BRPI0416912B1

BRPI0416912B1 - método para a produção de patchoulol, método para preparar uma patchoulol sintase funcional variante, construção de ácido nucleico, vetor, método de obtenção de uma célula hospedeira recombinante, célula de microrganismo hospedeira, método de fabricação de uma patchoulol sintase

Info

Publication number: BRPI0416912B1
Application number: BRPI0416912A
Authority: BR
Inventors: Schalk Michel
Original assignee: Firmenich & Cie
Priority date: 2003-11-26
Filing date: 2004-11-19
Publication date: 2020-01-28
Also published as: CN1886508B; CN1886508A; US20090205060A1; US8058046B2; WO2005052163A3; JP2007514416A; IL175728A0; IL175728A; US7622288B2; HK1094456A1; ATE424460T1; RU2006122534A; EP1697519A2; US20060206957A1; EP1697519B1; JP4700617B2; BRPI0416912A; DE602004019811D1; WO2005052163A2

Abstract

"ácido nucleico isolado, método para preparar uma sesquiterpeno sintase funcional variante, sintase, polipeptídeo, vetor, célula hospedeira, organismo nao humano, e, métodos para produzir uma célula hospedeira recombinante, uma sesquiterpeno sintase, e pelo menos um terpenóide". a invenção diz respeito a sesquiterpeno sintases de plantas de patchuli (pogostemon cablin), e a métodos de sua produção e uso. em uma forma de realização, a invenção fornece ácidos nucleicos compreendendo uma seqüência de nucleotídeos conforme aqui descrito, que codifica para pelo menos uma sesquiterpeno sintase. em uma outra forma de realização, a invenção também leva em conta sesquiterpeno sintases e métodos de produzir e usar estas enzimas. por exemplo, as sesquiterpeno sintases da invenção podem ser usadas para transformar farnesil-pirofosfato em vários sesquiterpenos, incluindo o patchulol, o <sym>-curcumeno e outros sesquiteipenos do tipo do germacreno.

Description

“MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE PATCHOULOL, MÉTODO PARA PREPARAR UMA PATCHOULOL SINTASE FUNCIONAL VARIANTE, CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR, MÉTODO DE OBTENÇÃO DE UMA CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE, CÉLULA DE MICRORGANISMO HOSPEDEIRA, MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE UMA PATCHOULOL SINTASE”

A presente invenção diz respeito a sesquiterpeno sintases de plantas de Patchuli (Pogostemon cablin'), e a métodos de sua produção e uso. Em uma forma de realização, a invenção fornece ácidos nucleicos compreendendo uma seqüência de nucleotídeos conforme descrito neste relatório, que codifica para pelo menos uma sesquiterpeno sintase. Em uma outra forma de realização, a invenção também leva em conta sesquiterpeno sintases e métodos de produzir e usar estas enzimas. Por exemplo, as sesquiterpeno sintases da invenção podem ser usadas para transformar farnesil-pirofosfato em vários sesquiterpenos, incluindo o patchulol, o γcurcumeno e outros sesquiterpenos do tipo do germacreno.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Os terpenóides ou terpenos representam uma família de produtos naturais encontrados na maior parte dos organismos (bactérias, fungos, animais, plantas). Os terpenóides são compostos de cinco unidades de carbono denominadas unidades de isopreno. Eles podem ser classificados pelo número de unidades de isopreno presentes em sua estrutura: monoterpenos (C10), sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20), triterpenos (C30), tetraterpenos (C40) e politerpenos (Cn). O reino das plantas contém a mais elevada diversidade de monoterpenos e sesquiterpenos.

Os monoterpenos e os sesquiterpenos são os isoprenóides mais estruturalmente diversos. Eles são usualmente compostos voláteis e são a maioria das vezes encontrados nas plantas onde eles desempenham um papel na defesa contra ataques de patógenos e de herbívoros, em atração

Petição 870160005520, de 19/02/2016, pág. 12/16 polinizadora e em comunicação de planta a planta.

Algumas plantas, conhecidas como plantas aromáticas ou plantas de óleos essenciais, acumulam grandes quantidades de monoterpenos e sesquiterpenos em suas folhas. Nestas plantas, os terpenos são ’ 5 freqüentemente sintetizados e acumulados em estruturas anatômicas especializadas, tricomas glandulares ou cavidades secretórias, localizadas nas folhas e na superfície dos troncos. Exemplos clássicos de tais plantas são os membros da família Lamiaceae, tais como a lavanda, a hortelã, a salva, o manjericão e o patchuli.

As plantas que acumulam monoterpeno e sesquiterpeno têm sido de interesse por milhares de anos, por causa do suas propriedades de sabor e fragrância e de seus efeitos cosméticos, medicinais e antimicrobianos. Os terpenos acumulados nas plantas podem ser extraídos por diferentes meios, tais como destilação de vapor, que produz o assim chamado óleo 15 essencial contendo os terpenos concentrados. Tais extratos naturais das plantas são componentes importantes para a indústria de condimentos e de perfumaria.

Muitos compostos de sesquiterpenos são usados em perfumaria (por exemplo o patchulol, nootkatone, santalol, vetivone, sinensal) 20 e muitos são extraídos das plantas. O preço e a disponibilidade dos extratos naturais de plantas dependem da abundância, da produção de óleo e da origem geográfica das plantas. Por causa da complexidade de sua estrutura, a produção das moléculas individuais do terpeno por síntese química é com freqüência limitada pelo custo do processo, e pode nem sempre ser química 25 ou financeiramente exeqüível. O progresso recente no entendimento da biossíntese do terpeno nas plantas e o uso de técnicas de biotecnologia modernas abrem novas oportunidades para a produção de moléculas de terpeno. O uso de biocatalisadores para a produção de terpenos requer um claro entendimento da biossíntese dos terpenos e do isolamento dos genes que codificam as enzimas envolvidas nas etapas biossintéticas específicas.

A biossíntese dos terpenos nas plantas tem sido extensivamente estudada. O precursor comum de cinco carbonos para todos os terpenos é o pirofosfato de isopentenila (IPP). A maior parte das enzimas * 5 que catalisam as etapas que conduzem ao IPP têm sido clonadas e caracterizadas. Duas vias distintas para a biossíntese do IPP coexistem nas plantas. A via do mevalonato é encontrada no citosol e no retículo endoplasmático, e a via não do mevalonato [ou via da desoxixilulose (DXP)] é encontrada nos plastídeos. Na etapa seguinte, o IPP é repetitivamente 10 condensado por prenil transferases para formar os precursores de terpeno de pirofosfato de prenila acíclico para cada classe de terpenos, por exemplo o geranil-pirofosfato (GPP) para os monoterpenos, o famesil-pirofosfato (FPP) para os sesquiterpenos, o geranilgeranil-pirofosfato (GGPP) para os diterpenos. Estes precursores servem como substrato para as terpeno sintases 15 ou ciclases, as quais são específicas para cada classe de terpeno, por exemplo monoterpeno, sesquiterpeno ou diterpeno sintases. As terpeno sintases catalisam as ciclizações de etapas múltiplas complexas para formar a grande diversidade de esqueleto de carbono dos compostos de terpeno. A reação inicia com a ionização do grupo difosfato para formar um cátion alílico. O 20 substrato sofre então isomerizações e rearranjos que são controlados pelo sítio ativo da enzima. O produto pode ser acíclico, ou cíclico com um ou com múltiplos anéis. A reação é terminada por desprotonação do carbocátion ou por captura por uma molécula de água, e o hidrocarboneto de terpeno ou o álcool são liberados. Algumas terpeno sintases produzem um produto único, 25 mas a maior parte delas produz produtos múltiplos. Estas enzimas são responsáveis pelo número extremamente grande de esqueletos de terpeno. Finalmente, no último estágio da biossíntese dos terpenóides, as moléculas de terpeno podem passar por várias etapas de transformações enzimáticas secundárias tais como hidroxilações, isomerizações, óxido-reduções ou acilações, conduzindo às dez mil diferentes moléculas de terpeno.

Esta invenção diz respeito ao isolamento dos ácidos nucléicos que codificam para as sesquiterpeno sintases. As sesquiterpeno sintases convertem o famesil-pirofosfato nos diferentes esqueletos de sesquiterpeno. ’ 5 Mais de 300 hidrocarbonetos de sesquiterpeno e de 3000 sesquiterpenóides foram identificados (Joulain, D. e Kõnig, W. A. The Atlas of Spectral Data of Sesquiterpene Hydrocarbons, EB Verlag, Hamburg, 1998; Connolly, J. D., Hill, R. A. Dictionary of Terpenoids, Vol. 1, Chapman e Hall (editores), 1991), e muitas novas estruturas são identificadas a cada ano. Existe 10 virtualmente uma infinidade de sesquiterpeno sintases presentes no reino das plantas, todas usando o mesmo substrato, porém tendo diferentes perfis do produto.

Vários cDNA ou genes codificando a sesquiterpeno sintase têm sido clonados e caracterizados de diferentes fontes de plantas, por 15 exemplo as aristolocheno sintases da Nicotiana tabacum (Facchini, P. J. e Chappell, J. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 11088-11092) e de Capsicum annum (Back, K., et al. (1998) Plant Cell Physiol. 39 (9), 899904), uma vetispiradieno sintase de muticus (Back, K. e Chappell, J. (1995) J. Biol. Chem. 270 (13), 7375-7381), uma (E)-P-fameseno sintase da Mentha 20 pipperita e do Citrus junos (Crock, J. et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci.

U.S.A. 94 (24), 12833-12838; Maruyama et al. (2001) Biol. Pharm. Bull. 24 (10), 1171-1175), uma δ-selineno sintase e uma γ-humuleno sintase da Abies grandis (Steele, C. L. et al. (1998) J. Biol. Chem. 273 (4), 2078- 2089), δcardineno sintase do Gossypium arboreum (Chen, X. Y. et al. (1995) Arch.

Biochem. Biophys. 324 (2), 255-266; Chen, X. Y. et al. (1996) J. Nat Prod. 59, 944-951), uma Ε-α-bisaboleno sintase da Abies grandis (Bohlmann, J. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95 (12), 6756- 6761), uma germacreno C sintase da Lycopersicon esculentum (Colby, S. M. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95 (5), 2216-2221), uma epi- cedrol sintase e uma amorfa-4,11-dieno sintase da Artemisia annua (Mercke, P. et al. (1999) Arch. Biochem. Biophys. 369 (2), 213-222; Mercke, P. et al. (2000) Arch.

Biochem. Biophys. 381 (2), 173-180), uma germacreno D sintase de Tycopersicon esculentum (van der Hoeven, R. S., Monforte, A. J., Breeden, • 5 D., Tanksley, S. D. e Steffens, J. C. (2000) The Plan cell 12, 2283-2294) e germacreno A sintases da Lactuca sativa, da Cichorium intybus e da Solidago canadensis (Bennett, Μ. H. et al. (2002) Phytochem. 60, 255-261;

Bouwmeester, H. J. et al. (2002) Plant Physiol. 129 (1), 134-144; Prosser, I. et al. (2002) Phytochem. 60,691-702).

Uma forma de realização da presente invenção diz respeito ao isolamento das plantas de patchuli de ácido nucleico codificando para as sesquiterpenes sintases. O óleo de patchuli é um material bruto importante para perfumarias obtido por destilação de vapor das folhas da planta Pogostemon cablin (patchuli), uma Lamiaceae que cresce em regiões tropicais. O óleo, que tem um odor agradável de longa duração com fragrâncias de madeira, terra e canforáceas, é amplamente usado em perfumaria. Nas plantas de patchuli, a biossíntese e a armazenagem do óleo é associada com estruturas anatomicamente especializadas: estruturas glandulares encontradas na superfície das folhas e estruturas internas encontradas por toda a planta. A biossíntese do óleo ocorre no estágio prematuro do desenvolvimento da folha (Henderson, W., Hart, J. W., How, P. e Judge, J. (1:969) Phytochem. 9, 1219-1228). O óleo é rico em sesquiterpenos. O sesquiterpeno patchulol (Figura 1) é o principal constituinte (5 a 40 %) e contribui consideravelmente para a fragrância típica.

A biossíntese do patchulol nas folhas do Patchuli (Pogostemon cablin) tem sido estudada e elucidada. Croteau e colaboradores estudaram o mecanismo da biossíntese do patchulol com o uso de extratos das folhas do patchuli e obtiveram a purificação e caracterização das patchulol sintases (Croteau et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 256 (1), 56-68; Munck e

Croteau (1990) Arch. Biochem. Biophys. 282(1), 55-64). Uma única sesquiterpene sintase é responsável pela biossintese do patchulol do famesilpirofosfato. A patchulol sintase do patchuli é uma enzima de produtos múltiplos que sintetiza o patchulol como um produto principal e vários ’ 5 produtos secundários, incluindo oc-bulneseno, ot-guaieno, a-patchuleno, βpatchuleno (Figura 1) (Croteau et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 256(1), 56-68; Munck e Croteau (1990) Arch. Biochem. Biophys. 282(1) 55-64). A síntese química do patchulol e de compostos estruturalmente relacionados envolve um grande número de etapas e, até aqui, não houve nenhum processo 10 químico comercialmente interessante. Portanto, uma diretriz bioquímica para a produção do patchulol deve ser de grande interesse. A engenharia de uma diretriz bioquímica para a produção do Patchulol requer o isolamento dos genes codificando para a patchulol sintase.

