BRPI0515516B1 - Immunogenic composition, vaccine, method of manufacturing a vaccine, and, use of immunogenic composition. - Google Patents

Abstract

"composição imunogênica, vacina, métodos de fabricar uma vacina e de prevenir ou tratar infecção estafilocócica, uso da composição imunogênica, método de preparar um globulina imune para uso na prevenção ou tratamento de infecção estafilocócica, composição farmacêutica, e, uso da composição farmcêutica". o presente pedido refere-se a composições imunogênicas compreendendo uma mistura de antígenos estafilocócicos que combinam antígenos tendo diferentes funções, por exemplo, combinações incluindo uma proteína estafilocócica de ligação de componente extracelular, e uma proteína transportadora estafilocócica ou uma proteína estafilocócoca de ligação de componente extracelular e um regulador estafilocócico de virulência ou toxina ou uma proteína transportadora estafilocócica e um regulador estafilocócico de virulência ou toxina. vacinas, métodos de tratamento, usos e processos para fabricar a vacina estafilocócica são também descritos.

Description

“COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, VACINA, MÉTODO DE FABRICAR UMA VACINA, E, USO DA COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA.” Campo Técnico A presente invenção refere-se ao campo das composições estafilocócicas imunogênicas e vacinas, sua fabricação e o uso destas composições em medicina. Mais particularmente, refere-se a composições de vacina compreendendo a combinação de antígenos para o tratamento ou prevenção de infecção estafilocócica. Métodos de usar estas vacinas em medicina e métodos para sua preparação são também providos.

Fundamentos O número de infecções adquiridas na comunidade como adquiridas nos hospitais tem aumentado nos anos recentes com o uso aumentado de dispositivos intravasculares. As infecções adquiridas em hospitais (nossocomiais) são a causa principal de morbidez e mortalidade, mais particularmente nos Estados Unidos, onde afeta mais de 2 milhões de pacientes anualmente. Após vários estudos, cerca de 6 por cento dos pacientes americanos irão adquirir uma infecção durante sua estadia no hospital. A carga econômica nos Estados Unidos foi estimada como sendo maior que $ 4,5 bilhões de dólares em 1992 (Emori e Gaynes, 1993, Clin. Microbiol. Rev. 6; 428). As mais freqüentes infecções são infecções do trato urinário (UTI-33% das infecções), seguido por pneumonia (15,5%), infecções no sítio cirúrgico (14,8%) e infecções primarias da corrente sanguínea (13%) Emori e Gaynes, 1993, Clin. Microbiol. Rev. 6; 428).

Staphylococcus aureus, estafilococos coagulase-negativos Segue página 2. (principalmente Staphylococcus epidermidis), eníerococcus spp, Esherichia coli e Pseudomotias aeruginosa são os patógenos nossocomiais principais. Apesar de estes patógenos causarem quase o mesmo número de infecções, a severidade dos distúrbios que podem produzir combinados com a freqüência. de isolados resistentes a antibióticos equilibra esta faixa para S. aureus e S. epidermidis como sendo os patógenos nossocomiais mais significantes.

Staphylococcus aureus é a causa mais comum de infecções nossocomiais com uma significante morbidez e mortalidade (Romero-Vivas et al 1995, Infect. Dis. 21; 1417). Ele é a causa se alguns casos de osteomielite, endocardite, artrite séptica, pneumonia, abscessos e síndrome de choque tóxico. S. epidermidis é um comensal de pele normal que é também um importante patógeno oportunístico responsável por infecções de dispositivos médicos implantados e infecções em sítios de cirurgia. Os dispositivos médicos infectados por S. epidermidis incluem marca-passos cardíacos, shunts de fluido cerebroespinhal, catéteres de diálise peritoneal ambulatória contínua, dispositivos ortopédicos e válvulas protéticas do coração, As infecções por S. aureus e S. epidermidis são tratadas com antibióticos com penicilina sendo a droga de escolha enquanto vancomicina é usada para isolados resistentes a meticilina. A porcentagem de cepas estafilocócicas demonstrando resistência de espectro amplo para os antibióticos tem se tomado cada vez mais prevalente desde os anos 80 (Panlilo et al 1992, Infect.Control. Hosp. Epidemiol. 13; 582), colocando uma ameaçada para uma terapia antimicrobiana eficaz. Além disso, a emergência recente de cepas de S. aureus resistente a vancomicina tem ocasionado o medo de que as cepas de S. aureus resistentes a meticilina irão surgir e se difundir para as quais não se encontra uma terapia eficaz disponível.

Uma abordagem alternativa de usar anticorpos contra antígenos estafilocócicos em imunoterapia passiva tem sido investigada. A terapia envolvendo a administração de antisoros policlonais está sob desenvolvimento (WO 00/15238, WO 00/12132) assim como tratamento com um anticorpo monoclonal contra ácido lipoteicóico (WO 98/57994).

Uma abordagem alternativa deve ser o uso de vacinação ativa para gerar uma resposta imune contra estafilococos. Vários candidatos para inclusão como componentes de vacina foram identificados. Estes incluem proteína de ligação de Fibronectina (US5840846), análogo de MHC II (US5648240), proteína de ligação de fibrinogênio (US6008341), GehD (US 2002/0169288), proteína de ligação de colágeno (US6288214), SdrF, SdrG e SdrH (WO 00/12689), exotoxinas mutantes SEA e SEB (WO 00/02523) e proteína de ligação de vitronectina 52kDa (WO 01/60852). O genoma de S, aureus foi seqüenciado e muitas seqüências de codificação foram identificadas (EP786519, WO 02/094868). O mesmo é verdadeiro para S. epidermidis (WO 01/34809). Como um refinamento desta abordagem, outros identificaram proteínas que são reconhecidas por soros hiperimune de pacientes que tinham sofrido infecção estafilocócica (WOOl/98499, WO 02/059148). A primeira geração de vacinas marcadas contra S. aureus ou contra as exoproteínas que ela produz tem alcançado sucesso limitado (Lee 1996 Trends Microbiol. 4; 162). Permanece a necessidade de desenvolvimento de vacinas eficaz contra infecções estafilocócicas.

Assim, a presente invenção provê uma composição imunogênica compreendendo pelo menos duas proteínas diferentes ou fragmentos imunogênicos das mesmas, selecionadas dentre pelo menos dois grupos de proteínas ou fragmentos imunogênicos selecionadas dentre os seguintes grupos: Grupo a) pelo menos uma proteína de ligação de componente extracelular estafilocócico de ou fragmento imunogênico da mesma selecionadas dentre o grupo consistindo de receptor de laminina, proteína de ligação SitC/MntC/saliva, EbhA, EbhB, proteína de ligação de elastina ( EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina, CIfA, SdrC, SdrG, SdrH, Lipase GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, CIfB, FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína de ligação de vitronectina, proteína de ligação de fibrinogênio, coagulase, Fig e MAP;

Grupo b) pelo menos uma proteína transportadora estafilocócica ou fragmento imunogênico da mesma selecionada dentre o grupo consistindo de transportador ABC imunodominante, IsdA, IsdB, Mg2+ transportador, Site e transportador de Ni ABC;

Grupo c) pelo menos um regulador estafilocócico de virulência, toxina ou fragmento imunogênico do mesmo selecionado dentre o grupo consistindo de alfa toxina (HIa), mutante H35R de alfa toxina, proteína de ativação de RNAIII (RAP).

Descrição da figuras Figura 1 - Seqüências de polipeptídeos de proteínas preferidas. Tabela 1 provê informação sobre qual proteína é representada por cada SEQ ID.

Figura 2 - seqüências de nucleotídeos codificando proteínas preferidas. Tabela 1 provê informação sobre qual proteína é codificada por cada SEQ ID.

Figura 3 - Purificação de alfa toxina sob condições nativas. Painel A mostra SDS-PAGE colorido com coommassie de amostras preparadas durante purificação de alfa toxina. Trilha 1 - marcadores de peso molecular, trilha 2 - fração solúvel contendo alfa toxina super- expressa, trilha 3 - fluxo através de coluna Ni-NTA, trilha 4 - frações eluídas com 10% tampão B, trilha 5 - frações eluídas com 20% tampão B, trilha 6 - frações eluídas com 30% tampão B, trilha 7 - frações eluídas com 50% tampão B, trilha 8 - frações eluídas com 75% tampão B, trilha 9 e 10 frações eluídas com 100% tampão B, trilha 11 bactérias a T=0 antes de indução, trilha 12 -bactérias a T=4 horas após indução, trilha 13 - lisado de células, trilha 14 -fração solúvel, trilha 15 - infração solúvel. Painel B mostra SDS-PAGE colorido com coommassie de 10,5,2 e 1 μΐ de alfa toxina purificada.

Figura 4 - Purificação de condições sub-desnaturantes de SdrC. Painel A mostra SDS-PAGE colorido com coommassie de amostras preparado durante purificação de alfa toxina. Trilha M - marcadores de peso molecular, trilha de partida - sobrenadante formado a partir da fração insolúvel contendo SdrC super-expresso, trilha FT1 - fluxo através da coluna de Ni-NTA, trilha C - frações eluídas com tampão C de lavagem, trilha D -frações eluídas com tampão D, trilha E - frações eluídas com tampão E.

Painel B mostra SDS-PAGE colorido com coommassie de 1, 2,5 e ΙΟμ.1 do SdrC purificado.

Figura 5 - Resultados ELISA para antisoros contra proteínas estafilocócicas em placas revestidas com proteínas purificadas.

Concentrado (pool) de camundongo pré - Resultado usando soros concentrados extraídos de camundongos pre-inoculação. Concentrado camundongos pós III - resultado usando soros de camundongo concentrados extraídos pós- imunização. Concentrado de coelho pré - Resultado usando soros concentrados extraídos de coelhos pre-inoculação. Concentrado de coelho Pos III - Resultado usando soros concentrados de coelho extraídos pós- imunização. Controle negativo BIc.

Figura 6 - Resultados ELISA para antisoros de camundongo criados contra proteínas estafílocócicas em placas revestidas com estafílococos mortos.

Painel A usa placas revestidas com células totais mortas sorotipo 5 de S. aureus. Painel B usa placas revestidas com células totais mortas sorotipo 8 de S. aureus. Painel C usa placas revestidas com células totais mortas de S. epidermis. A linha marcada com sinais quadrados mostra o resultado ELISA usando antisoros de camundongos imunizados três vezes com proteínas estafilocócicas indicadas. A linha marcada com sinais de diamante mostra o resultado ELISA para soros de camundongo pré-imune.

Figura 7 - Resultados ELISA para antisoros de coelho criados contra proteínas estafílocócicas em placas revestidas com estafilococos mortos.

Painel A usa placas revestidas com células totais mortas sorotipo 5 de S. aureus. Painel B usa placas revestidas com células totais mortas sorotipo 8 de S. aureus. Painel C usa placas revestidas com células totais mortas de S. epidermis. A linha marcada com sinais quadrados mostra o resultado ELISA usando antisoros de coelhos imunizados três vezes com proteínas estafílocócicas indicadas (exceto para HarA onde somente uma imunização foi dada). A linha marcada com sinais de diamante mostra o resultado ELISA para soros de coelho pré-imunes.

Descrição Detalhada A presente invenção descreve combinações particulares de antígenos estafilocócicos que quando combinados, levam à produção de uma composição imunogênica que é eficaz para tratar ou prevenir infecção estafilocócica. Composições imunogênicas da invenção de modo apropriado incorporam antígenos que estão envolvidos em diferentes funções estafílocócicas. Estas composições imunogênicas marcam a resposta imune para aspectos diferentes da função estafilocócica e são assim capazes de induzir uma resposta imune particularmente eficaz.

As infecções estafílocócicas progridem através de vários estágios s diferentes. Por exemplo, ciclo de vida de estafílococos envolve a colonização comensal, iniciação de infecção pode acesso aos tecidos adjuntivos ou à corrente sanguínea, multiplicação aneróbica no sangue, interjogo entre determinantes de virulência de S. aureus e tos mecanismos de defesa do hospedeiro e indução de complicações incluindo endocardite, formação de abscesso metastático e síndrome de sepsia. Moléculas diferentes na superfície da bactéria estarão envolvidas em diferentes etapas do ciclo de infecção. Ao visar a resposta imune contra uma quantidade eficaz de uma combinação de antígenos particulares envolvidos em diferentes processos de infecção estafilocócica, uma composição imunogênica estafilocócica ou vacina com aumentada eficácia pode ser obtida.

Em particular, combinações de determinados antígenos de diferentes classes, alguns dos quais estão envolvidos em adesão às células hospedeiras, alguns dos quais estão envolvidos em aquisição de ferro ou outras funções de transportador, sendo alguns toxinas ou reguladores de vimlência e antígenos imunodominantes, podem elicitar uma resposta imune que protege contra estágios múltiplos de infecção. A eficácia da resposta imune pode ser medida ou em testes de modelo animal como descrito nos exemplos e/ou usando um teste opsonofagocítico como descrito nos exemplos.

Uma vantagem adicional da invenção é que a combinação de antígenos da invenção de diferentes famílias de proteínas em uma composição imunogênica irá permitir proteção contra uma faixa mais ampla de cepas. A invenção refere-se a composições imunogênicas compreendendo uma pluralidade de proteínas selecionadas dentre pelo menos duas diferentes categorias de proteína, tendo diferentes funções dentro de estafilococos. Exemplos destas categorias de proteínas são proteínas de ligação extracelulares, proteínas transportadoras como proteínas de aquisição de Fe, toxinas ou reguladores de vimlência e outras proteínas imunodominantes. As combinações de vacina da invenção são eficazes contra cepas estafilocócicas homólogas (cepas das quais os antígenos são derivados) e preferivelmente também contra cepas estafilocócicas heterólogas.

Uma composição imunogênica da invenção compreende um número de proteínas igual ou maior do que 2,3,4,5 ou 6 selecionadas dentre 2 ou 3 dos seguintes grupos: • grupo a) - pelo menos uma proteína de ligação de componente extracelular estafilocócico ou fragmento imunogênico da mesma selecionada dentre o grupo consistindo de receptor de laminina, proteína de ligação SitC/MntC/saliva, EbhA, EbhB, proteína de ligação de elastina (EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina, CIfA, SdrC, SdrG, SdrH, Lipase GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, CIfB, FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína de ligação de vitronectina, proteína de ligação de fibrinogênio, coagulase, Fig e MAP; • grupo b) - pelo menos uma proteína transportadora estafilocócica ou fragmento imunogênico da mesma selecionada dentre o grupo consistindo de transportador ABC imunodominante, IsdA, IsdB, Mg2+ transportador, SitC e transportador de Ni ABC; • grupo c) - pelo menos um regulador estafilocócico de virulência, toxina ou fragmento imunogênico do mesmo selecionado dentre o grupo consistindo de alfa toxina (HIa), mutante H35R de alfa toxina, proteína de ativação de RNAIII (RAP).

Por exemplo, uma primeira proteína é selecionada dentre grupo a), b) ou c) e uma segunda proteína é selecionada dentre um grupo selecionado dentre grupos a), b) e c) que não inclui a segunda proteína.

Em uma forma de realização preferida, a composição imunogênica da invenção contém pelo menos uma proteína selecionada dentre o grupo a) e uma proteína adicional selecionada dentre o grupo b) e/ou grupo c).

Em uma outra forma de realização, a composição imunogênica da invenção contém pelo menos um antígeno selecionado dentre grupo b) e uma proteína adicional selecionada dentre o grupo c) e/ou grupo a).

Em uma outra forma de realização, a composição imunogêníca da invenção contém pelo menos um antígeno selecionado dentre grupo c) e uma proteína adicional selecionada dentre o grupo a) e/ou grupo b).

Composição imunogêníca da invenção de modo apropriado contém proteínas de S. aureus, e/ou S. epidermidis.

Proteínas Composições imunogênicas da invenção compreendem uma proteína isolada que compreende uma seqüência de aminoácidos que tem pelo menos 85% identidade, preferivelmente pelo menos 90% identidade, mais preferivelmente pelo menos 95% identidade, o mais preferivelmente pelo menos 97-99% ou identidade exata, como para qualquer seqüência da figura 1.

Onde a proteína é especifícamente mencionada aqui, ela é preferivelmente uma referência a uma proteína nativa ou recombinante, comprimento completo ou opcionalmente uma proteína madura em que qualquer seqüência de sinal foi removida. A proteína pode ser isolada diretamente da cepa estafilocócica ou produzida por técnicas de DNA recombinante. Fragmentos imunogênicos da proteína podem ser incorporados na composição imunogêníca da invenção. Estes são fragmentos compreendendo pelo menos 10 aminoácidos, preferivelmente 20 aminoácidos, mais preferivelmente 30 aminoácidos, mais preferivelmente 40 aminoácidos ou 50 aminoácidos, o mais preferivelmente 100 aminoácidos, tomados contiguamente da seqüência de aminoácidos da proteína. Além disso, estes fragmentos imunogênicos são imunologicamente reativos com anticorpos gerados contra as proteínas estafilocócicas ou com anticorpos gerados por infecção de um hospedeiro mamífero com estafílococos. Fragmentos imunogênicos também incluem fragmentos que quando administrados em uma dose eficaz, (ou sozinhos ou como um hapteno ligado a um veículo), elicitam uma resposta imune protetora contra infecção estafilocócica, mais preferivelmente é protetor contra infecção por S. aureus e/ou S. epidermidis. Este fragmento imunogênico pode incluir, por exemplo, a proteína faltando uma seqüência líder N-terminal, e/ou um domínio transmembrana e/ou domínio de âncora C-terminal. Em um aspecto preferido, o fragmento imunogênico de acordo com a invenção compreende substancialmente todo o domínio extracelular de uma proteína que tem pelo menos 85% identidade, preferivelmente pelo menos 90% identidade, mais preferivelmente pelo menos 95% identidade, o mais preferivelmente pelo menos 97-99% identidade, para uma seqüência selecionada dentre Figura 1 sobre o comprimento completo da seqüência do fragmento, Também incluídas nas composições imunogênicas da invenção estão as proteínas de fusão compostas de proteínas estafilocócicas, ou fragmentos imunogênicos de proteínas estafilocócicas. Estas proteínas de fusão podem ser tomadas recombinantemente e podem compreender uma porção de pelo menos 2, 3, 4, 5 ou 6 proteínas estafilocócicas. Altemativamente, a proteína de fusão pode compreender porções múltiplas de pelo menos 2, 3, 4 ou 5 proteínas estafilocócicas. Estas podem combinar diferentes proteínas estafilocócicas ou fragmentos imunogênicos das mesmas na mesma proteína. Altemativamente, a invenção também inclui proteínas de fusão individuais de proteínas estafilocócicas ou fragmentos imunogênicos das mesmas, como uma proteína de fusão com seqüências heterólogas como um provedor de epítopos de células T ou etiquetas de purificação, por exemplo: β- galactosidase, glutationa-S-transferase, proteínas fluorescentes verdes (GFP), etiquetas de epítopos como FLAG, etiqueta myc, poli histidina, ou proteínas de superfície viral como hemaglutinina de vírus de influenza, ou proteínas bacterianas como toxóide de tétano, toxóide de difteria, CRM197. Tabela 1 A seguinte tabela especifica os números de SEQ ID de preferidas seqüências de proteína e seqüências de DNA que são encontradas na Figura 1 e Figura 2 respectivamente. SA indica uma seqüência de S. aureus e SE indica a seqüência de S. epidermidis.

Proteínas De Ligação De Componente Extracelular Proteínas de ligação de componente extracelular são proteínas que ligam aos componentes extracelulares hospedeiros. O termo inclui, mas não é limitado a adesinas.

