BRPI0410027B1 - molécula de dna isolada, kit e método para identificação do evento tc1507, construto de dna, método para aumentar a resistência de uma planta a insetos, método de detecção da presença do evento tc1507, sequência de junção de dna isolado, método de screening de sementes, método para a produção de uma planta, método para a detecção da presença da inserção do evento tc1507, kit de detecção de dna - Google Patents
molécula de dna isolada, kit e método para identificação do evento tc1507, construto de dna, método para aumentar a resistência de uma planta a insetos, método de detecção da presença do evento tc1507, sequência de junção de dna isolado, método de screening de sementes, método para a produção de uma planta, método para a detecção da presença da inserção do evento tc1507, kit de detecção de dna Download PDFInfo
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Abstract
"MOLÉCULA E CONSTRUCTO DE DNA, KIT E MÉTODO PARA A IDENTIFICAÇÃO DE DNA E DO EVENTO TC1507 DE MILHO, MÉTODO PARA A CONFIRMAÇÃO DE PUREZA E DE SCREENING DE SEMENTES E MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UMA PLANTA DE MILHO RESISTENTE A INSETO". A invenção provê composições de DNA que se referem a plantas transgênicas de milho resistentes a inseto. São também providos ensaios para detectar a presença do evento TC1507 baseado na seqüência de DNA do constructo recombinante inserido no genoma de milho e seqüências de DNA flanqueadoras do sítio de inserção. São providos kits e condições utilizáveis na condução dos ensaios.
Description
[0001] A presente invenção se refere ao campo da biologia molecular de plantas, especificamente, a invenção se refere a um constructo de DNA para conferir, em uma planta, resistência a inseto. A invenção mais especificamente se refere a uma planta de milho TC1507 resistente a inseto e a ensaios para detectar a presença do DNA da planta de milho TC1507 em uma amostra e composições da mesma.
[0002] Esta invenção se refere à planta de milho (Zea mays) TC1507 resistente a inseto, também referenciada como linhagem de milho (maize)TC1507 ou evento de milho (maize)TC1507, e ao constructo de DNA de expressão, em planta, da planta de milho (corn)TC1507 e a detecção da região de inserção transgene/flanqueadora na planta de milho (corn)TC1507 e progénie da mesma.
[0003] O milho é um grão importante e é uma fonte primária de alimento em muitas áreas do mundo. Apesar do uso de medidas de proteção, tais como pesticidas químicos, o dano causado pelas pragas de insetos é um dos maiores fatores de perda de lavoura de milho no mundo. Em vista disto, a resistência a insetos tem sido realizada por engenharia genética em lavouras, tais como a de milho, de modo a controlar o dano por insetos e a reduzir a necessidade de pesticidas quimicos tradicionais. Um grupo de genes que tem sido utilizado na produção de culturas transgênicas resistentes a insetos são as delta-endotoxinas de Bacillus thuringiensis (B.t.). As delta- endotoxinas têm sido expressadas com sucesso em plantas de cultivo tais como algodão, batata, arroz, couve-flor, assim como milho, e têm provado serem capazes de fornecer excelente controle sobre pragas de insetos. (Perlak, F. J et al. (1990) Bio/Technology 8, 939-943; Perlak, F. J. et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22: 313-321; Fujimoto H. et al. (1993) Bio/Technology 11: 1151-1155; Tu et al. (2000) Nature Biotechnology 18: 1101-1104; pedido PCT número de publicação WO 01/13731; e Bing JW et al.
[0004] (2000) Efficacy of CrylF Transgenic Maize, 14a Biennial International Plant Resistance to Insects Workshop, Fort Collins, CO).
[0005] É sabido que a expressão de genes estrangeiros em plantas é influenciada por sua localização no genoma da planta, talvez devido à estrutura da cromatina (por exemplo, hetero-cromatina) ou pela proximidade dos elementos de regulação da transcrição (por exemplo, enhances)perto do sitio de integração (Weising etal. , Ann. Rev. Genet22: 421- 477, 1988). Ao mesmo tempo, a presença do transgene em diferentes localizações no genoma influenciará o fenótipo completo da planta de diferentes maneiras. Por esta razão, é freqüentemente necessário realizar o screeningde um grande número de eventos de forma a identificar um evento caracterizado por expressão ótima de um gene de interesse introduzido. Por exemplo, tem sido observado em plantas e em outros organismos que pode haver uma ampla variação, entre eventos, nos niveis de expressão de um gene introduzido. Pode também haver diferenças nos padrões espaciais ou temporais, por exemplo, diferenças na expressão relativa de um transgene em vários tecidos de planta, que pode não corresponder aos padrões esperados dos elementos de regulação de transcrição presentes no constructo do gene introduzido. Por esta razão, é comum produzir centenas de milhares de diferentes eventos e realizar o screeningdaqueles eventos em relação a um evento simples que tenha desejáveis niveis e padrões de expressão para finalidades comerciais. Um evento que tem niveis e padrões desejados de expressão de transgene é útil para introgressão do transgene em outro backgroundgenético por alogamia sexual usando métodos de melhoramento convencionais. A progénie de tais cruzamentos mantém as características de expressão do transgene do transformante original. Esta estratégia é usada para assegurar a expressão confiável do gene em um número de variedades que são bem adaptadas às condições do local de crescimento.
[0006] Seria vantajoso ter a capacidade de detectar a presença de um evento particular de forma a se determinar se a progénie de um cruzamento sexual contém um transgene de interesse. Adicionalmente, seria proveitoso um método para detectar um evento particular para atender às regulamentações requeridas de pré-aprovação para comercialização e identificação de alimentos, por exemplo, derivados de plantas de culturas recombinantes, ou para uso em monitoramento ambiental, caracteres de monitoramento em culturas no campo, ou monitoramento de produtos derivados de uma colheita de lavoura, bem como para uso na segurança com relação à obediência dos objetos das partes aos termos de regulação ou contratuais.
[0007] É possivel detectar a presença de um transgene por qualquer método de detecção de ácido nucléico conhecido do estado da técnica, incluindo, mas não estando limitado a reação de cadeia da polimerase (PCR) ou hibridização de DNA usando sondas de ácido nucléico. Esses métodos de detecção geralmente focalizam elementos genéticos freqüentemente usados, tais como promotores, terminadores, genes de marcação, etc., porque para muitos constructos de DNA, a região codificante é intercambiável. Como resultado, tais métodos podem não ser passíveis de utilização para discriminar entre eventos diferentes, particularmente aqueles produzidos pelo uso do mesmo constructo de DNA ou constructos muito semelhantes, a menos que seja conhecida a seqüência de DNA do DNA flanqueador adjacente ao DNA heterólogo inserido. Por exemplo, um ensaio de PCR evento-especifico é descrito na patente US 6.395.485 para a detecção do evento elite GAT-ZM1. Consequentemente, seria desejável ter um método simples e discriminador para a identificação do evento TC1507.
[0008] Esta invenção se refere preferencialmente a métodos para produzir e selecionar uma planta de cultura monocotiledônea resistente a insetos. Mais especificamente, é provido um constructo de DNA que quando expressado em células de planta e plantas confere resistência a insetos. De acordo com um aspecto da invenção, é provido um constructo de DNA, capaz de ser introduzido e replicado em uma célula de hospedeiro, que quando expressado em células de planta e plantas confere, nas células de planta ou plantas, resistência a insetos. 0 constructo de DNA é compreendido de uma molécula de DNA denominada PHI8999A e ela inclui dois cassetes de expressão de transgene. 0 primeiro cassete de expressão compreende uma molécula de DNA que inclui o promotor, o exon 5' não-traduzido, e o primeiro intron do gene da ubiquitina de milho (Ubi-1) (Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol.18: 675-689 e Christensen e Quail (1996) Transgenic Res. 5: 213- 218) operacionalmente ligado a uma molécula de DNA codificante de uma δ-endotoxina de B. t. identificada como CrylF (patentes US 5.188.960 e US 6.218.188) operacionalmente ligada a uma molécula de DNA compreendendo um terminador de transcrição 3' ORF25 isolado de Agrobacterium tumefaciens(Barker et al. (1983) Plant Mol. Biol. 2: 335-350) . O segundo cassete de expressão de transgene do constructo de DNA compreende uma molécula de DNA do promotor do virus de mosaico de couve-flor (CaMV) 35S (Odell J. T. et al. (1985) Nature313: 810-812; Mitsuhara et al. (1996) Plant Cell Physiol.37: 49-59) operacionalmente ligada a uma molécula codificante do gene da fosfinotricina acetiltransferase (PAT) (Wohlleben W. et al. (1988) Gene 70: 25-37) operacionalmente ligada a uma molécula de DNA compreendendo um terminador de transcrição 3' de (CaMV) 35S (ver Mitsuhara et al. (1996) Plant Cell Physiol.37: 49- 59) . São também providas as plantas contendo o constructo de DNA.
[0009] De acordo com um outro aspecto da invenção, são providos as composições e os métodos para identificar uma nova planta de milho denominada TC1507, métodos esses que são baseados em primers ou sondas que reconhecem especificamente a seqüência flanqueadora 5' e/ou 3'do TC1507. Essas moléculas podem ser selecionadas do grupo consistindo de: 5’-GTAGTACTATAGATTATATTATTCGTAGAG-3! (SEQ ID NO: 1); 5<GCCATACAGAACTCAAA\TCTITTCCGGAG-3’ (SEQ ID NO: 2); 5’- CTTCAAACAAGTGTGACAAA--3’ (SEQ ID NO: 23 ); S’-TGTGGTGTTTGTGGCTCTGTCCTAA-J’ (SEQ ID NO: 3); S’-AGCACCTTTTCATTCITTCATATAC-3’ (SEQ ID NO: 4); 5’-GACCTCCCCA CAGGCATGAT TGATC-3’ (SEQ £D NO: 5); e complementos das mesmas. A planta e semente de milho compreendendo essas moléculas é um aspecto desta invenção. Adicionalmente, são providos os kits utilizando essas seqüências de primer para a identificação do evento TC1507.
[0010] Um aspecto adicional da invenção refere-se às seqüências flanqueadoras especificas de TC1507 aqui descritas, as quais podem ser usadas para desenvolver métodos de identificação especifica para TC1507 em amostras biológicas. Mais particularmente, a invenção se refere às regiões f lanqueadoras 5' e/ou 3'de TC1507, SEQ ID No:21 e SEQ ID No:22, respectivamente, as quais podem ser usadas para o desenvolvimento de primers e sondas específicos. A invenção ainda se refere a métodos de identificação da presença de TC1507 em amostras biológicas baseados no uso de primers ou sondas específicos.
[0011] De acordo com um outro aspecto da invenção, são providos métodos para detectar a presença de DNA correspondente ao evento TC1507 de milho em uma amostra. Tais métodos compreendem os estágios de: (a) contactar a amostra compreendendo o DNA com um conjunto de primers de DNA, que quando usado em uma reação de amplificação de ácido nucléico com DNA genômico extraido do evento TC1507 de milho produz um amplicon que é o diagnóstico para o evento TC1507 de milho; (b) realizar uma reação de amplificação de ácido nucléico, produzindo por esse meio o amplicon; e (c) detectar o amplicon.
[0012] As moléculas de DNA que compreendem a nova região de inserção transgene/flanqueadora, SEQ ID No: 26 e SEQ ID No: 27 e são homólogas ou complementares à SEQ ID No: 26 e SEQ ID No: 27 são um aspecto desta invenção.
[0013] As seqüências de DNA que compreendem a nova região de inserção transgene/flanqueadora, SEQ ID No: 26 é um aspecto desta invenção. Estão incluídas as seqüências de DNA que compreendem um comprimento suficiente de polinucleotideos da seqüência do inserto de transgene e um comprimento suficiente de polinucleotideos da seqüência genômica e/ou flanqueadora de milho da planta de milho TC1507 da SEQ ID No: 26 que são utilizáveis como seqüências de primer para a produção de um diagnóstico de produto de amplicon para a planta de milho TC1507.
[0014] Adicionalmente, são providas as seqüências de DNA que compreendem a nova região de inserção transgene/ flanqueadora, SEQ ID No: 27. Estão incluídas as seqüências de DNA que compreendem um comprimento suficiente de polinucleotideos da seqüência do inserto e de um comprimento suficiente de polinucleotideos da seqüência genômica e/ou flanqueadora de milho da planta de milho TC1507 de SEQ ID No: 27 que são utilizáveis como seqüências de primer para a produção de um diagnóstico de produto de amplicon para a planta de milho TC1507.
[0015] De acordo com um outro aspecto da invenção, as seqüências de DNA que compreendem pelo menos 11 ou mais nucleotideos da porção do transgene da seqüência de DNA de SEQ ID No: 2 6 ou complementos da mesma, e um comprimento semelhante da seqüência de DNA 5' flanqueadora de milho de SEQ ID No: 26 ou complementos da mesma são utilizáveis como primers de DNA em métodos de amplificação de DNA. Os amplicons produzidos através do uso desses primers são o diagnóstico para o evento TC1507 de milho. Portanto, a invenção também inclui os amplicons produzidos pelos primers de DNA homólogos ou complementares da SEQ ID No: 26.
[0016] De acordo com um outro aspecto da invenção, as seqüências de DNA que compreendem pelo menos 11 ou mais nucleotideos da porção do transgene da seqüência de DNA de SEQ ID No: 27, ou complementos da mesma, e um comprimento semelhante ao da seqüência de DNA de milho 3' flanqueadora de SEQ ID No: 27, ou complementos da mesma, são utilizáveis como primers de DNA em métodos de amplificação de DNA. Os amplicons produzidos através do uso desses primers são o diagnóstico para o evento TC1507 de milho. Portanto, a invenção também inclui os amplicons produzidos pelos primers de DNA homólogos ou complementares da SEQ ID No: 27.
[0017] Mais especificamente, um par de moléculas de DNA compreendendo um conjunto de primers de DNA, em que as moléculas de DNA são identificadas como SEQ ID No: 1, ou complementos da mesma, e SEQ ID No: 2, ou complementos da mesma; SEQ ID No: 2, ou complementos da mesma, e SEQ ID No: 23, ou complementos da mesma; SEQ ID No: 3, ou complementos da mesma, e SEQ ID No: 5, ou complementos da mesma; SEQ ID No: 4, ou complementos da mesma, e SEQ ID No: 5, ou complementos da mesma são aspectos da invenção.
