BRPI0410789B1 - composição farmacêutica, uso de um ou mais oligonucleotídeos, e, método de detecção - Google Patents

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Jaime E. Villegas
Veronica A. Burzio
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Abstract

MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO, COMPOSTO OU OLIGONUCLEOTÍDEO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODOS PARA INDUZIR A MORTE DA CÉLULA PRÉ-CANCEROSA OU CANCEROSA EM CÉLULAS OU TECIDOS, PARA TRATAR UM SER HUMANO OU ANIMAL SUSPEITO DE TER PRÉ-CÂNCER OU CÂNCER, PARA MELHORAR A EFICÁCIA DE UM TRATAMENTO DE CÂNCER COM MEDICAMENTO QUIMIOTERAPÊUTICO E DE HIBRIDIZAÇÃO PARA DISTINGUIR ENTRE CÉLULAS NORMAIS, PRÉ-CANCEROSAS OU CANCEROSAS, KIT, E, MÉTODO DE HIBRIDIZAÇÃO IN SITU PARA DETERMINAR A LOCALIZAÇÃO DA CÉLULA DO RNA QUIMÉRICO MITOCONDRIAL ANTISENTIDO OU SENTIDO NO CITOPLASMA, NÚCLEO E NUCLÉOLO DAS CÉLULAS PRESENTES NA AMOSTRA. Uma nova família de RNAs mitocondriais humanos, aludidos como RNAs quiméricos, que são diferencialmente expressados em células normais, pré-cancerosas e cancerosas, é descrita. Oligonucleotídeos cujos alvos são os RNAs quiméricos são fornecidos. Os oligonucleotídeos descritos ou seus análogos podem ser usado para diagnósticos do câncer e terapia do câncer assim como para pesquisa. Em uma forma de realização desta invenção, estes oligonucleotídeos hibridizam com os RNAs quiméricos mitocondriais sentido ou anti-sentido e o resultado da hibridização é útil para diferenciar entre células proliferativas normais, células précancerosas e células cancerosas. Em uma outra forma de realização da invenção, as composições compreendem oligonucleotídeos que hibridizam com (...).

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
A invenção diz respeito à terapia do câncer, à diagnose do câncer e aos reagentes de pesquisa relativos a uma nova família de RNAs mitocondriais humanos referidos como RNAs quiméricos mitocondriais humanos.
Em particular, esta invenção diz respeito aos oligonucleotídeos alvejados aos RNAs quiméricos mitocondriais humanos.
Os oligonucleotídeos da invenção hibridizam aos RNAs quiméricos induzindo a morte da célula cancerosa. A composição e os métodos fornecidos na invenção são úteis como uma nova terapia do câncer. Além disso, os oligonucleotídeos podem ser usados para a diagnose de células cancerosas e pré cancerosas com base na expressão diferencial dos RNAs quiméricos mitocondriais no repouso e proliferação da célula normal, células pré cancerosas e cancerosas.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO Mitocôndrias
As mitocôndrias são organelas subcelulares que fabricam amolécula essencial trifosfato de adenosina (ATP) por fosforilação oxidativa.O DNA mitocondrial humano (mtDNA) de 16.654 pares de base codifica osdois RNAs ribossômicos, 22 RNAs de transferência (tRNAs) e 13 matrizes deleitura abertas (ORF) que codificam um número similar de polipeptídeos(Clayton, Hum Reprod. Suppl 2: 11 a 17, 2000; Taanman,Biochim. Biophys. Acta, 1410: 103 a 123, 1999).
Na base do teor dacomposição de base G+T, os dois filamentos do mtDNA diferem emdensidade flutuante e podem ser separados em gradientes de cloreto de césiodesnaturantes. O filamento pesado ou filamento H codifica dois RNAsribossômicos (12S e 16S), 14 tRNAs e 12 polipeptídeos correspondendo a ND1, ND 2, ND 3, ND 4L, ND 4, ND 5, COX I, COX II, COX III, ATP6, ATP8e Cyt b.
O filamento leve ou filamento L codifica 8 tRNAs e a subunidade dadesidrogenase ND6 de NAD complexo (Clayton, Hum Reprod. Suppl 2:11a17, 2000; Taanman, Biochim.
Biophys. Acta, 1410: 103 a 123, 1999).
Uma proporção grande do mtDNA contém uma estrutura detrês filamentos curtos denominada alça de deslocamento ou alça D. Estaregião, que em seres humanos é de 1.006 pares de bases, é flanqueada pelosgenes para o tRNA de fenilalanina (tRNAphe) e o tRNA de prolina (tRNAPro) econtém um filamento de ácido nucléico curto complementar ao filamento L eque desloca o filamento H (Clayton, Hum Reprod. Suppl 2: 11 a 17, 2000;Taanman, Biochim. Biophys. Acta, 1410: 103 a 123, 1999).
Esta regiãodesenvolveu como o sítio de controle principal para a expressão de mtDNA econtém o filamento principal ou a origem do filamento H de replicação e ospromotores principais para a transcrição do filamento H (HSP) e L (LSP).Apesar da proximidade imediata dos HSP e LSP (cerca de 150 pb), esteselementos reguladores são funcionalmente independentes in vitro (Shuey eAttardi, J Biol Chem. 260: 1952 a 1958, 1985; Taanman, Biochim. Biophys.Acta, 1410: 103 a 123, 1999) assim como in vivo,utilizando o modelo depacientes com doenças mitocondriais (Chinnery e Turnbull, Mol. Med.Today, 6: 425 a 432, 2000).
Ambos os filamentos são transcritos como RNAspolicistrônicos que depois são processados para liberar os mRNAs, tRNAsindividuais e os rRNAs (Taanman, Biochim. Biophys. Acta, 1410: 103 a 123,1999).
Em seres humanos, a RNA polimerase mitocondrial é uma proteína de1.230 aminoácidos com homologia significante com a seqüência de RNApolimerase mitocondrial de levedura e com as RNA polimerases de váriosbacteriófagos (Tiranti et al.,Hum Mol Genet. 6: 615 a 625, 1997). Alémdisso, uma família de fatores de transcrição foi caracterizada tais como o fatorde transcrição mitocondrial A ou TF AM que é essencial para a transcrição domtDNA mamífero e é um membro do grupo de mobilidade alta da família(HMG)-box das proteínas de ligação de DNA (Parisi e Clayon, Science. 252:965 a 969, 1991). Recentemente, dois relatórios independentes descreveramas características de novos fatores de transcrição, TFB1M e TFB2M, no serhumano e camundongo (McCulloch et al., Mol. Cell Biol. 22: 1116 a 1125,2002; Falkenberg et al.,Nat Genet. 31: 289 a 294, 2002; Rantanen et al.,Mamm Genome. 14: 1 a 6, 2003). Apesar do progresso considerável obtidonos elementos de representação cis e trans envolvidos na transcrição domtDNA, os detalhes funcionais não são completamente entendidos.
Mitocôndrias e ApoptoseAs mitocôndrias desempenham um papel central na apoptose,um processo biológico fundamental pelo qual as células morrem em umamaneira bem controlada ou programada.
Este programa de suicídio da célula éessencial durante o desenvolvimento e para a homeostase adulta de todos osanimais metazoários. A apoptose é ativada para erradicar as célulassupérfluas, danificadas, mutadas e envelhecidas (Meier et al.,Nature 407: 796 ■€ía 801, 2000). A desregulagem da apoptose é implicada no aparecimento de várias patologias.
Assim, a inibição anormal da apoptose é uma marca de neoplasia, ao passo que a apoptose maciça foi ligada com as doenças agudas tais como acidente vascular cerebral, choque séptico e distúrbios5 neurodegenerativos. No momento o processo de apoptose é descrito como dois caminhos principais conhecidos como os caminhos extrínsecos e intrínsecos (Zomig et al., Biochim. Biophys. Acta, 1551: Fl a F37, 2001).
O caminho extrínseco é um processo que é iniciado na membrana celular pela ligação de ligandos diferentes aos receptores mortais (Krammer, Nature 407:10 789 a 795, 2000; Kõmig et al., Biochim. Biophys. Acta, 1551: F1 a f37,2001).
As caspases, são responsáveis pela cascata proteolítica naapoptose. As caspases são sintetizadas como proteínas precursoras inativas que sofrem maturação ou processamento proteolíticos na indução da apoptose15 (Zomig et al., Biochim. Biophys. Acta, 1551: Fl a F37, 2001). Entretanto, mais recentemente várias evidências experimentais indicam que as proteases lisossômicas constituem um caminho alternativo de proteólise depois de insultos apoptóticos (Guicciardi et al.,Oncogene, 23: 2881 a 2890,2004).Por outro lado, as proteínas anti-apoptóticas homólogas à20 oncoproteína Bcl-2 humana foram descritas.
Esta proteína pertence a uma família de proteínas que são anti-apoptóticas (Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w) ou pró apoptóticas (Bax, Bak, Bim, Bid, etc.) (Zõming et al., Biochim. Biophys. Acta, 1551: F1 aF37, 2001).
As mitocôndrias são particularmente afetadas primeiro durante25 o processo apoptótico e no tempo presente elas são reconhecidas como os coordenadores centrais da morte celular (Boya et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 304: 575 a 581, 2003; Ferri e Kroemer, Nature Cell Biol. 3: E255 a E263, 2001; Zomig et al., Biochim. Biophys. Acta, 1551; Fl a F37, 2001). Vários caminhos de sinal e dano pró apoptóticos convergem em mitocôndrias para induzir a permeabilização de membrana mitocondrial, fenômeno que estásob o controle das proteínas Bcl-2 (Boya et al., Biochem. Biophys. Res.Commun. 304: 575 a 581, 2003; Zõmig et al., Biochim. Biophys. Acta, 1551:Fl a F37, 2001). Depois que as células recebem os insultos apoptóticos, opotencial de trans-membrana (Δψm) dissipa resultando na permeabilizaçãocompleta da membrana mitoncondrial externa e a vazamento consequente dasproteínas de intermembrana mitocondrial tóxicas. O primeiro exemplo dovazamento de uma proteína mitocondrial foi a liberação do citocromo c (Liuet al., Apoptose, 6: 453 a 462, 2001). Quando o citocromo c está presente nocitosol, ele induz a construção do complexo ativador de caspase denominadoo apoptossoma. O citocromo c se liga ao Apaf-1 (fator-1 de ativação daprotease apoptótica) facilitando a ligação de dATP/ATP ao complexo e aoligomerização de Apaf-1 (Adrain et al., 1999; Benedict et al., 2000). Aoligomerização de Apaf-1 permite o recrutamento da pró caspase-9 quecatalisa a ativação proteolítica do precursor e a geração da caspase-9 ativa(Adrain et al.,J. Biol. Chem. 274: 20855 a 20860, 1999; Benedict et al., J.Biol. Chem., 275: 8461 a 8468, 2000).Uma família de inibidor citossólico de proteínas de apoptosefoi descrita e é conhecida como XIAP, c-IAPl e C-IAP2.
Estas proteínas seligam a e inibem a caspase-3 e caspase-9 processadas e consequentementeinterrompem a cascata de degradação. Entretanto, a célula também contémmecanismos de contramina para desviar este caminho anti-apoptótico. Emcélulas que sofrem apoptose, as caspases são liberadas deste efeito inibitórioligando-se aos IAPs de uma proteína conhecida como Smac (SegundoAtivador Mitocondrial de Caspases) ou DIABLO (Proteína de Ligação de IAPDireta com pl Baixo) (Verhagen et al.,Apoptosis, 7: 163 a 166, 2002).Ligando-se aos IAPs, a Smac/DIABLO desloca as caspases ativas dos IAPs epromove assim a morte celular.
Uma outra proteína, conhecida como HtrA2, éliberada das mitocôndrias no citosol depois do insulto apoptótico onde aproteína se liga a IAPs em uma forma similar como faz a Smac/DIABLO edesse modo facilita a ativação das caspases (Verhagen et al., Apoptose, 7: 163a 166, 2002; Martins et al., 2001; Suzuki et al., Mol. Cell, 8: 613 a 621, 2001;Hedge et al., Apoptose, 7: 123 a 132, 2002).O fator de indução de apoptose (AIF) é um outro componenteda cascata apoptótica. Depois da indução da apoptose, o AIF se desloca aocitosol e ao núcleo.
No núcleo, o AIF induz a condensação de cromatinaperiférica e a fragmentação do DNA. O AIF também induz várias marcas deapoptose como a dissipação Δψme exposição a fosfatidilserina (Zomig et al.,Biochim. Biophys. Acta, 1551: Fl a F37, 2001).
Um fator que parece regulara atividade apoptótica de AIF é a proteína de choque de calor 70 (Ravagnan etal.,Nature Cell Biol. 3: 839 a 843, 2001). Um outro fator mitocondrial que saidas mitocôndrias e se desloca no núcleo como AIF é a endonuclease G ouEndo G. No núcleo, a Endo G gera a fragmentação do DNA mesmo napresença de inibidores de caspase (Li et al.,Nature, 412: 95 a 99, 2001).
AEndo G pode agir em forma similar como a CAD (DNAse ativada porcaspase), uma nuclease cuja ativação conta criticamente com as caspases(Samejima et al.,J. Biol. Chem., 276: 45427 a 45432, 2001).Câncer e Pré CâncerO câncer é uma malignidade celular cujo traço único, a perdade controle normal do ciclo celular, resulta no crescimento desregulado, faltade diferenciação e capacidade de invadir outros tecidos e espalhar-se pormetástase. A carcinogênese é o processo pelo qual uma célula normal étransformada em uma célula maligna.
A carcinogênese é um processo deetapa múltipla que começa com o evento genético de iniciação seguido pelaexpansão seletiva de células alteradas durante a promoção para formaradenomas precoces. Na ausência da promoção contínua, o adenoma regride edesaparece. Com um segundo evento genético, um número pequeno deadenomas promovidos progride para formar alguns adenomas tardios dos quais podem depois passar por conversão maligna (McKinnell et al., “TheBiology Basis of Cancer”, Ch. 3, 1998).A etiologia do cancer é complexa e inclui a alteração daregulação do ciclo celular, anormalidades cromossômicas e quebra doscromossomos.
Os agentes infecciosos tais como vários tipos de vírusoncogênicos, produtos químicos, radiação (radiação ultravioleta ou ionizante)e distúrbios imunológicos são considerados serem as causas principais decarcinogênese (McKinnell et al.,“The Biological Basis of Cancer, Ch. 3,1998).
Foi proposto durante um longo tempo que o câncer também érelacionado à disfunção mitocondrial. Uma destas teorias sugere que amutação mitocondrial pode ser a causa primária de transformação celular ecâncer (Warburg, 1956; Carew e Huang, Mol. Cancer, 1: 1 a 12, 2002). Asalterações do DNA mitocondrial (mtDNA) foram relatadas em malignidadeshematológicas (Clayton e Vinograd, Nature, 216: 652 a 657, 1967) e nocâncer de mama (Tan et al., 2002; Parrella et al., 2001). As mutações devárias regiões do mtDNA e as supressões também foram identificadas empacientes com câncer colorretal, câncer de próstata, câncer ovariano, câncergástrico, câncer pancreático, carcinoma hepatocelular, câncer esofágico,câncer renal, câncer tireoidal e tumores cerebrais (revisado por Carew eHuang, Mol. Cancer, 1: 1 a 12, 2002). No geral, parece haver dois aspectosprincipais de alterações de mtDNA no câncer sem restrição do tipo de tumor.
A maioria das mutações são transições de base de T a C e G a A. Segundo,enquanto existe diversidade nos genes particulares em que as mutaçõesocorrem, a alça D parece ser a região mutada somática mais freqüente domtDNA na maioria dos tipos de tumor.
As células pré cancerosas são definidas aqui como uma célulatransformada que pode evoluir ou diferenciar-se em uma célula maligna.Alguns exemplos são as células transformadas pelos oncovirus de DNA ou RNA.A presente invenção diz respeito a uma nova família de RNAsmitocondriais e o uso aqui destes RNAs como alvos para os diagnósticos eterapia do câncer.
A presente invenção fornece composições e métodos e quesão úteis para diferenciar as células normais das células tumorosas ou dascélulas pré malignas ou células transformadas com os vírus oncogênicos. Emparticular, como elaborado abaixo, a presente invenção fornece a composiçãoe os métodos para os ensaios de diagnósticos para diferenciar as célulasnormais das células pré cancerosas e cancerosas.
Em uma outra forma derealização da invenção, a composição e os métodos são fornecidos parainduzir a morte de célula tumorosa maciça e seletiva. Portanto, a presenteinvenção fornece composições e métodos que podem ser usados nodiagnóstico e terapia do câncer e pré câncer assim como para pesquisa.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO.
A presente invenção é direcionada às composições e aosmétodos úteis para detectar uma família de novos RNAs mitocondriaishumanos, referidos como RNAs quiméricos mitocondriais, que sãoexpressados diferencialmente em células em repouso e de proliferaçãonormais, células pré cancerosas e cancerosas.
RNAs quiméricos mitocondriais de sentidoEm um aspecto desta invenção as composições e os métodossão fornecidos para detectar um RNA quimérico mitocondrial compreendidode uma repetição invertida de 815 nucleotídeos unidos covalentemente àextremidade 5’ do RNA ribossômico mitocondrial 16S (SEQ ID NO 1). Arepetição invertida corresponde a um fragmento de 815 nucleotídeos do RNAtranscrito do filamento L do gene 16S do mtDNA.
