BRPI0314814B1 - anticorpo compreendendo uma variante de fc - Google Patents

Abstract

"variantes otimizadas de fc e métodos para sua geração". a presente invenção está relacionada a variantes otimizadas de fc, métodos para sua geração e anticorpos e fusões de fc que compreendem variantes otimizadas de fc.

Description

ANTICORPO COMPREENDENDO UMA VARIANTE DE EC

Esse pedido reivindica beneficio sob 35 U.S.C. §199(e) para USSNs

60/477.839 depositado em 12 de junho de 2003;

60/467.606, depositado em 2 de maio de 2003; 60/414.433 depositado em de setembro de

2002; e 60/442.301 depositado em de j aneiro de

2003, todos aqui incorporadas em sua totalidade como referência.

CAMPO

DA

INVENÇÃO

A presente invenção se relaciona a novas variantes otimizadas de Fc, métodos de engenharia para sua geração e sua aplicação, particularmente, para obj etivos terapêuticos.

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO

Anticorpos são proteínas imunológicas gue se ligam a um antígeno específico. Na maioria dos mamíferos, que incluem humanos e camundongos, anticorpos são construídos de cadeias pareadas leves e pesadas de polipeptídeos. Cada cadeia é feita de domínios individuais de imunoglobulina (Ig) , e portanto, o termo genérico imunoglobulina é usado para essas proteínas. Cada cadeia é feita de duas regiões distintas, referidas como as regiões variáveis e constantes.

As regiões variáveis de cadeia leve e pesada mostram significativa diversidade de seqüência entre anticorpos, e são responsáveis por ligação do antígeno alvo. As regiões constantes mostram menos diversidade de seqüência, e são responsáveis por ligação de inúmeras proteínas naturais para despertar importantes eventos bioquímicos. Em humanos há cinco diferentes classes de anticorpos que incluem IgA (que inclui subclasses IgAl e

IgA2), IgD, IgE, IgG (que inclui subclasses IgGl, IgG2,

Petição 870180132819, de 21/09/2018, pág. 13/275

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IgG3 e IgG4) e IgM. As características distinguíveis entre essas classes de anticorpo são suas regiões constantes, embora diferenças sutis possam existir na região V. A Figura 1 mostra um anticorpo IgGl, aqui usado como um exemplo para descrever as características estruturais gerais das imunoglobulinas. Anticorpos IgG são proteínas tetraméricas compostas de duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. A cadeia pesada de IgG é composta de quatro domínios de imunoglobulina ligados do terminal-N ao terminal-C na ordem V_H-CY1-Cy2-Cy3 , que se refere ao domínio variável da cadeia pesada, domínio constante gama 1, domínio constante gama 2 e domínio constante gama 3, respectivamente. A cadeia leve de IgG é composta de dois domínios de imunoglobulina ligados do terminal-N ao terminal-C na ordem V_l-CL, que se refere ao domínio variável da cadeia leve e domínio constante da cadeia leve, respectivamente.

da contém molécula os e, portanto, determina a especificidade de seu antígeno alvo. A região variável é um anticorpo para assim denominada porque ela é a mais distinta em seqüência de outros anticorpos na mesma classe. A maioria da variabilidade de seqüência ocorre nas regiões de determinação de complementaridade (CDRs) . Há 6 CDRs totais, três de cada por cadeia pesada e leve, designadas V_H CDR1, V_H CDR2, V_H CDR3, V_L CDR1, V_L CDR2 e V_L CDR3. A região variável fora das

CDRs é referida como a região de estrutura (FR). Embora não tão diversa quanto as CDRs, a variabilidade de seqüência ocorre na região FR entre diferentes anticorpos. No geral,

3/261 essa arquitetura característica dos anticorpos fornece um cavalete estável (a região FR) na qual a diversidade substancial de ligação de antígeno (as CDRs) pode ser explorada pelo sistema imunológico para obter especificidade para um amplo arranjo de antígenos. Inúmeras estruturas de alta resolução são disponíveis para uma variedade de fragmentos de região variável de diferentes organismos, algumas soltas e algumas em complexo com o antígeno. As características de sequência e estruturais das regiões variáveis do anticorpo são bem caracterizadas (Morea e outros, 1997, Biophys Chem 68:9-16; Morea e outros, 2000, Métodos 20:267-279), e as características conservadas dos anticorpos permitiram o desenvolvimento de uma riqueza de técnicas de engenharia de anticorpo (Maynard e outros, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-376). Por exemplo, é possível enxertar as CDRs de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo de murino, na região de cavalete de um outro anticorpo, por exemplo um anticorpo humano. Esse processo, referido na técnica como humanização, permite a geração de menos terapêuticos de anticorpo imunogênico de anticorpos não humanos. Fragmentos que compreendem a região variável podem existir na ausência de outras regiões do anticorpo, que incluem, por exemplo, o fragmento de ligação de antígeno (Fab) que compreende V_H-Cyl e V_H-C_L, o fragmento variável (F_v) , que compreende V_H e V_L, o fragmento variável de cadeia única (scFv) que compreende V_H e V_L ligados na mesma cadeia, assim como uma variedade de outros fragmentos de região variável (Little e outros, 2000, Immunol Today 21:364-370).

A região Fc de um anticorpo interage com vários

4/261 receptores e ligantes de Fc, transmitindo um arranjo de importantes capacidades funcionais referidas como funções determinantes. Para IgG a região Fc, como mostrado na Figura 1, compreende os domínios de Ig Cy2 e Cy3 e a articulação avançada N-terminal em Cy2 . Uma importante família de receptores de Fc para a classe IgG são os receptores gama Fc (FcyRs). Esses receptores mediam a comunicação entre anticorpos e o ramo celular do sistema imunológico (Raghavan e outros, 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ravetch e outros, 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290). Em humanos essa família de proteínas inclui FcyRI (CD64), incluindo as isoformas FcyRIa, FcyRIb e FcyRIc; FcyRII (CD32), incluindo as isoformas FcyRIIa (incluindo alótipos H131 e R131), FcyRIIb (incluindo FcyRIIb-l e FcyRIIb-2) , e FcyRIIc; e FcyRIII (CD16) , incluindo as isoformas FcyRIIIa (incluindo alótipos V158 e F158) e FcyRIIIb (incluindo alótipos FcyRIIIb-NAl e FcyRIIIb-NA2) (Jefferis e outros, 2002, Immunol Lett 82:5765). Esses receptores têm tipicamente um domínio extracelular que medeia a ligação a Fc, uma região que transpõe a membrana e um domínio intracelular que pode mediar algum evento de sinalização na célula. Esses receptores são expressos em uma variedade de células imunológicas incluindo monócitos, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, eosinófilos, mastócitos, plaquetas, células B, grandes linfócitos granulares, células de Langerhans, células extremas naturais (NK), e células γγ T. A formação do complexo Fc/FcyR recruta essas células determinantes a locais de antígeno ligado, resultando tipicamente em eventos de sinalização nas células e

5/261 importantes respostas imunológicas subsequentes, como a liberação de mediadores da inflamação, ativação de célula B, endocitose, fagocitose e ataque citotóxico. A capacidade de mediar funções determinantes citotóxicas e fagocíticas é um mecanismo potencial pelo qual os anticorpos destroem células alvo. A reação mediada por célula na qual células citotóxicas não específicas que expressam FcyRs reconhecem anticorpo ligado em uma célula alvo e subsequentemente causam a lise da célula alvo é referida como citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) (Raghavan

e outros, 1996,	Annu	Rev Cell Dev	Biol
outros,	2000,	Annu	Rev	Immunol	18
outros,	2001,	Annu	Rev	Immunol	19 :
mediada	por	célula	na	qual célul

específicas que expressam :275-290). A reação

12:181-220; Ghetie e as citotóxicas não :739-766; Ravetch e

FcyRs reconhecem anticorpo ligado em uma célula alvo e subsequentemente causam a fagocitose da célula alvo é referida como fagocitose mediada por célula dependente de anticorpo (ADCP). Inúmeras estruturas foram esclarecidas dos domínios extracelulares de FcyRs humanos, incluindo FcyRIIa (código de acesso pdb 1 H9V) (Sondermann e outros, 2001, J Mol Biol 309:737-749) (código de acesso pdb 1 FCG) (Maxwell e outros, 1999, Nat Struct Biol 6:437-442), FcyRIIb (código de acesso pdb 2FCB) (Sondermann e outros, 1999, Embo J 18:1095-1103); e FcyRIIIb (código de acesso pdb 1E4J) (Sondermann e outros, 2000, Nature 406:267-273.) . Todos FcyRs ligam a mesma região em Fc, na extremidade de terminal-N do domínio de

Cy2 e a articulação precedente, mostrado na Figura 2. Essa interação é bem caracterizada estruturalmente (Sondermann e outros, 2001, J Mol Biol 309:737-749) e várias estruturas

6/261 de Fc humano ligado ao domínio extracelular de FcyRIIIb humano foram esclarecidos (código de acesso pdb 1E4K)(Sondermann e outros, 2000, Nature 406:267-273) (código de acesso pdb 1IIS e 1IIX) (Radaevl e outros, 2001, J Biol Chem 276:16469-16477), assim como tem a estrutura do complexo de IgE humana Fc/FceRIcc (código de acesso pdb 1F6A)(Garman e outros, 2000, Nature 406:259-266).

As diferentes subclasses de IgG possuem diferentes afinidades para os FcyRs, com IgGl e IgG3 tipicamente se ligando substancialmente melhor aos receptores que IgG2 e

IgG4 (Jefferis e outros,

2002, Immunol Lett

82:57-65).

Todos os FcyRs se ligam na mesma região Fc de

IgG, embora com diferentes afinidades:

ligante de alta afinidade

FcyRI tem um

Kd para IgGl de IO'⁸

M *, enquanto os receptores de baixa afinidade

FcyRII e

FcyRIII geralmente ligam em

IO'⁶ e 10~⁵, respectivamente. Os domínios extracelulares de

FcyRIIIa e

FcyRIIIb são 96% idênticos, no entanto FcyRIIIb um domínio de sinalização intracelular.

Além disso, enquanto FcyRI, FcyRIIa/c e

FcyRII Ia são por complexo imunológico, caracterizados por terem um domínio intracelular que tem em tirosina imunorreceptora (ITAM) , FcyRIIb tem um motivo de inibição baseado em tirosina imunorreceptora (ITIM) e é, portanto, inibidor. Assim, os anteriores são referidos como receptores de ativação e FcyRIIb é referido como um receptor inibidor. Os receptores também diferem em padrão e níveis de expressão em diferentes células imunológicas. Ainda um outro nível de complexidade está a existência de inúmeros polimorfismos de FcyR no proteoma humano. Um

7/261 polimorfismo particularmente relevante com significância clínica é V158/F158 FcyRIIIa. IgGl humana liga com maior afinidade ao alótipo V158 do que ao alótipo F158. Essa diferença na afinidade e, presumivelmente, seu efeito sobre ADCC e/ou ADCP, mostrou ser um determinante significativo da eficácia do anticorpo anti-CD20 rituximab (Rituxan®, uma marca registrada de IDEC Pharmaceuticals Corporation). Pacientes com o alótipo V158 respondem favoravelmente ao tratamento com rituximab; no entanto, pacientes com o alótipo F158de baixa afinidade respondem pouco (Cartron e outros, 2002, Blood 99:754-758). Aproximadamente 10-20% dos humanos são homozigóticos para V158/V158, 45% são heterozigóticos para V158/F158 e 35-45% dos humanos são homozigóticos para F158/F158 (Lehrnbecher e outros, 1999, Blood 94:4220-4232; Cartron e outros, 2002, Blood 99:754758) . Portanto, 80-90% dos humanos ou seja, eles possuem pelo menos um alelo de F158 FcyRIIIa.

Um mas separado, em Fc, mostrado na Figura 1, serve como a interface para a proteína de complemento

Clq.

Do mesmo modo que ligação

Fc/FcyR medeia ADCC,

Fc/Clq medeia a citotoxicidade dependente de complemento

Clq forma um complexo com as proteases de serina Clr e Cls para formar o complexo Cl. Clq é capaz de ligar seis anticorpos, embora a ligação a duas IgGs seja suficiente para ativar a cascata do complemento. Similar à interação de Fc com

FcyRs, diferentes subclasses de IgG têm diferentes afinidades por Clq, com IgGl e IgG3 tipicamente ligando substancialmente melhor à FcyRs do que IgG2 e IgG4 (Jefferis e outros, 2002, Immunol Lett 82:57-65). Não há

8/261 atualmente estrutura disponível para o complexo Fc/Clq; no entanto, estudos de mutagênese mapearam o sítio de ligação em IgG humana para Clq a uma região que envolve os resíduos D270, K322, K326, P329 e P331, e E333 (Idusogie e outros, 2000, J Immunol 164:4178-4184; Idusogie e outros, 2001, J Immunol 166:2571-2575).

Um sítio em Fc entre os domínios Cy2 e Cy3, mostrado na Figura 1, medeia a interação com o receptor neonatal FcRn, cuja ligação recicla anticorpo endocitosado do endossoma de volta à corrente sangüínea (Raghavan e outros, 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ghetie e outros, 2000, Annu Rev Immunol 18:739-766) . Esse processo, junto com a obstrução da filtração renal devido ao grande tamanho da molécula de comprimento total, resulta em meias vidas séricas de anticorpo favoráveis que variam de uma a três semanas. A ligação de Fc ao FcRn também tem um papel chave no transporte de anticorpo. O sítio de ligação para FcRn em Fc também é o sítio no qual as proteínas bacterianas A e G se ligam. A ligação apertada feita por essas proteínas é tipicamente explorada como um meio de purificar anticorpos pelo emprego de cromatografia de afinidade de proteína A ou proteína G durante a purificação da proteína. Assim, a fidelidade dessa região em Fc é importante para ambas propriedades clínicas de anticorpos e sua purificação. Estruturas disponíveis do complexo de rato Fc/FcRn (Martin e outros, 2001, Mol Cell 7:867-877) e dos complexos de Fc com proteínas A e G (Deisenhofer, 1981, Biochemistry 20:2361-2370; Sauer-Eriksson e outros, 1995, Structure 3:265-278; Tashiro e outros, 1995, Curr Opin Struct Biol 5:471-481) fornecem uma percepção da interação de Fc com

9/261 essas proteínas.

Uma característica chave da região Fc é a glicosilação conservada N-ligada que ocorre em N297, mostrada na figura 1. Esse carboidrato ou oligossacarídeo, como é às vezes chamado, tem um papel estrutural e funcional crítico para o anticorpo, e é uma das principais razões pelas quais o anticorpo deve ser produzido com ou uso de sistemas de expressão de mamífero. Embora não desejando estar limitado a uma teoria, acredita-se que o objetivo estrutural desse carboidrato possa ser o de estabilizar ou solubilizar Fc, determinar um ângulo específico ou nível de flexibilidade entre os domínios Cy3 e Cy2, evitar que os dois domínios Cy2 se agreguem um ao outro através do eixo central ou uma combinação desses. A ligação eficaz de Fc a FcyR e Clq requer essa modificação, e alterações na composição do carboidrato N297 ou sua eliminação afeta a ligação a essas proteínas (Umana e outros, 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies e outros, 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Mimura e outros, 2001, J Biol Chem 276:45539-45547.; Radaevl e outros, 2001, J Biol Chem 276:16478-16483; Shields e outros, 2001, J Biol Chem 276:6591-6604; Shields e outros, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Simmons e outros, 2002, J Immunol Methods 263:133-147). Embora o carboidrato faça pouco ou nenhum contato específico com FcyRs (Radaevl e outros, 2001, J Biol Chem 276:16469-16477), o que indica que o papel funcional do carboidrato N297 na mediação da ligação de Fc/FcyR pode ser por meio do papel estrutural que ele tem na determinação da conformação de Fc. Isso é sustentado por uma coleção de estruturas em cristal de quatro diferentes

10/261 glicoformas de Fc, que mostram que a composição do oligossacarídeo influencia a conformação de Cy2 e como um resultado da interface Fc/FcyR (Krapp e outros, 2003, J Mol Biol 325:979-989).

As características dos anticorpos acima discutidas especificidade por alvo, capacidade de mediar mecanismos imunes efetores e meia vida longa no soro - tornam os anticorpos poderosos terapêuticos. Anticorpos monoclonais são usados terapeuticamente para o tratamento de uma variedade de condições que incluem câncer, inflamação, e doença cardiovascular. Há atualmente mais de dez produtos de anticorpo no mercado e centenas em desenvolvimento. Em adição a anticorpos, uma proteína semelhante a anticorpo que encontra um papel de expansão na pesquisa e terapia é a fusão de Fc (Chamow e outros, 1996, Trends Biotechnol 14:52-60; Ashkenazi e outros, 1997, Curr Opin Immunol 9:195-200) . Uma fusão de Fc é uma proteína na qual um ou mais polipeptídeos são operacionalmente ligados a Fc. Uma fusão de Fc combina a região de Fc de um anticorpo e, assim, suas funções efetora e farmacocinética favoráveis, com a região de ligação alvo de um receptor, ligante ou alguma outra proteína ou domínio de proteína. 0 papel do último é o de mediar o reconhecimento alvo, e assim é funcionalmente análogo à região variável do anticorpo. Devido a sobreposição estrutural e funcional de fusões de Fc com anticorpos, a discussão sobre anticorpos na presente invenção se estende diretamente às fusões de Fc.

A despeito de tal uso disseminado, os anticorpos não são otimizados para uso clínico. Duas deficiências significativas de anticorpos são sua potência anticâncer

11/261 subótima e seus necessidades de produção exigidas. Essas

Há inúmeros mecanismos possíveis pelos quais os anticorpos destroem células tumorais, incluindo antibloqueio de caminhos de crescimento necessários, sinalização intracelular que leva a apoptose, melhor infra-regulação e/ou modificação de receptores, CDC, ADCC, ADCP e promoção de uma resposta imunológica adaptativa (Cragg e outros, 1999, Curr Opin

Immunol 11:541-547; Glennie e outros, 2000, Immunol Today 21:403-410). A eficácia antitumoral pode ser resultante de uma combinação desses mecanismos, e sua importância relativa na terapia clínica parece ser câncer-dependente. A despeito desse arsenal de armas antitumorais, a potência de anticorpos como agentes anticâncer é insatisfatória, particularmente devido a seu alto custo. Os dados de resposta de tumor do paciente mostram que anticorpos monoclonais fornecem apenas uma pequena melhoria no sucesso terapêutico sobre os quimioterápicos citotóxicos normais de agente único. Por exemplo, exatamente a metade de todos os pacientes com linfoma não Hodgkin reincidente de baixo grau respondem ao anticorpo anti-CD20 rituximab (McLaughlin e outros, 1998, J Clin Oncol 16:2825-2833). De 166 pacientes clínicos,

6% mostraram uma resposta completa e 42% mostraram uma resposta parcial, com resposta de aproximadamente 12 meses. Trastuzumab (Herceptin®, uma marca registrada da Genentech) , um anticorpo anti-HER2/neu para o tratamento de câncer de mama metastático, tem menos eficácia. A taxa de resposta total com o uso de trastuzumab para os 222 pacientes testados foi

12/261 de apenas 15%, com 8 respostas completas e 26 parciais e uma duração média de resposta e sobrevivência de 9 a 13 meses (Cobleigh e outros, 1999, J Clin Oncol 17:2639-2648). Atualmente para terapia anticâncer, qualquer pequena melhoria na taxa de mortalidade define o sucesso. Assim, há uma necessidade significativa de melhorar a capacidade dos anticorpos para destruir células cancerosas alvo.

Um meio promissor para melhorar a potência antitumoral de anticorpos é por meio da melhoria de sua capacidade de mediar funções efetoras citotóxicas como ADCC, ADCP e CDC. A importância de funções efetoras mediadas por FcyR para a atividade anticâncer de anticorpos foi demonstrada em camundongos (Clynes e outros, 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95:652-656; Clynes e outros, 2000, Nat Med 6:443-446), e a afinidade de interação entre Fc e certos FcyRs combina com a citotoxicidade visada em ensaios baseados em célula (Shields e outros, 2001, J Biol Chem 276:6591-6604; Presta e outros, 2002, Biochem Soc Trans 30:487-490; Shields e outros, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740). Adicionalmente, foi observada uma correlação entre a eficácia clínica em humanos e seu alótipo de formas polimórficas de alta (V158) ou baixa (F158) afinidade de FcyRIIIa (Cartron e outros, 2002, Blood 99:754-758). Juntos, esses dados sugerem que um anticorpo com uma região Fc otimizada para ligação a certos FcyRs pode mediar melhor as funções efetoras e, dessa forma, destruir células cancerosas de forma mais eficaz em pacientes. O equilíbrio entre receptores de ativação e inibidores é uma importante consideração, e a função efetora ótima pode resultar de um Fc com melhor afinidade por receptores ativados, por exemplo, FcyRI, FcyRIIa/c e

13/261

FcyRIIIa, embora com afinidade reduzida para o receptor inbidor FcyRIIb. Além disso, pelo fato dos FcyRs poderem mediar a absorção e processamento de antígeno por células que apresentam antígeno, uma melhor afinidade de Fc/FcyR também pode melhorar a capacidade de terapêuticos de anticorpo de despertar uma resposta imune adaptativa.

Estudos de mutagênese foram realizados em Fc com vários objetivos, com substituições tipicamente feitas em alanina (referida como varredura de alanina) ou guiados por substituições de homologia de seqüência (Duncan e outros, 1988, Nature 332:563-564; Lund e outros, 1991, J Immunol 147:2657-2662; Lund e outros, 1992, Mol Immunol 29:53-59;

Jefferis e outros, 1995, Immunol Lett 44:111-117; Lund e outros, 1995, Faseb J 9:115-119; Jefferis e outros, 1996,

Immunol Lett 54:101-104; Lund e outros, 1996, J Immunol 157:4963-4969; Armour e outros, 1999, Eur J Immunol

29:2613-2624; Shields e outros, 2001, J Biol Chem 276:65916604; Jefferis e outros, 2002, Immunol Lett 82:57-65) (US 5.624.821; US 5.885.573; PCT WO 00/42072;

PCT WO 99/58572) . A maioria das substituições reduz ou extirpa a ligação com FcyRs. No entanto, algum sucesso foi atingido na obtenção de variantes de Fc com maior afinidade de FcyR (veja, por exemplo,

US 5.624.821 e

PCT WO 00/42072) .

Por exemplo,

Winter e colegas substituíram o aminoácido humano na posição

235 do anticorpo IgG2b de camundongo (uma mutação de ácido glutâmico para leucina) que aumentou a ligação do anticorpo de camundongo a FcyRI humano em 100 vezes (Duncan e outros,

1988, Nature 332:563-564) (US 5.624.821). Shields e outros usaram mutagênese de varredura de alanina para mapear

14/261 resíduos de Fc importantes para ligação de FcyR, seguido por substituição de resíduos selecionados por mutações não alanina (Shields e outros, 2001, J Biol Chem 276:6591-6604; Presta e outros, 2002, Biochem Soc Trans 30:487-490) (PCT WO 00/42072). Várias mutações reveladas nesse estudo, incluindo S298A, E333A e K334A, mostram melhor ligação ao receptor de ativação FcyRIIIa e reduzida ligação ao receptor inibidor FcyRIIb. Essas mutações foram combinadas para obter duplas e triplas variantes de mutação que mostram melhorias adicionais na ligação. A melhor variante revelada nesse estudo é um mutante triplo S298A/E333A/K334A com um aumento de aproximadamente 1,7 vezes na ligação a F158 FcyRIIIa, uma diminuição de 5 vezes na ligação a FcyRIIb e uma melhoria de 2,1 vezes em ADCC.

A afinidade melhorada de Fc para FcyR também foi atingida pelo uso de glicoformas construídas geradas por expressão de anticorpos em linhas de células construídas ou variantes (Umaría e outros, 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies e outros, 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294,Shields e outros, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa e outros, 2003, J Biol Chem 278:3466-3473). Essa abordagem tem gerado substanciais melhorias na capacidade dos anticorpos de ligar FcyRIIIa e de mediar ADCC. Embora haja limitações práticas como a eficiência de crescimento das cepas de expressão sob condições de produção de larga escala, essa abordagem para melhorar a afinidade de Fc/FcyR e a função efetora é promissora. De fato, a união dessas tecnologias de glicoformas alternativas com as variantes de Fc da presente invenção podem fornecer efeitos aditivos ou sinérgicos para função efetora ótima.

15/261

Embora haja uma necessidade por maior função efetora, para alguns terapêuticos de anticorpo a função efetora reduzida ou eliminada pode ser desejada. Esse é freqüentemente o caso para anticorpos terapêuticos cujo mecanismo de ação envolve o bloqueio ou antagonismo mas não a morte das células que sustentam antígeno alvo. Nesses casos a redução de células alvo não é desejável e pode ser considerada um efeito colateral. Por exemplo, a capacidade de anticorpos anti-CD4 de bloquear receptores CD4 em células T os torna antiinflamatórios eficazes, embora sua capacidade de recrutar receptores de FcyR também direcione ataque imunológico contra as células alvo, que resulta em redução de células T (Reddy e outros, 2000, J Immunol 164:1925-1933). A função efetora também pode ser um problema para anticorpos radiomarcados, referidos como radioconjugados, e anticorpos conjugados a toxinas, referidos como imunotoxinas. Esses medicamentos podem ser usados para destruir células cancerosas, mas o recrutamento de células imunes via interação de Fc com FcyRs traz células imunes saudáveis a uma proximidade de virulência mortal (radiação ou toxina), o que resulta na redução de tecido linfóide normal junto com as células cancerosas objetivadas (Hutchins e outros, 1995, Proc Natl Acad Sei USA 92:11980-11984; White e outros, 2001, Annu Rev Med 52:125-145). Esse problema pode ser potencialmente evitado pelo uso de isotipos de IgG que recrutam pouco o complemento ou as células efetoras, por exemplo, IgG2 e IgG4. Uma solução alternativa é o desenvolvimento de variantes de Fc que reduzam ou eliminem a ligação (Alegre e outros, 1994, Transplantation 57:1537-1543;

Hutchins

16/261 outros, 1995, Proc Natl Acad Sei USA 92:11980-11984; Armour e outros, 1999, Eur J Immunol 29:2613-2624; Reddy e ouros,

2000,

J Immunol 164:1925-1933;

Xu e outros,

2000, Cell

Immunol 200:16-26; Shields e outros,

2001, J Biol Chem

276:6591-6604) (US

6.194.551;

US 5.885.573;

PCT WO 99/58572) . Uma consideração crítica para a redução ou a eliminação da função efetora é que outras importantes propriedades de anticorpo não sejam afetadas. Devem ser construídas variantes de Fc que não apenas eliminem a ligação a FcyRs e/ou Clq, mas que também mantenham a estabilidade, solubilidade e integridade estrutural do anticorpo, assim como a capacidade de interagir com outros ligantes importantes de Fc, tais como FcRn e proteínas A e G.

A presente invenção enfoca uma outra desvantagem maior dos anticorpos, ou seja, seus requisitos exigentes de produção (Garber, 2001, Nat Biotechnol 19:184-185; Dove, 2002, Nat Biotechnol 20:777-779). Os anticorpos devem ser expressos em células de mamíferos e os anticorpos atualmente comercializados junto com outros bioterápicos de alta demanda consomem essencialmente toda a capacidade de manufatura disponível. Com centenas de produtos biológicos em desenvolvimento, a maioria dos quais são anticorpos, há uma necessidade urgente por métodos de produção mais eficientes e baratos. Os efeitos abaixo da capacidade de manufatura insuficiente de anticorpo são três. Primeiro, ela aumenta dramaticamente o custo de mercadorias para o produtor, um custo que é repassado ao paciente. Segundo, ela dificulta a produção industrial de produtos de anticorpo aprovados, limitando a disponibilidade de

17/261 terapêuticos de alta demanda aos pacientes. Finalmente,

experimentos clínicos necessitarem

grandes quantidades da proteína que ainda não é lucrativa, suprimento insuficiente impede o progresso da rota de

crescente

Métodos de produção alternativos foram explorados em tentativas de aliviar esse problema. Plantas e animais transgênicos estão sendo usados como sistemas de produção potencialmente mais baratos e de maior capacidade (Chadd e outros, 2001, Curr Opin Biotechnol 12:188-194). Tais sistemas de expressão, no entanto, podem gerar padrões de glicosilação significativamente diferentes de glicoproteínas humanas. Isso pode resultar em reduzida e mesmo ausência de função efetora porque, como discutido acima, a estrutura de carboidrato pode influenciar significativamente a ligação de FcyR e do complemento. Um problema potencialmente maior com glicoformas não humanas pode ser a imunogeni cidade; carboidratos são uma fonte chave de antigenicidade para o sistema imunológico, e a presença de glicoformas não humanas tem uma chance significativa de extrair anticorpos que neutralizam o terápico, ou pior, causam reações imunológicas adversas. Assim, a eficácia e a segurança de anticorpos produzidos por plantas e animais transgênicos permanecem incertas. A expressão bacteriana é uma outra solução atrativa ao problema da produção de anticorpo. A expressão em bactérias, por exemplo E. coli, fornece um método de custo compensador e de alta capacidade para a produção de proteínas. Para proteínas complexas, tais como anticorpos há inúmeros obstáculos para a expressão bacteriana,

18/261 incluindo dobra e montagem dessas moléculas complexas, adequada formação de dissulfeto e solubilidade, estabilidade e funcionalidade na ausência de glicosilação porque as proteínas expressas em bactérias não são glicosiladas. Anticorpos não glicosilados de comprimento total que ligam o antígeno foram expressos de forma bem sucedida em E. coli (Simmons e outros, 2002, J Immunol Methods 263:133-147), e assim, dobra, montagem e adequada formação de dissulfeto de anticorpos expressos em bactérias são possíveis na ausência do maquinário de chaperona eucariótica. Entretanto, a utilidade final de anticorpos expressos em bactérias como terápicos permanece pela ausência de glicosilação, que resulta na ausência de função efetora e pode resultar em pouca estabilidade e solubilidade. Isso será provavelmente mais problemático para a formulação nas altas concentrações pelos períodos prolongados demandados pelo uso clínico.

Um Fc não glicosilado com propriedades de solução favoráveis e a capacidade de mediar as funções efetoras deveríam capacitar significativamente os métodos de produção alternativos acima descritos. Ao superar as limitações estruturais e funcionais de Fc não glicosilado, os anticorpos podem ser produzidos em bactérias e plantas e animais transgênicos com risco reduzido de imunogenicidade e com função efetora para aplicações clínicas nas quais a citotoxicidade é desejada, tal como câncer. A presente invenção descreve a utilização de método de construção de proteína para desenvolver variantes de Fc estáveis, solúveis com função efetora. Atualmente tais variantes de Fc não existem na técnica.

19/261

Em resumo, há uma necessidade por anticorpos com propriedades terapêuticas melhoradas. A construção de variantes de Fc otimizadas ou melhoradas é uma abordagem promissora para satisfazer essa necessidade. Ainda um grande obstáculo à construção de variantes de Fc com as propriedades desejadas é a dificuldade na previsão de quais modificações de aminoácido, do número enorme de possibilidades, atingirão os objetivos desejados, junto com a produção e métodos de varredura para anticorpos ineficientes. De fato, uma das principais razões para o sucesso incompleto da técnica anterior é que as abordagens de engenharia de Fc têm envolvido métodos tudo ou nada, tais como varreduras de alanina ou produção de glicoformas que usam diferentes cepas de expressão. Nesses estudos, as modificações de Fc que foram feitas foram parcialmente ou totalmente aleatórias na esperança de obtenção de variantes com propriedades favoráveis. A presente invenção fornece uma variedade de métodos de engenharia, vários dos quais são baseados em técnicas mais sofisticadas e eficientes, que podem ser usadas para sobrepujar esses obstáculos a fim de desenvolver variantes de Fc que são otimizadas para as propriedades desejadas. Os métodos de engenharia descritos fornecem estratégias de projeto para guiar modificação de Fc, métodos de varredura computacionais para projetar variantes favoráveis de Fc, abordagens de geração de biblioteca para determinação de variantes promissoras para investigação experimental e um arranjo de produção experimental e métodos de varredura para determinação das variantes de Fc com propriedades favoráveis.

20/261

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece variantes de Fc que são otimizadas para inúmeras propriedades terapeuticamente relevantes.

É um objetivo da presente invenção o fornecimento de novas posições de Fc nas quais modificações de aminoácido podem ser feitas para gerar variantes otimizadas de Fc. As referidas posições de Fc incluem 240, 244, 245, 247, 262, 263, 266, 299, 313, 325, 328 e 332, nas quais a numeração dos resíduos na região de Fc é aquela do índice EU, tal como em Kabat. A presente invenção descreve qualquer modificação de aminoácido em qualquer das novas posições de Fc para gerar uma variante otimizada de Fc.

É um objetivo adicional da presente invenção o fornecimento de variantes de Fc que foram varridas de forma computacional. Uma variante de Fc varrida de forma computacional é uma que é prevista pelos cálculos de varredura computacional aqui descritos como tendo um potencial significativamente maior que aleatório para serem otimizadas para uma propriedade desejada. Desse modo, a varredura computacional serve como uma introdução para substituir a seleção experimental e, assim, as variantes de Fc varridas de forma computacional são consideradas novas.

É um objetivo adicional da presente invenção o fornecimento de variantes de Fc que foram caracterizadas pelo uso de um ou mais dos métodos experimentais aqui descritos. Em uma modalidade, as variantes de Fc compreendem pelo menos uma substituição de aminoácido na posição selecionada do grupo que consiste em: 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266,

21/261

267, 269

298, 299, 313,

325, 327, 328, 329, 330 e 332, na qual a numeração dos resíduos na aquela do índice EU como em

Kabat.

Em uma modalidade as variantes de preferida, pelo compreendem

Fc menos uma

substituição	selecionada do	grupo que consiste em	L234D,
L234E,	L234N,	L234Q,	L234T,	L234H,	L234Y,	L234I,	L234V,
L234F,	L235D,	L235S,	L235N,	L235Q,	L235T,	L235H,	L235Y,
L235I,	L235V,	L235F,	S239D,	S239E,	S239N,	S239Q,	S239F,
S239T,	S239H,	S239Y,	V240I,	V240A,	V240T,	V240M,	F241W,
F241L,	F241Y,	F241E,	F241R,	F243W,	F243L,	F243Y,	F243R,
F243Q,	P244H,	P245A,	P247V,	P247G,	V262I,	V262A,	V262T,
V262E,	V263I,	V263A,	V263T,	V263M,	V264L,	V264I,	V264W,
V264T,	V264R,	V264F,	V264M,	V264Y,	V264E,	D265G,	D265N,
D265Q,	D265Y,	D265F,	D265V,	D265I,	D265L,	D265H,	D265T,
V266I,	V266A,	V266T,	V266M,	S267Q,	S267L,	E269H,	E269Y,
E269F,	E269R,	Y296E,	Y296Q,	Y296D,	Y296N,	Y296S,	Y296T,
Y296L,	Y296I,	Y296H,	N297S,	N297D,	N297E,	A298H,	T299I,
T299L,	T299A,	T299S,	T299V,	T299H,	T299F,	T299E,	W313F,
N325Q,	N325L,	N325I,	N325D,	N325E,	N325A,	N325T,	N325V,
N325H,	A327N,	A327L,	L328M,	L328D,	L328E,	L328N,	L328Q,
L328F,	L328I,	L328V,	L328T,	L328H,	L328A,	P329F,	A330L,
A330Y,	A330V,	A330I,	A330F,	A330R,	A330H,	I332D,	I332E,
I332N,	I332Q,	I332T,	I332H,	I332Y	e I332A,	nas quais a
numeração dos	resíduos	na região de	Fc é aquela do	índice

EU como em Kabat.

Em uma modalidade mais preferida, as variantes de Fc são selecionadas do grupo que consiste em

V264L,

V264I,

F241W,

F241L, F243W,

F243L,

F241L/F243L/V262I/V264I, F241W/F243W,

F241W/F243W/V262A/

V264A, F241L/V262I,

F243L/V264I,

F243L/V262I/V264W,

F241Y/F243Y/V262T/V264T, F241E/F243R/V262E/V264R, F241E/

22/261

F243Q/V262T/V264E, F241R/F243Q/V262T/V264R, F241E/F243Y/

V262T/V264R, L328M, L328E, L328F, Ι332Ε, L328M/I332E,

Ρ244Η, Ρ245Α, P247V, W313F, P244H/P245A/P247V, P247G,

V264I/I332E, F241E/F243R/V262E/V264R/I332E, F241E/F243Q/ V262T/V264E/I332E, F241R/F243Q/V262T/V264R/I332E, F241E/ F243Y/V262T/V264R/I332E, S298A/I332E, S239E/I332E, S239Q/ I332E, S239E, D265G, D265N, S239E/D265G, S239E/D265N, S239E/D265Q, Y296E, Y296Q, T299I, A327N, S267Q/A327S, S267L/A327S, A327L, P329F, A330L, A330Y, I332D, N297S,

N297D,

N297S/I332E, N297D/I332E, N297E/I332E, D265Y/N297D/

I332E,

D265Y/N297D/T299L/I332E,

D265F/N297E/I332E,

L328I/

I332E,

L328Q/I332E,

I332N, I332Q, V264T, V264F,

V240I,

V263I,

V266I, T299A,

T299S, T299V, N325Q, N325L,

N325I,

S239D,

S239N, S239F,

S239D/I332D, S239D/I332E, S239D/I332N,

S239D/I332Q,

S239E/I332D, S239E/I332N, S239E/I332Q, S239N/

I332D, S239N/I332E, S239N/I332N,

S239N/I332Q, S239Q/I332D,

S239Q/I332N, S239Q/I332Q, Y296D,

Y296N, F241Y/F243Y/V262T/

V264T/N297D/I332E, A330Y/I332E,

A330L/

V264I/A330Y/I332E,

I332E,

L234T,

L235N,

S239T,

V263M,

E269F,

A330V,

N325T,

V264I/A330L/I332E,	L234D,	L234E,	L234N,	L234Q
L234H,	L234Y,	L234I,	L234V,	L234F,	L235D,	L235S
L235Q,	L235T,	L235H,	L235Y,	L235I,	L235V,	L235F
S239H,	S239Y,	V240A,	V240T,	V240M,	V263A,	V263T
V264M,	V264Y,	V266A,	V266T,	V266M,	E269H,	E269Y
E269R,	Y296S,	Y296T,	Y296L,	Y296I,	A298H,	T299H
A330I,	A330F,	A330R,	A330H,	N325D,	N325E,	N325A
N325V,	N325H,	L328D/I332E, L328E/I332E	, L328N/I332E

L328H/I332E, L328I/ /

f !

f !

t r

t

L328V/I332E, L328T/I332E,

L328Q/I332E,

I332E, L328A, I332T, I332H, I332Y,

I332A, S239E/V264I/

I332E, S239Q/V264I/I332E, S239E/V264I/A330Y/I332E, S239E/

V264I/S298A/A330Y/I332E, S239D/N297D/I332E, S239E/N297D/

23/261

Ι332Ε, S239D/D265V/N297D/I332E, S239D/D265I/N297D/I332E,

S239D/D265L/N297D/I332E, S239D/D265F/N297D/I332E, S239D/

D265Y/N297D/I332E, S239D/D265H/N297D/I332E, S239D/D265T/

N297D/I332E,

V264E/N297D/I332E,

Y296D/N297D/I332E,

Υ296Ε/

N297D/I332E,

Y296N/N297D/I332E,

Y296Q/N297D/I332E,

Υ296Η/

N297D/I332E,

Y296T/N297D/I332E,

Ν2 97D/T299V/Ι332Ε,

N297D/

Τ299Ι/Ι332Ε,

N297D/T299L/I332E,

N297D/T299F/I332E,

N297D/

Τ299Η/Ι332Ε,

N297D/T299E/I332E,

N297D/A330Y/I332E,

N297D/

S298A/A330Y/I332E,

S239D/A330L/I332E,

S239D/S298A/I332E,

S239D/A330Y/I332E,

S239N/A330L/I332E,

S239N/S298A/I332E,

S239N/A330Y/I332E,

V2641/S298A/I332E,

S239D/V2641/I332E,

S239D/V264I/S298A/I332E e S239D/V264I/A330L/I332E, nas quais a numeração dos resíduos na região de Fc é aquela do índice EU como em Kabat.

É um objetivo adicional da presente invenção o fornecimento de uma variante de Fc que liga com maior afinidade um ou mais FcyRs. Em uma modalidade, as variantes de Fc têm afinidade por um FcyR que é mais de 1 vez maior que aquela do polipeptídeo de Fc parente. Em uma modalidade alternativa, as variantes de Fc têm afinidade por um FcyR que é mais de 5 vezes maior que aquela do polipeptídeo de Fc parente. Em uma modalidade preferida, as variantes de Fc têm afinidade por um FcyR que é entre 5 e 300 vezes maior que aquela do polipeptídeo de Fc parente. Em uma modalidade, as variantes de Fc compreendem pelo menos uma substituição de aminoácido na posição selecionada do grupo que consiste em: 234, 235, 239, 240, 243, 264, 266, 328, 330, 332 e 325, nas quais a numeração dos resíduos na região de Fc é aquela do índice EU como em Kabat. Em uma modalidade preferida, as variantes de Fc compreendem pelo

24/261 selecionada do grupo menos uma substituição de aminoácido

que consiste	em: L234E, L234Y, L234I, L235D,	L235S,	L235Y,
L2351,	S239D	, S239E,	S239N,	S239Q,	S239T,	V240I,	V240M,
F243L,	V2 64I	, V264T,	V264Y,	V266I,	L328M,	L328I,	L328Q,
L328D,	L328V	, L328T,	A330Y,	A330L,	A330I,	I332D,	I332E,
I332N,	I332Q	e N325T, nas quais a numeração dos resíduos na
região	de Fc	é aquela	do índice EU	como em	Kabat.	Em uma

modalidade mais preferida, as variantes selecionadas do grupo que consiste em V264I,

L328M, I332E, L328M/I332E, V264I/I332E,

F243L/V264I,

S298A/I332E,

S239E/I332E

S239Q/I332E, S239E, A330Y, I332D,

L328I/I332E,

L328Q/I332E

V264T, V240I,

V266I, S239D,

S239D/I332D,

S239D/I332E

S239D/1332N,

S239D/1332Q,

S239E/I332D,

S239E/I332N,

S239E/I332Q

S239N/I332D,

S239N/I332E,

S239Q/I332D,

A330Y/I332E,

V264I/A330Y/I332E,

A330L/I332E,

V264I/A330L/I332E, L234E,

L234Y, L234I, L235D,

L235S,

L235Y, L235I, S239T,

V240M, V264Y, A330I,

N325T,

L328D/I332E, L328V/I332E, L328T/I332E,

L328I/I332E,

S239E/V2641/I332E, S239Q/V264I/I332E,

S239E/V264I/A330Y/

I332E

S239D/A330Y/I332E

S239N/A33ΟΥ/I332E

S239D/A330L/

I332E

S239N/A330L/I332E

V264I/S298A/I332E

S239D/S298A/

I332E

S239N/S298A/I332E

S239D/V264I/I332E

S239D/V264I/

S298A/I332E e S239D/V264I/A330L/I332E, nas quais a de

Fc ê aquela do índice

EU como em Kabat.

É um objetivo adicional da presente fornecimento de variante de Fc que têm uma proporção de

FcyRIIIa:FcyRIIb maior que 1:1.

Em uma modalidade, as variantes de Fc têm uma proporção de

FcyRIIIa:FcyRIIb maior que 11:1. Em uma modalidade preferida, as variantes de Fc

25/261 têm uma proporção de FcyRIIIa:FcyRIIb entre 11:1 e 86:1. Em uma modalidade, as variantes de Fc compreendem pelo menos uma substituição de aminoácido na posição selecionada do grupo que consiste em: 234, 235, 239, 240, 264, 296, 330 e 1332, nas quais a numeração dos resíduos na região de Fc é aquela do índice EU como em Kabat. Em uma modalidade preferida, as variantes de Fc compreendem pelo menos uma substituição de aminoácido selecionada do grupo que consiste em: L234Y, L234I, L235I, S239D, S239E, S239N, S239Q, V240A, V240M, V264I, V264Y, Y296Q, A330L, A330Y, A330I, I332D e I332E, nas quais a numeração dos resíduos na região de Fc é aquela do índice EU como em Kabat. Em uma modalidade mais preferida, as variantes de Fc são selecionadas do grupo que consiste em: I332E, V264I/I332E, S239E/I332E, S239Q/I332E, Y296Q, A330L, A330Y, I332D, S239D, S239D/I332E, A330Y/I332E, V264I/A330Y/I332E, A330L/ I332E, V264I/A330L/I332E, L234Y, L234I, L235I, V240A, V240M, V264Y, A330I, S239D/A330L/I332E, S239D/S298A/I332E, S239N/S298A/I332E, S239D/V264I/I332E, S239D/V264I/S298A/ I332E e S239D/V264I/A330L/I332E, nas quais a numeração dos resíduos na região de Fc é aquela do índice EU como em Kabat.

É um objetivo adicional da presente invenção o fornecimento de variantes de Fc que medeiam a função efetora de forma mais eficaz na presença de células efetoras. Em uma modalidade, as variantes de Fc medeiam ADCC que é maior que aquela mediada pelo polipeptídeo de Fc parente. Em uma modalidade preferida, as variantes de Fc medeiam ADCC que é mais de 5 vezes maior que aquela mediada pelo polipeptídeo de Fc parente. Em uma modalidade mais

26/261 preferida, as variantes de Fc medeiam ADCC que está entre a 50 vezes maior aquela mediada pelo polipeptídeo de Fc parente. Em uma modalidade, as variantes de Fc compreendem pelo menos uma substituição de aminoácido na posição selecionada do grupo que consiste em: 234, 235, 239, 240, 243, 264, 266, 328, 330, 332 e 325, nas quais a numeração dos resíduos na região de Fc é aquela do índice EU como em Kabat. Em uma modalidade preferida, as variantes de Fc compreendem pelo menos uma substituição de aminoácido

selecionada do	grupo	que consiste em	: L234E,	L234Y,	L234I,
L235D,	L235S,	L235Y,	L235I,	S239D,	S239E,	S239N,	S239Q,
S239T,	V240I,	V240M,	F243L,	V264I,	V264T,	V264Y,	V266I,
L328M,	L328I,	L328Q,	L328D,	L328V,	L328T,	A330Y,	A330L,
A330I,	I332D,	I332E,	I332N,	I332Q	e N325T,	nas quais a
numeração dos	resíduos na região de	Fc é aquela do	índice

EU como em Kabat. Em uma modalidade mais preferida, as variantes de Fc são selecionadas do grupo que consiste em: V264I, F243L/V264I, L328M, I332E, L328M/I332E, V264I/I332E,

S298N/I332E,

S239E/I332E, S239Q/I332E, S239E, A330Y, I332D,

L328I/I332E,

L328Q/I332E,

V264T, V240I,

V266I, S239D,

S239D/I332D,

S239D/I332E,

S239D/I332N,

S239D/1332Q,

S239E/I332D,

S239E/I332N,

S239E/I332Q,

S239N/I332D,

S239N/1332E,

S239Q/1332D, A330Y/I332E, V264I/A330Y/I332E,

A330L/I332E,

V264I/A330L/I332E, L234E, L234Y, L234I,

L235D,

L235S, L235Y, L235I, S239T, V240M, V264Y, A330I, N325T,

L328D/I332E, L328V/I332E, L328T/I332E, L328I/I332E, S239E/

V264I/I332E, S239Q/V264I/I332E, S239E/V264I/A330Y/I332E,

S239D/A330Y/I332E,

S239N/A330L/I332E,

S239N/S298A/I332E,

S239N/A330Y/I332E,

V264I/S298A/I332E,

S239D/V264I/I332E,

S239D/A330L/I332E,

S239D/S298A/I332E,

S239D/V264I/S298N/

27/261

Ι332Ε e S239D/V264I/A330L/I332E, nas quais a numeração dos resíduos na região de Fc é aquela do índice EU como em Kabat.

É um objetivo adicional da presente invenção o fornecimento de variantes de Fc que se ligam com menor afinidade a um ou mais FcyRs. Em uma modalidade, as variantes de Fc compreendem pelo menos uma substituição de aminoácido na posição selecionada do grupo que consiste em:

234 ,	235,	239,	240, 241, 243,	244,	245, 247, 262, 263, 264,
265,	266,	267,	269, 296, 297,	298,	299, 313, 325, 327, 328,
329,	330	e 332, nas quais	a numeração dos resíduos na

região de Fc é aquela do índice EU como em Kabat. Em uma modalidade preferida, as variantes de Fc compreendem uma substituição de aminoácido na posição selecionada do grupo que consiste em: L234D, L234N, L234Q, L234T, L234H,

L234V,

L234F,	L235N,	L235Q,	L235T,	L235H,	L235V,	L235F,	S239E,
S239N,	S239Q,	S239F,	S239H,	S239Y,	V240A,	V240T,	F241W,
F241L,	F241Y,	F241E,	F241R,	F243W,	F243L,	F243Y,	F243R,
F243Q,	P244H,	P245A,	P247V,	P247G,	V262I,	V262A,	V262T,
V262E,	V263I,	V263A,	V263T,	V263M,	V264L,	V264I,	V264W,
V264T,	V264R,	V264F,	V264M,	V264E,	D265G,	D265N,	D265Q,
D265Y,	D265F,	D265V,	D265I,	D265L,	D265H,	D265T,	V266A,
V266T,	V266M,	S267Q,	S267L,	E269H,	E269Y,	E269F,	E269R,
Y296E,	Y296Q,	Y296D,	Y296N,	Y296S,	Y296T,	Y296L,	Y296I,
Y296H,	N297S,	N297D,	N297E,	A298H,	T299I,	T299L,	T299A,
T299S,	T299V,	T299H,	T299F,	T299E,	W313F,	N325Q,	N325L,
N325I,	N325D,	N325E,	N325A,	N325V,	N325H,	A327N,	A327L,
L328M,	328E,	L328N,	L328Q,	L328F,	L328H,	L328A,	P329F,
A330L,	A330V,	A330F,	A330R,	A330H,	I332N,	I332Q,	I332T,

I332H, I332Y e I332A, nas quais a numeração dos resíduos na

28/261 região de Fc é aquela do índice EU como em Kabat. Em uma modalidade mais preferida, as variantes de Fc são selecionadas do grupo que consiste em: V264L, F241W, F241L, F243W, F243L, F241L/F243L/V262I/V264I, F241W/F243W, F241W/F243W/V262A/V264A, F241L/V262I, F243L/V262I/V264W, F241Y/F243Y/V262T/V264T, F241E/F243R/V262E/V264R, F241E/ F243Q/V262T/V264E, F241R/F243Q/V262T/V264R, F241E/F243Y/ V262T/V264R, L328M, L328E, L328F, P244H, P245A, P247V, W313F, P244H/P245A/P247V, P247G, F241E/F243R/V262E/V264R/ I332E, F241E/F243Y/V262T/V264R/I332E, D265G, D265N, S239E/D265G, S239E/D265N, S239E/D265Q, Y296E, Y296Q, T299I,

A327N,	S267Q/A327S,	S267L/A327S,	A327L,	P329F,	A330L,
N297S,	N297D,	N297S/	I332E,	I332N,	I332Q,	V264F,	V263I,
T299A,	T299S,	T299V,	N325Q,	N325L,	N325I,	S239N,	S239F,
S239N/I332N, S239N/I332Q, S239Q/I332N, S239Q/I332Q,	Y296D,
Y296N,	L234D,	L234N,	L234Q,	L234T,	L234H,	L234V,	L234F,
L235N,	L235Q,	L235T,	L235H,	L235V,	L235F,	S239H,	S239Y,
V240A,	V263T,	V263M,	V264M,	V266A,	V266T,	V266M,	E269H,
E269Y,	E269F,	E269R,	Y296S,	Y296T,	Y296L,	Y296I,	A298H,
T299H,	A330V,	A330F,	A330R,	A330H,	N325D,	N325E,	N325A,
N325V,	N325H,	L328E/I332E,	L328N/I332E,	L328Q/I332E,

L328H/I332E, L328A, I332T, I332H, I332Y, e I332A, nas quais a numeração dos resíduos na região de Fc é aquela do índice EU como em Kabat.

É um objetivo adicional da presente invenção o fornecimento de variantes de Fc que medeiam ADCC na presença de células efetoras de forma menos eficaz. Em uma modalidade, as variantes de Fc compreendem pelo menos uma substituição de aminoácido na posição selecionada do grupo que consiste em: 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245,

29/261

247, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 296, 297, 298, 299, 313, 325, 327, 328, 329, 330 e 332, nas quais a numeração dos resíduos na região de Fc é aquela do índice EU como em Kabat. Em uma modalidade preferida, as variantes de Fc compreendem pelo menos uma substituição de aminoácido na

posição	selecionada do	grupo	que consiste em:	L234D,	L234N
L234Q,	L234T,	L234H,	L234V,	L234F,	L235N,	L235Q,	L235T
L235H,	L235V,	L235F,	S239E,	S239N,	S239Q,	S239F,	S239H
S239Y,	V240A,	V240T,	F241W,	F241L,	F241Y,	F241E,	F241R
F243W,	F243L·,	F243Y,	F243R,	F243Q,	P244H,	P245A,	P247V
P247G,	V262I.,	V262A,	V262T,	V262E,	V263I,	V263A,	V263T
V263M,	V264L,	V264I,	V264W,	V264T,	V264R,	V264F,	V264M
V264E,	D265G,	D265N,	D265Q,	D265Y,	D265F,	D265V,	D265I
D265L,	D265H,	D265T,	V266A,	V266T,	V266M,	S267Q,	S267L
E269H,	E269Y,	E269F,	E269R,	Y296E,	Y296Q,	Y296D,	Y296N
Y296S,	Y296T,	Y296L,	Y296I,	Y296H,	N297S,	N297D,	N297E
A298H,	T299I,	T299L,	T299A,	T299S,	T299V,	T299H,	T299F
T299E,	W313F,	N325Q,	N325L,	N325I,	N325D,	N325E,	N32 5A
N325V,	N325H,	A327N,	A327L,	L328M,	328E,	L328N,	L328Q
L328F,	L328H,	L328A,	P329F,	A330L,	A330V,	A330F,	A33 0R

A3 3 0H

I332N, I332Q, I332T,

I332H, I332Y e I332A, nas quais a numeração dos resíduos na região de Fc é aquela do índice

EU como em Kabat.

Em uma modalidade mais preferida, as variantes de Fc são selecionadas do grupo que consiste em: V264L, F241W, F241L, F243W, F243L, F241L/F243L/V262I/V264I, F241W/F243W, F241W/F243W/V262A/V264A, F241L/V262I, F243L/ V262I/V264W, F241Y/F243Y/V262T/V264T, F241E/F243R/V262E/

V264R, F241E/F243Q/V262T/V264E, F241R/F243Q/V262T/V264R,

F241E/F243Y/V262T/V264R, L328M, L328E, L328F, P244H, P245A,

P247V, W313F, P244H/P245A/P247V, P247G, F241E/F243R/V262E/

30/261

V264R/I332E, F241E/F243Y/V262T/V264R/I332E, D265G, D265N,

S239E/D265G, S239E/D265N, S239E/D265Q, Υ296Ε, Y296Q, Τ299Ι,

A327N,	S267Q/A327S,	S267L/A327S,	A327L,	P329F,	A330L,
N297S,	N297D,	N297S/	I332E,	I332N,	I332Q,	V264F,	V263I,
T299A,	T299S,	T299V,	N325Q,	N325L,	N325I,	S239N,	S239F,
S239N/I332N, S239N/I332Q, S239Q/I332N, S239Q/I332Q,	Y296D,
Y296N,	L234D,	L234N,	L234Q,	L234T,	L234H,	L234V,	L234F,
L235N,	L235Q,	L235T,	L235H,	L235V,	L235F,	S239H,	S239Y,
V240A,	V263T,	V263M,	V264M,	V2 66A,	V266T,	V266M,	E269H,
E269Y,	E269F,	E269R,	Y296S,	Y296T,	Y296L,	Y296I,	A298H,
T299H,	A330V,	A330F,	A330R,	A330H,	N325D,	N325E,	N325A,
N325V,	N325H,	L328E/I332E,	L328N/I332E,	L328Q/I332E,

L328H/I332E, L328A, Ι332Τ, Ι332Η, Ι332Υ e I332A, nas quais a numeração dos resíduos na região de Fc é aquela do índice EU como em Kabat.

