BRPI0410332B1

BRPI0410332B1 - CEPA DE ESCHERICHIA COLI aroA- E COMPOSIÇÃO DE VACINA COMPREENDENDO A MESMA

Info

Publication number: BRPI0410332B1
Application number: BRPI0410332-7A
Authority: BR
Inventors: Henry H. FAN; Mahesh Kumar; Roberto Marcello La Ragione; Martin John Woodward
Original assignee: Zoetis Services Llc
Priority date: 2003-05-14
Filing date: 2004-05-12
Publication date: 2019-10-08
Also published as: JP2011234721A; FR12C0073I1; CN1822855A; CO5640040A2; NZ543559A; JP2007500745A; JP5334029B2; KR20060012612A; WO2004103402A1; US7357935B2; CY1107188T1; US20040234534A1; US7575754B2; SI1622642T1; PL1622642T3; KR101106024B1; ATE380557T1; FR12C0073I2; TW200505475A; CN100387299C

Abstract

"vacina aviária de e. coli para proteção contra colibacilose". a presente invenção refere-se a uma vacina de e. coli viva, mutante, de remoção genética, adequada para a aplicação em massa a aves domésticas, incluindo as galinhas. também é proporcionado um método seguro e eficaz para proteger as aves domésticas contra os danos da infecção e da doença de bacilose por escherichia coli, em que um imunógeno de e. coli com gene de aroa- removido, mutante, vivo, é administrado a galinhas, perus e similares, via rotas de aplicação em massa, tais como as pulverizações grosseiras e a água potável.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para CEPA DE ESCHERICHIA COLI aroA- E COMPOSIÇÃO DE VACINA COMPREENDENDO A MESMA.

CAMPO DA INVENÇÃO [001] A presente invenção refere-se às vacinas aviárias contra infecção por E. coli. Em particular, a invenção é dirigida às vacinas de E. coli de cepas mutantes, que são úteis para aves domésticas, e especialmente as galinhas. A invenção também se relaciona a um novo imunógeno de microorganismo de E. coli com gene aroA removido, o qual é útil e eficaz em uma vacina, via pulverização ou água potável, contra a colibacilose induzida por E. coli, uma doença devastadora de aves domésticas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [002] A colibacilose é uma doença sistêmica comum de importância econômica em aves domésticas e ocorre mundialmente. Esta infecção por Escherichia coli (E. coli) ocorre como uma septicemia fatal aguda ou pericardite subaguda e saculite aérea, bem como periepatite, artrite, e também celulite. Entre as infecções bacterianas, a colibacilose é muito freqüentemente a primeira causa de morbidade e mortalidade em aves domésticas. Grandes números de E. coli são mantidos no ambiente de habitação das aves domésticas através da contaminação fecal. A infecção sistêmica ocorre quando grandes números de E. coli patogênica ganham acesso à corrente sanguínea via o trato respiratório ou o intestino. A bacteremia progride para a septicemia e a morte, ou a infecção estende-se até as superfícies serosas, o pericárdio, as articulações e outros órgãos.

[003] A literatura sugere que os sorotipos O1, O2 e O 78 de E.

coli associados com a colibacilose são os sorotipos mais comuns encontrados nas galinhas e nos perus. Muitas cepas isoladas são também não tipáveis e são consideradas especialmente virulentas.

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2/27 [004] As estratégias de tratamento incluem o controle de infecções com predisposição ou os fatores ambientais, e o uso precose de antibióticos. Infelizmente, tem sido observada uma alta freqüência de resistência à tetraciclina, canamicina, neomicina, cefalotina, estreptomicina e eritromicina. Muitas cepas são também resistentes a diversos antibióticos. Tem também sido observada uma sensibilidade muito difundida à ampicilina e ao cloranfenicol.

[005] Embora haja uma vacina de E. coli viva comercial, disponível para uso contra colibacilose associada com infecção por O 78 de E. coli em perus, parece não haver nenhuma vacina de E. coli inteiramente segura e efetiva para uso em galinhas. Em particular, parece não haver qualquer vacina de E. coli com gene de aroA mutante removido, atenuada, viva, comercialmente disponível, para aves domésticas. Também parece não haver uma vacina de E. coli especialmente eficaz que seja adequada para a administração em massa via pulverização de aerossol ou água potável, por exemplo.

[006] Portanto, é um objetivo desta invenção proporcionar uma vacina de E. coli viva, segura e efetiva, adequada para uso em galinhas.

[007] É um outro objetivo desta invenção proporcionar um método para a prevenção ou a melhora de colibacilose em aves domésticas, que seja seguro e eficaz quando usado em galinhas.

[008] É uma característica desta invenção que a vacina de E. coli seja adequada para a aplicação em massa.

[009] É uma vantagem desta invenção que a vacina viva proporcione uma resposta de imunidade tanto celular boa quanto humoral boa no hospedeiro.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0010] A presente invenção proporciona o mutante de Escherichia coli com gene removido, microorganismo aroA- de E. coli, tendo as

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3/27 características de identificação da cepa que foi depositada com a American Type Culture Collection e número atribuído PTA-5094.

[0011] A presente invenção também proporciona uma composição de vacina aviária, a qual compreende uma quantidade imunogenicamente efetiva do dito microorganismo aroA- de E. coli e um veículo farmacologicamente aceitável.

[0012] A presente invenção adicionalmente proporciona um método para a prevenção ou a melhora de colibacilose em aves domésticas, o qual compreende administrar às ditas aves domésticas uma quantidade imunogenicamente efetiva do dito microorganismo aroAde E. coli.

[0013] Uma vacina para galinhas e outras aves domésticas contra colibacilose é adicionalmente proporcionada como parte da invenção, a qual compreende uma quantidade imunogenicamente efetiva de um mutante com remoção de aroA de E. coli em um veículo farmacologicamente aceitável.