Exemplos de proteínas de ligação de componente extracelular incluem receptor de laminina (Naidu et al J. Med. Microbiol. 1992, 36; 177), proteína de ligação de SitC/MntC/saliva (US5801234; Wiltshire e Foster Infec. Immun. 2001, 69; 5198), EbhA (Williams et al Infect. Immun. 2002, 70; 6805), EbhB, proteína de ligação de elastina (EbpS) (Park et al 1999, J. Biol. Chem. 274; 2845), EFB (FIB) (Wastfelt e Flock 1995, J. Clin. Microbiol. 33; 2347), SBI (Zhang et al FEMS Immun. Med. Microbiol. 2000, 28; 211), autolisina (Rupp et al 2001, J. Infect. Dis. 183; 1038), CIfA ( US6008341, McDevitt et al Mol. Microbiol. 1994, 11; 237), SdrC, SdrG (McCrea et al Microbiology 2000, 146; 1535), SdrH (McCrea et al Microbiology 2000, 146; 1535), Lipase GehD (US2002/0169288), SasA, FnbA (Flock et al Mol Microbiol. 1994, 12; 599, US6054572), FnbB (WO 97/14799, Booth et al 2001 Infec. Immun. 69; 345), proteína de ligação de colágeno Cna (Visai et al 2000, J. Biol. Chem. 275; 39837), CIfB (WO 99/27109), FbpA (Phonimdaeng et al 1988 J. Gen Microbiol. 134; 75), Npase (Flock 2001 J. Bacteriol. 183; 3999), IsaA/PisA (Lonenz et al FEMS Immuno. Med. Microbiol. 2000, 29; 145), SsaA (Lang et al FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2000, 29; 213), EPB (Hussain e Hermann symposium on Staph Denmark 14-17th 2000), SSP-1 (Veenstra et al 1996, J. Bacteriol. 178; 537), SSP-2 (Veenstra et al 1996, J. Bacteriol. 178; 537), proteína de ligação de heparina 17 kDa HBP (Fallgren et al 2001, J. Med. Microbiol. 50; 547), proteína de ligação de Vitronectina (Li et al 2001, Curr. Microbiol. 42; 361), proteína de ligação de fibrinogênio, coagulase, Fig (WO 97/48727) e MAP (US5648240) Proteína de ligação SitC/MntC/saliva Esta é uma proteína transportadora de ABC que é um homólogo de adesina PsaA em S. pneumoniae. Ela é uma lipoproteína 32kDa altamente imunogênica que é distribuída através da parede das células bacterianas (Cockayne et al Infect. Immun. 1998 66; 3767). Ela é expressa em S. aureus e S, epiãermidis como uma lipoproteína 32kDa e um homólogo 40 kDa está presente em S. hominis. Em S. epidermidis, ela é um componente de um operon regulado por ferro. Ela mostra homologia considerável para ambas as adesinas incluindo FimA de Streptococcus parasanguis, e com lipoproteínas de uma família de transportadores de ABC com funções de transporte de ferro metal putativas ou provadas. Assim SitC é incluído como uma proteína de ligação extracelular e como um transportador de íon metal. A proteína de ligação de saliva descrita em US5.801,234 é também uma forma de SitC e pode ser incluída em uma composição imunogênica da invenção.

CIfA e CIfB

Ambas as proteínas tem atividade de ligação de fíbrinogênio e provocam S. aureus a forma grupos na presença de plasma. Elas contém um motivo LPXTG comum às proteínas associadas com a parede.

CIfA é descrito em US6008341 e CIfB é descrito em WO 99/27109.

Coagulase ÍFbnAl Esta é uma proteína de ligação de fíbrinogênio que leva S. aureus a forma grupos na presença de plasma. Ela é descrita em referência relacionada com Coagulase: Phonimdaeng et al (J. Gen. Microbio. 1988, 134:75-83), Phonimdaeng et al. (Mol Microbiol 1990; 4:393- 404), Cheung et al. (Infect Immun 1995; 63:1914-1920) e Shopsin et al. (J. Clin. Microbiol. 2000; 38:3453-3456).

Os preferidos fragmentos para inclusão na composição imunogênica da invenção incluem a proteína madura da qual o peptídeo de sinal foi removido (aminoácidos 27 para o C-término).

Coàgulase tem três domínios distintos. Aminoácidos 59-297 que é uma região de espira enrolada, aminoácidos 326-505 que é uma região rica em prolina e glicina e o domínio C-terminal do aminoácido 506 a 645 que tem uma conformação de folha beta. Cada um destes domínios é um fragmento preferido da invenção.

SdrG- Fbe - EíB/FIG

Fbe é uma proteína de ligação de fibrinogênio que é encontrada em muitos isolados de S. epidermidis e tem um peso molecular deduzido de 119 kDa (Nilsson et al 1998. Infect, lmmun. 66; 2666). Sua seqüência é relacionada com a de fator de formação de grupos de S. aureus (CIfA). Anticorpos contra Fbe podem bloquear a ligação de S. epidermidis para as placas revestidas com fibrinogênio e para catéteres (Pei e Flock 2001, J. Infect. Dis. 184; 52). Esta proteína é também descrita como SdrG em WO 00/12689. SdrG é encontrado em estafilococos negativos para coagulase e é uma proteína associada com parede celular contendo uma seqüência de LPXTG.

SdrG contém um peptídeo de sinal (aminoácidos 1-51), a região contendo sítios de ligação de fibrinogênio e sítios de ligação de colágeno (aminoácidos 51-825), dois domínios CnaB (aminoácidos 627-698 e 738-809), uma região de repetição de SD (aminoácidos 825-1000) e um domínio de âncora (aminoácidos 1009-1056).

Fbe tem uma de seqüência de sinal putativa com um sítio de divagem entre aminoácidos 51 e 52. Assim um fragmento preferido de Fbe contém a forma madura de Fbe se estendendo de aminoácido 52 para o C-término (aminoácido 1,092). O domínio def Fbe do aminoácido 52 para o aminoácido 825 é responsável pela ligação de fibrinogênio. Assim um fragmento preferido de Fbe consiste de ou contém aminoácidos 52- 825. A região entre aminoácido 373 e 516 do Fbe mostra a maior conservação entrè Fbe e CIfA. Fragmento preferido assim irá conter aminoácidos 373-516 de Fbe.

Aminoácidos 825 - 1041 de Fbe contém uma região altamente competitiva composta de resíduos de serina e ácido aspártico repetidos em tandem..

Os preferidos fragmentos de SdrG incluem polipeptídeos em que o peptídeo de sinal e/ou as repetições de SD e o domínio de âncora foram removidos. Estes incluem polipeptídeos compreendendo ou consistindo de aminoácidos 50-825, aminoácidos 50-633, aminoácidos 50-597 (SEQ ID NO 2 de WO 03/76470), aminoácidos 273-597 (SEQ ID NO 4 de WO 03/76470), aminoácidos 273-577 (SEQ ID NO 6 de WO 03/76470) aminoácidos 1-549, aminoácidos 219-549, aminoácidos 225-549, aminoácidos 219-528, aminoácidos 225-528 de SEQ ID NO:70.

Preferivelmente, um polipeptídeo SdrG tendo a sequência pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% homóloga à seqüência de SEQ ID 70,20 ou 21 é incorporada na composição imunogênica da invenção.

As composições da invenção opcionalmente compreendem um fragmento dos polipeptídeos SdrG descritos acima.

Preferidos fragmentos tem o peptídeo de sinal e/ou o domínio de repetição de SD e/ou o domínio de âncora deletado. Por exemplo seqüências correspondentes aos aminoácidos 1-713,1-549,225-549,225-529, 24-717,1-707,1-690,1-680,1-670,1-660,1-650,1-640,1-630,1-620,1-610, 1-600,34-707,44-697,36-689 de SEQ ID 76 ou seqüências tendo 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% identidade para SEQ ID 70 ou 20 ou 21.

Fragmento preferido com peptídeo de sinal deletado tem um resíduo de metionina no N- término do fragmento para assegurar uma translação correta.

Um fragmento mais preferido tem o seguinte sequência:- MBEHSVQDVKDSfflDOBLSDSHDQSSDEBMmOTQBITOlDJ^QlimBTIilimiGIEKRSSDHÍEigra VDBHBaTPLQKTPQDOTHLTEEEVKESSSVBSSHSSIDTAQQPSHTTINREESVQTSDlJVEDSttVSfiFANSKI

KESMmGKSmXBQPMKVKBDSTTSQPSQraiDEKlSMQDE

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^raTNKDGIQGDDEKGlSGVKVTI.EXíENGKIIBTTmiENGKYQFDNXiNSGMYIVHFDKPSGÍlTQTTTDSGD ddeodadgeevkvtjitdhddfsidngyydde EbhA e EbhB

EbhA e EbhB são proteínas que são expressadas em tanto S. aureus como S. epidermidis (Clarke e Foster Mect Immun. 2002,70; 6680, Williams et al Infect. Immun. 2002, 20; 6805) e que ligam a fibrmectina. Porque fibronectina é importante componente de matriz extracelular, EbhA e EbhB tem uma função importante na aderência de estafilococos na matriz extracelular do hospedeiro.

As proteínas Ebh são grandes, tendo um peso molecular de 1,1 megadaltons. E vantajoso usar um fragmento da proteína Ebh em vez da seqüência completa devido à facilidade de produção e formulação. A região central da proteína contém repetições imperfeitas que contém sítios de ligação de fibronectina. Fragmentos contendo um ou mais dos domínios de repetição descritos abaixo são fragmentos preferidos para incorporação na composição imunogênica da invenção.

As proteínas Ebh contém unidades de repetição imperfeitas de 127 aminoácidos em comprimento que são caracterizadas por conterem a seqüência de consenso: L.G. {10} A. {13} Q. {26} L...M..L. {33} A Preferivelmente .{19} L.G. {10} A. {13} Q. {26} L...M..L. {33} A. {12} Mais preferivelmente ► ..W..A...I/V..AK.ALN/DG..NL..AK..A. {6} L..LN.AQK..L..QI/V..A..V.. V. {6} A..LN/D.AM..L... I/V.D/E. „TK.S .N Y/F.N/D AD. .K.. AY/F.. A V. .A. .I/V.N/D. onde l. “ significa qualquer arainoácido de “.{10}’ significa quaisquer 10 aminoácidos e I/V indica escolhas alternativas de aminoácido.

Por referência à seqüência descrita em Kuroda et al (2001) Lancet 357; 1225-1240, e Tabela 2, as sequências de repetição dentro das proteínas Ebh são prontamente deduzidas.

Preferidos fragmentos a serem incluídos na composição imunogênica da invenção incluem polipeptídeos contendo dentre um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais do que 10 das 127 unidades de repetição de aminoácidos. Estes fragmentos podem consistir de 1, 2,3, 4,5, 6, 7, 8, 9, 10 ou more repetidos das 127 regiões de repetição de aminoácidos ou pode consistir de 1,2,3,4, 5, 6,7, 8,9,10 ou mais repetições dentro dos resíduos de aminoácidos adicionais presentes em uma ou ambas as extremidades do fragmento. Um outro fragmento preferido é o polipeptídeo H2 de cerca de 44kDa se estendendo nas três repetições (aminoácidos 3202-3595) como descrito em Clarke et al, Infection and Immunity 70,6680- 6687, 2002. Estes fragmentos serão preferivelmente capazes de ligar a fibronectina e/ou elicitar anticorpos que são reativos contra a proteína Ebh completa.

Os polipeptídeos Ebh são capazes de ligação a fibronectina. i Preferidos fragmentos destas sequências de polipeptídeos retém a capacidade de ligar a fibronectina, Ligação a fibronectina pode ser avaliada por ELISA como descrito por Clarke et al (Infection and Immunity 70; 6680-6687 2002).

Ainda outros preferidos fragmentos são os que compreendem uma célula B- ou epítopo auxiliar T, por exemplo os ffagmentos/peptídeos i descritos em Tabelas 3 e 4. TABELA 2- Seqüências de repetição na seqüência de comprimento completo de Ebh. A seqüência de comprimento completo de Ebh é descrita em Kuroda et al (2001) Lancet 357; 1225- 1240. A seguinte tabela mostra os resíduos de aminoácidos em que as 127 repetições de aminoácidos começam e terminam dentro da sequência de comprimento completo.

Tabela 3 - Previsão de epítopo de célula B para uma repetição de 127aminoácidos A seqüência de comprimento completo é descrita em Kuroda et al (2001) Lancet 357; 1225-1240. uma destas repetições, codificada por aminoácidos 3204-3331 da seqüência de comprimento completo foi escolhida para realizar uma previsão de epítopo: MDVNTVNQKAASVKSTKDALDGQQNLQRAKTEATNA1THASDLNQAQ

KNALTQ

QVNSAQNVHAVNDIKQTTQSLNTAMTGLKRGVANHNQWQSDNYVN

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NDYNNAYNHAKDIINGNAQHPVI - As colunas de “começo” e “final” apresentam a posição dos epítopos de células B previstos na repetição de 127 aminoácidos - As colunas “partida” e “parada” apresentam a posição dos epítopos de células B previstos seqüência de comprimento completo Ebh Tabela 4 Previsão de epítopo de célula T-auxiliar em Ebh: A seqüência de comprimento completo é descrita em base de dados TrEMBL, referência de seqüência Q8NWQ6. Uma destas repetições, codificada por aminoácidos 3204-3331 da seqüência de comprimento completo foi escolhida para realizar uma previsão de epítopo: MDVNTVNQKAASVKSTKDALDGQQNLQRAKTEATNAITHASDLNQ AQKNALTQ

QVNSAQNVHAVNDIKQTTQSLNTAMTGLKRGVANHNQVVQSDNYV

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NDYNNAYNHANDIINGNAQHPVI A coluna de “repetição de posição” apresenta a posição dos epítopos de células T previstos na repetição A coluna de “seqüêncía de posição” apresenta a posição dos epítopos de células T previstos na sequência de comprimento completo de Ebh Os fragmentos dos polipeptídeos da invenção podem ser empregados para produzir polipeptídeo de comprimento completo correspondentes por síntese de peptídeo; assim, estes fragmentos podem ser empregados como intermediários para produzir polipeptídeos de comprimento completo da invenção. São particularmente preferidas as variantes em que vários 5-10,1-5,1-3,1-2 ou 1 aminoácidos são substituídos, deletados ou adicionados em qualquer combinação.

Proteína de ligação de elastina ÍEbpS) EbpS é uma proteína contendo 486 aminoácidos com um peso molecular de 83kDa. Ele é associado com membrana citoplásmica de S. aureus e tem três regiões hidrofóbicas que mantém a proteína na membrana (Downer et al 2002, J. BioL Chem. 277; 243; Park et al 1996, J. Biol. Chem. 271; 15803).

Duas regiões entre aminoácidos 1-205 e 343-486 são expostas na superfície na face externa da membrana citoplásmica. O domínio de ligação de ligando de EbpS está localizado entre resíduos 14-34 no N-término (Park et al 1999, J. Biol. Chem. 274; 2845).

Um fragmento preferido a ser incorporado na composição imunogênica da invenção deve ser fragmento exposto na superfície contendo a região de ligação de elastina (aminoácidos 1-205). Alguns preferidos fragmentos não contém o laço exposto completo mas devem conter a região de ligação de elastina (aminoácidos 14-34), Um alternativo fragmento que deve ser usado consiste de aminoácidos formando o segundo laço exposto na superfície (aminoácidos 343-486). Alternativos fragmentos contendo até 1, 2, 5, 10, 20, 50 aminoácidos menores em uma ou ambas as extremidades são também possíveis.

Receptores de laminina O receptor de laminina de S. aureus desempenha um papel importante na patogenicidade. Um aspecto característico de infecção é a invasão na corrente sanguínea que permite a formação de um abscesso metastático difundido. A invasão na corrente sanguínea requer a capacidade de extravasar através da membrana de base vascular. Isto é obtido através da ligação a laminina através do receptor de laminina (Lopes et al Science 1985, 229; 275).

Os receptores de laminina são expostos na superfície e estão presentes em muitas cepas de estafilococos incluindo S. aureus e S. epidermidis.

SBI

Sbi é uma proteína tendo uma região de ligação de IgG e um domínio de ligação de apolipoproteína H e ela é expressada na maior parte das cepas de S.aureus (Zhang et al 1998, Microbiology 144; 985). O N-término da seqüência def Sbi tem uma sequência de sinal típica com um sítio de divagem após o aminoácido 29. Assim um fragmento preferido de Sbi a ser incorporado em uma composição imunogênica da invenção começa no resíduo de aminoácido 30,31,32 ou 33 e continua para o C-término de Sbi, por exemplo de SEQID NO: 26. O domínio de ligação de IgG de Sbi foi identificado como uma região para o N-término da proteína a partir dos aminoácidos 41-92. Este s domínio é homólogo para os domínios de ligação de IgG de proteína A. O domínio de ligação de IgG mínimo de Sbi contém a seguintes seqüência:- QTTQHNYVTDQQríAFYQVLHLKGITSEQRNQYIKTLREHPBRAQEVFSESLK ****** ***** * ** * - denota aminoácidos que são similares entre os domínios de ligação de IgG

Fragmento preferido de Sbi a ser incluído na composição imunogênica da invenção contém um domínio de ligação de IgG. Este fragmento contém a seqüência de consenso para um domínio de ligação de IgG como designado por * como mostrado na seqüência acima. Preferivelmente o fragmento contém ou consiste da seqüência completa mostrada acima. Mais preferivelmente, o fragmento contém ou consiste de aminoácidos 30-92, 33-92, 30-94, 33-94, 30-146, 33- 146, 30-150, 33-150, 30-160, 33-160, 33-170, 33-180, 33-190, 33-200, 33-205 ou 33-210 de Sbi, por exemplo de SEQ ID NO:26.

Fragmento preferido pode conter 1, 2,3,4, 5, 6,7, 8, 9,10 das substituições de aminoácidos das sequências indicadas.

Preferidos fragmentos podem conter repetições múltiplas (2,3, 4,5,6,7,8,9 ou 10) do domínio de ligação de IgG.

EFB-FIB

Fib é uma proteína de ligação de fibrinogênio 19kDa que é secretada no meio extracelular por S. aureus. Ele é produzido por todos os isolados de S aureus testados (Wastfelt e Flock 1995, J. Clin. Microbiol. 33; 2347).

S. aureus agrupa na presença de fibrinogênio e liga a superfícies revestidas com fibrinogênio. Esta capacidade facilita a colonização estafilocócica de catéteres e células endoteliais. Fib contém uma sequência de sinal no N-término da proteína com um sítio de divagem putativa em cerca de aminoácido 30. Assim um fragmento preferido a ser introduzido na composição imunogênica da invenção deve conter a seqüência da proteína madura (de cerca de aminoácido 30 para o C-término da proteína). IsaA/PisA

IsaA é uma proteína 29kDa, também conhecido como PisA, foi demonstrado como sendo uma proteína estafilocócica imunodominante durante sepsia em pacientes hospitalizados (Lorenz et al 2000, FEMS Immunol. Med. Microb. 29; 145).

Os primeiros 29 aminoácidos da seqüência de IsaA são pensados como sendo uma seqüência de sinal. Assim um fragmento preferido de IsaA a ser incluído em uma composição imunogênica da invenção deve conter resíduos de aminoácido 30 em diante, até o final da seqüência codificada.

Proteína de ligação de fibronectina Proteína de ligação de Fibronectina A (FnbA) é descrita em US5320951 e Schennings et al (1993, Microb. Pathog. 15; 227). Proteína de ligação de Fibronectina A contém vários domínios que estão envolvidos em ligação a fibronectina (WO 94/18327). Estes são chamados Dl, D2, D3 e D4.

Preferidos fragmentos de proteína de ligação de Fíbronectina A ou B compreendem ou consistem de Dl, D2, D3, D4, D1-D2, D2-D3, D3-D4, Dl-D3, D2-D4 ou D1-D4 (como descrito em WO 94/18327).

Proteína de ligação de Fíbronectina contém uma seqüência de sinal de 36 aminoácidos. Por exemplo: VKNNLRY GIRKHKLGAAS VFLGTMIW GMGQDKEAA Opcionalmente, a proteína madura omitindo esta seqüência de sinal é incluída na composição imunogênica da invenção.

Proteínas transportadoras A parede celular de bactérias Gram positivas atua como uma barreira evitando a difusão livre de metabólitos na bactéria, Uma família de proteínas orquestra a passagem de nutrientes essenciais na bactéria e são assim essenciais para a viabilidade da bactéria. O termo proteína transportadora cobre as proteínas envolvidas na etapa inicial de ligação para metabólitos como ferro assim como os envolvidos em realmente transporte de metabólitos na bactéria. O ferro molecular é um co-fator essencial para o crescimento bacteriano. Os siderofóros são secretados que ligam o ferro livre e então são capturados por receptores de superfície bacteriana que liberam ferro para transporte através da membrana citoplásmica. A aquisição de ferro é crítica para o estabelecimento de infecções humanas de modo que a geração de uma resposta imune contra esta classe de proteínas leva a uma perda da viabilidade estafilocócica.

Os exemplos de proteínas transportadoras incluem transportador ABC imunodominante (Bumie et al 2000 Infect. Imun. 68; 3200), IsdA (Mazmanian et al 2002 PNAS 99; 2293), IsdB (Mazmanian et al 2002 PNAS 99; 2293), Mg2+ transportador, SitC (Wiltshire e Foster 2001 Infect. Immun. 69; 5198) e transportador de Ni ABC.

Transportador de ABC imunodominante O transportador de ABC imunodominante é uma proteína bem conservada que pòde ser capaz de gerar uma resposta imune que é contra-protetora contra cepas diferentes estafilocócicas (Mei et al 1997, Mol. Microbiol. 26; 399). Anticorpos contra esta proteína foram encontrados em pacientes com septicemia (Bumie et al 2000, Infect. Immun. 68; 3200).

Os preferido s fragmentos de transportador de ABC imunodominante irão incluir os peptídeos DRHFLN, GNYD, RRYPF KTLLK, GVTTSLS, VDWLR, RGFL, mais preferivelmente KIKVYVGNYDFWYQS, TVIVVSHDRHFLYNNV e/ou TETFLRGFLGRMLFS porque estas sequências contém epítopos que são reconhecidos pelo sistema imune humano.

IsdA-lsdB

Os genes isd (determinante de superfície regulado por ferro) de S. aureus codificam proteínas responsáveis pela ligação de hemoglobina e passagem de heme ferro no citoplasma, onde atua como um nutriente essencial. IsdA e IsdB estão localizados na parede celular de estafilococos. IsdA parece estar exposto sobre a superfície de bactéria porque ele é susceptível à digestão de proteinase K. IsdB foi parcialmente digerido sugerindo que ele é parcialmente exposto sobre a superfície da bactéria (Mazmanian et al 2003 Science 299; 906).