É um objetivo adicional da presente invenção o fornecimento de variantes de Fc que têm melhores propriedades de função e/ou solução quando comparadas à forma aglicosilada do polipeptídeo de Fc parente. Uma melhor funcionalidade aqui inclui, mas não se limita a, afinidade de ligação a um ligante de Fc. Melhores propriedades de solução aqui incluem, mas não se limitam a, estabilidade e solubilidade. Em uma modalidade, as variantes de Fc aglicosiladas se ligam a um FcyR com uma afinidade que é comparável ou melhor que a do polipeptídeo de Fc parente glicosilada. Em uma modalidade alternativa, as variantes de Fc se ligam a um FcyR com uma afinidade que é 0,4 vezes a da forma glicosilada do polipeptídeo de Fc parente. Em uma modalidade, as variantes de Fc compreendem pelo menos uma substituição de aminoácido na posição

31/261 selecionada do grupo que consiste em: 239, 241, 243, 262, 264, 265, 296, 297, 330 e 332, nas quais a numeração dos resíduos na região de Fc é aquela do índice EU como em Kabat. Em uma modalidade preferida, as variantes de Fc compreendem uma substituição de aminoácido selecionada do grupo que consiste em: S239D, S239E, F241Y, F243Y, V262T, V264T, V264E, D265Y, D265H, Y296N, N297D, A330Y e I332E, nas quais a numeração dos resíduos na região de Fc é aquela do índice EU como em Kabat. Em uma modalidade mais preferida, as variantes de Fc são selecionadas do grupo que consiste em: N297D/I332E, F241Y/F243Y/V262T/V264T/N297D/ I332E, S239D/N297D/I332E, S239E/N297D/I332E, S239D/D265Y/ N297D/I332E, S239D/D265H/N297D/I332E, V264E/297D/1332E, Y296N/N297D/I332E e N297D/A330Y/I332E, nas quais a numeração dos resíduos na região de Fc é aquela do índice EU como em Kabat.

A presente invenção também fornece métodos para construção de variantes de Fc otimizadas. É um objetivo da presente invenção o fornecimento de estratégias de desenho que podem ser usadas para guiar a otimização de Fc. É um objetivo adicional da presente invenção o fornecimento de métodos de varredura computacionais que podem ser usados para desenhar variantes de Fc. Ê um objetivo adicional da presente invenção o fornecimento de métodos para geração de bibliotecas para testes experimentais. É um objetivo adicional da presente invenção o fornecimento de métodos de produção e de varredura experimentais para obtenção de variantes de Fc otimizadas.

A presente invenção fornece ácidos nucléicos isolados que codificam as variantes de Fc aqui descritas. A presente

32/261 invenção fornece vetores que compreendem os ácidos nucléicos, opcionalmente, operacionalmente ligados para controlar sequências. A presente invenção fornece células hospedeiras que contêm os vetores e métodos para produção e opcionalmente recuperação de variantes de Fc.

A presente invenção fornece novos anticorpos e fusões de Fc que compreendem as variantes de Fc aqui reveladas. Os novos anticorpos e fusões de Fc podem ter uso em um produto terapêutico.

A presente invenção fornece composições que compreendem anticorpos e fusões de Fc que compreendem as variantes de Fc aqui descritas e um transportador ou diluente fisicamente ou farmaceuticamente aceitável.

A presente invenção contempla usos terapêuticos e diagnósticos para anticorpos e fusões de Fc que compreendem as variantes de Fc aqui reveladas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1. Estrutura e função de anticorpo. É mostrado um modelo de um anticorpo IgGl humano de comprimento total, modelado usando uma estrutura Fab humanizada do código de acesso pdb 1CE1 (James e outros, 1999, J Mol Biol 289:2933 01) e uma estrutura de Fc de IgGl humana do código de acesso pdb 1DN2 (DeLano e outros, 2000, Science 287:12791283) . A dobradiça flexível que liga as regiões Fab e Fc não é mostrada. IgGl é um homodímero de heterodímeros, feito de duas cadeias leves e duas cadeias pesadas. Os domínios de Ig que compreendem o anticorpo são marcados, e incluem V_L e C_L para a cadeia leve, e V_H, Cgamal (Cyl) , Cgama2 (Cy2) e Cgama3 (Cy3) para a cadeia pesada. A região de Fc é marcada. Os sítios de ligação para proteínas

33/261 relevantes são marcados, incluindo o sítio de ligação do antígeno na região variável e os sítios de ligação para FcyRs, FcRn, Clq e proteínas A e G na região de Fc.

Figura 2. A estrutura de complexo Fc/FcyRIIIb 1IIS. Fc é mostrado como um diagrama em fita cinza e FcyRIIIb é mostrado como uma fita preta. O carboidrato N2 97 é mostrado como varetas pretas.

Figura 3. A seqüência de aminoácidos da cadeia pesada do anticorpo alemtuzumab (Campath®, uma marca registrada de Ilex Pharmaceuticals LP) , que ilustra posições numeradas seqüencialmente (2 linhas acima da seqüência de aminoácidos) e posições numeradas de acordo com o índice EU como em Kabat (2 linhas abaixo da seqüência de aminoácidos). O início aproximado dos domínios de Ig VH1, Cyl, a dobradiça, Cy2 e Cy3 são também marcados acima da numeração seqüencial. Foram observados polimorfismos em inúmeras posições de Fc, incluindo, mas não limitadas a, Kabat 270, 272, 312, 315, 356 e 358, e assim pequenas diferenças entre a seqüência apresentada e seqüências na técnica anterior podem existir.

Figura 4. Resíduos de biblioteca experimental mapeados na estrutura de complexo Fc/FcyRIIIb 1IIS. Fc é mostrado como um diagrama em fita cinza e FcyRIIIb é mostrado como uma fita preta. Resíduos de biblioteca experimental são mostrados como bola e vareta pretos. O carboidrato N297 é mostrado como varetas pretas.

Figura 5. A seqüência de Fc de IgGl humana que mostra posições relevantes ao desenho da biblioteca experimental de variante de Fc. A seqüência inclui a região de dobradiça, domínio Cy2 e domínio Cy3. Os números dos

34/261 resíduos estão de acordo com o índice EU como em Kabat. Posições relevantes à biblioteca experimental são sublinhadas. Devido a mutações polimórficas observadas em inúmeras posições de Fc, pequenas diferenças entre a seqüência apresentada e seqüências na literatura podem existir.

Figura 6. Expressão de variante de Fc e proteínas de alemtuzumab de tipo selvagem (WT) em células 2 93T. Plasmídeos que contêm genes de cadeia pesada de alemtuzumab (WT ou variantes) foram co-transfectados com plasmídeo contendo o gene de cadeia leve de alemtuzumab. Os meios foram coletados 5 dias após transfecção. Para cada amostra transfectada, 10 ul de meio foi colocado em um gel SDS-PAGE para análise Western. A prova para Western foi IgG de cabra-anti-humana peroxidase-conjugada (Jackson Immuno-Research, catálogo # 109-035-088). WT: alemtuzumab de tipo selvagem; 1-10: variantes de alemtuzumab. H e L indicam cadeia pesada e cadeia leve de anticorpo, respectivamente.

Figura 7. Purificação de alemtuzumab usando cromatografia de proteína A. Proteínas de alemtuzumab WT foram expressas em células 293T e o meio foi coletado 5 dias após transfecção. 0 meio foi diluído a 1:1 com PBS e purificado com proteína A (Pierce, Catálogo # 20334). O: amostra original antes da purificação; FT: escoamento; E: eluição; C: amostra final concentrada. 0 quadro na esquerda mostra um gel SDS-PAGE simples corado em azul e o da direita mostra uma mancha western marcada que usa IgG de cabra-anti-humana peroxidase-conjugada.

Figura 8. Produção de anticorpos desglicosilados.

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Alemtuzumab de tipo selvagem e variantes desse foram expressos em células 293T e purificados com cromatografia de proteína A. Os anticorpos foram incubados com peptídeoN-glicosidase (PNGase F) a 37°C por 24h. para cada anticorpo, uma amostra tratada simulada (-PNGase F) foi feita em paralelo. WT: alemtuzumab de tipo selvagem; #15, #16, #17, #18, #22: variantes de alemtuzumab F241E/F243R/V262E/V264R, F241E/F243Q/V262T/V264E, F241R/F243Q/V262T/V264R, F241E/F243Y/V262T/V264R e I332E, respectivamente. A migração mais rápida das amostras tratadas com PNGase F versus simuladas representam as cadeias pesadas desglicosiladas.

Figura 9. Alemtuzumab expresso de células 293T liga seu antígeno. O peptídeo antigênico CD52, fundido a GST, foi expresso em E. coli BL21 (DE3) sob indução de IPTG. Tanto as amostras induzidas quanto as não induzidas foram passadas em um gel de SDS-PAGE e transferidas para membrana PVDF. Para análise de western, alemtuzumab de Sotec (aCD52, Sotec) (concentração final de 2,5 ng/ul) ou meio de células 293T transfectadas (Campath, Xencor) (concentração final de alemtuzumab aproximadamente 0,1-0,2 ng/ul) foram usados como anticorpo primário e IgG de cabra-anti-humana peroxidase-conjugada foi usada como anticorpo secundário. M: marcador pré-coloração; U: amostra não induzida para GST-CD52; I: amostra induzida para GST-CD52.

Figura 10. Expressão e purificação de região extracelular de V158 FcyRIIIa humano. FcyRIIIa rotulado foi transfectado em células 293T e o meio contendo FcyRIIIa secretado foram coletados 3 dias depois e purificados usando cromatografia por afinidade. 1: meio; 2: escoamento;

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3: lavagem; 4-8: eluições seriadas. Ambos os resultados de gel de SDS-PAGE simples corado em azul e de western são mostrados. Para a mancha western a membrana foi marcada com anticorpo anti-GST.

Figura 11. Ligação a V158 FcyRIIIa humano por variantes de Fc de alemtuzumab selecionadas da biblioteca experimental como determinado pelo ensaio AlfaScreen™, descrito no exemplo 2. Na presença de anticorpo competidor (variante de Fc ou alemtuzumab WT) uma curva de inibição característica é observada como uma diminuição no sinal de luminescência. Solução salina tamponada por fosfato (PBS) isolada foi usada como o controle negativo. Esses dados foram normalizados ao sinal de luminescência máximo e mínimo fornecido pelas linhas de base em baixas e altas concentrações de anticorpo competidor, respectivamente. As curvas representam os ajustes dos dados a um modelo de competição de sítio que usa regressão não linear. Esses ajustes fornecem IC50s para cada anticorpo, ilustrados para WT e S239D pelas linhas pontilhadas.

Figura 12. Ensaio AlfaScreen™ que mostra ligação de variantes de Fc de alemtuzumab selecionadas para FcyRIIb humano. Os dados foram normalizados e as curvas representam os ajustes dos dados a um modelo de competição de sítio. PBS foi usado como um controle negativo.

Figura 13. Ensaio AlfaScreen™ que mostra ligação de variantes de Fc de alemtuzumab selecionadas para VaI158 FcyRIIIa humano. Os dados foram normalizados e as curvas representam os ajustes dos dados a um modelo de competição de sítio. PBS foi usado como um controle negativo.

Figura 14. Ensaio AlfaScreen™ que mede a ligação a

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V158 FcyRIIIa humano por variantes de Fc selecionadas no contexto de rituximab. Os dados foram normalizados e as curvas representam os ajustes dos dados a um modelo de competição de sítio. PBS foi usado como um controle negativo.

Figura 15. Ensaio AlfaScreen™ que mede a ligação a V158 FcyRIIIa humano por variantes de Fc selecionadas no contexto de trastuzumab. Os dados foram normalizados e as curvas representam os ajustes dos dados a um modelo de competição de sítio. PBS foi usado como um controle negativo.

Figuras 16a - 16b. Ensaio AlfaScreen™ que compara ligação de variantes de Fc de alemtuzumab selecionadas para V158 FcyRIIIa humano (Figura 16a) e FcyRIIb humano (Figura 16b) . os dados foram normalizados e as curvas representam os ajustes dos dados a um modelo de competição de sítio. PBS foi usado como um controle negativo.

Figura 17. Ensaio AlfaScreen™ que mede a ligação a V158 FcyRIIIa humano por variantes de Fc selecionadas no contexto de trastuzumab. Os dados foram normalizados e as curvas representam os ajustes dos dados a um modelo de competição de sítio.

Figura 18. Ensaio AlfaScreen™ que mostra ligação de variantes de Fc de alemtuzumab selecionadas a R131 FcyRIIa humano. Os dados foram normalizados e as curvas representam os ajustes dos dados a um modelo de competição de sítio.

Figuras 19a e 19b. Ensaio AlfaScreen™ que mostra ligação de variantes de Fc de alemtuzumab selecionadas a VI5 8 FcyRIIIa humano. Os dados foram normalizados e as curvas representam os ajustes dos dados a um modelo de

38/261 competição de sítio. PBS foi usado como um controle negativo.

Figura 20. Ensaio AlfaScreen™ que mostra ligação de variantes de Fc de alemtuzumab aglicosiladas a V158 FcyRIIIa humano. Os dados foram normalizados e as curvas representam os ajustes dos dados a um modelo de competição de sítio. PBS foi usado como um controle negativo.

Figura 21. Ensaio AlfaScreen™ compara ligação de V158

FcyRIIIa humano por variantes de Fc de alemtuzumab selecionadas em glicosilados (símbolos sólidos, linhas sólidas) e desglicosilados (símbolos abertos, linhas pontilhadas)

Os dados foram normalizados e as curvas representam os ajustes dos dados a um modelo de competição de sítio.

Figuras 22a - 22b.

ligação de variantes de Fc alótipos de V158 (Figura FcyRIIIa humano. Os dados representam os ajustes dos

Ensaio AlfaScreen™ que mostra de alemtuzumab selecionadas aos

22a) e F158 (Figura 22b) de foram normalizados e as curvas dados a um modelo de competição de sítio. PBS foi usado como um controle negativo.

Figuras 23a - 23d. As Figuras 23a e 23b mostram a correlação entre SPR Kd's e AlfaScreen™ IC₅₀ de ligação de variantes de Fc de alemtuzumab selecionadas para V158 FcyRIIIa (Figura 23a) e F158 FcyRIIIa (Figura 23b) . As Figuras 23c e 23d mostram a correlação entre a melhoria de vezes de SPR e AlfaScreen™ sobre WT para ligação de variantes de Fc de alemtuzumab selecionadas para V158 FcyRIIIa (Figura 23c) e F158 FcyRIIIa (Figura 23d) . os dados de ligação são apresentados na tabela 62. As linhas através dos dados representam os ajustes lineares dos dados

39/261 e os valores r² indicam a significância desses ajustes.

Figuras 24a - 24b. Ensaios de ADCC baseados em célula de variantes de Fc selecionadas no contexto de alemtuzumab. O ADCC foi medido usando o ensaio de citoxicidade baseado em DELFIA® EuTDA (Perkin Elmer, MA) , como descrito no exemplo 7, usando células alvo de linfoma DoHH-2 e excesso de 50 vezes de PBMCs humanos. A Figura 24a é um diagrama de barras que mostra os dados brutos de fluorescência para os anticorpos de alemtuzumab indicados em 10 ng/ml. A barra PBMC indica níveis basais de citotoxicidade na ausência de anticorpo. A Figura 24b mostra dependência de dose de ADCC na concentração de anticorpo para os anticorpos de alemtuzumab indicados, normalizados a um sinal de fluorescência mínimo e máximo fornecido pelas linhas de base em baixas e altas concentrações de anticorpo, respectivamente. As curvas representam os ajustes dos dados a um modelo de resposta a dose sigmoidal que usa regressão não linear.

Figuras 25a - 25b. Ensaios de ADCC baseados em célula de variantes de Fc selecionadas no contexto de rituximab. 0 ADCC foi medido usando o ensaio de citoxicidade baseado em DELFIA® EuTDA, como descrito no exemplo 7, usando células alvo de linfoma WIL2-S e excesso de 50 vezes de PBMCs humanos. A Figura 25a é um diagrama de barras que mostra os dados brutos de fluorescência para os anticorpos de rituximab indicados em 1 ng/ml. A barra PBMC indica níveis basais de citotoxicidade na ausência de anticorpo. A Figura 2 5b mostra dependência de dose de ADCC na concentração de anticorpo para os anticorpos de rituximab indicados, normalizados a um sinal de fluorescência mínimo e máximo

40/261 fornecido pelas linhas de base em baixas e altas concentrações de anticorpo, respectivamente. As curvas representam os ajustes dos dados a um modelo de resposta a dose sigmoidal que

Figuras 26a

26c. Ensaios de

ADCC baseados em célula de variantes de Fc selecionadas no contexto de trastuzumab.

O ADCC foi medido usando o ensaio de citoxicidade baseado em DELFIA® EuTDA, como descrito no exemplo 7, usando células alvo de carcinoma de mama

BT474 e Sk-Br-3 excesso de 5 0 vezes de PBMCs humanos.

A Figura 26a é um diagrama de barras que mostra os dados brutos de fluorescência para os anticorpos de trastuzumab indicados em 1 ng/ml.

A barra de

PBMC indica níveis basais de citotoxicidade na ausência de anticorpo. As Figuras 26b e

26c mostram dependência de anticorpo para os anticorpos de trastuzumab indicados, normalizados a um sinal de fluorescência mínimo e máximo fornecido pelas linhas de base em baixas e altas concentrações de anticorpo, respectivamente. As curvas representam os ajustes dos dados a um modelo de resposta a dose sigmoidal que usa regressão não linear.

Figuras 27a - 27b. Capacidade de selecionar variantes de Fc para mediar ligação e ativar o complemento. A Figura 27a mostra um ensaio AlfaScreen™ que mede a ligação de variantes de Fc de alemtuzumab selecionadas para Clq. Os dados foram normalizados a um sinal de fluorescência máximo e mínimo fornecido pelas linhas de base em baixas e altas concentrações de anticorpo competidor, respectivamente. As curvas representam os ajustes dos dados a um modelo de competição de sítio que usa regressão não linear. A Figura

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7b um ensaio baseado em célula que mede a capacidade de selecionar variantes de Fc de rituximab para mediar CDC. Os ensaios de CDC foram realizados usando Amar Blue para monitorar a lise de variante de Fc e células de linfoma WIL2-S opsonizadas com rituximab WT por complemento sérico humano (Quidel, San Diego, CA) . A dependência de dose em concentração de anticorpo de lise mediada por complemento é mostrada para os anticorpos de rituximab indicados, normalizados a um sinal de fluorescência mínimo e máximo fornecido pelas linhas de base em baixas e altas concentrações de anticorpo, respectivamente. As curvas representam os ajustes dos dados a um modelo de resposta a dose sigmoidal que usa regressão não linear.

Figura 28. Ensaio AlfaScreen™ que mede a ligação de variantes de Fc de alemtuzumab selecionadas a proteína A bacteriana, como descrito no exemplo 9. Os dados foram normalizados e as curvas representam os ajustes dos dados a um modelo de competição de sítio. PBS foi usado como um controle negativo.

Figura 29. Ensaio AlfaScreen™ que mede a ligação de variantes de Fc de alemtuzumab selecionadas para FcyRIII de camundongo, como descrito no exemplo 10. Os dados foram normalizados e as curvas representam os ajustes dos dados a um modelo de competição de sítio. PBS foi usado como um controle negativo.

Figura 30. Ensaio AlfaScreen™ que mede a ligação a V158 FcyRIIIa humano por variantes de Fc de trastuzumab selecionadas expressas em células 293T e CHO, como descrito no exemplo 11. Os dados foram normalizados e as curvas representam os ajustes dos dados a um modelo de competição

42/261 de sítio. PBS foi usado como um controle negativo.

Figuras 31a - 31c. Seqüências que mostram anticorpos anti-CD20 aperfeiçoados. As seqüências de cadeia leve e pesada de rituximab são apresentadas nas Figuras 31a e 31b, respectivamente, e são retiradas da Seqüência 3 traduzida da US 5.736.137. Posições relevantes na figura 31b estão em negrito, incluindo S239, V240, V264I, N297, S298, A330 e 1332. A Figura 31c mostra as seqüências de cadeia pesada do anticorpo anti-CD20 aperfeiçoado, com posições variáveis designadas em negrito como X₃, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆ e Zi. A Tabela abaixo da seqüência fornece possíveis substituições para essas posições. As seqüências de anticorpo anti-CD20 aperfeiçoadas compreendem pelo menos um aminoácido não de tipo selvagem selecionado do grupo de substituições possíveis para Xi, X₂, X₃, X₄, X5 e X₆. Essas seqüências de anticorpo anti-CD20 aperfeiçoadas também podem compreender um substituição Z₃. Essas posições são numeradas de acordo com o índice EU como em Kabat e, assim, não correspondem a ordem sequencial na seqüência.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Com o objetivo de que a invenção seja mais completamente compreendida, várias definições são apresentadas abaixo. Tais definições devem englobar equivalentes gramaticais.

Por ADCC ou citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo como aqui usado entende-se a reação mediada por célula na qual células citotóxicas não específicas que expressam FcyRs reconhecem anticorpo ligado em uma célula alvo e subseqüentemente causam a lise da célula alvo.

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Por ADCP ou fagocitose mediada por célula dependente de anticorpo como aqui usado entende-se a reação mediada por célula na qual células citotóxicas não específicas que expressam FcyRs reconhecem anticorpo ligado em uma célula alvo e subseqüentemente causam fagocitose da célula alvo.

Por modificação de aminoácido entende-se aqui uma substituição, inserção e/ou deleção de aminoácido em uma sequência de polipeptídeos. A modificação de aminoácido aqui preferida é uma substituição. **TT

Por anticorpo entende-se aqui a proteína que consiste em um ou mais polipeptídeos substancialmente codificados por todos ou parte dos genes de imunoglobulina reconhecidos. Os genes de imunoglobulina reconhecidos, por exemplo em humanos, incluem o kapa (k) , lambda (λ) e lócus genético de cadeia pesada, que juntos compreendem a miríade de genes de região variável, e os genes de região constante mu (μ) , delta (δ) , gama (y) , sigma (σ) e alfa (a) , que codificam os isotipos de IgM, IgD, IgG, IgE e IgA, respectivamente. Anticorpo aqui deve incluir anticorpos de comprimento total e fragmentos de anticorpo, e pode se referir a um anticorpo natural de qualquer organismo, um anticorpo construído ou um anticorpo gerado de forma recombinante para objetivos experimental, terapêutico ou outro como mais definido abaixo. Assim, anticorpo inclui tanto anticorpo policlonal quanto monoclonal (mAb). Métodos de preparação e purificação de anticorpos monoclonal e policlonal são conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, em Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). Como

44/261 aqui apontado, anticorpo especificamente inclui variantes de Fc aqui descritas, anticorpos de comprimento total que incluem os fragmentos de variante de Fc aqui descritos e fusões de variante de Fc a outras proteínas como aqui descritas.

Em algumas modalidades, os anticorpos podem ser neutralizantes ou inibidores, ou estimulantes, e em modalidade preferidas, como aqui descritas, a atividade estimulante é medida por um aumento na afinidade de um anticorpo variante a um receptor, quando comparado ao anticorpo parente (pr exemplo, quando uma variante de ocorrência não natural é usada aqui como o ponto de partida para a análise de computação), ou ao anticorpo original de tipo selvagem. Conseqüentemente, por neutralização, neutraliza, neutralizante e equivalentes gramaticais entende-se a inibição ou diminuição do efeito biológico do anticorpo, em alguns casos por ligação (por exemplo, competitivamente) a um antígeno e evitando ou diminuindo o efeito biológico da ligação ou por ligação que resulta em diminuição do efeito biológico da ligação.

O termo anticorpo inclui fragmentos de anticorpo, como são conhecidos na técnica, como Fab, Fab', F(ab')2 Fcs ou outras subseqüências de ligação a antígeno de anticorpos, como, anticorpos de cadeia única (Fv, por exemplo), anticorpos quiméricos, etc., produzidos pela modificação de anticorpos totais ou aqueles sintetizados novamente usando tecnologias de DNA recombinante. Particularmente preferidas são variantes de Fc como aqui descritas. 0 termo anticorpo também compreende anticorpos policlonais e mAbs que podem ser anticorpos agonistas ou

45/261 antagonistas .

Os anticorpos da invenção especificamente se ligam a receptores de Fc, como aqui apontado. Por se ligam especificamente entende-se aqui que os anticorpos LC têm uma constante de ligação na faixa de pelo menos 10'⁴ a 10'⁶ M’¹, com uma faixa preferida sendo 10’⁷ - 10'⁹ M'¹.

Em uma modalidade preferida, os anticorpos da invenção são humanizados. Com o uso da atual tecnologia de anticorpo monoclonal uma pessoa pode produzir um anticorpo humanizado para virtualmente qualquer antígeno alvo que pode ser identificado [Stein, Trends Biotechnol. 15:88-90 (1997)] .

Formas humanizadas de anticorpos não humanos (por exemplo, de murídeo) são moléculas quiméricas de imunoglobulinas, cadeias de imunoglobulina ou fragmentos dessas (tais como Fv, Fc, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subseqüências de anticorpos de ligação a antígeno) que contêm seqüência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Os anticorpos humanizados incluem imunoglobulinas humanas (anticorpo recipiente) nas quais resíduos de uma região de determinação complementar (CDR) do recipiente são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato ou coelho tendo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, resíduos de estrutura Fv da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Anticorpos humanizados podem também compreender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo recipiente nem no CDR importado ou sequências de estrutura. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todo de pelo menos um, e tipicamente dois,

46/261 domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana, e todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas da seqüência de consenso de imunoglobulina humana. 0 anticorpo humanizado também irá compreender pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc) , tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana [Jones e outros, Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann e outros, Nature 332: 323-329 (1988) e Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)]. Métodos para humanização de anticorpos não humanos são bem conhecidos na técnica. Geralmente, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácido introduzidos nele a partir de uma fonte que é não humana. Esses resíduos de aminoácido não humanos são freqüentemente referidos como resíduos de importação, que são tipicamente tomados de um domínio variável de importação. A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e colaboradores [Jones e outros, Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann e outros, Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen e outros, Science, 239:1534-1536 (1988)], por substituição de CDRs ou seqüências de CDR de roedor pelas seqüências correspondentes de um anticorpo humano. Exemplos adicionais de anticorpos monoclonais de murídeo humanizados são também conhecidos na técnica, por exemplo, anticorpos que ligam proteína C humana [0'Connor e outros, Proteína Eng. 11:3218 (1998)], receptor de interleucina 2 [Queen e outros, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 86:10029-33 (1989]) e receptor 2 de fator de crescimento epidérmico humano [Carter e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285-9

47/261 (1992)]. Consequentemente, tais anticorpos humanizados são anticorpos quiméricos (Patente U.S. No. 4.816.567), nos quais substancialmente menos que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente e de uma espécie não humana. Na prática, anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos de CDR e possíveis resíduos FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedor.

Em uma modalidade preferida, os anticorpos da invenção são baseados em seqüências humanas e são, assim, seqüências humanas que são usadas como as seqüências de base, contra as quais outras seqüências, tais como seqüências de rato, camundongo e macaco. Para estabelecer homologia a seqüência ou estrutura primária, a seqüência de aminoácidos de um Fc precursor ou parente é comparada diretamente com a seqüência de Fc humano aqui apresentada. Após alinhamento das seqüências, usando um ou mais dos programas de alinhamento de homologia aqui descritas (por exemplo, usando resíduos conservados como entre espécies), que permite inserções e deleções necessárias para manter o alinhamento (ou seja, evitando a eliminação de resíduos conservados através de deleção e inserção arbitrárias) , os resíduos equivalentes a aminoácidos particulares na seqüência primária de Fc humano são definidos. 0 alinhamento de resíduos conservados deve conservar preferivelmente 100% de tais resíduos. Entretanto, alinhamento de mais que 75% ou tão pouco quanto 50% de resíduos conservados também é adequado para definir resíduos equivalentes (algumas vezes referidos aqui como resíduos correspondentes).

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Resíduos equivalentes também podem ser definidos por determinação de homologia no nível de estrutura terciária para um fragmento de Fc cuja estrutura terciária foi determinada por cristalografia de raio-X. Resíduos equivalentes são definidos como aqueles para os quais as coordenadas atômicas de dois ou mais átomos de cadeia principal de um resíduo de aminoácido particular do parente ou precursor (N em N, CA em CA, C em C e O em 0) são em 0,13 nm e preferivelmente 0,1 nm após alinhamento. 0 alinhamento é realizado após o melhor modelo ter sido orientado e posicionado para dar a máxima sobreposição de coordenadas atômicas dos átomos da proteína não hidrogênio do fragmento de variante de Fc.

Especificamente incluído na definição de anticorpo estão os anticorpos aglicosilados. Por anticorpo aglicosilado como aqui usado entende-se um anticorpo que é desprovido do carboidrato ligado na posição 297 da região de Fc, no qual a numeração é de acordo com o sistema EU como em Kabat. O anticorpo aglicosilado pode ser um anticorpo desglicosilado, que é um anticorpo para o qual o carboidrato Fc foi removido, por exemplo, quimicamente ou enzimaticamente. Alternativamente, o anticorpo aglicosilado pode ser um anticorpo não glicosilado, que é um anticorpo que foi expresso sem o carboidrato Fc, por exemplo, por mutação de um ou mais resíduos que codificam o padrão de glicosilação ou por expressão em um organismo que não liga os carboidratos a proteínas, por exemplo bactérias.

Especificamente incluídos na definição de anticorpo estão anticorpos de comprimento total que contêm uma porção de variante de Fc. Por anticorpo de comprimentototal

49/261 entende-se a estrutura que constitui a forma biológica natural de um anticorpo, incluindo regiões variáveis e constantes. Por exemplo, na maioria dos mamíferos, incluindo humanos e camundongos, o anticorpo de comprimento total da classe IgG é um tetrâmero e consiste em dois pares idênticos de duas cadeias de imunoglobulina, cada par tendo uma cadeia leve e uma pesada, cada cadeia leve compreendendo domínios de imunoglobulina V_L e C_L, e cada cadeia pesada compreendendo domínios de imunoglobulina V_H, Cyl, Cy2 e Cy3. Em alguns mamíferos, por exemplo em camelos e lhamas, os anticorpos IgG podem consistir em apenas duas cadeias pesadas, cada cadeia pesada compreendendo um domínio variável ligado à região de Fc. Por IgG como aqui usado entende-se um polipeptídeo que pertence à classe de anticorpos que são substancialmente codificados por um gene de imunoglobulina gama reconhecido. Em humanos essa classe compreende IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. Em camundongos essa classe compreende IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3.

Por aminoácido e identidade de aminoácido como aqui usado entende-se um dos 20 aminoácidos de ocorrência natural ou quaisquer análogos não naturais que podem estar presentes em uma posição específica, definida. Por proteína entende-se aqui pelo menos dois aminoácidos ligados de forma covalente, que incluem proteínas, polipeptídeos, oligopeptídeos e peptídeos. A proteína pode ser feita de aminoácidos de ocorrência natural e de ligações de peptídeos ou estruturas peptidomiméticas sintéticas, ou seja, análogos, tais como peptóides (veja Simon e outros, PNAS USA 89(20):9367 (1992)) particularmente quando peptídeos LC são administrados a um

50/261 paciente. Portanto, aminoácido ou resíduo de peptídeo como aqui usado significa tanto aminoácidos de ocorrência natural quanto sintéticos. Por exemplo, homofenilalanina, citrulina e norleucina são considerados aminoácidos para os objetivos da invenção. Aminoácido também inclui resíduos de iminoácidos, tais como prolina e hidroxiprolina. A cadeia lateral pode estar na configuração (R) ou (S) . Na modalidade preferida, os aminoácidos estão na configuração (S) ou L. Se cadeias laterais de ocorrência não natural são usadas, substituintes não aminoácidos podem ser usados, por exemplo para evitar ou retardar a degradação in vivo.

Por método de varredura computacional entende-se aqui qualquer método para desenho de uma ou mais mutações de uma proteína, na qual o método utiliza um computador para avaliar a energias das interações de substituições potenciais de cadeia lateral de aminoácido potencial uma com a outra e/ou com o restante da proteína. Como será observado por aqueles habilitados na técnica, a avaliação de energias, aqui referida como cálculo de energia, referese a algum método de pontuação de uma ou mais modificações de aminoácido. 0 método pode envolver um termo de energia físico ou químico, ou pode envolver termos de energia baseados em conhecimento, estatística, seqüência e outros.

Os cálculos que compõem um método de varredura computacional aqui referidos como cálculos de varredura computacional.

Por função efetora como aqui usado entende-se um evento bioquímico que uma região Fc de anticorpo com um efetoras incluem, mas não se limitam a, ADCC, ADCP e CDC.

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Por célula efetora como aqui usado entende-se uma célula do sistema imunológico que expressa um ou mais receptores de Fc e medeia uma ou mais funções efetoras. Células efetoras incluem, mas limitam a, monócitos, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, eosinófilos, mastócitos, plaquetas, células

B, grandes linfócitos granulares, células de

Langerhans, células assassinas naturais (NK) e células

T yy, e podem ser de qualquer organismo incluindo, mas se limitando a, humanos, camundongos, ratos, coelhos e macacos.

Por biblioteca entende-se aqui um conjunto de variantes de Fc em qualquer forma, incluindo, se limitando a, uma lista de ácido nucleico ou seqüências de aminoácidos, uma lista de ácido nucleico ou variáveis, uma biblioteca física que compreende ácidos nucleicos que codificam as seqüências da biblioteca ou uma biblioteca física que compreende proteínas de variante de

Fc, na forma purificada ou não.

Por Fc, região de Fc, polipeptídeo de Fc, etc. como aqui usado entende-se um anticorpo como aqui definido que inclui os polipeptídeos que compreendem a região constante de um anticorpo que exclui o primeiro domínio de imunoglobulina de região constante. Assim, Fc se refere aos últimos dois domínios de imunoglobulina de região constante de IgA, IgD e IgG, e os últimos três domínios de imunoglobulina de região constante de IgE e IgM, e a dobradiça flexível de terminal-N para esses domínios. Para IgA e IgM Fc pode incluir a cadeia J. Para IgG, como ilustrado na figura 1, Fc compreende domínios de imunoglobulina Cgama2 e Cgama3 (Cy2 e Cy3) e a dobradiça

52/261 entre Cgamal (Cyl) e Cgama2 (Cy2) . Embora os limites da região de Fc possam variar, a região de Fc de cadeia pesada de IgG humana é usualmente definida por compreender resíduos C226 ou P230 a seu terminal carboxil, na qual a numeração está de acordo com o índice EU como em Kabat. Fc pode se referir a essa região em isolamento, ou a essa região no contexto de um anticorpo, fragmento de anticorpo ou fusão de Fc. Um Fc pode ser um anticorpo, fusão de Fc ou uma proteína ou domínio de proteína que compreende Fc. Particularmente preferidas são as variantes de Fc que são variantes de ocorrência não natural de um Fc.

Por fusão	de Fc	como	aqui	usado entende-se	uma
proteína na qual um	ou	mais	polipeptídeos	são
operacionalmente	ligados	a Fc.	Fusão	de Fc significa	aqui
um sinônimo dos	termos	imunoadesina, fusão de	ig,

quimera de Ig e globulina receptora (algumas vezes com aspas) como usado na técnica anterior (Chamow e outros, 1996, Trends Biotechnol 14:52-60; Ashkenazi e outros, 1997, Curr Opin Immunol 9:195-200) . Uma fusão de Fc combina a região de Fc de uma imunoglobulina com um parceiro de fusão, que em geral pode ser qualquer proteína, incluindo, mas não se limitando a, região de ligação alvo deum receptor, uma molécula de adesão, um ligante, uma enzimaou alguma outra proteína ou domínio de proteína. 0 papelda parte não Fc de uma fusão de Fc é o de mediar a ligação alvo e, portanto, é funcionalmente análoga às regiões variáveis de um anticorpo.

Por receptor gama Fc ou FcyR como aqui usado entende-se qualquer membro da família de proteínas que ligam a região de Fc de anticorpo IgG e são

53/261 substancialmente codificados por genes de FcyR. Em humanos essa família inclui, mas não se limita a, FcyRI (CD64), incluindo isoformas FcyRIa, FcyRIb e FcyRlc; FcyRII (CD32) , incluindo isoformas FcyRIIa (incluindo alótipos H131 e R131) , FcyRIIb (incluindo FcyRIIb-Ι e FcyRIIb-2) e FcyRIIc; e FcyRIII (CD16), incluindo isoformas FcyRIIIa (incluindo alótipos V158 e F158) e FcyRIIIb (incluindo alótipos FcyRIIIb-NAl e FcyRIIIb-NA2) (Jefferis e outros, 2002, Immunol Lett 82:57-65), assim como qualquer isoformas ou alótipos de FcyRs ou FcyR humanos não descobertas. Um FcyR pode ser de qualquer organismo incluindo, mas não se limitando a, humanos, camundongos, ratos, coelhos e macacos. FcyRs de camundongos incluem, mas não se limitam a, FcyRI (CD64) , FcyRII (CD32) , FcyRIII (CD16) e FcyRIII-2 (CD16-2), assim como qualquer isoformas ou alótipos de FcyRs ou FcyR de camundongo não descobertas.

Por ligante de Fc como aqui usado entende-se uma molécula, preferivelmente um polipeptideo, de qualquer organismo que se liga à região de Fc de um anticorpo para formar um complexo Fc-ligante. Ligantes de Fc incluem, mas não se limitam a, FcyRs, FcyRs, FcyRs, FcRn, Clq, C3, de lectina de ligação de manana, receptor de manose, proteína estafilocócica

A, proteína estreptocócica

G e FcyR viral.

Ligantes de Fc podem incluir moléculas não descobertas que ligam Fc.

Por IgG como aqui usado entende-se um polipeptideo que pertence à classe de substancialmente codificados por gama imunoglobulina. Em humanos um gene reconhecido de essa classe compreende

IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. Em camundongos essa classe

54/261 compreende IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3. Por imunoglobulina (Ig) entende-se aqui uma proteína que consiste em um ou mais polipeptídeos substancialmente codificados por genes de imunoglobulina. Imunoglobulinas incluem, mas não se limitam a, anticorpos. Imunoglobulinas podem ter inúmeras formas estruturais incluindo, mas não se limitando a, anticorpos de comprimento total, fragmentos de anticorpo e domínios individuais de imunoglobulina. Por domínio de imunoglobulina (Ig) entende-se aqui a região de uma imunoglobulina que existe como uma entidade estrutural distinta como verificado por alguém habilitado na técnica de estrutura de proteína. Domínios de Ig tipicamente têm uma topologia característica de dobra β-sanduíche. Os domínios de Ig conhecidos na classe de anticorpos IgG são V_H, Cyl, Cy2, Cy3, V_L e CL.

Por polipeptídeo parente ou polipeptídeo precursor (incluindo Fc parente ou precursores) como aqui usado entende-se um polipeptídeo que é subsequentemente modificado para gerar uma variante. 0 polipeptídeo parente pode ser um polipeptídeo de ocorrência natural ou uma variante ou versão construída de um polipeptídeo de ocorrência natural. Polipeptídeo parente pode se referir ao polipeptídeo em si, composições que compreendem o polipeptídeo parente ou a seqüência de aminoácidos que o codifica. Conseqüentemente, por polipeptídeo de Fc parente como aqui usado entende-se um polipeptídeo de Fc não modificado que é modificado para gerar uma variante, e por anticorpo parente como aqui usado entende-se um anticorpo não modificado que é modificado para gerar um anticorpo variante.

55/261

Como apontado acima, certas posições da molécula de Fc podem ser alteradas. Por posição como aqui usado entendese uma localização na seqüência de uma proteína. Posições podem ser numeradas seqüencialmente ou de acordo com um formato estabelecido, por exemplo, o índice EU como em Kabat. Por exemplo, posição 297 é a posição no anticorpo IgGl humano. Posições correspondentes são determinadas como acima apontado, geralmente através de alinhamento com outras seqüências parentes.

Por resíduo como aqui usado entende-se a posição em uma proteína e sua identidade de aminoácido associado. Por exemplo, Daragina 297 (também referida como N297) é um resíduo no anticorpo IgGl humano.

Por antígeno alvo como aqui usado entende-se a molécula que é ligada especificamente pela região variável de um dado anticorpo. Um antígeno alvo pode ser uma proteína, carboidrato, lipídeo ou outro composto químico.

Por célula alvo como aqui usado entende-se uma célula que expressa um antígeno alvo.

Por região variável como aqui usado entende-se a região de uma imunoglobulina que compreende um ou mais domínios de IgG substancialmente codificados por qualquer um dos genes Vk, νλ e/ou V_H que fazem os lócus genéticos de imunoglobulina kappa, lambda e de cadeia pesada, respectivamente.

Por polipeptídeo variante como aqui usado entende-se uma seqüência de polipeptídeos que difere daquela de uma seqüência de polipeptídeos parentes por virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido. Polipeptídeo variante pode se referir ao polipeptídeo em si, a composição que

56/261 compreende o polipeptídeo ou a seqüência de amino que o codifica. Preferivelmente, o polipeptídeo variante tem pelo menos uma modificação de aminoácido comparada ao polipeptídeo parente, por exemplo, de cerca de um a cerca de dez modificações de aminoácido, e preferivelmente de cerca de um a cerca de cinco modificações de aminoácido comparado ao parente. A seqüência de polipeptídeos variantes possuirá aqui preferivelmente pelo menos cerca de 80% de homologia com a seqüência de polipeptídeos parentes, e, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 90% de homologia, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 95% de homologia. Consequentemente, por variante de Fc como aqui usado entende-se uma seqüência de Fc que se difere daquela de uma seqüência de Fc parente em pelo menos uma modificação de aminoácido. Uma variante de Fc pode englobar apenas uma região de Fc ou pode existir no contexto de um anticorpo, fusão de Fc ou outro polipeptídeo que é substancialmente codificado por Fc. Variante de Fc pode se referir ao polipeptídeo de Fc em si, composições que compreendem o polipeptídeo de variante de Fc ou a seqüência de aminoácidos que o codifica.

Para todas as posições discutidas na presente invenção, a numeração de uma cadeia pesada de imunoglobulina está de acordo com o índice EU (Kabat e outros, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. , United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda) . O índice EU como em Kabat se refere a numeração do resíduo do anticorpo IgGl EU humano.

As variantes de Fc da presente invenção podem ser

57/261 otimizadas para uma variedade de propriedades. Propriedades que podem ser otimizadas incluem, mas não se limitam a, afinidade melhorada ou reduzida por um FcyR. Em uma modalidade preferida, as variantes de

Fc da presente invenção são otimizadas para possuir maior afinidade por um

FcyR de ativação humano, preferivelmente

FcyRI, FcyRIIa,

FcyRIIc,

FcyRIIIa e FcyRIIIb, mais preferivelmente

FcyRIIIa.

Em uma modalidade preferida alternativa, as variantes de Fc são otimizadas para possuir reduzida afinidade para o receptor inibidor humano FcyRIIb. Essas modalidades preferidas são previstas por fornecerem anticorpos

Fc com propriedades terapêuticas melhoradas em humanos, por exemplo, função efetora melhorada maior potência anticâncer. Em uma modalidade alternativa, otimizadas para ter afinidade reduzida ou eliminada para

FcyR humano incluindo, mas não se limitando a FcyRI,

FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIc,

FcyRIIIa e FcyRIIIb. Essas modalidades são previstas por fornecerem anticorpos e fusões de Fc com propriedades terapêuticas melhoradas em humanos, por exemplo, função efetora reduzida e toxicidade reduzida. Modalidades preferidas compreendem a otimização de Fc que se liga a FcyR humano, entretanto, em modalidades alternativas as variantes de Fc da presente invenção possuem afinidade melhorada ou reduzida por FcyRs de organismos não humanos incluindo, mas não se limitando a camundongos, ratos, coelhos e macacos. Variantes de Fc que são otimizadas para ligação a FcyR não humano podem ter uso em experimentação. Por exemplo, modelos de camundongo são disponíveis para uma variedade de doenças que permitem

58/261 testar as propriedades tais como eficácia, toxicidade e farmacocinética para um dado candidato a medicamento. Como é conhecido na técnica, células cancerosas podem ser enxertadas ou injetadas em camundongos para imitar um câncer humano, um processo referido como xeno-enxerto. O teste de anticorpos ou fusões de Fc que compreendem variantes de Fc que são otimizadas para um ou mais FcyRs de camundongo, pode fornecer informação valiosa com relação à eficácia do anticorpo ou fusão de Fc, seu mecanismo de ação e semelhantes. As variantes de Fc da presente invenção também podem ser otimizadas para funcionalidade e/ou propriedades de solução melhoradas em forma aglicosilada. Em uma modalidade preferida, as variantes de Fc aglicosiladas da presente invenção se ligam a um ligante de Fc com maior afinidade que a forma aglicosilada do polipeptídeo de Fc parente. Os ligantes de Fc incluem, mas não se limitam a, FcyRs, Clq, FcRn e proteínas A e G, e podem ser de qualquer fonte incluindo, mas não se limitando a, humana, de camundongo, rato, coelho ou macaco, preferivelmente humana. Em uma modalidade preferida alternativa, as variantes de Fc são otimizadas para serem mais estáveis e/ou mais solúveis que a forma aglicosilada do polipeptídeo de Fc parente. Uma variante de Fc que é construída ou prevista para apresentar qualquer uma das propriedades otimizadas acima mencionadas é aqui referida como uma variante otimizada de Fc.

As variantes de Fc da presente invenção podem ser derivadas de polipept ídeos de Fc parentes que são eles próprios de uma ampla escala de fontes. 0 polipeptídeo de Fc parente pode ser substancialmente codificado por um ou

59/261 mais genes de Fc de qualquer organismo incluindo, mas não se limitando a, humanos, camundongos, ratos, coelhos, camelos, lhamas, dromedários, macacos, preferivelmente mamíferos e mais preferivelmente humanos e camundongos. Em uma modalidade preferida, o polipeptídeo de Fc parente compõe um anticorpo, referido como o anticorpo parente. O anticorpo parente pode ser totalmente humano, obtido, por exemplo, usando camundongos transgênicos (Bruggemann e outros, 1997, Curr Opin Biotechnol 8:455-458) ou de bibliotecas de anticorpo humano junto com métodos de seleção (Griffiths e outros, 1998, Curr Opin Biotechnol 9:102-108). O anticorpo parente não precisa ser de ocorrência natural. Por exemplo, o anticorpo parente pode ser um anticorpo construído incluindo, mas não se limitando a, anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados (Clark, 2000, Immunol Today 21:397-402). O anticorpo parente pode ser uma variante construída de um anticorpo que é substancialmente codificado por um ou mais genes de anticorpo natural. Em uma modalidade, o anticorpo parente foi maturado por afinidade, como conhecido na técnica. Alternativamente, o anticorpo foi modificado de alguma outra forma, por exemplo como descrito em USSN 10/339788, depositado em 3 de março de 2003.

As variantes de Fc da presente invenção podem ser substancialmente codificadas por genes de imunoglobulina que pertencem a qualquer uma das classes de anticorpo. Em uma modalidade preferida, as variantes de Fc da presente

invenção têm uso em	anticorpos	ou fusões de	Fc	que
compreendem sequências	que	pertencem à classe	IgG	de
anticorpos, incluindo	IgGl,	IgG2,	IgG3 ou IgG4 .	Em	uma

60/261 modalidade alternativa, as variantes de Fc da presente anticorpos ou fusões de

Fc que compreendem seqüências que pertencem às classes de IgA (incluindo subclasses IgAl e

IgA2), IgD, IgE, IgG ou IgM de anticorpos. As variantes de

Fc da presente invenção podem compreender mais de uma cadeia de proteína. Ou seja, a presente invenção pode ter uso em um anticorpo ou fusão de Fc que é um monômero ou um oligômero, incluindo um homo- ou hetero-oligômero.

As variantes de Fc da presente invenção podem ser combinadas com outras modificações de Fc incluindo, mas não se limitando a modificações que alteram a função efetora. Tal combinação pode fornecer propriedades aditivas, sinérgicas ou novas em anticorpos ou fusões de Fc. Em uma modalidade, as variantes de Fc da presente invenção podem ser combinadas com outras variantes conhecidas de Fc (Duncan e outros, 1988, Nature 332:563-564; Lund e outros, 1991, J Irnmunol 147:2657-2662; Lund e outros, 1992, Mol Irnmunol 29:53-59; Alegre e outros, 1994, Transplantation 57:1537-1543; Hutchins e outros, 1995, Proc Natl Acad Sci USA 92:11980-11984; Jefferis e outros, 1995, Irnmunol Lett 44:111-117; Lund e outros, 1995, Faseb J 9:115-119; Jefferis e outros, 1996, Irnmunol Lett 54:101-104; Lund e outros, 1996, J Irnmunol 157:4963-4969; Armour e outros, 1999, Eur J Irnmunol 29:2613-2624; Idusogie e outros, 2000, J Irnmunol 164:4178-4184; Reddy e outros, 2000, J Irnmunol 164:1925-1933; Xu e outros, 2000, Cell Irnmunol 200:16-26; Idusogie e outros, 2001, J Irnmunol 166:2571-2575; Shields e outros, 2001, J Biol Chem 276:6591-6604; Jefferis e outros, 2002, Irnmunol Lett 82:57-65; Presta e outros, 2002, Biochem

61/261

Soc Trans 30:487-490) (US 5.624.821; US 5.885.573; US 6.194.551; PCT WO 00/42072; PCT WO 99/58572). Em uma modalidade alternativa, as variantes de Fc da presente invenção são incorporadas em um anticorpo ou fusão de Fc que compreende uma ou mais glicoformas construídas. Por glicoforma construída como aqui usado entende-se uma composição de carboidrato que é ligada de forma covalente a um polipeptídeo de Fc, na qual a composição de Fc se difere quimicamente daquela de um polipeptídeo de Fc parente. Glicoformas construídas podem ser úteis para uma variedade de objetivos incluindo, mas não se limitando a, melhorar ou reduzir a função efetora. Glicoformas construídas podem ser geradas por qualquer método, por exemplo pelo uso de cepas de expressão construídas ou variantes, por co-expressão com uma ou mais enzimas, por exemplo, βΙ-4-Νacetilglicosaminiltransferase III (GnTIII), por expressão de um polipeptídeo de Fc em vários organismos ou linhas de células de vários organismos ou por modificação de carboidrato(s) após o polipeptídeo de Fc ter sido expresso. Métodos para gerar glicoformas construídas são conhecidos na técnica e incluem, mas não se limitam a, (Umana e outros, 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies e outros,

2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields e outros, 2002,

J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa e outros, 2003, J

Biol Chem 278:3466-3473)

US 6.602.684;

USSN 10/277.370;

USSN 10/113.929; PCT WO 00/61739A1;

PCT WO 01/29246A1;

PCT WO 02/31140A1; PCT WO 02/30954A1; tecnologia

Potelligent™ (Biowa, Inc., Princeton, N.J.); tecnologia de construção de glicosilação GlycoMAb™ (GLYCART biotechnology AG, Zürich, Switzerland)). Glicoforma

construída tipicamente se refere ao carboidrato ou oligossacarídeo diferentes; portanto, um polipeptídeo de

Fc, por exemplo, um anticorpo ou fusão de Fc pode compreender uma glicoforma construída. Alternativamente, glicoforma construída pode se referir ao polipeptídeo de Fc que compreende o carboidrato ou o oligossacarídeo diferentes. Portanto, combinações das variantes de Fc da presente invenção com outras modificações de Fc, assim como modificações de Fc não descobertas, são contempladas como o objetivo de gerar novos anticorpos ou fusões de Fc com propriedades otimizadas.

As variantes de Fc da presente invenção podem ter uso em um anticorpo. Por anticorpo da presente invenção como aqui usado entende-se um anticorpo que compreende uma variante de Fc da presente invenção. A presente invenção pode, de fato, ter uso em qualquer proteína que compreende Fc e, assim, a aplicação das variantes de Fc da presente invenção não é limitada a anticorpos. As variantes de Fc da presente invenção podem ter uso em uma fusão de Fc. Por fusão de Fc da presente invenção como aqui usado se refere a uma fusão de Fc que compreende uma variante de Fc da presente invenção. Fusões de Fc podem compreender uma variante de Fc da presente invenção operacionalmente ligada a uma citocina, domínio de receptor solúvel, molécula de domínio ligante, enzima, de proteína, e de Fc descritas peptídeo ou outra proteína ou incluem, nas US

5.843.725;

se

US limitam a,

6.018.026;

US 6.291.212; US 6.291.646; US

6.300.099;

US

6.323.323;

PCT WO 00/24782 e em (Chamow e outros,

1996, Trends

Biotechnol 14:52-60; Ashkenazi e outros, 1997, Curr Opin

63/261

Immunol 9:195-200).

Virtualmente qualquer antígeno pode ser alvo dos anticorpos e fusões da presente invenção incluindo, mas não se limitando a, seguinte lista de proteínas, subunidades, domínios, motivos e epítopos que pertencem à seguinte lista de proteínas: CD2, CD3, CD3E, CD4, CD11, CDlla, CD14, CD16, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD28, CD29, CD30, CD32, CD33 (p67 proteína), CD38, CD40, CD40L, CD52, CD54, CD56, CD80, CD147, GD3, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-12, IL-15, IL-18, IL-23, interferon alfa, interferon beta, interferon gama; TNF-alfa, TNFbeta2, TNFc, TNFalfabeta, TNF-RI, TNF-RII, FasL, CD27L, CD30L,

4-1BBL, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, LIGHT, VEGI, OX40L, TRAIL Receptor-1, Receptor de Al Adenosina, Receptor de Beta Linfotoxina, TACI, BAFF-R, EPO; LFA-3, ICAM-1, ICAM-3, EpCAM, integrina betai, integrina beta2, integrina alfa4/beta7, integrina alfa2, integrina alfa3, integrina alfa4, integrina alfa5, integrina alfa6, integrina alfav, integrina alfaVbeta3, FGFR-3, fator de crescimento de queratinócito, VLA-1, VLA-4, L-selectina, anti-Id, E-selectina, HLA, HLA-DR, CTLA-4, receptor de célula T, B7-1, B7-2, VNRintegrina, TGFbetal, TGFbeta2, eotaxina 1, BLyS (estimulador de B-linfócito), complemento C5, IgE, fator VII, CD64, CBL, NCA 90, EGFR (ErbB-1), Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), fator tecidual, VEGF, VEGFR, receptor de endotelina, VLA-4, Hapteno NP-cap ou ΝΙΡ-cap, receptor de célula T alfa/beta, E-selectina, digoxina, fosfatase alcalina de placenta (PLAP) e fosfatase alcalina testicular semelhante a PLAP, receptor de transferrina, antígeno carcinoembriônico (CEA), CEACAM5,

64/261

HMFG PEM, mucina

MUC1, MUC18, Heparanase I, miosina cardíaca humana, glicoproteína-72 associada a tumor (TAG-72), antígeno

CA 125 associado a tumor, antígeno específico de membrana prostática (PSMA), antígeno associado a melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA), antígeno associado a carcinoma,

Gcoproteína

Ilb/HIa (GPIIb/IIIa), antígeno associado tumor que expressa carboidrato relacionado a Lewis Y, citomegalovírus humano (HCMETIL) gH sobre glicoproteína, HIV gp 120, HCMV, vírus sincicial respiratório RSV F, RSVF Fgp, VNRintegrina, IL-8, antígeno associado a tumor de citoqueratina, Hep B gpl20, CMV, gpllbllla, HIV IIIB gpl20 V3 em forma de laço, vírus sincicial respiratório (RSV) Fgp, vírus Herpes simples (HSV) gD glicoproteína, HSV gB glicoproteína, HCMV gB glicoproteína em forma de laço e toxina de Clostridium perfringens.