[0014] As outras características da invenção tornar-se-ão mais aparentes a partir da descrição detalhada apresentada aqui abaixo. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0015] A colibacilose aviária em aves domésticas está freqüentemente associada com o sorotipo O78 de Escherichia coli (E. coli). A infecção ocorre comumente via o trato respiratório, freqüentemente seguindo a exposição a, ou infecção por, outras doenças das comunidades das aves domésticas, tais como a micoplasmose, a bronquite infecciosa, a doença de Newcastle, a enterite hemorrágica ou a bordetelose de peru. Nas galinhas, a colibacilose geralmente afeta os pintos de corte entre 3 a 10 semanas de idade e está associada com morbidade e mortalidade altas. A manifestação mais grave de colibacilose aviária é a septicemia, que é caracterizada por pericardite, periepatite e saculite aérea. A celulite é também um problema terrível. Os isolaPetição 870190048665, de 24/05/2019, pág. 5/44

4/27 dos de E. coli de aves domésticas são freqüentemente resistentes a drogas, tais como a ampicilina, o cloranfenicol, a oxitetraciclina, a neomicina, a gentamicina, os nitrofuranos, o ácido nalidíxico, a polimixina B, as sulfonamidas, ou similares. Além disso, no momento, não parece haver qualquer vacina de E. coli comercialmente disponível para galinhas.

[0016] Surpreendentemente, foi agora verificado que o mutante com remoção de aroA de E. coli, aroA- de E. coli, depositado com o American Type Culture Collection (ATCC) em 27 de março de 2003 e tendo o número da ATCC PTA-5094, é seguro e eficaz para uso contra a colibacilose aviária em galinhas. Vantajosamente, o aroA- de E. coli PTA-5094 da invenção, quando administrado às galinhas, proporciona boas respostas imunes celulares e humorais e o dito aroA- de E. coli PTA-5094 pode ser facilmente produzido e pode ser administrado via aplicação em massa, por exemplo, pulverização grosseira ou água potável.

[0017] Como usado no relatório descritivo e nas reivindicações, o termo aroA- de E. coli PTA-5094 designa o microorganismo mutante com deleção de aroA de Escherichia coli, o qual foi depositado com a ATCC em 27 de março de 2003 e foi atribuído o número da ATCC PTA-5094. Este termo também pretende incluir outras cepas de mutantes com deleção do gene de aroA de E. coli, que são preparados substancialmente no mesmo modo como descrito aqui, e que têm substancialmente as mesmas características imunogênicas destes.

[0018] A cepa mutante com gene de aroA removido de E. coli da invenção pode ser adicionalmente passada em série usando meios e técnicas disponíveis para o técnico versado. A passagem em série pode servir para atenuar mais a cepa, para torná-la mais adequada como um imunógeno da vacina. Até cerca de 10 passagens em série são contempladas aqui, com aproximadamente 3 a 5 sendo preferidas.

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5/27 [0019] O mutante com remoção de aroA de E. coli da invenção tem a vantagem distinta que os apêndices superficiais, tais como as fímbrias e os flagelos do tipo 1, que têm sido mostrados serem importantes na patogênese da colibacilose aviária, ainda são expressos. (LaRagione, R.M.; Sayus, A.R.; e Woodward, M.J., Epidemiology and Infection, 2000, 124:351-363 e LaRagione, R.M.; Cooly, W.A.; e Woodward, M.J., Journal of Medical Microbiology, 2000, 49:327-338). As vacinas de remoção genética inteiramente definidas são preferíveis como candidatas para vacinas vivas, oferecendo o potencial de segurança combinada e um alto grau de eficácia no hospedeiro. São particularmente desejáveis os mutantes de deleção que não podem reverter a um fenótipo do tipo selvagem. Na prática atual, um mutante aroAde E. coli definido, deficiente para a biossíntese de aminoácidos aromáticos, foi construído em uma cepa de E. coli patogênica para produzir o aroA- de E. coli PTA-5094 da invenção. O dito aroA- de E. coli PTA-5094 é seguro e eficaz em pintos contra uma provocação com E. coli do tipo selvagem. Desse modo, a presente invenção também proporciona um método para a prevenção ou a melhora de colibacilose aviária em aves domésticas, o qual compreende administrar às ditas aves domésticas uma quantidade imunogenicamente efetiva de aroAde E. coli PTA-5094.

[0020] As quantidades imunogenicamente efetivas podem variar de acordo com a idade e o tamanho do hospedeiro, a gravidade da infecção, a virilidade do patógeno, o modo de administração e similar. Em geral, as quantidades efetivas adequadas por unidade de dosagem podem ser cerca de 102 a 1014 unidades formadoras de colônicas (cfu), preferivelmente cerca de 5,0 x102 a 5,0 x1016 cfu, mais preferivelmente cerca de 3,0 x106 cfu a 6,0 x106 cfu, e ainda mais preferivelmente cerca de 5,0 x106 cfu a 6,0 x106 cfu. Uma ou duas unidades de dosagens podem ser contempladas pelo técnico versado. Se

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6/27 forem selecionadas duas unidades de dosagens, então é preferida a vacinação em torno do dia 1 após a eclosão e novamente em torno de uma semana a duas semanas de idade. Uma unidade de dosagem é desejavelmente cerca de 0,5 a 1 mL de vacina por ave, porém esta quantidade pode ser otimizada para distribuir uma quantidade imunogenicamente efetiva do imunógeno de microorganismo aqui acima descrito.

[0021] As aves domésticas adequadas para uso no método da invenção incluem as galinhas, os patos, os perus, os gansos, os garnisés, a codorna, o faisão, os pombos, ou similares, preferivelmente as aves domésticas comercialmente importantes, tais como as galinhas, os patos, os gansos e os perus, mais preferivelmente as galinhas e os perus, particular e preferivelmente as galinhas.

