marcador de seleção a qualquer momento. Uma amostra da cepa SPM509 foi depositada junto à Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, em 10 de julho de 2002 sob o número de registro 1-2913. EXEMPLO 14: construção de uma cepa de streptomyces ambofaciens inter- rompida no gene orf6* A inativação do gene orf6* foi realizada graças à técnica das cassette excisáveis (conforme acima e Figura 10). Para isso, o cosmídeo pSPM7 foi utilizado como matriz para amplificar um fragmento do gene orf6*, graças aos seguintes oligonucleotídeos: C9583 ; 5' CTGCAGGTGCTCCAGCGCGTCGATCT 3' (oligo sens) (SEQ ID N° 102) C9584 : 5' CTGCAGACGGAGGCGGACCTGCGGCT 3' (oligo antisens) (SEQ ID N° 103) Os 20 deóxi-oligo situados na extremidade 3’ desses oligonucleotídeos correspondem a uma seqüência situada na parte codificante do gene orf6* (SEQ ID N° 13) e os 6 deóxi-nucleotídeos situados além disso em 5’ correspondem à seqüência de um sítio Pdtl, permitindo facilitar a clonagem na seqüência. O fragmento de DNA amplificado constitui um tamanho de aproximadamente 1,11 kb. Esse produto de PCR é clonado no vetor pGEM-T Easy (comercializado pela sociedade Promega (Madison, Wisconcin, USA), o que permitiu obter o plasmídeo denominado pBXL1111 (conforme Figura 16). A cassette excisável att1Qhyg+ foi em seguida introduzida na seqüência codificante do gene orf6*. Para isso, o plasmídeo pBXL1111 foi digerido pelas enzimas de restrição Smal e Asp718l e o produto de digestão foi tratado pela enzima de Klenow. Essa manipulação permite realizar uma deleção interna de 120 pb na seqüência codificante do gene orf6* (conforme Figura 15). Além disso, de ambos os lados dos sítios de restrições, restam respectiva mente 511 pb e 485 pb da seqüência de orf6* que permitirão a recombinação homóloga para a inativação do gene orf6*. O cassette excisável att10hyg+ foi preparada a partir do plasmídeo patt1Qhyg+ (conforme acima) por digestão desse plasmídeo por EcoRV. Esta última foi em seguida subclonada no vetor pBXL1111 previamente preparado conforme descrito acima (digestão Smal e Asp718l, depois tratamento com a enzima de Klenow). O plasmídeo obtido foi denominado pBXL1112 (conforme Figura 17). Nessa construção, o gene orf6* comporta uma deleção de 120 pb e interrompido pelo cassette att1Qhyg+. O plasmídeo pBXL1112 foi em seguida digerido pela enzima Pstl (sítio que contorna a cassette, já que presente nos oligonucleotídeos PCR) e o enxerto Pstl de 3,7 kb compreendendo uma parte de orf6* interrompido pelo cassette att1Hhyg+ foi em seguida clonado ao nível do sítio Pstl doplas pOJ260 (conforme acima). O plasmídeo assim obtido foi denominado pBXL.1113. O vetor pBXL1113 foi introduzido na cepa streptomyces ambofa-ciens OSC2 (conforme acima) por transformação de protoplastos (Kieser, T. et al., 2000). Após transformação, os clones são selecionados por sua resistência à higromicina. Os clones resistentes à higromicina são em seguida repicados respectiva mente sobre meio com higromicina (antibiótico B) e sobre meio com apramicina (antibiótico A) (conforme Figura 9). Os clones resistentes à higromicina (HygR) e sensíveis à apramicina (ApraS) são em princípio aqueles nos quais um duplo acontecimento de cruzamento ocorreu e que possuem o gene orf6* interrompido pelo cassette att1Hhyg+. Esses clones foram mais particularmente selecionados e a substituição da cópia primitiva de orf6* pela cópia interrompida pelo cassette foi verificada pela técnica do Southern Blot. Assim, o DNA total dos clones obtidos foi digerido por várias enzimas, separado sobre gel de agarose, transferido sobre membrana e hibridizado com uma sonda correspondente ao gene hyg (obtido por PCR) para verificar a presença do cassette no DNA genômico dos clones obtidos. Uma segunda hibridização foi feita, utilizando-se como sonda o enxerto Pstl-Pstl, contendo o gene orf6*, de um tamanho de aproximadamente 1,1 kb e obtido a partir do plasmídeo pBXL1111 (conforme acima e Figura 6). A verificação do genótipo pode também ser realizada por qualquer método conhecido do técnico e notadamente por pCR, utilizando os oligonucleotídeos apropriados e seqüenciação do produto de PCR.

Um clone que apresenta as características esperadas (orf6*::att1Qhyg+) foi mais particularmente selecionado e denominado SPM501. Pôde com efeito ser verificado, graças às duas hibridizações que o cassette att^hyg+ estava presente no genoma desse clone e que se obtém o perfil de digestão esperado no caso de uma substituição, em conseqüência de um duplo acontecimento de recombinação, do gene primitivo pela cópia interrompida pelo cassette att1Qhyg+ no genoma desse clone. Esse clone possui , portanto, o genótipo: orf6*::att1 Qhyg+ e foi denominadoSPM501. Uma amostra da cepa SPM501 foi depositada junto à Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, em 10 de julho de 2002 sob o número de registro I-2909. A cepa SPM501 foi transformada pelo vetor pOSV508 por transformação de protoplastos para provocar a excisão do cassette (conforme Figura 14). O plasmídeo pOSV508 é derivado do plasmídeo pWHM3 (Vara J. et al., 1989) (conforme Figura 13) no qual os genes xis e int de pSAM2 (Boccard F. et al., 1989b) colocados sob o controle do promotor ptrc (Amann, E. et al., 1988) foram acrescentados (conforme Figura 14). A introdução na cepa SPM501 do plasmídeo pOSV508 portando os genes xis e int de pSAM2 permite a excisão eficaz por recombinação sítio específico do cassette excisável entre os sítios attL e attR que contornam Esse cassette (Raynal A. et al., 1998) (figura 10). Dentre os transformadores, selecionados por sua resistência ao tiostrepton, devido ao gene tsr portado por pOSV508, escolhem-se aqueles tomados sensíveis à higromicina, cujo gene de resistência é portado pelo cassette att1Qhyg+, a excisão acarreta com efeito a perda desse gene de resistência 9conforme Figura 10). O plasmídeo pOSV508 é instável e após duas passagens sucessivas sobre meio sem antibiótico dos clones isolados são repicados sobre meio com tiostrepton e sobre meio sem tiostrepton. Os clones sensíveis ao tiostrepton perderam pOSV508. Foi verificado que a excisão do cassette ocorreu em fase no gene orf6* por PCR e seqüenciação do produto PCR. A interrupção começa no 158° códon, 40 códons são deletados (120pb) e a excisão do cassette deixa uma seqüência "cicatricial" att1 característica de 33pb: 5' ATGGCGCGCTTCGTTCGGGACGAAGAGGTAGAT 3* (SEQID N° 104). A cepa assim obtida e possuindo o genótipo desejado (orf6*:att1) foi denominada SPM502.

Uma amostra da cepa SPM502 foi depositada junto à Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, em 10 de julho de 2002 sob o número de registro 1-2910. EXEMPLO 15: análise das cepas de streptomyces ambofaciens interrompida nos genes orf2, orf3, orf8, orf10, orf12, orf13c, orf14, orf6* Para testar a produção em espiramicinas das diversas cepas obtidas, um teste microbiológico baseado na sensibilidade de uma cepa de Micrococcus luteus foi desenvolvido (conforme(Goumelen A. et al., 1998)). A cepa de Micrococcus luteus utilizada é uma cepa derivada da cepa DSM1790 naturalmente sensível à espiramicina (essa cepa está disponível notadamente junto à German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ), (Braunschweig, Alemanha), sob o número DSM1790), a cepa utilizada no presente teste difere da cepa DSM1790 pelo fato de ser resistente à congocidina. Essa cepa é um mutante espontâneo obtido por seleção sobre meio que contém doses crescentes de congocidina. Essa cepa é um mutante espontâneo obtido por seleção sobre meio que contém doses crescentes de congocidina. Essa cepa foi selecionada devido ao fato de streptomyces ambofaciens produzir ao mesmo tempo a espiramicina e da congocidina. A finalidade sendo dosar a produção em espiramicina das diversas cepas obtidas graças a um teste microbiológico baseado na sensibilidade de uma cepa de Micrococcus luteus, é necessário dispor de uma cepa resistente à congocidina.

As diferentes cepas de streptomyces a testar foram cultivadas em erlenmeyers com chicans (erlenmeyers chicanados) de 500 ml, contendo 70 ml de meio MP5 (Pemodet et al., 1993). Os erlenmeyers chicanados foram ino-culados a uma concentração inicial de 2.5 106 esporas/ml das diferentes cepas de S.ambofaciens e colocadas para crescer a 27°C sob agitação orbital de 250 rpm. Retiradas de 2 ml de suspensões foram feitas após 48, 72 e 96 horas de cultura e centrifugadas. Os diferentes resíduos sobrenadantes foram em seguida congelados a -20°C. Uma diluição ao décimo desses resíduos em meio de cultura estéril é utilizada para o teste (conforme Figura 18). A cepa indicadora de Micrococcus luteus resistente à congocidi- na, mas sensível à espiramicinas, foi cultivada em meio 2TY (Sambrook et al., 1989) contendo a congocidina a 5 pg/ml durante 48 horas a 37°C. A densidade óptica (DO) da cultura é medida e essa cultura é diluída de forma a ajustar a densidade óptica em 4. 0,4 ml dessa pré-cultura é diluída em 40 ml de meio DAM5 (Difco Antibiotic Médium 5, comercializado pela sociedade Difco), previamente levado a uma temperatura de aproximadamente 45°C. Esse meio é em seguida derramado em uma caixa quadrada de 12 x 12 cm e deixado em repouso à temperatura ambiente.

Uma vez o meio resfriado e solidificado, discos em papel Wha-tman AA (Conforme Gourmelen A. et al., 1998) de 12 mm de diâmetro foram embebidos com 70 μΙ da diluição ao décimo de cada resíduo sobrenadante e depositados sobre a superfície da caixa. Discos embebidos com uma solução de espira de diferentes concentrações (2-4-8 pg/ml em meio de cultura MP5) são utilizados como faixa de aferição. As caixas são deixadas a 4 °C durante 2 horas, deforma a permitir a difusão dos antibióticos no agar, depois são incubadas a 37°C, durante 24 a 48 horas.

Caso o disco contenha espiramicina, esta se propaga no agar e inibe o aumento da cepa indicadora de Micrococcus luteus. Essa inibição cria um "halo" em torno do disco, esse halo refletindo a zona na qual a cepa de Micrococcus luteus não cresceu. A presença desse halo é, portanto, uma indicação da presença de espiramicinas e permite determinar se a cepa de S. ambofaciens correspondente ao disco em questão é produtora ou não de espiramicina. Uma comparação com os diâmetros de inibição obtidos para a faixa de aferição permite obter uma indicação da quantidade de espiramicinas produzida por essa cepa.

As diferentes cepas descritas nos Exemplos precedentes foram utilizadas nesse teste para detectar sua produção em espiramicinas. Os resultados obtidos foram reagrupados na Redutase.

Tabela 38 Esses resultados permitem tirar um certo número de conclusões no que refere-se à função dos diferentes genes implicados na biossíntese da espiramicinas. Assim, o gene orf3 é essencial à biossíntese da espiramici-nas. Com efeito, uma inativação em fase nesse gene leva a uma cepa (OS49.67, (conforme exemplo 6)) não produzindo espiramicina. A inativação em fase permite afastar a hipótese de uma eventual influência do cassette introduzida sobre a expressão dos genes situados a jusante de orf3.

Da mesma forma, os genes orf8 e orf10 codificam proteínas essenciais à biossíntese da espiramicinas, já que as cepas OS49.107 e OS49.50 têm um fenótipo não-produtor. Além disso, nestas duas últimas cepas, é a inativação do gene correspondente que é responsável por esse fenótipo não-produtor, já que, considerando-se diferentes orfs (conforme Figura 3), a construção introduzida não pode ter efeito polar. O estudo das cepas, possuindo umo cassette excisável, permite tirar um certo número de conclusões no que refere-se à função dos genes interrompidos. A cepa SPM507 possui o genótipo: 011^:.3^30.330-. É inútil proceder à excisão do cassette para o estudo do efeito da inativação de orf12, considerando-se a orientação dos genes (conforme Figura 3). O fato de orf13c ser orientado em sentido oposto ao orf12 mostra que esses genes não são co-transcritos. A utilização de umo cassette excisável permite, ao contrário, ter a possibilidade de se livrar do marcador de seleção a qualquer momento. O fenótipo da cepa SPM507 é não-produtor, pode-se, portanto, concluir que o gene orf12 é um gene essencial à biossíntese da espiramicina em S.ambofaciens. A cepa SPM 508 possui o genótipo: orf13c::att3. É inútil proceder à excisão do cassette para o estudo do efeito da inativação de orf13c, considerando-se a orientação dos genes (conforme Figura 3). O fato de orf14 ser orientado em sentido oposto ao orf13c mostra que esses genes não são co-transcritos. A utilização de umo cassette excisável permite ao contrário ter a possibilidade de se livrar do marcador de seleção a qualquer momento. O fenótipo da cepa SPM508 é produtor, pode-se, portanto, concluir que o gene orf13c não é um gene essencial à biossíntese da espiramicina em S.ambofaciens. A cepa SPM509 possui o genótipo: orf14::att3Qaac-. É inútil proceder à excisão do cassette para o estudo do efeito da inativação de orf14, considerando-se a orientação dos genes (conforme Figura 3), o fato de orf15c ser orientado em sentido oposto ao orf14 mostra que esses genes não são co-transcritos. A utilização de umo cassette excisável permite, ao contrário, ter a possibilidade de se livrar do marcador de seleção a qualquer momento. O fenótipo da cepa SPM509 é não-produtor, pode-se, portanto, concluir que o gene orf14 é um gene essencial à biossíntese da espiramicina em S.ambofadens. A cepa SPM21 possui o genótipo: orf2::att3Qaac-. O fenótipo dessa cepa é não-produtor de espiramicinas. Todavia, a orientação dos genes orf1 ao orf8 (conforme Figura 3) deixa pensar que esses genes são co-transcritos. Também, o fenótipo observado pode ser devido a um efeito polar do cassette introduzida em orf2 sobre a expressão de genes situados a jusante no operon. A cepa SPM22 possui o genótipo orf2::att3 e foi obtida após excisão em fase do cassette introduzida. A excisão do cassette deixa somente uma seqüência "cicatricial" característica (conforme exemplo 10). A cepa SPM22 sendo também de fenótipo não-produtor, pode-se concluir que o gene orf2 é um gene essencial à biossíntese da espiramicina em S.ambofadens. Observa-se no caso unicamente o efeito devido à inativação de orf2. A cepa SPM501 possui o genótipo: orf6*::att1Qhyg+. O fenótipo dessa cepa é não-produtor de espiramicinas. Todavia, os genes orf5* e orf6* (conforme Figura 3) que tem a mesma orientação, o fenótipo observado pode ser devido a um efeito polar do cassette introduzida em orf6* sobre a expressão de orf5*. A disposição desses genes deixar pensar que podem ser co-transcritos. Para responder a essa questão, a cepa SPM502 foi obtida após excisão em fase do cassette introduzida. Nessa cepa, observa-se unicamente o efeito da inativação de orf6*. Essa cepa possui o genótipo orf6*::att1 (conforme exemplo 14). A excisão do cassette deixa somente uma seqüência cicatricial em fase (conforme exemplo 14). A cepa SPM502 possui um fenótipo produtor (essa cepa todavia produz apenas a espiramicina I (cf*. exemplo 16)). Pode-se portanto concluir que o gene orf5* é um gene essencial à biossíntese da espiramicina em S.ambofadens, já que sua inativação indireta na cepa SPM501 leva a um fenótipo não-produtor. Ao contrário, o gene orf6* não é um gene essencial à biossíntese da espiramicina I em S.ambofadens (ao contrário, é essencial à produção de espiramicina II e III (conforme exemplo 16)). EXEMPLO 16: dosagem da produção das espiramicinas I, II e III nas cepas mutantes obtidas.