Uma pessoa habilitada na técnica perceberá que a lista acima mencionada de alvos se refere não apenas a proteínas e biomoléculas específicas, mas ao caminho ou caminhos bioquímicos que os compreendem. Por exemplo, referência a CTLA-4 como um antígeno alvo implica que os ligantes e receptores que fazem o caminho co-estimulador de célula T, incluindo CTLA-4, B7-1, B7-2, CD28 e quaisquer outros ligantes ou receptores não descobertos que se ligam a essas proteínas, também são alvos. Assim, alvo como aqui usado se refere não apenas à biomolécula específica, mas ao conjunto de proteínas que interagem com o alvo e os membros do caminho bioquímico ao qual o alvo pertence. Uma pessoa habilitada na técnica também perceberá que qualquer um dos antígenos alvo, ligantes ou receptores que os ligam ou

65/261 outros membros de seu caminho bioquímico correspondente, acima mencionados podem ser operacionalmente ligados às variantes de Fc da presente invenção para gerar uma fusão de Fc. Assim, por exemplo, uma fusão de Fc que tem por alvo EGFR poderia ser construída por ligação operacional de uma variante de Fc a EGF, TGFa ou qualquer outro ligante, descoberto ou não, que liga EGFR. Conseqüentemente, uma variante de Fc da presente invenção poderia ser operacionalmente ligada a EGFR para gerar uma fusão de Fc que liga EGF, TGFa ou qualquer outro ligante, descoberto ou não, que liga EGFR. Portanto, virtualmente qualquer polipeptídeo, seja um ligante, receptor ou alguma outra proteína ou domínio de proteína incluindo, mas não se limitando a, alvos acima mencionados e proteínas que compõe seus caminhos bioquímicos correspondentes, podem ser operacionalmente ligados às variantes de Fc da presente invenção para desenvolver uma fusão de Fc.

Inúmeros anticorpos e fusões de Fc que são aprovados para uso, em experimentos clínicos ou em desenvolvimento podem se beneficiar das variantes de Fc da presente invenção. Os anticorpos e fusões de Fc são aqui referidos como produtos e candidatos clínicos modalidade preferida, as variantes de invenção podem ter uso em uma faixa

Assim, em uma

Fc da presente de produtos candidatos clínicos. Por exemplo, inúmeros anticorpos que têm por alvo CD20 podem se beneficiar das variantes de Fc da presente invenção. Por exemplo, as variantes de Fc da presente invenção podem ter uso em um anticorpo que é substancialmente similar a rituximab (Rituxan®, IDEC/Genentech/Roche) (veja por exemplo a US 5.736.137), um

66/261 anticorpo quimérico anti-CD20 aprovado para tratar linfomas não Hodgkin; HuMax-CD20, um anti-CD20 atualmente sendo desenvolvido por Genmab, um anticorpo anti-CD20 descrito na US 5.500.362, AME-133 (Applied Molecular Evolution), hA20 (Immunomedics, Inc.) e HumaLYM (Intracel). Inúmeros anticorpos que têm por alvo membros da família de receptores de fator de crescimento epidérmico, incluindo

EGFR (ErbB-1), Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4

(ErbB-4),	podem ;	se beneficiar	das	variantes	de	Fc	da
presente	invenção	Por	exemplo,	as	variantes	de	Fc	da
presente	invenção	podem	ter uso em	um anticorpo	que	é

substancialmente similar a trastuzumab (Herceptin®,

Genentech) (veja por exemplo a US 5.677.171), um anticorpo anti-Her2/neu humanizado aprovado para tratar câncer de mama; pertuzumab (rhuMab-2C4, Omnitarg™) , atualmente sendo desenvolvido por Genentech; um anticorpo anti-Her2 descrito na US 4.753.894; cetuximab (Erbitux®, Imclone) (US 4.943.533; PCT WO 96/40210), um anticorpo quimérico anti-EGFR em experimentos clínicos para uma variedade de cânceres,ABX-EGF (US 6.235.883), atualmente sendo desenvolvido por

Abgenix/Immunex/Amgen;

HuMax-EGFr (USSN 10/172.317), atualmente sendo desenvolvido por

Genmab; 425, EMD55900, EMD62000 e EMD72000 (Merck KGaA) (US 5558864; Murthy e outros, 1987, Arch Biochem Biophys. 252(2) :549-60,- Rodeck e outros, 1987, J Cell Biochem. 35(4) :315-20,- Kettleborough e outros, 1991, Protein Eng. 4(7):773-83),- ICR62 (Institute of Câncer Research) (PCT WO 95/20045,- Modj tahedi e outros, 1993, J. Cell

Biophys. 1993, 22(1-3):129-46,- Modjtahedi e outros, 1993,

Br J Câncer. 1993, 67(2) :247-53,- Modjtahedi e outros, 1996,

67/261

Br J Câncer, 73(2):228-35,- Modjtahedi outros, 2003, Int J

Câncer, 105 (2):273-80),TheraCIM hR3 (YM Biosciences,

Canadá e Centro de Imunologia

Molecular,

Cuba (US 5.891.996;

US 6.506.883;

Mateo e outros, 1997,

Immunotechnology, 3(1):71-81),- mAb-806 (Ludwig Institue for Câncer Research, Memorial Sloan-Kettering) (Jungbluth e outros, 2 003, Proc Natl Acad Sei USA. 100(2) :639-44) ; KSB102 (KS Biomedix) ,· MR1-1 (IVAX, National Câncer Institute) (PCT WO 0162931A2) e SC100 (Scancell) (PCT WO 01/88138) . Em uma outra modalidade preferida, as variantes de Fc da presente invenção podem ter uso em alemtuzumab (Campath®, Millenium), um anticorpo monoclonal humanizado atualmente aproado para o tratamento de leucemia linfocítica crônica de célula B. As variantes de Fc da presente invenção podem ter uso em uma variedade de anticorpos ou fusões de Fc que são substancialmente similares a outros produtos e candidatos clínicos incluindo, mas não se limitando a, muromonab-CD3 (Orthoclone OKT3®), um anticorpo anti-CD3 desenvolvido por Ortho Biotech/Johnson & Johnson, ibritumomab tiuxetan (Zevalin®), um anticorpo anti-CD20 desenvolvido por IDEC/Schering AG, gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg®), um anticorpo anti-CD33 (proteína p67) desenvolvido por Celltech/Wyeth, alefacept (Amevive®), uma fusão de Fc anti-LFA-3 desenvolvida por Biogen, abeiximab (ReoPro®), desenvolvido por

Centocor/Lilly, basiliximab (Simulect®) desenvolvido por Novartis, palivizumab (Synagis®), desenvolvido por Medlmmune, infliximab um anticorpo anti-TNFalfa desenvolvido por

Centocor, adalimumab (Humira®, um anticorpo anti-TNFalfa desenvolvido por Abbott, Humicade™, um anticorpo anti

68/261

TNFalfa desenvolvido por Celltech, etanercept (Enbrel®), uma fusão de FC anti-TNFalfa desenvolvido por Immunex/Amgen, ABX-CBL, um anticorpo anti-CD147 sendo desenvolvido por Abgenix, ABX-IL8, um anticorpo anti-IL8 sendo desenvolvido por Abgenix, ABX-MA1, um anticorpo antiMUC18 sendo desenvolvido por Abgenix, Pemtumomab (R1549, ⁹⁰Y-muHMFGI), um anti-MUCl em desenvolvimento por Antisoma, Therex (R1550), an anti-MUCl anticorpo sendo desenvolvido por Antisoma, AngioMab (AS1405) , sendo desenvolvido por

Antisoma, HuBC-1, sendo desenvolvido por Antisoma, Tioplatina (AS1407) sendo desenvolvido por Antisoma, Antegren® (natalizumab), um anticorpo anti-alfa-4-beta-1 (VLA-4) e alfa-4-beta-7 sendo desenvolvido por Biogen, VLA-1 mAb, um anticorpo de integrina anti-VLA-1 sendo desenvolvido por

Biogen, LTBR mAb, um anticorpo de receptor ant i-1infotoxina beta (LTBR) sendo desenvolvido por Biogen,

CAT-152, um anticorpo anti-TGFP2 sendo desenvolvido por

Cambridge

Antibody Technology,

J 6 9 5, um anticorpo anti-IL-12 sendo desenvolvido por Cambridge

Antibody

Technology and Abbott,

CAT-192, um anticorpo anti-TGFpi sendo desenvolvido por

Cambridge

Antibody Technology e

Genzyme, CAT-213, um anticorpo anti-Eotaxinal sendo desenvolvido por

Cambridge

Antibody

Technology,

LymphoStat-B™, um anticorpo anti-Blys sendo desenvolvido por Cambridge

Antibody Technology e Human Genome Sciences

Inc., TRAIL-RlmAb, um anticorpo anti-TRAIL-R1 sendo desenvolvido por Cambridge Antibody Technology e Human

Genome

Sciences,

Avastin

TM (bevac i zumab, rhuMAb-VEGF), um anticorpo anti-VEGF sendo desenvolvido por

Genentech, um anticorpo da família de receptor anti-HER

69/261 sendo desenvolvido por Genentech, Anti-Tissue Factor (ATF), um anticorpo de fator anti-tecidual sendo desenvolvido por Genentech, Xolair™ (Omalizumab), um anticorpo anti-IgE sendo desenvolvido por Genentech, Raptiva™ (Efalizumab), um anticorpo anti-CDlla sendo desenvolvido por Genentech e Xoma, MLN-02 Antibody (anteriormente LDP-02), sendo desenvolvido por Genentech e Millenium Pharmaceuticals, HuMax CD4, um anticorpo anti-CD4 sendo desenvolvido por Genmab, HuMax-IL15, um anticorpo anti-IL15 sendo desenvolvido por Genmab e Amgen, HuMax-Inflam, sendo desenvolvido por Genmab e Medarex, HuMax-Câncer, um anticorpo anti-Heparanase I sendo desenvolvido por Genmab e Medarex e Oxford GcoSciences, HuMax-Linfoma, sendo desenvolvido por Genmab e Amgen, HuMax-TAC, sendo desenvolvido por Genmab, IDEC-131 e anticorpo anti-CD40L sendo desenvolvido por IDEC Pharmaceuticals, IDEC-151 (Clenoliximab), um anticorpo anti-CD4 sendo desenvolvido por IDEC Pharmaceuticals, IDEC-114, um anticorpo anti-CD80 sendo desenvolvido por IDEC Pharmaceuticals, IDEC-152, um anti-CD23 sendo desenvolvido por IDEC Pharmaceuticals, anticorpos de fator de migração de anti-macrófago (MIF) sendo desenvolvido por IDEC Pharmaceuticals, BEC2, um anticorpo anti-idiotípico sendo desenvolvido por Imclone, IMC-1C11, um anticorpo anti-KDR sendo desenvolvido por Imclone, DC101, um anticorpo anti-flk-1 sendo desenvolvido por Imclone, um anticorpo anti-VE caderina sendo desenvolvido por Imclone, CEA-Cide™ (labetuzumab) , um anticorpo de antígeno anti-carcinoembriônico (CEA) sendo desenvolvido por Immunomedics, LymphoCide™ (Epratuzumab), um anticorpo anti-CD22 sendo desenvolvido por Immunomedics,

70/261

AFP-Cide, sendo desenvolvido por Immunomedics, MyelomaCide, sendo desenvolvido por Immunomedics, LkoCide, sendo desenvolvido por Immunomedics, ProstaCide, sendo desenvolvido por Immunomedics, MDX-010, um anticorpo antiCTLA4 sendo desenvolvido por Medarex, MDX-060, um anticorpo anti-CD30 sendo desenvolvido por Medarex, MDX-070 sendo desenvolvido por Medarex, MDX-018 sendo desenvolvido por Medarex, Osidem™ (IDM-1) e um anticorpo anti-Her2 sendo desenvolvido por Medarex e Immuno-Designed Molecules, HuMax™-CD4, um anticorpo anti-CD4 sendo desenvolvido por Medarex e Genmab, HuMax-IL15, um anticorpo anti-IL15 sendo desenvolvido por Medarex and Genmab, CNTO 148, um anticorpo anti-TNFa sendo desenvolvido por Medarex e Centocor/J&J, CNTO 1275, um anticorpo anti-citocina sendo desenvolvido por Centocor/J&J, MOR101 e MOR102, anticorpos molécula-1 anti-adesão intercelular (ICAM-1) (CD54) sendo desenvolvido por MorphoSys, MOR201, um anticorpo de receptor 3 de fator de crescimento anti-fibroblasto (FGFR-3) sendo desenvolvido por MorphoSys, Nuvion® (visilizumab), um anticorpo anti-CD3 sendo desenvolvido por Proteína Design Labs, HuZAF™, um anticorpo anti- gama interferon sendo desenvolvido por Proteína Design Labs, Anti-a5/81 Integrina, sendo desenvolvido por Protein Design Labs, anti-IL-12, sendo desenvolvido por Protein Design Labs, ING-1, um anticorpo anti-Ep-CAM sendo desenvolvido por Xoma e MLN01, um anticorpo anti-Beta2 integrina sendo desenvolvido por Xoma.

A aplicação das variantes de Fc aos produtos e candidatos clínicos de anticorpo e fusão de Fc acima mencionados não pretende ser restrita a sua composição precisa. As variantes de Fc da presente invenção podem ser

71/261 incorporadas nos candidatos e produtos clínicos acima mencionados ou em anticorpos e fusões de Fc que são substancialmente similares a eles. As variantes de Fc da presente invenção podem ser incorporadas em versões dos candidatos e produtos clínicos acima mencionados que são humanizadas, maturadas por afinidade, construídas ou modificadas em alguma outra forma. Além disso, o polipeptídeo inteiro dos candidatos e produtos clínicos acima mencionados não precisam ser usados para construir um novo anticorpo ou fusão de Fc que incorpora as variantes de Fc da presente invenção; por exemplo, apenas a região variável de um anticorpo de produto ou candidato clínico, uma região variável substancialmente similar ou uma versão humanizada, maturada por afinidade, construída ou modificada da região variável pode ser usada. Em uma outra modalidade, as variantes de Fc da presente invenção podem ter uso em um anticorpo ou fusão de Fc que se liga ao mesmo epítopo, antígeno, ligante ou receptor como um dos candidatos e produtos clínicos acima mencionados.

As variantes de Fc da presente invenção podem ter uso em uma ampla faixa de produtos de anticorpo e fusão de Fc. Em uma modalidade, o anticorpo ou fusão de Fc da presente invenção é um reagente terapêutico, diagnóstico ou de pesquisa, preferivelmente um terapêutico. Alternativamente, os anticorpos e fusões de Fc da presente invenção podem ser usados para usos na agricultura ou indústria. Em uma modalidade alternativa, as variantes de Fc da presente invenção compõem uma biblioteca que pode ser varrida experimentalmente. Essa biblioteca pode ser uma lista de ácidos nucleicos ou seqüências de aminoácidos ou

72/261 pode ser a composição física de ácidos nucleicos ou polipeptídeos que codificam as sequências da biblioteca. A variante de Fc pode ter uso em uma composição de anticorpo que é monoclonal ou policlonal. Em uma modalidade preferida, os anticorpos e fusões de Fc da presente invenção são usados para matar células alvo que carregam o antígeno alvo, por exemplo células cancerosas. Em uma modalidade alternativa, os anticorpos e fusões de Fc da ser agonista do antígeno alvo, antagonizar citocina ou receptor por exemplo, para de citocina. Em uma modalidade preferida alternativa, os anticorpos

Fc da presente invenção são usados para bloquear, antagonizar ou ser agonista do antígeno alvo matar as células alvo que carregam o antígeno alvo.

As variantes de podem ser usadas para vários objetivos terapêuticos.

Em uma modalidade preferida, as proteínas de variante de Fc são administradas a um paciente para tratar um distúrbio relacionado a anticorpo. Um paciente para os objetivos da preferivelmente incluem humanos e mamíferos e, mais outros animais, preferivelmente, humanos. Assim, os de Fc da presente invenção têm aplicações em terapia humana e veterinária. Na modalidade preferida, o paciente é um mamífero, e na modalidade mais preferida, o paciente é humano. 0 termo tratamento na presente invenção pretende incluir tratamento terapêutico, assim como profilático ou medidas supressivas para uma doença ou distúrbio. Assim, por exemplo, a administração bem sucedida de um anticorpo ou

73/261 fusão de Fc antes do surgimento da doença resulta no tratamento da doença. Como um outro exemplo, a administração bem sucedida de um anticorpo ou fusão de Fc otimizados após manifestação clínica da doença para combater os sintomas da doença compreende o tratamento da doença. Tratamento também engloba a administração de uma proteína de anticorpo ou fusão de Fc otimizada após o surgimento da doença para erradicar a doença. A administração bem sucedida de um agente após o surgimento e após sintomas clínicos foi desenvolvida, com possível diminuição de sintomas clínicos e talvez melhora da doença, compreende o tratamento da doença. Aqueles em necessidade de tratamento incluem mamíferos que já têm a doença ou distúrbio, assim como aqueles com tendência a ter a doença ou distúrbio, incluindo aqueles nos quais a doença ou distúrbio pode ser prevenido. Por distúrbio relacionado a anticorpo ou distúrbio responsivo a anticorpo ou condição ou doença entende-se aqui um distúrbio que pode ser melhorado pela administração de uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo ou fusão de Fc da presente invenção. Distúrbios relacionados a anticorpos incluem, mas não se limitam a, doenças autoimunes, doenças imunológicas, doenças infecciosas, doenças inflamatórias, doenças neurológicas e doenças oncológicas e neoplásicas incluindo câncer. Câncer e canceroso se refere ou descreve a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento celular não regulado. Exemplos de câncer incluem, mas não se limitam a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma (incluindo lipossarcoma), tumores neuroendócrinos, mesotelioma,

74/261 schwanoma, meningioma, adenocarcinoma, melanoma e leucemia ou malignidades linfóides. Exemplos mais particulares desses cânceres incluem câncer de célula escamosa (por exemplo, câncer de célula escamosa epitelial) , câncer pulmonar incluindo câncer pulmonar de células pequenas, câncer pulmonar de células não pequenas, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão, câncer do peritônio, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou do estômago incluindo câncer gastrointestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer hepático, câncer vesical, hepatoma, câncer de mama, câncer do cólon, câncer retal, câncer colorretal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma da glândula salivar, câncer renal, câncer da próstata, câncer vulvar, câncer da tireóide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma peniano, câncer testicular, câncer esofágico, tumores do trato biliar, assim como câncer da cabeça e pescoço. Além disso, as variantes de Fc da presente invenção podem ser usadas para tratar condições incluindo, mas não se limitando a insuficiência cardíaca congestiva (CHF), vasculite, rosácea, acne, eczema, miocardite e outras condições do miocárdio, lúpus eritematoso disseminado, diabetes, espondilopatias, fibroblastos sinoviais e estroma da medula óssea; perda óssea; doença de Paget, osteoclastoma; mieloma múltiplo; câncer de mama; osteopenia de desuso; subnutrição, doença periodôntica, doença de

Gaucher, histiocitose da célula de Langerhans, dano a medula espinhal, artrite séptica aguda, osteomalácia, síndrome de Cushing, displasia fibrosa monoostótica, displasia fibrosa poliostótica, reconstrução periodôntica e

75/261 fraturas ósseas; sarcoidose; mieloma múltiplo; cânceres ósseos osteolíticos, câncer de mama, câncer pulmonar, câncer renal e câncer retal; metástase óssea, controle da dor óssea e hipercalcemia humoral maligna, espondiliete anquilosante e outras espondiloartropatias; rejeição a transplantes, infecções virais, neoplasias hematológicas e condições semelhantes a neoplasia, por exemplo, linfoma de Hodgkin; linfomas não Hodgkin (linfoma de Burkitt, linfoma linfocítico pequeno/leucemia linfocítica crônica, micoses fungóides, linfoma de célula manto, linfoma folicular, linfoma de célula B grande difuso, linfoma de zona marginal, leucemia de célula pilosa e leucemia linfoplasmocítica, tumores das células precursoras de linfócito, incluindo leucemia linfoblástica aguda de célula B /linfoma, e leucemia linfoblástica aguda de célula T /linfoma, timoma, tumores das células T e NK maduras, incluindo leucemias periféricas de célula T, leucemias de célula T do adulto/linfomas de célula T e leucemia linfocítica granular grande, histocitose de célula de Langerhans, neoplasias mielóides como leucemias mielóides agudas, incluindo AML com maturação, AML sem diferenciação, leucemia promielocítica aguda, leucemia mielomonocítica aguda, e leucemias monocíticas agudas, síndromes mielodisplásicas, e distúrbios mieloproliferativos agudos, incluindo leucemia mielóide crônica, tumores do sistema nervoso central, por exemplo, tumores xcerebrais (glioma, neuroblastoma, astrocitoma, meduloblastoma, ependimoma, e retinoblastoma), tumores sólidos (câncer nasofaríngeo, carcinoma basocelular, câncer pancreático, câncer do duto biliar, sarcoma de Kaposi, câncer testicular, cânceres

76/261 uterino, vaginal ou cervical, câncer ovariano, câncer hepático primário ou câncer endometrial, e tumores do sistema vascular (angiossarcoma e hemangiopericitoma)), osteoporose, hepatite, HIETIL, AIDS, espondiloartrite, artrite reumatóide, doenças inflamatórias de bexiga (IBD), sepsis e choque séptico, Doença de Crohn, psoríase, escleroderma, enxerto versus doença de hospedeiro (GETILHD), rejeição a enxerto alogênico de ilhota, malignidades hematológicas, como mieloma múltiplo (MM), síndrome mielodisplásica (MDS) e leucemia mielóide aguda (AML), inflamação associada a tumores, dano nervoso periférico ou doenças desmielinizantes.

Em uma modalidade, um anticorpo ou fusão de Fc da presente invenção é administrado a um paciente que tem uma doença que envolve expressão inadequada de uma proteína. No escopo da presente invenção essas incluem doenças e distúrbios caracterizados por proteínas aberrantes, por exemplo, por alterações na quantidade da a proteína presente, da presença de uma proteína mutante, ou ambos. Uma abundância pode ser por qualquer causa, incluindo mas não limitadas a supra-expressão no nível molecular, aparência prolongada ou acumulada atividade aumentada da proteína em relação ao normal.

Incluídas nessa definição estão doenças e distúrbios caracterizados por uma redução de uma proteína. Essa redução pode ser por qualquer causa, incluindo mas não limitadas a expressão reduzida no nível molecular, aparência encurtada ou reduzida no local de ação, formas mutantes de uma proteína, ou atividade diminuída da proteína em relação ao normal. Tal abundância ou redução da

77/261 proteína pode ser medida em relação à expressão, aparência, ou atividade normal de uma proteína, e a referida medida pode ter um importante papel no desenvolvimento e/ou teste clínico dos anticorpos e fusões de Fc da presente invenção. Em uma modalidade, um anticorpo ou fusão de Fc da presente invenção é o único agente terapeuticamente ativo administrado a um paciente. Alternativamente, o anticorpo ou fusão de Fc da presente invenção é administrado em combinação com um ou mais de outros agentes terapêuticos, incluindo mas não limitadas a agentes citotóxicos, agentes quimioterápicos, citocinas, agentes inibidores do crescimento, agentes anti-hormonais, inibidores de quinase, agentes anti-angiogênicos, cardioprotetores, ou outros agentes terapêuticos. Tais moléculas são adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o objetivo pretendido. 0 medico habilitado pode determinar empiricamente a dose adequada ou doses de outros agentes terapêuticos úteis. Os anticorpos e fusões de Fc da presente invenção podem ser administrados ao mesmo tempo com um ou mais de outros regimes terapêuticos. Por exemplo, um anticorpo ou fusão de Fc da presente invenção pode ser administrado ao paciente junto com quimioterápico, terapia de radiação, ou terapia quimioterápica e de radiação juntas. Em uma modalidade, o anticorpo ou fusão de Fc da presente invenção pode ser administrado em conjunto com um ou mais anticorpos ou fusões de Fc, que podem ou não compreender uma variante de Fc da presente invenção.

Em uma modalidade, os anticorpos e fusões de Fc da presente invenção são administrado com um agente quimioterápico. Por agente quimioterápico como aqui usado entende-se um

78/261 composto químico útil no tratamento de câncer. Exemplos de agentes quimioterápicos incluem mas não se limitam a agentes alquilantes como tiotepa e ciclofosfamida, (CYTOXAN™) ;

alquil sulfonatos como bussulfano, improssulfano carboquona, e pipossulfano; aziridinas como benzodopa, meturedopa, e uredopa;

veniminas metilamelaminas incluindo trietilenofosforamida, trimetilolomelamina;

altretamina, trietilenomelamina, trietilenotiofosforamida mostardas de nitrogênio como clorambucil, clornafazine, ifosfamida, mecloretamina, mecloretamina, prednimustina, melfalan, colofosfamida, estramustina, hidrocloreto novembichina, trofosfamida, mostarda de óxido de fenesterina, de uracil;

nitrosuréias como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, caminomicina, daunorubicina, doxorrubicina, marcelomicina, nogalamicina, cactinomicina, carzinofilina, detorrubicina, epirrubicina, calicheamicina, carabicina, cromomicinas, dactinomicina,

6-diazo-5-oxo-L-norleucina, esorrubicina, idarrubicina, mitomicinas, ácido micofenólico, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina;

fluoruracil denopterina, análogos de tiamiprina, ancitabina, anti-metabólitos (5-FU); análogos metotrexate, purina como tioguanina;

como metotrexate e 5de ácido fólico como pteropterina, trimetrexate;

fludarabina, 6-mercaptopurina, análogos de pirimidina como azacitidina,

6-azauridina, carmofur,

79/261 citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina,

5-FU;

androgênios como calusterona, dromostanolona propionato, epitiostanol, mepitiostano, testolactona;

anti-adrenais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; ácido fólico como ácido frolínico replenisher; aceglatona; aldofosfamida glicosídeo; ácido aminolvulínico;

amsacrina;

bestrabucil;

bisantreno;

edatraxato;

defofamina;

demecolcina;

diaziquona;

elformitina; acetato de eliptínio; etoglucide;

nitrato de gálio; hidroxiuréia; lentinan; lonidamina; mitoguazona;

mi toxantrona;

mopidamol; nitracrina; pentostatin; fenamet;

pirarubicina;

ácido podofiflínico;

2-etilhidrazida;

procarbazina;

PSK®; razoxano; sizofurano; espirogermanio;

ácido tenuazônico;

triaziquona;

triclorotrietilamina; uretano;

vindesina;

dacarbazina ;

mannomustina;

mitobronitol;

mitolactol;

pipobroman;

gacitosina; arabinosida (Ara-C) ciclofosfamida; tiotepa;

taxanos, por exemplo, paelitaxei (TAXOL®, Bristol-Myers

Squibb Oncology, Princeton, N.J.) e docetaxel (TAXOTERE®,

Rhne-Poulenc

Rorer, Antony, clorambucil;

gemeitabina;

6-tioguanina; mercaptopurina;

metotrexate;

análogos de platina como cisplatina e carboplatina;

vinblastina;

platina; etoposida (ETILP-16) ifosfamida;

mitomicina

C;

mitoxantrona; vin-cristina;

vinorelbina;

navelbina;

novantrona;

teniposida;

daunomicina;

aminopterina;

xeloda; ibandronato; CPT-11;

inibidor de topoisomerase

RFS 2000; difluormetil ornitina (DMFO); ácido retinóico; esperamicinas; capecitabina;

inibidor de timidilato sintase (como Tomudex); inibidores da cox-2, como celicoxib (CELEBREX®) ou MK-0966 (VIOXX®); e sais,

80/261 ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis, de qualquer um dos acima above. Também incluídos nessa definição estão agentes anti-hormonais que agem para regular ou inibir a ação de hormônio sobre os tumores como anti-estrógenos incluindo por exemplo tamoxifeno, raloxifeno, aromatase que inibem 4(5)-imidazoles, 4hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY 117018, onapristona, e toremifeno (Fareston); e anti-androgênios como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolide, e goserelina; e sai, ácidos e derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos acima.

Um agente quimioterápico ou outro citotóxico pode ser administrado como um pró-medicamento. Por pró-medicamento como aqui usado entende-se uma forma precursora ou derivada de uma substância farmaceuticamente ativa que é menos citotóxica a células tumorais comparadas ao medicamento parente e é capaz de ser ativada enzimaticamente ou convertida na forma parente mais ativa. Veja, por exemplo Wilman, 1986, Biochemical Society Transactions, 615° Meeting Belfast, 14:375-382; e Stella e cols., Prodrugs: A Chemical Approach to Alvoed Drug Delivery, Directed Drug Delivery, Borchardt e cols., (ed.): 247-267, Human Press, 1985. Os pró-medicamentos que podem ter uso na presente invenção incluem mas não se limitam a pró-medicamentos contendo fosfato, pró-medicamentos contendo tiofosfato, pró-medicamentos contendo sulfato, pró-medicamentos contendo peptídeo, pró-medicamentos modificados por Daminoácido, pró-medicamentos glicosilados, pró-medicamentos contendo betalactama, pró-medicamentos contendo fenoxiacetamida opcionalmente substituída ou pró81/261 medicamentos contendo fenilacetamida opcionalmente substituída, 5-fluorcitosina e outros pró-medicamentos de

5-fluoruridínio que podem ser convertidos no medicamento livre citotóxico mais ativo. Exemplos de medicamentos citotóxicos que podem ser derivatizados em uma forma de pró-medicamento para uso com os anticorpos e fusões de Fc da presente invenção incluem mas não se limitam a qualquer um dos agentes quimioterápico acima mencionados.

Os anticorpos e fusões de Fc da presente invenção podem ser combinados com outros regimes terapêuticos. Por exemplo, em uma modalidade, o paciente a ser tratado com o anticorpo ou fusão de Fc também pode receber terapia de radiação. A terapia de radiação pode ser administrada de acordo com protocolos comumente empregados na técnica e conhecidos pelo praticante habilitado. Tal terapia inclui mas não se limita a, radiação com césio, irídio, iodina, ou cobalto. A terapia de radiação pode ser irradiação total do corpo, ou pode ser direcionada localmente a um local específico ou tecido no corpo, como o pulmão, bexiga, ou próstata. Tipicamente, a terapia de radiação é administrada em pulsos por um período de tempo de cerca de 1 a 2 semanas. A terapia de radiação pode, no entanto, ser administrada por maiores períodos de tempo. Por exemplo, a terapia de radiação pode ser administrada a pacientes que têm câncer da cabeça e pescoço por cerca de 6 a cerca de 7 semanas. Opcionalmente, a terapia de radiação pode ser administrada como doses únicas ou múltiplas sequenciais. 0 médico habilitado pode determinar empiricamente a dose ou doses adequadas de terapia de radiação útil. De acordo com uma outra modalidade da invenção, o anticorpo ou fusão de Fc

82/261 da presente invenção e uma ou mais de outras terapias anticancerosas ex vivo. E contemplado que tal tratamento ex vivo pode ser útil no transplante de medula óssea e particularmente, transplante de medula óssea autólogo.

Por exemplo, tratamento de células ou tecidos que contêm células cancerosas com anticorpo ou fusão de Fc e uma ou mais de outras terapias anti-câncer, como acima descrito, pode ser empregado para esgotar ou substancialmente esgotar as células cancerosas antes do transplante em um paciente receptor. É de fato contemplado que os anticorpos e fusões de Fc da invenção podem ser empregados em combinação com outras técnicas terapêuticas como a cirurgia.

Em uma modalidade alternativa, os anticorpos e fusões de Fc da presente invenção são administrados com uma citocina. Por citocina como aqui usado entende-se um termo genérico para proteínas liberada por uma população de células que agem em uma outra célula como mediadores intercelulares. Exemplos de tais citocinas são linfocinas, monocinas, e hormônios polipeptídicos tradicionais. Incluídas entre as citocinas estão o hormônio do crescimento como hormônio do crescimento humano, hormônio do crescimento humano N-metionil, e hormônio do crescimento bovina; hormônio da paratireóide; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormônios de glicoproteína como hormônio folículo-estimulante (FSH) , hormônio estimulador da tireóide (TSH), e hormônio luteinizante (LH) ; fator de crescimento hepático; fator de crescimento de fibroblasto; prolactina; lactogênio placentário; fator alfa e beta de necrose tumoral;

83/261 substância inibidora muleriana; peptídeo associado a gonadotrofina de camundongo; inibinA; activina; vascular fator de crescimento vascular endotelial; integrina; trombopoietina (TPO); fatores de crescimento de nerva como NGF-beta; fator de crescimento de plaquetas; fatores de crescimento transformantes (TGFs) como TGF-alfa e TGF-beta; fator de crescimento semelhante a insulina I e II; eritropoietina (EPO) ; fatores osteoindutíveis; interferons como interferon-alfa, beta, e -gama; fatores estimulantes de colônia (CSFs) como macrófago-CSF (M-CSF); granulócitomacrófago-CSF (GM-CSF); e granulócito-CSF (G-CSF); interleucinas (ILs) como IL-1, IL-1 alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-15, um fator de necrose tumoral como TNF-alfa ou TNF-beta; e outros fatores de polipeptídeo incluindo LIF e ligante kit (KL). Como aqui usado, o termo citocina inclui proteínas de fontes naturais ou de cultura de célula recombinante, e equivalentes biologicamente ativos das citocinas de seqüência nativa.

Uma variedade de outros agentes terapêuticos podem ter uso para administração com os anticorpos e fusões de Fc da presente invenção. Em uma modalidade, o anticorpo ou fusão de Fc é administrado com um um agente anti-angiogênico. Por agente anti-angiogênico como aqui usado entende-se um composto que bloqueia, ou interfere em algum grau, com o desenvolvimento de vasos sangüíneos. O fator antiangiogênico pode, por exemplo, ser uma molécula pequena ou uma proteína, por exemplo um anticorpo, fusão de Fc, ou citocina, que se liga a um fator de crescimento ou receptor de fator de crescimento envolvido na promoção de

84/261 angiogênese. O fator anti-angiogênico preferido é um anticorpo que se liga a Fator de crescimento vascular endotelial (VEGF). Em uma modalidade alternativa, o anticorpo ou fusão de Fc é administrado com um agente terapêutico que induz ou melhora a resposta imune adaptativa, por exemplo um anticorpo que tem por alvo CTLA4. Em uma modalidade alternativa, o anticorpo ou fusão de Fc é administrado com um inibidor de tirosina quinase. Por inibidor de tirosina quinase como aqui usado entende-se a molécula que inibem em alguma extensão a atividade da tirosina quinase. Exemplos de tais inibidores incluem mas não se limitam a quinazolinas, como PD 153035, 4-(3cloroanilino)quinazolina; piridopirimidinas; pirimidopirimidinas; pirrolopirimidinas, como CGP 59326, CGP 60261 e CGP 62706; pirazolopirimidinas, 4-(fenilamino)-7Hpirrolo(2,3-d) pirimidinas; curcumina (diferuloil metano, 4,5-bis(4-fluoranilino)ftalimida); tirfostinas contendo porções nitrotiofeno; PD-0183805 (Warner-Lambert); moléculas anti-senso (por exemplo, aquelas que se ligam a ácido nucleico que codifica ErbB); quinoxalinas (US 5.804.396); trifostinas (US 5.804.396); ZD6474 (Astra Zeneca) ; PTK-787 (Novartis/Schering A G) ; inibidores panErbB como Cl-1033 (Pfizer); Affinitac (ISIS 3521; Isis/Lilly); Imatinib mesilato (STI571,Gleevec®; Novartis); PKI 166 (Novartis); GW2016 (Glaxo SmithKlina); Cl-1033 (Pfizer); EKB-569 (Wyeth); Semaxinib (Sugen); ZD6474 (AstraZeneca) ; PTK-787 (Novartis/Schering AG) ; INC-1 Cll (Imclone); ou como descrito em qualquer uma das publicações de patente: US 5.804.396; PCT WO 99/09016 (American Cyanimid); PCT WO 98/43960 (American Cyanamid); PCT WO

85/261

97/38983 (Warner-Lambert); PCT WO 99/06378 (WarnerLambert); PCT WO 99/06396 (Warner-Lambert) ; PCT WO 96/30347 (Pfizer, Inc); PCT WO 96/33978 (AstraZeneca); PCT WO96/3397 (AstraZeneca); PCT WO 96/33980 (AstraZeneca), gefitinib (IRESSATM, ZD1839, AstraZeneca) , e OSI-774 (TarcevaTM, OSI Pharmaceuticals/Genentech).

Em uma modalidade alternativa, o anticorpo ou fusão de Fc da presente invenção é conjugado ou operacionalmente ligado a um outro composto terapêutico. O composto terapêutico pode ser um agente citotóxico, um agente quimioterápico, uma toxina, um radioisótopo, uma citocina, ou outro agente terapeuticamente ativo. Conjugados do anticorpo ou fusão de Fc e agente citotóxico podem ser feitos usando uma variedade de agentes de união de proteína bifuncional como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) propionato (SPDP), succinimidil-4 -(N-maleimidometil) ciclohexano-l-carboxilato, iminotiolano (IT) derivados bifuncionais de imidoésteres (como dimetil adipimidato

HCL) , ésteres ativos (como disuccinimidil suberato), aldeídos (como glutaraldeído) , bis-azido compostos (como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados bis-diazônio (como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (como tolieno 2,6-diisocianato), e compostos bis-ativos fluorinum (como 1,5-diflúor-2,4dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina de ricina pode ser preparada como descrito em Vitetta e cols., 1971, Science 238:1098. Ácido Carbono-14-marcado 1 isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminapenta acético (MX-DTPA) é um agente quelante de exemplo para conjugação de radionucleotídeo ao anticorpo. Veja PCT WO 94/11026. O

86/261 ligante pode ser um ligante clivável que facilita a liberação do medicamento citotóxico na célula. Por exemplo, um ligante instável em ácido, ligante sensível a peptidase, ligante de dimetil ou ligante contendo dissulfeto (Chari e cols., 1992, Câncer Research 52: 127-131) podem ser usados. Alternativamente, o anticorpo ou fusão de Fc é operacionalmente ligados ao agente terapêutico, por exemplo, por técnicas recombinantes ou síntese de peptídeo. Agentes quimioterápicos que podem ser úteis para conjugação aos anticorpos e fusões de Fc da presente invenção foram descritos acima. Em uma modalidade alternativa, o anticorpo ou fusão de Fc é conjugado ou operacionalmente ligado a uma toxina, incluindo mas não limitadas a toxinas de molécula pequena e toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, de planta ou animal, incluindo fragmentos e/ou variantes desses. Toxinas de molécula

pequena incluem mas	não	se limitam	a	calicheamicina,
maitansina (US 5.208	.020),	tricoteno,	e	CC1065. Em uma
modalidade da invenção, o	anticorpo	ou	fusão de Fc é
conjugado a uma ou	mais	moléculas	de	maitansina (por

exemplo, cerca de 1 a cerca de 10 moléculas de maitansina por molécula de anticorpo). Maitansina pode, por exemplo, ser convertida em May-SS-Me que pode ser reduzida a May-SH3 e reagir com anticorpo modificado ou fusão de Fc (Chari e cols., 1992, Câncer Research 52: 127-131) para gerar um conjugado maitansinóide-anticorpo ou maitansinóide-fusão de Fc. Um outro conjugado de interesse compreende um anticorpo ou fusão de Fc conjugado a um ou mais moléculas de calicheamicina. A família de calicheamicina de antibióticos é capaz de produzir quebras de DNA de duplo filamento em

87/261 concentrações sub-picomolares. Análogos estruturais de calicheamicina que podem ser usados incluem mas não se limitam a γχ¹, α2¹, α3/ N-acetil-γχ¹, PSAG, e 011, (Hinman e cols., 1993, Câncer Research 53:3336-3342; Lode e cols., 1998, Câncer Research 58:2925-2928) (US 5.714.586; US 5.712.374; US 5.264.586; US 5.773.001). Análogos de Dolastatina 10 como auristatina E (AE) e monometilauristatina E (MMAE) podem ter uso como conjugados para as variantes de Fc da presente invenção (Doronina e cols, 2003, Nat Biotechnol 21(7):778-84,- Francisco e cols., 2003 Blood 102 (4) :1458-65) . Toxinas úteis enzimaticamente ativas incluem mas não se limitam a cadeia A de difteria, fragmentos ativos de não ligação de toxina diftérica, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa) , cadeia A de ricina, cadeia A de abrina, cadeia A de modeccina, alfasarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Veja, por exemplo, PCT WO 93/21232. A presente invenção também contempla um conjugado ou fusão formada entre um anticorpo ou fusão de Fc da presente invenção e um composto com atividade nucleolítica, por exemplo uma ribonuclease ou DNA endonuclease como uma desoxirribonuclease (DNase).

Em uma modalidade alternativa, um anticorpo ou fusão de Fc da presente invenção pode ser conjugado ou operacionalmente ligado a um radioisótopo para formar um radioconjugado. Uma variedade de isótopos radioativos é disponível para a produção de anticorpos radioconjugados e

88/261 fusões de Fc. Exemplos incluem, mas não se limitam , At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², e isótopos radioativos de Lu.

Ainda em uma outra modalidade, um anticorpo ou fusão de Fc da presente invenção pode ser conjugado a um receptor (como estreptavidina) para utilização tumor antes de mirar no qual o conjugado anticorpo-receptor ou fusão de Fc-receptor é administrado ao paciente, seguido por remoção de conjugado não ligado da circulação usando um agente de limpeza e então administração de um ligante (por exemplo, avidina) que é conjugado a um agente citotóxico (por exemplo, um radionucleotídeo). Em uma modalidade alternativa, o anticorpo ou fusão de Fc é conjugado ou operacionalmente ligado a uma enzima para empregar a terapia de Pró-medicamento mediada por enzima Dependente de Anticorpo (ADEPT) . ADEPT pode ser usado por conjugação ou ligação operacional do anticorpo ou fusão de Fc a uma enzima de ativação de pró-medicamento que converte um pró-medicamento (por exemplo, um agente quimioterápico de peptidil, veja PCT WO 81/01145) a um medicamento anticâncer ativo. Veja , por exemplo, PCT WO 88/07378 e US 4.975.278. 0 componente de enzima do imunoconjugado útil para ADEPT inclui qualquer enzima capaz de agir em um prómedicamento de forma a convertê-lo em sua forma mais ativa, citotóxica. Enzimas que são úteis no método dessa invenção incluem mas não se limitam a fosfatase alcalina útil para converter pró-medicamentos contendo fosfato em medicamentos livres; arulsulfatase úteis para converter pró-medicamentos contendo fosfato em medicamentos livres; citosina desaminase úteis para converter 5-fluorcitosina não tóxica

89/261 no medicamento anti-câncer, 5-fluoruracil; proteases, como protease de serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidases e catepsinas (como catepsinas B e L), que converter pró-medicamentos contendo peptídeos em medicamentos livres;

Dalanilcarboxipeptidases, úteis para medicamentos que contêm substituintes enzimas de divagem de carboidrato como converter próde D-aminoácido;

beta-galactosidase e neuramimidase úteis para converter pró-medicamentos glicosilados em medicamentos livres; beta-lactamase úteis para converter medicamentos derivatizados com alfa-lactamas em medicamentos livres; e penicilina amidases, como penicilina ETIL amidase ou penicilina G amidase, úteis para converter medicamentos derivatizados em seus nitrogênios de amina com fenoxiacetil ou grupos fenilacetil, respectivamente, em medicamentos livres. Alternativamente, anticorpos com atividade enzimática, também conhecidos na técnica como abzimas, podem ser usados para converter os pró-medicamentos da invenção em medicamentos ativos livres (veja, por exemplo, Massey, 1987, Nature 328: 457-458). Conjugados anticorpo-abzima e fusão de Fc-abzima podem ser preparados para liberação da abzima a uma população de célula tumoral. Outras modificações dos anticorpos e fusões de Fc da presente invenção são aqui contempladas. Por exemplo, o anticorpo ou fusão de Fc pode ser ligado a um de uma variedade de polímeros não proteináceos, por exemplo,, polietileno glicol, polipropileno glicol, polioxialquilenos, ou copolímeros de polietileno glicol e polipropileno glicol.

Composições farmacêuticas são aqui contempladas nas

90/261 quais um anticorpo ou fusão de Fc da presente invenção e um ou mais agentes terapeuticamente ativos

Formulações dos anticorpos e fusões de são formulados.

Fc da presente invenção são preparados para estocagem por mistura do referido anticorpo ou fusão de

Fc que tem o grau desejado de pureza com transportadores, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitável opcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.,1980), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Transportadores, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são não tóxicos a receptores nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem agentes de tamponamento como fosfato, citrato, acetato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluem ácido ascórbico e metionina; conservantes (como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio cloreto de, benzetônio; álcool fenólico, butílico ou benzílico; alquil parabéns como metil ou propil parabeno;

catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol;

polipeptídeos de baixo peso molecular (menos resíduos); proteínas, como albumina sérica, que cerca de gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como polietilinil pirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina;

monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo glicose, manose, ou dextrinss; agentes quelantes como EDTA; açúcares como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; adoçantes e outros agentes flavorizantes; preenchedores como celulose microcristalina, lactose, amido de milho e outros amidos; agentes de ligação; aditivos;

91/261 agentes colorantes; counter-ions formadores de sal como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos Znproteína); e/ou tensoativos não iônicos como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietileno glicol (PEG). Em uma modalidade preferida, a composição farmacêutica que compreende o anticorpo ou fusão de Fc da presente invenção está em uma forma hidrossolúvel, estando presente como sais farmaceuticamente aceitáveis, que deve incluir sais de adição ácida e básica. Sal de adição ácida farmaceuticamente aceitável se refere aqueles sais que retêm a eficácia biológica das bases livres e que não são biologicamente indesejáveis, formados com ácidos inorgânicos como ácido clorídrico, ácido hidrobrômico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico e outros, e ácido orgânicos como ácido acético, ácido propiônico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido maleico, ácido malônico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzóico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido metanossulfônico, ácido etanossulfônico, ácido p-toluenossulfônico, ácido salicílico outros.

Sais de adição básica farmaceuticamente bases inorgânicas aceitáveis incluem aqueles derivados de como sais de sódio, potássio, lítio, amônio, cálcio, magnésio, ferro, zinco, cobre, manganês, alumínio e outros. Particularmente preferidos são os sais de amônio, potássio, sódio, cálcio, e magnésio. Sais derivados de bases orgânicas não tóxicas farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de aminas primárias, secundárias, e terciárias, aminas substituídas incluindo aminas substituídas de ocorrência natural, aminas cíclicas e

92/261 resinas de troca iônica básicas, como isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina, e etanolamina. As formulações a serem usadas para administração in vivo são preferivelmente estéreis. Oisso é facilmente realizado por filtração através de membranas estéreis de filtração ou outros métodos.

Os anticorpos e fusões de Fc aqui revelados também podem ser formulados como imunolipossomos. Um lipossomo é uma vesícula pequena que compreende vários tipos de lipídeos, fosfolipídeos e/ou tensoativos que são úteis para liberação de um agente terapêutico a um mamífero. Lipossomos que contêm o anticorpo ou fusão de Fc são preparados por métodos conhecidos na técnica, como descrito em Epstein e cols., 1985, Proc Natl Acad Sei USA, 82:3688; Hwang e cols., 1980, Proc Natl Acad Sei USA, 77:4030; US 4.485.045; US 4.544.545; e PCT WO 97/38731. Lipossomos como melhor tempo de circulação são revelados na US 5.013.556. Os componentes do lipossomo são comumente arranjados em uma formação de duas camadas, similar ao arranjo de lipídeo de membranas biológicas. Lipossomos particularmente úteis podem ser gerados pelo método de evaporação de fase reversa com uma composição de lipídeo que compreende fosfatidileolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivatizada com PEG (PEG-PE). Lipossomos são passados através de filtros de tamanho de poro definido para produzir lipossomos com o diâmetro desejado. Um agente quimioterápico ou outro agente terapeuticamente ativo é opcionalmente contido no lipossomo (Gabizon e cols., 1989, J National Câncer Inst 81:1484).

Os anticorpos, fusões de Fc, e outros agentes

93/261 terapeuticamente ativos também podem ser aprisionados em microcápsulas preparadas por métodos que incluem, mas não limitadas a técnicas de co-acervação, polimerização interfacial (por exemplo, usando microcápsulas de hidróximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli(metil-metacrilato), ou em sistemas de liberação coloidal de medicamento (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, micro-emulsões, nano partículas, e nanocápsulas) e macro-emulsões. Tais técnicas são reveladas em Remington's Pharmaceutical Sciences 16a. Ed., A. Oslo, 1980 .

Preparações de liberação sustentada podem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímero hidrofóbico sólido, cujas matrizes estão na forma de artigos formados, por exemplo, filmes, ou microcápsulas.

Exemplos de matrizes sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo poli(2-hidroxietilmetacrilato) ou poli(etilinilálcool) ) , polilactides (US

3.773.919) , copolímeros de ácido L-glutâmico e gama etil-Lglutamato, acetato de etileno-etilinil não degradável, copolímeros de ácido glicólico-ácido lático degradáveis como LUPRON

DEPOT™ (que são microesferas inj etáveis compostas de copolímero ácido glicólico-ácido lático lactic acetato de poli-D-(-)-3hidroxibutírico, e ProLease® (comercialmente disponível por

Alkermes) , que microesfera incorporada composto da molécula bioativa desejada em uma matriz de poli-DL-lactide-co-glicolide (PLG).

94/261

A concentração do anticorpo terapeuticamente ativo ou fusão de Fc da presente invenção na formulação pode variar de cerca de 0,1 a 100 % em peso. Em uma modalidade preferida, a concentração do anticorpo ou fusão de Fc está na faixa de 0,003 a 1,0 molar. Para tratar um paciente, uma dose terapeuticamente eficaz do anticorpo ou fusão de Fc da presente invenção pode ser administrada. Por dose terapeuticamente eficaz entende-se a dose que produz os efeitos para os quais ela é administrada. A dose exata dependerá do objetivo do tratamento, e será determinada por uma pessoa habilitada na técnica usando técnicas conhecidas. As dosagens podem variar de 0,01 a 100 mg/kg de peso corporal ou maior, por exemplo 0,1, 1, 10, ou 50 mg/kg de peso corporal, com 1 a lOmg/kg sendo preferida. Como é conhecido na técnica, ajustes para degradação de anticorpo ou fusão de Fc, liberação sistêmica versus localizada, e taxa de síntese de novas proteases, assim como idade, peso corporal, saúde geral, sexo, dieta, tempo de administração, interação medicamentosa e a severidade da condição podem ser necessários, e serão determinados pela experimentação rotineira pelo praticante habilitado na técnica.

A administração da composição farmacêutica que compreende um anticorpo ou fusão de Fc da presente invenção, preferivelmente na forma de uma solução aquosa estéril, pode ser feita em uma variedade de vias, incluindo, mas não limitadas a, via oral, subcutânea, intravenosa, intranasal, intraótica, transdérmica, tópica (por exemplo,, géis, pomadas, loções, cremes, intraperitonial, intramuscular, intrapulmonar (por

95/261 exemplo,, AERx® tecnologia inalante comercialmente disponível por Aradigm, ou Inhance™ sistema de liberação pulmonar comercialmente disponível por Inhale Therapeutics) , vaginal, parenteral, retal, ou intraocular. Em alguns casos, por exemplo para o tratamento de ferimentos, inflamação, etc., o anticoOrpo ou fusão de Fc pode ser aplicado diretamente como uma solução ou spray. Como é conhecido na técnica, a composição farmacêutica pode ser formulada consequentemente dependendo do modo de introdução.

Métodos de construção

A presente invenção fornece métodos de construção que podem ser usados para gerar variantes de Fc. Um principal obstáculo que tem impedido tentativas prévias na construção de Fc é que apenas tentativas aleatórias na modificação foram possíveis, em parte pela ineficiência das estratégias e métodos de construção, e à natureza de baixo rendimento da produção e escolha de anticorpo. A presente invenção descreve métodos de construção que sobrepujam essas desvantagens. Uma variedade de estratégias de projeto, métodos de escolha comptacionais, métodos de geração de biblioteca, e métodos de produção experimental e escolha são contemplados. Essa estratégias, abordagens, técnicas, e métodos podem ser aplicados individualmente ou em várias combinações para variantes de Fc construídas otimizadas.

Estratégias de projeto

A abordagem mais eficiente para gerar variantes de Fc que são otimizadas para uma propriedade desejada é a de direcionar os esforços de engenharia na direção do objetivo. Conseqüentemente, a presente invenção ensina

96/261 estratégias de projeto que podem ser usadas para construir variantes de Fc otimizadas. 0 uso de uma estratégia de projeto pretende guiar a engenharia de Fc, mas não pretende restringir uma variante de Fc a uma propriedade otimizada particular baseada na estratégia de projeto que foi usada para construí-la. A primeira vista isso absurdo; no entanto sua validade é derivada da enorme complexidade de interações sutis que determinam a estrutura, estabilidade, soiubilidade, e função de proteínas e complexos proteínaproteína. Embora possam ser feitos esforços para prever quais posições de proteína, resíduos, interações, etc. são importantes para um projeto de objetivo, algumas vezes eles não são previsíveis. Efeitos na estrutura, estabilidade, soiubilidade, e função da proteína, favorável ou desfavorável, são frequentemente imprevistas. Há inúmeras modificações de aminoácido que são prejudiciais ou danosas às proteínas. Assim, muitas vezes a melhor abordagem para a engenharia vem da geração de proteína variantes que são focadas geralmente na direção de um objetivo de projeto mas não causa efeitos prejudiciais. Desse modo, um principal objetivo de uma estratégia de projeto pode ser a geração de diversidade de qualidade. Em um nível simplista, isso pode se pensado como acúmulo de chances em um fator. Como um exemplo, a perturbação do carboidrato de Fc ou um ângulo domínio-domínio particular, como descrito abaixo, são estratégias de projeto válidas para geração de variantes de Fc otimizadas, a despeito do fato de que como o carboidrato e ângulos domínio-domínio determinam as propriedades of Fc não é bem entendido. Por redução do número de modificações de aminoácido prejudiciais que são realizadas, ou seja, por

97/261 escolha de diversidade de qualidade, essas estratégias de projeto se tornam práticas. Assim o valor verdadeiro das estratégias de projeto ensinadas na a presente invenção é usa capacidade de direcionar esforços de engenharia para a geração de variantes de Fc valiosas. O valor específico de qualquer uma das variantes resultantes é determinado após experimentação.

Uma estratégia de projeto para engenharia de variantes de Fc é fornecida na qual a interação de Fc com algum ligante de Fc é alterada por modificações de engenharia de aminoácido na interface entre Fc e o referido ligante de Fc. Ligantes de Fc podem incluem mas não se limitam a FcyRs, Clq, FcRn, proteína A ou G, e outros. Ao explorar substituições energeticamente favoráveis nas posições de Fc que têm impacto na ligação da interface, variantes podem ser construídas que mostram novas conformações de interface, algumas podem melhorar a ligação ao ligante de Fc, algumas podem reduzir a ligação ao ligante de Fc, e algumas podem ter outras propriedades favoráveis. Tais novas conformações de interface podem ser o resultado de, por exemplo, interação direta com resíduos de ligante de Fc que formam a interface, ou efeitos indiretos causados pelas modificações de aminoácido como perturbação da cadeia lateral ou conformações de estrutura. Posições variáveis podem ser escolhidas como quaisquer posições que acreditase terem um papel importante na determinação da conformação da interface. Por exemplo, posições variáveis podem ser escolhidas como o conjunto de resíduos que estão em uma certa distância, por exemplo 5 Angstroms (Â) , preferivelmente entre 1 e 10 Â, de qualquer resíduo que

98/261 faça contato direto com o ligante de Fc.