[0018] Aspectos adicionais da invenção incluem o amplicon compreendendo as moléculas de DNA de SEQ ID No: 1 e SEQ ID No: 2; o amplicon compreendendo as moléculas de DNA de SEQ ID No: 2 e SEQ ID No: 23; o amplicon compreendendo as moléculas de DNA de SEQ ID No: 3 e SEQ ID No: 5; e o amplicon compreendendo as moléculas de DNA de SEQ ID No: 4 e SEQ ID No: 5.
[0019] De acordo com um outro aspecto da invenção, são providos métodos para detectar a presença de uma molécula de DNA correspondente ao evento TC1507 em uma amostra, tais métodos compreendendo as etapas de: (a) contactar a amostra compreendendo o DNA extraido de uma planta de milho com uma sonda de DNA, molécula que hibridiza sob condições estringentes de hibridização com o DNA extraido do evento TC1507 de milho e não hibridiza sob condições estringentes de hibridização com um DNA controle de planta de milho; (b) submeter a amostra e a sonda a condições estringentes de hibridização; e (c) detectar a hibridização da sonda com o DNA. Mais especificamente, são providos métodos para detectar a presença de uma molécula de DNA correspondente ao evento TC1507 em uma amostra, tais métodos consistindo das etapas de: (a) contactar a amostra compreendendo o DNA extraido de uma planta de milho com uma molécula de sonda de DNA que consiste de seqüências que são únicas para o evento, por exemplo, seqüências de junção, em que dita molécula de sonda de DNA hibridiza sob condições estringentes de hibridização com o DNA extraído do evento TC1507 de milho e não hibridiza sob condições estringentes de hibridização com um DNA controle de planta de milho; (b) submeter a amostra e sonda a condições estringentes de hibridização; e (c) detectar a hibridização da sonda com o DNA.
[0020] Adicionalmente, são providos um kit e métodos para identificar o evento TC1507 em uma amostra biológica que detecta uma região específica de TC1507 dentro da SEQ ID NO: 24 .
[0021] São providas as moléculas de DNA que compreendem pelo menos uma seqüência de junção de TC1507 selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID No: 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 e 57 e complementos das mesmas; em que uma seqüência de junção expande a junção entre um DNA heterólogo inserido no genoma e o DNA da célula de milho que flanqueia o sítio de inserção, ou seja, o DNA flanqueador, e é o diagnóstico para o evento TC1507.
[0022] De acordo com um outro aspecto da invenção, são providos métodos para produzir uma planta de milho resistente a insetos que compreende as etapas de: (a) fazer o cruzamento sexual de uma primeira linhagem parental de milho compreendendo os cassetes de expressão da presente invenção, que confere resistência a insetos, e uma segunda linhagem parental de milho com ausência de resistência a insetos, produzindo, por esse meio, uma pluralidade de plantas de progénie; e (b) selecionar uma progénie que é resistente a insetos. Tais métodos podem opcionalmente compreender uma etapa adicional de retrocruzamento da planta de progénie com a segunda linhagem parental de milho para produzir uma planta de milho de verdadeiro melhoramento que é resistente a insetos.
[0023] A presente invenção também provê um método para produzir uma planta de milho que é resistente a insetos compreendendo a transformação de uma célula de milho com o constructo de DNA PHI8999A (SEQ ID No: 25), o crescimento da célula de planta transformada, a seleção da planta de milho que mostra resistência a insetos, e posterior crescimento da planta de milho na forma de uma planta fértil de milho. A planta fértil de milho pode ser auto polinizada ou cruzada com variedades de milho compatíveis para produzir progénie resistente a insetos.
[0024] A invenção ainda se refere a um kit de detecção de DNA para identificar o evento TC1507 de milho em amostras biológicas. Preferencialmente, o kit da invenção compreende um primeiro primer que reconhece especificamente a região 5' ou 3' flanqueadora de TC1507, e um segundo primer que reconhece especificamente uma seqüência dentro do DNA estrangeiro de TC1507, ou dentro do DNA flanqueador, para uso em um protocolo de identificação por PCR. A invenção também se refere a um kit para identificar o evento TC1507 em amostras biológicas, sendo que o dito kit compreende uma sonda especifica tendo uma seqüência que corresponde, ou é complementar, a uma seqüência tendo entre 80% e 100% de identidade de seqüência com uma região especifica do evento TC1507. Preferencialmente, a seqüência da sonda corresponde a uma região especifica compreendendo parte da região flanqueadora 5' ou 3' do evento TC1507.
[0025] Os métodos e kits abrangidos pela presente invenção podem ser usados para diferentes finalidades, tais como, mas não limitadas às seguintes: identificar o evento TC1507 em plantas, material de planta ou em produtos tais como, mas não limitados a alimentos ou produtos forrageiros (frescos ou processados) compreendendo, ou derivadas de, material de planta; adicionalmente ou alternativamente, os métodos e kits da presente invenção podem ser usados para identifier material de planta transgênica para propósitos de segregação entre material transgênico e não-transgênico; adicionalmente ou alternativamente, os métodos e kits da presente invenção podem ser usados para determinar a gualidade do material de planta compreendendo o evento TC1507 de milho. Os kits podem também conter os reagentes e materiais necessários para o desempenho do método de detecção.
[0026] Esta invenção, adicionalmente, se refere à planta de milho TC1507 ou suas partes, incluindo, mas não estando limitados a pólen, óvulos, células vegetativas, o núcleo de células de pólen, e o núcleo de células de ovo da planta de milho TC1507 e da progénie derivada da mesma. A planta e semente de milho TC1507 da qual provêem as moléculas de primer de DNA da presente invenção, fornecendo um produto especifico de amplicon, é um aspecto da invenção.
[0027] O precedentemente descrito e outros aspectos da invenção ficarão mais evidentes a partir da descrição detalhada e dos desenhos que a acompanham.
[0028] Figura 1. Mapa linear mostrando o inserto transgênico PHI8999A, bem como as seqüências flanqueadoras do inserto transgênico.
[0029] As seguintes definições e métodos são providos para melhor definir a presente invenção e para orientar aqueles especialistas na técnica na prática da presente invenção. A menos que de outra maneira seja observado, os termos devem ser entendidos de acordo com o uso convencional por aqueles com conhecimento comum na técnica relevante. As definições de termos comuns em biologia molecular podem também ser encontrados em Rieger et al., Glossary of Genetics: Classical e Molecular;5a Edição, Springer-Verlag; New York, 1991; e Lewin, Genes V, Oxford University Press: New York, 1994. É usada a nomenclatura para as bases como estabelecido em 37 CFR 1.822 .
[0030] Como aqui usado, o termo "compreendendo" significa "incluindo, mas não limitado a".
[0031] Como aqui usado, o termo "milho (corn)"significa Zea maysou milho indiano (maize)e inclui todas as variedades de planta que podem ser melhoradas com milho, incluindo espécies de milho indiano do tipo selvagem.
[0032] Como aqui usado, o termo "TC1507 especifico" se refere a uma seqüência de nucleotideos que é apropriada para identificar de modo discriminatório o evento TC1507 em plantas, material de planta, ou em produtos tais como, mas não limitados a alimentos ou produtos forrageiros (frescos ou processados) compreendendo, ou derivados de, material de planta.
[0033] Como aqui usados, os termos "resistente a insetos" e "impactar as pragas de insetos" se refere a efetuar mudanças na alimentação, crescimento e/ou comportamento do inseto em qualquer estágio de desenvolvimento, incluindo, mas não estando limitado a: matar o inseto; retardar o crescimento; prevenir a capacidade reprodutiva; e semelhantes.
[0034] Como aqui usado, os termos "atividade pesticida" e "atividade insecticida" são usados de modo sinônimo para se referir à atividade de um organismo ou de uma substância (tal como, por exemplo, uma proteina) que pode ser medida por numerosos parâmetros, incluindo, mas não estando limitadas a mortalidade da praga, perda de peso da praga, atração da praga, repelência da praga, e outras mudanças comportamentais e fisicas de uma praga após se alimentar de e/ou ficar exposta ao organismo ou substância por um periodo de tempo apropriado. Por exemplo "proteínas pesticidas" são proteínas que apresentam atividade pesticida por si mesmas ou em combinação com outras proteínas.
[0035] "Seqüência codificante" se refere a uma seqüência de nucleotideos que codifica uma seqüência especifica de aminoácidos. Como aqui usado, os termos "codificante" ou "codificado", quando usados no contexto de um ácido nucléico especifico, compreendem a informação necessária para orientar a tradução de uma seqüência de nucleotideos em uma proteina especificada. A informação pela qual uma proteina é codificada é especificada pelo uso de códons. Um ácido nucléico codificante de uma proteina pode compreender seqüências não- traduzidas (por exemplo, introns) com regiões traduzidas do ácido nucléico ou pode ter ausência de seqüências mediadoras não-traduzidas (por exemplo, como no cDNA).
[0036] "Gene" se refere a um fragmento de ácido nucléico que expressa uma proteína especifica, incluindo seqüências de regulação que precedem (seqüências 5' não-codificantes) e que seguem (seqüências 3' não-codificantes) a seqüência codificante. "Gene nativo" se refere a um gene como encontrado na natureza com suas seqüências de regulação próprias. "Gene quimérico" se refere a qualquer gene que não é um gene nativo, compreendendo seqüências de regulação e codificantes que não são encontradas juntas na natureza. Conseqüentemente, um gene quimérico pode compreender seqüências de regulação e seqüências codificantes que são derivadas de diferentes fontes, ou seqüências de regulação e seqüências codificantes derivadas da mesma fonte, mas dispostas em um modo diferente daquele que é encontrado na natureza. "Gene endógeno" se refere a um gene nativo na sua localização natural no genoma de um organismo. "Estrangeiro" se refere ao material não encontrado normalmente na localização de interesse. Portanto, "DNA estrangeiro" pode compreender ambos DNA recombinante e DNA rearranjado, recentemente indroduzido, na planta. Um gene "estrangeiro" se refere a um gene não encontrado normalmente em um organismo hospedeiro, mas que é introduzido no organismo hospedeiro por transferência de gene. Genes estrangeiros podem compreender genes nativos inseridos em um organismo não- nativo, ou genes quiméricos. Um "transgene" é um gene que foi introduzido no genoma por meio de um procedimento de transformação. O sitio no genoma da planta onde um DNA recombinante foi inserido pode ser referenciado como "sitio de inserção" ou "sitio alvo".
[0037] Como aqui usado, o "DNA de inserto" se refere a um DNA heterólogo dentro de cassetes de expressão, que é usado para transformar material de planta na medida que o "DNA flanqueador" possa existir, tanto o DNA genômico naturalmente presente em um organismo tal como uma planta, como um DNA estrangeiro (heterólogo) introduzido via o processo de transformação, o qual é extrínseco à molécula de DNA do inserto original, por exemplo, fragmentos associados com o evento de transformação. Uma "região flanqueadora" ou "seqüência flanqueadora", como aqui usada, se refere a uma seqüência de pelo menos 20 pares de base, preferencialmente pelo menos 50 pares de base, e até 5000 pares de base, a qual está localizada tanto imediatamente a montante de e contigua com ou imediatamente a jusante de e contigua com a molécula de DNA do inserto estrangeiro original. Os procedimentos de transformação que levam à integração aleatória do DNA estrangeiro resultarão em transformantes contendo diferentes regiões flanqueadoras caracteristicas e únicas para cada transformante. Quando o DNA recombinante é introduzido em uma planta através de cruzamento tradicional, suas regiões flanqueadoras, em geral, não serão modificadas. Os transformantes também conterão junções únicas entre uma porção do DNA do inserto heterólogo e o DNA genômico, ou 2 porções do DNA genômico, ou 2 porções do DNA heterólogo. Uma "junção" é um ponto onde 2 fragmentos específicos de DNA se juntam. Por exemplo, uma junção existe onde o DNA do inserto se junta ao DNA flanqueador. Um ponto de junção também existe em um organismo transformado onde 2 fragmentos de DNA se juntam de uma maneira que é modificada em relação àquela da natureza. "DNA de junção" se refere ao DNA que compreende um ponto de j unção.
[0038] Como aqui usado, em relação a um ácido nucléico, "heterólogo" é um ácido nucléico que se origina de uma espécie estrangeira, ou, se da mesma espécie, está substancialmente modificado com referência à sua forma nativa em composição e/ou lócus genômico por deliberada intervenção humana. Por exemplo, um promotor operacionalmente ligado a uma seqüência de nucleotideos heteróloga pode ser de uma espécie diferente daquela da qual a seqüência de nucleotideos foi derivada, ou, se da mesma espécie, o promotor não é naturalmente encontrado como operacionalmente ligado à seqüência de nucleotideos. Uma proteina heteróloga pode se originar de uma espécie estrangeira, ou, se da mesma espécie, está substancialmente modificada com relação à sua forma original por deliberada intervenção humana.
[0039] "Seqüências de regulação" se referem a seqüências de nucleotideos localizados a montante (seqüências 5' não- codificantes), dentro, ou a jusnte (seqüências 3' não- codificantes) de uma seqüência codificante, e as quais influenciam a transcrição, o processamento ou estabilidade do RNA, ou a tradução da seqüência codificante associada. As seqüências de regulação podem incluir promotores, seqüências lider de tradução, introns, e seqüências de reconhecimento de poliadenilação.
