JP5201834B2 - 前癌と癌細胞用のマーカー、及び前記細胞の増殖阻害方法 - Google Patents

前癌と癌細胞用のマーカー、及び前記細胞の増殖阻害方法 Download PDF

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Description

１．本発明の技術分野
本発明は、２００３年５月２１日付けで出願された米国仮特許出願第６０／４７２１０６の利益を主張する。
本発明は、ヒトのミトコンドリアキメラＲＮＡと称される、ヒトミトコンドリアＲＮＡの新規なファミリーに関連する癌治療法、癌診断及び研究試薬に関する。
特に、本発明は、ヒトミトコンドリアＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチドに関する。本発明のオリゴヌクレオチドは、癌細胞死を誘発するキメラＲＮＡにハイブリタイズする。本発明により提供される組成物と方法は、新規な癌治療として有効である。更に、このオリゴヌクレオチドは、休止期及び増殖期の正常細胞、前癌および癌細胞においてミトコンドリアキメラＲＮＡの発現が異なることに基づき癌と前癌細胞の診断に用いることができる。
２．本発明の背景技術
２．１ ミトコンドリア
ミトコンドリアは、酸化性りん酸化反応により必須分子であるアデノシン三りん酸（ＡＴＰ）を製造する細胞内小器官である。１６６５塩基対のヒトミトコンドリア（ｍｔＤＮＡ）は、２つのリボゾームＲＮＡ、２２転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡｓ）、及び同じ数のポリペプチドをエンコードしている１３オープンリーデングフレーム（ＯＲＦ）をエンコードしている（Clayton, Hum Reprod. Suppl 2:11-17, 2000; Taanman, Biochim. Biophys. Acta, 1410:103-123, 1999）。
Ｇ＋Ｔ塩基組成物の成分を基に、mtＤＮＡの２つの鎖は、ボイヤント密度（浮遊密度）が異なり、セシウムクロライド勾配（gradient）を変性して（denaturating）分離される。重鎖（又はＨ鎖）は、２つのリボゾームＲＮＡs(12Sと16S)、１４ｔＲＮＡs、並びに、ND1、ND2、ND3、ND4L、ND4、ND5、COX I、COX II、COX III、ATP6、ATP8及びCyt bに対応する１２ポリペプチドをエンコードしている。
軽鎖（又はＬ鎖）は、８ｔＲＮＡｓ及びコンプレックスＮＡＤハイドロゼナーゼＮＳ６をコードしている(Clayton, Hum Reprod. Suppl 2:11-17, 2000; Taanman, Biochim. Biophys. Acta, 1410:103-123, 1999)。
多くのmtＤＮＡは、置換ループ又はＤループと呼ばれる短い３つの鎖構造を含んでいる。ヒトにおいて１,００６の塩基対である、この領域は、フェニルアラニンのtＲＮＡ(tRNAPhe)及びプロリンのtＲＮＡ(tRNAPro)の遺伝子に接しており、Ｌ鎖に相補してＨ鎖を置換する短核酸鎖を含んでいる(Clayton, Hum Reprod. Suppl 2:11-17, 2000; Taanman, Biochim. Biophys. Acta, 1410:103-123, 1999)。
この領域は、mtＤＮＡ発現のための主なコントロール・サイトとして発展しており、リーデング鎖又は複製のＨ鎖起点、及びＨ鎖(HSP)とＬ鎖(LSP)の転写のための主なプロモーターを含んでいる。
ＨＳＰとＬＳＰ(約150 bp)は隣接しているにもかかわらず、これらの調節要素は、ミトコンドリア疾病を有する患者のモデルを利用するインビボ（体内）(Chinnery and Turnbull, Mol. Med. Today, 6:425432, 2000)と同様に、インビトロ（体外）でも機能的に独立である(Shuey and Attardi, J Biol Chem. 260:1952-1958, 1985; Taanman, Biochim. Biophys. Acta, 1410:103-123, 1999)。
双方の鎖は、ポリシトロンＲＮＡsとして転写され、これらはその後個々のmＲＮＡ、tＲＮＡ及びｒＲＮＡをリリースするためにプロセスされる(Taanman, Biochim. Biophys. Acta, 1410:103-123, 1999)。
ヒトでは、ミトコンドリアのＲＮＡポリメラーゼは、イースト・ミトコンドリアＲＮＡポリメラーゼの配列、及びいくつかのバクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼと著しい相同性を有する１,２３０のアミノ酸の蛋白質である(Tirantiら, Hum Mol Genet. 6:615-625, 1997)。
更に、転写要因のファミリーは、哺乳類のmtＤＮＡ転写として本質的で、ＤＮＡ結合蛋白の高移動性グループ(ＨＭＧ)-ｂｏｘファミリーのメンバーである、ミトコンドリア転写因子Ａ又はＴＦＭＡなどで特徴づけらている(Parisi and Clayton, Science. 252:965-969, 1991)。
最近、2つの独立した報告書で、ヒトおよびマウスにおける新規な転写因子ＴＦＢ１ＭとＴＦＢ２Ｍの特徴について記述されている(McCulloch et al., Mol. Cell Biol. 22:1116-1125, 2002; Falkenberg et al., Nat Genet. 31:289-294, 2002; Rantanen et al., Mamm Genome. 14:1-6, 2003)。
mtＤＮＡ転写に包含されるcis-とtrans-活動因子についてなされた相当の進歩にもかかわらず、機能の詳細については、十分には理解されていない。
２．２ ミトコンドリアおよびアポトーシス
ミトコンドリアは、細胞がよくコントロールされた又はプログラムされた方法で細胞が死滅する基本的な生物学のプロセスである、アポトーシス（細胞死）における中心的な役割を果たす。この細胞自殺プログラムは、進化の間、そして後生動物の成熟したホメオスタシスには本質的である。アポトーシスは、不必要な、損傷した、突然変異した、そして老化した細胞を撲滅するために活性化される(Meier et al., Nature 407:796-801, 2000)。アポトーシスの不規則化（disregulation）は、いくつかの病理学の発表で示されている。
このように、アポトーシスの異常な抑制は、腫瘍形成の特徴で、この場合、広範なアポトーシスが発作、敗血性ショック及び神経性変性不調（neurodegerative disorders）のような急性の疾病と関係づけられている。
現在、アポトーシスのプロセスは、外因性と内因性経路として知られている２つの主な経路について述べられている(Zornig et al., Biochim.Biophys. Acta, 1551:F1-F37, 2001)。
外因性経路は、異なるリガンドが死のレセプターに結合することにより、細胞膜で開始されるプロセスである(Krammer, Nature 407:789-795, 2000; Zornigら, Biochim. Biophys. Acta, 1551:F1-f37, 2001)。
カスパーゼは、アポトーシスにおいて蛋白分解性カスケードに関与する。カスパーゼは、蛋白分解性成熟又はアポトーシス誘導プロセッシングを受ける不活性プレカーサーたんぱく質として合成される(Zornig et al., Biochim. Biophys. Acta, 1551:F1-F37, 2001)。
しかしながら、より最近、いくつかの実験証拠は、リソソームプロテアーゼがアポトーシス性損傷後に蛋白質分解の代替となる経路を構成することを示している(Guicciardi et al., Oncogene, 23:2881-2890, 2004)。
他方、ヒトのオンコプロテイン（癌タンパク）Ｂｃｌ-２に同種のアンチ−アポトーシス性蛋白が記述されている。この蛋白は、アンチ−アポトーシス（Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-w）あるいはプロ−アポトーシス（Bax、Bak、Bim、Bid等）であるたんぱく質のファミリーに属する(Zorning et al., Biochim. Biophys. Acta, 1551:F1-F37, 2001)。
ミトコンドリアは、特にアポトーシス性プロセスの間の初期に影響を受ける、そして現在、これらは、細胞死の中心的なコーディネーターとして認識されている(Boya et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 304:575-581, 2003; Ferri and Kroemer, Nature Cell Biol. 3:E255-E263, 2001; Zornig et al., Biochim. Biophys. Acta, 1551:F1-F37, 2001)。
いくつかのプロ−アポトーシスシグナルと損傷経路は、Ｂｃｌ-２蛋白の制御下にあるミトコンドリア膜浸透、現象を誘発するミトコンドリアに集中する(Boya et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 304:575-581, 2003; Zornig et al., Biochim. Biophys. Acta, 1551:F1-F37, 2001)。
細胞がアポトーシス傷害を受けた後に、トランス−膜ポテンシャル(Dym )は、消失して、外部のミトコンドリア膜の完全な浸透が起こり、そしてその結果、有害なミトコンドリア内部膜蛋白の漏出が起こる。
ミトコンドリア蛋白質の漏出の最初の例は、シトクロムｃの放出であった(Liu et al., Apoptosis, 6:453-462, 2001)。
シトクロムｃがサイトゾル中に存在すると、それは、アポプトゾームと名付けられた、カスパーゼを活性化する錯体の組み立てを促進する。
シトクロムｃは、Ａｐａｆ-１(アポトーシスプロテアーゼ活性因子-1)に結合して、ｄＡＴＯ／ＡＴＰの錯体への結合と、Ａｐａｆ-１のオリゴマー化を促進する(Adrain et al., 1999; Benedict et al., 2000)。
Ａｐａｆ-１のオリゴマー化は、前駆体の蛋白質分解活性化を触媒するプロ-カスパーゼ-９の補充と活性プロ-カスパーゼ-９の生成を可能にする(Adrain et al., J. Biol. Chem. 274:20855-20860, 1999; Benedict et al., J. Biol. Chem., 275:8461-8468, 2000)。
アポトーシス蛋白質の細胞基質抑制剤のファミリーは、記述されており、ＸＩＡＰ、c-ＩＡＰ１及びc-ＩＡＰ２として知られている。これらの蛋白質は、処理されたカスパーゼ-３及びカスパーゼ-９に結合して抑制し、そしてその結果、分解のカスケードを停止する。しかし、細胞は、更にこのアンチ−アポトーシス経路をバイパスするための対抗メカニズムを含んでいる。
アポトーシスを被る細胞において、カスパーゼは、Ｓｍａｃ(カスパーゼの第２のミトコンドリアの活性剤)あるいはＤＩＡＢＬＯ(蛋白質をLow plに結び付けるDirect IAP)として知られている蛋白質のＩＡＰに結合することにより、この抑制の影響から解放される(Verhagen et al., Apoptosis, 7:163-166, 2002)。
ＩＡＰに結合することによって、Ｓｍａｃ/ＤＩＡＢＬＯは、ＩＡＰから活性カスパーゼを置換し、その結果細胞死を促進する。
ＨｔｒＡ２として知られている他の蛋白質は、アポトーシス損傷後に、ミトコンドリアから細胞基質に開放される、この場合、たんぱく質は、Ｓｍａｃ/ＤＩＡＢＬＯと同じ方法でＩＡＰに結合する、そしてそれによりカスパーゼ活性を促進する(Verhagen et al., Apoptosis, 7:163-166, 2002; Martins et al., 2001; Suzuki et al., Mol. Cell, 8:613-621, 2001; Hedge et al., Apoptosis, 7:123-132, 2002)。
アポトーシス誘発因子(AIF)は、アポトーシスカスケードの他の成分である。
アポトーシスの誘発後、ＡＩＦは、細胞基質と核に移動する。核では、ＡＩＦが周辺のクロマチン凝縮およびＤＮＡ断片化（fragmentation）を引き起こす。ＡＩＦは、末梢のクロマチル縮合とＤＮＡ断片化を誘発する。ＡＩＦは、更にDym消失とホスファチジルセリン露出のようなアポトーシスのいくつかの特徴を引き起こす(Zornig et al., Biochim. Biophys. Acta, 1551:F1-F37, 2001)。
ＡＩＦのアポトーシス活性を規制するように思われる因子は、熱ショック蛋白質70である(Ravagnan et al., Nature Cell Biol. 3:839-843, 2001)。
ＡＩＦのように、ミトコンドリアを出て、核に移動する他のミトコンドリア因子は、エンドヌクレアーゼＧ（endonuclease G）かエンドＧ（Endo G）である。
核では、エンドＧがカスパーゼ抑制剤の存在下でもＤＮＡ断片化を発生する(Li et al., Nature, 412:95-99, 2001)。
エンドＧは、ＣＡＤ(カスパーゼに活性化されたＤＮＡse)のように、その活性化がカスパーゼに極めて依存しているヌクレアーゼと同様の様式で作用する(Samejima et al., J. Biol. Chem., 276:45427-45432, 2001)。
２．３ 癌および前癌
癌は、細胞の悪性疾患で、その独自の特徴、すなわち細胞サイクルの通常の制御を失って不規則に成長し、分化が欠如し、及び他の細胞組織に進入して転移する。発癌は、正常細胞が悪性細胞に変化することによるプロセスである。
発癌は、開始が遺伝的事象で始まり、その後に初期腺腫の形成が促進される期間に改変された細胞が選択的に増加する多段階プロセスである。
連続的な発癌補助作用がないと、腺腫は消退して消滅する。
第二の遺伝的事象で、少量の発癌補助作用を受けた腺腫は、後発の腺腫形成が進行して、その後悪性の変化をたどる(McKinnell et al., “The Biology Basis of Cancer”, Ch. 3, 1998)。
癌の病因は複雑で、細胞サイクル規則の改変、染色体異常、及び染色体破損を含んでいる。発癌性ウィルス、化学品、放射線（紫外線あるいは電離放射線)、及び免疫障害のようなタイプの感染性因子は、発癌の主な原因であると考えられている(McKinnell et al., “The Biological Basis of Cancer, Ch.3, 1998)。
癌もミトコンドリアの機能障害と関係のあることは長い間提案されてきた。
これらの理論のうちの1つは、ミトコンドリアの突然変異が細胞形質転換と癌の主要な原因であるとする提案である(Warburg, 1956; Carew and Huang, Mol. Cancer, 1:1-12, 2002)。
ミトコンドリアＤＮＡ(mtＤＮＡ)の変質は、血液作用による腫瘍(Clayton and Vinograd, Nature, 216:652-657, 1967)、及び乳癌(Tan et al., 2002; Parrella et al., 2001)において報告されている。
いくつかの部位のmtＤＮＡの突然変異と欠失（deletions）は、また患者において、直腸癌、前立腺癌、卵巣癌、胃癌、膵臓癌、肝細胞性癌、食道癌、腎臓癌、甲状腺癌および脳腫瘍で明らかにされてきている(reviewd by Carew and Huang, Mol. Cancer, 1:1-12, 2002)。
一般的に、腫瘍タイプと関係のない癌において、mtＤＮＡ変質の２つの主な特徴があると推定される。大部分の突然変異は、ＴからＣとＧからＡへの塩基の転移である。第二に、突然変異が生ずる特別の遺伝子における多様性はあるが、Ｄ−ループは、ほとんどの腺腫タイプにおいてmtＤＮＡの最も頻繁な体細胞の突然変異領域になると思われる。
前癌とは、悪性細胞に進化または分化する形質転換細胞として定義される。いくつかの例は、ＤＮＡまたはＲＮＡのオンコウィルスによって変化した細胞である。
本発明は、ミトコンドリアＲＮＡの新規なファミリー、及び診断法と癌治療を目標としてこれらのＲＮＡの使用に関する。
本発明は、組成物と方法を提供する、そしてこのことは、腫瘍細胞又は前悪性細胞もしくは腫瘍形成ウィルスで変化した細胞と正常細胞とを区別するのに有用である。
特に、以下に詳述するように、本発明は、前癌及び癌細胞と正常細胞とを区別する診断検査のための組成物と方法を提供する。
本発明の他の態様では、多くの又は選択的な癌細胞死を誘発するための組成物と方法が提供される。それ故、本発明は、研究のみならず、癌および前癌の診断と治療に用いることが可能である、組成物及び方法を提供する。
３．発明の概要
本発明は、正常な休止及び増殖する細胞、前癌細胞及び癌細胞において特異的に発現される、ミトコンドリアキメラＲＮＡと称される、新規なヒトミトコンドリアＲＮＡのファミリーを検出するのに有用な組成物及び方法を対象とする。
３.１ センスミトコンドリアキメラＲＮＡ
本発明の１の態様において、１６ＳミトコンドリアリボゾームＲＮＡ（SEQ ID NO 1)の５’末端に共有結合している８１５ヌクレオチドの逆方向反復配列（inverted repeat）を含むミトコンドリアキメラＲＮＡを検出するための組成物及び方法が提供される。
この逆方向反復配列は、mtＤＮＡの１６Ｓ遺伝子のＬ−鎖から転写されるＲＮＡの８１５ヌクレオチドのフラグメントに相当する。
このように、この新規なＲＮＡの合成は、mtＤＮＡの１６ＳのＬ―鎖とＨ−鎖の転写を必要とする。mtＤＮＡの両鎖の転写は、異なるプロモーターに規制されるので、我々は、ミトコンドリアキメラＲＮＡ（SEQ ID NO 1)として、本発明におけるこの新規なＲＮＡについて言及する。更に、８１５ヌクレオチドの逆方向反復配列は“センス”１６ＳのＲＮＡ（Ｈ−鎖から転写された）に結合されるので、我々は、“センスミトコンドリアキメラＲＮＡ”として、この新規なＲＮＡについて言及する。
本発明は、培養細胞、細胞サンプル及び組織切片（tissue sections）におけるセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの発現を検出する組成物と方法を提供する。
この検出は、in situハイブリダイゼーション、対応するcＤＮＡの合成とＰＣＲによる増殖、転写媒介増殖（transcription mediated amplification）（ＴＭＡ）(Comanor et al., J. Clin Virol., 28:14-26, 2003)もしくはノーザンブロット、又は当技術分野の技術者に自明である他の方法により行われる。
本発明の１の側面によると、in situ ハイブリダイゼーションアッセイは、センスミトコンドリアキメラＲＮＡが正常の増殖期の細胞、異なる腫瘍型の人体生検に存在する腫瘍細胞におけると同様に培養中の腫瘍細胞に発現することを示す。センスミトコンドリアキメラＲＮＡは、正常の休止期の細胞には発現しない。
本発明の他の態様によると、パピローマ・ウイルス（乳頭腫ウィルス）１６又は１８により形質転換（transform）した細胞中の第二の新規なセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを検出する方法と構成が提供される(Hausen, Biochim. Biophys. Acta, 1288:F55-F78, 1996)。