[0022] O aroA- de E. coli PTA-5094 da invenção pode ser administrado por qualquer meio convencional, preferivelmente um meio economicamente viável para a indústria de aves domésticas, tal como a administração em massa via pulverização ou água potável. É bastante inesperado que a E. coli, um patógeno natural da mucosa respiratória, possa ser aplicada via uma rota de pulverização (preferivelmente aerossol), e ainda ser segura, assim como eficaz. Normalmente seria esperado que uma vacina contra um tal patógeno fortemente letal, especialmente as bactérias, somente seria proporcionada via injeção ou alguma outra rota. A cepa de mutação aroA- da invenção é segura para a administração por pulverização. Na prática atual, o aroA- de E. coli PTA-5094 é misturado com um veículo líquido e administrado como uma pulverização ou como um aditivo da água potável. Desse modo, a presente invenção adicionalmente proporciona uma composição de vacina aviária que compreende uma quantidade imunogenicamente efetiva de aroA- de E. coli PTA-5094 e um veículo farmacologicamente aceitável.

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7/27 [0023] Os veículos farmacologicamente aceitáveis, adequados para uso na composição de vacina da invenção, podem ser quaisquer veículos líquidos convencionais, adequados para as composições farmacêuticas veterinárias, preferivelmente uma solução de sal balanceada, adequada para meios de cultura de tecidos ou células, tal como a solução salina tamponada com fosfato estéril, mais preferivelmente a água destilada. Os outros meios adequados podem incluir as emulsões. A vacina da invenção pode também ser acrescentada de adjuvantes pelo técnico versado. Quando a aplicação da vacina for via água potável, pode ser utilizado o leite seco sem gordura como um veículo. O leite seco sem gordura parece estabilizar a vacina, e talvez neutralize a ação de alguns minerais em traço que possam afetar a viabilidade.

[0024] Além do microorganismo aroA- de E. coli PTA-5094 como ingrediente ativo, é contemplado que a composição de vacina da invenção também pode conter outros componentes ativos, tais como um composto antipatogênico imunogênico aviário dirigido contra a leucose aviária, a reticuloendoteliose, a bronquite infecciosa, a doença infecciosa de uma bolsa, a doença de Newcastle, a doença de adenovírus aviário, a doença de reovírus aviário, a doença de epitelioma contagioso, a laringotraqueíte infecciosa, a influenza aviária, a coriza infecciosa, a tifóide aviária, a coccidiose, a criptosporidiose, a cólera das galinhas, ou similar.

[0025] Em uma modalidade da invenção, o microorganismo aroAde E. coli PTA-5094 da invenção pode ser incorporado em lipossomos usando tecnologia conhecida, tal como aquela descrita em Nature, 1974, 252-252-254 ou no Journal of Immunology, 1978, 120:11091113. Em uma outra modalidade da invenção, o microorganismo aroAde E. coli PTA-5094 da invenção pode ser conjugado a compostos biológicos adequados, tais como os polissacarídeos, os peptídeos, as

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8/27 proteínas, ou similares, ou uma combinação destes, usando protocolo disponível para o técnico versado.

[0026] A vacina da invenção, de acordo com as modalidades aqui descritas, é para ser considerada eficaz contra a colibacilose de todos os sorotipos de E. coli, incluindo os sorotipos O1, O2 e O78, bem como os sorotipos não tipados especialmente virulentos. A vacina aqui descrita é eficaz contra a septicemia, a pericardite, a saculite aérea, a periepatite, a artrite, e particularmente a celulite. Esta está freqüentemente associada com a colibacilose, porém pode ser um problema significativo em si mesmo.

[0027] Para um entendimento mais claro da invenção, os exemplos que seguem são descritos abaixo. Estes exemplos são meramente ilustrativos e não são interpretados para limitar o escopo ou os princípios fundamentais da invenção de modo algum. De fato, diversas modificações da invenção, além daquelas mostradas e descritas aqui, tornar-se-ão aparentes para aqueles versados na técnica a partir dos exemplos apresentados aqui abaixo e a partir da descrição precedente. Tais modificações são também pretendidas incidir no escopo das reivindicações em anexo.

EXEMPLO 1

CONSTRUÇÃO DE MUTANTE DE E. COLI COM GENE DE AROA REMOVIDO

I) Receptor [0028] O organismo parental é um isolado aviário de E. coli, isolado de um caso clínico de colibacilose aviária, submetido à Veterinary Laboratories Agency (“Agência de Laboratórios Veterinários”) (VLA), Addlestone, Surrey, UK, e sorotipado na VLA em 1995. A cepa de origem foi selecionada quanto a sua colonização, invasão, persistência e patogenicidade em pintos SPF de um dia de idade e por caracterização in vitro quanto ao seu padrão de sensibilidade a antibióticos. A ce

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9/27 pa receptora foi gerada por conjugação entre o doador transformado (E. coli K12 S17 λ pir abrigando PNG101 com aroA abrigando deleção de 100 pb) e a cepa de origem do tipo selvagem (isolado de E. coli do tipo selvagem EC34195).

II) Caracterização da Remoção [0029] O gene de aroA, que codifica a 3fosfoenolpiruvilchiquimato-5-fosfato sintetase, uma enzima da via biossintética aromática comum, está localizado adjacente e distal no promotor ao serC no operon de serC-aroa. A perda de função para o gene de aroA no receptor resulta em uma exigência por metabólitos aromáticos, incluindo a tirosina, a fenilalanina, o triptofano, o paminobenzoato (PABA) e o 2,3-diidroxibenzoato. A exigência pelo PABA, um metabólito não encontrado nos tecidos de vertebrados, resulta na atenuação do crescimento in vivo.