[0040] "Promotor" se refere a uma seqüência de nucleotideos capaz de controlar a expressão de uma seqüência codificante ou RNA funcional. Em geral, uma seqüência codificante está localizada na posição 3' com relação à seqüência do promotor. A seqüência do promotor consiste de elementos, a montante próximos ou mais distantes, sendo os últimos elementos, com freqüência, referidos como enhancers. Conseqüentemente, um "enhancer"é uma seqüência de nucleotideos que pode estimular a atividade do promotor e pode ser um elemento inerente do promotor ou um elemento heterólogo inserido para melhorar o nivel de especificidade ou de tecido-especificidade de um promotor. Os promotores podem ser derivados em sua totalidade de um gene nativo, ou serem compostos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados na natureza, ou mesmo que compreendam segmentos de nucleotideos obtidos por sintese. Deve ser entendido que aqueles especialistas na técnica podem direcionar a expressão de um gene em diferentes tecidos ou tipos de célula, ou em diferentes estágios de desenvolvimento, ou em resposta a diferentes condições ambientais. Os promotores que promovem a expressão de um fragmento de ácido nucléico na maioria das vezes são comumente referidos como "promotores constitutivos". Novos promotores de vários tipos utilizáveis em células de planta estão sendo constantemente descobertos; numerosos exemplos podem ser encontrados na compilação feita por Okamuro e Goldberg (1989) Biochemistry of Plants 15: 1-82. É ainda reconhecido que, na medida que na maioria dos casos as fronteiras exatas das seqüências de regulação não foram completamente definidas, os fragmentos de ácido nucléico de diferentes comprimentos podem possuir idêntica atividade de promotor.
[0041] A "seqüência líder de tradução" se refere a uma seqüência de nucleotídeos localizada entre a seqüência de promotor de um gene e a seqüência codificante. A seqüência líder de tradução está presente no mRNA completamente processado a montante da seqüência de início da tradução. A seqüência líder de tradução pode afetar numerosos parâmetros, incluindo, o processamento do transcripto primário para o mRNA, estabilidade do mRNA e/ou eficiência de tradução. Exemplos de seqüências líder de tradução têm sido descritas (Turner e Foster (1995) Mol. Biotechnol. 3: 225-236).
[0042] As "seqüências 3' não-codificantes" se referem às seqüências de nucleotídeos localizadas a jusante de uma seqüência codificante e incluem seqüências de reconhecimento de poliadenilação e outras seqüências codificantes de sinais de regulação capazes de afetar o processamento do mRNA ou expressão do gene. O sinal de poliadenilação é usualmente caracterizado por afetar a adição de caracteres de ácido poliadenílico à extremidade 3' do precursor do mRNA. O uso de diferentes seqüências 3' não-codificantes é exemplificada por Ingelbrecht et al. (1989) Plant Cell1: 671-680.
[0043] Uma "proteína" ou "polipeptídeo" é uma cadeia de aminoácidos arranjada em uma ordem específica determinada pela seqüência codificante em um polinucleotídeo codificante de um polipeptídeo.
[0044] Um constructo de DNA é uma montagem de moléculas de DNA ligadas de modo a prover um ou mais cassetes de expressão. O constructo de DNA pode ser um plasmídeo que está capacitado a se auto replicar em uma célula bacteriana e contém vários sítios de restrição da enzima endonuclease que são úteis para introduzir moléculas de DNA que fornecem elementos genéticos funcionais, ou seja, promotores, introns, lideres, seqüências codificantes, regiões de terminação 3', entre outros; ou um constructo de DNA pode ser uma montagem linear de moléculas de DNA, tal como um cassete de expressão. O cassete de expressão contido dentro de um constructo de DNA compreende os elementos genéticos necessários para prover a transcrição de um RNA mensageiro. O cassete de expressão pode ser desenhado para expressar em células procarióticas ou células eucarióticas. Os cassetes de expressão da presente invenção são desenhados para expressar preferencialmente em células de planta.
[0045] As moléculas de DNA da invenção são providas em cassetes para expressão em um organismo de interesse. O cassette incluirá seqüências de regulação 5' e 3' operacionalmente ligadas a uma seqüência codificante da invenção. "Operacionalmente ligado" significa que as seqüências de ácido nucléico que estão ligadas são contíguas e, quando necessário para juntar duas regiões codificantes de proteina, contíguas e no mesmo quadro aberto de leitura. O termo operacionalmente ligado tem a intenção de indicar uma ligação funcional entre um promotor e uma segunda seqüência, sendo que a seqüência do promotor inicia e media a transcrição da seqüência de DNA correspondente à segunda seqüência. O cassette pode adicionalmente conter pelo menos um gene adicional para ser co-transformado dentro no organismo. Alternativamente, o(s) gene(s) adicional(ais) pode(m) estar provido(s) em múltiplos cassetes de expressão ou múltiplos constructos de DNA.
[0046] O cassete de expressão incluirá, na direção 5' para 3' de transcrição: uma região de iniciação de transcrição e tradução, região codificante, e uma região de terminação de transcrição e tradução funcional no organismo que é o organismo que serve de hospedeiro. A região de iniciação de transcrição (ou seja, o promotor) pode ser nativa ou análoga, ou estrangeira ou heteróloga em relação ao organismo hospedeiro. Adicionalmente, o promotor pode ser a seqüência natural ou alternativamente uma seqüência sintética. Os cassetes de expressão podem adicionalmente conter seqüências lider 5' no constructo do cassete de expressão. Tais seqüências lider podem atuar para melhorar a tradução.
[0047] Deve ser entendido que, como aqui usado, o termo "transgênico" inclui quaisquer células, linhagem de célula, calo, tecido, parte de planta, ou planta, cujo genótipo tenha sido alterado pela presença de um ácido nucléico heterólogo, incluindo aqueles transgênicos assim inicialmente alterados, bem como aqueles criados por cruzamentos sexuais ou de propagação assexual a partir do transgênico inicial. O termo "transgênico", como aqui usado, não engloba a alteração do genoma (cromossômica ou extra-cromossômica) por métodos convencionais de melhoramento de plantas ou por eventos de ocorrência natural tais como a fertilização-cruzada aleatória, a infecção virai não-recombinante, a transformação bacteriana não-recombinante, a transposição não-recombinante, ou a mutação espontânea.
[0048] Um "evento" transgênico é produzido por transformação de células de planta com constructo(s) heterólogo(s), incluindo um cassete de expressão de ácido nucléico que compreende um transgene de interesse, a regeneração de uma população de plantas resultantes da inserção do transgene no genoma da planta, e seleção de uma planta particular caracterizada pela inserção em uma localização particular do genoma. Um evento é caracterizado fenotipicamente pela expressão do transgene. A nivel genético, um evento é parte da constituição genética de uma planta. 0 termo "evento" também se refere à progénie produzida por uma alogamia sexual entre o transformante e uma outra variedade que inclui o DNA heterólogo. Mesmo depois de repetidos retrocruzamentos com um parental recorrente, o DNA inserido e o DNA flanqueador do parental transformado está presente na progénie de cruzamento na mesma localização cromossômica. 0 termo "evento" também se refere ao DNA do transformante original compreendendo o DNA inserido e a seqüência flanqueadora imediatamente adjacente ao DNA inserido, cuja transferência para uma progénie que recebe DNA inserido seria esperada, incluindo o transgene de interesse como o resultado de um cruzamento sexual de uma linhagem parental que inclui o DNA inserido (por exemplo, o transformante original e a progénie resultante de autofecundação) e uma linhagem parental que não contém o DNA inserido.
[0049] Uma planta de milho TC1507 resistente insetos pode ser melhorada por um primeiro cruzamento sexual de uma primeira planta parental de milho consistindo de uma planta de milho crescida a partir da planta transgênica de milho TC1507 e a progénie da mesma derivada da transformação com os cassetes de expressão da presente invenção que conferem resistência a insetos, e uma segunda planta parental de milho com ausência de resistência a insetos, produzindo, por esse meio, uma pluralidade de plantas de primeira progénie; e depois selecionar a planta da primeira progénie que é resistente a insetos; e autofecundar a planta da primeira progénie, produzindo, por esse meio, uma pluralidade de plantas da segunda progénie; e depois selecionar das plantas da segunda progénie uma planta resistente a insetos. Estas etapas podem ainda incluir o retrocruzamento da planta da primeira progénie resistente a insetos ou da planta da segunda progénie resistente a insetos com a planta de milho segunda parental ou uma planta de milho terceira parental, produzindo, por esse meio, uma planta de milho que é resistente a insetos.
[0050] Como aqui usado, o termo "planta" inclui a referência a plantas completas, órgãos de planta (por exemplo, folhas, caules, raizes etc), sementes, células de planta, e progénie da mesma. Deve ser entendido que é também um aspecto da presente invenção, as partes de plantas transgênicas que estão dentro do escopo da invenção e compreendem, por exemplo, células de planta, protoplastos, tecidos, calo, embrião, bem como flores, caules, frutas, folhas e raizes oriundas de plantas transgênicas ou sua progénie previamente transformada com uma molécula de DNA da invenção e, portanto, consistindo de pelo menos em parte das células transgênicas.
[0051] Como aqui usado, o termo "célula de planta" inclui, sem limitação, sementes, culturas em suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calo, folhas, raizes, brotações, gametófitos, esporófitos, pólen e micro-esporos. A classe de plantas que pode ser usada nos métodos da invenção é, em geral, tão ampla quanto a classe de plantas superiores que estão sujeitas a técnicas de transformação, incluindo ambas plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas.
[0052] "Transformação" se refere à transferência de um fragmento de ácido nucléico para o genoma de um organismo hospedeiro, resultando em herança geneticamente estável. Os organismos hospedeiros contendo os fragmentos de ácido nucléico transformados são referidos como organismos "transgênicos". Exemplos de transformação de planta incluem a transformação Agrobacterium-mediada (De Blaere et al. (1987) Meth. Enzymol. 143: 277) e a tecnologia de transformação de particula-acelerada ou "arma de gene" (Klein et al. (1 987) Nature (London) 327: 70-73; patente US 4.945.050, aqui incorporados a titulo de referência). Métodos adicionais de transformação são discutidos a seguir.
[0053] Assim, os polinucleotideos isolados da presente invenção podem ser incorporados em constructos recombinantes, tipicamente constructos de DNA, que são capazes de serem introduzidos e replicados em uma célula hospedeira. Um tal constructo pode ser um vetor que inclui um sistema de replicação e seqüências que são capazes de transcrição e tradução de uma seqüência polipeptideo-codificante em uma dada célula hospedeira. Inúmeros vetores apropriados para a transfecção estável de células de planta ou para o estabelecimento de plantas transgênicas têm sido descritos em, por exemplo, Pouwels et al. , (1985); Supp. 1987) Cloning Vectors: A Laboratory Manual; Weissbach e Weissbach (1989) Methods for Plant Molecular Biology, (Academic Press, New York); e Flevin et al., (1990) Plant Molecular Bology Manual, (Kluwer Academic Publishers). Tipicamente, os vetores de expressão em planta incluem, por exemplo, um ou mais genes de planta clonados sob o controle de transcrição de seqüências de regulação 5' e 3' e um marcador dominante de seleção. Tais vetores de expressão em planta podem também conter uma região de regulação de promotor (por exemplo, uma região de regulação que controla a expressão induzivel ou constitutiva, ambientalmente-regulada ou regulada pelo desenvolvimento, ou célula- ou tecido-especifica) , um sitio de começo da iniciação de transcrição, um sitio de ligação a ribossomo, um sinal de processamento de RNA, um sitio de terminação de transcrição, e/ou um sinal de poliadenilação.
[0054] Deve também ser entendido que duas diferentes plantas transgênicas podem igualmente ser acasaladas para produzir filhotes que contêm dois genes exógenos, adicionados, independentemente segregantes. A autofecundação da progénie apropriada pode produzir plantas que são homozigotas com relação a ambos genes exógenos adicionados. O retrocruzamento com uma planta parental e a alogamia com uma planta não- transgênica estão também contemplados, como é o caso da propagação vegetativa. As descrições de outros métodos de melhoramento que são comumente usados para diferentes caracteres e culturas podem ser encontradas em uma das diversas referências, por exemplo, Fehr, em Breeding Methods for Cultivar Development,Wilcos J. ed., American Society of Agronomy, Madison Wis. (1987).
[0055] Uma "sonda" é um ácido nucléico isolado ao qual está presa uma marcação detectável convencional ou uma molécula repórter, por exemplo, um isótopo radioativo, um ligante, um agente quimio-luminescente, ou enzima. Uma tal sonda é complementar a uma fita de um ácido nucléico alvo, no caso da presente invenção a uma fita de DNA isolado do evento TC1507 de milho, quando for a partir de uma planta de milho ou de uma amostra que inclui o DNA do evento. As sondas de acordo com a presente invenção incluem não somente os ácidos desoxirribonucléico ou ribonucléico, mas também poliamidas e outros materiais de sonda que se ligam especificamente a uma seqüência alvo de DNA, e que podem ser usadas para detectar a presença daquela seqüência alvo de DNA.
[0056] "Primers"são ácidos nucléicos isolados que são anelados com uma fita complementar de DNA alvo por meio de hibridização de ácido nucléico para formar um hibrido entre o primer e a fita de DNA alvo, depois estendido com a fita de DNA alvo por meio de uma polimerase, por exemplo, uma DNA polimerase. Os pares de primer da presente invenção se referem ao seu uso para a amplificação de uma seqüência alvo de ácido nucléico, por exemplo, por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR) ou outros métodos convencionais de amplificação de ácido nucléico. "PCR" ou "reação em cadeia da polimerase" é uma técnica usada para amplificação de segmentos específicos de DNA (ver, patentes US 4.683.195 e US 4.800.159; aqui incorporadas a titulo de referência).
[0057] As sondas e primers têm suficiente comprimento de nucleotideos para se ligar à seqüência alvo de DNA especificamente nas condições de hibridização ou condições de reação determinadas pelo operador. Este comprimento pode ser de qualquer tamanho, que seja suficiente para ser utilizável no método de detecção de escolha. Em geral, são usados comprimentos de 11 nucleotideos ou mais, preferivelmente 18 nucleotideos ou mais, e mais preferivelmente 22 nucleotideos ou mais. Tais sondas e primers hibridizam especificamente com uma seqüência alvo sob condições de hibridização de alta estringência. Preferivelmente, as sondas e primers de acordo com a presente invenção possuem completa similaridade de seqüência de DNA de nucleotideos contíguos com a seqüência alvo, apesar de que sondas que diferem da seqüência alvo de DNA e que retêm a capacidade de hibridizar com as seqüências alvo de DNA podem ser desenhadas por métodos convencionais. As sondas podem ser usadas como primers, mas são geralmente desenhadas para se ligarem ao DNA ou RNA alvo e não são usadas em um processo de amplificação.
