JPH0458882A - ヒトプロラクチンに対するモノクローナル抗体産生用のハイブリドーマ細胞、及びモノクローナル抗体の産生方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は、ヒトプロラクチンに対して極めて特異的に
反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
細胞に関するものである。また、この発明は、上記のハ
イブリドーマ細胞を培養することによって、ヒトプロラ
クチンに対して極めて特異的に反応するモノクローナル
抗体を産生ずる方法に関するものである。

（従来の技術） 一般に、哺乳動物のプロラクチンは互いに性質が類似し
ている。例えば、ヒトプロラクチンとマウスプロラクチ
ンとは、構造的に似ている。このため、これらに特異的
に反応する抗体を得ることが困難であった。すなわち、
ヒトがら得られた天然型のヒトプロラクチンやマウスか
ら得られた天然型のマウスプロラクチンを動物に免疫し
ても、得られる抗体はポリクローナル性のものであって
、モノクローナル性の抗体を得ることはできなかった。

従って、ヒトプロラクチンに対して特異的に反応するモ
ノクローナル抗体は、これまで得られていなかった。

他方、ヒトのプロラクチンに対するモノクローナル抗体
は、知られているＣＩ　ＶＡＮＹ　Ｉ　　Ｊ　、　ａ　
ｎ　ｄＤＡＶＩＥＳ　　Ｐ、、Ｐｒｏｔｉｄｅｓ　　ｏ
ｆ　　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＦｌｕｉｄｓ、　２９．８
５５−８６０．　（１９８１）　：）ｏ　ここで扱われ
ているヒトのプロラクチンは、天然型のヒトプロラクチ
ンであって、第２表に示したアミノ酸配列のポリペプチ
ドであると考えられて来た。

ところが、第２表に示したアミノ酸配列から成るとドブ
フックチンに対するモノクローナル抗体は、天然型のヒ
トプロラクチンを原料とするものであり、天然型のヒト
プロラクチンはこれを入手することが困難なために、こ
れを産生ずることが容易でない、という欠点があった。

（発明が解決しようとする課題） この発明は、ヒトプロラクチンに対して極めて特異的に
反応するモノクローナル抗体を、容易に産生できるよう
にしようとしてなされたものである。

（課題解決のための手段） ヒトプロラクチンに対するモノクローナル抗体を検討す
る場合、これまでは天然型のヒトプロラクチンだけを対
象として来た。ところが、この発明者は、モノクローナ
ル抗体を作るのに、遺伝子の組み換えによって得られた
組み換え型のヒトプロラクチンを用いることを試みた。

すなわち、遺伝子の組み換えによって大腸菌を産生させ
て得られたヒトプロラクチンを用いて、モノクローナル
抗体を得ることを試みた。その結果、この発明者は、組
み換え型のヒトプロラクチンを用いると、抗原特異性に
すぐれたモノクローナル抗体が容易に得られることを見
出した。この発明は、このような知見に基づいてなされ
たものである。

天然型のヒトプロラクチンは、前述のように第２表に示
したアミノ酸配列を持っている。これに対し、組み換え
型のヒトプロラクチンは、第１表に示したアミノ酸配列
を持っている。第１表と第２表とにおけるアミノ酸配列
の違いは、頭にＭｅｔすなわちメチオニンが有るか無い
かという点である。

この発明は、ヒトプロラクチンとして天然型のものの代
わりに、組み換え型のものを用いることとした点、及び
これをクローナル抗体の産生用に利用することとした点
を除いては、既に知られている方法を踏襲することとし
ている。すなわち、ヒトプロラクチンを用いてマウスを
免疫し、こうして得られたマウス脾細胞と骨髄腫細胞と
を融合してハイプリドーマ細胞を作る点、及びこのハイ
ブリドーマ細胞を培養してクローナル抗体を産生きせる
点では、従来方法と何等変わるところがないのである。

（発明要旨） この発明は、第１表に示したアミノ酸配列から成るヒト
プロラクチンで免疫したマウス脾細胞と、骨髄腫細胞と
を融合して作られたヒトプロラクチンに対するモノクロ
ーナル抗体産生層のハイプリドーマ細胞を要旨とするも
のである。

また、この発明は、上記のハイブリドーマ細胞を培養し
てヒトプロラクチンに対するモノクローナル抗体を製造
する方法に関するものである。

（各要件の説明） この発明では、第１表に示したアミノ酸配列から成るヒ
トプロラクチン（以下、これを単に第１ＢＰという）を
用いる。第１ＨＰは、遺伝子の組み換えによって人工的
に作られたＤＮＡを例えば大腸菌内に導入し、その大腸
菌を培養することによって初めて得られるものである。