これらの形質転換した細胞において、１６ＳミトコンドリアＲＮＡの５’末端に共有結合している７５４ヌクレオチドの逆方向反復配列からなる、新規なセンスミトコンドリアキメラＲＮＡが発現する（SEQ ID NO 2）。
このＲＮＡは、正常な増殖細胞中又は腫瘍細胞中には存在しない。本方法と組成物は、また１６ＳミトコンドリアＲＮＡ（SEQ ID NO 3）の５’末端に共有結合している６９４ヌクレオチドの逆方向反復配列からなる第三のセンスミトコンドリアキメラＲＮＡがＨＴＬＶ−１で形質転換した細胞中に存在することを実証する。
３.２ アンチセンスのミトコンドリアキメラＲＮＡ
本発明は、更に正常な増殖細胞がSEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6に対応するアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを発現することを示す方法と組成物を提供する。
これらの転写産物は、１６ＳミトコンドリアリボゾームのＲＮＡ（Ｌ−鎖から転写された）の５’末端に結合している、それ故にアンチセンスのミトコンドリアＲＮＡ名である、可変の長さ（Ｈ−鎖から転写された）の逆方向反復配列を含む。
アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの発現は、形質転換した又は前癌細胞中のみならず、異なるタイプの腫瘍のヒト生検中に存在する腫瘍細胞中と同様に、増殖中の腫瘍細胞系中で下方制御（down regulate）される。
従って、本発明は、通常の増殖細胞を癌細胞と前癌細胞から区別するセンスとアンチセンスのミトコンドリアキメラＲＮＡの発現を検出する方法と組成物を提供し、それ故に悪性細胞と癌のための新規なマーカーを提供する。
３.３ 癌療法
本発明の他の態様では、方法と組成物は、センスとアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを阻害（interfere）するために提供される。
１つの好ましい態様は、低コピー数のこの転写産物を含む腫瘍細胞中のアンチセンスのミトコンドリアキメラＲＮＡを阻害することである。この阻害は、その配列がアンチセンスのミトコンドリアキメラＲＮＡ(SEQ ID NO 4及び／又はSEQ ID NO 5 及び／又は SEQ ID NO 6)の配列に相補している、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体を用いて行われる。１又はそれ以上のこれらの相補的なオリゴヌクオチドを用いた異なるタイプの腫瘍細胞の処理は、細胞死又はアポトーシスを誘発する。
これらのオリゴヌクレオチドは、少なくとも１５核酸塩基がSEQ ID NO 4及び／又はSEQ ID NO 5及び／又はSEQ ID NO 6に相補する１５ないし５０のヌクレオチドの合成物である。
これらの相補的なオリゴヌクレオチドの例は、SEQ ID NOS 9〜98の中で示される。
ヒトリンパ球（正常な休止細胞）又はフィトヘムアグルチニン（植物性血球凝集素）で活性化されたヒトリンパ球(正常な増殖細胞)の処理は、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの配列に相補するオリゴヌクレオチドを用いて同条件で処理した後にはアポトーシスを受けないので、アポトーシスの誘発は、選択的である。
もし、腫瘍細胞がセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ（SEQ ID NO 1及び／又はSEQ ID NO 2及び／又はSEQ ID NO 3）を標的又は相補するオリゴヌクレオチドで処理すると、細胞死又はアポトーシスの誘発が減じられる。
図面の簡単な説明
図面の簡単な説明については後述する。
４.発明の詳細な説明
４.１ ヒトミトコンドリアキメラＲＮＡファミリー
本発明は、ヒトの細胞がヒトのミトコンドリアキメラＲＮＡと称される、新規なミトコンドリアＲＮＡのファミリーを発現するという驚くべき発見に基づくものである。
これらの転写産物に１つは、センスミトコンドリアキメラＲＮＡと名付けられた、ミトコンドリアの１６ＳリボゾームＲＮＡの５’末端に共有結合している８１５ヌクレオチドの長い逆方向反復配列が含まれる。この長い逆方向反復配列は、長い二重鎖幹と５０ヌクレオチドを形成する、位置５１から８６６の１６ＳリボゾームＲＮＡに十分に相補している。
図１Ａに示すように、８１５塩基対のステムは、逆方向転写酵素（reverse transcriptase）が相当するｃＤＮＡを合成するのに重要な問題を示す。従って、新しい戦略は、図１Ａに例示するＲＴ−ＰＣＲによりこのＲＮＡを増殖するのに用いられる。
各重なり合うフラグメントの配列を得た後に、それらは、SEQ ID No1(図１Ａ)に示すセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの完全な配列を得るためにコンティグ（contigs）として組み立てられる。
この発明の他の側面は、癌遺伝子のヒトの乳頭腫ウィルス（パピローマ・ウイルス）１６又は１８で形質転換した細胞中に発現する他の新規なセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの発見である。
人間の包皮角化細胞（Human foreskin keratinocytes）(HFK)は、ＨＰＶ１６又は１８により感染した(Hausen, Biochim. Biophys. Acta, 1288:F55-F78, 1996)。
この感染は、ＨＦＫの形質転換又は不死化を引き起こす。
しかしながら、これらの細胞は、関連するＳｉＨａ細胞（ＨＰＶ１６に感染した）又はＨｅＬａ細胞（ＨＰＶ１８に感染した）のような発癌性ではない。
これらの細胞は、ＳｉＨａとＨｅＬａ細胞に類似するセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ（SEQ ID NO 1）を発現する。
しかしながら、形質転換した細胞は、更に１６ＳリボゾームＲＮＡ(図１Ｂ)(SEQ ID No 2)に結合する７５４ヌクレオチドの逆方向反復配列を含む、他の第二のセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを発現する。この新しいセンスミトコンドリアキメラＲＮＡは、正常なヒトの細胞（HFK）中もしくは発癌性細胞（SiHa又はHeLa細胞）中では下方制御されるか、又は発現しない。
この発明の別の態様で、我々は、ＨＴＬＶ-１(Kobayashi et al., EMBO J., 3:1339-1343, 1984)で形質転換した細胞中で第三のセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの発現を決定した。
ＨＴＬＶ-１に感染したＭＴ-２細胞は、センスミトコンドリアキメラＲＮＡ(SEQ ID NO 1)とＨＰＶ１６あるいは１８(SEQ ID NO 2)で形質転換された細胞中に発現するセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを発現する。
これらの転写産物に加えて、ＨＴＬＶ-１で感染された細胞は、１６ＳリボゾームＲＮＡの５’末端に結合する６９４ヌクレオチドの逆方向反復配列を含む、第三のセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを発現する。
この新規なＲＮＡ(図１Ｃ)(SEQ ID NO 3)は、正常な増殖する細胞の中で、癌細胞の中で、あるいはＨＰＶ１６あるいは１８で形質転換されたＨＦＫの中では発現されない。
前節に記載したヒトの包皮角化細胞（forskin keratinocytes）（HFK）のような正常の増殖する細胞は、センスミトコンドリアキメラＲＮＡ(図６) (SEQ ID NO 1)を過剰発現（over express）する。
フィトヘムアグルチニン（phytohaemagglutinin）(PHA)のようなミトゲンで活性化されたヒトのリンパ細胞は、細胞周期のSフェーズに入って、ＤＮＡの合成を始める（Yu et al., J. Biol. Chem., 266:7588-7595, 1991）。
増殖する細胞として、リンパ細胞は、Ｋｉ-６７のような増殖に関連して、細胞核抗原またはＰＣＮＡを増殖する抗原を発現する(Bantis et al., Cytopathology, 15:25-31, 2004)。
脾臓の胚の中心にあるリンパ細胞、精原細胞、及び胚の細胞のような他の増殖する細胞は、またセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ(SEQ ID NO 1)(図4)を過剰発現する。対照的に、活性化されないリンパ細胞、又は筋細胞のような非増殖細胞は、センスミトコンドリアキメラＲＮＡ(図7)を発現しない。
本発明の他の態様で、腫瘍細胞と正常に増殖する細胞とを区別する方法が提供される。以前に記述したように、腫瘍細胞と正常に増殖する細胞は、SEQ ID NO 1に記述したセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを過剰発現する。
更に、ＨＰＶおよびＨＴＬＶ-１で感染された特別の状況において、付加的なキメラＲＮＡが見出される (SEQ ID NO 2及びSEQ ID NO 3)。
しかしながら、本発明は、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを過剰発現するという驚くべき発見に基づくものである。
アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの発現は、ＰＨＡ(図7)で活性化されたヒトのリンパ細胞中で、正常なＨＦＫで及び他の正常な増殖する細胞(図6)中で確認された。
この発明の他の驚くべき発見は、正常に増殖する細胞と異なり、腫瘍細胞がアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを発現しないか、又はその生産を下方制御するということである(図6及び図7と図4を比較する)。
ＲＴ-ＰＣＲによってオーバーラップしているフラグメントに基づくキメラＲＮＡを増殖するために同様の方策を用いて、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの構造が決定された(図３)。
コンティグにおけるその配列と組み立ては、アンチセンスの１６ＳミトコンドリアリボゾームＲＮＡ(図３Ａ、Ｂ及びＣ)(SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6)の５’末端に結合している異なる長さの逆方向反復配列を含むアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの複雑なファミリーを明らかにする。
その配列は、またこれらのＲＮＡにおける二重鎖構造又はステムの生成、及び７、９６及び４５１ヌクレオチド(図３Ａ、Ｂ及びＣ、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6)をそれぞれ有するループの生成を明らかにする。
本発明の他の態様では、腫瘍ウィルスによって細胞の発癌性形質転換を生じさせる方法と組成物が提供される。ＨｅＬａ細胞(HPV 18に感染した)又はＳｉＨａ細胞(HPV 16に感染した)は、センスミトコンドリアキメラＲＮＡを過剰発現する、しかしアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの発現を下方制御する。他方、正常な増殖細胞であるＨＦＫは、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡと同様にセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの双方を過剰発現する。
ＨＰＶ１６あるいはＨＰＶ１８でＨＦＫの形質転換の後に、細胞は、腫瘍表現型を得、これらはセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを過剰発現し、そしてアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの発現を下方制御する。センスミトコンドリアキメラＲＮＡの過剰発現及びアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの発現の下方制御は、in situハイブリダイゼーション、ＲＴ-ＰＣＲによるＲＮＡの増殖、又は当該分野の技術者によってよく知られた方法によるＲＮＡを決定する他の方法を用いることにより決定される。これらの方法と組成物は、他の腫瘍ウィルスで又は形質転換又は発癌性を誘発する複合物により、キメラＲＮＡ細胞ファミリーの発現における変化を決定するのに用いられる(McKinnell et al., “The biological basis of Cancer, Cambridge University Press1998)。
４.２ 癌および前癌診断
本発明により、方法と組成物は、生体サンプル中にセンスミトコンドリアキメラＲＮＡとアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの存在を検出するために提供される。
1つの好ましい態様では、検出は、in situハイブリダイゼーションにより行われる。
生体サンプルの細胞中のセンスミトコンドリアキメラＲＮＡとアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの検出は、細胞が正常な増殖中の細胞であることを示す。
他の態様において、腫瘍細胞によるin situハイブリダイゼーションの結果は、センスミトコンドリアキメラＲＮＡの発現と、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの下方制御又は不存在を示す。
もし、生体サンプルが非増殖の正常細胞を含む場合、in situハイブリダイゼーションは、センスミトコンドリアキメラＲＮＡとアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡのいずれも発現しないことを示す。
生体サンプルは、培養中の又は血液スミア（smears）もしくは骨髄スミア中の正常細胞（休止又は増殖する細胞）、培養中の腫瘍細胞、及び腫瘍ウィルスで形質転換された正常細胞として理解される。
更に、生体細胞は、膀胱もしくは腎臓癌を有する疑いのある患者からの尿もしくは膀胱洗浄から得られた細胞、又は頭と首の癌を有する疑いのある患者の唾液からの細胞、肺癌を有する疑いのある患者の管支肺胞からの細胞を含む。また、生体サンプルは、白血病を有する疑いのある患者の血液からの細胞スミア、又は転移を有する疑いのある患者の血液、リンパ液、リンパ節からの細胞スミアを含む。
本発明による生体サンプルは、当分野の技術者に良く知られた技術である、組織病理学の分析のため急速冷凍した組織あるいは細胞サンプルの使用を含む。
あるいは、生体サンプルは、当分野でよく知られた多種多様の固定プロトコル(Frederick et al, Current Protocols In Molecular Biology, Volume 2, Unit 14, Frederick M. Ausubul et al. edS., 1995; Celis, Cell Biology, A Laboratoty Handbook, Julio E. Celis, ed., 1994)により行うことができる化学処理の使用により固定される薄片の生体検査になりうる。
生体サンプルは、また化学的修飾、ホルマリン処理又は当該分野でよく知られた他の固定がなされていない非固定の生物由来物質であってもよい。
あるいは、in situハイブリダイゼーションは、パラフィン又は他の包埋ができるポリマーのような物質に包埋された生体サンプルの使用により行うことができる。
包埋により得られたブロックは、ミクロトームで約４ないし１０μｍの厚みの切片にする。この切片は、ポリリシン又はムッセル（mussel）接着性蛋白質のような技術分野で知られた接着性物質で被覆されてガラス又はポラスチックスライドに乗せられる(Burzio et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8:309-312, 1997)。
in situハイブリダイゼーションは、この分野の技術者によく知られた方法で行われる。例えば、細胞中でセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ（SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3）、又はアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ(SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6)の１又は２以上の配列を標的にした１又は２以上の標識されたプローブからなるハイブリダイゼーション溶液は、ハイブリダイゼーション条件下で細胞と接触される。そのハイブリダイゼーションシグナルは、それから正常の又は制御された癌及び前癌細胞から予め決定されたハイブリダイゼーションパターンと比較される。
ここに使用されているように、in situハイブリダイゼーションを行うために標識されたプローブは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又は当該分野で知られている任意の方法により製造されうる合成核酸である。
合成核酸は、インビトロで転写されたリボプローブ又はＰＣＲフラグメントを含む。
この発明の好ましい態様において、合成された相補的なオリゴヌクレオチドが用いられる。相補的なオリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも長さ約１０のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１４、特に好ましくは少なくとも長さ１８のヌクレオチドである。当業者は、長さが１０ヌクレオチドから、センスミトコンドリアキメラＲＮＡ又はアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡにハイブリダイゼーションが可能である長さにまで拡張できることを理解する。ここでの好ましい態様において、長さは、約３０ヌクレオチド、より好ましくは約２５ヌクレオチド、そしと最も好ましくは１０から５０ヌクレオチドである。
より長いプロービング核酸もまた使用できる。プローブの配列は、少なくとも９５％がSEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5及びSEQ ID NO 6にリストされた配列に同種である。