[0058] Primers específicos podem ser usados para amplificar um fragmento de integração para produzir um amplicon que pode ser usado como uma "sonda especifica" para identificar o evento TC1507 em amostras biológicas. Quando a sonda é hibridizada com os ácidos nucléicos de uma amostra biológica sob condições que permitem a ligação da sonda à amostra, esta ligação pode ser detectada e, portanto, possibilitar uma indicação da presença do evento TC1507 na amostra biológica. Tal identificação de uma sonda ligada tem sido descrita no estado da técnica. A sonda especifica é preferencialmente uma seqüência que, sob condições de otimização, hibridiza especificamente com uma região dentro da região flanqueadora 5' ou 3' do evento e preferencialmente também compreende uma parte do DNA estrangeiro contíguo à mesma. Preferencialmente a sonda especifica compreende uma seqüência de pelo menos 80%, preferencialmente entre 80 e 85%, mais preferencialmente entre 85 e 90%, especialmente de preferência entre 90 e 95%, e ainda mais de preferência entre 95 e 100% idêntica (ou complementar) à região especifica do evento.
[0059] Os métodos para preparar e usar sondas e primers são descritos, por exemplo, em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. 1989 (daqui em diante, "Sambrook et al., 1989"); Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubelet al., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992 (com atulizações periódicas) (daqui em diante, "Ausubel et al., 1992"); e Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990. Os pares de primers de PCR podem ser derivados de uma seqüência conhecida, por exemplo, usando programas de computador feitos com a intenção dessa finalidade tais como o instrumento de análise de primer de PCR em Vector NTI versão 6 (Informax Inc., Bethesda MD); PrimerSelect(DNASTAR Inc., Madison, WI); e Primer (Version 0.5, © 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, Mass.). Adicionalmente, a seqüência pode ser visualmente escaneada e os primers manualmente identificados usando guidelinesconhecidos dos especialistas na técnica.
[0060] Um "kit" como aqui usado se refere a um conjunto de reagentes para a finalidade de desempenhar o método da invenção, mais particularmente, a identificação do evento TC1507 em amostras biológicas. O kit da invenção pode ser usado, e seus componentes podem ser especificamente ajustados, para finalidades de controle de qualidade (por exemplo, pureza de lotes de semente), detecção do evento TC1507 em material de planta, ou material compreendendo ou derivado de material de planta, tal como, mas não limitado a alimentos e produtos forrageiros. "Material de planta" como aqui usado se refere ao material que é obtido ou derivado de uma planta.
[0061] Os primers e sondas baseadas nas seqüências do DNA flanqueador e do inserto aqui revelados podem ser usados para confirmar (e, se necessário, corrigir) as seqüências descritas por métodos convencionais, por exemplo, por re-clonagem e seqüenciamento de tais seqüências. As sondas e primers de ácido nucléico da presente invenção hibridizam sob condições estringentes com uma seqüência alvo de DNA. Qualquer método convencional de hibridização ou amplificação de ácido nucléico pode ser usado para identificar a presença de DNA de um evento transgênico em uma amostra. As moléculas de ácido nucléico ou fragmentos das mesmas são capazes de hibridizar especificamente com outras moléculas de ácido nucléico sob certas circunstâncias. Como aqui usadas, duas moléculas de ácido nucléico são ditas serem capazes de especificamente hibridizar uma com a outra se as duas moléculas forem capazes de formar uma estrutura de ácido nucléico de dupla-fita, anti- paralela .
[0062] Uma molécula de ácido nucléico é dita ser o "complemento" de uma outra molécula de ácido nucléico se ela apresentar completa complementaridade. Como aqui usado, é dito que as moléculas apresentam "completa complementaridade" quando cada nucleotideo de uma das moléculas é complementar a um nucleotideo da outra. É dito que duas moléculas são "minimamente complementares" se elas puderem hibridizar uma com outra com suficiente estabilidade para possibilitar que elas permaneçam aneladas uma à outra sob condições pelo menos de "baixa estringência" convencional. Semelhantemente, é dito que as moléculas são "complementares" se elas puderem hibridizar uma com a outra com suficiente estabilidade para permitir que elas permaneçam aneladas uma à outra sob condições de "alta estringência" convencional.
[0063] Condições de estringência convencional são descritas por Sambrook et al., 1989, e por Haymes et al., In: Nucleic Acid Hybnidization, a Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985), sendo, entretanto, permissivel estarem afastadas da completa complementaridade, na medida que tais afastamentos impeçam completamente a capacidade das moléculas de formar uma estrutura de dupla-fita. Para que uma molécula de ácido nucléico seja útil como um primer, ou como uma sonda, é necessário somente que ela seja suficientemente complementar em seqüência para ser capaz de formar uma estrutura de dupla-fita estável sob solvente e emprego de concentrações de sal particulares.
[0064] Em reações de hibridização, especificamente é tipica a função de lavagens pós-hibridização, os fatores críticos sendo a força iônica e a temperatura da solução de lavagem final. O ponto de fusão térmica (Tm) é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) na qual 50% de uma seqüência alvo complementar hibridiza com uma sonda perfeitamente emparelhada. Para híbridos DNA-DNA, a Tm pode ser aproximada a partir da equação de Meinkoth e Wahl (1984) Anal. Biochem. 138: 267-284: Tm = 81,5°C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (%form) - 500/L; onde M é a molaridade de cátions monovalentes, %GC é a percentagem dos nucleotideos guanosina e citosina no DNA, %form é a percentagem de formamida na solução de hibridização, e L é o comprimento do hibrido em pares de base. Tm é reduzida em cerca de 1°C para cada 1% de emparelhamento desigual; portanto, a Tm de hibridização, e/ou condições de lavagem podem ser ajustadas para hibridizar seqüências de identidade desejada. Por exemplo, se são buscadas seqüências com identidade >90%, a Tm pode ser diminuída 10°C. Geralmente, as condições estringentes são selecionadas para serem cerca de 5°C mais baixas do que a Tm, para a seqüência especifica, e seu complemento, na força iônica e pH definidos. Entretanto, condições severamente estringentes podem utilizar hibridização e/ou lavagem a 1, 2, 3, ou 4 °C mais baixas do que a Tm; condições moderadamente estringentes podem utilizar a hibridização e/ou lavagem a 6, 7, 8, 9, ou 10°C mais baixas do que a Tm; condições de baixa estringência podem usar hibridização e/ou lavagem a 11, 12, 13, 14, 15, ou 20°C mais baixas do que a Tm.
[0065] Usando a equação, a hibridização e composições de lavagem, e a Tm desejada, aqueles com conhecimento comum na técnica entenderão que variações na estringência de hibridização e/ou soluções de lavagem estão inerentemente descritas. Se o grau desejado de emparelhamento desigual resultar em uma Tm de menos que 45°C (solução aquosa) ou 32°C (solução de formamida) , é preferível aumentar a concentração de SSC de modo que uma temperatura mais alta possa ser utilizada. Um guia extenso para a hibridização de ácidos nucléicos é encontrado em Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capitulo 2 (Elsevier, New York); e Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular
[0066] Como aqui usado, uma seqüência substancialmente homóloga é uma molécula de ácido nucléico que hibridizará especificamente com o complemento da molécula de ácido nucléico à qual ela está sendo comparada sob condições de alta estringência. Condições apropriadas de estringência que promovem a hibridização de DNA, por exemplo, 6X cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45°C, seguida por uma lavagem de 2X SSC a 50°C, são conhecidas daqueles especialistas na técnica ou podem ser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Tipicamente, condições estringentes serão aquelas nas quais a concentração de sal é menor do que 1,5 M de ion Na, tipicamente concentração de cerca de 0,01 a 1,0 M de ion Na (ou outros sais) a pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é pelo menos cerca de 30°C para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotideos) e pelo menos de cerca de 60°C para sondas longas (por exemplo, maiores que 50 nucleotideos). As condições estringentes também podem ser alcançadas com a adição de um agente desestabilizante, tal como formamida. Exemplos de condições de baixa estringência incluem hibridização com uma solução tampão de formamida a 30 a 35%, NaCl 1 M, SDS a 1% (dodecil sulfato de sódio) a 37°C, e uma lavagem em IX a 2X de SSC (20X SSC = NaCl 3,0 M/citrato trissódico 0,3 M) a 50 a 55°C. Exemplos de condições de estringência moderada incluem em formamida a 40 a 45%, NaCl 1 M, SDS a 1% a 37°C, e uma lavagem em 0,5X a IX de SSC a 55 a 60°C. Exemplos de condições de alta estringência incluem hibridização em formamida a 50%, NaCl 1 M, SDS a 1% a 37°C, e uma lavagem em 0, IX de SSC a 60 a 65°C. Em uma concretização preferida, um ácido nucléico da presente invenção hibridizará especificamente com uma ou mais moléculas de ácido nucléico única para o evento TC1507 ou complementos do mesmo ou fragmentos tanto de um como de outro sob condições moderadamente estringentes.
[0067] Os métodos de alinhamento de seqüências para comparação são bem conhecidos do estado da técnica. Portanto, a determinação de identidade percentual entre quaisquer duas seqüências pode ser realizada usando um algoritmo matemático. Exemplos não limitantes de tais algoritmos matemáticos são: o algoritmo de Myers e Miller (1988) CABIOS 4:11-17; o algoritmo de homologia local de Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; o algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; o método-de-busca-por similaridade de Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448; o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264, modificado como em Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877.
[0068] As implementações em computador desses algoritmos matemáticos podem ser utilizadas para comparação de seqüências para determinar a identidade de seqüência. Tais implementações incluem, mas não estão limitadas a: CLUSTAL no programa PC/Gene (disponível a partir de Intelligenetics, Mountain View, California); o programa ALIGN (Versão 2.0); o programa ALIGN PLUS (versão 3.0, copyright 1997); e GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Versão 10 (disponível a partir de Accelrys, 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121, USA) . Alinhamentos usando esses programas podem ser realizados usando parâmetros default.
[0069] O programa CLUSTAL está bem descrito em Higgins e Sharp, Gene 73:237-244 (1988); Higgins e Sharp, CABIOS 5:151- 153 (1989); Corpet, et al., Nucleic Acids Research 16:10881-90 (1988); Huang, et al. , Computer Applications in the Biosciences8:155-65 (1992), e Pearson, et al. , Methods in Molecular Biology24:307- 331(1994) . Os programas ALIGN e ALIGN PLUS estão baseados no algoritmo de Myers e Miller (1988) acima mencionado. Os programas BLAST de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403 são baseados no algoritmo de Karlin e Altschul (1990) acima mencionado.
[0070] A família BLAST de programas que pode ser usada para buscas em bases de dados de similaridade inclui: BLASTN para seqüências de busca de nucleotídeos com referência a seqüências de bases de dados de nucleotídeos; BLASTX para seqüências de busca de nucleotídeos com referência a seqüências de bases de dados de proteína; BLASTP para seqüências de busca de proteínas com referência a seqüências de bases de dados de proteínas; TBLASTN para seqüências de busca de proteínas com referência a seqüências de bases de dados de nucleotídeos; e TBLASTX para seqüências de busca de nucleotídeos com referência a seqüências de bases de dados de nucleotídeos. Ver, Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 19, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing e Wiley- Interscience, New York (1995). O alinhamento pode ser realizado manualmente por inspeção.
[0071] Para se obter alinhamentos com intervalos, para finalidades de comparação, pode ser utilizado o Gapped BLAST (em BLAST 2.0) como descrito em Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res.25: 3389. Alternativamente, pode ser usado o PSI- BLAST (em BLAST 2.0) para realizar uma busca interativa que detecta relações distantes entre moléculas. Ver Altschul et al. (1997) acima citado. Quando se utilizam BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, podem ser usados os parâmetros de default dos respectivos programas (por exemplo, BLASTN para seqüências de nucleotideos, BLASTX para proteínas). Ver www.ncbi. him. nih.gov.
[0072] Como aqui usada, a "identidade de seqüência" ou "identidade", no contexto de duas seqüências de ácido nucléico ou polipeptideo, faz-se referência aos residues nas duas seqüências que são os mesmos quando alinhados para correspondência máxima cobrindo uma janela de comparação especificada. Quando a percentagem de identidade de seqüência é usada com referência a proteínas é reconhecido que as posições de residues que não são idênticas freqüentemente diferem por substituições conservativas de aminoácidos, onde os residues de aminoácido são substituídos por outros residues de aminoácido com propriedades químicas similares (por exemplo, carga ou hidrofobicidade) e, portanto, não mudam as propriedades funcionais da molécula. Quando as seqüências diferem em substituições conservativas, a percentagem de identidade de seqüência pode ser ajustada para cima para corrigir a natureza conservativa da substituição. As seqüências que diferem por tais substituições conservativas são ditas como tendo "similaridade de seqüência" ou "similaridade". Os meios para fazer este ajuste são bem conhecidos do estado da técnica. Tipicamente isto envolve a contagem {scoring)de uma substituição conservative como um emparelhamento desigual parcial ao invés de completo, aumentando, por esse meio, a percentagem de identidade de seqüência. Portanto, por exemplo, quando a um aminoácido idêntico é dado o escore de 1 e a uma substituição não- conservativa é dado o escore de zero, para uma substituição conservative é dado um escore entre zero e 1. A contagem de substituições conservativas é calculada, por exemplo, como implementado no programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California).
[0073] Como aqui usada, a "percentagem de identidade de seqüência"significa o valor determinado por comparação entre duas seqüências alinhadas de modo ótimo cobrindo uma janela de comparação, em que a porção da seqüência de polinucleotideo na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (ou seja, gaps)em comparação com a seqüência de referência (que não compreende adições ou deleções) para o alinhamento ótimo das duas seqüências. A percentagem é calculada pela determinação do número de posições nas quais a base de ácido nucléico ou residue de aminoácido ocorre em ambas seqüências para produzir um número de posições emparelhadas, dividindo o número de posições emparelhadas pelo número total de posições na janela de comparação, e multiplicando o resultado por 100 para produzir a percentagem de identidade de seqüência.
