BRPI0608678A2 - uso de uma hidrofobina, processo para perfurar um furo de sondagem para desenvolver depósitos subterráneos, lama de perfuração, e, processo para produzir uma lama de perfuração - Google Patents

Abstract

USO DE UMA HIDROFOBINA, PROCESSO PARA PERFURAR UM FURO DE SONDAGEM PARA DESENVOLVER DEPóSITOS SUBTERRNEOS, LAMA DE PERFURAçãO, E, PROCESSO PARA PRODUZIR UMA LAMA DE PERFURAçãO A invenção diz respeito ao uso de pelo menos uma hidrofobina ou menos um derivado do mesmo como um agente auxiliar para fluido pelo de perfuração.

Description

"USO DE UMA fflDROFOBINA, PROCESSO PARA PERFURAR UMFURO DE SONDAGEM PARA DESENVOLVER DEPÓSITOSSUBTERRÂNEOS, LAMA DE PERFURAÇÃO, E, PROCESSO PARAPRODUZIR UMA LAMA DE PERFURAÇÃO"

A presente invenção diz respeito a uma lama de perfuraçãocompreendendo uma hidrofobina ou um de seus derivados, e ao uso de umahidrofobina como um auxiliar para uma lama de perfuração.

As lamas de perfuração geralmente têm a tarefa de simplificara operação de perfuração freqüentemente difícil no desenvolvimento de novosdepósitos para, por exemplo, óleo mineral ou gás natural. A intenção é apoiartanto a operação de perfuração quanto o transporte de fragmentos de rochagerados no processo. A ponta da broca e a coluna de perfuração têm de serlubrificadas e refrigeradas. Além disso, a pressão hidrostática do depósito temde ser compensada, motivo pelo qual as lamas de perfuração com um elevadopeso específico são freqüentemente usadas. As paredes dos furos devemtambém ser revestidas.

As propriedades importantes de uma lama de perfuraçãocomercialmente utilizável incluem a viscosidade adequada e as propriedadesde fluxo, a densidade, a estabilidade térmica, a capacidade de emulsificação ede dispersão, o controle do pH e, não menos importante, também um alto graude compatibilidade ambiental.

Tendo em vista que a pesquisa de novos materiais brutos estásendo continuada em muitas partes do mundo, e que a perfuração profundafreqüentemente também tem de ser empreendida em localizações isoladas, porexemplo longa da costa ou no centro de florestas virgens, existe a necessidadede novos auxiliares de perfuração, especialmente auxiliares quanto a umalama de perfuração que satisfaça às elevadas exigências técnicas e possa serproduzida de uma maneira não dispendiosa e usada localmente. Além disso,uma lama de perfuração deve também ser estável em armazenagem e serutilizável durante um período prolongado.

É igualmente de particular significância que uma lama deperfuração não conduza a dano duradouro no mundo animal e vegetal naeventualidade de liberação ao ambiente.

As hidrofobinas são proteínas pequenas de cerca de 100 a 150aminoácidos, as quais podem ser produzidas de fungos filamentosos, porexemplo do Schizophyllum commune. Elas geralmente têm 8 unidades decisteína por molécula.

As hidrofobinas têm uma afinidade marcante para com asinterfaces e são, portanto, adequadas para as superfícies de revestimento, porexemplo a fim de alterar as propriedades das interfaces pela formação demembranas anfifáticas. Por exemplo, o plástico Teflon pode ser revestido pormeio de hidrofobinas para se obter uma superfície hidrofílica.

As hidrofobinas podem ser isoladas de fontes naturais. Alémdisso, os processos de produção sintética para as hidrofobinas e seusderivados são conhecidos. Por exemplo, o pedido de patente alemã DE 102005 007 480.4 apresenta um processo de produção para hidrofobinas e seusderivados.

A técnica anterior já propôs o uso de hidrofobinas para váriasaplicações.

Por exemplo, a EP-A 05 016 962 descreve o uso de proteínaspara melhorar a separação de fase de, por exemplo, misturas de óleo/água oucombustível/água. É conhecido por aqueles habilitados na técnica que asmoléculas anfifílicas específicas, dependendo da concentração de uso e domeio circundante, podem ter ou efeitos de estabilização ou dedesestabilização sobre as interfaces das fases.

A WO 96/41882 propõe o uso de hidrofobinas comoemulsificantes, espessantes, substâncias ativas de superfície, para hidrofilizaras superfícies hidrofóbicas, para melhorar a resistência à água dos substratoshidrofílicos, para produzir emulsões de óleo-em-água ou emulsões de água-em-óleo. Igualmente propostas são as aplicações farmacêuticas, como aprodução de ungüentos ou cremes, e as aplicações cosméticas, tais como aproteção da pele, ou a produção de xampus ou enxágües de cabelos. A WO96/41882 adicionalmente descreve composições, por exemplo para aplicaçõesfarmacêuticas, compreendendo uma hidrofobina.

A EP-A 1 252 516 apresenta o revestimento de janelas, lentesde contato, biossensores, dispositivos médicos, vasos para realizar testes oupara armazenagem, cascos de navios, partículas sólidas ou estruturas ouchassis de veículos de passageiros, com uma solução contendo hidrofobinaem uma temperatura de 30 a 80 °C.

A WO 03/53383 descreve o uso de hidrofobina para tratar demateriais de queratina em aplicações cosméticas.

A WO 03/10331 descreve que as hidrofobinas possuempropriedades ativas de superfície. Por exemplo, um sensor revestido dehidrofobina é apresentado, por exemplo um elétrodo de teste ao qual outrassubstâncias, por exemplo substâncias eletroativas, anticorpos ou enzimas, sãoligadas não covalentemente.

A WO 2004/000880 apresenta o revestimento de superfíciescom hidrofobina ou substâncias semelhantes à hidrofobina. E igualmentedisposto que as emulsões óleo-em-água ou água-em-óleo também podem serestabilizadas pela adição das hidrofobinas.

A WO 01/74864, que diz respeito a proteínas semelhantes àhidrofobina, também estabelece que elas podem ser usadas para estabilizardispersões e emulsões.

O uso de proteínas para separação de fase também éconhecido, em princípio. Por exemplo, a GB 195.876 descreve um processopara quebrar emulsões de água-em-óleo com o uso de colóides. Os colóidesmencionados são, como exemplos, proteínas tais como gelatinas, caseína,albumina, ou polissacarídeos tais como a goma arábica ou a goma tragacanto.

A JP-A 11-169177 descreve o uso de proteínas com atividadede lipase para quebrar emulsões.

A WO 01/60916 apresenta o uso de misturas isentas detensoativos de pelo menos uma proteína solúvel em água, pelo menos umpolissacarídeo solúvel em água, e pelo menos um polímero solúvel em água,por exemplo o óxido de polietileno, para vários usos, também incluindo para ademulsificação do óleo bruto.

Entretanto, nenhum dos documentos citados descreve o uso dehidrofobinas como auxiliares nas lamas de perfuração.

A presente invenção fornece o uso de uma hidrofobina comoum auxiliar para uma lama de perfuração, a hidrofobina sendo usadaespecialmente como um emulsificante em uma lama de perfuração.

A hidrofobina usada é preferivelmente uma hidrofobina defusão, especialmente uma hidrofobina de fusão selecionada do grupomencionado posteriormente de yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) ou yaad-Xa-basfl-his (SEQ ID NO: 24), emque yaad pode também ser um yaad' parceiro de fusão trancado tendo de 20 a293 aminoácidos.

As lamas de perfuração consistem geralmente em um ou maislíquidos, por exemplo água, óleo bruto e aditivos orgânicos ou solventes, e emsólidos em suspensão ou dissolvidos. Dependendo ao tipo de componentelíquido principal, uma distinção é inferida entre as lamas de perfuraçãoaquosas, as lamas de perfuração à base de óleo e as lamas de perfuraçãosintéticas.

Na lama de perfuração da invenção, dá-se preferência ao usode uma lama de perfuração à base de óleo (por exemplo, óleo diesel, óleomineral). Preferência é da mesma forma dada ao uso da hidrofobina (étambém possível usar uma pluralidade de hidrofobinas simultaneamente) emuma quantidade de 0,1 a 10.000 ppm, de preferência de 1 a 1000 ppm,especialmente de 1 a 600 ppm, com base, em cada caso, na composiçãoglobal. É uma das vantagens que a quantidade de hidrofobina usada sejasignificativamente menor do que no caso dos emulsificantes convencionais,os quais são usados na faixa de 2 a 10% em peso.

A lama de perfuração é preferivelmente uma lama deperfuração à base de óleo, que compreenda de 40 a 95% em peso,preferivelmente de 70 a 95% em peso, de pelo menos um componente oleoso,de 2 a 80% em peso, preferivelmente de 2 a 30% em peso, de água, e, seapropriado, outros componentes.