本発明の相補的なオリゴヌクレオチドプローブは、一般にリン酸ジエステル（phosphodiester）結合を含む、しかし、ある場合には、限定されるものではないが、ホスフォロチオエート（phosphorothioate） (Mag et al., Nucleic Acids Res. 19:1437-1441, 1991; 及び米国特許番号5,644,048), ペプチド性核酸（peptide nucleic acid）又はＰＮＡ(Egholm, Nature, 365:566-568, 1993; 及び米国特許番号6,656,687), phosphoramide (Beaucage, Methods Mol. Biol. 20:33-61, 1993), ホスフォアミド（phosphoramide） (Beaucage, Methods Mol. Biol. 20:33-61, 1993), ホスフォロジチオエート（phosphorodithioate）(Capaldi et al., Nucleic Acids Res., 28:E40, 2000)からなるインターヌクレオシド連鎖を交互に含むオリゴヌクレオチドプローブ類似体も含まれる。
他の相補的なオリゴヌクレオチド類似体は、限定されるものではないが、モルフォリノ（morpholino） (Summerton, Biochim. Biophys. Acta, 1489:141-158, 1999)、ロックされたオリゴヌクレオチド（locked oligonucleotides） (Wahlestedt wt al., Proc. Natl. Acad. Sci. US, 97:5633-5638, 2000)、ペプチド性核酸（peptidic nucleic acids）又はＰＮＡ (Nielsen et al., 1993; Hyrup and Nielsen, 1996)又は2-O-(2-メトキシ)エチル変性５’及び３’末端オリゴヌクレオチド（2-o-(2-methoxy) ethyl modified 5’ and 3’ end oligonucleotides）(McKay et al., J. Biol. Chem., 274:1715-1722, 1999)などを含む。
これらの引例のすべては、参照することにより明らかに本明細書に組み込まれる。
核酸は、デオキシリボ−とリボ−ヌクレオチドのいかなる結合、及びウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キササナイン（xathanine）、ハイポキサナイン（hypoxathanine）、イソシトシン、イソグアニン（isoguanine）等を含むいかなる塩基の結合を含めることができる。
本発明の他の態様では、核酸またはオリゴヌクレオチドプローブは、センスミトコンドリアキメラＲＮＡ又はアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡによるハイブリダイゼーションを検出するために標識される。プローブは、その技術分野で知られている任意の方法により検出可能なマーカーにより標識される。
プローブを標識する方法は、ランダムのプライミング、エンドラベリング、ＰＣＲ、及びニックトランスレーションを含む。
酵素の標識付けは、核酸ポリメラーゼ、３つの未標識ヌクレオチド、及び標識が直接付けられるか、標識するためにリンカーアーム（linker arm）を含むか、又はハプテンもしくは標識が付けられた結合分子が結合するかもしれない他の分子に付けられる4番めのヌクレオチドの存在下で行なわれる。
適切な直接の標識は、.sup.32 P、.sup.3 Hおよび.sup.35 Sのような放射性のラベル、並びに蛍光性のマーカーのような非放射性の標識を含む。
好ましい蛍光色素(fluorophores)は、５(６)カルボキシフルオレセン[5(6)carboxyfluorescein]、６-((７-アミノの-４-メチルコウマリン-３-アセチル)アミノ)ヘキサノイック酸[6-((7-amino-4-methylcoumarin-3-acetyl)amino) hexanoic acid]、５（及び６）-カルボキシ-X-ローダミン[5(and 6)-carboxy-X-rhodamine]、シアニン２(Cy２)染料[Cyanine 2 (Cy2) Dye]、シアニン３(Cy３)染料[Cyanine 3 (Cy3) Dye]、シアニン３.５(Cy３.５)染料[Cyanine 3.5 (Cy3.5) Dye]、シアニン５(Cy５)染料[Cyanine 5 (Cy5) Dye]、シアニン５.５(Cy５.５) 染料[Cyanine 5.5 (Cy5.5) Dye]、シアニン７(Cy７)染料[Cyanine 7 (Cy7) Dye]、シアニン９(Cy９)染料[Cyanine 9 (Cy9) Dye]、（シアニン染料2、3、3.5、5および5.5は、Amersham, Arlington Heights, III からのNHSエステルとして入手可能である。）、又はアレクサ染料[Alexa dyes]（Alexa 488、Alexa 532、Alexa 556、Alexa 590等を含む。）(Molecular Probes, Eugene, Oreg.)を含む。
プローブは、ハプテン又は他の分子に共有結合しているヌクレオチドに結合することにより直接的に標識される。好ましいハプテンは、限定されるものではないが、５(６)-カルボキシフルオレセイン[5(6)-carboxyfluorescein]、２,４-ジニトロフェニルジオキシゼニン[2,4-dinitrophenyl、digoxigenin]、及びビオチンを含み、そしてそのハプテン又は他の分子に対する標識された抗体でプローブの検出を行う。
ビオチンの場合、検出は、検出可能なラベルに接合しているアビディン（avidin）あるいはストレプトアビジン(streptavidin)により行うことができる。
抗体、ストレプトアビジンおよびアビディンは、蛍光性のマーカーで、あるいはそれらを検出可能にするアルカリホスファターゼかホースラディッシュ・ペルオキシダーゼのような酵素のマーカーに接合される。
接合されたストレプトアビジン(streptavidin)、アビディン及び抗体アンチジゴキシゲニン(digoxigenin)は、ベクター研究所(バーリンゲーム,カリフォルニア)およびボエリンゲルマンハイム(Boehringer Mannheim)(インディアナポリス、インディア)のような会社から商業的に入手可能である。
他の具体例では、抗体又はストレプトアビジンは、多くの安定した蛍光放射量子ドットに接合される(Wu et al., Nature Biotechnol. 21:41-46, 2003)。
抗体とストレプトアビジンに結合している酵素は、酵素に対する基質（substrate）を提供することにより、熱量反応を通して検出することができる。
種々の基質の存在において、異なる色は、反応により生成され、そしてこれらの色は、多数のプローブを別々に検知するために視覚化することができる。
当該分野で公知のいかなる基質も使用できる。
アルカリ性ホスファターゼに対する好ましい基板は、５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリルホスフェーテ(5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate)(BCIP)及びニトロブルーテトラゾリウム（nitro blue tetrazolium）(NBT)を含む。
ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase）用の好ましい基質は、ジアミノベンゾエート(diaminobenzoate)(DAB)である。
その分野の当業者は、更にその他の酵素活性を用いることが可能であることを理解する。
本発明の他の具体例では、正確で複製可能な結果を達成するin situハイブリダイゼーションを行うための条件が記述される。
核酸ハイブリダイゼーションの分野の技術者は、ハイブリダイゼーションの厳格性をコントロールするために一般に使用される因子がホルムアミド濃度あるいは他の化学的変性試薬、塩濃度又は可変のイオン強度、ハイブリダイゼーション温度、界面活性剤濃度、ｐＨとカオトロピック剤（chaotropic agents）の存在又は不存在、を含むことを認識するであろう。
これらの厳格因子は、それによりキメラＲＮＡに対するオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションの厳格さをコントロールするために調整することができる。分析用の最適の厳格さは、所望の厳格さの程度が達成されるまで、各厳格因子の実験によって実験的に決定される。
最良のin situハイブリダイゼーションを制御するための他の条件は、例えば、標的のキメラＲＮＡよりも生体サンプル中に存在する、成分に対するプローブの非特定結合をブロックする化学薬品の使用である。
ブロッキング試薬（遮断薬）は、限定されるものではないが、ＲＮＡ、ＤＮＡあるいは標識されていないオリゴヌクレオチドである。
ハイブリダイゼーション溶液中で結合しているブロッキング試薬は、標識されたプローブの非特定結合を制御する、そしてそれ故分析のシグナル対ノイス比を増加する。
本発明の他の側面において、プローブは、センス又はアンチセンスのミトコンドリアＲＮＡの配列に相補する配列を有する(SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 and SEQ ID N 6 参照)
生化学的配列の固定は、また実験的に決定されるin situハイブリダイゼーションの重要な側面である。グルタルアルデヒドのような高度に架橋された固定剤は、標的のセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ又はアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡへのプローブのアクセスがブロックされるので、推奨されない。
この発明の好ましい方法は、冷凍のサンプルも好ましいが、ホルマリンで固定された生体サンプルである。センスミトコンドリアキメラＲＮＡ又はアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標識されたプローブに触れさせるために、付加的な操作を用いることができる。
例えば、生体サンプルは、プローブが標的キメラＲＮＡにアクセスするのをブロックする蛋白質を除去するためにプロテイナーゼＫで消化することができる。
in situハイブリダイゼーションに先立って、生体サンプルをプロテイナーゼＫ又は他のプロテアーゼで処理することは、当該分野の技術者によく知られている。
前述したように、キメラＲＮＡとアンチセンスキメラＲＮＡ中の長い逆方向反復配列は、高度に安定な二重鎖の生成を誘発する。キメラＲＮＡの単一鎖領域の第二の構造を有するこれらの構造は、プローブが標的キメラＲＮＡにアクセスするのにバリヤーを構成する。
従って、本発明の他の側面では、生体サンプルは、キメラＲＮＡを変性するために、室温で１０分間０．２ＭのＨＣｌで処理される。
該サンプルは、ここに記述するin situハイブリダイゼーションプロトコルを適用する前に、ｐＨ７．４の緩衝溶液で数回洗浄することにより急速に中和される。
ここに記述する、通常のルーチン実験およびその開示の下にこの分野の技術者は、ここに記述する方法と組成物を利用して分析を行うための適切なハイブリゼイション条件を容易に決めることができる。適切なin situハイブリダイゼーション条件は、in situハイブリダイゼーション操作を行うのに適切なこれらの条件である。
従って、適切なin situ ハイブリダイゼーション条件は、ここにおける開示と引例（場合によっては更なるルーチン実験を用いて）を用いて明らかになる。
本発明の他の具体例において、in situハイブリダイゼーションにより決められたようにセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの局在化（localization）は、癌を持つ患者の予後と管理に重要な情報である。腫瘍細胞において、センスミトコンドリアキメラＲＮＡは、遅発エンドソーム／リソソームに付随する細胞質中に最も見出される。しかし、核小体中の局在化は、また、ある細胞中にも見出される。
ヒトの生体検査における腫瘍細胞の存在において、そのハイブリダイゼーションのシグナルは、センスミトコンドリアキメラＲＮＡが細胞質中にのみ、又は細胞質と核小体中もしくは細胞質と細胞核中に存在することを示す。
従って、異なる局在化は、重要な予後の重要性を持つこともよそうされる。
好ましい具体例において、例えば乳房、大腸及び前立腺腫瘍からのヒトの生検のパネルは、キメラＲＮＡを検出するためのin situハイブリダイゼーションにより研究されうる。
肯定的なハイブリダイゼーションシグナルと共に（プローブがどのように標識されたかには左右されず）、細胞内局在化（唯一細胞質、細胞質及び核小体、又は細胞質及び細胞核）は、各腫瘍中で確立され、そしてその結果は各患者の生存と比較された。
この発明の他の側面において、正常な及び／又は腫瘍細胞を含む個別細胞の混合物は、蛍光色素（fluorochrome）で標識され、センスミトコンドリアキメラＲＮＡとアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡに相補するオリゴヌクレオチドプローブを有する検査液中でハイブリダイゼーションされる。
例えば、センスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にしているプローブは、ローダミンで標識表示され、そしてセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にしているプローブは、アレクサ（Alexa）４８８で標識表示されうる。
以前に記述した条件の下にハイブリダイゼーションと洗浄後に、細胞は、細胞内の標識表示するフローサイトメトリー（flow cytometry）により分析することができる。
本発明の好ましい態様は、腫瘍細胞中のキメラＲＮＡの特定の局在化について得られた情報が予後診断の重要な更なる情報を提供するので、in situハイブリダイゼーションに用いることである。
本発明の更に他の態様において、代替分子法は、正常、前癌及び癌細胞中でのキメラＲＮＡの発現及びセンスとアンチセンスキメラＲＮＡの差次的発現を検出するのに用いられる。これらの別法は、限定されるものではないがノーザンブロット、ドットブロット、キメラＲＮＡとアンチセンスキメラＲＮＡに対するオリゴヌクレオチド配列、ＲＴ−ＰＣＲによるＲＮＡの増殖、インビトロ転移介在性増殖又はＴＭＡによるＲＮＡの増殖、Ｓ１又はリボヌクレアーゼ（ＲＮＡ分解酵素）アッセイ、等を含む。
本発明の１つの態様で、センスミトコンドリアキメラＲＮＡは、１６ＳリボソームＲＮＡの５’末端部を含む領域、又は逆方向反復配列の部分的もしくは全領域の増殖により得られたプローブを用いて診断目的で検出することができる。
図１に示すように、リバースプライマーは例えばプライマー１（SEQ ID NO 139）にすることができ、そしてフォワードプライマーは、プライマー３,４,５,６又は７（SEQ ID NOS 129,11,106,102,63）にすることができる。他の部分に位置するプライマーもまた使用することができ、そしてこれらは該分野の技術者により容易にデザインできる。この発明の他の側面で、逆転写活性を有する酵素とヘキサマー又はより長鎖のようなランダムプライマーにより合成されるｃＤＮＡは、当該分野の技術者によく知られている。
得られた２１０、３５０、５００もしくは８５０ｂｐ、又は他の部分に位置するプライマーを用いて得られた他のサイズのアンプリコン（amplicons、単位複製配列）は、アガロースゲル又はポリアクリルアミドゲル中の電気泳動(Sambrook et al., 1989)及び臭化エチジウム又は他の挿入染料を用いて染色することにより検出できる。
このアンプリコンは、メーカーの指示書により精製される。
ミトコンドリアキメラＲＮＡの検出は、ノーザンブロットにより行うことができる(Sambrook et al., 1989)。
アガロースゲル中のＲＮＡの分離後に、フラグメントは、当該分野の技術者によく知られた操作により膜（ニトロセルロースまたはナイロン）に転送される(Sambrook et al., 1989)。膜を調べるために、センスミトコンドリアキメラＲＮＡの１０００から１２５の位置に相当する２５０ｂｐのフラグメントは、増殖される。
アンプリコンは、製造指示書により精製され(Wizard, Promega)、そして１０ナノグラムが第２の増殖のために鋳型として用いられる。
この増殖は、ＰＣＲ（Invitrogen）と32P-a-dCTP (Amerscham)の５マイクロキュリーの鎖混合物で行う。放射性の増殖フラグメントは、９５℃で１０分間インキュベートにより変性し、変性されたプローブは、ハイブリダイゼーション混合物に添加される。膜は、６５℃で１６時間、ハイブリダイズされて、その後２倍のＳＳＣ緩衝液で２度、６０℃で０．５倍のＳＳＣで２度、そして４５℃で０．２倍のＳＳＣで洗浄される(Sambrook et al., 1989)。洗浄された膜は、−７０℃で一晩Ｘ線フィルムに曝される(Sambrook et al., 1989)。
膜上のハイブリダイゼーションシグナルは、１６ＳリボゾームＲＮＡ(1559のヌクレオチド)と８１５ヌクレオチドの逆方向反復配列に相当するサイズである２,４００のヌクレオチドの主な成分に相当する。
本発明の他の態様で、センスミトコンドリアキメラＲＮＡの一部は、細胞又は細胞の組織から抽出された全ＲＮＡのリボヌクレアーゼ（ＲＮＡ分解酵素）の消化の後に検出される。
二重鎖構造又はセンスミトコンドリアキメラＲＮＡのステムは、リボヌクレアーゼによる消化に耐性がある。
細胞又は細胞の組織からトリゾール(TriZol) (Invitrogen)で抽出された全ＲＮＡは、２倍のＳＳＣの小容量中に溶解される。溶液は、５０μｇ／ｍｌの最終濃度でＲＮＡ分解酵素Ａ(Sigma)を用いてインキュベートされる。
２５℃で３０分後に、ヌクレアーゼに対するＲＮＡ耐性は、トリゾールで抽出され、−２０℃で一晩イソプロパノールを用いて沈殿させる。ヌクレアーゼに対するＲＮＡ耐性は、蒸留されたＤＥＰＣ処理水に溶解し、そしてＲＴ-ＰＣＲ増殖のために鋳型として用いられる。
１６ＳリボゾームＲＮＡの位置５５および７９０を標的とするプライマーを用いて行った増殖は、センスミトコンドリアキメラＲＮＡ(SEQ ID NO 1)のステムと同じ配列で１００％同一性を示す配列と約７３０塩基対のフラグメントを生ずる。
その一方、キメラＲＮＡで３’ハーフに相補する単一鎖、又は１２ＳミトコンドリアリボゾームＲＮＡ、又は１８ＳリボゾームＲＮＡもしくはＧＡＰＤＨに対するｍＲＮＡは、リボヌクレアーゼＡで処理することにより全体的に消化され、そしてそれ故、これらのＲＮＡを標的にするプライマーが用いられた場合に、増殖生成物は、得られない。
本発明の他の態様では、全ＲＮＡがリボヌクレアーゼＡで処理された後、得られたセンスミトコンドリアキメラＲＮＡのステムは、ノーザンブロットにより検出できる。ヌクレアーゼに耐性を示し、トリゾールによる抽出とイソプロピルアルコールを用いた沈殿により回収されるＲＮＡは、アガロースゲル中の電気泳動によって分離される。転移の後に、膜は、前述したプローブでブロットされ、そしてセンスミトコンドリアキメラＲＮＡをノーザンブロット(Sambrook et al., 1989)するのに用いられる。
他の態様では、この発明は、センスミトコンドリアキメラＲＮＡ又はアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを生体サンプル中でアッセイを検出するのに適したキッドを教示する。キメラＲＮＡの検出に適した、一般的で好ましい態様、組成物及び方法が提供され、in situハイブリダイゼーションによるアンチセンスキメラＲＮＡは、既に本明細書で記述された。
