BRPI0610197B1 - Anticorpo de ligação à esclerostina, processo para a produção do mesmo, composição farmacêutica que compreende o dito anticorpo e vetor de clonagem ou expressão - Google Patents

Anticorpo de ligação à esclerostina, processo para a produção do mesmo, composição farmacêutica que compreende o dito anticorpo e vetor de clonagem ou expressão Download PDF

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Martyn Kim Robinson
Kevin Graham
Alistair James
Kelly Sue Hoffmann
Alastair Lawson
Hsieng Sen Lu
Andy Popplewell
Wenyan Shen
David Winkler
Aaron George Winters
John Latham
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Abstract

AGENTES DE LIGAÇÃO DE ESCLEROSTINA São descritas composições e métodos relacionados aos epítopos da proteína esclerostina, e agentes de ligação de esclerostina, tais como anticorpos capazes de se ligarem à esclerostina.

Description

Campo Técnico
[001] A presente invenção se refere geralmente a epítopos de proteína esclerostina, incluindo proteína esclerostina humana, e agentes de ligação (como anticorpos) capazes de ligação à esclerostina ou fragmentos.
Antecedentes da Invenção
[002] Duas ou três fases distintas de alterações em massa óssea ocorrem ao longo da vida de um indivíduo (veja Riggs, West J, Med. 154:63-77 (1991)). A primeira fase ocorre tanto em homens como em mulheres e procede à realização de um pico de massa óssea. Esta primeira fase é obtida por meio do crescimento linear das placas de crescimento endocondral e crescimento radial, devido a uma taxa de aposição do periósseo. A segunda fase começa em torno de 30 anos de idade para a ossos trabeculares (ossos planos como as vértebras e pelve) e cerca de 40 anos de idade para ossos corticais (por exemplo, ossos longos encontrados nos membros) e continua durante a velhice. Esta fase caracteriza-se por lenta perda óssea e ocorre tanto nos homens como nas mulheres. Nas mulheres, uma terceira fase de perda óssea também ocorre, muito provavelmente devido a deficiência de estrogênio pós- menopausa. Durante esta fase apenas, como mulheres podem perder uma massa óssea adicional de osso cortical e do compartimento trabecular (veja Riggs, supra).
[003] A perda do conteúdo mineral ósseo pode ser causada por uma grande variedade de condições e pode resultar em problemas médicos significativos. Por exemplo, a osteoporose é uma doença debilitante em seres humanos e é caracterizada por diminuição da massa óssea no esqueleto e densidade mineral, a deterioração estrutural do osso, incluindo a degradação da microarquitetura óssea e o correspondente aumento na fragilidade óssea (ou seja, diminui a força óssea), e susceptibilidade à fratura em indivíduos afetados. A osteoporose em seres humanos é geralmente precedida pelo osteopenia clínica (densidade mineral óssea, que é superior a um desvio padrão, mas menos de 2,5 desvios padrão abaixo do valor médio para osso adulto jovem), uma condição encontrada em aproximadamente 25 milhões de pessoas nos Estados Unidos. Outros 7-8 milhões de pacientes nos Estados Unidos foram diagnosticados com osteoporose clínica (definida como conteúdo mineral ósseo superior a 2,5 desvios padrão abaixo do que osso adulto jovem maduro). A frequência de ocorrência de osteoporose na população humana aumenta com a idade. Entre caucasianos, a osteoporose é predominante em mulheres que, nos Estados Unidos, compreende a 80% do grupo de pacientes com osteoporose. A maior fragilidade e suscetibilidade à fratura do osso esquelético no envelhecida é agravada pelo maior risco de quedas acidentais nesta população. Quadris, punhos, e vértebras fraturadas estão entre como as lesões mais comuns associadas com osteoporose. As fraturas de quadril em particular são extremamente desconfortáveis e caras para o doente, e para como mulheres, se relacionam com altas taxas de mortalidade e morbilidade.
[004] Embora a osteoporose tenha sido considerada como um aumento do risco de fraturas devido à diminuição da massa óssea, alguns dos tratamentos atualmente disponíveis para perturbações esqueléticas podem aumentar a densidade óssea de adultos, bem como a maioria dos tratamentos disponíveis atualmente trabalham principalmente através da inibição da reabsorção óssea mais, Em vez de estimular a nova formação óssea. O estrogênio está agora sendo prescrito para retardar a perda óssea. No entanto, existe alguma controvérsia sobre se os doentes ganham qualquer benefício a longo prazo e se o estrogênio tem qualquer efeito sobre doentes com mais de 75 anos de idade. Além disso, acredita-se que o uso de estrogênio aumente o risco de câncer da mama e endométrio. A calcitonina, osteocalcina com vitamina K, ou altas doses de cálcio dietário, com ou sem vitamina D, também foram sugeridos para mulheres pós-menopáusicas. Altas doses de cálcio, no entanto, têm frequentemente efeitos gastrintestinais secundários indesejáveis, e os níveis de cálcio sérico e urinário devem ser continuamente controlados (por exemplo, Khosla e Riggs, Mayo Clin. Proc. 70:978982, 1995). Outras abordagens terapêuticas atuais para a osteoporose incluem bifosfonatos (por exemplo, Fosamax ™, Actonel ™, Bonviva ™, Zometa ™, olpadronato, neridronato, skelid, bonefos), hormônio paratiroidiano, calcilíticos, calcimiméticos (por exemplo, Cinacalcet), estatinas, esteróides anabolizantes, sais de lantânio e estrôncio, e fluoreto de sódio. Esses tratamentos, no entanto, são muitas vezes associados a efeitos secundários indesejáveis (veja Khosla e Riggs, supra). A esclerostina, o produto do gene SOST, está ausente em esclerosteose, uma doença esquelética caracterizada por super- crescimento do osso e ossos fortemente densos (Brunkow et al., Am. J. Hum. Genet, 68:577-589, 2001; Balemans et al., Hum. Mol. Genet, 10:537-543, 2001). A sequência de aminoácidos da esclerostina humana é relatada por Brunkow et al. ibid e é divulgada aqui como SEQ ID n°.: 1.
Breve Resumo da Invenção
[005] São divulgadas aqui composições e métodos que podem ser utilizados para aumentar pelo menos um entre formação óssea, densidade mineral óssea, conteúdo mineral ósseo, massa óssea, qualidade óssea e força óssea, e que, portanto, podem ser utilizados para tratar uma ampla variedade de condições de que um aumento de pelo menos um entre formação óssea, densidade mineral óssea, conteúdo mineral ósseo, massa óssea, qualidade óssea e força óssea é desejável. A presente invenção também oferece outras vantagens relacionadas descritas aqui.
[006] A invenção se refere às regiões (epítopos) da esclerostina humana reconhecidas pelos agentes de ligação divulgados aqui, métodos para a utilização desses epítopos, e métodos de produção desses epítopos.
[007] A invenção também se relaciona a epítopos específicos para a região de esclerostina identificados como volta 2, e agentes de ligação, que se ligam especificamente para aquela região.
[008] A invenção também se relaciona a epítopos específicos para a região de nó de cistina de esclerostina, e agentes de ligação tais como anticorpos que se ligam especificamente com aquela região.
[009] A invenção se relaciona a agentes de ligação, tais como anticorpos, que se ligam especificamente à esclerostina. Os agentes de ligação podem ser caracterizados pela sua capacidade de bloquear de modo cruzado a ligação de pelo menos um anticorpo divulgado aqui para esclerostina e/ou a ser bloqueado de modo cruzado a partir da ligação à esclerostina por pelo menos um anticorpo divulgado aqui. Os anticorpos e outros agentes de ligação também podem ser caracterizados pelo seu caráter de ligação padrão para peptídeos de esclerostina humana em um “ensaio de ligação de concorrência do epítopo de peptídeo de esclerostina humana”, como divulgados aqui.
[0010] A invenção se relaciona a agentes de ligação, tais como anticorpos, que podem contribuir para aumentar pelo menos um de formação óssea, densidade mineral óssea, conteúdo mineral ósseo, massa óssea, qualidade óssea e força óssea em um mamífero.
[0011] A invenção se relaciona a agentes de ligação, tais como anticorpos, que podem bloquear o efeito inibitório da esclerostina em um ensaio de mineralização com base na célula.
[0012] A invenção ainda se refere a construção de um polipeptídeo composto por dois, três ou quatro fragmentos polipeptídicos ligados por pelo menos uma ligação dissulfeto, o que representa uma região central de nó de cistina de esclerostina, e anticorpos capazes de se ligar especificamente aos mesmos.
[0013] A invenção se refere a métodos de obtenção de epítopos adequados para o uso como imunogênios para gerar, em mamíferos, agentes de ligação, tais como anticorpos capazes de se ligar especificamente à esclerostina; em certas modalidades os agentes de ligação gerados são capazes de neutralizar a atividade da esclerostina in vivo.
[0014] A invenção se refere a uma composição para obter um anticorpo específico para esclerostina quando a composição é administrada a um animal, o que inclui uma composição polipeptídeo tendo sequência de aminoácidos da SEQ ID n°.: 6, SEQ ID n°.: 63, SEQ ID n°: 64, SEQ ID n°.: 65, SEQ ID n°: 66, SEQ ID n°.: 67, SEQ ID n°.: 68, ou SEQ ID n°.: 69.
[0015] A invenção também se refere a uma composição para obter um anticorpo específico para esclerostina quando a composição é administrada a um animal, a composição compreendendo pelo menos um polipeptídeo constituído essencialmente da sequência de aminoácidos SEQ ID n°.: 2, SEQ ID n°.: 3, SEQ ID n°.: 4 ou SEQ ID n°.: 5, a composição pode incluir pelo menos dois ou pelo menos três das sequências de aminoácidos SEQ ID n°.: 2, SEQ ID n°.: 3, SEQ ID n°.: 4 e SEQ ID n°.: 5, a composição pode incluir todos os quatro das sequências de aminoácidos SEQ ID n°.: 2, SEQ ID n°.: 3, SEQ ID n°.: 4 e SEQ ID n°.: 5.
[0016] A invenção se refere ainda a uma composição para obter um anticorpo específico para esclerostina quando a composição é administrada a um animal, a composição inclua um polipeptídeo com as sequências de aminoácidos de SEQ ID n°.: 2, SEQ ID n°.: 3, SEQ ID n°.: 4 e SEQ ID n°.: 5, onde SEQ ID n°.: 2 e 4 estão ligados por uma ligação dissulfeto nas posições de aminoácidos 57 e 111 com referência à SEQ ID n°.: 1, e SEQ ID n°.: 3 e 5 são ligados por pelo menos um de (a) uma ligação dissulfeto nas posições de aminoácidos 82 e 142 com referência à SEQ ID n°.: 1, e (b) uma ligação dissulfeto nas posições de aminoácidos 86 e 144 com referência à SEQ ID n°.: 1; o polipeptídeo Podem manter a estrutura do terciário correspondente polipeptídeo região de esclerostina humana de SEQ ID n°.: 1.
[0017] A invenção também se refere ao polipeptídeo T20.6 constituído essencialmente de um multiplicar truncado proteína esclerostina humana de SEQ ID n°.: 1, onde aminoácidos 1-50, 65-72, 91-100, 118-137 e 150-190 da SEQ ID n°.: 1 estão ausentes da polipeptídeo; este polipeptídeo pode ser obtido por digestão tríptica de esclerostina humana, e como proteínas podem ser isolados por fracionamento HPLC.
[0018] A invenção ainda se refere a porção imunogênica T20.6 de esclerostina humana compreendendo aminoácidos 51-64, 73-90, 101-117 e 138-149 da SEQ ID n°.: 1, onde a porção imunogênica compreende pelo menos um dos seguintes: (a) uma ligação dissulfeto entre os aminoácidos 57 e 111; (b) uma ligação dissulfeto entre os aminoácidos 82 e 142; e (c) uma ligação dissulfeto entre os aminoácidos 86 e 144; a porção imunogênica pode ter pelo menos duas destas ligações dissulfeto; e a porção imunogênica pode ter as três ligações dissulfeto.
[0019] A invenção ainda se refere a uma porção imunogênica T20.6 derivada de esclerostina humana compreendendo aminoácidos 57-64, 73-86, 111-117 e 138-144 da SEQ ID n°.: 1, onde a porção imunogênica compreende pelo menos um dos : (a) uma ligação dissulfeto entre os aminoácidos 57 e 111; (b) uma ligação dissulfeto entre os aminoácidos 82 e 142; e (c) uma ligação dissulfeto entre os aminoácidos 86 e 144; a porção imunogênica pode ter pelo menos duas destas ligações dissulfeto; e a porção imunogênica pode ter todos as três ligações dissulfeto.
[0020] A invenção ainda se refere a um polipeptídeo constituído essencialmente de uma proteína esclerostina humana de SEQ ID n°.: 1 truncada nas extremidades do terminal C e terminal N, onde os aminoácidos 1-85 e 112-190 da SEQ ID n°.: 1 estão ausentes do polipeptídeo.
[0021] A invenção também se relaciona a uma porção de esclerostina humana imunogênica, compreendendo aminoácidos 86-111 de SEQ ID n°.: 1; a porção imunogênica pode ser constituída essencialmente por aminoácidos contíguos CGPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRC (SEQ ID n°.: 6).
[0022] A invenção ainda se refere a uma porção imunogênica de esclerostina de ratos, compreendendo aminoácidos 92-109 de SEQ ID n°.: 98; a porção imunogênica pode ser constituída essencialmente por aminoácidos contíguos PNAIGRVKWWRPNGPDFR (SEQ ID n°.: 96).
[0023] A invenção ainda se refere a uma porção imunogênica de esclerostina de ratos, compreendendo aminoácidos 99-120 de SEQ ID n°.: 98; a porção imunogênica pode ser constituída essencialmente por aminoácidos contíguos KWWRPNGPDFRCIPDRYRAQRV (SEQ ID n°.: 97).
[0024] A invenção se refere a um método de produzir uma porção de esclerostina humana imunogênica, compreendendo as etapas de: (a) tratamento da esclerostina humana para conseguir completar a digestão tríptica; (b) coleta da amostra da digestão tríptica com peso molecular médio de 7122,0 Daltons (massa teórica 7121,5 Daltons) ou tempo de retenção de cerca de 20,6 minutos, conforme determinado por eluição de uma HPLC de coluna de fase reversa com gradiente linear de ácido trifluoracético 0,05% para acetonitrila 90% em TFA 0,05% com uma taxa de fluxo de 0,2 mL/min; e (C) purificar a porção imunogênica.
[0025] A invenção se refere a um método de produção de um anticorpo capaz de ligar especificamente com esclerostina, incluindo: (a) imunizar um animal com uma composição que inclui um polipeptídeo de SEQ ID n°.: 6, SEQ ID n°.: 63, SEQ ID n°.: 64, SEQ ID n°.: 65, SEQ ID n°.: 66, SEQ ID n°.: 67, SEQ ID n°.: 68, SEQ ID n°.: 69, SEQ ID n°.: 96, ou SEQ ID n°.: 97; (b) coletar o soro do animal; e (c) isolar um anticorpo sérico capaz de ligar especificamente com esclerostina.
[0026] A invenção também se refere a um método de produção de um anticorpo capaz de ligar especificamente com esclerostina, o método inclui: (a) imunizar um animal com uma composição que inclui polipeptídeo T20.6 ou um derivado da T20.6; (b) coletar o soro do animal; e (c) isolar um anticorpo sérico capaz de ligar especificamente com esclerostina.
[0027] A invenção ainda se refere a um método de detecção de um anticorpo anti-esclerostina em uma amostra biológica, compreendendo as etapas de (a) contatar a amostra biológica com um polipeptídeo constituído essencialmente por SEQ ID n°.: 6, SEQ ID n°.: 63, SEQ ID n°.: 64, SEQ ID n°.: 65, SEQ ID n°.: 66, SEQ ID n°.: 67, SEQ ID n°.: 68, SEQ ID n°.: 69, SEQ ID n°.: 96, ou SEQ ID n°.: 97, em condições que permitam um complexo de modo a formar entre os anticorpos e o polipeptídeo; e (b) detectar a presença ou ausência do complexo, onde a presença do complexo indica que a amostra biológica contém um anticorpo anti-esclerostina.
[0028] A invenção também se refere a um método de detecção de um anticorpo anti-esclerostina em uma amostra biológica, compreendendo as etapas de (a) contatar a amostra biológica com polipeptídeo T20.6 ou um derivado da T20.6 em condições que permitam um complexo de modo a formar entre os anticorpos e o polipeptídeo; e (b) detectar a presença ou ausência do complexo, onde a presença do complexo indica que a amostra biológica contém um anticorpo anti-esclerostina.
[0029] A invenção ainda se refere a um agente de ligação à esclerostina, como um anticorpo, que bloqueia de modo cruzado a ligação de pelo menos um dos anticorpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, ou Ab-D para uma proteína esclerostina. o agente de ligação à esclerostina pode também ser bloqueado de modo cruzado desde a ligação à esclerostina em pelo menos um dos anticorpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, ou Ab-D. O anticorpo isolado, ou um fragmento ligado ao antígeno, pode ser um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, um anticorpo humanizado, um anticorpo humano, um anticorpo quimérico ou similar.
[0030] A invenção ainda se refere a um agente de ligação à esclerostina, como um anticorpo, que é impedido de ligar de modo cruzado à esclerostina em pelo menos um dos anticorpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, ou Ab-D. O anticorpo isolado, ou um fragmento ligado ao antígeno, pode ser um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, um anticorpo humanizado, um anticorpo humano, um anticorpo quimérico ou similar.
[0031] A invenção ainda se refere a um agente de ligação à esclerostina, como um anticorpo isolado, que bloqueia de modo cruzado a ligação de pelo menos um dos anticorpos 1.24 (Ab-1 a Ab-24) a uma proteína esclerostina. O agente de ligação à esclerostina pode também ser bloqueado de modo cruzado da ligação à esclerostina em pelo menos um dos anticorpos 1.24 (Ab-1 a Ab-24). O anticorpo isolado, ou um fragmento ligado ao antígeno, pode ser um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, um anticorpo humanizado, um anticorpo humano, ou um anticorpo quimérico.
[0032] A invenção ainda se refere a um agente de ligação à esclerostina, como um anticorpo isolado, que é impedido de ligar de modo cruzado à esclerostina em pelo menos um dos anticorpos 1.24 (Ab-1 a Ab-24), o anticorpo isolado, ou uma ligação ao fragmento de antígeno da mesma, pode ser um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, um anticorpo humanizado, um anticorpo humano, ou um anticorpo quimérico.
[0033] A invenção ainda se refere a um agente de ligação, como um isolado anticorpo que exibe um padrão semelhante a ligação à peptídeos de esclerostina humana em um “esclerostina humana peptídeo epítopo ensaio de competição de ligação”, como que exibiu em pelo menos um dos anticorpos Ab-A, AbB, C ou Ab-Ab-D; o anticorpo isolado, ou um fragmento ligado ao antígeno, pode ser um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, um anticorpo humanizado, um anticorpo humano, ou um anticorpo quimérico.
[0034] A invenção ainda se refere a um método para tratamento de uma doença óssea associada com pelo menos um de baixa formação óssea, baixa densidade mineral óssea, baixo conteúdo mineral ósseo, baixa massa óssea, baixa qualidade óssea e baixa força óssea em um mamífero indivíduo, que compreende Proporcionando a um indivíduo que necessitem de tal tratamento em um quantidade de um processo anti-agente de ligação à esclerostina suficiente para pelo menos um aumento de formação óssea, densidade mineral óssea, conteúdo mineral ósseo, massa óssea, qualidade óssea e força óssea onde o anti-agente de ligação à esclerostina compreende um anticorpo, ou fragmento de ligação à esclerostina.
[0035] A invenção também se refere a um isolado esclerostina polipeptídeo ou fragmentos, onde o polipeptídeo contém 6 resíduos conservados de cisteína e os fragmentos desse compreendem de 7 a 14 aminoácidos de SEQ ID n°.: 2, 8 a 17 aminoácidos de SEQ ID n°.: 3 ; 8 a 18 resíduos de SEQ ID n°: 4; e 6 a 12 resíduos de SEQ ID n°.: 5, e do polipeptídeo ou fragmentos dele estão estabilizados por ligações dissulfeto entre SEQ ID n°.: 2 e 4, e entre SEQ ID n°.: 3 e 5; o polipeptídeo ou fragmentos podem incluir 10-14 aminoácidos da SEQ ID n°.: 2, 14 a 17 aminoácidos de SEQ ID n°.: 3, 13 a 18 aminoácidos de SEQ ID n°.: 4;, e de 8 a 12 resíduos de SEQ ID n°.: 5; e do polipeptídeo ou fragmentos podem incluir SEQ ID n°.: 2, SEQ ID n°.: 3, SEQ ID n°.: 4, e SEQ ID n°.: 5.
[0036] São fornecidos aqui anticorpos que se ligam especificamente aos esclerostina humana. Os anticorpos são caracterizados pela sua capacidade de bloquear de modo cruzado a ligação de pelo menos um anticorpo divulgado aqui à esclerostina humana e/ou a ser bloqueado de modo cruzado desde ligação esclerostina humana por pelo menos um anticorpo divulgado aqui.
[0037] É fornecido também um anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação ao antígeno, que pode aumentar pelo menos um de formação óssea, densidade mineral óssea, conteúdo mineral ósseo, massa óssea, qualidade óssea e força óssea em um mamífero.
[0038] É fornecido também um anticorpo isolado, ou um fragmento de ligação ao antígeno, que podem bloquear o efeito inibitório de esclerostina em um ensaio de mineralização com base na célula.
[0039] É fornecido também um agente de ligação, tal como anticorpos, que se liga especificamente à esclerostina humana e tem pelo menos uma sequência CDR selecionada a partir de SEQ ID n°.s: 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 78, 79, 80, 81, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 237, 238, 239,240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256,257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273,274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290,291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 351, 352, 353, 358, 359, e 360, e variantes, onde o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo neutraliza esclerostina.
[0040] É fornecido também um agente de ligação, tal como anticorpos, que se liga especificamente à esclerostina humana e tem pelo menos uma sequência CDR selecionada a partir SEQ ID n°.s: 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 78, 79, 80, 81, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 237, 238, 239, 240,241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257,258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274,275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 351, 352, 353, 358, 359, e 360, e variantes.
[0041] Também são fornecidas regiões de esclerostina humana que são importantes para a atividade in vivo da proteína.
[0042] Estes e outros aspectos da presente invenção tornar-se-ão aparentes mediante referência à seguinte descrição detalhada e desenhos anexos. Todas as referências divulgadas aqui são incorporadas por referência em suas integridades como se cada uma fosse incorporada individualmente.
Breve Descrição dos Desenhos
[0043] Figura 1 mostra as sequências de aminoácidos de forma madura (peptídeos sinal clivados) da cadeia leve (Figura 1A) (SEQ ID n°.: 23) e cadeia pesada (Figura 1B) (SEQ ID n°: 27) para os anti-Esclerostina humana e anticorpo anti- esclerostina de rato Ab-A.
[0044] Figura 2 ilustra as sequências de aminoácidos de forma madura (peptídeos sinal clivados) da cadeia leve (Figura 2A) (SEQ ID n°.: 31) e cadeia pesada (Figura 2B) (SEQ ID n°.: 35) para o anticorpo Ab-B anti-Esclerostina humana e anti- esclerostina de rato.
[0045] Figura 3 descreve as sequências de aminoácidos de forma madura (peptídeos sinal clivados) da cadeia leve (Figura 3A) (SEQ ID n°.: 15) e cadeia pesada (Figura 3B) (SEQ ID n°.: 19) para o anticorpo Ab-C anti-Esclerostina humana e anti-esclerostina de rato.
[0046] Figura 4 ilustra as sequências de aminoácidos de forma madura (peptídeos sinal clivados) da cadeia leve (Figura 4A) (SEQ ID n°.: 7) e cadeia pesada (Figura 4B) (SEQ ID n°.: 11) para o anticorpo Ab-D anti-esclerostina humana e anti- esclerostina de rato.
[0047] Figura 5 descreve a densidade mineral óssea em ratos medidos em dois sítios esqueléticos (vértebras lombares e matáfise tibial) após 3 semanas de tratamento com o veículo, PTH (1-34), Ab-A ou Ab-B.
[0048] Figura 6 mostra a densidade mineral óssea em ratos medidos em dois sítios esqueléticos (vértebras lombares e matáfise tibial) após 2 semanas de tratamento com o veículo, PTH (1-34) ou Ab-C.
[0049] Figura 7 descreve a densidade mineral óssea em ratos medidos em dois sítios esqueléticos (Vértebras lombares e matáfise tibial) após 3 semanas de tratamento com o veículo ou Ab-D.
[0050] Figura 8 descreve a sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal clivado) de esclerostina humana (SEQ ID n°.: 1). Também é descrita a sequência nucleotídica de esclerostina humana codificação região que codifica a forma madura de esclerostina humana. As oito cisteínas são numerados C1 a C8. O nó de cistina é formado por três ligações dissulfeto (C1-C5; C3-C7; C4-C8). C2 e C6 também formam uma ligação dissulfeto, porém este dissulfeto não faz parte de nó de cistina.
[0051] Figura 9 ilustra um esquema da estrutura de base da esclerostina humana. Há um braço terminal N (a partir do primeiro Q para C1) e um braço terminal C (a partir de C8 ao terminal Y). Entre esses braços há a estrutura de nó de cistina (formada por três dissulfetos: C1-C5; C3-C7; C4-C8) e três voltas, que são designadas Volta 1, volta 2 e volta 3. As regiões distais da volta 1 e volta 3 estão ligadas pela dissulfeto C2-C6. Sítios potenciais de clivagem com tripsina são indicados (arginina e lisina = R = K). Alguns dos sítios potenciais de clivagem de AspN são indicados (apenas ácido aspártico (D) os resíduos são mostrados).
[0052] Figura 10 ilustra os mapas de HPLC de peptídeo humano esclerostina após digestão tanto com tripsina como AspN. Os peptídeos de esclerostina humana gerados por digestão por tripsina são indicados (T19.2, T20, T20.6 e T21-22), como são os peptídeos de esclerostina humana gerados por digestão com AspN (AspN14.6, AspN18.6 e AspN22.7-23.5).
[0053] Figura 11 ilustra sequência e informação de massa para o isolamento de peptídeos de esclerostina humana ligados com dissulfeto gerados por digestão por tripsina. Seq. POS. = Posição de sequência. OBS. = Observadas. A massa Observada foi determinada pela análise ESI-LC-MS.
[0054] Figura 12 ilustra sequência e informação de massa para o isolamento de peptídeo de esclerostina humana gerado por AspN digestão. O peptídeo AspN22.7-23,5 contém como 4 ligações dissulfeto. Seq. POS. = Posição de sequência. OBS. = Observadas. A massa Observada foi determinada por análise ESI- LC-MS.
[0055] Figura 13 mostra um processo linear esquemático de quatro peptídeos de esclerostina humana (T 19,2, T20, T20.6 e T21-22) gerados por digestão por tripsina.
[0056] Figura 14 mostra um processo linear esquemático de cinco peptídeos de esclerostina humana (AspN 14,6, AspN18.6 e AspN22.7-23,5) gerados por AspN digestão. O AspN14.6 HPLC pico é composto de três peptídeos não ligados por quaisquer ligações dissulfeto.
[0057] Figura 15 mostra o sinal de unidade de ressonância (Ru) do “ensaio de ligação de competição ao epítopo de peptídeo de esclerostina humana” baseado em Biacore. A ligação Mab relativa para vários peptídeos de esclerostina humana (em solução), versus ligação Mab para esclerostina humana de forma madura intacta (imobilizadas sobre Chip Biacore) foi avaliada. Os dados mostrados são de AbA. Os peptídeos de esclerostina humana utilizados foram T19.2, T20, T20.6, T21-22, AspN14.6, AspN18.6 e AspN22.7-23,5.
[0058] Figura 16 mostra o sinal de unidade de ressonância (Ru) do “ensaio de ligação de competição ao epítopo de peptídeo de esclerostina humana” baseado em Biacore. A ligação Mab relativa para vários peptídeos de esclerostina humana (em solução), versus ligação Mab para esclerostina humana de forma madura intacta (imobilizadas sobre Chip Biacore) foi avaliada. Os dados mostrados são de Ab B. Os peptídeos de esclerostina humana utilizados foram T19.2, T20, T20.6, T21-22, AspN14.6, AspN18.6 e AspN22.7-23,5.
[0059] Figura 17 mostra a ressonância unidade (Ru) sinal do “ensaio de ligação de competição ao epítopo de peptídeo de esclerostina humana” baseado em Biacore. A ligação Mab relativa para vários peptídeos de esclerostina humana (em solução), versus ligação Mab para esclerostina humana de forma madura intacta (imobilizadas sobre Chip Biacore) foi avaliada. Os dados mostrados são de Ab-C. Peptídeos de esclerostina humana utilizados foram T19.2, T20, T20.6, T21-22, AspN14.6, AspN18.6 e AspN22.7-23,5.
[0060] Figura 18 mostra a ressonância unidade (Ru) sinal de “ensaio de ligação de competição ao epítopo de peptídeo de esclerostina humana” baseado em Biacore. A ligação Mab relativa para vários peptídeos de esclerostina humana (em solução), versus ligação Mab para esclerostina humana de forma madura intacta (imobilizadas sobre Chip Biacore) foi avaliada. Os dados mostrados são de Ab-D. Peptídeos de esclerostina humana utilizados foram T19.2, T20, T20.6, T21-22, AspN14.6, AspN18.6 e AspN22.7-23,5.
[0061] Figura 19 mostra dois Mab ligação epítopos de esclerostina humana. Figura 19A mostra sequência do epítopo de volta 2 para ligação do Ab-A, Ab-B para esclerostina humana (SEQ ID n°.: 6). Figura 19B mostra sequência, ligação dissulfeto e esquemática do T20.6 epítopo para ligação de Ab e Ab-C-D para esclerostina humana (SEQ ID n°.:2-5).
[0062] Figura 20 ilustra os mapas de HPLC peptídeo humano esclerostina após digestão com tripsina. Figura 20A mostra digestão dos esclerostina humana Ab-D complexas. Figura 20B mostra de digestão de esclerostina humana sozinha. Os picos dos peptídeos T19.2, T20, T20.6 e T21-22 são indicados.
[0063] Figura 21 mostra a sequência, ligação dissulfeto e esquemática do epítopo “derivado 1 T20.6 (nó de cistina + 4 braços)” para ligação do Ab-D para esclerostina humana. (SEQ ID n°.:70-73).
[0064] Figura 22 mostra os resultados do ensaio de mineralização de linhagem celular de osteoblastos MC3T3-E1-BF utilizado para identificar as medidas de Mabs anti-esclerostina neutralizadoras. A esclerostina de camundongos(Scl) foi utilizada em 1 μg/mL. Os anticorpos monoclonais foram utilizados em 10 e 5 μg/mL. A extensão da mineralização (vários tipos de fosfato de cálcio insolúvel) foi quantificada medindo cálcio.
[0065] Figura 23 ilustra os resultados do ensaio de mineralização de linhagem celular de osteoblastos MC3T3-E1-BF utilizado para identificar as medidas de Mabs anti-esclerostina neutralizadoras. Esclerostina Humana (Scl) foi utilizada em 1 μg/mL. Os anticorpos monoclonais foram utilizados em 8 e 4 μg/mL. Extensão da mineralização (vários tipos de fosfato de cálcio insolúvel) foi quantificada medindo cálcio.
[0066] Figura 24 mostra os resultados do ensaio de mineralização de linhagem celular de osteoblastos MC3T3-E1-BF utilizado para identificar as medidas de Mabs anti-esclerostina neutralizadoras. Esclerostina Humana (Scl) foi utilizada em 1 μg/mL. Os anticorpos monoclonais foram utilizados em 10 μg/mL. Extensão da mineralização (vários tipos de fosfato de cálcio insolúvel) foi quantificado medindo cálcio.