III) Construção do Mutante de E. coli com aroA Removido

a) Os iniciadores da PCR são projetados incorporando sítios de restrição de SrfI e BglII e códons de interrupção para amplificar dois produtos da PCR separados de aproximadamente 650 pb para as extremidades de 5' e 3' do gene de aroA a partir do isolado de O78 de E. coli de aves domésticas descrito acima.

b) Ambos os produtos da PCR são digeridos com BglII por 2 horas, a eletroforese é corrida por 1 hora a 100 volts, as bandas são excisadas e as bandas respectivas são purificadas usando o kit bandprep SephaGlas.

c) Volumes iguais de cada produto da PCR purificado são misturados e ligados em pCR2.1.

d) O plasmídio ligado abrigando aroA é transformado nas células maxicompetentes DH5a e a clonagem é confirmada por mapeamento com enzima de restrição e PCR.

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e) O gene de aroA completo com a remoção do pCR2.1 é excisado com EcorV e SpeI, então purificado e ligado no vetor suicida pré-digerido (SpeI) (SacB, pKNHG101), transformado em E. coli K12 S17 λ pir e a clonagem é confirmada por mapeamento com enzima de restrição e PCR.

f) É efetuada uma conjugação entre o doador (E. coli S17 λ pir abrigando pKNG101 com aroA abrigando remoção de 100 pb) e o isolado de E. coli do tipo selvagem.

g) As colônias que surgem após 48 horas de incubação, a 37°C, são subcultivadas sobre meio mínimo suplementado com gentamicina e estreptomicina e aminoácidos aromáticos (20 mg/l de cada de DL triptofano, DL fenilalanina e DL tirosina). As colônias individuais são testadas por PCR. As colônias que produziram um produto da PCR do tipo selvagem e produto da PCR mutado de uns 100 pb menores são retidas para estudos adicionais.

h) As permutas individuais são cultivadas em caldo LB-G suplementado com 10% de sacarose, a 37°C, com agitação suave, por 16 horas. As diluições em série das culturas da noite anterior são preparadas sobre placas de LB-G suplementadas com 10% de sacarose e incubadas a 37°C, por 16 horas.

i) As colônias que crescem sobre as placas de LB-G com 10% de sacarose são subcultivadas sobre cada um de LB-G, LB-G + gentamicina e estreptomicina e mínimo, e incubadas a 37°C por 16 horas. As colônias que crescem somente sobre as placas de LB-G (permutas duplas) são subcultivadas sobre ágar de sangue de ovelha a 5% e mantidas a 4°C.

IV) Vetor de Clonagem Intermediário [0030] O vetor suicida (SacB, PNG101) foi o vetor de clonagem intermediário. A conjugação foi efetuada entre o doador (S17 abrigan

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11/27 do PNG101 com aroA abrigando remoção de 100 pb) e o isolado de E. coli do tipo selvagem.

EXEMPLO 2

PREPARAÇÃO DA SEMENTE PRINCIPAL [0031] A cepa de aroa- de E. coli (construída no Exemplo 1) é desenvolvida sobre placa de ágar de soja tríptico uma vez e passada 3 vezes em caldo de soja tríptico. A cultura é distribuída para frascos pequenos de vidro, vedada e liofilizada.

EXEMPLO 3

AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA DA VACINA VIVA DE AROA- DE E. COLI EM GALINHAS CONTRA A COLIBACILOSE AVIÁRIA APÓS UMA VACINAÇÃO [0032] Nesta avaliação, 96 galinhas legornes brancas SPF são divididas em 3 grupos de 32 cada. As aves são escolhidas manualmente e colocadas em um isolador especificado arbitrariamente. Cada grupo de teste é alojado em 2 isoladores contendo 16 aves cada.

[0033] O Grupo A é vacinado em 1 dia de idade por pulverização grosseira usando um pulverizador seguro pelas mãos. Em um dia de idade, as aves no grupo de teste A são agrupadas conjuntamente em um pequeno recipiente e a vacina é pulverizada nas cabeças das aves até a dosagem regulada ter sido dada. O microorganismo aroA- de E. coli do Exemplo 2 é diluído com solução salina tamponada com fosfato (PBS) estéril até um título de 5,0 x 106 cfu por dose (1 mL por ave).

[0034] Em 6 semanas de idade, o Grupo A e o Grupo B (não vacinado) são provocados de modo intratraqueal (IT) com uma dose de

1,0 mL de 1,0 x 109 cfu de O78 de E. coli.

[0035] O Grupo de Teste C é não vacinado e não provocado (grupo de controle negativo). Os vacinados e as aves de controle são criados em isoladores separados, até o término do estudo.

[0036] Todas as aves estão sob cuidado veterinário, com alimen

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12/27 tação e água disponíveis ad libitum. As aves são observadas diariamente por 7 dias após a provocação. No final do período de 7 dias após a provocação, todas as aves sobreviventes são necropsiadas e examinadas quanto à presença de lesões típicas de colibacilose. As aves não sobreviventes e as aves que demonstraram quaisquer das lesões grosseiramente visíveis, tais como periepatite, pericardite, saculite aérea, celulite, ou artrite, são consideradas positivas para a colibacilose.

[0037] Os resultados são mostrados na Tabela I.

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TABELA I % Positiva

Grupo de	Rota de	Rota de	% de	% de Aves sobreviventes com lesões grosseiras	para Colibacilose
Teste	Vacinação	Provocação	Mortalidade	Hep^b	Card^c	Aérea^d	Cel^e	Art^f
	Pulverização
A		IT	3,1^a	22,6	6,5	16,13	3,2	0	29,0
	grosseira
B	Nenhuma	IT	28,1	91,3	82,6	86,9	47,8	17,4	96,9
C	Nenhuma	Nenhuma	0	0	0	0	0	0	0

^aUma ave morreu em um dia após a vacinação. A causa não pôde ser determinada, porém foi provavelmente mortalidade de pinto prematura, não específica, freqüentemente relacionada ao saco vitelino ou infecção do umbigo.

^bPeriepatite ^cPericardite ^dSaculite aérea ^eCelulite ^fArtrite

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14/27 [0038] Conforme pode ser visto a partir dos dados na Tabela I, a vacina de aroA- de E. coli da invenção é segura e eficaz para a prevenção de colibacilose em galinhas causada por O78 de E. coli, quando a dita vacina é administrada em um dia de idade.