好ましいオリゴヌクレオチドプローブ配列は、限定されるものではないがリストに記載されている。更に、オリゴヌクレオチドプローブを使用するのに適した方法あるいはサンプル中のキメラＲＮＡもしくはアンチセンスキメラＲＮＡを検出するキッドのオリゴヌクレオチドプローブは、既に本明細書で記述された。
本発明のキットは、1つ以上のオリゴヌクレオチドプローブと、サンプル中のセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ又はアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを検出するために用いるin situハイブリダイゼーションを行うために選択された試薬又は組成物からなる。２以上のオリゴヌクレオチドの各セットは独立して検知可能な構成部分で好ましくはラベル化され、そして生体サンプルの個々の細胞において、センスミトコンドリアキメラＲＮＡ又はセンスミトコンドリアキメラＲＮＡが検出される。
好ましい態様において、センスミトコンドリアキメラＲＮＡ又はアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを検出するのに用いるキットのオリゴヌクレオチドプローブは、異なるハプテンで各セットごとに標識される。このハプテンは、ビオチン、ジゴキシゲニン、あるいは異なる酵素(例えばアルカリホスファターゼあるいはペルオキシダーゼ)で標識した抗体あるいはストレプトアビジンでin situハイブリダイゼーション方法で認識できるフルオレセイン（蛍光色素）とすることができる。
他の方法として、プローブの各セットの各オリゴヌクレオチドプローブは、独立して検出可能な蛍光性のグループで標識できる。
例えば、センスミトコンドリアキメラＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドプローブのセットは、ローダミンで標識できる、一方、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドプローブのセットは、アレクサ４８８(Alexa 488)で標識できる。
更に、生体サンプルの細胞中のキメラＲＮＡ又はアンチセンスキメラＲＮＡの局在化を決定する方法が提供される。
更に、本発明の組成物と方法は、共焦点顕微鏡分析を用いて異なる細胞小器官の特定のマーカーでキメラＲＮＡ又はアンチセンスキメラＲＮＡの共−局在化（co-localization）を決定するのに使用することができる。
ここに提供される組成物および方法は、前癌および癌の検知と診断に特に有効であると考えられる。
ここに提供されるような用語「癌」は、以下の確認されている特異な条件のいずれか１により悩まされる細胞を含んでいる。
これらは、急性慢性である骨髄性白血病、急性慢性であるリンパ芽球の白血病、多発性骨髄腫、ホジキン病、非ホジキンのリンパ腫あるいは悪性リンパ腫;胃癌、食道癌か腺癌、膵臓送管の腺癌、インスリノーマ（膵島細胞腫）、グルカゴン産生腫瘍（glucagonoma）、ガストリノーマ（gastrinoma）、小腸腺癌（small bowel adenocarcinoma）、結腸直腸癌;肝細胞性の癌、肝細胞性の腺腫;カルチノイド、腎臓腺癌のような尿生殖路、ウイルム腫瘍（Wilm's tumor）、膀胱および尿道癌および前立腺癌、精上皮腫のような精巣癌、奇形腫、奇形癌、間質細胞癌腫; 子宮内膜の癌、子宮頚癌、卵巣癌、外陰癌と膣癌、セルトリ-Ｌ-アイディグ（Sertoli-L-eydig）細胞癌、黒色腫および卵管癌;肺、歯槽と細気管支の癌;脳腫瘍; 皮膚悪性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌及びカルポシ(Karposi)肉腫を含む。
繊維肉腫、心臓の血管肉腫と横紋筋肉腫、及び他の悪性癌は、当該分野の技術者によく知られている。
４.３ 癌および前癌療法
化学療法薬は、癌細胞増殖および存続に影響を与える一連の細胞応答を含む。
これらの細胞応答の研究された最良のものは、アポトーシスであり、抗癌剤が共通のアポトーシス経路を活性化することにより腫瘍細胞を殺すことができることは現在明らかである。。
不運にも、これらの薬は、さらに急速に分裂する骨髄の正常細胞、正常な造血と腸の細胞および髪の毛マトリックスのケラチン生成細胞にも影響を与える(McKinnell et al., The biological Basis of cancer, 1998; Komarov et al., Science 285:1733-1737, 1999; Johnstone et al., Cell 108:153-164, 2002)。
他方、多くの腫瘍細胞が細胞死開始因子、調整因子及び細胞死の遂行因子を変化させる、これらは、異なる癌タイプの腫瘍細胞がなぜ種々の化学療法薬と放射線に耐性を示すことになるかを説明している。
この変化は、固有の経路の因子、ポストミトコンドリアル事象及び細胞死の固有の経路について報告されている(Rampino et al., Science 275:967-969, 1997; Vogelstein et al., Nature 408: 307-310, 2000; Teitz et al., Nature Med. 6:529-535, 2000; Reed, J. Clin. Oncol., 17:2941-2953, 1999; Johnston et al., Cell 108:153-164, 2002)。
従って、癌治療法のパラダイムは、腫瘍細胞の細胞死の選択的誘引となる操作、正常な増殖細胞を変化させない操作、及び異なる細胞死経路を変化又は突然変異させる要因を回避する操作である。
本発明の構成および方法は、正常な増殖細胞と同様のレベルで、腫瘍及び前腫瘍細胞がセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを過剰発現するという発見に基づく。
これらの転写産物の構造は、図１、図２、及びSEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5およびSEQ ID NO 6における対応する配列である。
その一方、他の驚きの発見は、前腫瘍及び腫瘍細胞がセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを過剰発現し、そしてアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを下方制御する、ということである。前腫瘍及び腫瘍細胞におけるアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの合成の抑制と阻害は、癌細胞と正常増殖細胞間の表現型の新たな差異を構成する、これは、本発明の主な態様に１つとして考えられる。
さらに、異なる癌タイプのヒトの生検における癌はまた、培養中の癌と同じ表現型を示す(図５Ａおよび５Ｂ)。
センスミトコンドリアキメラＲＮＡとアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの機能は明確ではないが、密接な相関関係はこれらのＲＮＡの発現と細胞増殖間に存在する。例えば、肝臓、腎臓および脾臓のような細胞組織中の、Ｋi-６７、ＰＣＮＡあるいはリン酸化されたヒストンＨ３(histone H3)のような抗原を意味するようなもので定義される正常な増殖する細胞は、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡだけでなくセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを過剰発現する。
Ｋi-６７又はＰＣＮＡを発現しない同様の細胞組織の非増殖細胞において、センスミトコンドリアキメラＲＮＡとアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡは発現しない。更に、図７に示すように、ミトゲンＰＨＡで活性化されたヒトのリンパ球は、ＤＮＡを合成し、増殖する抗原Ｋi-６７とＰＣＮＡを発現する。
この活性化されたリンパ球は、またアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡだけでなくセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを過剰発現する（図７）。
対照的に、休止しているリンパ球又は非活性リンパ球は、センスミトコンドリアキメラＲＮＡもアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡも発現しない。
本発明の1つの基本部分である、前述の発見は、正常の増殖細胞がセンスとアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを発現する期間、腫瘍細胞はセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを発現し、そしてアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの発現を下方制御する、ことを示す。
細胞増殖におけるこれらのＲＮＡの機能を理解するために、培養中の癌細胞は、センスミトコンドリアキメラＲＮＡ(SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3)又はアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ(SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6)を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された。
他の驚くべき発見である結果は、これらの条件下で細胞は、予定された細胞死又はアポトーシスをこうむることを示した。
センス又はアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡに相補するオリゴヌクレオチドで６ないし１５時間処理され処理後、細胞の７５〜９６％は、アポトーシス(表２参照)を被る。
処理された細胞で観察された変化は、クロマチン凝縮、核断片化、ＤＮＡ断片化、カスパーゼ活性及び細胞膜の変化プロセスであった。
４またはそれ以上のミスマッチ又はスクランブルオリゴヌクレオチドを有する制御オリゴヌクレオチドは、アポトーシスを誘発しなかった。
また、センス又はアンチセンス１２ＳミトコンドリアＲＮＡを標的とする、又はｍＲＮＡもしくはミトコンドリアＮＤ１サブユニットのアンチセンス転写産物を標的とするオリゴヌクレオチドで処理しても細胞は影響を受けなかった。
一般に、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にするオリゴヌクレオチドは、同じ濃度ではセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にするオリゴヌクレオチドよりもより効果的であった。
このことは、予期された結果であった、なぜなら腫瘍細胞は、センスミトコンドリアキメラＲＮＡを過剰発現し、そしてそれ故細胞内でこの転写産物のすべてのコピーを阻害する細胞内のオリゴヌクレオチド濃度に到達ことが困難だからである。
他方、腫瘍細胞は、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを下方制御するので、細胞あたりのコピー数が低くこのＲＮＡで阻害することが容易になる。
アポトーシスの誘発は、腫瘍細胞に対してまた選択的である。休止しているヒトリンパ球又はＰＨＡで４８時間活性化したヒトのリンパ球は、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡに相補する、又はセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標識にするオリゴヌクレオチドで、一晩処理をしても、また相補的オリゴヌクレオチド（１５ｕＭ）の高用量で処理しても影響されない。
アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ(SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6)を標的にする相補的オリゴヌクレオチドで処理することによるアポトーシスの誘発は、限定されるものではないが前骨髄球性白血病細胞ＨＬ-６０、急性リンパ芽球の白血病MOLT-4、Ｔ−リンパ球白血病細胞、Jurkat、Ｔ細胞白血病、Devernelle、又はＢリンパ腫、ＮＳＯ／２又は骨髄腫、ＨｅＬａ細胞、ＤＵ１４５、ＰＣ-３、Ｃａｃｏ-２、Ｈｅｐ-２及びＨｅｐＧ２で達成される。
治療の効かない（化学療法又は放射線治療）腫瘍細胞のパラダイムと見なすことができる、ＭＣＦ／７（乳癌）とメラノーマの２つの細胞は、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ(SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6)を標的とする相補的オリゴヌクレオチドで１５時間処理するとき、８０％以上アポトーシスを受ける。
より低いアポーシス結果は、センスキメラＲＮＡ(SEQ ID NO 1)に相補するオリゴヌクレオチドで得られた。
すでに記載したように、４つのミスマッチ又はスクランブルオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドは、細胞死を誘発しない。
以下の記載は、治療標的として、センスキメラＲＮＡとアンチセンスキメラＲＮＡを用いて癌を処理するための方法と組成物である。
好ましい態様は、限定されるものでないが、アンチセンスキメラＲＮＡに相補するオリゴヌクレオチドを用いて癌を処理するための方法と組成物である。
この治療の結果は、処理された対象で少なくとも健康に良い利益を生ずる、この利益は、癌の場合に癌の沈静化に限定されないが、癌の症状の緩和及び癌の転移拡散の制御を含む。このようなすべての方法は、腫瘍細胞において、及び正常細胞においてはマイナーな効果でアポトーシスの誘発を伴う。
特定のＲＮＡを標的する相補的なオリゴヌクレオチドは、多くのさまざまなｍＲＮＡの発現又は対応するたんぱく質の合成を少なくするかなくす為に用いられてきた(e.g. Vickers et al., J. Biol. Chem., 278:7108-7118, 2003)。
現在、異なる化学的性質を有する約４２のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、可能性のある薬剤としてスクリーニングされている(Stephens and Rivers, Curr. Opin. Mol. Therapeut., 5:118-122, 2003) (参照例：U.S. Pat. Nos. 5,801,154; 6,576,759; 6,720,413; 6,573,050 and 6,673,917)。
これらの引例のすべては、参照することにより明らかに本明細書に組み込まれる
この発明の1つの側面において、アンチセンスキメラＲＮＡを標的にする１以上のオリゴヌクレオチドが用いられる。
2つ以上の相補的なオリゴヌクレオチドの使用は、より有効で、ある程度の相乗作用を示す。
本発明のオリゴヌクレオチドは、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ又はセンスミトコンドリアキメラＲＮＡに相補することができる。
相補的なオリゴヌクレオチドは、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ又はセンスミトコンドリアキメラＲＮＡに結合し、それらの機能を妨げる。
絶対的な相補性は、好ましいが、要求はされない。
ここで記述するように、一部のＲＮＡに相補するオリゴヌクレオチド配列は、ＲＮＡでハイブリダイズして安定な二重鎖を形成するに十分な相補性を有する配列を意味する。ハイブリダイズする能力は、両者の相補の程度とオリゴヌクレオチドの長さによる。一般に、ハイブリダイズする核酸が長いほど、ＲＮＡでのミスマッチの増加した塩基を多く含むが、それでも安定な二重鎖を形成する。
当該分野の技術者は、ハイブリダイズ化された錯体の融点を決定する標準操作の使用によりミスマッチの許容程度を確認することができる。
一般に、異なる蛋白質をｍＲＮＡでハイブリダイズするための相補的オリゴヌクレオチドは、ＡＵＧスタートコドンの相補物を含むｍＲＮＡの５’未翻訳領域、又はより効果的な３’未翻訳領域を標的にする。
ｍＲＮＡコード領域に相補するオリゴヌクレオチドは、翻訳の効果が低い抑制剤である(前の引例を参照)。
センスミトコンドリアキメラＲＮＡとアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡは、非コードＲＮＡであり、それ故オリゴヌクレオチドの標的領域は、これらの転写産物のいかなる領域とも相補することができる。最も効果的な領域は、各３０ヌクレオチドでデザインされた相補的オリゴヌクレオチドを用いてアンチセンス又はセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの配列をスキャニングすることにより決定されたアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの単一鎖セグメントの周りに局在化される。
この分野の技術者は、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、及びSEQ ID NO 6の転写産物の完全な配列内の他の配列が代替の相補的なオリゴヌクレオチドをデザインするための標的であることを理解する。。
アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ又はセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的とし、本発明によると腫瘍細胞死を誘発することになるこの相補的なオリゴヌクレオチドは、一般にナチュラルなリン酸ジエステル結合と異なるバックボーンを含む。このオリゴヌクレオチドは、限定されないが、ホスフォロチオエーテ(Mag et al., Nucleic Acids Res. 19:1437-1441, 1991; and U.S. Pat. No. 5,644,048)、ペプチド核酸又はＰＮＡ(Egholm, Nature, 365:566-568, 1993; and U.S. Pat. No. 6,656,687)、ホスフォアミド(Beaucage, Methods Mol. Biol. 20:33-61, 1993)、ホスフォロチジオエーテ(Capaldi et al., Nucleic Acids Res., 28:E40, 2000)を含む、交互に並ぶインターヌクレオシド結合を有することができる。