Outros componentes úteis incluem, por exemplo, as seguintessubstâncias:

a) sais (por exemplo os cloretos de metais alcalinos e de metaisalcalino-terrosos, os brometos de metais alcalinos e de metais alcalino-terrosos, carbonatos de metais alcalinos e de metais alcalino-terrosos; estessais com freqüência também servem para controlar o pH),

b) aditivos para compensar as perdas de líquidos (por exemploas bentonitas, amido, celulose ou os derivados destes),

c) agentes umectantes [de modo a tornar os aditivos acimamencionados (por exemplo as bentonitas) umectáveis em óleo],

d) melhoradores do fluxo (o qual reduz a resistência do fluxo,por exemplo as resinas acrílicas, os polissiloxanos, os poliuretanos),

e) aditivos para aumentar o peso específico da lama deperfuração (por exemplo a barita, hematita, magnetita, ilmenita, siderita,dolomita, calcita, cloreto de sódio),

f) emulsificantes (por exemplos os sais de ácidos graxos; aspoliamidas),

g) outros aditivos, por exemplo dispersantes, aditivos de perdade fluido, polímeros ou copolímeros, aminas (por exemplo aspoliacrilamidas),

h) aditivos de aumento da viscosidade (por exemplo abentonita, a atapulgita).

Em uma forma de realização preferida da invenção, pelomenos um outro composto que melhore a formação da emulsão é usado,assim como a hidrofobina.

A invenção também diz respeito a um processo para perfurarum furo de sondagem, especialmente para desenvolver depósitos subterrâneos,especialmente de óleo e gás, em que uma lama de perfuração que compreendapelo menos uma hidrofobina ou um derivado do mesmo seja usada.

Preferência é dada ao uso das hidrofobinas de fusão acima mencionadas.

No processo de perfuração, uma lama de perfuração com baseem óleo é usualmente usada, a qual compreende de 40 a 95% em peso de pelomenos um componente de óleo, por exemplo o biodiesel, de 2 a 60% em pesode água (por exemplo água fresca ou água do mar) e, se apropriado, outroscomponentes.

A presente invenção ainda fornece uma lama de perfuraçãopropriamente dita, compreendendo pelo menos uma hidrofobina.

Em uma forma de realização particular, a lama de perfuraçãocompreende de 70 a 95% em peso de pelo menos um componente óleo (porexemplo o biodiesel), de 2 a 30% em peso de água, e, se apropriado, até 13%em peso de outros componentes (por exemplo a bentonita e/ou o cloreto decálcio).

A invenção também diz respeito a um processo para produziruma lama de perfuração, em que o componente de hidrofobina e oscomponentes remanescentes da lama de perfuração são misturadosintimamente. Isto pode ser feito em um sítio de produção industrial ou mesmolocalmente, por exemplo sobre uma plataforma de perfuração.

O uso de proteínas tais como a hidrofobina como auxiliares deperfuração tem a vantagem de que elas são substâncias de ocorrência naturalou análogas por natureza, as quais são biodegradáveis e, assim, não levamdano duradouro ao ambiente.

Em muitas aplicações em uma larga escala, por exemploquando da perfuração para depósitos de óleo, um fator crucial é a usabilidademuito duradoura dos auxiliares usados. É um objeto da invenção prover umprocesso aprimorado para empreender a perfuração do solo com o uso deproteínas específicas.

No contexto da presente invenção, uma hidrofobina é tambémentendida como seus derivados ou hidrofobina modificada. As hidrofobinasmodificadas ou derivadas podem, por exemplo, ser proteínas de fusão dehidrofobinas ou proteínas que tenham uma seqüência de aminoácidos quetenha pelo menos 60%, por exemplo pelo menos 70%, em particular pelomenos 80%, mais preferível pelo menos 90%, especialmente preferível pelomenos 95%, de identidade com a seqüência de uma hidrofobina, e quetambém satisfaçam as propriedades biológicas de uma hidrofobina até umaextensão de 50%, por exemplo até uma extensão de 60%, em particular atéuma extensão de 70%, mais preferível até uma extensão de 80%,especialmente a propriedade de que as propriedades superficiais sejamalteradas pelo revestimento com estas proteínas, de tal modo que o ângulo decontato de uma gotícula de água antes e após o revestimento de umasuperfície de vidro com a proteína, seja aumentado em pelo menos 20°,preferivelmente em pelo menos 25°, em particular em pelo menos 30°.

Foi observado que, surpreendentemente, as hidrofobinas ouseus derivados melhoram o desempenho da perfuração na exploração e nodesenvolvimento de depósitos. Isto também se baseia no fato de que a rápidaseparação de fase da lama de perfuração e do material transportado, éimpedida. Neste contexto, mesmo pequenas quantidades de hidrofobina sãoextremamente eficazes.Para a definição das hidrofobinas, o que é crucial é aespecificidade estrutural e não a especificidade de seqüência das hidrofobinas.

A seqüência de aminoácidos das hidrofobinas naturais é muito variada, maselas todas têm um padrão altamente característico de 8 resíduos de cisteínaconservados. Estes resíduos formam quatro pontes dissulfeto intramolecular.

O término Neo término C são variáveis através de uma faixa relativamenteampla. É possível, aqui, adicionar sobre o parceiro de fusão proteínas tendoum comprimento de 10 a 500 aminoácidos por meio das técnicas da biologiamolecular conhecidas daqueles versados na prática. Além disso, ashidrofobinas e seus derivados são entendidas no contexto da presenteinvenção significarem proteínas com uma estrutura semelhante e equivalênciafuncional.

No contexto da presente invenção, o termo "hidrofobinas"deve ser entendido, daqui por diante, como significando polipeptídeos dafórmula estrutural geral (I):

Xn-Cl-Xi-So-C2-Xo-S-C3-Xi-Ioo-C4-Xi-Ioo-C5-Xi-So-C6-Xo-S-C7-Xi-SoC8-Xm (I)

em que X pode ser qualquer dos 20 aminoácidos de ocorrêncianatural (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, lie, Met, Thr5 Asn,Lys, Vai, Ala, Asp, Glu, Gly). Na fórmula, X pode ser o mesmo ou diferenteem cada caso. Os índices ao pé de X são, cada um, o número de aminoácidos,C é cisteína, alanina, serina, glicina, metionina ou treonina, em que pelomenos quatro dos resíduos designados com C são cisteína, e os índices nemsão, cada um independentemente, números naturais entre 0 e 500, depreferência entre 15 e 300.

Os polipeptídeos da fórmula (I) são também caracterizadospela propriedade de que, na temperatura ambiente, após revestir umasuperfície de vidro, eles ocasionam um aumento no ângulo de contato de umagotícula de água de pelo menos 20°, preferivelmente de pelo menos 25°, e omais preferível de 30°, em comparação, em cada caso, com o ângulo decontato de uma gotícula de água igualmente grande com a superfície de vidronão revestida.

Os aminoácidos designados com C1 a C8 são preferivelmentecisteínas; entretanto, eles podem também ser substituídos por outrosaminoácidos com enchimento espacial semelhante, preferivelmente pelaalanina, serina, treonina, metionina ou glicina. No entanto, pelo menos quatro,preferivelmente pelo menos 5, mais preferível pelo menos 6 e, em particular,pelo menos 7, das posições C1 a C8 devem consistir em cisteínas. Nasproteínas da invenção, as cisteínas podem ou estar presentes na formareduzida ou formam pontes dissulfeto um com o outro. Preferência particularé dada à formação intramolecular de pontes C-C, especialmente aquelas compelo menos uma ponte dissulfeto intramolecular, preferivelmente 2, maispreferível 3, e o mais preferível 4, pontes dissulfeto intramoleculares. No casoda troca de cisteínas acima descrita por aminoácidos com enchimento especialsemelhante, tais posições C são vantajosamente trocadas em pares, o que podeformar pontes dissulfeto intramusculares umas com as outras.

Se as cisteínas, serinas, alaninas, glicinas, metioninas outreoninas forem também usadas nas posições designadas com X, a numeraçãodas posições C individuais nas fórmulas gerais pode mudarcorrespondentemente.

Preferência é dada ao uso de hidrofobinas da fórmula geral (II):

Xn-C1-X3.25-C2-X0-2-C3-X5-50-C4-X2-35-C5-X2-15-C6-X0-2-C7-X3-35C8-Xm (II)

para realizar a presente invenção, em que C, C e os índices aopé de X e de C são, cada um, como definido acima, os índices η e m são cadaum números entre 0 e 300, e as proteínas adicionalmente caracterizam amudança ilustrada acima no ângulo de contato, e, além disso, pelo menos 6dos resíduos designados com C são cisteína. Mais preferivelmente, todos osresíduos C são cisteína.Preferência particular é dada ao uso de hidrofobinas dafórmula geral (III):

Xn-C1-X5.9-C2-C3-Xn-39-C4-X2-23-C:)-X5-9-C6-C7-X6-18C8-Xni (IH)

em que X, C e os índices ao pé de X são, cada um, comodefinidos acima, os índices nem são cada um números entre 0 e 200, e asproteínas adicionalmente caracterizam a mudança acima ilustrada no ângulode contato, e pelo menos 6 dos resíduos designados com C são cisteína. Maispreferivelmente, todos os resíduos C são cisteína.

Os resíduos Xn e Xm podem ser seqüências de peptídeos quenaturalmente são também unidas a uma hidrofobina. Entretanto, um ou ambosos resíduos podem também ser seqüências de peptídeos que sejamnaturalmente não unidas a uma hidrofobina. Isto é também entendido comosignificando aqueles resíduos Xn e/ou Xm em que uma seqüência de peptídeosque ocorra naturalmente em uma hidrofobina seja alongada por umaseqüência de peptídeos que não ocorra naturalmente em uma hidrofobina.

