BRPI0315565B1 - Método para se obter uma linhagem celular de mieloma nso que contém uma sequência que codifica um polipeptídeo recombinante ou uma proteína recombinante adaptada para crescer em meio livre de soro e proteína, e, uso do método - Google Patents
Método para se obter uma linhagem celular de mieloma nso que contém uma sequência que codifica um polipeptídeo recombinante ou uma proteína recombinante adaptada para crescer em meio livre de soro e proteína, e, uso do método Download PDFInfo
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Abstract
"MÉTODO PARA SE OBTER UMA LINHAGEM CELULAR DE MAMÍFERO ADAPTADA PARA CRESCER EM MEIO LIVRE DE SORO E PROTEÍNA, LINHAGEM CELULAR DE MAMÍFERO, USO DO MÉTODO, ANTICORPOS HUMANIZADOS CONTRA O RECEPTOR DE EGF HR3 OU SEUS FRAGMENTOS, CONTRA O ANTÍGENO CD6 T1HT OU SEUS FRAGMENTOS, E CONTRA O ANTÍGENO CD3 T3Q OU SEUS FRAGMENTOS". A presente invenção diz respeito a um método de obtenção de células de mamífero adaptadas a crescer em meio livre de soro e de proteínas, o qual inclui um processo em duas etapas de adaptação em que existe um intervalo crítico de concentração de proteína em que as células devem adquirir a capacidade de sobreviver em meio livre de proteínas. O intervalo crítico da concentração da proteína é especifico para cada linhagem celular. A presente invenção também diz respeito a linhagens celulares de mamíferos que crescem de uma maneira estável em um meio livre de soro e proteínas por pelo menos 40 gerações. A invenção ainda diz respeito a clones que expressam os anticorpos humanizados anti-receptores de EGF hR~ 3~ e anti-CD6 T1hT e o anticorpo quimérico anti-CD~ 3~ T~ 3~Q, assim como os fragmentos dos referidos anticorpos.
Description
[001] A presente invenção diz respeito à biotecnologia, especificamente a um método para se obter linhagens celulares estáveis adaptadas para crescer em meio livre de soro e proteína, mediante um processo em duas etapas de adaptação.
[002] A partir do desenvolvimento do cultivo in vitro de células de mamíferos, a demanda quanto à produção em grande escala destas células aumentou por causa do potencial diagnóstico e terapêutico de muitos dos produtos obtidos por este meio. Estes agentes úteis incluem anticorpos monoclonais, o hormônio humano do crescimento, as linfocinas, a eritropoietina, os fatores de coagulação do sangue e os ativadores do plasminogênio do tecido.
[003] O uso dos anticorpos monoclonais recombinantes (AcMr) para a terapia e o diagnóstico in vivo de diversas enfermidades implica, em muitos casos, no uso dos tratamentos em altas doses. Este fato torna necessária a produção de AcMr específico em grande quantidade e com uma alta pureza.
[004] Vários anticorpos monoclonais recombinantes com uso potencial na terapia e diagnóstico do câncer e enfermidades autoimunes se expressaram nas células de mieloma NSO, no Centro de Imunologia Molecular. A U.S. 5.891.996 descreve a obtenção de anticorpos quiméricos e humanizados contra o receptor do Fator de Crescimento Epidérmico, com utilidade no diagnóstico e na terapia de tumores que expressem referido receptor. A WO 97/19111 descreve anticorpos monoclonais que reconhecem o antígeno CD6 para uso diagnóstico e terapêutico em pacientes com psoríase. Gavilondo et al. em Hybridoma 9 no 5, 1999, relatou o anticorpo IOR-T3a que reconhece o antígeno CD3.
[005] Para as condições de cultivo em meio livre de proteína, foram desenvolvidas várias técnicas. Assim, foram desenvolvidos os meios livres de proteína especificamente definidos, que permitem um crescimento da célula sob estas condições. A WO 97/05240 descreve a expressão de proteínas recombinantes sob condições de meio livre de proteínas.
[006] A JP 2.696.001 descreve o uso de um meio livre de proteína para a produção do fator VIII nas células de CHO, acrescentando um agente tensoativo não iônico ou ciclodextrina para aumentar a produtividade das células hospedeiras. Para aumentar a eficácia destes aditivos, recomenda-se a adição de, por exemplo, butirato e lítio.