[0074] Com relação à amplificação de uma seqüência de ácido nucléico alvo (por eexmplo, por PCR) usando um par particular de primers de amplificação, as "condições estringentes" são condições que permitem hibridizar o par de primers somente com a seqüência alvo de ácido nucléico à qual um primer tendo a seqüência correspondente do tipo-selvagem (ou seu complemento) se pode ligar e preferencialmente para produzir um produto único de amplificação, o amplicon, em uma reação de amplificação térmica de DNA.
[0075] O termo "especifico em relação (a uma seqüência alvo)" indica que uma sonda ou primer hibridiza sob condições estringentes de hibridização somente com relação à seqüência alvo em uma amostra compreendendo a seqüência alvo.
[0076] Como aqui usado, o "DNA amplificado" ou "amplicon"se refere a um produto de amplificação de ácido nucléico de uma seqüência de ácido nucléico alvo que é parte de um template de ácido nucléico. Por exemplo, para se determinar se uma planta de milho resultante de um cruzamento sexual contém o DNA geômico do evento transgênico a partir da planta de milho da presente invenção, o DNA extraido da amostra de tecido da planta de milho pode ser submetido a um método de amplificação de ácido nucléico usando um par de primers de DNA que inclui um primeiro primer derivado da seqüência flanqueadora adjacente ao sitio de inserção do DNA heterólogo inserido, e um segundo primer derivado do DNA heterólogo inserido para produzir um amplicon que é diagnóstico para a presença do DNA do evento. Alternativamente, o segundo primer pode ser derivado da seqüência flanqueadora. O amplicon é de um comprimento e possui uma seqüência que também é diagnóstica para o evento. O amplicon pode variar em comprimento desde um comprimento combinado dos pares de primers mais um par de bases de nucleotideo para qualquer tamanho de amplicon que seja produzivel por um protocolo de amplificação de DNA. Alternativamente, os pares de primers podem ser derivados da seqüência flanqueadora de ambos os lados do DNA inserido de modo a produzir um amplicon que inclui a completa seqüência de nucleotídeos inserida do constructo de expressão PHI8999A, ver Figura 1, com tamanho de aproximadamente 6,2 Kb. Um membro de um par de primers derivado da seqüência flanqueadora pode estar localizado a uma distância da seqüência inserida de DNA, esta distância podendo variar de um par de bases de nucleotideo até os limites de reação de amplificação, ou cerca de vinte mil pares de base de nucleotideo. 0 uso do termo "amplicon"exclui especificamente dimeros de primer que podem ser formados na reação de amplificação térmica de DNA.
[0077] A amplificação de ácido nucléico pode ser realizada por qualquer um dos vários métodos de amplificação de ácido nucléico conhecidos do estado da técnica, incluindo a reação em cadeia da polimerase (PCR). Uma diversidade de métodos de amplificação é conhecida do estado da técnica e estão descritos em, entre outros, patente US 4.683.195 e US 4.683.202 e em PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, ed. Innis et al., Academic press, San Diego, 1990. Os métodos de amplificação por PCR foram desenvolvidos para amplificar até 22 Kb de DNA genômico e até 42 Kb de DNA de bacteriófago (Cheng et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:5695-5699,1994). Estes métodos, bem como outros métodos conhecidos do estado da técnica de amplificação de DNA, podem ser usados na prática da presente invenção. Deve ser entendido que inúmeros parâmetros são necessários em um protocolo especifico de PCR para se ajustar às condições de laboratório especificas e podem ser levemente modificados e ainda permitir a coleta de dados similares. Esses ajustes serão evidentes para o especialista na técnica.
[0078] O amplicon produzido por esses métodos pode ser detectado por uma pluralidade de técnicas, incluindo, mas não estando limitada a Análise de Bit Genético {Genetic Bit Analysis) (Nikiforov, et al. Nucleic Acid Res. 22:4167-4175, 1994) em que é desenhado urn oligonucleotideo de DNA que envolve ambas seqüência flanqueadora de DNA adjacente e seqüência de DNA inserido. 0 oligonucleotideo é imobilizado em poços em uma placa de micro-poços. Em seguida ao PCR da região de interesse (usando um primer na seqüência inserida e um na seqüência flanqueadora adjacente), um produto de PCR de simples-fita pode ser hibridizado a um oligonucleotideo imobilizado e serve como um template para uma reação de extensão de base simples usando uma polimerase de DNA e ddNTPs marcados específicos para a esperada base próxima. A leitura pode ser fluorescente ou baseada-em-ELISA. Um sinal indica a presença da seqüência inserto/flanqueadora devida à amplificação, hibridização e extensão de base simples bem sucedidas.
[0079] Um outro método de detecção é a técnica de Piroseqüenciamento como descrita por Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000) . Neste método, um oligonucleotideo é desenhado, o qual envolve a junção DNA adjacente e DNA de inserto. O oligonucleotideo é hibridizado a um produto de PCR de simples-fita oriundo da região de interesse (um primer na seqüência inserida e um na seqüência flanqueadora) e incubado na presença de uma polimerase de DNA, ATP, sulfurilase, luciferase, apirase, adenosina 5' fosfosulfato e luciferina. Os dNTPs são adicionados individualmente e a incorporação resulta em um sinal luminoso que é medido. Um sinal luminoso indica a presença da seqüência inserto/flanqueadora do transgene devida à amplificação, hibridização e extensão simples ou multi-base bem sucedidas.
[0080] A Polarização de Fluorescência como descrita por Chen et al. , (Genome Res.9:492-498, 1999) é um método que pode ser usado para detectar um amplicon da presente invenção. Usando-se este método, um nucleotideo é desenhado, o qual envolve a junção flanqueadora e DNA inserido. O oligonucleotideo é hibridizado com um produto de PCR de simples-fita oriundo da região de interesse (um primer no DNA inserido e um na seqüência flanqueadora de DNA) e incubado na presença de uma polimerase de DNA e um ddNTP fluorescente- marcado. A extensão de base simples resulta na incorporação do ddNTP. A incorporação pode ser medida como uma mudança na polarização usando um fluorômetro. Uma mudança na polarização indica a presença da seqüência inserto/flanqueadora do transgene devida à amplificação, hibridização e extensão de base simples bem sucedidas.
[0081] O Taqman® (PE Applied Biosystems, Foster City, Calif.) é descrito como um método de detectar e quantificar a presença de uma seqüência de DNA e é completamente entendido nas instruções fornecidas pelo fabricante. Resumidamente, é desenhada uma sonda de oligonucleotideo FRET, a qual envolve a junção flanqueadora e DNA do inserto. A sonda FRET e os primers de PCR (um primer na seqüência de DNA do inserto e uma na seqüência genômica flanqueadora) são ciclizados na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. A hibridização da sonda FRET resulta na clivagem e liberação do componente de quenchingna sonda FRET. Um sinal fluorescente indica a presença da seqüência de inserto flanqueadora/transgene devida à amplificação e hibridização bem sucedidas.
[0082] Molecular Beaconstêm sido descritos para uso em detecção de seqüência como descrito em Tyangi et al. (Nature Biotech. 14:303-308, 1996). Resumidamente, é desenhada uma sonda de oligonucleotideo FRET que envolve a junção flanqueadora e DNA de inserto. A estrutura única da sonda FRET resulta do fato de ela conter estrutura secundária que mantém os componentes de fluorescência e quenchingem estreita proximidade. A sonda FRET e os primers de PCR (um primer na seqüência de DNA do inserto e outro na seqüência flanqueadora) são ciclizados na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. Em seguida à amplificação por PCR bem sucedida, a hibridização da sonda FRET da seqüência alvo resulta na remoção da estrutura secundária da sonda e separação espacial dos componentes fluorescente e quenching.Disso resulta um sinal fluorescente. Um sinal fluorescente indica a presença da seqüência de inserto flanqueadora/transgene devida à amplificação e hibridização bem sucedidas.
[0083] Uma reação de hibridização usando uma sonda especifica para uma seqüência encontrada dentro do amplicon é ainda um outro método usado para detectar o amplicon produzido por uma reação de PCR.
[0084] A presente invenção é ainda definida nos Exemplos a seguir. Deve ser entendido que esses Exemplos, apesar de indicarem concretizações preferidas da invenção, são dados a titulo de ilustração somente. A partir da discussão anterior e desses Exemplos, o especialista na técnica pode verificar as características desta invenção, e sem se afastar do espirito e escopo da mesma, pode fazer várias mudanças e modificações da invenção para adaptá-la a várias utilizações e condições. Portanto, várias modificações da invenção, em adição àquelas mostradas e descritas aqui, serão evidentes para aqueles especialistas na técnica, a partir da descrição precedente. Tais modificações devem ser entendidas como estando dentro do escopo das reivindicações em anexo.
[0085] A descrição de cada referência apresentada aqui é incorporada a esta descrição a titulo de referência e em sua integridade.
[0086] Foi usada, para transformar tecido de embrião de milho, uma molécula desenhada de DNA de 6,2 Kb, PHI8999A (ver Figura 1 e SEQ ID No: 25), que inclui um primeiro cassete de expressão de transgene compreendendo o promotor, o exon 5' não-traduzido, e primeiro intron do gene de ubiquitina (Ubi-1) de milho (Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675- 689 e Christensen e Quail (1996) Transgenic Res. 5:213-218) operacionalmente ligado a uma molécula de DNA codificante de uma δ-endotoxina de Bacillus thuringiensis identificada como CrylF (patentes US 5.188.960 e US 6.218.188) operacionalmente ligada a uma molécula de DNA compreendendo um terminador de transcrição 3' ORF25 isolado de Agrobacterium tumefaciens (Barker et al. (1983) Plant Mol. Biol.2:335-350), e um segundo cassete de expressão de transgene compreendendo uma molécula de DNA do promotor 35S de virus do mosaico de couve- flor (CaMV) (Odell J. T. et al. (1985) Nature313: 810-812; Mitsuhara et al. (1996) Plant Cell Physiol.37:49-59) operacionalmente ligado a uma molécula de DNA codificante do marcador de seleção, gene de fosfinotricina acetiltransferase (PAT) (Wohlleben W. et al. (1988) Gene 70:25-37) operacionalmente ligado a um molécula de DNA compreendendo um terminador de transcrição 3'de (CaMV) 35S (ver Mitsuhara et al. (1996) Plant Cell Physiol.37:49-59).
[0087] Plantas de milho com CrylF de B.t. foram obtidas por bombardeamento de microprojétil usando partícula gunPDS- lOOOHe de Biobalistica® produzida por Bio-Rad, Hercules, CA; essencialmente, como descrito por Klein et al. (1987) Nature, UK 327 (6117):70-73. Embriões imaturos isolados de espigas de milho, colhidos logo após a polinização, foram cultivados, por diversos dias, em meio de iniciação de calo. No dia da transformação, partículas microscópicas de tungsténio foram recobertas com DNA de PHI8999A (SEQ ID No: 25) e aceleradas para os embriões cultivados, quando o inserto de DNA foi incorporado no cromossomo das células. Somente o inserto PHI8999A foi usado durante a transformação e nenhum DNA adicional de plasmideo foi incorporado ao transformante. Após o bombardeamento, os embriões foram transferidos para meio de iniciação de calo contendo glufosinato como agente de seleção. Os embriões individuais foram mantidos fisicamente separados durante o cultivo, e a maioria dos explantes morreu no meio de seleção.
[0088] Para aqueles embriões que sobreviveram e produziram tecido de calo saudável, resistente a glufosinato foram designados códigos de identificação única representando eventos de transformação putativa, e continuadamente transferidos para meio de seleção recém-preparado. As plantas foram regeneradas a partir do tecido derivado de cada evento único e transferidas para a casa de vegetação. Foram retiradas amostras de folhas para análise molecular para verificar a presença do transgene por PCR e para confirmar a expressão da proteína CrylF pelo ELISA. As plantas foram então submetidas a bioensaios de planta total usando insetos de broca de milho Europeu. As plantas positivas foram cruzadas com linhagens endogâmicas para se obter semente das plantas transformadas iniciais. Uma quantidade de linhagens foi avaliada em campo. O evento TC1507 foi selecionado a partir de uma população de eventos transgênicos independentes baseado em uma combinação superior de caracteristicas, incluindo resistência a inseto e performance agronômica (ver Bing JW et al. (2000) Efficacy of CrylF Transgenic Maize, 14aBiennial International Plant Resistance to Insects Workshop, fortCollins, CO, aqui incorporado a titulo de referência).
[0089] Para identificar um fragmento de DNA que incluia a seqüência 5' para o inserto PHI8999A no evento TC1507, os fragmentos da enzima de restrição Spe I do DNA genômico do evento TC1507 foram selecionados, por tamanho, em géis de agarose, purificados e submetidos a secreening por análise Southern para confirmar a hibridização a uma sonda de CrylF. A seguir à confirmação de hibridização e do tamanho do fragmento, os fragmentos de interesse foram clonados em um vetor de clonagem pBluescript II SK (+) para preparar um plasmideo enriquecido selecionado por tamanho baseado em biblioteca de DNA genômico. Uma sonda homóloga a uma porção do gene CrylF foi usada para realizar o screeningda biblioteca de plasmideo para clones positivos. Um clone positivo foi identificado, purificado por screeningadicional, e confirmado para resultar em um sinal positivo quando hibridizado com a sonda de CrylF. 0 fragmento Spe I, de aproximadamente 3 Kb, contido no clone positivo isolado foi seqüenciado usando uma abordagem primer walking.Para iniciar a primeira rodada de seqüenciamento, foi desenhado um primer que se liga a uma seqüência conhecida no DNA do vetor de clonagem para seqüenciar uma porção do DNA de interesse. Uma segunda rodada de seqüenciamento ao longo da mesma região usando um outro primer orientado na direção inversa forneceu a cobertura da segunda fita. A estratégia primer walkingfoi realizada repetidamente usando dados de seqüência a partir de rodadas anteriores para desenhar novos primers que foram depois usados para estender a próxima rodada de seqüenciamento adicional no DNA de interesse até que foi obtida a seqüência flanqueadora 5' para o DNA transgênico inserido no evento TC1507 de milho. A informação da seqüência especifica é provida no Exemplo 4.