Uma estratégia de projeto adicional para geração de

variantes de Fc é fornecida	na qual	a	conformação do
carboidrato de Fc em N2 97 é	otimizada.	A	otimização como
usada nesse contexto inclui	mudanças	de	conformação e

composição no carboidrato N297 que resulta em uma propriedade desejada, por exemplo afinidade aumentada ou diminuída por um FcyR. tal estratégia é sustentada pela observação de que a estrutura e conformação do carboidrato afeta dramaticamente a ligação de Fc/FcyR e Fc/Clq (Umana e cols., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies e cols., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Mimura e cols., 2001, J Biol Chem 276:45539-45547.; Radeav e cols., 2001, J Biol Chem 276:16478-16483; Shields e cols., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa e cols., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473). No entanto o carboidrato não faz contato específico com FcyRs. Ao explorar substituições energeticamente favoráveis nas posições que interagem com carboidrato, a diversidade de qualidade de variantes pode ser construída que mostram novas conformações de carboidrato, algumas podem melhorar a ligação ao ligante de Fc e algumas podem reduzir a ligação a um ou mais ligantes de Fc. Embora a maioria das mutações próximas da interface Fc/carboidrato pareçam alterar a conformação do carboidrato, algumas mutações mostram alterar a composição de glicosilação (Lund e cols., 1996, J Immunol 157:49634969; Jefferis at aL, 2002, Immunol Lett 82:57-65).

Uma outra estratégia de projeto para geração de variantes de Fc é fornecida na qual o ângulo entre domínios Cy2 e Cy3 é otimizado. A otimização como usada esse

99/261 contexto pretende descrever mudanças conformacionais no ângulo do domínio Cy2 e Cy3 que resulta em uma propriedade desejada, por exemplo afinidade aumentada ou reduzida por um FcyR. esse ângulo é um importante determinante da afinidade Fc/FcyR (Radeav e cols., 2001, J Biol Chem 276:16478-16483), e inúmeras mutações distais à interface Fc/FcyR afetam a ligação potencialmente por modulação dela (Shields e cols., 2001, J Biol Chem 276:6591-6604). Ao explorar posições de substituições energeticamente favoráveis que parecem ter um papel chave na determinação do ângulo Cy2-Cy3 e a flexibilidade dos domínios relativos um ao outro, a diversidade de qualidade de variantes pode ser desenhada que mostra novas ângulos e níveis de flexibilidade, alguns podem ser otimizados para uma propriedade de Fc desejada.

Uma outra estratégia de projeto para geração de variantes de Fc é fornecida na qual Fc é reconstruído para eliminar a dependência estrutural e funcional sobre a glicosilação. Essa estratégia de projeto envolve a otimização de estrutura de Fc, estabilidade, solubilidade, e/ou função de Fc (por exemplo afinidade de Fc por um ou mais ligantes de Fc) na ausência de carboidrato N297. na abordagem, posições que são expostas a solvente na ausência de glicosilação são construídas de forma que elas são estáveis, estruturalmente consistentes com a estrutura de Fc, e não têm tendência a agregar. 0 Cy2 é o único domínio de Ig não pareado no anticorpo (veja Figura 1) . Assim o carboidrato N297 cobre o remendo hidrofóbico exposto que seria normalmente a interface para uma interação proteínaproteína com um outro domínio de Ig, a manutenção da

100/261 estabilidade e integridade estrutural de Fc e a manutenção dos domínios Cy2 de se agregar no eixo central. Abordagens para otimização de Fc aglicosilado pode envolver mas não se limitam a modificações de projeto de aminoácido que melhoram a estabilidade e/ou solubilidade de Fc aglicosilado por incorporação de resíduos polares e/ou carregados que encaram para dentro na direção do eixo do dímero Cy2-Cy2, e por desenho de modificações de aminoácido que melhoram diretamente a interface Fc/FcyR aglicosilada ou a interface de Fc aglicosilado com algum outro ligante de Fc.

Uma estratégia de projeto adicional para construção de variantes de Fc é fornecida na qual a conformação do domínio Cy2 é otimizada. A otimização como usada nesse contexto pretende descrever mudanças de conformação no ângulo do domínio Cy2 que resulta em uma propriedade desejada, por exemplo afinidade aumentada ou diminuída por um FcyR. Por exploração de substituições energeticamente favoráveis nas posições C72 que influenciam a conformação de Cy2, a diversidade de qualidade de variantes pode ser construída que mostra novas conformações de Cy2, algumas podem atingir o objetivo de projeto. Tais novas conformações de C72 devem ser o resultado de , por exemplo, conformações alternativas de estrutura que são amostradas pela variante. Posições variáveis podem ser escolhidas como quaisquer posições que acredita-se terem um importante papel na determinação de estrutura, estabilidade, solubilidade, flexibilidade, função de Cy2, e outros. Por exemplo, resíduos de núcleo hidrofóbicos de Cy2, que são resíduos de Cy2 que são parcialmente ou completamten

101/261 sequestrados do solvente, podem ser reconstruídos. Alternativamente, resíduos que não são do núcleo podem ser considerados, ou resíduos que são considerados importantes para a determinação da estrutura, estabilidade, ou flexibilidade.

Uma estratégia de projeto adicional para otimização de Fc é fornecida na qual a ligação a um FcyR, complemento, ou algum outro ligante de Fc é alterada por modificações que modulam a interação eletrostática entre Fc e o ligante de Fc. Tais modificações podem ser através de otimização do caráter global eletrostático de Fc, e inclui substituição de aminoácidos neutros com um aminoácido carregado, substituição de um aminoácido carregado com um aminoácido neutro, ou substituição de um aminoácido carregado com um aminoácido de carga oposta (ou seja reversão de carga). Tais modificações podem ser usadas para afetar mudanças na afinidade de ligação entre um Fc e um ou mais ligantes de Fc, por exemplo FcyRs. Em uma modalidade preferida, posições nas quais substituições eletrostáticas devem afetar a ligação são selecionadas usando um de uma variedade de métodos bem conhecidos para calcular os potenciais eletrostáticos. Na modalidade mais simples, a lei de Coulomb é usada para gerar potenciais eletrostáticos como uma função da posição na proteína. Modalidades adicionais incluem o uso de escala de Debye-Huckel para prestar contas pelos efeitos de resistência iônica, e modalidades mais sofisticadas côo cálculos de PoissonBoltzmann. Tais cálculos eletrostáticos podem apontar posições e sugerir modificações de aminoácido específicas para atingir o objetivo desejado. Em alguns casos, essa

102/261 substituições podem ser antecipadas por afetar variavelmente a ligação a diferentes ligantes de Fc, por exemplo para aumentar a ligação a FcyRs de ativação embora diminuam a afinidade de ligação a FcyRs inibidor.

Escolha Computacional

Um obstáculo principal para obtenção de variantes de Fc valiosas é a dificuldade em prever quais modificações de aminoácido, do número enorme de possibilidades, atingirá os objetivos desejados. De fato um das principais razões que tentativas prévias na engenharia de Fc falharam em produzir variantes de Fc de valor clínico significativo é que as abordagens para engenharia de Fc envolveram abordagens tudo ou nada. A presente invenção fornece métodos de escolha computacional que permitem engenharia quantitativa e sistemática de variantes de Fc. Esses métodos tipicamente usam funções de pontuação de nível atômico, amostragem de cadeia lateral, e métodos de otimização avançados para capturar de forma precisa as relações entre seqüência, estrutura, e função proteína. Escolha computacional permite a exploração do espaço da seqüência inteira de possibilidades nas posições alvo por filtragem da enorme diversidade que resulta. Bibliotecas variantes que são selecionadas de forma computacional são eficientemente enriquecidas para seqüências estáveis, adequadamente dobradas, e funcionais, permitindo a otimização ativa de Fc para um objetivo desejado. Devido a limitação da seqüência de sobreposição na estrutura, estabilidade, solubilidade, e função de proteína, um grande número dos candidatos em uma biblioteca ocupa espaço de seqüência desperdiçado. Por exemplo, uma grande fração do espaço da seqüência codifica

103/261 proteínas não dobradas, sem dobra, dobradas de forma incompleta, parcialmente dobradas, ou agregadas. Isso ê particularmente relevante para a construção porque domínios de Ig são pequenas estruturas de dobra beta, a construção das quais provou ser extremamente exigente (Quinn e cols., 1994, Proc Natl Acad Sei USA 91:8747-8751; Richardson e cols., 2002, Proc Natl Acad Sei USA 99:2754-2759). Mesmo substituições aparentemente inofensivas na superfície de dobra beta podem causar conflitos severos de embalagem, rompendo dramaticamente o equilíbrio da dobra (Smith e cols., 1995, Science 270:980-982); incidentalmente, alanina é um dos piores formadores de dobra beta (Minor e cols., 1994, Nature 371:264-267). Os determinantes de estabilidade e especificidade da dobra beta são u equilíbrio delicado entre um número extremamente grande de interações sutis. Escolha computacional permite a geração de bibliotecas que são compostas primariamente de espaço produtivo da seqüência, e como um resultado aumenta as chances de identificação de proteínas que são otimizadas para o objetivo desejado. De fato, a escolha computacional rende uma aumentada taxa de colisão, dessa forma diminuindo o número de variantes que deve ser escolhido experimentalmente. Um obstáculo adicional a construção de Fc é a necessidade por desenho ativo de mutações correlacionadas. Por exemplo, o maior aumento de afinidade Fc/FcyR observado até agora é S298A/E333A/K334A, obtido por combinação de três melhores ligantes obtidos separadamente em um scan de alanina (Shields e cols., 2001, J Biol Chem 276:6591-6604). Escolha computacional é capaz de gerar essa variante de três dobras em um experimento em vez de três

104/261 experimentos separados, e além disso, é capaz de testar a funcionalidade de todos os 20 aminoácidos naquelas posições em vez de apenas a alanina. A escolha computacional lida com essa complexidade por redução do problema combinatório a um tamanho experimentalmente tratável.

A escolha computacional, vista amplamente, tem quatro etapas: 1) seleção e preparação da estrutura ou estruturas do modelo da proteína, 2) seleção de posições variáveis, aminoácidos a serem considerados naquelas posições, e/ou seleção of rotâmeros para modelar aminoácidos considerados, 3) cálculo de energia, e 4) otimização combinatória. Em maiores detalhes, o processo de escolha computacional pode ser descrito como se segue. Uma estrutura tridimensional da proteína é usada como o ponto de partida. As posições a serem otimizadas são identificadas, que podem ser a seqüência da proteína inteira ou subconjunto dessa. Aminoácidos que serão considerados em cada posição são selecionados. Em uma modalidade preferida, cada aminoácido considerado pode ser representados por um conjunto distinto de conformações permitidas, chamadas rotâmeros. Energias de interação são calculadas entre cada aminoácido considerado e cada outro aminoácido considerado, e o restante da proteína, incluindo a estrutura da proteína e resíduos invariáveis. Em uma modalidade preferida, as energias de interação são calculadas entre cada rotâmero de cadeia lateral de aminoácido considerado e cada outro rotâmero de cadeia lateral de aminoácido considerado e o restante da proteína, incluindo a estrutura da proteína e resíduos invariáveis. Um ou mais algoritmos de pesquisa combinatória são então usados para identificar a seqüência de mais baixa

105/261 energia e/ou seqüências de baixa energia.

Em uma modalidade preferida, o método de escolha computacional usado é substancialmente similar a tecnologia Protein Design Automation® (PDA®), como é descrito em US 5 6.188.965; US 6.269.312; US 6.403.312; USSN 09/782.004;

USSN 09/927.790; USSN 10/218.102; PCT WO 98/07254; PCT WO 01/40091; e PCT WO 02/25588. Em uma modalidade preferida, o método de escolha computacional substancialmente similar à tecnologia de Algoritmo de Previsão de Seqüência ™ (SPATM) 10 é usado, como descrito em (Raha e cols., 2000, Protein Sei

9:1106-1119), USSN 09/877.695, e USSN 10/071.859. em uma outra modalidade preferida, o métodos de escolha computacional descrito em USSN 10/339788, depositado em 3 de março de o2003, intitulado ANTIBODY OPTIMIZATION, é 15 usado. Em algumas modalidades, combinações de diferentes métodos escolha computacional são usados, incluindo combinações de tecnologia PDA® e tecnologia SPATM, assim como combinações desses métodos computacionais em combinação com outras ferramentas de projeto. De forma 20 similar, esses métodos computacionais podem ser usados simultaneamente ou seqüencialmente em qualquer ordem.

Uma estrutura modelo é usada como entrada nos cálculos de escolha computacional. Por estrutura modelo entende-se as coordenadas estruturais de parte ou toda a 25 proteína a ser otimizada. A estrutura modelo pode ser qualquer proteína para a qual uma estrutura dimensional (ou seja, coordenadas tridimensionais para um conjunto de átomos de proteína) é conhecida ou pode ser calculada, estimada, modelada, gerada, ou determinada. As estruturas 30 tridimensionais das proteínas podem ser determinadas usando

106/261 métodos incluindo mas não limitadas a técnicas de cristalografia de raio X, técnicas de ressonância nuclear magnética (RNM), nova modelagem, e modelagem de homologia. Se a otimização é desejada para a proteína para a qual a estrutura não foi esclarecida experimentalmente, pode ser gerado um modelo estrutural adequado que pode funcionar como o modelo de cálculos de escolha computacional. Métodos para geração de modelos de homologia de proteínas são conhecidos na técnica, e esses métodos têm uso na presente invenção. Veja por exemplo, Luo, e cols. 2002, Protein Sei 11: 1218-1226, Lehmann & Wyss, 2001, Curr Opin Biotechnol 12(4) :371-5.,- Lehmann e cols., 2000, Biochim Biophys Acta 1543 (2):408-415,- Rath & Davidson, 2000, Protein Sei, 9(12):2457-69,- Lehmann e cols., 2000, Protein Eng 13(1):4957; Desjarlais & Berg, 1993, Proc Natl Acad Sei USA 90(6):2256-60,- Desjarlais & Berg, 1992, Proteins 12(2):1014; Henikoff & Henikoff, 2000, Adv Proteína Chem 54:73-97; Henikoff & Henikoff, 1994, J Mol Biol 243(4) :574-8,- Morea e cols., 2000, Methods 20:267-269. complexos proteína/proteína também podem ser obtidos usando métodos de ancoragem. Estruturas adequadas de proteína que podem servir como estruturas modelo incluem, mas não se limitam a, todas aquelas encontradas na Base de Dados de Proteína compilada e fornecida pelo Research Collaboratory for Structural Bioinformaties (RCSB, anteriormente o Brookhaven National Lab).

A estrutura modelo pode ser de uma proteína que ocorre naturalmente ou é construída. A estrutura modelo pode ser de uma proteína que é substancialmente codificados por uma proteína de qualquer organismo, com humano, camundongo,

107/261 rato, coelho, e macaco sendo preferidos. A estrutura modelo pode compreender qualquer uma de várias formas estruturais da proteína. Em uma modalidade preferida a estrutura modelo compreende uma região de Fc ou um domínio ou fragmento de Fc. Em uma modalidade alternativamente preferida a estrutura modelo compreende Fc ou um domínio ou fragmento de Fc ligado a um ou mais ligantes de Fc, com um complexo Fc/FcyR sendo preferido. O Fc na estrutura modelo pode ser glicosilado ou não glicosilado. A estrutura modelo pode compreender mais de uma cadeia de proteína. A estrutura modelo pode conter adicionalmente componentes não proteicos, incluindo mas não limitadas a pequenas moléculas, substratos, cofatores, metais, moléculas de água, grupos protéticos, polímeros e carboidratos. Em uma modalidade preferida, a estrutura modelo é uma pluralidade ou conjunto de proteínas modelo, por exemplo um grupo de estruturas como aquela s obtidas de RNM. Alternativamente, o conjunto de estruturas modelos é gerado de um conjunto de proteínas ou estruturas relacionadas, ou grupos artificialmente criados. A composição e fontes de uma estrutura modelo depende do objetivo de construção. Por exemplo, para melhor afinidade de Fc/FcyR humano, uma estrutura de complexo Fc/ FcyR humano ou derivado dessa pode ser usada como a estrutura modelo. Alternativamente, a estrutura de Fc sem complexo pode ser usada como a estrutura modelo. Se o objetivo for o de melhorar a afinidade de um Fc humano para um FcyR de camundongo, a estrutura modelo pode ser a estrutura ou modelo de um Fc humano ligado a um FcyR de camundongo.

A estrutura modelo pode ser modificada ou alterada

108/261 antes dos cálculos de projeto. Uma variedade de métodos para a preparação da estrutura modelo é descrita em US 6.188.965; US 6.269.312; US 6.403.312; USSN 09/782.004; USSN 09/927.790; USSN 09/877.695; USSN 10/071.859, USSN 10/218,102; PCT WO 98/07254; PCT WO 01/40091; e PCT WO 02/25588. Por exemplo, em uma modalidade preferida, hidrogênios explícitos podem ser adicionados se não incluídos na estrutura. Em uma modalidade alternativa, a minimização de energia da estrutura é feita para relaxar a tensão, incluindo tensão por confronto de van der Waals, ângulos de ligação desfavoráveis, e comprimentos de ligação desfavoráveis. Alternativamente, a estrutura modelo é alterada usando outros métodos, como manual, incluindo perturbações direcionadas ou aleatórias. Também é possível modificar a estrutura modelo durante etapas posteriores de escolha computacional, incluindo durante o cálculo de energia e etapas de otimização combinatória. Em uma modalidade alternativa, a estrutura modelo não é modificada antes ou durante os cálculos de escolha computacional.

Uma vez que a estrutura modelo tenha sido obtida, posições variáveis são escolhidas. Por posição variável entende-se a posição na qual a identidade de aminoácido é alterada em um cálculo de escolha computacional. Como é conhecido na técnica, permitir as modificações de aminoácido a serem consideradas apenas em certas posições variáveis reduz a complexidade de um cálculo e permite que a escolha computacional seja mais direcionada ao objetivo desejado. Um ou mais resíduos podem ser posições variáveis nos cálculos de escolha computacional. Posições que são escolhidas como posições variáveis podem ser aquelas que

109/261 contribuem ou são pretendem contribuir para a propriedade da proteína a ser otimizada, por exemplo afinidade de Fc por um FcyR, estabilidade de Fc, solubilidade de Fc, e assim por diante. Resíduos nas posições variáveis podem contribuir favoravelmente ou desfavoravelmente para uma propriedade de proteína específica. Por exemplo, um resíduo na interface Fc/FcyR pode ser envolvido na mediação da ligação, e assim essa posição pode ser variada nos cálculos do projeto desejado em melhorar a afinidade de Fc/FcyR. Como um outro exemplo, um resíduo que tem uma cadeia lateral hidrofóbica exposta pode ser responsável por causar agregação desfavorável, e assim essa posição pode ser variada nos cálculos de projeto desejados para melhorar a solubilidade. Posições variáveis podem ser aquelas posições que são diretamente envolvidas nas interações que são determinantes de uma propriedade particular da proteína. Por exemplo, o sítio de ligação de FcyR de Fc pode ser definido para incluir todos os resíduos que fazem contato com aquele FcyR particular. Por contato entende-se alguma interação química entre pelo menos um átomo de um resíduo de Fc com pelo menos um átomo do FcyR ligado, com interação química incluindo, mas não limitadas a interações de van der Waals, interações de ligação de hidrogênio, interações eletrostáticas, e interações hidrofóbicas. Em uma modalidade alternativa, posições variáveis podem incluir aquelas posições que estão indiretamente envolvidas na propriedade de proteína, ou seja, as posições podem ser proximais aos resíduos que são conhecidos como contribuintes para uma propriedade de Fc. Por exemplo, o sítio de ligação de FcyR de um Fc pode ser definido por

110/261 incluir todos os resíduos de Fc em uma certa distância, por exemplo 4 - 10 Â, de qualquer resíduo de Fc que está em contato de van der Waals com o FcyR. Portanto posições variáveis nesse caso podem ser escolhidas não apenas como resíduos que direcionam o contato de FcyR, mas também aquelas que contatam resíduos que contatam o FcyR e assim influenciam a ligação indiretamente. As posições específicas escolhidas são dependentes da estratégia de projeto sendo empregada.

Uma ou mais posições na estrutura modelo que não variáveis podem ser flutuantes. Por posição flutuante entende-se a posição na qual a conformação de aminoácido mas não a identidade de aminoácido varia no cálculo de escolha computacional. Em uma modalidade, a posição flutuantes pode ter a identidade de aminoácido parente. Por exemplo, posições flutuantes podem ser posições que estão em uma pequena distância, por exemplo 5 Â, de um resíduo de posição variável. Em uma modalidade alternativa, a posição flutuante pode ter uma identidade de aminoácido não parente. Tal modalidade pode ter uso na presente invenção, por exemplo, quando o objetivo é o de avaliar o resultado energético ou estrutural de uma mutação específica.

Posições que	não	são variáveis ou	flutuantes	são
fixas. Por posição	fixa	entende-se uma	posição	na
qual a identidade	de	aminoácido e a	conformação	são
mantidas constantes	no	cálculo de escolha computacional.

Posições que podem ser fixas incluem resíduos que não são conhecidos com estando envolvidos ou hipoteticamente envolvidos na propriedade a ser otimizada. Nesse caso a suposição é que há pouco ou nada a ser ganho ao variar

111/261 essas posições. As posições que são fixas também podem incluir posições cujos resíduos são conhecidos com sendo importantes ou hipoteticamente importantes para manter dobra, estrutura, estabilidade, solubilidade, e/ou função biológica adequadas. Por exemplo, as posições podem ser fixas para resíduos que interagem com um particular ligante de Fc ou resíduos que codificam um sítio de glicosilação para assegurar ao ligante de

Fc e adequada se j am perturbadas. Da mesma forma, se a estabilidade está sendo otimizado, pode ser benéfico diretamente ou indiretamente com um ligante de Fc, por exemplo um

FcyR, de forma que perturbada.

Posições fixas também podem incluir resíduos estruturalmente importantes como cisteínas que participam em pontes de dissulfeto, resíduos críticos para determinação de conformação de estrutura como prolina ou glicina, resíduos críticos de ligação de hidrogênio , e resíduos que formam interações favoráveis de embalagem.

A próxima etapa na escolha computacional é a seleção de um conjunto de possíveis identidades de aminoácido que serão consideradas em cada posição variável particular. Esse conjunto de aminoácidos possíveis é aqui referido como um aminoácido considerado em uma posição variável.

Aminoácidos como aqui usado se referem ao conjunto de 20 aminoácidos naturais e quaisquer análogos não naturais ou sintéticos. Em uma modalidade, todos os 20 aminoácidos naturais são considerados. Alternativamente, um subconjunto de aminoácidos, ou mesmo apenas um aminoácido é considerado em uma posição variável dada. Como será percebido por

112/261 aqueles habilitados na técnica, há benefício computacional na consideração apenas de certas identidades de aminoácido em posições variáveis, já que ela diminui a complexidade combinatória da pesquisa. Além disso, a consideração apenas de certos aminoácidos em posições variáveis pode ser usada para fazer cálculos na direção de estratégias específicas de desenho. Por exemplo, para otimização de solubilidade de Fc aglicosilado, pode ser benéfico permitir que apenas aminoácidos polares sejam considerados em resíduo de Fc não polares que são expostos a solvente na ausência de carboidrato. Aminoácidos não naturais, incluindo aminoácidos sintéticos e análogos de aminoácidos naturais, também podem ser aminoácido considerados. Por exemplo veja Chin e cols., 2003, Science, 301(5635):964-7; e Chin e cols., 2003, Chem Biol.10(6):511-9.

Uma ampla variedade de métodos pode ser usada, isoladamente ou em combinação, para selecionar quais aminoácidos serão considerados em cada posição. Por exemplo, o conjunto de aminoácidos considerados em uma posição variável dada pode ser escolhido baseado no grau de exposição ao solvente. Aminoácidos hidrofóbicos ou não polares tipicamente residem no interior ou núcleo de uma proteína, que são inacessíveis ou quase inacessíveis ao solvente. Assim em posições variáveis de núcleo pode ser benéfico considerar apenas ou a maioria dos aminoácidos não polares como alanina, valina, isoleucina, leucina, fenilalanina, tirosina, triptofano, e metionina. Aminoácidos hidrofílicos ou polares tipicamente residem no exterior ou superfície das proteínas, que têm um grau significativo de acessibilidade de solvente. Assim em

113/261 posições variáveis de superfície pode ser pode ser benéfico considerar apenas ou a maioria dos aminoácidos polares como alanina, serina, treonina, ácido aspártico, asparagina, glutamina, ácido glutâmico, arginina, lisina e histidina. Algumas posições são parcialmente expostas e parcialmente escondidas, e não são claramente posições de núcleo ou superfície da proteína, em um sentido funcionando como resíduos de limite entre resíduos de núcleo ou superfície. Assim em tais posições variáveis de limite pode ser pode ser benéfico considerar aminoácidos polares e não polares como alanina, serina, treonina, ácido aspártico, asparagina, glutamina, ácido glutâmico, arginina, lisina histidina, valina, isoleucina, leucina, fenilalanina, tirosina, triptofano, e metionina. A determinação do grau de exposição a solvente em posições variáveis pode ser por avaliação subjetiva ou inspeção visual da estrutura modelo por uma pessoa habilitada na técnica de biologia estrutural de proteína, ou pelo uso de uma variedade de algoritmos que são conhecidos na técnica. A seleção de tipos de aminoácido a serem considerados em posições variáveis pode ser auxiliada ou determinada completamente por métodos computacionais, como cálculo de área de superfície acessível a solvente, ou usando algoritmos que avaliam a orientação dos vetores Ca-C/3 em relação à superfície acessível a solvente, como apontado em US 6,188,965; 6.269.312; US 6.403.312; USSN 09/782.004; USSN 09/927.790; USSN 10/218.102; PCT WO 98/07254; PCT WO 01/40091; e PCT WO 02/25588. Em uma modalidade, cada posição variável pode ser classificada explicitamente como uma posição de núcleo, superfície, ou limite ou uma classificação substancialmente

114/261 similar a núcleo, superfície, ou limite.

Em uma modalidade alternativa, a seleção do conjunto de aminoácidos permitida em posições variáveis pode ser dirigida por hipótese. Hipóteses para quais tipos de aminoácidos devem ser considerados em posições variáveis podem ser derivadas por uma avaliação subjetiva ou inspeção visual da estrutura modelo por uma pessoa habilitada na técnica de biologia estrutural de proteína. Por exemplo, se for suspeitada que uma interação de ligação de hidrogênio pode ser favorável na posição variável, resíduos polares que têm a capacidade de formar pontes de hidrogênio podem ser considerados, mesmo se a posição estiver no núcleo. Do mesmo modo, se for suspeito que uma interação hidrofóbica de embalagem pode ser favorável em uma posição variável, resíduos não polares que têm a capacidade para formar interações favoráveis de embalagem podem ser considerados, mesmo se a posição estiver na superfície. Outros exemplos

de abordagens	direcionadas	por	hipóteses podem	envolver
questões de	flexibilidade	de	estrutura ou	dobra de
proteína. Como	é conhecidos	na	técnica, certos	resíduos,
por exemplo prolina, glicina,	e cisteína, T-em papéis

importantes na estrutura e estabilidade da proteína. Glicina permite maior flexibilidade da estrutura que todos os outros aminoácidos, prolina limita a estrutura mais que todos os outros aminoácidos, e cisteínas pode formar pontes de dissulfeto. Pode ser, portanto, benéfica a inclusão de um ou mais desses tipos de aminoácidos para atingir um objetivo de projeto desejado. Alternativamente, pode ser benéfico excluir um ou mais desses tipos de aminoácido da lista de aminoácidos considerados.

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Em uma modalidade alternativa, subconjuntos de aminoácidos podem ser escolhidos para maximizar a cobertura. Nesse caso, aminoácidos adicionais com propriedades similares àquelas na estrutura modelo podem ser considerados em posições variáveis. Por exemplo, se o resíduo na posição variável na estrutura modelo é um resíduo hidrofóbico grande, aminoácidos adicionais hidrofóbicos grandes podem ser considerados naquela posição. Alternativamente, subconjuntos de aminoácidos podem ser escolhidos para maximizar a diversidade. Nesse caso, aminoácidos com propriedades dissimilares àquelas na estrutura modelo podem ser consideradas nas posições variáveis. Por exemplo, s o resíduo na posição variável no modelo é um resíduo hidrofóbico grande, aminoácidos que são pequenos, polares, etc. podem ser considerados.

Como é conhecido na técnica, alguns métodos de escolha computacional requerem apenas a identidade de aminoácido considerados para ser determinada durante cálculos de projeto. Ou seja, nenhuma informação é necessária em relação a conformações ou possíveis conformações das cadeias laterais de aminoácido. Outros métodos preferidos utilizam um conjunto de conformações distintas de cadeia lateral, chamados rotâmeros, que são considerados para cada aminoácido. Assim, um conjunto de rotâmeros pode ser considerado em cada posição variável e flutuante. Rotâmeros podem ser obtidos de bibliotecas publicadas de rotâmeros (veja por exemplo, Lovel e cols., 2000, Proteins: Structure Function and Genetics 40:389-408; Dunbrack & Cohen, 1997, Protein Science 6:1661-1681; DeMeayer e cols., 1997, Folding and Design 2:53-66; Tuffery e cols., 1991, J Biomol

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Struct Dyn 8:1267-1289, Ponder & Richards, 1987, J Mol Biol

193:775-791). Como é conhecido na técnica, bibliotecas de rotâmeros estrutura.

podem ser independentes ou dependentes de

Rotâmeros também podem ser obtidos de mecânica molecular ou cálculos ab initio, usando outros métodos.

Em uma modalidade preferida, um modelo de rotâmetro flexível é usado (veja Mendes cols.,

1999,

Proteins:

Structure

Function and Genetics

37:530-543).

De forma similar, rotâmeros artificialmente gerados podem ser usados, ou aumento do conjunto escolhido para cada uma modalidade, pelo menos uma na lista em energia é incluída de rotâmeros. Em uma modalidade alternativa, o rotâmetro do resíduo de posição variável na estrutura modelo está incluído na lista de rotâmeros permitidos para aquela posição variável. Em uma modalidade alternativa, apenas a identidade de cada aminoácido considerado em posições variáveis é fornecida, e nenhum estado conformacional específico de cada aminoácido é usado durante cálculos de projeto. Ou seja, o uso de rotâmeros não é essencial para a escolha computacional.

Informação experimental pode ser usada para guiar a escolha de posições variáveis e/ou a escolha de aminoácidos considerados em posições variáveis. Como é conhecido na técnica, experimentos de mutagênese são freqüentemente realizados para determinar o papel de certos resíduos na estrutura e função da proteína, por exemplo, quais resíduos de proteína têm um papel na determinação de estabilidade, ou quais resíduos fazem a interface de uma interação proteína-proteína. Os dados obtidos de tais experimentos

117/261 são úteis na presente invenção. Por exemplo, posições variáveis para melhor afinidade de Fc/FcyR devem envolver a variação de todas as posições nas quais uma mutação mostrou afetar a ligação. De modo similar, os resultados de tal experimento pode ser usado para guiar a escolha de tipos de aminoácidos permitidos em posições variáveis. Por exemplo, se certos tipos de substituições de aminoácidos são favoráveis, tipos similares daqueles aminoácidos podem ser considerados. Em uma modalidade, aminoácidos adicionais com propriedades similares àquelas que foram favoráveis experimentalmente podem ser considerados em posições variáveis. Por exemplo, se mutação experimental da posição variável em uma interface Fc/ FcyR para um resíduo hidrofóbico grande é favorável, o usuário pode escolher incluir aminoácidos hidrofóbicos grandes adicionais naquela posição na escolha computacional. Como é conhecido na técnica, tecnologias de apresentação e outras tecnologias de seleção podem ser unidas com mutagênese aleatória para gerar uma lista ou listas de substituições de aminoácidos que são favoráveis para a propriedade selecionada. Tal lista ou listas obtidas de tal trabalho experimental têm uso na presente invenção. Por exemplo, posições que estão envolvidas em tal experimento podem ser excluídas como posições variáveis nos cálculos de escolha computacional, enquanto posições que são mais aceitáveis para mutação ou respondem favoravelmente a mutação podem ser escolhidas como posições variáveis. De forma similar, os resultados de tais experimentos podem ser usados para guiar a escolha de tipos de aminoácidos permitidos em posições variáveis. Por exemplo, se certos tipos de aminoácidos surgem mais

118/261 freqüentemente em uma seleção experimental, tipos similares daqueles aminoácidos podem ser considerados. Em uma modalidade, aminoácidos adicionais com propriedades similares àquelas que foram favoráveis experimentalmente podem ser considerados em posições variáveis. Por exemplo, se mutações selecionadas em uma posição variável que reside na interface Fc/FcyR são aminoácidos não carregados polares, o usuário pode escolher incluir aminoácidos não carregados polares adicionais, ou talvez aminoácidos carregados polares, naquela posição.

A informação de seqüência também pode ser usada para guiar a escolha de posições variáveis e/ou a escolha de aminoácidos considerados em posições variáveis. Como é conhecido na técnica, algumas proteínas partilham um andaime estrutural comum e são homólogas em seqüência. Essa informação pode ser usada para obter uma percepção em posições particulares na família de proteína. Como é conhecido na técnica, alinhamentos de seqüência são freqüentemente realizados para determinar quais resíduos de proteína são conservados e quais não são. Ou seja, por comparação e contraste de alinhamentos de seqüências de proteínas, o graus de variabilidade na posição pode ser observado, e os tipos de aminoácidos que ocorrem naturalmente em posições pode ser observado. Os dados obtidos de tal análise são úteis na presente invenção. 0 benefício do uso de informação de seqüência para escolhad e posições variáveis e aminoácidos considerados em posições variáveis são muitos. Para escolha de posições variáveis, a vantagem primária do uso de informação de seqüência é que pode ser obtida uma percepção na qual as posições são mais

119/261 tolerantes e que são menos tolerantes à mutação. Assim a informação de seqüência pode ajudar a assegurar que a diversidade de qualidade, ou seja, mutações que não são prejudiciais à estrutura, estabilidade, etc. da proteína, tem amostragem computacional. A mesma vantagem se aplica ao uso de informação de seqüência para selecionar tipos de aminoácidos considerados em posições variáveis. Ou seja, o conjunto de aminoácidos que ocorre no alinhamento de seqüência de proteína pode ser pré-escolhido por evolução por ter uma maior chance que aleatório para ser compatível com uma estrutura, estabilidade, solubilidade, função de proteína, etc. assim uma maior diversidade de qualidade tem amostragem computacional. Um segundo benefício do uso de informação de seqüência para selecionar tipos de aminoácidos considerados em posições variáveis é que certos alinhamentos pode representar seqüências que podem ser menos imunogênicas que seqüências aleatórias. Por exemplo, se os aminoácidos considerados em uma posição variável dada são o conjunto de aminoácidos que ocorre naquela posição no alinhamento de seqüências de proteína humana, aqueles aminoácidos podem ser pré-escolhidos por natureza para geração de nenhuma ou baixa resposta imune ou se a proteína otimizada é usada como um terapêutico humano.

A fonte das seqüências pode variar amplamente, e inclui uma ou mais das bases de dados conhecidas, incluindo mas não limitadas a base de dados de Kabat (Johnson & Wu, 2001, Ácido nucleicos Res 29:205-206; Johnson & Wu, 2000, Ácido nucleicos Res 28:214-218), a base de dados IMGT (IMGT, the international ImMunoGeneTics informação system®; Lefranc e cols., 1999, Ácido nucleicos Res 27:209-212; Ruiz

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e cols.	, 2000	Ácido	nucleicos	Res	28:219-221;	Lefranc e
cols.,	2001,	Ácido	nucleicos	Res	29:207-209;	Lefranc e
cols.,	2003 ,	Ácido	nucleicos	Res	31:307-310),	e VBASE,
SwissProt, GenBank e	! Entrez,	e EMBL Nucleotide Sequence

Base de dados. A informação de seqüência de proteína pode ser obtida, compilada, e/ou gerada de alinhamentos de seqüência das proteínas de ocorrência natural de qualquer organismo, incluindo mas não limitadas a mamíferos. A informação de seqüência de proteína pode ser obtida de uma base de dados que é compilada de forma privada. Há vários programas de alinhamento baseados em seqüência e métodos conhecidos na técnica, e todos esses têm uso na presente invenção para geração de alinhamentos de seqüência de proteínas que compreendem Fc e ligante de Fcs.

Uma vez que os alinhamentos são feitos, a informação de seqüência pode ser usada para guiar a escolha de posições variáveis. Tal informação de seqüência pode relacionar a variabilidade, natural ou de outro modo, de uma posição dada. A variabilidade deve ser distinguida da posição variável. Variabilidade se refere ao grau no qual a posição dada na em um alinhamento de seqüência mostra variação nos tipos de aminoácidos que ocorrem ali. Posição variável, para reiterar, é a posição escolhida pelo usuário para variar em identidade de aminoácido durante o cálculo de escolha computacional. A variabilidade pode ser determinada qualitativamente por uma pessoa habilitada na técnica de bioinformática. Há também métodos conhecidos na técnica para determinar quantitativamente a variabilidade que pode ter uso na presente invenção. A modalidade mais preferida mede informação de entropia ou entropia Shannon.

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Posições variáveis podem ser escolhidas baseadas em informação de seqüência obtida de seqüências proteína intimamente relacionadas, ou seqüências que são menos intimamente relacionadas.

uso de informação de seqüência para escolher posições variáveis tem amplo uso na presente invenção. Por exemplo, se uma posição de interface Fc/FcyR na estrutura modelo é triptofano, e o triptofano é observado naquela posição em mais que 90% das seqüências em um alinhamento, pode ser benéfico deixar aquela posição fixa. Em contraste, se uma outra posição de interface tem um maior nível de variabilidade, por exemplo se cinco diferentes aminoácidos são observados naquela posição com freqüências de aproximadamente 20% cada, aquela posição pode ser escolhida como a posição variável. Em uma outra modalidade, inspeção visual das seqüências de proteína alinhadas pode substituir ou auxiliar a inspeção visual da estrutura da proteína. Informação de seqüência também pode ser usada para guiar a escolha de aminoácidos considerados em posições variáveis. Tal informação de seqüência pode estar relacionada a quão freqüentemente um aminoácido, aminoácidos, ou tipos de aminoácidos (por exemplo polar ou não polar, carregado ou não carregado) ocorre, naturalmente ou de outro modo, em uma posição dada. Em uma modalidade, o conjunto de aminoácidos considerados em uma posição variável podem compreender o conjunto de aminoácidos que é observado naquela posição no alinhamento. Portanto, a informação de alinhamento específica da posição é usada diretamente para gerar a lista de aminoácido considerados em uma posição variável em um cálculo de escolha computacional. Tal

122/261 estratégia é bem conhecida na técnica; veja por exemplo Lehmann & Wyss, 2001, Curr Opin Biotechnol 12(4) :371-5,Lehmann e cols., 2000, Biochem Biophys Acta 1543 (2) :408415,- Rath & Davidson, 2000, Protein Sei, 9 (12) :2457-69,Lehmann e cols., 2000, Protein Eng 13 (1):49-57,- Desjarlais & Berg, 1993, Proc Natl Acad Sei USA 90(6):2256-60,Desjarlais & Berg, 1992, Proteins 12(2) :101-4,- Henikoff & Henikoff, 2000, Adv Protein Chem 54:73-97; Henikoff & Henikoff, 1994, J Mol Biol 243(4):574-8. Em uma modalidade alternativa, o conjunto de aminoácidos considerados em uma posição variável ou posições pode compreender um conjunto de aminoácidos que é observado mais freqüentemente no alinhamento. Portanto, um certo critério é aplicado para determinar se a frequência de um aminoácido ou tipos de aminoácido justifica sua inclusão no conjunto de aminoácidos que são considerados em uma posição variável. Como é conhecido na técnica, alinhamentos de seqüência podem ser analisados usando métodos estatísticos para calcular a diversidade de seqüência em qualquer posição no alinhamento e a freqüência ou probabilidade de ocorrência de cada aminoácido na posição. Tais dados podem ser então usados para determinar quais tipos de aminoácidos devem ser considerados. Na modalidade mais simples, essas frequências de ocorrência são calculadas por contagem do número de vezes no aminoácido que são observadas em uma posição de alinhamento, então dividindo pelo número total de sequências no alinhamento. Em outras modalidades, a contribuição de cada seqüência, posição ou aminoácido para o procedimento de contagem é ponderada por uma variedade de mecanismos possíveis. Em uma modalidade preferida, a

123/261 contribuição de cada seqüência alinhada para as estatísticas de freqüência é ponderada de acordo com sua diversidade em relação a outras seqüências no alinhamento. Uma estratégia comum para realizar isso é o sistema de ponderação de seqüência recomendado por Henikoff e Henikoff (Henikoff & Henikoff, 2000, Adv Protein Chem 54:73-97; Henikoff & Henikoff, 1994, J Mol Biol 243:574-8. Em uma modalidade preferida, a contribuição de cada seqüência para a estatística é dependente da extensão de similaridade à seqüência alvo, ou seja, a estrutura modelo usada, de forma que seqüências com maior similaridade à seqüência alvo são ponderadas mais amplamente. Exemplos de de similaridade incluem, mas não se limitam a, identidade de seqüência, pontuação de similaridade BLOSUM, de similaridade de matriz

PAM, e pontuação BLAST. Em uma modalidade alternativa, para a estatística é dependente de suas propriedades físicas ou funcionais conhecidas. Essas propriedades incluem, mas nao se limitam, estabilidade térmica e química, contribuição a atividade, e solubilidade. Por exemplo, quando da otimização de Fc aglicosilado para solubilidade, aquela conhecidas por serem e cols., 2003, J Mol seqüências em um alinhamento que são mais solúveis (por exemplo veja Ewert

Biol 325:531-553), contribuirão mais fortemente para as freqüências calculadas.

A despeito de quais critérios são aplicados para escolha do conjunto de aminoácidos no alinhamento de seqüência a ser considerado em posições variáveis, o uso de informação de seqüência para escolher aminoácidos considerados tem amplo uso na presente invenção. Por

124/261 exemplo, para otimizar solubilidade de Fc por substituição de resíduos de superfície não polares expostos, aminoácidos considerados podem ser escolhidos como o conjunto de aminoácidos, ou um subconjunto daqueles aminoácidos que estão de acordo com algum critério, que são observados naquela posição em um alinhamento de seqüências de proteína. Como um outro exemplo, um ou mais aminoácidos podem ser adicionados ou subtraídos subjetivamente de uma lista de aminoácidos derivados da alinhamento de seqüência para maximizar a cobertura.

Por exemplo, aminoácidos adicionais com propriedades similares àquelas que são encontradas em um alinhamento de seqüência podem ser considerados em posições variáveis.

Por exemplo, se uma ligar ou que liga hipoteticamente um FcyR é observada como tendo aminoácidos usuário pode escolher carregados computacional, em um alinhamento de incluir aminoácidos adicionais ou talvez seqüência, o polares não em um cálculo de escolha aminoácidos polares carregados,

Em uma modalidade, de alinhamento de seqüência é combinada com cálculo de energia, como discutido abaixo. Por exemplo, pseudo energias podem ser derivadas de seqüência para gerar uma função uso de uma baseada em seqüência pode ajudar reduzir significativamente a complexidade de um cálculo.

No entanto, como é observado por uma pessoa habilitada na técnica, o uso de uma função de pontuação baseada em seqüência isoladamente pode ser inadequado porque a informação de seqüência pode indicar

125/261 freqüentemente correlações equivocadas entre mutações que podem na realidade serem estruturalmente conflitantes. Assim, em uma modalidade preferida, o método baseado em estrutura de cálculo de energia é usado, isoladamente ou em combinação com uma função de pontuação baseada em seqüência. Ou seja, modalidades preferidas não se baseiam em informação de alinhamento de seqüência isoladamente como ma etapa de análise.

cálculo de energia se refere ao processo pelo qual modificações de aminoácido são pontuadas. As energias de interação são medidas por uma ou mais funções de pontuação. Uma variedade de funções de pontuação têm uso na presente invenção for cálculo de energia. Funções de pontuação podem incluir qualquer número de potenciais, aqui referidos como o termo de energias de uma função de pontuação, incluindo mas não limitadas potencial de van der Waals, potencial de ligação de hidrogênio, um potencial de solvação atômica ou outros modelos de solvação, um potencial de propensão estrutural secundário, um potencial eletrostático, um potencial torsional, e um potencial de entropia. Pelo menos um termo de energia é usado para pontuar cada variável ou posição flutuante, embora o termo de energias possam diferir dependendo da posição, aminoácidos considerados, e outras considerações. Em uma modalidade, uma função de pontuação que usa um termo de energia é usada. Na modalidade mais preferida, energias são calculadas usando uma função de pontuação que contém mais que um termo de energia, por exemplo descreve interações de ligação de van der Waals, solvação, eletrostática, e de hidrogênio, e combinações dessas. Em modalidades adicionais, termos de

126/261 energia adicionais incluem mas não se limitam a termos entrópicos, energias torsionais, e energias baseadas em conhecimento.

Uma variedade de funções de pontuação é descrita em US 6.188.965; US 6.269.312; US 6.403.312; USSN 09/782.004; USSN 09/927.790; USSN 09/877.695; USSN 10/071.859. USSN 10/218.102; PCT WO 98/07254; PCT WO 01/40091; e PCT WO 02/25588. como será observado pela pessoa habilitada na técnica, funções de pontuação não precisam ser limitadas a termos de energias físico-químicos. Por exemplo, potenciais baseados em conhecimento podem ter uso na escolha de metodologia computacional da presente invenção. Tais potenciais baseados em conhecimento podem ser derivadas de seqüência de proteína e/ou estatística de estrutura incluindo mas não limitadas a potências de movimento, energias de referência, pseudo energias, energias baseads em homologia, e inclinações de seqüências derivados de alinhamentos de seqüência. Em uma modalidade preferida, a função de pontuação é modificada para incluir modelos para imunogenicidade, como funções derivadas de dados na ligação de peptídeos a MHC (Major Htocompatability Complex), que podem ser usadas para identificar seqüências potencialmente imunogênicas (veja, por exemplo USSN 09/903.378; USSN 10/039.170; USSN 60/222.697; USSN 10/339788; PCT WO 01/21823; e PCT WO 02/00165). Em uma modalidade, informação de alinhamento de seqüência pode ser usada para pontuar substituições de aminoácidos. Por exemplo, comparação de seqüência de proteínas, a despeito da fonte dessas proteínas ser humana, de macaco, camundongo, ou pode ser usada para sugerir ou pontuar mutações de aminoácido na

127/261 metodologia de escolha computacional da presente invenção. Em uma modalidade, como é conhecido na técnica, uma ou mais funções de pontuação podem ser otimizadas ou treinadas durante a análise computacional, e então a análise referita usando o sistema otimizado. Tais funções de pontuação alteradas podem ser obtidas por exemplo, por treinamento de uma função de pontuação usando dados experimentais. Como será observado por aqueles habilitados na técnica, inúmeros campos de força, que compreendem um ou mais termos de energias, podem servir como funções de pontuação. Campos de força incluem mas não se limitam a campos de força mecânicos ab initio ou quantum, campos de força semiempíricos, e campos de força mecânicos moleculares. Funções de pontuação que são baseadas em conhecimento ou que usam métodos estatísticos podem ter uso na presente invenção. Esses métodos podem ser usados para avaliar a combinação entre a seqüência e a estrutura tridimensional da proteína, e portanto podem ser usados para pontuar substituições de aminoácidos por fidelidade à estrutura da proteína. Em uma modalidade, cálculos de dinâmica molecular podem ser usados para pontuar de forma computacional seqüências por cálculo individual das pontuações da seqüência mutante.

Há uma variedade de modos para representar aminoácidos para permitir cálculo de energia eficiente. Em uma modalidade preferida, aminoácidos considerados são representados como rotâmeros, como descrito anteriormente, e a energia (ou pontuação) da interação de cada rotâmetro possível em cada posição variável e flutuante com os outros rotâmeros variáveis e flutuantes, com resíduos de posição fixa, e com a estrutura e quaisquer átomos não

128/261 proteicos, é calculada. Em uma modalidade preferida, dois conjuntos de energias de interação são calculados para cada rotâmetro de cadeia lateral toda posição variável e flutuante: a energia de interação entre o rotâmetro e os átomos fixos (a energia única), e a energia de interação entre o rotâmetro de posições variáveis e flutuantes e todos os outros rotâmeros possíveis em cada outra posição variável e flutuante (a energia dupla). Em uma modalidade alternativa, energias única e dupla são calculadas para posições fixas assim como para posições variáveis e flutuantes. Em uma modalidade alternativa, aminoácido considerados não são representados como rotâmeros.

Um importante componente da escolha computacional é a identificação de uma ou mais seqüências que têm uma pontuação favorável, ou seja, são baixas em energia. A determinação de um conjunto de seqüências de baixa energia de um número extremamente grande de possibilidades não é trivial, e para resolver esse problema um algoritmo de otimização combinatória é empregado. A necessidade por um algoritmo de otimização combinatória é ilustrada por exame do número de possibilidade que são consideradas em um cálculo típico de escolha computacional. A natureza distinta dos conjuntos de rotâmetro permite um cálculo simples do número de seqüências rotaméricas possíveis para um problema de projeto dado. Uma estrutura de comprimento n com rotâmeros possíveis m por posição terão mⁿ possíveis seqüências de rotâmetro, um número que cresce exponencialmente com comprimento da seqüência. Para cálculos muito simples, é possível examinar cada possível seqüência para identificar a seqüência ótima e/ou uma ou

129/261 mais seqüências favoráveis. No entanto, para um problema típico de projeto, o número de seqüências possíveis (até 1080 ou mais) é tão grande que o exame de cada seqüência possível é inviável. Uma variedade de algoritmos de otimização combinatória pode então ser usada para identificar a seqüência ótima e/ou uma ou mais seqüências favoráveis. Os algoritmos de otimização combinatória podem ser divididos em duas classes: (1) aqueles que garantem retorno à configuração de energia global mínima se eles convergem, e (2) aqueles que não garantem retorno à configuração de energia global mínima, mas que sempre devolvem uma solução. Exemplos da primeira classe de algoritmos incluem mas não se limitam a Dead-End Elimination (DEE) e Branch & Bound (B&B) (incluindo Branch and Terminate) (Gordon & Mayo, 1999, Structure Fold Des 7:1089-98). Exemplos da segunda classe de algoritmos incluem, mas não se limitam a, Monte Cario (MC) , campo médio auto-consistente (SCMF), amostragem de Boltzmann (Metropolis e cols., 1953, J Chem Phys 21:1087), enrijecimento simulado (Kirkpatrick e cols., 1983, Science, 220:671-680), algoritmo genético (GA), e Topologia de Cadeia Lateral Precisa e Rápida e Refinamento de Energia (FASTER) (Desmet, e cols., 2002, Proteins, 48:31-43). Um algoritmo de otimização combinatória pode ser usado isoladamente ou em conjunto com um outro algoritmo de otimização combinatória.

Em uma modalidade da presente invenção, a estratégia para aplicação de um algoritmo de otimização combinatória é encontrar a configuração de energia global mínima. Em uma modalidade alternativa, a estratégia é encontrar uma ou

130/261 mais seqüências de baixa energia ou favoráveis. Em uma modalidade alternativa, a estratégia é encontrar a configuração de energia global mínima e então encontrar uma ou mais seqüências de baixa energia ou favoráveis. Por exemplo, como apontado em USSN 6.269.312, modalidades preferidas utilizam uma etapa Dead End Elimination (DEE) e uma etapa Monte Cario. Em outras modalidades, algoritmos de pesquisa proibidos são usados ou combinados com DEE e/ou Monte Cario, entre outros métodos de pesquisa (veja Modern Heuristic Search Methods, editado por V.J. Rayward-Smith e cols., 1996, John Wiley & Sons Ltd.; USSN 10/218.102; e PCT WO 02/25588) . Em uma outra modalidade preferida, um algoritmo genético pode ser usado; veja, por exemplo USSN 09/877.695 e USSN 10/071.859. Como um outro exemplo, como descrito mais completamente em US

US 6.403.312; USSN 09/782.004;

6.188.965; US 6.269.312;

USSN 09/927.790; USSN

10/218.102; PCT WO 98/07254; PCT

WO

01/40091; e PCT WO

02/25588, o ótimo global pode ser processamento computacional adicional pode ocorrer, que gera seqüências otimizadas adicionais.

Na modalidade mais simples, cálculos de projeto não são combinatórios. Ou seja, cálculos de energia aminoácidos variáveis únicas.

Para outros cálculos é preferível avaliar variável. Em uma aminoácidos em mais modalidade preferida, de uma posição todas energias de interação possíveis são calculadas antes da otimização combinatória. Em uma modalidade alternativamente preferida, as energias podem ser calculadas como necessário durante otimização combinatória.

131/261

Geração de biblioteca

A presente invenção fornece métodos para geração de bibliotecas que podem ser escolhidas subseqüentemente de forma experimental para escolher variantes de Fc otimizadas. Por biblioteca como aqui usado entende-se um conjunto de uma ou mais variantes de Fc. Biblioteca pode se referir ao conjunto de variantes em qualquer forma. Em uma modalidade, a biblioteca é uma lista de sequências de ácidos nucleicos ou de aminoácidos, ou uma lista de substituições ácidos nucleicos ou de aminoácidos em posições variáveis. Por exemplo, os exemplos usados abaixo para ilustrar a presente invenção fornecem bibliotecas como substituições de aminoácidos em posições variáveis. Em uma modalidade, a biblioteca é uma lista de pelo menos uma seqüência que são variantes de Fc otimizadas para uma propriedade desejada. Por exemplo veja, Filikov e cols., 2002, Protein Sei 11:1452-1461 e Luo e cols., 2002, Protein Sei 11:1218-1226. Em uma modalidade alternativa, a biblioteca pode ser definida como uma lista combinatória, significando que uma lista de substituições de aminoácidos é gerada para cada posição variável, com a implicação que cada substituição deve ser combinada com todas as outras substituições projetadas em todas as outras posições variáveis. Nesse caso, a expansão da combinação de todas possibilidades em todas posições variáveis resulta em uma biblioteca grande explicitamente definida. A biblioteca pode se referir a uma composição física de polipeptídeos que compreendem a região de Fc ou algum domínio ou fragmento da região de Fc. Portanto, a biblioteca pode se referir a uma composição física de anticorpos ou fusões de

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Fc, em forma purificada ou não purificada. A biblioteca pode se referir a composição físicas de ácidos nucleicos que codificam a biblioteca seqüências. Os referidos ácidos nucleicos podem ser os genes que codificam os membros da biblioteca, os genes que codificam os membros da biblioteca com quaisquer ácidos nucleicos operacionalmente ligados, ou vetores de expressão que codificam os membros da biblioteca junto com quaisquer outras seqüências reguladoras operacionalmente ligadas, marcadores selecionáveis, construções de fusão, e/ou outros elementos. Por exemplo, a biblioteca pode ser um conjunto de vetores de expressão de mamífero que codificam membros da biblioteca de Fc, os produtos de proteína dos quais podem ser subseqüentemente expressos, purificados, e escolhidos experimentalmente. Como um outro exemplo, a biblioteca pode ser uma biblioteca de exibição. Tal biblioteca deve, por exemplo, compreender um conjunto de vetores de expressão que codifica membros de biblioteca operacionalmente ligados a algum parceiro de fusão que permite a disposição de fago, disposição de ribossomo, disposição de levedura, disposição de superfície bacteriana, e outros.