第１ＨＰはヒトの体内から得られるヒトプロラクチンと
は構造を異にしている。ヒトの体内から得られるヒトフ
ロラクチンは、第２表に示したようなアミノ酸配列を有
するものであって、第１ＨＰに比べると、最初に位置す
るＭｅＬすなわちメチオニンを欠いている。

第１ＨＰを得る方法は、特開平２−４４５号公報に開示
されている。この公報の第１表を見ると、１５８−７５
４に ＴＴＧＯＣＣＡ・・・・・・・・・・ＡＡＣＴＧＣの環
基配列が見られるが、その直下には第２表で示したと全
く同じアミノ酸配列が示されている。

その実施例を見ると、第１ＨＰの得られることが明らか
である。

第１ＵＰで免疫する方法は、公知の方法を踏襲する。す
なわち、例えば８−１０週令のＢＡＬＢ／ｃマウスの皮
下又は腹腔内に、適当なアジュバント（例えばフロイン
トの完全アジュバント（ｃ　ｏｍｐ　１ｅｔｅ　Ｆｒｅ
ｕｎｄ’ｓ　　ａｄｊ　ｕｖａｎｔ））とともに１第１
ＨＰ　　２０−１００μ７／匹を投与する。２週間後に
、さらに追加免疫を行う。その後２日おいて、血清中の
抗プロラクチン抗体価を、以下に述べるように、固相法
による酵素免疫測定法で調べる。

酵素免疫測定法は次のとおりである。まず、９６穴ＥＩ
Ａ用プレートに５μｙ／ｍｅになるようにＰＢＳ（７，
２ｍＭす＞　７１！　２ナトリウム、２．８ｍＭリン酸
１ナトリウム、ｐＨ７，２）に溶解したプロラクチンを
１００μｌ／穴ずつ分注し、室温で１時間放置して抗原
を吸着させた後、ＰＢＳで３回洗浄後、０．５％ＢＳＡ
、０．０５％アジ化ナトリウム／ＰＢＳ溶液を２００μ
ｌ／穴ずつ分注し、室温に１時間放置してプレートをコ
ートする。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳで３回
洗浄後、０．０５％Ｔｗ６ｅｎ−２０／ＰＢＳで適当に
希釈した抗体を１００μｊ／穴ずつ分注し、室温に１時
間放置する。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／　Ｐ　Ｂ　
Ｓで３回洗浄後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／　Ｐ　
Ｂ　Ｓで適当に希釈したペルオキシダーゼ標識２吹抗体
を１００＃／穴ずつ分注し、室温に１時間放置する。０
４０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳで３回洗浄後、ＯＰ
Ｄ基質液（Ｏ−フェニレンジアミン１０メ２を２５ｍＭ
クエン酸、５０ｍＭリン酸ナトリウム２５ｒｎｌに溶解
し、過酸化水素１０μｊを加えたもの）を１００μｌ／
穴ずつ分注し、室温に３０分放置し、２Ｍ硫酸を５０／
＋！！／穴ずつ分注して反応を止め、４９２　ｎｍの吸
光度を測定する。

骨髄腫細胞としては公知のものを用いる。それは例えば
マウスから得られたＰ　３−Ｘ　６３−Ａｇ　８−ｕ　
ＩＣＰ３−Ｕｌ）（Ｃｕｒｒ、Ｔｏｐ、Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、８１，１．１９７８）や、Ｐ
３−ＮＳＩ−１−Ａｇ４−ＩＣＮＳ−１）（Ｅｕｒｏｐ
ｅａｎ　　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、６，５１１゜１９７
６）などの細胞株を用いる。これらの細胞株を８−アザ
グアニンを含む培地で培養し、細胞融合の２〜３日前に
正常培地に戻す。

細胞融合も、公知の方法に従って行う。まず、上述の免
疫したマウスから牌臓を摘出し、脾細胞を調整する。こ
の脾細胞と骨髄腫細胞を１０：１になるように混合し、
ポリエチレングリコール等で融合する。細胞融合後、ヒ
ボキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含むＨ
ＡＴ培地で培養して、融合細胞を選択する。２〜３日ご
とに培地を交換し、１０−１４日後に細胞の増殖が認め
られた時点で、培地をヒボキサンチン及びアミノプテリ
ンが含まれたＨＴ培地に変える。

その後、ハイプリドーマがコロニー状に生育して来たウ
ェルから培養上清を取り、ヒトプロラクチンに対する抗
体価を前述の酵素免疫測定法で調べる。抗体価の高いウ
ェルの細胞について、限界希釈法によりクローニングを
行い、こうして抗ヒトプロラクチンモノクローナル抗体
産生用のハイプリドーマ細胞株を得る。

この発明に従って、ヒトプロラクチンに対するモノクロ
ーナル抗体を得るには、上で得られたハイプリドーマ細
胞を培養し増殖させることにより、ｍ胞から分泌させれ
ばよい。培養にはｉｎ　　ｖｉｔｒ。