Se Xn e/ou Xm forem seqüências de peptídeos que não sejamligadas naturalmente nas hidrofobinas, tais seqüências serão geralmente depelo menos 20, preferivelmente pelo menos 35, mais preferível pelo menos50, e o mais preferível pelo menos 100 aminoácidos de comprimento. Um talresíduo que não seja naturalmente unido a uma hidrofobina será tambémreferido daqui por diante como um parceiro de fusão. Isto intenta expressarque as proteínas podem consistir em pelo menos um componente dehidrofobina e um componente de parceiro de fusão que não ocorra junto nestaforma na natureza.

O componente parceiro de fusão pode ser selecionado de umamultiplicidade de proteínas. É igualmente possível quanto a uma pluralidadede parceiros de fusão, serem unidos a um componente de hidrofobina, porexemplo no término amino (Xn) e no término carboxila (Xm) do componentede hidrofobina. Entretanto, é também possível, por exemplo, para os doisparceiros de fusão, serem unidos a uma posição (Xn ou Xm) da proteína dainvenção.

Parceiros de fusão particularmente adequados são proteínas deocorrência natural nos microorganismos, especialmente em E. coli ou Bacillussubtilis. Exemplos de tais parceiros de fusão são as seqüências yaad (SEQ IDNOs: 15 e 16), yaae (SEQ ID NOs: 17 e 18), e tiorredoxina.

Também muito adequados são os fragmentos ou derivadosdestas seqüências, que compreendem apenas algumas, por exemplo de 70 a99%, preferivelmente de 5 a 50%, e mais preferível de 10 a 40%, dasseqüências mencionadas, ou em que os aminoácidos ou nucleotídeosindividuais tenham sido mudados em comparação com a seqüênciamencionada, em cujo caso os percentuais são cada um baseados no número deaminoácidos.

Em uma outra forma de realização preferida, a hidrofobina defusão, bem como o parceiro de fusão como um grupo Xn ou Xm, também têmum assim chamado domínio de afinidade (rótulo de afinidade/cauda deafinidade). De uma maneira conhecida em princípio, isto compreende gruposde âncora que podem interagir com grupos complementares particulares epodem servir para mais fáceis processamento e purificação das proteínas.

Exemplos de tais domínios de afinidade compreendem os grupos (His)k,(Arg)k, (Asp)k, (Phe)k ou (Cys)k, em que k é geralmente um número natural de1 a 10. Pode preferivelmente ser um grupo (His)k, em que k seja de 4 a 6.

As proteínas usadas de acordo com a invenção comohidrofobinas ou derivados destas, podem também ser modificadas na suaseqüência de polipeptídeos, por exemplo mediante glicosilação, acetilação ou,mesmo, por reticulação química, por exemplo com glutaraldeído.

Uma propriedade das hidrofobinas ou seus derivados usadosde acordo com a invenção, é a mudança nas propriedades superficiais quandoas superfícies são revestidas com as proteínas. A mudança nas propriedadessuperficiais podem ser determinadas experimentalmente, por exemplo pelamedição do ângulo de contato de uma gotícula de água antes e após orevestimento da superfície com a proteína, e determinando-se a diferença dasduas medições.

O desempenho das medições do ângulo de contato é conhecidoem princípio por aqueles habilitados na técnica. As medições baseiam-se natemperatura ambiente e nas gotículas de água de 5 μΐ, e no uso de placas devidro como substratos. As condições experimentais exatas quanto a umexemplo de um método adequado para medir o ângulo de contato, são dadasna seção experimental. Sob as condições ali mencionadas, as proteínas defusão usadas de acordo com a invenção têm a propriedade de aumentar oângulo de contato em pelo menos 20°, preferivelmente pelo menos 25°, maispreferível pelo menos 30°, em comparação, em cada caso, com o ângulo decontato de uma gotícula de água igualmente grande com a superfície de vidronão revestida.

Hidrofobinas particularmente preferidas para realizar apresente invenção são as hidrofobinas do tipo dewA, rodA, hypA, hypB, sc3,basfl, basf2, as quais são caracterizadas estruturalmente na listagem deseqüências que segue. Elas podem também ser apenas suas partes ouderivados. É também possível quanto a uma pluralidade de componentes dehidrofobina, preferivelmente 2 ou 3, de idêntica ou diferente estrutura,estarem ligados uns aos outros e estarem ligados a uma seqüência depolipeptídeo adequada correspondente que não esteja ligada a umahidrofobina por natureza.

Também particularmente adequadas de acordo com a invençãosão as proteínas de fusão yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) ou yaad-Xa-basfl-his (SEQ ID NO: 24), com asseqüências de polipeptídeos especificadas dentro de parênteses e asseqüências de ácido nucléico que codificam para esse fim, especialmente asseqüências de acordo com as SEQ ID NOs: 19, 21, 23. As proteínas que,originando-se das seqüências de polipeptídeos apresentadas nas SEQ ID NOs:20, 22 ou 24, surgem através de troca, inserção ou deleção de pelo menos uma 10, preferivelmente 5, aminoácidos, mais preferível 5% de todos osaminoácidos, e que ainda têm a propriedade biológica das proteínas de partidaaté uma extensão de pelo menos 50%, são também formas de realizaçãoparticularmente preferidas. Uma propriedade biológica das proteínas é aquientendida significar a mudança no ângulo de contato em pelo menos 20°, oque já foi descrito.

Derivados particularmente adequados para realizar a invençãosão os resíduos derivados de yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) ou yaad-Xa-basfl-his (SEQ ID NO: 24) pelotruncamento do parceiro de fusão yaad. Ao invés do parceiro de fusão yaadcompleto (SEQ ID NO: 16) com 294 aminoácidos, pode ser vantajoso usarum resíduo yaad truncado. O resíduo truncado deve, não obstante,compreender pelo menos 20, mais preferível pelo menos 35, aminoácidos. Porexemplo, um radical truncado tendo de 20 a 293, preferivelmente de 25 a 250,mais preferível de 35 a 150 e, por exemplo, de 35 a 100 aminoácidos, podeser usado.

Um sítio de clivagem entre a hidrofobina e o parceiro de fusãoou os parceiros de fusão, pode ser utilizado para liberar a hidrofobina pura naforma não derivada (por exemplo, pela clivagem de BrCN na metionina, pelaclivagem do fator Xa, pela clivagem da enterocinase, pela clivagem datrombina, pela clivagem de TEV, etc.).

É também possível gerar proteínas de fusão em sucessão apartir de um parceiro de fusão, por exemplo yaad ou yaae, e uma pluralidadede hidrofobinas, mesmo de seqüência diferente, por exemplo DewA-RodA ouSc3-DewA, Sc3-RodA. É igualmente possível usar fragmentos de hidrofobina(por exemplo truncamentos N-terminais ou C-terminais) ou muteína quetenha até 70% de homologia. As construções ótimas são, em cada caso,selecionadas em relação ao uso particular, isto é, a fase líquida a ser separada.

As hidrofobinas usadas de acordo com a invenção ou presentesnas composições da invenção, podem ser preparadas quimicamente pormétodos conhecidos da síntese de peptídeos, por exemplo pela síntese de fasesólida de Merrifield.

As hidrofobinas de ocorrência natural podem ser isoladas defontes naturais por meio de métodos adequados. Referência é feita, comoexemplo, a Wõsten et al., Eur. J. Cell Bio. 63, 122-129 (1994) ou à WO96/41882.

As proteínas de fusão podem ser preparadas preferivelmentepor métodos da engenharia genética, em que uma seqüência de ácidosnucléicos, especialmente seqüência de DNA, codificando o parceiro de fusãoe uma codificando o componente de hidrofobina, são combinadas de umamaneira tal que a proteína desejada seja gerada em um organismo hospedeirocomo um resultado da expressão de genes da seqüência de ácidos nucléicoscombinada. Um tal processo de preparação é apresentado, por exemplo, naDE 102005007480.4.

Organismos hospedeiros adequados (organismos de produção)para o método de preparação mencionado, podem ser procariotas (incluindo aArchaea) ou eucariotas, particularmente bactérias incluindo halobactérias emethanococcia, fungos, células de insetos, células de plantas e células demamíferos, mais preferível Escherichia eoli, Bacillus subtilis, Baeillusmegaterium, Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger,Piehia pastoris, Pseudomonas spee., Iactobacillii Hansenula polymorpha,Triehoderma reesei, SF9 (ou células relacionadas), entre outras.

A invenção baseia-se também no uso de construções deexpressão compreendendo, sob o controle genético de seqüências reguladorasde ácidos nucléicos, uma seqüência de ácido nucléico que codifica umpolipeptídeo usado de acordo com a invenção, e também vetorescompreendendo pelo menos uma destas construções de expressão. Asconstruções usadas preferivelmente compreendem, a montante de 5' daseqüência codificadora particular, um promotor e, a jusante de 3', umaseqüência terminadora e, se apropriado, outros elementos reguladorescostumeiros, em cada caso ligado operativamente à seqüência codificadora.No contexto da presente invenção, um "ligação operativa" é entendidasignificar a disposição seqüencial do promotor, da seqüência codificadora, doterminador e, se apropriado, de outros elementos reguladores, de tal modo quecada um dos elementos reguladores possa preencher sua função comoplanejado na expressão da seqüência codificadora.