A biblioteca pode ser gerada usando a seqüência ou seqüências de resultado de escolha computacional. Como acima discutido, bibliotecas geradas de forma computacional são significativamente enriquecidas seqüências estáveis, adequadamente dobradas, e funcionais em relação em relação a bibliotecas aleatoriamente geradas. Como um resultado, a escolha computacional aumenta as chances de identificação de proteínas que são otimizadas para o objetivo de projeto. O conjunto de seqüências na biblioteca é geralmente, mas

133/261 não sempre, significativamente diferentes da seqüência parente, embora em alguns casos a biblioteca preferivelmente contenha a seqüência parente. Como é conhecido na técnica, há uma variedade de vias pelas quais a biblioteca pode ser derivada do resultado dos cálculos de escolha computacional. Por exemplo, métodos de geração de biblioteca descritos em US 6.403.312; USSN 09/782.004; USSN 09/927.790; USSN 10/218.102; PCT WO 01/40091; e PCT WO 02/25588 têm uso na presente invenção. Em uma modalidade, pontuações de seqüências em uma certa faixa de da seqüência global ótima podem ser incluídas na biblioteca. Por exemplo, todas as seqüências em 10 kcal/mol da seqüência de energia mais baixa podem ser usadas como uma biblioteca. Em uma modalidade alternativa, pontuações de seqüências em uma certa escala de uma ou mais seqüências mínimas locais podem ser usadas. Em uma modalidade preferida, as seqüências da biblioteca são obtidas de um conjunto filtrado. Tal lista ou conjunto pode ser gerado por uma variedade de métodos, como é conhecido na técnica, por exemplo usando um algoritmo como Monte Cario, 10³ seqüências de topo ou as conjunto filtrado podem Alternativamente, o número

B&B, ou SCMF. Por exemplo, as 10⁵ seqüências de topo no compreender a biblioteca, total de seqüências definido pela combinação de todas mutações pode ser usado como um critério de corte para a biblioteca. Valores preferidos para o número total de seqüências recombinadas varia de 10 to IO²⁰, valores particularmente preferidos variam de 100 a 10⁹. Alternativamente, um valor de corte pode ser implementado quando um número de mutações predeterminado por posição á atingido. Em algumas modalidades, seqüências

134/261 que não fazem o valor de corte são incluídas em uma biblioteca. Isso pode ser desejável em algumas situações, por exemplo, para avaliar a abordagem para geração da biblioteca, para fornecer controles ou comparações, ou para experimentar espaço de seqüência adicional. Por exemplo, a seqüência parente pode ser incluída na biblioteca, mesmo se ela não fizer o valor de corte.

Algoritmos em grupo podem ser úteis para classificação de seqüências derivadas por métodos de escolha computacional em grupos representativos. Por exemplo, os métodos de agrupamento e sua aplicação descritos em USSN 10/218.102 e PCT WO 02/25588, têm uso na presente invenção. Grupos representativos podem ser definidos, por exemplo, por similaridade. Medidas de similaridade incluem, mas não são limitadas a, similaridade de seqüência e similaridade energética. Assim as seqüências de resultado da escolha computacional podem ser agrupadas em mínimas locais, aqui referidas como conjuntos agrupados de seqüências. Por exemplo, conjuntos de seqüências que estão próximos em espaço de seqüência podem ser distintas de outros conjuntos. Em uma modalidade, cobertura em um conjunto ou um subconjunto de conjuntos agrupados pode ser maximizada por inclusão na biblioteca de algumas, da maioria ou de todas as seqüências que fazem um ou mais conjuntos agrupados de seqüências. Por exemplo, pode ser vantajoso maximizar a cobertura em um, dois ou três conjuntos agrupados de mais baixa energia por inclusão da maioria das seqüências nesses conjuntos na biblioteca. Em uma modalidade alternativa, a diversidade pelos conjuntos agrupados de seqüências pode ser mostrado por inclusão na

135/261 biblioteca apenas de um subconjunto de seqüências em cada conj unto agrupado.

Por exemplo, todos ou a conjuntos agrupados podem ser mostrados por seqüência de menor energia de cada conjunto

maioria	dos
inclusão	da
agrupado	na

biblioteca.

Informação de seqüência podem ser usadas para guiar ou da biblioteca. Como de alinhamentos de seqüências de proteínas, o grau de variabilidade na o tipos de aminoácidos que ocorrem naturalmente naquela posição podem ser observados.

Os dados obtidos de tais análises são úteis na presente de seqüência têm sido discutidos, e aqueles benefícios se aplicam igualmente ao uso de informação de seqüência para guiar biblioteca.

conjunto de aminoácidos que ocorre no alinhamento de seqüência pode ser considerado como sendo pré-escolhido por evolução por ter uma maior chance qie a aleatória de ser compatível com uma estrutura, imunogenicidade de proteína, a variedade de fontes de seqüência, assim como os foram discutidos, têm uso na aplicação da informação de seqüência para guiar a geração de biblioteca.

Do mesmo modo, como acima discutido, vários critérios podem ser aplicados para determinar a importância ou peso de certos resíduos no alinhamento. Esses métodos também têm uso na da biblioteca. 0 uso de informação de seqüência para guiar a partir dos resultados de escolha

136/261 computacional tem amplo uso na presente invenção. Em uma modalidade, informação de seqüência é usada para filtrar as seqüências de um resultado de escolha computacional. Ou de outra forma, algumas substituições são subtraídas do resultado computacional para gerar a biblioteca. Por exemplo o resultado do cálculo de escolha computacional ou cálculos pode ser filtrado de forma que a biblioteca inclua apenas aqueles aminoácidos, ou um subconjunto daqueles aminoácidos que estão de acordo com alguns critérios, por exemplo que são observados naquela posição em um alinhamento de seqüências. Em uma modalidade alternativa, informação de seqüência é usada para adicionar seqüências ao resultado da escolha computacional. Ou seja dizer que, a informação de seqüência é usada para guiar a escolha de aminoácidos adicionais que são adicionados ao resultado computacional para gerar a biblioteca. Por exemplo, o conjunto resultante de aminoácidos para uma posição dada dos cálculos de escolha computacional pode ser aumentado para incluir um ou mais aminoácidos que são observados naquela posição no alinhamento de seqüências de proteína.

Em uma modalidade alternativa, baseado na informação de alinhamento de seqüência, um ou mais aminoácidos podem ser adicionados ou subtraídos do resultado da seqüência de escolha computacional para maximizar a cobertura ou diversidade.

Por exemplo, aminoácidos adicionais com propriedades similares àquelas que são encontradas no alinhamento de seqüência podem ser adicionados biblioteca.

Por exemplo, se uma posição é observada por ter aminoácidos polares não carreados em um alinhamento de seqüência, aminoácidos polares não carreados adicionais

137/261 podem ser incluídos na biblioteca naquela posição.

Bibliotecas podem ser processadas adicionalmente para gerar bibliotecas subseqüentes. Desse modo, o resultado do cálculo da escolha computacional ou cálculos pode ser considerado como a biblioteca primária. Essa biblioteca primária pode ser combinada com outras biblioteca primárias de outros cálculos ou outras bibliotecas, processadas usando cálculos, informação de seqüência, ou outras análises subseqüentes, ou processadas experimentalmente para gerar a biblioteca subseqüente, aqui referida como uma biblioteca secundária. Como será observado a partir dessa descrição, o uso de informação de seqüência para guiar ou filtrar bibliotecas, acima discutido, é em si um método de geração de bibliotecas secundárias de biblioteca primárias. A geração de bibliotecas secundárias dá ao usuário um maior controle dos parâmetros na biblioteca.

Isso permite uma escolha experimental mais eficiente, e pode permitir feedback dos resultados experimentais para serem interpretados mais facilmente, fornecendo um ciclo de projeto/experimentação mais eficiente.

Há uma ampla variedade de métodos para gerar bibliotecas secundárias de biblioteca primárias. Por exemplo, USSN 10/218.102 e PCT WO 02/25588, descrevem métodos para geração de bibliotecas secundárias que têm uso na presente invenção. Tipicamente alguma etapa de seleção ocorre na qual a biblioteca primária é processada em algum modo. Por exemplo, em uma modalidade a etapa de seleção ocorre quando algum conjunto de seqüências primárias é escolhido para formar a biblioteca secundária. Em uma modalidade alternativa, a etapa de seleção e uma etapa

138/261 computacional, novamente incluindo geralmente uma etapa de seleção, na qual algum subconjunto da biblioteca primária é escolhido e então submetido a análise computacional posterior, incluindo tanto escolha computacional quanto técnicas como embaralhamento in silico ou recombinação (veja, por exemplo US 5.830.721; US 5.811.238; US 5.605.793; e US 5.837.458, PCR propensa a erro, por exemplo usando nucleotídeos modificados; técnicas conhecidas de mutagênese incluindo o uso de multi-cassetes; e embaralhamento de DNA (Crameri e cols., 1998, Nature 391:288-291; Coco e cols., 2001, Nat Biotechnol 19:354-9; Coco e cols., 2002, Nat Biotechnol, 20:1246-50), amostras de DNA heterogêneo (US 5.939.250); ITCHY (Ostermeier e cols., 1999, Nat Biotechnol 17:1205-1209); StEP (Zhao e cols., 1998, Nat Biotechnol 16:258-261), GSSM (US 6.171.820 e US 5.965.408); recombinação homóloga in vivo, montagem de gene assistida por ligase, PCR complementar final, profusão (Roberts & Szostak, 1997, Proc Natl Acad Sei USA 94:1229712302); exibição de superfície de levedura/bactéria (Lu e cols., 1995, Biotechnology 13:366-372); Seed & Aruffo, 1987, Proc Natl Acad Sei USA 84(10) :3365-3369,- Boder & Wittrup, 1997, Nat Biotechnol 15:553-557). Em uma modalidade alternativa, ocorre uma etapa de seleção que é uma etapa experimental, por exemplo quaisquer etapas de escolha de biblioteca abaixo, nas quais algum subconjunto da biblioteca primária é escolhido e então recombinado experimentalmente, por exemplo usando um dos métodos de evolução direcionada abaixo discutidos, para formar uma biblioteca secundária. Em uma modalidade preferida, a biblioteca primária é gerada e processada como apontado em

139/261

US 6.403.312.

A geração de bibliotecas subsequentes tem amplo uso na presente invenção. Em uma modalidade, diferentes

bibliotecas	primárias podem ser combinadas para gerar a
biblioteca	secundária ou subseqüente. Em uma outra
modalidade,	bibliotecas secundárias podem ser geradas por

amostragem de diversidade de seqüência em posições altamente mutáveis ou altamente conservadas. A biblioteca primária pode ser analisada para determinar quais posições de aminoácido na proteína modelo têm alta freqüência

mutacional,	e quais posições têm baixa freqüência
mutacional.	Por exemplo, posições na proteína que mostram

muita diversidade mutacional na escolha computacional podem ser fixadas em um ciclo subseqüente de cálculos de projeto. Um conjunto filtrado do mesmo tamanho que o primeiro mostrará agora diversidade em posições que foram amplamente

conservadas	na primeira biblioteca. Alternativamente, a
biblioteca	secundária pode ser gerada por variação dos
aminoácidos	nas posições que têm altos números de mutações,

enquanto se mantém constantes as posições que não têm mutações acima de uma certa freqüência.

Essa discussão não pretende limitar a geração de

bibliotecas	subseqüentes a bibliotecas primárias a
bibliotecas	secundárias. Como será observado, bibliotecas
primárias e	secundárias podem ser também processadas para

gerar bibliotecas terciárias, bibliotecas quaternárias, e assim por diante. Desse modo, a geração de biblioteca é um processo iterativo. Por exemplo, bibliotecas terciárias

podem ser

construídas usando uma variedade de etapas

adicionais aplicadas a uma ou mais bibliotecas secundárias;

140/261 por exemplo, processamento computacional adicional pode ocorrer, bibliotecas secundárias podem ser recombinadas, ou subconjuntos de diferentes bibliotecas secundárias podem ser combinados. Em uma modalidade preferida, uma biblioteca terciária pode ser gerada por combinação de bibliotecas secundárias. Por exemplo, bibliotecas primárias e/ou secundárias que analisam diferentes partes da proteína podem ser combinadas para gerar uma biblioteca terciária que trata as partes combinadas da proteína. Em uma modalidade alternativa, as variantes da biblioteca primária podem ser combinadas com as variantes de uma outra biblioteca primária para fornecer uma biblioteca terciária combinada em menor custo computacional que a criação de um conjunto filtrado muito longo. Essa combinações podem ser usadas, por exemplo, para analisar grandes proteínas, especialmente proteínas grandes de multi-domínios, das quais Fc é um exemplo. Portanto, a descrição acima da geração de biblioteca secundária se aplica para gerar qualquer biblioteca subseqüente a uma biblioteca primária, o resultado final sendo uma primeira biblioteca que pode ser escolhida experimentalmente para obter variantes otimizadas de proteína para um objetivo de projeto. Esses exemplos são pretendem limitar a geração de bibliotecas secundárias a qualquer aplicação ou teoria particular de operação para a presente invenção. Ao contrário, esses exemplos pretendem ilustrar que a geração de bibliotecas secundárias, e bibliotecas subseqüentes como bibliotecas terciárias e assim por diante, á amplamente útil na metodologia de escolha computacional para geração de biblioteca.

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Produção e escolha experimental

A presente invenção fornece métodos para produção e escolha de bibliotecas de variantes de Fc. Os métodos descritos não pretendem limitar a presente invenção a qualquer particular aplicação ou teoria particular de operação. Ao contrário, os métodos fornecidos pretendem ilustrar que uma ou mais variantes de Fc ou uma ou mais bibliotecas de variantes de Fc podem ser produzidas e escolhidas experimentalmente para obter variantes de Fc otimizadas. Variantes de Fc podem ser produzidas e escolhidas em qualquer contexto, como uma região de Fc como definido de forma precisa nesta, um domínio ou fragmento dessa, ou um polipeptídeo maior que compreende Fc como um anticorpo ou fusão de Fc. Métodos gerais para biologia molecular, expressão, purificação, e escolha de anticorpo são descrito em Antibody Engineering, editado por Duebel & Kontermann, Springer-Verlag, Heidelberg, 2001; e Hayhurst & Georgiou, 2001, Curr Opin Chem Biol 5:683-689; Maynard & Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-76.

Em uma modalidade da presente invenção, as seqüências da biblioteca são usadas para criar ácidos nucleicos que codificam as seqüências de membro, e que podem ser então clonadas em células hospedeiras, expressas e analisadas, se desejado. Assim, podem ser feitos ácidos nucleicos, e particularmente DNA,o que codificam cada seqüência de proteína membro. Essa práticas são realizadas com o uso de procedimentos bem conhecidos. Por exemplo, uma variedade de métodos que pode ter uso na presente invenção é descrit em Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001), e

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Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons). Como será observado por aqueles habilitados na técnica, a geração de seqüências exatas para a biblioteca que compreendem um grande número de seqüências é potencialmente dispendiosa e consome muito tempo. Conseqüentemente, há uma variedade de técnicas que podem ser usadas para gerar de forma eficaz bibliotecas da presente invenção. Tais métodos que podem ter uso na presente invenção são descritos ou referidos em US 6.403.312; USSN 09/782.004; USSN 09/927.790; USSN 10/218.102; PCT WO 01/40091; e PCT WO 02/25588. tais métodos incluem mas não se limitam a métodos de montagem de gene, método baseado em PCR e métodos que usam variações de PCR, métodos baseados em reação de cadeia de ligase, métodos oligo fundidos como aqueles usados em embaralhamento sintético, métodos de amplificação propensos a erro e métodos que usam oligos com mutações aleatórias, métodos clássicos de mutagênese direcionada a sítio, mutagênese de cassete, e outros métodos de amplificação e síntese de gene. Como é conhecido na técnica, há uma variedade de kits e métodos comercialmente disponíveis para montagem de gene, mutagênese, subclonagem de vetor e outros, e tais produtos comerciais têm uso na presente invenção para geração de ácidos nucleicos que codificam membros de variante de Fc da biblioteca.

As variantes de Fc da presente invenção podem ser produzidas por cultivo de uma célula hospedeira transformada com ácido nucleico, preferivelmente um vetor de expressão, que contém ácido nucleico que codifica as variantes de Fc, sob as condições adequadas para induzir ou causar expressão da proteína. As condições adequadas para

143/261 expressão irão variar com a escolha do vetor de expressão e da célula hospedeira, e serão facilmente avaliadas por uma pessoa habilitada na técnica através de experimentação rotineira. Uma ampla variedade de células hospedeiras adequadas pode ser usada, incluindo mas não limitadas a células de mamíferos, bacterianas, células de insetos, e leveduras. Por exemplo, uma variedade de linhas de células que pode ter uso na presente invenção é descrita no catálogo de linhas de células da ATCC®, disponível pela American Type Culture Collection.

Em uma modalidade preferida, as variantes de Fc são expressas em sistemas de expressão de mamíferos, incluindo sistemas nos quais as construções de expressão são introduzidas nas células de mamíferos usando vírus como retrovírus ou adenovírus. Quaisquer células de mamíferos podem ser usadas, com células humanas, de camundongo, de rato, hamster, e células de primatas sendo particularmente preferidas. Células adequadas também incluem de células de pesquisa conhecidas, incluindo mas não limitadas a células t de Jurkat, células NIH3T3, CHO, COS, e 2 93. Em uma modalidade alternativamente preferida, as proteínas da biblioteca são expressas em células bacterianas. Sistemas de expressão bacterianos são bem conhecidos na técnica, e incluem Escherichia coli (E. coli) , Bacillus subtilis, Streptococcus cremoris, e Streptococcus lividans. Em modalidades alternativas, variantes de Fc são produzidas em células de inseto ou células de levedura. Em uma modalidade alternativa, variantes de Fc são expressas in vitro usando sistemas de tradução livres de célula. Sistemas de tradução in vitro derivados de células procarióticas (por exemplo,

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E. coli) e eucarióticas (por exemplo, germe de trigo, reticulócitos de coelho) são disponíveis e podem ser escolhidas baseado nos níveis de expressão e propriedades funcionais da proteína de interesse. Por exemplo, como observado por aqueles habilitados na técnica, tradução in vitro é requerida por algumas tecnologias de apresentação, por exemplo, apresentação de ribossomo. Em adição, as variantes de Fc podem ser produzidas por métodos de síntese química.

Os ácidos nucleicos que codificam as variantes de Fc da presente invenção podem ser incorporados em um vetor de expressão para expressar a proteína. Uma variedade de vetores de expressão pode ser utilizada para expressão da proteína. Vetores de expressão podem compreender vetores ou vetores de auto-replicação extracromossômicos que se integram em um genoma do hospedeiro. Vetores de expressão são construídos para serem compatíveis com o tipo de célula hospedeira. Assim os vetores de expressão que têm uso na presente invenção incluem mas não se limitam àqueles que permitem a expressão da proteína em células de mamíferos, bactérias, células de insetos, leveduras, e sistemas in vitro. Como é conhecido na técnica, é disponível uma variedade de vetores de expressão, comercialmente ou de outro modo, que podem ter uso na presente invenção para expressão de proteínas de variante de Fc.

Vetores de expressão tipicamente compreendem a proteína operacionalmente ligada com seqüências de controle ou reguladoras, marcadores selecionáveis, qualquer parceiro de fusão, e/ou elementos adicionais. Por operacionalmente ligado entende-se que o ácido nucleico é colocado em uma

145/261 relação funcional com uma outra seqüência de

Geralmente, esses vetores ácido nucleico.

incluem ácido nucleico regulador de transcrição tradução operacionalmente ligado ao ácido nucleico que codifica a variante de Fc, e são tipicamente adequadas para a célula hospedeira usada para expressar a proteína. Em geral, as seqüências reguladoras de transcrição e tradução podem incluir seqüências promotoras, sítios de ligação ribossômicos, interrupção de transcrição, e seqüências intensificadoras ou ativadoras. Como também é conhecido na técnica, os vetores de expressão tipicamente contêm um gene de seleção ou marcador para permitir a seleção de células hospedeiras transformadas que contêm os vetor de expressão.

na técnica e irão variar com a célula hospedeira usada.

Variantes de Fc podem ser operacionalmente ligadas a um parceiro de fusão para permitir mirar a proteína expressa, purificação, escolha, apresentação, e outros. Parceiros de fusão podem ser ligados à seqüência de variante de Fc via seqüências ligantes. A seqüência ligante compreenderá geralmente um pequeno número de aminoácidos, tipicamente menos de dez, embora ligantes mais longos possam ser usados. Tipicamente, seqüências ligantes são selecionadas por serem flexíveis e resistentes à degradação. Como será observado por aqueles habilitados na técnica, qualquer uma . de uma ampla variedade de seqüências pode ser usada como ligantes. Por exemplo, uma seqüência ligante comum compreende a seqüência de aminoácidos GGGGS (SEQ ID NO: 6).

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Um parceiro de fusão pode ser uma seqüência para mirar ou sinalizadora que direciona proteína de variante de Fc e quaisquer parceiros de fusão associados a uma localização celular desejada ou ao meio extracelular. Como é conhecido na técnica, certas seqüências sinalizadoras podem visar a proteína para ser secretada no meio de crescimento, ou no espaço periplásmico, localizado entre a membrana interna e externa da célula. Um parceiro de fusão também pode ser a seqüência que codifica um peptídeo ou proteína que permite a purificação e/ou escolha. Tais parceiros de fusão incluem mas não se limitam a rótulos de polihistidina (His-tags) (por exemplo H₆ e Η_ϊ0 ou outros rótulos para uso com Cromatografia de Afinidade de Metal imobilizada (IMAC) sistemas (por exemplo, colunas de afinidade Ni⁺²) ) , fusões de GST, fusões de MBP, Strep-tag, a seqüência alvo de biotinilação BSP da enzima bacteriana BirA, e rótulos de epitopo que são visados por anticorpos (por exemplo rótulos c-myc, flag-tags, e outros ) . Como será observado por aqueles habilitados na técnica, tais rótulos podem ser úteis para purificação, para escolha, ou ambos. Por exemplo, uma variante de Fc pode ser purificada usando um His-tag por imobilização em uma coluna de afinidade Ni⁺², e então após purificação o mesmo His-tag pode ser usado para imobilizar o anticorpo a uma placa coberta com Ni⁺² para realizar uma ELISA ou outro ensaio de ligação (como abaixo descrito) . Um parceiro de fusão pode permitir o uso de um método de seleção para escolha de variantes de Fc (veja abaixo). Parceiros de fusão que permitem uma variedade de métodos de seleção são bem conhecidos na técnica, e todos esses têm uso na presente invenção. Por exemplo, por fusão

147/261 dos membros de uma biblioteca de variante de Fc à proteína de gene III, apresentação de fago pode ser empregada (Kay e cols., Apresentação de fago of peptides and proteins: a laboratory manual, Academic Press, San Diego, CA, 1996; Lowman e cols., 1991, Biochemistry 30:10832-10838; Smith, 1985, Science 228:1315-1317). Parceiros de fusão podem permitir que variantes de Fc sejam rotuladas. Alternativamente, um parceiro de fusão pode se ligar a uma seqüência específica no vetor de expressão, permitindo que o parceiro de fusão e a variante de Fc associada sejam ligados de forma covalente ou não covalente com o ácido nucleico que os codificam. Por exemplo, USSN 09/642.574; USSN 10/080.376; USSN 09/792.630; USSN 10/023.208; USSN 09/792.626; USSN 10/082.671; USSN 09/953.351; USSN 10/097.100; USSN 60/366.658; PCT WO 00/22906; PCT WO 01/49058; PCT WO 02/04852; PCT WO 02/04853; PCT WO 02/08023; PCT WO 2625 01/28702; e PCT WO 02/07466 descrevem tal parceiro de fusão e técnica que pode ter uso na presente invenção.

Os métodos de introdução de ácido nucleico exógeno em células hospedeiras são bem conhecidos na técnica, e irão variar com a célula hospedeira usada. Técnicas incluem mas não se limitam a transfecção mediada por dextrano, precipitação de fosfato de cálcio, tratamento e cloreto de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão de protoplasto, eletroporação, infecção viral ou fago, encapsulação do polinucleotídeo(s) em lipossomos, e microinjeção direta do DNA no núcleo. No caso de células de mamíferos, a transfecção pode ser transitória ou estável.

Em uma modalidade preferida, proteínas de variante de

148/261 podem ser isoladas ou purificadas em uma variedade de modos conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Métodos padrão de incluem técnicas comatográficas, incluindo troca iônica, realizadas em pressão at atmosférica ou em pressão alta usando sistemas como FPLC e HPLC. Métodos de purificação também incluem técnicas eletroforéticas, imunológicas, de precipitação, diálise, e de foco cromático. Técnicas de ultrafiltração e diafiltração, em conjunto com concentração de proteína, também são úteis. Como é conhecido na técnica, uma variedade de proteínas naturais ligam Fc e anticorpos, e essas proteínas podem ter uso na presente invenção para purificação de variantes de Fc. Por exemplo, as proteínas A e G bacterianas se ligam à região de Fc. Do mesmo modo, a proteína L bacteriana se liga à região Fab de alguns anticorpos, como de fato também faz o antígeno de alvo em anticorpo. A purificação pode ser frequentemente realizada por um parceiro de fusão particular. Por exemplo, proteínas de variante de Fc podem ser purificadas usando resina glutationa se uma fusão de GST for empregada, cromatografia por afinidade de Ni⁺² se for empregado His-tag, ou anticorpo imobilizado anti-flag se for usado um flagtag . Para um guia geral sobre técnicas adequadas de purificação, veja Protein Purification: Principies and Practice, 3^a Ed., Scopes, Springer-ETILerlag, NY, 1994. O grau de purificação irá variar necessariamente dependendo da escolha ou uso das variantes de Fc. Em alguns casos nenhuma purificação é necessária. Por exemplo em uma

149/261 modalidade, se as variantes de Fc são secretadas, a escolha pode acontecer diretamente do meio. Como é bem conhecido na técnica, alguns métodos de seleção não envolvem a purificação das proteínas. Portanto, por exemplo, se uma biblioteca de variantes de Fc é feita na biblioteca de apresentação de fago, a purificação de proteína pode não ser realizada.

Variantes de Fc podem ser escolhidas usando uma variedade de métodos, incluindo mas não limitadas àqueles que usam ensaios in vitro, ensaios baseados em célula in vivo, e tecnologias de seleção. Tecnologias de automação e de escolha de alto rendimento podem ser utilizadas nos procedimentos de escolha. A escolha pode empregar o uso de um parceiro de fusão ou rótulo. 0 uso de parceiros de fusão foi discutido acima. Por rotulado entende-se que as variantes de Fc da invenção têm um ou mais elementos, isótopos, ou compostos químicos anexados para permitir a detecção em uma escolha. Em geral, os rótulos estão em três classes: a) rótulos imunes, que podem ser um epitopo incorporado como um parceiro de fusão que é reconhecido por um anticorpo, b) rótulos isotópicos, que podem ser radioativos ou ter isótopos, e c) rótulos de molécula pequena, que podem incluir corantes fluorescentes e colorimétricôs, ou moléculas como biotina que permitem outros métodos de rotulagem,. Os rótulos podem ser incorporados no podem ser incorporados in vitro ou in vivo durante a expressão da proteína.

Em uma modalidade preferida, as propriedades funcionais e/ou biofísicas de variantes

150/261 rastreadas em um ensaio in vitro. Ensaios in vitro podem permitir uma ampla escala dinâmica para rastreamento de propriedades de interesse. As propriedades das variantes de Fc que podem ser rastreadas incluem mas não se limitam a estabilidade, solubilidade, e afinidade for ligante de Fcs, por exemplo FcyRs. Múltiplas propriedades podem ser rastreadas simultaneamente ou individualmente. As proteínas podem ser purificadas ou não purificadas, dependendo dos requerimentos do ensaio. Em uma modalidade, o rastreamento é um ensaio de ligação qualitativo ou quantitativo para ligação de variantes de Fc à molécula de proteína ou não proteína que é conhecida por ligar a variante de Fc. Em uma modalidade preferida, o rastreamento é um ensaio de ligação que mede a ligação ao antígeno alvo do anticorpo ou fusões de Fc. Em uma modalidade alternativamente preferidas, o rastreamento é um ensaio para ligação de variantes de Fc ao ligante de Fc, incluindo mas não limitadas à família de FcyRs, o receptor neonatal FcRn, a proteína de complemento Clq, e as proteínas bacterianas A e G. Os referidos ligantes de Fc podem ser de qualquer organismo, sendo preferidos humanos, camundongos, ratos, coelhos e macacos. Ensaios de ligação podem ser realizados usando uma variedade de métodos conhecidos na técnica, incluindo mas não limitadas a ensaios baseados em FRET (Transferência Ressonante de Energia de Fluorescência) e BRET (Transferência Ressonante de Energia de Bioluminescência), AlfaScreen™ (Ensaio homogêneo de proximidade luminescente amplificado), ensaio de proximidade de cintilação, ELISA (Ensaio imunoabsorvente ligado a enzima), SPR (ressonância de plasma de superfície, também conhecido como BIANÚCLEO®),

151/261 calorimetria calorimetria exploratória diferencial, eletroforese em gel, e cromatografia incluindo filtração a gel.

Esses e outros métodos pode tomar vantagem de algum parceiro de fusão ou rótulo na variante de Fc.

Os ensaios podem empregar uma variedade de métodos de detecção incluindo mas não limitados rótulos cromogênicos, fluorescentes, luminascentes, ou isotópicos.

As propriedades biofísicas das proteínas de variantes de Fc, por exemplo estabilidade e solubilidade, podem ser rastreadas usando uma variedade de métodos conhecidos na técnica. A estabilidade da proteína pode ser determinada por medição do equilíbrio termodinâmico entre estados dobrados e não dobrados. Por exemplo, proteínas de variante de Fc da presente invenção podem ser não dobradas usando desnaturante químico, calor, ou pH, e essa transição pode ser monitorada usando métodos incluindo mas não limitados a espectroscopia de dicroísmo circular, espectroscopia de fluorescência, espectroscopia de absorvência, espectroscopia NMR, calorimetria, e proteólise. Como será observado por aqueles habilitados na técnica, os parâmetros cinéticos das transições dobradas e não dobradas também podem ser monitorados usando essa e outras técnicas. A solubilidade e integridade estrutural geral de uma proteína de variante de Fc podem ser determinadas quantitativamente ou qualitativamente usando uma ampla escala de métodos que são conhecidos na técnica. Métodos que podem ter uso na presente invenção para caracterização das propriedades biofísicas das proteínas de variante de Fc incluem eletroforese a gel, cromatografia como cromatografia de

152/261 exclusão por tamanho e cromatografia líquida de alta performance de fase reversa, espectrometria de massa, espectroscopia de absorvência ultravioleta, espectroscopia de fluorescência, espectroscopia de dicroísmo circular, calorimetria de titulação isotérmica, calorimetria exploratória diferencial, ultra-centrifugação analítica, dispersão dinâmica da luz, proteólise, e entrecruzamento, medições de turbidez, ensaios de retardo de filtração, ensaios imunológicos, ensaios de ligação de corante fluorescente, ensaios de coloração de proteína, microscopia, e detecção de agregados via ELISA ou outros ensaios de ligação. Análise estrutural que emprega técnicas cristalográficas de raios

X e espectroscopia NMR também podem ter uso.

Em uma modalidade, estabilidade e/ou solubilidade podem ser medidas por determinação da quantidade de solução de proteína após algum período definido de tempo. Nesse ensaio, a proteína pode ou não ser exposta a algumas condições extremas, por exemplo temperatura elevada, baixo pH, ou a presença de desnaturante. Pelo fato da função tipicamente requerer uma proteína estável, solúvel, e/ou bem dobrada/estruturada, os ensaios funcionais e de ligação acima mencionados também fornecem vias para realizar tal medição. Por exemplo, a solução que compreende uma variante de Fc deve ser analisada para sua capacidade de ligar antígeno alvo, então exposta a temperatura elevada por um ou mais períodos definidos de tempo, então analisada para ligação de antígeno novamente. Pelo fato da proteína não dobrada e agregada não ser capaz de ligar o antígeno, a quantidade de atividade remanescente fornece uma medida da estabilidade e

153/261 soiubilidade da variante de Fc.

Em uma modalidade preferida, a biblioteca é rastreada usando um ou mais ensaios baseados em célula ou in vivo. Para tais ensaios, proteínas de variante de Fc, purificadas ou não purificadas, são tipicamente adicionadas de forma exógena de forma que as células são expostas a variantes individuais ou conjuntos de variantes que pertencem à biblioteca. Esses ensaios são tipicamente, mas nem sempre, baseados na função de um anticorpo ou fusão de Fc que compreende a variante de Fc; que é, a capacidade do anticorpo ou fusão de Fc de se liga ao antígeno alvo e mediar algum evento bioquímico, por exemplo função efetora, inibição de ligação ligante/receptor, apoptose, e outros. Tais ensaios frequentemente envolvem a monitoração da resposta de células a anticorpo ou fusão de Fc, por exemplo sobrevivência de célula, morte celular, troca na morfologia celular, ou ativação transcricional como expressão celular de um gene natural ou gene repórter. Por exemplo, tais ensaios podem medir a capacidade de variantes de Fc para elicitar ADCC, ADCP, ou CDC. Para alguns ensaios adicional células ou componentes, ou seja, em adição às células alvo, podem precisar de adição, por exemplo complemento sérico, ou células efetoras como monócitos sanguíneos periféricos (PBMCs), células NK, macrófagos, e outras. Tais células adicionais podem ser de qualquer organismo, preferivelmente humanos, camundongos, rato, coelho, e macaco. Anticorpos e fusões de Fc podem causar apoptose de certas linhas de células que expressam o antígeno alvo do anticorpo, ou eas podem mediar ataque em células alvo por células imunes que foram adicionadas ao ensaio. Métodos para monitoração da

154/261 morte da célula ou viabilidade são conhecidos na técnica, e incluem o uso de corantes, imunoquímica, citquímica, e reagentes radioativos. Por exemplo, ensaios de coloração de caspase podem permitir que a apoptose seja medida, e retenção ou liberação substratos radioativos ou corantes fluorescentes como azul alamar podem permitir que o crescimento ou ativação celular sejam monitorados. Em uma modalidade preferida, o ensaio de citotoxicidade baseado em EuTDA DELFIA® (Perkin Elmer, MA) é usado. Alternativamente, células alvo mortas ou danificadas podem ser monitoradas por medição da liberação de uma ou mais proteínas intracelulares naturais, por exemplo lactato desidrogenase. A ativação da transcrição também pode servir como um método para avaliação da função em ensaios baseados em célula.

Nesse caso, a resposta pode ser monitorada por avaliação dos genes ou proteínas naturais que podem ser supraregulados, por exemplo a liberação de ceras interleucinas pode ser medida, ou alternativamente lida por meio de uma construção repórter. Ensaios baseados em célula também podem envolver a medida das mudanças morfológicas de células como uma resposta à presença de uma variante de Fc. Tipos de célula para tais ensaios podem ser procarióticas ou eucarióticas, e uma variedade de linhas de células que são conhecidos na técnica pode ser empregada.

Alternativamente, rastreamentos baseados em célula são realizados usando células que foram transformadas ou transfectadas com ácidos nucleicos que codificam as variantes de Fc. Ou seja, proteínas de variante de Fc não são adicionadas de forma exógena às células. Por exemplo, em uma modalidade, o rastreamento baseado em célula utiliza

155/261 apresentação de superfície de célula. Pode ser empregado um parceiro de fusão que permite a apresentação de variantes de Fc na superfície das células (Witrrup, 2001, Curr Opin Biotechnol, 12:395-399). Métodos de apresentação de superfície de célula que podem ter uso na presente invenção incluem mas não se limitam a apresentação em bactéria (Georgiou e cols., 1997, Nat Biotechnol 15:29-34; Georgiou e cols., 1993, Trends Biotechnol 11:6-10; Lee e cols., 2000, Nat Biotechnol 18:645-648; Jun e cols., 1998, Nat Biotechnol 16:576-80), levedura (Boder & Wittrup, 2000, Methods Enzymol 328:430-44; Boder & Wittrup, 1997, Nat Biotechnol 15:553-557), e células de mamíferos (Whitehorn e cols., 1995, Bio/technology 13:1215-1219). Em uma modalidade alternativa, proteínas de variante de Fc não são apresentadas na superfície das células, mas em vez disso, são rastreadas de forma intracelular ou em algum outro compartimento celular. Por exemplo, expressão periplásmica e rastreamento citométrico (Chen e cols., 2001, Nat Biotechnol 19: 537-542), o ensaio de complementação de fragmento de proteína (Johnsson & Varshavsky, 1994, Proc Natl Acad Sei USA 91:10340-10344.; Pelletier e cols., 1998, Proc Natl Acad Sei USA 95:12141-12146), e o rastreamento de dois híbridos de levedura (Fields & Song, 1989, Nature 340:245-246) podem ter uso na presente invenção. Alternativamente, se um polipeptídeo que compreende as variantes de Fc, por exemplo um anticorpo ou fusão de Fc, transmite alguma vantagem de crescimento selecionável para uma célula, essa propriedade pode ser usada para escolha ou seleção de variantes de Fc.

Como é conhecido na técnica, um subconjunto de métodos

156/261 de escolha é aquele que seleciona membros favoráveis da biblioteca. Os referidos métodos são aqui referidos como métodos de seleção, e esses métodos têm uso na presente invenção para escolha de bibliotecas de variante de Fc. Quando bibliotecas são escolhidas usando um método de seleção, apenas aqueles membros da biblioteca que são favoráveis, ou seja que estão de acordo com alguns critérios de seleção, são propagados, isolados, e/ou observados. Como será observado, pelo fato das variantes mais ajustadas serem observadas, tais métodos permitem a escolha de bibliotecas que são maiores que aquelas selecionáveis por métodos que avaliam a adequação dos membros da biblioteca individualmente. A seleção é permitida por qualquer método, técnica, ou parceiro de fusão que liga, de forma covalente ou não covalente, o fenótipo de uma variante de Fc com seu genótipo, que é a função de uma variante de Fc com o ácido nucleico que a codifica. Por exemplo o uso de apresentação de fago como um método de seleção é permitido pela fusão dos membros da biblioteca ao gene da proteína III. Desse modo, seleção ou isolação de proteínas de variante que estão de acordo com algum critério, por exemplo afinidade de ligação por qualquer FcyR, também seleciona ou isola o ácido nucleico que as codificam. Uma vez isolado, o gene ou genes que codifica variantes de Fc podem então ser amplificados. Esse processo de isolação e amplificação, referido como crítico, pode ser repetido, permitindo que variantes favoráveis de Fc na biblioteca sejam enriquecidas. 0 sequenciamento de ácido nucleico do ácido nucleico anexado permite, ao final das contas, a identificação do gene.

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Vários métodos de seleção são conhecidos na técnica e podem ter uso na presente invenção para seleção de bibliotecas de variante de Fc. Esses incluem mas não se limitam a apresentação de fago (phage display of peptides and proteis: a laboratory manual, Kay e cols., 1996, Academic Press, San Diego, CA, 1996; Lowman e cols., 1991, Biochemistry 30:10832-10838; Smith, 1985, Science 228:13151317) e seus derivados como infecção de fago seletivo (Malmborg e cols., 1997, J Mol Biol 273:544-551), fago seletivamente infeccioso (Krebber e cols., 1997, J Mol Biol 268:619-630), e crítico de infetividade retardada (Benhar e cols, 2000, J Mol Biol 301:893-904), apresentação de superfície celular (Witrrup, 2001, Curr Opin Biotechnol, 12:395-399) como apresentação em bactérias (Georgiou e cols., 1997, Nat Biotechnol 15:29-34; Georgiou e cols., 1993, Trends Biotechnol 11:6-10; Lee e cols., 2000, Nat

Biotechnol 18:645-648; Jun e cols.,

1998, Nat Biotechnol

16:576-80), levedura (Boder & Wittrup,

2000, Methods

Enzymol 328:430-44; Boder & Wittrup, 1997,

Nat Biotechnol

15:553-557), e células de mamíferos (Whitehorn e cols.,

1995, Bio/technology 13:1215-1219), assim como tecnologias de apresentação in vitro (Amstutz e cols., 2001, Curr Opin Biotechnol 12:400-405) como apresentação de polissomo (Mattheakis e cols., 1994, Proc Natl Acad Sei USA 91:90229026), apresentação de ribossomo (Hanes at aL, 1997, Proc Natl Acad Sei USA 94:4937-4942), apresentação de mRNA (Roberts & Szostak, 1997, Proc Natl Acad Sei USA 94:12297

12302; Nemoto e cols., 1997, FEBS Lett 414:405-408), e sistema de apresentação de inativacao de ribossomo (Zhou e cols., 2002, J Am Chem Soc 124, 538-543).

158/261

Outros métodos de seleção que podem ter uso na presente invenção incluem métodos que não se baseia na apresentação, como métodos in vivo incluindo mas não limitadas a expressão periplásmica e rastreamento citométrico (Chen e cols., 2001, Nat Biotechnol 19:537542), o ensaio de complementação de fragmento de proteína (Johnsson & Varshavsky, 1994, Proc Natl Acad Sei USA 91:10340-10344; Pelletier e cols., 1998, Proc Natl Acad Sei USA 95:12141-12146), e o rastreamento de dois híbridos de levedura (Fields & Song, 1989, Nature 340:245-246) usados no modo de seleção (Visintin e cols., 1999, Proc Natl Acad Sei USA 96:11723-11728). Em uma modalidade alternativa, a seleção é permitida por um parceiro de fusão que se liga a uma seqüência específica no vetor de expressão, assim ligando de forma covalente ou não covalente o parceiro de fusão e membro da biblioteca de variante de Fc associado com os ácido nucleico que o codificam.

Por exemplo,

USSN

09/642.574;

USSN

10/080.376;

USSN

09/792.630;

USSN

10/023.208;

USSN

09/792.626;

USSN

10/082.671;

USSN

09/953.351;

USSN

10/097.100;

USSN 60/366.658;

PCT

WO

00/22906; PCT WO

01/49058; PCT WO 02/04852;

PCT

WO

02/04853; PCT WO

02/08023; PCT WO 01/28702; e

PCT

WO

02/07466 descrevem um parceiro de fusão e técnica que podem ter uso na presente invenção. Em uma modalidade alternativa, a seleção in vivo pode ocorrer se a expressão de um polipeptídeo que compreende a variante de Fc, como um anticorpo ou fusão de Fc, transmite alguma reprodução de crescimento, ou vantagem de sobrevivência à célula.

Um subconjunto of métodos de seleção referido como métodos de evolução direcionada são aqueles que incluem o

159/261 emparceiramento de seqüências favoráveis durante seleção, algumas vezes com a incorporação de novas mutações. Como será observado por aqueles habilitados na técnica, métodos de evolução direcionada podem facilitar a identificação das seqüências mais favoráveis na biblioteca, e podem aumentar a diversidade de seqüências que são selecionadas. Uma variedade de métodos de evolução direcionada são conhecidos na técnica e podem ter uso na presente invenção para escolha de bibliotecas de variante de Fc, incluindo mas não limitados a embaralhamento de DNA (PCT WO 00/42561 A3 ; PCT WO 01/70947 A3) , embaralhamento de exon (US 6.365.377; Kolkman & Stemmer, 2001, Nat Biotechnol 19:423428), embaralhamento de família (Crameri e cols., 1998, Nature 391:288-291; US 6,376,246), RACHITTTM (Coco e cols., 2001, Nat Biotechnol 19:354- 359; PCT WO 02/06469), priming STEP e randômico de recombinação in vitro (Zhao e cols., 1998, Nat Biotechnol 16:258-261; Shao e cols., 1998, Nucleic Acids Res 26:681-683), montagem, de gene mediada por exonuclease (US 6.352.842; US 6.361.974), Gene

Site Saturation Mutagenesis™ (US 6.358.709), Gene Reassembly™ (US 6.358.709), SCRATCHY (Lutz e cols., 2001, Proc Natl Acad Sei USA 98:11248-11253), métodos de fragmentação de DNA (Kikuchi e cols., Gene 236:159-167), embaralhamento de DNA de filamento único (Kikuchi e cols., 2000, Gene 243:133-137), e tecnologia de engenharia de proteína de evolução direcionada AMEsystem^Tm (Applied Molecular Evolution) (US US 5.824.514; US 5.817.483; US 5.814.476; US 5.763.192; US 5.723.323).

As propriedades biológicas dos anticorpos e fusões de Fc que compreendem as variantes de Fc da presente invenção

160/261 podem ser caracterizadas em experimentos de células, tecidos, e organismos totais. Como é conhecido na técnica, medicamentos são freqüentemente testados em animais, incluindo mas não limitadas a camundongos, ratos, coelhos, cães, gatos, porcos, e macacos, para medir a eficácia para tratamento de um medicamento contra uma doença ou modelo de doença, ou para medir a farmacocinética do medicamento, a toxicidade, e outras propriedades. Os referidos animais podem ser referidos como modelos de doença. Terapêuticos são frequentemente testados em camundongos, incluindo mas não limitadas a camundongos desnudos, camundongos SCID, camundongos de xenoenxerto, e camundongos transgênicos (incluindo despertos e sonolentos). Por exemplo, um anticorpo ou fusão de Fc da presente invenção que pretendese como um terapêutico anti-câncer pode ser testado em um modelo de câncer de camundongo, por exemplo um camundongo de xenoenxerto. Nesse método, um tumor ou linha de célula tumoral é enxertado ou injetado em um camundongo, e subseqüentemente o camundongo é tratado com o terapêutico para determinar a capacidade do anticorpo ou fusão de Fc de reduzir ou inibir o crescimento do câncer. Tal experimentação pode fornecer dados significantes para a determinação do potencial do referido anticorpo ou fusão de Fc para ser usada como um terapêutico. Qualquer organismo, preferivelmente mamíferos, pode ser usado para o teste. Por exemplo devido a sua similaridade genética a humanos, macacos podem ser modelos terapêuticos adequados, e assim podem ser usados para testar a eficácia, toxicidade, farmacocinética, ou outra propriedade dos anticorpos e fusões de Fc da presente invenção. Os testes dos anticorpos

161/261 e fusões de Fc da presente invenção em humanos são finalmente requeridos para aprovação como medicamentos, e assim esses experimentos são contemplados. Portanto os anticorpos e fusões de Fc da presente invenção podem ser testados em humanos para determinar sua eficácia terapêutica, toxicidade, farmacocinética, e/ou outras propriedades clínicas.

EXEMPLOS

São fornecidos exemplos abaixo para ilustrar a presente invenção. Esses exemplos não pretendem limitar a presente invenção a qualquer aplicação particular ou teoria de operação.

Para todas as posições discutidas na presente invenção, a numeração está de acordo com o índice EU como em Kabat (Kabat e cols., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. , United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda) .

Aqueles habilitados na técnica de anticorpos regiões específicas de uma seqüência de imunoglobulina, permitindo uma referência normalizada conservadas nas famílias de imunoglobulina.

Conseqüentemente, as posições de qualquer i munoglobulina dada como definidas pelo índice

EU não necessariamente a sua seqüência seqüencial. A Figura 3 o anticorpo alemtuzumab para ilustrar esse princípio mais claramente. Deve ser também notado que polimorfismos foram observados em um número de posições de Fc, incluindo mas não limitadas a Kabat 270,

272, 312, 315, 356, e 358, e

162/261 portanto, leves diferenças entre a seqüência apresentada e seqüências na literatura cientifica podem existir.

Exemplo 1. Escolha computacional e Projeto de Bibliotecas de Fc

Cálculos de escolha computacional foram realizados para projetar variantes de Fc otimizadas. Variantes de Fc foram selecionadas de forma computacional, construídas, e experimentalmente investigadas por vários ciclos de experimentação computacional. Para cada ciclo sucessivo, dados experimentais forneceram feedback para o próximo conjunto de cálculos de escolha computacional e projeto de biblioteca. Todos os cálculos de escolha computacional e projeto de biblioteca são apresentados no Exemplo 1. para cada conjunto de cálculos, é fornecida uma tabela que apresenta os resultados e fornece informação e parâmetros relevantes.

Várias estruturas diferentes de Fc ligadas ao domínio extracelular de FcyRs serviram como estruturas modelo para os cálculos de escolha computacional. Estruturas de complexo Fc/FcyR publicamente disponíveis incluem código de acesso pdb 1E4K (Sondermann e cols., 2000, Nature 406:267273.), e código de acesso pdbs 1IIS e 1IIX (Radaevl e cols., 2001, J Biol Chem 276:16469-16477). As regiões extracelulares de FcyRIIIb e FcyRIIIa são 96% idênticas, e portanto o uso da estrutura Fc/ FcyRIIIb ê essencialmente equivalente ao uso de FcyRIIIa. Apesar de tudo, para alguns cálculos, uma estrutura modelo de Fc/FcyRIIIa mais precisa foi construída por modelagem de uma mutação D129G nas estruturas 1IIS e 1E4K (referidas como estruturas modelo D129G 1 IIS e D129G 1E4K). Em adição, as estruturas para Fc

163/261 humano ligado aos domínios extracelulares de FcyRIIb humano, F158 FcyRIIIa humano e FcyRIII de camundongo foram modelados usando métodos padrão, a informação de seqüência de FcyR disponível, as estruturas de Fc/FcyR acima mencionadas, assim como a informação estrutural para complexos não ligados (código de acesso pdb 1 H9V)(Sondermann e cols., 2001, J Mol Bicl 309:737-749) (código de acesso pdb 1 FCG) (Maxwell e cols., 1999, Nat Struct Biol 6:437-442), FcyRIIb (código de acesso pdb 2FCB) (Sondermann e cols., 1999, Embo J 18:1095-1103), e FcyRIIIb (código de acesso pdb 1 E4J) (Sondermann e cols., 2000, Nature 406 : 267-273.) .

naquelas posições foram escolhidos por inspeção visual das estruturas de Fc/FcyR e FcyR acima mencionadas, e usando de acessibilidade a solvente e seqüência.

Informação de seqüência de Fcs

FcyRs foi de variáveis nas quais substituições podem fornecer afinidades

Virtualmente todas as posições de Cy2 foram selecionadas de forma computacional. A estrutura de Fc é um homodímero de duas cadeias pesadas (cadeias rotuladas A e B nas estruturas 1IIS, 1IIX, e 1E4K) que incluem a dobradiça e domínios Cy2- Cy3 (mostrados na figura 2) . Pelo fato do FcyR (cadeia C rotulada nas estruturas 1IIS, 1IIX, e 1 E4K) se ligar assimetricamente ao homodímero de Fc, cada cadeia foi freqüentemente considerada separadamente nos cálculos de projeto. Para alguns cálculos, resíduos de Fc e/ou FcyR proximais a resíduos de posição variável eram flutuantes,

164/261 ou seja, a conformação do aminoácido mas não a identidade de aminoácido variou no cálculo de projeto da proteína para permitir ajustes de conformação. Esses são indicados abaixo da tabela para cada conjunto de cálculos quando relevantes. Aminoácido considerados tipicamente pertenceram à cada uma das classificações núcleo, núcleo XM, superfície, limite, limite XM, ou todas as 20 classificações, a menos que apontado de outro modo. Essas classificações são definidas como se segue: núcleo = alanina, valina, isoleucina, leucina, fenilalanina, tirosina, triptofano, e metionina; Núcleo XM = alanina, valina, isoleucina, leucina, fenilalanina, tirosina, e triptofano; superfície = alanina, serina, treonina, ácido aspártico, asparagina, glutamina, 2915 ácido glutâmico, arginina, lisina e histidina; limite = alanina, serina, treonina, ácido aspártico, asparagina, glutamina, ácido glutâmico, arginina, lisina, histidina, valina, isoleucina, leucina, fenilalanina, tirosina, triptofano, e metionina; limite XM = limite= alanina, serina, treonina, ácido aspártico, asparagina, glutamina, ácido glutâmico, arginina, lisina, histidina, valina, isoleucina, leucina, fenilalanina, tirosina, e triptofano; todos 20 = todos 20 aminoácidos de ocorrência natural.

A maioria dos cálculos um de dois tipos gerais de métodos de escolha computacional. Em um método, as conformações de aminoácidos em posições variáveis foram representados como um conjunto de rotâmeros de cadeia lateral independentes de estrutura derivados da biblioteca de rotâmetro de Dunbrack & Cohen (Dunbrack e cols., 1997, Protein Sei 6:1661-1681) . As energias de todas as combinações possíveis dos aminoácidos considerados nas

165/261 posições variáveis escolhidas foram calculadas usando um campo de força contendo termos que descrevem interações de van der Waals, solvação, eletrostáticas, e de ponte de hidrogênio, e a seqüência ótima (estado base) foi determinada usando um algoritmo Dead End Elimination (DEE) . Como será observado por aqueles na técnica, a seqüência de energia mais baixa prevista não é necessariamente a seqüência de energia mais baixa verdadeira devido a erros primariamente na função de pontuação, junto com o fato de que diferenças sutis de conformação nas proteínas podem resultar em diferenças dramáticas na estabilidade. No entanto, a seqüência de ground state prevista provavelmente está próxima à de ground state verdadeira, e assim diversidade adicional favorável pode ser explorada por avaliação da energia de seqüências que são próximas em espaço de seqüência e energia ao redor do ground state previsto. Para realizar isso, assim como para gerar a diversidade de seqüências para a biblioteca, um algoritmo Monte Cario (MC) foi usado para avaliar as energias de 1.000 seqüências similares ao redor do ground state previsto. 0 número de seqüências do conjunto de 1.000 seqüências que contém aquele aminoácido naquela posição variável é referido como a ocupação para aquela substituição, e esse valor pode refletir quão favorável aquela substituição é. Esse método de escolha computacional é substancialmente similar a tecnologia de Automação de Projeto de Proteína® (tecnologia PDA®), como descrito em US 6.188.965; US 6.269.312; US 6.403.312; USSN 09/782.004; USSN 09/927.790; USSN 10/218.102; PCT WO 98/07254; PCT WO 01/400;91; e PCT WO 02/25588, e para

166/261 facilidade descrição, é referida como tecnologia PDA® nos exemplos. As tabelas que apresentam os resultados desses cálculos fornecem para cada posição variável na cadeia designada (coluna 1) os aminoácidos considerados em cada posição variável (coluna 2), a identidade de aminoácido de Fc de WT (tipo selvagem) em cada posição variável (coluna 3), a identidade de aminoácido em cada posição variável na seqüência ground state de DEE (coluna 4), e o conjunto de aminoácidos e ocupação correspondente que são observados nos resultados de Monte Cario (coluna 5).

Outros cálculos utilizaram um algoritmo genético (GA) para escolha de seqüências de baixa energia, com as energias sendo calculadas durante cada ciclo de evolução para aquelas seqüências sendo testadas. As conformações dos aminoácidos em t posições variáveis e flutuantes foram representadas como um conjunto de rotâmeros de cadeia lateral derivados da biblioteca de rotâmetro independente de estrutura usando um modelo flexível de rotâmetro (Mendes e cols., 1999, Proteins 37:530-543). As energias foram calculadas usando ume ampo de força contendo termos que descrevem interações de van der Waals, solvação, eletrostáticas, e de ligação de hidrogênio. Esse cálculo gerou uma lista de 300 seqüências que são previstas para terem baixa energia. Para facilitar a análise dos resultados e geração de biblioteca, as 300 seqüências de resultado foram agrupadas de forma computacional em 10 grupos de seqüências similares usando um algoritmo de agrupamento hierárquico de ligação do visinho mais próximo único para apontar seqüências a grupos relacionados baseado nas pontuações de similaridade (Diamond, 1995, Acta Cryst

167/261

D51:12 7-135) . Ou seja, todas as seqüências em um grupo são mais similares a todas as outras seqüências no mesmo grupo e menos similares a seqüências em outros grupos. A seqüência de energia mais baixa de cada um desses dez agrupamentos são usadas como um representante de cada grupo, e são apresentadas como resultados. Esse método de escolha computacional é substancialmente similar a tecnologia de Sequence Prediction Algorithm™ (Algoritmo de Previsão de Seqüência) (SPA™) , como descrito em (Raha e cols., 2000, Protein Scí 9:1106-1119); USSN 09/877.695; e USSN 10/071.859, e para facilidad e de descrição, é referida como tecnologia SPA™ nos exemplos.