による方法と、Ｉｎ　　ＶＩＶＯによる方法とがある。

ｉｎ　　ｖｉｔｒｏによる方法は、牛胎児血清を含むＲ
ＰＭＩ　１６４０やＤＭＥＭなどの培地に、抗ヒトプロ
ラクチンモノクローナル抗体産生用ノ−イブリドーマを
細胞濃度１×１０　Ｃｅ１ｌＳ／ｌｎｅ前後になるよう
にして、８７°ｃ、　ＣＯ２インキユベータで培養する
。２．３日培養し、細胞が５−１０倍に増殖したら、培
養液を遠心してモノクローナル抗体を得る。

ｉｎ　ｖｉｖｏによる方法は、ブリスタンを投与したＢ
ＡＬＢ／ｃマウスに、上の方法で得られた抗ヒトプロラ
クチンモノクローナル抗体産生泪ハイブリドーマ細胞を
２−５Ｘ１０　　ｃｅｌｌｓ／匹腹腔内に注射し、１−
２週間後にモノクローナル抗体を含む腹水を採取する。

この腹水を遠心して固形分を除き・モノクローナル抗体
を得る。

純度の高いモノクローナル抗体が必要な場合は、例えば
、免疫グロブリンＩｇＧクラスの場合、硫安塩析して沈
澱を集め、これを透析することにより、粗製モノクロー
ナル抗体が得られる。さらに精製するには、ＤＥＡＥ−
セルロースカラム、５ｅｐｈａｃｒｙＩＳ−３００カラ
ムなどにかける。

（発明の効果） この発明によれば、第１表に示したアミノ酸配列から成
るヒトプロラクチンで免疫したマウス脾細胞を用いるの
で、これを骨髄腫細胞に融合させて得られたハイブリド
ーマ細胞は、ヒトプロラクチンに対して特異性の強いモ
ノクローナル抗体を産生ずる能力を持っている。従って
、このハイブリドーマ細胞は、特異性の強いモノクロー
ナル抗体を産生ずる上で有用なものである。

また、この発明によれば、上述のハイブリドーマ細胞を
培養してモノクローナル抗体を得る方法が提供されるの
で、これによってヒトプロラクチンに対する特異性の強
いモノクローナル抗体を得ることかできる。従って、ヒ
トプロラクチンを検出する上において有用である。

以下に実施例を述べて、この発明のすぐれている所以を
説明する。

実施例１ この実施例では、以下に述べるようにして、抗ヒトプロ
ラクチンモノクローナル抗体産生用のハイブリドーマ細
胞株を得た。

１）　免疫マウス脾細胞の調整 第１表に示したヒトプロラクチンは、特開平２−４４５
号公報の記載に従って調整した。こうして得たヒトプロ
ラクチンをフロイントの完全アジュバントとともに、８
週令の雌ＢＡＬＢ／Ｃマウスに皮下投与した。その２週
間後に、さらにフロイントの不完全アジュバントととも
に、また第１表に示したヒトプロラクチン１００馬を皮
下投与した。その３週間後に、さらに第１表に示したヒ
トプロラクチン１００ｎを静脈内に投与した。

その後、２日おいてマウス血清中のヒトプロラクチンに
対する抗体価を前述の酵素免疫測定法で調べ、抗体価が
充分高くなっていることをｉ認した。

その後１日おいて、マウスから肺細胞を摘出した。摘出
した肺細胞をスライドガラスですり潰し、ステンレスメ
ッシェを通して単細胞にし、Ｔｒｒｓ　ｂｕｆｆｅｒ　
（ｐ）Ｉ　７．２）で赤血球を溶解し、その後ＨＡＮＫ
Ｓ溶液（田水製薬社製）で洗浄した。

２）　マウス骨髄腫細胞（Ｐ３−Ｕｌ）の調整８−アザ
グアニン耐性マウス骨髄腫細胞（Ｐ３−Ｕｌ）を増殖培
地（ＲＰ旧１６４０　　（田水製薬社製）にＮａ）Ｉｃ
Ｏ：＋　２８／　ｊ！、ピルビン酸ナトリウム０．１１
ｇ＃！、ペニシリン３１．２５Ｂ／ｊＬストレプトマイ
シン５０．０ｍｇ／ｊ２−ゲンタマイシン１５４．　Ｏ
ｍｇ／　ｊ２．２−メルカプトエタノール２．５Ｘ１０
−’Ｍ及び牛胎児血清１０．０％を加えた培地］で培養
しく３７°Ｃ，ＣＯ，インキュベーター）、ＨＡＮＫＳ
溶液で洗浄して、マウス骨髄腫細胞を得た。