Exemplos de seqüências operativamente articuláveis são asseqüências de alvejamento, e também intensificadores, sinais depoliadenilação e outros.

Outros elementos reguladores compreendem marcadoresselecionáveis, sinais de amplificação, origens de replicação e outros.Seqüências reguladoras adequadas são, por exemplo, descritas em Goeddel,Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press,SanDiego, CA (1990).

Além destas seqüências de regulação, a regulação naturaldestas seqüências pode ainda estar presente a montante dos genes estruturaisreais e, se apropriado, devem ter sido geneticamente modificados de modo ainterromper a regulação natural e aumentar a expressão dos genes.

Uma construção preferida de ácido nucléico tambémvantajosamente compreende uma ou mais assim chamadas seqüências"intensificadoras", unidas funcionalmente ao promotor, o que permite aexpressão aumentada da seqüência de ácido nucléico. Igualmente naextremidade 3' das seqüências de DNA5 é possível quanto às seqüênciasvantajosas adicionais serem introduzidas, assim como outros elementosreguladores ou terminadores.

Os ácidos nucléicos podem estar presentes na construção emuma ou mais cópias. É também possível para outros marcadores tais como asresistências a antibióticos ou genes que complementem as auxotrofias,estarem presentes na construção, se apropriado para a seleção para aconstrução.

Seqüências de regulação vantajosas para a preparação seacham presentes, por exemplo, nos promotores tais como os promotores cos,tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, laclq-T7, T5, T3, gal, trc, ara,rhaP(rhaPBAD) SP6, lambda-PR ou imlambda-P, os quais vantajosamenteencontram uso nas bactérias Gram-negativas. Outras seqüências de regulaçãovantajosas se acham presentes, por exemplo, nos promotores Gram-positivosamy e SP02, e na levedura ou promotores fungicos ADC1, MFalfa, AC, P-60,CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH.

É igualmente possível usar promotores sintéticos para aregulação.

Para a expressão em um organismo hospedeiro, a construçãode ácido nucléico é vantajosamente introduzida em um vetor, por exemplo umplasmídeo ou um fago que permitam expressão ótima dos genes nohospedeiro. Separadamente dos plasmídeos e fagos, vetores são tambémentendidos significar todos os outros vetores conhecidos daqueles versados natécnica, por exemplo os vírus tais como SV40, CMV, baculovírus eadenovírus, transpósons, elementos IS, fasmídeos, cosmídeos, e DNA linearou circular, e também o sistema de Agrobacterium.

Estes vetores podem ser replicados autonomamente noorganismo hospedeiro ou cromossomicamente replicados. Plasmídeosadequados são, por exemplo, em E. coli pLG338, pACYC184, pBR322,pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHSl, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2,pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, plN-ΙΠ'-ΒΙ, tgtll ou pBdCl, emStreptomyces plJlOl, plJ364, plJ702 ou plJ361, em Bacillus pUBllO, pC194ou pBD214, em Corynebaeterium pSA77 ou pAJ667, em fungos pALSl,plL2 ou pBBl 16, em leveduras 2alfa, pAG-1, YEp6, YEp 13 ou pEMBLYe23ou em plantas pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 ou pDH51. Osplasmídeos mencionados constituem uma pequena seleção dos plasmídeospossíveis. Outros plasmídeos são conhecidos daqueles habilitados na técnica epodem ser tirados, por exemplo, do livro Cloning Veetors (Eds. Pouwels, P.H. et ai. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN O 444 904018).

Vantajosamente, a construção de ácido nucléico, para aexpressão dos outros genes presentes, adicionalmente também compreendeseqüências reguladoras de terminal 3' e/ou 5' para intensificar a expressão, asquais são selecionadas para expressão ótima, dependendo do organismohospedeiro e do gene ou genes selecionados.

Estas seqüências reguladoras intentam permitir a expressãocontrolada dos genes e da expressão protéica. Dependendo do organismohospedeiro, isto pode significar, por exemplo, que o gene seja expresso ousobrexpressadado apenas após a indução, o que ele seja expresso e/ousobrexpressadado imediatamente.

As seqüências ou fatores reguladores podem de preferênciainfluenciar positivamente e, assim, aumentar a expressão genética dos genesintroduzidos. Assim, uma amplificação dos elementos reguladores podevantajosamente ser efetuada no nível de transcrição mediante o uso de fortessinais de transcrição, tais como promotores e/ou intensificadores. Além disso,é também possível intensificar a translação mediante, por exemplo, a melhorada estabilidade do mRNA.

Em uma outra forma de realização do vetor, o vetorcompreendendo a construção de ácido nucléico ou o ácido nucléico podetambém ser introduzido nos microorganismos vantajosamente na forma de umDNA linear, e ser integrado no genoma do organismo hospedeiro por meio derecombinação heteróloga ou homóloga. Este DNA linear pode consistir emum vetor linearizado, tal como um plasmídeo, ou apenas na construção deácido nucléico ou no ácido nucléico.

Para uma expressão ótima dos genes heterólogos nosorganismos, é vantajoso alterar as seqüências de ácidos nucléicos de acordocom a "utilização de códons" específica usada no organismo. A "utilização decódons" pode ser determinada facilmente com referência às avaliações decomputador de outros genes conhecidos do organismo em questão.

Um cassete de expressão é preparado pela fusão de umpromotor adequado com uma seqüência adequada de nucleotídeos decodificação e um sinal terminador ou sinal de poliadenilação. Para este fim, arecombinação comum e as técnicas de clonagem são usadas, como descrito,por exemplo, em T. Maniatis, E. F. Fritsch e J. Sambrook, MolecularCloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold SpringHarbor, NY (1989) e em T. J. Silhavy, M. L. Berman e L. W. Enquist,Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold SpringHarbor, NY (1984) e em Ausubel, F. M. et ai, Current Protocols inMolecular Biology, Greene Publishing Assoc. e Wiley Interscience (1987)

Quanto à expressão em um organismo hospedeiro adequado, aconstrução recombinante de ácido nucléico ou a construção de genes, évantajosamente introduzida em um vetor específico do hospedeiro quepermita uma expressão ótima dos genes no hospedeiro. Os vetores são bemconhecidos daqueles habilitados na técnica e podem ser obtidos, por exemplo,de iiCloning Vectors" (Pouwels, Ρ. H. et ai, eds., Elsevier, Amsterdam-NewYork-Oxford, 1985).

Com o auxilio dos vetores, é possível prepararmicroorganismos recombinantes que tenham sido transformados, porexemplo, com pelo menos um vetor e possam ser usados para a produção dashidrofobinas ou seus derivados usados de acordo com a invenção.Vantajosamente, as construções recombinantes acima descritas sãointroduzidas em um sistema de hospedeiro adequado e expressas. Preferênciaé dada ao uso dos métodos de clonagem e de transfecção familiares daquelesexperientes na técnica, por exemplo a coprecipitação, a fusão de protoplastos,a eletroporação, a transfecção retroviral, e outros, de modo a realizar aexpressão dos ácidos nucléicos mencionados no sistema particular deexpressão. Sistemas adequados são descritos, por exemplo, em CurrentProtocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., ed., Wiley Interscience,New York 1997, ou Sambrook et al. Molecular Cloning: A LaboratoryManual. 2~ edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

É também possível preparar microorganismos homologamenterecombinados. Para este fim, é preparado um vetor que compreenda pelomenos uma seção de um gene a ser usado ou uma seqüência codificadora, emque, se apropriado, pelo menos uma deleção, adição ou substituição deaminoácido tenha sido introduzida de modo a mudar, por exemplo a romperfuncionalmente, a seqüência (vetor "silenciado"). A seqüência introduzidapode, por exemplo, também ser um homólogo de um microorganismorelacionado ou ser derivado de uma fonte de mamífero, levedura ou inseto. Ovetor usado para a recombinação homóloga pode, alternativamente, serconfigurado de tal modo que o gene endógeno no caso da recombinaçãohomóloga tenha sido transformado ou alterado de outra maneira, mas aindacodifique a proteína funcional (por exemplo, a região reguladora de montantepode ser transformada de tal modo que a expressão da proteína endógena sejatransformada). A seção transformada do gene usado de acordo com ainvenção situa-se no vetor de recombinação homóloga. A construção devetores adequados para a recombinação homóloga é descrita, por exemplo,em Thomas, K. R. e Capecchi, M. R. (1987) Cell 51: 503.

Em princípio, todos os organismos procarióticos oueucarióticos são úteis como organismos hospedeiros recombinantes quanto atais ácidos nucléicos ou a tais construções de ácidos nucléicos.Vantajosamente, os organismos hospedeiros usados são microorganismos taiscomo bactérias, fungos ou leveduras. Vantajosamente, bactérias Gram-positivas ou Gram-negativas são usadas, preferivelmente bactérias dasfamílias Enterobacteriaceae, Pseudomonadaeeae, Rhizobiaeeae,Streptomycetaceae ou Noeardiaeeae, mais preferíveis as bactérias dosgêneros Escheriehia, Pseudomonas, Streptomyees, Noeardia, Burkholderia,Salmonella, Agrobaeterium ou Rhodococcus.