IsdA e IsdB são ambos proteínas 29kDa que ligam heme. Sua expressão é regulada pela disponibilidade de ferro via o repressor Fur. Uma expressão será elevada durante a infecção em um hospedeiro onde a concentração de ferro será baixa.

Eles são também conhecidos como FrpA e FrpB (Morrissey et al 2002, Infect. Immun. 70; 2399). FrpA e FrpB são proteínas de superfície principal com uma carga elevada. Eles foram demonstrados como provendo uma contribuição principal pela adesão a plástico. Em uma forma de realização, a composição imunogênica da invenção compreende um fragmento de IsdA e/ou IsdB que é descrito em WO 01/98499 ou WO 03/11899.

Toxinas e reguladores de virulência Membros desta família de proteínas incluem toxina como alfa toxina, hemolisina, enterotoxina B e TSST-1 assim como proteínas que regulam a produção de toxinas como RAP.

Alfa toxina (HIa) Alfa toxina é um determinante de virulência importante produzido pela maioria das cepas de S.aureus. Ela é uma toxina formadora de poros com atividade hemolítica. Os anticorpos contra alfa toxina foram mostrados como neutralizando os efeitos prejudiciais e letais de alfa toxina em modelos de animais (Adiam et al 1977 Infect. Immun. 17; 250). Plaquetas humanas, células endoteliais e células mononucleares são susceptíveis aos efeitos de alfa-toxina. A alta toxicidade de alfa toxina requer que ela deve ser destoxificada antes de ser usada como um imunogene. Isto pode ser obtido por tratamento químico, por exemplo por tratamento com formaldeído, glutaraldeído, ou outros reagentes de reticulação, ou por conjugação química da mesma a polissacarídeos bacterianos como descrito abaixo.

Um outro modo de remover a toxicidade é introduzir mutações de pontos que removem a toxicidade enquanto retendo a antigenicidade da toxina, A introdução de uma mutação por pontos em aminoácido 35 de alfa toxina onde um resíduo de histidina é substituído com um resíduo leucina resulta na remoção de toxicidade enquanto retendo a imunogenicidade (Menzies e Kemodle 1996; Infect. Immun. 64; 1839). Histidina 35 para ser crítica para a apropriada oligomerização requerida para a formação de poros e mutação deste resíduo leva a perda de toxicidade.

Quando incorporada em composições imunogênicas da invenção, alfa toxina é preferivelmente destoxificada por mutação de His 35, o mais preferivelmente por substituição de His 35 com Leu ou Arg. Em uma alternativa forma de realização, alfa toxina é destoxificada por conjugação em outros componentes da composição imunogênica, preferivelmente polissacarídeos capsulares, o mais preferivelmente para polissacarídeo tipo V de S. aureus tipo V e/ou polissacarídeo tipo VIII de S. aureus e/ou PNAG. Proteína de ativação de RNAIIIÍRAPt RAP não é sozinho uma toxina, mas é um regulador da expressão de fatores de virulência. RAP é produzido e secretado por estafilococos. Ele ativa o sistema regulador de agr de outros estafilococos e ativa a expressão e subseqiiente liberação de fatores de virulência como hemolisina, enterotoxina B e TSST-1.

Uma resposta imune gerada contra RAP não deve matar a bactérias, mas deve interferir com sua patogenicidade. Isto tem a vantagem de prover uma pressão menos seletiva para novas cepas resistentes emergir.

Seria uma segunda vantagem produzir uma resposta imune que iria ser instrumental para reduzir a morbidez da infecção. É particularmente vantajoso combinar RAP com outros antígenos em uma vacina, particularmente onde o adicional antígeno deve fornecer uma resposta imune que é capaz de matar a bactéria.

Outras proteínas Proteína associada com acúmulo (Aap) Aap é uma proteína 140 kDa que é essencial para o acúmulo de cepas de S. epidermidis sobre superfícies (Hussain et al Infect. Immun. 1997, 65; 519). Cepas expressando esta proteína produziram quantidade significativamente grandes de biofilme Aap parece estar envolvido em formação de biofilme. Os anticorpos contra Aap são capazes de inibir a formação de biofilme e inibir o acúmulo de S. epidermidis, Um fragmento preferido de Aap é um domínio conservado compreendendo ou consistindo de aminoácidos 550-1069.

Antígeno secretório estafilocócico SsaA

SsaA é uma proteína fortemente imunogênica def 30 kDa encontrada em tanto S. aureus como S. epidermidis (Lang et al 2000 FEMS Immunol. Med. Microbiol. 29; 213). Sua expressão durante a endocardite sugeriu um papel de virulência específico para a patogênese da doença infecciosa, SsaA contém uma sequência de líder N-terminal e um sítio de divagem de peptidase de sinal. O peptídeo líder é seguido por uma região hidrofílica de aproximadamente 100 aminoácidos de resíduo 30 para resíduo 130.

Um fragmento preferido de SsaA a ser incorporado na composição imunogênica da invenção é feito da proteína madura (aminoácidos 27 a C-término ou aminoácidos 30 ao C-término).

Outros fragmentos preferidos contêm a área hidrofílica de SsaA do aminoácido 30 ao aminoácido 130.

Combinações preferidas Uma combinação preferida de proteínas na composição imunogênica da invenção compreende receptor de laminina e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos selecionados dentre o grupo consistindo de transportador de ABC imunodominante, IsdA, IsdB, Mg2+ transportador, SitC, transportador de Ni ABC, alfa toxina, alfa toxina mutante H35L OU H35R, RAP, Aap e SsaA, Uma outra combinação preferida de proteínas na composição imunogênica da invenção compreende SitC e 1,2, 3, 4 ou 5 outros antígenos selecionados dentre o grupo consistindo de transportador de ABC imunodominante, IsdA, IsdB, Mg2+ transportador, SitC, transportador de Ni ABC, alfa toxina, alfa toxina mutante H35L OU H35R, RAP, Aap e SsaA.

Uma outra combinação preferida de proteínas na composição imunogênica da invenção compreende EbhÀ e 1,2,3,4 ou 5 outros antígenos selecionados dentre o grupo consistindo de transportador de ABC imunodominante, IsdA, IsdB, Mg2+ transportador, SitC, transportador de Ni ABC, alfa toxina, alfa toxina mutante H35L OU H35R, RAP, Aap e SsaA.

Uma outra combinação preferida de proteínas na composição imunogênica da invenção compreende EbhB e 1,2,3,4 ou 5 outros antígenos selecionados dentre o gmpo consistindo de transportador de ABC imunodominante, IsdA, IsdB, Mg2+ transportador, SitC; transportador de Ni ABC, alfa toxina, alfa toxina mutante H35L OU H35R, RAP, Aap e SsaA.

Uma outra combinação preferida de proteínas na composição imunogênica da invenção compreende EbpS e 1,2, 3,4 ou 5 outros antígenos selecionados dentre o grupo consistindo de transportador de ABC imunodominante, IsdA, IsdB, Mg2+ transportador, SitC, transportador de Ni ABC, alfa toxina, alfa toxina mutante H35L OU H35R, RAP, Aap e SsaA.

Uma outra combinação preferida de proteínas na composição imunogênica da invenção compreende EFB(FIB) e I, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos selecionados dentre o grupo consistindo de transportador de ABC imunodominante, IsdA, IsdB, Mg2+ transportador, SitC, transportador de Ni ABC, alfa toxina, alfa toxina mutante H35L OU H35R, RAP, Aap e SsaA.

Uma outra combinação preferida de proteínas na composição imunogênica da invenção compreende SBI e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos selecionados dentre o grupo consistindo de transportador de ABC imunodominante, IsdA, IsdB, Mg2+ transportador, SitC, transportador de Ni ABC, alfa toxina, alfa toxina mutante H35L OU H35R, RAP, Aap e SsaA.

Uma outra combinação preferida de proteínas na composição imunogênica da invenção compreende autolisina e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos selecionados dentre o grupo consistindo de transportador de ABC imunodominante, IsdA, IsdB, Mg2+ transportador, SitC, transportador de Ni ABC, alfa toxina, alfa toxina mutante H35L OU H35R, RAP, Aap e SsaA.

Uma outra combinação preferida de proteínas na composição imunogênica da invenção compreende CIfA e 1,2,3,4 ou 5 outros antígenos selecionados dentre o grupo consistindo de transportador de ABC imunodominante, IsdA, IsdB, Mg2+ transportador, Site, transportador de Ni ABC, alfa toxina, alfa toxina mutante H35L OU H35R, RAP, Aap e SsaA.

Uma outra combinação preferida de proteínas na composição imunogênica da invenção compreende SdrC e 1,2,3,4 ou 5 outros antígenos selecionados dentre o grupo consistindo de transportador de ABC imunodominante, IsdA, IsdB, Mg2+ transportador, Site, transportador de Ni ABC, alfa toxina, alfa toxina mutante H35L OU H35R, RAP, Aap e SsaA.

Uma outra combinação preferida de proteínas na composição imunogênica da invenção compreende SdrG e 1,2, 3,4 ou 5 outros antígenos selecionados dentre o grupo consistindo de transportador de ABC imunodominante, IsdA, IsdB, Mg2+ transportador, Site, transportador de Ni ABC, alfa toxina, alfa toxina mutante H35L OU H35R e RAP.

Uma outra combinação preferida de proteínas na composição imunogênica da invenção compreende SdrH e 1, 2, 3,4 ou 5 outros antígenos selecionados dentre o grupo consistindo de transportador de ABC imunodominante, IsdA, IsdB, Mg2+ transportador, SitC, transportador de Ni ABC, alfa toxina, alfa toxina mutante H35L OU H35R, RAP, Aap e SsaA.

Uma outra combinação preferida de proteínas na composição imunogênica da invenção compreende Lipase GehD e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos selecionados dentre o grupo consistindo de transportador de ABC imunodominante, IsdA, IsdB, Mg2+ transportador, SitC, transportador de Ni ABC, alfa toxina, alfa toxina mutante H35L OU H35R, RAP, Aap e SsaA.

Uma outra combinação preferida de proteínas na composição imunogênica da invenção compreende SasA e 1,2, 3,4 ou 5 outros antígenos selecionados dentre o grupo consistindo de transportador de ABC imunodominante, IsdA, IsdB, Mg2+ transportador, SitC, transportador de Ni ABC, alfa toxina, alfa toxina mutante H35L OU H35R, RAP, Aap e SsaA.

Uma outra combinação preferida de proteínas na composição imunogênica da invenção compreende FnbA e 1,2,3,4 ou 5 outros antígenos selecionados dentre o grupo consistindo de transportador de ABC imunodominante, IsdA, IsdB, Mg2+ transportador, SitC, transportador de Ni ABC, alfa toxina, alfa toxina mutante H35L OU H35R, RAP, Aap e SsaA.

Uma outra combinação preferida de proteínas na composição imunogênica da invenção compreende FnbB e 1,2,3,4 ou 5 outros antígenos selecionados dentre o grupo consistindo de transportador de ABC imunodominante, IsdA, IsdB, Mg2+ transportador, SitC, transportador de Ni ABC, alfa toxina, alfa toxina mutante H35L OU H35R, RAP, Aap e SsaA.

Uma outra combinação preferida de proteínas na composição imunogênica da invenção compreende Cna e 1, 2, 3,4 ou 5 outros antígenos selecionados dentre o grupo consistindo de transportador de ABC imunodominante, IsdA, IsdB, Mg2+ transportador, Site, transportador de Ni ABC, alfa toxina, alfa toxina mutante H35L OU H35R, RAP, Aap e SsaA.

Uma outra combinação preferida de proteínas na composição imunogênica da invenção compreende CIfB e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos selecionados dentre o grupo consistindo de transportador de ABC imunodominante, IsdA, IsdB, Mg2+ transportador, Site, transportador de Ni ABC, alfa toxina, alfa toxina mutante H35L OU H35R, RAP, Aap e SsaA.

Uma outra combinação preferida de proteínas na composição imunogênica da invenção compreende FbpA e 1,2,3,4 ou 5 outros antígenos selecionados dentre o gmpo consistindo de transportador de ABC imunodominante, IsdA, IsdB, Mg2+ transportador, Site, transportador de Ni ABC, alfa toxina, alfa toxina mutante H35L OU H35R, RAP, Aap e SsaA.

Uma outra combinação preferida de proteínas na composição imunogênica da invenção compreende Npase e 1,2,3,4 ou 5 outros antígenos selecionados dentre o grupo consistindo de transportador de ABC imunodominante, IsdA, IsdB, Mg2+ transportador, Site, transportador de Ni ABC, alfa toxina, alfa toxina mutante H35L OU H35R, RAP, Aap e SsaA.

Uma outra combinação preferida de proteínas na composição imunogênica da invenção compreende IsaA/PisA e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos selecionados dentre o grupo consistindo de transportador de ABC imunodominante, IsdA, MB, Mg2+ transportador, SitC, transportador de Ni ABC, alfa toxina, alfa toxina mutante H35L OU H35R, RAP, Aap e SsaA.

Uma outra combinação preferida de proteínas na composição imunogênica da invenção compreende SsaA e 1, 2, 3,4 ou 5 outros antígenos selecionados dentre o grupo consistindo de transportador de ABC imunodominante, IsdA, IsdB, Mg2+ transportador, SitC, transportador de Ni ABC, alfa toxina, alfa toxina mutante H35L OU H35R, RAP, Aap e SsaA.

Uma outra combinação preferida de proteínas na composição imunogênica da invenção compreende EPB e 1, 2, 3,4 ou 5 outros antígenos selecionados dentre o grupo consistindo de transportador de ABC imunodominante, IsdA, IsdB, Mg2+ transportador, SitC, transportador de Ni ABC, alfa toxina, alfa toxina mutante H35L OU H35R, RAP, Aap e SsaA.

Uma outra combinação preferida de proteínas na composição imunogênica da invenção compreende SSP-1 e 1,2, 3,4 ou 5 outros antígenos selecionados dentre o grupo consistindo de transportador de ABC imunodominante, IsdA, IsdB, Mg2+ transportador, SitC, transportador de Ni ABC, alfa toxina, alfa toxina mutante H35L OU H35R, RAP, Aap e SsaA.

Uma outra combinação preferida de proteínas na composição imunogênica da invenção compreende SSP-2 e 1,2,3,4 ou 5 outros antígenos selecionados dentre o grupo consistindo de transportador de ABC imunodominante, IsdA, IsdB, Mg2+ transportador, SitC, transportador de Ni ABC, alfa toxina, alfa toxina mutante H3 5L OU H3 5R, RAP, Aap e SsaA.

Uma outra combinação preferida de proteínas na composição imunogênica da invenção compreende HPB e 1, 2, 3,4 ou 5 outros antígenos selecionados dentre o grupo consistindo de transportador de ABC imunodominante, IsdA, IsdB, Mg2+ transportador, SitC, transportador de Ni ABC, alfa toxina, alfa toxina mutante H35L OU H35R, RAP, Aap e SsaA.

Uma outra combinação preferida de proteínas na composição imunogênica da invenção compreende vitronectina proteína de ligação de e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos selecionados dentre o grupo consistindo de transportador de ABC imunodominante, IsdA, IsdB, Mg2+ transportador, SitC, transportador de Ni ABC, alfa toxina, alfa toxina mutante H35L OU H35R, RAP, Aap e SsaA.

Uma outra combinação preferida de proteínas na composição imunogênica da invenção compreende proteína de ligação de fibrinogênio e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos selecionados dentre o grupo consistindo de transportador de ABC imunodominante, IsdA, IsdB, Mg2+ transportador, SitC, transportador de Ni ABC, alfa toxina, alfa toxina mutante H35L OU H35R, RAP, Aap e SsaA.

Uma outra combinação preferida de proteínas na composição imunogênica da invenção compreende coagulase e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos selecionados dentre o grupo consistindo de transportador de ABC imunodominante, IsdA, IsdB, Mg2+ transportador, SitC, transportador de Ni ABC, alfa toxina, alfa toxina mutante H35L OU H35R, RAP, Aap e SsaA.

Uma outra combinação preferida de proteínas na composição imunogênica da invenção compreende Fig e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos selecionados dentre o grupo consistindo de transportador de ABC imunodominante, IsdA, IsdB, Mg2+ transportador, SitC, transportador de Ni ABC, alfa toxina, alfa toxina mutante H35L OU H35R, RAP, Aap e SsaA.

Uma outra combinação preferida de proteínas na composição imunogênica da invenção compreende MAP e 1,2,3,4 ou 5 outros antígenos selecionados dentre o grupo consistindo de transportador de ABC imunodominante, IsdA, IsdB, Mg2+ transportador, SitC, transportador de Ni ABC, alfa toxina, alfa toxina mutante H35L OU H35R, RAP, Aap e SsaA.

Uma outra combinação preferida de proteína na composição imunogênica da invenção compreende transportador de ABC imunodominante e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos selecionados dentre o grupo consistindo de receptor de laminina, proteína de ligação SitC/MntC/saliva, EbhA, EbhB, proteína de ligação de elastina (EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina, CIfA, SdrC, SdrG, SdrH, Lipase GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, CIfB, FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA, EPB,'SSP-1, SSP-2, HBP, proteína de ligação de vitronectina, proteína de ligação de fibrinogênio, coagulase, Fig, MAP, alfa toxina, alfa toxina mutante H35L OU H35R, RAP, Aap e SsaA.

Uma outra combinação preferida de proteína na composição imunogênica da invenção compreende IsdA e 1,2, 3,4 ou 5 outros antígenos selecionados dentre o grupo consistindo de receptor de laminina, proteína de ligação SitC/MntC/saliva, EbhA, EbhB, proteína de ligação de elastina(EbpS), EFB (FIB), SBi, autolisina, CIfA, SdrC, SdrG, SdrH, Lipase GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, CIfB, FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína de ligação de vitronectina, proteína de ligação de fibrinogênio, coagulase, Fig, MAP, alfa toxina, alfa toxina mutante H35L OU H35R, RAP, Aap e SsaA.

Uma outra combinação preferida de proteína na composição imunogênica da invenção compreende IsdB e 1,2, 3, 4 ou 5 outros antígenos selecionados dentre o grupo consistindo de receptor de laminina, proteína de ligação SitC/MntC/saliva, EbhA, EbhB, proteína de ligação de elastina(EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina, CIfA, SdrC, SdrG, SdrH, Lipase GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, CIfB, FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína de ligação de vitronectina, proteína de ligação de fibrinogênio, coagulase, Fig, MAP, alfa toxina, alfa toxina mutante H35L OU H35R, RAP, Aap e SsaA.

Uma outra combinação preferida de proteína na composição imunogênica da invenção compreende SitC e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos selecionados dentre o grupo consistindo de receptor de laminina, proteína de ligação SitC/MntC/saliva, EbhA, EbhB, proteína de ligação de elastina(EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina, CIfA, SdrC, SdrG, SdrH, Lipase GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína de ligação de vitronectina, proteína de ligação de fibrinogênio, coagulase, Fig, MAP, alfa toxina, alfa toxina mutante H35L OU H35R, RAP, Aap e SsaA.

Uma outra combinação preferida de proteína na composição imunogênica da invenção compreende alfa toxina e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos selecionados dentre o grupo consistindo de receptor de laminina, proteína de ligação SitC/MntC/saliva, EbhA, EbhB, proteína de ligação de elastina(EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina, CIfA, SdrC, SdrG, SdrH, Lipase GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP- 2, HBP, proteína de ligação de vitronectina, proteína de ligação de fibrinogênio, coagulase, Fig, MAP, transportador de ABC imunodominante, IsdA, IsdB, Mg2+ transportador, SitC, transportador de Ni ABC, Aap e SsaA.

Uma outra combinação preferida de proteína na composição imunogênica da invenção compreende alfa toxina H35L ou H35R variante 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos selecionados dentre o grupo consistindo de receptor de laminina, proteína de ligação SitC/MntC/saliva, EbhA, EbhB, proteína de ligação de elastina(EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina, CIfA, SdrC, SdrG, SdrH, Lipase GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína de ligação de vitronectina, proteína de ligação de fibrinogênio, coagulase, Fig, MAP, transportador de ABC imunodominante, IsdA, IsdB, Mg2+ transportador, SitC, transportador de Ni ABC, Aap e SsaA.

Uma outra combinação preferida de proteína na composição imunogênica da invenção compreende RAP e 1,2, 3, 4 ou 5 outros antígenos selecionados dentre o grupo consistindo de receptor de laminina, proteína de ligação SitC/MntC/saliva, EbhA, EbhB, proteína de ligação de elastina(EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina, CIfA, SdrC, SdrG, SdrH, Lipase GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, CIfB, FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína de ligação de vitronectina, proteína de ligação de fibrinogênio, coagulase, Fig, MAP, transportador de ABC imunodominante, IsdA, IsdB, Mg2+ transportador, SitC, transportador de Ni ABC, Aap e SsaA.