Uma forma de realização da presente invenção provê ácidos nucléicos isolados das folhas de patchuli e codificando para as sesquiterpeno sintases. Outra forma de realização da invenção diz respeito à transformação de bactérias com os ácidos nucléicos isolados da invenção, incluindo a produção das sesquiterpeno sintases recombinantes resultantes. Por exemplo, uma forma de realização da presente invenção diz respeito ao uso de uma 20 sesquiterpeno sintase recombinante para produzir uma mistura de sesquiterpenes, com o patchulol sendo o produto principal. Outras formas de realização da invenção dizem respeito ao uso de outras sesquiterpeno sintases recombinantes para produzir γ-curcumeno como o produto principal, e outras sesquiterpeno sintases recombinantes para produtos sesquiterpenos do tipo germacrano (figura 1). Uma outra forma de realização da invenção diz respeito ao uso de sesquiterpeno sintases in vivo para produzir pelo menos um terpenóide, por exemplo o patchulol.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em uma forma de realização, a invenção diz respeito a ácidos

nucleicos isolados que codificam as sesquiterpeno sintases. Como aqui usado, uma sesquiterpeno sintase pode também ser referida por pelo menos um composto produzido pela enzima após o contato com um precursor do pirofosfato terpeno acíclico, tal como o famesil-pirofosfato. Em uma forma de ’ 5 realização, ele é o principal produto produzido. Por exemplo, a sesquiterpeno sintase capaz de produzir patchulol como um de seus produtos, por exemplo o produto principal, pode ser referido como uma patchulol sintase. Com o uso desta convenção, os exemplos de ácidos nucleicos da invenção incluem os cDNAs codificando a γ-curcumeno sintase (PatTpsA) (SEQ ID NO: 1); (-)10 germacreno D sintase (PatTpsBF2) (SEQ ID NO: 2); (+)-germacreno A sintase (PatTpsCF2) (SEQ ID NO: 3); outra (-)-germacreno D sintase (PatTpsB15) (SEQ ID NO: 4); e uma patchulol sintase (PatTpsl77) (SEQ ID NO: 5).

Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um 15 ácido nucléico isolado codificando uma patchulol sintase.

Em outra forma de realização, um ácido nucléico isolado codificando uma γ-curcumeno sintase é fornecido.

Em uma forma de realização, a invenção fornece um ácido nucléico isolado selecionado de: (a) um ácido nucléico compreendendo a 20 seqüência de nucleotídeos substancialmente como apresentada nas SEQ ID

NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 õu SEQ ID NO: 5; (b) um ácido nucléico codificando o polipeptídeo substancialmente apresentado nas SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10; e (c) um ácido nucléico que hibridiza ao ácido nucléico de (a) ou 25 de (b) sob condições de baixa estringência, em que o polipeptídeo codificado pelo referido ácido nucléico tem atividade de sesquiterpeno sintase. Em uma forma de realização, as condições definidas são condições de estringência moderada e, em uma outra forma de realização, as condições definidas são condições de alta estringência. Outras formas de realização incluem: um polipeptídeo codificado por um ácido nucleico da invenção, ou obtido do método para preparar um ácido nucleico codificando uma sesquiterpeno sintase melhorada; uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico da invenção; um organismo não humano modificado para abrigar um ácido ' 5 nucleico da invenção; e métodos de produzir um polipeptídeo compreendendo cultivar células hospedeiras da invenção.

Em uma forma de realização, a invenção fornece uma patchulol sintase isolada. Em outra forma de realização, a presente invenção fornece uma γ-curcumeno sintase isolada.

Em uma outra forma de realização, a invenção fornece um vetor compreendendo pelo menos um ácido nucleico dé acordo com a invenção. Em ainda outra forma de realização, a presente invenção fornece um método para preparar um ácido nucleico codificando uma sesquiterpeno sintase melhorada.

Outras formas de realização incluem métodos de produzir uma célula hospedeira recombinante, compreendendo introduzir um vetor da invenção em uma célula hospedeira.

Em uma forma de realização, a invenção fornece um método para produzir pelo menos uma sesquiterpeno sintase compreendendo cultivar 20 um hospedeiro modificado para conter pelo menos uma seqüência de ácido nucleico sob condições conducentes à produção da referida pelo menos uma sesquiterpeno sintase em que referido pelo menos um ácido nucleico é o ácido nucleico de acordo com a invenção.

Em outra forma de realização, a invenção fornece um método para produzir pelo menos um terpenóide compreendendo A) proporcionar o contato de pelo menos um precursor do pirofosfato terpeno acíclico com pelo menos um polipeptídeo codificado por um ácido nucleico de acordo com a invenção, e B) opcionalmente, isolar pelo menos um terpenóide produzido em A). Em uma forma de realização, o método é realizado in vivo. Por exemplo, pelo menos uma sintase é produzida in vivo em, por exemplo, um microorganismo ou uma planta compreendendo pelo menos um precursor do pirofosfato terpeno acíclico. Preferivelmente, o pelo menos um terpenóide é escolhido dos sesquiterpenos. Preferivelmente, o pelo menos um precursor do 5 pirofosfato terpeno acíclico é o famesil-pirofosfato. Os sesquiterpenos produzidos pelos métodos da invenção incluem, sem que a estes fiquem limitados, o patchulol, o γ-curcumeno e outros sesquiterpenos do tipo germacrano (Figura 1). Em uma forma de realização, o pelo menos um terpenóide é sesquiterpeno escolhido dentre γ-curcumeno e/ou patchulol.

Deve ficar entendido que tanto a descrição geral precedente quanto a seguinte descrição detalhada são exemplares e explanatórias apenas, e não são restritivas da invenção, conforme reivindicado. Referência será feita agora em detalhes às formas de realização exemplares da presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1: Estrutura das moléculas de sesquiterpeno citadas no texto.

Figura 2: Parte central dos alinhamentos das seqüências de aminoácidos de dois grupos de sesquiterpeno sintases (SEQ ID NOS: 13 a 24, respectivamente na ordem do aparecimento) usados para delinear os 20 iniciadores degenerados específicos da sesquiterpeno sintase (SEQ ID NOS:

a 30, respectivamente na ordem do aparecimento). As flechas abaixo e cada alinhamento mostram as regiões do alinhamento usadas para delinear cada iniciador e sua orientação.

Figura 3: Alinhamento das seqüências de aminoácidos 25 deduzidas dos produtos 3’RACE (SEQ ID NOS: 31 a 33, respectivamente na ordem do aparecimento). As letras brancas sobre fundo negro e as letras negras sobre fundo cinza, representam respectivamente resíduos idênticos e semelhantes em duas das três seqüências.

Figura 4: Alinhamento das seqüências de aminoácidos deduzidas dos produtos 5’RACE (SEQ ID NOS: 34 a 36, respectivamente na ordem do aparecimento). As letras brancas sobre fundo negro e as letras negras sobre fundo cinza, representam respectivamente resíduos idênticos e semelhantes em duas das três seqüências.

’ 5 Figura 5: Alinhamento das seqüências de aminoácidos deduzidas dos cDNAs isolados neste trabalho (SEQ ID NOS: 37 a 42, respectivamente na ordem do aparecimento). As letras brancas sobre fundo negro e as letras negras sobre fundo cinza, representam respectivamente resíduos idênticos e semelhantes em quatro das seis seqüências.

Figura 6: Alinhamento das seqüências de nucleotídeos das matrizes de leitura aberta dos cDNAs isolados neste trabalho (SEQ ID NOS: 43 a 48, respectivamente na ordem do aparecimento). As letras brancas sobre fundo negro representam nucleotídeos conservados em quatro das seis seqüências. As regiões usadas para delinear os iniciadores degenerados são 15 marcadas com flechas abaixo do alinhamento, e os nomes dos iniciadores são indicados.

Figura 7: Análise acoplada cromatográfica gasosaespectrofotomética de massa (GC-MS) dos sesquiterpenes produzidos por PatTpsA (SEQ ID NO: 6). A. Cromatograma de íons totais. O pico do 20 famesol (tempo de retenção 16,15) é devido à hidrólise do FPP pela fosfatase alcalina de E. coli presente no extrato de proteína bruta. Todos os picos, exceto o pico 1, são contaminantes do meio de incubação ou do uso do solvente para a extração. B. Espectro de massa e índice de retenção calculados para o pico 1.

Figura 8: Análise acoplada cromatográfica gasosaespectrofotomética de massa (GC-MS) dos sesquiterpenes produzidos por PatTpsBF2 (SEQ ID NO: 7). A. Cromatograma de íons totais. O pico do famesol (tempo de retenção 16,16) é devido à hidrólise do FPP pela fosfatase alcalina de E. coli presente no extrato de proteína bruta. Todos os picos, exceto o pico 1, são contaminantes do meio de incubação ou do uso do solvente para a extração. B. Espectro de massa e índice de retenção calculados para o pico 1.

Figura 9: Análise acoplada cromatográfica gasosa‘ 5 espectrofotomética de massa (GC-MS) dos sesquiterpenos produzidos por PatTpsCF2 (SEQ ID NO: 8). A. Cromatograma de ions totais. O pico do famesol (tempo de retenção 16,16) é devido à hidrólise do FPP pela fosfatase alcalina de E. coli presente no extrato de proteína bruta. Os picos marcados com número são sesquiterpenos. B, C, D, E. Os espectros de massa e os 10 índices de retenção calculados dos picos onde o sesquiterpeno foi identificado, O pico 5 é um hidrocarboneto de sesquiterpeno e o pico 6 é um álcool de sesquiterpeno. Quanto à estrutura das moléculas, ver a Figura 1.

Figura 10: Análise acoplada cromatográfica gasosaespectrofotomética de massa (GC-MS) dos sesquiterpenos produzidos por 15 PatTpsB-15 (SEQ ID NO: 9). A. Cromatograma de ions totais. Os picos marcados com número são sesquiterpenos. B, C, D, E, F, G. Os espectros de massa e os índices de retenção calculados dos picos onde o sesquiterpeno foi identificado, Os picos 4, 5, 7, 8, 9 e 12 são hidrocarbonetos de sesquiterpeno. Os picos 13 e 14 são álcoois de sesquiterpeno. Quanto à estrutura das 20 moléculas, ver a Figura 1.

Figura 11: Análise acoplada cromatográfica gasosaespectrofotométrica de massa (GC-MS) dos sesquiterpenos produzidos por PatTpsl77 (SEQ ID NO: 10). O cromatograma de ions totais é representado. Os picos marcados com número são sesquiterpenos. Todos os sesquiterpenos 25 nos picos marcados, exceto os picos 3, 4, 11, 13 e 17, puderam ser identificados.

Figura 12: Os espectros de massa dos picos selecionados da análise acoplada cromatográfica gasosa-espectrofotométrica de massa (GCMS) dos sesquiterpenos produzidos por PatTpsl77 (SEQ ID NO: 10). O espectro de massa, o nome do composto e o índice de retenção calculado são mostrados para cada pico, onde o sesquiterpeno tenha sido identificado. O espectro de massa do padrão autêntico de (-)-patchulol (purificado do óleo de patchuli) também é apresentado. Quanto à estrutura das moléculas, ver a Figura 1.

Figura 13: seqüências de DNA (SEQ ID NO: 1) e aminoácido (SEQ ID NO: 6) de PatTpsA, uma γ-curcumeno sintase.

Figura 14: seqüências de DNA (SEQ ID NO: 2) e aminoácido (SEQ ID NO: 7) de PatTpsBF2, uma (-)-germacreno D sintase.

Figura 15: seqüências de DNA (SEQ ID NO: 3) e aminoácido (SEQ ID NO: 8) de PatTpsCF2, uma (+)-germacreno A sintase.

Figura 16: seqüências de DNA (SEQ ID NO: 4) e aminoácido (SEQ ID NO: 9) de PatTpsB15, outra (-)-germacreno D sintase.

Figura 17: seqüências de DNA (SEQ ID NO: 5) e aminoácido (SEQ ID NO: 10) de PatTpsl77, uma patchulol sintase.

Figura 18: seqüências de DNA (SEQ ID NO: 11) e aminoácido (SEQ ID NO: 12) de PatTpsCló, uma sesquiterpeno sintase.

ABREVIATURAS USADAS pb par(es) de base

DNA ácido desoxirribonucleico cDNA DNA complementar

DTT ditiotreitol

EDTA ácido etilenodiaminotetraacético

FPP Famesil-pirofosfato

IPP Pirofosfato de isopentenila

IPTG isopropil-D-tiogalacto-piranosídeo

PCR reação em cadeia da polimerase

RT-PCR transcrição reversa - reação em cadeia da polimerase

3’-/5’-RACE amplificação rápida de 3’ e 5’ das extremidades do cDNA

RNA ácido ribonucleico mRNA

SDS-PAGE ácido ribonucleico mensageiro eletroforese em SDS-gel de poliacrilamida

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Um terpeno é um hidrocarboneto insaturado com base em uma unidade de isopreno (C₅H₈) que pode ser acíclica ou cíclica. Os derivados de 10 terpeno incluem, mas não ficam limitados, cânfora, mentol, terpinol, borneol, geraniol, nootkatone, cedrol e patchulol. Terpenos ou Terpenóides, como aqui usados, incluem .terpenos e derivados de terpenos, incluindo composto que tenha sido submetido a uma ou mais etapas de fimcionalização, tais como hidroxilações, isomerizações, oxirreduções ou acilações. Como aqui usado, 15 um sesquiterpeno é um terpeno com base em uma estrutura C15 e inclui sesquiterpenos e derivados de sesquiterpenos, incluindo compostos que tenham sido submetidos a uma ou mais etapas de fimcionalização, tais como hidroxilações, isomerizações, oxirreduções ou acilações.

Como aqui usado, um derivado é qualquer composto obtido de 20 um composto conhecido ou hipotético e contendo elementos essenciais da substância precursora.

Como aqui usado, sesquiterpeno sintase é qualquer enzima que catalise a síntese de um sesquiterpeno.

As expressões “idêntico”, “substancialmente idêntico” ou 25 “substancialmente como apresentado” significam que uma seqüência relevante é pelo menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica a uma dada seqüência. Como exemplo, tais seqüências podem ser variantes alélicas, seqüências derivadas de várias espécies, ou elas pode ser derivadas da seqüência dada mediante truncação, deleção, substituição ou adição de aminoácidos. Quanto aos polipeptídeos, o comprimento das seqüências de comparação geralmente será de pelo menos 20, 30, 50, 100 ou mais aminoácidos. Quanto aos ácidos nucleicos, o comprimento das seqüências de comparação será geralmente de pelo menos 50, 100, 150, 300 ou mais nucleotídeos. O percentual de identidade entre duas seqüências é determinado por algoritmos de alinhamento padrão, tais como, por exemplo, o Basic Local Alignment Tool (BLAST) descrito em Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410, o algoritmo de Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48: 444-453, ou o algoritmo de Meyers et al. Comput. Appl. Biosci.,4: 11-17.