[0067] Figura 25 mostra os resultados de uma perda óssea induzida por inflamação em modelo de rato SCID. O tratamento Ab-A protegeu os camundongos de perda óssea relacionada à inflamação associada a colite quando medida como o total da densidade mineral óssea (Figura 25A), densidade vertebral óssea (Figura 25B), e densidade óssea femoral (Figura 25C).
Descrição Detalhada
[0068] A presente invenção se refere às regiões do Homem proteína esclerostina que contêm epítopos reconhecidos por anticorpos que se ligam também a esclerostina de comprimento pleno, bem como os métodos de produzir e utilizar esses epítopos. A invenção fornece também agentes de ligação (como anticorpos), que se ligam especificamente a esclerostina ou porções de esclerostina, bem como os métodos para a utilização deste tipo de agentes de ligação. Os agentes de ligação são úteis para impedir ou prejudicar a ligação de esclerostina humana a um ou mais ligante.
[0069] A esclerostina recombinante humana/SOST está disponível comercialmente a partir de R & D Systems (Minneapolis, MN, E.U.A.; 2006 n° cat. 1406-ST-025). Além disso, esclerostina recombinante de rato/SOST está disponível comercialmente a partir de R & D Systems (Minneapolis, MN, E.U.A.; 2006 n° cat. 1589-ST-025). Os anticorpos monoclonais de ligação a esclerostina de grau de investigação estão comercialmente disponíveis a partir de R & D Systems (Minneapolis, MN, E.U.A.; os monoclonais de rato: 2006 n° cat. MAB1406; os monoclonais de rato: 2006 n° cat. MAB1589). Patente US n°s 6395511 e 6803453, e Publicações de Patente US 20040009535 e 20050106683 referem-se geralmente ao anticorpo anti-esclerostina.
[0070] Conforme utilizado neste documento, o termo esclerostina humana destina-se a incluir a proteína de SEQ ID n°.: 1 e variantes alélicos. A esclerostina pode ser purificada a partir células hospedeiras 293T que foram transfectadas por um gene que codifica esclerostina por eluição do sobrenadante filtrado do líquido de cultura de célula hospedeira utilizando uma coluna Heparina HP, usando um gradiente de sal. A preparação e posterior purificação utilizando cromatografia de troca catiônica são descritas em Exemplos 1 e 2.
[0071] Agentes de ligação da invenção são preferencialmente anticorpos, como definido aqui. O termo “anticorpo” se refere a um anticorpo intacto, ou um fragmento de ligação do mesmo. Um anticorpo pode incluir uma molécula de anticorpo completa (incluindo as versões policlonais, monoclonais, quimérica, humanizada, ou humana tendo cadeias pesadas e/ou cadeias leves), ou compreende um fragmento de ligação ao antígeno. Os fragmentos de Anticorpo incluem fragmentos F(aB’)2, Fab, Fab', Fv, Fc, e Fd, e podem ser incorporados a anticorpos de domínio único, anticorpos de cadeia única, maxicorpos, minicorpos, intracorpos, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, v-NAR e di-scFv (Veja, por exemplo, Hollinger e Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136). Polipeptídeos de Anticorpo também são divulgados em Patente US n° 6703199, incluindo monocorpos de polipeptídeo de fibronectina. Outros polipeptídeos de anticorpos são divulgados em Publicação de Patente US 2005/0238646, que são polipeptídeos de cadeia única.
[0072] Os fragmentos de ligação derivados de um antígeno de um anticorpo podem ser obtidos, por exemplo, por hidrólise proteolítica do anticorpo, por exemplo, ou digestão com pepsina papaína de qualquer anticorpo, de acordo com métodos convencionais. A título de exemplo, fragmentos de anticorpos podem ser produzidos por clivagem enzimática de anticorpos com pepsina para fornecer um fragmento 5S denominado F(aB’)2. Este fragmento pode ainda ser clivado usando um tiol como agente redutor para produzir fragmentos 3.5S Fab' monovalentes. Opcionalmente, a reação de clivagem pode ser realizada através de um grupo de bloqueio para grupos sulfidrila que resultam de clivagem das ligações dissulfeto. Como uma alternativa, uma clivagem enzimática utilizando papaína para produzir dois fragmentos monovalentes Fab e um fragmento Fc diretamente. Estes métodos estão descritos, por exemplo, por Goldenberg, Patente US n° 4331647, Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960; Porter, Biochem. J. 73:119, 1959; Edelman et al em Methods in Enzymology 1:422 (Academic Press 1967), e por Andrews, SM E Titus, JA em Current Protocols in Immunology (Coligan JE, et al., Orgs.), John Wiley & Sons, Nova York (2003). Páginas 2.8.1-2.8.10 e 2.10A.1-2.10A.5. Outros métodos de adesão de anticorpos, como separação de fragmentos de cadeias pesadas para formar fragmentos monovalentes de cadeia leve e pesada (Fd), clivagem adicional de fragmentos, ou outras técnicas enzimáticas, químicas ou genéticas também podem ser utilizados, desde que os fragmentos se liguem ao antígeno que é reconhecido pelo anticorpo intacto.
[0073] Um fragmento de anticorpo também pode ser qualquer proteína sintética ou geneticamente modificada. Por exemplo, fragmentos de anticorpos incluem fragmentos isolados consistindo da região variável de cadeia leve, fragmentos “Fv” consistindo na região variável de cadeia leve e pesada, moléculas polipeptídicas recombinantes de cadeia única em que as regiões variáveis leve e pesada são conectadas por um peptídeo ligante (ScFv proteínas).
[0074] Outra forma de um fragmento de anticorpo é um peptídeo composto por uma ou mais regiões de determinação de complementaridade (CDRs), de um anticorpo. CDRs (também designada “unidades mínimas de reconhecimento”, ou “região hipervariável”) podem ser obtidas pela construção de polinucleotídeos que codificam o CDR de interesse. Tais polinucleotídeos estão dispostos, por exemplo, por meio da cadeia de polimerase para sintetizar a região variável de RNAm utilizando células produtoras de anticorpos, como um modelo (veja, por exemplo, Larrick et al, Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, 1991; Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), pág 166 (Cambridge University Press 1995); e Ward et al, "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications", Birch et al, (eds.), pág 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)).
[0075] Assim, em uma modalidade, o agente de ligação compreende pelo menos uma CDR, conforme descrito aqui. O agente de ligação pode incluir pelo menos duas, três, quatro, cinco ou seis CDR's como descrito aqui. O agente de ligação ainda pode incluir pelo menos uma região de domínio variável de um anticorpo aqui descrita. A região de domínio variável pode ser de qualquer tamanho ou composição de aminoácidos e, em geral compreenderá pelo menos uma sequência CDR responsável pela ligação à esclerostina humana, por exemplo CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 e/ou CDRs de cadeia leve especificamente descritas neste documento e que é adjacente a ou n estrutura de uma ou mais sequências estruturais. Em termos gerais, a variável (V) pode ser qualquer arranjo de região de domínio adequado de imunoglobulina de domínios variáveis de cadeia pesada (VH) e/ou leve (VL). Assim, por exemplo, a região de domínio V pode ser monomérica e ser um domínio VH ou VL, que é capaz de autonomamente ligar à esclerostina humana com uma afinidade pelo menos igual a 1 x 10-7 M ou menos como descrito abaixo. Alternativamente, a região de domínio V pode ser dimérica e conter dímeros VH-VH, VH-VL, ou VL-VL. O dímero da região V compreende pelo menos uma cadeia VH e pelo menos uma cadeia VL que pode ser não covalentemente associada (a seguir designada FV). Se desejado, as cadeias podem ser acopladas covalentemente tanto diretamente, por exemplo através de uma ligação dissulfeto entre os dois domínios variáveis, ou através de uma ligação, por exemplo, um peptídeo ligante, para formar uma única cadeia Fv (scFV).
[0076] A região de domínio variável pode ser de ocorrência natural, ou uma versão geneticamente modificada da mesma. Versão geneticamente modificada significa uma região de domínio variável que foi criada utilizando técnicas de engenharia de DNA recombinante. Essas versões modificadas incluem aquelas criadas, por exemplo, a partir de um anticorpo específico de região variável por inserções, eliminações, ou mudanças em ou para as sequências de aminoácidos do anticorpo específico. Exemplos particulares incluem região de domínio variável modificada que contenha pelo menos uma CDR e opcionalmente uma ou mais estruturas de aminoácidos de um primeiro anticorpo e o restante da região de domínio variável de um segundo anticorpo.
[0077] A região de domínio variável pode ser covalentemente ligada a um aminoácido de terminal C a pelo menos um outro domínio de anticorpo ou um fragmento do mesmo. Assim, por exemplo, um domínio VH que está presente na região do domínio variável pode ser associado a um domínio de imunoglobulina CH1, ou um fragmento do mesmo. Do mesmo modo um domínio VL pode estar associado a um domínio CK ou um fragmento do mesmo. Desta forma, por exemplo, o anticorpo pode ser um fragmento Fab onde a ligação antígeno domínio contém domínios VH e VL associados covalentemente ligados ao seu terminal C de um domínio CH1 e CK, respectivamente. O domínio CH1 pode ser ampliado com mais aminoácidos, por exemplo, para fornecer uma região de articulação ou uma parte de um domínio de região de articulação como encontrado em um fragmento Fab’, ou fornecer mais domínios, tais como domínios de anticorpos CH2 e CH3.
[0078] Conforme descrito aqui, agentes de ligação incluir pelo menos um desses CDRs. Por exemplo, um ou mais CDR podem ser incorporadas conhecido anticorpo quadro regiões (IgG1, IgG2, etc), ou conjugada com um veículo adequado para reforçar a sua meia-vida. Veículos adequados incluem, mas não estão limitados a Fc, polietilenoglicol (PEG), albumina, transferrina, e similares. Estes e outros veículos adequados são conhecidos na técnica. Tais peptídeos conjugados CDR pode ser em forma monomérica, dimérica, tetramérica, ou outra. Em uma modalidade, um ou mais polímeros solúveis em água são ligados em uma ou mais condições específicas, por exemplo, no terminal amino, de um agente de ligação.
[0079] Em certas modalidades preferidas, um agente de ligação compreende um ou mais polímeros solúveis em água, incluindo, mas não limitado a, polietileno glicol, polioxietileno glicol, ou polipropileno glicol. Veja, por exemplo, Patentes US N °s 4640835, 4496689, 4301144, 4670417, 4791192, 4179337. Em certas modalidades, um agente de ligação derivado compreende um ou mais de monometoxi-polietilenoglicol, dextrano, celulose, ou outros polímeros baseados em carboidratos, poli-(N-vinilpirrolidona)-polietilenoglicol, propileno glicol homopolímeros, um co-polímero óxido de polipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados (por exemplo, glicerol) e policloreto álcool, bem como as misturas desses polímeros. Em certas modalidades, um ou mais polímero solúvel em água é aleatoriamente anexado a uma ou mais cadeias laterais. Em certas modalidades, PEG pode atuar para melhorar a capacidade de um agente terapêutico de ligação, como um anticorpo. Tais métodos são discutidos, por exemplo, em Patente US No. 6133426, que é incorporada por referência para qualquer finalidade.
[0080] Será apreciado que um agente de ligação da presente invenção pode ter pelo menos uma substituição de aminoácido, desde que o agente de ligação mantenha a especificidade da ligação. Portanto, as modificações das estruturas do agente de ligação são abrangidas pelo âmbito da aplicação da invenção. Estas podem incluir substituições de aminoácidos, que podem ser conservadora ou não- conservadora, que não destruam a capacidade de ligação esclerostina de um agente de ligação. As substituições conservadoras de aminoácidos podem englobar resíduos de aminoácido de ocorrência não natural, que são tipicamente incorporados pela síntese química do peptídeo, em vez de por síntese em sistemas biológicos. Estes incluem peptidomiméticos e outras formas revertidas ou invertidas de frações de aminoácidos. Uma substituição conservadora de um aminoácido pode também envolver a substituição de um resíduo nativo de aminoácido com um resíduos normativo de tal forma que haja pouco ou nenhum efeito sobre a polaridade ou carga do resíduo de aminoácido na posição.
[0081] As substituições não conservadoras podem envolver a troca de um membro de uma classe de aminoácidos ou aminoácidos miméticos por um membro de uma outra classe com diferentes propriedades físicas (por exemplo: tamanho, polaridade, hidrofobicidade, carga). Esses resíduos podem ser substituídos introduzidos em regiões dos anticorpos humanos que são homólogas com os anticorpos não-humanos, ou para as regiões não-homólogas da molécula.
[0082] Além disso, alguém versado na técnica podem gerar testes variantes contendo uma único substituição de aminoácido, em cada resíduo de aminoácido desejado. As variantes podem então ser analisados utilizando ensaios de atividade conhecidos por versados na técnica. Tais variantes poderiam ser utilizadas para recolher informações sobre variantes adequadas. Por exemplo, se alguém descobriu que a mudança para um determinado aminoácido resultou na destruição de resíduos, indesejavelmente reduzida, ou atividade imprópria, com variantes tal mudança pode ser evitada. Em outras palavras, com base em informações recolhidas a partir de tais rotinas de experiências, alguém versado na técnica pode facilmente determinar os aminoácidos onde mais substituições devem ser evitadas por si mesmas ou em combinação com outras mutações.
[0083] Um técnico qualificado será capaz de determinar variantes adequadas do polipeptídeo como aqui definido usando técnicas bem conhecidas. Em certas modalidades, alguém versado na técnica podem identificar áreas apropriadas da molécula que pode ser alterado sem destruir atividade segmentação por regiões que não acreditava ser importante para a atividade. Em certas modalidades, pode-se identificar resíduos e porções das moléculas que são conservadas entre semelhantes polipeptídeos. Em certas modalidades, mais áreas que podem ser importantes para a atividade biológica ou estrutural podem estar sujeitas a substituições conservadoras de aminoácido sem destruir a atividade biológica ou sem lesar a estrutura do polipeptídeo.
[0084] Além disso, alguém versado na técnica pode rever a função estrutural para identificar resíduos de polipeptídeos em estudos semelhantes, que são importantes para a atividade ou estrutura. Em virtude de tal comparação, pode-se prever a importância dos resíduos de aminoácido em uma proteína que correspondem aos resíduos de aminoácidos, que são importantes para a atividade ou estrutura semelhante em proteínas. Alguém versado na técnica podem optar pela substituição quimicamente semelhante de aminoácido para tais referidos resíduos importantes de aminoácido.
[0085] Alguém versado na técnica também pode analisar a estrutura tridimensional e sequência de aminoácidos, em relação a essa estrutura semelhante em polipeptídeos. Em virtude de tais informações, alguém versado na técnica permitam prever o alinhamento dos aminoácidos resíduos de um anticorpo com respeito à sua estrutura tridimensional. Em certas modalidades, alguém versado na técnica pode optar por não fazer mudanças radicais de aminoácidos resíduos prevista para ser na superfície da proteína, uma vez que esses resíduos podem estar envolvidos em importantes interações com outras moléculas.
[0086] Um número de publicações científicas foi dedicado à previsão de estrutura secundária. Veja Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4):422-427 (1996), Chou et al, Biochemistry, 13(2):222-245 (1974); Chou et al, Biochemistry, 113(2):211-222 (1974); Chou et al, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148 (1978); Chou et al, Ann. Rev. Biochem., 47:251-276 e Chou et al, Biophys. J., 26:367-384 (1979). Além disso, os programas de computador são atualmente disponíveis para ajudar com previsão da estrutura secundária. Um método de predição da estrutura secundário é baseado na homologia de modelagem. Por exemplo, dois polipeptídeos ou proteínas, que tenham uma sequência de identidade superior a 30%, ou semelhança superior a 40% têm frequentemente topologias estruturais semelhantes. O crescimento recente das proteínas estruturais de base (APO) foi reforçado já que a previsibilidade da estrutura secundária, incluindo o número potencial de vezes em um polipeptídeo ou da estrutura da proteína. Veja Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27 (l de) :244-247 (1999). Foi sugerido (Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7 (3): 369-376 (1997)) que há um número limitado de vezes, em um dado polipeptídeo ou proteínas e que, uma vez por críticos Número de estruturas foram resolvidos, estrutural previsão tornar-se-á dramaticamente mais precisos.
[0087] Métodos adicionais de predição da estrutura secundária incluem “alinhamento” (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol, 7 (3) :377-87 (1997); Sippl et al., Estrutura, 4 (1): 15-19 (1996)), “análise de perfil” (Bowie et al. Science, 253:164-170 (1991); Gribskov et al., Meth. Enzym., 183:146-159 (1990); Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sci, 84 (13) :4355-4358 (1987)), e “ligação evolutiva” (Veja Holm, supracitado (1999), e Brenner, supracitado (1997)).
[0088] Em certas modalidades, variantes de agentes de ligação incluem variantes de glicosilação onde o número e/ou tipo de glicosilação site tenha sido alterado, em comparação com as sequências de aminoácidos de um pai polipeptídeo. Em certas modalidades, variantes incluem um maior ou um menor número de sítios de N-glicosilação ligado do que o nativo proteínas. Um sítios de N-glicosilação ligado é caracterizada pela sequência: Asn-X-Ser ou Asn-X-Thr, onde o resíduo de aminoácido designado como X pode ser qualquer resíduo exceto aminoácido prolina. A substituição do resíduo de aminoácidos para criar essa sequência fornece um novo site potencial para a adição de uma cadeia de carboidratos N-ligados. Alternativamente, substituições que eliminar essa sequência irá remover uma existente cadeia de carboidratos N-ligada. Também é fornecido um rearranjo da N- ligados carboidratos cadeias onde um ou mais sítios de N-glicosilação ligada (tipicamente aqueles que estão naturalmente presentes) são eliminados e um ou mais novo N-ligados sítios são criados. Variantes de anticorpo adicional preferidas incluem variantes de cisteína em que um ou mais resíduos de cisteína são retirados ou substituídos por um outro aminoácido (por exemplo, serina), em comparação com o progenitor sequência aminoacídica. As variantes de cistina podem ser úteis quando anticorpos deve ser rearticulaçãodo em uma conformação biologicamente ativa, como após o isolamento da inclusão de órgãos insolúveis. As variantes de cistina geralmente têm menos resíduos de cisteína do que a proteína nativa, e normalmente têm um mesmo número para minimizar interações resultantes de cisteínas não pareadas.
[0089] As substituições desejadas de aminoácidos (seja conservadora ou não-conservadora) podem ser determinadas por aquele versado na técnica no momento em que tais substituições são desejados. Em certas modalidades, substituições aminoácidos podem ser usadas para identificar importante resíduos de anticorpos para esclerostina, ou para aumentar ou diminuir a afinidade dos anticorpos para esclerostina aqui descritas.
[0090] De acordo com certas modalidades, as substituições de aminoácidos preferidas são aquelas que: (1) reduzem a susceptibilidade a proteólise, (2) reduzem a susceptibilidade à oxidação, (3) alteram a afinidade de ligação para proteínas formando complexos, (4) alteram de afinidade de ligações, e/ou (4) conferem ou modificam outras propriedades fisioquímicas ou funcionais sobre tais polipeptídeos. De acordo com certas modalidades, as substituições de aminoácidos únicas ou múltiplas (em certas modalidades, substituições conservadoras de aminoácidos) podem ser feitas na sequência que ocorre naturalmente (em certas modalidades, na porção do polipeptídeo fora do domínio formando contatos intermoleculares). Em certas modalidades, uma substituição de aminoácido conservadora normalmente não pode alterar substancialmente como características estruturais da sequência mãe (por exemplo, um aminoácido substituto não deve tender a quebrar uma hélice que ocorra na sequência mãe, ou perturbar outros tipos de estrutura secundária que caracteriza a sequência mãe). Exemplos de estruturas reconhecidas na técnica de polipeptídeo secundário e terciário são descritas em Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, Nova York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden e J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nova York, N. Y. (1991)); e Thornton et al. Nature 354:105 (1991), que são, cada uma, incorporadas neste documento por referência.
[0091] Em certas modalidades, os agentes de ligação da invenção podem ser ligações químicas com polímeros, lipídios, ou outras frações.
[0092] Os agentes de ligação podem incluir pelo menos uma das CDRs aqui descritas incorporadas em um quadro de estrutura biocompatível. Em um exemplo, o quadro biocompatíveis estrutura composta por um polipeptídeo ou parte dele que é suficiente para formar um confomacionalmente estável apoio estrutural, ou quadro, ou estrutura, que é capaz de exibir uma ou mais sequências de aminoácidos que se ligam ao antígeno (por exemplo,.:, CDRs, uma região variável, etc) em uma região localizada na superfície. Tais estruturas podem ser de ocorrência natural polipeptídeo ou “articulação” de polipeptídeo (um motivo estrutural), ou pode ter uma ou mais modificações, como aditamentos, supressões ou substituições de aminoácidos, em relação a uma ocorrência natural polipeptídeo ou articulação. Estes estruturas pode ser derivada de um polipeptídeo de qualquer espécie (ou de mais de uma espécie), como um homem, outros mamíferos, outros vertebrados, invertebrados, vegetais, bactérias ou vírus.
[0093] Tipicamente, o quadro de estruturas biocompatíveis são baseadas em proteínas estruturas ou outros esqueletos de domínios de imunoglobulina. Por exemplo, os que se baseiam nos fibronectina, anquirina, lipocalina, neocarzinostaina, citocromo b, ponta de zinco CP1, PST1, mola, LACI-Dl, Z domínio e domínios tendramisat podem ser utilizados (Veja, por exemplo, Nygren e Uhlen, 1997, Current Opinion in Structural Biology, 7, 463-469).
[0094] Em modalidades preferidas, ele será apreciado que os agentes de ligação da invenção incluem a humanizado anticorpos aqui descritas. Anticorpos humanizados, como os descritos neste documento pode ser produzido utilizando técnicas conhecidas para aqueles hábeis na técnica (Zhang, W., et al Molecular Immunology. 42 (12) :1445-1451, 2005; Hwang W. et al. Methods. 36 (l de) :35-42, 2005; Dall'Acqua WF, et al. Methods 36 (J) :43-60, 2005; e Clark, M., Immunology Today. 21 (8) -. 397-402, 2000).
[0095] Além disso, alguém versado na técnica irá reconhecer que agentes de ligação adequados incluem frações destes anticorpos, como um ou mais dos CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 como concretamente divulgado aqui. Pelo menos uma das regiões da CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR- L1, CDR-L2 e CDR-L3 pode ter pelo menos uma substituição aminoácido, desde que o agente de ligação mantém o carácter ligação da especificidade da CDR não substituído. A parte não-CDR do agente de ligação pode ser uma molécula não- protéica, onde o agente de ligação bloqueia de modo cruzado a ligação de um anticorpo divulgada aqui para esclerostina e/ou neutralize esclerostina. A parte não- CDR do agente de ligação pode ser um não-proteico molécula em que o agente de ligação exibe um padrão semelhante a ligação à peptídeos de esclerostina humana em um “ensaio de competição de ligação de epítopo de peptídeo de esclerostina humana”, como que exibido em pelo menos um dos anticorpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, AbD, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23, e Ab-24, e/ou neutraliza a esclerostina. a parte não-CDR do agente de ligação pode ser composto de aminoácidos, onde o agente de ligação é uma proteína recombinante ligação ou um peptídeo sintético, e as proteínas recombinantes bloqueiam de modo cruzado a ligação de um anticorpo divulgado aqui para esclerostina e/ou neutralizam a esclerostina. a parte não-CDR do agente de ligação pode ser composto de aminoácidos, onde o agente de ligação é uma proteína recombinante ligação, e como ligação a proteínas recombinantes exibe um padrão semelhante a ligação a peptídeos de esclerostina humana no ensaio de competição de ligação ao epítopo de peptídeo de esclerostina humana (descrito abaixo) enquanto que exibido em pelo menos um dos anticorpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab -6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23, e Ab-24, e/ou neutralize a esclerostina.
[0096] Sempre que um anticorpo compreende um ou mais de CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 como descrito acima, ele pode ser obtido pela expressão de um grande número de células que contêm codificação de DNA para estas sequências. A codificação de DNA para cada sequência de CDR pode ser determinada com base na sequência de aminoácidos do CDR e sintetizadas em conjunto com qualquer anticorpo desejado de região variável na estrutura da região constante e sequências de DNA utilizando técnicas de síntese de oligonucleótido, mutagênese dirigida ao sítio e cadeia de polimerase (PCR) como técnicas adequadas. O DNA que codifica as estruturas de região variável e regiões constante são amplamente disponíveis para aqueles hábeis na técnica de dados de sequências genéticas tais como GenBank (R). Cada uma das referidas As CDRs estarão geralmente localizadas em uma estrutura de região variável nas posições 31-35 (CDR-H1), 50-65 (CDR-H2) e 95-102 (CDR-H3) da cadeia pesada e posições 24-34 (CDR-L1), 50-56 (CDR-L2) e 89-97 (CDR-L3) da cadeia leve, de acordo com o sistema de numeração de Kabat (Kabat et al, 1987 em Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, NIH, USA).
[0097] Uma vez sintetizado, o DNA que codifica um anticorpo da invenção ou fragmento dele pode ser propagado e expresso, de acordo com qualquer um de uma série de procedimentos bem conhecidos de excisão de ácido nucléico, ligação, transformação e transfecção utilizando qualquer número de vetores de expressão conhecidos. Assim, em determinados modalidades a expressão de um fragmento de anticorpo pode ser preferida em um hospedeiro procariótico, tais como Escherichia coli (veja, por exemplo, Pluckthun et al., 1989 Methods Enzymol. 178:497515). Em algumas outras modalidades, a expressão do anticorpo ou um fragmento dele pode ser preferida em uma célula hospedeira eucariótica, incluindo levedura (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, e Pichia pastoris), células animais (incluindo células mamíferas) ou células vegetais. Exemplos de células animais adequadas incluem, mas não são limitados a, mieloma (como uma linhagem de camundongo NSO), COS, CHO, ou células de hibridoma. Exemplos de células vegetais incluem células de tabaco, milho, soja, e arroz.
[0098] Um ou mais vetores de expressão replicáveis contendo o DNA que codifica um anticorpo na região variável e/ou constante podem ser preparados e usados para transformar uma linhagem celular adequada, por exemplo, a não- produção de linhagem de células de mieloma, como uma linhagem NSO de rato ou uma bactéria, tal como E. Coli, em que a produção de anticorpos irá ocorrer. A fim de obter eficiente transcrição e tradução, a sequência de DNA de cada vetor deve incluir sequências regulamentares adequadas, ou seja, uma sequência promotora e líder operacionalmente ligadas a sequência de domínio variável. Métodos particulares para produzir anticorpos desta forma são geralmente bem conhecidos e utilizados rotineiramente. Por exemplo, os procedimentos com base na biologia molecular são descritos por Maniatis e Al (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2 a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Nova York, 1989; veja também Maniatis et al. 3 a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Nova York, (2001)). A sequenciação do DNA pode ser efetuada como descrito em Sanger et al. (PNAS 74:5463, (1977)), bem como o sequenciamento manual Amersham International plc, e em sítios de mutagênese dirigidos podem ser efetuados de acordo com métodos conhecidos na técnica (Kramer et al, Nucleic Acids Res. 12:9441, (1984); Kunkel Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:48892 (1985); Kunkel et al, Methods in Enzymol. 154:367-82 (1987); the Anglian Biotechnology Ltd handbook). Além disso, diversas publicações descrevem técnicas adequadas para a preparação de anticorpos por manipulação de DNA, criação de vetores de expressão, e transformação da cultura de células adequada (Mountain A and Adair, J R em Biotechnology and Genetic Engineering Reviews (ed. Tombs, M P, 10, cap. 1, 1992, Intercept, Andover, UK); "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F.M. Ausubel (ed.), Wiley Interscience, Nova York).
[0099] Onde é desejado melhorar a afinidade de anticorpos, de acordo com a invenção que contenham uma ou mais das referidas CDRs pode ser obtida através de um número de protocolos de maturação de afinidade incluindo a manutenção das CDRs (Yang et al. J. Mol. Biol, 25 A, 392-403, 1995), embaralhamento da cadeia (Marks et al. Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), a utilização de mutação de cepas de E. coli (Low et al. J. Mol. Biol, 250, 350-368, 1996), embaralhamento de DNA (Patten et al. Curr. Opin. Biotechnol, 8, 724-733, 1997), exibição de fago (Thompson et al. J. MoI Biol, 256, 7-88, 1996) e PCR sexual (Crameri, et al. Nature, 391, 288-291, 1998). Todos esses métodos de maturação de afinidade são discutidas por Vaughan e Al (Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998).
[00100] Outros anticorpos, de acordo com a invenção podem ser obtidos por imunização convencional e fusão celular como procedimentos aqui descritos e conhecidos na técnica. Os anticorpos monoclonais da invenção podem ser gerados usando uma variedade de técnicas conhecidas. Em geral, os anticorpos monoclonais que se ligam aos antígenos específicos podem ser obtidos por métodos conhecidos para aqueles versados na técnica (veja, por exemplo, Kohler et al, Nature 256:495, 1975; Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, 1:2.5.12.6.7 (John Wiley & Sons 1991); Patente U.S. Nos. RE 32.011, 4.902.614, 4.543.439, e 4.411.993; Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn, and Bechtol (eds.) (1980); e Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); Picksley et al, "Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli," in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2a edição, Glover et al. (eds.), page 93 (Oxford University Press 1995)). Os fragmento de anticorpos podem ser derivados utilizando qualquer norma técnica adequada, como a digestão proteolítica, ou opcionalmente, por digestão proteolítica (por exemplo, utilizando papaína ou pepsina), seguindo-se de ligeira redução das ligações dissulfeto e alquilação. Alternativamente, esses fragmentos podem também ser gerados por técnicas de recombinação genética como descrito aqui.
[00101] Os anticorpos monoclonais podem ser obtidos através da injeção em um animal, por exemplo, um rato, hamster, um coelho, ou de preferência um rato, incluindo por exemplo um transgênico ou knock-out, como sabido na técnica, com um imunogênio compreendendo esclerostina humana de SEQ ID n°.: 1, ou um fragmento dela, de acordo com métodos conhecidos na técnica e aqui descritas. A presença de anticorpos específicos produção pode ser monitorizados após a primeira injeção e/ou após uma injeção de reforço mediante a obtenção de um soro amostra e detectar a presença de um anticorpo que se liga à esclerostina humana ou peptídeo usando qualquer um dos vários immunodetection métodos conhecidos na técnica e aqui descritas. De animais produzindo o desejado anticorpos, células linfóides, mais comumente células do baço ou dos gânglios linfáticos, que são removidos para obter B-linfócitos. Os linfócitos B são então fundidos com uma fármaco-sensibilizadas mieloma Fusão celular parceiro, de preferência um que seja singeneico com a imunização dos animais e que eventualmente tenha outras propriedades desejáveis (por exemplo, incapacidade de expressar produtos Ig de genes endógenos, por exemplo, P3X63-Ag 8.653 (No. ATCC CRL 1580); NSO, SP20) para produzir hibridomas, que são linhagens celulares eucarióticas imortais. As células linfóides (por exemplo, o baço) e células de mieloma podem ser combinadas por alguns minutos com um agente promotor de fusão de membrana, como o polietileno-glicol ou um detergente não iônico e, em seguida, plaqueadas em baixa densidade em um meio selectivo que suporta o crescimento de células hibridomas, mas não células de mieloma não fundidas. O meio de seleção preferido é HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina). Depois de um tempo suficiente, geralmente cerca de uma ou duas semanas, colônias de células são observados. O hibridomas são clonados (por exemplo, por diluição limitada de clonagem ou por suaves isolamento de placa ágar) e os clones positivos que produzem um anticorpo específico para a esclerostina são selecionados e cultivados. Os anticorpos monoclonais de culturas de hibridomas podem ser isolados dos sobrenadantes de culturas de hibridomas. Um método alternativo para a produção de um anticorpo monoclonal murino é injetar as células de hibridomas na cavidade peritoneal de um rato singeneico, por exemplo, um rato que tenha sido tratado (por exemplo, sensibilizado com pristano) para promover a formação de fluido de ascite contendo os anticorpos monoclonais. Os anticorpos monoclonais podem ser isoladas e purificados por uma variedade de técnicas bem estabelecidas. Tais técnicas de isolamento incluem cromatografia de afinidade com Proteína-A sefarose, cromatografia de exclusão tamanho, e cromatografia de troca iônica (veja, por exemplo, Coligan nas páginas 2.7.1-2.7.12 e páginas 2.9.1-2.9.3; Baines e Al, “Purification of Immunoglobulin G (IgG),” em Methods in Molecular Biology, Vol. 10, páginas 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)). Os anticorpos monoclonais podem ser purificados por cromatografia de afinidade usando uma adequada ligante selecionados com base em propriedades particulares dos anticorpos (por exemplo, pesado ou leve cadeia isotipo, ligação especificidade, etc.) Exemplos de um ligante adequado, imobilizadas em um suporte sólido, incluem Proteína A, proteína G, uma região constante (de cadeia leve ou cadeia pesada) anticorpo, um anticorpo anti- idiotípico, e uma proteína de ligação beta versão TGF, ou fragmento da mesma ou variante.