他のオリゴヌクレオチド誘導体は、限定されないがモルホリノ(Summerton, Biochim. Biophys. Acta, 1489:141-158, 1999)、固定されたオリゴヌクレオチド(Wahlestedt wt al., Proc. Natl. Acad. Sci. US, 97:5633-5638, 2000)、ペプチド核酸又はＰＮＡ(Nielsen et al., 1993; Hyrup and Nielsen, 1996)又は２-o-(２-メトキシ)エチル修飾５’と３’末端オリゴヌクレオチド(McKay et al., J. Biol. Chem., 274:1715-1722, 1999)のようなものを含む。
これらの引例のすべては、参照することにより明らかに本明細書に組み込まれる。
核酸は、デオキシリボ−とリボ核酸のいかなる結合、及びウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キササニン(xathanine)、ハイポキササニン（hypoxathanine）イソシトシン、イソグアニンを含む、塩基のいかなる結合も含むことができる。
本発明による相補的オリゴヌクレオチドは、限定されないが
５-フルオロウラシル、５-ブロモウラシル、５-クロロウラシル、５-ヨードウラシル、
ヒポキサンチン、キサンチン、４-アセチルシトシン、
５-(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、
５-カルボキシメチルアミノメチル-２-チオウリジン、
５-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、
ベータD-ガラクトシルキオシン(beta-D-galactosylqueosine)、イノシン、
Ｎ６-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、
２、２-ジメチルグアニン、２-メチルアデニン、２-メチルグアニン、３-メチルシトシン、5-メチルシトシン、Ｎ６アデニン、7-メチルグアニン、
５-メチルアミノメチルウラシル、５-メトキシアミノメチル-２-チオウラシル、
ベータＤ−マノシルキオシン(beta-D-mannosylqueosine)、
５'-メトキシカルボキシメチルウラシル、５-メトシキウラシル、
２-メチルチオ-Ｎ６-イソペンテニルアデニン、ウラシル-５-オキシアセテック酸（Ｖ）、ワイブトキソシン(wybutoxosine)、プソイドウラシル、キオシン(queosine)、
２-チオシトシン(thiocytosine)、５-メチル-２-チオウラシル、２-チオウラシル、
４-チオウラシル、５-メチルウラシル、ウラシル-５-オキシアセテックアシッド メチルエステル、ウラシル-５-オキシアセテック酸（Ｖ）、５-メチル-２-チオウラシル、３-(３-アミノ-３-Ｎ-２-カルボキシプロピル)ウラシル、
（acp3）w及び２,６-ジアミノプリン
を含むグループから選択された少なくとも１つの修飾塩基部分を含む。
相補的なオリゴヌクレオチドは、更に限定されないがアラビノース、２-フルオロアラビノーズ、キシルロース及びヘキソースを含むグループから選択された少なくとも１つの修飾糖部分を含むことができる。
本発明の他の態様では、相補的なオリゴヌクレオチドが、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡのいかなる領域とも、又はセンスミトコンドリアキメラＲＮＡのいかなる領域ともハイブリダイズするようにデザインされる。
相補的なオリゴヌクレオチドは、長さで少なくとも１０のヌクレオチドでなければならず、長さで１０から５０のヌクレオチド範囲の相補的オリゴヌクレオチドが好ましい。
特定の側面では、相補的なオリゴヌクレオチドが少なくとも１２のヌクレオチド、少なくとも１８のヌクレオチド、少なくとも２２のヌクレオチド、少なくとも３０のヌクレオチド、少なくとも５０のヌクレオチドである。
In vivoだけでなくin vitro実験においても、アンチセンス又は相補的オリゴヌクレオチドの非特定の生物学的効果で、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ又はセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの機能を用いてアンチセンス阻害を識別する制御を利用する実験を考慮することは重要である。
従って、オリゴヌクレオチドのデザインは、参照することにより明らかに本発明に組み込まれる、米国特許番号 6,673,917で報告されているように動物細胞に有毒効果があるCpGトラック、5' GGGGトラックおよび他の配列の存在は、避けなければならない。
更に、配列5' CGTTAの存在は、報告されているアンチセンスでない効果を避けられる(Tidd et al., Nucleic Acids Res. 28:2242-2250, 2000)。
本発明の他の態様では、癌を有する動物又は病人の治療薬として、センスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的とする又はアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的とする相補的オリゴヌクレオチドは、抗癌治療剤と放射線療法に対する活性を誘発することができる。
増感又は過敏性として知られている誘発される感度は、抗癌治療又は放射線療法に対する耐性を示す腫瘍細胞中で測定される。
抗癌剤は、これらの当該分野で使用中であり既に知られている、又は未発見の薬剤からなる。従来の化学療法薬の中には、アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗生物質および抗微小管薬がある。
これらの薬のいくつかの例はシスプラチン、メトトレキサート、ドキソルビシン,
ダクチノマイシン、マイトマイシン、シクロホスファミドなどである。
この発明の他の側面で、癌を有する動物又は病人をアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ及び／又はセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にした相補的オリゴヌクレオチドでの処理と共に又は処理後に、患者は、放射線療法で処理される、この場合、前記放射線療法は、紫外線、ガンマ線、アルファ粒子、ベータ粒子、Ｘ線および電子線を含んでいる。
この発明の他の側面で、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ又はセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの機能で腫瘍細胞死の阻害は、ＲＮＡ阻害又はＲＮＡサイレンシングによりもたらされる。
過去6年にわたって、ＲＮＡ阻害(RNAi)は、哺乳類細胞中の遺伝子サイレンシングに対する新規で有望なアプローチとして浮上してきている(Elbashir et al., Nature 411:494-498, 2001; McManus et al., Nature Rev. Genet. 3:737-747, 2002)。
長さで約１９から２１のヌクレオチドの合成的に合成された二重鎖のＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡの分解とその後の蛋白質ノックダウンをもたらす、特にそれらの相補的標的ｍＲＮＡにハイブリダイズする。
いくつかの異なる遺伝子は、小さなＲＮＡ又はsiＲＮＡ阻害により成功裡にサイレン化される(Lu et al., Curr. Opin. Mol. Ther. 5:225-234, 2003.; Wacheck et al., Oligonucleotides 13:393-400, 2003)。
アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ又はセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的とする１９から２１のヌクレオチドの合成された二重鎖のＲＮＡは、これらの転写産物を分解して、腫瘍細胞死を誘発する。
当該分野の技術者は、siＲＮＡの配列がアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ又はセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ(SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, and SEQ ID NO 6)のいかなる領域にも相補する必要があることは理解するだろう。
この発明の他の態様で、リボザイムは、腫瘍細胞死を誘発するためにアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ又はセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを阻害するのに用いることができる。
リボザイムの配列は、腫瘍細胞死を引き起こすのにより効果的な転写産物の特定の領域を開裂するために、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ(SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6)又はセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ(SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3)の配列によりデザインされなければならない。
リボザイムは、ＲＮＡの特定の開裂を触媒することが可能な酵素ＲＮＡ分子である(Rossi, Curr. Biology 4:469-471, 1994)。
リボザイム作用のメカニズムは、標的ＲＮＡに相補するリボザイム分子の配列の特定のハイブリダイゼーションを含み、その後エンドヌクレアーゼ的に切断する。
リボザイム分子の構成は、標的遺伝子ｍＲＮＡに相補する1つ以上の配列を含んでいると予想され、ｍＲＮＡ開裂の原因であることがよく知られ、また米国特許番号5,093,246（これは参照によってその全部がここに組み入れられる）に記述された触媒配列を含んでいると思われる。
本発明の範囲内において、ハンマーヘッドリボザイム分子は、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ又はセンスミトコンドリアキメラＲＮＡのエンドヌクレアーゼ的切断を特異的及び効果的に触媒するように作り出されている。
ハンマーヘッドリボザイムの構造と生産は、当該分野でよく知られており、また記述されている(Haseloff et al., Gene, 82:43-52, 1989)。
本発明のリボザイムは、更にＲＮＡエンドリボヌクレアーゼを含んでいる(Zaug et al., Science, 224:574-578, 1984)。
遺伝子治療は、癌にかかっている患者か、癌の予防あるいは禁止が望ましい患者への核酸の投与によって行なわれる癌の治療あるいは予防に言及する。
本発明のこの態様では、細胞内で生産された治療用核酸は、腫瘍細胞死を誘発するこれらのミトコンドリア転移産物の機能を阻害又は禁止することによる治療の影響を調節する、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ又はセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にする相補的ＲＮＡである。
従って、1つの好ましいアプローチは、アンチセンスＲＮＡの転移産物がＲＮＡポリメラーゼII又はIIIの強いプロモーターの制御下で置換された、組み換えられたＤＮＡの利用である。
相補的ＲＮＡをコード化する配列は、ほ乳類、好ましくはヒト細胞中で作用するその技術分野で知られているいかなるプロモーターでも発現する。
このようなプロモーターは、限定されるものでないが、ＳＶ４初期プロモーター領域(Benoist and Chambon, Nature 290:304-310, 1981)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445, 1981)、メタロチオネイン遺伝子の調節塩基配列(Brinster et al., Nature 296:39-42, 1982)、ラウス肉腫ウイルス(Yamamoto et al., Cell 22:787-797, 1980)、等を含む。
相補的ＲＮＡを生産する組み換えられたＤＮＡ構造は、限定されるものでないが、アデノウィルス・ベクター、アデノ関連性ウィルス・ベクター、単純ヘルペスウィルス・ベクター、ワクシニアウィルス・ベクター、及びレトロウィルス・ベクターを含むウィルス・ベクターにすることができる。
当該分野の技術者によく知られている方法を使用して、このベクターは、製薬組成物として標的腫瘍細胞中に導入される。
薬学的に受理可能なキャリヤーにおける相補的核酸（相補的オリゴヌクレオチド、siＲＮＡ、リボザイム、又はウィルス・ベクター）の効果的量からなる、本発明の薬剤組成物は、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ又はセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの作用を阻害するために癌患者に投与され、腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する。
相補的な核酸は、薬剤組成物中に配合される、この薬剤組成物は、キャリヤー、希釈剤、バッファー、予防薬、界面活性剤、ポリエチレンイミド（ＰＥＩ）、リポソームあるいはこの分野で周知の他の脂質製剤を含めることができる。
前記薬剤組成物は、局所適用、経口、非経口又は直腸投与によって投与される。
非経口投与は、静脈、皮下、腹腔内、又は筋肉注射、又は吸入又は通気による肺内投与を含んでいる。
本発明の組成物は、治療学、診断学、予防処置、そして研究試薬およびキットとして利用することができる。
ここに提供される組成物及び方法は、癌の治療に特に役立つと考えられる。
ここに提供される用語「癌」は、次の識別された特異な条件のうちのいずれか1つで悩まされる細胞を含んでいる。
これらは、急性慢性である脊髄性白血病、急性慢性であるリンパ芽球白血病、多発性骨髄腫、ホジキン病、非ホジキンのリンパ腫あるいは悪性リンパ腫;胃癌、食道癌又は腺癌、膵臓送管の腺癌、インシュリノーマ、グルカゴン産生腫瘍、多発性胃潰瘍、
小さな腸腺癌、結腸直腸癌；肝細胞性の癌、肝細胞性の腺腫；類癌腫、腎臓腺癌のような尿生殖器官、ウイルム腫瘍（Wilm's tumor）、膀胱および尿道癌及び前立腺腺癌、精上皮腫のような精巣癌、奇形腫、奇形癌、間質細胞癌腫；子宮内膜の癌、子宮頚癌、卵巣癌、外陰癌と膣癌、セルトリ-Ｌ-アイディグ（Sertoli-L-eydig）細胞癌、黒色腫および卵管癌；肺、歯槽と細気管支の癌;脳腫瘍；皮膚悪性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌及びカルポシ(Karposi)肉腫を含む。
繊維肉腫、心臓の血管肉腫と横紋筋肉腫、及び他の悪性癌は、当該分野の熟練技術者によく知られている。
ここに提供される用語「癌細胞」は、上記の識別された特異な条件のうちのいずれか1つで悩まされる細胞を含んでいる。
次の例は、本発明の様々な側面の実行のために最良の方法を述べるだけでなく、上記の記述された発明を使用する方法について記述する役割を果たす。
これらの例は、本発明の範囲を少しも制限することはなく、むしろこれらは実例となる目的のために示されることが理解される。
[実施例１]
センスミトコンドリアヒトキメラＲＮＡの分離と配列
(図１Ａ、SEQ ID NO 1)
最初の実験は、推定のヒトセンスミトコンドリアキメラＲＮＡがより複雑で安定な、マウスのキメラＲＮＡである第二の構造を含むことを示した(Villegas et al., DNA & Cell Biol. 19:579-588, 2000; Villegas et al., Nucleic Acids Res. 30:1895-1901, 2002)。
それ故、またマウスミトコンドリアキメラＲＮＡの第二の構造に基づき、理論的なヒトのセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの第二の構造が、推定された(図１Ａ)。
理論的なヒトの転写産物は、未知の長さ(図１Ａ)のループを形成するアンチセンス１６ＳミトコンドリアＲＮＡのフラグメントに５’末端で結合しているセンス１６ＳミトコンドリアＲＮＡの完全な配列を含んでいた。
アンチセンス１６ＳミトコンドリアＲＮＡのセグメントは、センス１６ＳミトコンドリアＲＮＡに十分に相補した、またそれゆえセンス１６Ｓ転写産物の５’末端に結合する逆方向反復配列に相当する。この構造に基づき、プライマーは、ＲＴ−ＰＣＲによるこの推定の転写産物を増殖するようにデザインされた。
１つのリバースプライマーは、ヒトセンス１６ＳミトコンドリアＲＮＡの５’末端から１１から３１に位置、又は理論的ループの始点に位置していた（プライマー１、図１Ａ）（SEQ ID NO 1）。
用いたフォワードプライマーの配列は、センス１６ＳミトコンドリアＲＮＡの位置２１３−２３４の配列で、図１Ａの中のプライマー３に相当する。
ＨｅＬａ細胞、ＨＬ−６０、Ｄｕ１４５、ＭＣＦ／７及びヒトのリンパ細胞を含むヒトの組織と細胞からＲＮＡの増殖は、プライマー１と３（図１Ａ）を用いてＲＴ−ＰＣＲによりＰＨＡ（実施例７参照）で刺激され、約２１０ｂｐの固有のアンプリコン(図２)を産出する。
ＲＴ−ＰＣＲは、前記した方法で実施した(Villegas et al., DNA & Cell Biol. 19:579-588, 2000; Villegas et al., Nucleic Acids Res. 30:1895-1901, 2002)。
個々のヒトの組織あるいは細胞からのアンプリコンは、クローン化された、また両鎖は配列された。
すべての場合に、２１６ｂｐの同一鎖が得られ、センス１６ＳミトコンドリアＲＮＡの５’末端の最初の３１ヌクレチドに結合している１８４ヌクレチドの逆方向反復配列を含んでいた。
その後、我々は、逆方向反復配列が１８４ヌクレチドより長いか、またアンチセンス１６ＳミトコンドリアＲＮＡ（図１Ａ）の５’末端に向かって更に拡張しているかを決定した。
前記したＨｅＬａ細胞又は他の細胞からのｃＤＮＡは、前記したようにループに位置するリバースプライマー１と、推定のより長い逆方向反復配列の５’末端に向かってウォークするプライマー４から７との間で増殖された（図１Ａ）。
このアプローチを用いて、プライマー1が、プライマー４、５及び６とそれぞれ結合するのに使用されたとき、およそ５００、７００及び８００ｂｐの増殖フラグメントが得られた。
他方、ｃＤＮＡがプライマー１とプライマー７の間で増殖されたとき、増殖産物は得られなかった、これは、逆方向反復配列の５’末端がプライマー７とプライマー８の間であったためと推定される（以下を参照）。
前記８００ｂｐのアンプリコンの完全な配列は、センス１６ＳミトコンドリアＲＮＡ(SEQ ID NO 1)(図１Ａ)の最初の３１ヌクレオチドに結合する７６９ヌクレオチドの逆方向反復配列を示す。
センス１６ＳミトコンドリアＲＮＡに結合する逆方向反復配列の３’末端で配列は、２１６ｂｐのアンプリコンの同じ領域に見出されるものと同一である。このことは、重要である、なぜなら両者の場合に我々は、同じＲＮＡを増殖していたからである。