３）　ハイブリドーマの作製 上で得た免疫マウス脾細胞ｌＸｌ０’個とマウス骨髄腫
細胞ｌＸｌ０’個とを混合し、１５００ｒｐｍで５分間
遠心分離を行い、上清を除いた。

沈澱として得られた免疫マウス脾細胞とマウス骨髄腫細
胞との混合物の塊をよく解きほぐした後、４５％ポリエ
チレングリコール１ｄを１分間にわたって徐々に加え、
よく混合した。その後ＨＡＮＫＳ溶液２０〆を５分間に
わたって徐々に添加し、１５００ｒｐｍで５分間遠心分
離して上清を除き、細胞濃度が５Ｘ１０’個／ｄになる
ように増殖培地を加え細胞を懸濁した。

９６穴培養用プレー１−　（ＦＡＬＣＯＮ社製）に２０
０ｕｆ／穴ずつ分注し、培養（３７°Ｃ，Ｃｏ。

インキュベーター）した、１日後及び３日後に、何れも
培養液１００μｌを各ウェルから捨て、ＨＡＴ培地（Ｉ
ＸＩＯ−’Ｍのヒボキサンチン、４Ｘ１０−’Ｍのアミ
ノプテリン、１．６Ｘ１０−’Ｍのチミジンを含む増殖
培地）を１００μ！加えた。２日後に、培養液１００μ
！を各ウェルから捨て、ＨＴ培地（ＩＸＩＯ−’Ｍのヒ
ボキサンチン、１．６　Ｘ　１０４Ｍのチミジンを含む
増殖培地）を１００μ！加えた。２日後に、培養液１０
０μｐを各ウェルから捨て、増殖培地を１００ｐｌ加え
た。こうして、ハイブリドーマ細胞を得た。

３日後に、培地上清のヒトプロラクチンに対する抗体価
を、前述の酵素免疫測定法により調べた。抗体を産生ず
るハイブリドーマ細胞を含むウェルの細胞を限界希釈法
により２回クローニングし、抗ヒトプロラクチンモノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞として、二種の細
胞株Ａ３１−ＡＳＣＬ−１を得た。

実施例２ この実施例では、実施例１で得たハイブリドマ細胞をｉ
ｎ　　ｖｉｔｒｏで培養し、その培養上澄中に産生され
たモノクローナル抗体の性質を次のようにしてｆ１１認
した。

マウスイムノグロブリンの各タイプ（ＩｇＡ、１ｇＭ、
ｒｇ（、、ＩｇＧｚａ、ＩｇＧｚｂ、Ｔ　ｇ　Ｇ２）に
特有なペルオキシダーゼ標識第２抗体（ＺｙｍｅＬ社製
）を用いる酵素免疫法によりアイソタイプを調べた。そ
の結果、Ａ３１−ＡＳＣｌ−１ともにＩｇＧ、に分類さ
れる抗体を産生じていることがわかった。

実施例３ この実施例では、得られたモノクローナル抗体の抗原特
異性を調べた。

測定は、前述の面相法による酵素免疫測定法により行っ
た。抗原としては、特開平２−４４５号公報記載の方法
によって大腸菌によって作られたｒｒＰＲＬ）、マウス
プロラクチン（ｒｍＰＲＬ）　（以上、敷島紡績社製）
天然型ヒトプロラクチン（ｈＰＲＬ）　　（ＣＡＬＢＩ
ＯＣｈｅｍ社製）及び天然型ヒツジプロラクチン（ｏＰ
ＲＬ）　（Ｓ　ｉ　ｇ　ｍ　ａ社製）を用いた。

抗体としては、この発明によって作られたモノクローナ
ル抗体、ヒトプロラクチン抗血清（オリエンタル酵母社
製）及びラットプロラクチン抗血清（ＵＣＢ　　Ｂｉｏ
ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）を用いた。なお、ヒトプロラク
チン抗血清と、ラフトプロラクチン抗血清とはポリクロ
ーナル抗体である。

その結果は、下記第３表に示すとおりであった。

ここで、＋は陽性、すなわち反応することを示し、−は
陰性、すなわち反応しないことを示している。

第１表により、この発明によって得られたＡ３１人と０
１−１とが、他の抗血清に比べて、抗原特異性にすぐれ
ていることが判明する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、第１表に示したアミノ酸配列から成るヒトプロラク
   チンで免疫したマウス脾細胞と、骨髄腫細胞とを融合し
   て作られたヒトプロラクチンに対するモノクローナル抗
   体産生用のハイブリドーマ細胞。 ２、第１表に示すアミノ酸配列から成るヒトプロラクチ
   ンで免疫したマウス脾細胞と、骨髄腫細胞とを融合して
   作られたハイブリドーマ細胞を培養することを特徴とす
   る、ヒトプロラクチンに対するモノクローナル抗体の製
   造方法。