Assim, a síntese destenovo RNA requer a transcrição do filamento L e do filamento H do gene 16Sdo mtDNA. Visto que a transcrição de ambos os filamentos do mtDNA éregulada por promotores diferentes, referimos a este novo RNA na presente invenção como o RNA quimérico mitocondrial (SEQ ID NO 1). Além disso,visto que a repetição invertida de 815 nucleotídeos é unida ao RNA 16S “desentido” (transcrito do filamento H) referimos a este novo RNA como o“RNA quimérico mitocondrial de sentido”.
Esta invenção fornece métodos e composições para detectar aexpressão do RNA quimérico mitocondrial de sentido em células cultivadas,em amostras de célula e em seções de tecido. A detecção pode ser realizadapor hibridização in situ,síntese do cDNA correspondente e amplificação porPCR, amplificação mediada por transcrição (TMA) (Comanor et al.,J. ClinVirol., 28: 14 a 26, 2003) ou Northern blot ou outros métodos evidentes auma pessoa habilitada na técnica.Em um aspecto desta invenção, os ensaios de hibridização insiturevelaram que o RNA quimérico mitocondrial de sentido é expressado emcélulas proliferativas normais, em células tumorosas em cultura assim comoem células tumorosas presentes em biópsias humanas de tipos de tumordiferentes.
O RNA quimérico mitocondrial de sentido não é expressado emcélulas em repouso normais. Ainda em uma outra forma de realização dainvenção, os métodos e as composições são fornecidos para detectar umsegundo novo RNA quimérico mitocondrial de sentido nas célulastransformadas com o papiloma vírus 16 ou 18 (Hausen, Biochim. Biophys.Acta, 1288: F55 a F78, 1996). Nestas células transformadas, um RNAquimérico mitocondrial de sentido novo que compreende uma repetiçãoinvertida de 754 nucleotídeos unidos covalentemente à extremidade 5’ doRNA mitocondrial 16S é expressado (SEQ ID NO 2). Este RNA não estápresente em células proliferativas normais ou em células tumorosas. Osmétodos e composições também demonstraram que um terceiro RNAquimérico mitocondrial de sentido, compreendendo uma repetição invertidade 694 nucleotídeos unidos covalentemente à extremidade 5’ do RNAmitocondrial 16S (SEQ ID NO 3), está presente em células transformadas
RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido
Esta invenção também fornece métodos e composições querevelaram que as células proliferativas normais sobrexpressam um RNAquimérico mitocondrial de anti-sentido correspondendo a SEQ ID NO 4, SEQID NO 5, SEQ ID NO 6. Estes transcritos contêm repetições invertidas decomprimento variável (transcrito do filamento H) unidos à extremidade 5 ’ doRNA ribossômico mitocondrial 16S de anti-sentido (transcrito do filamentoL), consequentemente o nome do RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido.
A expressão do RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido éinfrarregulada em linhagens de célula tumorosa em cultura assim como emcélulas tumorosas presentes em biópsias humanas de diferentes tipos detumores assim como em células transformadas ou pré cancerosas.Consequentemente, a presente invenção fornece métodos e composição paradetectar a expressão dos RNAs quiméricos mitocondriais de sentido e de anti-sentido, distinguindo as células proliferativas normais das células cancerosase pré cancerosas e fornece portanto um novo marcador para as célulasmalignas e câncer.
Terapia do câncer
Em um outro aspecto desta invenção, os métodos e ascomposições são fornecidos para interferir com os RNAs quiméricosmitocondriais de sentido e de anti-sentido.
Uma forma de realização preferidaé interferir com o RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido em célulastumorosas que contêm número de cópia inferior deste transcrito. Ainterferência é realizada com os oligonucleotídeos ou análogos deoligonucleotídeo, cujas seqüências são complementares às seqüências doRNA quimérico mitocondrial de anti-sentido (SEQ ID NO 4 e/ou SEQ ID NO5 e/ou SEQ ID NO 6).
O tratamento das células tumorosas de tipos diferentescom um ou mais destes oligonucleotídeos complementares induz a morte T . Kcelular ou apoptose. Os oligonucleotídeos são compostos de 15 a 50nucleotídeos onde pelo menos 15 nucleobases são complementares a SEQ IDNO 4 e/ou SEQ ID NO 5 e/ou SEQ ID NO 6.
Os exemplos destesoligonucleotídeos complementares são mostrados nas SEQ ID NOS 9 a 98. Aindução de apoptose é seletiva visto que o tratamento de linfócitos humanos(célula em repouso normal) ou os linfócitos humanos estimulados comfitoemaglutinina (células proliferativas normais) não sofrem apoptose depoisdo tratamento com os oligonucleotídeos complementares às seqüências doRN A quimérico mitocondrial de anti-sentido sob as mesmas condições.
Se ascélulas tumorosas são tratadas com oligonucleotídeos alvejados oucomplementares ao RNA quimérico mitocondrial de sentido (SEQ ID NO 1e/ou SEQ ID NO 2 e/ou SEQ ID NO 3) uma indução diminuída de mortecelular ou apoptose é obtida.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
FIGs. IA, B e C. Os desenhos gráficos que apresentam aestrutura dos RNAs quiméricos mitocondriais de sentido correspondem aSEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 e SEQ ID NO 3.As setas indicam a posição relativa dos iniciadores usados paraamplificar o RNA em partes.
As setas abaixo das linhas são iniciadoresreversos e as setas no topo das linhas são iniciadores dianteiros. O iniciador 1é posicionado junto à extremidade 5’ do RNA mitocondrial 16S.
As linhaspretas correspondem ao RNA mitocondrial 16S de sentido, enquanto que aslinhas pontilhadas correspondem ao RNA mitocondrial 16S de anti-sentido.Fig. 2. A eletroforese em gel de agarose mostra o produto deamplificação obtido entre o iniciador 1 e o iniciador 3 indicado na FIG. 1 A. Aamplificação foi realizada por RT-PCR usando como padrão uma célulatumorosa (SiHa), queratinócitos humanos transformados com HPV 16(HFK698) ou linfócitos B transformados com HTLV-1.
Com o RNA dascélulas SiHa apenas um único amplicon de 210 pb foi obtido e corresponde a um segmento da SEQID NO 1. No RNA total dos queratinócitostransformados com HPV 16, além do amplicon de 210 pb, um segundoamplicon de 150 pb foi obtido e corresponde a um segmento da SEQ ID NO2. Com o RNA das células transformadas com HTLV-1, além dos ampliconsde 210 pb e 150 pb, um terceiro amplicon foi obtido e corresponde a umsegmento da SEQ ID NO 3.FIG. 3. Os desenhos gráficos que apresentam a estrutura dosRNAs quiméricos mitocondriais de anti-sentido correspondem a SEQID NO4, SEQ ID NO 5 e SEQID NO 6. As setas representam o iniciador usado paraa amplificação e o iniciador 1 é posicionado junto à extremidade 5 ’ do RNAmitocondrial 16S de anti-sentido.
A estratégia para se obter a sequência destestranscritos é similar àquela descrita na Fig. 1.FIGs. 4A e 4B. Ensaios de hibridização in siturealizados comvárias linhagens de célula tumorosa em cultura. As células foram hibridizadascom sondas de oligonucleotídeo complementares ao RNA quiméricomitocondrial de sentido e rotuladas com digoxigenina (painéis esquerdos).Além disso, as células também foram hibridizadas em paralelo com as sondasde oligonucleotídeo complementares ao RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido rotulado com digoxigenina (painéis direitos).
As linhagens celularessão identificadas na esquerda.FIG. 5A. Hibridização in situde várias seções das biópsiashumanas correspondendo aos tipos de tumor diferentes.
As seções tumorosasforam hibridizadas com sondas de oligonucleotídeo complementares ao RNAquimérico mitocondrial de sentido e rotuladas com digoxigenina (painéisesquerdos). Além disso, as seções tumorosas em paralelo foram hibridizadascom sondas de oligonucleotídeo complementares ao RNA quiméricomitocondrial de anti-sentido rotulado com digoxigenina (painéis direitos). AFig. 5B é a hibridização in situde tumores humanos diferentes realizados comsondas de oligonucleotídeo complementares ao RNA quimérico mitocondrial de sentido rotulado com digoxigenina.FIG. 6 Hibridização in situ de células proliferativas normais.
As amostras foram hibridizadas com sondas alvejadas ao RNA quiméricomitocondrial de sentido ou anti-sentido e rotuladas com digoxigenina. O sinalde hibridização forte foi obtido com ambas as sondas, uma complementar aoRNA quimérico mitocondrial de sentido (painéis esquerdos) assim como aoRNA quimérico mitocondrial de anti-sentido (painéis direitos). Os tecidos oucélulas são identificados na esquerda.FIG. 7 Imunocitoquímica e hibridização in situparaapresentar mudanças na expressão em linfócitos humanos estimulados paraproliferar com o PHA de mitógeno. Depois de 48 horas de estimulação comPHA, os linfócitos expressam os antígenos Ki-67 e PCNA (painéis direitos).Estes antígenos não são expressados nos linfócitos de controle ou em repouso(painéis esquerdos).
A hibridização in situfoi realizada com sondas deoligonucleotídeo alvejadas ao RNA quimérico mitocondrial de sentido e anti-sentido e rotuladas com digoxigenina. Os linfócitos estimuladossobrexpressam o RNA quimérico mitocondrial de sentido assim como o deanti-sentido (painéis direitos).FIG. 8 Hibridização in situde células tumorosas apresentandolocalização do RNA quimérico mitocondrial de sentido no nucléolo.
Asseções celulares ou tumorosas são indicadas na esquerda.FIG. 9 Microscopia fluorescente para revelar as mudanças queocorrem nas células HL-60 tumorais tratadas com sondas deoligonucleotídeos alvejadas ao RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido.A, B, C e D mostram manchamento com um composto (VAD-fmok) que seliga com afinidade alta às caspases ativadas.
Este composto é rotulado comfluoresceína. As sondas de oligonucleotídeo alvejadas ao RNA quiméricomitocondrial de anti-sentido induzem a ativação das caspases na maneirasimilar que não o medicamento estaurosporina (comparar B e C). As caspases ativadas não são detectadas nas células não tratadas de controle (A) ou nas células tratadas com sondas de oligonucleotídeo alvejadas ao RNA mitocondrial 12S (D), como controle. E e F mostram manchamento das células HL-60 com DAPL As células de controle (não tratadas) mostram5 manchamento homogêneo do núcleo (E), enquanto que as células tratadas com as sondas de oligonucleotídeo alvejadas ao RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido apresentam fragmentação maciça do núcleo (F).FIG. 10 Porcentagem de células apoptóticas depois decondições de tratamento diferentes de linfócitos em repouso e de proliferação.10 A apoptose foi medida nos linfócitos em repouso ou linfócitos estimulados por PHA por manchamento com DAPI.
As barras 1 e 2 correspondem às células não tratadas. Uma apoptose espontânea inferior do controle (1) ou linfócitos estimulados por PHA (2) foi observada. Um nível baixo similar de apoptose foi observado nos linfócitos em repouso (3) ou linfócitos15 estimulados por PHA (4) tratados com sondas de oligonucleotídeo de 15 uM alvejadas ao RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido durante 15 horas, mostrando que a apoptose não é induzida em células normais.
Como um controle, os linfócitos em repouso e o linfócito estimulado por PHA foram tratados com estaurosporina. Sob estas condições, em tomo de 90 % de20 linfócitos em repouso (5) ou linfócitos estimulados por PHA (6) sofrem apoptose.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A família de RNA quimérico mitocondrial humano
A presente invenção é fundamentada na descoberta 25 surpreendente de que as células humanas expressam uma família de novos RNAs mitocondriais, referidos como os RNAs quiméricos mitocondriais humanos.Um destes transcritos contém uma repetição invertida longa de815 nucleotídeos co valentemente unidos à extremidade 5’ do RNA ribossômico 16S mitocondrial, denominado RNA quimérico mitocondrial desentido.
A repetição invertida longa é completamente complementar ao RNAribossômico 16S das posições 51 a 866, formando um ramo de filamentoduplo longo e uma alça de 50 nucleotídeos. Como mostrado na Fig. IA, oramo de 815 pares de bases representa um problema significante paraqualquer transcriptase reversa para sintetizar o cDNA correspondente.Portanto uma nova estratégia foi usada para amplificar este RNA pela RT-PCR que é ilustrada na Fig. IA. Depois de se obter a seqüência de cadafragmento sobreposto, eles foram construídos como contíguos para obter aseqüência completa do RNA quimérico mitocondrial de sentido mostrado naSEQ ID NO 1 (Fig. 1 A).
Outro aspecto desta invenção é a descoberta de outros RNAsquiméricos mitocondriais de sentido novos que são expressados em célulastransformadas com o papiloma vírus humano oncogênico 16 ou 18. Osqueratinócitos de prepúcio humano (HFK) onde infectados com HPV 16 ou18 (Hausen, Biochim. Biophys. Acta, 1288: F55 a F78, 1996). A infecçãoinduz a transformação ou imortalização do HFK. Entretanto, estas células nãosão tumorigênicas tais como as células SiHa relacionadas (infectadas comHPV 16) ou células HeLa (infectadas com HPV18).
Estas células expressam oRNA quimérico mitocondrial de sentido (SEQ ID NO 1) similar ao SiHa ecélulas HeLa. Entretanto, as células transformadas também expressam umoutro segundo RNA quimérico mitocondrial de sentido que contém umarepetição invertida de 754 nucleotídeos unidos ao RNA ribossômico 16S (Fig.IB) (SEQ ID NO 2).
Este novo RNA quimérico mitocondrial de sentido éinffarregulado ou não é expressado em células humanas normal (HFK) ou emcélulas tumorigênicas (células SiHa ou HeLa).Em uma outra forma de realização desta invenção nósdeterminamos a expressão de um terceiro RNA quimérico mitocondrial desentido em células transformada com HTLV-1 (Kobayashi et al., EMBO I, 3: 1339 a 1343, 1984).
As células MT-2 infectadas com HTLV-1 expressam oRNA quimérico mitocondrial de sentido (SEQ ID NO 1) e o RNA quiméricomitocondrial de sentido expressado em células transformada com HPV 16 ou18 (SEQ ID NO 2). Além destes transcritos, a célula infectada com HTLV-1expressa um terceiro RNA quimérico mitocondrial de sentido contendo umarepetição invertida de 694 nucleotídeos unidos à extremidade 5’ do RNAribossômico 16S. Este novo RNA (Fig. 1C) (SEQ ID NO 3) não é expressadoem células proliferativas normais, em células tumorosas ou em HFKtransformado com HPV 16 ou 18.As células proliferativas normais tais como os queratinócitosde prepúcio humano (HFK) como descrito na seção prévia tambémsobrexpressam o RNA quimérico mitocondrial de sentido (Fig. 6) (SEQ IDNO l).
Os linfócitos humanos estimulados com os mitógenos tais como afitoemaglutinina (PHA) entram na fase S do ciclo celular e começam a síntesedo DNA (Yu et al., J. Biol. Chem., 266: 7588 a 7595, 1991). Como as célulasproliferativas, os linfócitos também expressam os antígenos relacionados àproliferação tais como Ki-67 e antígeno nuclear de célula proliferativa ouPCNA (Bantis et al., Cytopathology, 15: 25 a 31, 2004). Os linfócitosestimulados também sobrexpressam o RNA quimérico mitocondrial desentido (SEQ ID NO 1).
Outras células proliferativas tais como os linfócitosno centro germinal do baço, células espermatogônias e embrionárias tambémsobrexpressam o RNA quimérico mitocondrial de sentido (SEQ ID NO 1)(Fig. 4).
Ao contrário, as células não proliferativas tais como os linfócitos nãoestimulados ou as células musculares não expressam o RNA quiméricomitocondrial de sentido (Fig. 7).Em uma outra forma de realização da invenção, os métodospara diferenciar uma célula proliferativa normal de uma célula tumorosa sãofornecidos.
Como descrito antes, as células tumorais e proliferativas normaissobrexpressam o RNA quimérico mitocondrial de sentido descrito na SEQ ID NO 1. Além disso, em situações específicas de infecção com HPV e HTLV-1,o RNA quimérico adicional é encontrado (SEQ ID NO 2 e SEQ ID NO 3).Entretanto, a presente invenção também é fundamentada na descobertasurpreendente de que as células proliferativas normais também sobrexpressamum RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido.
A expressão do RNAquimérico mitocondrial de anti-sentido foi confirmada nos linfócitos humanosestimulados com PHA (Fig. 7), em HFK normal e em outras célulasproliferativas normais (Fig. 6).
Uma outra descoberta surpreendente dapresente invenção é que diferente das células proliferativas normais, ascélulas tumorosas não expressam o RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido ou marcadamente infrarregularam a produção (comparar a Fig. 4 coma Fig. 6 e a Fig. 7).O uso da mesma estratégia para amplificar pela RT-PCR oRNA quimérico com base nos fragmentos sobrepostos descritos mais noinício, a estrutura do RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido foideterminada (Fig. 3).
O seqüenciamento e construção em contíguos revelauma família complexa de RNAs quiméricos mitocondriais de anti-sentidocontendo repetição invertida de comprimentos diferentes unidos àextremidade 5’ do RNA ribossômico mitocondrial 16S de anti-sentido (Figs.3A, B e C) (SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6).
A seqüênciatambém revela a formação de estruturas ou ramos de filamento duplo nesteRNA e a formação de laços com 17, 96 e 451 nucleotídeos, respectivamente(Fig. 3 A, B e C, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6).
Em outra forma de realização da invenção, os métodos e ascomposições são fornecidas para seguir a transformação oncogênica dascélulas por um vírus oncogênico. As células HeLa (infectadas com HPV 18)ou as células SiHa (infectadas com HPV 16) sobrexpressam o RNAquimérico mitocondrial de sentido mas infrarregulam a expressão dos RNAsquiméricos mitocondriais de anti-sentido.