A invenção, assim, fornece, em uma forma de realização, um ácido nucléico isolado selecionado de: (a) um ácido nucléico compreendendo a seqüência de nucleotídeos substancialmente como apresentado nas SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5; (b) um ácido nucléico codificando o polipeptídeo substancialmente apresentado nas SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10; e (c) um ácido nucléico que hibridiza ao ácido nucléico de (a) ou (b) sob condições de baixa estringência, em que o polipeptídeo codificado pelo referido ácido nucléico tem a atividade da sesquiterpeno sintase. Em uma forma de realização, as condições definidas são as condições de estringência moderada e, em uma outra forma de realização, as condições definidas são condições de alta estringência.

Como aqui usado, uma determina se um polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da invenção tem atividade de sesquiterpeno sintase pelo ensaio de caracterização da enzima descrito nos presentes exemplos.

Como aqui usada, a expressão hibridização ou hibridiza sob certas condições se destina a descrever condições para a hibridização e lavagens sob as quais as seqüências de nucleotídeos que sejam significativamente idênticas ou homólogas umas com as outras permanecem ligadas entre si. As condições podem ser tais que as seqüências, que sejam pelo menos cerca de 70 %, tal como pelo menos cerca de 80 %, e tal como pelo menos cerca de 85 a 90 % idênticas, permanecem ligadas umas com as * 5 outras. As definições de condições de hibridização de baixa estringência, moderada e alta estringência, são fornecidas neste relatório.

Condições de hibridização apropriadas podem ser selecionadas por aqueles habilitados na técnica com experimentação mínima, como exemplificado em Ausubel et al. (1995), Current Protocols in Molecular 10 Biology, John Wiley & Sons, seções 2,4 e 6. Adicionalmente, as condições de estringência são descritas em Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2~ ed., Cold Spring Harbor Press, capítulos 7, 9 e 11. Como aqui usado, as condições definidas de baixa estringência são como segue. Os filtros contendo DNA são pré-tratados por 6 horas a 40°C em uma 15 solução contendo 35 % de formamida, 5x SSC, Tris 50 mM-HCl (pH 7,5), EDTA 5 mM, PVP 0,1 %, Ficoll 0,1 %, BS A 1 % e 500 pg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado. As hibridizações são realizadas na mesma solução com as seguintes modificações: 0,02 % de PVP, 0,02 % de Ficoll, 0,2 % de BS A, 100 pg/ml de DNA de esperma de salmão, 10 % (peso/volume) de 20 sulfato de dextrano, e sonda rotulada de 32P de 5 a 20x106 é usada. Os filtros são incubados em mistura de hibridização por 18 a 20 horas a 40°C, e depois lavados por 1,5 hora a 55°C em uma solução contendo 2x SSC, Tris 25 mMHCl (pH 7,4), EDTA 5 mM, e SDS 0,1 %. A solução de lavagem é substituída por solução fresca e incubada por um adicional de 1,5 hora a 60°C. Os filtros 25 são manchados secos e expostos à auto-radiografia.

Como aqui usado, as condições definidas como estringência moderada são como segue. Os filtros contendo o DNA são pré-tratados por 7 horas a 50°C, em uma solução contendo 35 % de formamida, 5x SSC, Tris 50 mM-HCl (pH 7,5), EDTA 5 mM, PVP 0,1 %, Ficoll 0,1 %, BSA 1 % e 500 μg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado. As hibridizações são realizadas na mesma solução com as modificações seguintes: PVP 0,02 %, Ficoll 0,02 %, BS A 0,2 % e 100 pg/ml de DNA de esperma de salmão, 10 % (peso/volume) de sulfato de dextrano, e sonda rotulada de 32P de 5 a 20x106 * 5 é usada. Os filtros são incubados em mistura de hibridização por 30 horas a 50°C, e depois lavados por 1,5 hora a 55°C em uma solução contendo 2x SSC, Tris 25 mM-HCl (pH 7,4), EDTA 5 mM, e SDS 0,1 %. A solução de lavagem é substituída por solução fresca e incubada por um adicional de 1,5 hora a 60°C. Os filtros são manchados secos e expostos à auto-radiografia.

Como aqui usado, as condições definidas de alta estríngência são como segue. A pré-hibridização de filtros contendo DNA é realizada por 8 horas durante a noite a 65°C em tampão composto de 6x SSC, Tris 50 mMHCl (pH 7,5), EDTA 1 mM, PVP 0,02 %, Ficoll 0,02 %, BSA 0,02 % e 500 pg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado. Os filtros são hibridizados por 48 horas a 65°C na mistura de pré-hibridização contendo 100 pg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado e sonda rotulada de 32P de 5 a 20x106 cpm. A lavagem dos filtros é feita a 37°C por 1 hora em uma solução contendo 2x SSC, PVP 0,01 %, Ficoll 0,01 % e BSA 0,01 %. Isto é seguido por uma lavagem em 0,lx SSC a 50°C por 45 minutos. Outras condições de baixa, moderada e alta estríngência bem conhecidas na técnica (por exemplo, como empregado para as hibridizações de espécies cruzadas) podem ser usadas se as condições acima forem impróprias.

Em uma forma de realização do ácido nucléico da invenção, o ácido nucléico é escolhido de (a) um ácido nucléico compreendendo a 25 seqüência de nucleotídeos substancialmente como apresentado na SEQ ID NO: 5; (b) um ácido nucléico codificando o polipeptídeo substancialmente apresentado na SEQ ID NO: 10; e (c) um ácido nucléico que hibridiza ao ácido nucléico de (a) ou (b) sob condições de baixa estríngência, em que o polipeptídeo codificado pelo referido ácido nucléico tem atividade de sesquiterpeno sintase.

Em outra forma de realização do ácido nucleico da invenção, o ácido nucleico é escolhido de (a) um ácido nucleico compreendendo a seqüência de nucleotídeos substancialmente como apresentado na SEQ ID NO: 1; (b) um ácido nucleico codificando o polipeptídeo substancialmente apresentado na SEQ ID NO: 6; e (c) um ácido nucleico que hibridiza ao ácido nucleico de (a) ou de (b) sob condições de baixa estringência, em que o polipeptídeo codificado pelo referido ácido nucleico tem atividade de sesquiterpeno sintase.

Em uma forma de realização, os ácidos nucleicos são pelo menos 70 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 % ou pêlo menos 95 % idênticos aos nucleotídeos da SEQ ID NO: 5 e/ou 1. Preferivelmente, o ácido nucleico da etapa (c) hibridiza sob condições de estringência moderadas, mais preferível sob alta estringência, aos ácidos nucleicos de (a) ou de (b) acima.

Preferivelmente, um ácido nucleico e/ou polipeptídeo da invenção são isolados do patchuli (Pogostemon cablin'). Em uma forma de realização, o ácido nucleico é isolado das folhas do patchuli.

Preferivelmente, o ácido nucleico de acordo com a invenção compreende a SEQ ID NO: 5. Preferivelmente, o ácido nucleico compreende a SEQ ID NO: 10.

Em uma forma de realização particular, a invenção diz respeito a certas seqüências isoladas de nucleotídeos, incluindo aquelas que são substancialmente livres de material endógeno contammante. As expressões “ácido nucleico” ou “molécula de ácido nucleico” referem-se a um polímero desoxirribonucleotídeo ou tibonucleotídeo ou na forma de filamento único ou duplo, e a menos que de outra forma limitado, deve incluir análogos conhecidos de nucleotídeos naturais que possam funcionar de uma maneira semelhante como nucleotídeos de ocorrência natural. Uma “seqüência.....de nucleotídeos” também se refere a uma molécula de polinucleotídeos ou molécula de oligonucleotídeos na forma de um fragmento separado ou como um componente de um ácido nucléico maior. A seqüência ou molécula de nucleotídeos também pode ser referida como uma “sonda de nucleotídeos_. Algumas das moléculas de ácido nucléico da invenção são derivadas do DNA *5 ou do RNA isolado pelo menos uma vez na forma substancialmente pura e em uma quantidade ou concentração que permita a identificação, a manipulação e a recuperação de sua seqüencia de nucleotídeos componente mediante métodos bioquímicos padrão. Exemplos de tais métodos, incluindo os métodos para os protocolos da PCR, que podem ser aqui usados, são 10 apresentados em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,

2- ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989), Current Protocols in Molecular Biology editado por F. A. Ausubel et al. John and Sons, Inc. (1987), e Innis, M. et al., eds., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990).

Como descrito neste relatório, as moléculas de ácido nucléico da invenção incluem DNA tanto na forma de filamento único quanto de filamento duplo, bem como o seu complemento de RNA. DNA inclui, por exemplo, cDNA, DNA genômico, DNA quimicamente sintetizado, DNA amplificado por PCR, e combinações destes. O DNA genômico, incluindo o traduzido, não traduzido e as regiões de controle, pode ser isolado por técnicas convencionais, por exemplo com o uso de qüalquer um dentre os cDNAs da invenção, ou seu fragmentos adequados, como uma sonda, para identificar uma peça do DNA genômico, a qual pode então ser clonada com o uso de métodos comumente conhecidos na técnica. Em geral, as moléculas de ácido nucléico dentro do escopo da invenção incluem seqüências que hibridizam as seqüências da invenção sob as condições de hibridização e lavagem descritas acima, e de 5^o, 10°, 15°, 20°, 25° ou 30° abaixo da temperatura de fusão do DNA duplex das seqüências da invenção, incluindo qualquer faixa de condições agrupadas dentro destas faixas.

Em outra forma de realização, os ácidos nucleicos da invenção compreendem uma seqüência substancialmente como apresentada nas SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5. Em uma forma de realização, os ácidos nucleicos são pelo menos 70 %, pelo ‘ 5 menos 85 %, pelo menos 90 % ou pelo menos 95 % idênticos às SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5 de nucleotídeos. Em uma forma de realização, o ácido nucléico compreende as seqüências SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO; 3, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5 de nucleotídeos. Em uma outra forma de realização, o ácido nucléico codifica uma proteína que tenha atividade de sesquiterpeno sintase, como demonstrado, por exemplo, no ensaio de enzimas descrito nos exemplos. Os ácidos nucleicos compreendendo regiões conservadas entre as diferentes espécies, são também fornecidos.

Em ainda outra forma de realização, o ácido nucléico compreende uma extensão contígua de pelo menos 50, 100, 250, 500 ou 750 nucleotídeos contíguos das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5. Tais fragmentos contíguos destes nucleotídeos também podem conter pelo menos uma mutação, contanto que a seqüência mutante conserve a funcionalidade da seqüência original e a 20 capacidade de hibridizar com estes nucleotídeos sob condições de baixa ou alta estringência, tais como, por exemplo, as condições de moderada ou alta estringência. Um tal fragmento pode originar-se, por exemplo, do nucleotídeo (nt) 200 a nt 1600, de nt 800 a nt 1600, de nt 1000 a nt 1600, de nt 200 a nt 1000, de nt 200 a nt 800, de nt 400 a nt 1600, ou de nt 400 a nt 1000 das SEQ

ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5.

Como descrito acima, os polipeptídeos codificados pelos ácidos nucleicos da invenção são abrangidos pela invenção. Os ácidos nucleicos isolados da invenção podem ser selecionados de um ácido nucléico codificando o polipeptídeo substancialmente apresentado nas SEQ ID NO: 6,

SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10. Em uma forma de realização, os polipeptídeos são pelo menos 70 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 % ou pelo menos 95 % idênticos às SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10.

- 5 Em uma forma de realização, um polipeptídeo da invenção compreende uma seqüência de aminoácidos como apresentado nas SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10. Em outra forma de realização, o polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácidos substancialmente como apresentado nas SEQ ID NO: 6, SEQ ID

NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10. Em ainda outra forma de realização, o polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácidos que^seja pelo menos 80 %, pelo menos 85 % idêntica, pelo menos 90 % ou pelo menos 95 % idêntica à das SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10. Em uma forma de realização, o polipeptídeo tem atividade de sesquiterpeno sintase, como demonstrado, por exemplo, no ensaio de enzimas descrito abaixo.

Preferivelmente, o polipeptídeo é o polipeptídeo como substancialmente apresentado na SEQ ID NO: 6 e/ou na SEQ ID NO: 10. Mais preferivelmente, o polipeptídeo compreende uma seqüência de 20 aminoácidos que seja pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 97 %, ou que corresponda totalmente à seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 6 e/ou 10.

Por causa da degeneração do código genético em que mais do que um códon pode codificar o mesmo aminoácido, múltiplas seqüências de 25 DNA pode codificar o mesmo polipeptídeo. Tais seqüências variantes de DNA podem resultar da deriva genética ou de manipulação artificial (por exemplo, ocorrendo durante a amplificação da PCR ou como o produto da mutagênese deliberada de uma seqüência nativa). A presente invenção, assim, abrange qualquer ácido nucleico capaz de codificar uma proteína derivada das

SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5 ou de suas variantes.

A mutagênese deliberada de uma seqüência nativa pode ser realizada com o uso de numerosas técnicas bem conhecidas na prática. Por - 5 exemplo, os procedimentos de mutagênese específica do sítio direcionada ao oligonucleotídeo podem ser empregados, particularmente quando seja desejável transformar um gene de tal modo que os nucleotídeos ou códons de restrição predeterminados sejam alterados por substituição, deleção ou inserção. Métodos exemplares de produzir tais alterações são apresentados 10 por Walder et al. (Gene 42: 133, 1986); Bauer et al. (Gene 37: 73, 1985), Craik (BioTechniques, 12 a 19 de janeiro, 1985); Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981), Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488, 1985); Kunkel et al. (Methods in Enzymol. 154: 367, 1987); e Patente U.S. n-4.518.584 e 4.737.462.