As diferentes cepas a testar foram cultivadas em cada um dos 7 erlenmeyers chicanados de 500 mL contendo 70 ml de meio MP5 (Pernodet et al., 1993). Os erlens foram inoculados por 2.5 106 esporas/ml das diferentes cepas de S. ambofaciens e colocadas para crescer a 27°C sob agitação orbital de 250 rpm, durante 72 horas. As culturas correspondentes ao mesmo clone reunidas, eventualmente filtradas sobre filtro plissado, e centrifugadas durante 15 minutos a 7000 rpm. Os diferentes resíduos sobrena-dantes foram em seguida armazenados a -30°C.

As dosagens foram feitas por Cromatografia Líquida de Elevado Desempenho (CLHD) por emparelhamento de íons. A análise CLHD do meio de cultura permite determinar precisamente a concentração das três formas de espiramicina. A coluna utilizada (Macherey-Nagel) é cheia com uma fase Nucleosil de sílica enxertada octila. A granulometria é de 5 μηη e o tamanho dos poros 100 Â. O diâmetro interno da coluna é de 4,6 mm e seu comprimento é de 25 cm. A fase móvel é uma mistura de tampão H3PO4 (pH2,2) e de acetonitrila 70/30 (v/v) contendo 6,25 g/L de perclorato de NaCI04. A análise é feita em regime isocrático com uma vazão fixada em 1 ml/min. A coluna é termo-regulada em 23°C. A detecção é assegurada por espectro-fotometria UV a 238 nm. A amostra é refrigerada a +10°C e a quantificação é determinada a partir da área dos picos (por aferição externa). Nessas condições, os tempos de retenção da espiramicina I, II e III são respectivamente de aproximadamente 17, 21 e 30 minutos, conforme pôde ser verificado, graças a uma mostra comercial que compreende as três formas de espiramicina. A cepa OSC2 possui um fenótipo produtor de espiramicina. É a cepa parenteral utilizada para a obtenção das cepas que possuem uma cassette excisável (conforme exemplo 15). Essa cepa foi, portanto, utilizada como prova positiva de produção das três formas de espiramicina. Essa cepa produz as três formas de espiramicinas conforme foi verificado por CLHP (conforme Figura 19). O estudo das cepas que possuem uma cassette excisável permite tirar um certo número de conclusões no que refere-se à função dos genes interrompidos. A cepa SPM507 possui o genótipo: orf12::att3Qaac-, O fenótipo da cepa SPM507 é não-produtor (conforme exemplo 15), pode-se, portanto, concluir que o gene orf12 é um gene essencial à biossíntese da espiramicina em S.ambofaciens. Essa cepa não produz mais espiramicinas conforme foi verificado por CLHP (conforme Figura 22). Esse resultado confirma o caráter essencial do gene orf12 na biossíntese da espiramicina. A cepa SPM508 possui o genótipo: orf13c::att3Qaac-. O fenótipo da cepa SPM508 é produtor de espiramicina (conforme exemplo 15), pode-se portanto concluir que o gene orf14c não é um gene essencial à biossíntese da espiramicina em S.ambofaciens. Essa cepa produz espiramicinas I, II e III conforme foi verificado por CLHP (conforme Figura 23). Esse resultado confirma que o gene orf13c não é um gene essencial à biossíntese das espiramicinas I, II e III em S.ambofaciens. A cepa SPM509 possui o genótipo: orf14::att3Qaac-. O fenótipo da cepa SPM509 é não-produtor, pode-se portanto concluir que o gene orf14 é um gene essencial à biossíntese da espiramicina em S.ambofaciens. Essa cepa não produz mais espiramicinas conforme foi verificado por CLHP (conforme Figura 24). Esse resultado confirma a essencialidade do gene orf14 na biossíntese da espiramicinas.

A cepa SPM501 possui o genótipo: orf6*::att1Qhyg+. O fenótipo dessa cepa é não-produtor de espiramicinas. Essa cepa não produz mais espiramicinas conforme foi verificado por CLHP (conforme Figura 20). Todavia, os genes orf5* e orf6* (conforme Figura 3) tendo a mesma orientação, o fenótipo observado pode ser devido a um efeito polar do cassette introduzida em orf6* sobre a expressão de orf5* no operon. Isto deixa pensar que esses genes são co-transcritos. Para responder a essa questão, a cepa SPM502 foi obtida por execisão do cassette introduzida, produzindo uma deleção em fase no gene orf6* e restaurando a expressão de orf5*. Essa cepa possui o genótipo orf6*::att1 (conforme exemplo 14 e 15). A excisão do cassette deixa somente uma seqüência att "cicatricial" em fase (conforme exemplo 14). A cepa SOM502 possui um fenótipo produtor de espiramicina. Todavia, conforme foi provado por CLHP, esta cepa produz apenas espiramicina I e não produz espiramicina II e lil (conforme Figura 21). Pode-se portanto concluir desses resultados, que o gene orf5* é um gene essencial à biossíntese da espiramicina em S. ambofaciens, já que sua inativação indireta na cepa SPM501 leva a um fenótipo não-produtor de espiramicina (conforme Figura 20). Por outro lado, o gene orf6* não é um gene essencial à biossíntese da espiramicina I em S. ambofaciens, já que a inativação desse gene leva a um fenótipo produtor de espiramicina I (conforme Figura 21). Todavia, orf6* é essencial à produção de espiramicina II e ill (conforme exemplo 16). O gene orf6* codifica bem, portanto, uma acil-transferase responsável pela modificação do platenolídeo na posição 3 (conforme Figura 1). EXEMPLO 17: Determinação do ponto de acionamento da tradução de orf10 e melhoria da produção em espiramicinas 17.1 Construção dos plasmídeo pSPM523, pSPM524 e PSPM525 O gene orf10 foi identificado em streptomyces ambofaciens e foi designado srmR por Gleistlich et al. (Gleistlich, M. et al., 1992). A inativação do gene orf10 foi feita (conforme exemplo 8). Pôde assim ser mostrado que a cepa resultante não produz mais espiramicinas (conforme exemplo 15). Isto confirma que o gene orflO é implicado na biossíntese das espiramicinas. A proteína codificada por esse gene é, portanto, bem essencial à biossíntese das espiramicinas. Todavia, a análise da seqüência mostra que dois códons ATG situados na mesma fase de leitura podem ser utilizados para a tradução de orflO (conforme Figura 28). Um dos dois códons possível (o códon o mais a montante) aciona a posição 10656 da seqüência dada em SEQ ID N° 1, enquanto que o outro códon possível situado mais a jusante aciona a posição 10809 (conforme SEQ ID N° 1). Antes de testar um eventual efeito da superexpressão de srmR sobre a produção de espiramicina, é importante determinar em uma primeira etapa o ponto de acionamento da tradução.

Com a finalidade de determinar o sítio de acionamento da tradução, três construções que comportam três formas de orflO foram realizadas.

Estas foram obtidas por PCR, utilizando oligonucleotídeos, comportando seja um sítio de restrição Hindlll, seja um sítio de restrição BamHI. O primeiro par utilizado para a amplificação corresponde aos seguintes oligonucleotídeos: EDR39: 5 ’CCC AAGCTTGAGAAGGGAGCGG ACATTCATGGCCCGCGCCGA ACGC3 ’ (SEQ1D N° 122) (o sítio HirtdU.1 figura em negrito) EDR42 : 5’CGGGATCCGGCTGACCATGGGAGACGGGCGCATCGCCGAGTTCAGC3’ (SEQ ID M° 123) (o sítio BamHI figura em negrito) O par de atrações EDR39-EDR42 permite a amplificação de um fragmento de orf10, comportando a ATG situada o mais em 3’(posição 10809 na seqüência dada em SEQ ID N° 1) (Conforme Figura 28). O fragmento obtido forma um tamanho de aproximadamente 2 kb e será denominado na seqüência orf10 curta, ele não contém o promotor de orf10. Esse fragmento de 2kb foi clonado no vetor pGEM-T easy para dar origem ao plasmídeo pSPM520. O segundo par utilizado para a amplificação corresponde aos seguintes oligonucleotídeos: EDR40: 5’GGCAACCt J GAGAAGGGAGCGGACATTCAATGCTTTGGI AAAGCAC3 ’ (SEQ ID Nc 124) (o sítio Hindfll figura em negrito) EDR42: 5’CGGGATCCGGCTGACCATGGGAGACGGGCGCATCGCCGAGTTCAGC3’ (SEQ ID N° 123) (o sítio BamHI figura em negrito) O par de atrações EDR 40-EDR42 permite a amplificação de um fragmento de orf10, comportando o ATG situado além disso em 5’ (posição 10656 na seqüência dada em SEQ ID N° 1) (conforme Figura 28). Esse fragmento de 2,2 kb denominado na seqüência orf10 longo foi clonado no vetor pGEM-T easy para dar origem ao plasmídeo pSPM521, esse plasmídeo não contém o promotor de orf10. O terceiro par utilizado para a amplificação corresponde aos se- guintes oligonucleotídeos: EDR41 : 5’-CGCAAGCTrTCAAOGAACGACGGGGTGGTCAGTGAAGT-3’ (SEQ TD N° 125) (o sítio Hindffl figura em negrito) EDR42 : 5’CGGGATCCGGCTGACCATGGGAGACGGGCGCATCGCCGAGTTCAGC3’ (SEQ II) 123) (O Sítio BamHl figura em negrito) O par de atrações EDR41-EDR42 permite a amplificação do gene orf10 com as duas AGT, assim como seu próprio promotor (conforme Figura 28). Esse fragmento de 2,8 kb denominado na seqüência "orf10 pro" foi clonado no vetor pGEM-T easy para dar origem ao plasmídeo pSPM522. O fragmento orflO pro foi obtido utilizando-se como matriz o DNA cromossômico da cepa OSC2. Os fragmentos orflO curto e orflO longo foram obtidos utilizando-se como matriz o DNA do fragmento orflO pro previamente purificado.

Os enxertos Hindlll-BamHI dos plasmídeos pSPM520, pSPM521 e pSPM522 foram em seguida subclonados no vetor pl)WL201 (plasmídeo derivado do plasmídeo pUWL199 (Wehmeier UF, 1995), no qual o fragmento Kpnl-BamHI da região do promotor ermE (conforme Bibb et al., 1985, nota-damente a Figura 2) portando uma mutação que aumenta a força do promotor (promotor ermE*) (Bibb et al., 1994) foi introduzido (conforme Doumith et al., 2000)) previamente digerido pelas enzimas Hindlll-BamHI. Assim, foram obtidos três plasmídeo s: pSPM523 (derivado do pUWL201 com a forma orflO curto como enxerto), pSPM524 (derivado do pUWL201 com a foram orflO longo, como enxerto) e pSPM525 ((derivado do pUWL201 com a forma orflO pro) (figura 28). 17.2 Transformação da cepa OS49.50 pelas construções PSPM523, pSPM524 e pSPM525 A cepa OS49.50 (cepa interrompida no gene orflO, conforme exemplo 8) foi transformada independentemente por transformação de pro-toplastos (Kieser, T. et al., 2000) por cada um dos plasmídeos pSPM523, pSPM524 e pSPM525. Uma prova negativa foi igualmente construída, transformando-se a cepa OS49.50 pelo plasmídeo pUWL201 sem enxerto. Após transformação dos protoplastos, os clones são selecionados por sua resistência ao tiostrepton. A transformação dos clones por cada um dos plasmídeos é verificada por extração desses plasmídeos. Assim, quatro novas cepas foram obtidas: a cepa OSC49.50 pUWL201, o proveniente da transformação pelo plasmídeo pUWL201 sem enxerto, a cepa OSC49.50 pSPM523, proveniente da transformação pelo plasmídeo pSPM523, a cepa OSC49.50 pSPM524, proveniente da transformação pelo plasmídeo pSPM524 e enfim a cepa OS49.50 pSPM525, proveniente da transformação pelo plasmídeo pSPM525. A produção de espiramicinas de cada uma dessa quatro cepas foi testada por CLHP. Para isto, as diferentes cepas de streptomyces a testar foram cultivadas em erlenmeyers com chicanas (erlenmeyers chicanados) de 500 ml contendo 70 ml de meio MP5 (Pernodet et al., 1993). Quando a cepa contém o plasmídeo pUWL201 ou um de seus derivados, são acrescentados 5 pg/ml de tiostrepton. Os erlenmeyers chicanados foram inocula-dos a um concentração inicial de 2.5 106 esporas/ml das diferentes cepas de S.ambofaciens e as culturas foram incubadas a 27 °C sob agitação orbital de 250 rpm durante 96 horas. As células foram em seguida separadas do meio por centrifugação e o sobrenadante foi analisado por CLHP (conforme exemplo 16) para determinar a quantidade de espiramicina produzida. Graças a uma amostra de aferição e à medida do ar dos picos, foi possível determinar a quantidade de cada uma das espiramicinas produzidas por essas cepas. Os resultados dessa análise são apresentados na tabela 39, os dados são expressos em mg por litro do sobrenadante. Os resultados correspondem à produção total em espiramicinas (obtida adicionando-se a produção em espiramicinas I, II e III).