Por outro lado, o HFK como as células proliferativas normais, sobrexpressam tanto os RNAs quiméricosmitocondriais de sentido assim como os de anti-sentido. Depois datransformação de HFK com HPV 16 ou HPV 18, as células adquirem ofenótipo tumoral: elas sobrexpressam o RNA quimérico mitocondrial desentido e inffarregulam a expressão do RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido.
A sobrexpressão do RNA quimérico mitocondrial de sentido einfrarregulação do RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido podem serdeterminadas por hibridização in situ,amplificação do RNA por RT-PCR oupelo uso de outros métodos para determinar um RNA por caminhos bemconhecidos à pessoa habilitada na técnica. Estes métodos e composiçõespodem ser usados também para determinar a mudança na expressão da famíliade RNA quimérico nas células transformadas com outro vírus oncogênico oupelos compostos que induzem as transformações ou carcinogênese(McKinnell et al.,“The biological basis of Cancer, Cambridge UniversityPress 1998).
Diagnósticos do câncer e pré câncer.
De acordo com a presente invenção os métodos e ascomposições são fornecidos para detectar em uma amostra biológica apresença dos RNAs quiméricos mitocondriais de sentido e os RNAsquiméricos mitocondriais de anti-sentido. Em uma forma de realizaçãopreferida, a detecção é realizada por hibridização in situ.
A detecção do RNAquimérico mitocondrial de sentido e dos RNAs quiméricos mitocondriais deanti-sentido nas células da amostra biológica indica que as células são célulasproliferativas normais. Em uma outra forma de realização, o resultado dahibridização in situcom células tumorosas mostrará a expressão do RNAquimérico mitocondrial de sentido e a infrarregulação ou ausência do RNAquimérico mitocondrial de anti-sentido.
Se a amostra biológica contém célulasnão proliferativas normais a hibridização in situmostrará que nem o RNAquimérico mitocondrial de sentido nem o RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido são expressados.As amostras biológicas são entendidas como células normais(células em repouso ou proliferativas) em cultura ou em esffegaços de sangueou esffegaços de medula óssea, células tumorosas em cultura e célulasnormais transformadas com o vírus oncogênico.
Adicionalmente, as amostrasbiológicas compreendem as células obtidas da urina ou a lavagem de bexigade pacientes suspeitando de ter câncer de bexiga ou renal ou as células dasaliva em pacientes suspeitando de ter cânceres de cabeça e pescoço ou ascélulas da lavagem broncoalveolar de pacientes suspeitando de ter câncerpulmonar. Também, as amostras biológicas compreendem os esfregaços decélulas do sangue de pacientes suspeitando de ter leucemia ou esffegaços decélula do sangue ou linfa, linfonodo de pacientes suspeitando de termetástase.
As amostras biológicas de acordo com a invenção incluem ouso de amostras de tecido ou células rapidamente congeladas para a análisehistopatológica, bem conhecida na técnica pelos técnicos no campo.Altemativamente, a amostra biológica pode ser biópsias de seções fixadaspelo uso de tratamento químico que pode ser realizado pela variedade amplade protocolos de fixação conhecidos na técnica (Frederick et al,CurrentProtocols in Molecular Biology, Volume 2, Unidade 14, Frederick M.Ausubul et al. edS., 1995; Celis, Cell Biology, A Laboratoty Handbook, JulioE. Celis, ed., 1994). As amostras biológicas também podem ser materiaisbiológicos não fixados que não foram quimicamente modificados ou tratadoscom formalina ou outro fixador bem conhecido na técnica.Altemativamente, a hibridização in situpode ser realizada pelouso de amostras biológicas embutidas em materiais tais como parafina ououtros polímeros de encaixe. Os blocos obtidos depois do encaixe podem serselecionados com um micrótomo na seção de cerca de 4 a cerca de 10 pm deespessura.
A seção depois pode ser aplicada às lâminas de vidro ou plástico revestidas com uma substância adesiva conhecida na técnica tal comopolilisina ou proteína adesiva de mexilhão (Burzio et al., Curr. Opin.Biotechnol., 8: 309 a 312, 1997).A hibridização in situda presente invenção pode ser realizadaem caminhos bem conhecidos às pessoas habilitadas na técnica.
Por exemplo,uma solução de hibridização compreendendo uma ou mais sondas rotuladasalvejadas a uma ou mais das seqüências de RNA quimérico mitocondrial desentido (SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3) ou de RNA quiméricomitocondrial de anti-sentido (SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6)dentro da célula, é contatada com a célula sob condições de hibridização. Osinal de hibridização depois é comparado com um padrão de hibridizaçãopredeterminado de células cancerosas e pré cancerosas normais ou decontrole.
Como aqui usado, as sondas rotuladas para realizar ahibridização in situsão ácidos nucléicos de RNA, DNA ou sintéticos quepodem ser preparado por qualquer método conhecido na técnica. Os ácidosnucléicos sintéticos incluem as ribossondas transcritas in vitroou fragmentosde PCR.
Em uma forma de realização preferida desta invenção, osoligonucleotídeos complementares sintéticos podem ser usados. As sondas deoligonucleotídeo complementares são pelo menos cerca de 10 nucleotídeosem comprimento, o mais preferivelmente pelo menos cerca de 14 e o maispreferivelmente pelo menos 18 nucleotídeos em comprimento.
O técnicohabilitado entende que o comprimento pode se estender de 10 nucleotídeos oumais a qualquer comprimento que ainda permita a hibridização aos RNAsquiméricos mitocondriais de sentido ou aos RNAs quiméricos mitocondriaisde anti-sentido. Em uma forma de realização preferida aqui, o comprimento écerca de 30 nucleotídeos, mais preferivelmente cerca de 25 nucleotídeos e omais preferivelmente entre 10 a 50 nucleotídeos em comprimento.
Os ácidosnucléicos de sondagem mais longos também podem ser usado. As seqüências da sonda é pelo menos noventa e cinco por cento homóloga às seqüênciaslistadas na SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQID NO 5 e SEQ ID NO 6.
As sondas de oligonucleotídeo complementares da presenteinvenção no geral conterão ligações de fosfodiéster, embora em alguns casos,os análogos de sonda de oligonucleotídeos são incluídos que podem terligações de nucleosídeo internas alternadas, compreendendo, mas nãolimitadas a, fosforotioato (Mag et al.,Nucleic Acids Res. 19: 1437 a 1441,1991; e Pat. U.S. 5.644.048), ácido nucléico de peptídeo ou PNA (Egholm,Nature, 365: 566 a 568, 1993; e Pat. U.S. 6.656.687), fosforamida (Beaucage,Methods Mol. Biol. 20: 33 a 61, 1993), fosforoditioato (Capaldi et al.,Nucleic Acids Res., 28: E40, 2000). Outros análogos de oligonucleotídeoscomplementares incluem tais como, mas não limitados a, morfolino(Summerton, Biochim. Biophys. Acta, 1489: 141 a 158, 1999),oligonucleotídeos bloqueados (Wahlestedt et al.,Proc. Natl. Acad. Sei. US,97: 5633 a 5638, 2000), ácidos nucléicos peptídicos ou PNA (Nielsen et al.,1993; Hyrup e Nielsen, 1996) ou oligonucleotídeos de extremidade 5’ e 3’modificados por 2-o-(2-metóxi)etila (McKay et al.,J. Biol. Chem., 274: 1715a 1722, 1999). Todas destas referências são por meio desta expressamenteincorporadas por referência. O ácido nucléico pode conter qualquercombinação de desoxirribo- e ribo-nucleotídeos e qualquer combinação debases, incluindo uracila, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xantaninahipoxantanina, isocitosina, isoguanina, etc.
Em uma outra forma de realização da invenção, o ácidonucléico ou sondas de oligonucleotídeo foram rotulados para detectar ahibridização com os RNAs quiméricos mitocondriais de sentido ou os RNAsquiméricos mitocondriais de anti-sentido. As sondas podem ser rotuladas comum marcador detectável por qualquer método conhecido na técnica.
Osmétodos para rotular as sondas incluem impressão aleatória, rotulagem final, PCR e tradução de entalhe. A rotulagem enzimática é conduzida na presençade polimerase de ácido nucléico, três nucleotídeos não rotulados e um quartonucleotídeo que é diretamente rotulado, contém um braço ligador para ligarum rótulo ou é ligado a um hapteno ou outra molécula à qual uma moléculade ligação rotulada pode ligar-se.
Os rótulos diretos adequados incluem osrótulos radioativos tais como, sup.32 P, .sup.3 H, e .sup.35 S e rótulos nãoradioativos tais como os marcadores fluorescentes.
Os fluorocromospreferidos (fluoróforos) incluem 5(6)-carboxifluoresceína, ácido 6-((7-amino-4-metil-coumarina.-3 -acetil)amino)hexanóico, 5 (e 6)-carbóxi-X-rodamina,Corante de Cianina 2 (Cy2), Corante de Cianina 3 (Cy3), Corante de Cianina3,5 (Cy3,5), Corante de Cianina 5 (Cy5), Corante de Cianina 5,5 (Cy5,5),Corante de Cianina 7 (Cy7), Corante de Cianina 9 (Cy9) (os corantes deCianina 2, 3, 3,5, 5 e 5,5 estão disponíveis como ésteres de NHS daAmersham, Arlington Heights, III.) ou os corantes de Alexa compreendendoAlexa 488, Alexa 532, Alexa 556, Alexa 590, etc. (Molecular Probes, Eugene,Oreg.).
As sondas podem ser indiretamente rotuladas incorporando-seum nucleotídeo covalentemente ligado a um hapteno ou outra molécula. Oshaptenos preferidos, mas não limitados a, incluem 5(6)-carboxifluoresceína,2,4-dinitrofenila, digoxigenina e biotina e realizam a detecção da sonda comum anticorpo rotulado direcionado àquele hapteno ou outra molécula.
No casoda biotina, a detecção pode ser realizada com avidina ou estreptavidinaconjugadas a um rótulo detectável. Os anticorpos, estreptavidina e avidinapodem ser conjugados com um marcador fluorescente ou com um marcadorenzimático tal como fosfatase alcalina ou peroxidade de rábano para tomá-losdetectáveis.
A estreptavidina, avidina e anticorpos anti-digoxigeninaconjugados estão comercialmente disponíveis das companhias tais comoVector Laboratories (Burlingame, Calif.) e Boehringer Mannheim(Indianapolis, Ind.).
Em uma outra forma de realização, os anticorpos ou a estreptavidina podem ser conjugados ao ponto quântico com emissão defluorescência superior e mais estável (Wu et al.,Nature Biotechnol. 21: 41 a46, 2003).A enzima nos conjugados de anticorpos e estreptavidina podeser detectada através de uma reação calorimétrica fomecendo-se um substratopara a enzima.
Na presença de vários substratos, cores diferentes sãoproduzidas pela reação e estas cores podem ser visualizadas para detectarseparadamente as sondas múltiplas. Qualquer substrato conhecido na técnicapode ser usado.
Os substratos preferidos para a fosfatase alcalina incluemfosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolila (BCIP) e nitro azul de tetrazólio (NBT).O substrato preferido para a peroxidade de rábano é o diaminobenzoato(DAB). Aqueles habilitados na técnica entendem que outras atividadesenzimáticas também podem ser usadas.
Em uma outra forma de realização da presente invenção, ascondições para realizar a hibridização in situpara obter resultados exatos ereproduzíveis são descritas. Aqueles de habilidade comum na técnica dehibridização de ácido nucléico reconhecerão que os fatores comumenteusados para controlar a severidade da hibridização incluem concentração deformamida ou outro reagente químico desnaturante, a concentração de sal ouforça iônica variável, temperatura de hibridização, concentração dedetergente, pH e a presença ou ausência de agentes caotrópicos.
Estes fatoresde severidade pode ser modulados para controlar desse modo a severidade dehibridização das sondas de oligonucleotídeo para o RNA quimérico. Aseveridade ótima para um ensaio pode ser experimentalmente determinadapor examinação de cada fator de severidade até que o grau desejado dediscriminação seja obtido.
Outras condições que devem ser controlada para a hibridizaçãoin situótima são por exemplo o uso de agente químico para bloquear a ligaçãonão específica da sonda aos componentes presentes nas amostras biológicasoutros que não os RNAs quiméricos alvo. O agente de bloqueio, mas nãolimitado a, são RNA, DNA ou oligonucleotídeos sem um rótulo.
O agente debloqueio incorporado na solução de hibridização suprimirá a ligação nãoespecífica da sonda rotulada e conseqüentemente, aumentará o sinal pararazão de ruído do ensaio. Ainda em um outro aspecto da invenção, a sondatem uma seqüência complementar à seqüência dos RNAs quiméricosmitocondriais de sentido ou anti-sentido (ver as SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2,SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 6).
A fixação da seqüência biológica também é um aspectoimportante de hibridização in situque deve ser determinadoexperimentalmente. O fixador altamente reticulante tal como glutaraldeídonão é recomendado visto que ele pode bloquear o acesso da sonda ao RNAquimérico mitocondrial de sentido ou RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido alvos.
O método preferido desta invenção é fixar a amostra biológicacom formalina, embora as amostras congeladas também sejam preferidas.Para expor os RNAs quiméricos mitocondriais de sentido ou o RNAquimérico mitocondrial de anti-sentido à sonda rotulada, procedimentosadicionais podem ser usados.
Por exemplo, a amostra biológica pode serdigerida com a proteinase K para remover as proteínas que podem bloquear oacesso da sonda aos RNAs quiméricos alvos. O tratamento das amostrasbiológicas com proteinase K ou outras proteases anterior à hibridização in situé bem conhecido para aqueles técnicos no ramo.
Como descrito antes, a presença de repetições invertidaslongas no RNA quimérico e nos RNAs quiméricos de anti-sentido, induz aformação de estruturas de filamento duplo altamente estáveis. Estas estruturasjunto com as estruturas secundárias da região de filamento único dos RNAsquiméricos podem constituir barreiras para o acesso da sonda aos RNAsquiméricos alvos.
Portanto, em um outro aspecto da invenção, a amostrabiológica é tratada com HC1 0,2 M durante 10 min na temperatura ambiente para desnaturar o RNA quimérico. Depois a amostra é rapidamenteneutralizada por várias lavagens com um solução tampão no pH 7,4 antes deaplicar o protocolo de hibridização in situaqui descrito.
Auxiliado por nãomais do que a experimentação de rotina e a divulgação fornecida aqui,aqueles de habilidade na técnica serão facilmente capazes de determinar ascondições de hibridização adequadas para realizar os ensaios utilizando osmétodos e as composições descritas aqui. As condições de hibridização in situadequadas são aquelas condições adequadas para realizar um procedimento dehibridização in situ.
Assim, as condições de hibridização in situadequadastomar-se-ão evidente usando a divulgação e referências aqui; com ou semexperimentação de rotina adicional.Em uma outra forma de realização da presente invenção, alocalização dos RNAs quiméricos mitocondriais de sentido como determinadopela hibridização in situpode ter informação importante para o prognóstico emanejo do paciente com câncer.
Em células tumorosas, o RNA quiméricomitocondrial de sentido é encontrado a maioria das vezes no citoplasma emassociação limitada com os últimos endossomas/lisossomas. Entretanto, alocalização no nucléolo também é encontrada em certas células.
Em célulastumorosas presentes em biópsias humanas, o sinal de hibridização revela queo RNA quimérico mitocondrial de sentido está no citoplasma apenas ou nocitoplasma e no nucléolo ou no citoplasma e no núcleo. Portanto aslocalizações diferentes podem ter um valor de prognóstico importante.
Emuma forma de realização preferida, o quadro das biópsias humanas, porexemplo de tumores de mama, colorretal ou de próstata, pode ser estudadopela hibridização in situpara detectar o RNA quimérico. Junto com o sinal dehibridização positivo (independente de como a sonda foi rotulada), alocalização intracelular (apenas citoplasma, citoplasma e núcleo oucitoplasma e nucléolo) deve ser estabelecida em cada tumor e os resultadoscomparados com a sobrevivência de cada paciente.
Em um outro aspecto desta invenção, a mistura de célulasindividuais contendo células normais e/ou tumorosas pode ser submetida àhibridização em suspensão com sondas de oligonucleotídeo rotuladas comfluorocromos e complementares ao RNA quimérico mitocondrial de sentido eao RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido. Por exemplo a sonda ou assondas alvejadas ao RNA quimérico mitocondrial de sentido podem serrotuladas com rodamina e a sonda ou sondas alvejadas ao RNA quiméricomitocondrial de anti-sentido podem ser rotuladas com Alexa 488.
Depois dahibridização e lavagem sob as condições descritas antes, as células podem seranalisadas por citometria de fluxo de rotulagem intracelular.A forma de realização preferida da invenção é usar ahibridização in situvisto que a informação obtida a cerca da localizaçãoespecífica do RNA quimérico na célula tumorosa fornece informaçãoadicional importante de prognóstico.
Ainda em uma outra forma de realização da invenção, osmétodos moleculares alternativos podem ser usados para detectar a expressãodo RNA quimérico e a expressão diferencial do RNA quimérico de sentido eanti-sentido em células normais, pré cancerosas e cancerosas. Estes métodosalternativos incluem, mas não são limitados a, Northern blot, dot blot,arranjos de oligonucleotídeo para o RNA quimérico e os RNAs quiméricos deanti-sentido, amplificação do RNA por RT-PCR, amplificação do RNA poramplificação in vitromediada por transcrição ou TMA, SI ou ensaios deproteção de ribonuclease, etc.