EXEMPLO 4

AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA DA VACINA VIVA DE AROA- DE E. COLI EM GALINHAS CONTRA A COLIBACILOSE AVIÁRIA APÓS DUAS VACINAÇÕES [0039] Nesta avaliação, 96 galinhas legornes brancas SPF são divididas em 3 grupos de 32 cada. As aves são escolhidas manualmente e colocadas em um isolador especificado arbitrariamente. Cada grupo de teste é alojado em 2 isoladores, cada um contendo 16 aves.

[0040] O Grupo A (vacinados) é vacinado em um dia de idade por pulverização grosseira, conforme descrito no Exemplo B, e novamente em 1 semana de idade pela rota de água potável. Em uma semana de idade, as aves são privadas de água potável por 3 h. A vacina de aroA- de E. coli do Exemplo 2 é diluída e misturada com uma quantidade medida de água destilada gelada até um título final de 5,0 x 106 cfu. A quantidade medida de água destilada é aquela quantidade previamente determinada para ser consumida em uma hora.

[0041] Em 6 semanas de idade, o Grupo A (vacinado) e o Grupo B (não vacinado) são provocados de modo intratraqueal (IT) com uma dose de 1,0 mL de 1,0 x 109 cfu de O78 de E. coli.

[0042] O Grupo de Teste C é não vacinado e não provocado (grupo de controle negativo). Os vacinados e as aves de controle são criados em isoladores separados, até o término do estudo.

[0043] Todas as aves estão sob cuidado veterinário, com alimentação e água disponíveis ad libitum. As aves são observadas diariamente por 7 dias após a provocação. No final do período de 7 dias após a provocação, todas as aves sobreviventes são necropsiadas e

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15/27 examinadas quanto à presença de lesões típicas de colibacilose. As aves não sobreviventes e as aves que demonstraram quaisquer das lesões grosseiramente visíveis, tais como periepatite, pericardite, saculite aérea, celulite, ou artrite, são consideradas positivas para a colibacilose.

[0044] Os resultados são mostrados na Tabela II.

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TABELA II ai

									% Positiva
Grupo	Rota de	Rota de	% de	% de Aves sobreviventes com lesões grosseiras	para
de Teste	Vacinação	Provocação	Mortalidade	Hep^b	Card^c	Aérea^d	Cel^e	Art^f	Colibacilose
A	Pulverização Grosseira/Água Potável	IT	6,3^a	10	23,3	20	0	0	36,7
B	Nenhuma	IT	28,1	91,3	82,6	86,9	47,8	17,4	96,9
C	Nenhuma	Nenhuma	0	0	0	0	0	0	0
Duas aves morreram em 2 dias após a vacinação, via a	rota de	pulverização grosseira. A	causa	não pôde ser

16/27 determinada, porém foi provavelmente mortalidade de pinto prematura, não específica, freqüentemente relacionada ao saco vitelino ou infecção do umbigo.

^bPeriepatite ^cPericardite ^dSaculite aérea ^eCelulite ^fArtrite

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17/27 [0045] Conforme pode ser visto a partir dos dados na Tabela II, a vacina de aroA- de E. coli da invenção é segura e eficaz para a prevenção de colibacilose em galinhas causada por O78 de E. coli, quando a dita vacina é administrada em um dia de idade via pulverização grosseira, e novamente em uma semana de idade via água potável. EXEMPLO 5

AVALIAÇÃO ADICIONAL DA EFICÁCIA DA VACINA VIVA DE AROADE E. COLI EM GALINHAS CONTRA A COLIBACILOSE AVIÁRIA (SOROTIPO 078) APÓS DUAS VACINAÇÕES [0046] Este estudo investigou a eficácia de uma vacina viva de aroA- de E. coli na prevenção de colibacilose em galinhas seguindo a provocação intratraqueal com uma cepa virulenta de E. coli - sorotipo O78. Cada ave no grupo de teste no 1 (32 aves) foi vacinada por pulverização grosseira em 1 dia de idade e novamente na água potável em 1 semana de idade com uma dose por ave de vacina de aroA- de E. coli. As aves no grupo de teste no 2 (32 aves) serviram como controles provocados não vacinados. As aves no grupo de teste no 3 (32 aves) não foram vacinadas e não foram provocadas. Todas as aves nos grupos no 1 e no 2 foram provocadas de modo intratraqueal em 6 semanas de idade com 1,5 x 109 cfu por dose de E. coli O78. Em 7 dias após a provocação, todas as aves sobreviventes foram necropsiadas e examinadas quanto à presença de lesões grosseiramente visíveis, típicas de colibacilose (periepatite, pericardite, saculite aérea, celulite, ou artrite).

[0047] Não houve nenhuma reação desfavorável (morte ou outros sinais clínicos) que fosse atribuível à administração da vacina viva de aroA- de E. coli de FDAH, uma indicação de sua segurança para a administração em massa.

[0048] A cepa virulenta de E. coli O78 causou 28,1% de mortalidade (9 das 32 aves morreram) nos controles provocados não vacinados

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18/27 (grupo no 2) durante o período de 7 dias após a provocação. A mortalidade causada pela cepa virulenta de E. coli O78 nas aves vacinadas com a vacina viva de aroA- de E. coli de FDAH foi 0% (0 das 32 aves morreu) durante o período de 7 dias após a provocação.

[0049] As taxas de colibacilose foram analisadas estatisticamente entre as aves provocadas vacinadas e as aves de controle provocadas não vacinadas. Houve uma diferença significativa (p<0,0001) entre as aves provocadas vacinadas e não vacinadas com lesões grosseiras típicas de colibacilose. A fração preventiva foi 72,4% (95% CI 53,7, 83,6).