Tabela 39. Produção em espiramicinas das cepas derivadas de OS49.50, (resultados expressos em mg/l)_________________ Conforme mostram os resultados dados na tabela 39, a prova negativa (cepa OS49.50 transformada pelo plasmídeo pUWL201) não produz espiramicina. Quando o plasmídeo pSPM523 (que contém a forma orf10 curto) é introduzido na cepa OS49.50, nenhuma produção de espiramicina é observada. Ao contrário, a presença do plasmídeo pSPM524 (que contém a forma orflO longo) e do plasmídeo pSPM525 (que contém a form orflO pro) restaura a produção de espiramicina na cepa hospedeira OS49.50. Assim, só os fragmentos de orflO contendo o ATG mais a montante permitem restaurar a síntese de espiramicina.

Com a finalidade de confirmar esses resultados, o plasmídeo pSPM521 (plasmídeo pGEM-T easy contendo a forma orflO longo) foi digerido pela enzima de restrição Xhol (essa enzima possui um sítio único nesse plasmídeo, localizado entre as duas ATG (conforme Figura 28)). As extremidades Xhol foram em seguida tornados extremidade livre por tratamento na enzima de Klenow. O plasmídeo foi então contido sobre ele mesmo por ação da T4 DNA ligase para dar origem ao plasmídeo pSPM527. Caso a ATG a mais a montante (posição 10656 na seqüência dada em SEQ ID N° 1) seja bem utilizada como sítio de iniciação da tradução, esse tratamento acarretará uma defasagem do âmbito de leitura ao nível do sítio Xhol e terá por efeito a produção de uma proteína que não apresenta atividade ativadora. Ao contrário, se a iniciação da tradução ocorrer ao nível da ATG mais a jusante (posição 10809 na seqüência dada em SEQ ID N° 1), esse tratamento deverá ter pouco efeito ou quase nenhum sobre a expressão de OrflO (considerando-se a localização do ponto de acionamento datranscrição) e nenhum efeito sobre a proteína produzida. O enxerto BamHI-Hindlll de pSPM527 foi em seguida subclona-do no vetor pUWL201 para dar origem ao plasmídeo pSPM528. Esse plas-mídeo foi introduzido na cepa OS49.50 e um clone que possui o plasmídeo desejado foi mais particularmente selecionado. A produção de espiramicina da cepa resultante foi em seguida testada por CLHP (conforme exemplo 16 e acima). Contrariamente ao que fora observado com o plasmídeo pSPM524 (conforme tabela 39), a presença do plasmídeo pSPM528 na cepa OS49.50 não restabelece a produção de espiramicina. Isto confirma que o acionamento da tradução do gene orf10 é a ATG situado mais a jusante (ATG 1, conforme Figura 28). 17.3 Melhoria da produção em eSpiramicinas da cepa OSC2 de S.ambofaciens A fim de testar o efeito da superexpressão do gene orf10 sobre a produção de espiramicinas, os plasmídeos pSPM523, pSPM524, pSPM525 e pSPM528 foram introduzidos na cepa OSC2. Para isto, protoplastos da cepa OSC2 foram transformados (Kieser, T. et al., 2000) independentemente por cada um dos plasmídeos pSPM523, pSPM524, pSPM525 e pSPM528. Uma prova negativa foi também realizada, transformando a cepa OSC2 pelo plasmídeo pUWL201 sem enxerto. Após transformação de protoplastos, os clones são selecionados por sua resistência ao tiostrepton. Assim, cinco novas cepas foram obtidas: a cepa OSC2 pUWL201, proveniente da transformação pelo plasmídeo pUWL201 sem enxerto, a cepa OSC2 pSPM523, proveniente da transformação pelo plasmídeo pSPM523, a cepa OSC2 pSPM524, proveniente da transformação pelo plasmídeo pSPM524, a cepa OSC2 pSPM525, proveniente da transformação pelo plasmídeo pSPM525, e enfim a cepa OSC2 pSPM528, proveniente da transformação pelo plasmídeo pSPM528. A produção em espiramicinas dessas cepas foi então analisada por CLHP (do mesmo modo que no exemplo 17.2). A análise da produção em espiramicinas da cepa OSC2 foi também feita em paralelo para comparação. Os resultados dessa análise são apresentadas na tabela 40, os dados são expressos em mg por litro do sobrenadante. Os resultados correspondem à produção total em espiramicinas (obtida adicionando-se a pro- dução em espiramicina I, II e III).

Tabela 40. Produção em espiramicinas das cepas derivadas de OSC2 (re-sultados expressos em mg/l).________________________________________ Assim, foi observado que a presença do plasmídeo pSPM524 ou do plasmídeo pSPM525 aumenta significativamente a produção em espiramicinas da cepa OSC2. Isto demonstra bem que a superexpressão de OrflO tem um efeito positivo sobre a produção em espiramicinas. O plasmídeo pSPM528 não tem, ao contrário, efeito sobre a produção em espiramicinas.

Os plasmídeos pSPM525 e pUWL201 foram do mesmo modo introduzidos na cepa SPM502 (conforme exemplo 14). Assim duas novas cepas foram obtidas: a cepa SPM502 pUWL 201, proveniente da transformação pelo plasmídeo pUWL201 sem enxerto, e a cepa SPM502 pSPM525, proveniente da transformação pelo plasmídeo pSPM525.

Uma amostra da cepa SPM502 pSPM525 (essa cepa contém o plasmídeo pSPM525, conforme acima) foi depositada junto à Collection Na-tionale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, em 26 de fevereiro de 2003 sob o número de registro I-2977. A produção em espiramicinas das cepas SPM502 pUWL201 e SPM502 pSPM525 foi analisada por CLHP (da mesma maneira que no exemplo 17.2). A análise da produção em espiramicinas da cepa SPM502 foi também feita em paralelo para comparação. Os resultados dessa análise são apresentados na tabela 41, os dados são expressos em mg por litro do sobrenadante. Os resultados correspondem à produção em espiramicinas I. Com efeito, nenhuma dessas cepas produz espiramicina II e III.

Tabela 41. Produção em espiramicina I das cepas derivadas de SPM502, (resu tados expressos em mg/l)______________________ Assim, pôde ser observado que a superexpressão do gene orf10 na cepa SPM502 aumenta de forma importante a produção de espiramicina I. EXEMPLO 18: construção de uma banco de DNA genômico da cepa OSC2 de streptomyces ambofaciens em E.coli no cosmídeo pWED2. 18.1 Construção do cosmídeo pWED2 Com a finalidade de facilitar a inativação de genes em streptomyces, um cosmídeo que porta a seqüência oriT do plasmídeo RK2 (o que permite sua introdução por conjugação em streptomyces a partir de uma cepa apropriada de E. coli) e portando também um gene de resistência a um antibiótico conferindo um fenótipo marcável em streptomyces foi construído. Esse cosmídeo contendo grandes enxertos de DNA genômica de streptomyces ambofaciens pode ser utilizado em experiências de inativação de genes.

Para construir esse vetor, umo cassette pac-oriT (fragmento EcoRV) foi introduzido no cosmídeo pWED1 (Gourmelen et., 1998), derivado do cosmídeo pWED15 (Wahl et al., 1987), ao nível do sítio único Hpal. O cassette pac-oriT foi obtida por PCR. Para isto, o gene pac foi amplificado por PCR a partir do plasmídeo pVF 10.4 (Vara et al., 1985; Lacalle et al., 1989), utilizando como primeira atração, a atração A (de seqüência 5' CCAGTAGATATCCCGCCAACCCGGAGCTGCAC-31 (SEQ ID N° 126), o sítio de restrição EcoRV foi sublinhado e a seqüência em negrítode 20 nu-cleotídeos corresponde a uma região a montante do promotor do gene pac) e como segunda atração, a atração B (de seqüência 5' GAAAAGATCCGTCATGOGQTCGTGCGCTC.eTTT (SEQ ID N° 127), que comporta em sua extremidade 5’ uma seqüência de 12 nucleotídeos correspondentes ao começo da sequência oriT (sublinhado duplo) e uma seqüência de 20 nucleotídeos (em traços cheios) correspondente ao fim do gene pac (conforme Figura 29, 1a PCR). O gene oriT foi amplificado por PCR a partir do plasmídeo pPM803 (Mazodier,P. et al., 1989), utilizando como primeira atração, a atração C (de seqüência 5'-C ACGACCCCAT G ACGO ATCTTTTCCGC-TGCAT-31 (SEQ ID N° 128)), que comporta em sua extremidade 5’ uma seqüência De 12 nucleotídeos correspondendo a uma seqüência a jusante da seqüência codificante do gene pac (em traços cheios) e uma seqüência de 20 nucleotídeos correspondendo ao começo da seqüência oriT) e como segunda atração, a atração D (de seqüência que comporta o sítio de restrição EcoRV (sublinhado duplo) (conforme Figura 29, 2a PCR). O produto de amplificação obtido com as atrações A e B e aquele obtido com as atrações C e D têm em uma de suas extremidades, uma seqüência comum de 24 nucleotídeos. Uma terceira PCR foi realizada, misturando-se os dois produtos de amplificação obtidos anteriormente e utilizando-se como atrações, as atrações A e D (conforme Figura 29, 3a PCR). Isto permitiu obter um produto de amplificação correspondente ao conjunto pac+oriT. Esse fragmento pac-oriT foi então clonado no vetor pGEM-T Easy (comercializado pela sociedade Promega (Madison, Wisconcin, USA)), o que permitiu obter o plasmídeo pGEM-T-pac-oriT. O enxerto desse plasmídeo foi em seguida subclonado no cosmídeo pWEDI. Para isto, o plasmídeo pGEM-pac-oriT foi digerido pela enzima EcoRV e o enxerto EcoRV contendo o conjunto pac+oriT foi inserido no cosmídeo pWEDI aberto previamente pela enzima Hpal. O cosmídeo assim obtido foi batizado pWED2 (conforme Figura 30).

Esse cosmídeo permite facilitar a inativação de genes em streptomyces. Com efeito, ele porta a seqüência oriT (o que permite sua introdução por conjugação em streptomyces, a partir de uma cepa apropriada de E.coli), mas também um gene de resistência a um antibiótico, conferindo um fenótipo marcável em streptomyces. Esse cosmídeo, contendo grandes enxertos de DNA genômico de streptomyces ambofaciens pode ser utilizado em experiências de inativação de genes.

Assim, um cosmídeo derivado de pWED2, contendo o gene alvo, poderá, por exemplo, ser introduzido na cepa de E. coli KS272, contendo o plasmídeo pKOBEG (conforme Chaveroche et al., 2000) e umo cassette será introduzida no gene alvo, segundo a técnica descrita por Chaveroche et al., 2000. O cosmídeo obtido por essa técnica (cosmídeo no qual o gene alvo é inativado), poderá em seguida ser introduzido em uma cepa de E.coli, tal como a cepa S17.1 ou qualquer outra cepa, permitindo transferir por conjugação dos plasmídeos contendo a seqüência oriT em direção ao streptomyces.

Após conjugação entre E.coli e streptomyces, clones de streptomyces nas quais a cópia primitiva do gene alvo terá sido substituída pela cópia interrompida poderão ser obtidas conforme descrito no exemplo 2. O gene de resistência expresso em streptomyces presente sobre esse novo cosmídeo é o gene pac de streptomyces alboniger (Vara, J. et al., 1985; Lacalle et al., 1989) que codifica a puromicina N-acetil transferase e que confere a resistência à puromicina. Quando de experiências de inativação de g ene, buscar-se-ão clones nos quais um duplo acontecimento de recombinação terá ocorrido. Esses clones terão eliminado o cosmídeo pWED2 e serão, portanto, tornados de novo sensíveis à puromicina. 18.2 Construção de um banco de DNA genômico da cepa OSC2 de streptomyces ambofaciens em E.coli no cosmídeo pWED2 O DNA genômico da cepa OSC2 de streptomyces ambofaciens foi digerido parcialmente pela enzima de restrição BamHI, de maneira a serem obtidos fragmentos de DNA de tamanho compreendido entre aproximadamente 35 e 45 kb. Esses fragmentos foram em seguida clonados no cosmídeo pWED2, este tendo sido previamente digerido por BamHI, depois tratado pela fosfatase alcalina. A mistura de ligação foi em seguida encapsi- dada in vitro em partículas de fagos lambda, graças ao sistema "Packagene® Lambda DNA packaging system" comercializado pela sociedade Promega (Madison, Wisconcin, USA) seguindo as recomendações do fabricante. As partículas fágicas obtidas foram utilizadas para infectar a cepa SURE® de E.coli comercializada pela sociedade Stratagene (LaJolla, Califórnia, USA). A seleção dos clones foi feita sobre meio LB + ampicilina (50 pg/ml), o cos-mídeo pWED2, conferindo a resistência à ampicilina. EXEMPLO 19: isolamento de cosmídeo do novo banco que cobre a região da via de biossíntese das espiramicinas. Sob clonagem e seqüenciação de fragmentos desses cosmídeos. 19.1 Hibridização sobre colônias do banco genômico de streptomyces ambofaciens OSC2 Cosmídeos do novo banco de streptomyces ambofaciens OSC2 (conforme exemplo 18), cobrindo os orf*1 ao orf10* ou uma parte ou a totalidade dos orf1 a orf25c, ou uma região mais a montante do orf25c foram isolados. Para isso, hibridizações sucessivas sobre as colunas de E. coli obtidas segundo o exemplo 18 foram realizadas, utilizando-se as 3 seguintes sondas (conforme Figura 31): - a primeira sonda utilizada corresponde a um fragmento de DNA de aproximadamente 0,8kb amplificado por PCR, utilizando como matriz o cosmídeo pSPM5 e as seguintes atrações: ORF23c: 5VACGTGCGCGGTGAGTTCGCCGTTGC-3' (SEQ XD K° 130) e ORF25c: 5'-CTGAACGACGCCATCGCGGTGGTGC-3* (SEQ 1D N° 131). O produto de PCR assim obtido contém um fragmento do começo do orf23c, orf24c por inteiro e o fim do orf25c (conforme Figura 31, sonda I); - a segunda sonda utilizada corresponde a um fragmento de DNA de aproximadamente 0,7kb amplificado por PCR, utilizando como matriz o DNA total da cepa S.ambofaciens ATCC23877 e as seguintes atrações: ORFl*c: 5'-GACCACCTCGAACCGTCCGGCGTCA-3' (SEQ ID N° 132) e ORF2*c : 5'-GGCCCGGTCCAGCGTGCCGAAOC-3’ (SEQ ID N° 133). O produto de PCR assim obtido contém um fragmento do fim do orf1*c e do começo da orf2*c (conforme Figura 31, sonda II); - a terceira sonda utilizada corresponde a um fragmento EcoRI-BamHI de aproximadamente 3Kb contendo os orf1, orf2 e orf3 e obtido por digestão do plasmídeo pOS49.99 (cf Figura 31, sonda III).