Uma outra combinação preferida de proteína na composição imunogênica da invenção compreende Aap e 1, 2, 3,4 ou 5 outros antígenos selecionados dentre o grupo consistindo de receptor de laminina, proteína de ligação SitC/MntC/saliva, EbhA, EbhB, proteína de ligação de elastina(EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina, CIfA, SdrC, SdrG, SdrH, Lipase GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, CIfB, FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína de ligação de vitronectina, proteína de ligação de fibrinogênio, coagulase, Fig, MAP, transportador de ABC imunodominante, IsdA, IsdB, Mg2+ transportador, SitC, transportador de Ni ABC, RAP, alfa toxina e alfa toxina H35L OU H35R.

Uma outra combinação preferida de proteína na composição imunogênica da invenção compreende SsaA e 1,2, 3,4 ou 5 outros antígenos selecionados dentre o grupo consistindo de receptor de laminina, proteína de ligação SitC/MntC/saliva, EbhA, EbhB, proteína de ligação de elastina(EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina, CIfA, SdrC, SdrG, SdrH, Lipase GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, CIfB, FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína de ligação de vitronectina, proteína de ligação de fibrinogênio, coagulase, Fig, MAP, transportador de ABC imunodominante, IsdA, IsdB, Mg2+ transportador, SitC, transportador de Ni ABC, RAP, alfa toxina e alfa toxina H35L OU H35R.

Os inventores demonstraram que alguns antígenos produzem juma resposta imune particularmente eficaz dentro do contexto da mistura de antígenos. Assim, um a forma de realização da invenção é uma composição imunogênica compreendendo IsaA e uma proteína transportadora estafilocócica, ou IsaA e um regulador estafilocócico de virulência ou toxina, ou compreendendo Sbi e uma proteína transportadora estafílocócica, ou Sbi e um regulador estafilocócico de virulência ou toxina, ou compreendendo SdrC e uma proteína transportadora estafilocócicas, ou SdrC e um regulador estafilocócico de virulência ou toxina, ou IsaA e Sbi, ou IsaA e SdrC, ou IsaA e autolisina, ou IsaA e Ebh, ou Sbi e SdrC, ou Sbi e autolisina, ou Sbi e Ebh, ou SdrC e autolisina, ou SdrC e Ebh, ou autolisina- glucosaminidase e Ebh. Para cada uma destas combinações, as proteínas podem ser de comprimento completo ou fragmentos, tendo seqüências pelo menos 85%, 90%, 95%, 98% ou 100% idênticas às das seqüências da figura 1. Nas combinações acima e abaixo, as proteínas especificadas podem estar opcionalmente presentes na composição imunogênica da invenção como um fragmento ou proteína de fusão como descrito acima, As composições imunogênicas preferidas da invenção não incluem as seqüências de proteína descritas em WO02/094868.

Combinações de três proteínas Uma composição imunogênica preferida da invenção contém três componentes de proteínas em uma combinação de alfa-toxina, uma proteína de ligação de componente extracelular (preferivelmente uma adesina) e uma proteína transportadora (preferivelmente uma proteína de ligação de ferro).

Em tal combinação, a alfa toxina pode ser quimicamente destoxificada ou geneticamente destoxificada por introdução de mutação(ões) de pontos, preferivelmente a mutação por pontos His35Leu. A alfa toxina está presente como uma proteína livre ou altemativamente é conjugada a um polissacarídeo ou componente LTA da imunogênica composição.

As combinações preferidas incluem:- Uma composição imunogênica compreendendo alfa toxina, IsdA e um componente extracelular de proteína de ligação selecionado dentre o grupo consistindo de receptor de laminina, proteína de ligação SitC/MntC/saliva, EbhA, EbhB, proteína de ligação de elastina(EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina, CIfA, SdrC, SdrG, SdrH, Lipase GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, CIfB, FbpA, Npase, isaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína de ligação de vitronectina, proteína de ligação de fibrinogênio, coagulase, Fig e MAP.

Uma composição imunogênica compreendendo alfa toxina, IsdB e um componente extracelular de proteína de ligação selecionado dentre o grupo consistindo de receptor de laminina, proteína de ligação SitC/MntC/saliva, EbhA, EbhB, proteína de ligação de elastina(EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina, CIfA, SdrC, SdrG, SdrH, Lipase GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, CIfB, FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína de ligação de vitronectina, proteína de ligação de fibrinogênio, coagulase, Fig e MAP.

Uma composição imunogênica compreendendo alfa toxina, IsdA e uma adesina selecionada dentre o grupo consistindo de receptor de laminina, EbhA, EbhB, proteína de ligação de elastina(EbpS), EFB (FIB), CIfA, SdrC, SdrG, SdrH, autolisina, FnbA, FnbB, Cna, CIfB, FbpA, Npase, SSP-1, SSP-2, proteína de ligação de vitronectina, proteína de ligação de fibrinogênio, coagulase, Fig e MAP.

Uma composição imunogênica compreendendo alfa toxina, IsdB e uma adesina selecionada dentre o gmpo consistindo de receptor de laminina, EbhA, EbhB, proteína de ligação de elastina(EbpS), EFB (FIB), autolisina, CIfA, SdrC, SdrG, SdrH, FnbA, FnbB, Cna, CIfB, FbpA, Npase, SSP-1, SSP-2, proteína de ligação de vitronectina, proteína de ligação de fibrinogênio, coagulase, Fig e MAP.

Uma composição imunogênica compreendendo alfa toxina, IsdA e receptor de laminina.

Uma composição imunogênica compreendendo alfa toxina, IsdA e EbhA.

Uma composição imunogênica compreendendo alfa toxina, IsdA e EbhB.

Uma composição imunogênica compreendendo alfa toxina, IsdA e EbpS.

Uma composição imunogênica compreendendo alfa toxina, IsdA e EFB (FIB).

Uma composição imunogênica compreendendo alfa toxina, IsdAeSdrG.

Uma composição imunogênica compreendendo alfa toxina, IsdAeCIfA.

Uma composição imunogênica compreendendo alfa toxina, IsdA e CIfB.

Uma composição imunogênica compreendendo alfa toxina, IsdA e FnbA.

Uma composição imunogênica compreendendo alfa toxina, IsdA e coagulase.

Uma composição imunogênica compreendendo alfa toxina, IsdA e Fig.

Uma composição imunogênica compreendendo alfa toxina, IsdA e SdrH.

Uma composição imunogênica compreendendo alfa toxina, IsdAe Uma composição imunogênica compreendendo alfa toxina, IsdA e MAP.

Uma composição imunogênica compreendendo IsaA e Sbi.

Uma composição imunogênica compreendendo IsaA e IsdB.

Uma composição imunogênica compreendendo IsaA e IsdA.

Uma composição imunogênica compreendendo IsaA e SdrC.

Uma composição imunogênica compreendendo IsaA e Ebh ou fragmento dos mesmos como descrito acima.

Uma composição imunogênica compreendendo Sbi e SdrC.

Uma composição imunogênica compreendendo Sbi e Ebh ou fragmento dos mesmos como descrito acima.

Uma composição imunogênica da invenção compreendendo IsaA, Sbi ou SdrC.

Seleção de antígenos expressa em diferentes linhagens clonais A análise da ocorrência de fatores de virulência com relação à estrutura da população de Staphylococcus aureus mostrou uma presença variável de genes de virulência em populações naturais de S. aureus.

Dentre os isolados clínicos de Staphylococcus aureus, pelo menos cinco linhagens clonais como mostrada como altamente prevalentes (Booth et al., 2001 Infect Immun. 69(1):345-52). Alfa- hemolisina (hla), -proteína de ligação de fibronectina A (fribA) e fator de formação de grupos A {elf A) foram demonstrado como estando presentes na maior parte dos isolados, apesar de sua identidade de linhagem, sugerindo um papel importantes nestas proteínas na sobrevivência de S. aureus (Booth et al., 2001 Infect Immun. 69(1 ):345-52). Além disso, de acordo com Peacock et al. 2002, as distribuições de fiibA, elf A, coagulase, spa, map, pvl (leucocidina de Panton-Valentine), hlg (gama-toxina), alfa-toxina e ica pareceram não estar relacionados com a estrutura clonagem subjacente sugerindo uma transferência horizontal considerável destes genes.

Em contrário, outros genes de virulência como proteína de ligação de Fibronectina B (fhbB), beta- hemolisina (hlb), proteína de ligação de colágeno (cna), TSST-1 (tst) e gene de resistência a meticilina (mecA) são fortemente associados com linhagens específicas (Booth et al., 2001 Infect Irrnnun. 69(1):345-52). Similarmente, Peacock et al. 2002 (Infect Immun. 70(9):4987-96) mostraram que as distribuições das enterotoxinas, tst, as exfolatinas (eta e etb), beta- e delta-toxinas, os genes sdr (sdrD, sdrE e bbp), cna, ebpS e efb dentro da população estão todos altamente significativamente relacionados com os complexos clonais derivados de MLST.

Os dados de MLST não fornecem evidência de que cepas responsáveis por doença nossocomial representam uma subpopulação distinta de cepas causando doença adquirida na comunidade ou cepas recuperadas de veículos assintomáticos (Feil et al., 2003 J Bacteriol. 185(11):3307-16).

As composições imunogênicas preferidas da invenção são eficazes contra estafilococos de diferentes linhagens clonais. Em uma forma de realização, isto é obtido incluindo 1,2, 3,4, preferivelmente pelo menos 1 proteína que é expressa na maior parte dos isolados de estafilococos. Exemplos destas proteínas incluem alfa-hemolisina (hla), -proteína de ligação de fibronectina A (fiihA) e fator de formação de grupos A (clfA), coagulase, spa, map, pvl (leucocidina Panton-Valentine), hlg (gama-toxina) e ica. Os requerentes também identificaram transportador de ABC imunodominante, RAP, autolisina (Rupp et al 2001, J. Infect. Dis. 183; 1038), receptores de laminina, SitC, IsaA/PisA, SPOIIIE (), SsaA, EbpS, SasF (Roche et al 2003, Microbiology 149; 643), EFB(FIB), SBI, CIfB, IsdA, IsdB, FnbB, Npase, EBP, proteína de ligação sialo de osso II, IsaB/PisB (Lorenz et al FEMS Immuno. Med. Microb. 2000, 29; 145), SasH (Roche et al 2003, Microbiology 149; 643), MRPI, SasD (Roche et al 2003, Microbiology 149; 643), SasH (Roche et al 2003, Microbiology 149; 643), precursor de aureolisina (AUR)/Seppl e autolisina nova.

Em uma alternativa forma de realização, 2 ou mais proteínas que são expressas em diferentes conjuntos de cepas clonais são incluídas na composição imunogênica da invenção. Preferivelmente a combinação de antígenos irá permitir uma resposta imune a ser gerada que é eficaz contra cepas clonais múltiplas, o mais preferivelmente contra todas as cepas clonais. Preferidas combinações incluem FnbB e beta-hemolisina, FnbB e Cna, FnbB e TSST-1, FnbB e mecA, FnbB e SdrD, FnbB e SdrF, FnbB e EbpS, FnbB e Efb, beta- hemolisina e Cna, beta-hemolisina e TSST-1, beta-hemolisina e mecA, beta- hemolisina e SdrD, beta-hemolisina e SdrF, beta-hemolisina e EbpS, beta- hemolisina e Efb, Cna e TSST-1, Cna e mecA, Cna e SdrD, Cna e SdrF, Cna e EbpS, Cna e Efb, TSST-1 e mecA, TSST-1 e SdrD, TSST-1 e SdrF, TSST-1 e EbpS, TssT-1 e Efb, MecA e SdrD, MecA e SdrF, MecA e EbpS, MecA e Efb, SdrD e SdrF, SdrD e EbpS, SdeD e Efb, SdrF e EbpS, SdrF e Efb, e, EbpS e Efb.

As preferidas combinações descritas acima podem ser combinadas com componentes adicionais descritos abaixo.

Seleção de antígenos expressados durante fases de crescimento diferentes Os estafilococos passam através de uma fase de crescimento exponencial durante a qual um conjunto particular de proteínas será expresso. Estes incluem muitas das proteínas de ligação de componente extracelular e proteínas transportadoras. Após um período de crescimento exponencial, os estafilococos revertem para uma fase pós- exponencial durante a qual o crescimento é menor e a expressão de proteína é modulada. Muitas das proteínas expressas durante a fase de crescimento exponencial são reguladas de modo negativo, enquanto as outras proteínas, como enzimas e a maior parte das toxinas, incluindo alfa toxina, são expressas em níveis maiores.

As preferidas composições imunogênicas da invenção compreendem uma proteína expressada em níveis maiores durante fase de crescimento e uma proteína expressada em níveis maiores durante a fase pós-exponencial. “Níveis maiores” se referem ao nível de expressão sendo maior em uma fase em comparação com outra fase.

Em uma forma de realização preferida, a composição imunogênica da invenção compreende alfa toxina e uma proteína de ligação de componente extracelular (preferivelmente FnbA, FnbB, CIfA e CIfB) ou uma transportador proteína.

Mais preferivelmente, ela compreende alfa toxina ou Cna ou Lipase GehD e uma proteína selecionada dentre o grupo consistindo de receptor de laminina, proteína de ligação SitC/MntC/saliva, proteína de ligação de elastina (EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina, CIfA) SdrC, SdrG, SdrH, SasA, FnbA, FnbB, CIfB, FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína de ligação de vitronectina, proteína de ligação de fibrinogênio, coagulase, Fig e MAP, transportador ABC imunodominante, IsdA, IsdB, Mg2+ transportador, SitC, transportador de Ni ABC, Aap e SsaA.

Nas combinações descritas acima, a alfa toxina pode ser geneticamente ou quimicamente destoxificada, como descrito acima, e pode ser não conjugada ou conjugada ao polissacarídeo como descrito abaixo. Polissacarídeos As composições imunogênicas da invenção preferivelmente compreendem polissacarídeos capsulares incluindo um ou mais dentre PIA (também conhecidos como PNAG) e/ou polissacarídeo capsular de S, aureus Tipo V e/ou polissacarídeo capsular de S. epidermidis tipo VIII e/ou tipo I, e/ou tipo II e/ou tipo III. PIA (PNAG) Agora é evidente que as várias formas de polissacarídeos de superfície estafilocócica identificados como PS/A, PIA e SAA são a mesma entidade química - PNAG (Maira-Litran et al Vaccine 22; 872-879 (2004)). Assim o termo PIA ou PNAG engloba todos estes polissacarídeos ou oligossacarídeos derivados dos mesmos. PIA é uma adesina intercelular de polissacarídeo e é composta de um polímero de /3-(1 -> 6)- glucosamina ligada substituída com componentes N-acetila e O-succinila; Este polissacarídeo está presente em ambos S, aureus e S, epidermidis e pode ser isolado de ambas as fontes (Joyce et al 2003, Carbohydrate Research 338; 903; Maira-Litran et al 2002, Infect. Imun. 70; 4433). Por exemplo, PNAG pode ser isolado de S. aureus cepa MN8m(WO 04/43407). PIA isolado de S. epidermidis é um constituinte integral de biofílme. Ele é responsável por mediar a adesão célula-célula e provavelmente também funciona para proteger a colônia de crescimento da resposta imune do hospedeiro. O polissacarídeo previamente conhecido como poli-N-succinil-/3-(l -> 6)-glucosamina (PNSG) foi recentemente mostrado como não tendo a estrutura esperada porque a identificação de N- succinilação estava incorreta (Maira-Litran et al 2002, Infect. Imun. 70; 4433). Assim o polissacarídeo anteriormente conhecido como PNSG e agora verificado como sendo PNSG é também englobado pelo termo PIA. PIA (ou PNAG) pode ser de tamanhos diferentes variando de acima de 400 kDa a entre 75 e 400 kDa a entre 10 e 75kDa para oligossacarídeos compostos de até to 30 unidades de repetição (de /3-(1 -* 6)-glucosamina ligada substituída com constituintes N-acetil e O-succinil). Qualquer tamanho de polissacarídeo ou oligossacarídeo de PIA pode ser usado em uma composição imunogênica da invenção, no entanto um tamanho de acima de 40 kDa é preferido. O tamanho pode ser obtido por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo por microfluidização, irradiação ultrassônica ou por divagem química (WO 03/53462, EP497524, EP497525).

As faixas de tamanho preferidas de PIA (PNAG) são 40-400 kDa, 40-300 kDa, 50-350 kDa, 60-300 kDa, 50-250 kDa e 60-200 kDa. PIA (PNAG) pode ter diferentes graus de acetilação devido à substituição dos grupos amino por acetato. O PIA produzido in vitro é quase completamente substituído em grupos amino (95- 100%). Altemativamente, um PIA desacetilado (PNAG) pode ser usado tendo menos do que 60%, preferivelmente menos do que 50%, 40%, 30%, 20%, 10% acetilação. Uso de um PIA desacetilado (PNAG) é preferido por epítopos não acetilados de PNAG são eficazes em mediar a morte opsônica de bactérias Gram positivas, preferivelmente S. aurrn e/ou S. epidermidis. O mais preferivelmente, PIA (PNAG) tem um tamanho entre 40 kDa e 300 kDa e é desacetilado de modo que menos do que 60%, 50%, 40%, 30% ou 20% de grupos amino são acetilados. O termo PNAG desacetilado (dPNAG) refere-se a polissacarídeo ou oligossacarídeo PNAG em que menos do que 60%, 50%, 40%, 30%, 20% ou 10% dos grupos amino são acetilados.

Em uma forma de realização, PNAG é um desacetilado para formar dPNAG quimicamente tratando o polissacarídeo nativo. Por exemplo, o PNAG nativo é tratado com uma solução básica de modo que o pH se eleva a acima de 10. Por exemplo, o PNAG é tratado com 0,1 -5M, 0,2-4M, 0,3-3M, 0,5-2M, 0,75-1,5 M ou 1 M NaOH, KOH ou NH40H. Tratamento é por pelo menos 10 ou 30 minutos, ou 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 ou 20 horas a temperatura de 20-100,25-80, 30-60 ou 30-50 ou 35-45 °C. dPNAG pode ser preparado como descrito em WO 04/43405. O polissacarídeo (s) incluído (s) na composição imunogênica da invenção é (são) preferivelmente conjugado (a) a uma proteína carreadora como descrito abaixo ou altemativamente não conjugado.

Polissacarídeos Tipo 5 e Tipo 8 de S. aureus A maior parte das cepas de S. aureus que causam infecção no homem contém polissacarídeos ou de Tipo 5 ou Tipo 8. Aproximadamente 60% de cepas humanas são de Tipo 8 e aproximadamente 30% são Tipo 5. As estruturas de antígenos de polissacarídeo capsular de Tipo 5 e Tipo 8 são descritas em Moreau et al Carbohydrate Res. 201; 285 (1990) e Foumier et al Infect. Immun. 45; 87 (1984). Ambas tem um FucNAcp em sua unidade de repetição, assim como ManNAcA que pode ser usado para introduzir um grupo sulfidrila. As estruturas foram registradas como: Tipo 5 4)-jS-D-ManNAcA(30Ac)-(l -* 4)-a-L-FucNAc(l -+ 3)-/3- D-FucNAc-(l Tipo 8 ■+ 3)-/3-D"ManNAcA(40Ac)-( 1 -+3)-a-L-FucNAc(l -» 3)-/3-D-FucNAc-(l -+ Recentemente (Jones Carbohydrate Research 340, 1097-1106 (2005)) por espectroscopia de RMN revisou em estruturas para: Tipo 5 4)-/3-D-ManNAcA-(l -+ 4)-a-L-FucNAc(30Ac)-(l -+3)-/3- D-FucNAc-(l ->

Tipo 8 3)-/3-D-ManNAcA(40Ac)-(l -> 3)-a-L-FucNAc(l -+3)-0- D-FucNAc (1-3 Polissacarídeos podem ser extraídos da cepa apropriada de S. aureus usando método bem conhecido do versado, por exemplo como descrito em US6294177. Por exemplo, ATCC 12902 é uma cepa de S. aureus tipo 5 e ATCC 12605 é uma cepa de S. aureus tipo 8.

Polissacarídeos são de tamanho nativo ou altemativamente podem ser dimensionados, por exemplo por microfluidização, irradiação ultrassônica ou por tratamento químico. A invenção também cobre oligossaearídeos derivados de polissacarídeos tipo 5 e 8 de S. aureus. Os polissacarídeos tipo 5 e 8 incluídos na composição imunogênica da invenção são preferivelmente conjugados a uma proteína carreadora como descrito abaixo ou são altemativamente não conjugados.

As composições imunogênicas da invenção altemativamente contém polissacarídeo ou de tipo 5 ou tipo 8.

Antígeno 336 de S. aureus Em uma forma de realização, a composição imunogênica da invenção compreende o antígeno 336 de S, aureus descrito em US6294177. O antígeno 336 compreende hexosamina /3-ligada. não contém grupos O-acetila e especificamente liga a anticorpos para S.. aureus Tipo 336 depositado sob ATCC 55804.