更に、配列は、アンチセンス１６ＳミトコンドリアＲＮＡの３’末端のその５０ヌクレオチドがセンス１６ＳミトコンドリアＲＮＡの逆方向反復配列中には見当たらない、ことを示した。
すべて、これらの結果は、二重鎖構造が逆方向反復配列と後者の５１の位置で始まるセンス１６ＳミトコンドリアＲＮＡとの間で形成され、また５０ヌクレオチドの推定ループを形成することを示唆する。
ループのサイズを確認するために、ヒトのｃＤＮＡは、逆方向反復配列の３’末端に位置するフォワードプライマー２と、センス１６ＳミトコンドリアＲＮＡ（図１Ａ）の位置２１３−２３４でまたリバースであるプライマー３との間でＰＣＲにより増殖された。およそ２４０ｂｐのアンプリコンが得られた、またこの配列は、センス１６ＳミトコンドリアＲＮＡの最初の２３４ヌクレオチドが逆方向反復配列の３’末端の最後の２５ヌクレオチドに結合していたことを示した。逆方向反復配列の２５ヌクレオチドの配列は、センス１６ＳミトコンドリアＲＮＡの位置５１から７５（図１Ａ）に十分に相補していた。
プライマー１と６で得られたアンプリコンの配列、及びプライマー２と３で得られたアンプリコンの配列がコンティグのように組い立てられる場合には、ヒトセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの新たな構造は、５０ヌクレオチドのループと少なくとも７６９ｂｐの二重鎖構造であることを確認した（図１Ａ）(SEQ ID NO 1参照)。
二重鎖ＲＮＡは、RNase Aによって消化されないので、ヒトセンスミトコンドリアキメラＲＮＡのステムは、この酵素に耐性がなければならない。一方、ループ又は二重鎖を越えて拡張したセンス１６ＳミトコンドリアＲＮＡ鎖の３’の領域は、酵素により消化されなければならない。
ＨｅＬａ細胞又は他の細胞からのＲＮＡは、RNase A（50μｇ／ｍｌ）によって消化され、続いてフェノール抽出された、そしてヌクレアーゼ耐性物質はエタノール沈殿により回収された。
消化されたＲＮＡからのｃＤＮＡは、図１Ａに示すプライマーを用いてＰＣＲにより増殖された。
プライマー１と６で得られた約８００ｂｐのアンプリコンは、ループが酵素により消化されたことを示すRNase A消化後には増殖されなかった。図１Ａに示したようにプライマー１０と１１で得られた３６０ｂｐのアンプリコンと同じであった。
すべて、これらの結果は、ステムを超えて拡張したセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの３’領域だけでなくループも酵素により消化されたことを示した。
センスミトコンドリアキメラＲＮＡの二重鎖の構造に一致しまたプライマー８と６で得られた７５０ｂｐアンプリコンの増殖は、RNase A消化により影響されなかった。
リボ核酸消化に耐性を示す二重鎖フラグメントの配列は、予期されたステムの配列と同一であった。
センスミトコンドリアキメラＲＮＡの逆方向反復配列の５’末端を決めるために、RNase A消化後に得られた転写産物のステムは、５’ＲＡＣＥ分析に用いられた。
逆方向反復配列の５’末端決定は、メーカーのインストラクション（Invitrogen）に従って行われた。
この結果は、逆方向反復配列がプライマー１と６を用いたセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの増殖後に得られたアンプリコンの５’末端から４６の付加的ヌクレオチドに伸びていることを示した。
要約すると、８１５ヌクレオチドの逆方向反復配列は、１６ＳミトコンドリアＲＮＡの最初の８６５ヌクレオチドの５’末端に結合している。この転写産物の配列は、ヒト１６Ｓミトコンドリア遺伝子（ＨとＬ鎖）(SEQ ID NO 1)と９９．８％の同一性を示した。二重鎖ステムの両端の５’末端は、５’ＲＡＣＥにより確認された。
上記の結果は、センスミトコンドリアキメラＲＮＡが８１５塩基対のステムあるいは二重鎖構造と５０ヌクレオチドを含んでいたことを示した。
しかしながら、これらの結果は、逆方向反復配列が完全な１６ＳミトコンドリアＲＮＡに結合していることを立証するものではない。３’末端から完全なｃＤＮＡの合成のような従来のアプローチの使用は役に立たない、なぜなら転写産物の二重鎖構造は、Ｔｔｈを含む逆転写酵素に対し克服できない問題を示すからである(Myers and Gelfand, Biochemistry 30:7661-7666, 1991)。
もし８１５ヌクレオチドの逆方向反復配列が１６ＳミトコンドリアＲＮＡの１５５９ヌクレオチドに結合したら、２．３Ｋｂの転写産物が予期できる。
ＨｅＬａ細胞、ＨＬ−６０及びＭＣＦ／７細胞から全ＲＮＡのノーザンブロット分析は、３２Ｐで標識されたプローブを用いて行われ、センスミトコンドリアキメラＲＮＡの二重鎖構造を標的にした。その結果は、１．６Ｋｂのバンドを除いて、センスミトコンドリアキメラＲＮＡとセンス１６ＳミトコンドリアＲＮＡにそれぞれ対応する約２．４Ｋｂのバンドを示した。
もし前記ＲＮＡがノーザンブロットより先にRNase Aで消化されたら、およそ０．８Ｋｂのシングルハイブリダイゼーションバンドが得られた、これはセンスミトコンドリアキメラＲＮＡのステムのサイズに相当する。
すべて、これらの結果は、前記センスミトコンドリアキメラＲＮＡが完全なセンス１６ＳミトコンドリアＲＮＡの５’末端に結合した８１５ヌクレオチドの逆方向反復配列を含んでいて、SEQ ID NO 1に相当していた、ことを強く実証した。
逆方向反復配列とセンス１６ＳミトコンドリアＲＮＡ間の結合領域を、ヌクレオチドプローブを用いて具体的に検出することが可能である。
プローブは、逆方向反復配列の３’末端とセンス１６ＳミトコンドリアＲＮＡ間の結合点の各サイドで７から１０のヌクレオチドを含まなければならない。
このオリゴヌクレオチドは、in situハイブリダイゼーション、又はＲＴ−ＰＣＲもしくはこの新規なＲＮＡを検出するための分野の技術者によく知られた任意の方法による増殖に用いることができる。
センスミトコンドリアキメラＲＮＡは、正常な増殖細胞（ヒトの包皮角化細胞、脾臓、ＰＨＡで刺激されたリンパ球、マウス胚）中、前癌細胞（ＨＰＶ１６又は１８で形質転換された角化細胞、ＨＴＬＶ−１で形質転換されたＭＴ−２細胞）中に、そして癌細胞中に存在する。正常な休止細胞中には存在しない。これらの結果の要約は、表１（実施例４）に示されている。
[実施例２]
乳頭腫ウィルスで形質転換されたヒトの角化細胞は、新規なセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを合成する(図１Ｂ、SEQ ID NO 2)
ヒトの包皮角化細胞(ＨＦＫ)は、ヒトの乳頭腫ウィルス１６（ＨＰＶ１６）に既に感染した細胞溶解物を用いた培養により形質転換された。
この細胞は、３部のＫ−ＳＦＭ、１部のＤＭＥＭ培地（Invitrogen）、５ｎｇ/ｍｌの下垂体抽出物、及び１０％の子牛胎児血清で培養された。
培養条件は、３７℃で５％ＣＯ２であった。２４時間の感染後、形質転換されたＨＦＫは、が新しいフラスコに転送され、同じ条件下で培養された。
この後に、細胞(HFK698)は、１：４から１：３の分離比率を使用して、３日ごとに新しい培養フラスコに連続的に転送された。
１９継代後に、細胞(HPV16で形質転換されたHFK698)は、記載したように集菌され(Hausen, Biochim.Biophys. Acta, 1288:F55-F78, 1996)、１０分間の３００×ｇでの遠心分離で集められ、そして塩性のリン酸塩バッファー(PBS)で2度洗浄された。
全ＲＮＡは、トリゾール(Invitrogene)で洗浄された細胞から抽出された。
約２００ナノグラムのＲＮＡは、実施例１に記載したようにランダムのヘキサマー（hexamers）でｃＤＮＡを合成するために使用された。
ｃＤＮＡは、図１Ａに記述されているように、リバースプライマー１とフォワードプライマー３を用いてＰＣＲにより増殖された。
この増殖プロトコルは、予期した２１０ｂｐのアンプリコンを生じた、ここでセンス１６ＳミトコンドリアＲＮＡの最初の３１ヌクレオチドは、実施例１に記述したように１８４ヌクレオチドの逆方向反復配列に結合していた。
この増殖製品の電気泳動分析は、センスミトコンドリアキメラＲＮＡに相当する２１０塩基対のアンプリコンと、図２に示すように約１５０塩基対の他の増殖フラグメントの存在を示した。この新しいフラグメント(SEQ ID NO 2)の完全な存在は、センス１６ＳミトコンドリアＲＮＡの５’ 末端から最初の３１のヌクレオチドが１２１ヌクレオチドの逆方向反復配列に結合されており、これはSEQ ID NO 1のセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの逆方向反復配列と比較すると、６３ヌクレオチドより短い。
このより短い逆方向反復配列は、ミトコンドリアキメラＲＮＡの構造においてＲＮＡ９６ヌクレオチド（図１Ｂ）のより長いループを生成する。
配列の残部は、SEQ ID NO 1と同一である。
この新規なミトコンドリアキメラＲＮＡは、ＳｉＨａ細胞(図４Ａ)には存在しない、これは、ＰＨＡで刺激されたヒトリンパ球のような増殖型細胞中にも存在しない、ＨＰＶで形質転換された発癌性細胞である（実施例参照）。
同様の結果は、ＨＰＶ１６又はＨＰＶ１８で形質転換された又は不滅化された（しかし発癌性ではない）細胞は、前−悪性細胞と考えられ、それ故新規なセンスミトコンドリアキメラＲＮＡは、前−悪性細胞の新規なポテンシャルマーカーである。
１６ＳミトコンドリアＲＮＡに結合しているSEQ ID NO 2の逆方向反復配列の３’末端の配列がSEQ ID NO 1の同じ領域とは異なるので、オリゴヌクレオチドプローブは、この転写産物の特別の検出に用いることができる。
このプローブは、逆方向反復配列の３’末端とSEQ ID NO 7のオリゴヌクレオチドのようなセンス１６ＳミトコンドリアＲＮＡの始めとの間の結合点の各端で７ないし１０のヌクレオチドを含まなければならない。
このオリゴヌクレオチドは、in situハイブリダイゼーションもしくはＲＴ−ＰＣＲによる増殖、又は前癌細胞のこの新規な特別のマーカーを検出する、この分野の技術者によく知られた任意の方法に用いることができる。
[実施例３]
HTLV-1で形質転換されたヒトMT-2細胞は、第３の新規なセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの発現を誘発する(図１Ｃ、SEQ ID NO 3)。
HTLV-1で形質転換されたヒトMT-2細胞は、記述された方法で培養された(Kobayashi et al., EMBO J., 3:1339-1343, 1984)。
細胞は集菌され、３００×ｇで１０分間遠心分離され、ＰＢＳで２度洗浄された。最後の細胞ペレットは、実施例１で記述したようにトリゾールで抽出された。
ｃＤＮＡは、ＲＮＡを鋳型として用いてランダムヘキサマーで合成された、またｃＤＮＡは、リバースプライマー１および図１Ａに記述されるようなフォワードプライマー３を使用して、ＰＣＲにより増殖された。
以前に記述したように、この増殖プロトコルは、実施例１に記述したセンスミトコンドリアキメラＲＮＡに相当する、１８４ヌクレオチドの逆方向反復配列に結合したセンス１６ＳミトコンドリアＲＮＡの最初の３１ヌクレオチドを含む２１０塩基対のアンプリコンを生ずる。
増殖産物の電気泳動分析は、すでに記述された２１０塩基対のアンプリコンの存在に加えて、約１５０塩基対のバンドを示した(図２を参照)。
この１５０塩基対のアンプリコンの配列は、ＨＰＶ１６あるいはＨＰＶ１８(SEQ ID NO 2)で形質転換された細胞中で発現する第２のセンスミトコンドリアキメラＲＮＡに相当する、実施例２で記述したアンプリコンの配列に同じである。
更に、新しい増殖産物は、約１００ｂｐであることが見出された(図２)。
この第３のアンプリコンの配列は、センス１６ＳミトコンドリアＲＮＡの５’末端に結合して、１６７ヌクレオチドのループを発生する、６１ヌクレオチドの逆方向反復配列を示した(図１Ｃ；SEQ ID NO 3)。
この新規なアンプリコンは、正常細胞中に、腫瘍細胞中にまたＥＰＶ１６あるいは１８で形質転換された細胞中には存在しなかった。
従って、この新規なセンスミトコンドリアキメラＲＮＡは、発癌性レトロウイルスで形質転換された細胞のポテンシャルマーカーである。
１６ＳミトコンドリアＲＮＡに結合しているSEQ ID NO 3の逆方向反復配列の３’末端の配列は、SEQ ID NO 1及びSEQ ID NO 2の同じ領域とは異なるので、オリゴヌクレオチドプローブは、この転写産物の特定の検出に用いることができる。
このプローブは、逆方向反復配列の３’末端とSEQ ID NO 8のオリゴヌクレオチドのようなセンス１６ＳミトコンドリアＲＮＡの始まりとの間の結合点の各端で７から１０のヌクレオチドに及ばなければならない。
このオリゴヌクレオチドは、in situハイブリダイゼーションもしくはＲＴ−ＰＣＲによる増殖、又はレトロウィルス腫瘍ウィルスで形質転換された細胞のこの特別なマーカーを検出する、この分野の技術者によく知られた任意の方法に用いることができる。
[実施例４]
ヒトアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの構造
我々の最初の実験は、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡに相当するキメラＲＮＡの第二のファミリーは、いくつかの細胞研究に存在することを示した。
ヒトアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの構造を決定するために、センスミトコンドリアキメラＲＮＡに用いられる方法が採用された（図１）。
理論的なアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡは、アンチセンス１６ＳミトコンドリアＲＮＡの５’末端に結合している逆方向反復配列としてのセンス１６ＳミトコンドリアＲＮＡのフラグメントを含んでいた。
後者のＲＮＡは、ミトコンドリアＤＮＡのＬ−鎖から転写され、そして１６Ｓミトコンドリア遺伝子に相当する（図３）。このＲＮＡを増殖するために、リバースプライマーはアンチセンス１６ＳミトコンドリアＲＮＡの５’末端に接近してハイブリダイズされた、またフォワードプライマーは、逆方向反復配列（図３）の推定のフラグメントの異なる位置でハイブリダイズされた。
ＰＨＡで４８時間刺激されたヒトリンパ球からの全ＲＮＡは、鋳型として用いられた。ｃＤＮＡは、実施例１に記載したようにランダムヘキサマーで合成された。
ＰＣＲによるｃＤＮＡの増殖は、アンチセンス１６ＳミトコンドリアＲＮＡの５’末端の始めに接近した位置でのリバースプライマー（プライマー１、図３）及び逆方向反復配列（図３）上に位置する異なるフォワードプライマーで行われた。
３つの主なアンプリコンだけが得られた、これは逆方向反復配列のサイズとループのサイズで異なっていた。
これらのアンプリコンは、精製され、配列が決定された。これらのアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの１つは、３６５ヌクレオチドの逆方向反復配列と１７のヌクレオチド(SEQ ID NO 4)のループを含んでいる。
他のＲＮＡは、９６ヌクレオチドのループと１８９ヌクレオチド(SEQ ID NO 5)の逆方向反復配列を含んでいる。
更に、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの他の種は、２９６ヌクレオチドの逆方向反復配列と４５１ヌクレオチド(SEQ ID NO 6)のループを含んでいる。
３つのアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡのすべての配列は、ミトコンドリアＤＮＡ遺伝子（HとL鎖）の配列と９９．８％同一であった。
以下の例において示される結果は、前腫瘍及び腫瘍細胞と、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの発現にかかわる正常な増殖細胞との間に大きな違いがあることを示す。増殖する細胞はすべてセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを過剰発現する。
しかしながら、一方正常な増殖細胞もまたセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを発現するが、これらの転写産物は、腫瘍細胞中では下方制御される。非増殖細胞又は休止細胞は共にミトコンドリアキメラＲＮＡを発現しない。
従って、これらの異なる発現は、発癌の新規で有効なマーカーであることを示し、これはin situハイブリダイゼーション、ノーザンブロット分析、ＲＴ−ＰＣＲもしくはＴＭＡ又はこの分野の技術者に知られている他の技術により検出できる。
センスとアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの異なる発現の要約は、表１に示されている。
Figure 0005201834
[実施例５]
腫瘍細胞系は、センスミトコンドリアキメラＲＮＡ(SEQ ID NO 1)を過剰発現し、またアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ(SEQ ID NO 4,5及び6)の発現を下方制御する。
in situハイブリダイゼーションは、培養中の腫瘍細胞系でセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの発現を決定するのに用いられた。in situハイブリダイゼーションに対し、粘着性腫瘍細胞は、８−ウエルのチャンバースライド(Lab-TekO, NUNC)中で、アメリカン組織培養収集（American Tissue Culture Collection）(ATCC)により推奨された適切な培地と条件を用いて３７℃で２４ないし４８時間培養された。
非粘着性細胞(e.g. HL-60, Jurkat and Ramos)に対しては、小さなフラスコ中で３７℃で４８時間培養された。細胞は、３００×ｇで１０分間遠心分離により回収され、ＰＢＳの小さな容量中に再懸濁され、そして１０から２０ｕｌのアリコートは、あらかじめポリリシン又はマッスル（mussel）から精製された接着タンパク質でコートされたガラススライド上に塗布された(Burzio et al, Curr. Opin. Biotechnol., 8:309-312, 1997)。細胞は室温で３０分間乾燥された。
前記細胞は、ＰＢＳで3回洗浄され、４％のパラホルムアルデヒドで室温下１０分間固定された。スライドはその後ＰＢＳで５分間３度洗浄され、0．2Ｎ ＨＣｌで室温下１０分間インキュベートされた。
該細胞は、更に３度、最初は室温下にＰＢＳで、その後２×ＳＳＣで１０分間（2×SSC:0.3MのNaCl、30mMクエン酸ナトリウム、pH 7.0）洗浄された(Sambrook et al., 1989)。
プレハイブリダイゼーションは、4×SSC、１０％硫酸デキストラン、１５０μｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ及びニシン精液ＤＮＡ、５０％のホルムアミド及び1×Denhardt溶液（0.2mg/mlのFicollタイプ400、0、2mg/mlのポリビニルピロリジン、0.2mg/mlのBSA）を含む溶液中で３７℃で３０分間行われた。ハイブリダイゼーションは、センスとアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にする３．５ｐｍｏｌのプローブを含む同じプレハイブリダイゼーション混合物中３７℃で１５時間行った。