Aproximadamente 2000 clones do banco obtido no exemplo 18.2 foram transferidos sobre filtro para hibridização sobre colônias, segundo as técnicas clássicas (Sambrook et al., 1989). A primeira sonda (conforme Figura 31, sonda I) foi marcada com 32P pela técnica do "random priming" (Kit comercializado pela sociedade Roche) e utilizadas para a hibridização sobre 2000 clones do banco, após transferência sobre filtro. A hibridização foi feita a 65°C no tampão descrito por Church & Gilbert (Church & Gilbert, 1984). Duas lavagens foram feitas em 2x SSC, 0,1% SDS a 65°C, a primeira durante 10 minutos e a segunda durante 20 minutos e uma terceira lavagem de uma duração de 30 minutos foi em seguida feita em 0,2X SSC, 0,1% SDS a 65°C. Nessas condições de hibridização e de lavagem, 20 clones dentre os 2000 hibridados apresentavam um forte sinal de hibridização com a primeira sonda. Esses 20 clones foram cultivados em meio LB+ ampicilina (50 pg/ml) e os 20 cosmídeos cor-respondenets foram extraídos por lise alcalina (Sambrook et al., 1989), depois foram digeridos pela enzima de restrição BamHI. Os produtos de digestões foram em seguida separados sobre gel de agarose, transferidos sobre membrana de Nylon e hibridados pela primeira sonda (cgf. acima: o produto de PCR ORF23c-ORF25c, sonda I) nas mesmas condições que acima. Doze cosmídeos possuíam um fragmento pSPM34, pSPM35, pSPM36, pSPM37, pSPM38, pSPM39, pSPM40, pSPM41, pSPM42, pSPM43, pSPM44 e pSPM45. Os perfis, após digestão por BamHI, desses 12 cosmídeos foram comparados entre si e com aquele do cosmídeo pSPM5. Além disso, experiências de amplificação por PCR, utilizando diferentes atrações correspondentes a diferentes genes já identificados na região orf1-orf25c permitiram posicionar o enxerto de certos desses cosmídeos uns em relação aos outros e determinar também a localização desses enxertos na região orf1-orf25c]á conhecida (conforme Figura 32). O cosmídeo pSPM36 foi mais particularmente escolhido, pois era capaz de conter uma grande região a montante do orf25c (conforme Figura 31 e 32).

Em uma segunda etapa, e utilizando as mesmas condições que aquelas descritas acima, os 200 clones do banco de streptomyces ambofa-ciens OSC2 foram hibridados com a segunda sonda correspondente ao produto de PCR: ORF1*c-ORF2*c (conforme Figura 31, sonda II). Essa hibridi-zação permitiu isolar cosmídeos, cujo enxerto fica situado na região de orf1*c ao orf10*c. Nas condições de hibridização utilizadas, 16 clones dentre os 2000 hibridados apresentavam um forte sinal de hibridização com essa segunda sonda. Esses 16 clones foram cultivados em meio LB+ ampicilina (50 pg/ml) e os 16 cosmídeo correspondentes foram extraídos por lise alcalina (Sambrook et a!., 1989), depois foram digeridos pela enzima de restrição BamHI. Os perfis de digestão (após digestão por BamHI) desses 16 cosmídeos foram comparados entre si e com aquele do cosmídeo pSPM7. Experiências de amplificação por PCR com as atrações ORF1*c e ORF2*c permitiram escolher dois cosmídeos que continham bem os genes orf1*c e orf2*c e cujos perfis possuíam faixas comuns, mas também faixas diferentes. Além disso, outras experiências de amplificação por PCR, utilizando diferentes atrações correspondentes a diferentes genes já identificados na região orf1*c à orf10*c permitiram posicionar o enxerto desses cosmídeos uns em relação aos outros e determinar também a localização desses enxertos na região orf1*c ao orf10*c já conhecida (conforme Figura 32). Os dois cosmídeos mais particularmente selecionados foram denominados pSPM47 e pSPM48 (conforme Figura 32).

Utilizando-se as mesmas condições que aquelas descritas acima, os 2000 clones do banco de streptomyces ambofaciens OSC2 foram também hibridados com a terceira sonda correspondente ao fragmento de DNA EcoRI-BamHI do plasmídeo pOS49.99 (conforme Figura 31 sonda III). Essa hibridização permitiu isolar os cosmídeo contendo a região do orf1 até orf3 e capazes de conter seja uma grande parte dos genes dos PKS, seja uma grande parte dos genes orf1 ao orf25c da via de biossíntese das espi- ramicinas. Nessas condições de hibridização, 35 clones dentre os 2000 hi-bridados apresentavam um forte sinal de hibridização com a terceira sonda. Esses 35 clones foram cultivados em meio LB+ ampiciiina (50 μς/ιτιΙ) e os 35 cosmídeos correspondentes foram extraídos por lise alcalina (Sambrook et al., 1989), depois digeridos pela enzima de restrição BamHI. Os perfis, após digestão por BamHI, desses 35 cosmídeo foram comparados entre si e com aquele do cosmídeo pSPM5. Além disso, experiências de amplificação por PCR, utilizando diferentes atrações correspondentes a diferentes genes já identificados na região orf1 ao orf25c permitiram verificar que esses cosmídeos continham bem enxertos provenientes da região orf1 ao orf25c e posicionar os enxertos desses cosmídeos uns em relação aos outros e em relação à região orf1 ao orf25c já conhecida (conforme Figura 32). Cinco cosmídeo foram mais particularmente selecionados, foram denominados pSPM50, pSPM51, pSPM53, pSPM55 e pSPM56 (conforme Figura 32). 19.2 Subclonagem e seqüenciação de uma parte do enxerto do cosmídeo pSPM36 A sonda de aproximadamente 0,8 kb obtida por PCR com as atrações ORF23c e ORF25c (conforme acima e Figura 31, sonda I) foi também utilizada em experiências de Southern Blot sobre o DNA total de S.ambofaciens OSC2 digerido pela enzima Pstl. Nas condições de hibridização descrita acima, essa sonda revela um fragmento único Pstl de aproximadamente 6 kb, quando hibridizado sobre o DNA total de S.ambo OSC2 digerido pela enzima Pstl. Existe um local Pstl ao nível do orf23c (conforme SEQ ID N° 80), mas nenhum outro local Pstl até à extremidade (site BamHI) da seqüência conhecida (conforme SEQ ID N° 1). Esse fragmento Pstl-BamHI tem um tamanho de aproximadamente 1.4 kb. O fragmento Pstl de 6 kb hibridizado sobre o DNA total de S.ambofaciens digerido pela enzima Pstl contém, portanto, uma região de aproximadamente 4,6 kb situada a montante de orf25c. Essa região é capaz de conter outros genes, cujos produtos são implicados na via de biossíntese da espiramicina. Foi verificado por digestão que o cosmídeo pSPM36 continha bem esse fragmento pstl de 6 kb. Esse fragmento foi isolado a partir de pSPM36, com a finalidade de determi- nar a seringa mais a montante de orf25c. Para isso, o cosmídeo pSPM36 foi digerido pela enzima de restrição Pstl. O fragmento Pstl-Pstl de um tamanho de aproximadamente 6 kb foi isolado por eletropurificação, a partir de um gel de agarose 0,8%, depois clonado no vetor pBK-CMV (4512bp) (comercializado pela sociedade Stratagene (La Jolla, Califórnia, USA). O plasmídeo assim obtido foi denominado pSPM58 (conforme Figura 33) e a seqüência de seu enxerto foi determinada. A seringa desse enxerto é apresentada em SEQ ID N° 134.

Todavia, toda a seqüência não foi determinada e subsiste um orifício de aproximadamente 450 nucleotídeos, a parte da seqüência não-determinada foi anotada por uma sucessão de "N" na seqüência correspondente. 19.3 Análise das novas seqüências nucleotídicas, determinação das fases abertas de leitura e caracterização dos genes implicados na bios-síntese das espiramicinas A seqüência do enxerto do cosmídeo pSPM58 obtida foi analisada graças ao programa FramePlot (Ishikawa J. & Hotta K. 1999). Isto permitir identificar, dentre as fases abertas de leitura, as fases abertas de leitura apresentando um uso dos códons típico de streptomyces. Essa análise permitiu determinar que esse enxerto comporta 4 novos ORFs a montante da orf25c (conforme Figura 34). Esses genes foram denominados orf26 (SEQ ID N° 107), orf27 (SEQ ID N° 109), orf28c (SEQ ID N° 111, a seqüência desse orf não foi determinada completamente já que um orifício de aproximadamente 450 nucleotídeos subsiste, quando da seqüenciação do enxerto de pSPM58, esses 450 nucleotídeos figuram sob a forma de uma série de "N" na seqüência SEQ ID N° 111) e orf29 (a seqüência deste último orf era incompleta nesse enxerto). O "c" acrescentado no nome do gene significante para a ORF em questão que a seqüência codificante está orientação inversa (conforme Figura 34).

As seqüências protéicas deduzidas dessas fases abertas de leitura foram comparadas com aquelas presentes em diferentes bases de dados graças a diferentes programas: BLAST (Altschul et al., 1990) (Altschul et al., 1997), CD-serach, (esses dois programas são acessíveis notadamente junto ao National Center for Biotechnology Information (NCBI) (Bethesda, Maryland, USA)), FASTA ((Pearson W.R & D.J. Lipman, 1988) e (Pearson W.R., 1990) (esse programa é acessível notadamente junto ao centro de pesquisas INFOBIOGEN, Evry, França). Essas comparações permitiram formular hipóteses sobre a função dos produtos desses genes e identificar aqueles capazes de serem implicados na biossíntese de espiramicinas. 19.4 Subclonagem e seqüenciação de uma outra do enxerto do cosmídeo pSPM36 A sonda de aproximadamente 0,8 kb obtida por PCR com as atrações ORF23c e ORF25c (conforme acima e Figura 31, sonda I) foi também utilizada em experiências de Southern Blot sobre o DNA total da cepa OSC2 digerido pela enzima Stul. Nas condições de hibridização descrita acima para essa sonda, essa sonda revela um fragmento único Stul de aproximadamente 10 kb, quando hibridizado sobre o DNA total da cepa OSC2 digerido pela enzima Stul. Considerando-se a presença de um sítio Stul no orf23c (conforme SEQ ID N° 80) e da localização desse sítio em relação ao sítio Pstl, esse fragmento de 10 kb inclui a totalidade do fragmento Pstl anteriormente estudado (enxerto de pSPM58) e permite ter acesso a uma região não ainda estudada de aproximadamente 4 kb (conforme Figura 33). Foi verificado por digestão que o cosmídeo pSPM36 continha bem esse fragmento Stul do 10 kb. Esse fragmento foi isolado a partir do cosmídeo pSPM36, com a finalidade de determinar a seqüência do fim de orf29 e de outros genes mais a montante de orf29. Para isto, o cosmídeo pSPM36 foi digerido pela enzima de restrição Stul. O fragmento Stul-Stul de um tamanho de aproximadamente 10 kb foi isolado por eletropurificação a partir de um gel de agarose 0,8%, depois clonado no vetor pBK-CMV (4512bp) (comercializado pela sociedade Stratagene (LaJolla, Califórnia, USA)). O plas-mídeo assim obtido foi denominado pSPM72 (conforme Figura 33). Este último foi em seguida digerido por EcoRI (sítio EcoRI no enxerto de pSPM58) e Hindlll (sítio Hindlll no sítio de clonagem múltipla do vetor, imediatamente após o sítio Stul da extremidade do enxerto) (conforme Figura 33). O frag- mento de DNA EcoRI-Hindlll assim obtido corresponde a um fragmento do enxerto do plasmídeo pSPM72 (conforme Figura 33) e foi subclonado no vetor pBC-SK+ (comercializado pela sociedade Stratagene (La Jolla, Califórnia, USA)) digerido previamente por EcoRI e Hindlll. O plasmídeo assim obtido foi denominado pSPM73 e a seqüência de seu enxerto foi determinada. A seqüência desse enxerto é apresentada em SEQ ID N° 135.

Uma ligação das seqüências dos enxertos de pSPM58 e pSPM73 está presente em SEQ ID N° 106. Essa seqüência parte do sítio Pstl ao nível da orf23c (conforme SEQ ID N° 80) e vai até o sítio Stul ao nível do orf32c (conforme Figura 34). A seqüência do orf28c (SEQ ID N° 111) não estando completa (conforme exemplo 19.3), uma região de aproximadamente 450 nucleotídeos não é seqüenciada, esses 450 nucleotídeos figuram sob a forma de uma série de "N" na seqüência SEQ ID N° 106) 19.5 Análise das novas seqüências de nucleotídeos, determinação das fases abertas de leitura e caracterização dos genes implicados na biossíntese de espiramicinas A seqüência parcial do enxerto do cosmídeo pSPM73 obtida foi analisada graças ao programa FramePlot (Ishikawa J & Hotta K., 1999). Isto permitiu identificar, dentre as fases abertas de leitura, as fases abertas de leitura apresentando um uso de códons típica de streptomyces. Essa análise permitiu determinar que esse enxerto comporta 4 ORFs, uma incompleta e três completas (conforme Figura 34). A ORF incompleta corresponde à parte 3’ da seqüência codificante de orf29, o que permitiu completar a seqüência desse gene, graças à seqüência parcial desse mesmo orf obtida quando da seqüenciação do enxerto do plasmídeo pSPM58 (conforme exemplo 19.2 e 19.3), o conjunto das duas seqüências permitiu assim obter a seqüência completa de orf29. Os 4 genes foram assim chamados orf29 (SEQ ID N° 113), orf30c (SEQ ID N° 115), orf31 (SEQ ID N° 118) e orf32c (SEQ ID N° 120). O "c" acrescentado no nome do gene significante para o ORF em questão indica que a seqüência codificante está na orientação inversa (conforme Figura 34).