[00102] Um anticorpo da presente invenção pode também ser um anticorpo monoclonal humano. Human anticorpos monoclonais podem ser gerados por qualquer número de técnicas com as quais aqueles que tenham habilidade ordinária na técnica serão familiarizados. Tais métodos incluem, mas não estão limitados a, transformação de células do sangue periférico humano pelo vírus Epstein Barr (EBV) (por exemplo, contendo linfócitos B), imunização, in vitro de células humanas B, a fusão de células transgênicas de baço imunizado de camundongos transportando genes inseridos de imunoglobulina humana, isolamento de bibliotecas de fagos de região da imunoglobulina humana V, ou outros procedimentos como são conhecidos na técnica e baseiados nesta divulgação. Por exemplo, os anticorpos monoclonais humanos podem ser obtidos a partir de camundongos transgênicos que foram manipulados para produzir anticorpos humanos específicos em resposta ao desafio antigênico. Os métodos para a obtenção de anticorpos humanos camundongos transgênicos são descritos, por exemplo, Green et al. Nature Genet. 7:13, 1994; Lonberg et al. Nature 368:856, 1994; Taylor et al.Jnt. Immun. 6:579, 1994; Patente US n° 5877397; Bruggemann et al. 1997 Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58; Jakobovits et al. 1995 Ann. NY Acad. Sci. 764:525-35. Nesta técnica, elementos da cadeia humana pesados e leves legitimidade são introduzidas em linhagens de ratos derivadas de células estaminais embrionárias a partir de linhagens que contêm perturbações endógenas direcionadas aos locais de cadeia pesada e cadeia leve (veja também Bruggemann et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58 (1997)). Por exemplo, transgenes de imunoglobulina humana podem ser mini-genes construídos, ou transsituados sobre cromossomos artificiais de levedura, que sofrem rearranjos específicos nas células B-DNA e hitrocação no tecido linfóide do rato. Os anticorpos humanos monoclonais podem ser obtidos pela imunização dos camundongos transgênicos, que poderá então produzir anticorpos humanos específicos para esclerostina. As células linfóides dos camundongos transgênicos imunizados podem ser usadas para produzir hibridomas secretores de anticorpos humanos de acordo com os métodos aqui descritos. Soro contendo anticorpos policlonais humanos também pode ser obtido a partir do sangue do animal imunizado.
[00103] Outro método da invenção para gerar anticorpos humanos inclui immortalizar as células do sangue periférico humano por transformação EBV. Veja, por exemplo, Patente US n° 4464456. Tal linhagem celular imortalizada B (ou linhagem celular de linfoblastóides) produz um anticorpo monoclonal que se liga especificamente à esclerostina podem ser identificada por métodos de imunodetecção como nela se prevê, por exemplo, um ELISA e, em seguida, isolada por técnicas padrão de clonagem. A estabilidade da linhagem das células linfoblastóides produzindo um anticorpo anti-esclerostina pode ser melhorada através da fusão das células transformadas linha com um mieloma murino para produzir um rato-humano híbrido linhagem celular, de acordo com métodos conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Glasky et al., Hybridoma 8:377-89 (1989)). Ainda um outro método para gerar anticorpos monoclonais humanos é a imunização in vivo, que inclui sensibilização de células B esplênicas humanas com esclerostina humana, seguida pela fusão de células B sensibilizadas com um parceiro de fusão heteroíbrido. Veja, por exemplo, Boerner et al. 1991 J. Immunol 147:86-95. Em certas modalidades, célula B que produz um anticorpo anti-esclerostina humano é selecionada e as regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada são clonadas a partir das células B, de acordo com técnicas de biologia molecular conhecidas na técnica (WO 92/02551; E.U. patente 5627052 ; Babcook et al. Proc. Natl Acad. Sci. E.U.A. 93:7843-48 (1996)) e aqui descritas. Células B de um animal imunizado podem ser isoladas do baço, dos gânglios linfáticos, ou amostra de sangue periférico, selecionando uma célula que está produzindo um anticorpo que se liga especificamente à esclerostina. As células B podem também ser isoladas de seres humanos, por exemplo, a partir de uma amostra de sangue periférico. Métodos de detecção única B células que estão a produzir um anticorpo com o desejado especificidade são bem conhecidas na técnica, por exemplo, formação de placas, riagem de célula ativada por fluorescência, a estimulação, in vitro seguida pela detecção de anticorpos específicos, e similares. Métodos para seleção de anticorpos específicos produtoras de células B incluem, por exemplo, preparar uma única célula suspensão de células B em meio ágar contém esclerostina humana. Ligação do anticorpo específico produzido pelas células B para o antigênio resulta na formação de um complexo, que pode ser visível como um imunoprecipitado. Após a produção como células B desejadas os anticorpos são selecionados, os Genes específicos do anticorpo podem ser clonados para isolar e amplificar DNA ou RNAm, de acordo com métodos conhecidos na técnica e aqui descritos.
[00104] Um outro método para a obtenção de anticorpos da invenção é por visor de fago. Veja, por exemplo, Winter et al. 1994 Annu. Rev. Immunol 12:43355; Burton et al, 1994 Adv. Immunol 57:191-280. Bibliotecas combinatórias de genes da região variável da Imunoglobulina humana ou murina podem ser criadas em vetores fago que podem ser selecionados para selecionar fragmentos de Ig (Fab, Fv, sFv, ou multímeros dos mesmos), que se ligam especificamente a proteínas de ligação TGF-versão beta ou variantes ou fragmentos delas. Veja, por exemplo, Patente U.S. No. 5,223,409; Huse et al, 1989 Science 246:1275-81; Sastry et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5728-32 (1989); Alting-Mees et al, Strategies in Molecular Biology 3:1-9 (1990); Kang et al, 1991 Proc. Natl Acad. Sci. USA 88:4363-66; Hoogenboom et al, 1992 J. Molec. Biol 227:381-388; Schlebusch et al., 1997 Hybridoma 16:47-52 e referências aí citadas. Por exemplo, uma biblioteca que contém uma pluralidade de sequências polinucleotídicas de codificação de fragmentos de região variável Ig podem ser inseridas no genoma de um bacteriofago filamentoso, tal como M13 ou uma variante, na armação com a sequência codifica uma proteína de revestimento de fago. A fusão da proteína pode ser uma fusão da camada proteína com a cadeia leve região de domínio variável e/ou com a cadeia pesada região de domínio variável. De acordo com certas modalidades, imunoglobulina Fab fragmentos também podem ser exibidos em partículas de fago (veja, por exemplo, Patente US n° 5.698.426).
[00105] As bibliotecas de expressão de DNAc de imunoglobulina de cadeias pesadas e leves de também podem ser preparados em função de fago lambda, por exemplo, usando vetores ImmunoZap ™ (H) e ImmunoZap ™ (L) (Stratagene, La Jolla, Califórnia). Resumidamente, RNAm é isolado a partir de células B população, e usado para criar bibliotecas de expressão de imunoglobulina DNAc de cadeia pesada e leve em vetores ImmunoZap ™ (H) e ImmunoZap ™ (L). Estes vetores podem ser selecionados individualmente ou co-expressa a forma Fab fragmentos ou anticorpos (veja Huse et al., Supracitado; veja também Sastry et al., Supra). Placas Positivas poderão ser posteriormente convertidas para um plasmídeo não-lítico que permite elevado nível de expressão anticorpo monoclonal fragmentos de E. Coli.
[00106] Em uma modalidade, em um hibridomas a variável regiões de um gene expressando um anticorpo monoclonal de interesse são amplificados utilizando nucleótidos Primários. Estes primários podem ser sintetizados por alguém com habilidade na técnica, ou podem ser adquiridos a partir de fontes comercialmente disponíveis. (Veja, por exemplo, Stratagene (La Jolla, Califórnia), que vende iniciadores de regiões variáveis de rato e humanos, incluindo, entre outros, primários para VHa, Vm, VHC, VHd, CHI, VL CL e regiões.) Primários Estes podem ser usados Para amplificar regiões variáveis de cadeia leve ou pesada, o que pode então ser inserido em vetores, tais como ImmunoZAP ™ H ou ImmunoZAP ™ L (Stratagene), respectivamente. Estes vetores podem, então, ser introduzida em E. Coli, levedura, ou mamíferos para sistemas baseados expressão. Grandes quantidades de uma única cadeia de proteínas contendo uma fusão dos domínios VH e VL pode ser produzido utilizando esses métodos (veja Bird et al., Science 242:423-426, 1988).
[00107] Uma vez que as células que produzem anticorpos, de acordo com a invenção foram obtidas utilizando alguma das situações acima descritas de técnicas de imunização e outras, os Genes dos anticorpos específicos podem ser clonados por isolar e amplificar DNA ou RNAm daí, de acordo com procedimentos normalizados conforme descrito aqui. Os anticorpos produzidos daí podem ser ordenados e os CDRs identificados e como DNA que codifica as CDRs pode ser manipulado como descrito anteriormente para gerar outros anticorpos, de acordo com a invenção.
[00108] Preferencialmente os agentes de ligação se ligam especificamente à esclerostina. Como acontece com todos os agentes de ligação e ligação ensaios, alguém versado na técnica nesta técnica reconhece que como várias frações o qual um agente de ligação não deve se ligar de modo dectável, de modo a ser terapeuticamente eficaz e adequada seria impraticável e exaustiva a lista. Portanto, por um agente de ligação divulgada neste documento, o termo “especificamente liga” se refere à capacidade de um agente de ligação para ligar para esclerostina, preferencialmente humano esclerostina, com maior afinidade do que se liga a uma proteína alheio ao controle. De preferência a proteína controle é lisozima dos ovos brancos de galinha. Preferencialmente os agentes de ligação deve ligar a esclerostina com uma afinidade que seja pelo menos 50, 100, 250, 500, 1000, ou 10000 vezes maior do que a afinidade de uma proteína controle. Um agente de ligação pode ter um carácter de afinidade de ligação para esclerostina humana igual ou inferior a 1 x 10-7 M, inferior ou igual a 1 x 10-8 M, inferior ou igual a 1 x 10-9 M, inferior ou igual a 1 x 1010 M, inferior ou igual a 1 x 10-11 M, ou igual ou inferior a 1 x 10-12 M. A afinidade pode ser determinada por um teste de afinidade ELISA. Em certas modalidades, afinidade pode ser determinada por um ensaio BIAcore. Em certas modalidades, afinidade pode ser determinado por um método cinético. Em certas modalidades, afinidade pode ser determinado por um método equilíbrio/solução. Esses métodos estão descritos em detalhes aqui ou conhecidos na técnica. Agentes de ligação à esclerostina da presente invenção de preferência modulam a função do ensaio de esclerostina com base na célula aqui descritos e/ou no ensaio in vivo aqui descritos e/ou ligam a um ou mais dos epítopos aqui descritos e/ou bloquear de modo cruzado a ligação de um dos anticorpos descritos no presente pedido e/ou são bloqueado de modo cruzado desde ligação esclerostina por um dos anticorpos descritos no presente pedido. Por conseguinte, tais agentes de ligação podem ser identificados usando a ensaios aqui descritos.
[00109] Em certas modalidades, os agentes de ligação são gerados pelo primeiro identificar anticorpos que se ligam a mais um dos epítopos aqui fornecidas e/ou neutralizar na célula de base e/ou in vivo aqui descritas e/ou bloquear a cruzar- anticorpos descritos neste Aplicação e/ou são bloqueado de modo cruzado desde ligação esclerostina por um dos anticorpos descritos no presente pedido. O CDR regiões destes anticorpos são então utilizados para inserir em quadros biocompatíveis adequados para gerar agentes de ligação à esclerostina. a parte não-CDR do agente de ligação pode ser composto de aminoácidos, ou pode ser um não-proteico molécula. Os ensaios aqui descritos permitem a caracterização de agentes de ligação. Preferencialmente os agentes de ligação da presente invenção são anticorpos como definido aqui. Será entendido por alguém versado na técnica que algumas proteínas, tais como anticorpos, podem sofrer uma variedade de modificações postranslacionais. O tipo e a extensão destas modificações depende muitas vezes da célula hospedeira linha utilizada para expressar como proteínas, bem como a cultura condições. Essas modificações podem incluir variações na glicosilação, oxidação com metionina, formação de dicetopiperizina, Isomerização de aspartato e desamidação de asparagina. A modificação frequente é a perda de um terminal carboxila básicos de resíduos (como lisina ou arginina) devido à ação de carboxipeptidases (conforme descrito em Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995). Anticorpos referidos como Ab-A, Ab-B, Ab-C, D-Ab e Ab-1 são descritas a seguir. “HC” se refere à cadeia pesada e “LC” se refere à cadeia leve. Para alguns anticorpos abaixo, o CDRs são caixa sombreada e as regiões constantes (C) estão em negrito itálico.
Ab-D
[00110] Anticorpo D (também aqui referidos como Ab-D e Mab-D) é um anticorpo de rato que apresenta alta afinidade à ligação à esclerostina. O padrão de ligação BIAcore de Ab-D é mostrado na Figura 18. Sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removida) do Ab- D cadeia leve: 1 DVQMIQSPSS LSASLGDIVT MTCQASQGTS INLNWFQQKP GKAPKLLIYG 51 SSNLEDGVPS RFSGSRYGTD FTLTISSLED EDLATYFCLQ HSYLPYTFGG 101 GTKLEIKJRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA SWCFLNNFYPKDINVKWKI 151 DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKT 201 STSPIVKSFNRNEC (SEQ ID n°.: 7) Sequência de ácidos nucléicos codificação a forma madura (peptídeo sinal removido) Ab-D da LC é a seguinte: 1 GATGTCCAGA TGATTCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTTTGGGAGA 51 CATAGTCACC ATGACTTGCC AGGCAAGTCA GGGCACTAGC ATTAATTTAA 101 ACTGGTTTCA GCAAAAACCA GGGAAGGCTC CTAAGCTCCT GATCTATGGT 151 TCAAGCAACT TGGAAGATGG GGTCCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTAGATA 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTGGAGGAT GAAGATCTGG 251 CAACTTATTT CTGTCTACAA CATAGTTATC TCCCGTACAC GTTCGGAGGG 301 GGGACCAAGC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA CTGTATCCAT 351 CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC TCAGTCGTGT 401 GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA GTGGAAGATT 451 GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA CTGATCAGGA 501 CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG TTGACCAAGG 551 ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC TCACAAGACA 601 TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT GTTAG (SEQ ID n°.: 8) A sequência de aminoácidos de Ab-D LC incluindo peptídeo sinal é como segue: 1 MNTRAPAEFL GFLLLWFLGA RCDVQMIQSP SSLSASLGDI VTMTCQASQG 51 TSINLNWFQQ KPGKAPKLLI YGSSNLEDGV PSRFSGSRYG TDFTLTISSL 101 EDEDLATYFC LQHSYLPYTF GGGTKLEIKR ADAAPTVSIF PPSSEQLTSG 151 GASVVCFLNN FYPKDINVKW KIDGSERQNG VLNSWTDQDS KDSTYSMSST 201 LTLTKDEYER HNSYTCEATH KTSTSPIVKS FNRNEC (SEQ ID n°.:9) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-D LC incluindo a sequência de codificação de peptídeo sinal: 1 ATGAACACGA GGGCCCCTGC TGAGTTCCTT GGGTTCCTGT TGCTCTGGTT 51 TTTAGGTGCC AGATGTGATG TCCAGATGAT TCAGTCTCCA TCCTCCCTGT 101 CTGCATCTTT GGGAGACATA GTCACCATGA CTTGCCAGGC AAGTCAGGGC 151 ACTAGCATTA ATTTAAACTG GTTTCAGCAA AAACCAGGGA AGGCTCCTAA 201 GCTCCTGATC TATGGTTCAA GCAACTTGGA AGATGGGGTC CCATCAAGGT 251 TCAGTGGCAG TAGATATGGG ACAGATTTCA CTCTCACCAT CAGCAGCCTG 301 GAGGATGAAG ATCTGGCAAC TTATTTCTGT CTACAACATA GTTATCTCCC 351 GTACACGTTC GGAGGGGGGA CCAAGCTGGA AATAAAACGG GCTGATGCTG 401 CACCAACTGT ATCCATCTTC CCACCATCCA GTGAGCAGTT AACATCTGGA 451 GGTGCCTCAG TCGTGTGCTT CTTGAACAAC TTCTACCCCA AAGACATCAA 501 TGTCAAGTGG AAGATTGATG GCAGTGAACG ACAAAATGGC GTCCTGAACA 551 GTTGGACTGA TCAGGACAGC AAAGACAGCA CCTACAGCAT GAGCAGCACC 601 CTCACGTTGA CCAAGGACGA GTATGAACGA CATAACAGCT ATACCTGTGA 651 GGCCACTCAC AAGACATCAA CTTCACCCAT TGTCAAGAGC TTCAACAGGA 701 ATGAGTGTTA G (SEQ ID n°.: 10) A sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-D HC cadeia pesada é como segue: 1 EVQLQQSGPE LVTPGASVKI SCKASGYTFT DHYMSWVKQS HGKSLEWIGb 51 INPYSGEFTY NQKFKGTATL TVDKSSSIAY MEIRGLTSED SAVYYCARDD 101 YDASPFAYWG QGTLVTVSAA KTTPPSVYPL APGSAAQTNS MVTLGCLVKG 151 YFPEPVTVTW NSGSLSSGVH TFPAVLQSDL YTLSSSVTVP SSTWPSETVT 201 CNVAHPASST KVDKKIVPRD CGCKPCICTV PEVSSVFIFP PKPKDVLTIT 251 LTPKVTCVVV DISKDDPEVQ FSWFVDDVEV HTAQTQPREE QFNSTFRSVS 301 ELPIMHQDWL NGKEFKCRVN SPAFPAPIEK TISKTKGRPK APQVYTIPPP 351 KEQMAKDKVS LTCMITDFFP EDITVEWQWN GQPAENYKNT QPIMDTDGSY 401 FIYSKLNVQK SNWEAGNTFT CSVLHEGLHN HHTEKSLSHS PGK (SEQ ID n°.: 11 ) A sequência de ácidos nucléicos codificando a forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-D HC é: 1 GAGGTCCAGC TGCAACAGTC TGGACCTGAA CTGGTGACGC CTGGGGCTTC 51 AGTGAAGATA TCTTGTAAGG CTTCTGGATA CACATTCACT GACCACTACA 101 TGAGCTGGGT GAAGCAGAGT CATGGAAAAA GCCTTGAGTG GATTGGAGAT 151 ATTAATCCCT ATTCTGGTGA AACTACCTAC TCAAGGGCAC 201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AGTCTTCCAG ATGGAGATCC 251 GCGGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT AAGAGATGAT 301 TACGACGCCT CTCCGTTTGC TTACTGGGGC TGGTCACTGT 351 CTCTGCAGCC AAAACGACAC CCCCATCTGT GCCCCTGGAT 401 CTGCTGCCCA AACTAACTCC ATGGTGACCC GGTCAAGGGC 451 TATTTCCCTG AGCCAGTGAC AGTGACCTGG CCCTGTCCAG 501 CGGTGTGCAC ACCTTCCCAG CTGTCCTGCA TACACTCTGA 551 GCAGCTCAGT GACTGTCCCC TCCAGCACCT GACCGTCACC 601 TGCAACGTTG CCCACCCGGC CAGCAGCACC AGAAAATTGT 651 GCCCAGGGAT TGTGGTTGTA AGCCTTGCAT CCAGAAGTAT 701 CATCTGTCTT CATCTTCCCC CCAAAGCCCA CACCATTACT 751 CTGACTCCTA AGGTCACGTG TGTTGTGGTA AGGATGATCC 801 CGAGGTCCAG TTCAGCTGGT TTGTAGATGA CACACAGCTC 851 AGACGCAACC CCGGGAGGAG CAGTTCAACA GCACTTTCCG CTCAGTCAGT 901 GAACTTCCCA TCATGCACCA GGACTGGCTC AATGGCAAGG AGTTCAAATG 951 CAGGGTCAAC AGTCCAGCTT TCCCTGCCCC CATCGAGAAA ACCATCTCCA 1001 AAACCAAAGG CAGACCGAAG GCTCCACAGG TGTACACCAT TCCACCTCCC 1051 AAGGAGCAGA TGGCCAAGGA TAAAGTCAGT CTGACCTGCA TGATAACAGA 1101 CTTCTTCCCT GAAGACATTA CTGTGGAGTG GCAGTGGAAT GGGCAGCCAG 1151 CGGAGAACTA CAAGAACACT CAGCCCATCA TGGACACAGA TGGCTCTTAC 1201 TTCATCTACA GCAAGCTCAA TGTGCAGAAG AGCAACTGGG AGGCAGGAAA 1251 TACTTTCACC TGCTCTGTGT TACATGAGGG CCTGCACAAC CACCATACTG 1301 AGAAGAGCCT CTCCCACTCT CCTGGTAAAT GA (SEQ ID NO:12) A sequência de aminoácidos de Ab-D HC incluindo peptídeo sinal é: 1 MRCRWIFLFL LSGTAGVLSE VQLQQSGPEL CKASGYTFTD 51 HYMSWVKQSH GKSLEWIGDI NPYSGETTYN VDKSSSIAYM 101 EIRGLTSEDS AVYYCARDDY DASPFAYWGQ TTPPSVYPLA 151 PGSAAQTNSM VTLGCLVKGY FPEPVTVTWN FPAVLQSDLY 201 TLSSSVTVPS STWPSETVTC NVAHPASSTK GCKPCICTVP 251 EVSSVFIFPP KPKDVLTITL TPKVTCVVVD SWFVDDVEVH 301 TAQTQPREEQ FNSTFRSVSE LPIMHQDWLN PAFPAPIEKT 351 ISKTKGRPKA PQVYTIPPPK EQMAKDKVSL DITVEWQWNG 401 QPAENYKNTQ PIMDTDGSYF IYSKLNVQKS SVLHEGLHNH 451 HTEKSLSHSP GK (SEQ ID NO:13) A sequência de ácidos nucléicos de Ab-D HC incluindo codificação de peptídeo sinal é: 1 ATGAGATGCA GGTGGATCTT TCTCTTTCTC CTGCAGGTGT 51 CCTCTCTGAG GTCCAGCTGC AACAGTCTGG GTGACGCCTG 101 GGGCTTCAGT GAAGATATCT TGTAAGGCTT ATTCACTGAC 151 CACTACATGA GCTGGGTGAA GCAGAGTCAT TTGAGTGGAT 201 TGGAGATATT AATCCCTATT CTGGTGAAAC CAGAAGTTCA 251 AGGGCACGGC CACATTGACT GTAGACAAGT AGCCTACATG 301 GAGATCCGCG GCCTGACATC TGAGGACTCT ACTGTGCAAG 351 AGATGATTAC GACGCCTCTC CGTTTGCTTA GGGACTCTGG 401 TCACTGTCTC TGCAGCCAAA ACGACACCCC TCCACTGGCC 451 CCTGGATCTG CTGCCCAAAC TAACTCCATG GATGCCTGGT 501 CAAGGGCTAT TTCCCTGAGC CAGTGACAGT TCTGGATCCC 551 TGTCCAGCGG TGTGCACACC TTCCCAGCTG TGACCTCTAC 601 ACTCTGAGCA GCTCAGTGAC TGTCCCCTCC CCAGCGAGAC 651 CGTCACCTGC AACGTTGCCC ACCCGGCCAG GTGGACAAGA 701 AAATTGTGCC CAGGGATTGT GGTTGTAAGC TACAGTCCCA 751 GAAGTATCAT CTGTCTTCAT CTTCCCCCCA ATGTGCTCAC 801 CATTACTCTG ACTCCTAAGG TCACGTGTGT ATCAGCAAGG 851 ATGATCCCGA GGTCCAGTTC AGCTGGTTTG GGAGGTGCAC 901 ACAGCTCAGA CGCAACCCCG GGAGGAGCAG CTTTCCGCTC 951 AGTCAGTGAA CTTCCCATCA TGCACCAGGA GGCAAGGAGT 1001 TCAAATGCAG GGTCAACAGT CCAGCTTTCC CTGCCCCCAT CGAGAAAACC 1051 ATCTCCAAAA CCAAAGGCAG ACCGAAGGCT CCACAGGTGT ACACCATTCC 1101 ACCTCCCAAG GAGCAGATGG CCAAGGATAA AGTCAGTCTG ACCTGCATGA 1151 TAACAGACTT CTTCCCTGAA GACATTACTG TGGAGTGGCA GTGGAATGGG 1201 CAGCCAGCGG AGAACTACAA GAACACTCAG CCCATCATGG ACACAGATGG 1251 CTCTTACTTC ATCTACAGCA AGCTCAATGT GCAGAAGAGC AACTGGGAGG 1301 CAGGAAATAC TTTCACCTGC TCTGTGTTAC ATGAGGGCCT GCACAACCAC 1351 CATACTGAGA AGAGCCTCTC CCACTCTCCT GGTAAATGA (SEQ ID NO:14) As sequências CDR (região determinante de complementaridade) na região variável da cadeia pesada de Ab-D são como segue: CDR-H1 : DHYMS (SEQ ID n°.:39) CDR-H2: DINPYSGETTYNQKFKG (SEQ ID n°.:40) CDR-H3: DDYDASPFAY (SEQ ID n°.:41) As sequências de regiões variáveis de cadeia leve CDR de Ab-D são: CDR-L1 : QASQGTSINLN (SEQ ID n°.:42) CDR-L2: GSSNLED (SEQ ID n°.:43) CDR-L3 : LQHSYLPYT (SEQ ID n°.:44) Ab-C Anticorpo C (também referido aqui como Ab-C e Mab-C) é um anticorpo de camundongo que exibe alta afinidade de ligação à esclerostina. O