[007] A WO 96/26266 descreve o cultivo de células em um meio com hidrolisado de proteína que contém glutamina, cujo conteúdo de aminoácidos livres é menor do que 15% do peso total da proteína, e cujos peptídeos têm um peso molecular menor do que 44 kD. Como meio de cultura para as células utiliza-se um meio mínimo sintético, como o meio básico ao qual se acrescentam, além do hidrolisado da proteína, soro fetal bovino, gentamicina e mercaptoetanol. Não foi mencionado o uso de meio contendo soro para a produção dos fatores recombinantes do sangue.
[008] A U.S. 5.393.668 A descreve o crescimento celular sob condições de meio livre de proteína, de células aderidas a superfícies sintéticas especiais.
[009] Para estimular a proliferação celular, células de CHO, que superexpressam a insulina humana, proliferam sobre um substrato artificial que se tenha ligado covalentemente à insulina (Ito et al. 1996 PNAS USA. 93: 3598-3601).
[0010] Reiter et al. (1992, Cytotechnology 9: 247-253) descrevem a imobilização das células r-CHO crescidas primeiro em alta densidade sobre portadores em meio que contém soro, e a subseqüente perfusão das células imobilizadas no meio sem proteína durante a fase de produção, encontrando- se uma liberação contínua da proteína no sobrenadante da cultura. Ali, as células foram mantidas por menos de 10 gerações no meio sem proteína.
[0011] Os métodos anteriores para a preparação acertada de uma cultura de células em grande escala sob condições de meio livre de proteína, foram descritos quanto a linhagens celulares mantidas em cultura, em particular as células VERO (WO 96/15231), na qual as células crescem sob condições de meio livre de soro e de proteína, desde a ampola original até uma grande escala técnica de 1200 litros.
[0012] A adaptação das células cultivadas inicialmente sob condições de meio contendo soro ao meio livre de proteína, é um processo um tanto enfadonho geralmente demorado, além de se ter observado que a produção de proteína expressa e a produtividade das células de CHO recombinantes diminuem muito depois da adaptação ao meio sem proteína em relação ao que contém soro (Paterson et al., 1994, Appl. Microbiologia. Biotechnol. 40: 691658). Isto é uma conseqüência da instabilidade ou a redução do crescimento do clone recombinante por causa da troca das condições de cultura. Apesar do uso de um clone original estável, por causa das condições extremas na fermentação, uma grande parte das células reduz ou perde totalmente sua capacidade de expressão, as quais crescem muito mais do que as células produtoras durante o processo de produção, motivo por que, finalmente, o cultivo do fermentador consiste em uma maior população de células não produtoras ou de células que tenham uma baixa expressão.
[0013] A presente invenção fornece uma estratégia para desenvolver linhagens celulares estáveis adaptadas para crescer em meio livre de soro e de proteína. Seguindo-se a estratégia proposta, foram obtidos diferentes clones adaptados ao crescimento em meio livre de proteína.
[0014] Este procedimento abrange as linhagens de células de mamíferos, para as quais não é possível realizar um procedimento direto de adaptação do meio suplementado com soro ao meio livre de soro e de proteína.
[0015] O método da invenção inclui duas etapas na adaptação da linhagem ao meio livre de proteína (MLP). Na primeira etapa, considerada não crítica, a redução do conteúdo de proteínas do meio ocorre sem a perda da viabilidade celular e não há uma redução importante do tempo de duplicação da população em cada passo durante a redução da concentração de proteína. A etapa não crítica é observada geralmente entre 5 e 0,5 mg/ml de proteína total no meio de cultura, e este quase apresenta o mesmo índice de crescimento que no meio de cultura inicial.
[0016] Para iniciar esta primeira etapa, inicia-se de uma linhagem com uma viabilidade celular entre 80 e 100%, e as células crescem sucessivamente em meio de cultura com concentrações decrescentes de proteína até que se alcance uma concentração crítica em que a viabilidade seja reduzida a 0%, a qual constitui o ponto de partida para o início da segunda etapa.