Em uma forma de realização, o antígeno 336 é um polissacarídeo que é de tamanho nativo ou altemativamente pode ser dimensionado, por exemplo por microfluidização, irradiação ultrassônica ou por tratamento químico. A invenção também cobre oligossacarídeos derivados do antígeno 336. O antígeno336, quando incluído na composição imunogênica da invenção é preferivelmente conjugado a uma proteína carreadora como descrito abaixo ou são altemativamente não conjugados.

Polissacarídeos Tipo I. II e III de S. epidemidis Cepas ATCC-31432, SE-360 e SE-10 de S. epidermidis são característica de três tipos diferentes capsulares, I, II e III respectivamente (lchiman e Yoshida 1981, J. Appl. Bacterid. 51; 229). Polissacarídeos Capsulares extraídos de cada sorotipo de S, epidermidis constituem os polissacarídeos de tipo I, II e III. Polissacarídeos podem ser extraídos por vários métodos incluindo os métodos descritos em US4197290 ou como descrito em lchiman et al 1991, J. Appl. Bacterid. 71; 176.

Em uma forma de realização da invenção, a composição imunogênica compreende polissacarídeos tipo I e/ou II e/ou III ou oligossacarídeos de S. epidermidis.

Polissacarídeos são de tamanho nativo ou altemativamente podem ser dimensionados, por exemplo por microfluidização, irradiação ultrassônica ou divagem química. A invenção também cobre oligossacarídeos extraídos de cepas de S. epidermidis.

Estes polissacarídeos são não conjugados ou são preferivelmente conjugados como descrito abaixo.

Conjugação de polissacarídeos Dentre os problemas associados com o uso de polissacarídeos em vacinação, é o fato de que os polissacarídeos são, per se, imunogenes fracos. As estratégias, que foram projetadas para superar esta falta de imunogenicidade, incluem a ligação do polissacarídeo a veículos de proteína grandes, que proveem ajuda de célula T suplementar. Prefere-se que os polissacarídeos usados na invenção sejam ligados a um veículo de proteína que provê uma ajuda de célula T suplementar. Os exemplos destes veículos, que podem ser conjugados a imunogenes de polissacarídeos incluem os toxóides de difteria e tétano (DT, DT crml97 e TT respectivamente), hemociana de lapa (KLH), e o derivado purificado de proteína de Tuberculina (PPD), exoproteína A de Pseudomonas aeruginosa (rEPA), proteína D de Haemophilus influenzae, pneumolisina ou fragmentos de qualquer um dos acima. Os fragmentos apropriados para uso incluem os fragmentos englobando os epítopos de auxiliar T. Particularmente, o fragmento de proteína D irá preferivelmente conter o N-terminal 1/3 de proteína. A proteína D é uma proteína de ligação a IgD de Haemophilus influenzae (EP 0 594 610 BI) e é um imunogene potencial.

Além disso, as proteínas estafilocócicas podem ser usadas como proteína carreadora nos conjugados de polissacarídeo da invenção. As proteínas estafilocócicas descritas abaixo podem ser usadas como proteína carreadora; por exemplo, receptor de laminina, proteína de ligação SitC/MntC/saliva, EbhA, EbhB, proteína de ligação de elastina(EbpS), EFB (FIB), SBI, CIfA, SdrC, SdrG, SdrH, Lipase GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína de ligação de vitronectina, proteína de ligação de fibrinogênio, coagulase, Fig, MAP, transportador de ABC imunodominante, IsdA, IsdB, Mg2+ transportador, SitC, transportador de Ni ABC, alfa toxina (HIa)i mutante H35R de alfa toxina, proteína de ativação de RNAIII (RAP), ou fragmentos dos mesmos.

Uma nova proteína carreadora que seria particularmente vantajosa de usar no contexto das vacinas estafilocócicas é alfa toxóide estafilocócico; A forma nativa pode ser conjugada a um polissacarídeo porque o processo de conjugação reduz a toxicidade. Preferivelmente uma alfa toxina geneticamente destoxificada, como as variantes His35Leu ou His 35 Arg são usadas como veículos porque a toxicidade residual é menor. Altemativamente, a alfa toxina é quimicamente destoxificada por tratamento com um reagente de reticulação, formaldeído ou glutaraldeído. Uma alfa toxina geneticamente destoxificada é opcionalmente quimicamente destoxificada, preferivelmente por tratamento com um reagente de reticulação, formaldeído ou glutaraldeído para ainda reduzir a toxicidade.

Os polissacarídeos pode ser ligados à(s) proteína(s) carreadora(s) por qualquer método conhecido (por exemplo, por Likhite, patente US4,372,945 por Armor et al., patente US4,474,757, e Jennings et al, patente US4,356,170). Preferivelmente, a química de conjugação CD AP é realizada (ver WO95/08348).

Em CD AP, o reagente de cianilação tetrafluoroborato de 1-ciano-dimetilaminopirídio (CDAP) é preferivelmente usado para a síntese de conjugados polissacarídeo-proteína. A reação de cianilação pode ser realizada sob condições relativamente suaves, que evita a hidrólise dos polissacarídeos sensíveis alcalinos. Esta síntese permite a copulação direta a uma proteína carreadora. O polissacarídeo é solubilizado em água ou solução salina. CDAP é dissolvido em acetonitrila e adicionado imediatamente à solução de polissacarídeo, O CDAP reage com grupos hidroxila do polissacarídeo para formar um éster de cianado. Após a etapa de ativação, a proteína carreadora é adicionada. Os grupos Amino de lisína reagem com o polissacarídeo ativado para formar uma ligação covalente de isouréia. Após a reação de copulação, um excesso grande de glicina é então adicionado para extinguir grupos funcionais residuais ativados. O produto é então passado através de uma coluna de permeação de gel para remover a proteína carreadora não reagida e reagentes residuais.

Conjugação preferivelmente envolve produzir uma ligação direta entre a proteína carreadora e polissacarídeo. Opcionalmente um espaçador (como di-hidreto adípico (ADH)) pode ser introduzido entre a proteína carreadora e o polissacarídeo.

Proteção contra S. aureus e S, epidermidis Em uma forma de realização preferida da invenção, a composição imunogênica provê uma resposta imune eficaz contra mais do que uma cepa de estafilococos, preferivelmente contra cepas de ambos S. aureus e S. epidermidis. Mais preferivelmente, uma resposta imune protetora é gerada contra sorotipos tipo 5 e 8 de S. aureus. Mais preferivelmente, uma resposta imune protetora é gerada contra cepas múltiplas de S. epidermidis, por exemplo de cepas def pelo menos dois dos sorotipos I, II e III de S. epidermidis.

Um uso da composição imunogênica da invenção é prevenir as infecções nossocomiais por inoculação antes do tratamento hospitalar. Neste estágio, é difícil prever com precisão a quais cepas estafilocócicas o paciente estará exposto. Assim, é vantajoso inocular com a vacina que é capaz de gerar uma resposta imune eficaz contra várias cepas de estafilococos.

Uma resposta imune eficaz é definida como uma resposta imune que dá uma significante proteção em um modelo de desafio de camundongo ou teste de opsonofagocitose como descrito nos exemplos. Significante proteção em um modelo de desafio de camundongo, por exemplo o do exemplo 5, é definido como um aumento em LD50 em comparação com camundongos inoculados com veículo de pelo menos 10%, 20%, 50%, 100% ou 200%. Significante proteção em um modelo de desafio de rato do algodão, por exemplo o do exemplo 8, é definido como uma diminuição no LogCFU/focinho médio observado de pelo menos 10%, 20%, 50%, 70% ou 90%. A presença de anticorpos opsonisantes é conhecida como correlacionada com proteção, assim significante proteção é indicada por uma diminuição na contagem bacteriana de pelo menos 10%, 20%, 50%, 70% ou 90% em um teste de opsonofagocitose, por exemplo o do exemplo 7. Vários das proteínas incluindo transportador de ABC imunodominante, proteína de ativação de RNA III, Receptores de laminina, SitC, IsaA/PisA, SsaA, EbhA/EbhB, EbpS e Aap são bem conservadas entre S. aureus e S. epidermidis e exemplo 8 mostra que IsaA, CIfA, IsdB, SdrG, HarA, FnbpA e Sbi podem gerar uma resposta imune reativa -cruzada (por exemplo reativo cmzado entre pelo menos uma cepa de S. aureus e pelo menos uma cepa de S. epidermidis). PIA é também bem conservado entre S. aureus e S. epidermidis e é capaz de induzir uma resposta imune protetora cruzada.

Assim, em uma forma de realização preferida, a composição imunogênica da invenção irá compreender duas, três ou quadro das proteínas acima, preferivelmente ainda compreendendo PIA (PNAG).

Vacinas de Polinucleotídeos Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se ao uso dos polinucleotídeos da figura 2 no tratamento, prevenção ou diagnose de infecção estafilocócica. Estes polinucleotídeos incluem polinucleotídeos isolados, compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificando um polipeptídeo que tem pelo menos 70% identidade, preferivelmente pelo menos 80% identidade, mais preferivelmente pelo menos 90% identidade, ainda mais preferivelmente pelo menos 95% identidade, para a seqüência de aminoácidos da figura 1, sobre o comprimento completo da seqüência. Neste aspecto, os polipeptídeos que tem pelo menos 97% identidade são altamente preferidos, enquanto os com pelo menos 98-99% identidade são mais altamente preferidos, e os com pelo menos 99% de identidade são os mais altamente preferidos.

Outros polinucleotídeos que encontram utilidade na presente invenção incluem polinucleotídeos isolados compreendendo uma seqüência de nucleotídeos que tem pelo menos 70% identidade, preferivelmente pelo menos 80% identidade, mais preferivelmente pelo menos 90% identidade, ainda mais preferivelmente pelo menos 95% identidade, para uma seqüência de nucleotídeos codificando uma proteína da invenção sobre toda a região de codificação. Neste aspecto, polinucleotídeos que tem pelo menos 97% identidade são altamente preferidos, enquanto os com pelo menos 98-99% identidade são mais altamente preferidos, e os com pelo menos 99% identidade são os mais altamente preferidos.

Outros polinucleotídeos incluem polinucleotídeos isolados compreendendo uma seqüência de nucleotídeos que tem pelo menos 70% identidade, preferivelmente pelo menos 80% identidade, mais preferivelmente pelo menos 90% identidade, ainda mais preferivelmente pelo menos 95% identidade, para as seqüências da figura 1. Neste aspecto, polinucleotídeos que tem pelo menos 97% identidade são altamente preferidos, enquanto os com pelo menos 98-99% identidade são mais altamente preferidos, e os com pelo menos 99% identidade são os mais altamente preferidos. Referido polinucleotídeo pode ser inserido em um plasmídeo apropriado ou vetor de microrganismo recombinante e usado para imunização (ver por exemplo Wolff et. al, Science 247:1465-1468 (1990); Corr et. al., J. Exp. Med. 184:1555-1560 (1996); Doe et. al., Proc. Natl. Acad. Sei. 93:8578-8583 (1996)). A presente invenção também provê um ácido nucleico codificando as proteínas acima mencionadas da presente invenção e seu uso era medicina. Em uma forma de realização preferida, os polinucleotídeos isolados de acordo com a invenção podem ser de filamento único (codificação ou anti-sentido) ou de filamento duplo, e podem ser moléculas de DNA (genômico, cDNA ou sintético) ou de RNA. As seqüências de codificação ou não codificação adicionais podem, mas não precisam, estar presentes dentro de um polinucleotídeo da presente invenção. Em outras formas de realização relacionadas, a presente invenção provê variantes de polinucleotídeos tendo identidade substancial para as seqüências como descritas aqui na figura 2; as compreendendo pelo menos 70% identidade de sequência, preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95 %, 96%, 97%, 98%, ou 99% ou mais, identidade de seqüência comparada a uma sequência de polinucleotídeos desta invenção usando os métodos descritos aqui, (por exemplo, análise BLAST usando parâmetros padrões). Em uma relacionada forma de realização, o polinucleotídeo isolado da invenção irá compreender uma seqüência de nucleotídeos codificando um polipeptídeo que tem pelo menos 90%, preferivelmente 95% e acima, de identidade para a seqüência de aminoácidos da figura 1, sobre o comprimento completo da seqüência da figura 1; ou uma seqüência de nucleotídeos complementar ao referido polinucleotídeo isolado. A invenção também contempla o uso de polinucleotídeos que são complementares a todos os polinucleotídeos acima descritos. A invenção também provê o uso de um fragmento de um polinucleotídeo da invenção que quando administrado a um indivíduo tem as mesmas propriedades imunogênicas como um polinucleotídeo da figura 1. A invenção também provê o uso de um polinucleotídeo codificando um fragmento imunológico de uma proteína da figura 1 como acima definido. Também são contemplados o uso destes fragmentos que tem um nível de atividade imunogênica de pelo menos cerca de 50%, preferivelmente pelo menos cerca de 70% e mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% do nível de atividade imunogênica de uma sequência de polipeptídeos codificada por uma sequência de polinucleotídeos especificada em Figura 2.

Os fragmentos de polipeptídeos para uso de acordo com a invenção preferivelmente compreendem pelo menos cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 50, ou 100 aminoácidos contíguos, ou mais, -incluindo todos os comprimentos intermediários, de uma composição de polipeptídeo especificada aqui, como especificado acima.

Os polinucleotídeos para uso na invenção podem ser obtidos, usando técnicas de clonagem e triagem padrões, de uma biblioteca de cDNA derivada de mRNA em células de tecido de tumor ou pré-neoplásico humano (pulmão, por exemplo), (por exemplo Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a' Ed., Cold Spring harbor Laboratory Press, Cold Spring harbor, N.Y. (1989)). Polinucleotídeos da invenção também podem ser obtidos de fontes naturais como bibliotecas de DNA genômico ou podem ser sintetizados usando técnicas bem conhecidas e comercialmente disponíveis.

Existem vários métodos disponíveis e bem conhecidos dos versados na técnica para obter cDNAs de comprimento completo, ou para estender cDNAs curtos, por exemplo os baseados no método de Amplificação Rápida de extremidades de cDNA (RACE) (ver, por exemplo, Frohman et al., PNAS USA 85, 8998-9002, 1988). Recentes modificações da técnica, exemplificada por tecnologia Marathon™ (Clontech Laboratories Inc.) por exemplo, tem amplificado significantemente a busca por cDNAs mais longos. Na tecnologia Marathon™, cDNAs foram preparados a partir de mRNA extraído de um tecido escolhido e uma sequência de 'adaptador' ligada em cada extremidade. A amplificação de ácido nucleico (PCR) é então realizada para amplificar a extremidade 5' “faltante” do cDNA usando uma combinação de iniciadores de oligonucleotídeos específicos para genes e específicos para adaptador. A reação de PCR é então repetida usando iniciadores 'abrigados' isto, é iniciadores projetados para anelar dentro do produto amplificado, (tipicamente um iniciador específico para adaptador que anela outro 3' na seqüência de adaptador e um iniciador específico para gene que anela outro 5’ na seqüência de gene conhecida). Os produtos desta reação são então analisados por seqüenciamento de DNA e um cDNA de comprimento completo construído por ou união do produto diretamente ao cDNA existente para dar uma seqüência completa ou realizando um PCR de comprimento completo separado, usando a nova informação de seqüência para o projeto de um iniciador 5’.

Vetores compreendendo este DNA, hospedeiros transformados assim e as próprias proteínas híbridas ou truncadas, expressados como descritos abaixo formam, todos, parte da invenção. O sistema de expressão também pode ser um microorganismo vivo recombinante, como um vírus ou bactéria. O gene de interesse pode ser inserido no genoma de um vírus recombinante vivo ou bactéria. A inoculação e infecção in vivo com este vetor vivo irá levar a uma expressão in vivo do antígeno e indução das respostas imunes.

Assim, em algumas formas de realização, polinucleotídeos codificando polipeptídeos imunogênicos para uso de acordo com a presente invenção são introduzidos em células de hospedeiro mamífero apropriadas, para expressão usando qualquer número de sistemas com base viral conhecidos. Em uma forma de realização ilustrativa, os retrovírus provêem uma plataforma conveniente e eficaz para os sistemas de liberação de genes. Uma seqüência de nucleotídeos selecionada codificando um polipeptídeo para uso na presente invenção pode ser inserida em um vetor e embalada em partículas retrovirais usando técnicas bem conhecidas na técnica. O vírus recombinante pode ser então isolado e liberado para um indivíduo. Vários sistemas retrovirais ilustrativos foram descritos (por exemplo, patente US No. 5,219,740; Miller e Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852; Bums et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:8033-8037; e Boris-Lawrie e Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109.

Além disso, vários sistemas com base em adenovírus ilustrativos foram também descritos. Diferente dos retrovírus que integram no genoma hospedeiro, os adenovírus persistem extracromossomicamente, assim minimizando os riscos associados com mutagenese insercional (Haj-Ahmad e Graham (1986) J. Virol. 57:267-274; Bett et al. (1993) J. Virol. 67:5911-5921; Mittereder et al. (1994) Human Gene Therapy 5:717-729; Seth et al. (1994) J. Virol. 68:933-940; Barr et al. (1994) Gene Therapy 1:51-58; Berkner, K. L. (1988) BioTechniques 6:616-629; e Rich et al. (1993) Human Gene Therapy 4:461-476).

Os vários sistemas de vetor de vírus adeno-associados (AAV) também foram desenvolvidos para a liberação de polinucleotídeos. Os vetores AAV podem ser prontamente construídos usando técnicas bem conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, patente US Nos. 5.173.414 e 5.139.941; Publicação Internacional Nos. WO 92/01070 e WO 93/03769; Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B. J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539; Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol, and Immunol. 158:97-129; Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Shelling e Smith (1994) Gene Therapy 1:165-169; e Zhou et al. (1994) J. Exp. Med. 179:1867-1875.

Os vetores virais adicionais utilizáveis para a liberação de moléculas de ácido nucleico codificando polipeptídeos para uso na presente invenção por transferência de genes incluem os derivados de família pox de vírus, como vírus de vacínia e poxvíms aviário. A título de exemplo, os recombinantes de vírus de vacínia expressando as moléculas de interesse podem ser construídos como a seguir. O DNA codificando um polipeptídeo é primeiro inserido em um vetor apropriado de modo a ficar adjacente a um promotor de vacínia e flanquear as sequências de DNA de vacínia, como a seqüência codificando timidina cinase (TK). Este vetor é então usado para transfectar células que são simultaneamente infectadas com vacínia. A recombinação homóloga serve para inserir o promotor de vacínia mais o gene codificando o polipeptídeo de interesse no genoma viral. O recombinante Tk.sup.(-) resultante pode ser selecionado por cultivo de células na presença de 5-bromodeoxiuridina e recolhendo placas virais resistentes ao mesmo.

Um sistema de infecção / transfecção baseado em vacínia pode ser usado de modo conveniente para prover uma expressão indutível, transiente, ou co-expressão de um ou mais polipeptídeos descritos aqui em células hospedeiras de um organismo. Neste sistema particular, as células são primeiro infectadas in vitro com um recombinante de vírus de vacínia que codifica RNA polimerase de bacteriófago T7. Esta polimerase demonstra especificidade extraordinária em que somente transcreve gabaritos contendo promotores T7. Após infecção, as células são transfectadas com o polinucleotídeo ou polinucleotídeos de interesse, dirigidos por um promotor T7. A polimerase expressada no citoplasma do recombinante de vírus de vacínia transcreve o DNA transfectado no RNA que é então traduzido em polipeptídeo pelo maquinário translacional do hospedeiro. O método provê uma produção citoplásmica transiente, de alto nível de quantidades grandes de RNA e seus produtos de tradução. Ver, por exemplo, Elroy-Stein e Moss, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1990) 87:6743-6747; Fuerst et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1986) 83:8122-8126.

Altemativamente, avipoxvírus, como os vírus fowlpox e canarypox, também podem ser usados para liberar as seqüências de codificação de interesse. Os vírus avipox recombinantes, expressando imunogenes de patógenos de mamíferos, são bem conhecidos como conferindo imunidade protetora quando administrados a espécies não aviárias. 0 uso de um vetor Avipox é particularmente desejável em espécies humanas e outras de mamíferos, porque os membros do gênero Avipox podem somente se replicar produtivamente em espécies aviárias susceptíveis e, assim, não são infectivos em células de mamíferos. Os métodos para produzir Avipoxvírus recombinantes são bem conhecidos na técnica e empregam recombinação genética, como descrito acima com relação à produção' de vírus de vacínia. Ver, por exemplo, WO 91/12882; WO 89/03429; e WO 92/03545.

Qualquer um dentre vários vetores de alfavírus também podem ser usados para a liberação de composições de polinucleotídeos para uso na presente invenção, como os vetores descritos em patentes US os. 5.843.723; 6.015.686; 6.008.035 e 6.015.694. Alguns vetores baseados em encefalite eqüina da Venezuela (VEE) também podem ser usados, ilustrativos exemplos podendo ser encontrados em patentes US Nos. 5.505.947 e 5.643.576.