Em uma forma de realização da presente invenção, o RNAquimérico mitocondrial de sentido pode ser detectado para propósitos dediagnóstico com uma sonda obtida por amplificação de uma região quecontém parte da extremidade 5’ do RNA ribossômico 16S e uma regiãoparcial ou completa da repetição invertida. Como mostrado na Fig. 1, oiniciador reverso pode ser por exemplo o iniciador 1 (SEQ ID NO 139) e os iniciadores dianteiros podem ser os iniciadores 3, 4, 5, 6 ou 7 (SEQ ID NOS129, 116, 106, 102, 63).
Os iniciadores localizado em outras posições tambémpodem ser usados e eles são facilmente designados por aqueles habilitados natécnica. Em um outro aspecto desta invenção, o cDNA que pode sersintetizado com uma enzima com atividade de transcrição reversa einiciadores aleatórios tais como hexâmeros ou mais longos, familiares àqueleshabilitados na técnica.
Os amplicons de 210, 350, 500 ou 850 pb obtidos ou de outrostamanhos que resultam usando-se os iniciadores localizados em outrasposições, podem ser detectados por eletroforese em gel em gel de agarose ougéis de poliacrilamida (Sambrook et al., 1989) e manchamento com brometode etídio ou outros corantes de intercalação.
Os amplicons podem serpurificados de acordo com os fabricantes instrutivos.A detecção do RNA quimérico mitocondrial pode ser realizadapela análise de Northern blot (Sambrook et al., 1989).
Depois da separaçãodos RNAs em um gel de agarose, os fragmentos são transferidos a umamembrana (nitrocelulose ou Náilon) por procedimentos bem conhecidosàqueles habilitados na técnica (Sambrook et al., 1989).
Para sondar asmembranas, um fragmento de 250 pb correspondendo à posição 1000 a 125do RNA quimérico mitocondrial de sentido pode ser amplificado. O ampliconé purificado (Wizard, Promega) de acordo com a instrução do fabricante e 10nanogramas são usados como padrão para uma segunda amplificação.
Estaamplificação é realizada com a mistura de PCR padrão (Invitrogen) mais 5micro Curie de 32P-a-dCTP (Amerscham). O fragmento de amplificaçãoradioativa é desnaturado por incubação a 95 °C durante 10 minutos e a sondadesnaturada foi adicionada à mistura de hibridização.
As membranas sãohibridizadas durante 16 horas a 65 °C e depois lavadas duas vezes com 2 vezesde tampão SSC, duas vezes com 0,5 de SSC a 60°C e 0,2 de SSC a 45°C(Sambrook et al., 1989).
A membrana lavada foi exposta à película de raio X durante a noite a -70°C (Sambrook et al., 1989).
O sinal de hibridização na membrana corresponde a um componente principal de cerca de 2.400 nucleotídeos que é o tamanho que corresponde ao RNA ribossômico 16S (1559 nucleotídeos) mais a repetição invertida de 815 nucleotídeos.
Em uma outra forma de realização da invenção, parte do RNAquimérico mitocondrial de sentido pode ser detectada depois da digestão de ribonuclease de RNA total extraído das células ou tecidos. A estrutura de filamento duplo ou o ramo do RNA quimérico mitocondrial de sentido é resistente à digestão com ribonuclease A.
O RNA total das células ou tecidos 010 extraído com TriZol (Invitrogen) é dissolvido em um volume pequeno de 2 vezes SSC. A solução é incubada com ribonuclease A (Sigma) em uma concentração final de 50 microgramas por ml.
Depois de 30 min a 25°C, o RNA resistente à nuclease é extraído com TriZol e precipitado com isopropanol a -20°C durante a noite. O RNA resistente à nuclease é dissolvido 15 em água tratada com DEPC destilada e usado como padrão para a amplificação por RT-PCR.
Esta amplificação, realizada com os iniciadores alvejados às posições 55 e 790 do RNA ribossômico 16S, produz um fragmento de cerca de 730 pares de bases com uma sequência que apresenta 100 % de identidade com a sequência do ramo do RNA quimérico 20 mitocondrial de sentido (SEQ ID NO 1). Ao contrário, o filamento único do RNA quimérico e correspondendo à metade 3’ ou o RNA ribossômico mitocondrial 12S ou o RNA ribossômico 18S ou então o RNA para GAPDH são totalmente digeridos pelo tratamento com a ribonuclease A e portanto, nenhum produto de amplificação é obtido quando os iniciadores alvejados a 25 estes RNAs são usados.
Em um outro aspecto da invenção, o ramo do RNA quimérico mitocondrial de sentido obtido depois do tratamento do RNA total com a ribonuclease A pode ser detectado por Northern blot. O RNA resistente à nuclease e recuperado por extração com TriZol e precipitação com isopropanol, é separado por eletroforese em um gel de agarose.
Depois datransferência, a membrana é blotted com a sonda descrita antes e usada paraNorthern blot (Sambrook et ál.,Vfà9) para o RNA quimérico mitocondrial desentido.Ainda em uma outra forma de realização, esta invenção édirecionada aos kits adequados para realizar um ensaio que detecta os RNAsquiméricos mitocondriais de sentido ou o RNA quimérico mitocondrial deanti-sentido em amostras biológicas.
O geral e a forma de realizaçãopreferida, as composições e os métodos são fornecidos que são adequadospara a detecção do RNA quimérico e do RNA quimérico de anti-sentido porhibridização in situforam previamente descritos aqui. As seqüências desondas de oligonucleotídeo preferidas, mas não limitadas a, são listadas. Alémdisso, os métodos adequados para usar as sondas de oligonucleotídeo ougrupo de sondas de oligonucleotídeo de um kit para detectar os RNAsquiméricos ou os RNAs quiméricos de anti-sentido em uma amostra forampreviamente descritos aqui.O kit desta invenção compreende uma ou mais sondas deoligonucleotídeo e outros reagentes ou composições que são selecionadospara realizar a hibridização in situusada para detectar os RNAs quiméricosmitocondriais de sentido ou os RNAs quiméricos mitocondriais de anti-sentido em uma amostra.
Cada grupo de duas ou mais sondas deoligonucleotídeo é preferivelmente rotulado com porções detectáveisindependentes de modo que em uma célula individual da amostra biológica osRNAs quiméricos mitocondriais de sentido ou os RNAs quiméricosmitocondriais de anti-sentido podem ser detectados. Em uma forma derealização preferida, as sondas de oligonucleotídeo do kit que é usado paradetectar os RNAs quiméricos mitocondriais de sentido ou os RNAsquiméricos mitocondriais de anti-sentido são cada rotuladas por grupo comum hapteno diferente. O hapteno pode ser biotina, digoxigenina ou fluoresceína que podem ser reconhecidos no método de hibridização in situ com anticorpos ou estreptavidina rotulados com enzimas diferentes (por exemplo, fosfatase ou peroxidase alcalina).
Altemativamente, cada sonda de oligonucleotídeo de cada grupo de sondas pode ser rotulada com grupos 5 fluorescentes detectáveis independentes. Por exemplo, o grupo de sondas de oligonucleotídeos para detectar o RNA quimérico mitocondrial de sentido pode ser rotulado com rodamina, enquanto que o grupo de sondas de oligonucleotídeos para detectar os RNAs quiméricos mitocondriais de anti- sentido pode ser rotulado com Alexa 488. Além disso, os métodos são 10 fornecidos para determinar a localização do RNA quimérico ou dos RNAsquiméricos de anti-sentido em células da amostra biológica. Adicionalmente, as composições e os métodos da invenção podem ser usados para determinar a co-localização do RNAs quiméricos ou dos RNAs quiméricos de anti-sentido com marcadores específicos das organelas celulares diferentes, pelo uso de 15 análise de microscopia confocal.
As composições e os métodos fornecidos aqui são considerados particularmente úteis para a detecção e diagnóstico de pré câncer e câncer. O termo câncer como fornecido aqui, inclui as células afligidas por qualquer uma das condições anômalas identificadas seguintes. 20 Estas incluem leucemia mielóide aguda ou crônica, leucemia linfoblástica aguda ou crônica, mieloma múltiplo, doença de Hodgkin, linfoma que não de Hodgkin ou linfoma maligno; carcinoma estomacal, carcinoma esofágico ou adenocarcinoma, adenocarcinoma dutal pancreático, insulinoma, glucagonoma, gastrinoma, adenocarcinoma de intestino pequeno, carcinomas 25 colorretais; carcinoma hepatocelular, adenoma hepatocelular; carcinóides, trato genitourinário tal como adenocarcinoma renal, tumor de Wilm, carcinoma de bexiga e uretra e adenocarcinoma prostático, câncer de testículo como seminoma, teratoma, teratocarcinoma, carcinoma de célula intersticial; carcinoma endometrial do útero, carcinoma cervical, carcinoma ovariano, carcinoma de vulva e vagina, tumores de célula de Sertoli-L-eydig, melanomae carcinoma das trompas de falópio; carcinomas pulmonares, alveolares ebronquiolares; tumores cerebrais; melanoma maligno de pele, carcinoma decélula basal, carcinoma de célula escamosa e sarcoma de Karposi.
Tambémfibrossarcoma, angiossarcoma e rabdomiossarcoma do coração e outrasmalignidades que são familiares àqueles habilitados na técnica.
Terapia do câncer e pré câncer
Os medicamentos quimioterapêuticos podem induzir uma sériede respostas celulares que sofre impacto na proliferação e sobrevivência decélula tumoral.
A mais estudada destas respostas celulares é a apoptose e éevidente no momento que os medicamentos anti-câncer podem matar ascélulas tumorosas ativando-se caminhos apoptóticos comuns. Infelizmente,estes medicamentos também afetam rapidamente as células normais dedivisão da medula óssea, células hematopoiéticas e intestinais normais equeratinócitos da matriz capilar (McKinnell et al,,The biological Basis ofcancer, 1998; Komarov et al., Science 285 : 1733 a 1737, 1999; Johnstone etal., Cell 108: 153 a 164, 2002).Por outro lado, muitas células tumorosas têm fatoresiniciadores apoptóticos mutados, fatores reguladores e fatores executores deapoptose, que explicam porque a célula tumorosa de diferentes tipos de câncertoma-se resistente a uma variedade de medicamentos quimioterapêuticos e àradiação.
As mutações foram relatadas dos fatores do caminho intrínseco,eventos pós mitocondriais e caminho extrínseco de apoptose (Rampino et al,,Science 275: 967 a 969, 1997; Vogelstein et al.,Nature 408: 307 a 310, 2000;Teitz et al.,Nature Med. 6: 529 a 535, 2000; Reed, J. Clin. Oncol., 17: 2941 a2953, 1999; Johnston et al., Cell 108: 153 a 164, 2002). Portanto, umaparadigma de um tratamento de terapia do câncer é um procedimento queseletivamente provoca a apoptose de células tumorosas, que não alteram ascélulas proliferativas normais e que desviam os fatores alterados ou mutados dos caminhos apoptóticos diferentes.
As composições e os métodos da presente invenção, sãofundamentados na descoberta de que as células tumorosas e pré tumorosassobrexpressam o RNA quimérico mitocondrial de sentido em níveis similaresdas células proliferativas normais. Entretanto, e ao contrário das célulasproliferativas normais, as células tumorosas e pré tumorosas infrarregulam aexpressão do RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido.As estruturas destes transcritos são mostradas na Fig. 1 e Fig. 3e as seqüências correspondentes nas SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ IDNO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 6.Ao contrário, e constituindo uma outra descobertasurpreendente, as células pré tumorosas e tumorosas sobrexpressam o RNAquimérico mitocondrial de sentido e infrarregulam a expressão do RNAquimérico mitocondrial de anti-sentido.
A supressão ou inibição da síntese doRNA quimérico mitocondrial de anti-sentido em células pré tumorosas etumorosas constitui uma nova diferença no fenótipo entre uma célulacancerosa e uma célula proliferativa normal, que é considerada como uma dasformas de realização principais da presente invenção. Além disso, as célulastumorosas em biópsias humanas de diferentes tipos de câncer, tambémexibem o mesmo fenótipo das células cancerosas em cultura (Figs. 5A e 5B).
Embora a função do RNA quimérico mitocondrial de sentido edo RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido não seja clara, umacorrelação restrita existe entre a expressão destes RNAs e a proliferaçãocelular. Por exemplo, as células proliferativas normais nos tecidos comofígado, rim e baço e definidos como tais pela expressão dos antígenos taiscomo Ki-67, PCNA ou histona H3 fosforilada, sobrexpressam o RNAquimérico mitocondrial de sentido assim como o RNA quiméricomitocondrial de anti-sentido. Nas células não proliferativas dos mesmostecidos, que não expressam Ki-67 ou PCNA, o RNA quimérico mitocondrial de sentido e o RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido não sãoexpressados.
Além disso e como ilustrado na Fig.7, os linfócitos humanosestimulados com o mitógeno PHA sintetizam o DNA e expressam osantígenos proliferativos Ki-67 e PCNA.
Os linfócitos estimulados tambémsobrexpressam o RNA quimérico mitocondrial de sentido assim como o RNAquimérico mitocondrial de anti-sentido (Fig. 7). Ao contrário, os linfócitos emrepouso ou os linfócitos não estimulados não expressam nem o RNAquimérico mitocondrial de sentido nem o RNA quimérico mitocondrial deanti-sentido.A descoberta prévia, que é uma parte fundamental da presenteinvenção, mostra que enquanto as células proliferativas normais expressam osRNAs quiméricos mitocondriais de sentido e de anti-sentido, as célulastumorosas expressam o RNA quimérico mitocondrial de sentido einfrarregulam a expressão do RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido.
Para entender a função destes RNAs na proliferação celular, as célulascancerosas em cultura foram tratadas com os oligonucleotídeos de anti-sentido alvejados aos RNAs quiméricos mitocondriais de sentido (SEQ IDNO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3) ou ao RNA quimérico mitocondrial deanti-sentido (SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6). Os resultados,que constituem uma outra descoberta surpreendente, mostraram que sob estascondições as células sofrem a programação da morte celular ou apoptose.