[0017] Nesta segunda etapa, considerada crítica, na qual ocorre uma redução da viabilidade e do tempo de duplicação celular, as células necessitam de mais tempo para que se adaptem à passagem de uma situação da concentração da proteína para outra de menor concentração. Existem concentrações críticas de proteína no meio de cultura, que não é possível passar por cima durante o processo de adaptação. Estas concentrações críticas de proteína são específicas para cada linhagem celular, e geralmente estão abaixo de 0,6 mg/ml. Uma vez que as células tenham recuperado os índices iniciais de viabilidade e de velocidade de crescimento nestas concentrações críticas de proteína, é possível cultivar as células na condição seguinte, com uma concentração de proteína mais baixa.
[0018] Para conduzir esta segunda etapa, uma vez determinada a concentração crítica, recorre-se à concentração anterior em que ainda exista crescimento celular, considerada como concentração pré-crítica, e, a partir dela, reduz-se lentamente a referida concentração de proteína até que as células recuperem a viabilidade e o tempo de duplicação original.
[0019] A combinação de passos para reduzir a concentração de proteína na etapa crítica determinará o tempo total de adaptação nesta etapa e a velocidade da adaptação (Vadapt.), calculada como a relação:
[0020] Não obstante, esta combinação de situações não terá influência sobre o tempo necessário para a adaptação a cada concentração de proteína, incluindo as concentrações críticas.
[0021] Isto é, para determinar-se o final da etapa não crítica e das concentrações críticas, é necessário executar uma adaptação passo a passo, e isto é realizado mediante diluições em série do cultivo celular no meio sem proteína desejado, reduzindo-se à metade a concentração de proteína em cada situação (Tabela 1). Esta redução pode ser feita tanto pela redução da concentração de soro quanto suplementando-se o meio básico com diferentes níveis de alguns substituintes do soro ricos em proteínas.TABELA 1: Redução passo a passo da concentração de proteína para determinar-se as concentrações críticas, iniciando-se com um meio de cultura suplementado com 5 mg/ml de proteína (equivalente a 10% de soro fetal bovino).
Legenda: SFB - Soro Fetal Bovino MLP - Meio Livre de Proteína MCS - Meio Contendo Soro * O conteúdo total de proteína do soro fetal bovino foi estimado ao redor de 50 mg/ml (6).
[0022] Antes de iniciar-se o procedimento de adaptação, as células devem ser mantidas com mais de 80% de viabilidade em frascos T no meio padrão empregado geralmente para o cultivo das células.
[0023] Para realizar-se a adaptação, realizam-se consecutivamente os seguintes passos que transitam pelas duas etapas anteriormente mencionadas: i. As células são semeadas em pelo menos 3 repetições em uma densidade de 1 a 5 x 105 células/ml em meio de cultivo contendo soro e proteínas, depois de 48 horas substitui-se a metade do sobrenadante da cultura por meio fresco livre de proteína, ficando a concentração final de proteína em 50% da concentração inicial; ii. Substitui-se todo o meio de cultura a cada 48 horas pelo meio fresco com 50% da concentração inicial de proteínas; iii. Deixam-se crescer as células no meio com 50% da concentração inicial de proteínas, até que a cultura alcance a confluência; iv. Semeiam-se as células obtidas no passo anterior (iii) em pelo menos 3 repetições, a uma densidade de 1 a 5 x 105 células/ml no meio que contém 50% da concentração inicial de proteína e, depois de 48 horas de crescimento, substitui-se a metade do sobrenadante da cultura por meio fresco livre de proteína, ficando a concentração final de proteínas nos 50% da concentração anterior; v. Substitui-se todo o meio a cada 48 horas pelo meio fresco que contém os 50% da concentração de proteína anterior; vi. Deixam-se crescer as células no meio que contém os 50% da concentração de proteína anterior, até que a cultura alcance a confluência; vii. Repetem-se os procedimentos (iv) a (vi), reduzindo-se, em cada ciclo, a concentração da proteína contida no meio, até os 50% da usada no ciclo anterior, até alcançar-se uma concentração de proteína