[0050] Com base no presente estudo, foi concluído que a vacina viva de aroA- de E. coli de FDAH, com um título de 3,2 x 106 cfu por dose, era segura e eficaz para a prevenção de colibacilose em galinhas causada por E. coli O78, quando ela foi administrada em um dia de idade por pulverização grosseira e novamente em 1 semana de idade na água potável.

EXEMPLO 6

AVALIAÇÃO ADICIONAL DA EFICÁCIA DA VACINA VIVA DE AROADE E. COLI EM GALINHAS CONTRA A COLIBACILOSE AVIÁRIA (SOROTIPO 078) APÓS UMA VACINAÇÃO [0051] Este estudo investigou a eficácia de uma vacina viva de aroA- de E. coli na prevenção de colibacilose em galinhas seguindo a provocação intratraqueal com uma cepa virulenta de E. coli O78. Cada ave no grupo de teste no 1 (32 aves) foi vacinada por pulverização grosseira em 1 dia de idade com uma dose por ave de vacina de aroAde E. coli. As aves no grupo de teste no 2 (32 aves) serviram como controles provocados não vacinados. As aves no grupo de teste no 3 (32 aves) não foram vacinadas e não foram provocadas. Todas as aves nos grupos no 1 e no 2 foram provocadas de modo intratraqueal em 6 semanas de idade com 1,5 x 109 cfu por dose de E. coli O78.

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19/27

Em 7 dias após a provocação, todas as aves sobreviventes foram necropsiadas e examinadas quanto à presença de lesões grosseiramente visíveis, típicas de colibacilose (periepatite, pericardite, saculite aérea, celulite, ou artrite).

[0052] Não houve nenhuma reação desfavorável (morte ou outros sinais clínicos) que fosse atribuível à administração da vacina viva de aroA- de E. coli de FDAH, uma indicação de sua segurança para a administração em massa.

[0053] A cepa virulenta de E. coli O78 causou 28,1% de mortalidade (9 das 32 aves morreram) nos controles provocados não vacinados durante o período de 7 dias após a provocação. A mortalidade causada pela cepa virulenta de E. coli O78 nas aves vacinadas com a vacina viva de aroA- de E. coli de FDAH foi 0% (0 das 32 aves morreram) durante o período de 7 dias após a provocação.

[0054] As taxas de colibacilose foram analisadas estatisticamente entre as aves provocadas vacinadas e as aves de controle provocadas não vacinadas. Houve uma diferença significativa (p<0,0001) entre as aves provocadas vacinadas e não vacinadas com lesões grosseiras típicas de colibacilose. A fração preventiva foi 76,5% (95% CI 57,9, 86,9).

[0055] Com base no presente estudo, foi concluído que a vacina viva de aroA- de E. coli de FDAH, contendo 3,2 x 106 cfu por dose, era segura e eficaz para a prevenção de colibacilose em galinhas causada por E. coli O78, quando ela foi administrada em um dia de idade por pulverização grosseira.

EXEMPLO 7

AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA DA VACINA VIVA DE AROA- DE E. COLI EM GALINHAS CONTRA A COLIBACILOSE AVIÁRIA (SOROTIPO NÃO TIPADO VIRULENTO) APÓS DUAS VACINAÇÕES [0056] Este estudo investigou a eficácia de uma vacina viva de

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20/27 aroA- de E. coli na prevenção de colibacilose em galinhas seguindo a provocação intratraqueal com uma E. coli virulenta que é não tipada. Cada ave no grupo de teste no 1 (32 aves) foi vacinada por pulverização grosseira em 1 dia de idade e novamente na água potável em 1 semana de idade com uma dose por ave de vacina de aroA- de E. coli. As aves no grupo de teste no 2 (32 aves) serviram como controles provocados não vacinados. As aves no grupo de teste no 3 (32 aves) não foram vacinadas e não foram provocadas. Todas as aves nos grupos no 1 e no 2 foram provocadas de modo intratraqueal em 6 semanas de idade com 2,5 x 1010 cfu por dose de E. coli virulenta. Em 7 dias após a provocação, todas as aves sobreviventes foram necropsiadas e examinadas quanto à presença de lesões grosseiramente visíveis, típicas de colibacilose (periepatite, pericardite, saculite aérea, celulite, ou artrite).

[0057] Não houve nenhuma reação desfavorável (morte ou outros sinais clínicos) que fosse atribuível à administração da vacina viva de aroA- de E. coli de FDAH, uma indicação de sua segurança para a administração em massa.

[0058] A E. coli virulenta não causou mortalidade nos controles provocados não vacinados ou nas aves vacinadas com a vacina viva de aroA- de E. coli de FDAH durante o período de 7 dias após a provocação.

[0059] As taxas de colibacilose foram analisadas estatisticamente entre as aves provocadas vacinadas e as aves de controle provocadas não vacinadas. Houve uma diferença significativa (p<0,0001) entre as aves provocadas vacinadas e não vacinadas com lesões grosseiras típicas de colibacilose. A fração preventiva foi 87,1% (95% CI 61,9, 95,6).

[0060] Com base no presente estudo, foi concluído que a vacina viva de aroA- de E. coli de FDAH, com um título de 3,2 x 106 cfu por

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21/27 dose, era segura e eficaz para a prevenção de colibacilose em galinhas causada por E. coli virulenta, quando ela foi administrada em um dia de idade por pulverização grosseira e novamente em 1 semana de idade na água potável.