Depois do tratamento com os oligonucleotídeos complementares aos RNAsquiméricos mitocondriais de sentido ou anti-sentido durante 6 a 15 horas,entre 75 a 96 % das células sofrem apoptose (Tabela 2). A mudançaobservada nas células tratadas foram condensação de cromatina,fragmentação nuclear, fragmentação do DNA, ativação das caspases eprocesso alterado da membrana celular. Os oligonucleotídeos de controle com4 ou mais desemparelhamentos ou oligonucleotídeos misturados não induzema apoptose. Também, as células não foram afetadas se tratadas com os oligonucleotídeos alvejados ao RNA mitocondrial 12S de sentido ou anti-sentido ou alvejados ao mRNA ou ao transcrito de anti-sentido da subunidadeND1 mitocondrial. No geral, os oligonucleotídeos alvejados ao RNAquimérico mitocondrial de anti-sentido foram muito mais eficazes, na mesmaconcentração, do que os oligonucleotídeos alvejados ao RNA quiméricomitocondrial de sentido. Isto foi um resultado esperado visto que as célulastumorosas sobrexpressam o RNA quimérico mitocondrial de sentido eportanto é mais difícil alcançar uma concentração de oligonucleotídeos dentroda célula para interferir com todas as cópias deste transcrito. Por outro lado,visto que as células tumorosas infrarregulam o RNA quimérico mitocondrialde anti-sentido, deve ser mais fácil interferir com este RNA visto que existeum número inferior de cópias por células.A indução da apoptose também é seletiva para as célulastumorosas. Os linfócitos humanos em repouso ou os linfócitos humanosestimulados durante 48 horas com PHA não são afetados pelo tratamento comos oligonucleotídeos complementares aos RNAs quiméricos mitocondriais deanti-sentido ou alvejados ao RNA quimérico mitocondrial de sentido mesmodepois do tratamento durante a noite e com uma dose alta deoligonucleotídeos complementares (15 uM).A indução de apoptose pelo tratamento com osoligonucleotídeos complementares alvejados ao RNA quimérico mitocondrialde anti-sentido (SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6) foi obtida, masnão limitada a, célula HL-60 de leucemia pró mielocítica, MOLT-4 deleucemia linfoblástica aguda, uma célula de leucemia linfocítica T, Jurkat,uma leucemia de célula T, Devemelle ou linfoma B, NSO/2 ou mieloma,células HeLa, DU145, PC- 3, Caco-2, Hep-2 e HepG2. Duas células, MCF/7(carcinoma de mama) e melanoma, que podem ser consideradas como oparadigma das células tumorosas resistentes ao tratamento (quimioterapia ouradioterapia) sofrem apoptose acima de 80 % quando tratadas durante 15 horas com os oligonucleotídeos complementares alvejados ao RNA quiméricomitocondrial de anti-sentido (SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6).Um efeito apoptótico inferior foi obtido com os oligonucleotídeoscomplementares ao RNA quimérico de sentido (SEQ ID NO 1). Comorelatado antes, os oligonucleotídeos com 4 desemparelhamentos ouoligonucleotídeos misturados não induzem a morte celular.Descritos abaixo estão os métodos e as composições para trataro câncer usando os RNAs quiméricos de sentido e os RNAs quiméricos deanti-sentido como um alvo terapêutico.A forma de realização preferida, mas não limitada a, são osmétodos e as composições para tratar o câncer usando oligonucleotídeoscomplementares aos RNAs quiméricos de anti-sentido. O resultado destetratamento é pelo menos produzir em um paciente tratado um benefíciosaudável, que no caso do câncer, inclui mas não é limitado a redução docâncer, paliação dos sintomas do câncer e controle da propagação metastáticado câncer. Todos os tais métodos envolvem a indução de apoptose nas célulastumorosas e com efeito menor nas células normais. Os oligonucleotídeoscomplementares que alvejam os RNAs específicos foram usados paradiminuir ou abrogar a expressão de uma variedade grande de mRNA ou dasíntese das proteínas correspondentes (por exemplo, Vickers et al.,J. Biol.Chem., 278: 7108 a 7118, 2003). No momento, cerca de 42 oligonucleotídeosde anti-sentido com químicas diferentes correntemente estão sendo triadoscomo medicamentos potenciais (Stephens e Rivers, Curr. Opin. Mol.Therapeut, 5: 118 a 122, 2003) (ver também como exemplos as Pat. U.S?5.801.154; 6.576.759; 6.720.413; 6.573.050 e 6.673.917). Todas destasreferências são por meio desta expressamente incorporadas por referência.Em um aspecto desta invenção, um ou mais oligonucleotídeosalvejados ao RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido podem ser usados. O uso de dois ou mais oligonucleotídeos complementares é mais eficaz e apresenta algum grau de sinergismo.O oligonucleotídeo da invenção pode ser complementar ao RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido ou ao RNA quimérico mitocondrial de sentido. Os oligonucleotídeos complementares ligar-se-ão aos 5 RNAs quiméricos mitocondriais de anti-sentido ou aos RNAs quiméricos mitocondriais de sentido e interferirão com suas funções. A complementaridade absoluta, embora preferida, não é requerida. Uma sequência de oligonucleotídeo “complementar” a uma porção de um RNA, como referido aqui, significa uma sequência tendo complementaridade 0 10 suficiente para ser capaz de hibridizar com o RNA, formando um duplex estável. A capacidade de hibridizar dependerá tanto do grau de complementaridade quanto do comprimento do oligonucleotídeo. No geral, quanto mais longa a hibridização do ácido nucléico, maisdesemparelhamentos de base com um RNA pode conter e ainda forma um 15 duplex estável. Aqueles habilitados na técnica podem determinar um grau tolerável de desemparelhamento pelo uso de procedimentos padrão para determinar o ponto de fusão do complexo hibridizado.No geral, os oligonucleotídeos complementares para hibridizar gg com os mRNAs por proteínas diferentes são alvejados à região não traduzida 20 5 ’ do mRNA incluindo o complemento do códon de início AUG ou à regiãonão traduzida 3 ’ para serem mais eficazes. Os oligonucleotídeos complementares às regiões de codificação de mRNA são inibidores menos eficientes da tradução (ver as referências prévias). O RNA quimérico mitocondrial de sentido e o RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido são 25 RNA de não codificação e portanto a região alvo dos oligonucleotídeos pode ser complementar a qualquer região destes transcritos. As regiões mais eficazes estão localizadas em tomo dos segmentos de filamento único do RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido determinado varrendo-se as sequências do RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido ou sentido com oligonucleotídeos complementares designados a todos os 30 nucleotídeos.Aqueles habilitados na técnica entenderão que outras seqüências dentro dasseqüências completas dos transcritos da SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 6, são alvos paradesignar os oligonucleotídeos complementares alternativos.Os oligonucleotídeos complementares alvejados ao RNAquimérico mitocondrial de anti-sentido ou ao RNA quimérico mitocondrial desentido que resultam na indução de morte de célula tumorosa de acordo com apresente invenção no geral conterão suportes principais diferentes para asligações de fosfodiéster naturais. Os oligonucleotídeos podem ter ligações denucleosídeo internas alternadas, compreendendo, mas não limitados a,fosforotioato (Mag et al.,Nucleic Acids Res. 19: 1437 a 1441, 1991; e Pat.U.S. 5.644.048), ácido nucléico de peptídeo ou PNA (Egholm, Nature, 365:566 a 568, 1993; e Pat. U.S. 6.656.687), fosforamida (Beaucage, MethodsMol. Biol. 20: 33 a 61, 1993), fosforoditioato (Capaldi et al., Nucleic AcidsRes., 28: E40, 2000). Outros análogos de oligonucleotídeo incluem tais como,mas não limitados a, morfolino (Summerton, Biochim. Biophys. Acta, 1489:141 a 158, 1999), oligonucleotídeos bloqueados (Wahlestedt et al.,Proc. Natl.Acad. Sei. US, 97: 5633 a 5638, 2000), ácidos nucléicos peptídicos ou PNA(Nielsen et al., 1993; Hyrup e Nielsen, 1996) ou oligonucleotídeos deextremidade 5’ e 3’ modificados por 2-o-(2-metóxi)etila (McKay et al., J.Biol. Chem., 274: 1715 a 1722, 1999). Todas destas referências são por meiodesta expressamente incorporadas por referência. Os ácidos nucléicos podemconter qualquer combinação de desoxirribo- e ribo-nucleotídeos e qualquercombinação de bases, incluindo uracila, adenina, timina, citosina, guanina,inosina, xantanina hipoxantanina, isocitosina, isoguanina, etc.Os oligonucleotídeos complementares de acordo com ainvenção podem compreender pelo menos uma porção básica modificada queé selecionada do grupo incluindo mas não limitado a 5-fluorouracila, 5- bromouracila, 5-clorouracila, 5-iodouracila, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxiidroxilmetil)uracila, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracila, diidrouracila, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracila, 5-metoxiaminometil-2-tiouracila, beta-D-manosilqueosina, 5’-metoxicarboximetiluracila, 5-metoxiuracila, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), vibutoxosina,pseudouracila, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracila, 2-tiouracila, 4-tiouracila, 5-metiluracila, éster metilico do ácido uracil-5-oxiacético, ácidouracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracila, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracila, (acp3)w, e 2,6-diaminopurina.Os oligonucleotídeos complementares também podemcompreender pelo menos uma porção de açúcar modificado selecionada dogrupo incluindo mas não limitado a arabinose, 2-fluoroarabinose, xilulose, ehexose.Em uma outra forma de realização da presente invenção, osoligonucleotídeos complementares são designados para hibridizar comqualquer região do RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido ou a qualquerregião do RNA quimérico mitocondrial de sentido. Os oligonucleotídeoscomplementares devem ser pelo menos de dez nucleotídeos em comprimentoe são preferivelmente oligonucleotídeos complementares que variam de 10 acerca de 50 nucleotídeos em comprimento. Em aspectos específicos, ooligonucleotídeo complementar é pelo menos de 12 nucleotídeos, pelo menosde 18 nucleotídeos, pelo menos de 22 nucleotídeos, pelo menos de 30nucleotídeos, pelo menos de 50 nucleotídeos.É importante considerar para os experimentos in vitroassimcomo in vivo utilizar os controles que distinguem entre a interferência de anti- sentido com a função do RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido ouRNA quimérico mitocondrial de sentido com efeitos biológicos nãoespecíficos dos oligonucleotídeos de anti-sentido ou complementares.Portanto, o projeto dos oligonucleotídeos deve evitar a presença na seqüênciade trilhas de CpG, trilhas de 5’ GGGG e outras sequências que têm efeitotóxico nas células animais como relatado na Pat. U.S. 6.673.917, incorporadaaqui por referência. Também a presença da seqüência 5’ CGTTA foi evitadapara o efeito que não de anti-sentido que foi relatado (Tidd et al.,NucleicAcids Res. 28: 2242 a 2250, 2000).Em uma outra forma de realização da presente invenção, osoligonucleotídeos complementares alvejados aos RNAs quiméricosmitocondriais de anti-sentido ou alvejados aos RNAs quiméricosmitocondriais de sentido como agentes terapêuticos para animais ou para ospacientes que têm câncer podem induzir sensibilidade aos medicamentosterapêuticos anti-câncer e radiação. A sensibilidade induzida, tambémconhecida como sensibilização ou hipersensibilidade, pode ser medida emcélulas tumorosas que apresentam tolerância ao produto terapêutico anti-câncer ou radiação. Os medicamentos anti-câncer compreendem aqueles jáconhecidos na técnica e em uso ou os medicamentos não descobertos atéagora. Dentre os medicamentos quimioterapêuticos convencionais estão osagentes alquilantes, anti-metabólito, antibióticos e agentes anti-micro tubulares. Alguns exemplos destes medicamentos são cisplatina,metotrexato, doxorubicina dactinomicina, mitomicina, ciclofosfamida, etc.Em um outro aspecto da invenção, junto ou depois dotratamento de um animal ou de um paciente que tem câncer comoligonucleotídeos complementares alvejados ao RNA quimérico mitocondrialde anti-sentido e/ou ao RNA quimérico mitocondrial de sentido, o pacientepode ser tratado com radioterapia, em que a dita radioterapia inclui radiaçãoultravioleta, radiação gama, partículas alfa, partículas beta, raio X e feixes de elétron.Em um outro aspecto desta invenção, a interferência com a função do RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido ou do RNA quimérico mitocondrial de sentido para induzir a morte de célula tumorosa pode ser 5 obtida por interferência de RNA ou silenciamento de RNA. Durante os seis últimos anos a interferência de RNA (RNAi) tem emergido como um método I novo e promissor para o silenciamento de gene nas células de mamífero I (Elbashir et al,,Nature 411: 494 a 498, 2001; McManus et al,,Nature Rev.Genet. 3: 737 a 747, 2002). As moléculas de RNA de filamento duplo 10 sinteticamente sintetizadas de cerca de 19 a 21 nucleotídeos em comprimento hibridizam especificamente ao seu mRNA alvo complementar, levando à degradação do mRNA e desmonte de proteína subseqüente. Vários genes diferentes foram silenciados com êxito pelo RNA interferente pequeno ou siRNA (Lu et al,, Curr. Opin, Mol. Ther. 5: 225 a 234, 2003.; Wacheck et al., 15 Oligonucleotides 13: 393 a 400, 2003). Portanto, o RNA de filamento duplo sintético de cerca de 19 a 21 nucleotídeos alvejados ao RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido ou ao RNA quimérico mitocondrial de sentido pode ser usado para degradar estes transcritos e induzir a morte de célula tumorosa. Aqueles familiares na técnica entenderão que a sequência do 20 siRNA tem que ser complementar à qualquer região dos RNAs quiméricos mitocondriais de anti-sentido ou aos RNAs quiméricos mitocondriais de sentido (SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 e SEQ ID NO 6).Em uma outra forma de realização da invenção, as ribozimas 25 podem ser usadas para interferir com o RNA quimérico mitocondrial de anti- sentido ou com o RNA quimérico mitocondrial de sentido para induzir a morte de célula tumorosa. A seqüência da ribozima tem que ser designada de acordo com a seqüência do RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido (SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6) ou do RNA quimérico mitocondrial de sentido (SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3) paraclivar as regiões específicas do transcrito que são mais eficientes paraprovocar a morte de célula tumorosa. As ribozimas são moléculas de RNAenzimáticas capazes de catalisar a clivagem específica do RNA (Rossi, Curr.Biology 4: 469 a 471, 1994). O mecanismo de ação da ribozima envolve ahibridização específica de seqüência da molécula de ribozima ao RNA alvocomplementar, seguido por uma clivagem endonucleolítica. A composiçãodas moléculas de ribozima deve incluir uma ou mais seqüênciascomplementares ao mRNA de gene alvo e deve incluir a seqüência catalíticabem conhecida responsável pela clivagem do mRNA e descrita na Pat. U.S.5.093.246, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade. Como tal,dentro do escopo da invenção as moléculas de ribozima de cabeça de martelosão engendradas de modo que específica e eficazmente catalisam a divagemendonucleolítica dos RNAs quiméricos mitocondriais de anti-sentido ou dosRNAs quiméricos mitocondriais de sentido. A construção e a produção deribozimas de cabeça de martelo são bem conhecidas na técnica e foramdescritas (Haseloff et al., Gene, 82: 43 a 52, 1989). As ribozimas da presenteinvenção também incluem as RNA endorribonucleases (Zaug et al., Science,224: 574 a 578, 1984).A terapia de gene refere-se ao tratamento ou prevenção docâncer realizado pela administração de um ácido nucléico a um paciente quetem câncer ou em que a prevenção ou inibição do câncer é desejável. Nestaforma de realização da presente invenção, o ácido nucléico terapêuticoproduzido intracelularmente é um RNA complementar alvejado ao RNAquimérico mitocondrial de anti-sentido ou ao RNA quimérico mitocondrial desentido que medeia o efeito terapêutico interferindo-se ou inibindo-se afunção destes transcritos mitocondriais, induzindo a morte de célulatumorosa. Portanto, um método preferido é utilizar uma construção de DNArecombinante em que a transcrição do RNA de anti-sentido é colocada sob o controle de promotores fortes de RNA polimerase II ou III. A expressão da seqüência que codifica o RNA complementar pode ser por qualquer promotor conhecido na técnica para agir em células mamíferas, preferivelmente humanas. Tais promotores incluem mas não são limitados a região promotora 5 inicial de SV40 (Benoist e Chambon, Nature 290: 304 a 310, 1981), o promotor de timidina cinase de herpes (Wagner et al.,Proc. Natl. Acad. Sei.í U.S.A. 78: 1441 a 1445, 1981), as sequências reguladoras do gene ■ metalotioneína (Brinster et al.,Nature 296: 39 a 42, 1982), o promotor do1 vírus sarcoma de Rous (Yamamoto et al.,Cell 22: 787 a 797, 1980), etc. A 10 construção de DNA recombinante para produzir o RNA complementar pode ser um vetor virai que inclui, mas não é limitado ao vetor de adenovirus, vetor de vírus associado a adeno, vetor do vírus simples do herpes, vetor do vírus de vacina e vetores de retrovirus. O vetor é introduzido nas células tumorosas alvo, em uma composição farmacêutica, usando métodos familiares àqueles 15 habilitados na técnica.As composições farmacêuticas da invenção compreendendo uma quantidade eficaz de um ácido nucléico complementar (oligonucleotídeos complementares, siRNA, ribozimas ou vetores virais) em um carregador farmaceuticamente aceitável, que pode ser administrado a um 20 paciente que tem câncer para interferir com a função do RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido ou RNA quimérico mitocondrial de sentido e induzir a apoptose das células tumorosas. Os ácidos nucléicos complementares podem ser formulados em uma composição farmacêutica, que pode incluir carregadores, diluentes, tampões, conservantes, agentes 25 ativos de superfície, polietilenimida (PEI), lipossomas ou outra formulação lipídica conhecida na técnica. A composição farmacêutica pode ser administrada por aplicação tópica, administração oral, parenteral ou retal. A administração parenteral inclui injeção intravenosa, subcutânea, intraperitoneal ou intramuscular ou administração pulmonar por inalação ou insuflação.As composições da presente invenção podem ser utilizadas para terapêutica, diagnósticos, profilaxia e como reagentes e kits de pesquisa.As composições e os métodos fornecidos aqui são 5 considerados particularmente úteis para o tratamento do câncer. O termo câncer como fornecido aqui, inclui as células afligidas por qualquer uma das condições anômalas identificadas seguintes. Estas incluem leucemia mielóide aguda ou crônica, leucemia linfoblástica aguda ou crônica, mieloma múltiplo, doença de Hodgkin, linfoma que não de Hodgkin ou linfoma maligno;10 carcinoma estomacal, carcinoma esofágico ou adenocarcinoma, adenocarcinoma dutal pancreático, insulinoma, glucagonoma, gastrinoma, adenocarcinoma de intestino pequeno, carcinomas colorretais; carcinoma hepatocelular, adenoma hepatocelular; carcinóides, adenocarcinoma do trato genitourinário tal como renal, tumor de Wilm, carcinoma de bexiga e uretra e 15 adenocarcinoma prostático, câncer de testículo como seminoma, teratoma, teratocarcinoma, carcinoma de célula intersticial; carcinoma endometrial do útero, carcinoma cervical, carcinoma ovariano, carcinoma de vulva e vagina, tumores de célula de Sertoli-L-eydig, melanoma e carcinoma das trompas de falópio; carcinomas pulmonares, alveolares e bronquiolares; tumores 20 cerebrais; melanoma maligno de pele, carcinoma de célula basal, carcinoma de célula escamosa e sarcoma de Karposi. Também fibrossarcoma, angiossarcoma e rabdomiossarcoma do coração e outras malignidades que são familiares àqueles habilitados na técnica. Assim, o termo “célula cancerosa” como fornecido aqui, inclui uma célula afligida por qualquer uma das 25 condições identificadas acima.Os exemplos seguintes servem para descrever a maneira de usar a invenção descrita acima assim como para demonstrar a melhor maneira para realizar vários aspectos da invenção. É entendido que de nenhum modo estes exemplos pretenderam limitar o escopo desta invenção, mas certamente
eles são apresentados para propósitos ilustrativos.
EXEMPLO 1 Isolamento e seqüência do RNA quimérico humano mitocondrial de sentido. (Fig. IA, SEQ ID NO 1)
Os experimentos iniciais indicaram que o RNA quiméricoI mitoncondrial de sentido humano putativo conteve uma estrutura secundária p mais complexa e estável que o RNA quimérico de camundongo (Villegas et al,, DNA &Cell Biol. 19: 579 a 588,2000; Villegas et al., Nucleic Acids Res.10 30: 1895 a 1901, 2002). Portanto e com base na estrutura secundária do RNAquimérico mitocondrial de camundongo, uma estrutura secundária do RNA quimérico mitocondrial humano de sentido teórica foi deduzida (Fig. IA).