As seqüência protéicas deduzidas dessas fases abertas de leitu- ra (SEQ ID N° 114 para orf29, SEQ ID N° 116 e 117 para orf30c, SEQ ID N° 119 para orf31 e SEQ ID N° 121 para orf32c) foram comparadas com aquelas presentes em diferentes bases de dados, graças a diferentes programas: BLAST (Altschul et al., 1990) (Altschul et al, 1997), CD-search, (esses dois programas são acessíveis notadamente junto ao National Center for Biote-chnology Information (NCBI) (Bethseda, Maryland, USA)), FASTA ((Pearson W.R & D.J. Lipman, 1988) e (Pearson W.R., 1990) (esse programa é acessível notadamente junto ao centro de pesquisas INFOBIOGEN, Evry, França). Essas comparações permitiram formular hipóteses sobre a função dos produtos desses genes e identificar aqueles capazes de ser implicados na bios-síntese de espiramicinas. 19.6. Subclonagem e seqüenciação de uma terceira parte do enxerto do cosmídeo pSPM36.

Uma sonda (fragmento de DNA de 0,8 kb) correspondente a uma seqüência interna ao orf32c foi obtida por PCR, utilizando como matriz o DNA total da cepa de streptomyces ambofaciens e as seguintes atrações: KF36: 5’- TTGCCGTAGCCGAGGACCAGCG-3’ (SEQ ID N° 151) e KF37: 5'- CACATGGCCCTGGAGGACCCTG-3, (SEQ ID N° 152). O produto PCR assim obtido representa uma seqüência interna do orf32c. Essa sonda foi utilizada em experiências de Southern Blot sobre o DNA cromossômico da cepa OSC2 e sobre o DNA dos cosmídeos pSPM36 digeridos pela enzima Pstl. Utilizando-se as mesmas condições de hibridiza-ção que aquelas descritas acima (conforme exemplo 19.1), essa sonda revela dois fragmentos Pstl de aproximadamente 3,4 kb e 2,5 kb, quando hi-bridizada sobre o DNA total da cepa OSC2 e sobre o DNA do cosmídeo pSPM36 digeridos pela enzima Pstl. Considerando-se a presença de um sítio Pstl na sonda utilizada, podem ser explicados esses resultados. O primeiro fragmento de DNA que tem um tamanho de aproximadamente 3,4 kb é um fragmento cuja seqüência já é conhecida na totalidade. A seqüência do fragmento de 2,5 kb é conhecida apenas parcialmente, sobre uma região de 700 pb. Esse fragmento foi isolado a partir do cosmídeo pSPM36 com a finalidade de determinar a seqüência do fim da orf32c e de outros genes a montante deste. Para isto, o cosmídeo pSPM36 foi digerido pela enzima de restrição Pstl. O fragmento Pstl-Pstí de um tamanho de aproximadamente 2,5 kb foi isolado por purificação a partir de um gel de agarose 0,8%, depois clonado no vetor pBK-CMV (4518bp) (comercializado pela sociedade Strata-gene (La Jolla, Califórnia, USA)). O plasmídeo assim obtido foi denominado pSPM79 (conforme Figura 41) e a seqüência de seu enxerto foi determinada. A seqüência do orf28c (SEQ ID N° 111) não era completa (conforme exemplo 19.3). Com efeito, uma região de aproximadamente 450 nu-cleotídeos não pudera ser determinada, esses 450 nucleotídeos figuram sob a forma de uma série de "N" na seqüência SEQ ID N° 106. A seqüência da totalidade da região que falta foi determinada por nova seqüenciação dessa região. A seqüência dos enxertos de pSPM58 e pSPM73 foi, portanto, determinada por inteiro. A seqüência completa da parte codifícante do orf28c é apresentada em SEQ ID N° 141 e a proteína deduzida dessa seqüência em SEQ ID N° 142. A seqüência do enxerto do plasmídeo pSPM79 é apresentada em SEQ ID N° 161.

Uma ligação das seqüências dos enxertos de pSPM58, pSPM73 e pSPM79 é apresentada em SEQ ID N° 140 (conforme Figura 41). Essa seqüência parte do sítio Pstl ao nível do orf23c (conforme SEQ ID N° 80) e vai até o sítio Pstl ao nível do orf34c (conforme Figura 41). 19.7 Análise das novas seqüências nucleotídicas, determinação das fases abertas de leitura e caracterização dos genes que podem ser implicados na biossíntese das espiramicinas A seqüência do enxerto do plasmídeo pSPM79 obtida foi analisada, graças ao programa Frame Plot (Ishikawa J & Hotta K., 1999). Isto permitiu identificar, dentre as fases abertas de leitura, as fases abertas de leitura que apresentam um uso dos códons típico de streptomyces. Essa análise permitiu determinar que esse enxerto comporta 30RFs, dois incompletos (orf32c e orf34c) e um completo (orf33) (conforme Figura 41). O primeiro ORF incompleto corresponde à parte 5’ da seqüência codifícante de orf32c. Isto permitiu completar a seqüência desse gene, gra- ças à seqüência parcial desse mesmo orf obtido quando da seqüenciação do enxerto do plasmídeo pSPM73, (conforme exemplo 19.4 e 19.5), o conjunto das duas seqüências permitiu assim obter a seqüência completa de orf32c. (SEQ ID N° 145). O "c" acrescentado no nome do gene significa para o ORF em questão que a seqüência codificante está na orientação inversa (conforme Figura 41). O orf completo foi denominado orf33 (SEQ ID N° 147). O terceiro ORF foi denominado orf34 (SEQ ID N° 149). O "c" acrescentado no nome do gene significa para o ORF em questão que a seqüência codificante está na orientação inversa (conforme Figura 37). As comparações feitas entre o produto desse orf e os bancos de dados sugerem que a parte C-terminal dessa proteína não está no produto deduzido da seqüência nucleo-tídica e, portanto, que esse orf seria mais longo e continuaria fora da região seqüenciada.

As seqüências protéicas deduzidas dessas fases abertas de leitura foram comparadas com aquelas presentes em diferentes bases de dados graças a diferentes programas: BLAST (Altschul et al., 1990) (Altschul et al., 1997), CD-search (esses dois programas são acessíveis notadamente junto ao National Center for Biotechnoiogy Information (NCBI) (Bethesda, Maryland, USA)), FASTA ((Pearson W. R & D.J. Lipman, 1988) e (Pearson W. R., 1990) (esse programa é acessível notadamente junto ao centro de pesquisas INFOBIOGEN, Evry, França). Essas comparações permitiram formular hipóteses sobre a função dos produtos desses genes e identificar aqueles capazes de serem implicados na biossíntese de espíramicinas. EXEMPLO 20: Análise da produção de intermediários de biossíntese de es-piramicinas 20.1 Preparação das amostras As diferentes cepas a testar foram cultivadas cada uma em 7 erlenmeyers chicanados de 500 ml, contendo 70 ml de meio MP5 (Pernodet et al., 1993). Os erlens foram inoculados por 2.5 106 esporas/ml das diferentes cepas de S. ambofaciens e colocadas para crescer a 27°C sob agitação orbital de 250 rpm durante 96 horas. As culturas correspondentes ao mesmo clone são reunidas, eventualmente filtradas sobre filtro plissado, e centrifugadas 15 minutos a 7000 rpm. O pH do mosto é em seguida ajustado a 9 com a soda e o so-brenadante é extraído pela metil iso-butiril cetona (MIBK). A fase orgânica (MIBK) é então recuperada e evaporada. O extrato seco é em seguida retomado em 1 ml de acetonitrila, depois diluído em 1/10 (100 μΙ qsp 1 ml com água), antes de ser utilizado para as análises em cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa (CL/SM).

20.2 Análise das amostras em CL/SM

As amostras foram analisadas em CL/SM com a finalidade de determinar a massa dos diferentes produtos sintetizados pelas cepas a testar. A coluna de cromatografia líquida de elevado desempenho utilizada é uma coluna Kromasil C8 150*4,6mmm, 5mmm, 100 Λ. A fase móvel é um gradiente constituído de uma mistura de acetonitrila e de uma solução aquosa de ácido trifluoroacético a 0,05%, a vazão é fixada em 1 ml/min. A temperatura do forno da coluna é mantida em 30°C. A detecção UV na saída da coluna é feita com dois comprimentos de onda diferentes: 238 nm e 280 nm. O espectrômetro de massa acoplado à coluna de cromatografia é um aparelho Simples Quadripolo comercializado pela sociedade Agilent, com tensões de cone a 30 e a 70V. 20.3 Análise dos intermediários de biossíntese produzidos pela cepa OS49.67 A sonda OS49.67 na qual o gene orf3 é inativado por uma dele-ção em fase não produz espiramicinas (conforme exemplo 6 e 15).

Uma amostra foi preparada segundo o método descrito acima (conforme parágrafo 20.1) e foi analisada por CL/SM conforme descrito acima (conforme o parágrafo 20.2).

Mais particularmente, a análise por cromatografia foi feita em gradiente de solvente com como fase móvel: 20% de acetonitrila do tempo T = 0 a 5 min, depois subida linear a 30% a T = 35 minutos, seguida de um patamar até T = 50 minutos.

Nessas condições, dois produtos foram mais particularmente observados: um absorvente com 238 nm (tempo de retenção de 33,4 minutos) e um absorvente com 280 nm (tempo de retenção de 44,8 minutos) (conforme Figura 35). A Figura 35 mostra a superposição dos cromatogra-mas CLHP realizados em 238 e 280 nm (alto), assim como os espectros UV das moléculas purificadas em 33,4 minutos e 44,8 minutos (embaixo).

As condições de análises em espectrometria de massa acoplada eram as seguintes: a varredura foi feita em modo scan, abrangendo uma faixa de massa compreendida entre 100 e 1000 Da. O ganho do eletromulti-plicador era de 1V. Com referência à fonte eletrospray, a pressão do gás de nebulização era de 241,3 KpA manométrico (35 psig), a vazão do gás se-cante de 12.0 l.min'1, a temperatura do gás secante de 350°C, a tensão do capilar era levada a +/- 3000 V. Essas experiências permitiram determinar a massa dos dois produtos separados. Essas massas são respectivamente de 370 g/mol para o produto purificado primeiro ([M-hhO]* = 353 produto majoritário) e 368 g/mol para o segundo produto ([Μ-Η2θ]+ = 351 produto majoritário). A fim de se obter a estrutura, os produtos mencionados acima foram isolados e purificados nas seguintes condições: a fase móvel é uma mistura de uma solução aquosa de ácido trifluoroacético a 0,05% e de ace-tonitrila 70/30 (v/v). A cromatografia é feita em regime isocrático com uma vazão fixada em 1 ml/min. Nessas condições, os tempos de retenção dos 2 produtos são respectivamente de 8 e 13,3 minutos. Além disso, nesse caso, a amostra preparada (conforme parágrafo 20.1) não é diluída na água antes da injeção de 10 μΙ.

Os 2 produtos são recuperados à saída da coluna cromatográfi-ca e isolados nas seguintes condições: um cartucho Oásis HLB 1 cc 30 mg (Waters) é acondicionado seqüencialmente por 1 ml de acetonitrila, depois 1 ml de água/acetonitrila (20v/80v) e 1 ml de água/acetonitrila 80/20. A amostra é em seguida introduzida e o cartucho lavado sucessivamente por 1 ml de água/acetonitrila (95/5), 1 ml de água/acetonitrila deuterada (95/5), depois purificada com 600 μΙ de água/acetonitrila deuterada 40/60. A solução recuperada é em seguida diretamente analisada em RMN.

Os espectros RMN obtidos para esses dois compostos são os seguintes: - Primeiro produto purificado: platenolídeo A: (Espectro 9646V) Espectro 1H em CD3CN (deslocamentos químicos em ppm): 0,90 (3H, t, J=6Hz), 0,93 (3H, t, J=5Hz), 1,27 (3H, t, J=5Hz), entre 1,27 e 1,40 (3H, m), 1,51 (1H, m), 1,95 (1H, m), 2,12 (1H, m), 2,30 (1H, d, J=12Hz), 2,50 (1H, d, J=11 Hz), 2,58 (1H, dd, J=9 e 12 Hz), 2,96 (1H, d, J=7Hz), 3,43 (3H, s), 3,70 (1H, d, J=9Hz), 3,86 (1H, d, J=7Hz), 4,10 (1H, m), 5,08 (1H, m), 5,58 (1H, dt, J=3 e 12Hz), 5,70 (1H, dd, J=8 e 12Hz), 6,05 (1H, dd, J=9 e 12Hz), 6,24 (1H, dd, J=9 e 12Hz). - Segundo produto purificado: platenolídeo B: (espectro 9647V) Espectro 1H em CD3CN (deslocamentos químicos em ppm): 0,81 ((3H, t, J=6Hz), 0,89 (1H, m), 1,17 (3H, d, J=5Hz), 1,30 (4H, m), 1,47 (2H, m), 1,61 (1H, t, J=10Hz), 2,20 (1H, m), 2,38 (1H, d, J=13Hz), 2,52 (1H, m), 2,58 (1H, m), 2,68 (1H, dd, J=8 e 13Hz), 3,10 (1H, d, J=7Hz), 3,50 (3H, s), 3,61 (1H, d, J=8Hz), 3,82 (1H, d, J=7Hz), 5,09 (1H, m), 6,20 (1H, m), 6,25 (1H, dd, J=9 e 12Hz), 6,58 (1H, d, J=12Hz), 7,19 (1H, dd, J=9 e 12Hz).