Além disso, vetores de conjugados moleculares, como os vetores quiméricos de adenovírus descritos em Michael et al. J. Biol. Chem. (1993) 268:6866-6869 e Wagner et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1992) 89:6099-6103, também podem ser usados para a liberação de genes sob a invenção. A informação ilustrativa adicional para estes e outros sistemas de liberação com base viral podem ser encontrados por exemplo, em Fisher-Hoch et al., Proc. Natl. Acad, Sei. USA 86:317-321, 1989; Flexner et al., Ann. N.Y. Acad. Sei. 569:86-103, 1989; Flexner et al., Vaccine 8:17-21, 1990; patentes US 4.603.112, 4.769.330, e 5.017.487; WO 89/01973; patente USNo. 4.777,127; GB 2.200.651; EP 0,345.242; WO 91/02805; Berkner, Biotechniques 6:616-627, 1988; Rosenfeld et al., Science 252:431-434,1991; KoIIs et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91-215-219,1994; Kass-Eisler et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:11498-11502, 1993; Guzman et al., Circulation 88: 2838-2848, 1993; e Guzman et al., Cir. Res. 73:1202-1207, 1993.

Us microorganismos vivos recombinantes descritos acima podem ser virulentos, ou atenuados em vários modos a fim de obter vacinas vivas. Estas vacinas também formam parte da invenção.

Em algumas formas de realização, um polinucleotídeo pode ser integrado no genoma de uma célula de marcação. Esta integração pode ser no local específico e orientação via recombinação homóloga (substituição de genes) ou pode ser integrada em local aleatório, não específico (aumento do gene). Em ainda outras formas de realização, o polinucleotídeo pode ser estavelmente mantido na célula como um segmento epissomal separado de DNA. Estes segmentos de polinucleotídeo s ou “epissomas” codificam seqüências suficientes para permitir manutenção e replicação independentes de ou em sincronização com o ciclo de célula hospedeira. O modo em que a construção de expressão é liberada para uma célula e onde na célula o polinucleotídeo permanece é dependente do tipo de construção de expressão empregada.

Em outra forma de realização da invenção, um polinucleotídeo é administrado/liberado como DNA “nu”, por exemplo como descrito em Ulmer et al., Science 259:1745-1749, 1993 e revisto por Cohen, Science 259:1691-1692, 1993. A absorção do DNA nu pode ser aumentada por revestimento do DNA em contas biodegradáveis, que são transportadas de modo eficiente nas células.

Em ainda outra forma de realização, uma composição da presente invenção pode ser liberada via uma abordagem de bombardeio de partículas, muitas das quais foram descritas. Em um exemplo ilustrativo, a aceleração de partículas acionada por gás pode ser obtida com dispositivos como os fabricados por Powderject Pharmaceuticals PLC (Oxford, UK) e Powderject Vacinas Inc. (Madison, Wl)i dos quais alguns exemplos são descritos em patentes US Nos. 5.846.796; 6.010,478; 5.865.796; 5.584.807; e Patente EP No. 0500 799. Esta abordagem oferece uma abordagem de liberação sem agulha em que uma formulação de pó seco de partículas microscópicas, como partículas de polinucleotídeos ou polipeptídeos, são aceleradas em alta velocidade dentro de um jato de gás hélio gerado por um dispositivo manual, propelindo as partículas em um tecido alvo de interesse.

Em uma forma de realização, outros dispositivos e métodos que podem ser utilizáveis para injeção sem agulha acionada por gás de composições da presente invenção incluem os providos por Bioject, Inc. (Portland, OR), dos quais alguns exemplos são descritos em patentes US Nos. 4.790.824; 5.064.413; 5.312.335; 5.383.851; 5.399.163; 5.520.639 e 5.993.412.

Vacinas Em uma forma de realização preferida, a composição imunogênica da invenção é misturada com um excipiente farmaceuticamente aceitável, mais preferivelmente com um adjuvante para formar a vacina.

As vacinas da presente invenção são preferivelmente feitas com adjuvantes. Os adjuvantes apropriados incluem um sal de alumínio como gel hidróxido de alumínio (alúmen) ou fosfato de alumínio, mas também podem ser um sal de cálcio, magnésio, ferro ou zinco, ou podem ser uma suspensão insolúvel de tirosina acilada, ou açúcares acilados, polissacarídeos cationicamente ou anionicamente derivatizados ou polifosfazenos.

Prefere-se que o adjuvante seja selecionado para ser um indutor preferencial de tipo TH1 ou TH2 de resposta. Os níveis elevados de citocinas de tipo Thl tendem a favorecer a indução de respostas imunes mediadas por células para um dado antígeno, enquanto níveis elevados de citocinas de tipo Th2 tendem a favorecer a indução de respostas imunes humorais para o antígeno. É importante lembrar que a distinção de resposta imune de tipo Thl e Th2 não é absoluta. Na verdade, um indivíduo irá suportar uma resposta imune que é descrita como sendo predominantemente Thl ou predominantemente Th2. No entanto, é com freqüência conveniente considerar as famílias de citocinas em termos como descritas em clones de células T CD4 +ve de murinos por Mosmann e Coffman (Mosmann, T.R. e Coffman, R.L (1989) TH1 e TH2 cells: different pattems of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, pl45-173). Tradicionalmente as respostas tipo Thl são associadas com a produção de citocinas IL-2 e INF-γ por linfócitos T. Outras citocinas com freqüência diretamente associadas com a indução de resposta imune tipo Thl não são produzidas por células T, como IL-12. Em contraste, as respostas de tipo Th2 são associadas com a secreção de II- 4, IL-5, IL-6, IL-10. Os sistemas adjuvantes apropriados que promovem uma resposta predominantemente Thl incluem: monofosforil lipídeo A ou um derivado do mesmo, particularmente 3-de-O-acilado lipídeo monofosforila A (3D-MPL) (para sua preparação ver GB 2220211 A); e a combinação de lipídeo monofosforila A, preferivelmente 3-de-O-acilado lipídeo monofosforila A, (3D-MPL) (para sua preparação ver GB 2220211 A), e uma combinação de lipídeo monofosforila A, preferivelmente 3-de-O-acilado lipídeo monofosforila A, junto com ou um sal de alumínio (por exemplo fosfato de alumínio ou hidróxido de alumínio) ou uma emulsão óleo-em-água. Em tais combinações, o antígeno e 3D-MPL estão contidos nas mesmas estruturas particuladas, permitindo por uma liberação mais eficaz de sinais antigênicos e imunoestimulatórios. Os estudos tem demonstrado que 3D-MPL é capaz de ainda melhorar a imunogenicidade de um antígeno adsorvido em alúmen [Thoelen et al Vacine (1998) 16:708-14; EP 689454-B1].

Um sistema melhorado envolve a combinação de lipídeo monofosforila A e um derivado de saponina, particularmente a combinação de QS21 e 3D-MPL como descrito em WO 94/00153, ou uma composição menos reatogênica onde o QS21 é extinto com colesterol como descrito em WO 96/33739. Uma formulação de adjuvante particularmente potente envolvendo QS21, 3D-MPL e tocoferol em uma emulsão óleo em água é descrita em WO 95/17210, e é uma formulação preferida. Preferivelmente a vacina adicionalmente compreende uma saponina, mais preferivelmente QS21. A formulação também pode compreender uma emulsão óleo em água e tocoferol (WO 95/17210). A presente invenção também provê um método para produzir uma formulação de vacina compreendendo misturar uma proteína da presente invenção junto com um excipiente farmaceuticamente aceitável, como 3D-MPL. CpG não metilado contendo oligonucleotídeos (WO 96/02555) é também um indutor preferencial de uma resposta de TH1 e apropriado para uso na presente invenção.

As composições preferidas da invenção são as formando uma estrutura de lipossoma. Composição onde a fração de esterol / saponina imunologicamente ativa forma uma estrutura ISCOM também forma um aspecto da invenção. A relação de QS21: esterol irá tipicamente ser da ordem de 1: 100 a 1: 1 peso a peso. Preferivelmente o esterol em excesso está presente, a relação de QS21: esterol sendo de pelo menos 1: 2 p/p. Tipicamente, para administração humana, QS21 e esterol estarão presentes na vacina na faixa de cerca de 1 jag a cerca de 100 μg, preferivelmente cerca de 10 ftg a cerca de 50 μg por dose.

Os lipossomas preferivelmente contém um lipídeo neutro, por exemplo fosfatidilcolina, que é preferivelmente não cristalina em temperatura ambiente, por exemplo fosfatidilcolina de gema de ovo, dioleoil fosfatidilcolina ou dilauril fosfatidilcolina. Os lipossomas também podem conter um lipídeo carregado que aumenta a estabilidade da estrutura lipossoma- QS21 para lipossomas compostos de lipídeos saturados. Nestes casos, a quantidade de lipídeo carregado é preferivelmente 1-20% p/p, o mais preferivelmente 5-10%. A relação de esterol para fosfolipídeo é 1-50% (mol/mol), o mais preferivelmente 20-25%.

Preferivelmente, as composições da invenção contém MPL (3-deacilado mono-fosforil lipídeo A, também conhecido como 3D-MPL), 3D-MPL é conhecido de GB 2 220 211 (Ribi) como uma mistura de 3 tipos de De-O-acilado lipídeo monofosforila A com 4, 5 ou 6 cadeias acetiladas e fabricado por Ribi Immunochem, Montana. Uma forma preferida é descrita no pedido de patente internacional 92/116556.

As composições apropriadas da invenção são as em que os lipossomas são inicialmente preparados sem MPL, e MPL é então adicionado, preferivelmente como partículas de 100 nm. O MPL assim não está contido dentro da membrana da vesícula (conhecido como fora de MPL). As composições onde o MPL está contido dentro da membrana da vesícula (conhecidas como MPL) também formam um aspecto da invenção. O antígeno pode estar contido dentro da membrana da vesícula ou contido fora da membrana da vesícula. Preferivelmente, os antígenos solúveis estão fora e antígenos hidrofóbicos e lipidados estão ou contidos dentro ou fora da membrana.

As preparações de vacina da presente invenção podem ser usadas para proteger ou tratar um mamífero susceptível à infecção, por meio de administração de uma vacina através de via sistêmica ou mucosal. Estas administrações podem incluir injeção através das vias intramuscular, intraperitoneal, intradérmica ou subcutânea, ou através de administração mucosal aos tratos oral/ alimentar, respiratório, genitourinário. A administração intranasal de vacinas para o tratamento de pneumonia ou otite média é preferida (como o transporte nasofaringeal de pneumococos pode ser evitado de modo mais efetivo, assim a atenuação da infecção em seu estado prematuro). Apesar da vacina da invenção poder ser administrada como uma dose única, os seus componentes podem ser também co-administrados juntos ao mesmo tempo ou em tempos diferentes (por exemplo polissacarídeos pneumocócicos podem ser administrados em separado, ao mesmo tempo ou 1-2 semanas após a administração de qualquer componente de proteína bacteriana da vacina para uma coordenação ótima das respostas imunes com relação um ao outro). Para co-administração, o adjuvante Thl opcional pode estar presente em qualquer uma ou todas as administrações diferentes, no entanto, prefere-se se estiver presente em combinação com o componente de proteína bacteriana da vacina. Além de uma via única de administração, 2 vias diferentes de administração podem ser usadas. Por exemplo, os polissacarídeos podem seT administrados IM (ou DD) e proteínas bacterianas podem ser administradas IN (ou ID). Além disso, as vacinas da invenção podem ser administradas IM para doses de iniciação e ΪΝ para doses de reforço. A quantidade de antígeno conjugado em cada dose de vacina é selecionada como uma quantidade que induz uma resposta imunoprotetora sem efeitos laterais adversos, signifícantes, em vacinas típicas. Esta quantidade irá variar dependendo de qual imunogene específico é empregado e como ele é apresentado. Geralmente, espera-se que cada dose irá compreender 0,1 -100 /Ag de polissacarídeo, preferivelmente 0,1 -50 μg para conjugados de polissacarídeo, preferivelmente 0,1 -10 /xg, mais preferivelmente 1-10 /Ag, de que 1 a 5 /Ag é uma faixa mais preferível. O teor dos antígenos de proteína na vacina estarão tipicamente na faixa de l-100^g, preferivelmente 5-50/Ag, o mais tipicamente na faixa de 5 - 25/Ag. Após uma vacinação inicial, os indivíduos podem receber uma ou várias imunizações de reforço espaçadas de modo apropriado. A preparação de vacina é geralmente descrita em Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M. F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York). Encapsulação dentro de lipossomas é descrita por Fullerton, Patente US 4.235.877.

As vacinas da presente invenção pode ser armazenadas em solução ou liofilízadas. Preferivelmente a solução é liofilizada na presença de um açúcar como sacarose, trealose ou lactose. É ainda mais preferível que elas sejam liofilizadas e reconstituídas extemporaneamente antes do uso. A liofilização pode resultar em uma composição mais estável (vacina) e pode possivelmente levar a maiores títulos de anticorpos na presença de 3D-MPL e na ausência de um adjuvante à base de alumínio.

Anticorpos e imunização passiva Outro aspecto da invenção é um método de preparar uma globulina imune para uso na prevenção ou tratamento de infecção estafilocócica compreendendo as etapas de imunizar um recipiente com vacina da invenção e isolar a globulina imune do recipiente. Uma globulina imune preparada por este método é um outro aspecto da invenção. A composição farmacêutica compreendendo a globulina imune da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável é um outro aspecto da invenção que pode ser usado na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de doenças estafilocócicas. Um método para tratamento ou prevenção de infecção estafilocócica compreendendo uma etapa de administrar a um paciente uma quantidade eficaz da preparação farmacêutica da invenção é um outro aspecto da invenção.

Os inóculos para a produção de anticorpos policlonais são tipicamente preparados por dispersão da composição antigênica em um diluente fisiologicamente tolerável como solução salina ou outros adjuvantes apropriados para uso humano para formar uma composição aquosa. Uma quantidade imunoestimulatória de inóculo é administrada a um mamífero e o mamífero inoculado é então mantido durante um tempo suficiente para a composição antigênica induzir anticorpos protetores.

Os anticorpos podem ser isolados na extensão desejada por técnicas bem conhecidas como cromatografia de afinidade (Harlow e Lane, Antibodies; a laboratory manual 1988).

Os anticorpos podem incluir preparações de antisoro de vários dos animais comumente usados, porção cabras, primatas, burros, suínos, cavalos, porquinhos da índia, ratos ou homens. Os animais são sangrados e o soro recuperado.

Uma globulina imune produzida de acordo com a presente invenção pode incluir anticorpos completos, fragmentos de anticorpos ou sub-ffagmentos. Os anticorpos podem ser imunoglobulinas completas de qualquer classe, por exemplo IgG, IgM, IgAj IgD ou IgE, anticorpos quiméricos, ou anticorpos híbridos com especificidade dual para dois ou mais antígenos da invenção. Eles também podem ser fragmentos por exemplo F(ab')2, Fab', Fab, Fv e outros incluindo fragmentos híbridos. Uma globulina imune também inclui proteínas naturais, sintéticas ou geneticamente engenheiradas que podem atuar como um anticorpo por ligação a antígenos específicos para formar um complexo. A vacina da presente invenção pode ser administrada a um recipiente que então atua como uma fonte de globulina imune, produzida em resposta ao desafio da vacina específica. Um indivíduo assim tratado irá doar plasma da qual a globulina super-imune pode ser obtida via uma metodologia de fracionamento de plasma convencional. A globulina hiperimune deve ser administrada a outro indivíduo a fim de conferir resistência contra ou tratar a infecção estafílocócica. As globulinas hiperimunes da invenção são particularmente úteis para tratamento ou prevenção de doenças estafilocócicas em criancinhas, indivíduos imuno- comprometidos ou onde o tratamento é requerido e não se tem tempo para o indivíduo produzir anticorpos em resposta à vacinação.

Um aspecto adicional da invenção é uma composição farmacêutica compreendendo dois ou mais anticorpos monoclonais (ou fragmentos dos mesmos; preferivelmente humanos ou humanizados) reativos contra pelo menos dois constituintes da composição imunogênica da invenção, que podem ser usados para tratar ou evitar infecção por bactérias Gram positivas, preferivelmente estafilococos, mais preferivelmente S. aureus ou S. epidermidis. Estas composições farmacêuticas compreendem anticorpos monoclonais que podem ser imunoglobulinas completas de qualquer classe, por exemplo IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE, anticorpos quiméricos ou anticorpos híbridos com especificidade para dois ou mais antígenos da invenção. Eles também podem ser fragmentos por exemplo F(ab')2, Fab', Fab, Fv e outros incluindo fragmentos híbridos. Métodos de fabricar anticorpos monoclonais são bem conhecidos na técnica e podem incluir a fusão de esplenócitos com células de mieloma (Kohler e Milstein 1975 Nature 256; 495; Antibodies - a laboratory manual Harlow e Lane 1988). Altemativamente, fragmentos Fv monoclonais podem ser obtidos por triagem de uma biblioteca de exibição de fagos apropriada (Vaughan TJ et al 1998 Nature Biotechnology 16; 535). Anticorpo monoclonais podem ser humanizados ou humanizados em parte por métodos bem conhecidos. Métodos A invenção também engloba método de fabricar as composições imunogênicas e vacinas da invenção.

Um processo preferido da invenção, é um método para fabricar uma vacina compreendendo as etapas de misturar antígenos para fazer a composição imunogênica da invenção e adicionar um excipiente farmaceuticamente aceitável. Métodos de tratamento A invenção também engloba métodos de tratamento ou infecção estafilocócica, particularmente infecções nossocomiais adquiridas em hospital.

Esta composição imunogênica ou vacina da invenção é particularmente vantajosa de usar em casos de cirurgia eletiva. Estes pacientes irão saber a data de cirurgia antes e podem ser inoculados antes. Porque não se sabe se o paciente será exposto a infecção por S. aureus ou S. epidermidis, prefere-se inocular com uma vacina da invenção que protege contra ambos, como acima mencionado. Preferivelmente, adultos acima de 16 esperando uma cirurgia eletiva são tratados com as composições imunogênicas e vacinas da invenção.

Também é vantajoso inocular os trabalhadores na área de saúde com a vacina da invenção.

As preparações de vacina da presente invenção podem ser usadas para proteger ou tratar um mamífero susceptível a infecção, por meio de administração de referida vacina através de uma via sistêmica ou mucosal. Estas administrações podem incluir injeção através das vias intramuscular, intraperitoneal, intradérmica ou subcutânea, ou via administração mucosal para os tratos oral/alimentar, respiratório, genitourinário. A quantidade de antígeno em cada dose de vacina dose é selecionada como uma quantidade que induz uma resposta imunoprotetora sem efeitos laterais adversos significantes, de vacinas típicas. Esta quantidade irá variar dependendo do imunogene específica empregado e como ele é apresentado. O teor de proteína da vacina estará tipicamente na faixa de 1 -lOOjttg, preferivelmente 5-50/xg, o mais tipicamente na faixa de 10 - 25pg. Geralmente, espera-se que cada dose irá compreender 0,1 -100 pg de polissacarídeo onde presente, preferivelmente 0,1 -50 pg, preferivelmente 0,1 -10 μg, das quais a faixa mais preferível é de 1 a 5 pg, Uma quantidade ótima para uma vacina particular pode ser verificada por estudos padrões envolvendo a observação de respostas imunes apropriadas em indivíduos. Após uma vacinação inicial, os indivíduos podem receber uma ou várias imunizações de reforço espaçadas de modo adequado.

Apesar das vacinas da presente invenção poderem ser administradas por qualquer via, a administração das vacinas descritas na pele (ID) forma uma forma de realização da presente invenção. A pele humana compreende uma cutícula “calosa” externa, chamada o estrato córneo, que está acima da epíderme. Embaixo desta epiderme, está uma camada chamada a derme, que por sua vez sobrepõe o tecido subcutâneo. Os pesquisadores tem demonstrado que a injeção de uma vacina dentro da pele, e particularmente na derme, estimula uma resposta imune, que pode também estar associada com várias vantagens adicionais. A vacinação intradérmica com as vacinas aqui descritas forma um aspecto preferido da presente invenção. A técnica convencional de injeção intradérmica, o “procedimento mantoux” compreende as etapas de limpar a pele, e então esticar com uma mão, e com o chanfro de uma agulha de calibre estreito (calibre 26-31) voltada para cima, a agulha é inserida em um ângulo de entre 10-15 °. Uma vez que o chanfro da agulha é inserido, o tambor da agulha é abaixado e ainda avançado enquanto provendo uma pressão leve para o elevar sob a pele. O líquido é então injetado muito lentamente assim formando uma bolha ou inchaço sobre a superfície da pele, seguido por retirada lenta da agulha.

Mais recentemente, dispositivos que são especificamente projetados para administrar agentes líquidos dentro ou através da pele foram descritos, por exemplo os dispositivos descritos em WO 99/34850 e EP 1092444, também os dispositivos de injeção com jato descritos, por exemplo em WO 01/13977; US 5.480,381, US 5.599.302, US 5.334.144, US

5.993.412, US 5.649.912, US 5.569.189, US 5.704.911, US 5.383.851, US 5.893.397, US 5.466.220, US 5.339.163, US 5.312.335, US 5.503.627, US 5.064.413, US 5.520, 639, US 4,596.556, US 4.790.824, US 4.941.880, US 4.940,460, WO 97/37705 e WO 97/13537. Métodos alternativos de administração intradérmica das preparações de vacina podem incluir seringas convencionais e agulhas, ou dispositivos projetados para liberação balística de vacinas sólidas (WO 99/27961), ou curativos transdérmicos (WO 97/48440; WO 98/28037); ou aplicados à superfície da pele (liberação transdérmica ou subcutânea WO 98/20734; WO 98/28037).