O transcrito humano teórico conteve a seqüência completa do RNA mitocondrial 16S de sentido unido pela extremidade 5’ a um fragmento do15 RNA mitocondrial 16S de anti-sentido formando uma alça de comprimento desconhecido (Fig. IA).
O segmento do RNA mitocondrial 16S de anti- sentido foi completamente complementar ao RNA mitocondrial 16S de sentido e portanto correspondeu a uma repetição invertida unida à extremidade 5’ do transcrito 16S de sentido. Com base nesta estrutura, os20 iniciadores foram designados para amplificar este transcrito putativo pela RT- PCR.
Um iniciador reverso estava na posição 11 a 31 da extremidade 5 ’ do RNA mitocondrial 16S de sentido humano ou no começo da alça teórica (iniciador 1, Fig. IA) (SEQ ID NO 139).
A seqüência do iniciador dianteiro usado foi aquela das posições 213 a 234 do RNA mitocondrial 16S de sentido25 e corresponde ao iniciador 3 na Fig. IA.
A amplificação do RNA de vários tecidos e células humanos incluindo HeLa, HL-60, Dul45, MCF/7 e linfócitos humanos estimulados com PHA (ver Exemplo 7) por RT-PCR usando os iniciadores 1 e 3 (Fig. IA), produziu um único amplicon de cerca de 210 pb (Figura 2).
A RT-PCR foi realizada como descrito antes (Villegas et al., DNA &Cell Biol. 19: 579 a 588, 2000; Villegas et al., Nucleic Acids Res. 30: 1895 a 1901, 2002). Os amplicons de cada tecido ou células humanos foram clonados e ambos os filamentos foram seqüenciados.
Em todos os casos, uma seqüência idêntica de 216 pb foi obtida, contendo uma repetição 5 invertida de 184 nucleotídeos unidos aos primeiros 31 nucleotídeos daextremidade 5 ’ do RNA mitocondrial 16S de sentido. Depois, nós determinamos se a repetição invertida foi mais longa do que 184 nucleotídeos M e se estendeu mais para a extremidade 5’ do RNA mitocondrial 16S de anti-sentido (Fig. IA). O cDNA de HeLa ou outras células descritas antes foi 10 amplificado entre o iniciador reverso 1 posicionado na alça como descritoantes e os iniciadores 4 a 7 caminharam para a extremidade 5’ da repetição invertida mais longa putativa (Fig. 1 A).
Pelo uso deste método, os fragmentos de amplificação de aproximadamente 500, 700 e 800 pb foram obtidos quando o iniciador 1 foi usado em combinação com os iniciadores 4, 5 e 6, 15 respectivamente. Por outro lado, quando o cDNA foi amplificado entre oiniciador 1 e o iniciador 7 no produto de amplificação foi obtido, sugerindo que a extremidade 5 ’ da repetição invertida foi entre os iniciadores 7 e 8 (ver abaixo).
A seqüência completa do amplicon de 800 pb revela uma repetição invertida de 769 nucleotídeos unidos aos primeiros 31 nucleotídeos do RNA20 mitocondrial 16S de sentido (SEQ ID NO 1) (Fig. IA).
A seqüência na extremidade 3’ da repetição invertida unida ao RNA mitocondrial 16S de sentido foi idêntica àquela encontrada na mesma região do amplicon de 216 pb. Isto é importante porque indica que em ambos os casos nós amplificamos o mesmo RNA. Além disso, a seqüência mostrou que os 50 nucleotídeos da25 extremidade 3’ do RNA mitocondrial 16S de anti-sentido foram perdidos na repetição invertida do RNA quimérico mitocondrial de sentido.
De modo geral, estes resultados sugerem que a estrutura de filamento duplo formada entre a repetição invertida e o RNA mitocondrial 16S de sentido começa na posição 51 do último e forma uma alça putativa de 50 nucleotídeos. Para confirmar o tamanho da alça, o cDNA humano foiamplificado por PCR entre o iniciador dianteiro 2 posicionado na extremidade3’ da repetição invertida e o iniciador 3, que também é reverso na posição 213a 234 do RNA mitocondrial 16S de sentido (Fig. IA).
Um amplicon deaproximadamente 240 pb foi obtido e a seqüência mostrou que os primeiros234 nucleotídeos do RNA mitocondrial 16S de sentido foram unidos aosúltimos 25 nucleotídeos da extremidade 3 ’ da repetição invertida. A seqüênciados 25 nucleotídeos da repetição invertida foi completamente complementarao RNA mitocondrial 16S de sentido das posições 51 a 75 (Fig. IA).
Se a seqüência do amplicon obtido com os iniciadores 1 e 6 e aseqüência do amplicon obtido com os iniciadores 2 e 3 são construídas comocontíguos, a estrutura emergente do RNA quimérico mitocondrial humano desentido confirmou uma alça de 50 nucleotídeos e uma estrutura de filamentoduplo de pelo menos 769 pb (Fig. 1 A) (ver também SEQ ID NO 1).
Visto que o RNA de filamento duplo não é digerido pelaRNase A, o ramo do RNA quimérico mitocondrial humano de sentido deveser resistente a esta enzima. Por outro lado, a alça ou a região 3’ do RNAmitocondrial 16S de sentido filamento que se estendeu além da estrutura defilamento duplo devem ser digeridas pela enzima.
O RNA de HeLa ou outrascélulas foi digerido com a RNase A (50 ug por ml), seguido pela extração defenol e o material resistente a nuclease foi recuperado pela precipitação doetanol. O cDNA do RNA digerido depois foi amplificado por PCR usando osiniciadores mostrados na Fig. IA.
O amplicon de cerca de 800 pb obtido comos iniciadores 1 e 6 não foi amplificado depois da digestão com RNase Aindicando que a alça foi digerida pela enzima. O mesmo foi verdade com oamplicon de 360 pb obtido com os iniciadores 10 e 11 como indicado na Fig.1 A.
De modo geral, estes resultados indicaram que a alça assim como a região3’ do RNA quimérico mitocondrial de sentido que se estende além do ramo,foram digeridas pela enzima. Por outro lado, a amplificação do amplicon de 750 pb, correspondendo à estrutura de filamento duplo do RNA quiméricomitocondrial de sentido e obtida com os iniciadores 8 e 6, não foi afetada peladigestão com RNase A.
A seqüência do fragmento de filamento duploresistente à digestão com ribonuclease foi idêntica com a seqüência esperadado ramo. Os mesmos resultados foram obtidos depois da digestão do RNAtotal das células HL-60 ou outras células humanas.
Para determinar a extremidade 5’ da repetição invertida doRNA quimérico mitocondrial de sentido, o ramo do transcrito obtido depoisda digestão com RNase A foi usado para a análise de RACE de 5’. Adeterminação da extremidade 5 ’ da repetição invertida foi realizada de acordocom as instruções do fabricante (Invitrogen).
Os resultados indicaram que arepetição invertida se estende para os 46 nucleotídeos adicionais daextremidade 5’ do amplicon obtido depois da amplificação do RNAquimérico mitocondrial de sentido com os iniciadores 1 e 6. Em resumo, arepetição invertida dos 815 nucleotídeos é unida à extremidade 5’ dosprimeiros 865 nucleotídeos do RNA mitocondrial 16S.
A seqüência destetranscrito mostrou 99,8 % de identidade com o gene mitocondrial 16Shumano (filamento H e L) (SEQ ID NO 1). As extremidades 5’ de ambasextremidades do ramo de filamento duplo foram confirmadas por RACE de5’.Os resultados acima indicaram que o RNA quiméricomitocondrial de sentido conteve um ramo ou estrutura de filamento duplo de815 pares de base e uma alça de 50 nucleotídeos. Entretanto, estes resultadosnão provam que a repetição invertida é unida ao RNA mitocondrial 16S desentido completo. O uso de métodos convencionais tais como a síntese docDNA completo da extremidade 3’ é desnecessário, visto que a estrutura defilamento duplo do transcrito representa um problema insuperável para astranscriptases reversas, incluindo Tth (Myers e Gelfand, Biochemistry 30:7661 a 7666, 1991).
Se a repetição invertida de 815 nucleotídeos for unida aos 1559 nucleotídeos do RNA mitocondrial 16S uma pessoa esperaria umtranscrito de 2,3 Kb. A análise de Northern blot do RNA total das célulasHeLa, HL-60 e MCF/7 foi realizada com uma sonda rotulada com 32P ealvejada à estrutura de filamento duplo do RNA quimérico mitocondrial desentido. Os resultados revelaram uma faixa de cerca de 2,4 Kb, além de umafaixa de 1,6 Kb, correspondendo ao RNA quimérico mitocondrial de sentido eao RNA mitocondrial 16S de sentido, respectivamente.
Se o RNA foi digeridocom a RNase A antes do Northern blot, uma única faixa de hibridização deaproximadamente 0,8 Kb foi obtida, que corresponde ao tamanho do ramo doRNA quimérico mitocondrial de sentido. De modo geral, estes resultadosdemonstraram fortemente que o RNA quimérico mitocondrial de sentidoconteve uma repetição invertida de 815 nucleotídeos unidos à extremidade 5 ’do RNA mitocondrial 16S de sentido completo e que corresponde a SEQ IDNO 1.É possível detectar especificamente a região de junção entre arepetição invertida e o RNA mitocondrial 16S de sentido, usando uma sondade oligonucleotídeo. A sonda tem que incluir 7 a 10 nucleotídeos em cadalado do ponto de junção entre a extremidade 3’ da repetição invertida e oinício do RNA mitocondrial 16S de sentido. Este oligonucleotídeo pode serusado para a hibridização in situou a amplificação por RT-PCR ou quaisqueroutros métodos familiares àqueles habilitados na técnica para detectar estenovo RNA.
O RNA quimérico mitocondrial de sentido está presente emcélulas proliferativas normais (queratinócitos de prepúcio humano, baço,linfócitos estimulados com PHA, embriões de camundongo), em células précancerosas (queratinócitos transformados com HPV 16 ou 18, células MT-2transformadas com HTLV-1) e em células tumorosas. Ele não está presenteem células em repouso normais. Um resumo destes resultados estáapresentado na Tabela 1 (no Exemplo 4).
EXEMPLO 2.
Os queratinócitos humanos transformados com o papiloma vírus sintetizam um novo RNA quimérico mitocondrial de sentido (Fig. 1B,SEQ ID NO 2).Os queratinócitos de prepúcio humano (HFK) foramtransformados por incubação com um lisato de células previamente infectadascom o papiloma vírus humano 16 (HPV 16). As células foram cultivadas com3 partes de K-SFM, uma parte de meio DMEM (Invitrogen), 5 ng/ml de EGF,50 ug/ml de extrato pituitário e 10 % de soro de bezerro fetal.
As condiçõesde cultivo foram de 37°C e 5 % de CO2. Depois de 24 horas de infecção, osHFK transformados foram transferidos a um novo frasco e cultivados sob asmesmas condições. Depois deste tempo as células (HFK698) foramtransferidas sucessivamente aos novos frascos de cultura a cada 3 dias usandouma razão de divisão de 1:3 a 1:4.
Depois da 19- passagem as células(HFK698 transformadas com HPV 16) foram colhidas como descrito(Hausen, Biochim. Biophys. Acta, 1288: F55 a F78, 1996), coletadas porcentrifugação a 300x g durante 10 min e lavadas duas vezes com tampão defosfato em solução salina (PBS).
O RNA total foi extraído das células lavadascom Trizol (Invitrogene). Cerca de 200 nanogramas de RNA foram usadospara sintetizar o cDNA com hexâmeros aleatórios como descrito no Exemplo1. O cDNA foi amplificado por PCR usando o iniciador reverso 1 e oiniciador avançado 3 como descrito na Fig. IA. Este protocolo deamplificação produziu o amplicon esperado de 210 pb onde os primeiros 31nucleotídeos do RNA mitocondrial 16S de sentido são unidos à repetiçãoinvertida de 184 nucleotídeos como descrito antes no Exemplo 1.
A análise deeletroforese dos produtos de amplificação revelou a presença do amplicon de210 pares de bases correspondendo ao RNA quimérico mitocondrial desentido, mais um outro fragmento de amplificação de cerca de 150 pares debases como mostrado na Fig. 2. A seqüência completa deste fragmento novo (SEQ ID NO 2) mostrou que os 31 nucleotídeos iniciais da extremidade 5’ doRNA mitocondrial 16S de sentido são unidos a uma repetição invertida de121 nucleotídeos, que é mais curta nos 63 nucleotídeos se comparada com arepetição invertida do RNA quimérico mitocondrial de sentido da SEQ IDNO 1.
Esta repetição invertida mais curta gera uma alça mais longa de 96nucleotídeos (Fig. 1B) na estrutura do RNA quimérico mitocondrial. Orestante da seqüência é idêntico à SEQ ID NO 1).
Este novo RNA quiméricomitocondrial de sentido não está presente nas células SiHa (Fig. 4A), que sãocélulas tumorigênicas transformadas com HPV 16, não em células humanasproliferativas normais como linfócitos humanos estimulados com PHA (vero Exemplo).
Resultados similares foram obtidos com HFK transformado comHPV 18 ou células 18Nco. As células transformadas ou imortalizadas (masnão tumorigênicas) com HPV 16 ou HPV 18 são consideradas como célulaspré malignas e portanto o novo RNA quimérico mitocondrial de sentido é ummarcador potencial novo para as células pré malignas.
Visto que a seqüência da extremidade 3’ da repetição invertidada SEQ ID NO 2 unida ao RNA mitocondrial 16S é diferente para a mesmaregião da SEQ ID NO 1, uma sonda de oligonucleotídeo pode ser usada para adetecção específica deste transcrito. A sonda deve incluir 7 a 10 nucleotídeosem cada lado do ponto de junção entre a extremidade 3’ da repetição invertidae o início do RNA mitocondrial 16S de sentido, tal como o oligonucleotídeoda SEQ ID NO 7.
Este oligonucleotídeo pode ser usado para a hibridização insituou amplificação por RT-PCR ou quaisquer outros métodos familiaresàqueles habilitados na técnica para detectar este marcador novo e específicodas células pré cancerosas.EXEMPLO 3:Células transformadas com HTLV-1 induzem a expressão de um terceironovo RNA quimérico mitocondrial de sentido (Fig. 1C, SEQ ID NO 3).As células MT-2 humanas transformadas com HTLV-1 foram cultivadas como descrito (Kobayashi et al., EMBO J., 3: 1339 a 1343, 1984).As células foram colhidas, centrifugadas a 300 x g durante 10 min e lavadasduas vezes com PBS.
A pelota de célula final foi extraída com Trizol comodescrito no Exemplo 1. O cDNA foi sintetizado com hexâmeros aleatóriosusando o RNA como padrão e o cDNA foi amplificado por PCR usandò oiniciador reverso 1 e o iniciador avançado 3 como descrito na Fig. 1 A.
Comodescrito antes, este protocolo de amplificação produz um amplicon de 210pares de base que contém os primeiros 31 nucleotídeos do RNA mitocondrial16S de sentido unido a uma repetição invertida de 184 nucleotídeos quecorresponde ao RNA quimérico mitocondrial de sentido como descrito noExemplo 1. A análise de eletroforese dos produtos de amplificação revelou,além da presença do amplicon já debatido de 210 pares de base, uma faixa decerca de 150 pares de base (ver Fig. 2).
A seqüência do amplicon de 150 paresde base é idêntica à seqüência do amplicon descrita no Exemplo 2,correspondendo a um segundo RNA quimérico mitocondrial de sentidoexpressado nas células transformadas com HPV 16 ou HPV 18 (SEQ ID NO2). Além disso, um novo produto de amplificação foi descoberto de cerca de100 pb (Fig. 2).
A seqüência deste terceiro amplicon revelou uma repetiçãoinvertida de 61 nucleotídeos unidos à extremidade 5’ do RNA mitocondrial16S de sentido e que gera uma alça de 167 nucleotídeos (Fig. 1C; SEQ ID NO3).
Este novo amplicon não estava presente nas células normais, nas célulastumorosas e nas células transformadas com HPV 16 ou 18. Portanto, estenovo RNA quimérico mitocondrial de sentido é um marcador potencial decélulas transformadas com o retrovirus oncogênico HTLV-1.
Visto que a seqüência da extremidade 3’ da repetição invertidada SEQ ID NO 3 unida ao RNA mitocondrial 16S é diferente para a mesmaregião da SEQ ID NO 1 e SEQ ID NO 2, uma sonda de oligonucleotídeo podeser usada para a detecção específica deste transcrito. A sonda deve se estenderentre 7 a 10 nucleotídeos em cada lado do ponto de junção entre a extremidade 3’ da repetição invertida e o início do RNA mitocondrial 16S desentido, tal como o oligonucleotídeo da SEQ ID NO 8.
Este oligonucleotídeopode ser usado para a hibridização in situou amplificação por RT-PCR ouquaisquer outros métodos familiares àqueles habilitados na técnica paradetectar este marcador específico de células transformadas com um vírusoncogênico retroviral.
EXEMPLO 4. Estrutura do RNA quimérico mitocondrial humano de anti-sentido.
Nossos experimentos iniciais indicaram que uma segunda famíliade RNAs quiméricos correspondendo ao RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido estava presente em alguns dos estudos de células.
Para estabelecer aestrutura do RNA quimérico mitocondrial humano de anti-sentido, a estratégiausada para o RNA quimérico mitocondrial de sentido foi utilizada (Fig. 1).
ORNA quimérico mitocondrial de anti-sentido teórico conteve um fragmento doRNA mitocondrial 16S de sentido como a repetição invertida unida àextremidade 5’ do RNA mitocondrial 16S de anti-sentido. O último RNA étranscrito do filamento L do DNA mitocondrial e corresponde ao genemitocondrial 16S (Fig. 3).