A escolha computacional foi aplicada para preojetar interações energeticamente favoráveis na interface Fc/FcyR em grupos de posições variáveis que medeiam ou potencialmente medeiam a ligação com FcyR. Porque a interface de ligação envolve um grande número de resíduo de Fcs nas duas diferentes cadeias, e porque FcyRs se liga assimetricamente a 1 Fc, os resíduos foram agrupados em diferentes conjuntos de posições variáveis que interagem, e projetados em conjuntos separados de cálculos. Em vários casos esses conjuntos foram escolhidos como grupos de resíduos que foram considerados como sendo pareados, ou seja a energia de um ou mais resíduos é dependente da identidade de um ou mais resíduos. Várias estruturas modelo foram usadas, e em vários casos os cálculos exploraram substituições em ambas cadeias. Para vários dos conjuntos de posições variáveis, os cálculos foram realizados usando métodos de escolha computacional de tecnologia PDA® e SPA™ descritos. Os resultados desses cálculos e parâmetros

168/261 relevantes e informação são apresentados nas tabelas 1-30 abaixo.

As tabelas que apresentam os resultados desses cálculos fornecem cada posição variável na cadeia designada (coluna 1) os aminoácidos considerados em cada posição variável (coluna 2), a identidade de aminoácido WT de Fc em cada posição variável (coluna 3), e a identidade de aminoácido nas posições variáveis para a seqüência de mais baixa energia de cada grupo agrupado (colunas 4-13) . As tabelas 1-59 são quebradas em dois conjuntos, como marcado abaixo, tecnologia PDA® e SPA™. A coluna 4 da tabela de PDA® mostra a freqüência de cada resíduo que ocorre nas primeiras 1.000 seqüências durante o ciclo de PDA®. Portanto, na primeira linha da tabela 1, na posição 328, quando do uso de aminoácidos de limite como o conjunto de resíduos variáveis para aquela posição, L ocorreu 330 vezes nas primeiras 1.000 seqüência, M ocorreu 302 vezes, etc.

Em adição, incluídos nas composições da invenção estão anticorpos que têm quaisquer um dos resíduos de aminoácidos listados nas posições listadas, isoladamente ou em qualquer combinação (observe que combinações preferidas são listadas nas reivindicações, no resumo e figuras). Uma combinação preferida são os resíduos de aminoácidos listados nas posições listadas em um ground state (algumas vezes aqui referido como a solução global, como distinto do tipo selvagem - WT) . De forma similar, posições de resíduo e aminoácidos particulares naquelas posições de resíduo podem ser combinados entre as tabelas.

Para as tabelas de tecnologia SPA™, como a tabela 4, a coluna 4 é um ciclo SPA™ que resulta em uma proteína com

169/261 (por exemplo, seqüência de

269Y, 270T individuais combinações coluna 4 é uma proteína única com uma tipo selvagem exceto por 239E, 265G, 267S,

299S. portanto, cada uma dessas proteínas está entre tabelas, também são proteínas SPA™, nas tabelas incluídas.

de carboidrato, mas são especificamente seqüências reversas; por exemplo, tabela 1 é e entre ausência incluídas as listada para uma variante aglicosilada, mas essa mesma mudanças de aminoácido pode ser feita em uma variante glicosilada.

Além disso, cada tabela lista a estrutura modelo usada, assim como resíduos flutuantes; por exemplo, tabela 2 usou PDA® que flutuou

C120, C132 e C134.

Tabela 1

Posição	Aminoácidos Considerados	WT	Estado base	Seqüências ao redor do Estado base
328 A	Limite	L	L	L:330 M:302 E:lll K:62 A:45 Q:39 D:36 S:30 T:28 N:10 R:7
332 A	Superfície	I	R	R:247 K:209 Q:130 H:95 E:92 T:59 D:51 N:51 S:42 A:24
328 B	Limite	L	L	L:321 M:237 T:166 K:73 T:72 S:55 Q:20 D:17 E:13 A:12 V:10 N:4
332 B	Superfície	I	E	E:269 Q:180 R:145 K:lll D:97 T:78 N:65 S:28 A:14 H:13

tecnologia PDA®, estrutura modelo 1IIS; carboidrato 170/261

Tabela 2

Posição	Aminoácidos Considerados	WT	Estado base	Seqüências ao redor do Estado base
239 A	Superfície	s	K	E:349 D:203 K:196 A:95 Q:83 S:63 N:10 R:1
265 A	Limite XM	D	D	D:616 N:113 L:110 E:104 S:25 A:23 Q:9
299 A	Limite XM	T	I	I:669 H:196 V:135
327 A	Limite XM	A	S	A:518 S:389 N:67 D:26
265 B	Limite XM	D	Q	Q:314 R:247 N:118 1:115 A:63 E:55 D:34 S:22 K:21 V:ll

tecnologia PDA®; estrutura modelo 1IIS; carboidrato +; 120

C, 132 C, 134 C flutuantes

Tabela 3

Posição	Aminoácidos Considerados	WT	Estado base	Seqüências ao redor do Estado base
239 A	Superfície	s	E	E:872 Q:69 D:39 K:16 A:4
265 A	Limite XM	D	Y	Y:693 H:lll E:69 D:62 F:29 K:19 R:14 W:2 Q:1
267 A	Limite XM	S	S	S:991 A:9
269 A	Núcleo XM	E	F	F:938 E:59 Y:3
270 A	Superfície	D	E	E:267 T:218 K:186 D:89 Q:88 R:46 S:34 N:29 H:23 A:20
299 A	Limite XM	T	H	H:486 T:245 K:130 E:40 S:39 D:27 Q:27 A:4 N:2

tecnologia PDA®; estrutura modelo 1IIS; carboidrato

C, 122 C, 132 C, 133 C, 134 C flutuantes

120

171/261

Tabela 4

Posição

Aminoácidos Considerados

WT

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

239 A

Superfície

s

E

Q

Q

Q

E

E

E

Q

E

E

265 A

Todos 20

D

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

267 A

Todos os 20

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

269 A

Núcleo

E

Y

Y

A

A

V

Y

A

A

A

A

270 A

Superfície

D

T

S

A

S

T

T

T

A

A

A

299 A

Todos os 20

T

s

S

S

S

s

S

S

S

S

S

tecnologia SPA®; estrutura modelo 1IIS; carboidrato +; 120

C, 122 C, 132 C, 133 C, 134 C flutuantes

Tabela 5

Posição	Considerados Aminoácidos	WT	Estado base	Sequências ao redor do Estado base
235 A	Limite XM	L	T	T:195 V:131 L:112 W:107 K:85 F:66 Y:56 E:52 Q:38 S:37 1:34 R:29 H:26 N:23 D:9
296 A	Superfície	Y	N	N:322 D:181 R:172 K:76 Y:70 Q:59 E:48 S:40 H:20 T:ll A:1
298 A	Superfície	s	T	T:370 R:343 K:193 A:55 S:39
235 B	Limite XM	L	L	L:922 1:78

tecnologia PDA®; estrutura modelo 1IIS; carboidrato 119 C, 128 C, 157 C flutuantes

Tabela 6

Posição

Aminoácidos Considerados

WT

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

235 A

Todos os 20

L

s

S

P

S

S

S

S

S

S

s

296 A

Superfície

Y

Q

Q

Q

E

E

Q

E

Q

Q

N

298 A

Superfície

S

s

K

K

K

K

S

S

S

K

S

172/261

235 B

Todos os 20

L

K

K

K

L

L

L

L

L

L

K

tecnologia SPA®; estrutura modelo 1IIS; carboidrato +; 119

C, 128 C, 157 C flutuantes

Tabela 7

Posição	Considerados Aminoácidos	WT	Estado base	Seqüências ao redor do Estado base
239 B	Superfície	s	E	K:402 E:282 H:116 T:67 R:47 Q:39 D:26 A:ll S:7 N:3
265 B	Limite XM	D	W	Y:341 W:283 1:236 V:77 F:36 H:9 T:7 E:4 K:4 A:2 D:1
327 B	Limite XM	A	R	R:838 K: 86 H:35 E:12 T:10 Q:7 A:6 D:3 N:3
328 B	Núcleo XM	L	L	L: 1000
329 B	Núcleo XM	P	P	P:801 A:199
330 B	Núcleo XM	A	Y	Y:918 F:42 L:22 A:18
332 B	Superfície	I	I	1:792 E:202 Q:5 K:1

tecnologia PDA®; estrutura modelo 1IIS; carboidrato 88

C, 90 C, 113 C, 114 C, 116 C, 160 C, 161 C flutuantes

Tabela 8

Posição

Aminoácidos Considerados

WT

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

239 B

Superfície

s

D

T

E

E

E

E

E

E

E

E

265 B

Todos os 20

D

G

G

K

G

K

G

G

K

K

G

327 B

Todos os 20

A

K

M

L

L

N

L

K

L

L

L

328 B

Núcleo

L

M

M

M

L

A

M

L

M

L

L

329 B

Núcleo

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

330 B

Núcleo

A

L

A

A

A

A

A

A

A

A

A

332 B

Superfície

I

I

Q

I

I

Q

Q

E

D

I

I

173/261

SPA® tecnologia; estrutura modelo 1IIS; carboidrato + ; 88 C, 90 C, 113 C, 114 C, 3035 116 C, 160 C, 161 C flutuantes

Tabela 9

Posição

Aminoácidos Considerados

WT

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

239 A

Superfície

s

Q

Q

Q

E

Q

E

Q

E

Q

Q

265 A

Todos os 20

D

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

299 A

Todos os 20

T

S

S

A

S

S

S

S

S

S

S

327 A

Todos os 20

A

A

S

S

S

S

S

S

S

A

S

265 B

Todos os 20

D

N

G

G

G

G

G

G

G

G

G

tecnologia SPA®; estrutura modelo 1IIS; carboidrato -; 120

C, 132 C, 134 C flutuantes

Tabela 10

Posição	Aminoácidos Considerados	WT	Estado base	Seqüências ao redor do Estado base
234 A	Limite XM	L	K	Y:401 L:260 F:151 1:82 K:63 H:17 Q:ll W:7 R:3 T:2 E:2 V:1
235 A	Limite XM	L	L	W:777 L:200 K:12 Y:5 1:3 F:2 V: 1
234 B	Limite XM	L	W	W:427 Y:203 L:143 F:74 1:59 E:32 K:23 V:14 D:10 T:7 H:4 R:4
235 B	Limite XM	L	W	W:380 Y:380 F:135 K:38 L:26 E:15 Q:12 H:8 R:4 T:2

tecnologia PDA®; estrutura modelo D129G 1E4K; carboidrato ; 113 C, 116 C, 132 C, 155 C, 157 C flutuantes

174/261

Tabela 11

Posição

Aminoácidos Considerados

WT

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

234 A

Todos os 20

L

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

235 A

Todos os 20

L

T

L

L

L

L

L

L

L

T

L

234 B

Todos os 20

L

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

235 B

Todos os 20

L

S

A

S

A

A

S

S

S

A

A

tecnologia SPA®; estrutura modelo D129G 1E4K; carboidrato +; 113 C, 116 C, 132 C, 155 C, 157 C flutuantes

Tabela 12

Posição	Aminoácidos Considerados	WT	Estado base	Seqüências ao redor do Estado base
239 A	Limite XM	s	E	E:235 S:122 D:94 Q:93 A:74 K:70 L:67 T:63 N:57 R:51 1:29 V:18 W:15 H:12
328 A	Limite XM	L	L	L:688 E:121 K:43 Q:41 A:33 D:26 S:14 T:14 N:12 R:8
332 A	Limite XM	I	W	1:155 W:95 L:82 K:79 E:74 Q:69 H:67 V:63 R:57 T:57 D:45 S:43 N:42 A:35 F:19 Y:18

tecnologia PDA®; estrutura modelo D129G 1IIS; carboidrato ; 120 C flutuante

Tabela 13

Posição

Aminoácidos Considerados

WT

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

239 A

Todos os 20

s

L

E

E

Q

E

E

K

K

K

K

328 A

Todos os 20

L

L

Q

L

Q

K

L

L

Q

K

L

332 A

Todos os 20

I

K

K

L

Q

A

K

L

Q

A

Q

SPA® tecnologia; estrutura modelo D129G 1IIS; carboidrato +; 120 C flutuante

175/261

Tabela 14

Posição	Aminoácidos Considerados	WT	Estado base	Seqüências ao redor do Estado base
239 B	Limite XM	s	I	R:195 1:169 L:126 V:91 K:89 E:61 H:52 T:50 Q:42 N:35 S:34 D:30 A:26
328 B	Limite XM	L	L	L.-671 T.-165 K:40 S:38 E:28 R:17 Q:17 V:ll A:8 D:5
332 B	Limite XM	I	I	1:387 E:157 L:151 V:78 Q:63 K:50 R:33 T:29 D:25 A:12 N:8 S:6 W:1

tecnologia PDA®; estrutura modelo D129G 1IIS; carboidrato ; 90 C, 160 C, 161 C flutuantes

Tabela 15

Posição

Aminoácidos Considerados

WT

2

3

4

5

6

7

8

9

10

239 B

Todos os 20

s

T

L

L

L

L

L

L

L

L

L

328 B

Todos os 20

L

M

R

M

D

T

M

L

Q

D

L

332 B

Todos os 20

I

I

D

Q

Q

Q

L

L

T

Q

L

tecnologia SPA®; estrutura modelo D129G 1IIS; carboidrato +; 90 C, 160 C, 161 C flutuantes

Tabela 16

Posição	Aminoácidos Considerados	WT	Estado base	Seqüências ao redor do Estado base
239 B	Limite XM	s	T	T:164 S:159 L:156 E:86 W:76 K:71 D:65 A:52 R:43 H:38 Q:38 N:31 1:14 V:7
328 B	Limite XM	L	L	L:556 E:114 T:84 K:80 S:69 Q:36 A:31 D:15 R:ll N:4

176/261

332 B

Limite XM

I

w

1:188 W:177 E:97 L:94 T:59 Q:57 V:54 K:52 F:51 D:34 H:33 S:27 R:26 N:18 A:17 Y: 16

tecnologia PDA®; estrutura modelo D129G 1E4K; carboidrato ; 117 C flutuante

Tabela 17

Posição

Aminoácidos Considerados

WT

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

239 B

Todos os 20

s

P

s

P

E

L

L

L

L

L

L

328 B

Todos os 20

L

K

K

K

K

K

L

K

K

K

L

332 B

Todos os 20

I

s

s

E

L

L

L

E

L

L

L

tecnologia SPA®; estrutura modelo D129G 1E4K; carboidrato +; 117 C flutuante

Tabela 18

Posição	Aminoácidos Considerados	WT	Estado base	Seqüências ao redor do Estado base
239 A	Limite XM	s	L	K:196 L:171 1:146 E:88 V:76 R:75 T:50 H:45 D:43 Q:39 S:30 N:22 A:19
328 A	Limite XM	L	W	L:517 F:230 W:164 H:40 K:29 E:ll R:5 T:4
332 A	Limite XM	I	E	1:283 L:217 E:178 Q:81 V:64 D:47 T:35 K:27 W:18 R:12 A:10 Y:7 N:7 F:6 S:5 H:3

tecnologia PDA®; estrutura modelo D129G 1E4K; carboidrato ; 87 C, 157 C, 158 C flutuantes

177/261

Tabela 19

Posição

Aminoácidos Considerados

WT

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

239 A

Todos os 20

s

F

Q

E

T

P

P

T

P

P

P

328 A

Todos os 20

L

K

R

R

K

K

M

R

K

M

R

332 A

Todos os 20

I

L

L

I

I

E

I

E

E

I

I

tecnologia SPA®; estrutura modelo D129G 1E4K; carboidrato + átomos; 87 C, 157 C, 158 C flutuantes

Tabela 20

Posição	Aminoácidos Considerados	WT	Estado base	Seqüências ao redor do Estado base
240 A	Núcleo + Thr	V	V	V:698 M:162 T:140
263 A	Núcleo + Thr	V	V	V:966 T:34
266 A	Núcleo + Thr	V	V	V:983 T:17
325 A	Limite	N	N	N:943 T:40 A:17
328 A	Limite	L	L	L:610 M:363 K:27
332 A	Glu	I	E	E:1000

tecnologia PDA®; estrutura modelo D129G 1IIS; carboidrato ; 273 A, 275 A, 302 A, 3075 323 A, 134 C flutuantes

Tabela 21

Posição

Aminoácidos Considerados

WT

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

240 A

Todos os 20

V

V

A

V

V

V

V

V

V

V

V

263 A

Todos os 20

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

266 A

Todos os 20

V

I

V

I

I

T

V

V

V

V

325 A

Todos os 20

N

A

N

N

N

Q

T

T

Q

N

T

328 A

Todos os 20

L

K

K

L

K

L

K

L

L

L

332 A

Glu

I

D

D

D

D

D

D

D

D

D

D

tecnologia SPA®; estrutura modelo D129G 1IIS; carboidrato

178/261 +; 273 A, 275 A, 302 A, 323 A, 134C flutuantes

Tabela 22

Posição	Aminoácidos	WT	Estado	Seqüências ao redor do
	Considerados		base	Estado base
240 B	Núcleo + Thr	V	V	V:713 T:287
263 B	Núcleo + Thr	V	V	V:992 T:8
266 B	Núcleo + Thr	V	V	V:976 T:24
325 B	Limite	N	N	N:453 T:296 A:116 D:96 S:30
				V: 9
328 B	Limite	L	L	L:623 M:194 T:100 R:72 K:ll
332 B	Glu	I	E	E:1000

tecnologia PDA®; estrutura modelo D129G 1IIS; carboidrato ; 273 B, 275 B, 302 B, 323 B, 161 C flutuantes

Tabela 23

Posição

Aminoácidos Considerados

WT

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

240 B

Todos os 20

V

A

T

A

T

T

A

A

T

T

T

263 B

Todos os 20

V

V

A

A

T

T

V

V

T

A

T

266 B

Todos os 20

V

V

V

V

V

V

V

V

V

I

V

325 B

Todos os 20

N

N

K

K

N

K

K

N

N

N

N

328 B

Todos os 20

L

R

L

L

L

L

L

L

L

L

L

332 A

Glu

I

D

D

D

D

D

D

D

D

D

D

tecnologia SPA®,· estrutura modelo D129G 1IIS; carboidrato +; 273 B, 275 B, 302 B, 323 B, 161 C flutuantes

Tabela 24

Posição	Aminoácidos Considerados	WT	Estado base	Seqüências ao redor do Estado base
240 B	Núcleo + Thr	V	M	V:715 M:271 T:12 1:2
263 B	Núcleo + Thr	V	V	V:992 T:8

179/261

266 B	Núcleo + Thr	V	V	V:996 T:4
325 B	Limite	N	N	N:651 T:232 D:64 A:53
328 B	Limite	L	M	M:556 L:407 K:37
332 B	Glu	I	E	E:1000

tecnologia PDA®; estrutura modelo D129G 1E4K; carboidrato ; 273 B, 275 B, 302 B, 323 B, 131 C flutuantes

Tabela 25

Posição

Aminoácidos Considerados

WT

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

240 B

Todos os 20

V

T

A

T

A

A

A

A

T

A

A

263 B

Todos os 20

V

T

W

T

T

A

T

T

T

L

L

266 B

Todos os 20

V

L

A

T

T

V

L

T

T

L

V

325 B

Todos os 20

N

A

N

A

A

N

A

A

A

A

A

328 B

Todos os 20

L

L

K

L

L

L

L

L

L

L

L

332 A

Glu

I

D

D

D

D

D

D

D

D

D

D

Tecnologia SPA®; estrutura modelo D129G 1E4K; carboidrato +; 273 B, 275 B, 302 B, 3095 323 B, 131 C flutuantes

Tabela 26

Posição	Aminoácidos	WT	Estado	Seqüências ao redor do
	Considerados		base	Estado base
240 A	Núcleo + Thr	V	V	V:876 T:109 M:15
263 A	Núcleo + Thr	V	V	V:913 T:87
266 A	Núcleo + Thr	V	V	V:969 T:31
325 A	Limite	N	V	V:491 N:236 T:187 A:35 D:32
				S:19
328 A	Limite	L	L	L:321 W:290 M:271 F:49 K:46
				R:23
332 A	Glu	I	E	E:1000

tecnologia PDA®; estrutura modelo D129G 1E4K; carboidrato 180/261 ; 273 A, 275 A, 302 A, 323 A, 158 C flutuantes

Tabela 27

Posição

Aminoácidos Considerados

WT

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

240 A

Todos os 20

V

A

T

A

A

T

T

A

A

A

T

263 A

Todos os 20

V

T

T

V

V

T

V

L

L

V

T

266 A

Todos os 20

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

325 A

Todos os 20

N

Q

N

Q

Q

Q

Q

Q

Q

N

N

328 A

Todos os 20

L

K

M

K

K

K

K

K

K

K

K

332 A

Glu

I

D

D

D

D

D

D

D

D

D

D

tecnologia SPA®; estrutura modelo D129G 1E4K; carboidrato +; 273 A, 275 A, 302 A, 323 A, 158 C flutuantes

Cálculos de para o projeto conformação do escolha computacional de variantes de Fc carboidrato N297 e foram direcionados para otimizar a do domínio Cy2.

Explorando-se substituições energeticamente favoráveis em posições que interagem com o carboidrato, podem ser projetadas variantes que mostram novas conformações de carboidrato, potencialmente favoráveis. Resíduos de Fc F241, F243, V262, e V264 medeiam a interação Fc/carboidrato e, dessa forma, são posições-alvo. Os resultados desses cálculos de design são apresentados na Tabela 28.

Tabela 28

Posição	Aminoácidos Considerados	WT	Estado base	Seqüências ao redor do Estado base
241 A	Núcleo	F	Y	Y:172 M:162 L:144 F:140 W:110 I:97 A:91 V:84
243 A	Núcleo	F	Y	Y:211 L:204 W:199 F:160 M:141 A:85
262 A	Núcleo	V	M	M:302 1:253 V:243 A:202

181/261

264 A	Núcleo	V	F	1:159 M:152 V:142 L:140
				W:136 F:120 Y:104 A:47

tecnologia PDA®, estrutura modelo 1IIS; carboidrato Cálculos de escolha computacional foram direcionados para o projeto de variantes de Fc para otimizar o ângulo entre os domínios Cy3 e Cy2 . Os resíduos P244, P245, P247 e 5 W313, que se localizam na interface Cy2/Cy3, parecem desempenhar um papel-chave na determinação do ângulo Cy2Cy3 e da flexibilidade dos domínios em relação um ao outro. Explorando-se substituições energeticamente favoráveis nessas posições, podem ser projetadas variantes que mostram 10 novos ângulos e níveis de flexibilidade potencialmente favoráveis. Os resultados desses cálculos de design são apresentados na Tabela 29.

Tabela 29

Posição	Aminoácidos Considerados	WT	Estado base	Seqüências ao redor do Estado base
244 A	Limite	P	H	K:164 H:152 R:110 M:100 S:92 N:57 A:54 D:50 Q:49 T:46 E:37 V:30 L:27 W:23 F: 9
245 A	Limite	P	A	A:491 S:378 N:131
247 A	Limite	P	V	V:156 T:125 K:101 E:87 Q:79 R:78 S:76 A:72 D:72 H:60 M:47 N:47
313 A	Limite	w	W	W:359 F:255 Y:128 M:114 H:48 K:29 T:24 A:ll E:10 V:10 S:9 Q:3

tecnologia PDA®; estrutura modelo 1IIS; carboidrato 15

Além dos cálculos acima usando os métodos de escolha

182/261 computacional PDA® e SPA®, foram usados cálculos adicionais usando somente um potencial eletrostático para escolha computacional de variantes de Fc. Os cálculos com a lei de Coulomb e com a escala de Debye-Huckel enfatizou inúmeras posições em Fc para as quais substituições de aminoácidos afetariam favoravelmente a ligação a um ou mais de FcyRs, incluindo posições para as quais a substituição de um aminoácido neutro por um aminoácido carregado negativamente poderia aumentar a ligação a FcyRIIIa, e para as quais a substituição de um aminoácido carregado positivamente por um aminoácido neutro ou carregado negativamente poderia aumentar a ligação a FcyRIIIa. Esses resultados são apresentados na Tabela 30.

Tabela 30

Substituição de um resíduo + Por um resíduo -	Substituição de um resíduo neutro por um resíduo -
H268	S239
K326	Y296
K334	A327
	1332

Lei de Coulomb e escala de Debye-Huckel; estrutura modelo

1IIS; carboidrato +

Foram realizados cálculos de escolha computacional para otimizar Fc aglicosilado, ou seja, para otimizar a estrutura, estabilidade, solubilidade de Fc, e a afinidade de Fc/FcyR na ausência do carboidrato N2 97. Os cálculos de projeto foram direcionados para o projeto de substituições favoráveis no contexto da estrutura modelo de Fc aglicosilado no resíduo 297, resíduos proximais a ele, resíduos na interface Fc/FcyR, e resíduos na interface

183/261

Fc/carboidrato. Posições variáveis foram agrupadas em conjuntos diferentes de posições variáveis interativas e projetadas em conjuntos separados de cálculos, e foram usados vários modelos de estrutura. Para muitos dos 5 conjuntos de posição variável, os cálculos foram realizados usando os métodos de escolha computacional PDA® e SPA®. Os resultados desses cálculos e informações relevantes são apresentados na Tabelas 31-53 abaixo.

Tabela 31

Posição	Aminoácidos Considerados	WT	Estado base	Seqüências ao redor do Estado base
265 A	Limite XM	D	Y	Y: 531 F:226 W:105 H:92 K:21 D:16 E:6 T:3
297 A	Limite XM	N	D	A:235 S:229 D:166 E:114 N:92 Y:57 F:55 Q:25 H:10 T:7 K:6 L:3 R:1
299 A	Limite XM	T	L	L:482 Y:186 F:131 T:55 S:51 K:31 H:22 A:18 E:14 Q: 10
297 B	Limite XM	N	I	1:299 K:147 V:85 R:82 W:71 N:65 D:35 E:35 Q:34 S:32 L:31 H:30 T:28 A:26

tecnologia PDA®; estrutura modelo 1IIS; carboidrato -; 122 C, 129 C, 132 C, 155 C flutuantes

Tabela 32

Posição

Aminoácidos Considerados

WT

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

265 A

Todos os 20

D

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

297 A

Todos os 20

N

A

T

A

E

K

K

A

A

N

N

299 A

Todos os 20

T

S

K

S

K

F

F

F

F

F

S

184/261

297 B

Todos os 20

N

K

K

K

K

K

K

K

K

K

K

tecnologia SPA®; estrutura modelo 1IIS; carboidrato -; 122

C, 129 C, 132 C, 155 C flutuantes

Tabela 33

Posição	Aminoácidos Considerados	WT	Estado base	Seqüências ao redor do Estado base
239 A	Superfície	s	E	E:928 Q:65 D:7
265 A	Limite XM	D	W	W:709 Y:248 F:43
296 A	Superfície	Y	H	H:449 Y:146 E:137 D:89 K:64 N:32 T:30 R:25 Q:23 S : 5
297 A	Superfície	N	E	E:471 H:189 D:102 T:97 K:96 R:22 Q:15 S:8
298 A	Limite XM	S	R	R:353 T:275 K:269 A:56 S:38 E:5 Q:2 H:2
299 A	Limite XM	T	F	Y:398 F:366 L:217 H:15 K:4

tecnologia PDA®; estrutura modelo D129G 1IIS; carboidrato 5 ; 120 C, 122 C, 128 C, 132 C, 155 C flutuantes

Tabela 34

Posição

Aminoácidos Considerados

WT

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

239 A

Todos os 20

s

E

Q

Q

E

Q

Q

Q

Q

Q

Q

265 A

Todos os 20

D

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

296 A

Todos os 20

Y

D

Q

N

N

Q

N

N

N

Q

N

297 A

Todos os 20

N

A

A

N

A

D

D

E

N

N

E

298 A

Todos os 20

S

K

K

K

S

K

K

K

K

S

K

299 A

Todos os 20

T

S

Y

F

S

Y

F

K

F

S

K

tecnologia SPA®; estrutura modelo D129G 1IIS; carboidrato ; 120 C, 122 C, 128 C, 132 C, 155 C flutuantes

185/261

Tabela 35

Posição	Aminoácidos Considerados	WT	Estado base	Seqüências ao redor do Estado base
239 B	Superfície	s	E	E:417 T:122 D:117 Q:94 R:84 S:63 K:47 H:29 N:19 A:8
265 B	Limite XM	D	W	W:865 Y:79 F:55 K:1
296 B	Superfície	Y	Y	Y:549 H:97 D:80 S:75 N:48 E:45 K:32 R:30 Q:28 A:16
297 B	Superfície	N	R	R:265 H:224 E:157 K:154 Q:75 D:47 T:34 N:24 S:13 A: 7
298 B	Limite XM	S	V	V:966 D:10 T:8 A:8 N:4 S:4
299 B	Limite XM	T	Y	Y:667 F:330 H:3

tecnologia PDA®; estrutura modelo D129G 1E4K; carboidrato ; 117 C, 119 C, 125 C, 129 C, 152 C flutuantes

Tabela 36

Posição

Aminoácidos Considerados

WT

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

239 B

Todos os 20

s

s

R

E

K

S

S

E

E

E

K

265 B

Todos os 20

D

A

D

K

Y

A

A

F

F

K

Y

296 B

Todos os 20

Y

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

297 B

Todos os 20

N

T

S

T

T

E

E

E

S

E

E

298 B

Todos os 20

S

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

299 B

Todos os 20

T

L

F

E

E

Y

F

Y

F

Y

Y

tecnologia SPA®; estrutura modelo D129G 1E4K; carboidrato ; 117 C, 119 C, 125 C, 129 C, 152 C flutuantes

186/261

Tabela 37

Posição	Aminoácidos Considerados	WT	Estado base	Seqüências ao redor do Estado base
239 A	Superfície	s	E	E:868 Q:92 D:38 K:1 N:1
265 A	Limite XM	D	W	W:575 Y:343 F:66 H:15 K:1
296 A	Superfície	Y	H	H:489 Y:103 R:98 K:97 Q:64 D:63 T:41 N:38 E:7
297 A	Asp	N	D	D:1000
298 A	Limite XM	S	R	R:340 K:262 T:255 A:59 S:57 E:ll Q:10 H:6
299 A	Limite XM	T	F	Y:375 F:323 L:260 H:24 K:18

tecnologia PDA®; estrutura modelo D129G 1IIS; carboidrato ; 120 C, 122 C, 128 C, 132 C, 155 C flutuantes

Tabela 38

Posição

Aminoácidos Considerados

WT

2

3

4

5

6

7

8

9

10

239 A

Todos os 20

s

E

Q

E

E

E

E

E

E

Q

E

265 A

Todos os 20

D

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

296 A

Todos os 20

Y

E

N

Q

E

N

Q

Q

Q

Q

N

297 A

Asp

N

D

D

D

D

D

D

D

D

D

D

298 A

Todos os 20

S

K

S

K

S

K

K

K

S

K

K

299 A

Todos os 20

T

S

K

Y

S

F

F

F

F

F

K

tecnologia SPA®; estrutura modelo D129G 1IIS; carboidrato ; floated 120 C, 122 C, 128 C, 132 C, 155 C

Tabela 39

Posição	Aminoácidos Considerados	WT	Estado base	Seqüências ao redor do Estado base
239 B	Superfície	s	E	E:318 Q:123 T:109 D:108 R:93 S:89 K:69 N:40 H:38

187/261

				A: 13
265 B	Limite XM	D	w	W:745 Y.-158 F:85 K:9 E:1 R:1 H:1
296 B	Superfície	Y	Y	Y:390 H:127 S:83 R:81 K:78 N:65 D:55 E:49 Q:44 A:26 T:2
297 B	Asp	N	D	D: 1000
298 B	Limite XM	S	V	V:890 T:35 A:29 D:19 S:16 N:10 E:1
299 B	Limite XM	T	Y	Y:627 F:363 H:10

tecnologia PDA®; estrutura modelo D129G 1E4K; carboidrato ; 117 C, 119 C, 125 C, 129 C, 152 C flutuantes

Tabela 40

Posição

Aminoácidos Considerados

WT

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

239 B

Todos os 20

s

K

E

E

Q

E

K

Q

E

K

Q

265 B

Todos os 20

D

F

K

K

A

K

Y

W

K

L

F

296 B

Todos os 20

Y

A

A

A

A

A

A

A

A

A

A

297 B

Asp

N

D

D

D

D

D

D

D

D

D

D

298 B

Todos os 20

S

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

299 B

Todos os 20

T

Y

Y

Y

Y

Y

Y

F

F

Y

Y

tecnologia SPA®; estrutura modelo D129G 1E4K; carboidrato 5 ; 117 C, 119 C, 125 C, 3185 129 C, 152 C flutuantes

Tabela 41

Posição	Considerados Aminoácidos	WT	Estado base	Seqüências ao redor do Estado base
239 A	Bou~dary XM	s	E	E:312 L:148 D:102 Q:98 K:64 1:61 S:57 A:44 T:39 N:29 R:23 V:18 W:5
265 A	Limite XM	D	W	W:363 Y:352 F:139 H:77 K:39

188/261

				R:14 D:ll E:4 Q:1
297 A	Asp	N	D	D:1000
299 A	Limite XM	T	Y	Y:309 F:224 L:212 H:96 K:92 E:28 Q:20 R:16 T:2 S:1

tecnologia PDA®; estrutura modelo D129G 1IIS; carboidrato ; 120 C, 122 C, 132 C, 155 C flutuantes

Tabela 42

Posição

Aminoácidos Considerados

WT

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

239 A

Todos os 20

s

E

L

L

L

E

E

E

Q

L

E

265 A

Todos os 20

D

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

297 B

Asp

N

D

D

D

D

D

D

D

D

D

D

299 A

Todos os 20

T

S

K

K

F

F

F

K

F

K

F

tecnologia SPA®; estrutura modelo D129G 1IIS; carboidrato 5 ; 120 C, 122 C, 132 C, 155 C flutuantes

Tabela 43

Posição	Aminoácidos Considerados	WT	Estado base	Seqüências ao redor do Estado base
239 B	Limite XM	s	L	L:194 T:122 S:120 E:lll D:79 K:71 A:62 Q:57 R:43 H:43 N:37 I:24 W:24 V:13
265 B	Limite XM	D	W	Y:248 W:233 F:198 K:84 D:57 E:55 H:42 R:28 Q:20 A:10 T:10 N:8 S:7
297 B	Asp	N	D	D:1000
299 B	Limite XM	T	Y	Y:493 F:380 H:76 T:31 E:10 D:4 A:3 S:3

tecnologia PDA®; estrutura modelo D129G 1E4K; carboidrato ; 117 C, 119 C, 129 C, 152 C flutuantes

189/261

Tabela 44

Posição

Aminoácidos Considerados

WT

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

239 B

Todos os 20

s

R

E

P

L

L

F

P

P

L

L

265 B

Todos os 20

D

D

K

S

F

S

Y

A

M

A

D

297 B

Asp

N

D

D

D

D

D

D

D

D

D

D

299 B

Todos os 20

T

Y

Y

Y

Y

E

Y

Y

Y

Y

Y

tecnologia SPA®; estrutura modelo D129G 1E4K; carboidrato ; 117 C, 119 C, 129 C, 152 C flutuantes

Tabela 45

Posição	Aminoácidos Considerados	WT	Estado base	Seqüências ao redor do Estado base
239	A	Limite XM	s	E	E:251 L:125 D:120	Q: 112
					S:73 K:65 1:61 A:58	T:45
					N:35 R:28 V:23 W:4
265	A	Limite XM	D	Y	Y:216 H:153 K:135	D: 109
					W:104 F:86 R:54 T:38	E:29
					Q:22 A:21 N:17 S:13 L	3
297	A	Asp	N	D	D:1000

tecnologia PDA®; estrutura modelo D129G 1IIS; carboidrato ; 299 A, 120 C, 122 C, 3205 132 C, 155 C flutuantes

Tabela 46

Posição

Aminoácidos Considerados

WT

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

239 A

Todos os 20

s

s

L

E

L

Q

Q

E

Q

Q

E

265 A

Todos os 20

D

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

297 A

Asp

N

D

D

D

D

D

D

D

D

D

D

tecnologia SPA®; estrutura modelo D129G 1IIS; carboidrato ; floated 299 A, 120 C, 122 C, 132 C, 155 C

190/261

Tabela 47

Posição	Aminoácidos Considerados	WT	Estado base	Seqüências ao redor do Estado base
239 B	Limite XM	s	L	L:158 S:137 T:125 E:115 D:86 K:75 A:62 Q:56 H:43 R:39 N:35 W:30 1:24 V:15
265 B	Limite XM	D	Y	Y:188 W:159 F:156 D:122 K:77 E:71 H:61 Q:44 R:39 A:24 S:22 N:19 T:18
297 B	Asp	N	D	D:1000

tecnologia PDA®; estrutura modelo D129G 1E4K; carboidrato ; 299 B, 117 C, 119 C, 129 C, 152 C flutuantes

Tabela 48

Posição

Aminoácidos Considerados

WT

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

239 B

Todos os 20

s

s

E

P

P

E

S

P

L

F

L

265 B

Todos os 20

D

A

K

A

M

K

F

Y

D

F

F

297 B

Asp

N

D

D

D

D

D

D

D

D

D

D

tecnologia SPA®; estrutura modelo D129G 1E4K; carboidrato ; 299 B, 117 C, 119 C, 129 C, 152 C flutuantes

Tabela 49

Posição	Aminoácidos Considerados	WT	Estado base	Seqüências ao redor do Estado base
297 A	Asp	N	D	D: 1000
299 A	Limite XM	T	Y	T:123 Y:64 H:64 K:64 Q:64 F:64 R:63 D:63 E:63 S:63 L:63 N:62 1:57 A:54 V:52 W: 17

tecnologia PDA®; estrutura modelo D129G 1IIS; carboidrato ; 239 A, 265 A, 120 C, 122 C, 132 C, 155 C flutuantes

191/261

Tabela 50

Posição

Aminoácidos Considerados

WT

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

297 A

Asp

N

D

D

D

D

D

D

D

D

D

D

299 A

Todos os 20

T

K

K

K

K

F

F

K

K

K

K

tecnologia SPA®; estrutura modelo D129G 1IIS; carboidrato ; 239 A, 265 A, 120 C, 122 C, 132 C, 155 C flutuantes

Tabela 51

Posição	Aminoácidos Considerados	WT	Estado base	Seqüências ao redor do Estado base
297 B	Asp	N	D	D:1000
299 B	Limite XM	T	Y	T:123 F:64 Y:64 H:64 S:63 N:61 Q:61 D:61 E:60 K:58 V:57 A:57 R:54I:52 L:51 W: 50

tecnologia PDA®; D129G 1.E4K estrutura modelo; carboidrato

-; 239 B, 265 B, 117 C, 119 C, 129 C, 152 C flutuantes

Tabela 52

Posição

Considerados Aminoácidos

WT

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

297 B

Asp

N

D

D

D

D

D

D

D

D

D

D

299 B

Todos os 20

T

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

tecnologia SPA®; estrutura modelo D129G 1E4K; carboidrato ; floated 239 B, 265 B, 117 C, 119 C, 129 C, 152 C foram realizados cálculos de escolha computacional para otimizar Fc aglicosilado por projeto de substituições favoráveis nos resíduos que são expostos ao solvente na ausência de glicosilação de forma que sejam estáveis, mantenham a estrutura de Fc, e não tenham tendência em agregar. O carboidrato N297 recobre o remendo hidrofóbico

192/261 exposto normalmente seria a interface para a interação proteína-proteína com um outro domínio de Ig, mantendo a estabilidade e integridade estrutural de Fc e mantendo o domínios de Cy2 de se agregar através do eixo central.

Resíduos chave para projeto são F241, F243, V262, e V264, que residem atrás do carboidrato em Cy2, em adição aos resíduos como L328, 1332, e 1336, que são resíduos não polares expostos que confrontam interiormente na direção do domínio Cy2 oposto, que foram considerados em cálculos 10 previamente apresentados.

A importância desses resíduos C72 é sustentada pela observação de que os resíduos correspondentes no domínio Cy3 por alinhamento de seqüência medeiam a interação não polar entre os dois domínios Cy3 ou são enterrados no 15 núcleo de Cy3. Os resultados desses cálculos de projeto são apresentados na Tabela 53.

Tabela 53

Posição	Aminoácidos Considerados	WT	Estado base	Seqüências ao redor do Estado base
241 A	Superfície	F	E	E:190 R:172 K:138 H:117 T:93 Q:91 D:85 S:49 N:49 A: 16
243 A	Superfície	F	R	R:190 H:164 Q:152 E:149 K:92 T:71 D:64 N:58 S:42 A: 18
262 A	Superfície	V	D	D:416 E:164 N:138 Q:87 T:83 R:44 S:32 K:24 A:ll H:1
264 A	Superfície	V	H	R:368 H:196 K:147 E:108 Q:68 T:34 N:33 D:25 S:15 A:6

193/261 tecnologia PDA®; estrutura modelo IIIS; carboidrato Em um conjunto final de cálculos, o Método de escolha computacional SPATM foi aplicado para avaliar as substituições de todas as posições variáveis escolhidas com todos os 20 aminoácidos. A conformação de rotâmero de mais baixa energia para todos os 20 aminoácidos foi determinada, e essa energia foi definida como a energia de substituição para aquele aminoácido naquela posição variável. Esses cálculos assim forneceram uma energia de substituição para cada um dos 20 aminoácidos em cada posição variável. Esses dados foram úteis para uma variedade de objetivos de projeto direcionados para Fc glicosilado e aglicosilado, incluindo a otimização de afinidade Fc/FcyR, estabilidade de Fc, solubilidade de Fc, conformação de carboidrato, e conformação de dobradiça. Além disso, porque esses cálculos fornecem energias para substituições favoráveis e desfavoráveis, eles guiam substituições que podem permitir ligação diferencial a FcyRs de ativação versus de inibição. Várias estruturas modelo foram usadas, e cálculos exploraram substituições em ambas cadeias. Os resultados desses cálculos e parâmetros relevantes e informação são apresentados nas tabelas 54 - 59 abaixo. A coluna 1 lista as posições variáveis na cadeia A e B da estrutura modelo 1IIS. A coluna 2 lista a identidade de aminoácido de tipo selvagem em cada posição variável. As 20 colunas remanescente fornecem a energia para cada um dos 20 aminoácidos naturais (mostrados na fileira superior). Todas as substituições foram normalizadas com relação à substituição de mais baixa energia, que foi ajustada como energia 0. Por exemplo na tabela 54, para L235 na cadeia A,

194/261 serina é a substituição de mais baixa energia, e L235A é 0,9 kcal/mol menos estável que L235S. Energias extremamente altas foram ajustadas em 20 kcal/mol para energias entre 20 - 50 kcal/mol, e 50 kcal/mol para energias maiores que 50 kcal/mol. Substituições favoráveis podem ser considerados como sendo a substituição de mais baixa energia para cada posição, e substituições que tem pequenas diferenças de energia da substituição de mais baixa energia, por exemplo substituições em 1-2, 1-3, 1-5, ou 1-10 kcal/mol.

Tabela 54

Pos	WT	A	C	D	E	F	G	H	I	K	L	M	N	P	Q	R	S	T	V	W	Y
235 A	L	0,9	2,8	2,8	1,5	3,2	3,2	3,4	4,9	1,6	2,1	3,2	0,9	0,3	1,3	0,7	0,0	1,7	4,3	6,5	3,2
236 A	G	0,0	1,9	5,1	6,7	10,0	2,3	4,3	17,2	5,7	20,0	4,6	3,2	12,6	5,6	6,1	0,6	6,2	12,0	6,7	20,0
237 A	G	20,0	20,0	20,0	50,0	50,0	0,0	50,0	50,0	20,0	50,0	20,0	20,0	50,0	50,0	50,0	20,0	20,0	50,0	50,0	50,0
239 A	S	0,2	4,3	2,6	0,0	18,8	4,5	6,9	11,3	1,7	0,1	2,1	1,7	7,9	1,2	2,6	0,3	5,7	11,0	20,0	20,0
265 A	D	9,0	8,1	6,3	7,8	5,1	0,0	7,3	50,0	8,2	9,9	7,7	6,0	50,0	9,0	8,5	7,8	20,0	50,0	20,0	5,8
267 A	S	2,1	3,3	7,3	1,4	50,0	7,3	20,0	20,0	0,9	2,2	5,0	4,8	0,0	2,2	3,1	2,9	20,0	20,0	50,0	50,0
269 A	E	0,5	2,1	1,3	0,6	1,6	3,9	2,0	1,2	1,1	1,3	2,7	0,0	50,0	0,6	1,1	0,3	0,8	1,0	5,6	1,2
270 A	D	0,3	2,8	2,3	2,0	4,0	4,0	3,4	2,4	1,2	0,0	2,3	2,1	20,0	2,0	2,3	1,4	1,8	4,2	5,4	6,0
296 A	Y	2,7	2,0	1,4	0,0	50,0	0,0	50,0	4,6	2,1	2,4	3,3	1,2	50,0	0,2	1,5	1,3	4,6	4,4	16,3	18,2
298 A	S	0,7	2,4	6,7	3,4	20,0	3,9	20,0	6,7	0,0	4,1	1,4	4,1	50,0	1,8	1,1	0,2	2,2	6,3	17,8	20,0
299 A	T	0,6	2,8	11,5	10,1	20,0	6,1	20,0	10,7	7,1	20,0	4,3	6,8	50,0	6,3	12,0	0,0	3,0	7,1	14,8	20,0
234 B	L	2,1	3,2	4,1	4,2	1,6	5,3	0,1	0,7	0,6	1,0	2,0	1,7	50,0	2,8	0,3	2,3	1,7	2,6	13,0	0,0
235 B	L	0,6	2,3	2,5	0,7	5,4	4,8	1,4	3,6	0,1	0,0	2,0	1,7	16,6	0,5	1,2	0,7	0,7	5,3	6,8	5,5
236 B	G	3,1	1,3	4,4	8,2	5,2	0,0	1,9	20,0	3,1	20,0	4,1	2,7	50,0	3,7	1,6	1,2	20,0	20,0	20,0	11,3
237 B	G	20,0	50,0	50,0	50,0	50,0	0,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0
239 B	S	0,9	2,4	3,4	1,8	5,4	5,6	2,7	3,0	0,9	0,0	2,0	1,6	50,0	1,8	1,8	1,4	1,4	5,1	20,0	5,3
265 B	D	4,5	5,1	4,6	4,6	4,9	0,0	3,8	9,0	2,0	2,5	4,1	2,1	50,0	4,5	5,1	4,4	5,9	9,2	11,4	5,8

Pos	WT	A	C	D	E	F	G	H	I	K	L	M	N	P	Q	R	S	T	V	W	Y
327 B	A	1,8	3,4	4,7	3,9	20,0	7,0	20,0	20,0	0,8	0,0	1,9	1,5	20,0	3,0	2,6	3,2	20,0	20,0	20,0	20,0
328 B	L	3,7	3,6	4,0	3,7	50,0	8,4	6,8	50,0	3,8	0,0	2,1	4,1	50,0	3,6	8,1	4,9	3,0	12,5	50,0	50,0
329 B	P	3,4	8,6	20,0	20,0	50,0	8,0	16,8	50,0	20,0	20,0	16,9	20,0	0,0	20,0	20,0	1,3	17,1	16,5	50,0	50,0
330 B	A	0,5	2,0	2,6	0,5	2,4	3,8	1,4	4,2	0,0	2,0	2,2	0,8	20,0	0,1	0,6	0,9	0,3	5,1	8,0	2,7
332 B	I	1,5	2,7	1,2	1,6	11,9	6,8	12,9	1,2	2,9	0,0	1,4	1,7	50,0	1,3	4,9	1,8	1,7	3,0	20,0	20,0

Tecnologia SPA®; estrutura modelo 1IIS; átomos de carboidrato +, sem posições flutuantes

Tabela 55

Pos	WT	A	C	D	E	F	G	H	I	K	L	M	N	P	Q	R	S	T	V	W	Y
235 A	L	0,9	2,8	2,6	1,7	3,3	3,3	3,4	5,0	1,6	2,1	3,3	1,0	0,3	1,4	1,8	0,0	1,9	3,6	6,6	3,3
236 A	G	0,0	1,7	5,2	6,0	11,3	2,3	4,4	17,2	5,8	19,0	4,9	3,3	8,2	5,6	6,0	0,8	5,6	11,8	6,6	20,0
237 A	G	20,0	20,0	20,0	50,0	50,0	0,0	50,0	50,0	20,0	50,0	20,0	20,0	50,0	50,0	50,0	20,0	20,0	50,0	50,0	50,0
238 A	P	8,6	8,0	10,5	13,4	6,4	0,0	5,0	50,0	12,4	11,3	9,7	9,3	3,2	12,4	20,0	8,6	50,0	50,0	20,0	8,4
239 A	S	0,1	4,2	2,5	0,0	20,0	4,5	9,0	10,8	1,8	0,2	2,1	1,8	9,1	1,3	2,5	0,3	5,7	10,7	20,0	19,7
240 A	V	1,3	2,4	2,3	6,3	20,0	7,2	50,0	5,1	10,8	6,2	5,7	2,0	1,1	9,5	13,1	2,5	0,5	0,0	20,0	20,0
241 A	F	0,1	1,6	1,2	0,3	0,2	4,1	1,2	10,0	1,3	0,1	2,1	0,4	14,7	0,5	1,1	0,1	0,0	8,3	3,6	0,4
242 A	L	3,0	3,4	5,5	8,3	14,4	8,5	11,1	3,3	13,9	2,2	2,7	5,5	0,9	7,9	17,1	3,8	2,3	0,0	20,0	17,5
243 A	F	1,6	2,2	2,7	0,2	1,4	5,6	2,5	0,0	2,2	2,0	3,0	2,3	10,2	0,5	1,6	1,3	0,9	1,2	5,3	1,6
244 A	P	1,2	1,8	3,8	0,8	10,2	3,8	4,6	20,0	0,2	2,9	2,0	2,8	2,0	0,9	1,7	0,0	19,3	20,0	7,6	12,2

195/261 196/261

Pos	WT	A	C	D	E	F	G	H	I	K	L	M	N	P	Q	R	S	T	V	W	Y
245 A	P	3,9	20,0	20,0	20,0	20,0	9,1	20,0	20,0	20,0	20,0	20,0	20,0	0,0	20,0	20,0	8,0	20,0	50,0	20,0	20,0
246 A	K	1,3	2,7	2,0	2,0	2,9	5,7	2,9	1,4	1,4	1,5	3,1	0,2	0,0	1,2	1,5	1,7	1,4	1,2	5,4	3,0
247 A	P	1,2	2,1	0,3	0,7	4,0	3,9	3,7	1,8	1,6	1,7	3,3	0,0	0,5	0,9	1,5	0,7	1,1	1,3	6,9	3,7
248 A	K	0,9	2,7	1,5	0,8	3,1	4,7	3,4	3,3	2,0	1,9	2,6	1,2	3,6	1,5	2,3	0,7	0,0	2,5	5,6	2,7
249 A	D	1,2	3,7	1,6	0,0	20,0	7,3	19,7	50,0	1,7	20,0	2,2	1,4	20,0	1,5	3,4	2,5	18,3	50,0	20,0	20,0
250 A	T	0,0	1,8	3,8	5,8	50,0	6,0	20,0	4,5	6,3	6,3	0,3	3,2	50,0	8,7	9,3	1,8	1,3	1,9	20,0	50,0
251 A	L	1,1	1,9	1,2	0,5	5,8	5,1	1,9	5,6	0,9	0,7	2,4	1,4	50,0	0,0	1,4	0,5	0,8	6,9	8,9	5,8
252 A	L	0,9	2,8	2,6	1,7	3,3	3,3	3,4	5,0	1,6	2,1	3,3	1,0	0,3	1,4	1,8	0,0	1,9	3,6	6,6	3,3
253 A	I	0,7	1,7	1,1	0,2	1,8	3,5	2,2	2,0	0,3	1,2	0,8	0,8	0,3	0,0	1,1	0,3	0,5	2,8	2,4	1,9
254A	S	0,7	1,7	0,4	0,7	2,2	3,6	2,0	0,3	1,2	1,9	2,4	0,0	20,0	0,3	1,2	0,3	0,8	0,7	3,8	1,9
255A	R	1,4	2,8	2,4	2,5	0,2	5,4	1,1	17,0	1,0	2,2	1,5	1,7	50,0	2,1	0,0	2,3	50,0	17,2	4,0	0,5
256 A	T	0,6	1,8	1,2	1,1	2,7	3,4	2,1	1,4	0,7	1,5	2,4	0,0	0,4	0,1	0,2	0,4	0,9	1,2	5,6	2,7
257 A	P	0,0	7,8	20,0	12,9	50,0	6,2	50,0	20,0	12,3	12,8	14,4	20,0	0,1	13,1	20,0	2,9	16,0	20,0	50,0	50,0
258 A	E	0,0	1,6	4,8	2,6	1,0	4,3	2,2	14,8	4,4	6,2	3,2	2,9	10,4	7,4	6,0	1,0	6,2	17,6	20,0	1,0
259 A	V	3,9	4,3	5,1	8,7	20,0	10,3	6,8	2,3	9,6	2,8	6,2	4,1	50,0	9,2	20,0	5,2	2,1	0,0	20,0	20,0
260 A	T	1,7	2,3	3,3	1,1	20,0	6,6	8,6	0,0	0,2	1,8	2,8	1,8	1,1	0,8	0,9	1,7	0,4	1,9	7,1	20,0
261 A	c	0,0	20,0	20,0	20,0	20,0	3,9	20,0	20,0	20,0	20,0	20,0	20,0	50,0	20,0	20,0	3,6	20,0	20,0	20,0	20,0
262 A	V	1,9	3,2	0,0	3,3	20,0	7,2	20,0	8,3	2,9	2,9	2,2	0,6	50,0	3,8	5,2	3,4	3,0	1,7	20,0	20,0

Pos	WT	A	C	D	E	F	G	H	I	K	L	M	N	P	Q	R	S	T	V	W	Y
263 A	V	2,2	2,7	6,0	17,4	20,0	8,8	20,0	10,0	7,1	7,6	16,9	5,2	50,0	19,8	17,7	2,8	1,4	0,0	20,0	20,0
264 A	V	1,9	3,3	2,8	2,2	0,0	6,4	2,1	0,7	2,6	0,9	2,7	2,1	2,3	2,6	2,7	2,2	1,1	0,6	3,9	0,1
265 A	D	9,0	8,1	5,9	8,6	5,3	0,0	7,3	50,0	7,9	9,7	7,5	5,5	50,0	10,2	8,6	7,9	20,0	50,0	20,0	5,7
266 A	V	4,9	5,3	71	12,1	20,0	11,2	20,0	0,4	12,2	20,0	8,8	7,1	50,0	12,2	20,0	6,1	3,8	0,0	20,0	20,0
267 A	S	2,3	3,5	7,2	1,3	50,0	7,4	20,0	20,0	0,7	1,4	3,9	4,7	0,0	2,3	3,1	3,0	20,0	20,0	50,0	50,0
268 A	H	1,2	1,9	2,2	1,5	3,7	5,0	4,9	0,4	0,5	3,7	2,7	1,7	0,0	1,4	1,7	1,1	0,2	0,9	6,1	3,7
269 A	E	0,3	1,9	1,3	0,5	1,3	3,7	1,9	1,1	0,8	1,2	2,5	0,0	50,0	0,6	0,8	0,2	0,6	0,7	4,0	1,0
270 A	D	0,2	2,6	2,1	1,9	5,2	3,9	3,1	2,1	1,2	0,0	2,2	1,9	20,0	1,9	1,8	1,2	1,7	4,1	5,1	7,0
271 A	P	0,0	5,3	8,1	9,3	20,0	3,1	9,1	20,0	6,0	9,5	5,3	7,3	5,9	5,9	5,9	1,6	4,1	15,2	20,0	20,0
272 A	Q	0,8	1,9	0,9	1,2	3,0	3,2	3,7	3,7	1,6	1,8	3,2	0,3	50,0	1,1	1,6	0,0	1,0	3,5	4,0	3,4
273 A	V	1,2	2,9	1,8	20,0	20,0	7,1	20,0	6,8	20,0	20,0	20,0	0,0	2,8	20,0	20,0	2,1	1,4	1,7	20,0	20,0
274 A	K	0,4	1,8	1,4	0,8	1,9	3,9	2,4	1,4	0,7	1,1	2,9	0,9	20,0	0,0	0,1	0,0	0,4	0,7	3,3	2,3
275 A	F	8,0	9,5	10,3	9,5	0,0	13,5	5,1	10,0	6,2	6,3	6,0	9,1	6,1	9,1	15,1	9,6	7,2	6,1	13,5	4,3
276 A	N	1,3	2,4	2,4	2,2	0,8	5,1	0,8	1,2	0,6	2,3	2,5	1,8	50,0	1,6	2,5	1,2	0,0	0,3	4,2	3,6
277 A	W	5,5	7,4	8,4	6,4	15,4	11,2	3,2	8,2	1,9	3,9	3,6	6,6	3,5	5,5	15,4	6,9	6,1	14,1	0,0	20,0
278 A	Y	1,6	2,7	3,9	1,6	1,0	7,3	3,4	17,7	1,4	7,5	2,1	0,0	50,0	1,9	2,2	2,6	9,9	20,0	15,8	1,4
279 A	V	3,1	4,1	4,0	2,2	20,0	8,1	9,7	8,5	0,0	1,4	3,1	3,3	20,0	1,9	4,6	4,3	3,4	4,2	20,0	20,0
280 A	D	1,8	2,6	2,7	0,2	11,5	2,9	8,8	20,0	3,4	3,2	2,8	3,8	50,0	0,0	3,7	0,6	6,8	12,7	11,9	11,4