padrão de ligação BIAcore de Ab-C é mostrado na Figura 17. A sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-C de cadeia leve é como segue: 1 DIVLTQSPAS LTVSLGLRAT ISCKASQSVD YDGDSYMNWY QQKPGQPPKL 51 LIYAASNLES GIPARFSGNG SGTDFTLNIH PVEEEDAVTY YCQQSNEDPW 101 TFGGGTKLEI KRADAAPTVS IFPPSSEQLT SGGASVVCFL NNFYPKDINV 151 KWKIDGSERQ NGVLNSWTDQ DSKDSTYSMS STLTLTKDEY ERHNSYTCEA 201 THKTSTSPIV KSFNRNEC (SEQ ID n°.: 15) A sequência de ácidos nucléicos codificando a forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-C LC é: 1 GACATTGTGC TGACCCAATC TCCAGCTTCT TTGACTGTGT CTCTAGGCCT 51 GAGGGCCACC ATCTCCTGCA AGGCCAGCCA AAGTGTTGAT TATGATGGTG 101 ATAGTTATAT GAACTGGTAC CAGCAGAAAC CAGGACAGCC ACCCAAACTC 151 CTCATCTATG CTGCATCCAA TCTAGAATCT GGGATCCCAG CCAGGTTTAG 201 TGGCAATGGG TCTGGGACAG ACTTCACCCT CAACATCCAT CCTGTGGAGG 251 AGGAGGATGC TGTAACCTAT TACTGTCAAC AAAGTAATGA GGATCCGTGG 301 ACGTTCGGTG GAGGCACCAA GCTGGAAATC AAACGGGCTG ATGCTGCACC 351 AACTGTATCC ATCTTCCCAC CATCCAGTGA GCAGTTAACA TCTGGAGGTG 401 CCTCAGTCGT GTGCTTCTTG AACAACTTCT ACCCCAAAGA CATCAATGTC 451 AAGTGGAAGA TTGATGGCAG TGAACGACAA AATGGCGTCC TGAACAGTTG 501 GACTGATCAG GACAGCAAAG ACAGCACCTA CAGCATGAGC AGCACCCTCA 551 CGTTGACCAA GGACGAGTAT GAACGACATA ACAGCTATAC CTGTGAGGCC 601 ACTCACAAGACATCAACTTC ACCCATTGTC AAGAGCTTCA ACAGGAATGA 651 GTGTTAG (SEQ ID n°.:16) A sequência de aminoácidos de Ab-C LC incluindo peptídeo sinal é: 1 METDTILLWV LLLWVPGSTG DIVLTQSPAS LTVSLGLRAT ISCKASQSVD 51 YDGDSYMNWY QQKPGQPPKL LIYAASNLES GIPARFSGNG SGTDFTLNIH 101 PVEEEDAVTY YCQQSNEDPW TFGGGTKLEI KRADAAPTVS IFPPSSEQLT 151 SGGASVVCFL NNFYPKDINV KWKIDGSERQ NGVLNSWTDQ DSKDSTYSMS 201 STLTLTKDEY ERHNSYTCEA THKTSTSPIV KSFNRNEC (SEQ ID n°.: 17) A sequência de ácidos nucléicos de Ab-C LC incluindo a sequência de codificação de peptídeo sinal é: 1 ATGGAGACAG ACACAATCCT GCTATGGGTG GGGTTCCAGG 51 CTCCACTGGT GACATTGTGC TGACCCAATC TTGACTGTGT 101 CTCTAGGCCT GAGGGCCACC ATCTCCTGCA AAGTGTTGAT 151 TATGATGGTG ATAGTTATAT GAACTGGTAC CAGGACAGCC 201 ACCCAAACTC CTCATCTATG CTGCATCCAA GGGATCCCAG 251 CCAGGTTTAG TGGCAATGGG TCTGGGACAG CAACATCCAT 301 CCTGTGGAGG AGGAGGATGC TGTAACCTAT AAAGTAATGA 351 GGATCCGTGG ACGTTCGGTG GAGGCACCAA AAACGGGCTG 401 ATGCTGCACC AACTGTATCC ATCTTCCCAC GCAGTTAACA 451 TCTGGAGGTG CCTCAGTCGT GTGCTTCTTG ACCCCAAAGA 501 CATCAATGTC AAGTGGAAGA TTGATGGCAG AATGGCGTCC 551 TGAACAGTTG GACTGATCAG GACAGCAAAG CAGCATGAGC 601 AGCACCCTCA CGTTGACCAA GGACGAGTAT ACAGCTATAC 651 CTGTGAGGCC ACTCACAAGA CATCAACTTC ACCCATTGTC AAGAGCTTCA 701 ACAGGAATGA GTGTTAG (SEQ ID n°.: 18) Ab-C Cadeia pesada A sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-C HC é: 1 EVQLQQSGPE LVKPGTSVKM SCKASGYTFT DCYMNWVKQS HGKSLEWIGD 51 INPFNGGTTY NQKFKGKATL TVDKSSSTAY MQLNSLTSDD SAVYYCARSH 101 YYFDGRVPWD AMDYWGQGTS VTVSSAKTTP PSVYPLAPGS AAQTNSMVTL 151 GCLVKGYFPE PVTVTWNSGS LSSGVHTFPA VLQSDLYTLS SSVTVPSSTW 201 PSETVTCNVA HPASSTKVDK KIVPRDCGCK PCICTVPEVS SVFIFPPKPK 251 DVLTITLTPK VTCVVVDISK DDPEVQFSWF VDDVEVHTAQ TQPREEQFNS 301 TFRSVSELPI MHQDWLNGKE FKCRVNSAAF PAPIEKTISK TKGRPKAPQV 351 YTIPPPKEQM AKDKVSLTCM ITDFFPEDIT VEWQWNGQPA ENYKNTQPIM 401 DTDGSYFIYS KLNVQKSNWE AGNTFTCSVL HEGLHNHHTE KSLSHSPGK (SEQ ID n°.: 19) A sequência de ácidos nucléicos codificando a forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-C HC é como segue: 1 GAGGTCCAGC TGCAACAATC TGGACCTGAG CTGGTGAAGC CTGGGACTTC 51 AGTGAAGATG TCCTGTAAGG CTTCTGGATA CACATTCACT GACTGCTACA 101 TGAACTGGGT GAAGCAGAGC CATGGGAAGA GCCTTGAATG GATTGGAGAT 151 ATTAATCCTT TCAACGGTGG TACTACCTAC AACCAGAAGT TCAAGGGCAA 201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AATCCTCCAG CACAGCCTAC ATGCAGCTCA 251 ACAGCCTGAC ATCTGACGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGATCCCAT 301 TATTACTTCG ATGGTAGAGT CCCTTGGGAT GCTATGGACT ACTGGGGTCA 351 AGGAACCTCA GTCACCGTCT CCTCAGCCAA AACGACACCC CCATCTGTCT 401 ATCCACTGGC CCCTGGATCT GCTGCCCAAA CTAACTCCAT GGTGACCCTG 451 GGATGCCTGG TCAAGGGCTA TTTCCCTGAG CCAGTGACAG TGACCTGGAA 501 CTCTGGATCC CTGTCCAGCG GTGTGCACAC CTTCCCAGCT GTCCTGCAGT 551 CTGACCTCTA CACTCTGAGC AGCTCAGTGA CTGTCCCCTC CAGCACCTGG 601 CCCAGCGAGA CCGTCACCTG CAACGTTGCC CACCCGGCCA GCAGCACCAA 651 GGTGGACAAG AAAATTGTGC CCAGGGATTG TGGTTGTAAG CCTTGCATAT 701 GTACAGTCCC AGAAGTATCA TCTGTCTTCA TCTTCCCCCC AAAGCCCAAG 751 GATGTGCTCA CCATTACTCT GACTCCTAAG GTCACGTGTG TTGTGGTAGA 801 CATCAGCAAG GATGATCCCG AGGTCCAGTT CAGCTGGTTT GTAGATGATG 851 TGGAGGTGCA CACAGCTCAG ACGCAACCCC GGGAGGAGCA GTTCAACAGC 901 ACTTTCCGCT CAGTCAGTGA ACTTCCCATC ATGCACCAGG ACTGGCTCAA 951 TGGCAAGGAG TTCAAATGCA GGGTCAACAG TGCAGCTTTC CCTGCCCCCA 1001 TCGAGAAAAC CATCTCCAAA ACCAAAGGCA GACCGAAGGC TCCACAGGTG 1051 TACACCATTC CACCTCCCAA GGAGCAGATG GCCAAGGATA AAGTCAGTCT 1101 GACCTGCATG ATAACAGACT TCTTCCCTGA AGACATTACT GTGGAGTGGC 1151 AGTGGAATGG GCAGCCAGCG GAGAACTACA AGAACACTCA GCCCATCATG 1201 GACACAGATG GCTCTTACTT CATCTACAGC AAGCTCAATG TGCAGAAGAG 1251 CAACTGGGAG GCAGGAAATA CTTTCACCTG CTCTGTGTTA CATGAGGGCC 1301 TGCACAACCA CCATACTGAG AAGAGCCTCT CCCACTCTCC TGGTAAATGA (SEQ ID n°.-20) A sequência de aminoácidos de Ab-C HC incluindo peptídeo sinal é: 1 MGWNWIFLFL LSGTAGVYSE VQLQQSGPEL CKASGYTFTD 51 CYMNWVKQSH GKSLEWIGDI NPFNGGTTYN VDKSSSTAYM 101 QLNSLTSDDs AVYYCARSHY YFDGRVPWDA TVSSAKTTPP 151 SVYPLAPGSA AQTNSMVTLG CLVKGYFPEP SSGVHTFPAV 201 LQSDLYTLSS SVTVPSSTWP SETVTCNVAH IVPRDCGCKP 251 CICTVPEVSS VFIFPPKPKD VLTITLTPKV DPEVQFSWFV 301 DDVEVHTAQT QPREEQFNST FRSVSELPIM KCRVNSAAFP 351 APIEKTISKT KGRPKAPQVY TIPPPKEQMA TDFFPEDITV 401 EWQWNGQPAE NYKNTQPIMD TDGSYFIYSK GNTFTCSVLH 451 EGLHNHHTEK SLSHSPGK (SEQ ID n°.:21) A sequência de ácidos nucléicos de Ab-C HC incluindo codificação de peptídeo sinal é: 1 ATGGGATGGA ACTGGATCTT TCTCTTCCTC CTGCAGGTGT 51 CTACTCTGAG GTCCAGCTGC AACAATCTGG GTGAAGCCTG 101 GGACTTCAGT GAAGATGTCC TGTAAGGCTT ATTCACTGAC 151 TGCTACATGA ACTGGGTGAA GCAGAGCCAT TTGAATGGAT 201 TGGAGATATT AATCCTTTCA ACGGTGGTAC CAGAAGTTCA 251 AGGGCAAGGC CACATTGACT GTAGACAAAT AGCCTACATG 301 CAGCTCAACA GCCTGACATC TGACGACTCT ACTGTGCAAG 351 ATCCCATTAT TACTTCGATG GTAGAGTCCC ATGGACTACT 401 GGGGTCAAGG AACCTCAGTC ACCGTCTCCT GACACCCCCA 451 TCTGTCTATC CACTGGCCCC TGGATCTGCT ACTCCATGGT 501 GACCCTGGGA TGCCTGGTCA AGGGCTATTT GTGACAGTGA 551 CCTGGAACTC TGGATCCCTG TCCAGCGGTG CCCAGCTGTC 601 CTGCAGTCTG ACCTCTACAC TCTGAGCAGC TCCCCTCCAG 651 CACCTGGCCC AGCGAGACCG TCACCTGCAA CCGGCCAGCA 701 GCACCAAGGT GGACAAGAAA ATTGTGCCCA TTGTAAGCCT 751 TGCATATGTA CAGTCCCAGA AGTATCATCT TCCCCCCAAA 801 GCCCAAGGAT GTGCTCACCA TTACTCTGAC ACGTGTGTTG 851 TGGTAGACAT CAGCAAGGAT GATCCCGAGG TCCAGTTCAG CTGGTTTGTA 901 GATGATGTGG AGGTGCACAC AGCTCAGACG CAACCCCGGG AGGAGCAGTT 951 CAACAGCACT TTCCGCTCAG TCAGTGAACT TCCCATCATG CACCAGGACT 1001 GGCTCAATGG CAAGGAGTTC AAATGCAGGG TCAACAGTGC AGCTTTCCCT 1051 GCCCCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAACC AAAGGCAGAC CGAAGGCTCC 1101 ACAGGTGTAC ACCATTCCAC CTCCCAAGGA GCAGATGGCC AAGGATAAAG 1151 TCAGTCTGAC CTGCATGATA ACAGACTTCT TCCCTGAAGA CATTACTGTG 1201 GAGTGGCAGT GGAATGGGCA GCCAGCGGAG AACTACAAGA ACACTCAGCC 1251 CATCATGGAC ACAGATGGCT CTTACTTCAT CTACAGCAAG CTCAATGTGC 1301 AGAAGAGCAA CTGGGAGGCA GGAAATACTT TCACCTGCTC TGTGTTACAT 1351 GAGGGCCTGC ACAACCACCA TACTGAGAAG AGCCTCTCCC ACTCTCCTGG 1401 TAAATGA (SEQ ID n°.:22) As sequências CDR (região determinante de complementaridade) na região variável da cadeia pesada de Ab-C são como segue: CDR-H1 : DCYMN (SEQ ID n°.:45) CDR-H2: DINPFNGGTTYNQKFKG (SEQ ID n°.:46) CDR-H3 : SHYYFDGRVPWDAMDY (SEQ ID n°.:47) As sequências de região variável CDR de cadeia leve de Ab-C são: CDR-L1 : KASQ SVDYDGD SYMN (SEQ ID n°.:48) CDR-L2: AASNLES (SEQ ID n°.:49) CDR-L3 : QQSNEDPWT (SEQ ID n°.:50). Ab-A Anticorpo A (também referido aqui como Ab-A e Mab-A) é a anticorpo quimérico coelho-camundongo que exibe alta afinidade de ligação à esclerostina. O padrão de ligação BIAcore de Ab-A é mostrado em Figura 15. Ab-A Cadeia leve A sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-A LC: 1 AQVLTQTPAS VSAAVGGTVT INCQSSQSVY DNNWLAWFQQ KPGQPPKLLI 51 YDASDLASGV PSRFSGSGSG TQFTLTISGV QCADAATYYC QGAYNDVIYA 101 FGGGTEVVVK RTDAAPTVSI FPPSSEQLTS GGASVVCFLN NFYPKDINVK 151 WKIDGSERQN GVLNSWTDQD SKDSTYSMSS TLTLTKDEYE RHNSYTCEAT 201 HKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID n°.:23) A sequência de ácidos nucléicos codificando a forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-A LC: 1 GCGCAAGTGC TGACCCAGAC TCCAGCCTCC GTGTCTGCAG CTGTGGGAGG 51 CACAGTCACC ATCAATTGCC AGTCCAGTCA GAGTGTTTAT GATAACAACT 101 GGTTAGCCTG GTTTCAGCAG AAACCAGGGC AGCCTCCCAA GCTCCTGATT 151 TATGATGCAT CCGATCTGGC ATCTGGGGTC CCATCGCGGT TCAGTGGCAG 201 TGGATCTGGG ACACAGTTCA CTCTCACCAT CAGCGGCGTG CAGTGTGCCG 251 ATGCTGCCAC TTACTACTGT CAAGGCGCTT ATAATGATGT TATTTATGCT 301 TTCGGCGGAG GGACCGAGGT GGTGGTCAAA CGTACGGATG CTGCACCAAC 351 TGTATCCATC TTCCCACCAT CCAGTGAGCA GTTAACATCT GGAGGTGCCT 401 CAGTCGTGTG CTTCTTGAAC AACTTCTACC CCAAAGACAT CAATGTCAAG 451 TGGAAGATTG ATGGCAGTGA ACGACAAAAT GGCGTCCTGA ACAGTTGGAC 501 TGATCAGGAC AGCAAAGACA GCACCTACAG CATGAGCAGC ACCCTCACGT 551 TGACCAAGGA CGAGTATGAA CGACATAACA GCTATACCTG TGAGGCCACT 601 CACAAGACAT CAACTTCACC CATTGTCAAG AGCTTCAACA GGAATGAGTG 651 TTAG (SEQ ID n°.:24) A sequência de aminoácidos de Ab-A LC incluindo peptídeo sinal é: 1 MDTRAPTQLL GLLLLWLPGA TFAQVLTQTP ASVSAAVGGT VTINCQSSQS 51 VYDNNWLAWF QQKPGQPPKL LIYDASDLAS GVPSRFSGSG SGTQFTLTIS 101 GVQCADAATY YCQGAYNDVI YAFGGGTEVV VKRTDAAPTV SIFPPSSEQL 151 TSGGASVVCF LNNFYPKDIN VKWKIDGSER QNGVLNSWTD QDSKDSTYSM 201 SSTLTLTKDE YERHNSYTCE ATHKTSTSPI VKSFNRNEC (SEQ ID n°.:25) A sequência de ácidos nucléicos de Ab-A LC incluindo a sequência de codificação de peptídeo sinal é: 1 ATGGACACGA GGGCCCCCAC TCAGCTGCTG GGGCTCCTGC TGCTCTGGCT 51 CCCAGGTGCC ACATTTGCGC AAGTGCTGAC CCAGACTCCA GCCTCCGTGT 101 CTGCAGCTGT GGGAGGCACA GTCACCATCA ATTGCCAGTC CAGTCAGAGT 151 GTTTATGATA ACAACTGGTT AGCCTGGTTT CAGCAGAAAC CAGGGCAGCC 201 TCCCAAGCTC CTGATTTATG ATGCATCCGA TCTGGCATCT GGGGTCCCAT 251 CGCGGTTCAG TGGCAGTGGA TCTGGGACAC AGTTCACTCT CACCATCAGC 301 GGCGTGCAGT GTGCCGATGC TGCCACTTAC TACTGTCAAG GCGCTTATAA 351 TGATGTTATT TATGCTTTCG GCGGAGGGAC CGAGGTGGTG GTCAAACGTA 401 CGGATGCTGC ACCAACTGTA TCCATCTTCC CACCATCCAG TGAGCAGTTA 451 ACATCTGGAG GTGCCTCAGT CGTGTGCTTC TTGAACAACT TCTACCCCAA 501 AGACATCAAT GTCAAGTGGA AGATTGATGG CAGTGAACGA CAAAATGGCG 551 TCCTGAACAG TTGGACTGAT CAGGACAGCA AAGACAGCAC CTACAGCATG 601 AGCAGCACCC TCACGTTGAC CAAGGACGAG TATGAACGAC ATAACAGCTA 651 TACCTGTGAG GCCACTCACA AGACATCAAC TTCACCCATT GTCAAGAGCT 701 TCAACAGGAA TGAGTGTTAG (SEQ ID n°.:26) A sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-A HC é: 1 QSLEESGGRL VTPGTPLTLT CTASGFSLSS YWMNWVRQAP GEGLEWIGTI 51 DSGGRTDYAS WAKGRFTISR TSTTMDLKMT SLTTGDTARY FCARNWNLWG 101 QGTLVTVSSA STKGPSVYPL APGSAAQTNS MVTLGCLVKG YFPEPVTVTW 151 NSGSLSSGVH TFPAVLQSDL YTLSSSVTVP SSTWPSETVT CNVAHPASST 201 KVDKKLVPRD CGCKPCICTV PEVSSVFIFP PKPKDVLTIT LTPKVTCVVV 251 DISKDDPEVQ FSWFVDDVEV HTAQTQPREE QFNSTFRSVSE LPIMHQDWL 301 NGKEFKCRVN SAAFPAPIEK TISKTKGRPK APQVYTIPPP KEQMAKDKVS 351 LTCMITDFFP EDITVEWQWN GQPAENYKNT QPIMNTNGSY FVYSKLNVQK 401 SNWEAGNTFT CSVLHEGLHN HHTEKSLSHS PGK (SEQ ID n°.:27) A sequência de ácidos nucléicos codificando a forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-A HC: 1 CAGTCGCTGG AGGAGTCCGG GGGTCGCCTG GTCACGCCTG GGACACCCCT 51 GACACTCACC TGCACAGCCT CTGGATTCTC CCTCAGTAGT TATTGGATGA 101 ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGGGAGGGGC TGGAATGGAT CGGAACCATT 151 GATTCTGGTG GTAGGACGGA CTACGCGAGC TGGGCAAAAG GCCGATTCAC 201 CATCTCCAGA ACCTCGACTA CGATGGATCT GAAAATGACC AGTCTGACGA 251 CCGGGGACAC GGCCCGTTAT TTCTGTGCCA GAAATTGGAA CTTGTGGGGC 301 CAAGGCACCC TCGTCACCGT CTCGAGCGCT TCTACAAAGG GCCCATCTGT 351 CTATCCACTG GCCCCTGGAT CTGCTGCCCA AACTAACTCC ATGGTGACCC 401 TGGGATGCCT GGTCAAGGGC TATTTCCCTG AGCCAGTGAC AGTGACCTGG 451 AACTCTGGAT CCCTGTCCAG CGGTGTGCAC ACCTTCCCAG CTGTCCTGCA 501 GTCTGACCTC TACACTCTGA GCAGCTCAGT GACTGTCCCC TCCAGCACCT 551 GGCCCAGCGA GACCGTCACC TGCAACGTTG CAGCAGCACC 601 AAGGTGGACA AGAAAATTGT GCCCAGGGAT AGCCTTGCAT 651 ATGTACAGTC CCAGAAGTAT CATCTGTCTT CCAAAGCCCA 701 AGGATGTGCT CACCATTACT CTGACTCCTA TGTTGTGGTA 751 GACATCAGCA AGGATGATCC CGAGGTCCAG TTGTAGATGA 801 TGTGGAGGTG CACACAGCTC AGACGCAACC CAGTTCAACA 851 GCACTTTCCG CTCAGTCAGT GAACTTCCCA GGACTGGCTC 901 AATGGCAAGG AGTTCAAATG CAGGGTCAAC TCCCTGCCCC 951 CATCGAGAAA ACCATCTCCA AAACCAAAGG GCTCCACAGG 1001 TGTACACCAT TCCACCTCCC AAGGAGCAGA TAAAGTCAGT 1051 CTGACCTGCA TGATAACAGA CTTCTTCCCT CTGTGGAGTG 1101 GCAGTGGAAT GGGCAGCCAG CGGAGAACTA CAGCCCATCA 1151 TGGACACAGA TGGCTCTTAC TTCGTCTACA TGTGCAGAAG 1201 AGCAACTGGG AGGCAGGAAA TACTTTCACC TACATGAGGG 1251 CCTGCACAAC CACCATACTG AGAAGAGCCT CTCCCACTCT CCTGGTAAAT 1301 GA (SEQ ID n°.:28) A sequência de aminoácidos de Ab-A HC incluindo peptídeo sinal é: 1 METGLRWLLL VAVLKGVHCQ SLEESGGRLV TPGTPLTLTC TASGFSLSSY 51 WMNWVRQAPG EGLEWIGTID SGGRTDYASW AKGRFTISRT STTMDLKMTS 101 LTTGDTARYF CARNWNLWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVYPLA PGSAAQTNSM 151 VTLGCLVKGY FPEPVTVTWN SGSLSSGVHT FPAVLQSDLY TLSSSVTVPS 201 STWPSETVTC NVAHPASSTK VDKKIVPRDC GCKPCICTVP EVSSVFIFPP 251 KPKDVLTITL TPKVTCVVVD ISKDDPEVQF SWFVDDVEVH TAQTQPREEQ 301 FNSTFRSVSE LPIMHQDWLN GKEFKCRVNS AAFPAPIEKT ISKTKGRPKA 351 PQVYTIPPPK EQMAKDKVSL TCMITDFFPE DITVEWQWNG QPAENYKNTQ 401 PIMNTNGSYF VYSKLNVQKS NWEAGNTFTC SVLHEGLHNH HTEKSLSHSP 451 GK (SEQ ID n°.:29) A sequência de ácidos nucléicos de Ab-A HC incluindo a sequência de codificação de peptídeo sinal: 1 ATGGAGACTG GGCTGCGCTG GCTTCTCCTG GTCGCTGTGC TCAAAGGTGT 51 CCACTGTCAG TCGCTGGAGG AGTCCGGGGG TCGCCTGGTC ACGCCTGGGA 101 CACCCCTGAC ACTCACCTGC ACAGCCTCTG GATTCTCCCT CAGTAGTTAT 151 TGGATGAACT GGGTCCGCCA GGCTCCAGGG GAGGGGCTGG AATGGATCGG 201 AACCATTGAT TCTGGTGGTA GGACGGACTA CGCGAGCTGG GCAAAAGGCC 251 GATTCACCAT CTCCAGAACC TCGACTACGA TGGATCTGAA AATGACCAGT 301 CTGACGACCG GGGACACGGC CCGTTATTTC TGTGCCAGAA ATTGGAACTT 351 GTGGGGCCAA GGCACCCTCG TCACCGTCTC GAGCGCTTCT ACAAAGGGCC 401 CATCTGTCTA TCCACTGGCC CCTGGATCTG CTGCCCAAAC TAACTCCATG 451 GTGACCCTGG GATGCCTGGT CAAGGGCTAT TTCCCTGAGC CAGTGACAGT 501 GACCTGGAAC TCTGGATCCC TGTCCAGCGG TGTGCACACC TTCCCAGCTG 551 TCCTGCAGTC TGACCTCTAC ACTCTGAGCA GCTCAGTGAC TGTCCCCTCC 601 AGCACCTGGC CCAGCGAGAC CGTCACCTGC AACGTTGCCC ACCCGGCCAG 651 CAGCACCAAG GTGGACAAGA AAATTGTGCC CAGGGATTGT GGTTGTAAGC 701 CTTGCATATG TACAGTCCCA GAAGTATCAT CTTCCCCCCA 751 AAGCCCAAGG ATGTGCTCAC CATTACTCTG TCACGTGTGT 801 TGTGGTAGAC ATCAGCAAGG ATGATCCCGA AGCTGGTTTG 851 TAGATGATGT GGAGGTGCAC ACAGCTCAGA GGAGGAGCAG 901 TTCAACAGCA CTTTCCGCTC AGTCAGTGAA TGCACCAGGA 951 CTGGCTCAAT GGCAAGGAGT TCAAATGCAG GCAGCTTTCC 1001 CTGCCCCCAT CGAGAAAACC ATCTCCAAAA ACCGAAGGCT 1051 CCACAGGTGT ACACCATTCC ACCTCCCAAG CCAAGGATAA 1101 AGTCAGTCTG ACCTGCATGA TAACAGACTT GACATTACTG 1151 TGGAGTGGCA GTGGAATGGG CAGCCAGCGG GAACACTCAG 1201 CCCATCATGG ACACAGATGG CTCTTACTTC AGCTCAATGT 1251 GCAGAAGAGC AACTGGGAGG CAGGAAATAC TCTGTGTTAC 1301 ATGAGGGCCT GCACAACCAC CATACTGAGA CCACTCTCCT 1351 GGTAAATGA (SEQ ID n°.:30) As sequências CDR (região determinante de complementaridade) na região variável da cadeia pesada de Ab-A são como segue: CDR-H1: SYWMN (SEQ ID n°.:51) CDR-H2: TIDSGGRTDYASWAKG (SEQ ID n°.:52) CDR-H3: NWNL (SEQ ID n°.:53) As sequências de região variável CDR de cadeia leve de Ab-A são: CDR-L1 : QSSQSVYDNNWLA (SEQ ID n°.:54) CDR-L2: DASDLAS (SEQ ID n°.: 55) CDR-L3 : QGAYNDVTYA (SEQ ID n°.:56) Ab-A foi humanizado, e é referido como Anticorpo 1 (também referido aqui como Ab-1), tendo as seguintes sequências: A sequência de ácidos nucléicos de Ab-1 LC região variável incluindo a sequência de codificação de peptídeo sinal é ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGG CTCCCAGGT GCCACATTTGCTCAAGTTCTGACCCAGAGTCCAAGCAGTCTCTCCGCCAGCGTA GGC GATCGTGTGACTATTACCTGTCAATCTAGTCAGAGCGTGTATGATAACAATTGGC TG GCGTGGTACCAGCAAAAACCGGGCAAAGCCCCGAAGCTGCTCATCTATGACGC GTC CGATCTGGCTAGCGGTGTGCCAAGCCGTTTCAGTGGCAGTGGCAGCGGTACTG ACT TTACCCTCACAATTTCGTCTCTCCAGCCGGAAGATTTCGCCACTTACTATTGTCA AG GTGCTTACAACGATGTGATTTATGCCTTCGGTCAGGGCACTAAAGTAGAAATCA AA CGT (SEQ ID n°.:74) A sequência de aminoácidos de região variável Ab -1 LC incluindo peptídeo sinal é: MDTRAPTOLLGLLLLWLPGATFAOVLTOS PSSLSASVGD RVTITCQSSQSV YDNNWLA WYQQKPGKAPKLLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQG AYN DVIYAFGQGTKVEIKR (SEQ ID n°.:75) A sequência de ácidos nucléicos de Ab-1 HC região variável incluindo a sequência de codificação de peptídeo sinal é: ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGT GTCCACTGT GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGAGGCGGGCTTGTCCAGCCTGGAGGGAGCC TGCG TCTCTCTTGTGCAGCAAGCGGCTTCAGCTTATCCTCTTACTGGATGAATTGGGT GCG GCAGGCACCTGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTGGGCACCATTGATTCCGGAGGC CGTA CAGACTACGCGTCTTGGGCAAAGGGCCGTTTCACCATTTCCCGCGACAACTCCA AA AATACCATGTACCTCCAGATGAACTCTCTCCGCGCAGAGGACACAGCACGTTAT TA CTGTGCACGCAACTGGAATCTGTGGGGTCAAGGTACTCTTGTAACAGTCTCGAG C (SEQ ID n°.:76 ) Sequência de aminoácidos de Ab-1 HC região variável incluindo peptídeo sinal METGLRWLLLVAVLKGVHCEVQLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFSLSS YWMNWVR QAPGKGLEWVGTIDSGGRTDYASWAKGRFTISRDNSKNTMYLQMNSLRAEDtARY YC ARNWNLWGQGTLVTVSS (SEQ ID n°.: 77 ) As regiões CDR (região determinante de complementaridade) sequências na região variável da cadeia pesada de Ab-1 são como segue: CDR-H1: SYWMN (SEQ ID n°.:51) CDR-H2: TIDSGGRTDYASWAKG (SEQ ID n°.:52) CDR-H3 : NWNL (SEQ ID n°.:53) As sequências de região variável CDR de cadeia leve de Ab-1 são: CDR-L1 : QSSQSVYDNNWLA (SEQ ID n°.:54) CDR-L2: DASDLAS (SEQ ID n°.:55) CDR-L3: QGAYNDVTYA (SEQ ID n°.:56) Ab-B Anticorpo B (também referido aqui como Ab-B e Mab-B) é o anticorpo de camundongo que exibe alta afinidade de ligação à esclerostina. O padrão de ligação BIAcore de Ab-B é mostrado em Figura 16. Ab-B Cadeia leve A sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-B LC é: 1 QIVLTQSPTI VSASPGEKVT LICSASSSVS FVDWFQQKPG TSPKRWIYRT 51 SNLGFGVPAR FSGGGSGTSH SLTISRMEAE DAATYYCQQR STYPPTFGAG 101 TKLELKRADA APTVSIFPPS SEQLTSGGAS VVCFLNNFYP KDINVKWKID 151 GSERQNGVLN SWTDQDSKDS TYSMSSTLTL TKDEYERHNS YTCEATHKTS 201 TSPIVKSFNR NEC(SEQ ID n°.:31) A sequência de ácidos nucléicos codificando a forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-B LC é: 1 CAAATTGTTC TCACCCAGTC TCCAACAATC GTGTCTGCAT CTCCAGGGGA 51 GAAGGTCACc CTAATCTGCA GTGCCAGTTC AAGTGTAAGT TTCGTGGACT 101 GGTTCCAGCA GAAGCCAGGC ACTTCTCCCA AACGCTGGAT TTACAGAACA 151 TCCAACCTGG GTTTTGGAGT CCCTGCTCGC TTCAGTGGCG GTGGATCTGG 201 GACCTCTCAC TCTCTCACAA TCAGCCGAAT GGAGGCTGAA GATGCTGCCA 251 CTTATTACTG CCAGCAAAGG AGTACTTACC CACCCACGTT CGGTGCTGGG 301 ACCAAGCTGG AACTGAAACG GGCTGATGCT GCACCAACTG TATCCATCTT 351 CCCACCATCC AGTGAGCAGT TAACATCTGG AGGTGCCTCA GTCGTGTGCT 401 TCTTGAACAA CTTCTACCCC AAAGACATCA ATGTCAAGTG GAAGATTGAT 451 GGCAGTGAAC GACAAAATGG CGTCCTGAAC AGTTGGACTG ATCAGGACAG 501 CAAAGACAGC ACCTACAGCA TGAGCAGCAC CCTCACGTTG ACCAAGGACG 551 AGTATGAACG ACATAACAGC TATACCTGTG AGGCCACTCA CAAGACATCA 601 ACTTCACCCA TTGTCAAGAG CTTCAACAGG AATGAGTGTT AG (SEQ ID n°.:32) A sequência de aminoácidos de Ab-B LC incluindo peptídeo sinal é: 1 MHFQVQIFSF LLISASVIVS RGQIVLTQSP TIVSASPGEK VTLICSASSS 51 VSFVDWFQQK PGTSPKRWIY RTSNLGFGVP ARFSGGGSGT SHSLTISRME 101 AEDAATYYCQ QRSTYPPTFG AGTKLELKRA DAAPTVSIFP PSSEQLTSGG 151 ASVVCFLNNF YPKDINVKWK IDGSERQNGV LNSWTDQDSK DSTYSMSSTL 201 TLTKDEYERH NSYTCEATHK TSTSPIVKSF NRNEC (SEQ ID n°.:33) A sequência de ácidos nucléicos de Ab-B LC incluindo a sequência de codificação de peptídeo sinal é: 1 ATGCATTTTC AAGTGCAGAT TTTCAGCTTC CTGCTAATCA GTGCCTCAGT 51 CATAGTGTCC AGAGGGCAAA TTGTTCTCAC CCAGTCTCCA ACAATCGTGT 101 CTGCATCTCC AGGGGAGAAG GTCACCCTAA TCTGCAGTGC CAGTTCAAGT 151 GTAAGTTTCG TGGACTGGTT CCAGCAGAAG CCAGGCACTT CTCCCAAACG 201 CTGGATTTAC AGAACATCCA ACCTGGGTTT TGGAGTCCCT GCTCGCTTCA 251 GTGGCGGTGG ATCTGGGACC TCTCACTCTC TCACAATCAG CCGAATGGAG 301 GCTGAAGATG CTGCCACTTA TTACTGCCAG CAAAGGAGTA CTTACCCACC 351 CACGTTCGGT GCTGGGACCA AGCTGGAACT GAAACGGGCT GATGCTGCAC 401 CAACTGTATC CATCTTCCCA CCATCCAGTG AGCAGTTAAC ATCTGGAGGT 451 GCCTCAGTCG TGTGCTTCTT GAACAACTTC TACCCCAAAG ACATCAATGT 501 CAAGTGGAAG ATTGATGGCA GTGAACGACA AAATGGCGTC CTGAACAGTT 551 GGACTGATCA GGACAGCAAA GACAGCACCT ACAGCATGAG CAGCACCCTC 601 ACGTTGACCA AGGACGAGTA TGAACGACAT AACAGCTATA CCTGTGAGGC 651 CACTCACAAG ACATCAACTT CACCCATTGT CAAGAGCTTC AACAGGAATG 701 AGTGTTAG (SEQ ID n°.:34) Ab-B Cadeia pesada A sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-B HC: 1 QVTLKESGPG ILQPSQTLSL TCSFSGFSLS TSGMGVGWIR HPSGKNLEWL 51 AHIWWDDVKR YNPVLKSRLT ISKDTSNSQV FLKIANVDTA DTATYYCARI 101 EDFDYDEEYY AMDYWGQGTS VIVSSAKTTP PSVYPLAPGS AAQTNSMVTL 151 GCLVKGYFPE PVTVTWNSGS LSSGVHTFPA VLQSDLYTLS SSVTVPSSTW 201 PSETVTCNVA HPASSTKVDK KIVPRDCGCK PCICTVPEVS SVFIFPPKPK 251 DVLTITLTPK VTCVVVDISK DDPEVQFSWF VDDVEVHTAQ TQPBEEQFNS 301 TFRSVSELPI MHQDWLNGKE FKCRVNSAAF PAPIEKTISK TKGRPKAPQV 351 YTIPPPKEQM AKDKVSLTCM ITDFFPEDIT VEWQWNGQPA ENYKNTQPIM 401 DTDGSYFVYS KLNVQKSNWE AGNTFTCSVL HEGLHNHHTE KSLSHSPGK (SEQ ID n°.:35) A sequência de ácidos nucléicos codificando a forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-B