Para amplificar este RNA, um iniciador reverso foihibridizado junto à extremidade 5’ do RNA mitocondrial 16S de anti-sentido eos iniciadores dianteiros foram hibridizados em posições diferente do fragmentoputativo da repetição invertida (Fig. 3).
O RNA total dos linfócitos humanosestimulados com PHA durante 48 horas foi usado como padrão. O cDNA foisintetizado com hexâmeros aleatórios como descrito no Exemplo 1.
Aamplificação do cDNA por PCR foi realizada com o iniciador reversoposicionado próximo ao início da extremidade 5’ do RNA mitocondrial 16S deanti-sentido (iniciador 1, Fig. 3) e iniciadores dianteiros diferentes posicionadosna repetição invertida (Fig. 3).
Apenas três amplicons principais foram obtidosque diferiram no tamanho da repetição invertida e no tamanho da alça. Estesamplicons foram purificados e seqüenciados.
Um deste RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido contém uma repetição invertida de 365 nucleotídeose uma alça de 17 nucleotídeos (SEQ ID NO 4). Um outro RNA contém uma alçade 96 nucleotídeos e uma repetição invertida de 189 nucleotídeos (SEQ ID NO5).
Até agora, uma outra espécie do RNA quimérico mitocondrial de anti-sentidocontém uma repetição invertida de 296 nucleotídeos e uma alça de 451nucleotídeos (SEQ ID NO 6). As sequências de todos os três RNAs quiméricosmitocondriais de anti-sentido foram 99,8 por cento homólogas com a seqüênciado gene do DNA mitocondrial (filamentos H e L).
Os resultados, que serão apresentados nos exemplos seguintesindicam que existe uma diferença maior entre as células pré tumorosas etumorosas e as células proliferativas normais com respeito à expressão do RNAquimérico mitocondrial de anti-sentido. Todas as células proliferativas sobrexpressam o RNA quimérico mitocondrial de sentido.
Entretanto, enquanto ascélulas proliferativas normais também expressam os RNAs quiméricosmitocondriais de anti-sentido, estes transcritos são infrarregulados nas célulastumorosas. As células não proliferativas ou em repouso não expressam cada umdos RNAs quiméricos mitocondriais.
Portanto, a expressão diferencial deste RNArepresenta um marcador novo e potente da carcinogênese, que pode ser detectadopela hibridização in situ,análise de Northern blot, RT-PCR ou TMA ou outrastécnicas conhecidas por uma pessoa habilitada no ramo.Um resumo da expressão diferencial dos RNAs quiméricosmitocondriais de sentido e de anti-sentido é mostrado na Tabela 1.
Figure img0001
EXEMPLO 5.
Linhagens de células tumorosas sobrexpressam o RNA quimérico mitocondrial de sentido (SEQ ID NO 1) e infrarregulam a expressão doRNA quimérico mitocondrial de anti-sentido (SEQ ID NOS 4,5 e 6).A hibridização in situfoi usada para determinar a expressão doRNA quimérico mitocondrial de sentido em linhagens de célula tumorosa emcultura.
Para a hibridização in situ,as células tumorosas aderentes foramcultivadas em lâminas de câmara de 8 reservatórios (Lab-Tek®, NUNC)durante 24 a 48 horas a 37°C, usando o meio apropriados e as condiçõesrecomendadas por American Tissue Culture Collection ou ATCC. Para ascélulas não aderentes (por exemplo, HL-60, Jurkat e Ramos), elas foramcultivadas em frasco pequeno durante 48 horas a 37°C.
As células foramrecuperadas por centrifugação a 300 x g durante 10 min, recolocadas emsuspensão em volume pequeno de PBS e alíquotas de 10 a 20 ul foramaplicadas nas lâminas de vidro previamente revestidas com polilisina ou umaproteína adesiva purificada de mexilhões (Burzio et al, Curr. Opin.Biotechnol., 8: 309 a 312, 1997). As células foram secas na temperaturaambiente durante 30 min.
As células foram lavadas três vezes com PBS e fixadas com 4% de para-formaldeído durante 10 min na temperatura ambiente. As lâminasdepois foram lavadas três vezes com PBS durante 5 min e incubadas com HC10,2 N durante 10 min na temperatura ambiente.
As células foram lavadasnovamente três vezes, primeiro com PBS e depois com 2 X de SSC durante10 min (2 X de SSC:0,3 M de NaCl, 30 mM de citrato de sódio, pH 7,0)(Sambrook et al., 1989) na temperatura ambiente.
A pré hibridização foirealizada durante 30 min a 37°C em uma solução contendo 4 X de SSC, 10 %de sulfato de dextrano, 150 pg/ml de tRNA de levedura e DNA de esperma dearenque, 50 % de formamida e 1 X de solução de Denhardt (0,2 mg/ml deFicoll tipo 400, 0,2 mg/ml de polivinilpirrolidona, 0,2 mg/ml de BSA). A hibridização foi realizada durante 15 horas a 37°C na mesma mistura de préhibridização contendo 3,5 pmoles de sondas alvejadas aos RNAs quiméricosmitocondriais de sentido e anti-sentido.
As sondas contiveram de 20 ou maisdesoxinucleotídeos alvejados às regiões diferentes da seqüência do RNAquimérico mitocondrial de sentido ou anti-sentido (ver SEQ ID NO 99 a 197 eSEQ ID NO 9 a 98, respectivamente). As sondas foram previamente rotuladasna extremidade 3’ com digoxigenina-11-dUTP (Roche) e transferase terminal(Promega) como descrito antes (Villegas et al., DNA &Cell Biol., 19: 579 a588, 2000).
Para eliminar o excesso da sonda, as lâminas foram lavadasprimeiro com 2 X de SSC durante 10 min e com 1 X de S SC durante 10 minna temperatura ambiente. Depois as amostras foram lavadas com 0,2 X deSSC durante 30 min a 45°C e fmalmente, com 0,2 X de SSC durante 10 minna temperatura ambiente.
Depois da hibridização, as células foram incubadas durante 30min em tampão de bloqueio (1 % de BS A, 0,3 % de Triton X-100 em PBS) edepois incubadas durante 2 horas na temperatura ambiente com anticorpomonoclonal anti-digoxigenina conjugado à fosfatase alcalina (Roche),previamente diluído 1:500 no tampão de bloqueio. Finalmente, as lâminasforam lavadas duas vezes com PBS e a reação de corante foi realizada comuma mistura do substrato BCIP/NBT (DAKO) como descrito antes (Villegaset al., DNA &Cell Biol., 19: 579 a 588, 2000). O mesmo procedimento foiutilizado para FISH, usando anticorpos anti-digoxigenina conjugados comfluoresceína ou rodamina.Como mostrado nas Figs. 4A e 4B, a hibridização in situ comuma sonda rotulada com digoxigenina correspondendo a SEQ ID NO 63revela que as células humanas tumorosas sobrexpressam o RNA quiméricomitocondrial de sentido.
A hibridização in situcom a sonda de sentidorotulada com digoxigenina e correspondendo a SEQ ID NO 64 foi negativa(Figs. 4A e B) indicando a infrarregulação da expressão do RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido. Os mesmos resultados foram obtidos com assondas de oligonucleotídeo alvejadas a outras regiões do RNA quiméricomitocondrial de sentido ou anti-sentido.
EXEMPLO 6
Células tumorosas em biópsias humanas sobrexpressam o RNAquimérico mitocondrial de sentido (SEQ ID NO 1) e infrarregulam oRNA quimérico mitocondrial de anti-sentido (SEQ ID NOS 4, 5 e 6).
Biópsias humanas foram obtidas de patologistas ou de arranjosteciduais de DAKO. A maioria das amostras analisadas foram embutidas emparafina e fixadas com formalina.
Outras amostras de tecido foram fixadascom fixador de Boiun e uma outra amostra foram seções de tecido congeladasa fresco. As seções de tecido de cerca de 4 a 8 pm foram fixadas em lâminaspreviamente revestidas com polilisina ou a proteína polifenólica adesivapurificada de mexilhão Aulacomya ater (Burzio et al., Curr. Opin.Biotechnol., 8: 309 a 312, 1997). As seções de tecido embutidas em parafinaforam incubadas durante 1 hora a 60°C e a parafina foi removida por trêslavagens com xilol durante 15 min cada vez. As seções foram secas ao ar elavadas quatro vezes com PBS.
Depois as seções foram incubadas com HC10,2 N durante 10 min na temperatura ambiente e depois completamentelavadas com PBS. Posteriormente, as amostras foram submetidas àhibridização in situcom as sondas de anti-sentido rotuladas com digoxigeninade acordo com o protocolo descrito no Exemplo 4. Uma seção paralela foihibridizada com uma sonda de sentido correspondendo à mesma região doRNA quimérico mitocondrial de sentido.Como mostrado na Fig. 5A, as células presentes nos tumoresde carcinoma de mama, colo uterino, de bexiga e pulmonar revelaram ummanchamento forte com as sondas de anti-sentido alvejadas ao RNAquimérico mitocondrial de sentido, indicando a presença forte do transcrito.Por outro lado a hibridização in situcom a sonda alvejada ao RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido foi negativa, indicando a infrarregulação destetranscrito (Fig. 5A). Outro tumores também sobrexpressam o RNA quiméricomitocondrial de sentido e infrarregulam a expressão do RNA quiméricomitocondrial de anti-sentido (Fig. 5B).
EXEMPLO 7
Células proliferativas normais sobrexpressam os RNAs quiméricos mitocondriais de sentido e anti-sentido.Usando o mesmo protocolo para a hibridização in situdescritonos Exemplos 5 e 6, a expressão do quimérico mitocondrial de sentido foideterminada nas células proliferativas.
Como mostrado na Fig. 6, as célulasHFK, espermatogônia, células do baço e células proliferativas de embrião decamundongo, apresentaram sinal forte de hibridização indicando asobrexpressão do RNA quimérico mitocondrial de sentido. Ao contrário, ascélulas não proliferativas tais como as células do cérebro, músculo e fígadonão apresentam nenhum sinal indicando que o RNA quimérico mitocondrialde sentido não é expressado ou é inffarregulado nestas células.Entretanto, o resultado surpreendente foi que quando ahibridização in situfoi realizada com as sondas alvejadas ao RNAquimérico mitocondrial de anti-sentido, um sinal forte também foiobservado (Fig. 6).
Vários controles ensaiados em paralelo indicaram queo sinal de hibridização com estas sondas não foi devido a um artefato. Osinal de hibridização desapareceu se a hibridização in situfoi realizadacom a sonda rotulada junto com um excesso (50 a 100 vezes) da mesmasonda mas não rotulada com digoxigenina. Se antes da hibridização asamostras foram incubadas com ribonuclease A durante a noite, o sinal dehibridização desapareceu. Também, nenhum sinal de hibridização foiobservado se a hibridização foi realizada com uma sonda rotuladaalvejada ao RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido com 4desemparelhamentos.
EXEMPLO 8
Linfócitos humanos normais estimulados com fitoemaglutinina (PHA)sobrexpressam os RNAs quiméricos mitocondriais de sentido e anti-sentido.Cinco ml de sangue de doadores saudáveis foram coletadoscom EDTA.
O sangue foi diluído com um volume de 0,9 % de NaCl e amistura foi aplicada em 5 ml de Histopaque-1077 (Sigma) em um tubo decentrífuga. Os tubos foram centrifugados a 800 x g durante 20 min natemperatura ambiente. As células brancas na interfase foram coletados,diluídos com 2 volumes de 0,9 % de NaCl e centrifugados a 250 x g durante10 min na temperatura ambiente. As células coletadas foram colocadas emsuspensão e lavadas duas vezes com meio RPMI 1640 suplementado com 200mM de glutamina, 10 mM de aminoácidos não essenciais, penicilina,estreptomicina isenta de soro de bezerro fetal.
O sedimento final foirecolocado em suspensão no mesmo meio com 10 % de soro de bezerro fetale o número de linfócitos humanos por ml foi determinado por contagem sob omicroscópio em uma câmara de Neubauer.Os linfócitos humanos foram cultivados em placasmicrotituladoras de 96 reservatórios com o meio RPMI 1640 suplementadocomo descrito mais 10 % de soro de bezerro fetal a 37°C e com 5 % de CO2.Cerca de 30.000 linfócitos por reservatório foram cultivados com ou sem 10ug por ml do mitógeno PHA, que induz a proliferação celular (Yu et al., J.Biol. Chem., 266: 7588 a 7595, 1991). Depois de 48 a 72 horas de tratamentocom PHA, as células são ativamente embutidas na síntese de DNA comodemonstrado pela incorporação de H3-timidina ou BrdU (Yu et al., J. Biol.Chem., 266: 7588 a7595, 1991). Também, 48 horas depois da estimulaçãocom PHA, os linfócitos sobrexpressaram outros marcadores de proliferaçãocelular tais como o antígeno nuclear de célula proliferativa ou PCNA e Ki-67(Bantis et al., Cytopathology, 15: 25 a 31, 2004) (Fig. 7). Os linfócitos em repouso ou de controle não expressaram estes antígenos (Fig. 7).
Para determinar se os linfócitos estimulados expressaram osRNAs quiméricos mitocondriais de sentido, as células foram submetidas àhibridização in situcom sondas de oligonucleotídeo rotuladas comdigoxigenina e alvejadas ao RNA quimérico mitocondrial de sentido. Oprotocolo de hibridização in situutilizado foi descrito no Exemplo 5. Umsinal de hibridização forte foi obtido indicando a sobrexpressão destetranscrito (Fig. 7). O sinal de hibridização foi similar em intensidade àqueleobservado nas células tumorosas ou outras células proliferativas normais(comparar a Fig. 7 com as Figs. 4 A e B, Figs. 5A e B). Nenhum sinal dehibridização foi observado nos linfócitos de controle incubados sem PHA(Fig. 7).
Quando a hibridização in situfoi realizada com as sondas deoligonucleotídeo de sentido rotuladas com digoxigenina e alvejadas ao RNAquimérico mitocondrial de anti-sentido, um sinal de hibridização igualmenteforte foi obtido (Fig. 7). Vários controles foram realizados para descartar apossibilidade de que o sinal de hibridização foi devido aos artefatos. O sinalde hibridização desaparece se a hibridização in situ é realizada com a sondade sentido rotulada junto com o excesso (50 a 100 vezes) da mesma sonda desentido mas não rotulada com digoxigenina. Se antes da hibridização asamostras são incubadas com ribonuclease A durante a noite, o sinal dehibridização desaparece.
Também, nenhum sinal de hibridização é observadose a hibridização é realizada com as sondas de sentido com 4desemparelhamentos. Ao contrário, a hibridização in situdo linfócito nãoestimulado não apresentou nenhum sinal de hibridização (Fig. 7). Emconclusão, os linfócitos humanos normais estimulados para proliferarsobrexpressam tanto, o RNA quimérico mitocondrial de sentido quanto oRNA quimérico mitocondrial de anti-sentido.
Estes transcritos não sãoexpressados nas células em repouso.
EXEMPLO 9.
O RNA quimérico mitocondrial de sentido exibi localizações diferentes nas células normais e tumorosas.As hibridizações in siturelatadas nos Exemplos 5 e 6,indicaram que em várias linhagens de célula tumorosa assim como em célulastumorosas de biópsias humanas, o RNA quimérico mitocondrial de sentido élocalizado preferencialmente no citoplasma.
Entretanto, em algumas biópsiasde tumor uma localização clara dos transcritos no núcleo também foiencontrada (FIGs. 4 A, B).Uma descoberta surpreendente foi a localização do RNAquimérico mitocondrial de sentido no núcleo. A hibridização in siturealizadacomo relatado no Exemplo 5, revelou o sinal de hibridização positivo nonúcleo das células HeLa e SiHa (FIG. 8). O sinal de hibridização foi maisforte no núcleo de HFK transformada com HPV 16 (FIG. 8).
A localizaçãonucleolar também foi encontrada nas células tumorosas de tumores de mamae rabdomiossarcoma (FIG. 8).Os estudos de co-localizaçao indicaram que o RNA quiméricomitocondrial de sentido localizado no citoplasma está fora das mitocôndrias eassociado aos últimos endossomas/lisossomas. Se os estudos de co-localização são realizados com marcadores de mitocôndrias tais comoMitotrack (Molecular Probes) ou anticorpos anti-citocromo c (Promega) ouanti-Endonuclease G (Chemicon), a hibridização in situapresentou uma co-localização desfavorável.
Entretanto, uma co-localização perfeita foiencontrada entre o sinal de hibridização com a imunocitoquímica dos últimosmarcadores de endossomas/lisossomas tais como Lysotrack (MolecularProbes) ou anticorpos anti-Lamp-2 (BD Pharmigen) ou anti-catepsina D(Zymed).As células HeLa foram submetidas à hibridização in situ comsondas de oligonucleotídeo rotuladas com digoxigenina como descrito no Exemplo 5. Depois da pós hibridização e dos procedimentos de lavagem, ascélulas foram incubadas com um anticorpo anti-digoxigenina rotulado comrodamina (Roche) e um anticorpo anti-Lamp-2 rotulado com fluoresceína(BD Pharmingen). Depois da incubação na temperatura ambiente durante 3horas no escuro, as lâminas foram lavadas, montadas e analisadas com ummicroscópio confocal Zeiss.