[0090] Para confirmar a seqüência flanqueadora do inserto TC1507 na linhagem de milho CrylF de B. t., os pares de primer de PCR foram desenhados para obter os produtos de sobreposição de PCR que se estendem desde a região flanqueadora 5'até o inserto transgênico completo PHI8999A. Os produtos de PCR foram amplificados com sucesso a partir do DNA genômico da linhagem isolada de TC1507 de milho com CrylF de B. t., e seqüenciada para a Região 1 até a Região 6, mostrada na Tabela 1, e confirmado ser emparelhada à seqüência previamente determinada a partir do fragmento Spe I, descrito no Exemplo 2. No entanto, a região do pb 2358 até o pb 2829, imediatamente adjacente e 5' com relação ao inicio do inserto completo foi recalcitrante à amplificação por PCR e pareceu ser maior do que a seqüência obtida a partir do clone de Spe I descrito acima. O uso dos pares de primers flanqueadores desta região e do Advantage®-GC 2 Polymerase Mix (BD Biosciences Clontech, Paio Alto, CA) foi bem sucedido em amplificar os produtos de PCR a partir do DNA genômico da linhagem TC1507 de milho com CrylF de B. t. para seqüenciamento. As condições de amplificação usadas para produzir os amplicons com o sistema Advantage®-GC 2 são mostradas na Tabela 10. Os pares de primer de DNA usados para confirmar a seqüência na região do bp 2358 até o 2829 são aquelas listadas na SEQ ID No: 1 e SEQ ID No: 2; e SEQ ID No: 2 e SEQ ID No: 23. A seqüência desta região está descrita na Tabela 1 (Regiões 7a, 7b, 7c, e 8). Exemplo4.SeqüênciaFlanqueadora5"doEventoTC1507.Uma descrição de cada região é provida na Tabela 1 Região 1 (SEQ ID No: 28) Milho genômico (sem homologia significante) 1 ACTAGTTTCC TAGCCCGCGT CGTGCCCCTA CCCCACCGAC GTTTATGGAA 51 GGTGCCATTC CACGGTTCTT CGTGGCCGCC CCTAAGGATG TAAATGGTCG 101 GTAAAATCCG GTAAATTTCC GGTACCGTTT ACCAGATTTT TCCAGCCGTT 151 TTCGGATTTA TCGGGATATA CAGAAAACGA GACGGAAACG GAATAGGTTT 2 01 TTTTTCGAAA ACGGTACGGT AAACGGTGAG ACAAACTTAC CGTCCGTTTT 251 CGTATTTCTC GGGAAACTCT GGTATATTCC CGTATTTGTC CCGTATTTTC 3 01 CCGACCCACG GACCTGCCAA TCAACCATCA GCCAGTCAGC CCATCCCCAC 351 AGCTATGGCC CATGGGGCCA TGTTGGCCAC ATGCCCACGC AACGCAAGGC 4 01 AGTAAGGCTG GCAGCCTGGC ACGCATTGAC GCATGTGGAC ACACACAGCC 451 GCCGCCTGTT CGTGTTTCTG TGCCGTTGTG CGAGACTGTG ACTGCGAGTG 501 GCGGAGTCGG CGAACGGCGA GGCGTCTCCG GAGTCTGGAC TGCGGCTGTG 551 GACAGCGACG CTGTGACGGC GACTCGGCGA AGCCCCAAGC TACCAAGCCC 601 CCAAGTCCCC ATCCATCTCT GCTTCTCTGG TCATCTCCTT CCCCTGGTCG 651 ATCTGCAGGC GCCAGACCG Região 2 (SEQ ID No: 29) Seqüência genômica de milho não-descrita (complemento) 670 G CCGAAGCATC ACGAAACGCA CTAAGACCTC 701 GAAGGAGTCA AACCACTCCT CCGAGGCCTC GGGGGCTACA CCCGGCGGGT 751 GCGCTCGCGC GCACCCACCG GAACAAAATG TAACCGAGAA AGGTCGGTCC 801 CCTTGCAAAA AAAGTGCGAC AAAAGCCTCC AAGCGAGTAT TAACACTCAC 851 TTTGAGGCTC GGGGGCTAC Regiáo 3 (SEQ ID No: 30) Fragmento do Retrotransposon Huck-1 de milho 870 T GTCGGGGACC ATAATTAGGG GTACCCCCAA 901 GACTCCTAAT CTCAGCTGGT AACCCCCATC AGCACAAAGC TGCAAAGGCC 951 TGATGGGTGC GATTAAGTCA AGGCTCGGTC CACTCAAGGG ACACGATCTC 10 01 GCCTCGCCCG AGCCCAGCCT CGGGCAAGGG CGGCCGACCC CGAGGATTCA 1051 CGTCTCGCCC GAGGGCCCCC TCAAGCGACG GGCACACCTT CGGCTCGCCC 1101 GAGGCCCATT CTTCGCCGAG AAGCAACCTT GGCCAGATCG CCACACCGAC 1151 CGACCGTATC GCAGGAGCAT TTAATGCGAG GATCGCCTGA CACCTTATCC 12 01 TGACGCGCGC TCTTCAGTCG ACAGAGCCGA AGTGACCGCA ATCACTTCGC 12 51 CGCTCCACTG ACCGACCTGA CAAGAAGACA GCGCCGCCTG CGTCGCTCCG 1301 ACTGCTGTGC CACTCGACAG AGTGAGGCTG ACAGCAGCCA AGTCCGGCCT 1351 CGGGCGCCAT AGGAAGCTCC GCCTCGCCCG ACCCTAGGGC TCGGACTCGG 1401 CCTCGGCTCC GGAAGACGAC GAACTACGCT TCGCCCGACC CCAGGGCTTG 14 51 GACTCAGCCT CGGCTCCGGA AGACGACGAA TTCCGCCTCG CCCGACCCCA 15 01 GGGCTCGGAC TCGGCCTCGG CTCCAGAAGA CGACGAACTC CGCCTCGCCC 15 51 GACCCCAGGG CTCGGACTCA GCCTCGGCTC CGGAAGACGA CGAACTCCGC 16 01 CTCGCCCGAC CCCAGGGCTC GGACTCAGCC TCGGCCTCAG ACGATGGTCT 1651 CCGCCTCGCC CGACCCGGGG CTCGGACTCG A Região 4 (SEQ ID No: 31) Fragmento do gene cry1 F 16 82 CCTTTCTAT CGGACCTTGT 17 01 CAGATCCTGT CTTCGTCCGA GGAGGCTTTG GCAATCCTCA CTATGTACTC 17 51 GGTCTTAGGG GAGTGGCCTT TCAACAAACT GGTACGAATC ACACCCGCAC 18 01 ATTCAGGAAC TCCGGGACCA TTGACTCTCT AGATGAGATA CCACCTCAAG 1851 ACAACAGCGG CGCACCTTGG AATGACTACT CCCATGTGCT GAATCATGTT 1901 ACCTTTGTGC GCTGGCCAGG TGAGATCTCA GGTTCCGACT CATGGAGAGC 1951 ACCAATGTTC TCTTGGACGC ATCGTAGCGC TACCCCCACA AACACCATTG 2001 ATCCAGAGAG AATCAC Região 5 (SEQ ID No: 32) Fragmento do gene rpoC2 de cloroplasto de milho 2017 TCAT TCTTCAAGAA CTGCATATCT TGCCGAGATC 20 51 CTCATCCCTA AAGGTACTTG ACAATAGTAT TATTGGAGTC GATACACAAC 2101 TCACAAAAAA TACAAGAAGT CGACTAGGTG GATTGGTCCG AGTGAAGAGA 2151 AAAAAAAGCC ATACAGAACT CAAAATCTTT TCCGGAGATA TTCATTTTCC 22 01 TGAAGAGGCG GATAAGATAT TAGGTGGCAG TTTGATACCA CCAGAAAGAG 22 51 AAAAAAAAGA TTCTAAGGAA TCAAAAAAAA GGAAAAATTG GGTTTATGTT 2 3 01 CAACGGAAAA AATTTCTCAA AAGCAAGGAA AAGTATT Região 6 (SEQ ID No: 33) Fragmento de cloroplasto de milho ou promotorub/ZM1 (2) 23 38 GTG GCTATTTATC 2351 TATC Nucleotideos 2355-2358 (CGT) que conectam a Região 6 a Região 7a Região 7a (SEQ ID No: 34} Fragmento do gene pat 2358 GCA GCTGATATGG CCGCGGTTTG TGATATCGTT AACCATTACA 24 01 TTGAGACGTC TACAGTGAAC TTTAGGACAG AGCCACAAAC ACCACAAGAG 24 51 TGGATTGATG ATCTAGAGAG GTTGCAAGAT AGATACCCTT GGTTGGTTGC 2501 TGAGGTTGAG GGTGTTGTGG CTGGTATTGC TTACGCTGGG CCCTGGAAGG 2551 CTAGGAAC Região 7b (SEQ ID No: 35) Fragmento do gene pat (complemento) 25 59 CC TCAACCTCAG CAACCAACCA ATGGTATCTA TCTTGCAACC 26 01 TCTCTAGATC ATCAATCCAC TCTTGTGGTG TTTGTGGCTC TGTCCTAAAG 26 51 TTCACTGTAG ACGTCTCAAT GTAATGGTTA ACGATATCAC AAACCG Região 7c (SEQ ID No: 36) Fragmento do gene crj/1 F (complemento) 2697 AGAG 2701 AAGAGGGATC T Região 8 (SEQ ID No: 37) Fragmento do Polylinker 2712 CGAAGCTTC GGCCGGGGCC CATCGATATC CGCGGGCATG 27 51 CCTGCAGTGC AGCGTGACCC GGTCGTGCCC CTCTCTAGAG ATAATGAGCA 28 01 TTGCATGTCT AAGTTATAAA AAATTACCA Região 9 (SEQ ID No: 25) Inserto completo de PHI8999A
[0091] De modo a descrever completamente a seqüência flanqueadora 5' do evento TC1507, foi feita a busca de homologia com referência às bases de dados públicas do GenBank {release122, 2/01) usando o Basic Local Alignment Search Tool (BLAST). O programa BLAST realiza a busca de similaridade de seqüência e é particularmente utilizável na identificação de homólogos de uma seqüência desconhecida. Em adição à busca em bases de dados públicas, foram realizados os alinhamentos aos pares usando o AlignX (InforMax Inc., Bethesda, MD) para procurar a homologia entre a seqüência flanqueadora do evento TC1507 de milho e o inserto transgênico PHI8999A. Os resultados dessas buscas de homologia são apresentados na Tabela 1. A seqüência flanqueadora 5'do TC1507 é numerada com a base 1 sendo a 5' mais posterior do inserto e a base 2830 no ponto de inicio do inserto transgênico completo PHI8999A (ver Figura 1) . Os valores percentuais de identidade indicam a percentagem de emparelhamentos idênticos ao longo do comprimento das seqüências analisadas.
[0092] Na maioria dos casos, a busca de similaridade com a seqüência 5' flanqueadora do evento TC1507 resultou em um emparelhamento com uma única seqüência com base em um valor de identidade percentual muito alto. Essas seqüências estão identificadas na Tabela 1. Adicionalmente, há duas regiões na seqüência flanqueadora de DNA 5'do TC1507 com alta similaridade com relação a mais do que uma seqüência conhecida. Nas regiões 870-1681 e 2338-2354, os escores de identidade percentual com ambos fragmentos de seqüência são suficientemente altos de modo que um emparelhamento simples (homólogo) não pode ser determinado. Os dois homólogos possíveis para cada uma dessas regiões estão indicados na Tabela 1.
[0093] As seqüências altamente similares foram identificadas para quase todos os 669 pares de base da seqüência. Geralmente, os resultados de busca de similaridade indicam alta homologia com as seqüências genômicas 5'de milho para a base 1681. A região a partir da base 1682 até o inicio do inserto PHI8999A na posição 2830 contém alguns fragmentos associados com o evento de transformação. TABELA 1
N/A; não aplicável -'LTR; repetição terminal longa [long terminai repeat')
[0094] Foi usada análise por PCR para determinar se as Regiões 1, 2 e 3 (Tabela 1) na região flanqueadora 5" do Evento TC1507 estão presentes em uma linhagem de milho controle não-modifiçada usada na transformação para produzir o evento TC1507 de milho e, portanto, representa um limítrofe com o DNA genômico de milho. Nove diferentes análises de PCR foram realizadas no DNA genômico preparado a partir do TC1507 e a linhagem de milho controle não-modificada Hi-II (ver Armstrong (1994) The Maize Handbook, ed. Freeling e Walbot, Springer-Verlag, New York, pp. 663-671, para informação em Hill) como esquematizado na Tabela 2 usando as seqüências de primer mostradas na Tabela 3.
[0095] Duas reações foram desenhadas para amplificar o DNA dentro da Região 1 da região flanqueadora desde o pb 25 até o 324 (Reação A - amplicon de 300 pb); e desde o pb 25 até o 480 (Reação B - amplicon de 456 pb). Os amplicons esperados estavam presentes em ambas linhagens Hi-II de milho não- modif içado e no evento TC1507 de milho. Um par de primers de PCR, Reação C, se estendeu da Região 2 até a Região 3 da região flanqueadora 5' do pb 759 até o 1182 (amplicon de 424 pb) e novamente produziu produtos de PCR do tamanho esperado em ambos Hi-II e TC1507. A Reação D, se estendeu da Região 1 até a Região 3 da região flanqueadora 5' a partir do pb 415 até o 1182 (amplicon de 7 68 pb) e novamente produziu produtos de PCR do tamanho esperado em ambos Hi-II e TC1507. As Reações E e F foram desenhadas como pares de primers específicos para a região do gene pat do inserto completo de PHI8999A no TC 1507 e, portanto, um amplicon na linhagem de milho não- modif içado Hi-II não é esperado. Os resultados indicam que as Reações E e F são especificas para uma linhagem de milho transformada com uma região do gene pat e produzem o amplicon esperado, enquanto que o amplicon foi produzido na linhagem de milho não-modifiçado Hi-II. A Reação G foi também desenhada como um par de primers que pode produzir um amplicon de 366 pb no evento TC1507 de milho e nenhum amplicon na linhagem de milho não-modifiçado Hi-II.