Em uma forma de realização, a invenção considera polipeptídeos isolados. Como aqui usado, o termo “polipeptídeos” refere-se a um gênero de polipeptídeo ou de fragmentos de peptídeos que inclui as seqüências de aminoácidos aqui identificadas, bem como os fragmentos menores. Altemativamente, um polipeptídeo pode ser definido em termos de seu relacionamento antigênico a qualquer peptídeo codificado pelas seqüências de ácido nucléico da invenção. Assim, em uma forma de realização, um polipeptídeo dentro do escopo da invenção é definido como < uma seqüência de aminoácidos compreendendo um epítopo linear ou tridimensional compartilhado com qualquer peptídeo codificado pelas seqüências de ácido nucléico da invenção. Altemativamente, um polipeptídeo dentro do escopo da invenção é reconhecido por um anticorpo que especificamente reconheça qualquer peptídeo codificado pelas seqüências de ácido nucléico da invenção. Os anticorpos são definidos como sendo especificamente ligação, se eles ligarem os polipeptídeos da invenção com K_a

TV maior ou igual a cerca de 10⁷ M’¹, tal como maior ou igual a 10⁸ M'¹.

Uma “variante” de polipeptídeo como aqui referida significa um polipeptídeo substancialmente homólogo a um polipeptídeo nativo, porem que tenha uma seqüência de ammoácidos diferente daquela codificada por * 5 qualquer uma das seqüências de ácido nucléico da invenção, por causa de uma ou mais deleções, inserções ou substituições.

Variantes podem compreender seqüências conservativamente substituídas, significando que um dado resíduo de ammoácido é substituído por um resíduo que tenha características físico-quimicas semelhantes.

Exemplos de substituições conservativas incluem a substituição de um resíduo alifático por outro, tal como Ile, Vai, Leu ou Ala ém substituição a outros, ou substituições de um resíduo polar por outro, tal como entre Lys e Arg; Glu e Asp ou Gin e Asn. Ver Zubay, Biochemistry, Addison-Wesley Pub. Co. (1983). Os efeitos de tais substituições podem ser calculados com ο uso das matrizes de classificação de substituições tais como PAM-120, PAM200 e PAM-250. como examinado em Altschul, (J. Mol. Biol. 219: 555-565, 1991). Outras de tais substituições conservativas, por exemplo substituições de regiões inteiras tendo características de hidrofobicidade semelhantes, são bem conhecidas.

Variantes de peptídeos de ocorrência natural são também abrangidas pela invenção. Exemplos de tais variantes são as proteínas que resultem de eventos alternados de recombinação de mRNA ou de divagem proteolítica dos polipeptídeos aqui descritos. As variações atribuíveis à proteólise incluem, por exemplo, as diferenças nos términos N ou C após a expressão nos diferentes tipos de células hospedeiras, por causa da remoção proteolítica de um ou mais aminoácidos terminais dos polipeptídeos codificados pelas seqüências da invenção.

As variantes das sesquiterpeno sintases da invenção podem ser usadas para se obter a atividade enzimática desejada intensificada ou reduzida, a regioquímica ou estereoquímica modificada, ou a utilização alterada do substrato ou a distribuição do produto. Além disso, as variantes podem ser preparadas para que tenham pelo menos uma propriedade modificada, por exemplo uma afinidade aumentada para com o substrato, uma * 5 especificidade melhorada quanto à produção de um ou mais compostos desejados, uma distribuição diferente do produto, uma atividade enzimática diferente, um aumento da velocidade da reação enzimática, uma atividade ou estabilidade superior em um ambiente específico (pH, temperatura, solvente etc.), ou um nível de expressão melhorado em um sistema de expressão 10 desejado. Uma variante ou mutante dirigido ao sítio podem ser produzidos por qualquer método conhecido na técnica. Como estabelecido acima, a invenção fornece polipeptídeos isolados e purificados, recombinantes e não recombinantes, tais como os das plantas de patchuli. As variantes e derivados dos polipeptídeos nativos podem ser obtidos pelo isolamento de variantes de 15 ocorrência natural, ou das seqüências de nucleotídeos de variantes, de outras ou das mesmas linhagens de plantas, ou por mutações artificialmente programadas de seqüências de nucleotídeos codificando para os polipeptídeos de patchuli nativo. As alterações da seqüência de aminoácido nativo podem ser realizadas por qualquer um dentre vários métodos convencionais.

Conseqüentemente, a presente invenção fornece um método para preparar uma sesquiterpeno sintase funcional variante, o método compreendendo as etapas de (a) selecionar qualquer dos ácidos nucléicos do grupo consistindo das SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4 ou 5, (b) alterar a seqüência de ácidos nucléicos para obter uma população de ácidos nucléicos mutantes, e (c) transformar as células hospedeiras com o ácido nucléico mutante para expressar polipeptídeos, e (d) triar os polipeptídeos quanto a um polipeptídeo funcional tendo pelo menos uma propriedade modificada. A propriedade modificada pode ser qualquer propriedade desejada, por exemplo as propriedades mencionadas acima. A alteração do ácido nucléico selecionado pode ser realizada por mutagênese aleatória, mutagênese específica do sítio ou embaralhamento do DNA, por exemplo. A alteração pode ser pelo menos uma mutação pontual, deleção ou inserção. Por exemplo, os polipeptídeos tendo uma seqüência de aminoácidos codificada por um ácido nucléico obtido das técnicas de embaralhamento, envolvendo pelo menos qualquer uma das SEQ ID NOS: 1 a 5, são também abrangidos pela presente invenção. As etapas do método de acordo com esta forma de realização da invenção, tais como a triagem dos polipeptídeos quanto a um polipeptídeo funcional, são conhecidas da pessoa habilitada, que rotineiramente adaptará produtos conhecidos à propriedade específica modificada que seja desejada.

Por exemplo, as mutações podem ser introduzidas em locais particulares por .oligonucleotídeos de sintetização contendo uma seqüência mutante, flanqueada por sítios de restrição que permitam a ligação a fragmentos da seqüência nativa. Em seguida à ligação, a seqüência resultante reconstruída codifica um análogo tendo a inserção, substituição ou deleção de aminoácido desejadas. Altemativamente, os procedimentos de mutagênese específica do sítio dirigida ao oligonucleotídeo podem ser empregados para fornecer um gene alterado em que os códons predeterminados possam ser alterados por substituição, deleção ou inserção. A presente invenção também abrange ácidos nucléicos obtidos da alteração de um ácido nucléico da presente invenção, por exemplo de modo a obter um polipeptídeo variante.

Em uma forma de realização, a invenção abrange: vetores compreendendo os ácidos nucléicos da invenção. Por exemplo, um vetor que compreenda pelo menos um ácido nucléico escolhido de (a) um ácido nucléico compreendendo a seqüência de nucleotídeos substancialmente como apresentado nas SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5; (b) um ácido nucléico codificando o polipeptídeo substancialmente apresentado nas SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10; e (c) um ácido nucléico que hidridiza ao ácido nucleico de (a) ou de (b) sob condições de baixa estringência, em que o polipeptídeo codificado pelo referido ácido nucleico tem atividade de sesquiterpeno sintase.

Um vetor, como aqui usado, inclui qualquer vetor - 5 recombinante incluindo, porém não limitando, vetores virais, bacteriófagos e plasmídeos.

Os vetores de expressão recombinantes que contêm uma seqüência de ácido nucleico da invenção podem ser preparados com o uso de métodos bem conhecidos. Em uma forma de realização, os vetores de 10 expressão incluem uma seqüência de cDNA codificando o polipeptídeo operavelmente ligado a seqüências de nucleotídéos reguladoras transcricionais ou translacionais adequadas, tais como aquelas derivadas de um gene de mamífero, microbianos, virais, de plantas ou de insetos. Exemplos de seqüências reguladoras incluem os promotores, operadores ou 15 intensificadores transcricionais, os sítios de ligação ribossômica de mRNA, e seqüências apropriadas que controlem a transcrição e o início e térmico da tradução. As seqüências de nucleotídeos são “operavelmente ligadas” quando a seqüência reguladora fimcionalmente diga respeito à seqüência de cDNA da invenção. A capacidade de replicar-se nas células hospedeiras desejadas, 20 usualmente conferida por uma origem de replicação, e um gene de seleção pelo qual os transformantes são identificados, podem adicionalmente ser incorporados no vetor de expressão.

Além disso, as seqüência que codificam os peptídeos de sinal apropriado, que não sejam naturalmente associados com os polipeptídeos da 25 invenção, podem ser incorporados nos vetores de expressão. Por exemplo, uma seqüência de DNA para um peptídeo de sinal (condutora secretória) pode ser fundida in-ffame a uma seqüência de nucleotídeos da invenção, de modo que os polipeptídeos da invenção sejam inicialmente traduzidos como uma proteína de fusão compreendendo o peptídeo de sinal. Um peptídeo de sinal que seja funcional nas células hospedeiras pretendidas intensiva a secreção extracelular do polipeptídeo expresso. O polipeptídeo de sinal pode ser clivado do polipeptídeo quando da secreção da células. Altemativamente, o polipeptídeo de sinal pode ser adequado para dirigir o polipeptídeo a uma * 5 localização intracelular, por exemplo para um compartimento celular específico ou organela.

As fusões das seqüências de peptídeos adicionais nas extremidades de terminal amino e carboxila dos polipeptídeos da invenção podem ser usadas para intensificar a expressão dos polipeptídeos, auxiliar na 10 purificação da proteína ou melhorar a atividade enzimática do polipeptídeo em um ambiente ou sistema de expressão desejados, por exemplo.

Em uma forma de realização, a invenção inclui uma célula hospedeira que compreende um ácido nucleico da invenção. Outra forma de realização da invenção é um método para produzir uma célula hospedeira 15 recombinante compreendendo introduzir os vetores da invenção, em uma célula hospedeira. Em uma outra forma de realização, um método para produzir um polipeptídeo compreendendo cultivar as células hospedeiras da invenção sob condições para produzir o polipeptídeo, é considerada. Em uma forma de realização, o polipeptídeo é recuperado. Os métodos da invenção 20 incluem métodos de produzir pelo menos uma sesquiterpeno sintase da invenção, compreendendo cultivar uma célula hospedeira que contenha um ácido nucleico da invenção, e recuperar a sesquiterpeno sintase acumulada.

Células hospedeiras adequadas para expressão de polipeptídeos da invenção incluem células procariotas, de levedura ou 25 eucarióticas superiores. Por exemplo, a célula hospedeira adequada é uma célula de planta. Vetores de clonagem e de expressão apropriados para uso com hospedeiros celulares bacterianos, fungicos, de levedura e de mamíferos são descritos, por exemplo, em Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985). Os sistemas de tradução livres de células pode também ser empregados para produzir os polipeptídeos apresentados usando RNAs derivados de construções de DNA apresentadas neste relatório.

Os procariotas incluem organismos Gram negativos ou Gram ' 5 positivos, por exemplo E. coli ou Bacilli. Células hospedeiras procarióticas adequadas para transformação incluem, por exemplo, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, e várias outras espécies dento dos gêneros Pseudomonas, Streptomyces e Staphylococcus. Em uma célula hospedeira procariótica, tal como E. coli, os polipeptídeos podem incluir um resíduo de 10 metionina N-terminal para facilitar a expressão do polipeptídeo recombinante na célula hospedeira procariótica. A metionina N-terminal pode ser clivada do polipeptídeo recombinante expresso.

Exemplos de vetores de expressão úteis para as células hospedeiras procarióticas incluem aqueles derivados de plasmídeos 15 comercialmente disponíveis tais como os plasmídeos pET do vetor de clonagem (Novagen, Madison, WI, USA) ou ainda pBR322 (ATCC 37017). O pBR322 contém genes para resistência à ampicilina e à tetraciclina e, assim fornece meios simples para identificar células transformadas. Para construir um vetor de expressão com o uso do pBR322, um promotor apropriado e uma 20 seqüência de DNA codificando um ou mais dos polipeptídeos da invenção, são introduzidos no vetor pBR322. Outros vetores comercialmente disponíveis incluem, por exemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suécia) e pGEM-1 (Promega Biotec, Madison, USA). Outros vetores comercialmente disponíveis incluem aqueles que são especificamente 25 projetados para a expressão de proteínas; estes devem incluir os vetores pMAL-p2 e pMAL-c2, os quais são usados para a expressão de proteínas fundidas à proteína de ligação da maltose (New England Biolabs, Beverly, MA, USA).

Seqüências promotoras comumente usadas para vetores de expressão de células hospedeiras procarióticas recombinantes incluem o promotor bacteriófago T7 (Studier, F. W. e Moffatt, B. A., J. Mol. Biol. 189: 113, 1986), β-lactamase (penicilinase), sistema promotor da lactose (Chang et al. Nature 275: 615, 1978; e Goeddel et al., Nature 281: 544,1979), sistema * 5 promotor do triptofano (trp) (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8: 4057, 1980; e EP-A-36776), e um promotor tac (Maniatis, MoLecular Cloning: A

Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 412, 1982). Um sistema de expressão de células hospedeiras procarióticas particularmente úteis emprega um promotor PL de fago λ e uma seqüência repressora termolábil cI857ts. Os vetores plasmídeos disponíveis da American Type Culture Collection (“ATCC”), que incorporam derivados do promotor PL, incluem o plasnúdeo pHUB2 (presente na cepa de E. coli JMB9 (ATCC 37092)) e o pPLc28 (presente em E. coli RR1 (ATCC 53082)).

Os polipeptídeos da invenção também podem ser expressos em células hospedeiras de levedura, preferivelmente do gênero Saccharomyces (por exemplo, S. cerevisiae). Outros gêneros de levedura, tais como Pichia ou Kluyveromyces (por exemplo, o K. lactis), também podem ser empregados. Os vetores de levedura freqüentemente conterão uma seqüência de origem de replicação de um plasmídeo de levedura 2μ, uma seqüência de replicação autônoma (ARS), uma região promotora, seqüências para poliadenilação, seqüências para terminação da transcrição, e um gene marcador selecionável. Seqüências promotoras adequadas para vetores de levedura incluem, entre outras, promotores para metalotionina, 3-fosfoglicerato cinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 2073, 1980), ou outras enzimas glicolíticas (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 1968; e Holland et al., Biochem. 17: 4900, 1978), tais como a enolase, a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, a hexocinase, a piruvato descarboxilase, a fosfofructocinase, a glicose-6-fosfato isomerase, a 3-fosfoglicerato mutase, a piruvato cinase, a triosefosfato isomerase, a fosfoglicose isomerase e a glicocinase. Outros vetores e promotores adequados para uso na expressão da levedura são ainda descritos em Hitzeman, EPA-73.657 ou em Fleer et al., Gene, 107: 285-195 (1991); e van den Berg et al., Bio/Technology, 8: 135-139 (1990). Outra alternativa é o promotor ADH2 repressível em glicose descrito por Russell et al. (J. Biol.