197/261 198/261

Pos	WT	A	C	D	E	F	G	H	I	K	L	M	N	P	Q	R	S	T	V	W	Y
281 A	G	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	0,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0
282 A	V	0,9	2,1	1,6	1,1	2,9	4,2	3,5	1,4	1,5	1,8	3,6	0,4	18,9	0,5	1,0	0,0	0,6	0,9	4,7	3,1
283 A	E	0,7	1,6	0,7	0,5	1,0	4,4	1,4	0,4	1,2	1,8	1,9	0,0	0,4	0,6	1,5	0,4	0,3	1,2	4,1	0,9
284 A	V	0,0	2,2	3,1	1,2	20,0	5,0	20,0	4,0	0,7	2,6	0,8	2,6	50,0	0,8	0,7	0,8	0,1	1,5	20,0	20,0
285 A	H	0,2	1,4	3,1	1,3	3,0	2,0	2,4	3,6	1,1	2,6	3,0	0,7	2,2	0,2	0,8	0,0	1,1	4,7	4,9	4,0
286 A	N	0,8	2,5	1,2	1,1	2,4	4,7	2,7	2,1	0,0	0,7	1,8	0,6	20,0	1,2	0,7	0,9	1,7	2,1	5,2	2,7
287 A	A	0,6	2,6	5,8	3,3	10,4	5,4	9,1	11,3	0,0	4,4	1,3	3,6	50,0	2,6	2,3	1,0	1,9	12,5	9,1	10,4
288 A	K	0,8	2,6	2,0	1,3	3,0	3,4	3,8	2,3	1,4	1,7	2,5	0,3	50,0	0,5	1,3	0,0	0,4	2,0	4,5	3,6
289 A	T	0,3	1,9	4,7	1,1	3,1	3,6	2,9	10,5	0,4	2,7	1,6	2,1	8,2	1,2	2,0	0,0	0,4	12,0	3,9	3,2
290 A	K	1,7	2,2	0,5	0,6	3,0	1,3	3,0	3,7	1,7	2,1	3,2	0,0	50,0	0,7	2,0	0,3	1,3	3,3	5,6	3,3
291 A	P	1,6	3,1	1,8	0,5	1,9	5,5	1,8	0,1	0,5	1,5	1,2	1,2	0,7	0,0	2,9	2,2	0,9	1,3	2,6	0,9
292 A	R	1,1	2,2	3,1	0,8	5,9	4,4	8,0	5,0	0,0	1,6	2,1	1,1	8,4	0,2	0,4	1,0	1,3	4,7	8,3	5,7
293 A	E	2,2	6,5	9,0	17,9	16,3	0,0	13,2	50,0	12,8	10,3	10,3	7,2	5,5	15,1	14,5	3,5	20,0	50,0	14,5	17,1
294 A	E	1,5	2,1	2,1	0,7	8,1	2,8	3,3	2,0	2,6	1,8	2,8	1,0	50,0	1,3	1,3	0,5	0,0	3,4	11,2	10,2
295 A	Q	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	0,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0
296 A	Y	2,8	2,3	1,1	0,4	50,0	0,0	50,0	4,6	2,2	2,3	3,1	0,9	50,0	0,2	1,8	1,3	4,7	4,8	18,2	20,0
297 A	N	0,0	6,5	8,4	5,3	20,0	3,4	20,0	13,8	2,7	20,0	4,8	9,3	50,0	4,4	4,4	1,5	1,6	15,5	20,0	20,0
298 A	S	0,8	2,4	5,7	2,2	20,0	3,7	20,0	6,2	0,9	9,2	1,8	3,3	50,0	1,7	2,1	0,0	2,2	7,3	15,6	20,0

Pos	WT	A	C	D	E	F	G	H	I	K	L	M	N	P	Q	R	S	T	V	W	Y
299 A	T	1,9	3,4	6,0	3,1	1,0	7,1	2,9	3,1	0,0	2,7	2,6	3,6	50,0	2,2	2,5	1,1	2,2	5,4	3,6	1,4
300 A	Y	2,8	2,9	2,7	4,5	20,0	4,0	7,5	13,1	1,2	0,0	2,2	2,3	50,0	3,3	4,0	2,6	1,1	1,1	11,0	2,4
301 A	R	3,0	3,5	3,8	2,8	0,8	3,4	1,8	0,0	1,3	0,7	2,6	2,5	50,0	2,6	2,3	2,9	1,8	0,9	9,8	1,8
302 A	V	2,7	4,6	6,7	3,9	2,8	8,9	1,2	6,9	2,7	2,0	2,2	4,8	50,0	4,7	3,2	4,3	7,7	3,8	0,0	8,4
303 A	V	0,0	2,2	3,3	1,0	6,7	4,5	5,3	1,4	2,5	3,1	2,0	3,1	1,0	2,1	2,9	0,4	0,4	2,9	10,9	6,2
304 A	S	0,0	12,1	10,8	20,0	20,0	6,2	20,0	20,0	17,2	20,0	11,9	16,6	50,0	20,0	16,8	2,2	14,2	17,9	20,0	20,0
305 A	V	1,1	2,3	3,3	1,2	0,3	5,4	1,2	0,0	0,9	1,1	2,8	1,1	3,9	1,1	1,4	1,2	0,9	0,0	0,8	0,8
306 A	L	4,3	6,2	7,1	5,9	2,8	10,4	3,4	13,7	3,4	0,0	3,5	6,0	50,0	5,9	9,9	6,2	5,3	11,4	9,6	10,3
307 A	T	1,4	3,2	3,8	2,2	6,5	5,5	4,2	0,5	0,3	4,2	3,0	2,2	0,0	1,9	1,3	1,4	0,9	1,2	6,2	6,5
308 A	V	1,8	5,5	6,5	8,0	50,0	7,9	20,0	4,5	20,0	5,5	19,4	7,6	50,0	7,7	15,5	0,0	0,7	5,9	50,0	50,0
309 A	L	1,1	2,7	0,7	0,7	1,3	4,6	2,7	0,7	1,7	1,0	2,8	0,0	1,6	0,7	1,3	1,0	0,6	0,5	5,0	2,1
310 A	H	2,0	2,6	0,9	4,1	50,0	5,6	0,2	6,8	4,0	7,1	4,0	0,0	0,2	4,9	10,0	2,0	2,5	6,4	50,0	50,0
311 A	Q	0,6	2,5	1,6	1,6	2,5	4,3	1,6	1,4	0,6	0,9	2,9	0,9	1,7	0,8	0,9	0,0	0,3	2,2	4,6	2,0
312 A	N	5,4	5,1	5,9	1,3	20,0	0,0	20,0	10,0	3,4	4,8	3,3	7,1	50,0	2,7	3,9	4,1	3,2	11,9	20,0	20,0
313 A	W	4,6	6,4	5,5	5,6	1,1	10,8	5,0	11,0	5,8	5,2	7,6	5,4	50,0	4,8	12,9	6,0	3,8	6,6	0,0	2,6
314 A	L	2,1	2,9	4,3	2,2	5,7	6,1	7,9	5,4	0,7	0,0	1,7	2,3	50,0	1,6	1,6	3,0	4,7	6,3	8,0	6,0
315 A	D	0,3	1,4	1,5	0,1	3,3	4,2	1,9	1,8	0,8	0,5	1,8	0,6	50,0	0,0	0,7	0,0	0,9	2,4	6,2	3,7
316 A	G	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	0,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0

199/261 200/261

Pos	WT	A	C	D	E	F	G	H	I	K	L	M	N	P	Q	R	S	T	V	W	Y
317 A	K	0,0	14,0	18,4	17,9	50,0	5,0	50,0	20,0	8,5	12,5	12,7	20,0	15,9	17,2	13,5	2,8	9,2	20,0	50,0	50,0
318 A	E	2,0	3,0	2,7	1,7	2,7	6,7	2,6	0,0	1,1	1,6	1,3	1,7	20,0	1,4	2,6	2,2	1,3	0,0	6,1	9,5
319 A	Y	2,9	4,4	3,9	3,4	0,0	8,8	1,8	20,0	0,5	5,2	0,7	3,2	50,0	3,1	5,6	3,4	3,6	20,0	50,0	0,2
320 A	K	2,3	3,1	3,0	2,7	20,0	7,8	20,0	9,4	0,0	0,6	2,7	1,3	50,0	2,4	1,9	3,3	3,3	7,2	20,0	20,0
321 A	c	0,0	3,2	20,0	18,8	20,0	6,9	20,0	20,0	20,0	20,0	10,4	20,0	50,0	19,6	20,0	1,5	8,7	18,3	20,0	20,0
322 A	K	2,0	2,5	3,5	2,8	2,7	6,4	2,1	0,2	0,1	1,2	2,7	2,7	50,0	2,1	0,0	2,3	1,6	0,9	14,5	2,8
323 A	V	1,5	2,8	7,3	11,9	20,0	8,1	20,0	6,0	9,6	20,0	4,9	8,5	50,0	13,6	20,0	2,8	1,6	0,0	20,0	20,0
324 A	s	2,0	2,1	0,6	0,0	1,9	4,9	3,9	1,5	2,8	0,7	1,9	0,9	50,0	0,8	2,9	2,7	1,9	2,1	3,8	2,5
325 A	N	2,8	3,9	8,4	3,0	20,0	8,3	20,0	0,0	7,7	20,0	6,2	1,6	13,4	0,5	20,0	3,1	0,1	1,3	20,0	20,0
326 A	K	1,0	2,7	3,0	1,6	3,7	4,1	3,1	3,2	1,7	2,4	3,7	1,2	0,0	0,6	1,4	1,0	1,9	2,6	5,6	3,6
327 A	A	0,9	2,8	5,8	3,1	20,0	6,3	16,7	14,7	2,8	20,0	2,5	5,3	20,0	1,3	4,1	0,0	5,2	13,7	20,0	20,0
328 A	L	6,0	6,3	7,0	4,1	50,0	8,6	20,0	50,0	5,7	0,0	7,1	6,0	50,0	3,7	8,2	6,6	50,0	50,0	20,0	50,0
329 A	P	1,0	2,5	0,9	0,6	4,0	3,4	3,3	1,7	1,9	2,5	3,6	0,0	0,3	0,7	1,5	0,1	1,1	1,1	6,2	3,6
330 A	A	0,9	2,0	1,3	0,7	3,4	3,8	3,0	2,0	1,4	2,0	3,4	0,0	20,0	0,6	1,2	0,2	0,6	1,9	7,0	3,4
331 A	P	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	0,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0
332 A	I	1,9	3,7	4,6	1,7	5,0	7,0	1,9	3,8	1,8	0,0	2,5	3,9	20,0	0,8	2,4	2,3	2,6	4,4	20,0	5,9
333 A	E	0,0	3,1	3,2	0,8	4,1	4,4	4,2	16,9	3,6	2,8	2,8	2,5	1,6	1,3	3,2	1,3	1,4	7,7	4,0	4,8
334 A	K	1,7	2,9	2,5	0,0	1,0	6,1	3,3	1,0	1,5	0,5	3,5	1,5	4,4	0,1	2,7	2,2	0,9	1,3	4,9	1,8

Pos	WT	A	C	D	E	F	G	H	I	K	L	M	N	P	Q	R	S	T	V	W	Y
335 A	T	0,5	3,2	4,5	2,7	4,2	4,9	4,1	20,0	2,1	3,1	3,0	1,2	0,0	2,3	2,8	1,4	1,4	7,3	5,1	4,5
336 A	I	1,2	1,6	5,0	1,5	20,0	6,1	16,8	0,7	3,4	7,8	2,5	3,2	20,0	2,8	1,4	0,7	0,6	0,0	20,0	20,0
337 A	s	4,8	4,8	7,5	11,5	10,1	0,0	5,5	50,0	9,9	7,0	7,9	5,0	50,0	11,4	12,7	4,5	2,3	50,0	19,3	10,6
338 A	K	1,0	2,7	2,3	2,2	4,6	5,9	2,4	50,0	0,0	2,1	1,9	1,0	50,0	1,5	0,9	0,7	10,3	50,0	5,4	4,9
339 A	A	1,0	2,5	0,8	1,1	4,4	3,7	3,7	2,1	1,8	2,6	3,6	0,0	0,8	0,6	1,6	0,6	0,9	2,4	6,8	3,8
340 A	K	1,3	2,4	2,3	2,0	1,7	4,1	2,3	1,9	0,0	2,3	1,8	1,0	1,9	0,9	1,3	0,5	0,8	1,7	4,9	2,4
232 B	P	1,3	3,2	2,2	2,2	4,1	2,9	3,6	1,8	2,1	2,8	3,9	1,1	0,0	1,1	1,6	0,7	1,4	3,0	6,2	4,1
233 B	E	0,5	2,2	1,7	0,5	2,6	3,7	2,9	4,4	1,4	1,1	3,2	0,6	2,7	0,4	1,6	0,0	1,2	6,9	5,5	2,6
234 B	L	2,9	4,0	4,8	4,9	2,0	6,1	0,8	1,5	0,0	1,9	2,7	2,6	20,0	3,6	1,2	3,1	2,5	3,4	13,4	0,5
235 B	L	0,6	2,3	2,4	0,9	5,7	4,9	1,4	3,7	0,0	0,0	1,9	1,9	17,3	0,6	1,4	0,8	0,7	5,2	7,8	5,3
236 B	G	3,6	2,5	5,1	11,8	6,8	0,0	2,8	20,0	5,0	20,0	4,5	3,5	50,0	5,5	19,9	2,6	20,0	20,0	20,0	14,1
237 B	G	20,0	50,0	50,0	50,0	50,0	0,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0
238 B	P	3,5	4,7	8,5	4,2	20,0	9,8	50,0	0,0	5,6	9,6	4,6	8,1	1,3	5,8	20,0	4,9	4,4	1,3	20,0	20,0
239 B	s	1,0	2,5	3,4	2,0	7,2	5,7	3,1	3,1	0,6	0,0	2,0	1,9	50,0	1,7	1,1	1,5	1,5	5,2	20,0	5,2
240 B	V	0,1	2,3	7,0	11,9	20,0	6,5	20,0	8,1	12,7	20,0	12,0	7,6	0,0	11,6	20,0	1,2	1,9	0,8	20,0	20,0
241 B	F	0,0	2,0	1,4	0,8	1,0	4,0	2,0	6,5	1,1	0,6	2,3	0,2	50,0	0,3	1,5	0,1	0,9	5,7	4,1	1,1
242 B	L	2,2	3,3	6,5	6,6	6,9	7,9	4,3	0,0	8,7	3,9	4,8	5,3	0,0	9,1	6,8	2,9	1,1	0,5	20,0	8,7
243 B	F	0,8	2,6	1,9	1,7	0,8	4,9	2,0	3,6	1,2	0,8	2,5	0,0	50,0	1,6	2,7	0,1	1,8	3,9	4,3	1,0

201/261 202/261

Pos	WT	A	C	D	E	F	G	H	I	K	L	M	N	P	Q	R	S	T	V	w	Y
244 B	P	1,1	2,1	4,0	1,1	11,9	3,5	5,4	20,0	1,4	3,2	3,0	2,0	1,8	1,2	1,3	0,0	19,6	20,0	9,1	11,0
245 B	P	3,2	20,0	20,0	20,0	20,0	8,6	20,0	20,0	20,0	20,0	20,0	20,0	0,0	20,0	20,0	6,0	20,0	50,0	20,0	20,0
246 B	K	0,5	2,6	1,4	1,2	2,1	4,4	1,6	0,6	0,9	1,4	2,5	0,2	0,3	0,2	0,3	0,1	0,0	2,0	4,9	2,4
247 B	P	0,8	2,5	0,7	1,0	3,6	3,9	2,6	6,2	1,8	2,1	2,9	0,3	0,0	0,8	1,5	0,3	0,7	9,5	6,6	3,4
248 B	K	0,2	2,2	0,2	0,6	2,2	4,1	2,5	2,4	1,7	1,0	2,2	0,0	1,3	0,8	1,7	0,5	0,7	2,8	4,7	2,3
249 B	D	2,8	3,3	0,0	4,6	10,1	8,2	6,5	50,0	4,6	6,2	4,4	0,5	50,0	4,7	6,3	3,5	6,1	50,0	20,0	7,2
250 B	T	0,0	2,2	4,9	2,8	20,0	6,3	20,0	2,2	4,3	3,2	3,0	9,2	50,0	3,4	4,9	1,3	2,3	3,1	20,0	20,0
251 B	L	0,0	2,4	1,6	1,2	5,6	3,6	2,2	734	1,2	0,6	2,3	0,5	50,0	0,6	1,8	0,4	2,5	8,7	8,2	5,9
252 B	M	1,3	2,4	0,8	0,0	1,8	5,7	2,3	0,6	1,6	0,6	2,5	1,0	50,0	1,0	1,6	1,5	1,3	0,8	5,1	1,6
253 B	I	1,6	3,0	2,0	1,2	3,7	4,5	3,5	2,9	0,8	2,4	2,4	1,1	1,0	0,0	1,5	1,2	1,4	3,4	4,4	3,6
254 B	S	1,0	1,5	0,8	0,6	3,8	3,8	3,2	0,5	1,9	2,5	3,1	0,3	6,2	0,5	1,7	0,0	0,1	1,1	5,5	3,7
255 B	R	0,9	2,0	2,0	1,7	0,0	5,4	1,4	20,0	1,0	1,6	1,3	0,8	50,0	1,4	1,1	1,5	20,0	20,0	3,7	0,8
256 B	T	0,6	2,0	1,8	1,1	2,5	3,7	1,9	1,6	1,0	1,4	2,2	0,0	1,2	0,5	0,1	0,8	1,2	1,2	5,5	2,4
257 B	P	2,5	20,0	20,0	20,0	50,0	9,0	50,0	20,0	20,0	20,0	20,0	20,0	0,0	20,0	20,0	4,8	20,0	20,0	50,0	50,0
258 B	E	1,5	2,4	2,7	1,4	2,7	6,4	4,2	0,0	0,2	5,4	2,4	1,1	50,0	1,3	2,5	2,2	1,1	1,0	19,1	3,0
259 B	V	2,9	4,2	6,3	5,2	20,0	9,3	20,0	0,0	8,1	8,9	5,5	5,6	50,0	6,2	20,0	4,5	2,5	0,0	20,0	20,0
260 B	T	0,0	1,6	5,3	1,9	20,0	4,9	20,0	0,6	1,1	2,8	1,4	3,9	0,2	2,3	2,6	0,4	0,1	2,7	20,0	20,0
261 B	c	0,0	10,0	20,0	20,0	20,0	2,6	20,0	20,0	20,0	20,0	20,0	20,0	20,0	20,0	20,0	2,0	16,6	20,0	20,0	20,0

Pos	WT	A	C	D	E	F	G	H	I	K	L	M	N	P	Q	R	S	T	V	W	Y
262 B	V	2,1	2,4	2,7	2,4	8,1	7,2	3,8	1,8	3,5	8,6	3,4	2,7	50,0	3,2	4,8	2,9	1,9	0,0	14,7	9,1
263 B	V	2,2	3,7	4,7	11,2	20,0	9,1	20,0	15,0	13,7	2,8	20,0	5,4	50,0	13,0	20,0	3,6	2,1	0,0	20,0	20,0
264 B	V	2,1	3,0	4,6	2,7	8,6	6,8	6,6	0,0	1,8	1,8	3,7	3,6	10,1	3,0	2,2	2,6	2,2	1,0	12,7	20,0
265 B	D	4,5	5,2	4,8	4,7	5,0	0,0	3,8	8,5	1,8	2,6	4,1	1,8	50,0	4,5	5,3	4,5	6,0	9,2	12,2	5,6
266 B	V	5,3	5,5	7,2	12,7	20,0	12,0	20,0	2,1	20,0	20,0	20,0	2,7	50,0	18,3	20,0	5,9	4,7	0,0	50,0	50,0
267 B	S	2,8	4,3	6,2	3,8	0,0	7,4	1,0	50,0	1,0	0,3	3,2	3,2	0,5	1,5	0,8	3,3	11,6	50,0	6,3	50,0
268 B	H	2,6	3,7	5,1	4,1	4,9	6,0	1,8	2,6	0,0	2,5	3,8	2,6	3,4	2,1	1,8	2,5	3,8	2,7	7,8	5,5
269 B	E	0,4	2,4	1,7	0,8	2,8	3,7	2,6	1,1	1,0	1,6	3,0	0,0	12,8	0,5	0,7	0,3	0,7	0,6	5,1	2,7
270 B	D	0,0	1,6	1,1	7,3	4,8	4,3	2,6	20,0	3,8	14,5	3,8	1,2	5,9	6,3	2,1	0,3	1,9	5,4	16,3	5,6
271 B	P	1,1	3,3	5,6	3,4	4,1	5,5	4,2	20,0	1,9	3,6	3,9	3,3	7,4	2,7	0,0	1,5	2,2	5,2	4,8	4,4
272 B	Q	0,9	1,9	1,0	0,6	3,0	3,9	2,9	1,5	1,7	2,2	3,5	0,6	4,9	0,0	1,4	0,2	0,6	1,4	3,9	3,2
273 B	V	3,5	4,8	6,2	8,3	20,0	9,2	20,0	4,6	8,4	3,1	3,5	7,4	50,0	10,6	20,0	2,0	0,0	4,8	20,0	20,0
274 B	K	0,1	1,6	0,4	0,9	1,7	3,8	1,8	1,9	0,4	0,5	2,4	0,3	15,6	0,1	0,0	0,0	0,2	1,6	2,2	1,9
275 B	F	5,7	7,0	8,4	9,2	0,0	11,2	3,5	9,2	7,9	5,7	5,1	7,0	4,1	9,7	12,3	6,9	4,5	3,3	10,3	5,0
276 B	N	0,0	6,2	6,9	6,4	20,0	4,7	12,1	20,0	9,3	10,0	7,4	3,8	50,0	6,4	9,2	2,8	20,0	20,0	20,0	20,0
277 B	W	8,3	10,0	10,6	9,2	2,6	14,2	7,4	12,7	6,7	7,4	6,4	10,8	6,8	9,3	11,9	9,7	8,0	14,4	0,0	15,9
278 B	Y	0,0	2,3	17,4	4,0	50,0	5,1	50,0	20,0	2,8	20,0	2,1	12,6	11,0	4,4	2,0	0,8	2,5	19,8	20,0	4,2
279 B	V	3,1	3,5	4,2	2,9	20,0	8,5	13,9	0,4	0,0	2,9	2,0	3,4	20,0	1,4	4,0	4,2	2,4	1,2	20,0	20,0

203/261 204/261

Pos	WT	A	C	D	E	F	G	H	I	K	L	M	N	P	Q	R	S	T	V	W	Y
280 B	D	0,5	3,0	2,1	1,5	6,7	3,1	4,7	12,6	2,9	1,6	2,9	1,6	20,0	1,4	3,1	0,0	2,7	5,5	8,1	7,3
281 B	G	5,6	5,8	5,5	4,8	7,9	0,0	7,2	6,5	5,3	5,7	7,1	3,4	50,0	4,0	5,3	3,6	3,2	6,4	10,3	7,6
282 B	V	0,4	1,9	1,1	0,6	2,9	4,1	2,1	1,3	1,0	1,4	2,9	0,2	50,0	0,0	0,7	0,0	0,4	0,7	6,1	2,8
283 B	E	0,6	1,9	4,3	1,7	6,7	4,2	5,2	2,9	0,5	4,4	0,3	2,5	0,0	1,5	1,6	1,0	1,5	3,9	7,9	6,7
284 B	V	0,4	2,4	2,5	1,1	20,0	5,9	20,0	1,1	1,2	6,2	0,8	2,4	50,0	1,5	3,3	0,0	1,5	1,8	20,0	20,0
285 B	H	1,3	2,4	2,1	1,7	2,4	3,4	1,2	1,8	0,7	2,3	2,7	0,0	1,6	0,9	0,8	0,5	0,4	2,0	5,8	2,4
286 B	N	1,2	2,7	1,0	1,1	3,0	3,1	2,6	0,8	2,0	1,9	2,9	0,0	50,0	0,4	1,6	1,1	0,5	2,9	4,9	3,0
287 B	A	2,5	4,4	6,1	7,5	0,0	8,2	3,0	10,2	5,1	16,5	4,5	0,3	12,3	8,1	9,1	4,1	3,3	7,1	3,4	0,8
288 B	K	0,4	1,9	1,9	0,0	2,9	3,5	2,9	2,5	1,8	2,1	2,5	0,9	15,4	0,6	1,1	0,2	0,9	3,8	5,9	2,7
289 B	T	0,1	1,5	3,7	1,4	2,7	3,9	2,6	1,8	0,0	2,2	1,6	1,5	1,8	1,1	1,7	0,0	0,4	2,3	3,4	2,5
290 B	K	0,9	1,8	0,8	0,5	2,4	0,8	2,7	3,0	1,3	1,3	2,6	0,2	50,0	0,7	1,5	0,0	0,6	2,9	5,0	2,7
291 B	P	1,2	2,1	2,5	0,5	3,9	4,6	3,4	0,7	0,0	3,4	1,5	1,1	0,6	0,1	1,1	1,1	0,9	1,5	3,2	2,6
292 B	R	0,8	2,6	3,3	1,2	4,9	3,6	6,8	3,1	2,0	2,4	2,2	2,2	16,8	1,5	1,8	0,1	0,0	3,2	7,6	5,2
293 B	E	0,0	3,0	4,1	2,8	7,3	3,6	5,8	5,8	2,6	4,5	3,2	2,2	1,3	2,2	2,5	0,0	1,2	7,8	7,0	6,9
294 B	E	2,5	3,3	3,9	2,3	8,3	6,8	4,4	5,6	3,6	2,3	3,7	4,1	0,0	3,3	5,0	2,1	2,9	5,0	6,7	11,9
295 B	Q	1,1	2,2	1,9	0,6	3,8	2,8	3,1	8,0	1,4	2,2	3,4	1,0	0,4	0,4	1,1	0,0	3,9	6,6	6,1	3,5
296 B	Y	1,5	2,7	1,2	1,2	4,1	4,1	3,5	1,1	1,8	2,7	3,5	0,0	20,0	0,6	1,9	1,2	1,4	1,3	6,4	4,0
297 B	N	3,9	4,5	10,1	6,0	15,5	7,3	16,7	6,6	0,0	5,1	4,6	7,3	20,0	4,4	4,2	3,6	4,1	7,9	18,0	15,0

Pos	WT	A	C	D	E	F	G	H	I	K	L	M	N	P	Q	R	S	T	V	W	Y
298 B	S	1,7	2,5	3,5	2,5	2,5	3,7	2,4	3,0	0,0	1,8	2,3	0,4	50,0	1,2	1,0	0,9	2,2	3,3	5,5	2,0
299 B	T	0,0	2,7	7,2	11,1	20,0	4,8	20,0	7,5	6,9	20,0	7,1	4,8	50,0	9,8	17,9	0,3	1,3	5,8	20,0	20,0
300 B	Y	3,8	5,2	8,0	4,3	20,0	8,6	20,0	12,2	0,0	4,3	3,2	6,5	50,0	4,0	3,8	4,3	3,6	9,1	20,0	6,4
301 B	R	1,2	1,8	2,3	1,1	20,0	5,8	11,3	5,2	0,3	5,0	2,0	1,6	14,1	0,6	0,4	1,8	1,1	0,0	17,9	20,0
302 B	V	3,5	4,8	5,5	3,7	0,2	9,6	1,1	0,5	2,6	3,5	2,5	4,7	9,6	4,1	0,6	4,3	2,0	0,0	20,0	0,2
303 B	V	0,2	0,0	0,2	1,0	20,0	5,0	13,3	5,1	1,7	10,4	1,9	2,0	8,6	2,0;	4,7	0,6	0,5	1,3	20,0	20,0
304 B	S	1,5	2,3	8,2	20,0	20,0	7,6	20,0	7,6	20,0	20,0	20,0	6,3	50,0	20,0	20,0	0,0	2,7	3,8	20,0	20,0
305 B	V	0,1	1,2	3,3	1,1	20,0	4,6	20,0	3,2	1,1	11,0	1,5	1,8	50,0	0,6	2,0	0,6	0,0	0,7	20,0	20,0
306 B	L	4,7	6,8	6,3	4,3	10,4	11,1	7,8	4,2	3,0	0,0	3,8	5,7	13,4	4,4	14,1	5,5	4,3	6,0	20,0	12,1
307 B	T	1,5	3,0	2,7	1,7	4,1	5,2	3,0	1,6	1,9	3,1	3,4	1,7	0,0	1,7	1,9	1,5	1,4	2,0	4,4	4,3
308 B	V	0,0	0,6	7,6	20,0	20,0	6,6	20,0	20,0	16,1	15,1	20,0	12,4	50,0	20,0	20,0	1,2	3,6	4,3	20,0	20,0
309 B	L	1,4	3,0	2,2	1,1	3,0	6,0	3,5	20,0	2,4	1,7	3,6	0,2	0,0	1,6	2,3	1,8	14,3	20,0	5,1	3,3
310 B	H	2,4	2,9	2,7	4,9	20,0	6,8	4,4	4,8	3,1	15,0	3,4	0,0	2,3	4,6	7,0	1,8	1,6	3,8	20,0	20,0
311 B	Q	0,0	2,2	1,3	0,7	2,1	3,3	2,4	12,6	0,6	0,9	2,3	0,6	3,2	0,4	0,8	0,2	1,6	18,8	4,6	2,0
312 B	N	0,0	1,0	0,2	0,3	6,0	5,4	2,3	12,0	2,1	2,9	1,6	0,9	50,0	1,3	5,7	0,1	5,6	3,8	8,0	7,8
313 B	W	5,3	6,6	7,3	5,4	0,0	11,4	6,2	20,0	4,0	5,2	4,3	8,0	50,0	6,5	8,9	6,6	17,2	20,0	2,1	0,9
314 B	L	1,7	2,2	3,1	0,0	6,4	5,6	1,5	2,1	0,6	0,2	1,1	1,9	50,0	0,8	1,0	1,7	0,9	3,1	3,7	11,3
315 B	D	1,4	2,3	2,4	0,7	6,0	5,5	2,3	4,8	2,2	1,0	2,9	1,8	50,0	1,0	2,2	0,2	0,0	4,5	8,5	6,8

205/261 206/261

Pos	WT	A	C	D	E	F	G	H	I	K	L	M	N	P	Q	R	S	T	V	W	Y
316 B	G	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	0,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0
317 B	K	0,9	2,3	4,3	2,8	1,2	4,0	0,6	13,9	0,0	4,8	1,6	1,3	50,0	4,2	0,9	0,4	13,8	10,1	20,0	1,7
318 B	E	0,7	1,2	3,1	1,0	7,0	5,1	8,2	0,4	1,0	5,7	1,7	2,3	3,8	1,0	1,6	0,4	0,0	1,0	3,8	7,7
319 B	Y	6,5	7,1	8,5	8,8	0,0	12,5	3,9	3,1	5,2	5,4	8,4	7,2	50,0	9,0	13,7	7,2	5,8	3,9	20,0	1,7
320 B	K	3,1	4,3	7,3	4,3	20,0	8,6	15,0	1,4	0,0	11,6	3,6	6,6	50,0	2,9	2,4	4,0	3,3	2,0	20,0	20,0
321 B	C	0,0	6,5	20,0	20,0	20,0	6,6	20,0	20,0	20,0	20,0	20,0	20,0	19,7	20,0	20,0	3,1	11,2	20,0	20,0	20,0
322 B	K	2,3	3,2	3,5	1,8	20,0	7,9	20,0	1,1	0,6	4,9	3,7	2,2	50,0	0,9	0,3	3,3	1,6	0,0	20,0	20,0
323 B	V	4,0	4,6	6,9	8,1	20,0	10,6	20,0	9,0	17,1	7,9	8,1	10,5	50,0	8,7	20,0	5,6	4,6	0,0	20,0	20,0
324 B	S	1,3	3,0	1,4	0,0	2,1	6,0	4,4	1,3	2,4	0,6	2,7	2,2	50,0	1,3	3,6	1,5	1,6	1,8	3,6	2,4
325 B	N	3,4	5,1	9,0	4,7	20,0	8,2	20,0	16,6	16,6	20,0	20,0	0,0	50,0	6,3	20,0	4,6	8,8	17,8	20,0	20,0
326 B	K	0,3	2,1	2,0	0,9	1,0	3,5	2,0	2,9	0,9	2,9	2,8	0,1	4,4	0,0	1,1	0,1	3,2	2,1	5,2	0,7
327 B	A	1,9	3,3	4,5	3,5	20,0	7,0	20,0	20,0	0,3	0,0	1,9	1,9	20,0	3,0	2,3	3,3	20,0	20,0	20,0	20,0
328 B	L	3,7	3,6	3,8	4,4	50,0	8,4	7,0	50,0	3,8	0,0	2,6	4,0	50,0	4,2	8,7	4,8	2,9	12,3	50,0	50,0
329 B	P	3,3	8,5	20,0	20,0	50,0	8,0	16,5	50,0	18,5	20,0	14,7	20,0	0,0	20,0	20,0	1,4	17,1	16,4	50,0	50,0
330 B	A	0,5	2,0	2,8	0,5	2,4	3,9	1,2	4,0	0,0	2,0	2,1	0,8	20,0	0,0	0,5	0,8	0,2	4,6	8,2	2,6
331 B	P	1,7	3,8	6,4	10,1	20,0	4,7	11,0	10,1	7,5	20,0	5,5	5,0	0,0	7,6	7,4	2,6	20,0	10,1	17,6	20,0
332 B	I	1,7	2,9	1,3	1,7	14,8	7,0	13,9	1,7	3,1	0,0	1,7	1,7	50,0	1,8	5,3	2,0	1,9	3,4	20,0	20,0
333 B	E	1,9	2,5	1,9	0,0	8,9	5,9	8,2	1,2	3,0	6,4	3,4	2,0	3,1	1,1	2,3	1,8	1,6	1,6	8,9	9,3

Pos	WT	A	C	D	E	F	G	H	I	K	L	M	N	P	Q	R	S	T	V	W	Y
334 B	K	2,9	3,9	3,7	2,6	20,0	8,3	12,1	1,5	2,6	5,3	3,7	4,3	50,0	1,9	0,0	3,4	1,8	1,4	9,9	20,0
335 B	T	0,0	2,1	7,2	7,0	4,2	0,4	3,3	17,3	6,5	7,7	5,2	5,5	3,5	7,0	5,7	0,2	5,5	11,5	5,2	3,1
336 B	I	0,5	1,6	2,1	0,7	20,0	5,0	6,1	0,0	1,3	5,3	2,1	1,8	20,0	0,6	3,1	1,1	0,8	0,7	19,4	20,0
337 B	s	1,1	2,1	4,0	2,0	3,1	3,2	2,0	50,0	0,0	1,6	0,9	1,9	15,8	1,1	2,2	1,4	50,0	50,0	5,5	3,9
338 B	K	0,6	2,3	3,0	3,0	9,4	5,3	10,6	2,2	1,1	0,0	3,2	1,5	16,2	2,7	2,7	1,1	2,8	3,5	8,1	11,0
339 B	A	1, 1	2,4	1,2	0,8	4,3	3,6	3,7	2,6	1,8	2,6	3,5	0,0	2,3	0,5	1,3	0,2	0,8	2,0	6,7	3,8
340 B	K	0,9	2,0	1,4	0,8	3,0	3,4	2,9	2,1	0,8	2,5	2,3	0,2	1,0	0,1	1,2	0,0	0,5	2,0	5,5	3,2

Tecnologia SPA®; estrutura modelo 1IIS; carboidrato sem posições flutuantes

Tabela 56

207/261 208/261

Pos	WT	A	C	D	E	F	G	H	I	K	L	M	N	P	Q	R	S	T	V	w	Y
239 A	S	0,2	4,6	2,7	0,0	20,0	4,6	14,5	11,0	1,9	0,3	2,0	1,9	8,1	1,4	2,6	0,4	5,7	11,6	20,0	20,0
240 A	V	1,5	2,4	2,4	6,9	20,0	7,4	20,0	5,1	9,9	5,9	5,5	2,4	1,1	12,3	13,1	2,6	0,5	0,0	20,0	20,0
263 A	V	2,3	2,8	6,3	16,5	20,0	8,8	20,0	9,6	7,3	7,3	15,3	4,8	50,0	16,4	17,4	2,8	1,4	0,0	20,0	20,0
264 A	V	1,8	3,1	2,6	1,8	0,0	6,3	1,9	0,6	2,4	0,8	2,7	2,1	1,6	2,3	2,7	2,3	1,1	0,5	3,5	0,0
266 A	V	4,9	5,2	6,9	12,3	20,0	11,1	20,0	0,8	11,9	20,0	8,5	6,6	50,0	12,5	20,0	6,1	3,7	0,0	20,0	20,0
296 A	Y	3,4	2,7	1,1	0,0	50,0	0,7	50,0	5,0	3,6	3,5	4,2	0,9	50,0	0,9	2,9	2,2	5,3	5,5	16,1	18,4
299 A	T	0,7	3,2	9,9	10,4	20,0	6,2	20,0	10,7	6,7	20,0	4,1	12,9	50,0	5,9	11,8	0,0	2,5	8,2	13,3	20,0
325 A	N	2,5	3,5	7,7	2,5	20,0	8,0	20,0	0,0	6,1	20,0	7,8	1,2	12,8	0,8	20,0	2,7	0,0	1,0	20,0	20,0

Pos	WT	A	C	D	E	F	G	H	I	K	L	M	N	P	Q	R	S	T	V	W	Y
328 A	L	6,1	6,3	7,1	4,2	50,0	8,8	20,0	50,0	4,6	0,0	7,2	6,1	50,0	4,0	8,3	6,7	50,0	50,0	20,0	50,0
330 A	A	0,9	1,8	1,2	0,0	2,5	4,0	2,9	1,7	1,2	1,6	2,8	0,0	20,0	0,4	1,0	0,2	0,5	1,7	6,2	2,9
332 A	I	1,9	3,8	4,6	1,3	5,1	7,1	1,8	3,4	0,2	0,0	2,6	3,8	20,0	0,6	2,4	2,3	2,5	4,2	20,0	5,6
239 B	S	1,0	2,4	3,5	2,0	6,7	5,6	2,9	3,1	0,3	0,0	1,9	2,1	50,0	1,5	1,8	1,4	1,4	5,2	20,0	4,2
240 B	V	0,3	2,4	6,7	11,7	20,0	6,6	20,0	8,3	12,3	20,0	14,2	7,4	0,0	13,4	20,0	1,3	1,9	0,9	20,0	20,0
263 B	V	2,4	3,9	4,5	12,5	20,0	9,3	20,0	15,8	17,1	2,1	20,0	5,3	50,0	13,8	20,0	3,9	2,2	0,0	20,0	20,0
264 B	V	2,2	3,2	4,8	2,7	7,4	6,9	6,0	0,0	1,9	1,9	3,8	3,7	9,9	3,1	2,2	2,7	2,4	0,9	14,7	18,2
266 B	V	5,4	5,5	7,5	13,2	20,0	12,1	20,0	2,6	20,0	20,0	20,0	5,4	50,0	16,1	20,0	6,0	4,7	0,0	50,0	50,0
296 B	Y	1,5	2,7	1,3	1,2	4,0	4,1	3,6	1,1	1,9	2,6	3,5	0,0	20,0	0,7	1,8	1,1	1,4	1,3	6,5	4,2
299 B	T	0,0	2,2	7,5	10,2	20,0	4,8	20,0	7,7	5,8	20,0	10,3	5,1	50,0	10,2	18,4	0,3	1,1	5,4	20,0	20,0
325 B	N	3,4	5,1	8,6	5,0	20,0	8,2	20,0	16,7	20,0	20,0	20,0	0,0	19,7	6,3	20,0	4,6	8,6	18,2	20,0	20,0
328 B	L	3,6	3,5	3,8	3,9	50,0	8,3	7,0	50,0	2,9	0,0	1,9	3,8	50,0	3,4	8,4	4,7	2,9	12,5	50,0	50,0
330 B	A	0,7	2,1	2,9	0,7	2,7	4,0	1,4	4,8	0,0	2,2	2,3	0,8	20,0	0,2	0,8	1,1	0,2	4,7	7,8	3,2
332 B	I	1,8	2,9	1,2	1,8	13,5	7,0	9,9	1,7	3,2	0,0	1,7	1,9	50,0	1,2	5,4	2,0	2,0	3,3	20,0	20,0

Tecnologia SPA®; estrutura modelo 1IIS; carboidrato +

Tabela 57

Pos	WT	A	C	D	E	F	G	H	I	K	L	M	N	P	Q	R	S	T	V	W	Y
239 A	S	1,2	3,5	1,7	0,0	20,0	5,8	11,0	6,6	2,9	3,9	3,9	2,7	8,5	1,3	2,7	0,6	3,5	5,4	20,0	20,0

Pos	WT	A	C	D	E	F	G	H	I	K	L	M	N	P	Q	R	S	T	V	W	Y
240 A	V	1,2	2,4	6,0	14,0	20,0	7,1	20,0	6,7	9,4	10,0	7,5	4,4	1,8	14,8	20,0	2,0	0,4	0,0	20,0	20,0
263 A	V	0,0	0,4	1,0	8,7	20,0	6,9	4,4	11,7	4,9	16,0	19,2	0,8	50,0	11,7	20,0	1,4	0,1	1,0	20,0	20,0
264 A	V	2,9	3,7	6,3	2,8	11,6	7,6	13,2	0,0	3,2	3,4	4,1	4,2	7,1	2,9	3,4	3,1	1,9	0,8	12,8	16,3
266 A	V	4,8	5,9	6,8	9,5	50,0	10,3	20,0	3,5	12,7	12,2	12,7	4,1	50,0	11,9	11,9	5,2	2,9	0,0	50,0	50,0
296 A	Y	0,8	2,0	1,5	0,1	0,2	3,4	1,5	6,6	1,7	0,6	1,8	1,2	2,6	0,0	1,6	0,2	2,5	5,6	3,8	0,0
299 A	T	1,9	3,7	7,5	0,0	20,0	7,9	14,2	2,9	0,8	3,4	4,4	2,3	50,0	1,9	3,0	3,5	4,1	3,3	20,0	20,0
325 A	N	1,0	1,4	3,1	2,8	20,0	7,4	20,0	8,5	7,7	10,4	6,1	2,8	15,4	5,4	20,0	0,0	0,1	3,8	20,0	20,0
328 A	L	2,5	5,3	4,0	1,9	50,0	7,5	20,0	20,0	1,6	0,2	0,0	2,9	50,0	0,4	4,8	3,2	2,9	7,0	50,0	50,0
330 A	A	0,9	2,1	1,8	1,2	2,4	2,7	3,1	3,1	1,4	2,1	3,5	0,5	20,0	0,8	1,0	0,0	0,5	2,9	5,2	2,9
332 A	I	2,9	3,7	3,9	0,9	, 1	7,8	2,5	0,0	2,7	0,8	2,8	3,5	50,0	0,7	3,7	2,9	2,5	1,0	8,1	6,9
239 B	S	1,9	3,1	3,0	1,9	1,5	6,2	2,3	14,1	1,8	1,4	2,9	1,8	0,0	1,9	3,2	1,9	2,3	7,7	6,6	15,8
240 B	V	0,5	1,7	5,0	13,3	20,0	6,6	20,0	1,2	12,4	12,1	8,8	4,6	6,3	20,0	20,0	1,0	0,2	0,0	20,0	20,0
263 B	V	2,9	3,2	6,4	18,2	10,1	9,2	6,9	12,8	6,0	20,0	10,3	5,7	50,0	17,5	20,0	3,2	2,2	0,0	20,0	20,0
264 B	V	2,9	3,6	4,4	3,0	8,8	7,1	6,2	0,0	2,3	1,9	4,5	3,4	1,7	3,2	3,5	3,5	2,0	0,9	12,0	16,4
266 B	V	4,4	4,6	2,6	6,6	20,0	10,7	20,0	0,0	4,9	1,7	8,5	5,6	50,0	6,0	12,4	5,3	4,6	1,5	20,0	50,0
296 B	Y	0,0	7,1	6,7	7,2	20,0	0,1	18,6	50,0	7,0	2,7	6,6	6,8	50,0	7,2	9,3	2,3	50,0	50,0	20,0	14,1
299 B	T	0,0	3,2	10,4	6,3	20,0	5,5	20,0	15,9	3,2	5,9	4,4	6,4	50,0	5,7	9,4	1,2	1,4	13,7	20,0	20,0
325 B	N	1,4	2,5	5,0	0,0	20,0	7,0	20,0	20,0	1, o	2,2	1,0	0,3	1,9	1,1	20,0	2,6	5,1	20,0	20,0	20,0

209/261 210/261

Pos	WT	A	C	D	E	F	G	H	I	K	L	M	N	P	Q	R	S	T	V	W	Y
328 B	L	0,4	1,3	5,6	0,0	50,0	4,5	50,0	50,0	1,9	2,4	2,4	8,3	50,0	0,8	16,4	1,0	1,2	50,0	50,0	50,0
330 B	A	0,6	1,4	2,5	0,9	3,1	2,5	1,2	20,0	0,0	2,4	2,1	0,3	20,0	0,4	0,6	0,0	40,	20,0	13,5	3,4
332 B	I	4,3	5,3	5,7	0,0	11,4	9,3	4,3	2,5	5,8	2,0	4,0	6,5	17,9	3,7	5,9	4,6	4,2	3,7	20,0	11,6

tecnologia SPA®; estrutura modelo D129G 1IIX ; carboidrato +

Tabela 58

Pos	WT	A	C	D	E	F	G	H	I	K	L	M	N	P	Q	R	S	T	V	W	Y
239 A	S	1,2	2,3	2,2	1,8	7,9	5,5	7,6	0,5	0,2	1,8	2,6	1,4	0,9	1,3	1,9	1,5	0,8	0,0	8,6	9,6
240 A	V	0,7	2,9	6,8	4,3	20,0	6,5	20,0	0,0	10,7	20,0	3,1	9,1	2,1	7,7	20,0	1,4	1,1	2,4	20,0	20,0
263 A	V	1,7	2,9	4,6	18,8	20,0	8,4	5,8	15,1	2,3	14,5	2,1	3,2	50,0	20,0	15,0	3,6	1,2	0,0	20,0	20,0
264 A	V	2,7	3,3	3,6	1,5	13,9	6,7	5,9	0,0	2,3	4,9	3,7	3,2	1,9	2,5	3,0	3,0	2,5	0,7	19,9	19,0
266 A	V	3,5	3,5	5,7	12,4	20,0	10,0	20,0	2,7	6,3	7,8	7,4	5,2	50,0	16,6	20,0	4,2	1,7	0,0	20,0	50,0
296 A	Y	2,6	50,0	50,0	50,0	50,0	0,0	50,0	50,0	18,5	18,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	13,6
299 A	T	0,2	0,7	6,6	1,2	20,0	5,6	9,6	1,6	0,8	1,5	1,8	4,8	50,0	1,0	9,2	0,0	0,0	1,6	20,0	20,0
325 A	N	3,1	3,6	7,3	2,4	20,0	7,7	20,0	20,0	20,0	10,0	13,1	3,6	50,0	0,0	20,0	4,0	9,7	20,0	20,0	20,0
328 A	L	0,6	0,0	1,5	5,4	50,0	1,6	50,0	50,0	3,1	4,2	9,6	1,4	50,0	6,9	9,6	0,6	0,1	50,0	50,0	50,0
330 A	A	1,9	2,5	4,1	2,8	4,5	4,1	3,0	3,2	1,0	2,7	3,5	2,1	20,0	2,4	2,6	1,3	0,0	3,9	7,6	5,3
332 A	I	2,3	3,5	2,2	0,8	20,0	6,8	9,6	0,0	3,4	0,2	2,6	2,8	14,5	3,3	4,6	2,6	1,3	0,9	10,5	20,0
239 B	s	1,4	3,6	2,5	1,4	16,8	5,8	6,2	5,0	2,5	1,4	2,0	3,8	0,3	0,5	2,4	0,0	1,6	5,3	20,0	19,5

Pos	WT	A	C	D	E	F	G	H	I	K	L	M	N	P	Q	R	S	T	V	W	Y
240 B	V	0,0	2,6	12,8	18,6	20,0	5,7	20,0	12,7	10,4	20,0	8,5	15,1	3,1	20,0	20,0	l,o	0,2	2,4	20,0	20,0
263 B	V	1,1	2,4	3,6	20,0	20,0	7,8	17,7	11,8	4,5	20,0	6,3	3,3	50,0	20,0	20,0	3,2	1,2	0,0	20,0	20,0
264 B	V	3,3	4,0	5,0	2,9	14,2	7,5	4,8	0,0	2,6	3,6	4,6	3,5	1,7	3,1	4,1	3,9	2,9	1,3	6,9	20,0
266 B	V	2,9	3,3	4,9	11,3	50,0	9,5	20,0	20,0	20,0	7,9	15,0	4,5	50,0	4,9	20,0	1,9	0,0	3,6	50,0	50,0
296 B	Y	2,8	50,0	50,0	50,0	50,0	0,0	50,0	50,0	17,7	18,7	50,0	05,0	05,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	50,0	11,3
299 B	T	0,0	3,8	12,6	9,2	20,0	5,9	20,0	7,3	4,8	3,2	4,3	8,0	50,0	12,3	8,8	0,2	2,1	4,4	20,0	20,0
325 B	N	0,3	2,0	5,5	2,2	50,0	6,1	20,0	0,0	10,5	15,5	14,6	1,3	10,0	2,4	20,0	2,3	2,0	1,0	20,0	50,0
328 B	L	5,4	5,7	7,3	4,4	50,0	9,8	20,0	50,0	2,5	0,0	5,1	5,9	50,0	2,8	7,4	6,1	6,4	50,0	50,0	5,0,
330 B	A	0,6	1,4	3,2	1,3	3,9	3,2	2,7	4,0	1,3	3,7	3,1	0,7	20,0	0,6	1,3	0,0	0,4	4,2	8,2	3,6
332 B	I	1,9	3,1	2,7	1,7	5,2	6,9	3,1	0,4	1,3	0,0	1,9	2,6	7,7	1,3	2,2	2,3	1,6	2,0	10,4	5,6

211/261 212/261

Tecnologia; D129G 1E4K estrutura modelo; carboidrato +

Tabela 59

Pos	WT	A	C	D	E	F	G	H	I	K	L	M	N	P	Q	R	S	T	V	W	Y
239 A	S	1,4	2,6	3,1	1,0	20,0	5,7	4,8	3,4	2,0	1,2	2,6	1,6	4,8	0,0	2,1	1,3	2,1	3,3	13,8	19,6
240 A	V	2,9	3,5	3,7	4,6	20,0	8,2	10,8	0,0	9,1	3,2	5,4	3,1	4,8	5,5	17,5	4,0	1,8	1,2	20,0	20,0
263 A	V	3,6	4,9	6,2	8,7	20,0	9,9	20,0	3,7	4,2	0,5	6,7	6,1	50,0	9,5	20,0	5,1	3,6	0,0	20,0	20,0
264 A	V	1,8	2,8	3,3	2,0	2,9	6,2	3,1	0,0	2,4	0,8	3,0	2,4	6,1	1,4	2,8	2,4	1,9	0,8	10,2	2,2
266 A	V	4,4	5,2	4,9	7,1	20,0	10,6	20,0	1, o	12,1	4,8	9,1	4,6	50,0	7,9	12,6	5,8	3,5	0,0	20,0	20,0

Pos	WT	A	C	D	E	F	G	H	I	K	L	M	N	P	Q	R	S	T	V	w	Y
296 A	Y	1,2	2,9	0,7	1,4	3,1	3,9	2,7	2,4	2,3	1,9	2,2	0,0	1,6	1,4	3,0	0,9	l,o	3,5	6,0	2,6
299 A	T	0,0	2,6	6,0	11,5	20,0	5,3	20,0	20,0	6,0	20,0	4,4	3,0	50,0	14,1	13,2	0,9	3,8	15,1	15,0	20,0
325 A	N	5,2	7,0	6,6	6,9	50,0	11,3	20,0	1,3	14,3	13,5	13,9	0,0	5,0	6,0	20,0	6,0	4,6	3,2	20,0	20,0
328 A	L	4,8	5,5	7,0	3,2	20,0	10,5	20,0	50,0	5,1	0,0	8,5	5,5	50,0	3,5	8,2	5,5	13,4	50,0	20,0	50,0
330 A	A	0,9	1,8	1,1	0,9	3,5	4,0	3,0	2,3	1,2	1,6	2,8	0,0	14,5	0,9	1,1	0,1	0,4	2,0	6,4	3,2
332 A	I	5,3	6,4	6,7	4,8	8,2	9,9	5,2	3,1	0,0	3,6	5,2	6,8	20,0	3,5	4,6	5,5	4,8	4,0	11,2	7,1
239 B	s	0,7	2,3	2,6	2,0	5,3	5,1	3,3	1,7	0,0	0,0	2,0	0,8	15,5	0,9	0,8	0,7	0,7	3,3	8,2	6,0
240 B	V	2,3	3,0	4,1	7,3	20,0	8,1	20,0	5,1	20,0	11,8	10,9	3,8	2,0	17,0	20,0	3,6	1,6	0,0	20,0	20,0
263 B	V	3,2	4,3	7,3	8,3	20,0	9,6	20,0	13,3	8,5	0,6	20,0	6,0	50,0	8,5	20,0	4,6	4,0	0,0	20,0	20,0
264 B	V	2,1	3,2	3,7	2,7	17,8	6,6	11,5	0,0	2,0	0,8	3,5	3,0	7,8	2,0	1,5	2,5	1,3	1,0	13,9	20,0
266 B	V	5,0	5,0	5,2	16,3	20,0	11,2	20,0	2,3	20,0	14,3	17,3	2,5	50,0	11,6	20,0	5,4	3,9	0,0	20,0	20,0
296 B	Y	0,9	2,3	1,0	0,5	2,7	3,7	2,5	1,2	1,3	2,1	3,0	0,0	7,0	0,4	1,1	0,3	0,8	1,8	6,0	2,4
299 B	T	1,1	2,2	7,6	5,4	20,0	6,4	12,8	1,8	3,9	17,5	6,9	3,9	20,0	4,6	10,3	0,8	0,0	1,9	20,0	20,0
325 B	N	10,1	11,5	13,1	11,2	20,0	15,7	20,0	8,6	14,3	17,1	20,0	0,0	16,1	10,6	20,0	11,1	10,9	10,5	20,0	20,0
328 B	L	2,9	4,1	4,8	3,5	50,0	8,5	1,7	9,6	1,5	0,0	1,5	3,5	50,0	3,3	2,0	3,3	1,9	5,2	50,0	50,0
330 B	A	0,1	2,0	1,4	1,8	1,6	4,0	3,0	2,0	0,5	0,5	2,6	0,0	20,0	0,7	2,0	0,3	0,6	2,1	4,4	2,4
332 B	I	3,4	4,4	3,5	3,1	6,1	8,2	4,1	0,0	3,3	1,3	3,3	4,0	15,7	0,8	2,1	3,9	2,7	1,1	20,0	6,1

213/261

Tecnologia SPA®; estrutura modelo Fc/FcyRIIb; carboidrato 214/261

Os resultados dos cálculos de projeto apresentados acima nas tabelas 1-59 foram usados para construir uma série de bibliotecas de variante de Fc para produção e escolha experimental. Bibliotecas experimentais foram projetadas em ciclos sucessivos de escolha computacional e experimental. O projeto de bibliotecas de Fc subsequentes se beneficiou de feedback de bibliotecas anteriores, e assim tipicamente compreendeu combinações de variantes de Fc que mostraram propriedades favoráveis na escolha prévia.