Uma co-localização clara do sinal dehibridização com a localização de Lamp-2 foi obtida. Os resultados de co-localização similares do sinal de hibridização foram obtidos quandoLysotrack ou anticorpos anti-catepsina D foram usados como marcadores dafração lisossômica. Tanto quanto nós conhecemos, este é o primeiro relatoque mostra que um RNA (especialmente um transcrito mitocondrial) éassociado aos lisossomas da célula. A determinação da localização do RNAquimérico mitocondrial de sentido nas células tumorosas pode ter um valor deprognóstico importante para os pacientes com câncer.
No geral, nas célulasproliferativas normais, os RNAs quiméricos mitocondriais de sentido e anti-sentido estão localizados principalmente no núcleo.
EXEMPLO 10.
Tratamento de células tumorosas in vitrocom oligonucleotídeos de anti-sentido alvejados ao RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido induz amorte celular.As células HL-60 foram cultivadas sob as condições ótimasrecomendadas por ATCC.
Cerca de 30.000 células foram cultivadas emplacas microtituladoras de 96 reservatórios. Os oligonucleotídeos (2 uM)alvejados ao RNA quimérico mitocondrial de sentido ou anti-sentido foramadicionados. Para realçar a permeabilidade das células, os oligonucleotídeosforam adicionados na mistura com lipofectamina ou oligofectamina(Invitrogen) ou com polietilenimida (PEI) (Exgen TM500, Fermentas). A PEIfoi preferida porque é praticamente não tóxica às células. As células foramincubadas com os oligonucleotídeos durante 6 horas e a porcentagem de sobrevivência celular foi determinada pela permeabilidade ao azul de tripano.
Depois de 6 horas de incubação com os oligonucleotídeos uma porcentagemimportante das células morreram. Entretanto, os oligonucleotídeos alvejadosao RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido foram mais eficazes eminduzir a morte celular (cerca de 90 % versus 15 % de morte celular). Poroutro lado, nenhuma apoptose foi induzida quando as células foram tratadascom oligonucleotídeos alvejados ao RNA mitocondrial 12S de sentido ouanti-sentido ou o mRNA da subunidade ND1 ou com oligonucleotídeosmisturados ou oligonucleotídeos com quatro desemparelhamentos, todos dosquais foram usados como controles.
Os oligonucleotídeos usados nestesestudos contêm ligação de fosforotioato nos primeiros 5 nucleotídeos naextremidade 5’ e os últimos cinco nucleotídeos na extremidade 3’. Na média,os 10 nucleotídeos centrais contêm ligações de fosfodiéster.Para estabelecer se o tratamento das células com estesoligonucleotídeos induz a fragmentação do DNA, as células HL-60 foramincubadas sob as mesmas condições descritas antes com os oligonucleotídeosdurante 6 horas. Cerca de 30.000 células HL-60 foram cultivadas em 200 ulde IDMEM mais 10 % de soro de bezerro fetal na placa microtituladora de 96reservatórios junto com 1 uM de oligonucleotídeos alvejados ao RNAquimérico mitocondrial de sentido ou alvejados ao RNA quiméricomitocondrial de anti-sentido. A química dos oligonucleotídeos adicionados namistura com PEI foi a mesma descrita na seção prévia. Depois de umincubação de 6 horas com os oligonucleotídeos as células foram ensaiadasquanto a fragmentação do DNA usando o ensaio de TUNEL (DeadEndColorimetric TUNEL System, Promega).
Como mostrado na Tabela 2, cercade 96 % das células apresentaram fragmentação do DNA depois dotratamento com o oligonucleotídeo alvejado ao RNA quimérico mitocondrialde anti-sentido. A taxa similar de fragmentação do DNA foi obtida com omedicamento estaurosporina. Os oligonucleotídeos misturados ou os oligonucleotídeos com desemparelhamentos não apresentaram nenhum efeito.Ao contrário, apenas cerca de 20 % das células morreram quando tratadascom o oligonucleotídeo alvejado ao RNA quimérico mitocondrial de sentido(Tabela 2).
Como mostrado previamente, as células tumorosas infrarregulama expressão do RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido econseqüentemente estas células carregam um número baixo de cópias destetranscrito. Portanto, a morte celular é mais eficazmente induzida com osoligonucleotídeos alvejados ao RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido.Estes resultados fortemente sugerem que o número baixo de cópias do RNAquimérico mitocondrial de anti-sentido nas células tumorosas constitui umalvo para a terapia.Tabela 2.Oligonucleotídeos complementares ao RNA quimérico mitocondrial de anti-
Figure img0002
Em um outro estudo, nós determinamos se o tratamento dascélulas com oligonucleotídeos alvejados ao RNA quimérico mitocondrial deanti-sentido induziu a ativação das caspases.
As caspases são enzimasproteolíticas, ativamente envolvidas na morte celular programada ouapoptose. As HL-60 foram incubadas com os oligonucleotídeos alvejados aoRNA quimérico mitocondrial de anti-sentido ou com estaurosporina durante 6horas sob as condições de cultivo descritas antes. Depois, VAD-fmk (CaspaCe FITC-VAD-FMK, Promega) conjugado com fluoresceína foiadicionado à cultura e incubado durante 30 min a 37°C. O VAD-fmk é oinibidor forte das caspases e se liga às proteases com afinidade muito alta(Gracia-Calvo et al., J. Biol. Chem., 273: 32608 a 32613, 1998). As célulasforam lavadas por centrifugação, montadas e observadas com um microscópiode fluorescência. Como mostrado na Fig. 9, as células HL-60 tratadas com ooligonucleotídeo alvejado ao RNA quimérico mitocondrial de anti-sentidoinduziram a ativação das caspases, em nível similar à ativação obtida com aestaurosporina. Nenhuma ativação das caspases foi obtida com osoligonucleotídeos de anti-sentido alvejados ao RNA mitocondrial 12S usadocomo controle.As células tratadas com os oligonucleotídeos alvejados aoRNA quimérico mitocondrial de anti-sentido também exibem outrasmudanças que são congruentes com a apoptose.
A análise de microscopia deelétron mostrou a fragmentação nuclear e a condensação de cromatina. Afragmentação nuclear também foi demonstrada pelo manchamento dosnúcleos com DAPI. Depois do tratamento com estes oligonucleotídeosalvejados ao RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido, as células sofremfragmentação nuclear como revelado pelo manchamento com DAPI (Figs. 9Ee9F).
EXEMPLO 11.
Outras células tumorosas também sofrem morte celular quando tratadas com oligonucleotídeos complementares ao RNA quimérico mitocondrialde anti-sentido.Outras células tumorosas foram tratadas com osoligonucleotídeos complementares ao RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido de acordo com o protocolo descrito no Exemplo 10. As células foramincubadas em sua condição ótima de acordo com a recomendação de ATCC e2 uM de oligonucleotídeo foram adicionados no período inicial do experimento junto com PEL Seis horas mais tarde uma segunda adição dooligonucleotídeo foi realizada na mesma concentração e o efeito foideterminado 15 horas depois da iniciação do experimento.
A morte celular foideterminada pelo manchamento com DAPI e contagem do número de célulascom os núcleos fragmentados. Como mostrado na Tabela 3, mais de 70 % dascélulas tratadas com oligonucleotídeos sofrem apoptose. É importantemencionar, que as células de melanoma, células de linfoma e as células de
Figure img0003
carcinoma de mama MCF/7, conhecidas serem completamente resistentes aotratamento com medicamento, sofrem apoptose em uma taxa muito alta(Tabela 3)Tabela 3.Indução de apoptose em linhagens de célula tumorosa pelo tratamento comoligonucleotídeos complementares ao RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido.* O tratamento foi durante 15 horas e 2 uM de oligonucleotídeos.
A apoptose em célulastratadas com oligonucleotídeos misturados ou desemparelhados ou sem oligonucleotídeosvaria entre 3 a 10 %.Para determinar se existem regiões no transcrito que são alvosmais eficientes para os oligonucleotídeos em induzir a apoptose osexperimentos seguintes foram realizados. A indução da apoptose foi estudadaem células Hela, HL-60 e MCF/7 com os oligonucleotídeos de anti-sentido decerca de 20 nucleotídeos, alvejados a cerca de cada 30 nucleotídeos partindoda extremidade 5’ do RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido. No tempozero 1 uM de oligonucleotídeo foi adicionado junto com PEI e este tratamentofoi repetido 6 horas mais tarde. Quinze horas depois do início do tratamento, a porcentagem da célula que sofre apoptose foi determinada pelo manchamentocom D API e pela contagem das células com núcleos fragmentados.
Embora amaioria dos oligonucleotídeos induziu um grau variável de apoptose, a regiãode filamento único do RNA quimérico mitocondrial de anti-sentido foi umalvo melhor para induzir a morte celular. Os oligonucleotídeos alvejados àestrutura de alça ou de filamento duplo putativa dos RNAs quiméricosmitocondriais de anti-sentido foram menos eficazes.A apoptose também pode ser determinada pelo manchamentocom azul de tripano, manchamento com iodeto de propídio, imunoquímica deanexina. Nestas técnicas, as células podem ser analisadas pela microscopiafluorescente ou pela citometria de fluxo. A fragmentação do DNA pode sermedida por TUNEL ou por eletroforese para revelar a escada do DNA.
Aanálise de Western blot também pode ser usada para determinar oprocessamento das proteínas tais como caspases, poli(ADP-Rib)sintase, etc.
EXEMPLO 12.
Tratamento de células proliferativas normais ou em repouso com oligonucleotídeos complementares ao RNA quimérico mitocondrial deanti-sentido é refratário à apoptose.Como descrito antes, as células proliferativas normaissobrexpressam o RNA quimérico mitocondrial de sentido assim como o RNAquimérico mitocondrial de anti-sentido.
As células em repouso, por outrolado, não expressam nenhum destes transcritos. Portanto, foi importantedeterminar se oligonucleotídeos complementares ao RNA quiméricomitocondrial de anti-sentido induzem a morte celular em células normais.Os linfócitos humanos foram estimulados com 10 ug por ml dePHA durante 48 horas como descrito no Exemplo 8.
Em paralelo, oslinfócitos de controle também foram incubados durante 48 horas mas semPHA. Em 48 horas de cultura, 15 uM de oligonucleotídeo misturados comPEI (ver o Exemplo 10) foram adicionados aos linfócitos estimulados e de controle e ainda incubados durante 15 horas. A concentração dooligonucleotídeo foi 10 vezes mais alta do que a concentração usada nosexperimentos prévios (1 a 2 uM).
Outras amostras de linfócitos estimuladosou de controle foram tratadas com 0,4 uM de estaurosporina durante o mesmoperíodo de tempo. No final do experimento, a morte celular foi medida pelomanchamento com azul de tripano ou manchamento com DAPL Comomostrado na Fig. 10, os linfócitos de controle ou linfócitos estimulados comPHA incubados durante 15 horas sem oligonucleotídeo mostraram um nívelsimilar de apoptose espontânea que variou entre 7 a 10 % nos experimentosdiferentes. Um resultado similar foi obtido com uma concentração mais baixa(1 a 2 uM) de oligonucleotídeo. Também, os linfócitos de controle eestimulados incubados com 15 uM de oligonucleotídeo de anti-sentidodurante 15 horas mostrou nível baixo similar de apoptose (em tomo de 10 %)(Fig. 10).
Ao contrário, os linfócitos de controle ou os linfócitos estimuladoscom PHA e incubados com estaurosporina também durante 15 horas mostrouque mais de 80 % das células sofrem apoptose (Fig. 10). Isto é um resultadomuito importante porque mostra que as células em repouso normais ou ascélulas proliferativas normais tais como os linfócitos humanos são refratáriasà indução de apoptose pelos oligonucleotídeos complementares ao RNAquimérico mitocondrial de anti-sentido.
Em outras palavras, a indução deapoptose nas células tumorosas interferindo-se com o RNA quiméricomitocondrial de anti-sentido é um método terapêutico seletivo para o câncer.
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Claims (28)

1. Composição farmacêutica, caracterizadapelo fato de que a composição compreende um ou mais oligonucleotídeos de 10-50 nucleobases de comprimento que são complementares a:(i) uma molécula de RNA 16S ribossomal mitocondrial anti- sentido ligada covalentemente na sua extremidade 5' à extremidade 3' de um polinucleotídeo com uma sequência de repetição invertida, em que o referido RNA anti-sentido quimérico compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6, ou(ii) uma molécula de RNA 16S ribossomal mitocondrial sentido ligada covalentemente na sua extremidade 5' à extremidade 3' de um polinucleotídeo com uma sequência de repetição invertida, em que o referido RNA quimérico sentido compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3,Tal que os oligonucleotídeos são capazes de hibridizar com o RNA quimérico sentido ou anti-sentido para formar um dúplex estável, em que, adicionalmente, um ou mais dos oligonucleotídeos compreendem uma ou mais ligações internucleosídicas alternativas.
2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que o referido um ou mais oligonucleotídeos são selecionados do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 9-196.
3. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que a molécula quimérica mitocondrial humana compreende uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4, 5 e 6.
4. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que a molécula quimérica mitocondrial humana compreende uma sequência nucleotídica selecionada do grupo que consiste nas SEQIDNOs: l,2e3.
5. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a ligação internucleosídica alternativa é uma ligação internucleosídica de fosforotioato.
6. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o referido um ou mais oligonucleotídeos compreende ainda um ou mais oligonucleotídeos de extremidade 5’ modificados com 2-o-(2-metoxi) etila e um ou mais oligonucleotídeos de extremidade 3' modificados com 2-o- (2-metoxi) etila.
7. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido um ou mais oligonucleotídeos compreende um ou mais oligonucleotídeos bloqueados.
8. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido um ou mais oligonucleotídeos compreende um ou mais ácidos nucleicos peptídicos.
9. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a composição é formulada para administração tópica, oral, parenteral ou retal.
10. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de ser para uso no tratamento de câncer ou pré-câncer.
11. Uso de um ou mais oligonucleotídeos de 10 a 50 nucleobases de comprimento que são suficientemente complementares a:(i) uma molécula de RNA 16S ribossomal mitocondrial anti- sentido ligada covalentemente na sua extremidade 5' à extremidade 3' de um polinucleotídeo com uma sequência de repetição invertida, em que o referido RNA anti-sentido quimérico compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6, ou(ii) uma molécula de RNA 16S ribossomal mitocondrial sentido ligada covalentemente na sua extremidade 5' à extremidade 3' de um polinucleotídeo com uma sequência de repetição invertida, em que o referido RNA quimérico sentido compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3,Tal que os oligonucleotídeos são capazes de hibridizar com o RNA quimérico sentido ou anti-sentido para formar um dúplex estável, caracterizadopelo fato de ser para o preparo de um medicamento para o tratamento de um pré-câncer ou câncer.
12. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que o referido RNA quimérico sentido compreende uma sequência nucleotídicas de SEQ ID NO: 1.
13. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que o referido RNA quimérico sentido compreende uma sequência nucleotídicas de SEQ ID NO: 2.
14. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que o referido RNA quimérico sentido compreende uma sequência nucleotídicas de SEQ ID NO: 3.
15. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que o referido RNA quimérico sentido compreende uma sequência nucleotídicas de SEQ ID NO: 4.
16. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que o referido RNA quimérico sentido compreende uma sequência nucleotídicas de SEQ ID NO: 5.
17. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que o referido RNA quimérico sentido compreende uma sequência nucleotídicas de SEQ ID NO: 6.
18. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracterizadopelo fato de que os oligonucleotídeos são selecionados das SEQ ID NOs: 98-196.
19. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 11a 14, caracterizado pelo fato de que os oligonucleotídeos são oligonucleotídeos de 15 a 50 nucleobases de comprimento em que pelo menos 15 nucleobases são complementares a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e/ou SEQ ID NO: 3.
20. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 ou 15 a 17, caracterizado pelo fato de que os oligonucleotídeos são oligonucleotídeos selecionados das SEQ ID NOs: 9-97.
21. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 ou 15 a 17, caracterizado pelo fato de que os oligonucleotídeos são oligonucleotídeos de 15 a 50 nucleobases de comprimento em que pelo menos 15 nucleobases são complementares a SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 e/ou SEQ ID NO: 6.
22. Uso de acordo com a reivindicação 19 ou 21, caracterizado pelo fato de que os oligonucleotídeos possuem 18 a 50 nucleobases de comprimento.
23. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 11a 22, caracterizado pelo fato de que o referido medicamento é capaz de induzir pelo menos um de: morte de célula pré-câncer e morte de célula de câncer em células ou tecidos.
24. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 11a 23, caracterizado pelo fato de que o referido medicamento é adaptado para administração em conjunto com um medicamento quimioterapêutico para o tratamento de câncer.
25. Método de detecção para distinguir entre células normais e pré-cancerosas ou cancerosas, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:determinar o nível de pelo menos um dos RNAs quiméricos mitocondriais de anti-sentido humano de SEQ ID NO: 4-6, edeterminar o nível do RNA quimérico mitocondrial de sentido humano de SEQ ID NO: 1.
26. Método de detecção de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que cada referida etapa de determinação compreende identificar e quantificar pelo menos um dos RNAs quiméricos mitocondriais de sentido e de anti-sentido através de pelo menos um dos seguintes procedimentos: hibridização in situ,hibridização in situ fluorescente, dot blot, Northern blot, amplificação de cDNA por PCR, TMA ou ensaios de proteção de ribonuclease.
27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 e 26, caracterizado pelo fato de que as referidas etapas de determinação são realizadas em amostras humanas.
28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que as referidas amostras humanas compreendem uma amostra selecionada de: seções de tecido de biópsias humanas fixas ou congeladas, esfregaços citológicos ou suspensões de células em saliva, urina, sangue, medula óssea, colonócitos, lavagem pulmonar, e células metastáticas circulantes do sangue ou linfa.
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