* 5 Chem. 258: 2674, 1982) e Beier et al. (Nature 300: 724, 1982). Os vetores de transporte replicáveis tanto em levedura quanto em E. coli podem ser construídos pela inserção das seqüências de DNA de pBR322 para seleção e replicação em E. coli (gene Ampr e origem de replicação) nos vetores de levedura acima descritos. Uma forma de realização da invenção é um 10 organismo não humano modificado para abrigar um ácido nucléico da invenção. O organismo não humano e/ou a célula hospedeira podem ser modificados por. quaisquer métodos conhecidos na técnica para transferir genes, incluindo, por exemplo, o uso de dispositivos de liberação, tais como lipídeos e vetores virais, DNA desnudos, eletroporação, métodos químicos e 15 transferência de genes mediados por partículas. Em uma forma de realização, o organismo não humano é uma planta, um inseto ou um microorganismo.

Por exemplo, em uma forma de realização, a invenção fornece um método para produzir pelo menos uma sesquiterpeno sintase compreendendo cultivar um hospedeiro modificado para conter pelo menos 20 um ácido nucléico sob condições conducentes à produção da referida pelo menos uma sesquiterpeno sintase em que referido pelo menos um ácido nucléico é escolhido de (a) um ácido nucléico compreendendo a seqüência de nucleotídeos substancialmente como apresentado nas SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5; (b) um ácido 25 nucléico codificando o polipeptídeo substancialmente apresentado nas SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5; e (c) um ácido nucléico que hidridiza ao ácido nucléico de (a) ou de (b) sob condições de baixa estringência, em que o polipeptídeo codificado pelo referido ácido nucléico tem atividade de sesquiterpeno sintase.

Em uma outra forma de realização, o hospedeiro é uma planta tal como tabaco ou patchuli, animal ou microorganismo, também incluindo, porém sem limitar, células bacterianas, células de levedura, células de plantas e células de animais. Como aqui usado, células de plantas e células de animais incluem o uso de plantas e animais como um hospedeiro. Por exemplo, em algumas formas de realização da invenção, a expressão se dá em um organismo não humano geneticamente modificado.

Por exemplo, os sistemas de cultura de células hospedeiras de mamíferos ou de insetos são empregados para expressar os polipeptídeos recombinantes da invenção. Tais sistemas de cultura de células hospedeiras, bem como os métodos para introduzir DNA em células de mamíferos ou de insetos, são conhecidos da pessoa habilitada.

De forma semelhante, as seqüências de controle transcricional ou translacional para os vetores de expressão de células hospedeiras de mamíferos têm sido relatadas extensivamente. Elas podem ser excisadas de genomas virais, por exemplo.

Existem vários métodos conhecidos na técnica para a criação de plantas transgênicas. Estes incluem, sem limitar: eletroporação de protoplastos de plantas, transformação mediada pelo lipossoma, transformação mediada pela agrobactéria, transformação mediada pelo polietileno glicol, microinjeção de células de plantas, e transformação com o uso de vírus. Em uma forma de realização, a transferência direta de genes mediante o bombardeamento de partículas é utilizada. Em outra forma de realização, a transformação mediada pela agrobactéria é utilizada.

A transferência direta de genes mediante o bombardeamento de partículas fornece um exemplo para transformar o tecido das plantas. Nesta técnica uma partícula, ou microprojétil, revestido com DNA, é um tiro através das barreiras físicas da célula. O bombardeamento das partículas pode ser usado para introduzir DNA em qualquer tecido alvo que seja penetrável pelas st partículas revestidas de DNA, mas para a transformação estável, é imperativo que as células regeneráveis sejam usadas. Tipicamente as partículas são feitas de outro ou tungstênio. As partículas são revestidas com DNA com o uso ou de CaCl₂ ou de métodos de precipitação do etanol que são comumente 5 conhecidos na técnica.

As partículas revestidas de DNA são disparadas de uma pistola de partículas. Uma pistola de partículas adequada pode ser comprada da BioRad Laboratories (Hercules, CA). A penetração das partículas é controlada por parâmetros variáveis tais como a intensidade da ruptura explosiva, do 10 tamanho das partículas, ou da distância em que as partículas devem percorrer para alcançar o tecido alvo.

O. DNA usado para revestir as partículas podem compreender um cassete de expressão adequado para acionar a expressão do gene de interesse que virá a compreender um promotor operavelmente ligado ao gene 15 de interesse.

Os métodos para realizar a transferência direta dos genes mediante bombardeamento de partículas são apresentados na Patente U.S. 5.990.387 para Tomes et al.

Em uma forma de realização, os cDNAs da invenção podem 20 ser expressos de uma tal maneira de modo a produzir TNA ou de sentido ou anti-sentido. O RNA anti-sentido é o RNA que tem uma seqüência que é o complemento inverso do mRNA (RNA de sentido) codificado por um gene. Um vetor que venha a conduzir a expressão do RNA anti-sentido é aquele em que o cDNA é colocado na “orientação inversa” em relação ao promotor, de 25 tal modo que o filamento não codificador (ao invés do filamento codificador) é transcrito. A expressão do RNA anti-sentido pode ser usada para inframodular a expressão da proteína codificada pelo mRNA ao qual o RNA antisentido é complementar. Os RNA’s anti-sentido produtores de vetores podem ser usados para produzir plantas transgênicas, como descrito acima.

Em uma forma de realização, o DNA transfectado é integrado em um cromossoma de um organismo não humano, de tal modo que resulta um sistema recombinante estável. Qualquer método de integração cromossômica conhecido na técnica pode ser usado na prática da invenção, * 5 incluindo, sem limitar, a troca de cassete mediada pela recombinase (RMCE), a inserção cromossômica viral específica do sítio, o adenovirus e a injeção pronuclear.

Uma outra forma de realização da invenção inclui métodos de produzir terpenóides e compostos de sesquiterpeno com o uso dos 10 nucleotídeos e polipeptídeos da invenção. Exemplos incluem os métodos de produzir pelo menos um terpenóide compreendendo o contato de pelo menos um precursor de piro fosfato terpeno acíclico com pelo menos um polipeptídeo codificado pelo ácido nucléico de acordo com a invenção. De preferência, o ácido nucléico é escolhido de (a) um ácido nucléico compreendendo a 15 seqüência de nucleotídeos substancialmente como apresentado nas SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5; (b) um ácido nucléico codificando o polipeptídeo substancialmente apresentado nas SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10; e (c) um ácido nucléico que hidridiza ao ácido nucléico de (a) ou 20 (b) sob condições de baixa estringência, em que o polipeptídeo codificado pelo referido ácido nucléico tem atividade de sesquiterpeno sintase, e isolar pelo menos um terpenóide produzido. Outro exemplo é um método para produzir pelo menos um terpenóide compreendendo o contato de pelo menos um precursor de pirofosfato terpeno acíclico com pelo menos um polipeptídeo 25 substancialmente apresentado nas um ácido nucléico compreendendo a seqüência de nucleotídeos substancialmente como apresentado nas SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10 e isolar pelo menos um terpenóide produzido.

Como aqui usado, um precursor de pirofosfato terpeno acíclico é qualquer composto de pirofosfato acíclico que seja um precursor para a produção de pelo menos um terpeno, incluindo, mas não limitando, o geranilpirofosfato (GPP), o famesil-pirofosfato (FPP) e o geranilgeranil-pirofosfato (GGPP).

• 5 Em uma forma de realização, o pelo menos um terpenóide é escolhido de sesquiterpenes. Em uma forma de realização, o pelo menos um precursor de pirofosfato terpeno acíclico é o famesil-pirofosfato. Em uma outra forma de realização, o pelo menos um sesquiterpeno é escolhido de patchulol, γ-curcumeno e outros sesquiterpenes do tipo germacrano mostrados 10 nas presentes Figuras 1 a 12. Os terpenóides da invenção podem ser isolados por qualquer método usado na técnica, incluindo, mas sem limitar, a cromatografia, a extração e a destilação.

Em uma forma de realização, a distribuição dos produtos ou os reais produtos formados podem ser alterados pela variação do pH em que a 15 sintase entra em contato com o precursor do pirofosfato terpeno acíclico, tal como, por exemplo, o famesil-pirofosfato. Em uma forma de realização, o pH é 7. Em uma outra forma de realização, o pH é menor do que 7, tal como, por exemplo, 6, 5, 4 e 3.

Igualmente dentro da prática da invenção encontra-se um 20 organismo (por exemplo, microorganismo ou planta) que é usado para construir uma plataforma para a produção de alto nívél de um substrato de sesquiterpeno sintases (por exemplo, FPP) e a introdução de um ácido nucléico da invenção no organismo. Por exemplo, pelo menos um ácido nucléico da invenção que codifica um seu sal, solvato ou derivado 25 fisiologicamente funcional, farmaceuticamente aceitáveis é incorporado em um organismo não humano que produza FPP, dessa forma efetuando a conversão do FPP em um sesquiterpeno, e a subseqüente produção metabólica do sesquiterpeno. Em uma forma de realização, isto resulta em uma plataforma para a produção em alto nível de sesquiterpenos.

Em uma forma de realização, os ácidos nucleicos da invenção são usados para criar outros ácidos nucleicos codificando para as sesquiterpeno sintases. Por exemplo, a invenção considera um método de identificar sesquiterpeno sintases, compreendendo construir uma biblioteca de * 5 DNA com o uso dos ácidos nucleicos da invenção, triar a biblioteca quanto aos ácidos nucleicos que codificam para pelo menos uma sesquiterpeno sintase. A biblioteca de DNA com o uso dos ácidos nucleicos da invenção pode ser construída por qualquer processo conhecido na técnica em que as seqüências de DNA são criadas com o uso dos ácidos nucleicos da invenção 10 como um ponto de partida, incluindo, mas sem limitar, o embaralhamento do DNA. Em um tal método, a biblioteca pode ser examinada quanto às sesquiterpeno sintases com o uso de um ensaio funcional para encontrar um ácido nucléico alvo que codifique uma sesquiterpeno sintase. A atividade de uma sesquiterpeno sintase pode ser analisada com o uso, por exemplo, dos 15 métodos descritos neste relatório. Em uma forma de realização, a triagem de alta produção é utilizada para analisar a atividade dos polipeptídeos codificados.

Como aqui usado, uma “sonda de nucleotídeos” é definida como um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo capaz de ligar-se a um ácido 20 nucléico alvo da seqüência complementar através de um ou mais tipos de ligações químicas, através do pareamento de bases complementar, ou através da formação de_:ligação de hidrogênio. Como descrito acima, a sonda de oligonucleotídeo pode incluir bases naturais (isto é, A, G, C ou T) ou modificadas (7-desazaguanosina, inosina etc.). Além disso, as bases em uma 25 sonda de nucleotídeos podem ser unidas por uma articulação outra que não uma ligação de fosfodiéster, contanto que ela não impeça a hibridização. Assim, as sondas de oligonucleotídeos podem ter bases constituintes ligadas por ligações peptídicas, ao invés de articulações de fosfodiéster.

Um “ácido nucléico alvo” aqui refere-se a um ácido nucléico ao qual a sonda ou molécula de nucleotídeo pode especificamente hibridizar. A sonda é projetada para determinar a presença ou a ausência do ácido nucléico alvo, e a quantidade de ácido nucléico alvo. O ácido nucléico alvo tem uma seqüência que é complementar à seqüência de ácido nucléico da sonda correspondente dirigida ao alvo. Como reconhecido por uma pessoa habilitada na técnica, a sonda também pode conter ácidos nucléicos adicionais ou outras porções, tais como rótulos, os quais podem não especificamente hibridizar ao alvo. O termo ácido nucléico alvo pode referir-se à seqüência de nucleotídeos específica de um ácido nucléico maior ao qual a sonda esteja dirigida ou à seqüência global (por exemplo, gene ou mRNA). Uma pessoa habilitada na técnica reconhecerá a completa utilidade sob várias condições.

Outros números que não no exemplo de operação, ou quando de outra forma indicado, todos os números que expressem quantidades de ingredientes, condições de reação, e assim por diante, usados no relatório descritivo e nas reivindicações, devem ser entendidos como sendo modificados em todos os casos pelo termo “cerca de”. Conseqüentemente, a menos que indicado em contrário, os parâmetros numéricos apresentados no relatório descritivo e nas reivindicações são aproximações que podem variar, dependendo das propriedades desejadas que estejam sendo procuradas a serem obtidas pela presente invenção. No mínimo, e não como uma tentativa para limitar a aplicação da doutrina de equivalentes ao escopo das reivindicações, cada parâmetro numérico deve ser interpretado à luz do número de dígitos significativos e das abordagens de arredondamentos comuns.

Não obstante as variações numéricas e os parâmetros que demonstram que o amplo escopo da invenção sejam aproximações, os valores numéricos apresentados nos exemplos específicos são relatados de forma tão precisa quanto possível. Qualquer valor numérico, entretanto, contém inerentemente certos erros necessariamente resultantes do desvio padrão encontrado em suas medições de testes respectivas. Os seguintes exemplos são fornecidos para ilustrar a invenção, sem limitar o escopo como resultado. Os percentuais são dados em uma base em peso.

A menos que de outra forma definidos, todos os termos * 5 técnicos e científicos usados neste relatório têm os mesmos significados comumente entendidos por uma pessoa de habilidade normal na técnica à qual esta invenção pertence. Não obstante quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles aqui descritos possam também ser usados na prática da presente invenção, os métodos e materiais exemplares 10 são descritos com fins ilustrativos. Todas as publicações mencionadas neste pedido são incorporadas como referência para apresentar e descrever os métodos e/ou materiais, em conexão com os quais as publicações são citadas.