前記プローブは、センスとアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの配列の異なる領域をターゲットにする２０以上のデオキシヌクレオチドを含んでいた(SEQ ID NO 99〜197及びSEQ ID NO 9〜98をそれぞれ参照)。プローブは、既に記述したように予めジゴキシゲニン-11-dUTP(Roche)とターミナル・トランスフェラーゼ(Promega)を用いて３’末端でラベル表示された(Villegas et al., DNA & Cell Biol., 19:579-588, 2000)。
過剰のプローブを除去するために、スライドは、室温で、最初2×SSCで１０分間及び1×SSCで１０分間洗浄された。その後、サンプルは室温で0.2×SSCで４５℃３０分間、及び最後に0.2×SSCで１０分間洗浄された。
ハイブリダイゼーション後、細胞はブロッキング緩衝液中(1%BSA、0.3%トリトンX-100 in PBS)中で３０分間インキュベートされ、その後予めブロッキング緩衝液中で１：５００に希釈され、アルカリ性ホスファターゼに結合しているアンチ−ジゴキシゲニン単クローン抗体を用いて室温で２時間インキュベートされた。
最後に、スライドは、PBSで2度洗われた、そして呈色反応は以前に記載したようにＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質混合物(DAKO)を用いて実行された(Villegas et al., DNA & Cell Biol., 19:579-588, 2000)。同様の操作は、フルオレスセインまたはローダミンに接合されるアンチ−ジゴキシゲニン抗体を使用して、ＦＩＳＨに対して行われた。
図４Ａと４Ｂに示されるように、SEQ ID NO 63に対応するジゴキシゲニンでラベル表示したプローブを用いたin situハイブリダイゼーションは、ヒト腫瘍細胞がセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを過剰発現することを示す。
ジゴキシゲニンでラベル表示した、SEQ ID NO 64に対応するセンスプローブを用いたin situハイブリダイゼーションは、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの発現を下方制御を示して、ネガティブであった(図４Ａ及びＢ)。同じ結果は、センスあるいはアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの他の領域を標的にするオリゴヌクレオチドプローブで得られた。
[実施例６]
ヒト生体中の腫瘍細胞はセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ(SEQ ID NO 1)を過剰発現し、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡ(SEQ ID NOS 4、5及び6)を下方制御する。
ヒトの生体は、病理学者あるいはDAKOからの組織アレーから入手した
分析されたほとんどのサンプルはパラフィンに埋め込まれていたか、またはホルマリンで固定されていた。他の組織サンプルは、Boiun固定剤で固定されていた、また他のサンプルは、新鮮な凍結組織切片であった。
約４ないし８μｍの組織切片は、予めポリリシン又はムラサキイガイ(Aulacomya ater)から精製された接着性ポリフェノール蛋白質でコートされたガラススライド上に固定された(Burzio et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8:309-312, 1997)。
パラフィンに包埋された組織切片は、６０℃で１時間インキュベートされた、そしてパラフィンは、キシロールで各１５分間３度洗浄により除去された。
切片は、空気乾燥され、ＰＢＳで４回洗浄された。その後、切片は、０．２ Ｎ ＨＣｌを用いて、室温で１０分間インキュベートされた、そしてＰＢＳで十分に洗浄された。後で、サンプルは、実施例４に記述されたプロトコルに従って、ジゴキシゲニンでラベル表示されたアンチセンスプローブを用いてin situハイブリダイゼーションに供された。パラレルセクションはセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの同じ領域に対応するセンスプローブでハイブリダイズされた。
図５Ａに示すように、胸、子宮頚部、膀胱の腫瘍及び肺の癌は、転移産物の強い存在を示して、センスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にするアンチセンスプローブで強く染色されることを示した。他方、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にするプローブを用いたin situハイブリダイゼーションは、この転写産物（図５Ａ）の下方制御を示してネガティブであった。
他の腫瘍細胞もまたセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを過剰発現し、そしてアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの発現を下方制御する（図５Ｂ）。
[実施例７]
正常増殖細胞はセンス及びアンチセンストコンドリアキメラＲＮＡを過剰発現する。
実施例５及び６に記述されたin situハイブリダイゼーションで同じプロトコルを使用して、センスミトコンドリアキメラＲＮＡの発現は、増殖細胞で決定した。
図６に示すように、ＨＦＫ細胞、精原細胞、脾臓細胞、及び増殖型マウス胚は、センスミトコンドリアキメラＲＮＡの過剰発現を示唆する、強いハイブリダイゼーションシグナルを示した。
対照的に、脳、筋肉及び肝臓の細胞のような非増殖細胞は、センスミトコンドリアキメラＲＮＡが発現しないか又はこれらの細胞で下方制御されることを示唆して、シグナルを示さなかった。
しかしながら、驚くべき結果は、in situハイブリダイゼーションがアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にするプローブで行われたとき、強いシグナルも観察された（図６）。
並行して分析されたいくつかの制御は、これらのプローブのハイブリダイゼーションシグナルが技術上の原因によらないことを示した。
もしin situハイブリダイゼーションがジゴキシゲニンで非ラベル表示されたものを除いて、過剰（５０ないし１００倍）の同じプローブと共にラベル表示されたプローブで行われたら、ハイブリダイゼーションシグナルは消失した。
ハイブリダイゼーションに先立ちサンプルがリボヌクレアーゼＡで一晩インキュベートされた場合、ハイブリダイゼーションシグナルは消失した。
また、ハイブリダイゼーションが４つのミスマッチを有するアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にするラベル表示されたプローブで行われた場合、ハイブリダイゼーションシグナルは観察されなかった。
[実施例８]
フィトヘムアグルチニン(PHA)で刺激された正常なヒトのリンパ細胞は、センス及びアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを過剰発現する。健康なドナーから５ｍｌの血液がＥＤＴＡで集められた。この血液は、０．９％ＮａＣｌの１容積で希釈され、該混合物は、遠心分離機チューブ中の５ｍｌのHistopaque-1077(Sigma)に適用された。このチューブは室温下で２０分間８００×ｇで遠心分離された。
分裂期の白血球が集められ、０．９％のＮａＣｌの２容積で薄められ、室温で１０分間、２５０×ｇで遠心分離された。集められた細胞は、けん濁され、２００ｍＭグルタミン、１０ｍＭ非必須アミノ酸、ペニシリン、子牛の胎児血清を欠いているストレプトマイシンが追加されたＲＰＭＩ１６４０倍地で２度洗浄された。
最後の沈殿物は、１０％子牛の胎児血清を含む同じ培地で再けん濁され、１ｍｌ当たりのヒトリンパ球の数は、ノイバウエルチャンバー中の顕微鏡で数えて決定された。
ヒトのリンパ球は、上記の追加されたＲＰＭＩ１６４０倍地に１０％の子牛の胎児血清を添加した９６ウエルのマイクロリッタープレート中で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養された。１ウエル当たり約30,000のリンパ球は、１０ｕｇ／ｍｌの（細胞増殖を誘発する）ミトゲンＰＨＡ存在、非存在下で培養された(Yu et al., J. Biol. Chem., 266:7588-7595, 1991)。
ＰＨＡで処理後４８ないし７２時間後、細胞は、Ｈ３−チミジン又はＢｒｄＵの取り込みにより立証されたように活発にＤＮＡ合成にたずさわった(Yu et al., J. Biol. Chem., 266:7588-7595, 1991)。また、ＰＨＡで刺激された48時間後に、リンパ球は、増殖細胞核抗原又はＰＣＮＡ及びＫｉ−６７のように、細胞増殖の他のマーカーを過剰発現した(Bantis et al., Cytopathology, 15:25-31, 2004) (図7)。
休止中又はコントロール・リンパ細胞は、これらの抗原を発現しなかった(図7)。
刺激されたリンパ球がセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを発現する否かを決定するために、細胞は、ジゴキシゲニンでラベル表示され、センスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にするオリゴヌクレオチドプローブでin situハイブリダイズされた。
使用されたin situハイブリダイゼーションプロトコルは、実施例５に記載された。
この転写産物の過剰発現を示唆する、強いハイブリダイゼーションシグナルが得られた(図7)。ハイブリダイゼーションシグナルは、腫瘍細胞又は他の正常増殖細胞で観察されたシグナルと同程度であった(図７を図４ＡとＢ、図５ＡとＢと比較)。
ハイブリダイゼーションシグナルは、ＰＨＡなしでインキュベートされたコントロールリンパ球には観察されなかった(図7)。
このiｎ situハイブリダイゼーションがジゴキシゲニンでラベル表示され、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にするセンスオリゴヌクレオチドを用いて行なわれた場合、同様に強いハイブリダイゼーションシグナルが得られた（図７）。
いくつかのコントロールは、ハイブリダイゼーションシグナルが技術上の原因よる可能性を否定するために行なわれた。
ハイブリダイゼーションシグナルは、もしin situハイブリダイゼーションが過剰（５０ないし１００倍）の（ジゴキシゲニンでラベル表示されていない）同一センスプローブと共にセンスラベル表示プローブで行なわれるときには、消失する。
ハイブリダイゼーションに先立ちサンプルをリボヌクレアーゼＡで一晩インキュベートすると、ハイブリダイゼーションシグナルは、消失する。
更に、ハイブリダイゼーションが４つのミスマッチを有するセンスプローブで行なうと、ハイブリダイゼーションシグナルは、観察されない。対照的に、刺激を受けていないリンパ球のin situハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションシグナルを示さない（図７）。
結論として、増殖するために刺激された正常なヒトリンパ細胞は、センスミトコンドリアキメラＲＮＡ及びアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの双方を過剰発現する。これらの転写産物は、休止細胞中では発現しない。
[実施例９]
センスミトコンドリアキメラＲＮＡは、正常な及び腫瘍細胞中で異なる局在化を示す。
実施例５と６に記述したin situハイブリダイゼーションは、ヒトの生検の腫瘍細胞中だけでなくいくつかの腫瘍細胞系においても、センスミトコンドリアキメラＲＮＡは、細胞質中で選択的に局在化される。しかしながら、ある腫瘍生検において、核中の転写産物の明らかな局在化が見出された（図４Ａ、Ｂ）。
驚くべき発見は、核中のセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの局在化であった。
実施例５に記載したように実施されたin situハイブリダイゼーションは、ＨｅＬａとＳｉＨａ細胞の核中にポジティブなハイブリダイゼーションシグナルを示した（図８）。ハイブリダイゼーションシグナルは、ＨＰＶ１６で形質転換されたＨＦＫの核中で強くなった（図８）。核の局在化は、また胸腫瘍及び横紋筋肉腫からの腫瘍細胞中にも見出された（図８）。
共−局在化（co-localization）の研究は、細胞質で局在化したセンスミトコンドリアキメラＲＮＡがミトコンドリアの外側で後期エンドゾーム／リゾソームと結合することを示した。もし共−局在化の研究が分子プローブ(Mitotrack)又は抗体アンチ−シトクロムｃ(Promega)もしくはアンチ−エンドヌクレアーゼＧ(Chemicon)のようなミトコンドリアのマーカーで行なわれる場合、in situハイブリダイゼーションは、弱い共−局在化を示した。
しかしながら、完全な共−局在化は、リソトラック(Lysotrack)(Molecular Probes)又はアンチ-ランプ-２(anti-Lamp-2) (BD Pharmigen)もしくはアンチカプサイシンＤ(anti-cathepsin D) (Zymed)のような後期エンドゾーム／リゾソームの免疫細胞学でハイブリダイゼーションシグナル中に見出された。
ＨｅＬａ細胞は、実施例５に記述したようなジゴキシゲニンでラベル表示されたオリゴヌクレオチドプローブでin situハイブリダイズされた。
ポスト−ハイブリダイゼーションと洗浄操作後、細胞は、ローダミン(Roche)でラベル表示されたアンチ−ジゴキシゲニン及びフルオレスセイン(BD Pharmingen)でラベル表示されたanti-Lamp-2 antibodyでインキュベートされた。暗所で室温下に３時間インキュベートした後、スライドは洗浄され、マウントされてツァィス共焦点顕微鏡で分析された。
リソトラック（Lysotrack）又はアンチ−カテプシンＤ抗体がリソソーム分画として用いられたとき、ランプ-２（Lamp-2）の局在化によるハイブリダイゼーションシグナルの明らかな共−局在化が得られた。同様のハイブリダイゼーションシグナルの共−局在化結果が得られた。
我々が知っている限り、これは、ＲＮＡ（特にミトコンドリア転写産物）が細胞のリソソームに結合されたことを示す最初の報告書である。
腫瘍細胞中のセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの局在化の決定は、癌を有する患者に対する重要な予後の値となる。一般に、正常な増殖細胞中でセンス及びアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡは、主に核中に局在化される。
[実施例１０]
アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて腫瘍細胞をin vitro処理すると細胞死を誘発する。
ＨＬ-６０細胞は、ＡＴＣＣによって推奨された最適条件の下で培養される。
約30,000個の細胞が９６―ウエルのマイクロタイタープレートで培養された。
センス又はアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にするオリゴヌクレオチド（２ｕＭ）が加えられた。細胞の浸透性を増すために、オリゴヌクレオチドは、リプフェクタミン（lipofectamin）もしくはオリゴフェクタミン（oligofectamin）(Invitrogen)又はポリエチレンイミド（PEI）を有する混合物中に添加された( Exgen TM500, Fermentas)。細胞に特に非毒性であるＰＥＩがより好ましい、
細胞は、オリゴヌクレオチドで６時間インキュベートされる、そして細胞残存の割合は、トリパンブルーへの浸透性で決定される。
オリゴヌクレオチドで６時間インキュベートした後、細胞の主要な割合が死滅した。
しかしながら、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にするオリゴヌクレオチドは、細胞死を誘発するのに更に有効であった(細胞死の１５％に対し約９０％)。
他方、細胞がセンスもしくはアンチセンス１２ＳミトコンドリアＲＮＡ又はＮＤ１サブニットのｍＲＮＡを標的にするオリゴヌクレオチド、又はスクランブルオリゴヌクレオチドもしくは４つのミスマッチを有するオリゴヌクレオチド(これらのすべてはコントロールとして使用された)で処理されたとき、細胞死は生じなかった。
これらの研究に用いられたオリゴヌクレオチドは、５’末端で最初の５ヌクレオチドまた３’末端で最初の５ヌクレオチドにホスフォロチオエートリンケージを含んでいる。平均して、１０の中央のヌクレオチドは、ホスフォジエステル結合を含んでいる。これらのオリゴヌクレオチドを備えた細胞の処理がＤＮＡ断片化を引き起こすかどうか確証するために、HL-60細胞は、オリゴヌクレオチドで６時間、以前に記述されたと同じ条件下でインキュベートされた。
約30,000個のHL-60細胞が、９６ウエルのマイクロチッタープレート上で、２００ｕｌのＩＤＭＥＭプラス１０％の子牛胎児血清中で、センスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的とする又はアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的とする１ｕＭのオリゴヌクレオチドと共に培養された。
ＰＥＩを含む混合物中に添加されたオリゴヌクレオチドの化学は、前節に記載したのと同様である。オリゴヌクレオチドで６時間定温放置した後、細胞は、TUNEL分析(DeadEndの比色定量のTUNELシステム、Promega)を用いてDNA断片化のために分析された。
表２に示されるように、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチドで処理後、約９６％の細胞がＤＮＡ断片化を示した。同様のＤＮＡ断片化率は薬物スタウロスポリンで得られた。スクランブルオリゴヌクレオチド又はミスマッチを有するオリゴヌクレオチドは効力を示さなかった。
対照的に、センスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチドで処理されると、約２０％の腫瘍細胞はアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの発現を下方制御し、そしてその結果これらの細胞は、この転写産物の少ないコピー数をもたらす（表２）。
従って、細胞死は、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にするオリゴヌクレオチドでより効率的に誘発される。
これらの結果は、腫瘍細胞中のアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの少ないコピー数は、治療目的になる、ことを強く示唆する。
Figure 0005201834