que provoque a morte celular. viii. A partir de uma cultura com mais de 80% de viabilidade, cultivada na concentração na concentração pré-crítica, as células são semeadas em pelo menos 3 repetições a uma densidade de 2 a 6 x 105 células/ml em meio de cultura na concentração pré- crítica, e depois de 48 horas substituem-se os 25% do sobrenadante da cultura pelo meio fresco sem proteína, ficando a concentração final de proteína nos 75% da concentração pré- crítica; ix. Substitui-se todo o meio a cada 48 horas, pelo meio fresco que contém os 75% da concentração pré-crítica; x. Deixam-se crescer as células no meio que contém os 75% da concentração pré-crítica de proteína, até que a cultura alcance a confluência; xi. Semeia-se a linhagem celular derivada do passo anterior em pelo menos 3 repetições, a uma densidade de 2 a 6 x 105 células/ml no meio que contém os 75% da concentração pré-crítica de proteína e, após 48 horas de crescimento, substituem-se os 25% do sobrenadante da cultura por meio fresco livre de proteína, ficando a concentração final de proteína nos 75% da concentração anterior; xii. Substitui-se todo o meio a cada 48 horas pelo meio fresco que contém os 75% da concentração anterior; xiii. Deixam-se crescer as células no meio que contém os 75% da concentração anterior de proteína, até que a cultura alcance a confluência; xiv. Repetem-se os procedimentos (xi) a (xiii), reduzindo-se, em cada ciclo, a concentração da proteína contida no meio até que os 75% da usada no ciclo anterior, até que se alcance uma concentração de proteína tal que, quando as células sejam transferidas para uma concentração mais baixa, cresçam com uma viabilidade similar e com o tempo de duplicação original, de maneira que a redução subseqüente da concentração de proteína não afete a viabilidade nem o tempo de duplicação.
[0024] No método de adaptação proposto na presente invenção, o meio de cultura em que inicialmente se semeiam as células, compreende entre 5% e 10% do soro fetal bovino.
[0025] No referido método, a linhagem celular de mamífero que se adapta a crescer em meio livre de proteína é um mieloma, particularmente NSO.
[0026] A invenção também pode ser aplicada à adaptação de NSO transfectada com uma seqüência que codifica uma proteína ou polipeptídeo recombinante, particularmente quando a seqüência codifique um anticorpo recombinante ou seus fragmentos, pelo que referida seqüência também inclui as linhagens celulares de mamífero adaptadas ao crescimento em meio livre de proteína.
[0027] Nas diferentes formas de realização da invenção, esta fornece linhagens celulares de mamífero que expressam qualquer um dos anticorpos humanizados ou quiméricos anti-receptores de EGF hR3, anti-CD6 T1hT, anti-CD3 T3Q ou seus fragmentos, adaptadas ao crescimento mediante o método da invenção, em meio livre de proteína, assim como os referidos anticorpos obtidos das referidas linhagens.
[0028] As linhagens adaptadas pelo método da invenção crescem estavelmente em condições de meio livre de soro e de proteínas, por pelo menos 40 gerações.
[0029] A linhagem celular recombinante hR3 foi obtida pela transfecção da linhagem celular de mieloma NSO, com as construções dos vetores para a expressão das cadeias leves e pesadas do anticorpo monoclonal humanizado hR3, que reconhece o receptor do EGF humano.
[0030] A adaptação desta linhagem celular ao meio livre de proteínas foi realizada seguindo-se o procedimento descrito anteriormente, por meio de uma redução do conteúdo de proteínas em duas etapas.
[0031] As células foram inicialmente cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) e logo a partir de uma concentração de proteínas de 0,15 mg/ml, o soro fetal foi substituído pelo suplemento rico em proteínas, Nutridoma NS (Boheringer Manheinn), acrescentado ao meio basal RPMI-1640 (meio livre de soro). A redução no conteúdo de proteínas realizou-se por diluições sucessivas em meio PFHM-II (Gibco) do conteúdo de proteínas presentes no meio inicial.
[0032] Os resultados do cálculo das concentrações críticas e das velocidades de adaptação Vadapt para esta linhagem celular são apresentados nas Figuras 1 e 2, respectivamente.