Adicionalmente, as publicações aqui examinadas são providas unicamente quanto à sua apresentação antes da data de depósito do presente 15 pedido. Nada aqui deve ser interpretado como uma aceitação de que a presente invenção não esteja autorizada a antecipar tal publicação em virtude da invenção anterior. Além disso, as datas de publicação fornecidas podem ser diferentes das datas reais da aplicação, o que pode necessitar sejam independentemente confirmadas.

Deve-se observar que, como usado neste relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um(a)”, “e” e “o(a)” incluem quaisquer informações no plural, a menos que o contexto claramente indique de outra maneira. Assim, por exemplo, a referência a “um terpeno” inclui uma pluralidade de tais terpenos, e a referência a “um vetor” inclui referência a um 25 ou mais vetores e seus equivalentes conhecidos daqueles habilitados na técnica.

Métodos, técnicas e/ou protocolos (coletivamente “métodos”) que possam ser usados na prática da invenção não ficam limitados aos exemplos particulares destes procedimentos citados na totalidade do relatório, mas abrangem qualquer procedimento conhecido na técnica para a mesma finalidade. Por exemplo, com respeito aos métodos para a expressão de seqüências de DNA em células hospedeiras, a presente invenção não fica limitada aos protocolos nela citados, mas inclui qualquer método disponível na técnica ao técnico habilitado, para expressar seqüências de DNA em células hospedeiras.

Os seguintes exemplos intentam ilustrar a invenção sem limitar o escopo como resultado.

EXEMPLOS

Material

As plantas de Pogostemon cablin (patchüli) usadas nos presentes exemplos foram obtidas de um produtor local, Le Jardin des Senteurs (Neuchâtel, Suíça), e foram desenvolvidas e reproduzidas por mudas em uma estufa no Centre d’Horticulture de Lullier (Jussy, Suíça). Outras fontes disponíveis de plantas de patchüli podem ser usadas nos exemplos seguintes. A análise das folhas das plantas por GC-MS apresentaram um alto teor de patchulol nas folhas de todos os tamanhos. O RNA e o mRNA totais foram extraídos de uma mistura de folhas de diferentes tamanhos recémcolhidas das plantas de patchüli.

EXEMPLO 1

ISOLAMENTO DO RNA E DO mRNA

Folhas foram coletadas das plantas de patchüli, imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e moídas com o uso de um amofariz e pilão. O RNA total foi extraído com o uso do Reagente de RNA de Plantas Concert® da Invitrogen, seguindo as instruções do fabricante. Tipicamente, uma média de 200 pg de RNA total foi obtida de 1 g de tecido moído. A concentração do RNA foi estimada da OD em 260 nm. A integridade do RNA foi avaliada em um gel de agarose pela verificação da integridade das bandas de RNA ribossômico. O mRNA foi purificado do RNA total por cromatografia de afinidade oligodT-celulose com o uso do Kit de isolamento de mRNA FastTrack® (Invitrogen) seguindo as instruções do fabricante.

EXEMPLO 2

TRANSCRIÇÃO REVERSA (RT)-PCR * 5 A RT-PCR foi realizada com o uso do Kit Qiagen OneStep

RT-PCR e um ciclador térmico Eppendorf Mastercycler Gradient. As misturas de reação típicas contêm 10 μΐ de 5X tampão de Qiagen OneStep RT-PCR, 400 μΜ de cada dNTP, 400 nM de cada iniciador, 2 μΐ de Mistura de Enzimas Qiagen OneStep RT-PCR, 1 μΐ do inibidor da Ribonuclease

RNasin® (Promega Co.) e 1 pg de RNA total em um volume final de 50 μΐ. As condições do ciclador térmico foram: 30 minutos a 50°C (transcrição reversa); 15 minutos a 95°C (ativação da DNA polimerase); 40 ciclos de 45 segundos a 94°C, 10 segundos a 42°C e 45 segundos a 72°C; e finalmente 10 minutos a 72°C.

Os tamanhos dos produtos da PCR foram avaliados em um gel de agarose a 1 %. As bandas correspondentes ao tamanho esperado foram excisadas do gel, purificadas com o uso do Kit de Extração em Gel QIAquick® (Qiagen) e clonadas no vetor pCR®2.1-TOPO usando o Kit de clonagem TOPO TA (Invitrogen). Os fragmentos de DNA inseridos foram 20 então submetidos a seqüenciação de DNA e a seqüência foi comparada em relação ao banco de dados de proteínas não redundantes do GenBank (NCBI) com o uso do algoritmo BLASTX (Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W. e Lipman, D. J. (1990) Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215,403-410).

EXEMPLO 3

3’-E 5’-RACE

Para a Amplificação Rápida de 3 ’ e 5 ’ das Extremidades do cDNA (RACE), o cDNA de filamento duplo ligado ao adaptador foi preparado do mRNA do patchuli usando o Kit de Amplificação de cDNA

Marathon® (Clontech) seguindo o protocolo do fabricante. As extremidades 3’ ou 5’ dos cDNAs específicos foram amplificadas com a Advantage® 2 Polymerase Mix usando uma combinação oligonucleotídeos específicos do gene e do adaptador. As misturas típicas de reação de - 5 RACE contêm, em um volume final de 50 μΐ, 5 μΐ de 10X Tampão de

PCR Reaction Buffer (Clontech), 200 nM de cada dNTP, 1 μΐ de Advantage® 2 Polymerase Mix, 200 μΜ de iniciador específico do adaptador (Clontech), 200 μΜ de iniciador específico do gene e 5 μΐ de cDNA diluído 50 a 250 vezes. A amplificação foi realizada em um 10 ciclador térmico Eppendorf Mastercycler Gradient. As condições de ciclagem térmica foram como segue: 1 minuto a 94°C, 5 ciclos de 30 segundos a 94°C e 2 a 4 minutos a 72°C, 5 ciclos de 30 segundos a 94°C e 2 a 4 minutos a 70°C, 20 ciclos de 20 segundos a 94°C e 2 a 4 minutos a 68°C. Uma segunda rodada de amplificação usando um iniciador 15 específico do adaptador abrigado (Clontech) e um iniciador específico do gene abrigado foi rotineiramente realizada. Os produtos de amplificação foram avaliados, subclonados, e a seqüência foi analisada como descrito acima.

Os tamanhos dos produtos de PCR foram avaliados em um gel 20 de agarose a 1 %. As bandas correspondentes ao tamanho esperado foram excisadas do gel, purificadas com o uso do Kit de Extração em Gel QIAquick® (Qiagen) e clonadas no vetor pCR®2.1-TOPO usando o Kit de clonagem TOPO TA (Invitrogen). Os fragmentos de DNA inseridos foram então submetidos a seqüenciação de DNA. A seqüência foi primeiro 25 comparada em relação ao banco de dados de proteínas não redundantes do GenBank (NCBI) com o uso do algoritmo BLASTX (Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W. e Lipman, D. J. (1990) Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215, 403- 410) e depois comparada em relação à seqüência de DNA inicial para garantir que a sobreposição significativa da seqüência de DNA fora obtida.

EXEMPLO 4

CONSTRUÇÃO DOS PLASMÍDEOS DE EXPRESSÃO

Para a expressão funcional das sesquiterpeno sintases, o cDNA foi subclonado nos plasmídeos de expressão pETlla (Novagen), pETIOl (Invitrogen) ou pET102 (Invitrogen). Nestes plasmídeos, o cDNA é colocado a jusante do promotor T7 que controla a expressão da proteína recombinante nas células de E. coli. Após a transformação das células de E. coli, a expressão da proteína pode ser induzida por isopropil-beta-Dtiogalactopiranosídeo (IPTG).

As ligações dos insertos em pETlla necessitaram o uso das endonucleases de.restrição Ndel e BamHl. Os insertos foram amplificados por PCR usando como iniciadores oligonucleotídeos designados para introduzir os sítios de reconhecimento da enzima de restrição apropriados (Ndet e BamHf) imediatamente antes do códon de partida e após o códon de parada. Os cDNAs amplificados foram purificados, digeridos com as enzimas de restrição apropriadas e ligados no plasmídeo pETlla digerido com as mesmas enzimas. As construções foram verificadas por digestão e seqüenciação do DNA.

Para a ligação do PatTpsA no pETlla, o cDNA foi amplificado por PCR com o uso dos iniciadores PatTpsA Nde e ParTpsA Bam (Tabela 1) para introduzir o sítio de restrição Ndei imediatamente antes do códon de partida e um sítio de restrição TtamElI imediatamente após o códon de parada.

Os plasmídeos pETIOl e pET102 usados com o Kit de Expressão TOPO® Direcional de pET (Invitrogen) permite a clonagem direcional dos produtos de PCR sem a necessidade de introduzir sítios de restrição (úteis quando o cDNA contém, na região codificadora, os sítios de restrição requeridos para a subclonagem). Para a ligação dos cDNAs nestes dois plasmídeos, os insertos foram amplificados por PCR usando como iniciadores oligonucleotídeos projetados para amplificar os cDNAs incluindo os códons de partida e de parada. As ligações foram realizadas de acordo com o protocolo do fabricante. As construções foram verificadas por seqüenciação • 5 de DNA.

Para a ligação de PatTpsA no pET102, o cDNA foi amplificado com o uso dos iniciadores PatTpsA topo e PatTpsA Stop (Tabela 1). Para a ligação do PatTpsBF2 no pETIOl e pET102, o cDNA foi amplificado por PCR com o uso dos iniciadores PatTpsBF2.1 topo e 10 PatTpsBF2.1 stop (Tabela 1). Para a amplificação do PatTpsCF2 para ligação no pETIOl, os iniciadores PatTpsCF2 topo e PatTpsCF2 stop foram usados (Tabela 1). Para, amplificação do PaTpsB15 e PatTpsl77 para ligação no pETIOl, os pares de iniciadores PatTpsB15 topo-PatTpsB15 stop e PatTpsl77 topo-PatTpsl77 stop foram respectivamente usados.

Todas as amplificações do cDNA para expressão foram realizadas com o uso da Pfu DNA polimerase (Promega), em um volume final de 50 μΐ contendo 5 μΐ de tampão de 10X Pfu DNA polimerase, 200 μΜ cada de dNTP, 0,4 μΜ cada de iniciador dianteiro e reverso, 2,9 unidades de Pfu DNA polimerase e 5 μΐ de cDNA 100 vezes diluído (preparado como aqui descrito com o uso do Marathon® cDNA Amplification Kit (Clontech)). As condições de ciclagem térmica foram como segue: 2 minutos a 95°C; 25 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 52°C e 4 minutos a 72°C; e 10 minutos a 72°C. Os produtos da PCR foram purificados em um gel de agarose e eluídos com o uso do Kit de Extração em Gel QIAquick® (Qiagen).

EXEMPLO 5

EXPRESSÃO DAS SESQUITERPENO SINTASES

Em uma experiência padrão de expressão de proteínas, os plasmídeos de expressão contendo os cDNAs da sesquiterpeno sintase, bem como o plasmídeo vazio (para controle negativo), foram transformados nas células de E. coli BL21(DE3) ou na BL21 Star® (DE3) (Novagen). Colônias isoladas de E. coli transformado foram usadas para inocular 5 ml de meio de LB. Após 5 a 6 horas de incubação a 37°C, as culturas foram transferidas para uma incubadora a 20°C e deixadas por 1 hora para equilíbrio. A expressão da 5 proteína foi então induzida pela adição de IPTG 0,5 mM e a cultura foi incubada durante a noite a 20°C. No dia seguinte, as células foram coletadas por centrifugação, recolocadas em suspensão em 0,5 ml de Tampão de Extração (MOPSO 50 mM pH DTT 7,5 mM, 10 % de glicerol) e sonicadas por 3 vezes de 30 segundos. Os detritos celulares foram sedimentados por 10 centrifugação por 30 minutos a 18.000 g e o sobrenadante contendo as proteínas solúveis foi recuperado. A expressão das sesquiterpeno sintases foi avaliada por separação do extrato protéico sobre SDS-PAGE, colorindo-se com azul de coomassie e comparação do extrato protéico obtido das células transformadas com o plasmídeo vazio.

EXEMPLO 6

ENSAIO ENZIMÁTICOS

Os ensaios enzimáticos foram realizados em tubos de vidro selados de Teflon, com o uso de 50 a 100 μΐ de extrato protéico em um volume final de 1 ml de Tampão de Extração suplementado com MgCl₂ 15 20 mM e 100 a 250 μΜ de FPP (Sigma). O meio foi coberto com 1 ml de pentano e os tubos foram incubados durante a noite a 30°C. A fase do pentano, contendo os sesquiterpenes, foi recuperada e o meio extraído com um segundo volume de pentano. As frações de pentano combinadas foram concentradas sob nitrogênio e analisadas por Cromatografia Gasosa em um 25 sistema Hewlett-Packard 6890 Série GC com o uso de uma coluna capilar SPB-1 (Supelco) de 0,25 mm de diâmetro interno por 30 m. O gás portador foi He em fluxo constante de 1,6 ml/minuto. A injeção foi feita no modo não dividido com o injetor estabelecido em 200°C e o forno programado a partir de 100°C (considerado o minuto 0) em 7,5°C/minuto (considerado o minuto

0) seguido por 20°C/minuto a 280°C (considerado o minuto 2). A detecção foi feita com um detector de ionização de chama. A identificação do composto baseou-se na identidade do tempo de retenção com padrões autênticos quando disponíveis. Para a confirmação das identidades dos produtos, as amostras • 5 foram analisadas por GC-MS capilar combinado com o uso de um sistema detector seletivo de massa quadripolar Hewlett-Packard 6890 GC, equipado com uma coluna capilar SPB-1 de 0,25 mm de diâmetro interno por 30 m (Supelco). O forno foi programado a partir de 80°C (considerado o minuto 0) a 280°C em 7°C em um fluxo constante de 1,5 ml/minuto de He. Os espectros 10 foram registrados em 70eV com uma voltagem multiplicadora de elétrons de 2200 V. O tempo de retenção dos produtos enzimáticos foi comparado com o tempo de retenção do padrão autêntico, ou o índice de retenção Kovats foi calculado e comparado com os dados publicados (Joulain, D. e Kõnig, W. A. The Atlas of Spectral Data of Sesquiterpene Hydrocarbons, EB Verlag, 15 Hamburg, 1998).