別の研究で、我々は、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にするオリゴヌクレオチドで細胞を処理するとカスパーゼ活性を誘発する、ことを決定した。
カスパーゼは、プログラムされた細胞死あるいはアポトーシスに活発に伴う、蛋白質分解を生ずる酵素である。ＨＬ-６０は、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にするオリゴヌクレオチド、又はスタウロスポリンを用いて、以前に記述された培養条件下で６時間、インキュベートされた。
その後、フルオレセインで結合したＶＡＤ-ｆｍｋ(CaspaCe FITC-VAD-FMK、Promega)を培養に加え、３７℃で３０分間インキュベートされた。 VAD-fmokは、カスパーゼの強い抑制剤で、非常に高い親和性でプロテアーゼに結合する(Gracia-Calvo et al., J. Biol. Chem., 273:32608-32613, 1998)。
細胞は、遠心分離によって洗われ、標本化されて蛍光顕微鏡で観察された。
ズ９に示すように、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にするオリゴヌクレオチドで処理したＨＬ-６０細胞は、スタウロスポリンで達成された活性化と同様のレベルで、カスパーゼ活性を誘発した。１２ＳミトコンドリアＲＮＡを標的にしたアンチセンスのオリゴヌクレオチドでは、カスパーゼ活性は得られなかった。
アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にするオリゴヌクレオチドで処理した細胞は、またアポトーシスに一致する他の変化を示す。電子顕微鏡分析は、核断片化およびクロマチン凝縮を示した。核断片化もＤＡＰＩで核を染色することにより実証された。
アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にするこれらのオリゴヌクレオチドで処理後、細胞は、ＤＡＰＩ染色で示されたように(図９Ｅ及び９Ｆ)、核断片化を受ける。
[実施例１１]
アンチセンストコンドリアキメラＲＮＡに相補するオリゴヌクレオチドで処理されると、他の癌細胞も細胞死を被る。
他の癌細胞は、実施例１０に記載したプロトコルに従い、アンチセンストコンドリアキメラＲＮＡに相補するオリゴヌクレオチドで処理された。この細胞は、ＡＴＣＣのリコメンドに従い、それらの最適条件下でインキュベートし、そして２ｕＭオリゴヌクレオチドがＰＥＩと共に実験の初期段階で添加された。
６時間後に、オリゴヌクレオチドの２回目の添加を同様の濃度で実行し、結果は、実験の開始の後１５時間で決定された。細胞死は、ＤＡＰＩ染色と断片化された核の細胞数を数えることにより決定された。表３に示すように、オリゴヌクレオチドで処理された細胞の７０％以上がアポトーシスを被った。
薬剤処理に全くの耐性を示すことが知られている、黒色腫細胞、リンパ腫細胞および胸癌細胞ＭＣＦ／７は、非常に高い割合でアポトーシスを被ることに気づくことは重要である（表３）。
Figure 0005201834
アポトーシスを誘発する際にオリゴヌクレオチドに対するより有効な標的となる転写産物の領域があるかを決定するために、次の実験を行った。アポトーシスの誘発は、アンチセンストコンドリアキメラＲＮＡの５’末端から始まっておよそ各３０ヌクレオチドを標的とした、約２０ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドを有するＨｅＬａ、ＨＥ-６０及びＭＣＦ／７細胞において研究された。
時間０では、１ｕＭオリゴヌクレオチドがＰＥＩと共に加えられた、そしてこの処理は６時間後に繰り返された。処理開始後１５時間でアポトーシスを被る細胞の割合は、ＤＡＰＩ染色と断片化された核を有する細胞を数えることにより決定された。
殆どのオリゴヌクレオチドは、変わりうる程度のアポトーシスを誘発したが、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの単一鎖領域は、細胞死を誘発するよい標的であった。推定二重鎖又はアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡのループ構造を標的にするオリゴヌクレオチドは、それほど有効ではない
アポトーシスは、またトリパンブルー染色、ヨウ化プロピジウム染色、アネキシン（anexine）免疫化学により決定することができる。 これらの技術において、細胞は、蛍光顕微鏡又はフロー・サイトメトリーにより分析することができる。ＤＮＡ断片化は、TUNEL、あるいはＤＮＡラダーを示す電気泳動によって測定されうる。
ウエスタンブロット分析もまた、カスパーゼ、poly(ADP Rib)合成等のような蛋白質のプロセッシングを決定するために使用することができる。
[実施例１２]
アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡに相補するオリゴヌクレオチドで正常増殖または休止細胞の処理は、アポトーシスに効果がない。以前に記載したように、正常増殖細胞は、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡと同様にセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを過剰発現する。
他方、休止細胞は、これらの転写産物を発言しない。
それ故、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡに相補するオリゴヌクレオチドが正常細胞において細胞死を誘発するかを決定することは重要である。ヒトリンパ細胞は、実施例８に記述したように１０ｕｇ／ｍｌのＰＨＡで４８時間刺激された。
並行して、コントロールリンパ細胞がＰＨＡなしで４８時間インキュベートされた。
４８時間の培養では、ＰＥＩ（実施例１０参照）と混合した１５ｕＭのオリゴヌクレオチドは、刺激されそしてコントロールされたリンパ細胞に添加された、そして更に１５時間インキュベートされた。オリゴヌクレオチドの濃度は、以前の実験（１−２ｕＭ）に用いた濃度よりも１０フォールド高かった。
刺激されそしてコントロールされたリンパ細胞の他の例は、同じ期間の間、０．４ｕＭスタウロスポリンで処理された。実験の終わりに、細胞死は、トリパンブルー染色又はＤＡＰＩ染色のいずれかにより測定された。
図１０に示すように、コントロールリンパ細胞またはオリゴヌクレオチドを含まない１５時間のインキュベートでＰＨＡ刺激されたリンパ細胞は、異なる実験で７から１０％間の変動で自然におこるアポトーシスと同様のレベルを示した。
同様の結果は、オリゴヌクレオチドのより低い(1-2 ｕＭ)濃度で得られた。
更に、１５ｕＭアンチセンスオリゴヌクレオチドで１５時間インキュベートしたコントロール及び刺激されたリンパ細胞は、同じ低レベルのアポトーシス（およそ１０％）を示した(図１０)。
対照的に、コントロールリンパ細胞又はＰＨＡ刺激され、スタウロスポリンで１５時間インキュベートされたリンパ細胞は、８０％以上の細胞がアポトーシスを被ることを示した（図１０）。これは非常に重要な結果である、なぜならヒトリンパ細胞のような正常休止細胞又は正常増殖細胞がアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡに相補するオリゴヌクレオチドによりアポトーシスを誘発するのに抵抗性であるからである。言いかえれば、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡで阻害することにより、腫瘍細胞中のアポトーシスの誘発が癌に対する選択的治療アプローチとなるからである。
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図１Ａ、Ｂ及びＣは、SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2及びSEQ ID NO 3に相当するセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの構造を示す線画である。 矢印は、ピースによりＲＮＡを増殖するのに用いるプライマーの相対的位置を示す。 線の下部の矢印は、リバースプライマーで、線の先頭の矢は、フォワードプライマーである。プライマー１は、１６Ｓミトコンドリアの５’末端に隣接して位置付けされる。黒線は、センス１６Ｓミトコンドリアに相当する、一方、点線は、アンチセンス１６Ｓミトコンドリアに相当する。
図２は、図１Ａに示したプライマー１とプライマー３の間で得られた増殖産物を示すアガロースゲル電気泳動である。 増殖は、鋳型としてＳｉＨａ(癌細胞)、ＨＰＶ１６(HFK698)で形質転換されたヒト角化細胞、あるいはＨＴＬＶ-１で形質転換されたＢリンパ細胞を用いて、ＰＴ−ＣＲにより実行された。ＳｉＨａ細胞からのＲＮＡで、２１０ｂｐの1つの単一アンプリコンだけが得られ、SEQ ID NO 1のセグメントに相当する。ＨＰＶ１６で形質転換されたヒト角化細胞の全ＲＮＡにおいて、２１０ｂｐのアンプリコンに加えて、１５０ｂｐの２番目のアンプリコンが得られた、SEQ ID NO 2に相当する。 ＨＴＬＶ-１で形質転換された細胞からのＲＮＡで、２１０ｂｐ及び１５０ｂｐのアンプリコンに加えて、３番目のアンプリコンが得られ、SEQ ID NO 3に相当する。
図３は、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5及びSEQ ID NO 6に相当するアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの構造を示す線画である。矢印は、増殖に用いられたプライマーを示す。プライマー１は、アンチセンスの１６ＳミトコンドリアＲＮＡの５’末端に隣接して位置付けされる。 これらの転写産物の配列を得るための方策は、図１に記載されたのと同様である。
図４Ａ及び図４Ｂは、培養液中でいくつかの腫瘍細胞を用いて行われたin situハイブリダイゼーション分析を示す。 細胞は、センスミトコンドリアキメラＲＮＡに相補するオリゴヌクレオチドプローブでハイブリダイズされ、そしてジゴキシゲニンでラベル表示された(左パネル)。 更に、細胞は、ジゴキシゲニンでラベル表示されたアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡに相補するオリゴヌクレオチドプローブで並行してハイブリダイズされた（右パネル）。細胞系は左側で識別される。
図５Ａは、異なる腫瘍細胞タイプに相当するヒトの生検のいくつかのセクションのin situハイブリダイゼーションである。 腫瘍セクションは、センスミトコンドリアキメラＲＮＡに相補するオリゴヌクレオチドプローブでハイブリダイズされ、ジゴキシゲニンでラベル表示された（左パネル）。 更に、並列の腫瘍セクションは、ジゴキシゲニンでラベル表示されたアンチセンスセンスミトコンドリアキメラＲＮＡに相補するオリゴヌクレオチドプローブでハイブリダイズされた（右パネル）。 図５Ｂは、ジゴキシゲニンでラベル表示されたセンスミトコンドリアキメラＲＮＡに相補するオリゴヌクレオチドプローブを用いて行われた、異なるヒト腫瘍細胞のin situハイブリダイゼーションである。
図６は、正常増殖細胞のin situハイブリダイゼーションである。 サンプルは、センス又はアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にしたプローブでハイブリダイズし、ジゴキシゲニンでラベル表示された。 強いハイブリダイゼーションシグナルは、双方のプローブで得られた、１つはセンスミトコンドリアキメラＲＮＡに相補し（左パネル）、同様に他はアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡに相補する（右パネル）。 組織あるいは細胞は、左側で識別される。
図７は、ミトゲンＰＨＡで増殖するために刺激されたヒトリンパ細胞における発現の変化を示すための免疫細胞化学及びin situハイブリダイゼーションである。 ＰＨＡで刺激４８時間後、リンパ細胞は、抗原Ｋｉ-６７及びＰＣＮＡを表現する。 これらの抗原は、コントロール中又は休止リンパ細胞中では発現されない（左パネル）。前記in situハイブリダイゼーションは、センス及びアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にするオリゴヌクレオチドで行ない、ジゴキシゲニンでラベル表示された。刺激を受けたリンパ細胞は、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡだけでなくセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを過剰発現した（右パネル）。
図８は、核小体中でセンスミトコンドリアキメラＲＮＡの局在化を示す腫瘍細胞のin situハイブリダイゼーションである。 細胞あるいは腫瘍セクションは、左側で示される。
図９は、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にするオリゴヌクレオチドプローブで処理された腫瘍ＨＬ-６０細胞に生じる変化示す蛍光顕微鏡検査である。Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、活性化されたカスパーゼに高い親和性で結合する化合物(VAD-fmok)で染色されることを示す。この化合物は、フルオレスセインで標識される。アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にするオリゴヌクレオチドプローブは、（Ｂ，Ｃと対比して）同じ方法でも薬剤スタウロスポリンよりも高いカスパーゼ活性を誘発する。 活性化されたカスパーゼは、対照として、コントロール未処理細胞（Ａ）又は１２ＳミトコンドリアＲＮＡを標的にするオリゴヌクレオチドプローブで処理された細胞（Ｄ）中では検出されなかった。ＥとＦは、ＤＡＰＩでＨＬ-６０細胞の染色を示す。 コントロール細胞（未処理）は、核の均質な染色を示す（Ｅ）、一方、アンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にするオリゴヌクレオチドプローブで処理された細胞は、広範な核の断片化を示す（Ｆ）。
図１０は、休止及び増殖リンパ細胞の異なる処理条件後のアポトーシスを起こした細胞の割合を示す。 アポトーシスは、ＤＡＰＩ染色により休止中の細胞又はＰＨＡに刺激されたリンパ細胞で測定された。バー１及び２は、未処理細胞に相当する。コントロール（１）又はＰＨＡに刺激されたリンパ細胞（２）の低い自然のアポトーシスが観察された。同様の低いレベルのアポトーシスは、休止中のリンパ細胞又はアンチセンスミトコンドリアキメラＲＮＡを標的にする１５ｕＭのオリゴヌクレオチドプローブで１５時間処理されたＰＨＡ刺激リンパ細胞で観察された、アポトーシスは正常細胞中では誘発されないことを示した。対照として、休止中の細胞とＰＨＡに刺激されたリンパ細胞は、スタウロスポリンで処理された。これらの条件下では、休止中のリンパ細胞(５)あるいはＰＨＡに刺激されたリンパ細胞(６)の約９０％がアポトーシスをこうむる。

Claims (10)

  1. （Ａ）SEQ ID NO 4〜6記載のヒトのアンチセンスのミトコンドリアキメラRNAのうち少なくとも一つのキメラRNAのレベルを測定する工程及びSEQ ID NO 1記載のヒトのセンスのミトコンドリアキメラRNAのレベルを測定する工程を含む正常細胞と前癌細胞又は癌細胞を識別するための方法、
    （Ｂ）SEQ ID NO 4〜6記載のヒトのアンチセンスのミトコンドリアキメラRNAのうち少なくとも一つのキメラRNAのレベルを測定する工程及びSEQ ID NO 2記載のヒトのセンスのミトコンドリアキメラRNAのレベルを測定する工程を含む正常な休止細胞、正常な増殖細胞、前癌細胞及び癌細胞を識別するための方法、及び、
    （Ｃ）SEQ ID NO 3記載のヒトのセンスのミトコンドリアキメラRNAのレベルを測定する工程を含むRNAウィルスで形質転換した細胞を癌細胞又は正常細胞から識別するための方法から選択される検出方法。
  2. 各測定工程が、前記アンチセンス及びセンスのミトコンドリアキメラRNAのうち少なくとも一つを、in situハイブリッド形成法、蛍光in situハイブリッド形成法、ノーザンブロット法、ドットブロット法、PCRを用いたｃDNA増幅法、TMA及びリボヌクレアーゼプロテクションアッセイからなる群から選択された少なくとも一つの方法により、同定し定量化する工程を含む請求項１に記載の検出方法。
  3. ヒトから採取した試料中で測定工程が行われる請求項１または２に記載の検出方法。
  4. 前記ヒトから採取した試料が、冷凍若しくは固定されたヒトの生体からの組織切片、唾液、尿、血液、骨髄、コロノサイト若しくは肺洗浄の細胞塗抹標本若しくは細胞懸濁液または血液若しくはリンパ液転移細胞から選択された試料を含む請求項３に記載の検出方法。
  5. SEQ ID NO 4〜6記載のヒトのアンチセンスのミトコンドリアキメラRNAのうち少なくとも一つのキメラRNAのレベルを測定する工程及びSEQ ID NO 1記載のヒトのセンスのミトコンドリアキメラRNAのレベルを測定する工程を含む請求項１から４までのいずれか１項記載の正常細胞と前癌細胞又は癌細胞を識別するための検出方法。
  6. SEQ ID NO 4〜6記載のヒトのアンチセンスのミトコンドリアキメラRNAのうち少なくとも一つのキメラRNAのレベルを測定する工程及びSEQ ID NO 2記載のヒトのセンスのミトコンドリアキメラRNAのレベルを測定する工程を含む請求項１から４までのいずれか１項記載の正常な休止細胞、正常な増殖細胞、前癌細胞及び癌細胞を識別するための検出方法。
  7. SEQ ID NO 3記載のヒトのセンスのミトコンドリアキメラRNAのレベルを測定することによりRNAウィルスで形質転換した細胞を癌細胞又は正常細胞から識別する請求項１から４までのいずれか１項記載の検出方法。
  8. SEQ ID NO 4〜6記載のヒトのアンチセンスのミトコンドリアRNAの少なくとも一つのキメラRNAのレベルを測定し、かつSEQ ID NO 1記載のヒトのセンスのミトコンドリアRNAのレベルを測定することによる、
    正常細胞と前癌細胞又は癌細胞を識別することによる癌及び前癌の診断のための標的としてのSEQ ID NO 1、及びSEQ ID NO 4〜6のうち少なくとも一つに記載のヒトのミトコンドリアキメラRNA分子の使用。
  9. SEQ ID NO 4〜6記載のヒトのアンチセンスのミトコンドリアRNAの少なくとも一つのキメラRNAのレベルを測定し、かつSEQ ID NO 2記載のヒトのセンスのミトコンドリアRNAのレベルを測定することによる、
    正常な休止細胞、正常な増殖細胞、前癌細胞及び癌細胞を識別することによる癌及び前癌の診断のための標的としてのSEQ ID NO 2、及びSEQ ID NO 4〜6のうち少なくとも一つに記載のヒトのミトコンドリアキメラRNA分子の使用。
  10. SEQ ID NO 3記載のヒトのセンスのミトコンドリアキメラRNAのレベルを測定することによる、
    RNAウィルスで形質転換した細胞を癌細胞又は正常細胞から識別するための標的としてのSEQ ID NO 3記載のヒトのミトコンドリアキメラRNA分子の使用。
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