Essas experiências permitiram assim determinar a estrutura desses dois compostos. O primeiro produto purificado é o platenolídeo A e o segundo é o platenolídeo B, a estrutura deduzida dessas suas moléculas é apresentada na Figura 36. Pôde também ser determinado, graças à técnica de CL/SM associada à RMN, em condições ligeiramente diferentes daquelas descritas anteriormente, mas cujo desenvolvimento é bem conhecido do técnico, que a cepa OS49.67 produz além do platenolídeo A e B um derivado desses dois compostos. Trata-se do platenolídeo A+ micarose e do platenolídeo B+ mi-carose (a estrutura desses dois compostos é apresentada na Figura 40). Os resultados da análise do mosto da cepa OS49.67 são apresentadas na tabela 42. TABELA 42. Os resu tados da análise CL/SM do mosto da cepa OS49.67 20.4 Análise dos intermediários de biossíntese produzidos pela cepa SPM509 A cepa SPM509 na qual o gene orf14 é inativado (θΓΠ4::3ίί3Ω33θ-) não produz espiramicinas (conforme exemplo 13, 15 e 16). Uma amostra foi preparada segundo o método descrito acima (conforme parágrafo 20.1) e foi analisada por CL/SM conforme descrito acima (conforme o parágrafo 20.2 e 20.3). A análise dos intermediários de biossíntese presentes no sobrenadante de cultura da cepa SPM509 cultivada em meio MP5 mostrou que essa cepa produzia apenas a forma B do platenolídeo ("platenolídeo B", conforme Figura 36), mas não a forma A ("platenolídeo A", conforme Figura 36). EXEMPLO 21: Interrupção do gene orf14 em uma cepa interrompida no gene orf3 (OS49.67) O produto do gene orf14 é indispensável à biossíntese das espi-ramicinas (conforme exemplo 13, 15 e 16: a cepa SPM509 na qual esse gene é interrompido não produz mais espiramicinas). A análise dos intermediários de biossíntese presentes no sobrenadante de cultura da cepa SPM509 cultivada em meio MP5 mostrou que essa cepa produzia apenas a forma B do platenolídeo, mas não a forma A (conforme exemplo 20). Uma das hipóteses que podem explicar essa observação é que o produto de orf14 seja implicado na conversão da forma B do platenolídeo em forma A por uma etapa enzimática de redução. Para testar essa hipótese, o gene orf14 foi inativado em um mutante que não produz mais espiramicina, mas produzindo as formas A e B do platenolídeo. É o caso da cepa OS49.67 (conforme exemplo 6 e 20) na qual o gene orf3 é inativado por uma deleção em fase (Aorf3). Para inativar o gene orf14 nessa cepa, o plasmídeo pSPM509 foi introduzido por transformação de protoplastos da cepa OS49.67 (Kieser, T. et al., 2000). A inativação do gene orf14 foi descrita no caso da cepa OSC2 (conforme exemplo 13) e foi procedida do mesmo modo para a inativação do gene orf14 na cepa OS49.67. Após transformação pelo plasmídeo pSPM509, os clones são selecionados por sua resistência à apramicina. Os clones resistentes à apramicina são em seguida repicados respectivamente sobre meio com apramicina e sobre meio com higromicina. Os clones resistentes à apramicina (ApraR) e sensíveis à higromicina (HygS) são em princípio aqueles nos quais um duplo acontecimento de cruzamento ocorreu e nos quais o gene orf14 foi substituído por uma cópia de orf14 interrompida pelo cassette att3Qaac-. Esses clones foram mais particularmente selecionados e a substituição da cópia selvagem de orf14 pela cópia interrompida pelo cassette foi verificada por hibridização. Assim, o DNA total dos clones obtidos foi digerido por várias enzima, separado sobre gel de agarose, transferido sobre membrana e hibridizado com uma sonda correspondente à cassette aat3Qaac- para verificar que a substituição do gene ocorrera. A verificação do genótipo pode também ser realizada por qualquer método conhecido do técnico e notadamente por PCR, utilizando os oligonucleotídeos apropriados e seqüenciação do produto PCR.

Um clone que apresenta características esperadas (Aorf3, orf14::att3Qaac-) foi mais particularmente selecionado e denominado SPM510. Pôde com efeito ser verificado graças às duas hibridizações que o cassette att3Qaac- estava bem presente no genoma desse clone e que se obtém o perfil de digestão esperado no caso de uma substituição, em con-seqüência de um duplo acontecimento de recombinação, do gene selvagem orf14 pela cópia interrompida pelo cassette att3Qaac- no genoma desse clone. EXEMPLO 22: Complementação funcional da interrupção do gene orf14 22.1 Construção do plasmídeo pSPM519 O gene orf14 foi amplificado por PCR, utilizando o seguinte par de oligonucleotídeos: EDR31 ■ 5’ CCCAAGCTTCTGCGCCCGCGGGCGTGAA 3’ (SEQ ID N° 136) e EDR37 : 5’ GCTCTAGAACCGTGTAGCCGCGCCCCGG 3’ (SEQ ID N° 137) como matriz o DNA cromossômico da cepa OSC2. Os oligonucleotídeos EDR31 e EDR37 portam respectivamente o sítio de restrição Hindlll e Xbal (seqüência em traços escuros). O fragmento de 1,2 kb assim obtido foi clonado no vetor pGEM-T easy (comercializado pela sociedade Promega (Madison, Wisconcin, USA)) para dar origem ao plasmídeo pSPM515. Esse plasmídeo foi em seguida digerido pelas enzimas de restrição Hindlll e Xbal. O enxerto Hindlll/Xbal de 1,2 kb obtido foi clonado no vetor pUWL201 (conforme exemplo 17.1) previamente digerido pelas mesmas enzimas. O plasmídeo assim obtido foi denominado pSPM519. 22.1 Transformação das cepas SPM509 e SPM510 pelo plasmídeo pSPM519. O plasmídeo pSPM519 foi introduzido nas cepas SPM509 (conforme exemplo 13) e SPM510 (conforme exemplo 17) por transformação de protoplastos (Kieser, T. et al., 2000). Após transformação, os clones são selecionados por sua resistência ao tiostrepton. Os clones são em seguida re-picados sobre um meio contendo tiostrepton. A cepa SPM509 é uma cepa não-produtora de espiramicinas (conforme exemplo 13, 15 e 16 e Figura 24). A produção em espiramicinas da cepa SPM509 transformada pelo vetor pSPM519 (cepa denominada SPM509 pSPM519) foi analisada, cultivando-se essa cepa em meio MP5 em presença de tiostrepton. O sobrenadante de cultura foi em seguida analisado por CLHP (conforme exemplo 16 e 17). Os resultados dessa análise são apresentados na tabela 43, os dados são expressos em mg por litro do sobrenadante. Os resultados correspondem à produção total em espiramicinas (obtida adicionando-se a produção em espiramicina I, II e III). Foi observado que a presença do vetor pSPM519 na cepa SPM509 restaura a produção de espiramicinas (conforme tabela 43). TABELA 43. Produção em espiramicinas da cepa SPM509 transformada pelo vetor pSPM519 (resultados expressos em mg/l do sobrenadante). A cepa SPM509 transformada pelo plasmídeo pSPM519 foi denominada SPM510 pSPM509. EXEMPLO 23: complementação funcional da interrupção do gene orf3 pelo gene tylB de S. fradiae 23.1 Construção do plasmídeo pOSP49.52 O plasmídeo pOS49.52 corresponde a um plasmídeo, permitindo a expressão da proteína TylB em S.ambofadens. Para construí-lo, a seqüência codificante do gene TylB de S. fradiae (Merson-Davies & Cundliffe, 1994, número de acesso GenBank: U08223 (seqüência da região), SFU08223 (seqüência DNA) e AAA21342 (seqüência protéica) foi introduzida no plasmídeo pKC1218 (Bierman et al., 1992, Kieser et al., 2000, uma cepa de E. coli contendo esse plasmídeo é acessível notadamente junto à ARS (NRRL) Agricultural Research Service Culture Coilection) (Peoria, Illinois, USA), sob o número B-14790). Além disso, essa seqüência codificante foi colocada sob controle do promotor ermE* (conforme acima, notadamente exemplo 17.1, Bibb etal., 1985, Bibb etal., 1994). 23.1 Transformação da cepa OS49.67 pelo plasmídeo pOS49.52 A cepa OS49.67 na qual o gene orf3 é inativada por uma dele-ção em fase não produz espiramicinas (conforme exemplo 6 e 15). O plas-mídeo pOS49.52 foi introduzido na cepa OS49.67 por transformação de protoplastos (Kieser, T et al., 2000). Após transformação, os clones são selecionados por sua resistência à apramicina. Os clones são em seguida repi-cados sobre um meio contendo a apramicina. Um clone foi mais particularmente selecionado e foi denominado OS49.67 e pOS49.52.

Conforme foi demonstrado acima, a cepa OS49.67 não produz espiramicinas (conforme exemplo 6 e 15). A produção em espiramicinas da cepa OS49.67 transformada pelo vetor pOS49.52 foi analisada pela técnica descrita no exemplo 15. Pôde assim ser demonstrado que essa cepa possui um fenótipo produtor de espiramicinas. Assim, a proteína TylB permite a complementação funcional da interrupção do gene orf3. EXEMPLO 24: Melhoria da produção em espiramicinas por superexpressão do gene orf28c 24.1 Construção do plasmídeo pSPM75 O gene orf28c foi amplificado por PCR, utilizando um par de oli-gonucleotídeos, comportando um sítio de restrição Hindlll ou um sítio de restrição BamHI. Essas atrações têm a seguinte sentença: KF30 : 5’ AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3’ (SEQ ID N° 138) com um sítio de restrição Hindlll (que Figura em traços cheios) KJF31 : 5’ GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3 ’ (SEQ ID N° 139) com um sítio de restrição Hindlll (que Figura em traços cheios) As atrações KF30 e KF31 portam respectivamente o sítio de restrição Hindlll e BamHI (seqüência em traços cheios). O par de atrações KF30 e KF31 permite amplificar um fragmento de DNA de um tamanho de aproximadamente 1,5 kb contendo o gene orf28c, utilizando como matriz o cosmídeo pSPM36 (conforme acima). O fragmento de 1,5 kb assim obtido foi clonado no vetor pGEM-T easy (comercializado pela sociedade Promega (Madison, Wisconcin, USA)) para dar origem ao plasmídeo pSPM74. O plasmídeo pSPM74 foi em seguida digerido pelas enzimas de restrição Hindlll e BamHI e o enxerto Hindlll/BamHI de aproximadamente 1,5 kb obti- do foi subclonado no vetor pUWL201 (conforme exemplo 17.1) previamente digerido pelas mesmas enzimas. O piasmídeo assim obtido foi denominado pSPM75, ele contém o conjunto da seqüência codificante de orf28c colocada sob o controle do promotor ermE*. 24.2 Transformação da cepa OSC2 pelo piasmídeo pSPM75 O piasmídeo pSPM75 foi introduzido nas cepas OSC2 por transformação de protoplastos (Kieser, T. et al., 2000). Após transformação dos protoplastos, os clones são selecionados por sua resistência ao tios-trepton. Os clones são em seguida repicados sobre um meio contendo o ti-ostrepton e a transformação pelo piasmídeo é verificada por extração de plasmídeos. Dois clones foram mais particularmente selecionados e denominados OSC2/pSPM75( 1) e OSC2/pSPM75(2).

Uma amostra da cepa OSC2/pSPM75(2) foi depositada junto à Collection Nationale de Cultures et Microorganismes (CNCM) Institut Pas-teur, 25, rue du Docteur Roux 75724 Paris Cedex 15, France, 6 de outubro de 2003 sob o número de registro 1-3101. A fim de testar o efeito da superexpressão do gene orf28c sobre a produção de espiramicinas, a produção em espiramicinas dos clones OSC2/pSPM75(1) e OSC2/pSPM75(2) foi testada pela técnica descrita no exemplo 15. A análise da produção em espiramicinas da cepa OSC2 foi também efetuada em paralelo para comparação. Foi possível assim ser observada que a presença do piasmídeo pSPM75 aumenta significativamente a produção em espiramicinas da cepa OSC2. Isto demonstra que a superexpressão de orf28c leva a um aumento da produção em espiramicinas e confirma seu papel como regulador. A produção em espiramicinas dos clones OSC2/pSPM75(1) e OSC2/pSPM75(2) foi também analisada por CLHP (da mesma maneira que no exemplo 17.2). A análise da produção em espiramicinas da cepa OSC2 foi também efetuada em paralelo para comparação. Os resultados dessa análise são apresentados na tabela 44. Os dados são expressos em mg por litro do sobrenadante. Os resultados correspondem à produção total em espiramicinas (obtida adicionando-se a produção em espiramicina I, II e III). TABELA 44. Produção em espiramicinas das cepas derivadas de OSC2 transformado por pSPM75, (resultados expressos em mg/l).______________ Assim, foi observado que a presença do plasmídeo pSPM75 aumenta significativamente a produção em espiramicinas da cepa OSC2. Isto demonstra bem que a superexpressão de orf28c tem um efeito positivo em espiramicinas. EXEMPLO 25: Análise da produção de intermediários de biossíntese de espiramicinas de uma cepa inativada no gene orf8 A cepa OS49.107, na qual o gene orf8 é inativado por inserção do cassette Qhyg não produz espiramicinas (conforme exemplo 7 e 15). O gene orf8 codifica uma proteína que apresenta uma relativa forte similitude com várias aminotransferases e sugere fortemente que o gene orf8 codifica uma 4 aminotransferase responsável pela reação de transaminação necessária à biossíntese da forosamina (conforme Figura 6). Espera-se, portanto, que a biossíntese das espiramicinas seja bloqueada no estágio da forocidina (conforme Figura 7). A cepa OS49.107 que é não-produtora de espiramicina deveria portanto produzir a forocidina.

Uma amostra do sobrenadante da cepa OS49.107 foi preparada segundo o método descrito acima (conforme exemplo 16, sem extração do MIBK) e foi analisada por CL/SM conforme descrito acima (conforme o parágrafo 20.2 e 20.3). Em modo SIM, a massa 558 relativa ao íon molecular da forocidina foi selecionada e vários picos foram detectados. A presença de compostos de massa 588 é compatível com a hipótese do papel de orf8 em síntese de forosamina. EXEMPLO 26: Análise da produção de intermediários de biossíntese de espiramicinas de uma cepa inativada no gene orf12 A cepa SPM507, na qual o gene orf12 é inativado, não produz espiramicinas (conforme exemplo 11 e 15). O gene orf12 codificaria uma 3,4 desidratase responsável pela reação díe desidratação necessária à biossín-tese da forosamina (conforme Figura 6). Espera-se, portanto que a biossín-tese das espiramicinas seja bloqueada no estágio da forocidina (conforme Figura 7). A cepa SPM507 que é não-produtora de espiramicina deveria, portanto, produzir a forocidina.

Uma amostra do sobrenadante da cepa SPM507 foi preparada segundo método descrito acima (conforme exemplo 16, sem extração ao MIBK) e foi analisado por CL/SM conforme descrito acima (conforme o parágrafo 20.2 e 20.3). Nessas condições, o tempo de retenção da forocidina é de aproximadamente 12,9 minutos. Em modo SIM, a massa 558 relativa ao íon molecular [M+H]+ da forocidina foi selecionado e um pico foi detectado. A presença de um composto com 558 permite validar a hipótese do papel do produto de orf12 na biossíntese das espiramicinas.