Quando as vacinas da presente invenção devem ser administradas à pele, ou mais especificamente na derme, a vacina é de um volume de líquido baixo, particularmente um volume de entre cerca de 0,05 ml e 0,2 ml. O teor de antígenos na pele ou vacinas intradérmicas da presente invenção pode ser similar a doses convencionais, como encontrado em vacinas intramusculares (ver acima). No entanto, é um aspecto das vacinas intradérmicas ou na pele que as formulações podem ser “de dose baixa”. Conseqüentemente, os antígenos de proteína em vacinas de “dose baixa” estão preferivelmente presentes em tão pouco como 0,1 a 10 pg, preferivelmente 0,1 a 5 jug por dose; e os antígenos de polissacarídeo (preferivelmente conjugados) podem estar presentes na faixa de 0,01-1 μg, e preferivelmente entre 0,01 a 0,5 pg de polissacarídeo por dose.

Como usado aqui, o termo “liberação intradérmica” significa a liberação da vacina na região da derme da pele. No entanto, a vacina não estará necessariamente localizada exclusivamente na derme. A derme é a camada na pele localizada entre cerca de 1,0 e cerca de 2,0 mm da superfície na pele humana, mas se tem uma certa quantidade de variação entre os indivíduos e em diferentes partes do corpo. Geralmente, pode-se expor para alcançar a pele ao passar 1,5 mm abaixo da superfície da pele. A derme está localizada entre o estrato córneo e a epiderme na superfície e na camada subcutânea abaixo. Dependendo do modo de liberação, a vacina pode por fim estar localizada sozinha ou primariamente dentro da derme, ou pode por fim ser distribuída dentro da epiderme e na derme.

Uma forma de realização preferida da invenção é um método de prevenir ou tratar infecção estafilocócica ou doença compreendendo a etapa de administrar a composição imunogênica ou vacina da invenção a um paciente em necessidade da mesma.

Em uma forma de realização preferida, o paciente está esperando uma cirurgia eletiva.

Uma outra forma de realização preferida da invenção é um uso da composição imunogênica da invenção na fabricação de uma vacina para o tratamento ou prevenção de infecção estafilocócica ou doença, preferivelmente infecção estafílocócica após cirurgia. O termo “infecção estafílocócica” engloba a infecção causada por S. aureus e/ou 5. epidermidis e outras cepas estafilocócicas capazes de causar infecção em um hospedeiro mamífero, preferivelmente humano.

Os termos “compreendendo”, “compreender” e “compreende” aqui se destinam de acordo com os inventores a serem opcionalmente substituíveis pelos termos “consistindo de”, "consistir de” e “consiste de”, respectivamente, em cada caso.

Todas as referências ou pedidos de patente aqui citados no relatório de patente são incorporados por referência aqui. A fim de que a invenção seja mais bem entendida, os seguintes exemplos são especificados. Estes exemplos são para fins de ilustração apenas, e não devem ser construídos como limitando o escopo da invenção de qualquer modo.

Exemplos Exemplo 1 Construção de Plasmídeo para Expressar Proteínas Recombinantes A: Clonagem.

Os sítios de restrição apropriados engenheirados em oligonucleotídeos específicos para o gene estafilocócico permitiu a clonagem direcional do produto PCR no plasmídeo de expressão de E. coli pET24d ou pQE-30 de modo que uma proteína pode ser expressada como uma proteína de fusão contendo uma etiqueta de cromatografia de afinidade (His)ó N- ou C-término, Os iniciadores usados foram: Alfa toxina - 5'- CGCGGATCCGCAGATTCTGATATTAATATTAAAAC-3’ e 5’ CCCAAGCTTTTAATTTGTCATTTCTTCTTTTTC-3’ EbpS - 5'- CGCGGATCCGCTGGGTCTAATAATTTTAAAGATG-3 ’ e 5'CCCAAGCTTTTATGGAATAACGATTTGTTG-3 ’ - CIfA - 5'- CGCGGATCCAGTGAAAATAGTGTTACGCAATC-3 ’ e 5'CCCAAGCTTTTACTCTGGAATTGGTTCAATTTC-3' FnbpA - 5'- CGCGGATCCACACAAACAACTGCAACTAACG-31 e 5'CCCAAGCTTTTATGCTTTGTGATTCTTTTTCAAAC3' Sbi - 5 '-CGCGGATCCAACACGCAACAAACTTC-3' e 5'GGAACTGCAGTTATTTCCAGAATGATAATAAATTAC-3' SdrC - 5'-CGCGGATCCGCAGAAC ATACGAATGGAG-3' e 5'CCCAAGCTTTTATGTTTCTTCTTCGTAGTAGC-3' SdrG - 5'-CGCGGATCCGAGGAGAATTCAGTACAAG-3' e 5GCCAAGCTTTTATTCGTCATCATAGTATCCG-3’ Ebh - 5'-AAAAGTACTCACCACCACCACCACC-3’ e 5’AAAAGTACTCACTTGATTCATCGCTTCAG-3’ Aaa - 5'- GCGCGCCATGGCACAAGCTTCT AC ACAAC AT AC-31 e 5'GCGCGCTCGAGATGGATGAATGCATAGCTAGA-3' IsaA - 5- GCATCCATGGCACCATCACCATCACCACGAAGTAAACGTTGATCA AGC-3'e 5'-AGCACTCGAGTTAGAATCCCCAAGCACCTAAACC- 3' HarA - 5'-GCACCCATGGCAGAAAATACAAATACTTC-3' e5'TTTTCTCGAGCATTTTAGATTGACTAAGTTG-3' Autolisina glucosaminidase - 5'- CAAGTCCCATGGCTGAGACGACACAAGATCAAC-3'e 5'-CAGTCTCGAGTTTTACAGCTGTTTTTGGTTG-3' Autolisina amidase - 5'- AGCTCATATGGCTTATACTGTTACTAAACC-3'e - 5'GCGCCTCGAGTTTATATTGTGGGATGTCG-3' IsdA - 5'- CAAGTCCCATGGCAACAGAAGCTACGAACGCAAC-3' e 5 ’ ACCAGTCTCGAGT AATTCTTTAGCTTTAGAGCTTG-3’ IsdB - 5’- TATTCTCGAGGCTTTGAGTGTGTCCATCATTTGG' e 5' GAAGCCATGGCAGCAGCTGAAGAAACAGGTGG-3' MRPII - 5'- GATTACACCATGGTTAAACCTCAAGCGAAA-3' e 5’AGGTGTCTCGAGTGCGATTGTAGCTTCATT-3' Os produtos PC-R foram primeiro introduzidos no vetor de clonagem pGEM-T (Novagen) usando células bacterianas ToplO, de acordo com as instruções do fabricante. Esta construção intermediária foi feita para facilitar outra clonagem em um vetor de expressão. Os transformantes contendo o inserto de DNA foram selecionados por análise de enzima de restrição. Após digestão, uma alíquota de - 20 jul da reação foi analisada por eletroforese de gel agarose (0,8 % agarose em tampão Tris-acetato-EDTA (TAE)). Fragmentos de DNA foram visualizados por iluminação com UV após eletroforese de gel e coloração com brometo de etídeo. Um padrão de DNA de peso molecular (patamar de 1 Kb, Life Technologies) foi submetido a eletroforese em paralelo com amostras de teste e foi usado para estimar o tamanho dos fragmentos de DNA. Plasmídeo purificado de transformantes selecionados para cada clonagem foi então seqüencialmente digerido para completar com enzimas de restrição apropriadas como recomendado pelo fabricante (Life Technologies). O fragmento de DNA digerido foi então purificado usando colunas de fuso com base em sílica gel antes da ligação com pET24d ou plasmídeo pQE-30. Clonagem de Ebh (fragmento H2), AaA, IsdA, IsdB, HarA, Atl-amidase, Atl-glucosamina, MRP, IsaA foi realizado usando o plasmídeo pET24d e clonagem de CIfA, SdrC, SdrE, FnbpA, SdrG/Fbe, alfa toxina e Sbi foi realizada usando plasmídeo pQE-30. B: Produção de vetor de expressão.

Para preparar o plasmídeo de expressão pET24d ou pQE-30 para ligação, ele foi similarmente digerido até completar com enzimas de restrição apropriadas. Um excesso molar de aproximadamente 5 vezes dos fragmentos digeridos para o vetor preparado foi usado para programar a reação de ligação. Uma reação de ligação padrão de ~20 μΐ (~16°C, ~16 horas), usando métodos bem conhecidos na técnica, foi realizado usando T4 DNA ligase (-2,0 unidades / reação, Life Technologies). Uma alíquota de ligação (-5 μΐ) foi usada para transformar células eletro-competentes M15(pREP4) ou BT21::DE3 de acordo com métodos bem conhecidos na técnica, Após um período de -2-3 horas a 37°C em -1,0 ml de caldo LB, células transformadas foram colocadas em placas de LB agar contendo ampicilina (100 ,ug/ml) e/ou canamicina (30/ig/ml). Antibióticos foram incluídos na seleção. Placas foram incubadas ovemight a 37°C durante -16 horas. As colônias individuais ApR/KanR foram tomadas com palitos de dentes estéreis e usadas para inocular como "curativo” placas LB ApR/KanR novas assim como uma cultura de caldo de ~1,0 ml LB Ap/ Kan. Ambas as placas e a cultura de caldo foram incubadas durante a noite a 37°C em um incubador padrão (placas) ou um banho d’água agitado. A análise PCR com base em célula total foi empregada para verificar que os transformantes continham o inserto de DNA. Aqui, o caldo de cultura LB Αρ/Kan de -1,0 ml noturno foi transferido para um tubo de polipropileno de 1,5 ml e as células coletadas por centrifugação em uma microcentrífuga Beckmann (~3 min., temperatura ambiente, -12,000 X g). A pelota de célula foi colocada em suspensão em ~200/d de água estéril e uma alíquota de ~10μ1 usada para programar uma reação PCR de volume final de ~50/il contendo ambos os iniciadores de amplificação dianteiro e reverso. A etapa inicial de denaturação a 95°C foi aumentada a 3 minutos para assegurar ruptura térmica das células bacterianas e liberação de plasmídeo DNA. Um ciclador térmico AB1 Modelo 9700 e um perfil de amplificação térmica de três etapas, e 32 ciclos, isto é,. 95 °C 45s; 55-58°C, 45 s, 72°C, 1 min., foram usados para amplificar o fragmento BASB203 das amostras de transformantes lisados. Após a amplificação térmica, uma alíquota de ~20μ1 da reação foi analisada por eletroforese de gel agarose (0,8 % agarose em um tampão Tris-acetato-EDTA (TAE)). Os fragmentos de DNA foram visualizados por iluminação UV após eletroforese do gel e coloração com brometo de etídeo. Um padrão de tamanho molecular de DNA (1 Kb patamar, Life Technologies) foi submetido a eletroforese em paralelo com amostras de teste e foi usado para estimar o tamanho de produtos PCR. Transformantes que produziram o produto PCR de tamanho esperado foram identificados como cepas contendo uma construção de expressão de proteína. O plasmídeo de expressão contendo cepas foi então analisado para a expressão indutível de proteína recombinante. C: Análise de expressão de transformantes positivos para PCR-, Uma alíquota da cultura de semente noturna (-1,0 ml) foi inoculada em um frasco erlenmeyer de 125 ml contendo -25 ml de caldo LB Ap/Kan e foi cultivada a 37 °C com agitação (-250 rpm) até a turvação de a cultura alcançar O.D.600 de -0,5, isto é, fase meio-log (geralmente cerca de 1,5 - 2,0 horas). Neste tempo, aproximadamente metade da cultura (-12.5 ml) foi transferida para um segundo frasco de 125 ml e expressão de proteína recombinante induzida pela adição de IPTG (carga de 1,0 M preparada em água estéril, Sigma) a uma concentração final de 1,0 mM. Incubação tanto das culturas induzidas por IPTG como não induzidas continuou por mais ~4 horas a 37 °C com agitação. Amostras (-1,0 ml) de culturas induzidas como culturas não induzidas foram removidas após o período de indução e as células coletadas por centrifugação em uma microcentrífuga a temperatura ambiente durante ~3 minutos. Pelota de células individual foi colocada em suspensão em ~50/xl de água estéril, então misturada com volume igual de tampão de amostra 2X Laemelli SDS-PAGE contendo 2-mercaptoetanol, e colocados em água em ebulição durante ~3 min para desnaturar a proteína. Volumes iguais (~15/d) de lisados de células tanto induzido por IPTG bruto como não induzido foram carregados em duplicata a 12% Tris/ gel glicina poliacrilamida (mini-géis com 1 mm de espessura, Novex). As amostras de lisado induzido e não induzido foram submetidas a eletroforese junto com marcadores de peso molecular pré- coloridos(SeeBlue, Novex) sob condições convencionais usando tampão padrão de ciclo SDS/Tris/glicina (BioRad). Após a eletroforese, um gel foi colorido com azul commassie brilliant R250 (BioRad) e então descolorido para visualizar novas proteínas indutíveis por IPTG. O segundo gel foi electroblotted sobre uma membrana PVDF (tamanho de poro de 0,45 mícrons, Novex) durante ~2 h a 4 °C usando um aparelho BioRad Mini-Protean II blotting e tampão de transferência de metanol de Towbin (20 %). O bloqueio da membrana e incubações de anticorpo foram realizados de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Um anticorpo monoclonal anti-RGS (His)3, segundo por um segundo anticorpo anti -camundongo de coelho conjugado a HRP (QiaGen), foram usados para confirmar a expressão e identidade da proteína recombinante. Visualização do padrão reativo do anticorpo anti-His foi obtida usando ou um substrato insolúvel em ABT ou usando Hyperfilm com sistema de quimioiluminescência Amersham ECL.

Exemplo 2: Produção de Proteína Recombinante Cepa bacteriana Uma cepa de expressão recombinante de E. coli M15(pREP4) contendo um plasmídeo (pQE30) ou BL21::DE3 contendo plasmídeo pET24d codificando proteínas estafilocócicas foi usada para produzir massa celular para a purificação de proteína recombinante.

Meios O meio de fermentação usado para a produção de proteína recombinante consistia de caldo 2X YT (Difco) contendo 100pg/ml Ap e/ou 30 jLig/ml Km. Antiespumante foi adicionado ao meio para o fermentador a 0,25 ml/L (Antifoam 204, Sigma). Para induzir a expressão de proteína recombinante, IPTG (Isopropil /3-D-Tiogalactopiranosídeo) foi adicionado ao fermentador (1 mM, final).

Produção de proteínas recombinantes Sob condições nativas IPTG foi adicionado na concentração final de lmM e a cultura foi cultivada durante 4 h adicionais. A cultura foi então centrifugada a 6,000 rpm durante 10 minutos e a pelota foi recolocada em suspensão em tampão fosfato (50 mM K2HP04, KH2P04 pH 7) incluindo um coquetel inibidor de protease. Esta amostra foi submetida a lise de pressão French usando uma pressão de 1500 bars ( 2 ciclos). Após centrifugação durante 30 minutos a 15,000 rpm, o sobrenadante foi reservado para outra purificação e NaCI foi adicionado a 0,5M. A amostra foi então carregada em uma resina de Ni-NTA (XK 16 coluna Pharmacia, resina Ni-NTA Qiagen) condicionada em 50 mM K2HP04, KH2P04 pH 7. Após carregar a amostra, a coluna foi lavada com Tampão A (0,2M NaH2P04 pH 7, 0,3M NaCI, 10% glicerol). Para eluir a proteína ligada, o gradiente de etapa foi usado onde diferentes proporções de tampão B (0,2M NaH2P04 pH 7, 0,3M NaCI, 10% glicerol e 200 mM imidazol) foram adicionados a tampão A. A proporção de tampão B foi gradualmente aumentada de 10% a 100%. Após purificação, a fração eluída contendo a proteína foi reunida, concentrada e dialisada contra 0,002M ΚΗ2Ρ04/Κ2ΗΡ04 ρΗ 7,0,1 5Μ NaCI.

Este método foi usado para purificar CIfA, SdrG, IsdA, IsaB, HarA, Atl-glucosamine e alfa toxina.

Sob condições desnaturantes IPTG foi adicionado a uma concentração final de lmM e a cultura foi cultivada durante 4 horas adicionais. A cultura foi então centrifugada a 6,000 rpm durante 10 minutos e a pelota foi recolocada em suspensão em tampão fosfato (50 mM K2HP04, KH2P04 pH 7) incluindo um coquetel de inibidor de protease. Esta amostra foi submetida lise sob pressão French usando pressão de 1500 bars (2 ciclos). Após centrifugação durante 30 minutos a 15,000 rpm, a pelota foi lavada com tampão fosfato incluindo 1 M uréia. A amostra foi centrifugada durante 30 min a 15000rpm e a pelota foi recolocada em suspensão em 8M uréia, 0,1 M NaH2P04, 0,5M NaCI, 0,01 M Tris-Hcl pH 8 e mantida durante a noite a temperatura ambiente. A amostra foi centrifugada durante 20 minutos a 15000 rpm e o sobrenadante foi coletado para outra purificação. A amostra foi então carregada em uma resina Ni-NTA (coluna XK 16 Pharmacia, resina Ni-NTA, Qiagen) condicionada em 8M uréia, 0,1 M NaH2P04, 0,5M NaCI, 0,01 M Tris-Hcl pH 8. Após passagem do fluxo transpassante, a coluna foi lavada sucessivamente com tampão A (8M Uréia, 0,1 MNaH2P04,0,5M NaCI, 0,01 M Tris, pH 8,0), tampão C (8M Uréia, 0,1 MNaH2P04,0,5M NaCI, 0,01 M Tris, pH 6,3), tampão D (8M Uréia, 0,1 MNaH2P04, 0,5M NaCI, 0,01 M Tris, pH 5,9) e tampão E (8M Uréia, 0,1 MNaH2P04, 0,5M NaCI, 0,01 M Tris, pH 4,5). A proteína recombinante foi eluída da coluna durante lavagens com tampão D e E. A proteína recombinante desnaturada pode ser solubilizada em uma solução isenta de uréia. Para este fim, a proteína desnaturada contida em 8M uréia foi sucessivamente diaiisada contra 4M uréia, 0,1 MNa2P04, 0,01 M Tris-HCI, pH 7,1, 2M uréia, 0,1 M NaH2P04, 0,01 M Tris-HCI, pH 7,1, 0,5M arginina e 0,002M KH2P04/K2HP04 pH 7,1, 0,1 5MNaCI, Q,5M arginina.

Este método foi usado para purificar Ebh (fragmento H2), AaA, SdrC, FnbpA, Sbi, Atl-amidase e IsaA.

As proteínas purificadas foram analisadas por SDS-PAGE. Os resultados para uma proteína purificada sob condições nativas (alfa toxina) e uma proteína purificada sob condições desnaturantes (SdrC) são mostrados nas figuras 3 e 4.

Exemplo 3 Preparação de Polissacarídeos PIA (PNAG) é preparado como descrito em Joyce et al 2003, Carbohydrate Research 338; 903-922.

Polissacarídeos Tipo 5 e tipo 8 são extraídos de S.aureus como descrito em Infection and Immunity 58(7); 2367.

Ativação e química de copulacão: O polissacarídeo nativo é dissolvido em NaCI 2M ou em água. A concentração ótima de polissacarídeo é avaliada para todos os sorotipos e está entre 2mg/ml e 5mg/ml. A partir de uma solução de carga de 100 mg/ml em acetonitrila, CDAP (relação CDAP/PS:0,75 mg/mg PS) é adicionado à solução de polissacarídeo. 1,5 minutos depois, 0,2M trietilamina é adicionada para obter o pH de ativação específico (pH 8,5-10,0). A ativação do polissacarídeo é realizada nestes pH durante 2 minutos a 25°C. A proteína carreadora é adicionada ao polissacarídeo ativado em uma quantidade suficiente ara dar uma relação molar 1/1 e a reação de copulação é realizada neste pH específico durante 1 hora.

Então, a reação é extinta com glicina durante 30 minutos a 25°C e durante a noite a 4°C.

Os conjugados são purificados por filtração em gel usando uma coluna de filtração com gel Sephacryl 500HR equilibrada com 0,2M NaCI.

Os teores de carboidratos e proteína das frações eluídas são determinados. Os conjugados são reunidos e filtrados de modo estéril em uma membrana esterilizando de 0,22 μπι. As relações de PS/Proteína nas preparações conjugadas são determinadas.

Caracterização: Cada conjugado é caracterizado por teor de proteína e polissacarídeo. O teor de polissacarídeo é medido por teste de Resorcinol do teor de proteína pelo teste de Lowry. A relação final PS/PD (p/p) é determinada pela relação de concentrações.