O conjunto inteiro de variantes de Fc que foi construído e experimentalmente testado é mostrado na tabela 60. nessa tabela, a linha 1 lista as posições variáveis, e as linhas que se seguem indicam os aminoácidos naquelas posições variáveis para WT e as variantes de Fc. Por exemplo, variante 18 tem as seguintes quatro mutações: F241 E, F243Y, ETIL262T, e ETIL264R. Os resíduos de posição variável que compõem esse conjunto de variantes de Fc são ilustrados estruturalmente na figura 3, e são apresentados no contexto da seqüência de Fc de IgGl humana na figura 4.

Tabela 60

Pos.	234	235	239	240	241	243	244	245	247	262	263	264	265	266	267	269	296	297	298	299	313	325	326	327	328	329	330	332	333	334
WT	L	L	S	V	F	F	P	P	P	V	V	V	D	V	S	E	Y	N	S	T	W	N	K	A	L	P	A	I	E	K
1												A
2												L
3												I
4					W
5					L
6						W
7						L
8					L	L				1'		I
9					W	W
10					W	W				A		A
11					L					I
12						L						I
13						L				I		W
14					Y	Y				T		T
15					E	R				E		R
16					E	Q				T		E

Pos.

234

235

239

240

241

243

244

245

247

262

263

264

265

266

267

269

296

297

298

299

313

325

326

327

328

329

330

332

333

334

WT

L

L

S

V

F

F

P

P

P

V

V

V

D

V

S

E

Y

N

S

T

W

N

K

A

L

P

A

I

E

K

17

R

Q

T

R

18

E

Y

T

R

19

M

20

E

21

F

22

E

23

M

E

24

H

25

A

26

V

27

F

28

H

A

V

30

I

E

31

E

R

E

R

E

32

E

Q

T

E

E

33

R

Q

T

R

E

34

E

Y

T

R

E

215/261 216/261

Pos .	234	235	239	240	241	243	244	245	247	262	263	264	265	266	267	269	296	297	298	299	313	325	326	327	328	329	330	332	333	334
WT	L	L	S	V	F	F	P	P	P	V	V	V	D	V	S	E	Y	N	S	T	W	N	K	A	L	P	A	I	E	K
35																			A
36																			A									E
37																			A										A	A
41			E																									E
42			Q																									E
43			E
44													G
45													N
46			E										G
47			E										N
48			E										Q
49																	E
50																	Q
51																			T
52																			N
53																				I
54																								S

Pos.	234	235	239	240	241	243	244	245	247	262	263	264	265	266	267	269	296	297	298	299	313	325	326	327	328	329	330	332	333	334
WT	L	L	S	V	F	F	P	P	P	V	V	V	D	V	S	E	Y	N	S	T	W	N	K	A	L	P	A	I	E	K
55																								N
56															Q									S
57															L									S
58																								L
59																										F
60																											L
61																											Y
62																												D
62																												D
63																		S
64																		D
65																		S										E
66																		D										E
67																		E										E
68													Y					D										E
69													Y					D										E
70													F					E										E

217/261 218/261

Pos .	234	235	239	240	241	243	244	245	247	262	263	264	265	266	267	269	296	297	298	299	313	325	326	327	328	329	330	332	333	334
WT	L	L	S	V	F	F	P	P	P	V	V	V	D	V	S	E	Y	N	S	T	W	N	K	A	L	P	A	I	E	K
71																												E
72																									Q			E
73																												N
74																												Q
75												T
76												F
77				I
78											I
79														I
80																				A
81																				S
82																				V
83																						Q
84																						L
85																						I
86			D
87			N

Pos.	234	235	239	240	241	243	244	245	247	262	263	264	265	266	267	269	296	297	298	299	313	325	326	327	328	329	330	332	333	334
WT	L	L	S	V	F	F	P	P	P	V	V	V	D	V	S	E	Y	N	S	T	W	N	K	A	L	P	A	I	E	K
88			F
89			D																									D
90			D																									E
91			D																									N
92			D																									Q
93			E																									D
94			E																									N
95			E																									Q
96			N																									D
97			N																									E
98			N																									N
99			N																									Q
100			Q																									D
101			Q																									N
102			Q																									Q
103																							E
104																	D

219/261 220/261

Pos.	234	235	239	240	241	243	244	245	247	262	263	264	265	266	267	269	296	297	298	299	313	325	326	327	328	329	330	332	333	334
WT	L	L	S	V	F	F	P	P	P	V	V	V	D	V	S	E	Y	N	S	T	W	N	K	A	L	P	A	I	E	K
105																	N
106					Y	Y				T		T						D										E
107																											Y	E
108												I															Y	E
109																											L	E
110												I															L	E
111	D
112	E
112	N
114	Q
115	T
116	H
117	Y
118	I
119	V
120	F
121		D

Pos.	234	235	239	240	241	243	244	245	247	262	263	264	265	266	267	269	296	297	298	299	313	325	326	327	328	329	330	332	333	334
WT	L	L	S	V	F	F	P	P	P	V	V	V	D	V	S	E	Y	N	S	T	W	N	K	A	L	P	A	I	E	K
122		S
123		N
124		Q
125		T
126		H
127		Y
128		I
129		V
130		F
131			T
132			H
133			Y
134				A
135				T
136				M
137											A
138											T

221/261 222/261

Pos.	234	235	239	240	241	243	244	245	247	262	263	264	265	266	267	269	296	297	298	299	313	325	326	327	328	329	330	332	333	334
WT	L	L	S	V	F	F	P	P	P	V	V	V	D	V	S	E	Y	N	S	T	W	N	K	A	L	P	A	I	E	K
139											M
140												M
141												Y
142														A
143														T
144														M
145																H
146																Y
147																F
148																R
149																	S
150																	T
151																	L
152																	I
153																			H
154																				H
155																											V

Pos.	234	235	239	240	241	243	244	245	247	262	263	264	265	266	267	269	296	297	298	299	313	325	326	327	328	329	330	332	333	334
WT	L	L	S	V	F	F	P	P	P	V	V	V	D	V	S	E	Y	N	S	T	W	N	K	A	L	P	A	I	E	K
156																											I
157																											F
158																											R
159																											H
160																						D
161																						E
162																						A
163																						T
164																						V
165																						H
166																									D			E
167																									E			E
168																									N			E
169																									Q			E
170																									V			E
171																									T			E
172																									H			E

223/261 f 224/261

Pos.

234

235

239

240

241

243

244

245

247

262

263

264

265

266

267

269

296

297

298

299

313

325

326

327

328

329

330

332

333

334

WT

L

L

S

V

F

F

P

P

P

V

V

V

D

V

S

E

Y

N

S

T

W

N

K

A

L

P

A

I

E

K

173

I

E

174

A

175

T

176

H

177

Y

178

A

179

E

E

180

Q

I

E

181

E

I

Y

E

182

E

I

A

Y

E

183

D

D

E

184

E

D

E

185

D

V

D

E

186

D

I

D

E

187

D

L

D

E

188

D

F

D

E

189

D

Y

D

E

Pos.

234

235

239

240

241

243

244

245

247

262

263

264

265

266

267

269

296

297

298

299

313

325

326

327

328

329

330

332

333

334

WT

L

L

S

V

F

F

P

P

P

V

V

V

D

V

S

E

Y

N

S

T

W

N

K

A

L

P

A

I

E

K

190

D

H

D

E

191

D

T

D

E

192

E

D

E

193

D

D

E

194

E

D

E

195

N

D

E

196

Q

D

E

197

H

D

E

198

T

D

E

199

D

V

E

200

D

I

E

201

D

L

E

202

D

F

E

203

D

H

E

204

D

E

E

205

D

Y

E

206

D

A

Y

E

225/261 226/261

Pos.

234

235

239

240

241

243

244

245

247

262

263

264

265

266

267

269

296

297

298

299

313

325

326

327

328

329

330

332

333

334

WT

L

L

S

V

F

F

P

P

P

V

V

V

D

V

S

E

Y

N

S

T

W

N

K

A

L

P

A

I

E

K

207

D

Y

E

208

N

Y

E

209

D

L

E

210

N

L

E

211

I

A

E

212

D

A

E

213

N

A

E

214

D

E

215

D

I

A

E

216

D

I

L

E

227/261

228/261

Exemplo 2 produção experimental e escolha de bibliotecas de

Fc

A maioria foi realizada dos experimentos nas variantes de Fc no contexto do anticorpo anti-câncer alemtuzumab (Campath®,

Pharmaceuticals LP).

1inear

1995 , curto em seu

1990, Tissue uma marca registrada

Alemtuzumab liga um antígeno alvo CD52

Antigens 35:118-127

Immunotechnology de Ilex epitopo (Hale e ; Hale,

1:175-187). Alemtuzumab tem sido escolhido como o modelo de engenharia primário por causa de sua eficácia ser em parte devida a sua capacidade de recrutar células efetoras (Dyer e

1991 ,

1998 ,

1989, Blood 73:1431-1439

Transplant Proc 23:2253-2254

Blood 92:4581-4590;

Glennie

Friend ; Hale cols .

2000

Immunol Today 21:403-410) e porque a produção e uso de seu antígeno nos ensaios de relativamente claros. Para avaliar as variante s de

Fc otimizadas da presente no contexto de outros anticorpos, variantes de

Fc selecionadas foram avaliadas no anticorpo anti-CD20 rituximab (Rituxan®, uma marca registrada de

IDEC

Pharmaceuticals Corporation), e no anticorpo antiHer2 trastuzumab (Herceptin®, uma marca registrada de Genentech). O uso de alemtuzumab, rituximab, e trastuzumab para objetivos de escolha não pretende limitar a presente invenção a qualquer anticorpo particular.

Os genes de anticorpo de cadeia leve (V_L-C_L) e pesada (V_H-Cyl - Cy2 - Cy3 ) de IgGl de comprimento total

229/261 para alemtuzumab, rituxiinab, e trastuzumab foram construídos com sítios de final convenientes para facilitar a subclonagem. Os gene s foram ligados no vetor de pcDNA3.1Zeo (Invitrogen) .

clone V_H-Cyl - Cy2 -Cy3 em pcDNA3.1zeo foi usado como modelo para mutagênese da região de Fc . Mutações foram introduzidas nesse clone usando técnicas de mutagênese baseadas em

PCR. Variantes de Fc confirmar a fidelidade contendo gene de cadeia pesada (V_H- Cyl-Cy2-Cy3) (tipo selvagem ou variantes) foram co-transfectados com plasmídeo contendo gene de cadeia leve (V_L-C_L) em células 293T.

Os meios foram coletados 5 dias de imunoglobulina foi monitorada por rastreamento do sobrenadante de cultura de transfectomas por western usando

IgG de cabra-anti-humana peroxidase-conjugada (Jackson lmmunoResearch, catálogo # 109-035- 088) .

A Figura 6 alemtuzumab de tipo selvagem e variantes 1 até 10 em células 293T.

Anticorpos foram puri f içados do sobrenadante usando cromatograf i a por afinidade de proteína A (Pierce,

Catálogo

20334. Figura mostra resultados da da proteína para alemtuzumab WT.

Variantes de anticorpo de

Fc mostraram similares resultados de expressão e

Algumas variantes de Fc foram desglicosi1adas para determinar suas propriedades de solução e funcionais na ausência de carboidrato. Para obter

230/261 ant i corpos desglicosilados, anticorpos alemtuzumab purificados f oram incubados com pept ídeo-Nglicosidase (PNGase

F) a 37°C por 24h.

A Figura apresenta um SDS

PAGE gel que conf i rma várias variantes de Fc alemtuzumab WT.

Para confirmar a fidelidade funcional de alemtuzumab produzido sob essas condições, o peptídeo antigênico CD52, fundido a GST, foi expresso em E.coli BL21 (DE3) sob indução de IPTG. As amostras induzidas e não induzidas foram colocadas em um SDS PAGE gel, e transferidas para membrana PETILDF. Para análise western cada alemtuzumab de Sotec (concentração final 2,5 ng/ul) ou meio de células 293T transfectadas (concentração final de alemtuzumab de cerca de 0,1-0,2 ng/ul) foram usados como anticorpo primário, e IgG de cabra-anti-humana peroxidase-conjugada foi usada como anticorpo secundário. A Figura 9 apresenta esses resultados. A capacidade de ligar antígeno alvo confirma a fidelidade estrutural e funcional do alemtuzumab expresso. Variantes de Fc que têm a mesma região variável que alemtuzumab WT são previstas para manter uma afinidade de ligação comparável para o antígeno.

Para rastrear a ligação de Fc/FcyR, as regiões extracelulares de V158 FcyRIIIa humano, F158 FcyRIIIa humano, FcyRIIb humano, FcyRIIa humano, e FcyRIII de camundongo, foram expressos purificados. Figura 10 apresenta um SDS PAGE gel que mostra os

231/261 resultados de expressão e purificação de V158 FcyRIIIa humano. A região extracelular desse receptor foi obtida por PCR de um clone obtido da Mammalian Gene Collection (MGC:22630). 0 receptor foi fundido com glutationa S-Transferase (GST) para permitir rastreamento. FcyRIIIa rotulado foi transfectado em células 293T, e o meio contendo FcyRIIIa secretado foi coletado 3 dias depois e purificado. Para análise de western, membrana foi marcada com anticorpo anti-GST.

A afinidade de ligação a FcyRIIIa e FcyRIIb foi medida para todas as variantes de Fc projetadas usando um ensaio AlfaScreen™ (Amplified Luminascent

Proximity Homogeneous assay (ALFA),

Perkinalmer,

Wellesley,

MA) , um ensaio de proximidade luminascente não radioativo baseado em glóbulo.

Excitação de laser de um glóbulo doador excita oxigênio, que está suficientemente próximo ao glóbulo aceitador gerando uma cascata de eventos quimioluminescentes , finalmente levando emi s são de fluorescência em

520-620 nm.

ensaio

AlfaScreen™ foi apliçado como um ensaio de competição para escolha de variantes de

Fc .

Anticorpo alemtuzumab WT foi biotinilatado por de glóbulos doadores de estreptavidina, e FcyR rotulado com GST foi ligado a glóbulos aceitadores de quelante glutationa. Na ausência de variantes de Fc de competição, anticorpo WT e FcyR interagem e produzem um sinal em 520-620 nm. A adição de variante de Fc não rotulada

232/261 compete com a interação WT Fc/FcyR, reduzindo a fluorescência quantitativamente para permitir a determinação de afinidades de ligação relativas. Todas as variantes de Fc foram rastreadas para ligação de V158 FcyRIIIa usando o ensaio AlfaScreen™. Variantes de Fc selecionadas foram ligação FcyRIIb, assim como outros FcyRs e ligantes

A Figura 11 mostra dados de de Fc .

AlfaScreen™ para ligação a V158 FcyRIIIa humano por variantes de Fc selecionadas.

Os dados de foram normalizados ao sinal de luminescência Máximo e mínimo fornecidos pelas linhas de base em baixas e altas de anticorpo competidor respectivamente. Os dados foram ajustados a um modelo de de sítio usando regressão não

1inear, esses aj ustes são representados pelas curvas na figura. Esses ajustes fornecem 50% de concentração inibi tória (IC₅₀) (ou seja, concentração necessária para 50% de inibição) para cada anticorpo, ilustrada pelas linhas pontilhadas na figura 11, assim permitindo que as afinidades de ligação relativas de variantes de Fc sejam determinadas quantitativamente. Aqui, alemtuzumab WT tem um IC₅₀ de (4,63x10 - 9)x(2) = 9,2 nM, enquanto mS239D tem um IC₅₀ de 3 , 9 8x1 0 - 1 0 ) x ( 2 ) = 0,8 nM .

Assim alemtuzumab S239D liga 9,2 nM / 0,8 nM

11,64-vezes mais firmemente que alemtuzumab WT para V158 FcyRIIIa humano. Cálculos similares foram realizados para a ligação de todas as variantes de

233/261

Fc a V158 FcyRIIIa humano. Variantes de Fc selecionadas foram também rastreadas para ligação a

FcyRIIb humano, e exemplos desses dados de ligação de AlfaScreen™ são mostrados na figura 12. A tabela 61 apresenta o aumento de vezes ou redução de vezes em relação ao anticorpo parente para ligação de variantes de Fc a V158 FcyRIIIa humano (coluna

3) e FcyRIIb humano (coluna 4), como determinado pelo ensaio AlfaScreen™.

Para esses dados, um aumento acima de 1 indica um aumento na afinidade redução na

Todos os , e um aumento abaixo de 1 indica uma alemtuzumab afinidade de ligação em relação a Fc dados foram , exceto por asterisco (*), que foram

WT .

obtidos no contexto aqueles indicados com testados no contexto de um de trastuzumab.

Tabela 61

Vari-	Substitutição (s)	Vezes	Vezes	Vezes de
ante		de	de	FcyRIIIa:
		FcyRIIIa	FcyRIIa	Vezes de
				FcyRIIa
1	V2 64A	0,53
2	V264L	0,56
3	V2 64I	1,43
4	F241W	0,29
5	F241L	0,26
6	F243W	0,51
7	F243L	0,51
8	F241L/F243L/V2621/V264I	0,09
9	F241W/F243W	0,07

234/261

Variante	Substitutição (s)	Vezes de FcyRIIIa	Vezes de FcyRIIa	Vezes de FcyRIIIa: Vezes de FcyRIIa
10	F241W/F243W/V262A1V264A	0,04
11	F241L/V2621	0,06
12	F243L/V2641	1,23
13	F243L/V262I/V264W	0,02
14	F241Y/F243Y/V262T/V264T	0,05
15	F241E/F243R/V262E/V264R	0,05
16	F241E/F243Q/V262T/V264E	0,07
17	F241R/F243Q/V262T/V264R	0,02
18	F241 E/F243Y/V262T/V264R	0,05
19	L328M	0,21
20	L328E	0,12
21	L328F	0,24
22	I332E	6,72	3,93	1,71
23	L328M/I332E	2,60
24	P244H	0,83
25	P24 5A	0,25
26	P247V	0,53
27	W313F	0,88
28	P244H/P245A/P247V	0,93
29	P247G	0,54
30	V264I/I332E	12,49	1,57*	7,96
31	F241E/F243R/V262E/V264R/I332E	0,19
32	F241E/F243Q/V262T/V264E/I332E
33	F241R/F2430/V262T/V264R/I332E
34	F241E/F243Y/V262T1V264R/I332E	0,10

235/261

Variante	Substitutição (s)	Vezes de FcyRIIIa	Vezes de FcyRIIa	Vezes de FcyRIIIa: Vezes de FcyRIIa
35	S298A	2,21
36	S298A/I332E	21,73
37	S298A/E333A/K334A	2,56
41	S239E/I332E	5,80	3,49	1,66
42	S239Q/I332E	6,60	4,68	1,41
43	S239E	10,16
44	D265G	<0,02
45	D265N	<0,02
46	S239E/D265G	<0,02
47	S239E/D265N	0,02
48	S239E/D265Q	0,05
49	Y296E	0,73	1,11	0,66
50	Y296Q	0,52	0,43	1,21
51	S298T	0,94	<0,02
52	S298N	0,41	<0,02
53	T299I	<0,02
54	A327S	0,23	0,39	0,59
55	A32 7N	0,19	1,15	0,17
56	S267Q/A327S	0,03
57	S267L/A327S	<0,02
58	A32 7L	0,05
59	P329F	<0,02
60	A33 0L	0,73	0,38	1,92
61	A33 0Y	1,64	0,75	2,19
62	I332D	17,80	3,34	5,33

236/261

Variante	Substitutição (s)	Vezes de FcyRIIIa	Vezes de FcyRIIa	Vezes de FcyRIIIa: Vezes de FcyRIIa
63	N297S	<0,02
64	N297D	<0,02
65	N297S/I332E	<0,02
66	N297D/I332E	0,08	<0,02
67	N297E/I332E	<0,02
68	D265Y/N297D/I332E	<0,02
69	D265Y/N297D/T299UI332E	<0,02
70	D265F/N297E/I332E	<0,02
71	L328I/I332E	7,03
72	L328Q/I332E	1,54
73	I332N	0,39
74	I332Q	0,37
75	V264T	2,73
76	V264F	0,16
77	V240I	3,25
78	V263I	0,10
79	V2661	1,86
80	T2 99A	0,03
81	T299S	0,15
82	T299V	<0,02
83	N325Q	<0,02
84	N325L	<0,02
85	N325I	<0,02
86	S239D	11,64	4,47*	2,60
87	S239N	<0,02

237/261

Variante	Substltutlção (s)	Vezes de FcyRIIIa	Vezes de FcyRIIa	Vezes de FcyRIIIa: Vezes de FcyRIIa
88	S239F	0,22	<0,02
89	S239D/1332D	14,10
90	S239D/I332E	56,10	19,71*	2,85
91	S239D/I332N	7,19
92	S239D/I332Q	9,28
93	S239E/I332D	9,33
94	S239E/I332N	11,93
95	S239E/I332Q	3,80
96	S239N/I332D	3,08
97	S239N/I332E	14,21
98	S239N/1332N	0,43
99	S239N/I332Q	0,56
100	S239Q/I332D	5,05
101	S239Q/I332N	0,39
102	S239Q/I332Q	0,59
103	K32 6E	3,85
104	Y296D	0,62
105	Y2 96N	0,29
106	F241Y/F243Y/V262T/V264T/N297D /I332E	0,15
107	A330Y/I332E	12,02	4,40	2,73
108	V264I/A330Y/I332E	12,00	3,54	3,39
109	A330L/I332E	10,34	2,03	5,09
110	V264I/A330L/I332E	11,15	1,79	6,23
111	L234D	0,21

238/261

Vari-	Substitutição (s)	Vezes	Vezes	Vezes de
ante		de	de	FcyRIIIa:
		FcyRIIIa	FcyRIIa	Vezes de
				FcyRIIa
112	L234E	1,34	2,21	0,61
113	L234N	0,56	1,39	0,40
114	L234Q	0,37
115	L234T	0,35
116	L234H	0,33
117	L234Y	1,42	1,08	1,31
118	L234I	1,55	1,14	1,36
119	L234V	0,38
120	L234F	0,30
121	L235D	1,66	3,63	0,46
122	L235S	1,25
123	L235N	0,40
124	L235Q	0,51
125	L235T	0,52
126	L23 5H	0,41
127	L23 5Y	1,19	10,15	0,12
128	L235I	1,10	0,94	1,17
129	L235V	0,48
130	L235F	0,73	3,53	0,21
131	S239T	1,34
132	S239H	0,20
133	S239Y	0,21
134	V24 0A	0,70	0,14	5,00
135	V240T
136	V24 0M	2,06	1,38	1,49

239/261

Vari-	Substitutição (s)	Vezes	Vezes	Vezes de
ante		de	de	FcyRllla:
		FcyRllla	FcyRIIa	Vezes de
				FcyRIIa
137	V263A
138	V263T	0,43
139	V263M	0,05
140	V264M	0,26
141	V264Y	1,02	0,27	3,78
142	V2 66A	<0,02
143	V266T	0,45
144	V2 66M	0,62
145	E269H	<0,02
146	E269Y	0,12
147	E269F	0,16
148	E269R	0,05
149	Y296S	0,12
150	Y296T	<0,02
151	Y296L	0,22
152	Y296I	0,09
153	A298H	0,27
154	T299H	<0,02
155	A33 0V	0,43
156	A330I	1,71	0,02	85,5
157	A330F	0,60
158	A33 0R	<0,02
159	A33 0H	0,52
160	N325D	0,41
161	N325E	<0,02

240/261

Vari-	Substitutição (s)	Vezes	Vezes	Vezes de
ante		de	de	FcyRIIIa:
		FcyRIIIa	FcyRIIa	Vezes de
				FcyRIIa
162	N325A	0,11
163	N325T	1,10
164	N325V	0,48
165	N325H	0,73
166	L328D/I332E	1,34
167	L328E/I332E	0,20
168	L328N/I332E	<0,02
169	L328Q/I332E	0,70
170	L328V/I332E	2,06
171	L328T/I332E	1,10
172	L328H/I332E	<0,02
173	L328I/I332E	3,49
174	L328A	0,20
175	I332T	0,72
176	I332H	0,46
177	I332Y	0,76
178	1332a	0,89
179	S239E/V2641/I332E	15,46
180	S239Q/V2641/I332E	2,14
181	S239E/V264I/A330Y/I332E	8,53
182	S239E/V264I/S298A/A330Y/I332E
183	S239D/N297D/I332E	0,28
184	S239E/N297D/I332E	0,06
185	S239D/D265V/N297D/I332E
186	S239D/D265I/N297D/I332E

241/261

Variante	Substitutição (s)	Vezes de FcyRIIIa	Vezes de FcyRIIa	Vezes de FcyRIIIa: Vezes de FcyRIIa
187	S239D/D265UN297D/I332E	<0,02
188	S239D/D265F/N297D/I332E	<0,02
189	S239D/D265Y/N297D/I332E	0,02
190	S239D/D265H/N297D/I332E	0,04
191	S239D/D265T/N297D/I332E	<0,02
192	V264I/N297D/I332E	0,05
193	Y296D/N297D/I332E
194	Y296E/N297D/I332E	<0,02
195	Y296N/N297D/I332E	0,04
196	Y296Q/N297D/I332E	<0,02
197	Y296H/N297D/I332E	<0,02
198	Y296T/N297D/I332E	<0,02
199	N297D/T299V/I332E	<0,02
200	N297D/T299I/I332E	<0,02
201	N297D/T299U/I332E	<0,02
202	N297D/T299F/I332E	<0,02
203	N297D/T299H/I332E	<0,02
204	N297D/T299E/I332E	<0,02
205	N297D/A330Y/I332E	0,43
206	N297D/S298A/A330Y/I332E
207*	S239D/A330Y/I332E	129,58
208*	S239N/A330Y/I332E	14,22
209*	S239D/A330UI332E	138,63	7,50	18,48
210*	S239N/A330L/I332E	12,95
211*	V2641/S298A/I332E	16,50

242/261

Variante	Substitutição (s)	Vezes de FcyRIIIa	Vezes de FcyRIIa	Vezes de FcyRIIIa: Vezes de FcyRIIa
212*	S239D/S298A/I332E	295,16	6,16	47,92
213*	S239N/S298A/I332E	32,14	5,15	6,24
214*	S239D/V264I/I332E	36,58	14,39	2,54
215*	S239D/V2641/S298A/I332E
216*	S239D/V264I/A330L/I332E

Exemplo 3: ligação a FcyRs seletivamente aumentada

Um número de variantes de Fc promissoras com propriedades otimizadas foi obtida de rastreamento de FcyRIIIa e FcyRIIb. A tabela 61 fornece variantes de Fc que ligam mais firmemente a FcyRIIIa, e assim são candidatas para melhorar a função efetora de anticorpos e fusões de Fc . Essas incluem um número de variantes que compreendem substituições em 239, 264, 330, e 332. A Figura 13 mostra dados de ligação de AlfaScreen™ para algumas dessas variantes de Fc. A maioria dessas variantes de Fc fornece melhorias de ligação de FcyRIIIa substancialmente maiores sobre S298A/E333A/K334A.

Embora a maioria das variantes de Fc tenham sido rast readas no contexto do anticorpo alemtuzumab, variantes de Fc selecionadas também foram rastreadas no contexto de rituximab e trastuzumab.

Dados de variantes de

Fc selecionadas a

V158 FcyRIIIa humano trastuzumab são mostrados nas figuras 14 e 15 respectivamente. Os no contexto de rituximab e

243/261 resultados indicam que as variantes de Fc apresentam consistentes melhorias de ligação a despeito do contexto de anticorpo, e assim as variantes de Fc da presente invenção são amplamente aplicáveis a anticorpos e fusões de Fc .

Foram obtidas variantes de Fc que mostram ligação a FcyRIIIa diferencialmente aumentada sobre FcyRIIb. Como discutido, função efetora ótima pode resultar de variantes de Fc nas quais a afinidade por FcyRs de ativação é meior que a afinidade por FcyRIIb de inibição. Dados de AlfaScreen™ que comparam diretamente a ligação a FcyRIIIa e FcyRIIb a duas variantes de Fc com esse perfil de especificidade são mostrados nas figuras 16a e 16b. Esse conceito pode ser definido quantitativamente como o aumento ou redução de vezes do FyR de ativação (Tabela 61, coluna 3) do FcyR referidos inibidor (Tabela 61, coluna 4) , aqui como proporção de vezes FcyRIIIa:vezes

FcyRIIb.

Esse valor é fornecido na Coluna 5 na tabela 61

A tabela 61 mostra que variantes de

Fc fornecem esse perfil de especificidade, com uma proporção de vezes FcyRIIIa:vezes FcyRIIb tão alta quanto 86:1.

Algumas das variantes de Fc mais promissoras da presente invenção para melhoria da função efetora têm aumentos substanciais na afinidade por FcyRIIIa e favoráveis proporções de vezes FcyRI11 a:vezes FcyRIIb. Essas incluem por exemplo, S239D/I332E ( FcyRI11 a-vezes= 56, vezes FcyRIIIa : vezes FcyRIIb =

244/261

3), S239D/A330Y/I332E ( FcyRIIIa-vezes = 130),

S239D/A330L/I332E (FcyRI11 a-vezes= 139, vezes FcyRllla:vezes FcyRIIb = 18), e S239D/S298A/I332E (FcyRI11 a-vezes= 295, vezes FcyRI11 a:vezes FcyRIIb = 48) . A Figura 17 mostra dados de ligação de AlfaScreen™ para essas e outras variantes de Fc a V158 FcyRllla humano.

Porque existe um número de FcyRs que contribui para a função efetora, pode ser compensador rastrear adicionalmente variantes de Fc contra outros receptores. Figura 18 mostra dados de AlfaScreen™ para ligação de variantes de Fc selecionadas a R131 FcyRIIa humano. Como pode ser observado, aquelas variantes acima mencionadas com aumentos de ligação favoráveis e perfis de especificidade também mostram melhor ligação a esse receptor de ativação. O uso de FcyRllla, FcyRIIb, e FcyRIIc para rastreamento não pretende limitar o teste experimental a esses FcyRs particulares; outros FcyRs são contemplados para rastreamento, incluindo mas não limitados a isoformas e alótipos de FcyRI, FcyRII, e

FcyRIIl de humanos, camundongos, ratos, macacos, outros, como previamente descrito.

Tomados juntos , os dados de fornecidos nas figuras 11 tabela 61 indicam que um numero

235 ,

239, 240,

243, 264, 266, 325 , 328, 330, e 332 candidatos efetora of anticorpos e fusões de Fc . Porque as

245/261 combinações de algumas dessas resultaram tipicamente em melhorias de ligação aditivas ou sinérgicas, prevê-se que as combinações das variantes na tabela também resultados f avoráve i s.

Assim todas as das variantes de

Fc na tabela

Do mesmo modo, de qualquer um das variantes de

Fc na tabela com outras variantes de Fc descobertas e não descobertas também fornecem propriedades favoráveis, e essa combinações são também contempladas. Além disso, é previsto a partir desses resultados que outras substituições nas posições 234, 235, 239 , 240, 243, 264, 266,

325, 328, 330, e 332 possam fornecer melhorias de ligação e especificidades favoráveis, e assim substituições nessas posições outras que as apresentadas na tabela 61 são contempladas.

Exemplo 4: ligação a FcyRs reduzida

Como discutido, embora haja uma necessidade por maior função efetora, para alguns ant i corpos eliminada pode ser desejada. Várias variantes de Fc na tabela reduzem substancialmente ou eliminam de

FcyR, e isso pode ter uso de

Fc nos quais a efetora é indesejável.

Dados de

1igação de AlfaScreen™ para alguns exemplos de tais variantes são mostrados nas figuras 19a e

19b .

Essas variantes de Fc, assim como seu uso em combinação, podem ter uso para

246/261 eliminação da função efetora quando desejada, por exemplo em anticorpos e fusões de Fc cujo mecanismo de ação evolve o bloqueio ou antagonismo mas não a morte das células que carregam o antígeno alvo.

Exemplo 5: Variantes de Fc agllcosiladas

Como discutido, um objetivo dos atuais experimentos era para obter variantes de Fc aglicosi1adas otimizadas. Várias variantes de Fc fornecem progresso significante para esse objetivo.

N297 resulta em um Fc aglicosilado.

Enquanto todas as outras variantes de Fc que compreendem subst ituição em N297 eliminam completamente de

FcyR, N297D/I332E tem af inidade de tabela significativa por FcyRIIIa, mostrada na e ilustrada na figura 2 0.

a razão exata para esse resultado é incerta na ausência de uma estrutura de embora as sugiram que ela potencialmente devida

Fc/ FcyR e propriedades eletrostáticas favoráveis.

De fato previstas tabela 61 mostra que outras variantes de Fc aglicosiladas como S239D/N297D/I332E e N297D/A330Y/I332E fornecem melhorias de ligação que trazem a afinidade por FcyRIIIa em 0,28- e 0,43-vezes respectivamente de alemtuzumab WT glicosilado. Combinações dessas variantes com outras variantes de Fc que melhoram a

247/261 ligação de FcyR são contempladas, com o objetivo de obter variantes de Fc aglicosi1adas que ligam um ou mais FcyRs com afinidade que é aproximadamente a mesma que ou mesmo melhor que a de Fc glicosilado parente. Um conjunto adicional de variantes de Fc promissoras fornece melhorias de estabilidade e solubilidade na ausência de carboidrato. variantes de Fc que compreendem substituições em posições

241, 243,

262 ,

264 , ligação de

FyR mas determinam a interface entre o carboidrato

Fc, eliminam a ligação de FyR, presumivelmente porque do carboidrato.

Em forma desglicosi1ada, no entanto, variantes de

Fc F241E/F243R/V262E/V264R,

F241 E/F243Q/V262T/V264E,

F241 R/F243Q/V262T/V264R, e F241

E/F243Y/V262T/V264R mostram ligação mais forte a

FcyRIIIa que na forma glicosilada, como mostrado nos dados de AlfaScreen_TM na figura 21.

Esse resultado indica que essas são posições chave para a ot imi zação da estrutura, estabilidade, solubilidade, e função de Fc aglicosi1ado. Juntos, esses resultados sugerem que a engenharia de proteína pode ser usada para restaurar as propriedades favoráveis funcionais de ant i corpos fusões de Fc na ausência de carboidrato, e prepara anticorpos aglicosi1ados fusões de Fc com propriedades favoráveis de solução completa funcionalidade que compreendem substituições nessas e outras posições de Fc.

248/261

Exemplo 6. Afinidade de variantes de Fc por formas polimórficas de FcyRIIIa

Como acima discutido, um parâmetro importante de função efetora mediada por Fc é a afinidade de Fc por formas polimórficas V158 e F158 de FcyRIIIa. Dados de AlfaScreen™ que comparam a ligação de variantes selecionadas aos dois alótipos receptores são mostrados na figura 22a (V158 FcyRIIIa) e Figura

22b (F158 FcyRIIIa) . Como pode ser observado, todas as variantes melhoram a ligação a ambos alótipos de FcyRIIIa. Esses dados indicam que aquelas variantes de Fc da presente invenção com melhor função efetora serão amplamente aplicáveis à inteira população de pacientes, e que a melhoria à eficácia clínica sera potencialmente a maior para a população de pacientes pouco responsivos que precisam mais dei a .

As afinidades de de FcyR dessas variantes de Fc também foram investigadas usando

Re s sonânc i a de superfície de plasma e (SPR) (Bi ancore,

Uppsala, Sweden). SPR é um método sensível e extremamente quantitativo que permite a medição das afinidades de interações proteínaproteína, e tem sido usado para medir de forma eficaz a ligação Fc/FcyR (Radeav e cols., 2001, J

Biol Chem 2 7 6:16478 -16483 ) . SPR fornece, portanto, um excelente ensaio de ligação complementar ao ensaio AlfaScreen™. His-tagged V158 FcyRIIIa foi imobilizado a um chip SPR, e anticorpos alemtuzumab WT e variante de Fc fluíram sobre o chip em uma

249/261 ·» faixa foram obtidas pelo ajuste dos dados usando métodos de ajuste de curva.

variantes de Fc

FcyRIIIa obtidas

IC₅₀s obtidos

Kd e IC50 alemtuzumab (vezes ) são do selecionadas usando SPR

A tabela 62 apresenta (Kd) para ligação de a V158 FcyRIIIa e F158 , e compara esses com ensaio AlfaScreen™ para cada variante

WT, os aumentos em obtidos.

Por por vezes de aquela sobre de

WT

Tabela 62

	SPR V158 FcyRIIIa	SPR	AlfaScreen™ V158 FcyRIIIa	AlfaScreen™ F158 FcyRIIIa
F158 FcyRIi:	Ea
	Kd	vezes	Kd	vezes	ic50	vezes	IC5o	vezes
	(nM)		(nM)		(nM)		(nM)
WT	68		730		6,4		17,2
V2 64I	64	1,1	550	1,3	4,5	1,4	11,5	1,5
I332E	31	2,2	72	10,1	1,0	6,4	2,5	6,9
V2641/I332E	17	4,0	52	14,0	0,5	12,8	1,1	15,6
S298A	52	1,3	285	2,6	2,9	2,2	12,0	1,4
S298A/E333A	39	1,7	156	4,7	2,5	2,6	7,5	2,3
/K334A

SPR corroboram

FcyRIIIa tabela superioridade af inidade

AlfaScreen

melhorias observada ensaio por também indica

V264I/I332E e

I332E sobre S298A e

S2 9 8A/E333A/K334A;

enquanto

S298A/E333A/K334A

Fc a V158 e F158 FcyRIIIa em

1,7 vezes e 4,7 vezes respectivamente, I332E mostra

250/261 melhorias de ligação de 2,2 vezes e 10,1 vezes respectivamente, e V264I/I332E mostra melhorias de ligação de 4,0 vezes e 14 vezes respectivamente. Também vale notar que, a afinidade de V264I/I332E para F158 FcyRIIIa (52 nM) é melhor que aquela de WT para o alótipo V158 (68 nM) , sugerindo que essa variante de Fc, assim como aquelas com melhorias ainda maiores na ligação, podem permitir a eficácia clínica de anticorpos para a população de pacientes pouco responsivos para atingir aquela atualmente possível para aqueles que reagem muito. A correlação entre as medidas de ligação de SPR e AlfaScreen™ são mostradas nas figuras 23a - 23d. As

Figuras 23a e 23b mostram as correlações de Kd

IC₅₀ para ligação a V158 FcyRIIIa e F158 FcyRIIIa respectivamente,

Figuras 23c e

23d mostram as

V158

FcyRIIIa e bons

0,9, melhoria de vezes para ligação

F158 FcyRIIIa respectivamente.

ajustes desses dados para linhas retas (r²

Os r²

0,84, r²

0,98, e r²

0,90) sustentam a uso para das medidas de AlfaScreen™, e validam seu de ligação re1at ivas de FcyR de variantes de

Fc .

Exemplo 7

ADCC de variantes de Fc

Para determinar o efeito sobre efetora, ensaios ADCC baseados em célula foram realizados em variantes de Fc selecionadas. ADCC foi medido usando o citotoxicidade ensaio baseado em EuTDA DELFIA® (Perkin Elmer, MA) como monócitos sanguíneos periféricos humanos purificados (PBMCs)

251/261 como células efetoras. Células alvo foram carregadas com BATDA em lxlO⁶ células/ml, lavadas 4 vezes es e semeadas em placas de 96 cavidades em 10.000 células/cavidade. As células alvo foram então opsonizadas usando variante de Fc ou anticorpos WT na concentração final indicada. PBMCs humanos foram adicionados no excesso de vezes indicado de células alvo e a placa foi incubada a

37°C por hrs. As células co-cultivadas foram centrifugadas sobrenadantes foram transferidos uma placa separada e incubados com solução de Eu, e unidades de fluorescência relativa também medidas usando um leitor

Packard Fusion™ (Packard Biosciences,

IL) .

As amostras foram passadas em triplicata para fornecer estimativas de erro (n=3, +/- S.D.). PBMCs foram alotipados para o alótipo V158 ou F158 FcyRllla usando PCR.

Ensaios ADCC foram realizados em variante de Fc alemtuzumab

WT usando células alvo DoHH-2 de

1inforna. A

Figura 24a é um gráfico que mostra

ADCC dessas proteínas em ng/ml anticorpo.

Os resultados mostram que variantes de

Fc de alemtuzumab

I332E, V2641, e I332E/V264I têm ADCC substancialmente aumentado comparado a alemtuzumab

WT, com os aumentos de ADCC relat ivos proporcionais a FcyRllla como indicado por ensaio AlfaScreen™ e SPR. A dependência de dose figura 24b. Esses dados foram normalizados a um sinal de fluorescência mínimo e máximo fornecido

252/261 pelas linhas de base em concentrações at baixas e altas de anticorpo respectivamente. Os dados foram ajustados a um modelo de resposta de dose sigmoidal usando regressão não linear, representado pela curva na figura. Os ajustes permitem a determinação da concentração eficaz a 50% (EC₅₀) (ou seja, a concentração necessária para eficácia de 50%) , que fornece as melhorias relativas a ADCC para cada variante de Fc . Os EC₅₀s para esses dados de ligação são análogos aos IC₅₀s obtidos dos dados de competição AlfaScreen™, e derivação desses valores ê portanto análoga aquela descrita no exemplo 2 e Figura 11. Na figura 24b, o log(EC₅₀)s, obtido dos ajustes dos dados, para WT, V264I/I332E, e S239D/I332E alemtuzumab são 0,99, 0,60, e 0,49 respectivamente, e portanto seus EC50s respectivos são 9,9, 4,0, e 3,0. Assim, V264I/I332E e

S239E/I332E fornecem uma aumento de 2,5 vezes e 3,3 vezes respectivamente em ADCC sobre alemtuzumab WT usando PBMCs que expressam V158/F158 FcyRIIIa heterozigóticos. Esses dados são sumarizados na tabela 63 abaixo.

Tabela 63

	log (EC50)	ECso (ng/ml)	Vezes de sobre WT	aumento
WT	0,99	9,9
V2641/I332E	0,60	4,0	2,5
S239D/I332E	0,49	3,0	3,3

Para determinar se esses aumentos de ADCC são amplamente aplicáveis a anticorpos, variantes de Fc

253/261 selecionadas foram avaliados no contexto de rituximab e trastuzumab. Ensaios

ADCC foram feitos em V264I/I332E, WT , e S298A/D333A/K334A rituximab usando células alvo de linfoma WIL2-S. A Figura 25a apresenta um gráfico de barras que mostra o ADCC dessas proteínas em ng/ml de anticorpo. Os resultados indicam que

V264I/I332E ri tuximab fornece ADCC substancialmente aumentado a rituximab

WT, assim como ADCC superior a

S298A/D333A/K334A, consistente com as melhorias de de

FcyRI11 a observadas por ensaio

AlfaScreen™

Figura 25b mostra a dependênc i a dose de ant i corpo. Os

EC₅₀s obtidos dos ajustes desses dados e as melhorias de vezes relativas em fornecidas na tabela 64 abaixo. Como pode ser observado

V264I/I332E rituximab fornece um aumento de 11,3 vezes no EC₅₀ sobre

WT para

PBMCs que expressam

F158/F158 FcyRIIIa homozigóticos.

As maiores melhorias observadas para rituximab versus alemtuzumab são provavelmente devidas ao uso de

F158/F158 FcyRIIIa homozigóticos em vez de PBMCs

V158/F158

FcyRIIIa heterozigóticos, assim como potencialmente o uso de diferentes anticorpos e linhas de células alvo.

Tabela 64

	log (ECso)	EC50	(ng/ml)	Melhoria em vezes sobre WT
WT	0,23	1,7
S298A/E333A/K33	-0,44	0,37,		4,6

254/261

4A
V264I/I332E	-0,83	0,15	11,3

Ensaios ADCC foram feitos em variante de Fc e trastuzumab WT usando de carcinoma BT474 e duas linhas de células alvo

Sk-Br-3. A Figura 26a mostra um gráfico de barras que ilustra ADCC em 1 ng/ml ant i corpo. Os resultados indicam que V264I e

V264I/I332E trastuzumab fornecem

ADCC substancialmente aumentado comparado a trastuzumab

WT, com os aumentos de ADCC relativos proporcionais a FcyRIIIa como indicado por ensaio AlfaScreen™ e SPR. A

Figura 26b mostra a dependência de dose de ADCC em concentração de anticorpo. Os EC₅₀s obtidos dos ajustes desses data e as melhorias em vezes relativas em ADCC são fornecidos na tabela abaixo.

Melhorias significativas de

ADCC são observadas para I332E trastuzumab quando combinados com A330L

A330Y.

Tabela 65

	log (EC50)	EC5o (ng/ml)	Melhoria em vezes sobre WT
WT	1,1	11,5
I332E	0,34	2,2	5,2
A330Y/I332E	-0,04	0,9	12,8
A330L/I332E	0,04	1,1	10,5

A figura 26c mostra um outro conjunto de dados de ADCC de resposta a dose em concentrações variáveis de anticorpo para variantes de trastuzumab. Os EC₅₀s obtidos dos ajustes desses data e as melhorias em vezes relativas em ADCC são

255/261 fornecidos na tabela 66 abaixo. Os resultados mostram que variantes de Fc de trastuzumab S239D/I332E, S239D/S298A/I332E, S 2 3 9D / A3 3 0 Y/I 3 3 2 E , e S239D/A330L/I332E/ fornecem melhorias substanciais relativa s de de ADCC a trastuzumab WT e S298A/E333A/K334A, consistentes com os dados de e SPR.

maior de FcyR observados

S239D/A330L/I332E aumento na função pelo ensaio

AlfaScreen™ trastuzumab mostram ao efetora observado até agora, fornecendo um aumento aproximado de 50 vezes em EC₅₀ sobre WT para

PBMCs que expressa F158/F158

FcyRIIIa homozigóticos provavelmente devido ao uso de F1 58/F158 FcyRIIIa homoz igót icos em vez de PBMCs

V158/F158 FcyRIIIa heterozigóticos, assim como potencialmente o uso de diferentes anticorpos e linhas de célula alvo.

Tabela 66

	Log (EC50)	EC50 (ng/ml)	Melhoria em vezes sobre WT
WT	0,23	1,7
S298A/E333A/K33 4A	-0,44	0,37	4,6
V264I/I332E	-0,83	0,15	11,3

Ensaios ADCC foram feitos em variante de Fc e trastuzumab WT usando duas linhas de célula alvo de carcinoma de mama BT474 e Sk-Br-3. A Figura 26a mostra um gráfico de barras que ilustra ADCC em 1 ng/ml anticorpo. Os resultados indicam que V264I e V264I/I332E trastuzumab fornecem ADCC substancialmente aumentado comparado a trastuzumab

256/261

WT, com os aumentos de ADCC relativos proporcionais a suas melhorias de ligação a FcyRIIIa como indicado por ensaio AlfaScreen™ e SPR. A

Figura 26b mostra a dependência de dose de ADCC em concentração de anticorpo. Os EC₅₀s obtidos e as melhorias em vezes fornecidos na tabela dos significativas de trastuzumab quando

ADCC ajustes desses data abaixo.

Melhorias são observadas para I332E combinados com A330L e A330Y.

Tabela 67

	log(ECso)	EC5o (ng/ml)	Melhoria em vezes sobre WT
WT	1,1	11,5
I332E	0,34	2,2	5,2
A330Y/I332E	-0,04	0,9	12,8
A330L/I332E	0,04	1,1	10,5

A Figura 26c mostra outro conjunto de dados de ADCC de resposta

para dose em variáveis de anticorpo variantes de trastuzumab. Os EC₅₀s data e as melhorias em fornecidos na tabela obtidos dos ajustes desses vezes relativas

6 abaixo. Os mostram que variantes de

Fc de em ADCC são resultados t rastuzumab

S239D/I332E, S239D/S298A/I332E, S239D/A330Y/I332E,

S239D/A330L/I332E/ fornecem melhorias substanciais relativas de ADCC a trastuzumab WT e

S298A/E333A/K334A, consistentes com os dados de maior de FcyR observados

S239D/A330L/I332E pelo ensaio AlfaScreen™ trastuzumab mostram ao efetora observado até

257/261 agora, fornecendo um aumento aproximado de 50 vezes em EC₅₀ sobre WT para PBMCs que expressa F158/F158 FcyRIIIa homozigóticos.

Tabela 68

	log (EC50)	EC50 (ng/ml)	Melhoria em vezes sobre WT
WT	0,45	2,83
S298A/E333A/K33 4A	-0,17	0,67	4,2
S239D/I332E	-0,18	0,66	4,3
S239D/A330Y/I33 2E	-0,29	0,51	5,5
S239D/S298A/I33 2E	-0,52	0,30	9,4
S239D/A330L/I33 2E	-1,22	0,06	47,2

Exemplo 8 .

Ligação de Complemento e ativação por variantes de

Proteína em Fc que portanto variantes recrutar e

Fc

Clq de próximo complemento se liga a um sítio foi prudente para de Fc mantiveram ativar complemento.

determinar se sua capacidade de ensaio AlfaScreen™ foi usado

Fc selecionadas a proteína ensaio foi realizado com biotinilatado

1igado de complemento Clq.

anticorpo alemtuzumab glóbulos doadores

WT de estreptavidina como descrito no exemplo 2, e usando Clq ligado diretamente aos glóbulos aceitadores. Os dados de ligação de variantes de Fc selecionadas

258/261 mostrados na figura 27a indicam que a ligação Clq não é comprometida. Os CDC baseados em célula

também foram

realizados em variantes de Fc

selecionadas para investigar se as variantes de Fc mantêm a capacidade de ativar o complemento. Amar

Blue foi usado	para monitorar a lise de variante de
Fc e células	de linfoma WIL2-S opsonizadas por

rituximab WT por complemento sérico humano (Quidel, San Diego, CA) . Os resultados mostrados na figura 27b para variantes de Fc selecionadas indicam que CDC não é comprometido.

Exemplo 9 . Ligação de proteína A por variantes de Fc

Como discutido, proteína A bacteriana se liga à

região de Fc	entre os domínios Cy2 e Cy3, e é
frequentemente	empregada para purificação de
anticorpo. 0	ensaio AlfaScreen™ foi usado para

medir a ligação de variantes de Fc selecionadas à

proteína A	usando anticorpo alemtuzumab WT
biotinilatado	ligado a glóbulos doadores de
estreptavidina	como descrito no exemplo 2, e usando
proteína A	ligada diretamente aos glóbulos

aceitadores. Os dados de ligação mostrados na

figura 28 para

variantes de Fc selecionadas indicam

que a capacidade das variantes de Fc de ligar a proteína A não é comprometida. Esses resultados

sugerem que a	afinidade das variantes de Fc por
outros ligante	de Fcs que ligam o mesmo sítio em Fc
como proteína	A, como o receptor neonatal de Fc

FcRn e proteína G, também não são afetados.

259/261

Exemplo 10

Capacidade das variantes de Fc de ligarem FcyRs de camundongo de Fc a FcyRs não humanos pode ser útil para teste experimental de variantes de Fc em modelos animais.

Por exemplo, quando testados em camundongos (por exemplo camundongos desnudos, camundongos

SCID, camundongos de xenoenxerto, e/ou camundongos transgênicos), anticorpos e fusões de

Fc que compreendem variantes de

Fc que são otimizadas para um ou mais FcyRs de camundongos fornecem valiosa com rela mecanismo e outros.

Para avaliar se variantes de Fc da presente ser úteis em tais experimentos a afinidade de variantes de Fc selecionadas por FcyRIII de camundongo foi medida usando o ensaio AlfaScreen™ ensaio

AlfaScreen™ foi realizado usando alemtuzumab

WT biotinilatado ligado a glóbulos doadores de estreptavidina como descrito no exemplo

2, e GST-tagged FcyRIII de camundongo ligado a glóbulos aceitadores de quelante de glutationa, expressos e purificados como descrito no exemplo mostrados na f igura

Os resultados mostram que algumas variantes de

Fc que aumentam a ligação a

FcyRIIIa humano também de camundongo. Esse

FcyRIII aumentam

resultado	indica	que	as variantes	de	Fc
presente	invenção,	ou outras variantes	de	Fc
são otimizadas para	FcyRs	ano humanos, podem	ter
em experimentos que	usam	modelos animais.

da que uso

260/261

Exemplo 11. Validação de variantes de Fc expressas em células CHO

Embora as variantes de Fc da presente tenham sido expressas em células

293T para obj et ivos ant i corpos em linhas de de escolha, produção de tipicamente células de (Chinase Hamster Ovary) propriedades de variantes expressos descrito larga escala de de Fc em no

AlfaScreen™

Fc expressas

FcyRII Ia variantes aumentos em 293T

Exemplo

Fc

Um realizada

Ovário (CHO).

de apor expressão

Hamster chinês

Para avaliar as variantes de

Fc expressas em

CHO, selecionadas células

CHO alemtuzumab WT e purificados foram como exemplo 2. A que comparam em CHO e humano. Os de Fc da

Figura 30 mostra dados de

293T e alemtuzumab WT resultados presente de ligação comparável de ou CHO.

presente a V158 indicam que as mostram

FcyR expressos . aplicação terapêutica número de invenção de variantes de variantes de

Fc descrito na possui significativo potencial para melhorar a eficácia terapêutica de anticâncer. Para objetivos de ilustração, de variantes incorporado na cadeias leve descrita em

31a e 32b.

melhoradas

US

As anticorpos um numero de Fc da presente seqüência e cadeia

5,736,137 foi são do anticorpo pesada de rituximab.

ri tuximab

As

WT, são fornecidos na figuras seqüências de anticorpo anti-CD20 fornecidas na figura 31c. T As

261/261 seqüências compreendem selecionado de anticorpo pelo menos do grupo

X4, X5, e X6 . Essas

CD2 0 melhoradas um exemplo, o variantes

Z1 . 0 e não ant i-CD2 0 aminoácido que consiste seqüências de também podem uso de rituximab pretende limitar melhoradas em XI, X2,

WT anticorpo anticompreender aqui é somente de Fc a esse anticorpo ou qualquer incorporadas expressamente como referência.

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Anticorpo caracterizado por compreender uma variante de Fc que compreende uma modificação de aminoácido na região Fc de um polipeptídeo Fc de IgGl humano, em que a

   5 referida variante de Fc aumenta a ligação a um FcyR quando comparado ao referido polipeptídeo Fc de IgGl humano, e em que a referida variante de Fc compreende uma substituição selecionada do grupo consistindo em 239D, 239E, 328F, 330L, 332D e 332E na região Fc do referido polipeptídeo Fc de 10 IgGl humano, em que a numeração está de acordo com o índice EU.