HC: 1 CAGGTTACTC TGAAAGAGTC TGGCCCTGGG ATATTGCAGC CCTCCCAGAC 51 CCTCAGTCTG ACTTGTTCTT TCTCTGGGTT TTCACTGAGC ACTTCTGGTA 101 TGGGTGTAGG CTGGATTCGT CACCCATCAG GGAAGAATCT GGAGTGGCTG 151 GCACACATTT GGTGGGATGA TGTCAAGCGC TATAACCCAG TCCTGAAGAG 201 CCGACTGACT ATCTCCAAGG ATACCTCCAA CAGCCAGGTA TTCCTCAAGA 251 TCGCCAATGT GGACACTGCA GATACTGCCA CATACTACTG TGCTCGAATA 301 GAGGACTTTG ATTACGACGA GGAGTATTAT GCTATGGACT ACTGGGGTCA 351 AGGAACCTCA GTCATCGTCT CCTCAGCCAA AACGACACCC CCATCTGTCT 401 ATCCACTGGC CCCTGGATCT GCTGCCCAAA CTAACTCCAT GGTGACCCTG 451 GGATGCCTGG TCAAGGGCTA TTTCCCTGAG TGACCTGGAA 501 CTCTGGATCC CTGTCCAGCG GTGTGCACAC GTCCTGCAGT 551 CTGACCTCTA CACTCTGAGC AGCTCAGTGA CAGCACCTGG 601 CCCAGCGAGA CCGTCACCTG CAACGTTGCC GCAGCACCAA 651 GGTGGACAAG AAAATTGTGC CCAGGGATTG CCTTGCATAT 701 GTACAGTCCC AGAAGTATCA TCTGTCTTCA AAAGCCCAAG 751 GATGTGCTCA CCATTACTCT GACTCCTAAG TTGTGGTAGA 801 CATCAGCAAG GATGATCCCG AGGTCCAGTT GTAGATGATG 851 TGGAGGTGCA CACAGCTCAG ACGCAACCCC GTTCAACAGC 901 ACTTTCCGCT CAGTCAGTGA ACTTCCCATC ACTGGCTCAA 951 TGGCAAGGAG TTCAAATGCA GGGTCAACAG CCTGCCCCCA 1001 TCGAGAAAAC CATCTCCAAA ACCAAAGGCA TCCACAGGTG 1051 TACACCATTC CACCTCCCAA GGAGCAGATG AAGTCAGTCT 1101 GACCTGCATG ATAACAGACT TCTTCCCTGA GTGGAGTGGC 1151 AGTGGAATGG GCAGCCAGCG GAGAACTACA AGAACACTCA GCCCATCATG 1201 GACACAGATG GCTCTTACTT CGTCTACAGC AAGCTCAATG TGCAGAAGAG 1251 CAACTGGGAG GCAGGAAATA CTTTCACCTG CTCTGTGTTA CATGAGGGCC 1301 TGCACAACCA CCATACTGAG AAGAGCCTCT CCCACTCTCC TGGTAAATGA (SEQ ID n°.:36) A sequência de aminoácidos de Ab-B HC incluindo peptídeo sinal: 1 MGRLTSSFLL LIVPAYVLSQ VTLKESGPGI LQPSQTLSLT CSFSGFSLST 51 SGMGVGWIRH PSGKNLEWLA HIWWDDVKRY NPVLKSRLTI SKDTSNSQVF 101 LKIANVDTAD TATYYCARIE DFDYDEEYYA MDYWGQGTSV IVSSAKTTPP 151 SVYPLAPGSA AQTNSMVTLG CLVKGYFPEP VTVTWNSGSL SSGVHTFPAV 201 LQSDLYTLSS SVTVPSSTWP SETVTCNVAH PASSTKVDKK IVPRDCGCKP 251 CICTVPEVSS VFIFPPKPKD VLTITLTPKV TCVVVDISKD DPEVQFSWFV 301 DDVEVHTAQT QPREEQFNST FRSVSELPIM HQDWLNGKEF KCRVNSAAFP 351 APIEKTISKT KGRPKAPQVY TIPPPKEQMA KDKVSLTCMI TDFFPEDITV 401 EWQWNGQPAE NYKNTQPIMD TDGSYFVYSK LNVQKSNWEA GNTFTCSVLH 451 EGLHNHHTEK SLSHSPGK (SEQ ID n°.:37) A sequência de ácidos nucléicos de Ab-B HC incluindo codificação de peptídeo sinal: 1 ATGGGCAGGC TTACTTCTTC ATTCCTGCTA CTGCATATGT 51 ccTGTCccAG GTTACTCTGA AAGAGTCTGG TTGCAGCCCT 101 CCCAGACCCT CAGTCTGACT TGTTCTTTCT ACTGAGCACT 151 TCTGGTATGG GTGTAGGCTG GATTCGTCAC AGAATCTGGA 201 GTGGCTGGCA CACATTTGGT GGGATGATGT AACCCAGTCC 251 TGAAGAGCCG ACTGACTATC TCCAAGGATA CCAGGTATTC 301 CTCAAGATCG CCAATGTGGA CACTGCAGAT ACTACTGTGC 351 TCGAATAGAG GACTTTGATT ACGACGAGGA ATGGACTACT 401 GGGGTCAAGG AACCTCAGTC ATCGTCTCCT GACACCCCCA 451 TCTGTCTATC CACTGGCCCC TGGATCTGCT ACTCCATGGT 501 GACCCTGGGA TGCCTGGTCA AGGGCTATTT GTGACAGTGA 551 CCTGGAACTC TGGATCCCTG TCCAGCGGTG CCCAGCTGTC 601 CTGCAGTCTG ACCTCTACAC TCTGAGCAGC TCAGTGACTG TCCCCTCCAG 651 CACCTGGCCC AGCGAGACCG TCACCTGCAA CGTTGCCCAC CCGGCCAGCA 701 GCACCAAGGT GGACAAGAAA ATTGTGCCCA GGGATTGTGG TTGTAAGCCT 751 TGCATATGTA CAGTCCCAGA AGTATCATCT GTCTTCATCT TCCCCCCAAA 801 GCCCAAGGAT GTGCTCACCA TTACTCTGAC TCCTAAGGTC ACGTGTGTTG 851 TGGTAGACAT CAGCAAGGAT GATCCCGAGG TCCAGTTCAG CTGGTTTGTA 901 GATGATGTGG AGGTGCACAC AGCTCAGACG CAACCCCGGG AGGAGCAGTT 951 CAACAGCACT TTCCGCTCAG TCAGTGAACT TCCCATCATG CACCAGGACT 1001 GGCTCAATGG CAAGGAGTTC AAATGCAGGG TCAACAGTGC AGCTTTCCCT 1051 GCCCCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAACC AAAGGCAGAC CGAAGGCTCC 1101 ACAGGTGTAC ACCATTCCAC CTCCCAAGGA GCAGATGGCC AAGGATAAAG 1151 TCAGTCTGAC CTGCATGATA ACAGACTTCT TCCCTGAAGA CATTACTGTG 1201 GAGTGGCAGT GGAATGGGCA GCCAGCGGAG AACTACAAGA ACACTCAGCC 1251 CATCATGGAC ACAGATGGCT CTTACTTCGT CTACAGCAAG CTCAATGTGC 1301 AGAAGAGCAA CTGGGAGGCA GGAAATACTT TCACCTGCTC TGTGTTACAT 1351 GAGGGCCTGC ACAACCACCA TACTGAGAAG AGCCTCTCCC ACTCTCCTGG 1401 TAAATGA (SEQ ID n°.:38) As sequências CDR (região determinante de complementaridade) na região variável da cadeia pesada de Ab-B são como segue: CDR-H1 : TSGMGVG (SEQ ID n°.:57) CDR-H2: fflWWDDVKRYNPVLKS (SEQ ID n°.:58) CDR-H3 : EDFDYDEEYYAMDY (SEQ ID n°.:59) As sequências de região CDR cadeia leve variável de Ab-B são: CDR-L1: SASSSVSFVD (SEQ ID n°.: 60) CDR-L2: RTSNLGF (SEQ ID n°.: 61) CDR-L3: QQRSTYPPT (SEQ ID n°.: 62) Os anticorpos divulgados aqui se ligam a regiões de esclerostina humana que são importantes para in vivo na atividade da proteína. A ligação de um anticorpo para esclerostina podem ser correlacionados com aumentos de, por exemplo, a densidade mineral óssea alcançada pelo uso do anticorpo in vivo, como descrito em Exemplos 5 e 9 (ratos) e Exemplo 12 (macaco). Aumenta em pelo menos um dos formação óssea, conteúdo mineral ósseo, massa óssea, qualidade óssea e força óssea também pode ser obtida por utilização do anticorpo in vivo, como descrito em Exemplos 5 e 9 (ratos) e Exemplo 12 (macaco). Desde a ligação de um anticorpo para esclerostina é principalmente determinada pelos seus CDR sequências, um anticorpo para praticar a invenção pode ser gerada com todas ou algumas das sequências CDR divulgada em um enquadramento adequado, onde o anticorpo retém a capacidade de se ligam especificamente a esclerostina, E pode-se esperar para conseguir aumentos de, por exemplo, a densidade mineral óssea. Esses anticorpos são úteis no tratamento de seres humanos ou animais são causadas por condições que, associado com, ou resultar em pelo menos uma de baixa formação óssea, baixa densidade mineral óssea, baixo conteúdo mineral ósseo, baixa massa óssea, baixa qualidade óssea e baixa força óssea. Os métodos de construção e expressão de anticorpos e fragmentos dos mesmos compreendendo CDR's da presente invenção são bem conhecidos pelos técnicos versados na técnica. A presente invenção se refere, portanto, em uma modalidade de um anticorpo isolados, inclusive Ab-A, ou um fragmento antígeno ligação, que se liga especificamente à esclerostina e onde a variável domínio da cadeia pesada compreende pelo menos uma CDR com como sequências dadas em SEQ ID n°.: 51 de CDR-H1, SEQ ID n°: 52 de CDR-H2 e SEQ ID n°: 53 de CDR-H3. O anticorpo ou antigênio ligação fragmento dela podem incluir uma cadeia pesada variável domínio no qual os CDRs constituídas, em pelo menos um dos peptídeos de SEQ ID n°.: 51 de CDR-H1, SEQ ID n°.: 52 de CDR-H2 e SEQ ID n°.: 53 de CDR-H3. Quando nos anticorpos da invenção uma cadeia leve está presente a cadeia leve pode ser qualquer cadeia complementares adequados e podem, em particular, ser selecionados a partir de uma cadeia leve onde a variável domínio inclui pelo menos uma CDR com como sequências dadas em SEQ ID n°.: 54 de CDR-L1, SEQ ID n°.: 55 de CDR-L2 e SEQ ID n°.: 56 de CDR-L3. O anticorpo ou antigênio ligação desse fragmento pode incluir um domínio variável de cadeia leve no qual os CDRs constituídas, em pelo menos um dos peptídeos de SEQ ID n°.: 54 de CDR-L1, SEQ ID n°.: 55 de CDR-L2 e SEQ ID n°.: 56 de CDR-L3. A presente invenção ainda se refere a um anticorpo isolados, inclusive Ab-B, ou um fragmento antígeno ligação ora, que se liga especificamente à esclerostina e onde a variável domínio da cadeia pesada compreende pelo menos uma CDR com como sequências dadas em SEQ ID n°.: 57 de CDR-H1, SEQ ID n°.: 58 Para CDR-H2 e SEQ ID n°: 59 de CDR-H3. O anticorpo ou antigênio ligação fragmento dela podem incluir uma cadeia pesada variável domínio no qual os CDRs constituídas, em pelo menos um dos peptídeos de SEQ ID n°.: 57 de CDR-H1, SEQ ID n°.: 58 de CDR-H2 e SEQ ID n°.: 59 de CDR-H3. Quando nos anticorpos da invenção uma cadeia leve está presente a cadeia leve pode ser qualquer cadeia complementares adequados e podem, em particular, ser selecionados a partir de uma cadeia leve onde a variável domínio inclui pelo menos uma CDR com como sequências dadas em SEQ ID n°.: 60 de CDR-L1, SEQ ID n°.: 61 de CDR-L2 e SEQ ID n°.: 62 de CDR-L3. O anticorpo ou antigênio de ligação desse fragmento pode incluir um domínio variável de cadeia leve no qual as CDRs constituídas, em pelo menos um dos peptídeos de SEQ ID n°.: 60 de CDR-L1, SEQ ID n°.: 61 de CDR-L2 e SEQ ID n°.: 62 de CDR-L3. A presente invenção ainda se refere a um anticorpo isolados, inclusive Ab-C, ou um fragmento antígeno ligação ora, que se liga especificamente à esclerostina e onde a variável domínio da cadeia pesada compreende pelo menos uma CDR com como sequências dadas em SEQ ID n°.: 45 de CDR-H1, SEQ ID n°.: 46 de CDR-H2 e SEQ ID n°.: 47 de CDR-H3. O anticorpo ou antigênio ligação fragmento dela podem incluir uma cadeia pesada variável domínio no qual os CDRs constituídas, em pelo menos um dos peptídeos de SEQ ID n°.: 45 de CDR-H1, SEQ ID n°.: 46 de CDR-H2 e SEQ ID n°.: 47 de CDR-H3. Quando nos anticorpos da invenção uma cadeia leve está presente a cadeia leve pode ser qualquer cadeia complementares adequados e podem, em particular, ser selecionados a partir de uma cadeia leve onde a variável domínio inclui pelo menos uma CDR com como sequências dadas em SEQ ID n°.: 48 de CDR-L1, SEQ ID n°.: 49 de CDR-L2 e SEQ ID n°.: 50 de CDR-L3. O anticorpo ou antigênio ligação desse fragmento pode incluir um domínio variável de cadeia leve no qual os CDRs constituídas, em pelo menos um dos peptídeos de SEQ ID n°.: 48 de CDR-L1, SEQ ID n°.: 49 de CDR-L2 e SEQ ID n°.: 50 de CDR-L3. A presente invenção também se refere a um único anticorpo, incluindo Ab-D, ou um fragmento antígeno ligação ora, que se liga especificamente à esclerostina e onde a variável domínio da cadeia pesada compreende pelo menos uma CDR com como sequências dadas em SEQ ID n°.: 39 para CDR-H1, SEQ ID n°.: 40 de CDR-H2 e SEQ ID n°.: 41 de CDR-H3. O anticorpo ou antigênio ligação fragmento dela podem incluir uma cadeia pesada variável domínio no qual os CDRs constituídas, em pelo menos um dos peptídeos de SEQ ID n°.: 39 de CDR-H1, SEQ ID n°.: 40 de CDR-H2 e SEQ ID n°.: 41 de CDR-H3. Quando nos anticorpos da invenção uma cadeia leve está presente a cadeia leve pode ser qualquer cadeia complementares adequados e podem, em particular, ser selecionados a partir de uma cadeia leve onde a variável domínio inclui pelo menos uma CDR com como sequências dadas em SEQ ID n°.: 42 de CDR-L1, SEQ ID n°.: 43 de CDR-L2 e SEQ ID n°.: 44 de CDR-L3. O anticorpo ou antigênio de ligação desse fragmento pode incluir um domínio variável de cadeia leve no qual os CDRs constituídas, em pelo menos um dos peptídeos de SEQ ID n°.: 42 de CDR-L1, SEQ ID n°.: 43 de CDR-L2 e SEQ ID n°.: 44 de CDR-L3. Anticorpos anti-esclerostina adicionais são descritas a seguir. Para alguns dos aminoácidos sequências a complementaridade-determinação regiões (CDRs) são embalados-sombreadas e o constante regiões estão em negrito, itálico. Ab-2 As sequências do Anticorpo 2 (também designada por Ab-2) LC e HC são como seguintes: Ab-2 Cadeia leve: Aminoácido sequência de forma madura (peptídeo sinal removida) do Ab-2 LC: 1 QIVLSQSPAI LSTSPGEKVT MTCRASSSVY YMHWYQQKPG SSPKPWIYAT 51 SNLASGVPVR FSGSGSGTSY SLTITRVEAE DAATYYCQQW SSDPLTFGAG 101 TKLELKRADA APTVSIFPPS SEQLTSGGAS VVCFLNNFYP KDINVKWKID 151 GSERQNGVLN SWTDQDSKDS TYSMSSTLTL TKDEYERHNS YTCEATHKTS 201 TSPIVKSFNR NEC (ID NO seguintes: 117) Sequência de codificação de ácidos nucléicos de forma madura (peptídeo sinal removida) do Ab-2 LC: 1 CAAATTGTTC TCTCCCAGTC TCCAGCAATC CTGTCTACAT CTCCAGGGGA 51 GAAGGTCACA ATGACTTGCA GGGCCAGCTC AAGTGTATAT TACATGCACT 101 GGTACCAGCA GAAGCCAGGA TCCTCCCCCA AACCCTGGAT TTATGCCACA 151 TCCAACCTGG CTTCTGGAGT CCCTGTTCGC TTCAGTGGCA GTGGGTCTGG 201 GACCTCTTAC TCTCTCACAA TCACCAGAGT GGAGGCTGAA GATGCTGCCA 251 CTTATTACTG CCAGCAGTGG AGTAGTGACC CACTCACGTT CGGTGCTGGG 301 ACCAAGCTGG AGCTGAAACG GGCTGATGCT GCACCAACTG TATCCATCTT 351 CCCACCATCC AGTGAGCAGT TAACATCTGG AGGTGCCTCA GTCGTGTGCT 401 TCTTGAACAA CTTCTACCCC AAAGACATCA ATGTCAAGTG GAAGATTGAT 451 GGCAGTGAAC GACAAAATGG CGTCCTGAAC AGTTGGACTG ATCAGGACAG 501 CAAAGACAGC ACCTACAGCA TGAGCAGCAC CCTCACGTTG ACCAAGGACG 551 AGTATGAACG ACATAACAGC TATACCTGTG AGGCCACTCA CAAGACATCA 601 ACTTCACCCA TTGTCAAGAG CTTCAACAGG AATGAGTGTT AG (SEQ ID n°.: 118) Sequência de aminoácidos de Ab-2 LC incluindo peptídeo sinal: 1 MDFQVQIFSF LLISASVIMS RGQIVLSQSP AILSTSPGEK VTMTCRASSS 51 VYYMHWYQQK PGSSPKPWIY ATSNLASGVP VRFSGSGSGT SYSLTITRVE 101 AEDAATYYCQ QWSSDPLTFG AGTKLELKRA DAAPTVSIFP PSSEQLTSGG 151 ASVVCFLNNF YPKDINVKWK IDGSERQNGV LNSWTDQDSK DSTYSMSSTL 201 TLTKDEYERH NSYTCEATHK TSTSPIVKSF NRNEC (SEQ ID n°.: 119) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-2 LC incluindo a sequência de codificação de peptídeo sinal: 1 ATGGATTTTC AAGTGCAGAT TTTCAGCTTC CTGCTAATCA GTGCTTCAGT 51 CATTATGTCC AGGGGACAAA TTGTTCTCTC CCAGTCTCCA GCAATCCTGT 101 CTACATCTCC AGGGGAGAAG GTCACAATGA CTTGCAGGGC CAGCTCAAGT 151 GTATATTACA TGCACTGGTA CCAGCAGAAG CCAGGATCCT CCCCCAAACC 201 CTGGATTTAT GCCACATCCA ACCTGGCTTC TGGAGTCCCT GTTCGCTTCA 251 GTGGCAGTGG GTCTGGGACC TCTTACTCTC TCACAATCAC CAGAGTGGAG 301 GCTGAAGATG CTGCCACTTA TTACTGCCAG CAGTGGAGTA GTGACCCACT 351 CACGTTCGGT GCTGGGACCA AGCTGGAGCT GAAACGGGCT GATGCTGCAC 401 CAACTGTATC CATCTTCCCA CCATCCAGTG AGCAGTTAAC ATCTGGAGGT 451 GCCTCAGTCG TGTGCTTCTT GAACAACTTC TACCCCAAAG ACATCAATGT 501 CAAGTGGAAG ATTGATGGCA GTGAACGACA AAATGGCGTC CTGAACAGTT 551 GGACTGATCA GGACAGCAAA GACAGCACCT ACAGCATGAG CAGCACCCTC 601 ACGTTGACCA AGGACGAGTA TGAACGACAT AACAGCTATA CCTGTGAGGC 651 CACTCACAAGACATCAACTT CACCCATTGT CAAGAGCTTC AACAGGAATG 701 AGTGTTAG (SEQ ID n°.: 120) Ab-2 Cadeia pesada Sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab- 2 HC: 1 EVQVQQSGPE LVKPGASVKL SCTASGFNIK DYFIHWVKQR PEQGLEWIGR 51 LDPEDGESDY APKFQDKAIM TADTSSNTAY LQLRSLTSED TAIYYCERED 101 YDGTYTFFPY WGQGTLVTVS AAKTTPPSVY PLAPGSAAQT NSMVTLGCLV 151 KGYFPEPVTV TWNSGSLSSG VHTFPAVLQS DLYTLSSSVT VPSSTWPSET 201 VTCNVAHPAS STKVDKKIVP RDCGCKPCIC TVPEVSSVFI FPPKPKDVLT 251 ITLTPKVTCV VVDISKDDPE VQFSWFVDDV EVHTAQTQPR EEQFNSTFRS 301 VSELPIMHQD WLNGKEFKCR VNSAAFPAPI EKTISKTKGR PKAPQVYTIP 351 PPKEQMAKDK VSLTCMITDF FPEDITVEWQ WNGQPAENYK NTQPIMDTDG 401 SYFIYSKLNV QKSNWEAGNT FTCSVLHEGL HNHHTEKSLS HSPGK (SEQ ID n°.:121) Sequência de ácidos nucléicos codificando a forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-2 HC: 1 GAGGTTCAGG TGCAGCAGTC TGGGCCAGAA CTTGTGAAGC CAGGGGCCTC 51 AGTCAAGTTG TCCTGCACAG CTTCTGGCTT CAACATTAAA GACTACTTTA 101 TACACTGGGT GAAGCAGAGG CCTGAACAGG GCCTGGAGTG GATTGGAAGG 151 CTTGATCCTG AGGATGGTGA AAGTGATTAT GCCCCGAAGT TCCAGGACAA 201 GGCCATTATG ACAGCAGACA CATCATCCAA CACAGCCTAT CTTCAGCTCA 251 GAAGCCTGAC ATCTGAGGAC ACTGCCATCT ATTATTGTGA GAGAGAGGAC 301 TACGATGGTA CCTACACCTT TTTTCCTTAC GGACTCTGGT 351 CACTGTCTCT GCAGCCAAAA CGACACCCCC CCACTGGCCC 401 CTGGATCTGC TGCCCAAACT AACTCCATGG ATGCCTGGTC 451 AAGGGCTATT TCCCTGAGCC AGTGACAGTG CTGGATCCCT 501 GTCCAGCGGT GTGCACACCT TCCCAGCTGT GACCTCTACA 551 CTCTGAGCAG CTCAGTGACT GTCCCCTCCA CAGCGAGACC 601 GTCACCTGCA ACGTTGCCCA CCCGGCCAGC TGGACAAGAA 651 AATTGTGCCC AGGGATTGTG GTTGTAAGCC ACAGTCCCAG 701 AAGTATCATC TGTCTTCATC TTCCCCCCAA TGTGCTCACC 751 ATTACTCTGA CTCCTAAGGT CACGTGTGTT TCAGCAAGGA 801 TGATCCCGAG GTCCAGTTCA GCTGGTTTGT GAGGTGCACA 851 CAGCTCAGAC GCAACCCCGG GAGGAGCAGT TTTCCGCTCA 901 GTCAGTGAAC TTCCCATCAT GCACCAGGAC GCAAGGAGTT 951 CAAATGCAGG GTCAACAGTG CAGCTTTCCC TGCCCCCATC GAGAAAACCA 1001 TCTCCAAAAC CAAAGGCAGA CCGAAGGCTC CACAGGTGTA CACCATTCCA 1051 CCTCCCAAGG AGCAGATGGC CAAGGATAAA GTCAGTCTGA CCTGCATGAT 1101 AACAGACTTC TTCCCTGAAG ACATTACTGT GGAGTGGCAG TGGAATGGGC 1151 AGCCAGCGGA GAACTACAAG AACACTCAGC CCATCATGGA CACAGATGGC 1201 TCTTACTTCA TCTACAGCAA GCTCAATGTG CAGAAGAGCA ACTGGGAGGC 1251 AGGAAATACT TTCACCTGCT CTGTGTTACA TGAGGGCCTG CACAACCACC 1301 ATACTGAGAA GAGCCTCTCC CACTCTCCTG GTAAATGA (SEQ ID n°.: 122) Sequência de aminoácidos de Ab-2 HC incluindo peptídeo sinal: 1 MKCSWVIFFL MAVVTGVNSE VQVQQSGPEL VKPGASVKLS CTASGFNIKD 51 YFIHWVKQRP EQGLEWIGRL DPEDGESDYA PKFQDKAIMT ADTSSNTAYL 101 QLRSLTSEDT AIYYCEREDY DGTYTFFPYW GQGTLVTVSA AKTTPPSVYP 151 LAPGSAAQTN SMVTLGCLVK GYFPEPVTVT WNSGSLSSGV HTFPAVLQSD 201 LYTLSSSVTV PSSTWPSETV TCNVAHPASS TKVDKKIVPR DCGCKPCICT 251 VPEVSSVFIF PPKPKDVLTI TLTPKVTCVV VDISKDDPEV QFSWFVDDVE 301 VHTAQTQPRE EQFNSTFRSV SELPIMHQDW LNGKEFKCRV NSAAFPAPIE 351 KTISKTKGRP KAPQVYTIPP PKEQMAKDKV SLTCMITDFF PEDITVEWQW 401 NGQPAENYKN TQPIMDTDGS YFIYSKLNVQ KSNWEAGNTF TCSVLHEGLH 451 NHHTEKSLSH SPGK (SEQ ID n°.: 123) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-2 HC incluindo a sequência de codificação de peptídeo sinal: 1 ATGAAATGCA GCTGGGTCAT CTTCTTCCTG ATGGCAGTGG TTACAGGGGT 51 CAATTCAGAG GTTCAGGTGC AGCAGTCTGG GCCAGAACTT GTGAAGCCAG 101 GGGCCTCAGT CAAGTTGTCC TGCACAGCTT CTGGCTTCAA CATTAAAGAC 151 TACTTTATAC ACTGGGTGAA GCAGAGGCCT GAACAGGGCC TGGAGTGGAT 201 TGGAAGGCTT GATCCTGAGG ATGGTGAAAG TGATTATGCC CCGAAGTTCC 251 AGGACAAGGC CATTATGACA GCAGACACAT CATCCAACAC AGCCTATCTT 301 CAGCTCAGAA GCCTGACATC TGAGGACACT GCCATCTATT ATTGTGAGAG 351 AGAGGACTAC GATGGTACCT ACACCTTTTT TCCTTACTGG GGCCAAGGGA 401 CTCTGGTCAC TGTCTCTGCA GCCAAAACGA TGTCTATCCA 451 CTGGCCCCTG GATCTGCTGC CCAAACTAAC CCCTGGGATG 501 CCTGGTCAAG GGCTATTTCC CTGAGCCAGT TGGAACTCTG 551 GATCCCTGTC CAGCGGTGTG CACACCTTCC GCAGTCTGAC 601 CTCTACACTC TGAGCAGCTC AGTGACTGTC CCTGGCCCAG 651 CGAGACCGTC ACCTGCAACG TTGCCCACCC ACCAAGGTGG 701 ACAAGAAAAT TGTGCCCAGG GATTGTGGTT CATATGTACA 751 GTCCCAGAAG TATCATCTGT CTTCATCTTC CCAAGGATGT 801 GCTCACCATT ACTCTGACTC CTAAGGTCAC GTAGACATCA 851 GCAAGGATGA TCCCGAGGTC CAGTTCAGCT TGATGTGGAG 901 GTGCACACAG CTCAGACGCA ACCCCGGGAG ACAGCACTTT 951 CCGCTCAGTC AGTGAACTTC CCATCATGCA CTCAATGGCA 1001 AGGAGTTCAA ATGCAGGGTC AACAGTGCAG CCCCATCGAG 1051 AAAACCATCT CCAAAACCAA AGGCAGACCG AGGTGTACAC 1101 CATTCCACCT CCCAAGGAGC AGATGGCCAA GGATAAAGTC AGTCTGACCT 1151 GCATGATAAC AGACTTCTTC CCTGAAGACA TTACTGTGGA GTGGCAGTGG 1201 AATGGGCAGC CAGCGGAGAA CTACAAGAAC ACTCAGCCCA TCATGGACAC 1251 AGATGGCTCT TACTTCATCT ACAGCAAGCT CAATGTGCAG AAGAGCAACT 1301 GGGAGGCAGG AAATACTTTC ACCTGCTCTG TGTTACATGA GGGCCTGCAC 1351 AACCACCATA CTGAGAAGAG CCTCTCCCAC TCTCCTGGTA AATGA (SEQ ID n°.: 124) Ab-3 As sequências da Anticorpo 3 (também referido aqui como Ab-3) LC e HC são como segue: Ab-3 Cadeia leve Sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-3 LC: 1 EIVLTQSPAL MAASPGEKVT ITCSVSSTIS SNHLHWFQQK SDTSPKPWIY 51 GTSNLASGVP VRFSGSGSGT SYSLTISSME AEDAATYYCQ QWSSYPLTFG 101 AGTKLELRRA DAAPTVSIFP PSSEQLTSGG ASVVCFLNNF YPKDINVKWK 151 IDGSERQNGV LNSWTDQDSK DSTYSMSSTL TLTKDEYERH NSYTCEATHK 201 TSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID n°.: 125) Sequência de ácidos nucléicos codificando a forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-3 LC: 1 GAAATTGTGC TCACCCAGTC TCCAGCACTC ATGGCTGCAT CTCCGGGGGA 51 GAAGGTCACC ATCACCTGCA GTGTCAGTTC AACTATAAGT TCCAACCACT 101 TGCACTGGTT CCAGCAGAAG TCAGACACCT CCCCCAAACC CTGGATTTAT 151 GGCACATCCA ACCTGGCTTC TGGAGTCCCT GTTCGCTTCA GTGGCAGTGG 201 ATCTGGGACC TCTTATTCTC TCACAATCAG CAGCATGGAG GCTGAGGATG 251 CTGCCACTTA TTACTGTCAA CAGTGGAGTA GTTACCCACT CACGTTCGGC 301 GCTGGGACCA AGCTGGAGCT GAGACGGGCT GATGCTGCAC CAACTGTATC 351 CATCTTCCCA CCATCCAGTG AGCAGTTAAC ATCTGGAGGT GCCTCAGTCG 401 TGTGCTTCTT GAACAACTTC TACCCCAAAG ACATCAATGT CAAGTGGAAG 451 ATTGATGGCA GTGAACGACA AAATGGCGTC CTGAACAGTT GGACTGATCA 501 GGACAGCAAA GACAGCACCT ACAGCATGAG CAGCACCCTC ACGTTGACCA 551 AGGACGAGTA TGAACGACAT AACAGCTATA CCTGTGAGGC CACTCACAAG 601 ACATCAACTT CACCCATTGT CAAGAGCTTC AACAGGAATG AGTGTTAG (SEQ ID n°.: 126) Sequência de aminoácidos de Ab-3 LC incluindo peptídeo sinal: 1 MDFHVGIFSF MLISVTVILS SGEIVLTQSP ALMAASPGEK VTITCSVSST 51 ISSNHLHWFQ QKSDTSPKPW IYGTSNLASG VPVRFSGSGS GTSYSLTISS 101 MEAEDAATYY CQQWSSYPLT FGAGTKLELR RADAAPTVSI FPPSSEQLTS 151 GGASVVCFLN NFYPKDINVK WKIDGSERQN GVLNSWTDQD SKDSTYSMSS 201 TLTLTKDEYE RHNSYTCEAT HKTSTSPIVK SFNRNEC (SEQ ID n°.: 127) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-3 LC incluindo a sequência de codificação de peptídeo sinal: 1 ATGGATTTTC ATGTGCAGAT TTTCAGCTTC ATGCTAATCA GTGTCACAGT 51 CATTTTGTCC AGTGGAGAAA TTGTGCTCAC CCAGTCTCCA GCACTCATGG 101 CTGCATCTCC GGGGGAGAAG GTCACCATCA CCTGCAGTGT CAGTTCAACT 151 ATAAGTTCCA ACCACTTGCA CTGGTTCCAG CAGAAGTCAG ACACCTCCCC 201 CAAACCCTGG ATTTATGGCA CATCCAACCT GGCTTCTGGA GTCCCTGTTC 251 GCTTCAGTGG CAGTGGATCT GGGACCTCTT ATTCTCTCAC AATCAGCAGC 301 ATGGAGGCTG AGGATGCTGC CACTTATTAC TGTCAACAGT GGAGTAGTTA 351 CCCACTCACG TTCGGCGCTG GGACCAAGCT GGAGCTGAGA CGGGCTGATG 401 CTGCACCAAC TGTATCCATC TTCCCACCAT CCAGTGAGCA GTTAACATCT 451 GGAGGTGCCT CAGTCGTGTG CTTCTTGAAC AACTTCTACC CCAAAGACAT 501 CAATGTCAAG TGGAAGATTG ATGGCAGTGA ACGACAAAAT GGCGTCCTGA 551 ACAGTTGGAC TGATCAGGAC AGCAAAGACA GCACCTACAG CATGAGCAGC 601 ACCCTCACGT TGACCAAGGA CGAGTATGAA CGACATAACA GCTATACCTG 651 TGAGGCCACT CACAAGACAT CAACTTCACC CATTGTCAAG AGCTTCAACA 701 GGAATGAGTG TTAG (SEQ ID n°.: 128) Ab-3 Cadeia pesada Sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-3 HC: 1 EVQLQQSGAE LVRPGALVKL SCTASDFNIK DFYLHWMRQR PEQGLDWIGR 51 IDPENGDTLY DPKFQDKATL TTDTSSNTAY LQLSGLTSET TAVYYCSREA 101 DYFHDGTSYW YFDVWGAGTT ITVSSAKTTP PSVYPLAPGS AAQTNSMVTL 151 GCLVKGYFPE PVTVTWNSGS LSSGVHTFPA VLQSDLYTLS SSVTVPSSTW 201 PSETVTCNVA HPASSTKVDK KIVPRDCGCK PCICTVPEVS SVFIFPPKPK 