Teor de DIWAP Residual (ng/jttg PS): A ativação do polissacarídeo com CDAP introduz um grupo cianato no polissacarídeo e DMAP (4-dimetilamino-piridin) é liberado. O teor residual de DMAP é determinados por um teste específico desejado e validado em GSK.

Teor de polissacarídeo livre (%): O teor de polissacarídeo livre em conjugados mantidos a 4°C ou armazenados 7 dias a 37°C é determinado no sobrenadante obtido após incubação com anticorpos a- veículos e sulfato de amônio saturado seguido por uma centrifugação.

Um ELISA α-PS/a-PS é usado para a quantificação de polissacarídeo livre no sobrenadante. A ausência de conjugado é também controlada por um ELISA a-veículo/a-PS.

Exemplo 4 Formulação Composições Adjuvantes Proteína, ou individualmente ou junta, a partir dos exemplos acima pode ser formulada com combinação de polissacarídeos estafilocócicos como adjuvante, a formulação por compreende uma mistura de 3 de -0-acilado lipídeo monofosforila A (3D-MPL) e hidróxido de alumínio, ou de 3 de -O-acilado lipídeo monofosforila A (3D-MPL) e fosfato de alumínio, ou 3D-MPL e/ou QS21 opcionalmente em uma emulsão óleo/água, e opcionalmente formulado com colesterol, ou sal de alumínio sozinho, preferivelmente fosfato de alumínio. 3D-MPL: é uma forma quimicamente destoxificada de lipopolissacarídeo (LPS) de bactérias Gram- negativas Salmonella minnesota.

Experimentos realizados em GSK Biologicals mostraram que 3D-MPL combinado com vários veículos melhora muito tanto o tipo humoral como ο TH1 tipo de imunidade celular. QS21: é uma saponina purificada a partir do extrato bruto de casca de árvore Quillaja Saponaria Molina, que tem uma atividade de adjuvante forte, ela ativa tanto a linfoproliferação específica para antígeno como CTLs para vários antígenos.

Vacina contendo um antígeno da invenção contendo 3D-MPL e alúmen pode ser preparada em um modo análogo ao descrito em WO93/19780 ou 92/16231. Experimentos realizados a GSK Biologicals demonstraram um efeito sinergístico claro de combinações de 3D-MPL e QS21 na indução de respostas imunes tanto humorais como de tipo TH1. Vacinas contendo um antígeno, tais antígenos são descritos emUS 5750110.

Uma emulsão óleo/água pode ser composta de 2 óleos (um tocoferol e esqualeno), e de PBS contendo Tween 80 como emulsificador. A emulsão compreendida 5% esqualeno, 5% tocoferol, 0,4% Tween 80 e tinha um tamanho médio de partícula de 180 nm e conhecido como SB62 (ver WO 95/17210).

Experimentos realizados em GSK Biologicals provaram que a adição desta emulsão O/W a MPL/QS21 ainda aumenta suas propriedades imunoestimulantes, Preparação de emulsão SB62 (concentrado de duas vezes) Tween 80 é dissolvido em solução salina tamponada com fosfato (PBS) para dar uma solução a 2% em PBS. Para prover 100 ml de emulsão concentrada em duas vezes, 5g de DL alfa tocoferol e 5ml de esqualenos são submetidos a vórtice para misturar completamente. 90 ml de solução PBS/Tween são adicionados e misturados completamente. A emulsão resultante é então passada através de uma seringa e finalmente micro-fluidizada usando uma máquina M110S microfluidics. As gotículas de óleo resultantes tem um tamanho de aproximadamente 180 nm.

Exemplo 5 Experimentos com animais.

Camundongos fêmeas CD-I 8 a 10 semanas de idade são obtidos de Charles River Laboratories, Kingston, Mass. Para estudos de letalidade, cinco grupos de 9 a 11 camundongos CD-I são desafiados intraperitonealmente (i.p.) com diluições em série de S. aureus cultivado em placas CSA. Os tamanhos inoculares na faixa de ~1010 a 108 CFU/camundongo. Mortalidade é avaliada em uma base diária durante 3 dias. As doses letais de 50% (LD50S) são estimadas usando um modelo probit das relações de resposta a dose. A hipótese de nulo de LD50S comuns foi testada pelo teste de relação de possibilidade. A bacteremia subletal é iniciada por grupos de desafio de 8 a 20 camundongos pela via intravenosa (i.v.) ~2xl O6 CFU/camundongo ou pela via i.p. com ~2 x 107 CFU/ camundongo. Após inocular, grupos separados de animais são sangrados do rabo em tempos especificados, e os níveis de bacteremia são estimados por contagens de placas quantitativas realizadas em duplicata em placas de agar triptic soja com 5% de sangue de ovelha (Becton Dickinson Microbiology Systems). A significância estatística é determinada com a modificação de Welch do teste t de Stutent.

Exemplo 6 Metodologia geral para a determinação de respostas de anticorpos em vários mamíferos Os soros foram testados para anticorpos IgG para os polissacarídeos estafüocócicos por um ELISA. Brevemente, os polissacarídeos capsulares purificados de ATCC. (Rockville, Md, 20852) são revestidos a 25 /xg/ml solução salina tamponada com fosfato (PBS) em placas de microtítulo de ligação elevada (Nunc Maxísorp) durante a noite a 4 C. As placas são bloqueadas com soro de bezerro fetal a 10%(FCS), 1 hora a 37 C. As amostras de soro são pre-incubadas com 20 jug/ml polissacarídeo de parede celular (Statens Serum Institute, Copenhagen) e 10% FCS a temperatura ambiente durante 30 minutos para neutralizar anticorpos para este antígeno. As amostras são então diluídas duas vezes na microplaca em 10% FCS em PBS, e equilibradas a temperatura ambiente durante 1 hora com agitação. Após lavar, as microplacas são equilibradas com anticorpo monoclonal IgG Fc anti-humano rotulado com peroxidase (HP6043-HRP, Stratech Scientifíc Ltd) diluídas 1:4000 em 10% FCS em PBS durante 1 hora a temperatura ambiente com agitação. ELISA é realizado para medir IgG de rato usando IgG anti-Rato de cabra AffmiPure conjugado a peroxidase de Jackson ImmunoLaboratories Inc. - (H+L) (código 112-035-003) a 1:5000. As curvas de titulação são referidas para soros padrões para cada sorotipo usando comparação de log logístico por SoftMax Pro. As concentrações de polissacarídeos usadas para revestir a placa ELISA são de 10-20 gg/ml. A cor é revelada usando 4 mg OPD (Sigma) por 10 ml pH 4,5 0,1M tampão citrato com 14 μ\ H202 durante 15 min no escuro a temperatura ambiente. A reação é parada com 50 μ\ HCI, e a densidade óptica é lida a 490 nm com relação a 650 nm. As concentrações de IgG são determinadas por referência de pontos de titulação para a curva de calibre modulada usando uma equação log logística de 4 parâmetros calculada por SoftMax Pro software. O ELISA para medir IgG de rato e murinos para os polissacarídeos estafilocócicos é similar com as seguintes exceções. IgG anti-camundongo de cabra affiniPure conjugado a peroxidase de Jackson ImmunoLaboratories Inc. - (H+L) e IgG Anti-rato de cabra AffmiPure (H+L) foram empregados para detectar IgG ligado. HP6043-HRP reage igualmente com IgG purificado humano e de Rhesus, e assim este reagente é usado para anti-soro de Rhesus. ELISA de proteína é realizado similarmente ao ELISA de polissacarídeo com as seguintes modificações. A proteína é revestida durante a noite a 2,0 jug/ml em PBS. As amostras de soro são diluídas em PBS contendo 10% soro de bezerro fetal e 0,1% álcool polivinílico. O anticorpo humano ligado é detectado usando anticorpo purificado por afinidade de cabra conjugado a Peroxidase de Sigma para IgG Fc humano - (referencia A-2290). Exemplo 7 Teste de opsonofagocitose A morte opsonofagocitósica m. vitro de S. aureus por leucócitos polimorfonucleares humanos (PMNs) é realizada como descrito em Xu et al 1992 Infect. Immun. 60; 1358. PMNs Humanos são preparados a partir de sangue heparinizado por sedimentação em 3% dextrano T- 250. A mistura de reação opsônica (1 ml) contém ~ 106 PMNs em meio RPMI 1640 suplementado com 10% soro de bezerro fetal inativado com calor, ~ 108 CFU de S-aureus, e 0,1 ml de soro de teste ou preparação de IgG. O soro de coelho hiperimunizado é usado como um controle positivo, e 0,1 ml de soro de coelho não imune foi usado como uma fonte completa para as amostras de IgG. As misturas de reação são incubadas a 370C, e amostras bacterianas são transferidas a 0, 60, e 120 min em água e subseqüentemente diluídas, espalhadas em placas de agar tryptic soy, e incubadas a 370C para contagem bacteriana após incubação durante a noite. Exemplo 8 lmunogenicidade de proteínas estafilocócicas em camundongos e coelhos Animais foram imunizados com proteínas purificadas estafilocócicas a fim de gerar soro hiper-imune. Os camundongos foram imunizados três vezes (dias 0,14 e 28) com 10 /Ag de cada proteína com adjuvante em Specol. Coelhos foram imunizados três vezes (dias 0,21 e 42) com 20 pg de cada proteína com adjuvante em Specol. Os soros imunes foram coletados e avaliados em ELISA de células completas anti - proteína e anti- mortas. ELISA Anti-Proteína; A proteína purificada foi revestida a 1 /rg/ml em solução salina tamponada com fosfato (PBS) emplacas de microtitulação de ligação elevada (Nunc Maxisorp) durante a noite a 4o C. As placas foram bloqueadas com PBS-BSA 1 %, durante 30 min a temperatura ambiente com agitação. As amostras de teste foram então diluídas 1/1000 e incubadas a temperatura ambiente durante 1 hora com agitação. Após lavar, anticorpo de murinos ou coelho ligado foi detectado usando IgG Anti-Camundongo de cabra affiniPure conjugado a peroxidase de Jackson ImmunoLaboratories Inc. (H+L) (ref: 115-035-003) ou IgG anti-coelho de cabra AffiniPure (H+L) (ref: 11-035-003) diluídos 1:5000 em PBS-tween 0,05%. Os anticorpos de detecção foram incubados durante 30 min. a temperatura ambiente com agitação. A cor foi revelada usando 4 mg OPD (Sigma) + 5 /li H202 por 10 ml pH 4,5 0,1 M tampão citrato durante 15 minutos no escuro em temperatura ambiente. A reação foi parada com 50 μ\ HCI, e a densidade óptica foi lida com 490 nm relativo a 650 nm. O O. D. para uma diluição 1/1000 de Post III foi comparado ao O.D. obtido com a mesma diluição de soro pré-imune.

Resultados gerados com soros de camundongos e coelhos foram apresentados na figura 5. Uma boa soro-conversão contra cada antígeno foi observada. A avaliação de soros dirigidos contra SB1 foi prejudicada devido à atividade de ligação de Ig desta proteína. ELISA de células completas anti-mortas Células completas mortas (inativadas com formaldeído ou calor) de S. aureus tipo 5 e 8 ou S. epidermidis cepa Hay foram revestidas a 20 gg/ml em solução salina tamponada com fosfato (PBS) em placas de microtitulação de ligação elevada (Nunc Maxisorp) durante a noite a 4o C com evaporação. As placas foram bloqueadas com PBS-BSA 1% 30 min a temperatura ambiente com agitação. Proteína A foi neutralizada por adição de lOjttg/ml de anti-Proteína A de galinha purificada por afinidade (ICL ref: CPA-65A-2) diluída em PBS-tween 0,05% seguido por incubação durante 1 hora a temperatura ambiente. As amostras de teste foram então diluídas duas vezes na microplaca em PBS-0,05% de uma diluição de partida a 1/10 e incubadas 1 hora em temperatura ambiente com agitação. Após lavar, anticorpo de coelho ou murinos ligado foi detectado usando IgG Anti-Camundongo de cabra affmiPure conjugado a peroxidase de Jackson ImmunoLaboratories Inc. - (H+L) (ref: 115-035-003) ou IgG anti-coelho de cabra AffmiPure (H+L) (ref: 11-035-003) diluídos 1:5000 em PBS-tween 0,05%. Estes anticorpos de detecção foram incubados durante 30 min. a temperatura ambiente com agitação. A cor foi revelada usando 4 mg OPD (Sigma) + 5 pl H202 por 10 ml pH 4,5 0,1 M tampão citrato durante 15 minutos no escuro, em temperatura ambiente. A reação foi parada com 50 μ] HCI, e a densidade óptica foi lida a 490 nm relativa a 650 nm.

Deve-se notar que os níveis de expressão de proteínas em estafilococos irá variar dependendo das condições de cultura. Assim, um resultado negativo pode refletir a escolha de condições de cultura incorretas em vez de uma falta de imunogenicidade.

Os resultados usando soros de camundongos são mostrados na Tabela 5 e alguns dos gráficos são mostrados na figura 6. Um reconhecimento fraco de cepa de S. aureus 5 é observado com soros dirigidos contra SdrC, FnbpA, Ebh, Sbi e IsaA. O reconhecimento de cepa 8 de S. aureus é somente observado com o soro dirigido contra Sbi. O reconhecimento fraco de Hay de S. Epidermidis é observado com soros dirigidos contra Atl amidase, MRP, IsdA, IsaA, Ebh, Aaa e Sbi.

Uma seleção de resultados gerados usando soros de coelho são mostrados na figura 7 e resumidos na Tabela 6. Um reconhecimento muito bom das três cepas foi observado com IsaA e IsdB. Um reconhecimento fraco das três cepas foi observado com HarA apesar dos animais apenas receberem uma injeção em vez de três injeções usadas para as outras proteínas.

Tabela 5 Exemplo 8 Eficácia de combinações de nroteínas estafilocócicas em um modelo de colonização nasal Quinze grupos de três ratos de algodão foram inoculados com combinações de oito antígenos estafilocócicos e cinco ratos de algodão que atuaram como controles foram tratados sem antígeno. Estes 16 grupos são como a seguir: Grupo 1 - Atl-glucosamina, Atl-amidase, AAAi alfa toxina, SdrC, SdrG, Ebh, Sbi Grupo 2 - Atl-glucosamina, Atl-amidase, IsdA, IsdB, CIfA, SdrC, Ebh, FnbpA

Grupo 3 - Atl-glucosamina, Atl-amidase; HarA, IsdA, MRP, IsdB, AAA, alfa toxina Grupo 4 - Atl-glucosamina, HarA, IsdA, AAA, CIfA, IsaA, Ebh, Sbi Gmpo 5 - HarA, MRP, AAA, alfa toxina, CIfA, SdrC, Ebh, FnbpA Grupo 6 - IsdA, IsdB, AAA, alfa toxina, CIfA, SdrG, Sbi, FnbpA Grupo 7 - Atl-aminidase, IsdA, MRP, AAA, IsaA, SdrG, Ebh, FnbpA ■ Grupo 8 - Controle Grupo 9 - Atl-glucosamina, IsdA, MRP, alfa toxina, IsaA, SdrC, Sbi, FnbpA

Grupo 10 -Atl-glucosamina, MRP, isdB, AAA, CIfA, IsaA, ScIrCi SdrG

Grupo 11- Atl-amindase, MRP, IsdB, alfa toxina, CIfA, IsaA, Ebh, Sbi Grupo 12 - Atl-glucosamina, HarA, IsdB, alfa toxina, IsaA, SdrG, Ebh, FnbpA

Grupo 13 - Atl-amidase, HarA, IsdB, AAA, IsaA, SdrC, Sbi, FnbpA

Grupo 14 - Atl-glucosamina, Atl-amidase, HarA, MRP, CIfA, SdrG, Sbi, FnbpA .

Grupo 15 - Atl-amidase, HarA, IsdA, alfa toxina, CIfA, IsaA, SdfC, SdrG

Grupo 16 - HarA, IsdA, MRP, IsdB, SdrC, SdrG, Ebh, Sbi Cada mistura de antígenos continha 3 μg de cada antígeno misturado com um adjuvante feito de lipossomas contendo MPL e QS21. Os ratos do algodão foram inoculados três vezes em dias 1, 14 e 28 da experiência. Duas semanas após inoculação, a eficácia das imunizações foram avaliadas usando um teste de colonização nasal como descrito em Kokai-Kun et al (2003) Antimicrob.Agents.Chemother. 47; 1589-1597. A análise de regressão linear múltipla clássica foi realizada nos dados usando software "Design Expert 6". A presença de um antígeno foi codificada como +1 e a ausência de um antígeno por -1. Usando a equação do modelo, foi possível determinar que antígenos fossem os antígenos chave que produziram uma grande diminuição no número de colônias por focinho. Resultados Os resultados do teste de colonização nasal são mostrados na Tabela 7. O grupo de controle tinha um logCFU/focinho médio de 3,51335 e uma diminuição na colonização nasal pode ser vista para todos os grupos de ratos do algodão inoculados com as proteínas estafilocócicas. Os grupos 4,9 e 13 mostraram a maior diminuição em colonização nasal com uma diminuição de acima de 2 logs em CFU/focinho. Os grupos 12 e 16 também deram bons resultados, mostrando uma diminuição de cerca de 2 logs em CFU/ focinho.

Tabela 7 A contribuição de antígenos específicos dentro da mistura de antígeno foi calculada usando análise de regressão múltipla de dados de colonização nasal. O modelo final contém os sete melhores antígenos. Os resultados para estes antígenos são mostrados na tabela 8. Dentro do contexto da presente mistura, a inclusão de HarA deu a maior diminuição em colonização nasal, seguido por IsaA, Sbi, SdrC, autolisína-glucosamina, MRP e Ebh.

Tabela 8 - Efeitos em diferença de log CFU/fccinho e relação de CFU/focinho para os sete melhores antígenos no modelo e valores p-correspondentes REIVINDICAÇÕES

Claims (13)

1. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de compreender pelo menos duas proteínas diferentes ou fragmentos imunogênicos das mesmas selecionadas dentre pelo menos dois grupos de proteínas ou fragmentos imunogênicos selecionados dentre os seguintes grupos: grupo a) pelo menos uma proteína de ligação de componente extracelular estafilocócico isolada ou fragmento imunogênico da mesma selecionada dentre o grupo consistindo de SdrG, receptor de lamimna, EbhA, EbhB, proteína de ligação de elastina (EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina* CIfA, SdrC, SdrH, Lipase GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, CIfB, FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína de ligação de vitronectina, coagulase, MAP e fragmentos imunogênicos de qualquer um dos mesmos de pelo menos 100 amínoácidos contíguos; grupo b) pelo menos uma proteína transportadora estafilocócica isolada ou fragmento imunogênico da mesma selecionada dentre o grupo consistindo de transportador ABC imunodominante, IsdA, IsdB, Mg2+ transportador, SitC, transportador de Ni ABC e fragmentos imunogênicos de qualquer um dos mesmos de pelo menos 100 aminoácidos contíguos; grupo c) pelo menos um regulador estafilocócico de virulência, toxina ou fragmento imunogênico do mesmo selecionado dentre o grupo consistindo de alfa toxina (HIa), mutante H35R de alfa toxina, e fragmentos imunogênicos de qualquer um dos mesmos de pelo menos 100 aminoácidos contíguos; em que a composição compreende pelo menos uma proteína do grupo c).

2. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1 caracterizada pelo fato de que pelo menos uma proteína ou fragmento imunogênico é selecionada dentre grupo a).

3. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1 ou 2 caracterizada pelo fato de que pelo menos uma proteína ou fragmento imunogênico é selecionada dentre grupo b).

4. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3 caracterizada pelo fato de que pelo menos uma proteína ou fragmento imunogênico é selecionada dentre grupo a), grupo b) e grupo c).

5. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4 caracterizada pelo fato de compreender pelo menos uma proteína ou fragmento imunogênico de S. aureus.

6. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5 caracterizada pelo fato de compreender pelo menos uma proteína ou fragmento imunogênico de S. epidermidis.

7. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6 caracterizada pelo fato de ainda compreender um polissacarídeo ou oligossacarídeo PIA.

8. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7 caracterizada pelo fato de ainda compreender polissacarídeo ou oligossacarídeo capsular tipo V e/ou VIII de S. aureus.

9. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações 7 ou 8, caracterizada pelo fato de compreender um carreador de proteína, em que o carreador de proteína é selecionado dentre o grupo consistindo de toxóide de tétano, toxóide de difteria, CRM197, proteína D de Haemophilus influenzae, pneumolisina e alfa toxóide.

10. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9, caracterizada pelo fato de que uma resposta imune eficaz é gerada contra tanto S. aureus como S. epidermidis.

11. Vacina, caracterizada pelo fato de compreender a composição imunogênica como definida nas reivindicações 1-10 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

12. Método de fabricar uma vacina, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de misturar antígenos para fazer a composição imunogênica como definida nas reivindicações 1-10 e adicionar um excipiente farmaceuticamente aceitável.

13. Uso da composição imunogênica como definida nas reivindicações 1-10, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de uma vacina para tratamento ou prevenção de infecção estafilocócica.