[0033] A linhagem celular recombinante T1hT foi obtida pela transfecção da linhagem celular de mieloma NSO, com as construções dos vetores para a expressão das cadeias leves e pesadas do anticorpo monoclonal T1hT humanizado pelo método de supressão de epítopos T e que reconhece o receptor CD6 de linfócitos T humanos.
[0034] A adaptação desta linhagem celular ao meio livre de proteínas foi realizada seguindo-se o procedimento descrito no ponto 2, por meio de uma redução do conteúdo de proteínas em duas etapas.
[0035] As células foram inicialmente cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de SFB. A redução no conteúdo de proteínas realizou-se por diluições sucessivas em meio PFHM-II (Gibco) do conteúdo de proteínas presentes no meio inicial.
[0036] Os resultados do cálculo das concentrações críticas e das velocidades de adaptação Vadapt para esta linhagem celular são apresentados nas Figuras 3 e 4, respectivamente.
[0037] A linhagem celular recombinante T3Q foi obtida pela transfecção da linhagem celular de mieloma NSO, com as construções dos vetores para a expressão das cadeias leves e pesadas do anticorpo monoclonal T3Q humanizado pelo método de supressão de epítopos T e que reconhece o receptor do CD3 de linfócitos T humanos.
[0038] A adaptação desta linhagem celular ao meio livre de proteínas foi realizada seguindo-se o procedimento descrito no ponto 2, por meio de uma redução do conteúdo de proteínas em duas etapas.
[0039] As células foram inicialmente cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de SFB. A redução no conteúdo de proteínas realizou-se por diluições sucessivas em meio PFHM-II (Gibco) do conteúdo de proteínas presentes no meio inicial.
[0040] Os resultados do cálculo das concentrações críticas e das velocidades de adaptação Vadapt para esta linhagem celular são apresentados nas Figuras 5 e 6, respectivamente.
[0041] Figura 1: Correlação dos tempos necessários para adaptar a linhagem hR3 a cada concentração de proteínas (até que se recupere a viabilidade e o tempo de duplicação) com o logaritmo natural (neperiano) do inverso da concentração de proteínas. Os valores de concentrações críticas de proteínas para a linhagem celular hR3 são: -0,32 e 0,11 mg/ml da concentração de proteínas totais.
[0042] Figura 2: Correlação do tempo total transcorrido desde o início do procedimento de adaptação com o logaritmo natural do inverso da concentração de proteínas para a linhagem celular hR3. Valor da velocidade de adaptação desta linhagem na fase crítica: -0,0053 mg/d.
[0043] Figura 3: Correlação dos tempos necessários para adaptar a linhagem T1hT a cada concentração de proteínas (até que se recupere a viabilidade e o tempo de duplicação) com o logaritmo natural do inverso da concentração de proteínas. Os valores de concentrações críticas de proteínas para a linhagem celular T1hT são: -0,12 e 0,01 mg/ml da concentração de proteínas totais.
[0044] Figura 4: Correlação do tempo total transcorrido desde o início do procedimento de adaptação com o logaritmo natural do inverso da concentração de proteínas para a linhagem celular T1hT. Valor da velocidade de adaptação desta linhagem na fase crítica: -0,0014 mg/d.
[0045] Figura 5: Correlação dos tempos necessários para adaptar a linhagem T3Q a cada concentração de proteínas (até que se recupere a viabilidade e o tempo de duplicação) com o logaritmo natural do inverso da concentração de proteínas. O valor de concentração crítica de proteínas para a linhagem celular T3Q é de: -0,63 mg/ml da concentração de proteínas totais.
[0046] Figura 6: Correlação do tempo total transcorrido desde o início do procedimento de adaptação com o logaritmo natural do inverso da concentração de proteínas para a linhagem celular T3Q. Valor da velocidade de adaptação desta linhagem na fase crítica: -0,0172 mg/d.