[0096] As Reações Hei foram desenhadas como pares de primers específicos para o TC1507 que pode se estender da extremidade do inserto transgênico na região flanqueadora 5'. Em ambas Reações H e I, o primer reverso ficou localizado na região do promotor de ubiquitina do inserto PHI8999A (Região 9 na Tabela 1) e o primer forwardficou localizado na Região 5, o fragmento de gene rpoC2 (ver Tabela 1) . A Reação H e a Reação I ambas produziram um amplicon na linhagem de milho TC1507 e não produziram um amplicon na linhagem de milho controle não-modifiçado. Estes resultados indicam que ambas as Reações Hei são específicas para o evento TC1507.
[0097] Os resultados de PCR mostram que a seqüência não- descrita (Região 1) está presente na linhagem de milho não- modificado Hi-II e que as Regiões 1, 2 e 3 são contíguas na linhagem de milho não-modifiçado Hi-II. As seqüências de DNA amplificadas nas Reações A, B, C, e D não são únicas para a região flanqueadora 5'do evento de milho TC1507, mas também estão presentes na linhagem de milho não-modifiçado Hi-II. TABELA 2
TABELA 3
[0098] Duas abordagens separadas de PCR foram usadas para estender o comprimento da informação de seqüência 3'para o inserto completo PHI8999A no evento de milho TC1507. Na primeira abordagem, os pares de primers de PCR foram desenhados para amplificar um produto que estende a junção entre o inserto completo e o terminador ORF25 invertido, ver Figura 1 de uma apresentação do terminador ORF25 invertido. Um primer forwardficou localizado na extremidade do inserto completo PHI8999A e uma série de primers reversos ficou localizada a intervalos de 100 pb na seqüência invertida. Desta maneira, o comprimento do fragmento invertido presente no evento de milho TC1507 pode ser determinado dentro de uma região de 100 pb com base nas reações de PCR bem sucedidas. Este método indicou o fragmento invertido contido na maior parte do terminador ORF25, mas não na seqüência CrylF. Os fragmentos de PCR foram isolados e seqüenciados a partir desta região.
[0099] Na segunda abordagem, os primers de PCR foram desenhados para caminhar na direção da seqüência flanqueadora de DNA a partir da região do terminador ORF25 invertido como determinado no experimento de PCR descrito acima. O DNA genômico isolado a partir de duas ou três plantas individuais do evento TC1507 e uma linhagem de milho controle não- modificado foi digerido com várias enzimas de restrição e depois ligadas a adaptadores específicos para a enzima de restrição usada na digestão {Universal Genome Walker Kit™, Clontech Laboratories, Inc. e Devon et al. (1995) Nucleic Acids Res.23:1644-1645). O PCR primário foi realizado usando um primer especifico do terminador ORF25 e um primer homólogo à seqüência do adaptador ligado ao DNA digerido. De modo a aumentar a especificidade da reação, foi novamente realizado um PCR nestedsecundário com um outro primer especifico do terminador ORF25 e um primer secundário homólogo à seqüência do adaptador, tendo primers secundários internos aos respectivos primers usados no PCR primário. Os produtos obtidos pelo PCR nestedforam analisados por eletroforese em gel de agarose e os fragmentos únicos para as amostras de DNA de TC1507 foram isolados e seqüenciados. Os fragmentos foram amplificados a partir de ambos terminador ORF25 contido dentro do inserto completo e o terminador direcionado ORF25 (invertido) na extremidade 3' do inserto completo PHI8999A. Os fragmentos oriundos do inserto completo tiveram o tamanho predito com base no conhecimento dos sitios de enzima de restrição localizados no inserto completo. Os fragmentos produzidos a partir do terminador ORF25 invertido 3' apareceram como fragmentos de tamanho não-esperado. A análise de seqüência dos fragmentos amplificados a partir do terminador ORF25 invertido 3" resultou em seqüência flanqueadora de DNA de 1043 pb. A seqüência resultante da série de experimentos de genome walkingacima descritos foi usada para desenhar os primers adicionais para a posterior construção (walk out)a partir do inserto para a fronteira do genoma de milho com uma seqüência flanqueadora final 3', de 2346 pb.
[0100] De modo a descrever a seqüência flanqueadora 3" do TC1507, foi feita uma busca de homologia nas bases de dados públicas do GenBank usando o Basic Local Alignment Search Tool (BLAST). O programa BLAST realiza a busca de similaridade de seqüências e é particularmente útil na identificação de homólogos de seqüência desconhecida. Em adição à busca em bases de dados públicas, foram realizados alinhamentos usando o SeqMan 4.05™, algoritmos de alinhamento de Martinez e Needleman-Wunsch (DNASTAR Inc.) para procurar homologia entre a seqüência flanqueadora 3"do TC1507 e o inserto transgênico PHI8999A. Os resultados dessas buscas de homologia estão apresentados na Tabela 1. Os valores de identidade percentual indicam a percentagem de emparelhamentos idênticos ao longo do comprimento das seqüências analisadas. Os resultados de busca de similaridade da seqüência flanqueadora 3' indicam alta homologia entre as três regiões do DNA de cloroplasto de milho, um fragmento de 188 pb do gene pat, e 254 pb do DNA (Região 15, Tabela 1) sem homologia significante. Um adicional de 749 pb (Região 16) além da Região 15 (ver Tabela 1) foi também seqüenciado. Nenhum resultado de busca de similaridade está disponível na Região 16.
[0101] A análise de PCR do controle e DNA genômico do TC1507 determinou que a seqüência de 254 pb (Região 15, fragmento do "ORF241" do cloroplasto de milho) está presente no genoma de milho. A seqüência de DNA da Região 15 na região flanqueadora 3' não é única para a região flanqueadora 3' do evento TC1507 de milho, mas também está presente na linhagem de milho controle não-modifiçado. A seqüência flanqueadora 3'do TC1507 é apresentada no Exemplo 8 e diagrama da Figura 1. Exemplo 8. Seqüência da Região 3' para a Extremidade do DNA do Inserto Completo no Evento TC1507 de Milho. Uma descrição de cada região está na Tabela 1 Região 10 (SEQ ID No: 38) Fragmento do Terminador ORF25 (complemento) 9016 CTCAC TCCGCTTGAT CTTGGCAAAG ATATTTGACG 9051 CATTTATTAG TATGTGTTAA TTTTCATTTG CAGTGCAGTA TTTTCTATTC 9101 GATCTTTATG TAATTCGTTA CAATTAATAA ATATTCAAAT CAGATTATTG 9151 ACTGTCATTT GTATCAAATC GTGTTTAATG GATATTTTTA TTATAATATT 9201 GATGATATCT CAATCAAAAC GTAGATAATA ATAATATTTA TTTAATATTT 9251 TTGCGTCGCA CAGTGAAAAT CTATATGAGA TTACAAAATA CCGACAACAT 9 301 TATTTAAGAA ACATAGACAT TAACCCTGAG ACTG'ETGGAC ATCAACGGGT 9351 AGATTCCTTC ATGCATAGCA CCTCATTCTT GGGGACAAAA GCACGGTTTG 9401 GCCGTTCCAT TGCTGCACGA ACGAGCTTTG CTATATCCTC GGGTTGGATC 9451 ATCTCATCAG GTCCAATCAA ATTTGTCCAA GAACTCATGT TAGTCGCAAC 9501 GAAACCGGGG CATATGTCGG GTATCTCGAG CTCGCGAAAG CTTGGCTGCA 9551 GGTCGACGGA TCCTT Região 11 (SEQ ID No: 39) Fragmento do gene do rRNA de rps12 de cloroplasto de milho (complemento) 9566 CAACA AAAGGGTACC TGTACCCGAA ACCGACACAG 9601 GTGGGTAGGT AGAGAATACC TAGGGGCGCG AGACAACTCT CTCTAAGGAA 9651 CTCGGCAAAA TAGCCCCGTA ACTTCGGGAG AAGGGGTGCC CCC Nucleotideos 9694-9695 (CG) conectam a Região 11 ã Região 12 Região 12 (SEQ ID No: 40) Fragmento do genoma de cloroplasto de milho 9696 CTAAC 9701 AATAAACGAA TACGGTTTAT GTATGGATTC CGGTAAAATA CCGGTACTCG 9751 ATTTCATAAG AGTCGAATAG GAAGTTAAGA TGAGGGTGGT ATCATCATAA 9801 AAATGGAGTA GTATCCTAAA TTATACTAAT CCACGTATGA TATGTATGCC 9851 TTTCCTTATC AACCGGAAGT AGTGCAAAAA AAATTCTATA CTGCACTGCT 9901 CTCTTTTTAC TGAGAAATGC AAAAAAATAA AAGTGAAGTA AGGGTGCCCC (continuação) 9951 ATAGATATTT GATCTTGCCT CCTGTCCCCC CCCCCCTTTT TTCATCAAAA 10001 ATTTCCATGA AAAAAGAAAA GATGAATTTG TCCATTCATT GAACCCTAGT 10051 TCGGGACTGA CGGGGCTCGA ACCCGCAGCT TCCGCCT Região 13 (SEQ ID No: 41) Fragmento do gene pat (complemento) 10 08 8 GTT CCTAGCCTTC 10101 CAGGGCCCAG CGTAAGCAAT 10151 CAACCAAGGG TATCTATCTT 1020’. GTGGTGTTTG TGGCTCTGTC 10251 TGGTTAACGA TATCACAAAC Nucleotideos 10276-10277 (AA) conectam a Região 13 á Região 14 Região 14 (SEQ ID No: 42) Fragmento do ORF241 do cloroplasto de milho (complemento) 10278 CAC AAGAACGAAA GCACCTTTTC 10301 ATTCTTTCAT ATACTAGGGG TTTTTACTTG GAAAAGACAA TGTTCCATAC 10351 TAAAGGAT Região 15 (SEQ ID No: 43) Milho genômico (sem homologia significante) 10359 AG CTGCAGAAGC CGCCACCGTC TTGAGGACCT TCCGGGGAGC 10401 CAGACCGGTC GAACCGTGCC TCCACTTGCT AAGGAGAAAG GGAAAATCAG 10451 GGCCAGGACA TACGAAGGAG GAGCCAGAAC GAAGATATCC TAAGATACTT 10501 ACTCGCTCCG GGCCATGATC AATCATGCCT GTGGGGAGGT CTCTCGCACC 10551 TCGATCCATG AAGGTACCAC CGAGGTCTGC CCCGCCGCCG GCTTCGGTAC 10601 CGTCCTCGCC TT Região 16 (SEQ ID No: 44) Milho genômico 10613 GGGCGCCC GAGGCACCCG GGGGATGGAC TGCCCAGGCG 10651 CAGCCACGAC GACCCAAGGA TCACCCTCCT GCGCAGTCGG CACGAGCAAT 10701 AGTTCTCGGG GAACAGGCAG CTTGGCCTGA CTCCCCGGGG TCACCTCAAC 10751 TACCTCGGCC GAGGGGTCAA GTACCCCCTC AGTCCGCCCC CGCTCTTCGG (continuação) 10801 ACCGGGACCC CGACGTCCCG GCCCCGGATA CCGACGGCAC CAGCCCGCTC 10851 GGGGGCTGGC TTGACGACCC CTGGCCCAGC CTCAGATCTG GGCTGAGGCC 10901 GAGGCAGGCG GCCATGTCGT CGTCTTCATC ATCGTCTTCA TCATCGTCGT 10951 CGTCATCAGG CGTCTCCGGC GACGGCTCCC TTGGGAGCCC CTCCCTCTCC 11001 TGCCGACGAC GAAGCCTTTC CAAGGCATCC CGAGCCCACG TCCGCTCGTG 11051 GGCCCGAGCC TTCTTTGCGT CCTTCTTCTC CTTCCTCTTC TCCGCGGTGA 11101 CCCTCCGCGC AGCTCGGTCC ACCGCATCCT CCGGGACTGG TGGCAGGGAA 11151 GGCTTGTGAT GCCCTACCTC CTGGAGACAG ACGAAAAGTC TCAGCTATGA 11201 GAACCGAGGG CAATCTGACG CAAGAAGGAA GAAGGAGCGG ATACTCACCA 11251 GAGACACGCA CCCGCGATCG GGACGCATTA AGGGCTGGGA AAAAGTGCCG 11301 GCCTCTAATT TCGCTACCGT GCCGTCCACC CACCTGTGGA GGTCATCGAT 11351 GGGAAGGGGA A
[0102] Foi usada análise de PCR para determinar se a região não-descrita da seqüência na extremidade da seqüência flanqueadora 3' (Região 15 na Tabela 1) está presente na linhagem de milho controle não-modifiçado na transformação para produzir o evento TC1507 de milho e, portanto, representa o limite com o DNA genômico de milho. A amplificação por PCR bem sucedida da Região 15 em ambas linhagens de milho TC1507 e a linhagem de milho controle não-modifiçado Hi-II revelou que a Região 15 estava de fato presente no DNA genômico de milho. Cinco diferentes análises por PCR foram realizadas no DNA genômico preparado a partir do TC1507 e da linhagem de milho controle não-modifiçado Hi-II como esquematizado na Tabela 7 a seguir usando as seqüências de primer mostradas na Tabela 8. Três reações foram desenhadas para amplificar o DNA dentro da Região 15 da região flanqueadora 3': Reação L - produzindo um amplicon de 175 pb, Reação M - produzindo um amplicon de 134 pb, e Reação N - produzindo um amplicon de 107 pb. Os amplicons esperados estavam presentes em ambas linhagens de milho não-modifiçado e na linhagem de milho TC1507. As Reações J e K foram desenhadas como pares de primers específicos para o TC1507 que pode estender a extremidade do inserto para a região flanqueadora 3'. Na Reação J, o primer forwardestava localizado no fragmento do gene pat na extremidade 3' do inserto PHI8999A completo (Região 13 na Tabela 1) e o primer reverso estava localizado na Região indefinida 15. Na Reação K o primer forwardestava localizado no gene de proteina hipotética do cloroplasto na extremidade 3' do inserto completo (Região 14 na Tabela 1) e o primer reverso estava localizado na Região indefinida 15. Ambas Reação J e Reação K produziram um amplicon na linhagem de milho TC1507 e não produziram um amplicon na linhagem de milho controle não- modif içado. Os resultados indicam que ambas Reações J e K são especificas para o evento TC1507.