EXEMPLO 8

AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA DA VACINA VIVA DE AROA- DE E. COLI EM GALINHAS CONTRA A COLIBACILOSE AVIÁRIA (SOROTIPO NÃO TIPADO VIRULENTO) APÓS UMA VACINAÇÃO [0061] Este estudo investigou a eficácia de uma vacina viva de aroA- de E. coli na prevenção de colibacilose em galinhas seguindo a provocação intratraqueal com uma E. coli virulenta que é não tipada. Cada ave no grupo de teste no 1 (32 aves) foi vacinada por pulverização grosseira em 1 dia de idade com uma dose por ave de vacina de aroA- de E. coli. As aves no grupo de teste no 2 (32 aves) serviram como controles provocados não vacinados. As aves no grupo de teste no 3 (32 aves) eram não vacinadas e não foram provocadas. Todas as aves nos grupos no 1 e no 2 foram provocadas de modo intratraqueal em 6 semanas de idade com 2,5 x 1010 cfu por dose de E. coli virulenta. Em 7 dias após a provocação, todas as aves sobreviventes foram necropsiadas e examinadas quanto à presença de lesões grosseiramente visíveis, típicas de colibacilose (periepatite, pericardite, saculite aérea, celulite, ou artrite).

[0062] Não houve nenhuma reação desfavorável (morte ou outros sinais clínicos) que fosse atribuível à administração da vacina viva de aroA- de E. coli de FDAH, uma indicação de sua segurança para a administração em massa.

[0063] A E. coli virulenta não causou mortalidade nos controles provocados não vacinados ou nas aves vacinadas com a vacina viva de aroA- de E. coli de FDAH durante o período de 7 dias após a provocação.

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22/27 [0064] As taxas de colibacilose foram analisadas estatisticamente entre as aves provocadas vacinadas e as aves de controle provocadas não vacinadas. Houve uma diferença significativa (p<0,0001) entre as aves provocadas vacinadas e não vacinadas com lesões grosseiras típicas de colibacilose. A fração preventiva foi 66,6% (95% CI 39,8, 81,5).

[0065] Com base no presente estudo, foi concluído que a vacina viva de aroA- de E. coli de FDAH, com um título de 3,2 x 106 cfu por dose, era segura e eficaz para a prevenção de colibacilose em galinhas causada por E. coli virulenta, quando ela foi administrada em um dia de idade por pulverização grosseira.

EXEMPLO 9

ESTUDO COMPARATIVO A [0066] Neste estudo, a vacina da invenção foi comparada contra a vacina comercial GARAVAX®-T, um produto do competidor, que é uma vacina viva bacteriana contendo um mutante de E. coli sensível à temperatura, avirulento, e é recomendada para uso em perus para auxiliar na prevenção de colibacilose associada com infecção por E. coli sorotipo O78.

[0067] Cada ave no grupo de teste no 1 (30 aves) foi vacinada por pulverização grosseira em 1 dia de idade e novamente na água potável em 2 semanas de idade com uma dose por ave de vacina de aroAde E. coli de acordo com uma modalidade da invenção (nível de passagem X+5; 5,0 X 106 cfu por dose de 1 mL). As aves no grupo de teste no 2 (30 aves) foram, cada uma, vacinadas por pulverização grosseira em 1 dia de idade e novamente na água potável em 2 semanas de idade com uma dose por ave de vacina GARAVAX®-T, seguindo as instruções recomendadas no rótulo. As aves no grupo de teste no 3 (30 aves) serviram como controles provocados não vacinados. As aves no grupo de teste no 4 (30 aves) não foram vacinadas e

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23/27 não foram provocadas. Todas as aves nos grupos no 1, no 2 e no 3 foram provocadas de modo intratraqueal em 6 semanas de idade com uma dose-alvo de 5 x 109 cfu por dose (1,0 mL/dose) de uma E. coli O78 virulenta. Em 7 dias após a provocação, o número de aves mortas foi anotado e todas as aves sobreviventes foram necropsiadas e examinadas quanto à presença de lesões grosseiramente visíveis, típicas de colibacilose.

[0068] Os resultados são apresentados na Tabela III abaixo - as porcentagens de galinhas com saculite aérea específica e lesões globais de colibacilose são quantificadas na mesma:

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TABELA III

EFICÁCIA DA VACINA DE AROA- DE E. COLI. NA PREVENÇÃO DE SACULITE AÉREA EM GALINHAS CONTRA PROVOCAÇÃO COM E. COLI O78

Grupo N^o	Rota de Vacinação	Rota de Pro- vocação	N^o Total de Aves	Saculite Aérea	Colibacilose	% de Positivas para Saculite Aérea¹	% de Positivas para Colibacilose²
1	PG/AP	Intratraquealmente	30	2	2	6,6 (2/30^a)	6,6 (2/30^a)
3	Nenhuma	Intratraquealmente	30	16	19	53,3 (16/30^b)	63,3 (19/30^b)

24/27

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TABELA III (cont.)

EFICÁCIA DA VACINA DE GARAVAX®-T NA PREVENÇÃO DE SACULITE AÉREA EM GALINHAS CONTRA

PROVOCAÇÃO COM E. COLI O78

Grupo No	Rota de Vacinação	Rota de Pro- vocação	N^o Total de Aves	Saculite Aérea	Colibacilo- se	% de Positivas para Saculite Aérea¹	% de Positivas para Colibacilose²
2	PG/AP	Intratraquealmente	30	8	10	26,7 (8/30^a)	33,3 (10/30^a)
3	Nenhuma	Intratraquealmente	30	16	19	53,3 (16/30^b)	63,3 (19/30^b)

¹ % Positiva para saculite aérea = N^o Total de aves com saculite aérea/ n^o total de aves

25/27 ² % Positiva para colibacilose = N^o total de aves com lesões por colibacilose e aves mortas/n^o total de aves

PG = Pulverização Grosseira

AP = Água Potável

Os valores dentro da mesma coluna seguidos por letras diferentes são significativamente diferentes (prova do qui quadrado: p<0.05)

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EXEMPLO 10

ESTUDO COMPARATIVO B [0069] Neste estudo, a vacina da invenção foi comparada contra a vacina comercial GARAVAX®-T, um produto do competidor, que é uma vacina viva bacteriana contendo um mutante de E. coli sensível à temperatura, avirulento, e é recomendada para uso em perus para auxiliar na prevenção de colibacilose associada com infecção por E. coli sorotipo O78.