Claims (7)
1. Método para se obter uma linhagem celular de mieloma NSO que contém uma sequência que codifica um polipeptídeo recombinante ou uma proteína recombinante, adaptada para crescer em meio livre de soro e proteína, caracterizado pelo fato de que compreende duas etapas: I. Um primeiro estágio no qual, a partir de uma linhagem com uma viabilidade celular entre 80 e 100%, e as células crescem em meio de cultura com redução consecutiva de concentrações de proteína até uma concentração crítica de proteína em que a viabilidade caia a 0%; II. Um segundo estágio, o qual é composto pelas seguintes etapas: i. As células são semeadas a partir de uma cultura de células com uma viabilidade de 80% ou maior crescendo na concentração de proteína pré-crítica em 3 poços a uma densidade em um intervalo de 2 a 6x105 células/mL, onde as células são cultivadas na concentração de proteína pré- crítica e após 48 horas os 25% do sobrenadante são substituídos por meio livre de proteína fresco, tornando-se assim uma concentração de proteína final que é 75% da concentração de proteína pré-crítica; ii. A cada 48 horas, o sobrenadante é completamente substituído por meio de cultura fresco com uma concentração de proteína que é 75% da concentração de proteína pré-crítica; iii. As células são cultivadas até a confluência sob esta concentração de proteína; iv. As células da etapa (iii) são semeadas em 3 poços com uma densidade na faixa de 2 a 6x105 células/mL em meio de cultura com uma concentração de proteína que é 75% da concentração de proteína pré-crítica; onde após 48 horas, 25% do sobrenadante é substituído por meio fresco livre de proteína, tornando-o assim uma concentração final de proteína que é 75% da concentração da etapa anterior; v. A cada 48 horas, o sobrenadante é completamente substituído por meio de cultura fresco com uma concentração de proteína que é 75% da concentração da concentração na etapa (iii); vi. As células são cultivadas até a confluência sob esta concentração de proteína; vii. As etapas de (iv) a (vi) são repetidas, durante cada ciclo a concentração de proteína é reduzida para 75% da concentração do ciclo anterior, então este procedimento é repetido até atingir uma concentração de proteína que não cause nenhuma perda de viabilidade celular e diminuição do tempo de duplicação da população, quando as células são transferidas para um meio com menor concentração de proteína e são capazes de crescer sem qualquer perda de viabilidade celular e diminuição do tempo de duplicação da população antes da primeira subcultura, considera-se que as células atingiram novamente o estágio não crítico e semeá-las diretamente em meio sem proteína (0 mg/mL de concentração de proteína).
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro estágio é composto pelas seguintes etapas: i. Semear 3 poços na placa de cultura de seis poços com linha de células recombinantes usando o meio de cultura de células padrão (com a concentração inicial de proteína), em uma densidade de 1 a 5 x 105 células/ml, depois de 48 horas substitui- se a metade do sobrenadante da cultura por meio fresco livre de proteína, tornando assim uma concentração de proteína final que é 50% da condição inicial; ii. A cada 48 horas, substituir completamente o sobrenadante por meio de cultura fresco com uma concentração de proteína que é 50% da condição inicial; iii. As células são cultivadas até a confluência sob esta concentração de proteína; iv. As células da etapa (iii) são semeadas em 3 poços, a uma densidade de 1 a 5x105 células/ml em meio de cultura com uma concentração de proteína que é 50% da condição inicial e, depois de 48 horas de crescimento, substitui-se a metade do sobrenadante da cultura por meio fresco livre de proteína, ficando a concentração final de proteínas nos 50% da concentração anterior; v. A cada 48 horas, substituir completamente o sobrenadante por meio de cultura fresco com uma concentração de proteína que é 50% da condição anterior; vi. As células são cultivadas até a confluência sob esta concentração de proteína; vii. As etapas (iv) a (vi) são repetidas, reduzindo-se, durante em cada ciclo, a concentração da proteína contida no meio, até os 50% da concentração do ciclo anterior, repetindo-se este procedimento até alcançar-se uma concentração de proteína que provoque a morte celular.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o meio no qual as células são inicialmente semeadas compreende entre 5% e 10% de soro fetal bovino.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a sequência que codifica um polipeptídeo recombinante ou uma proteína recombinante codifica um anticorpo recombinante ou um fragmento do mesmo.
5. Uso do método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser para a obtenção de linhagens celulares adaptadas a crescer em meio livre de proteínas.
6. Uso do método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a referida linhagem celular é um mieloma.
7. Uso do método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a referida linhagem celular é a linhagem celular NSO.
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