[0103] Os resultados de PCR indicam que a seqüência não- descrita (Região 15) da seqüência flanqueadora 3'do TC1507 também está presente no DNA genômico isolado da linhagem de milho controle não-modifiçado Hi-II. As seqüências de DNA amplificadas nas Reações L, M, e N não são únicas para a região flanqueadora 3'do TC1507, mas estão presentes na linhagem de milho controle não-modifiçado. TABELA 7
TABELA 8
[0104] Foram usados pares de primers específicos do evento de DNA para produzir um diagnóstico de amplicon para o TC1507. Esses pares de primers do evento incluem, mas não estão limitados a SEQ ID No: 1 e SEQ ID No 2; SEQ ID No: 2 e SEQ ID No: 23; SEQ ID No: 3 e SEQ ID No: 5; e SEQ ID No: 4 e SEQ ID No: 5. Em adição a esses primers, qualquer par de primers derivados de SEQ ID No: 26 e SEQ ID No: 27, que quando usados em uma reação de amplificação de DNA produzem um diagnóstico de amplicon para o TC1507, é um aspecto da presente invenção. As condições de amplificação para esta análise estão ilustradas na Tabela 9, entretanto, qualquer modificação desses métodos que use primers de DNA ou complementos dos mesmos para produzir uma molécula de DNA de amplicon diagnóstico para o TC1507 está dentro do conhecimento comum do estado da técnica. As condições preferidas de amplificação para reações utilizando os primers de PCR identificados nas SEQ ID Nos: 1, 2 e 23 estão ilustradas na Tabela 10. Adicionalmente, os pares de primers controle, que incluem SEQ ID Nos: 10 e 11; SEQ ID Nos: 10 e 12; SEQ ID Nos: 13 e 14; SEQ ID Nos: 14 e 15; SEQ ID Nos: 5 e 16; SEQ ID Nos: 5 e 17; e SEQ ID Nos: 5 e 18; para amplificação de um gene de milho endógeno estão incluídos como padrões internos para as condições de reação. Também estão incluídos os pares de primers que produzirão um amplicon em eventos transgênicos contendo um gene pat(SEQ ID Nos: 6 e 7; SEQ ID Nos: 8 e 9) , e um par de primers que produzirá um amplicon em eventos transgênicos contendo um gene crylF (SEQ ID Nos: 19 e 20).
[0105] A análise dos extratos de DNA de tecido de planta para testar a presença do evento TC1507 deve incluir um extrato controle positivo de DNA de tecido (uma amostra de DNA conhecida por conter as seqüências transgênicas) . Uma amplificação bem sucedida do controle positivo demonstra que o PCR foi corrido sob condições que permitem a amplificação das seqüências alvo. Um controle de extrato de DNA negativo, ou tipo-selvagem, no qual o DNA do template provido tanto é DNA genômico preparado a partir de uma planta não-transgênica, como é uma planta transgênica não-TC1507, também deve estar incluído. Adicionalmente, um controle negativo que não contenha extrato de DNA de milho template será uma medida útil dos reagentes e condições usados no protocolo de PCR.
[0106] Moléculas adicionais de primer de DNA de comprimento suficiente podem ser selecionadas a partir de SEQ ID No: 26 e SEQ ID No: 27 por aqueles especialistas na técnica de métodos e condições de amplificação de DNA otimizada para a produção de um amplicon que pode diferir dos métodos mostrados na Tabela 9 ou Tabela 10, mas resultam em um diagnóstico de amplicon para o evento TC1507. O uso dessas seqüências de primer de DNA com modificações para os métodos mostrados na Tabela 9 e na Tabela 10 estão dentro do escopo da invenção. O amplicon em que pelo menos uma molécula de primer de DNA de tamanho suficiente, derivada da SEQ ID No: 26 e da SEQ ID No: 27 que é diagnóstico para o evento TC1507, é um aspecto da invenção. O amplicon em que pelo menos um primer de DNA de comprimento suficiente, derivado de qualquer um dos elementos genéticos do PHIS999A que é diagnóstico para o evento TC1507, é um aspecto da invenção. O ensaio para o amplicon do TC1507 pode ser realizado pelo uso de um Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700, ou Eppendorf Mastercycler Gradient thermocycler,ou por meio de métodos e aparelhos conhecidos dos especialistas na técnica. TABELA 9
TABELA 10
Parâmetros de Ciclização GeneAmp ® PCR System 9700 5 min 94: C 35 ciclos: 94° C 1 min 60° C 2 min 72° C 3 min 7 min 72° C Manter 4:C
[0107] Tendo ilustrado e descrito os princípios da presente invenção, deve ficar evidente para os especialistas na técnica que a invenção pode ser modificada nos arranjos e detalhes sem se afastar de tais princípios. Nós reivindicamos todas as modificações que estão dentro do espirito e escopo das reivindicações anexas.
[0108] Todas as publicações e documentos de patente publicados e citados nesta descrição são aqui incorporados a titulo de referência na mesma extensão como se cada publicação individual ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado a título de referência.
Claims (35)
1. Molécula de DNA isolada caracterizada por consistir na sequência de nucleotideos de SEQ ID NO:24.
2. Molécula de DNA isolada caracterizada por consistir na sequência de nucleotideos de SEQ ID NO:26.
3. Molécula de DNA isolada caracterizada por consistir na sequência de nucleotideos de SEQ ID NO:27.
4. Kit para identificação do evento TC1507 da SEQ ID NO. 24 em uma amostra biológica que detecta uma região especifica do TC1507 caracterizado pelo fato de dito kit compreender pelo menos um primeiro primer de SEQ ID NO:1 e um segundo primerde SEQ ID NO:2.
5. Kit para identificação do evento TC1507 da SEQ ID NO. 24 em uma amostra biológica que detecta uma região especifica do TC1507 caracterizado pelo fato de dito kit compreender pelo menos um primeiro primer de SEQ ID NO:2 e um segundo primerde SEQ ID NO:23.
6. Kit para identificação do evento TC1507 da SEQ ID NO. 24 em uma amostra biológica que detecta uma região especifica do TC1507 caracterizado pelo fato de dito kit compreender pelo menos um primeiro primer de SEQ ID NO:3 e um segundo primerde SEQ ID NO:5.
7. Kit para identificação do evento TC1507 da SEQ ID NO. 24 em uma amostra biológica que detecta uma região especifica do TC1507 caracterizado pelo fato de dito kit compreender pelo menos um primeiro primer de SEQ ID NO:4 e um segundo primerde SEQ ID NO:5.
8. Constructo de DNA caracterizado pelo fato de consistir na SEQ ID NO. 25.
9. Método para aumentar a resistência de uma planta a insetos caracterizado pelo fato de compreender: transformar uma planta com o constructo de DNA de SEQ ID NO:25, resultando em uma planta com caracteristicas superiores quando comparada a uma planta não transformada.
10. Método de acordo com a reivindicação 9 caracterizado pelo fato de a planta a ser transformada ser uma planta de milho.
11. Método para a identificação do evento TC1507 da SEQ ID NO. 24 em uma amostra biológica caracterizado pelo fato de compreender detectar uma região especifica do TC1507 com uma sonda ou primeiro primer de SEQ ID NO:2 e uma sonda ou segundo primer de SEQ ID NO:1 respectivamente.
12. Método para a identificação do evento TC1507 da SEQ ID NO. 24 em uma amostra biológica caracterizado pelo fato de compreender detectar uma região especifica do TC1507 com uma sonda ou primeiro primer de SEQ ID NO:2 e uma sonda ou segundo primer de SEQ ID NO:23 respectivamente.
13. Método para a identificação do evento TC1507 da SEQ ID NO. 24 em uma amostra biológica caracterizado pelo fato de compreender detectar uma região especifica do TC1507 com uma sonda ou primeiro primer de SEQ ID NO:3 e uma sonda ou segundo primer de SEQ ID NO:5 respectivamente.
14. Método para a identificação do evento TC1507 da SEQ ID NO. 24 em uma amostra biológica caracterizado pelo fato de compreender detectar uma região especifica do TC1507 com uma sonda ou primeiro primer de SEQ ID NO:4 e uma sonda ou segundo primer de SEQ ID NO:5 respectivamente.
15. Método de acordo com a reivindicação 11 caracterizado pelo fato de compreender amplificar um fragmento de 912 pares de bases por PCR.
16. Método de acordo com a reivindicação 12 caracterizado pelo fato de compreender amplificar um fragmento de 844 pares de bases por PCR.
17. Método de acordo com a reivindicação 13 caracterizado pelo fato de compreender amplificar um fragmento de 342 pares de bases por PCR.
18. Método de acordo com a reivindicação 14 caracterizado pelo fato de compreender amplificar um fragmento de 252 pares de bases por PCR.
19. Método de detecção da presença do evento TC1507 da SEQ ID NO. 24 do milho ou da progénie do mesmo em uma amostra biológica caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: (a) extrair uma amostra de DNA a partir da dita amostra biológica; (b) prover as moléculas de primer de DNA SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO: 2; (c) realizar uma reação de amplificação de DNA, produzindo assim uma molécula de DNA ampliconde pares de bases 2158 a 3069 da SEQ ID NO:24; e (d) detectar dita molécula de DNA amplicon,em que a detecção de dita molécula de DNA ampliconem dita reação de amplificação de DNA indica a presença do evento TC1507 da SEQ ID NO. 24 do milho.
20. Método de detecção da presença do evento TC1507 da SEQ ID NO. 24 do milho ou da progénie do mesmo em uma amostra biológica caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: (a) extrair uma amostra de DNA a partir da dita amostra biológica; (b) prover as moléculas de primer de DNA SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:23; (c) realizar uma reação de amplificação de DNA, produzindo assim uma molécula de DNA ampliconde pares de bases 2158 a 3001 da SEQ ID NO:24; e (d) detectar dita molécula de DNA amplicon,em que a detecção de dita molécula de DNA ampliconem dita reação de amplificação de DNA indica a presença do evento TC1507 da SEQ ID NO. 24 do milho.
21. Método de detecção da presença do evento TC1507 da SEQ ID NO. 24 do milho ou da progénie do mesmo em uma amostra biológica caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: (a) extrair uma amostra de DNA a partir da dita amostra biológica; (b) prover as moléculas de primer de DNA SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:5; (c) realizar uma reação de amplificação de DNA, produzindo assim uma molécula de DNA ampliconde pares de bases 10200 a 10541 da SEQ ID NO:24; e (d) detectar dita molécula de DNA amplicon,em que a detecção de dita molécula de DNA ampliconem dita reação de amplificação de DNA indica a presença do evento TC1507 da SEQ ID NO. 24 do milho.
22. Método de detecção da presença do evento TC1507 da SEQ ID NO. 24 do milho ou da progénie do mesmo em uma amostra biológica caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: (a) extrair uma amostra de DNA a partir da dita amostra biológica; (b) prover as moléculas de primer de DNA SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO:5; (c) realizar uma reação de amplificação de DNA, produzindo assim uma molécula de DNA ampliconde pares de bases 10290 a 10541 da SEQ ID NO:24; e (d) detectar dita molécula de DNA amplicon,em que a detecção de dita molécula de DNA ampliconem dita reação de amplificação de DNA indica a presença do evento TC1507 da SEQ ID NO. 24 do milho.
23. Molécula de DNA isolada caracterizada pelo fato de consistir do ampliconde pares de bases 2158 a 3069 da SEQ ID NO:24.
24. Molécula de DNA isolada caracterizada pelo fato de consistir do ampliconde pares de bases 2158 a 3001 da SEQ ID NO:24.
25. Molécula de DNA isolada caracterizada pelo fato de consistir do ampliconde pares de bases 10200 a 10541 da SEQ ID NO:24.
26. Molécula de DNA isolada caracterizada pelo fato de consistir do ampliconde pares de bases 10290 a 10541 da SEQ ID NO:24.
27. Sequência de junção de DNA isolado caracterizada pelo fato de que consiste de uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 e 57 e um complemento de SEQ ID NOs: 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 e 57 das mesmas.
28. Método de screeningde sementes com relação à presença do evento TC1507 da SEQ ID NO. 24 caracterizado pelo fato de compreender a detecção de um amplicongerado a partir dos pares de primersSEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 14; e SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 5, em uma amostra de um lote de sementes.
29. Método para a produção de uma planta de milho resistente a insetos, ou de partes da mesma, caracterizado pelo fato de que o método compreende transformar o genoma da planta com a molécula de DNA de SEQ ID NO:25.
30. Método para a produção de uma planta descendente da planta de milho resistente a insetos obtida de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o método compreende transformar o genoma da planta com a molécula de DNA de SEQ ID NO:25.
31. Método para a produção de uma planta de milho resistente a insetos caracterizado por compreender: (i) o melhoramento com uma planta, suas partes ou sua descendente, obtida pelo método definido na reivindicação 29 ou 30, e (ii) a seleção da progénie pela análise de pelo menos uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 e 57 e um complemento de SEQ ID NOs: 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56 e 57 das mesmas.
32. Método para a detecção da presença da inserção do evento TC1507 da SEQ ID No. 24 em tecido de milho caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: (a) gerar um amplicona partir dos pares de primers:SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO7; SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 14; e SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 5 em que o ampliconé especifico para dita inserção de evento TC1507 da SEQ ID NO. 24; (b) pôr a amostra do dito tecido de milho em contato com dito par de primers; (c) executar a amplificação do DNA e analisar para os amplicons.
33. Kit de detecção de DNA para realizar o método para detectar a presença da inserção do evento TC1507 da SEQ ID No. 24 em tecido de milho caracterizado pelo fato de que dito kit possui um par de primersselecionado do grupo que consiste de: SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 6 e SEQ ID N07; SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 14; e SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 5.
34. Método para a produção de uma planta transformada estável caracterizado pelo fato de compreender: (i) transformar uma célula de planta com o constructo de DNA da reivindicação 8 e; (ii) regenerar uma planta transformada estável a partir da célula transformada.
35. Método de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de a célula de planta a ser transformada ser de uma planta de milho.
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