EXEMPLO 7

ISOLAMENTO DO cDNA DA SESQUITERPENO

SINTASE COM O USO DE RT-PCR

As seqüências de aminoácidos deduzida de sesquiterpeno 20 sintases de plantas foram alinhadas para identificar regiões conservadas e delinear oligonucleotídeos específicos das sesquiterpeno sintases de plantas. De modo a obter melhor homologia de seqüência, as seqüências foram separadas em dois grupos (Figura 2). O primeiro grupo continha as seqüências da Germacreno C sintase de Lycopersicon esculentum cv. FVNT cereja 25 (Colby, S. M. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95 (5), 2216-2221), a (2i)-3-farmeseno sintase da Mentha x piperita (Crock, J. et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94 (24), 12833-12838), a ^-selineno sintase da Abies grandis (Steele, C. L. et al. (1998) J. Biol. Chem. 273 (4), 2078-2089), a sesquiterpeno sintase do Citrus junos (n° de acesso ao GenBank AF288465),

as 5-epz-aristolocheno sintases do Nicotiana tabacum (Facchini, P. J. e Chappell, J. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 11088-11092) e da

Capsicum annuum (Back, K. et al. (1998) Plant Cell Physiol. 39 (9), 899904), as vetispiradieno sintases da Solanum tuberosum e da Hyoscyamus • 5 muticus (Back, K. e Chappell, J. (1995) J. Biol. Chem. 270 (13), 7375-7381).

I segundo grupo continha seqüências das (+)-δ- cadineno sintases da Gossypium arboreum (Chen, X. Y. et al. (1995) Arch. Biochem. Biophys. 324 (2), 255-266), a amorfa-4,11-dieno sintase (Mercke, P. et al. (2000) Arch. Biochem. Biophys. 381 (2), 173-180) e a epz-cedrol sintase (Mercke, P. et al.

(1999) Arch. Biochem. Biophys. 369 (2), 213-222) da Artemisia annua e a γhumulene sintase da Abies grandis (Steele, C. L., et al. (1998) J. Biol. Chem.

273 (4), 2078-2089). A homologia de seqüência mais elevada foi observada na parte central das seqüências. Três regiões contendo aminoácidos suficientemente conservados foram selecionados e oligonucleotídeos 15 degenerados específicos para estas regiões foram designados (isto é, quatro iniciadores dianteiros (TpsVFl, TpsVF2, TpsCFl, TpsCF2) e dois reversos (TpsVR3, TpsCR3) foram deduzidos) (Figura 2).

O RNA total das folhas do patchuli foi usado para realizar a

RT-PCR (transcrição reversa-reação em cadeia da polimerase) usando várias 20 combinações destes oligonucleotídeos. A amplificação com o uso da combinação de iniciadores TpsCF 1 e TpsCR3 deu um amplicon (denominado Pat5) com o tamanho esperado (180 pb). Este fragmento foi purificado e reamplificado com os mesmos iniciadores. O amplicon (Pat5-10) de 180 pb foi purificado, subclonado no plasmídeo pCR®2.1-TOPO (Invitrogen), e cinco 25 clones foram seqüenciados. Entre eles, um clone, Pat5-10-4, tinha similaridades de seqüência de sesquiterpeno sintases e foi denominado ParTpsA.

De uma maneira semelhante, o fragmento Pat5 foi reamplificado com os iniciadores TpsCF2 e TpsCR3. Isto forneceu três clones (inserto de 120 pb), Pat8-1-1, Pat8-l-6 e Pat8-l-7 tendo similaridades de seqüência com as sesquiterpeno sintases. Os Pat8-l-6 e Pat8-l-7 tiveram o mesmo DNA seqüenciado como o clone anteriormente obtido Pat5-10-4 (PatTpsA). O Pat8-1-1 teve uma seqüência de DNa diferente e foi * 5 denominado PatTpsC.

Em uma outra experiência, usando os iniciadores TpsVF2 e TpsCR3, um fragmento de DNA de 120 pb (Pat8-10-2) foi obtido, o qual apresentou similaridades de seqüências com as sesquiterpeno sintases e diferenças significativas com os dois clones anteriormente obtidos. Este clone 10 foi denominado PatTpsB.

EXEMPLO 8

ISOLAMENTO DE cDNA DAS SESQUITERPENO

SINTASES COM O USO DE 573’-RACE

Para isolar as seqüências de comprimento completo das 15 sesquiterpeno sintases, uma abordagem de 573’-RACE (Amplificação Rápida das Extremidades do cDNA) foi primeiro usada. Iniciador dianteiro especifico para as três seqüências de sesquiterpeno sintases identificadas foi projetado (Tabela 1) e 3’RACE foi realizado. Os fragmentos com o tamanho esperado foram obtidos para todos os três clones. A análise de seqüências identificou a 20 metade do cDNA 3 ’ de três diferentes clones que foram denominados PatA14, PatB-15 e PatC-16 (Figura 3).

De modo a obter a outra metade (extremidade 5’) deste clone, os iniciadores reversos foram projetados com base nestas três seqüências (dois iniciadores para cada clone; Tabela 1). 5’RACE foi realizada e os meios 25 comprimentos das extremidades 5’ de três diferentes sesquiterpeno sintases foram obtidos: PatAF2, PatBF2 e PatCF2 (Figura 4). A comparação das seqüências dos produtos de 3’RACE e dos produtos de 5’RACE, mostrou que existia uma sobreposição de seqüência (54 pb) com 100 % de identidade entre PatA-14 e PatAF2, assim confirmando que a seqüência de comprimento completo de ParTpsA havia sido obtida (Figura 5). Entretanto, para os quatro outros produtos de RACE não houve nenhuma sobreposição, significando que os dois produtos de 3’RACE e os dois produtos de 5’RACE eram de diferentes clones.

• 5 Neste estágio, nós tivemos um cDNA de comprimento completo (PatTpsA), dois meios cDNAs de extremidade 3’ e dois meios cDNAs de extremidade 5’. De modo a se obter o cDNA de comprimento completo destes últimos clones, nós designamos iniciadores específicos. Primeiro, os iniciadores dianteiros específicos para PatBF2 e PatCF2 foram 10 projetados (Tabela 1) e 3’RACE foi realizado. As seqüências dos produtos de 3’RACE obtidos foram analisadas e apresentaram similaridades de sesquiterpeno sintases. A comparação com ParBF2 e PatCF2 revelou suficiente sobreposição de seqüências para concluir que a seqüência de comprimento completo do cDNA para as duas sesquiterpeno sintases 15 denominadas PatTpsBF2 e PatTpsCF2 havia sido obtida (Figura 5). Da mesma maneira, novos iniciadores reversos específicos para PatB-15 e PatC16 foram projetados (Tabela 1). As regiões nas seqüências com a maioria das diferenças com os clones anteriormente obtidos foram escolhidas de modo a favorecer a amplificação dos cDNAs de PatB-15 e PatC-16. A 5’RACE 20 desenvolvida para PatB-15 e, assim, a seqüência de cDNA de comprimento completo de PatTpsB-15 foi obtida (Figura 5). Para PatC-16, a 5’RACE não produziu o fragmento de DNA esperado e este clone permanece incompleto.

A fim de isolar novos cDNAs codificando para sesquiterpeno sintases, os oligonucleotídeos foram projetados com base na seqüência de 25 DNA das quatro sesquiterpeno sintases codificando cDNAs já isolados das folhas de patchuli. As seqüências de DNA de PatTpsA, PatTpsBF2, PatTpsCF2 e PatTpsB15 foram alinhadas e as regiões conservadas foram pesquisadas. Quatro regiões foram selecionadas (Figura 6) e dois oligonucleotídeos degenerados dianteiros e dois reversos foram projetados (Tabela 1). Estes quatro iniciadores “específicos das sesquiterpeno sintases de patchuli” foram usados na PCR usando como padrão o cDNA preparado do mRNA da folha de patchuli (Kit Marathon, Clontech). A análise da seqüência de DNA de diferentes clones obtidos por esta abordagem mostrou que, como - 5 seria de se esperar, a maior parte deles eram fragmentos do cDNA já isolados.

Mas dois clones, o FID177 e o FID178 (que eram idênticos), eram de uma nova sesquiterpeno sintase. 3’RACE usando os iniciadores específicos Patl77-5R1 e Patl77-5R2 (Tabela 1), e 5’RACE usando os iniciadores específicos Patl77-3R1 e Patl77-3R2 (Tabela 1) deram a seqüência de 10 comprimento completo deste cDNA, a qual foi denominada PatTpsl77.

Um alinhamento da seqüência de aminoácidos deduzida dos cinco cDNA de .sesquiterpeno sintases de comprimento completo e de um parcial, é mostrado na Figura 5. O alinhamento das seqüências de nucleotídeos destes cDNAs é mostrado na Figura 6, e as seqüências de DNA e 15 de aminoácidos das sesquiterpeno sintases obtidas nestas experiências são mostradas nas Figuras 13 a 18.

Tabela l:Nome, seqüência e descrição dos oligonucleotídeos usados neste trabalho. As seq id nos: 49 a 88 são apresentadas respectivamente na ordem de aparecimento na tabela 1.

(V=A+C+G, D=A+T+G, B=T+C+G, H=A+T+C, W=A+T, S=C+G, K=T+G,

M=A+C, Y=C+T, R=A+G).

TABELA 1

Nome	Seqüência (5 ’ a 3’)	Descrição
PatTpsAFI	CCTACCATATATAAGAGACAGCGTGGCGG	iniciador dianteiro específico para PatTpsA
PatTpsAF2	TGCCTATCTTTGGGCTGTAGCATTATATTTCG	iniciador dianteiro abrigado específico para PatTpsA
PatTpsBF!	CATGGGGTTrTATTTTGAACCACAATATGC	iniciador reverso específico para PatTpsB

PatTpsBF2	GAAATATCTTAGTCAAAGTACAATGTTTGGTGTC	iniciador reverso abrigado específico para PatTpsB
PatTpsCFí	gagtgttccatgaacccaagtactctcg	iniciador dianteiro específico para PatTpsC
PatTpsCF2	CTCGTGCCCGTATTATGTTTAGTAAAACC	iniciador reverso abrigado específico para PatTpsC
PatTpsARI	GTAAGAAGTTGAGCTTCTCGAATGGTCGC	iniciador reverso específico para PatTpsA-14
PatTpsAR2	GGTCGCATAATTATCGTATGTATCATCTACTCGAG	iniciador reverso abrigado específico para PatTpsA-14
PatTpsBRI	TCTAAGCATGAGATACTCCATCTA7CAATGGC	iniciador reverso específico para PatTpsB-15
PatTpsBR2	CCTTAAAGCACCATATGCATCAAAAGTGTCATC	iniciador reverso abrigado específico para PatTpsB-15
PatTpsCRi	CTGGGAGTCCATTAATTTCCTTAATATCCCACC	iniciador reverso específico para PatTpsC-16
PatTpsCR2	GCCTTGGTGAGAAGATCAAGTTGTTGAAGTG	iniciador reverso abrigado especifico para PatTpsC-16
Pa®F23R1	AATGTTACCATTTGCTAGACAACGATTGGTG	iniciador reverso específico para PatBF2
PatBF2 3K2	GGAGACATACTTCTGGGACGCTGGAGTAG	iniciador reverso abrigado especifico para PatBF2
PatCF2 3’Rl	GAGTGTTACTTTTGGGCAGTGGGAGTGTACTATC	iniciador reverso específico para PatCF2
PatCF2 3'R2	CCCAAGTACTCTCGTGCCCGTATTATGC	iniciador reverso abrigado específico para PatCF2
PatTpsB15 5R1	CCATTGGAAGGCTTGTGGGGTGGC	iniciador reverso específico para PatTpsB-15
PatTpsB15 5R2	CTCTCAATTTCTTCAAACACGTCCAAAACCAG	iniciador reverso abrigado específico para PatTpsB~15
PatTpsC16 5R1	GCGGTGGAGGTGÀTGAGAGAAATCC	iniciador reverso específico para PatTpsC-16
PatTpsC16 5R2	GAAATrGCTGATGGAGTTCCAACAACACTC	iniciador reverso abrigado específico para PatTpsC-16
PatF1	TVGACRCAMTMSARCGHCTDGG	iniciador degenerado dianteiro deduzido da teipeno sintase de patchuli
PatF2	RATWMCTYCCWGAKTAYATS
PatR1	CCTCRTTHAHDKYCTTCCATBC	iniciador degenerado dianteiro deduzido da texpeno sintase de patchuli
PatR2	SCATAWKHRTCRWADGTRTCATC
Pat177-5R1	GGGCCTCTTCCATGTAAGGTCTCGCGGCG	iniciador reverso específico para Pat177
Pat177-5R2	GGCTTCTTTTCCATAGTAGGCTCGATAT GGT GCG .........	iniciador reverso abrigado especifico para PaU 77

Pati77-3R1	ggcaggctcgtcaatgatattacgggacac	iniciador específico para Pat177
Pat177-3R2	CACGAGTTTGAGAAAAAACGAGAGCACGTTCGC	iniciador abrigado específico para Pat177
PatTpsA Nds	GGCATATCCATATGGCTGCTTTTACTGCTAATGCT GTTG	iniciador dianteiro para expressão de PatTpsA empETl ia
PatTpsA Bam PatTpsA topo	CGCGGATCCTCAAATGCGTAGAGGGTTAACAAAA AGGG	iniciador reverso para expressão de PatTpsA empETlla
CACCATGGCTGCTTTTACTGCTAATGC	iniciador dianteiro para expressão de PatTpsA empET102
PatTpsA Stop	TCAAATGCGTAGAGGGTTAACAAAAAGGGC	iniciador reverso para expressão de PatTpsA em pETl 02
PatTpsBF2.1 topo	CACCATGGAATTGAAAAACCAAAGT GTT GC	iniciador dianteiro para expressão de PatTpsBF2 empETXOl
PatTpsBF2.1 stop	CTATGGAATAGGGTGAA7ATATÃGTTGCTTGATG	iniciador reverso para expressão de PatTpsBF2 empETl 01
PatTpsCF2 topo	CACCATGGCTGTACAAATCTCCGAAACTG	iniciador dianteiro para expressão de PatTpsCF2 empETlOl
PatTpsCF2 stop	TTAAAGCTTGATCTGATCAACAAACAGAGC	iniciador reverso para expressão de PatTpsCF2 empETl01
PatTpsBTS topo	CACCATGGATTTGAATGAAATCACC	iniciador dianteiro para expressão de PafTpsB15 empETl 01
PafTpsBtS stop	TTAAGGAATAGGGTGAATGTATAGTTGG	iniciador reverso para expressão de PatTpsB15 empETlOl
: PatTps177 topo	CACCATGGAGTTGTATGCCCAAAGTG	iniciador dianteiro para expressão de PatTpsl77 empETlOl
PatTps177 stop	TTAATATGGAACAGGGTGAAGGTAC	iniciador reverso para expressão de PatTpsl77 empETlOl

EXEMPLO 9

EXPRESSÃO HETERÓLOGA E CARACTERIZAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA

Para a caracterização das sesquiterpeno sintases para as quais o cDNA de comprimento completo foi isolado, o cDNA foi ligado nos plasmídeos de expressão apropriados. Estes plasmídeos foram usados para transformar as células de E coli e, após a expressão das proteínas recombinantes, as proteínas de E. coli foram extraídas e usadas para avaliar a conversão bioquímica de FPP em compostos de sesquiterpeno (ver Exemplos 10 5 e 6).