Os organismos usados nos processos de preparação acimadescritos quanto às proteínas de fusão são, dependendo do organismohospedeiro, desenvolvidos ou cultivados de uma maneira conhecida daqueleshabilitados na técnica. Os microorganismos são geralmente cultivados em ummeio líquido que compreenda uma fonte de carbono, usualmente na forma deaçúcares, uma fonte de nitrogênio, usualmente na forma de fontes denitrogênio orgânico tais como o extrato de levedura ou sais tais como osulfato de amônio, elementos de traço tais como o ferro, os sais de manganêse de magnésio, e também, se apropriado, vitaminas, nas temperaturas entre 0 e100 °C, preferivelmente entre 10 e 60 °C, com aspersão de oxigênio. O pH dolíquido nutriente pode ser mantido em um valor fixado, isto é, regulado ounão durante o cultivo. O cultivo pode ser efetuado às bateladas, àssemibateladas ou continuamente. Os nutrientes podem ser introduzidos noinício da fermentação ou ser reabastecidos semicontínua ou continuamente.As enzimas podem ser isoladas dos organismos pelo processo descrito nosexemplos ou ser usadas para a reação como um extrato bruto.

As hidrofobinas usadas de acordo com a invenção, ou seusfragmentos funcionais, biologicamente ativos, podem ser preparados por meiode um processo para a preparação recombinante, em que um microorganismoprodutor de polipeptídeos é cultivado, a expressão das proteínas é induzida seapropriado, e elas são isoladas da cultura. As proteínas podem também serproduzidas desta maneira em uma escala industrial, se isto for desejável. Omicroorganismo recombinante pode ser cultivado e fermentado por processosconhecidos. As bactérias podem ser propagadas, por exemplo, em meio TB ouLB e em uma temperatura de 20 a 40 0C e em um pH de 6 a 9. Condições decultivo adequadas são descritas especificamente, por exemplo, em T.Maniatis, E. F. Fritsch e J. Sambrook, Molecular Cloning: A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989).

Se as proteínas não forem secretadas no meio de cultura, ascélulas serão então rompidas e o produto é obtido do lisado por processos deisolamento de proteínas conhecidos. Quando desejável, as células podem serrompidas por ultra-som de alta freqüência, por alta pressão, por exemplo emuma célula de pressão francesa, por osmólise, pela ação de detergentes,enzimas líticas ou solventes orgânicos, por homogeneizadores ou pelacombinação de uma pluralidade dos processos listados.

As proteínas podem ser purificadas por processoscromatográficos conhecidos, tais como a cromatografia de peneira molecular(filtração em gel) tal como a cromatografia Q Sepharose, a cromatografia detroca de íons e a cromatografia hidrofóbica, e também com outros processoscostumeiros tais como a ultrafiltração, a cristalização, a cristalização(precipitação da proteína por saturação de sal), diálise e eletroforese em gelnativo. Processos adequados são descritos, por exemplo, em Cooper, F. G.,Biochemische Arbeitsmethoden (Técnicas Bioquímicas), Verlag Walter deGruyter, Berlim, New York, ou em Scopes, R., Protein Purification, SpringerVerlag, New York, Heidelberg, Berlim.

Pode ser particularmente vantajoso facilitar o isolamento e apurificação das hidrofobinas de fusão dotando-as com grupos âncoraespecíficos que possam ligar-se a grupos complementares correspondentessobre suportes sólidos, polímeros especialmente adequados. Tais suportessólidos podem, por exemplo, ser usados como um enchimento para colunas decromatografia, e a eficiência da separação pode geralmente ser aumentadasignificativamente desta maneira. Tais processos de separação são tambémconhecidos como cromatografia de afinidade. Para a incorporação dos gruposâncora, é possível usar, na preparação das proteínas, sistemas de vetores ouoligonucleotídeos que prolonguem o cDNA mediante seqüências particularesde nucleotídeos e, daí, codifiquem as proteínas alteradas ou as proteínas defusão. Para purificação mais fácil, as proteínas modificadas compreendem asassim chamadas "etiquetas" que funcionam como âncoras, por exemplo amodificação conhecida como âncora de hexa-histidina. As hidrofobinas defusão modificadas com âncoras de histidina podem ser purificadascromatograficamente, por exemplo com o uso de Sepharose de níquel como oenchimento da coluna. A hidrofobina de fusão pode subseqüentemente sereluída novamente da coluna por meio de agentes adequados para a eluição,por exemplo uma solução de imidazol.

Em um processo de purificação simplificado, é possívelprescindir da purificação cromatográfica. Para este fim, as células sãoprimeiro removidas do caldo de fermentação por meio de um métodoadequado, por exemplo por microfiltração ou por centrifugação.

Subseqüentemente, as células podem ser rompidas por meio de métodosadequados, por exemplo por meio dos métodos já mencionados acima, e osdetritos celulares podem ser separados dos corpos de inclusão. Esta últimaseparação pode ser vantajosamente efetuada por centrifugação. Finalmente, oscorpos de inclusão podem ser rompidos de uma maneira conhecida emprincípio de modo a liberar as hidrofobinas de fusão. Isto pode ser feito, porexemplo, por meio de ácidos, bases e/ou detergentes. Os corpos de inclusãocom as hidrofobinas de fusão usadas de acordo com a invenção podemgeralmente ser dissolvidos completamente mesmo usando-se NaOH 0,1 Mdentro de aproximadamente 1 hora. A pureza das hidrofobinas de fusãoobtidas por este processo simplificado é geralmente de 60 a 80% em peso,com base na quantidade de todas as proteínas. As soluções obtidas peloprocesso de purificação simplificado descrito podem ser usadas para realizaresta invenção sem purificação adicional.

As hidrofobinas preparadas como descrito podem ser usadasou diretamente como proteínas de fusão ou, após destacamento e remoção doparceiro de fusão, como hidrofobinas "puras".

Quando uma remoção do parceiro de fusão for pretendida, érecomendável incorporar um sítio de clivagem potencial (sítio dereconhecimento específico para as proteases) dentro da proteína de fusãoentre o componente de hidrofobina e o componente do parceiro de fusão.Sítios de clivagem adequados são especialmente aquelas seqüências depeptídeos que não ocorrem de outra forma nem no componente dehidrofobina nem no componente do parceiro de fusão, o que pode serdeterminado facilmente com ferramentas da bioinformática. Exemplosparticularmente adequados são a clivagem de BrCN na metionina, ou naclivagem mediada pela protease com clivagem do fator Xa, clivagem daenterocinase, clivagem da trombina, clivagem do TEV (vírus etch do tabaco).

De acordo com a invenção, as hidrofobinas ou seus derivadospodem ser usados nas lama de perfuração compreendendo pelo menos umafase líquida. As lamas de perfuração podem ser de quaisquer composições,contanto que elas tenham pelo menos uma fase líquida, especialmente umafase com base em óleo. A composição pode, no contexto da presenteinvenção, também ter outras fases.

De acordo com a invenção, as lamas de perfuração à base deóleo em óleo são preferivelmente biodiesel, uma olefina interna, uma a-olefina, um éster vegetal, uma parafina ou uma mistura destes.

Outros solventes adequados são, por exemplo, os solventesorgânicos tais como o éter, compostos aromáticos tais como o tolueno,álcoois, alcanos, alquenos, cicloalcanos, cicloalquenos, ésteres, cetonas,naftenos ou hidrocarbonetos halogenados.

A lama de perfuração pode ser ajustada ao tipo de perfuração aser empreendido e, se apropriado, a quaisquer substâncias presentes no solo(minérios, sais, recursos minerais), de modo a obter-se ação ótima. Aperfuração com o uso da lama de perfuração pode também adicionalmente serpromovida por uma temperatura elevada, poro exemplo uma temperatura de 0a 400 °C, por exemplo de 30 a 200 °C, especialmente de 40 a 150 °C.

A quantidade da hidrofobina ou derivado do mesmo usadapode variar dentro de amplas faixas, e a quantidade é vantajosamente ajustadaà composição por si e a quaisquer outros componentes nela presentes.

A lama de perfuração (em especial sua densidade) tem de serajustada às condições específicas, por exemplo às propriedades da formação aser perfurada, à profundidade da perfuração, à pressão e à temperatura.

Foi observado surpreendentemente que, mesmo quantidadespequenas de uma hidrofobina ou derivado do mesmo conduzem a ummelhoramento na estabilidade das lamas de perfuração e em conseqüênciatambém na operação de perfuração.

De acordo com a invenção, a pelo menos uma hidrofobina ouderivado do mesmo podem ser usados em qualquer quantidade adequada. Emgeral, a pelo menos uma hidrofobina ou derivado do mesmo são usados emuma quantidade de 0,1 a 10.000 ppm, com base na composição total,preferivelmente em uma quantidade de 1 a 1.000 ppm, mais preferível de 1 a600 ppm e, o mais preferível, de 4 a 500 ppm. No contexto do presentepedido, a unidade ppm denota mg por kg.

As lamas de perfuração da invenção pode ser combinada comoutros componentes e aditivos costumeiros. Menção deve ser feita aqui, porexemplo, dos óleos carreadores sem ou com ação detergente marcante.