Todavia, a forocidina está presente em quantidade relativamente fraca e nessas condições, um produto absorvente com 238 nm foi mais particularmente observado (tempo de retenção de 17,1 min). A análise em LC/SM permitiu determinar a massa desse composto que é de 744,3 g/mol ([M+H]+ = 744,3 produto majoritário). A fim de se obter a estrutura, o produto mencionado acima foi isolado e purificado nas condições descritas anteriormente (conforme parágrafo 20.1)). A fase orgânica (MIBK) é então recuperada e evaporada. O extrato seco é retomado com água e extraído com heptano. A solução aquosa é em seguida extraída por fixação sobre cartucho Oásis HLB 1 g (Waters ASA, St-Quentin en-Yvelines, França). O composto é recuperado por purificação com uma mistura água/acetonitrila 30/70. Essa solução é em seguida injetada (100 μΙ_) sobre a coluna analítica e as frações recuperadas sobre cartucho Oásis HLB 1 cc 30 mg (Waters). Antes da utilização, os cartuchos Oásis HLB 1cc 30 mg (Waters) são acondicionados seqüencialmente pela acetonitrila, depois uma mistura água/acetonitrila (20v/80v) e uma mistura de água/acetonitrila 80/20. O cartucho Oásis HLB 1 cc 30 mg (Waters) é em seguida lavado sucessivamente por 1 ml de água/acetonitrila (95/5) , 1 ml de água/acetonitrila deuterada (95/5), depois purificado com 600 μ[ de água/acetonitrila deuterada 40/60. A solução recuperada é em seguida diretamente analisada em RMN. O espectro RMN obtido para esse composto é o seguinte (Espectro RMN 19312V): Espectro 1H em CD3CN/D20 (deslocamentos químicos em ppm): 0,92 (3H, d, J=6Hz), 1,10 (1H, m), 1,14 (3H, s), 1,17 (3H,d, J=6Hz), 1,22 (3H, d, J=6Hz), 1,25 (3H, d, J=6Hz), 1,40 (1H, m), 1,75 (1H, dd, J=12 e 2Hz), 1,81 (1H, m), 1,90 (1H, d, J=12Hz), 2,05 (1H, m), 2,12 (3H, s), 2,15 (1H, m), 2,35 (2H, m), 2,45 (6H, s amplo), 2,53 (1H, m), 2,64 (1H, dd, J=12 e 9Hz), 2,80 (1H, dd, J=9 e 16Hz), 2,95 (1H, d, J=8Hz), 3,23 (2H, m), 3,34 (1H, d, J=7Hz), 3,45 (3H, s), 3,49 (1H, m), 3,93 (1H, dd, J=7 e 3Hz), 4,08 (1H, m), 4,37 (1H, d, J=6Hz), 4,88 (1H, m), 5,05 (2H, m), 5,65 (2Η, m), 6,08 (1H, dd, J=8 e 12Hz), 6,40 (1H, dd, J=12 e 9Hz), 9,60 (1H, s).

Essas experiências permitiram assim determinar a estrutura desse composto, esta sendo apresentada na Figura 38. EXEMPLO 28: Análise da produção de intermediários de biossíntese de es-piramicinas de uma cepa inativada no gene orf5* A cepa SPM501 possui o genótipo orf6*::att10hyg+. Graças ao efeito polar da inserção do cassette att1Qhyg+ no gene orf6*, pôde ser determinado que o gene orf5* é indispensável à via de biossíntese das espira-micinas. Com efeito, a inserção do cassette excisável na parte codificante do gene orf6* acarreta uma parada total da produção em espiramicinas por efeito polar sobre a expressão do gene orf5*. Todavia, uma vez que o cassette inserida foi excisada (e portanto quando só o gene orf6* é inativado, cf Exemplos 14 e 15), restaura-se uma produção de espiramicina I. Isto demonstra que o gene orf5* é indispensável à biossíntese das espiramicinas, já que sua inativação acarreta um parada total da produção em espiramicinas. O gene orf5* codifica uma proteína que apresenta uma relativa forte similitude com várias O-metiltransferases. O gene orf5* seria uma O-metil transferase implicada na biossíntese do platenolídeo. Para verificar essa hipótese, experiências de análise CL/SM e de RMN foram feitas sobre uma cepa S.ambofaciens de genótipo orf6*::att1Qhyg+ obtida a partir de uma cepa que superproduz as espiramicinas.

Uma amostra do sobrenadante dessa cepa foi preparada, segundo o método descrito acima (conforme exemplo 16, sem extração ao MIBK) e foi analisada por CL/SM conforme descrito acima (conforme o parágrafo 20.2 e 20.3). Todavia, a coluna utilizada é uma coluna X-Terra (Waters AS, St-Quentin en Yvelines, França) e a tensão de cone do espectrômetro é regulada em 380 V para se obter a fragmentação do composto analisado. Nessas condições, um produto cujo tempo de retenção é de aproximadamente 13,1 minutos é observado. O espectro de massa desse composto tem um andamento similar àquele da espiramicina I, mas o íon molecular é de 829. A diferença de massa de 14 em relação à massa da espiramicina pode ser explicada pela ausência de grupo metila sobre oxigênio portada pelo carbono N° 4 do ciclolactona (a estrutura desse composto é apresentada na Figura 39). A presença de um composto em 829 permite validar a hipótese do papel de orf5* na biossíntese das espiramicinas.

Por um teste microbiológico feito sobre uma cepa sensível de M. luteus (conforme exemplo 15 e Figura 18) foi demonstrado que a molécula intermediária (espiramicina menos grupo metila cuja estrutura é apresentada na Figura 39) produzida pela cepa orf6*:: Oatthyg+ é muito menos ativa (de um fator 10) que a espiramicina de origem com o grupo metila em posição 4. EXEMPLO 28: Construção de novas "cassettes excisáveis" Novas cassettes excisáveis foram construídas. Essas cassettes são muito semelhantes às cassettes excisáveis descritas no exemplo 9. A diferença principal entre as antigas e as novas cassettes é a ausência nestas das seqüências correspondentes às extremidades da interposon Ω, seqüências que contêm um terminador de transcrição proveniente do fago T4.

Nas cassetes sem terminador, o gene que confere a resistência a um antibiótico é contornado pelas seqüências attR e attL que permitem a excisão. O gene de resistência é o gene aac(3)IV que codifica uma acetil- transferase que confere a resistência à apramicina. Esse gene está presente no cassette Gaac (número de acesso GenBank: X99313, Blondelet-Rouault. M.H. et al, 1997) e foi amplificado por pCR, utilizando como matriz o plasmí-deo pOSK1102 (conforme acima) e como atrações os oligonucleotídeos KF42 e KF43 contendo cada um o sítio de restrição Hindlll (em traço cheios) (AAGCTT) em 5’. KF42: 5’-AAGCTTGTACGGCCCACAGAATGATGTCAC-3' (SEQ Π> N° 153) e KF43: 5-AAGGTTCGACTAGCTTGGTGATCTGGCCTT-3' (SEQ ID N° 154). O produto PCR obtido de aproximadamente 1kb foi clonado no vetor E.Coli pGEMT Easy dando origem ao plasmídeo pSPM83. O vetor pSPM83 foi digerido pela enzima de restrição Hindll. O fragmento Hindlll-Hindlll do enxerto foi isolado por purificação a partir de um gel de agarose 0,8%, depois clonado no sítio Hindlll situado entre as se-qüências attL e attR dos diferentes plasmídeos que portam as diferentes cassette excisáveis possíveis (conforme exemplo 9 e Figura 27) de forma a substituir o fragmento Hindlll correspondente a Gacc pelo fragmento Hindlll correspondente ao gene aac sozinho. Isto permitiu obter as cassettes attlaac, att2aac e att3aac (segundo a fase desejada, conforme exemplo 9). Segundo a orientação do gene aac em relação às seqüências attL e aTTR, distinguem-se att1aac+, attlacc-, att2aac+, att2aac-, att3aac+ e att3aac-(segundo as mesmas convenções que aquelas adotadas no exemplo 9). EXEMPLO 29: Construção de uma cepa de S.ambofaciens interrompida no gene orf28c A inativação do gene orf28c foi feita, graças à técnica das cassettes excisáveis. O cassette excisável att3aac+ (conforme exemplo 28) foi amplificada por PCR, utilizando como matriz o plasmídeo pSPM101 (O plasmídeo pSPM101 é um plasmídeo derivado do vetor pGP704Not (Chave-roche et al., 2000) (Miller VL & Mekalanos JJ, 1988) no qual o cassette att3aac+ foi clonada como um fragmento EcoRV no sítio único EcoRV de pGP704Not) e com o auxílio das seguintes atrações: KF32: 5’ CAACCGCTTGAGCTGCTCCATCAACTGCTGGGCCGAGGTATÇGÇGÇGÇG CTTCGTTCGGGACGAA 3' (SEQ Π) N° 155) Θ KE33: yTGGGTCCCGCCGCGCGGCACGACTrCGACTCGCTCGTCTATCTGCCTCTT CGTCCCGAAGCAACT 3' (SEQ Π) N° 156) Os 39 nucleotídeos situados na extremidade 5’ desses oligonu-cleotídeos comportam uma seqüência correspondente a uma seqüência no gene orf28c e os 26 nucleotídeos situados mais em 3’(representado em negrito e sublinhados acima) correspondem à seringa de uma das extremidades do cassette excisável att3aac+. O produto de PCR assim obtido foi utilizado para transformar a cepa E.coli hiper-recombinante DY330 (Yu et al., 2000) (essa cepa contém os genes exo, bet e gam do fago lambda integrados em seu cromossoma, esses genes são expressos em 42°C, ela foi utilizada no lugar da cepa E.coli KS272 (Chaveroche et al., 2000) contendo o cosmídeo pSPM36. Assim, as bactérias foram transformadas por eletroporação por esse produto de PCR e os clones foram selecionados por seu reservatório à apramicina. Os cosmí-deos dos clones obtidos foram extraídos e digeridos pela enzima de restrição BamHI, com a finalidade de verificar se o perfil de digestão obtido correspondia ao perfil esperado, caso houvesse inserção do cassette (att3aac+) no gene orf28c, isto é, se tivesse havido recombinação homóloga entre as extremidades do produto PCR e o gene alvo. A verificação da construção pode também, ser realizada por qualquer método conhecido do técnico e notadamente por PCR, utilizando os oligonucleotídeos apropriados e se-qüenciação do produto de PCR. Um clone, cujo cosmídeo possui um perfil esperado foi selecionado e o cosmídeo correspondente foi denominado pSPM107. Esse cosmídeo é um derivado de pSPM36 no qual orf28c é interrompido pelo cassette att3aac-. A inserção do cassette é acompanhada de uma deleção no gene orf28c, a interrupção começa ao nível do 28° códon de orf28c. Restam após o cassette os 137 últimos códons de orf28c. O cosmídeo pSPM107 foi em uma primeira etapa introduzido na cepa E.coli DH5 α, depois na cepa streptomyces ambofaciens OSC2 por transformação de protoplastos. Após transformação, os clones são selecionados por sua resistência à apramicina. Os clones resistentes à apramicina são em seguida repicados respectivamente sobre meio com apramicina (antibiótico B) e sobre meio com puromicina (antibiótico A) (conforme Figura 9). Os clones resistentes à apramicina (ApraR) e sensíveis à puromicina (Pu-roS) são em princípio aqueles nos quais um duplo acontecimento de cruzamento ocorreu e que possuem o gene orf28c interrompido pela cassette att3aac-. Esses clones foram mais particularmente selecionados e a substituição da cópia primitiva de orf28c pela cópia interrompida pelo cassette foi verificado por hibridização. Assim, o DNA total dos clones obtidos, foi digerido por várias enzimas, separado sobre gel de agarose, transferido sobre membrana e hibridizado com uma sonda correspondente à cassette att3aac+ para verificar a presença do cassette no local esperado no DNA genômico dos clones obtidos. A verificação do genótipo pode também ser realizada por qualquer método conhecido e notadamente por PCR, utilizando os oligonucleotídeos apropriados e seqüenciação do produto de PCR.

Um clone que apresenta as características esperadas (orf28c::att3aac+) foi mais particularmente selecionado e denominado SPM107. Esse clone possui, portanto, o genótipo: orf28c::att3aac+ e foi denominado SPM107. É inútil procederá excisão do cassette para o estudo do efeito da inativação de orf28c, considerando-se a orientação dos genes (conforme Figura 3). Com efeito, o fato de orf29 ser orientado em sentido oposto ao orf28c mostra que esses genes não são co-transcritos. A utilização de uma cassette excisável permite, ao contrário, ter a possibilidade de se livrar do marcador de seleção a qualquer momento, notadamente por transformação pelo plasmídeo pOSV508. A fim de testar o efeito da extinção do gene orf28c sobre a produção de espiramicinas da cepa SPM107 foi testado pela técnica descrita no exemplo 15. Pôde assim ser demonstrado que essa cepa possui um fenótipo não-produtor de espiramicinas. Isto demonstra que o gene orf28c é um gene essencial à biossíntese da espiramicina em S.ambofaciens. EXEMPLO 30: Construção de uma cepa de S.ambofaciens interrompida no gene orf31 A inativação do gene orf31 foi feita graças à técnica das cassettes excisáveis. O cassette excisável att3aac+ foi amplificada por PCR, utilizando como matriz o plasmídeo pSPM101 e os oligonucieotídeos EDR71 e EDR72. EDR71: 5’ CGTCATCGACGTGCGGGGAAGACAGAGGTGATACCGATGATCGCGCGC GCTTCGTTCGGGACGAA 3’ (SEQ Π>Ν° 157) EDR72: 5’ GCCAGCACCTCGTGGAGCTGCTCGACGGAACTCACCCCCATCTGCCTCT TCGTCCCGAAGCAACT 3’ fSEO TD N° 158) Os 39 nucleotídeos situados na extremidade 5’ desses oligonu-cleotídeos comportam uma seqüência correspondente a uma seqüência no gene orf31 e os 26 nucleotídeos situados mais em 3’ (figurados em negrito e sublinhados acima) correspondem à seqüência de uma das extremidades do cassette excisável att3aac+. O produto de PCR assim obtido foi utilizado para transformar a cepa E.coli KS272 contendo o plasmídeo pKOBEG e o cosmídeo pSPM36, conforme descrito por Chaveroche et al. (Chaveroche et al., 2000) (conforme Figura 12 para o princípio, o plasmídeo pOS49.99 deve ser substituído pelo cosmídeo pSPM36 e o plasmídeo obtido não é mais pSPM17, mas pSPM543). Assim, as bactérias foram transformadas por eletroporação por esse produto de PCR e os clones foram selecionados por sua resistência à apramicina. Os cosmídeos dos clones obtidos foram extraídos e digeridos por várias enzimas de restrição, com a finalidade de verificar se o perfil de digestão obtido corresponde ao perfil esperado se tiver tido inserção do cassette (att3aac+) no gene orf31, isto é, se tiver tido recombinação homóloga entre as extremidades do produto PCR e o gene alvo. A verificação da construção pode também ser feita por qualquer método conhecido do técnico e notadamente por pCR, utilizando os oligonucieotídeos apropriados e seqüenciação do produto de PCR. Um clone cujo cosmídeo possui o perfil esperado foi selecionado e o cosmídeo correspondente foi denominado pSPM543. Esse cosmídeo é um derivado de pSPM36 no qual orf31 é interrompido pelo cassette att3aac+ (conforme Figura 12). A inserção do cassette é acompanhada de uma deleção no gene orf31, a interrupção começa ao nível do trigésimo sexto códon de orf31. Restam após o cassette os 33 últimos códons de orf31. O cosmídeo pSPM543 foi introduzido na cepa streptomyces am-bofaciens OSC2 (conforme acima) por transformação de protoplastos (Kie-ser, T. al., 2000). Após transformação, os clones são selecionados por sua resistência à apramicina. Os clones resistentes à apramicina são em seguida repicados respectiva mente sobre meio com apramicina (antibiótico B) e sobre meio com puromicina (antibiótioco A) (conforme Figura 9). Os clones resistentes à apramicina (ApraR) e sensíveis à puromicina (PuroS) são em princípio aqueles nos quais um duplo acontecimento de cruzamento ocorreu e que possuem o gene orf31 interrompido pelo cassette att3aac+. Esses clones foram mais particularmente selecionados e a substituição da cópia primitiva de orf31 pela cópia interrompida pelo cassette foi verificada por hi-bridização. Assim, o DNA total dos clones obtidos foi digerido por várias enzimas, separado sobre gel de agarose, transferido sobre membrana e hibri-dizado com uma sonda correspondente à cassette att3aac+ para verificar a presença do cassette no local esperado no DNA genômico dos clones obtidos. Uma segunda hibridização foi feita, utilizando como sonda um fragmento de DNA obtido por PCR e correspondente a uma parte muito larga da seqüência codificante do gene orf31. A verificação do genótipo pode também ser realizada por qualquer método conhecido do técnico e notadamente por PCR, utilizando os oligonucleotídeos apropriados e seqüenciação do produto de PCR.