PatTpsA: O cDNA de PatTpsA foi ligado no plasmídeo de expressão pETlla (Exemplos 5 e 6). A expressão heteróloga na cepa BL21 (DE3) de E. coli comercialmente disponível produziu apenas pequenas quantidades de proteínas recombinantes solúveis funcionais e grandes quantidades de proteínas insolúveis (as sesquiterpeno sintases são proteínas * 5 solúveis e as proteínas solúveis refletem proteínas inativas que se precipitam como corpos de inclusão). Várias tentativas foram feitas para melhorar a fração de proteína solúvel de sesquiterpeno sintases mediante redução da síntese protéica para facilitar a correta duplicação (baixa temperatura de cultura, baixa concentração do indutor). Nenhuma melhora significativa foi 10 observada.

PatTpsA foi também ligado no plasmídeo pET102 que permitiu a expressão da sesquiterpeno sintase como uma proteína de fusão com uma proteína de tiorredoxina. A tiorredoxina promove a formação de ligações dissulfetos durante a duplicação protéica. Este tipo de fusão tem 15 mostrado melhorar a correta duplicação e a solubilização das proteínas expressas. A expressão de PatTpsA com o uso deste sistema não melhorou a expressão das proteínas funcionais.

Conseqüentemente, para PatTpsA, a atividade enzimática encontrada no extrato de proteína de E. coli recombinante foi baixa, mas a 20 biossíntese de pequenas quantidades de sesquiterpenos foi detectada. A análise de GC-MS e o cálculo do índice de retenção (Kl) deixou a identificação do: γ-curcumeno como o principal sesquiterpeno produzido (Figura 7). A produção de vários sesquiterpenos secundários pode não ser excluída, mas por causa da baixa atividade eles podem não ser identificados.

Isto constitui a primeiro relato de clonagem de um cDNA codificando para uma γ-curcumeno sintase. o γ-curcumeno não foi detectado no óleo de patchuli. Pode ser possível que este composto esteja presente em muito baixa concentração, ou que ele seja convertido em outros compostos.

PatTpsBF2: O cDNA de PatTpsBF2 foi ligado no plasmídeo pETIOl (Exemplo 4). Após a transformação das células de E. coli BL21 Star® (DE3) (Invitrogen) e indução da expressão, apenas pequenas quantidades de proteína recombinante solúvel foram detectadas. Quanto ao PatTpsA, a expressão com o uso do plasmídeo pET102 (expressão como fusão na • 5 proteína tiorredoxina) não melhorou a expressão das proteínas funcionais. A atividade da sesquiterpeno sintase pode ser detectada com o extrato de proteína bruta de E. coli expressando a proteína PatTpsBF2 (Figura 8).

Apenas um produto de sesquiterpeno, o (-)-germacreno D, pôde ser identificado (confirmado pelo espectro de massa e pelo índice de retenção). O 10 germacreno D nunca foi detectado no óleo de patchuli e pode estar presente como constituinte de traço ou pode ser convertido em outro composto nas plantas. Um cDNA da germacreno D sintase foi anteriormente isolado do tomate (van der Hoeven, R. S., Monforte, A. J., Breeden, D., Tanksley, S. D. e Steffens, J. C. (2000) The Plan cell 12, 2283-2294), mas quando da inclusão 15 de todos os produtos secundários, o perfil do produto global parece ter sido diferente.

PatTpsCF2: O cDNA de PatTpsCF2 foi ligado no plasmídeo pETIOl e as células de E. coli BL21 Star® (DE3) foram transformadas com esta construção. Quantidades relativamente grandes de proteína recombinante 20 foram obtidas e a atividade da sesquiterpeno sintase foi facilmente detectada.

Após a incubação com famesil-pirofosfato, diversos sesquiterpenos puderam ser separados por GC-MS (Figura 9). O pico principal pôde ser identificado como (-)-/Telemento. Este composto é formado por rearranjo térmico (rearranjo de Cope) de (+)-germacreno A no injetor quente do GC. Assim, 25 PatTpsCF2 é uma sesquiterpeno sintase produzindo como composto principal o (+)-germacreno A. Outros sesquiterpenos secundários foram também detectados e alguns deles, isto é, o 4,5-di-epi-aristolocheno, o (-)-eremofileno e o ot-selineno, foram tentativamente identificados (Figura 9). O (-)-/?elemento foi detectado como constituinte secundário em alguma análise do óleo de patchuli, significando que o (+)-germacreno A está presente no óleo. O germacreno A é um sesquiterpeno relativamente ubíquo nas espécies de plantas. Os cDNAs codificando para as germacreno sintases foram isoladas de várias espécies de plantas, incluindo a alface, a chicória e a vara-de-ouro > 5 (virga-áurea) (Bennett, Μ. H. et al. (2002) Phytochem. 60, 255-261;

Bouwmeester, H. J. et al. (2002) Plant Physiol. 129 (1), 134-144; Prosser et al. (2002) Phytochem. 60, 691-702).

PatTpsB15: O cDNA de PatTpsB15 foi ligado no plasmídeo pETIOl e as células de E. coli BL21 Star® (DE3) foram transformadas. Os 10 ensaios enzimáticos com proteínas de E. coli brutas extraídas após a indução da expressão da sesquiterpeno sintase recombinante, mostraram metabolização do FFP relativamente boa. Vários sesquiterpenos foram detectados por GC-MS (Figura 10). O principal produto foi identificado (por espectro de massa e índice de retenção) como (-)-germacreno D. O elemento 15 δ, (-)-P-elemento (os produtos do rearranjo térmico de germacreno C e de (+)germacreno A respectivamente), β-ilangeno, (E,E)-3-farmaseno e (Ε,Ε)-αfameseno puderam também ser identificados entre os produtos secundários formados pelo PatTpsB15 recombinante. Pelo menos oito outros sesquiterpenos foram produzidos, porém sua estrutura não pôde ser não 20 ambiguamente determinada. As sesquiterpeno sintases PatTpsB15 tem uma atividade semelhante à atividade de PatTpsBF2 com o produto principal formado sendo o (-)-germacreno D. Porém, quando da inclusão de todos os produtos formados, a atividade catalítica destas duas enzimas parece ser significativamente diferentes.

PatTpsl77: O cDNA de PatTpsl77 foi ligado no plasmídeo pETIOl, as células de E. coli BL21 Star® (DE3) foram transformadas e a expressão da sesquiterpeno sintase recombinante foi induzida. O ensaio enzimático com o uso do extrato de proteína bruta e FPP como substrato, mostraram que o PatTpsl77 foi a patchulol sintase. A enzima produziu como produto principal o (-)-patchulol e pelo menos 18 outros sesquiterpenos (Figuras 11 e 12). A maior parte dos sesquiterpenos produzidos pelas enzimas pôde ser identificada por GC-MS e as quantidades estimadas por GC (detecção de ionização de chama): (-)-patchulol (39,1 %), β-patchuleno (2,1 - 5 %), (+)-germacreno A (detectado como o produto do rearranjo térmico βelemento) (1,6 %), íraws-/?-cariofileno (4,5 %), aZ/à-guaieno (14 %), seicheleno (4 %), /rara-^-fameseno (3 %), aZ/h-humuleno (1,1 %), apatchuleno (8,9 %), (Z,E)-a-fameseno (1,35 %), γ-patchuleno (2,5 %), (trans)-alfa-fameseno (3 %) e tz-bulneseno (8,6 %). Todos os sesquiterpenos 10 produzidos pela patchulol sintase recombinante são encontrados na análise do óleo de patchüli, aproximadamente nas mesmas proporções, exceto quanto aos famesano sesquiterpenos. O perfil do produto da patchulol sintase recombinante mostra que uma única sesquiterpeno sintase é responsável pela produção dos principais e mais característicos sesquiterpenos encontrados nas 15 plantas de patchüli.

EXEMPLO 10

BIOSSÍNTESE IN VIVO DO PATCHULOL

As bactérias usam a via de DXP para produzir isoprenóides essenciais para funções tais como a prenilação do tRNA, e a biossíntese das 20 quinonas e dos dolicóis. Assim, nas células de E. coli, o FPP está presente como intermediário e pelo menos parte do aglomerado deve ser utilizável pelas sesquiterpeno sintases expressas nestas células.

As experiências foram realizadas com o uso de E. coli, para testar a capacidade da patchulol sintase de sintetizar, in vivo, os 25 sesquiterpenos do aglomerado de FPP endógeno. As experiências típicas para avaliar a produção de sesquiterpeno in vivo são realizadas como segue. O plasmídeo de expressão contendo o cDNA de sesquiterpeno sintases é transformado em células de E. coli BL21 (DE3). Colônias isoladas de células transformadas são usadas para inocular 5 ml de meio LB suplementado com os antibióticos apropriado. Após 5 a 6 horas de incubação a 37°C, a cultura foi usada para inocular 100 ml de meio TB suplementado com os antibióticos apropriados, e a cultura foi incubada por 2 horas a 20°C em um frasco de agitação de 250 ml. Após 2 horas de incubação, a expressão da proteína foi - 5 induzida pela adição de IPTG 1 mM. As culturas foram deixadas por 24 horas e foram então diretamente extraídas por duas vezes com um volume de pentano. As duas frações de solvente foram recuperadas, combinadas e concentradas a 0,5 ml antes da análise de GC-MS. No ensaio de produção de sesquiterpeno in vivo, as células de E. coli expressando a patchulol sintase 10 (como descrito no Exemplo 9) produziu o patchulol. O patchulol pôde ser claramente detectado pela análise GC do extrato de cultura, e nenhum patchulol foi detectado com as células transformadas com o plasmídeo vazio. A identidade do produto pôde ser confirmada por GC-MS, mas a quantidade de sesquiterpeno produzido foi relativamente baixa e a estimativa das 15 quantidades não foi possível.

Esta experiência demonstrou que a patchulol sintase é capaz de utilizar FPP endógeno e produzir patchulol in vivo. O cDNA codificando para a patchulol sintase pode, assim, ser usado para engendrar o organismo para a produção in vivo do patchulol.

Claims

1. Método para a produção de patchoulol, caracterizado pelo fato de que compreende:

a) o contato de farnesil-pirofosfato com pelo menos um polipeptídio tendo uma atividade sintase de patchoulol e que compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10; e

b) opcionalmente, isolar o patchoulol produzido em a).

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa a) compreende a transformação de um organismo não humano que produz farnesilpirofosfato com um ácido nucleico que codifica um polipeptídio contendo uma atividade de sintase de patchoulol e que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, efetuando assim a conversão de farnesil-pirofosfato para patchoulol.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o referido organismo hospedeiro é uma planta ou um microrganismo.

4. Método para preparar uma patchoulol sintase funcional variante, caracterizado pelo fato de que o referido método compreende as etapas:

a) selecionar um ácido nucleico de SEQ ID NO: 5;

b) alteração da sequência de ácido nucleico selecionada para obter uma população de ácidos nucleicos mutantes;

c) transformação de células hospedeiras com os ácidos nucleicos mutantes para expressar polipeptídios; e

d) rastrear os polipeptídios para obter um polipeptídio funcional, com uma atividade sintase de patchoulol modificada.

5. Construção de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5 e, pelo menos, um elemento promotor e / ou, pelo menos, um elemento terminador.

Petição 870160005520, de 19/02/2016, pág. 8/16

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6. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 5.

7. Método de obtenção de uma célula hospedeira recombinante compreendendo um ácido nucleico da SEQ ID NO: 5, caracterizado pelo fato de dito método compreender as etapas de transformação da célula hospedeira com o ácido nucleico de SEQ ID NO: 5; selecionar células hospedeiras que produzem o polipeptídio compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, e cultivar as células em condições de crescimento de cultura.

8. Método para a obtenção de uma célula hospedeira recombinante, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende a introdução da construção de ácido nucleico conforme definida na reivindicação 5 na referida célula hospedeira.

9. Método de obtenção de uma célula hospedeira recombinante, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende a introdução do vetor conforme definido na reivindicação 6 na referida célula hospedeira.

10. Método de acordo com qualquer das reivindicações de 7 a 9, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula de planta, uma célula procariótica ou uma célula de levedura.

11. Célula de microrganismo hospedeira, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de SEQ ID NO: 5 como um transgene.

12. Método de fabricação de uma patchoulol sintase, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar um hospedeiro modificado para conter um ácido nucleico de SEQ ID NO: 5, em condições conducentes à produção da referida patchoulol sintase.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o referido hospedeiro é uma célula hospedeira selecionada a partir do grupo que consiste

Petição 870160005520, de 19/02/2016, pág. 9/16

3/3 em uma célula bacteriana, uma célula de levedura e uma célula de planta ou de um organismo hospedeiro selecionado a partir do grupo que consiste de uma planta e um microrganismo.