Óleos carreadores minerais adequados são as frações obtidasno processamento do óleo mineral, tais como lubrificante desparafinizado ouóleos base tendo viscosidades, por exemplo, da classe SN 500-2000; mastambém hidrocarbonetos aromáticos, hidrocarbonetos parafínicos ealcoxialcanóis. Da mesma forma adequada de acordo com a invenção é umafração que é obtida na refinação do óleo mineral e é conhecida como "óleo dehidrocraqueamento" (corte de destilado a vácuo tendo uma faixa de ebuliçãode cerca de 360 a 500 °C, obtenível do óleo mineral natural que tenha sidocataliticamente hidrogenado e isomerizado sob alta pressão e tambémdesparafinizado). Da mesma forma adequadas são as misturas dos óleoscarreadores minerais acima mencionados.

Exemplos de óleos carreadores sintéticos utilizáveis de acordocom a invenção são selecionados de: poliolefinas (polialfaolefinas ou olefinaspoliinternas), (poli)ésteres, (poli)alcoxilatos, poliéteres, polieteraminasalifáticas, poliéteres iniciados com alquilfenóis, polieteraminas iniciadas comalquilfenóis e ésteres carboxílicos de alcanóis de cadeia longa. Exemplos depoliolefinas adequadas são os polímeros de olefina em que Mn = de 400 a1800, em particular com base no polibuteno ou no poliisobuteno (hidrogenadoou não hidrogenado). Outros sistemas adequados de óleos carreadores são,por exemplo, descritos nas DE-A 38 26 608, DE-A 41 42 241, DE-A 43 09074, EP-A 0 452 328 e EP-A 0 548 617, as quais são aqui incorporadasexplicitamente como referência. Os óleos carreadores mencionados sãousados nas quantidades que parecem ser adequadas àqueles habilitados natécnica, para a aplicação particular.

Outros aditivos costumeiros são os inibidores da corrosão, porexemplo com base nos sais de amônio de ácidos carboxílicos orgânicos,referidos sais tendendo a formar películas, ou nos aromáticos heterocíclicosno caso de proteção da corrosão de metais não ferrosos; antioxidantes ouestabilizadores, por exemplo com base nas aminas, outros emulsificantesconvencionais; antiestáticos; metalocenos tais como o ferroceno;melhoradores da lubricidade, tais como ácidos graxos específicos, ésteresalquenilsuccínicos, aminas graxas de bis(hidroxialquila), hidroxiacetamidasou óleo de mamona; corantes (marcadores), aditivos de perda de fluidos (porexemplo, polímeros), substâncias para ajustar a densidade, modificadores dareologia, e também substâncias que formam um bolo de filtragem (porexemplo, bentonita ou argila), cal ou outros emulsificantes. Se apropriado,aminas são também adicionadas para reduzir o pH.

A invenção será ilustrada em detalhes, daqui por diante, pelosexemplos.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1

PREPARAÇÕES PARA A CLONAGEM DE yaad-His6 / yaaE-His6

Uma reação em cadeia da polimerase foi realizada com oauxílio dos oligonucleotídeos Hal570 e Hal571 (Hal 572/Hal 573). O DNApadrão usado foi o DNA genômico da bactéria Bacillus subtilis. O fragmentode DNA resultante continha a seqüência codificadora do gene yaaD / yaaE deBacillus subtilis, e um sítio de clivagem de restrição Ncol e BgIIIrespectivamente em cada extremidade. O fragmento de PCR foi purificado ecortado com as endonucleases de restrição NCol e BglII. Este fragmento deDNA foi usado como um inserto e clonado no vetor pQE60 da Qiagen, quehavia sido linearizado de antemão com as endonucleases de restrição Ncol eBglII. Os vetores pQE60YAAD#2 / pQE60YaaE#5 assim formados puderamser usados para expressar proteínas consistindo em YAADiiHISó ou YAAE-HIS6.

Hal5 70: gcgcgcccatggctcaaacaggtactga

Hal571: gcagatctccagccgcgttcttgcatac

Hal5 72: ggccatgggattaacaataggtgtactagg

Hal573: gcagatcttacaagtgccttttgcttatattccEXEMPLO 2

CLONAGEM DE HIDROFOBINA yaad DewA-His6Uma reação em cadeia da polimerase foi realizada com oauxílio dos oligonucleotídeos KaM 416 e KaM 417. O DNA padrão usado foio DNA genômico do mofo Arpergillus nidulans. O fragmento de PCRresultante continha a seqüência codificadora do gene dewA da hidrofobina eum sítio de clivagem da proteinase do fator Xa N-terminal. O fragmento dePCR foi purificado e cortado com a endonuclease de restrição NamHL Estefragmento de DNA foi usado como um inserto e clonado no vetorpQE60YAAD#2 que havia sido linearizado de antemão com a endonucleasede restrição BgIII.

O vetor #508 assim formado pôde ser usado para expressaruma proteína de fusão consistindo em YAAD::Xa:IdewAiiHIS6.KaM416: GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGCKaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC

EXEMPLO 3

CLONAGEM DA HIDROFOBINA yaad RodA-His6O plasmídeo #513 foi clonado analogamente no plasmídeo#508 com o uso dos oligonucleotídeos KaM 434 e KaM 435.

KaM434: GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGC

KaM435: CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG

EXEMPLO 4

CLONAGEM DA HIDROFOBINA yaad BASF 1 -His6

O plasmídeo #507 foi clonado analogamente ao plasmídeo#508 com o uso dos oligonucleotídeos KaM 417 e KaM 418.

O DNA padrão usado foi uma seqüência de DNA sintético(hidrofobina BASF1) (ver apêndice, SEQ ID NOs: 11 e 12).KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC

KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAGEXEMPLO 5

CLONAGEM DA fflDROFOBINA yaad BASF2-His6

O plasmídeo #506 foi clonado analogamente ao plasmídeo#508 com o uso dos oligonucleotídeos KaM 417 e KaM 418.

O DNA padrão usado foi uma seqüência de DNA sintético(hidrofobina BASF2) (ver apêndice, SEQ ID NOs: 13 e 14).KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC

KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG

EXEMPLO 6

CLONAGEM DA HIDROFOBINA yaad SC3-His6

O plasmídeo #526 foi clonado analogamente ao plasmídeo#508, com o uso dos oligonucleotídeos KaM464 e KaM465.

O DNA padrão usado foi o cDNA de Schyzophyllum commune(ver apêndice, SEQ ID NOs. 9 e 10).

KaM464: CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGCKaM465: GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT

EXEMPLO 7

FERMENTAÇÃO DA HIDROFOBINA yaad DewA-His6 DACEPA RECOMBINANTE DE E. Coli

Inoculação de 3 ml de meio líquido LB com um cepa de E.coli expressando a hidrofobina yaad DewA-His6 em tubos Greiner de 15 ml.A inoculação por 8 horas a 37 0C em uma batedeira a 200 rpm. Em cada caso,dois frascos Erlenmeyer de 1 litro com abafadores e 250 ml de meio LB (+100 μ^πιΐ de ampicilina) foram inoculados com 1 ml em cada caso da culturapreliminar e incubados por 9 horas a 37 0C em uma batedeira a 180 rpm.Inocular 13,5 litros de meio LB (+ 100 μ^πιΐ de ampicilina)com 0,5 litro de cultura preliminar (OD600nm 1:10, medido em relação a H2O)em um fermentador de 20 litros. Em uma OD60nm de -3,5, adição de 140 ml deIPTG 100 mM. Após 3 horas, esfriar o fermentador até 10 0C e centrifugar ocaldo de fermentação. Usar a pelota celular para purificação adicional.

EXEMPLO 8

100 g de pelota celular (100 a 500 mg de hidrofobina) sãoproduzidos até volume total de 200 ml com tampão de fosfato de sódio 50mM, pH 7,5, e recolocados em suspensão. A suspensão é tratada com umUltraturrax tipo T25 (Janke e Kunkel; IKA-Labortechnik) por 10 minutos esubseqüentemente incubada com 500 unidades de Benzonase (Merck,Darmstadt; ordem n° 1.01697.0001) na temperatura ambiente por 1 hora paradegradar os ácidos nucléicos. Antes do rompimento celular, a filtração éefetuada com um cartucho de vidro (PI). Para o rompimento celular e para acisão do DNA genômico remanescente, dois ciclos de homogeneizador sãorealizados em 1500 bar (Microfluidizer M-110EH; Microfluidics Corp.). Ohomogeneizado é centrifugado (Sorvall RC-5B, rotor GSA, cuba dacentrífuga de 250 ml, 60 minutos, 4 °C, 12.000 rpm, 23.000 g), osobrenadante foi colocado sobre gelo e a pelota foi recolocada em suspensãoem 100 ml de tampão de fosfato de sódio, pH 7,5. A centrifugação e aressuspensão são repetidas por três vezes, o tampão de fosfato de sódiocompreendendo 1% de SDS na terceira repetição. Após a ressuspensão, amistura é agitada por uma hora e uma centrifugação final é realizada (SorvallRC-5B, rotor GSA, cuba da centrífuga de 250 ml, 60 minutos, 4 °C, 12.000rpm, 23.000 g). De acordo com a análise de SDS-PAGE, a hidrofobina seacha presente no sobrenadante após a centrifugação final (Figura 1). Asexperiências mostram que a hidrofobina se acha provavelmente na forma decorpos de inclusão nas células correspondentes de E. coli. 50 ml dosobrenadante contendo hidrofobina são aplicados a uma coluna de 50 ml deuma Sepharose de níquel 17-5268-02 (Amersham) que tenha sido equilibradacom tampão de Tris 50 mM-Cl pH 8,0. A coluna é lavada com tampão de Tris50 mM-Cl pH 8,0 e a hidrofobina é subseqüentemente eluída com tampão deTris 50 mM-Cl pH 8,0 que compreende imidazol 200 mM. Para remover oimidazol, a solução é dialisada em relação ao tampão de Tris 50 mM-Cl pH8,0.