251 DVLTITLTPK VTCVWDISKD DPEVQFSVVF VDDVEVHTAQ TQPREEQFNS 301 TFRSVSELPI MHQDWLNGKE FKCRVNSAAF PAPIEKTISK TKGRPKAPQV 351 YTIPPPKEQM AKDKVSLTCM ITDFFPEDIT VEWQWNGQPA ENYKNTQPIM 401 DTDGSYFIYS KLNVQKSNWE AGNTFTCSVL HEGLHNHHTE KSLSHSPGK (SEQ ID NO: 129) Sequência de ácidos nucléicos codificando a forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-3 HC: 1 GAGGTTCAGC TGCAGCAGTC TGGGGCTGAA CTTGTGAGGC CAGGGGCCTT 51 AGTCAAGTTG TCCTGCACAG CTTCTGACTT CAACATTAAA GACTTCTATC 101 TACACTGGAT GAGGCAGCGG CCTGAACAGG GCCTGGACTG GATTGGAAGG 151 ATTGATCCTG AGAATGGTGA TACTTTATAT GACCCGAAGT TCCAGGACAA 201 GGCCACTCTT ACAACAGACA CATCCTCCAA CACAGCCTAC CTGCAGCTCA 251 GCGGCCTGAC ATCTGAGACC ACTGCCGTCT ATTACTGTTC TAGAGAGGCG 301 GATTATTTCC ACGATGGTAC CTCCTACTGG TACTTCGATG TCTGGGGCGC 351 AGGGACCACA ATCACCGTCT CCTCAGCCAA AACGACACCC CCATCTGTCT 401 ATCCACTGGC CCCTGGATCT GCTGCCCAAA GGTGACCCTG 451 GGATGCCTGG TCAAGGGCTA TTTCCCTGAG TGACCTGGAA 501 CTCTGGATCC CTGTCCAGCG GTGTGCACAC GTCCTGCAGT 551 CTGACCTCTA CACTCTGAGC AGCTCAGTGA CAGCACCTGG 601 CCCAGCGAGA CCGTCACCTG CAACGTTGCC GCAGCACCAA 651 GGTGGACAAG AAAATTGTGC CCAGGGATTG CCTTGCATAT 701 GTACAGTCCC AGAAGTATCA TCTGTCTTCA AAAGCCCAAG 751 GATGTGCTCA CCATTACTCT GACTCCTAAG TTGTGGTAGA 801 CATCAGCAAG GATGATCCCG AGGTCCAGTT GTAGATGATG 851 TGGAGGTGCA CACAGCTCAG ACGCAACCCC GTTCAACAGC 901 ACTTTCCGCT CAGTCAGTGA ACTTCCCATC ACTGGCTCAA 951 TGGCAAGGAG TTCAAATGCA GGGTCAACAG CCTGCCCCCA 1001 TCGAGAAAAC CATCTCCAAA ACCAAAGGCA TCCACAGGTG 1051 TACACCATTC CACCTCCCAA GGAGCAGATG AAGTCAGTCT 1101 GACCTGCATG ATAACAGACT TCTTCCCTGA AGACATTACT GTGGAGTGGC 1151 AGTGGAATGG GCAGCCAGCG GAGAACTACA AGAACACTCA GCCCATCATG 1201 GACACAGATG GCTCTTACTT CATCTACAGC AAGCTCAATG TGCAGAAGAG 1251 CAACTGGGAG GCAGGAAATA CTTTCACCTG CTCTGTGTTA CATGAGGGCC 1301 TGCACAACCA CCATACTGAG AAGAGCCTCT CCCACTCTCC TGGTAAATGA (SEQ ID n°.: 130) Sequência de aminoácidos de Ab-3 HC incluindo peptídeo sinal: 1 MKCSWVIFFL MAVVTGVNSE VQLQQSGAEL CTASDFNIKD 51 FYLHWMRQRP EQGLDWIGRI DPENGDTLYD TDTSSNTAYL 101 QLSGLTSETT AVYYCSREAD YFHDGTSYWY TVSSAKTTPP 151 SVYPLAPGSA AQTNSMVTLG CLVKGYFPEP VTVTWNSGSL SSGVHTFPAV 201 LQSDLYTLSS SVTVPSSTWP SETVTCNVAH PASSTKVDKK IVPRDCGCKP 251 CICTVPEVSS VFIFPPKPKD VLTITLTPKV TCVVVDISKD DPEVQFSWFV 301 DDVEVHTAQT QPREEQFNST FRSVSELPIM HQDWLNGKEF KCRVNSAAFP 351 APIEKTISKT KGRPKAPQVY TIPPPKEQMA KDKVSLTCMI TDFFPEDITV 401 EWQWNGQPAE NYKNTQPIMD TDGSYFIYSK LNVQKSNWEA GNTFTCSVLH 451 EGLHNHHTEK SLSHSPGK (SEQ ID n°.: 131) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-3 HC incluindo a sequência de codificação de peptídeo sinal: 1 ATGAAATGCA GCTGGGTCAT CTTCTTCCTG ATGGCAGTGG TTACAGGGGT 51 CAATTCAGAG GTTCAGCTGC AGCAGTCTGG GGCTGAACTT GTGAGGCCAG 101 GGGCCTTAGT CAAGTTGTCC TGCACAGCTT CTGACTTCAA CATTAAAGAC 151 TTCTATCTAC ACTGGATGAG GCAGCGGCCT GAACAGGGCC TGGACTGGAT 201 TGGAAGGATT GATCCTGAGA ATGGTGATAC TTTATATGAC CCGAAGTTCC 251 AGGACAAGGC CACTCTTACA ACAGACACAT CCTCCAACAC AGCCTACCTG 301 CAGCTCAGCG GCCTGACATC TGAGACCACT GCCGTCTATT ACTGTTCTAG 351 AGAGGCGGAT TATTTCCACG ATGGTACCTC CTACTGGTAC TTCGATGTCT 401 GGGGCGCAGG GACCACAATC ACCGTCTCCT CAGCCAAAAC GACACCCCCA 451 TCTGTCTATC CACTGGCCCC TGGATCTGCT GCCCAAACTA ACTCCATGGT 501 GACCCTGGGA TGCCTGGTCA AGGGCTATTT CCCTGAGCCA GTGACAGTGA 551 CCTGGAACTC TGGATCCCTG TCCAGCGGTG TGCACACCTT CCCAGCTGTC 601 CTGCAGTCTG ACCTCTACAC TCTGAGCAGC TCAGTGACTG TCCCCTCCAG 651 CACCTGGCCC AGCGAGACCG TCACCTGCAA CGTTGCCCAC CCGGCCAGCA 701 GCACCAAGGT GGACAAGAAA ATTGTGCCCA GGGATTGTGG TTGTAAGCCT 751 TGCATATGTA CAGTCCCAGA AGTATCATCT GTCTTCATCT TCCCCCCAAA 801 GCCCAAGGAT GTGCTCACCA TTACTCTGAC TCCTAAGGTC ACGTGTGTTG 851 TGGTAGACAT CAGCAAGGAT GATCCCGAGG TCCAGTTCAG CTGGTTTGTA 901 GATGATGTGG AGGTGCACAC AGCTCAGACG CAACCCCGGG AGGAGCAGTT 951 CAACAGCACT TTCCGCTCAG TCAGTGAACT TCCCATCATG CACCAGGACT 1001 GGCTCAATGG TAAGGAGTTC AAATGCAGGG TCAACAGTGC AGCTTTCCCT 1051 GCCCCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAACC AAAGGCAGAC CGAAGGCTCC 1101 ACAGGTGTAC ACCATTCCAC CTCCCAAGGA GCAGATGGCC AAGGATAAAG 1151 TCAGTCTGAC CTGCATGATA ACAGACTTCT TCCCTGAAGA CATTACTGTG 1201 GAGTGGCAGT GGAATGGGCA GCCAGCGGAG AACTACAAGA ACACTCAGCC 1251 CATCATGGAC ACAGATGGCT CTTACTTCAT CTACAGCAAG CTCAATGTGC 1301 AGAAGAGCAA CTGGGAGGCA GGAAATACTT TCACCTGCTC TGTGTTACAT 1351 GAGGGCCTGC ACAACCACCA TACTGAGAAG AGCCTCTCCC ACTCTCCTGG 1401 TAAATGA (SEQ ID n°.: 132) Ab-4 As sequências da Anticorpo 4 (também referido aqui como Ab-4) LC e HC são como segue: Ab-4 Cadeia leve: Sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab- 4 LC: 1 DIQMTQITSS LSASLGDRVS ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTFKLLIFY 51 TSRLLSGVPS RFSGSGSGTD YSLTIYNLEQ EDFATYFCQQ GDTLPYTFGG 101 GTKLEIKRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA SVVCFLNNFY PKDINVKWKI 151 DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT LTKDEYERHN SYTCEATHKT 201 STSPIVKSFNRNEC (SEQ ID n°.: 133) Sequência de ácidos nucléicos codificando a forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-4 LC: 1 GATATCCAGA TGACACAGAT TACATCCTCC CTGTCTGCCT CTCTGGGAGA 51 CAGGGTCTCC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA AGACATTAGC AATTATTTAA 101 ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT TATCTTCTAC 151 ACATCAAGAT TACTCTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC 201 TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTTACAA CCTGGAGCAA GAAGATTTTG 251 CCACTTACTT TTGCCAACAG GGAGATACGC TTCCGTACAC TTTCGGAGGG 301 GGGACCAAGC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA CTGTATCCAT 351 CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC TCAGTCGTGT 401 GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA GTGGAAGATT 451 GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA CTGATCAGGA 501 CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG TTGACCAAGG 551 ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC TCACAAGACA 601 TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT GTTAG (SEQ ID n°.: 134) Sequência de aminoácidos de Ab-4 LC incluindo peptídeo sinal: 1 MMSSAQFLGL LLLCFQGTRC DIQMTQITSS LSASLGDRVS ISCRASQDIS 51 NYLNWYQQKP DGTFKLLIFY TSRLLSGVPS RFSGSGSGTD YSLTIYNLEQ 101 EDFATYFCQQ GDTLPYTFGG GTKLEIKRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA 151 SVVCFLNNFY PKDINVKWKI DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT 201 LTKDEYERHN SYTCEATHKT STSPIVKSFN RNEC (SEQ ID n°.: 135) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-4 LC incluindo a sequência de codificação de peptídeo sinal: 1 ATGATGTCCT CTGCTCAGTT CCTTGGTCTC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG 51 TACCAGATGT GATATCCAGA TGACACAGAT TACATCCTCC CTGTCTGCCT 101 CTCTGGGIGA CIGGGTCTCC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA AGACATTAGC 151 AATTATTTAA ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT 201 TATCTTCTAC ACATCAAGAT TACTCTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG 251 GCAGTGGGTC TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTTACAA CCTGGAGCAA 301 GAAGATTTTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGAGATACGC TTCCGTACAC 351 TTTCGGAGGG GGGACCAAGC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA 401 CTGTATCCAT CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC 451 TCAGTCGTGT GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA 501 GTGGAAGATT GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA 551 CTGATCAGGA CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG 601 TTGACCAAGG ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC 651 TCACAAGACA TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT 701 GTTAG (SEQ ID n°.: 136) Ab-4 Cadeia pesada: Sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab- 4 HC: 1 EVQLQQSGPE LMKPGASVKM SCKASGYTFT DYNMHWVKQN QGKTLEWIGE 51 INPNSGGAGY NQKFKGKATL TVDKSSTTAY MELRSLTSED SAVYYCARLG 101 YDDIYDDWYF DVWGAGTTVT YSSAKTTPPS VYPLAfGSAA QTNSMVTLGC 151 LVKGIFPEPV TVTWNSGSLS SGVHTFPAVL QSDLYTLSSS VTVPSSTWPS 201 ETVTCNVAHP ASSTKVDKKI VPRDCGCKPC ICTVPEVSSV FIFPPKPKDV 251 LTITLTPKVT CVVVDISKDD PEVQFSWFVD DVEVHTAQTQ PREEQFNSTF 301 RSVSELPIMH QDWLNGKEFK CRVNSAAFPA PIEKTISKTK GRPKAPQVYT 351 IPPPKEQMAK DKVSLTCMIT DFFPEDITVE WQWNGQPAEN YKNTQPIMDT 401 DGSYFIYSKL NVQKSNWEAG NTFTCSVLHE GLHNHHTEKS LSHSPGK (SEQ ID n°.: 137) Sequência de ácidos nucléicos codificando a forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-4 HC: 1 GAGGTCCAAC TGCAACAGTC TGGACCTGAA CTAATGAAGC CTGGGGCTTC 51 AGTGAAGATG TCCTGCAAGG CTTCTGGATA TACATTCACT GACTACAACA 101 TGCACTGGGT GAAGCAGAAC CAAGGAAAGA CCCTAGAGTG GATAGGAGAA 151 ATTAATCCTA ACAGTGGTGG TGCTGGCTAC AACCAGAAGT TCAAGGGCAA 201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AGTCCTCCAC CACAGCCTAC ATGGAGCTCC 251 GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGATTGGGC 301 TACGATGATA TCTACGACGA CTGGTACTTC GATGTCTGGG GCGCAGGGAC 351 CACGGTCACC GTCTCCTCAG CCAAAACGAC ACCCCCATCT GTCTATCCAC 401 TGGCCCCTGG ATCTGCTGCC CAAACTAACT CCATGGTGAC CCTGGGATGC 451 CTGGTCAAGG GCTATTTCCC TGAGCCAGTG GGAACTCTGG 501 ATCCCTGTCC AGCGGTGTGC ACACCTTCCC CAGTCTGACC 551 TCTACACTCT GAGCAGCTCA GTGACTGTCC CTGGCCCAGC 601 GAGACCGTCA CCTGCAACGT TGCCCACCCG CCAAGGTGGA 651 CAAGAAAATT GTGCCCAGGG ATTGTGGTTG ATATGTACAG 701 TCCCAGAAGTATCATCTGTC TTCATCTTCC CAAGGATGTG 751 CTCACCATTA CTCTGACTCC TAAGGTCACG TAGACATCAG 801 CAAGGATGAT CCCGAGGTCC AGTTCAGCTG GATGTGGAGG 851 TGCACACAGC TCAGACGCAA CCCCGGGAGG CAGCACTTTC 901 CGCTCAGTCA GTGAACTTCC CATCATGCAC TCAATGGCAA 951 GGAGTTCAAA TGCAGGGTCA ACAGTGCAGC CCCATCGAGA 1001 AAACCATCTC CAAAACCAAA GGCAGACCGA GGTGTACACC 1051 ATTCCACCTC CCAAGGAGCA GATGGCCAAG GTCTGACCTG 1101 CATGATAACA GACTTCTTCC CTGAAGACAT TGGCAGTGGA 1151 ATGGGCAGCC AGCGGAGAAC TACAAGAACA CTCAGCCCAT CATGGACACA 1201 GATGGCTCTT ACTTCATCTA CAGCAAGCTC AATGTGCAGA AGAGCAACTG 1251 GGAGGCAGGA AATACTTTCA CCTGCTCTGT GTTACATGAG GGCCTGCACA 1301 ACCACCATAC TGAGAAGAGC CTCTCCCACT CTCCTGGTAA ATGA (SEQ ID n°.: 138) Sequência de aminoácidos de Ab-4 HC incluindo peptídeo sinal: 1 MGWSWTFLFL LSGTAGVLSE VQLQQSGPEL MKPGASVKMS CKASGYTFTD 51 YNMHWVKQNQ GKTLEWIGEI NPNSGGAGYN QKFKGKATLT VDKSSTTAYM 101 ELRSLTSEDS AVYYCARLGY DDIYDDWYFD VWGAGTTVTV SSAKTTPPSV 151 YPLAPGSAAQ TNSMVTLGCL VKGYFPEPVT VTWNSGSLSS GVHTFPAVLQ 201 SDLYTLSSSV TVPSSTWPSE TVTCNVAHPA SSTKVDKKIV PRDCGCKPCI 251 CTVPEVSSVF IFPPKPKDVL TITLTPKVTC VVVDISKDDP EVQFSWFVDD 301 VEVHTAQTQP REEQFNSTFR SVSELPIMHQ DWLNGKEFKC RVNSAAFPAP 351 IEKTISKTKG RPKAPQVYTI PPPKEQMAKD KVSLTCMITD FFPEDITVYW 401 QWNGQPAENY KNTQPIMDTD GSYFIYSKLN VQKSNWEAGN TFTCSVLHEG 451 LHNHHTEKSL SHSPGK (SEQ ID n°.: 139) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-4 HC incluindo codificação de peptídeo sinal: 1 ATGGGATGGA GCTGGACCTT TCTCTTCCTC CTGCAGGTGT 51 CCTCTCTGAG GTCCAACTGC AACAGTCTGG ATGAAGCCTG 101 GGGCTTCAGT GAAGATGTCC TGCAAGGCTT ATTCACTGAC 151 TACAACATGC ACTGGGTGAA GCAGAACCAA TAGAGTGGAT 201 AGGAGAAATT AATCCTAACA GTGGTGGTGC CAGAAGTTCA 251 AGGGCAAGGC CACATTGACT GTAGACAAGT AGCCTACATG 301 GAGCTCCGCA GCCTGACATC TGAGGACTCT ACTGTGCAAG 351 ATTGGGCTAC GATGATATCT ACGACGACTG GTCTGGGGCG 401 CAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCAGCCA CCCATCTGTC 451 TATCCACTGG CCCCTGGATC TGCTGCCCAA TGGTGACCCT 501 GGGATGCCTG GTCAAGGGCT ATTTCCCTGA GTGACCTGGA 551 ACTCTGGATC CCTGTCCAGC GGTGTGCACA TGTCCTGCAG 601 TCTGACCTCT ACACTCTGAG CAGCTCAGTG ACTGTCCCCT CCAGCACCTG 651 GCCCAGCGAG ACCGTCACCT GCAACGTTGC CCACCCGGCC AGCAGCACCA 701 AGGTGGACAA GAAAATTGTG CCCAGGGATT GTGGTTGTAA GCCTTGCATA 751 TGTACAGTCC CAGAAGTATC ATCTGTCTTC ATCTTCCCCC CAAAGCCCAA 801 GGATGTGCTC ACCATTACTC TGACTCCTAA GGTCACGTGT GTTGTGGTAG 851 ACATCAGCAA GGATGATCCC GAGGTCCAGT TCAGCTGGTT TGTAGATGAT 901 GTGGAGGTGC ACACAGCTCA GACGCAACCC CGGGAGGAGC AGTTCAACAG 951 CACTTTCCGC TCAGTCAGTG AACTTCCCAT CATGCACCAG GACTGGCTCA 1001 ATGGCAAGGA GTTCAAATGC AGGGTCAACA GTGCAGCTTT CCCTGCCCCC 1051 ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AACCAAAGGC AGACCGAAGG CTCCACAGGT 1101 GTACACCATT CCACCTCCCA AGGAGCAGAT GGCCAAGGAT AAAGTCAGTC 1151 TGACCTGCAT GATAACAGAC TTCTTCCCTG AAGACATTAC TGTGGAGTGG 1201 CAGTGGAATG GGCAGCCAGC GGAGAACTAC AAGAACACTC AGCCCATCAT 1251 GGACACAGAT GGCTCTTACT TCATCTACAG CAAGCTCAAT GTGCAGAAGA 1301 GCAACTGGGA GGCAGGAAAT ACTTTCACCT GCTCTGTGTT ACATGAGGGC 1351 CTGCACAACC ACCATACTGA GAAGAGCCTC TCCCACTCTC CTGGTAAATG 1401 A (SEQ ID n°.:140) Ab-4 foi humanizado para gerar Ab-5. Ab-5 As sequências da Anticorpo 5 (também referido aqui como Ab-5) LC e HC são como segue: Ab-5 Cadeia leve: Sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab- 5 LC: 1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY 51 TSRLLSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ GDTLPYTFGG 101 GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV 151 DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG 201 LSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID n°.: 141) Sequência de ácidos nucléicos codificando a forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-5 LC: 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTCTCCGCAT CCGTAGGCGA 51 CCGCGTAACC ATAACATGTA GAGCATCTCA AGATATTTCC AACTATTTGA 101 ATTGGTACCA ACAAAAACCC GGCAAAGCAC CTAAACTCCT CATTTACTAT 151 ACATCAAGAC TCCTCTCCGG CGTTCCATCA CGATTCTCAG GCTCCGGCTC 201 CGGCACAGAT TTCACACTCA CTATTTCCTC CCTCCAACCA GAAGATTTTG 251 CAACCTATTA CTGTCAACAA GGCGATACAC TCCCATACAC ATTCGGCGGC 301 GGCACAAAAG TTGAAATTAA ACGTACGGTG GCTGCACCAT CTGTCTTCAT 351 CTTCCCGCCA TCTGATGAGC AGTTGAAATC TGGAACTGCC TCTGTTGTGT 401 GCCTGCTGAA TAACTTCTAT CCCAGAGAGG CCAAAGTACA GTGGAAGGTG 451 GATAACGCCC TCCAATCGGG TAACTCCCAG GAGAGTGTCA CAGAGCAGGA 501 CAGCAAGGAC AGCACCTACA GCCTCAGCAG CACCCTGACG CTGAGCAAAG 551 CAGACTACGA GAAACACAAA GTCTACGCCT GCGAAGTCAC CCATCAGGGC 601 CTGAGCTCGC CCGTCACAAA GAGCTTCAAC AGGGGAGAGT GT (SEQ ID n°.: 142) Sequência de aminoácidos de Ab-5 LC incluindo peptídeo sinal: 1 MDMRVPAQLL GLLLLWLRGA RCDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRASQD 51 ISNYLNWYQQ KPGKAPKLLI YYTSRLLSGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL 101 QPEDFATYYC QQGDTLPYTF GGGTKVEIKR TVAAPSVFIF PPSDEQLKSG 151 TASVVCLLNN FYPREAKVQW KVDNALQSGN SQESVTEQDS KDSTYSLSST 201 LTLSKADYEK HKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGEC (SEQ ID n°.: 143) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-5 LC incluindo a sequência de codificação de peptídeo sinal: 1 ATGGACATGA GGGTCCCCGC TCAGCTCCTG GGGCTCCTGC TACTCTGGCT 51 CCGAGGTGCC AGATGTGACA TCCAGATGAC CCAGTCTCCA TCCTCCCTCT 101 CCGCATCCGT AGGCGACCGC GTAACCATAA CATGTAGAGC ATCTCAAGAT 151 ATTTCCAACT ATTTGAATTG GTACCAACAA AAACCCGGCA AAGCACCTAA 201 ACTCCTCATT TACTATACAT CAAGACTCCT CTCCGGCGTT CCATCACGAT 251 TCTCAGGCTC CGGCTCCGGC ACAGATTTCA CACTCACTAT TTCCTCCCTC 301 CAACCAGAAG ATTTTGCAAC CTATTACTGT CAACAAGGCG ATACACTCCC 351 ATACACATTC GGCGGCGGCA CAAAAGTTGA AATTAAACGT ACGGTGGCTG 401 CACCATCTGT CTTCATCTTC CCGCCATCTG ATGAGCAGTT GAAATCTGGA 451 ACTGCCTCTG TTGTGTGCCT GCTGAATAAC TTCTATCCCA GAGAGGCCAA 501 AGTACAGTGG AAGGTGGATA ACGCCCTCCA ATCGGGTAAC TCCCAGGAGA 551 GTGTCACAGA GCAGGACAGC AAGGACAGCA CCTACAGCCT CAGCAGCACC 601 CTGACGCTGA GCAAAGCAGA CTACGAGAAA CACAAAGTCT ACGCCTGCGA 651 AGTCACCCAT CAGGGCCTGA GCTCGCCCGT CACAAAGAGC TTCAACAGGG 701 GAGAGTGT (SEQ ID n°.:144) Ab-5 Cadeia pesada: Sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab- 5 HC: 1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DYNMHWVRQA PGQGLEWMGE 51 INPNSGGAGY NQKPKGRVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARLG 101 YDDIYDDWYF DVWGQGTTVT YSSASTKGPS VFPLAPCSRS TSESTAALGC 151 LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSNFG 201 TQTYTCNVDH KPSNTKVDKT VERKCCVECP PCPAPPVAGP SVFLFPPKPK 251 DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVQFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQFNS 301 TFRVVSVLTV VHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PAPIEKTISK TKGQPREPQV 351 YTLPPSREEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPML 401 DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGK (SEQ ID n°.: 145) Sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab- 5 HC sem terminal carbóxi-lisina: 1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DYNMHWVRQA PGQGLEWMGE 51 INPNSGGAGY NQKFKGRVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARLG 101 YDDIYDDWYF DVWGQGTTVT VSSASTKGPS VFPLAPCSRS TSESTAALGC 151 LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSNFG 201 TQTYTCNVDH KPSNTKVDKT VERKCCVECP PCPAPPVAGP SVFLFPPKPK 251 DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVQFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQFNS 301 TFRVVSVLTV VHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PAPIEKTISK TKGQPREPQV 351 YTLPPSREEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPML 401 DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPG (SEQ ID n°.:392) Sequência de ácidos nucléicos codificando a forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-5 HC: 1 GAGGTGCAGC TGGTGCAGAG CGGCGCCGAG CAGGAGCAAG 51 CGTTAAAGTT TCTTGTAAAG CAAGCGGATA GATTACAACA 101 TGCATTGGGT AAGACAAGCG CCAGGACAAG GATGGGCGAA 151 ATTAACCCTA ATAGTGGAGG AGCAGGCTAC TCAAAGGGAG 201 AGTTACAATG ACAACAGACA CAAGCACTTC ATGGAACTGC 251 GATCACTTAG AAGCGACGAT ACAGCTGTAT ACGACTTGGG 301 TATGATGATA TATATGATGA CTGGTATTTC GCCAGGGAAC 351 AACAGTTACC GTCTCTAGTG CCTCCACCAA GTCTTCCCCC 401 TGGCGCCCTG CTCCAGGAGC ACCTCCGAGA CCTGGGCTGC 451 CTGGTCAAGG ACTACTTCCC CGAACCGGTG GGAACTCAGG 501 CGCTCTGACC AGCGGCGTGC ACACCTTCCC CAGTCCTCAG 551 GACTCTACTC CCTCAGCAGC GTGGTGACCG CAACTTCGGC 601 ACCCAGACCT ACACCTGCAA CGTAGATCAC ACACCAAGGT 651 GGACAAGACA GTTGAGCGCA AATGTTGTGT CCGTGCCCAG 701 CACCACCTGT GGCAGGACCG TCAGTCTTCC AAAACCCAAG 751 GACACCCT CATGATCTCCCG GACCCCTGAG TGGTGGTGGA 801 CGTGAGCCAC GAAGACCCCG AGGTCCAGTT GTGGACGGCG 851 TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCAC GTTCAACAGC 901 ACGTTCCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTT ACTGGCTGAA 951 CGGCAAGGAG TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CCAGCCCCCA 1001 TCGAGAAAAC CATCTCCAAA ACCAAAGGGC ACCACAGGTG 1051 TACACCCTGC CCCCATCCCG GGAGGAGATG AGGTCAGCCT 1101 GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTACCCCAG GTGGAGTGGG 1151 AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA TCCCATGCTG 1201 GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC TGGACAAGAG 1251 CAGGTGGCAG CAGGGGAACG TCTTCTCATG CATGAGGCTC 1301 TGCACAACCA CTACACGCAG AAGAGCCTCT GGGTAAA (SEQ ID n°.: 146) Sequência de aminoácidos de Ab-5 HC incluindo peptídeo sinal: 1 MDWTWRILFL VAAATGAHSE VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTD 51 YNMHWVRQAP GQGLEWMGEI NPNSGGAGYN QKFKGRVTMT TDTSTSTAYM 101 ELRSLRSDDT AVYYCARLGY DDIYDDWYFD VWGQGTTVTV SSASTKGPSV 151 FPLAPCSRST SESTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ 201 ssGLYSLssv VTVPSSNFGT QTYTCNVDHK PSNTKVDKTV ERKCCVYCPP 251 CPAPPVAGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVQFNWYV 301 DGVEVHNAKT KPREEQFNST FRVVSVLTVV HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP 351 APIEKTISKT KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV 401 EWESNGQPEN NYKTTPPMLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH 451 EALHNHYTQK SLSLSPGK (SEQ ID n°.: 147) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-5 HC incluindo a sequência de codificação de peptídeo sinal: 1 ATGGACTGGA CCTGGAGGAT CCTCTTCTTG GTGGCAGCAG CCACAGGAGC 51 CCACTCCGAG GTGCAGCTGG TGCAGAGCGG CGCCGAGGTA AAAAAACCAG 101 GAGCAAGCGT TAAAGTTTCT TGTAAAGCAA ATTTACAGAT 151 TACAACATGC ATTGGGTAAG ACAAGCGCCA TGGAATGGAT 201 GGGCGAAATT AACCCTAATA GTGGAGGAGC CAAAAATTCA 251 AAGGGAGAGT TACAATGACA ACAGACACAA AGCATATATG 301 GAACTGCGAT CACTTAGAAG CGACGATACA ATTGCGCACG 351 ACTTGGGTAT GATGATATAT ATGATGACTG GTTTGGGGCC 401 AGGGAACAAC AGTTACCGTC TCTAGTGCCT CCCATCGGTC 451 TTCCCCCTGG CGCCCTGCTC CAGGAGCACC CAGCGGCCCT 501 GGGCTGCCTG GTCAAGGACT ACTTCCCCGA GTGTCGTGGA 551 ACTCAGGCGC TCTGACCAGC GGCGTGCACA TGTCCTACAG 601 TCCTCAGGAC TCTACTCCCT CAGCAGCGTG CCTCCAGCAA 651 CTTCGGCACC CAGACCTACA CCTGCAACGT CCCAGCAACA 701 CCAAGGTGGA CAAGACAGTT GAGCGCAAAT GTGCCCACCG 751 TGCCCAGCAC CACCTGTGGC AGGACCGTCA TCCCCCCAAA 801 ACCCAAGGAC ACCCTCATGA TCTCCCGGAC CCCTGAGGTC ACGTGCGTGG 851 TGGTGGACGT GAGCCACGAA GACCCCGAGG TCCAGTTCAA CTGGTACGTG 901 GACGGCGTGG AGGTGCATAA TGCCAAGACA AAGCCACGGG AGGAGCAGTT 951 CAACAGCACG TTCCGTGTGG TCAGCGTCCT CACCGTTGTG CACCAGGACT 1001 GGCTGAACGG CAAGGAGTAC AAGTGCAAGG TCTCCAACAA AGGCCTCCCA 1051 GCCCCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAACC AAAGGGCAGC CCCGAGAACC 1101 ACAGGTGTAC ACCCTGCCCC CATCCCGGGA GGAGATGACC AAGAACCAGG 1151 TCAGCCTGAC CTGCCTGGTC AAAGGCTTCT ACCCCAGCGA CATCGCCGTG 1201 GAGTGGGAGA GCAATGGGCA GCCGGAGAAC AACTACAAGA CCACACCTCC 1251 CATGCTGGAC TCCGACGGCT CCTTCTTCCT CTACAGCAAG CTCACCGTGG 1301 ACAAGAGCAG GTGGCAGCAG GGGAACGTCT TCTCATGCTC CGTGATGCAT 1351 GAGGCTCTGC ACAACCACTA CACGCAGAAG AGCCTCTCCC TGTCTCCGGG 1401 TAAA (SEQ ID n°.: 148) Ab-5 Domínio variável: Sequência de aminoácidos de Ab-5 de cadeia leve de domínio variável (sem sequência sinal): 1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQICP GKAPKLLIYY 51 TSRLLSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ GDTLPYTFGG 101 GTKVEIK (SEQ ID n°.:376) sequência