Um clone que apresenta as características esperadas (orf31 ::att3aac+) foi mais particularmente selecionado e denominado SPM543. Pôde, com efeito, ser verificado, graças às duas hibridizações que o cassette att3aac+ estava bem presente no genoma desse clone que se obtém bem o perfil de digestão esperado no caso de uma substituição, após um duplo acontecimento de recombinação, do gene selvagem pela cópia interrompida pelo cassette att3aac+ no genoma desse clone. Esse clone possui, portanto, o genótipo: orf31 ::att3aac+ e foi denominado SPM543. É inútil proceder à excisão do cassette para o estudo do efeito da inativação de orf31, considerando-se a orientação dos genes (conforme Figura 3). Com efeito, o fato de orf32c ser orientado em sentido oposto ao orf31 mostra que esses genes não são co-transcritos. A utilização de uma cassette excisável permite, ao contrário, ter a possibilidade de se livrar do marcador de seção a qualquer momento, notadamente por transformação pelo plasmídeo pOSV508. A fim de testar o efeito da extinção do gene orf31 sobre a produção de espiramicinas, a produção em espiramicinas da cepa SPM543 foi testada pela técnica descrita no exemplo 15. Pôde assim ser demonstrado que essa cepa possui um fenótipo não-produtor de espiramicinas. Isto demonstra que o gene orf31 é um gene essencial à biossíntese da espiramici-na em S. ambofaciens. EXEMPLO 31: Construção de uma cepa de S.ambofaciens interrompida no gene orf32c A inativação do gene orf32c foi realizada graças à técnica das cassettes excisáveis. O cassette excisável att3aac+ foi amplificada por PCR utilizando-se como matriz o plasmídeo pSPM101 e com o auxílio das seguintes atrações: KF52: 5’ GATCCGCCAGCCTCACGTCACGCCGCGCCGCCTCCCTGACATÇGÇGÇGÇ GCTTCGTTCGGGACGAA 3' (SEQ IDN° 159). e KF53: 5’ GAGGCGGACGTCGGTACGCGGTGGGAGCCGGAGTTCGACAATÇTGGÇTÇ TTCGTCCCGAAGCAACT 3’ (SEQ ID N° 160).

Os 40 nucleotídeos situados na extremidade 5’ desses oligonu-cleotídeos comportam uma seqüência que corresponde a uma seqüência no gene orf32c e os 26 nucleotídeos situados mais em 3’ (figurado em negrito e sublinhado acima) correspondem à sequência de uma das extremidades do cassette excisável att3aac+. O produto de PCR assim obtido foi utilizado para transformar a cepa E. coli hiper-recombinante DY330 (Yu et al., 2000) contendo o cosmí-deo pSPM36. Assim, as bactérias foram transformadas por eletroporação por esse produto de PCR e os clones foram selecionados por sua resistência à apramicina. Os cosmídeos dos clones obtidos foram extraídos e digeridos pelas enzimas de restrição BamHI, com o objetivo de verificar se o perfil de digestão obtido corresponde ao perfil esperado, se houve inserção do cassette (att3aac+) no gene orf32c, isto é, se houve recombinação homóloga entre as extremidades do produto PCR e o gene alvo. A verificação da construção pode também ser realizada por qualquer método conhecido do técnico, e notadamente por PCR, utilizando-se os oligonucleotídeos apropriados e seqüenciação do produto de PCR. Um clone, cujo cosmídeo possui o perfil esperado, foi selecionado e o cosmídeo correspondente foi denominado pSPM106. Esse cosmídeo é um derivado de pSPM36 no qual orf32c é interrompido pelo cassette att3aac+. A inserção do cassette é acompanhada de uma deleção no gene orf32c, a interrupção começa ao nível do 112° có-don de orf32c. Permanecem, após a cassette, os 91 últimos códons de orf32c. O cosmídeo pSPM106 foi, num primeiro tempo, introduzido na cepa E. coli DH5a depois, na cepa streptomyces ambofaciens OSC2 por transformação. Após transformação, os clones são selecionados por sua resistência à apramicina. Os clones resistentes à apramicina são, em seguida, repicados respectivamente sobre meio com apramicina (antibiótico B) e sobre meio com puromicina (antibiótico A) (conforme Figura 9). Os clones resistentes à apramicina (ApraR) e sensíveis à puromicina (PuroS) são em princípio aqueles nos quais um duplo acontecimento de cruzamento se produziu e que possuem o gene orf32c interrompido pela cassette att3aac+ . Esses clones foram mais particularmente selecionados e a substituição da cópia primitiva de orf32c pela cópia interrompida pelo cassette foi verificado por hibridização. Assim, o DNA total dos clones obtidos foi digerido por vári- as enzimas, separado sobre gel de agarose, transferido sobre membrana e hibridizado com uma sonda correspondente à cassette att3aac+ para verificar a presença do cassette no DNA genômico dos clones obtidos. A verificação do genótipo pode também ser realizado por qualquer método conhecido do técnico e notadamente por PCR, utilizando os oligonucleotídeos apropriados e seqüenciação do produto de PCR.

Um clone que apresenta as características esperadas (orf32c::att3aac+) foi mais particularmente selecionado. Esse clone possui, portanto, o genótipo: orf32c::att3aac+ e foi denominado SPM106. É inútil proceder à excisão do cassette para o estudo do efeito da inativação de orf32c, considerando-se a orientação dos genes (conforme Figura 3). Com efeito , o fato de orf33 ser orientado em sentido oposto a orf32c mostra que esses genes não são co-transcritos. A utilização de uma cassette excisável permite, ao contrário, ter a possibilidade de se livrar do marcador de seleção a qualquer momento, notadamente por transformação pelo plasmídeo pOSV508. A fim de testar o efeito da extinção do gene orf32c sobre a produção de espiramicinas, a produção em espiramicinas da cepa SPM106 foi testada pela técnica descrita no exemplo 15. Pôde assim ser demonstrado que essa cepa possui um fenótipo produtor de espiramicinas. Isto demonstra que o gene orf32c não é um gene essencial à biossíntese da espiramicina em S.ambofaciens.

Lista das construções descritas no presente pedido Lista das abreviações: Am: ampicilina; Hyg: higromicina; Sp: espiramicina; Ts: tiostrepton; Cm: cloranfenicol. Kn: canamicina, Apra: aprami-cina.

Depósito de material biológico Os seguintes organismos foram depositados em 10 de julho de 2002 junto à Collection Nationaie de Cultures de Microorganismes (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France, segundo as disposições do Tratado de Budapeste. - Cepa OSC2 sob o número de registro I-2908 - Cepa SPM501 sob o número de registro I-2909 - Cepa SPM502 sob o número de registro 1-2910 - Cepa SPM507 sob o número de registro 1-2911 - Cepa SPM508 sob o número de registro 1-2912 - Cepa SPM509 sob o número de registro 1-2913 - Cepa SPM21 sob o número de registro 1-2914 - Cepa SPM22 sob o número de registro 1-2915 - Cepa OS49.67 sob o número de registro 1-2916 - Cepa OS49107 sob o número de registro 1-2917 - Cepa Escherichia coli DH5a contendo o plasmídeo pOS44.4 sob o número de registro 1-2918 Os seguintes organismos foram depositados em 26 de fevereiro de 2003 junto à Collection Nationaie de Cultures de Microorganismes (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France, segundo as disposições do Tratado de Budapeste. - Cepa SPM502 pSPM525 sob o número de registro I-2977.

Os seguintes organismos foram depositados junto à Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, França, segundo as disposições do Tratado de Budapeste. - Cepa OSC2/pSPM75(2) sob o número de registro 1-3101.

Todas as publicações e patentes citadas incorporadas ao presente pedido por referência.

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Claims (19)

1. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que é transformada ou transfectada com um vetor de expressão, permitindo a expressão de um ou vários polipeptídeos implicados na biossíntese das espiramicinas, em que os ditos polipeptídeos resultam da expressão de polinucleotídeos inseridos no referido vetor de expressão, a sequência dos ditos polinucleotídeos sendo: (a) uma das sequências de SEQ ID N° 111 ou 141; ou (b) uma das sequências derivadas da sequência (a) em razão da degenerescência do código genético; em que a referida célula hospedeira é uma célula hospedeira procariótica ou uma célula hospedeira de levedura.

2. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo é isolado a partir de uma bactéria do gênero Streptomyces.

3. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo apresenta uma sequência compreendendo a SEQ ID N° 142.

4. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo apresenta uma sequência compreendendo a SEQ ID N° 112.

5. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira procariótica é Escherichia coli.

6. Processo de produção de um polipeptídeo implicado na biossíntese das espiramicinas, em que o dito polipeptídeo possui uma sequência compreendendo SEQ ID NO: 112 ou 142 e resulta da expressão de um polinucleotídeo, a sequência do dito polinucleotídeo sendo: (a) uma das sequências de SEQ ID N° 111 ou 141; ou (b) uma das sequências derivadas da sequência (a) em razão da degenerescência do código genético o processo sendo caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas: a) inserir pelo menos um dos referidos polinucleotídeos codificando o referido polipeptídeo em um vetor de expressão que permite a expressão do referido polipeptídeo; b) cultivar, em um meio de cultura apropriado, uma célula hospedeira procariótica ou de levedura previamente transformada ou transfecta-da com o vetor da etapa a); c) recuperar o meio de cultura acondicionado ou um extrato celular; d) separar e purificar o dito polipeptídeo a partir desse meio de cultura ou ainda a partir do extrato celular obtido na etapa c); e e) se for o caso, caracterizar o polipeptídeo recombinante produzido.

7. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é isolado a partir de uma bactéria do gênero Streptomyces.

8. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira procariótica é Escherichia coli.

9. Micro-organismo transgênico mutante produtor de macrolídeo, caracterizado pelo fato de que superexpressa pelo menos um gene que compreende um polinuleotídeo, a sequência do dito polinucletídeo sendo: (a) uma das sequências de SEQ ID N° 111 ou 141; ou (b) uma das sequências derivadas da sequência (a) em razão da degenerescência do código genético; em que a superexpressão do referido gene é obtida pelo aumento do número de cópias para esse gene e pela introdução de um promotor que é mais ativo que o promotor selvagem.

10. Micro-organismo transgênico mutante produtor de macrolídeo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que superexpressa um ou vários genes que compreende(m) uma sequência correspondendo a uma ou mais das sequências SEQ ID N° 111 ou 141, ou uma das sequências derivadas destas em razão da degenerescência do código genético.

11. Micro-organismo transgênico mutante produtor de macrolí-deo de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é isolado a partir de uma bactéria do gênero Streptomyces.

12. Micro-organismo transgênico mutante produtor de macrolí-deo de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que é uma cepa de Streptomyces ambofaciens.

13. Micro-organismo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que é uma cepa de Streptomyces ambofaciens OSC2/pSPM75(1) ou uma cepa OSC2/pSPM75(2) depositada junto à Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sob o número de registro 1-3101.

14. Processo de produção de macrolídeos, caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas: (a) cultivar, em um meio de cultura apropriado, um microorganismo como definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 13, (b) recuperar o meio de cultura acondicionado ou um extrato celular, e (c) separar e purificar esse(s) macrolídeo(s) produzido(s) a partir do meio de cultura ou ainda a partir do extrato celular obtido na etapa (b).

15. Utilização de uma sequência e/ou de um DNA recombinante correspondendo a uma ou mais das sequências SEQ ID N°111 ou 141, ou uma das sequências derivadas destas em razão da degenerescência do código genético e/ou de uma célula hospedeira coma definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por ser para a preparação de antibióticos híbridos.

16. DNA recombinante, caracterizado pelo fato de compreender: - um polinucleotídeo obtido por amplificação em cadeia por poli-merase, utilizando o seguinte par de sequências iniciadoras: 5 'AAGCTTGTGTGCCCGGTGTACCTGGGGAGC 3' (SEQ ID N° 138) e 5 'GGATCCCGCGACGGACACGACCGCCGCGCA 3' (SEQ ID N° 139) e, como matriz, o cosmídeo pSPM36, - ou um fragmento de pelo menos 1200, 1400, 1450 ou 1500 nucleotídeos consecutivos desse polinucleotídeo, o dito fragmento sendo opcionalmente usado para amplificar as sequências SEQ ID N° 111 ou 141, ou uma das sequências derivadas destas em razão da degenerescência do código genético.

17. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que foi introduzido na mesma pelo menos um DNA recombinante como definido na reivindicação 16, a dita célula hospedeira sendo uma célula procariótica ou uma célula de levedura.

18. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira procariótica é Escherichia coli.

19. Processo de produção de espiramicina(s), caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas: (a) cultivar, em um meio de cultura apropriado, uma célula hospedeira como definida na reivindicação 17 ou 18, (b) recuperar o meio de cultura acondicionado ou um extrato celular, e (c) separar e purificar a(s) espiramicina(s) a partir desse meio de cultura ou ainda a partir do extrato celular obtido na etapa (b).