A Figura 1 mostra a purificação da hidrofobina preparada:

Coluna A: Aplicação à coluna de Sepharose de níquel(diluição de 1:10)

Coluna B: Fluxo atravessante = eluído da etapa de lavagem

Colunas C a E: OD 280 Máxima das frações de eluição (WP1,WP2, WP3)

A Coluna F mostra o marcador aplicado.

A hidrofobina da Figura 1 tem um peso molecular deaproximadamente 53 kD. Algumas das menores faixas representam osprodutos de degradação da hidrofobina.

EXEMPLO 9

TESTE DE DESEMPENHO; CARACTERIZAÇÃO DAHIDROFOBINA PELA MUDANÇA NO ÂNGULO DE CONTATO DEUMA GOTÍCULA DE ÁGUA SOBRE VIDRO

Substrato:

Vidro (vidraça, vidro Süddeutsche, Mannheim):

A hidrofobina purificada em conformidade com o Exemplo 8foi usada.

- Concentração da hidrofobina na solução: 100 μ§/ιη1, asolução ainda compreendia 50 mM de tampão de acetato de sódio e 0,1% demonolaurato de polioxietileno(20)-sorbitano (Tween® 20), pH da solução: 4

- Imersão das placas de vidro nesta solução durante a noite(temperatura de 80 °C)- As placas de vidro revestidas de hidrofobina são entãoretiradas da solução e lavadas em água destilada,

- Depois, incubação 10 minutos / 80 0C / 1% de solução deSDS em água destilada

- Lavar novamente em água destilada

As amostras são secadas sob ar e o ângulo de contato (emgraus) de uma gotícula de 5 μΐ de água com a superfície de vidro revestida édeterminado na temperatura ambiente.

O ângulo de contato foi medido em um sistema de ângulo decontato Dataphysics OCA 15+, Programa SCA 10.2.0 (novembro de 2002). Amedição foi efetuada de acordo com as instruções do fabricante.

O vidro não tratado deu um ângulo de contato de 30 ± 5o.

—> Aumento no ângulo de contato: 45°

EXEMPLO 10

PRODUÇÃO DE UMA LAMA DE PERFURAÇÃO COMBASE EM ÓLEO COMPREENDENDO UM CONCENTRADO DEHIDROFOBINA (yaad-Xa-dewA-His6)

O concentrado de hidrofobina foi adicionado em umaquantidade de:

a) 0 ppm

b) 10 ppm

c) 100 ppm

d) 10.000 ppm

a uma formulação compreendendo 222 ml de biodiesel e 61 mlde uma solução de cloreto de cálcio (25%).

Uma unidade de emulsificação (Ultra Turrax T50) foi usadapara produzir várias emulsões em várias séries de testes nas velocidades de2000, 6000 e 10000 rpm, e os tempos de agitação de 5 e 10 minutos.

Cada uma das amostras da lama de perfuração foi usada pararealizar os testes de emulsão (analogamente à DIN 51415).

Nestes testes, os componentes são misturados uns com osoutros, as condições (tempo de agitação e velocidade rotacional) sendoespecificadas. Depois disso, o procedimento de desfazer a mistura éobservado como uma função do tempo.

A avaliação é feita com referência aos padrões, em que

1 representa a divisão completa da emulsão,

2 representa a divisão parcial com liberação de água,

3 representa a divisão não detectável da emulsão.

Na Tabela 1, os resultados dos testes quanto às concentraçõesde hidrofobina mencionadas são compilados. O que é listado em cada casosão as avaliações das camadas de separação de fase após 1 minuto, 24 horas e48 horas (em cada na temperatura ambiente, 23 °C). Além disso, os testes sãotambém realizados em uma temperatura uniforme de 80 0C).

TABELA 1

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Sem a adição da hidrofobina A, a divisão acelerada da misturade perfuração é observada. A avaliação 1 é inaceitável para a perfuraçãooleosa na prática. Mesmo em quantidades extremamente pequenas, ashidrofobinas têm um bom efeito emulsificante. Mesmo 10 ppm dehidrofobina (menos do que 1 mg) leva a um resultado aceitável. No caso douso de hidrofobina em dosagem mais elevada, ainda melhores resultados sãoobtidos, especialmente com respeito à estabilidade térmica.LISTAGEM DAS SEQÜÊNCIASESPECIFICAÇÃO DOS NOMES DE SEQÜÊNCIAS PARAAS SEQÜÊNCIAS DE DNA E POLIPEPTÍDEOS NA LISTAGEM DESEQÜÊNCIAS

<table>table see original document page 34</column></row><table>LISTAGEM DAS SEQÜÊNCIAS

<110> BASF AktieiigeEellgchaft

<120> Uso de proteínas como deseimilsificantes

<l30> AE 20CS00040

<160> 24

<170> PatentIn versão 3.1

<210> 1

<211> 405

<212> DKTi

<213> basf-dewA<220>

<221> CDS

<222> (1).. .(405)

<223>

<400> 1

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age ggt ctg ctc ggt gçt ggc ctc ctc aac ggg etc tcg ggc aac act 240

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gct ctc gtc gac cac act gag gaa ggc ccc gtc tgc aag aac ate gtc 336"

Ala Lei» vai Asp Hia Thr Glu Glu Gly Pr© Val Cys Ly3 Αεη Ile Val100 105 110

gct tgc tgc cct gag gga acc acc aac tgt gtt gcc gtc gac aac gct 384

Ala cys cys Pro Olu Oly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn AlaÜ5 120 125

ggc gçt ggt acc aag gct gag 405

Glv Ala Gly Thr Lyg Ala Glu130 135

<210> 2<211> 135<212> PRT<213> basf-dewA

<400> 2

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Ala Ala Phe Ala Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser

4b

35

40

Ile Ala Cys Cys Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu50 55 60

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Gly Ser Ala Cys Ala Lys Ala Ser Leu Xle Asp Gln Leu Gly Leu Leu

85

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Ala Cys Cys Pro Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala

X15 120 125

Gly Ala Gly Thr Lys Ala Glu130 135

<210> 3

<211> 471

<212> DNA

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<220>

<221> CDS

<222> (1)..(471)

<223>

tcc att qct gcc gct gtc gtt gct ttc gcc gcc tcc gtc 48

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x - 5 10

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<210> 4

<211> 157

<212> PRT<213> basf-rodA

<400> 4

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Ala Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala100 105 110Val Leu Ile Gly Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn115 120 125

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<210> 5<211> 336

<212> DNA

<213> basf-HypA

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (336)

<223>

<400> 5

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1

5 10 15

48

96

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<210> 6

<211> 112

<212> PRT

<213> basf-HypA

288

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<210> 7

<211> 357

<212> DNA

<213> basf-HypB

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(357)

<223>

<400> 7

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ctc ttc gtc aat ate aat ate gtc gtt ggt act gea act acc ggc aagLeu Phe Val Asn Ile Asn Ile Val Val Gly Thr Ala Thr Thr Gly Lys20 25 30

aag age cct cag gct acg gag ctt ctt acg aag aat ggc ctt ggc ctgLys Ser Pro Gln Ala Thr Glu Leu Leu Thr Lys Asn Gly Leu Gly Leu50 55 60

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48

96

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192

240

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<210> 8<211> 119<212> PRT<213> basf-HypB

<400> 8

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<210> 9

<211> 408

<212> DNA

<213> basf-sc3

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(408)

<223>

<400> 9

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<210> 10<211> 136<212> PRT<213> basf<400> 10Met Phe Ala 1

5 10 15

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96

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Gly Cys Thr Pro Ile Asn Ile Leu130 135

<210> 11

<211> 483

<212> DNA

<213> basf-BASFl

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (483)<223 >

<400> 11

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<400> 12

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Val Asn Leu Gly Leu Gly Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His145 150 155 160

Met

<210> 13

<211> 465

<212> DNA

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<220>

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<400> 13

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1 5 10 15

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240

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<210> 14

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<212> PRT

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<400> 14

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Ala Ala Leu Pro Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val20 25 30

Gly Asn Lys Phe Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr35 40 45

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Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly130 135 140

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<210> 15

<211> 882

<212> DNA

<213> basf-yaad

<220>

<221> CDS

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<400 > 15

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atg cag ctt ggt gct gac gga gta ttt gtt ggt tct ggt att ttt aaaMet Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys225 230 235 240

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720

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816

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<210> 16

<211> 294

<212> PRT<213> basf-yaad

<400> 16

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Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser130 135 140

Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala145 150 155 160

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gtc tcc gcc gcc gtc ctc gcc ttc gcc gcc tcc gtc gcc gcc ctc cct 960