de DNA de Ab-5 de cadeia leve de domínio variável(sem sequência sinal): 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTCTCCGCAT CCGTAGGCGA 51 CCGCGTAACC ATAACATGTA GAGCATCTCA AGATATTTCC AACTATTTGA 101 ATTGGTACCA ACAAAAACCC GGCAAAGCAC CTAAACTCCT CATTTACTAT 151 ACATCAAGAC TCCTCTCCGG CGTTCCATCA CGATTCTCAG GCTCCGGCTC 201 CGGCACAGAT TTCACACTCA CTATTTCCTC CCTCCAACCA GAAGATTTTG 251 CAACCTATTA CTGTCAACAA GGCGATACAC TCCCATACAC ATTCGGCGGC 301 GGCACAAAAG TTGAAATTAA A (SEQ ID n°.:377) Sequência de aminoácidos de Ab-5 de cadeia pesada de domínio variável (sem sequência sinal): 1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DYNMHWVRQA PGQGLEWMGE 51 INPNSGGAGY NQKFKGRVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARLG 101.YDDIYDDWYF DVWGQGTTVT VSS (SEQ ID n°.:378) Sequência de DNA de Ab-5 de cadeia pesada de domínio variável(sem sequência sinal): 1 GAGGTGCAGC TGGTGCAGAG CGGCGCCGAG GTAAAAAAAC CAGGAGCAAG 51 CGTTAAAGTT TCTTGTAAAG CAAGCGGATA TACATTTACA GATTACAACA 101 TGCATTGGGT AAGACAAGCG CCAGGACAAG GATTGGAATG GATGGGCGAA 151 ATTAACCCTA ATAGTGGAGG AGCAGGCTAC AATCAAAAAT TCAAAGGGAG 201 AGTTACAATG ACAACAGACA CAAGCACTTC AACAGCATAT ATGGAACTGC 251 GATCACTTAG AAGCGACGAT ACAGCTGTAT ACTATTGCGC ACGACTTGGG 301 TATGATGATA TATATGATGA CTGGTATTTC GATGTTTGGG GCCAGGGAAC 351 AACAGTTACC GTCTCTAGT (SEQ ID n°.:379) As sequências de região CDR (região determinante de complementaridade) na região variável da cadeia pesada de Ab-5 são como segue: CDR-Hl: DYNMH (SEQ ID n°.:245) CDR-H2: EINPNSGGAGYNQKFKG (SEQ ID n°.:246) CDR-H3 : LGYDDIYDD WYFDV (SEQ ID n°.:247) As sequências de região variável CDR de cadeia leve de Ab-5 são: CDR-L1 : RASQDISNYLN (SEQ ID n°.:78) CDR-L2: YTSRLLS (SEQ ID n°.:79) CDR-L3 : QQGDTLPYT (SEQ ID n°.:80) Ab-6 As sequências de Anticorpo 6 (também referido aqui como Ab-6) LC e HC são como segue: Ab-6 Cadeia leve: Sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab- 6 LC: 1 DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NYLNWFQQKP DGTLKLLIFY 51 TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GDTLPYTFGG 101 GTKLEIRRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA SVVCFLNNFY PKDINVKWKI 151 DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT LTKDEYERHN SYTCEATHKT 201 STSPIVKSFNRNEC (SEQ ID n°.: 149) Sequência de ácidos nucléicos codificando a forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-6 LC: 1 GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT CTCTGGGAGA 51 CAGAGTCACC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA GGACATTAGC AATTATTTAA 101 ACTGGTTTCA GCAGAAACCA GATGGAACTC TTAAACTCCT GATCTTCTAC 151 ACATCAAGAT TACACTCAGG AGTTCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC 201 TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTAGCAA CCTGGAGCAA GAAGATATTG 251 CCACTTACTT TTGCCAACAG GGTGATACGC TTCCGTACAC GTTCGGGGGG 301 GGGACCAAGC TGGAAATAAG ACGGGCTGAT GCTGCACCAA CTGTATCCAT 351 CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC TCAGTCGTGT 401 GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA GTGGAAGATT 451 GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA CTGATCAGGA 501 CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG TTGACCAAGG 551 ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC TCACAAGACA 601 TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT GTTAG (SEQ ID n°.: 150) Sequência de aminoácidos de Ab-6 LC incluindo peptídeo sinal: 1 MMSSAQFLGL LLLCFQGTRC DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS 51 NYLNWFQQKP DGTLKLLIFY TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ 101 EDIATYFCQQ GDTLPYTFGG GTKLEIRRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA 151 SVVCFLNNFY PKDINVKWKI DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT 201 LTKDEYERHN SYTCEATHKT STSPIVKSFN RNEC (SEQ ID n°.: 151) Sequência de ácidos nucléicos Ab-6 LC incluindo a sequência de codificação de peptídeo sinal: 1 ATGATGTCCT CTGCTCAGTT CCTTGGTCTC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG 51 TACCAGATGT GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT 101 CTCTGGGAGA CAGAGTCACC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA GGACATTAGC 151 AATTATTTAA ACTGGTTTCA GCAGAAACCA GATGGAACTC TTAAACTCCT 201 GATCTTCTAC ACATCAAGAT TACACTCAGG AGTTCCATCA AGGTTCAGTG 251 GCAGTGGGTC TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTAGCAA CCTGGAGCAA 301 GAAGATATTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGTGATACGC TTCCGTACAC 351 GTTCGGGGGG GGGACCAAGC TGGAAATAAG ACGGGCTGAT GCTGCACCAA 401 CTGTATCCAT CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC 451 TCAGTCGTGT GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA 501 GTGGAAGATT GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA 551 CTGATCAGGA CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG 601 TTGACCAAGG ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC 651 TCACAAGACA TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT 701 GTTAG (SEQ ID n°.: 152) Ab-6 Cadeia pesada: Sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab- 6 HC: 1 EVQLQQSGPE LMKPGASVKM SCKASGYTFT DYNMHWVKQN QGKSLEWIGE 51 INPNSGGSGY NQKFKGKATL TVDKSSSTAY MELRSLTSED SAVYYCARLV 101 YDGSYEDWYF DVWGAGTTVT YSSAKTTPPS VYPLAPGSAA QTNSMVTLGC 151 LVKGYFPEPV TVTWNSGSLS SGVHTFPAVL QSDLYTLSSS VTVPSSTWPS 201 ETVTCNVAHP ASSTKVDKKI VPRDCGCKPC ICTVPEVSSV FIFPPKPKDV 251 LTITLTPKVT CVWDISKDD PEVQFSWFVD D VEVHTAQTQ PREEQFNSTF 301 RSVSELPIMH QDWLNGKEFK CRVNSAAFPA PIEKTISKTK GRPKAPQVYT 351 IPPPKEQMAK DKVSLTCMIT DFFPEDITVE WQWNGQPAEN YKNTQPIMDT 401 DGSYFIYSKL NVQKSNWEAG NTFTCSVLHE GLHNHHTEKS LSHSPGK (SEQ ID n°.: 153) Sequência de ácidos nucléicos codificando a forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-6 HC: 1 GAGGTCCAGC TGCAACAGTC TGGACCTGAA CTGGGGCTTC 51 AGTGAAGATG TCCTGCAAGG CTTCTGGATA GACTACAACA 101 TGCACTGGGT GAAACAGAAC CAAGGAAAGA GATAGGAGAA 151 ATTAATCCTA ACAGTGGTGG TAGTGGCTAC TCAAAGGCAA 201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AGTCTTCCAG ATGGAGCTCC 251 GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT AAGATTGGTC 301 TACGATGGCA GCTACGAGGA CTGGTACTTC GCGCAGGGAC 351 CACGGTCACC GTCTCCTCAG CCAAAACGAC GTCTATCCAC 401 TGGCCCCTGG ATCTGCTGCC CAAACTAACT CCTGGGATGC 451 CTGGTCAAGG GCTATTTCCC TGAGCCAGTG GGAACTCTGG 501 ATCCCTGTCC AGCGGTGTGC ACACCTTCCC CAGTCTGACC 551 TCTACACTCT GAGCAGCTCA GTGACTGTCC CTGGCCCAGC 601 GAGACCGTCA CCTGCAACGT TGCCCACCCG CCAAGGTGGA 651 CAAGAAAATT GTGCCCAGGG ATTGTGGTTG TAAGCCTTGC ATATGTACAG 701 TCCCAGAAGT ATCATCTGTC TTCATCTTCC CCCCAAAGCC CAAGGATGTG 751 CTCACCATTA CTCTGACTCC TAAGGTCACG TGTGTTGTGG TAGACATCAG 801 CAAGGATGAT CCCGAGGTCC AGTTCAGCTG GTTTGTAGAT GATGTGGAGG 851 TGCACACAGC TCAGACGCAA CCCCGGGAGG AGCAGTTCAA CAGCACTTTC 901 CGCTCAGTCA GTGAACTTCC CATCATGCAC CAGGACTGGC TCAATGGCAA 951 GGAGTTCAAA TGCAGGGTCA ACAGTGCAGC TTTCCCTGCC CCCATCGAGA 1001 AAACCATCTC CAAAACCAAA GGCAGACCGA AGGCTCCACA GGTGTACACC 1051 ATTCCACCTC CCAAGGAGCA GATGGCCAAG GATAAAGTCA GTCTGACCTG 1101 CATGATAACA GACTTCTTCC CTGAAGACAT TACTGTGGAG TGGCAGTGGA 1151 ATGGGCAGCC AGCGGAGAAC TACAAGAACA CTCAGCCCAT CATGGACACA 1201 GATGGCTCTT ACTTCATCTA CAGCAAGCTC AATGTGCAGA AGAGCAACTG 1251 GGAGGCAGGA AATACTTTCA CCTGCTCTGT GTTACATGAG GGCCTGCACA 1301 ACCACCATAC TGAGAAGAGC CTCTCCCACT CTCCTGGTAA ATGA (SEQ ID n°.: 154) Sequência de aminoácidos de Ab-6 HC incluindo peptídeo sinal: 1 MGWSWTFLFL LSGTAGVLSE VQLQQSGPEL MKPGASVKMS CKASGYTFTD 51 YNMHWVKQNQ GKSLEWIGEI NPNSGGSGYN QKFKGKATLT VDKSSSTAYM 101 ELRSLTSEDS AVYYCARLVY DGSYEDWYFD VWGAGTTVTV SSAKTTPPSV 151 YPLAPGSAAQ TNSMVTLGCL VKGYFPEPVT VTWNSGSLSS GVHTFPAVLQ 201 SDLYTLSSSV TVPSSTWPSE TVTCNVAHPA SSTKVDKKIV PRDCGCKPCI 251 CTVPEVSSVF IFPPKPKDVL TITLTPKVTC VVVDISKDDP EVQFSWFVDD 301 VEVHTAQTQP REEQFNSTFR SVSELPIMHQ DWLNGKEFKC RVNSAAFPAP 351 IEKTISKTKG RPKAPQVYTI PPPKEQMAKD KVSLTCMITD FFPEDITVEW 401 QWNGQPAENY KNTQPIMDTD GSYFIYSKLN VQKSNWEAGN TFTCSVLHEG 451 LHNHHTEKSL SHSPGK (SEQ ID n°.:155) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-6 HC incluindo a sequência de codificação de peptídeo sinal: 1 ATGGGATGGA GCTGGACCTT TCTCTTCCTC CTGTCAGGAA CTGCAGGTGT 51 CCTCTCTGAG GTCCAGCTGC AACAGTCTGG ACCTGAACTA ATGAAGCCTG 101 GGGCTTCAGT GAAGATGTCC TGCAAGGCTT ATTCACTGAC 151 TACAACATGC ACTGGGTGAA ACAGAACCAA TAGAGTGGAT 201 AGGAGAAATT AATCCTAACA GTGGTGGTAG CAAAAGTTCA 251 AAGGCAAGGC CACATTGACT GTAGACAAGT AGCCTACATG 301 GAGCTCCGCA GCCTGACATC TGAGGACTCT ACTGTGCAAG 351 ATTGGTCTAC GATGGCAGCT ACGAGGACTG GTCTGGGGCG 401 CAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCAGCCA CCCATCTGTC 451 TATCCACTGG CCCCTGGATC TGCTGCCCAA TGGTGACCCT 501 GGGATGCCTG GTCAAGGGCT ATTTCCCTGA GTGACCTGGA 551 ACTCTGGATC CCTGTCCAGC GGTGTGCACA TGTCCTGCAG 601 TCTGACCTCT ACACTCTGAG CAGCTCAGTG CCAGCACCTG 651 GCCCAGCGAG ACCGTCACCT GCAACGTTGC AGCAGCACCA 701 AGGTGGACAA GAAAATTGTG CCCAGGGATT GCCTTGCATA 751 TGTACAGTCC CAGAAGTATC ATCTGTCTTC CAAAGCCCAA 801 GGATGTGCTC ACCATTACTC TGACTCCTAA GGTCACGTGT GTTGTGGTAG 851 ACATCAGCAA GGATGATCCC GAGGTCCAGT TCAGCTGGTT TGTAGATGAT 901 GTGGAGGTGC ACACAGCTCA GACGCAACCC CGGGAGGAGC AGTTCAACAG 951 CACTTTCCGC TCAGTCAGTG AACTTCCCAT CATGCACCAG GACTGGCTCA 1001 ATGGCAAGGA GTTCAAATGC AGGGTCAACA GTGCAGCTTT CCCTGCCCCC 1051 ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AACCAAAGGC AGACCGAAGG CTCCACAGGT 1101 GTACACCATT CCACCTCCCA AGGAGCAGAT GGCCAAGGAT AAAGTCAGTC 1151 TGACCTGCAT GATAACAGAC TTCTTCCCTG AAGACATTAC TGTGGAGTGG 1201 CAGTGGAATG GGCAGCCAGC GGAGAACTAC AAGAACACTC AGCCCATCAT l251 GGACACAGAT GGCTCTTACT TCATCTACAG CAAGCTCAAT GTGCAGAAGA 1301 GCAACTGGGA GGCAGGAAAT ACTTTCACCT GCTCTGTGTT ACATGAGGGC 1351 CTGCACAACC ACCATACTGA GAAGAGCCTC TCCCACTCTC CTGGTAAATG 1401 A (SEQ ID n°.: 156) Ab-7 As sequências de Anticorpo 7 (também referido aqui como Ab-7) LC e HC são como segue: Ab-7 Cadeia leve: Sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab- 7 LC: 1 DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ICCRASQVIT NYLYWYQQKP DGTFKLLIYY 51 TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GDTLPYTFGG 101 GTKLEIKRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA SVVCFLNNFY PKDINVKWKI 151 DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT LTKDEYERHN SYTCEATHKT 201 STSPIVKSFNRNEC (SEQ ID n°.: 157) Sequência de ácidos nucléicos codificando a forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-7 LC: 1 GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT CTCTGGGAGA 51 CAGAGTCACC ATCTGTTGCA GGGCAAGTCA GGTCATTACC AATTATTTAT 101 ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT GATCTACTAC 151 ACATCAAGAT TACACTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC 201 TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTAGCAA CCTGGAACAG GAAGATATTG 251 CCACTTACTT TTGCCAACAG GGTGATACGC TTCCGTACAC GTTCGGAGGG 301 GGGACCAAGC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA CTGTATCCAT 351 CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC TCAGTCGTGT 401 GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA GTGGAAGATT 451 GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA CTGATCAGGA 501 CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG TTGACCAAGG 551 ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC TCACAAGACA 601 TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT GT (SEQ ID n°.: 158) Sequência de aminoácidos de Ab-7 LC incluindo peptídeo sinal: 1 MMSSAQFLGL LLLCFQGTRC DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ICCRASQVIT 51 NYLYWYQQKP DGTFKLLIYY TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ 101 EDIATYFCQQ GDTLPYTFGG GTKLEIKRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA 151 SVVCFLNNFY PKDINVKWKI DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT 201 LTKDEYERHN SYTCEATHKT STSPIVKSFN RNEC (SEQ ID n°.: 159) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-7 LC incluindo a sequência de codificação de peptídeo sinal: 1 ATGATGTCCT CTGCTCAGTT CCTTGGTCTC GTTTTCAAGG 51 TACCAGATGT GATATCCAGA TGACACAGAC CTGTCTGCCT 101 CTCTGGGAGA CAGAGTCACC ATCTGTTGCA GGTCATTACC 151 AATTATTTAT ACTGGTATCA GCAGAAACCA TTAAACTCCT 201 GATCTACTAC ACATCAAGAT TACACTCAGG AGGTTCAGTG 251 GCAGTGGGTC TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCTGGAACAG 301 GAAGATATTG CCACTTACTT TTGCCAACAG TTCCGTACAC 351 GTTCGGAGGG GGGACCAAGC TGGAAATAAA GCTGCACCAA 401 CTGTATCCAT CTTCCCACCA TCCAGTGAGC TGGAGGTGCC 451 TCAGTCGTGT GCTTCTTGAA CAACTTCTAC TCAATGTCAA 501 GTGGAAGATT GATGGCAGTG AACGACAAAA AACAGTTGGA 551 CTGATCAGGA CAGCAAAGAC AGCACCTACA CACCCTCACG 601 TTGACCAAGG ACGAGTATGA ACGACATAAC GTGAGGCCAC 651 TCACAAGACA TCAACTTCAC CCATTGTCAA AGGAATGAGT 701 GT (SEQ ID n°.: 160) Ab-7 Cadeia pesada: Sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab- 7 HC: 1 EVQLQQSGPE LMKPGASVKM SCKASGYTFT DYNMHWMKQN QGKSLEWIGE 51 INPNSGGAGY NQQFKGKATL TVDKSSRTAY MELRSLTSED SAVYYCARLG 101 YVGNYEDWYF DVWGAGTTVT YSSAKTTPPS VYPLAPGSAA QTNSMVTLGC 151 LVKGYFPEPV TVTWNSGSLS SGVHTFPAVL QSDLYTLSSS VTVPSSTWPS 201 ETVTCNVAHP ASSTKVDKKI VPRDCGCKPC ICTVPEVSSV FIFPPKPKDV 251 LTITLTPKVT CVVVDISKDD PEVQFSWFVD DVEVHTAQTQ PREEQFNSTF 301 RSVSELPIMH QDWLNGKEFK CRVNSAAFPA PIEKTISKTK GRPKAPQVYT 351 IPPPKEQMAK DKVSLTCMIT DFFPEDITVE WQWNGQPAEN YKNTQPIMDT 401 DGSYFIYSKL NVQKSNWEAG NTFTCSVLHE GLHNHHTEKS LSHSPGK (SEQ ID n°.: 161) Sequência de ácidos nucléicos codificando a forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-7 HC: 1 GAGGTCCAGC TGCAACAGTC TGGACCTGAA CTAATGAAGC CTGGGGCTTC 51 AGTGAAGATG TCCTGCAAGG CTTCTGGATA GACTACAACA 101 TGCACTGGAT GAAGCAGAAC CAAGGAAAGA GATAGGAGAA 151 ATTAATCCTA ACAGTGGTGG TGCTGGCTAC TCAAAGGCAA 201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AGTCCTCCAG ATGGAGCTCC 251 GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT AAGATTGGGC 301 TACGTTGGTA ATTACGAGGA CTGGTACTTC GCGCAGGGAC 351 CACGGTCACC GTCTCCTCAG CCAAAACGAC GTCTATCCAC 401 TGGCCCCTGG ATCTGCTGCC CAAACTAACT CCTGGGATGC 451 CTGGTCAAGG GCTATTTCCC TGAGCCAGTG GGAACTCTGG 501 ATCCCTGTCC AGCGGTGTGC ACACCTTCCC CAGTCTGACC 551 TCTACACTCT GAGCAGCTCA GTGACTGTCC CTGGCCCAGC 601 GAGACCGTCA CCTGCAACGT TGCCCACCCG CCAAGGTGGA 651 CAAGAAAATT GTGCCCAGGG ATTGTGGTTG ATATGTACAG 701 TCCCAGAAGT ATCATCTGTC TTCATCTTCC CAAGGATGTG 751 CTCACCATTA CTCTGACTCC TAAGGTCACG TGTGTTGTGG TAGACATCAG 801 CAAGGATGAT CCCGAGGTCC AGTTCAGCTG GTTTGTAGAT GATGTGGAGG 851 TGCACACAGC TCAGACGCAA CCCCGGGAGG AGCAGTTCAA CAGCACTTTC 901 CGCTCAGTCA GTGAACTTCC CATCATGCAC CAGGACTGGC TCAATGGCAA 951 GGAGTTCAAA TGCAGGGTCA ACAGTGCAGC TTTCCCTGCC CCCATCGAGA 1001 AAACCATCTC CAAAACCAAA GGCAGACCGA AGGCTCCACA GGTGTACACC 1051 ATTCCACCTC CCAAGGAGCA GATGGCCAAG GATAAAGTCA GTCTGACCTG 1101 CATGATAACA GACTTCTTCC CTGAAGACAT TACTGTGGAG TGGCAGTGGA 1151 ATGGGCAGCC AGCGGAGAAC TACAAGAACA CTCAGCCCAT CATGGACACA 1201 GATGGCTCTT ACTTCATCTA CAGCAAGCTC AATGTGCAGA AGAGCAACTG 1251 GGAGGCAGGA AATACTTTCA CCTGCTCTGT GTTACATGAG GGCCTGCACA 1301 ACCACCATACTGAGAAGAGC CTCTCCCACT CTCCTGGTAA A (SEQ ID n°.: 162) Sequência de aminoácidos de Ab-7 HC incluindo peptídeo sinal: 1 MGWSWTFLFL LSGTAGVLSE VQLQQSGPEL MKPGASVKMS CKASGYTFTD 51 YNMHWMKQNQ GKSLEWIGEI NPNSGGAGYN VDKSSRTAYM 101 ELRSLTSEDS AVYYCARLGY VGNYEDWYFD SSAKTTPPSV 151 YPLAPGSAAQ TNSMVTLGCL VKGYFPEPVT GVHTFPAVLQ 201 SDLYTLSSSV TVPSSTWPSE TVTCNVAHPA PRDCGCKPCI 251 CTVPEVSSVF IFPPKPKDVL TITLTPKVTC EVQFSWFVDD 301 VEVHTAQTQP REEQFNSTFR SVSELPIMHQ RVNSAAFPAP 351 IEKTISKTKG RPKAPQVYTI PPPKEQMAKD FFPEDITVEW 401 QWNGQPAENY KNTQPIMDTD GSYFIYSKLN TFTCSVLHEG 451 LHNHHTEKSL SHSPGK (SEQ ID n°.: 163) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-7 HC incluindo codificação de peptídeo sinal: 1 ATGGGATGGA GCTGGACCTT TCTCTTCCTC CTGCAGGTGT 51 CCTCTCTGAG GTCCAGCTGC AACAGTCTGG ATGAAGCCTG 101 GGGCTTCAGT GAAGATGTCC TGCAAGGCTT ATTCACTGAC 151 TACAACATGC ACTGGATGAA GCAGAACCAA TAGAATGGAT 201 AGGAGAAATT AATCCTAACA GTGGTGGTGC TGGCTACAAC CAGCAGTTCA 251 AAGGCAAGGC CACATTGACT GTAGACAAGT CCTCCAGGAC AGCCTACATG 301 GAGCTCCGCA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAG 351 ATTGGGCTAC GTTGGTAATT ACGAGGACTG GTACTTCGAT GTCTGGGGCG 401 CAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCAGCCA AAACGACACC CCCATCTGTC 451 TATCCACTGG CCCCTGGATC TGCTGCCCAA ACTAACTCCA TGGTGACCCT 501 GGGATGCCTG GTCAAGGGCT ATTTCCCTGA GCCAGTGACA GTGACCTGGA 551 ACTCTGGATC CCTGTCCAGC GGTGTGCACA CCTTCCCAGC TGTCCTGCAG 601 TCTGACCTCT ACACTCTGAG CAGCTCAGTG ACTGTCCCCT CCAGCACCTG 651 GCCCAGCGAG ACCGTCACCT GCAACGTTGC CCACCCGGCC AGCAGCACCA 701 AGGTGGACAA GAAAATTGTG CCCAGGGATT GTGGTTGTAA GCCTTGCATA 751 TGTACAGTCC CAGAAGTATC ATCTGTCTTC ATCTTCCCCC CAAAGCCCAA 801 GGATGTGCTC ACCATTACTC TGACTCCTAA GGTCACGTGT GTTGTGGTAG 851 ACATCAGCAA GGATGATCCC GAGGTCCAGT TCAGCTGGTT TGTAGATGAT 901 GTGGAGGTGC ACACAGCTCA GACGCAACCC CGGGAGGAGC AGTTCAACAG 951 CACTTTCCGC TCAGTCAGTG AACTTCCCAT CATGCACCAG GACTGGCTCA 1001 ATGGCAAGGA GTTCAAATGC AGGGTCAACA GTGCAGCTTT CCCTGCCCCC 1051 ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AACCAAAGGC AGACCGAAGG CTCCACAGGT 1101 GTACACCATT CCACCTCCCA AGGAGCAGAT GGCCAAGGAT AAAGTCAGTC 1151 TGACCTGCAT GATAACAGAC TTCTTCCCTG AAGACATTAC TGTGGAGTGG 1201 CAGTGGAATG GGCAGCCAGC GGAGAACTAC AAGAACACTC AGCCCATCAT 1251 GGACACAGAT GGCTCTTACT TCATCTACAG CAAGCTCAAT GTGCAGAAGA 1301 GCAACTGGGA GGCAGGAAAT ACTTTCACCT GCTCTGTGTT ACATGAGGGC 1351 CTGCACAACC ACCATACTGA GAAGAGCCTC TCCCACTCTC CTGGTAAA (SEQ ID n°.: 164) Ab-8 As sequências da Anticorpo 8 (também referido aqui como Ab-8) LC e HC são como segue: Ab-8 Cadeia leve: Sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab- 8 LC: 1 DIQMTQTTSS LSASLGDRVS ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTFKLLIFY 51 TSRLLSGVPS RFSGSGSGTD YSLTIYNLEQ EDFATYFCQQ GDTLPYTFGG 101 GTKLEIKRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA SVVCFLNNFY PKDINVKWKI 151 DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT LTKDEYERHN SYTCEATHKT 201 STSPIVKSFNRNEC (SEQ ID n°.: 165) Sequência de ácidos nucléicos codificando a forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-8 LC: 1 GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT CTCTGGGAGA 51 CAGGGTCTCC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA AGACATTAGC AATTATTTAA 101 ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT TATCTTCTAC 151 ACATCAAGAT TACTCTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC 201 TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTTACAA CCTGGAGCAA GAAGATTTTG 251 CCACTTACTT TTGCCAACAG GGAGATACGC TTCCGTACAC TTTCGGAGGG 301 GGGACCAAAC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA CTGTATCCAT 351 CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC TCAGTCGTGT 401 GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA GTGGAAGATT 451 GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA CTGATCAGGA 501 CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG TTGACCAAGG 551 ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC TCACAAGACA 601 TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT GTTAG (SEQ ID n°.: 166) Sequência de aminoácidos de Ab-8 LC incluindo peptídeo sinal: 1 MMSSAQFLGL LLLCFQGTRC DIQMTQTTSS LSASLGDRVS ISCRASQDIS 51 NYLNWYQQKP DGTFKLLIFY TSRLLSGVPS RFSGSGSGTD YSLTIYNLEQ 101 EDFATYFCQQ GDTLPYTFGG GTKLEIKRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA 151 SVVCFLNNFY PKDINVKWKI DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT 201 LTKDEYERHN SYTCEATHKT STSPIVKSFN RNEC (SEQ ID n°.: 167) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-8 LC incluindo a sequência de codificação de peptídeo sinal: 1 ATGATGTCCT CTGCTCAGTT CCTTGGTCTC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG 51 TACCAGATGT GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT 101 CTCTGGGAGA CAGGGTCTCC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA AGACATTAGC 151 AATTATTTAA ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT 201 TATCTTCTAC ACATCAAGAT TACTCTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG 251 GCAGTGGGTC TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTTACAA CCTGGAGCAA 301 GAAGATTTTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGAGATACGC TTCCGTACAC 351 TTTCGGAGGG GGGACCAAAC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA 401 CTGTATCCAT CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC 451 TCAGTCGTGT GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA 501 GTGGAAGATT GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA 551 CTGATCAGGA CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG 601 TTGACCAAGG ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC 651 TCACAAGACA TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT 701 GTTAG (SEQ ID n°.: 168) Ab-8 Cadeia pesada<“>: Sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab- 8 HC: 1 EVQLQQSGPE LMKPGASVKM SCKASGYTFT DYNMHWVKQN QGKTLDWIGE 51 INPNSGGAGY NQKFKGKATL TVDKSSTTAY MELRSLTSED SAVYYCARLG 101 YDDIYDDWYF DVWGAGTTVT YSSAKTTPPS VYPLAPGSAA QTNSMVTLGC 151 LVKGYFPEPV TVTWNSGSLS SGVHTFPAVL QSDLYTLSSS VTVPSSTWPS 201 ETVTCNVAHP ASSTKVDKKI VPRDCGCKPC ICTVPEVSSV FIFPPKPKDV 251 LTITLTPKVT CVVVDISKDD PEVQFSWFVD DVEVHTAQTQ PREEQFNSTF 301 RSVSELPIMH QDWLNGKEFK CRVNSAAFPA PIEKTISKTK GRPKAPQVYT 351 IPPPKEQMAK DKVSLTCMIT DFFPEDITVE WQWNGQPAEN