[0070] Cada ave no grupo de teste no 1 (31 aves) foi vacinada por pulverização grosseira em 1 dia de idade e novamente na água potável em 2 semanas de idade com uma dose por ave de vacina de aroAde E. coli de acordo com uma modalidade da invenção (nível de passagem X+5; 5,0 X 106 cfu por dose de 1 mL). As aves no grupo de teste no 2 (29 aves) foram, cada uma, vacinadas por pulverização grosseira em 1 dia de idade e novamente na água potável em 2 semanas de idade com uma dose por ave de vacina GARAVAX®-T, seguindo as instruções recomendadas no rótulo. As aves no grupo de teste no 3 (31 aves) serviram como controles provocados não vacinados. As aves no grupo de teste no 4 (30 aves) não foram vacinadas e não foram provocadas; nenhuma destas morreu. Todas as aves nos grupos no 1, no 2 e no 3 foram provocadas de modo intratraqueal em 6 semanas de idade com uma dose-alvo de 5,0 x 109 cfu por dose (1,0 mL/dose) de uma E. coli 624 virulenta (sorotipo não tipado). Em 7 dias após a provocação, o número de aves mortas foi anotado e todas as aves sobreviventes foram necropsiadas e examinadas quanto à presença de lesões grosseiramente visíveis, típicas de colibacilose.

[0071] Os resultados são apresentados na Tabela IV abaixo - as porcentagens de galinhas com celulite específica são quantificadas na mesma:

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TABELA IV

EFICÁCIA DA VACINA DE AROA- DE E. COLI NA PREVENÇÃO DE CELULITE EM GALINHAS CONTRA PROVOCAÇÃO COM E. COLI 624 (SOROTIPO NÃO TIPADO)

N^o do Grupo	Rota de Vacinação	Rota de Provocação	N^o Total de Aves	Celulite	N^o de Aves Mortas	% de Positivas para Celulite¹
1	PG/AP	Intratraquealmente	31	6	8	45,2 (14/31^a)
3	Nenhuma	Intratraquealmente	31	4	20	77,4 (24/31^b)

TABELA IV (cont.)

EFICÁCIA DA VACINA DE GARAVAX®-T NA PREVENÇÃO DE CELULITE EM GALINHAS CONTRA PROVOCAÇÃO COM E. COLI 624 (SOROTIPO NÃO TIPADO)

27/27

N^o do Grupo	Rota de Vacinação	Rota de Provocação	N^o Total de Aves	Celulite	N^o de Aves Mortas	% Positiva para Celulite¹
2	PG/AP	Intratraquealmente	29	7	12	65,5 (19/29^a)
3	Nenhuma	Intratraquealmente	31	4	20	77,4 (24/31^a)

¹ % Positiva para Celulite = N^o total de aves c/ celulite e aves mortas / n^o total de aves

PG =Pulverização Grosseira

AP = Água Potável

Os valores dentro da mesma coluna seguidos por letras diferentes são significativamente diferentes (Prova do qui quadrado: p<0,05).

Claims

1. Cepa mutante de Escherichia coli aroA-, caracterizada pelo fato de que consiste na cepa depositada sob o número PTA-5094, na qual o gene aroA relacionado com a biossíntese de aminoácidos aromáticos foi deletado.

2. Cepa mutante de E. coli de acordo com a reivindicação

1, caracterizada pelo fato de que é para uso na prevenção ou melhora de colibacilose em aves domésticas, em que as referidas características de identificação compreendem uma deficiência na biossíntese de aminoácidos aromáticos

3. Cepa mutante de E. coli de acordo com a reivindicação

2, caracterizada pelo fato de que as aves domésticas são selecionadas a partir do grupo consistindo em: galinhas, patos; gansos; perus; garnizés; codornas; faisões; e pombos.

4. Cepa mutante de E. coli de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a referida E. coli é administrada via aplicação em massa.

5. Cepa mutante de E. coli de acordo com a reivindicação

2, caracterizada pelo fato de que a dita quantidade eficaz é cerca de 5,0 x10² cfu a 5,0 x 10¹⁰ cfu.

6. Cepa mutante de E. coli de acordo com a reivindicação

3, caracterizada pelo fato de que as ditas aves domésticas são galinhas ou perus.

7. Cepa mutante de E. coli de acordo com a reivindicação

4, caracterizada pelo fato de que a dita E. coli é administrada através de aplicação por pulverização.

8. Cepa mutante de E. coli de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a dita E. coli é administrada na água potável.

9. Cepa mutante de E. coli de acordo com a reivindicação 6,

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2/2 caracterizada pelo fato de que as ditas aves domésticas são galinhas.

10. Cepa mutante de E. coli de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a dita quantidade eficaz é cerca de 5,0 x106 cfu a 6,0 x10⁶ cfu.

11. Cepa mutante de E. coli de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de ser para uso na prevenção ou melhora de celulite em aves domésticas, as referidas características de identificação compreendendo uma deficiência na biossíntese de aminoácidos aromáticos.

12. Composição de vacina, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade imunogenicamente eficaz de uma cepa mutante de E. coli como definida na reivindicação 1 e um veículo farmacologicamente aceitável.

13. Composição de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o dito veículo é uma solução de sal balanceada adequada para uso em meios de culturas de tecidos ou de células.

14. Composição de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o dito veículo é água destilada.

15. Composição de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a quantidade imunogenicamente eficaz é uma quantidade suficiente para proporcionar cerca de 5,0 x 10² cfu a 5,0 x10¹⁰ cfu.

16. Composição de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que a dita quantidade eficaz é cerca de 5,0 x 106 cfu a 6,0 x10⁶ cfu.

17. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que é segura e eficaz para aplicação em massa via pulverização de aerossol ou água potável, em que a dita quantidade imunogenicamente eficaz é suficiente para proporcionar cerca de 3,0 X 106 cfu a 6,0 X 106 cfu.