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cag cac gac tcc gcc gcc ggc aac ggc aac ggc gtc ggc aac aag ttc 1008Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val Gly Asn Lys Phe325 330 335

cct gtc cct gac gac gtc acc gtc aag cag gcc acc gac aag tgc ggc 1056Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr Asp Lys Cys Gly340 345 350

gac cag gcc cag ctc tcc tgc tgc aac aag gcc acc tac gcc ggc gac 1104Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp355 360 365

gtc ctc acc gac ate gac gag ggc ate ctc gcc ggc ctc ctc aag aac 1152Val Leu Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly Leu Leu Lys Asn370 375 380

ctc ate ggc ggc ggc tcc ggc tcc gag ggc ctc ggc ctc ttc gac cag 1200Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln385 390 395 400

tgc gtc aag ctc gac ctc cag ate tcc gtc ate ggc ate cct ate cag 1248Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly Ile Pro Ile Gln405 410 415

gac ctc ctc aac cag gtc aac aag cag tgc aag cag aac ate gcc tgc 1296Asp Leu Leu Asn Gln Val Asn Lys Gln Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys420 425 430

tgc cag aac tcc cct tcc gac gcc acc ggc tcc ctc gtc aac ctc ggc 1344Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly435 440 445

ctc ggc aac cct tgc ate cct gtc tcc ctc ctc cat atg gga tet cat 1392Leu Gly Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His Met Gly Ser His450 455 460

cac cat cac cat cac 1407

His His His His His

465

<210> 24<211> 469<212> PRT

<213> basf-yaad-Xa-BASFl-his

<400> 24

Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met15 10 15Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys20 25 30

Xle Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val35 40 45

Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro50 55 60

Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala65 70 75 80

Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met85 90 95

Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu100 105 110

Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly115 120 125

Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser130 135 140

Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala145 150 155 160

Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala165 170 175

Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro180 185 190

Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val195 200 205

Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met210 215 220

Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys225 230 235 240

Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr245 250 255

His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly260 265 270

Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg275 280 285

Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ile Glu Gly Arg Met Lys Phe Ser290 295 300Val Ser Ala Ala Val Lsu Ala Phe Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Pro305 310 315 320

Glii Kis Asp Ser Ala Ala Gly Asn Qly Asn Gly Val Gly Asn Lys phe325 330 335

Pro Val Pro Asp Asp Val Tlir Val Lvs Gln Ala Thr Asp Lys Cys Gly340 345 3 50

Asd Gln Ala Gln Leu Ssx Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp355 360 365

Vsl l>eu Thr Asp lie Asp Glu Qly Ile Leu Ala Gly Leu Ley Lys Asn370 375 380

Leu lie Gly Gly Gly Ser Gly Ser GIu Gly Leu Gly Leu IPlse Asp Gln385 390 395 400

Cys Val Lys Lew Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly lie Pro Ile Gln405 410 415

Asp Leu Leu Asn Gln Val Asn Lys Gln Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys420 425 430

Cys Gln Asn Ser Prõ Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly435 440 445

Gly Asn Pro Cys Ile í>ro Val Ser Leu Leu His Ket Gly Ser His450 455 460

His His His His Hia465

Claims (30)

1. Uso de uma hidrofobina, caracterizado pelo fato de sercomo um auxiliar para uma lama de perfuração.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a hidrofobina é usada como um emulsificante em uma lama deperfuração.

3. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2,caracterizado pelo fato de que a hidrofobina usada é uma hidrofobina defusão.

4. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3,caracterizado pelo fato de que a hidrofobina usada é uma hidrofobina de fusãoselecionada do grupo de yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) ou yaad-Xa-basfl-his (SEQ ID NO: 24), em queyaad pode também ser um parceiro de fusão trancado yaad' tendo de 20 a 293aminoácidos.

5. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4,caracterizado pelo fato de que a hidrofobina serve como um auxiliar para umalama de perfuração com base em óleo.

6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5,caracterizado pelo fato de que a hidrofobina é usada em uma quantidade de-0,1 a 10.000 ppm, com base na composição total.

7. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6,caracterizado pelo fato de que a hidrofobina é usada em uma quantidade de 1a 1.000 ppm, com base na composição total.

8. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7,caracterizado pelo fato de que a lama de perfuração é uma lama de perfuraçãocom base em óleo, a qual compreende de 40 a 95% em peso de pelo menosum componente oleoso, de 2 a 60% em peso de água e, se apropriado, outroscomponentes.

9. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8,caracterizado pelo fato de que pelo menos um outro composto que melhore aformação da emulsão é usado assim como a hidrofobina.

10. Processo para perfurar um furo de sondagem paradesenvolver depósitos subterrâneos, caracterizado pelo fato de que uma lamade perfuração que compreende pelo menos uma hidrofobina é usada.

11. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelo fato de que a hidrofobina usada na lama de perfuração é uma hidrofobinade fusão ou um derivado do mesmo.

12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 e 11, caracterizado pelo fato de que a hidrofobina usada na lama deperfuração é uma hidrofobina de fusão selecionada do grupo de yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) ou yaad-Xa-basfl-his (SEQ ID NO: 24), em que yaad pode também ser um parceiro defusão truncado yaad' tendo de 20 a 293 aminoácidos.

13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que a hidrofobina serve como um auxiliarpara uma lama de perfuração com base em óleo.

14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizado pelo fato de que a hidrofobina é usada em umaquantidade de 0,1 a 10.000 ppm, com base na composição total.

15. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 14, caracterizado pelo fato de que a hidrofobina é usada em umaquantidade de 1 a 1.000 ppm, com base na composição total.

16. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 15, caracterizado pelo fato de que a lama de perfuração é uma lama deperfuração com base em óleo, a qual compreende de 40 a 95% em peso depelo menos um componente oleoso, de 2 a 60% em peso de água e, seapropriado, outros componentes.

17. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações-10 a 16, caracterizado pelo fato de que a lama de perfuração é uma lama deperfuração com base em óleo, a qual compreende de 70 a 95% em peso depelo menos um componente oleoso, de 2 a 30% em peso de água e, seapropriado, outros componentes.

18. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações-10 a 17, caracterizado pelo fato de que a lama de perfuração é uma lama deperfuração com base em óleo, a qual compreende de 70 a 95% em peso depelo menos um componente oleoso, de 2 a 30% em peso de água e, seapropriado, até 13% em peso de outros componentes.

19. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações-10 a 18, caracterizado pelo fato de que pelo menos um outro composto quemelhore a formação de emulsão é usado, assim como a hidrofobina.

20. Lama de perfuração, caracterizada pelo fato de quecompreende pelo menos uma hidrofobina.

21. Lama de perfuração de acordo com a reivindicação 20,caracterizada pelo fato de que a hidrofobina é uma hidrofobina de fusão ouum derivado do mesmo.

22. Lama de perfuração de acordo com qualquer uma dasreivindicações 20 e 21, caracterizada pelo fato de que a hidrofobina usada nalama de perfuração é uma hidrofobina de fusão selecionada do grupo de yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) ouyaad-Xa-basfl-his (SEQ ID NO: 24), em que yaad pode também ser umparceiro de fusão truncado yaad' tendo de 20 a 293 aminoácidos.

23. Lama de perfuração de acordo com qualquer uma dasreivindicações 20 a 22, caracterizada pelo fato de que é uma lama deperfuração com base em óleo.

24. Lama de perfuração de acordo com qualquer uma dasreivindicações 20 a 23, caracterizada pelo fato de que compreende ahidrofobina em uma quantidade de 0,1 a 10.000 ppm, com base nacomposição total.

25. Lama de perfuração de acordo com qualquer uma dasreivindicações 20 a 24, caracterizada pelo fato de que compreende ahidrofobina em uma quantidade de 1 a 1.000 ppm, com base na composiçãototal.

26. Lama de perfuração de acordo com qualquer uma dasreivindicações 20 a 25, caracterizada pelo fato de que é uma lama deperfuração com base em óleo, a qual compreende de 40 a 95 por cento empeso de pelo menos um componente oleoso, de 2 a 60 por cento em peso deágua e, se apropriado, outros componentes.

27. Lama de perfuração de acordo com qualquer uma dasreivindicações 20 a 26, caracterizada pelo fato de que é uma lama deperfuração com base em óleo, a qual compreende de 70 a 95 por cento empeso de pelo menos um componente oleoso, de 2 a 30 por cento em peso deágua e, se apropriado, outros componentes.

28. Lama de perfuração de acordo com qualquer uma dasreivindicações 20 a 27, caracterizada pelo fato de que é uma lama deperfuração com base em óleo, a qual compreende de 70 a 95 por cento empeso de pelo menos um componente oleoso, de 2 a 30 por cento em peso deágua e, se apropriado, até 13 por cento em peso de outros componentes.

29. Lama de perfuração de acordo com qualquer uma dasreivindicações 20 a 28, caracterizada pelo fato de que compreende, assimcomo pelo menos uma hidrofobina, pelo menos um outro composto quemelhore a formação de emulsão.

30. Processo para produzir uma lama de perfuração comodefinida em qualquer uma das reivindicações 20 a 29, caracterizado pelo fatode que o componente de hidrofobina é intimamente misturado com oscomponentes remanescentes da lama de perfuração.