YKNTQPIMDT 401 DGSYFIYSKL NVQKSNWEA GNTFTCSVLHE GLHNHHTEKS LSHSPGK (SEQ ID n°.: 169) Sequência de ácidos nucléicos codificando a forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-8 HC: 1 GAGGTCCAAC TGCAACAGTC TGGACCTGAA CTAATGAAGC CTGGGGCTTC 51 AGTGAAGATG TCCTGCAAGG CTTCTGGATA TACATTCACT GACTACAACA 101 TGCACTGGGT GAAGCAGAAC CAAGGAAAGA CCCTAGACTG GATAGGAGAA 151 ATTAATCCTA ACAGTGGTGG TGCTGGCTAC AACCAGAAGT TCAAGGGCAA 201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AGTCCTCCAC CACAGCCTAC ATGGAGCTCC 251 GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGATTGGGC 301 TACGATGATA TCTACGACGA CTGGTACTTC GATGTCTGGG GCGCAGGGAC 351 CACGGTCACC GTCTCCTCAG CCAAAACGAC ACCCCCATCT GTCTATCCAC 401 TGGCCCCTGG ATCTGCTGCC CAAACTAACT CCATGGTGAC CCTGGGATGC 451 CTGGTCAAGG GCTATTTCCC TGAGCCAGTG ACAGTGACCT GGAACTCTGG 501 ATCCCTGTCC AGCGGTGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTG CAGTCTGACC 551 TCTACACTCT GAGCAGCTCA GTGACTGTCC CCTCCAGCAC CTGGCCCAGC 601 GAGACCGTCA CCTGCAACGT TGCCCACCCG GCCAGCAGCA CCAAGGTGGA 651 CAAGAAAATT GTGCCCAGGG ATTGTGGTTG TAAGCCTTGC ATATGTACAG 701 TCCCAGAAGT ATCATCTGTC TTCATCTTCC CCCCAAAGCC CAAGGATGTG 751 CTCACCATTA CTCTGACTCC TAAGGTCACG TGTGTTGTGG TAGACATCAG 801 CAAGGATGAT CCCGAGGTCC AGTTCAGCTG GTTTGTAGAT GATGTGGAGG 851 TGCACACAGC TCAGACGCAA CCCCGGGAGG AGCAGTTCAA CAGCACTTTC 901 CGCTCAGTCA GTGAACTTCC CATCATGCAC CAGGACTGGC TCAATGGCAA 951 GGAGTTCAAA TGCAGGGTCA ACAGTGCAGC TTTCCCTGCC CCCATCGAGA 1001 AAACCATCTC CAAAACCAAA GGCAGACCGA AGGCTCCACA GGTGTACACC 1051 ATTCCACCTC CCAAGGAGCA GATGGCCAAG GATAAAGTCA GTCTGACCTG 1101 CATGATAACA GACTTCTTCC CTGAAGACAT TACTGTGGAG TGGCAGTGGA 1151 ATGGGCAGCC AGCGGAGAAC TACAAGAACA CTCAGCCCAT CATGGACACA 1201 GATGGCTCTT ACTTCATCTA CAGCAAGCTC AATGTGCAGA AGAGCAACTG 1251 GGAGGCAGGA AATACTTTCA CCTGCTCTGT GTTACATGAG GGCCTGCACA 1301 ACCACCATAC TGAGAAGAGC CTCTCCCACT CTCCTGGTAA ATGA (SEQ ID n°.: 170) Sequência de aminoácidos de Ab-8 HC incluindo peptídeo sinal: 1 MGWSWTFLFL LSGTAGVLSE VQLQQSGPEL MKPGASVKMS CKASGYTFTD 51 YNMHWVKQNQ GKTLDWIGEI NPNSGGAGYN QKFKGKATLT VDKSSTTAYM 101 ELRSLTSEDS AVYYCARLGY DDIYDDWYFD VWGAGTTVTV SSAKTTPPSV 151 YPLAPGSAAQ TNSMVTLGCL VKGYFPEPVT VTWNSGSLSS GVHTFPAVLQ 201 SDLYTLSSSV IVPSSTWPSE TVTCNVAHPA SSTKVDKKIV PRDCGCKPCI 251 CTVPEVSSVF IFPPKPKDVL TITLTPKVTC VVVDISKDDP EVQFSWFVDD 301 VEVHTAQTQP REEQFNSTFR SVSELPIMHQ DWLNGKEFKC RVNSAAFPAP 351 IEKTISKTKG RPKAPQVYTI PPPKEQMAKD KVSLTCMITD FFPEDITVEW 401 QWNGQPAENY KNTQPIMDTD GSYFIYSKLN VQKSNWEAGN TFTCSVLHEG 451 LHNHHTEKSL SHSPGK (SEQ ID n°.: 171) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-8 HC incluindo a sequência de codificação de peptídeo sinal: 1 ATGGGATGGA GCTGGACCTT TCTCTTCCTC CTGTCAGGAA CTGCAGGTGT 51 CCTCTCTGAG GTCCAACTGC AACAGTCTGG ACCTGAACTA ATGAAGCCTG 101 GGGCTTCAGT GAAGATGTCC TGCAAGGCTT CTGGATATAC ATTCACTGAC 151 TACAACATGC ACTGGGTGAA GCAGAACCAA GGAAAGACCC TAGACTGGAT 201 AGGAGAAATT AATCCTAACA GTGGTGGTGC TGGCTACAAC CAGAAGTTCA 251 AGGGCAAGGC CACATTGACT GTAGACAAGT CCTCCACCAC AGCCTACATG 301 GAGCTCCGCA GCCTGACATC TGAGGACTCT ACTGTGCAAG 351 ATTGGGCTAC GATGATATCT ACGACGACTG GTCTGGGGCG 401 CAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCAGCCA CCCATCTGTC 451 TATCCACTGG CCCCTGGATC TGCTGCCCAA TGGTGACCCT 501 GGGATGCCTG GTCAAGGGCT ATTTCCCTGA GTGACCTGGA 551 ACTCTGGATC CCTGTCCAGC GGTGTGCACA TGTCCTGCAG 601 TCTGACCTCT ACACTCTGAG CAGCTCAGTG CCAGCACCTG 651 GCCCAGCGAG ACCGTCACCT GCAACGTTGC AGCAGCACCA 701 AGGTGGACAA GAAAATTGTG CCCAGGGATT GCCTTGCATA 751 TGTACAGTCC CAGAAGTATC ATCTGTCTTC CAAAGCCCAA 801 GGATGTGCTC ACCATTACTC TGACTCCTAA GTTGTGGTAG 851 ACATCAGCAA GGATGATCCC GAGGTCCAGT TGTAGATGAT 901 GTGGAGGTGC ACACAGCTCA GACGCAACCC AGTTCAACAG 951 CACTTTCCGC TCAGTCAGTG AACTTCCCAT GACTGGCTCA 1001 ATGGCAAGGA GTTCAAATGC AGGGTCAACA GTGCAGCTTT CCCTGCCCCC 1051 ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AACCAAAGGC AGACCGAAGG CTCCACAGGT 1101 GTACACCATT CCACCTCCCA AGGAGCAGAT GGCCAAGGAT AAAGTCAGTC 1151 TGACCTGCAT GATAACAGAC TTCTTCCCTG AAGACATTAC TGTGGAGTGG 1201 CAGTGGAATG GGCAGCCAGC GGAGAACTAC AAGAACACTC AGCCCATCAT 1251 GGACACAGAT GGCTCTTACT TCATCTACAG CAAGCTCAAT GTGCAGAAGA 1301 GCAACTGGGA GGCAGGAAAT ACTTTCACCT GCTCTGTGTT ACATGAGGGC 1351 CTGCACAACC ACCATACTGA GAAGAGCCTC TCCCACTCTC CTGGTAAATG 1401 A (SEQ ID n°.: 172) Ab-9 As sequências da Anticorpo 9 (também referido aqui como Ab-9) LC e HC são como segue: Ab-9 Cadeia leve: Sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab- 9 LC: 1 DIQMTQITSS LSASLGDRVS ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTFKLLIFY 51 TSRLFSGVPS RFSGSGSGTD YSLTIYNLEQ EDFATYFCQQ GDTLPYTFGG 101 GTKVEIKRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA SVVCFLNNFY PKDINVKWKI 151 DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT LTKDEYERHN SYTCEATHKT 201 STSPIVKSFNRNEC (SEQ ID n°.: 173) Sequência de ácidos nucléicos codificando a forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-9 LC: 1 GATATCCAGA TGACACAGAT TACATCCTCC CTGTCTGCCT CTCTGGGAGA 51 CAGGGTCTCC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA AGACATTAGC AATTATTTAA 101 ATTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT TATCTTCTAC 151 ACATCAAGAT TATTTTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC 201 TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTTACAA CCTGGAGCAA GAAGATTTTG 251 CCACTTACTT TTGCCAACAG GGAGATACGC TTCCGTACAC TTTCGGAGGG 301 GGGACCAAGG TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA CTGTATCCAT 351 CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC TCAGTCGTGT 401 GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA GTGGAAGATT 451 GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA CTGATCAGGA 501 CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG TTGACCAAGG 551 ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC TCACAAGACA 601 TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT GT (SEQ ID n°.: 174) Sequência de aminoácidos de Ab-9 LC incluindo peptídeo sinal: 1 MMSSAQFLGL LLLCFQGTRC DIQMTQITSS LSASLGDRVS ISCRASQDIS 51 NYLNWYQQKP DGTFKLLIFY TSRLFSGVPS RFSGSGSGTD YSLTIYNLEQ 101 EDFATYFCQQ GDTLPYTFGG GTKVEIKRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA 151 SVVCFLNNFY PKDINVKWKI DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT 201 LTKDEYERHN SYTCEATHKT STSPIVKSFN RNEC (SEQ ID n°.: 175) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-9 LC incluindo a sequência de codificação de peptídeo sinal: 1 ATGATGTCCT CTGCTCAGTT CCTTGGTCTC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG 51 TACCAGATGT GATATCCAGA TGACACAGAT TACATCCTCC CTGTCTGCCT 101 CTCTGGGAGA CAGGGTCTCC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA AGACATTAGC 151 AATTATTTAA ATTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT 201 TATCTTCTAC ACATCAAGAT TATTTTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG 251 GCAGTGGGTC TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTTACAA CCTGGAGCAA 301 GAAGATTTTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGAGATACGC TTCCGTACAC 351 TTTCGGAGGG GGGACCAAGG TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA 401 CTGTATCCAT CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC 451 TCAGTCGTGT GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA 501 GTGGAAGATT GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA 551 CTGATCAGGA CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG 601 TTGACCAAGG ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC 651 TCACAAGACA TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT 701 GT (SEQ ID n°.: 176) Ab-9 Cadeia pesada: Sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab- 9 HC: 1 EVQLQQSGPE LMKPGTSVKM SCKASGYTFT DYNMHWVKQT QGKTLEWIGE 51 INPNSGGAGY NQKFKGKATL TVDKSSTTAY MELRSLTSED SAVYYCAKLG 101 YDDIYDDWYF DVWGAGTTVT YSSAKTTAPS VYPLAPVCGD TTGSSVTLGC 151 LVKGYFPEPV TLTWNSGSLS SDVHTFPALL QSGLYTLSSS VTVTTWPSQT 201 ITCNVAHPAS STKVDKKIEP RGSPTHKPCP PCPAPNLLGG PSVFIFPPKI 251 KDVLMISLSP MVTCVVVDVS EDDPDVHVSW FVNNVEVHTA QTQTHREDYN 301 STIRVVSALP IQHQDWMSGK EFKCKVNNKA LPAPIERTIS KPKGPVRAPQ 351 VYVLPPPEEE MTKKQVTLTC MITDFMPEDI YVEWTNNGQT ELNYKNTEPV 401 LDSDGSYFMY SKLRVEKKNW VERNSYSCSV VHEGLHNHHT TKSFSRTPGK (SEQ ID n°.: 177) Sequência de ácidos nucléicos codificando a forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-9 HC: 1 GAGGTCCAAC TGCAACAGTC TGGACCTGAA CTAATGAAGC CTGGGACTTC 51 AGTGAAGATG TCCTGCAAGG CTTCTGGATA TACATTCACT GACTACAACA 101 TGCACTGGGT GAAGCAGACC CAAGGAAAGA CCCTAGAGTG GATAGGAGAA 151 ATTAATCCTA ACAGTGGTGG TGCTGGCTAC AACCAGAAGT TCAAGGGCAA 201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AGTCCTCCAC CACAGCCTAC ATGGAGCTCC 251 GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAAATTGGGC 301 TACGATGATA TCTACGACGA CTGGTATTTC GATGTCTGGG GCGCAGGGAC 351 CACGGTCACC GTCTCCTCAG CCAAAACAAC AGCCCCATCG GTCTATCCAC 401 TGGCCCCTGT GTGTGGAGAT ACAACTGGCT CCTCGGTGAC TCTAGGATGC 451 CTGGTCAAGG GTTATTTCCC TGAGCCAGTG ACCTTGACCT GGAACTCTGG 501 ATCCCTGTCC AGTGATGTGC ACACCTTCCC AGCTCTCCTG CAGTCTGGCC 551 TCTACACCCT CAGCAGCTCA GTGACTGTAA CCACCTGGCC CAGCCAGACC 601 ATCACCTGCA ATGTGGCCCA CCCGGCAAGC AGCACCAAAG TGGACAAGAA 651 AATTGAGCCC AGAGGGTCCC CAACACATAA ACCCTGTCCT CCATGCCCAG 701 CTCCTAACCT CTTGGGTGGA CCATCCGTCT TCATCTTCCC TCCAAAGATC 751 AAGGATGTAC TCATGATCTC CCTGAGCCCC ATGGTCACGT GTGTGGTGGT 801 GGATGTGAGC GAGGATGACC CAGATGTCCA TGTCAGCTGG TTCGTGAACA 851 ACGTGGAAGT ACACACAGCT CAGACACAAA CCCATAGAGA GGATTACAAC 901 AGTACTATCC GGGTGGTCAG TGCCCTCCCC ATCCAGCACC AGGACTGGAT 951 GAGTGGCAAG GAGTTCAAAT GCAAGGTCAA CAACAAAGCC CTCCCAGCGC 1001 CCATCGAGAG AACCATCTCA AAACCCAAAG GGCCAGTAAG AGCTCCACAG 1051 GTATATGTCT TGCCTCCACC AGAAGAAGAG ATGACTAAGA AACAGGTCAC 1101 TCTGACCTGC ATGATCACAG ACTTCATGCC TGAAGACATT TACGTGGAGT 1151 GGACCAACAA CGGGCAAACA GAGCTAAACT ACAAGAACAC TGAACCAGTC 1201 CTGGACTCTG ATGGTTCTTA CTTCATGTAC AGCAAGCTGA GAGTGGAAAA 1251 GAAGAACTGG GTGGAAAGAA ATAGCTACTC CTGTTCAGTG GTCCACGAGG 1301 GTCTGCACAA TCACCACACG ACTAAGAGCT TCTCCCGGAC TCCGGGTAAA (SEQ ID n°.: 178) Sequência de aminoácidos de Ab-9 HC incluindo peptídeo sinal: 1 MGWSWTFLFL LSGTAGVLSE VQLQQSGPEL MKPGTSVKMS CKASGYTFTD 51 YNMHWVKQTQ GKTLEWIGEI NPNSGGAGYN QKFKGKATLT VDKSSTTAYM 101 ELRSLTSEDS AVYYCAKLGY DDIYDDWYFD VWGAGTTVTV SSAKTTAPSV 151 YPLAPVCGDT TGSSVTLGCL VKGYFPEPVT LTWNSGSLSS DVHTFPALLQ 201 SGLYTLSSSV TVTTWPSQTI TCNVAHPASS GSPTHKPCPP 251 CPAPNLLGGP SVFIFPPKIK DVLMISLSPM DDPDVHVSWF 301 VNNVEVHTAQ TQTHREDYNS TIRVVSALPI FKCKVNNKAL 351 PAPIERTISK PKGPVRAPQV YVLPPPEEEM ITDFMPEDIY 401 VEWTNNGQTE LNYKNTEPVL DSDGSYFMYS ERNSYSCSVV 451 HEGLHNHHTT KSFSRTPGK (SEQ ID n°.: 179) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-9 HC incluindo codificação de peptídeo sinal: 1 ATGGGATGGA GCTGGACCTT TCTCTTCCTC CTGCAGGTGT 51 CCTCTCTGAG GTCCAACTGC AACAGTCTGG ATGAAGCCTG 101 GGACTTCAGt GAAGATGTCC TGCAAGGCTT ATTCACTGAC 151 TACAACATGC ACTGGGTGAA GCAGACCCAA TAGAGTGGAT 201 AGGAGAAATT AATCCTAACA GTGGTGGTGC CAGAAGTTCA 251 AGGGCAAGGC CACATTGACT GTAGACAAGT AGCCTACATG 301 GAGCTCCGCA GCCTGACATC TGAGGACTCT ACTGTGCAAA 351 ATTGGGCTAC GATGATATCT ACGACGACTG GTCTGGGGCG 401 CAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCAGCCA CCCATCGGTC 451 TATCCACTGG CCCCTGTGTG TGGAGATACA CGGTGACTCT 501 AGGATGCCTG GTCAAGGGTT ATTTCCCTGA TTGACCTGGA 551 ACTCTGGATC CCTGTCCAGT GATGTGCACA TCTCCTGCAG 601 TCTGGCCTCT ACACCCTCAG CAGCTCAGTG CCTGGCCCAG 651 CCAGACCATC ACCTGCAATG TGGCCCACCC ACCAAAGTGG 701 ACAAGAAAAT TGAGCCCAGA GGGTCCCCAA CTGTCCTCCA 751 TGCCCAGCTC CTAACCTCTT GGGTGGACCA TCTTCCCTCC 801 AAAGATCAAG GATGTACTCA TGATCTCCCT GTCACGTGTG 851 TGGTGGTGGA TGTGAGCGAG GATGACCCAG CAGCTGGTTC 901 GTGAACAACG TGGAAGTACA CACAGCTCAG ATAGAGAGGA 951 TTACAACAGT ACTATCCGGG TGGTCAGTGC CAGCACCAGG 1001 ACTGGATGAG TGGCAAGGAG TTCAAATGCA CAAAGCCCTC 1051 CCAGCGCCCA TCGAGAGAAC CATCTCAAAA CCCAAAGGGC CAGTAAGAGC 1101 TCCACAGGTA TATGTCTTGC CTCCACCAGA AGAAGAGATG ACTAAGAAAC 1151 AGGTCACTCT GACCTGCATG ATCACAGACT TCATGCCTGA AGACATTTAC 1201 GTGGAGTGGA CCAACAACGG GCAAACAGAG CTAAACTACA AGAACACTGA 1251 ACCAGTCCTG GACTCTGATG GTTCTTACTT CATGTACAGC AAGCTGAGAG 1301 TGGAAAAGAA GAACTGGGTG GAAAGAAATA GCTACTCCTG TTCAGTGGTC 1351 CACGAGGGTC TGCACAATCA CCACACGACT AAGAGCTTCT CCCGGACTCC 1401 GGGTAAA (SEQ ID n°.:180) Ab-IO As sequências da Anticorpo 10 (também referido aqui como Ab-10) LC e HC são como segue: Ab-10 Cadeia leve: Sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-10 LC: 1 DIQMTQTTSS LSASLGDRVS ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTFKLLIFY 51 TSRLLSGVPS RFSGSGSGTD YSLTIYNLEQ EDFATYFCQQ GDTLPYTFGG 101 GTKLEIKRAD AAPTVSIFPL SSEQLTSGGA SVVCFLNNFY PKDINVKWKI 151 DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT LTKDEYERH NSYTCEATHKT 201 STSPLVKSFNRNEC (SEQ ID n°.: 181) Sequência de ácidos nucléicos codificando a forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-10 LC: 1 GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT CTCTGGGAGA 51 CAGGGTCTCC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA AGACATTAGC AATTATTTAA 101 ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT TATCTTCTAC 151 ACATCAAGAT TACTCTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC 201 TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTTACAA CCTGGAGCAA GAAGATTTTG 251 CCACTTACTT TTGCCAACAG GGAGATACGC TTCCGTACAC TTTCGGAGGG 301 GGGACCAAAC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA CTGTATCCAT 351 CTTCCCACTA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC TCAGTCGTGT 401 GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA GTGGAAGATT 451 GATGGCAGTG XACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA CTGATCAGGA 501 CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG TTGACCAAGG 551 ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC TCACAAGACA 601 TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT GTTAG (SEQ ID n°.: 182) Sequência de aminoácidos de Ab-10 LC incluindo peptídeo sinal: 1 MMSSAQFLGL LLLCFQGTRC DIQMTQTTSS LSASLGDRVS ISCRASQDIS 51 NYLNWYQQKP DGTFKLLIFY TSRLLSGVPS RFSGSGSGTD YSLTIYNLEQ 101 EDFATYFCQQ GDTLPYTFGG GTKLEIKRAD AAPTVSIFPL SSEQLTSGGA 151 SVVCFLNNFY PKDINVKWKI DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT 201 LTKDEYERHN SYTCEATHKT STSPIVKSFN RNEC (SEQ ID n°.: 183) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-10 LC incluindo a sequência de codificação de peptídeo sinal: 1 ATGATGTCCT CTGCTCAGTT CCTTGGTCTC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG 51 TACCAGATGT GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT 101 CTCTGGGAGA CAGGGTCTCC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA AGACATTAGC 151 AATTATTTAA ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT 201 TATCTTCTAC ACATCAAGAT TACTCTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG 251 GCAGTGGGTC TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTTACAA CCTGGAGCAA 301 GAAGATTTTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGAGATACGC TTCCGTACAC 351 TTTCGGAGGG GGGACCAAAC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA 401 CTGTATCCAT CTTCCCACTA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC 451 TCAGTCGTGT GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA 501 GTGGAAGATT GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA 551 CTGATCAGGA CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG 601 TTGACCAAGG ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC 651 TCACAAGACA TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT 701 GTTAG (SEQ ID n°.:184) Ab-10 Cadeia pesada: Sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab- 10 HC: 1 EVQLQQSGPE LMKPGASVKM SCKASGYTFT DYNMHWVKQN QGKTLEWIGE 51 INPNSGGAGY NQKFKGKATL TVDKSSTTAY MELRSLTSED SAVYYCARLG 101 YDDIYDDWYF DVWGAGTTVT YSSAKTTPPS VYPLAPGSAA QTNSMVTLGC 151 LVKGYFPEPV TVTWNSGSLS SGVHTFPAVL QSDLYTLSSS VTVPSSTWPS 201 ETVTCNVAHP ASSTKVDKKI VPRDCGCKPC ICTVPEVSSV FIFPPKPKDV 251 LTITLTPKVT CVVVDISKDD PEVQFSWFVD DVEVHTAQTQ PREEQFNSTF 301 RSVSELPIMH QDWLNGKEFK CRVNSAAFPA PIEKTISKTK GRPKAPQVYT 351 IPPPKEQMAK DKVSLTCMIT DFFPEDITVE WQWNGQPAEN YKNTQPIMDT 401 DGSYFIYSKL NVQKSNWEAG NTFTCSVLHE GLHNHHTEKS LSHSPGK(SEQ ID n°.: 185) Sequência de ácidos nucléicos codificando a forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-10 HC: 1 GAGGTCCAAC TGCAACAGTC TGGACCTGAA CTAATGAAGC CTGGGGCTTC 51 AGTGAAGATG TCCTGCAAGG CTTCTGGATA TACATTCACT GACTACAACA 101 TGCACTGGGT GAAGCAGAAC CAAGGAAAGA CCCTAGAATG GATAGGAGAA 151 ATTAATCCTA ACAGTGGTGG TGCTGGCTAC AACCAGAAGT TCAAGGGCAA 201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AGTCCTCCAC CACAGCCTAC ATGGAGCTCC 251 GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGATTGGGC 301 TACGATGATA TCTACGACGA CTGGTACTTC GATGTCTGGG GCGCAGGGAC 351 CACGGTCACC GTCTCCTCAG CCAAAACGAC ACCCCCATCT GTCTATCCAC 401 TGGCCCCTGG ATCTGCTGCC CAAACTAACT CCATGGTGAC CCTGGGATGC 451 CTGGTCAAGG GCTATTTCCC TGAGCCAGTG ACAGTGACCT GGAACTCTGG 501 ATCCCTGTCC AGCGGTGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTG CAGTCTGACC 551 TCTACACTCT GAGCAGCTCA GTGACTGTCC CCTCCAGCAC CTGGCCCAGC 601 GAGACCGTCA CCTGCAACGT TGCCCACCCG GCCAGCAGCA CCAAGGTGGA 651 CAAGAAAATT GTGCCCAGGG ATTGTGGTTG TAAGCCTTGC ATATGTACAG 701 TCCCAGAAGT ATCATCTGTC TTCATCTTCC CCCCAAAGCC CAAGGATGTG 751 CTCACCATTA CTCTGACTCC TAAGGTCACG TGTGTTGTGG TAGACATCAG 801 CAAGGATGAT CCCGAGGTCC AGTTCAGCTG GTTTGTAGAT GATGTGGAGG 851 TGCACACAGC TCAGACGCAA CCCCGGGAGG AGCAGTTCAA CAGCACTTTC 901 CGCTCAGTCA GTGAACTTCC CATCATGCAC CAGGACTGGC TCAATGGCAA 951 GGAGTTCAAA TGCAGGGTCA ACAGTGCAGC TTTCCCTGCC CCCATCGAGA 1001 AAACCATCTC CAAAACCAAA GGCAGACCGA AGGCTCCACA GGTGTACACC 1051 ATTCCACCTC CCAAGGAGCA GATGGCCAAG GATAAAGTCA GTCTGACCTG 1101 CATGATAACA GACTTCTTCC CTGAAGACAT TACTGTGGAG TGGCAGTGGA 1151 ATGGGCAGCC AGCGGAGAAC TACAAGAACA CTCAGCCCAT CATGGACACA 1201 GATGGCTCTT ACTTCATCTA CAGCAAGCTC AATGTGCAGA AGAGCAACTG 1251 GGAGGCAGGA AATACTTTCA CCTGCTCTGT GTTACATGAG GGCCTGCACA 1301 ACCACCATAC TGAGAAGAGC CTCTCCCACT CTCCTGGTAA ATGA (SEQ ID n°.: 186) Sequência de aminoácidos de Ab-10 HC incluindo peptídeo sinal: 1 MGWSWTFLFL LSGTAGVLSE VQLQQSGPEL MKPGASVKMS CKASGYTFTD 51 YNMHWVKQNQ GKTLEWIGEI NPNSGGAGYN QKFKGKATLT VDKSSTTAYM 101 ELRSLTSEDS AVYYCARLGY DDIYDDWYFD VWGAGTTVTV SSAKTTPPSV 151 YPLAPGSAAQ TNSMVTLGCL VKGYFPEPVT VTWNSGSLSS GVHTFPAVLQ 201 SDLYTLSSSV TVPSSTWPSE TVTCNVAHPA SSTKVDKKIV PRDCGCKPCI 251 CTVPEVSSVF IFPPKPKDVL TITLTPKVTC VVVDISKDDP EVQFSWFVDD 301 VEVHTAQTQP REEQFNSTFR SVSELPIMHQ DWLNGKEFKC RVNSAAFPAP 351 IEKTISKTKG RPKAPQVYTI PPPKEQMAKD FFPEDITVEW 401 QWNGQPAENY KNTQPIMDTD GSYFIYSKLN TFTCSVLHEG 451 LHNHHTEKSL SHSPGK (SEQ ID n°.: 187) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-10 HC incluindo codificação de peptídeo sinal: 1 ATGGGATGGA GCTGGACCTT TCTCTTCCTC CTGCAGGTGT 51 CCTCTCTGAG GTCCAACTGC AACAGTCTGG ATGAAGCCTG 101 GGGCTTCAGT GAAGATGTCC TGCAAGGCTT ATTCACTGAC 151 TACAACATGC ACTGGGTGAA GCAGAACCAA TAGAATGGAT 201 AGGAGAAATT AATCCTAACA GTGGTGGTGC CAGAAGTTCA 251 AGGGCAAGGC CACATTGACT GTAGACAAGT AGCCTACATG 301 GAGCTCCGCA GCCTGACATC TGAGGACTCT ACTGTGCAAG 351 ATTGGGCTAC GATGATATCT ACGACGACTG GTCTGGGGCG 401 CAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCAGCCA CCCATCTGTC 451 TATCCACTGG CCCCTGGATC TGCTGCCCAA TGGTGACCCT 501 GGGATGCCTG GTCAAGGGCT ATTTCCCTGA GTGACCTGGA 551 ACTCTGGATC CCTGTCCAGC GGTGTGCACA TGTCCTGCAG 601 TCTGACCTCT ACACTCTGAG CAGCTCAGTG CCAGCACCTG 651 GCCCAGCGAG ACCGTCACCT GCAACGTTGC AGCAGCACCA 701 AGGTGGACAA GAAAATTGTG CCCAGGGATT GCCTTGCATA 751 TGTACAGTCC CAGAAGTATC ATCTGTCTTC CAAAGCCCAA 801 GGATGTGCTC ACCATTACTC TGACTCCTAA GTTGTGGTAG 851 ACATCAGCAA GGATGATCCC GAGGTCCAGT TGTAGATGAT 901 GTGGAGGTGC ACACAGCTCA GACGCAACCC AGTTCAACAG 951 CACTTTCCGC TCAGTCAGTG AACTTCCCAT GACTGGCTCA 1001 ATGGCAAGGA GTTCAAATGC AGGGTCAACA CCCTGCCCCC 1051 ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AACCAAAGGC CTCCACAGGT 1101 GTACACCATT CCACCTCCCA AGGAGCAGAT AAAGTCAGTC 1151 TGACCTGCAT GATAACAGAC TTCTTCCCTG TGTGGAGTGG 1201 CAGTGGAATG GGCAGCCAGC GGAGAACTAC AAGAACACTC AGCCCATCAT 1251 GGACACAGAT GGCTCTTACT TCATCTACAG CAAGCTCAAT GTGCAGAAGA 1301 GCAACTGGGA GGCAGGAAAT ACTTTCACCT GCTCTGTGTT ACATGAGGGC 1351 CTGCACAACC ACCATACTGA GAAGAGCCTC TCCCACTCTC CTGGTAAATG 1401 A (SEQ ID n°.: 188) Ab-11 As sequências da Anticorpo 11 (também referido aqui como Ab-11) LC e HC são como segue: Ab-11 Cadeia leve: Sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab- 11 LC: 1 QIVLSQSPAF LSVSPGDKVT MTCRASSSIS YIHWFQQKPG SSPRSWIYAT 51 SNLASGVPGR FSGSGSGTSY SLTISRVEAE DAATYYCQQW SSDPLTFGAG 101 TKLELKRADA APTVSIFPPS SEQLTSGGAS VVCFLNNFYP KDINVKWKID 151 GSERQNGVLN SWTDQDSKDS TYSMSSTLTL TKDEYERHNS YTCEATHKTS 201 TSPIVKSFNR NEC (SEQ ID n°.: 189) Sequência de ácidos nucléicos codificando a forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-11 LC: 1 CAAATTGTTC TCTCCCAGTC TCCAGCATTC CTGTCTGTAT CTCCAGGGGA 51 TAAGGTCACA ATGACTTGCA GGGCCAGCTC AAGTATAAGT TACATACACT 101 GGTTTCAGCA GAAGCCAGGA TCCTCCCCCA GATCCTGGAT TTATGCCACA 151 TCCAACCTGG CTTCTGGAGT CCCTGGTCGC TTCAGTGGCA GTGGGTCTGG 201 GACCTCTTAC TCTCTCACAA TCAGCAGAGT GGAGGCTGAG GATGCTGCCA 251 CTTATTACTG CCAGCAGTGG AGTAGTGACC CACTCACGTT CGGTGCTGGG 301 ACCAAGCTGG AGCTGAAACG GGCTGATGCT GCACCAACTG TATCCATCTT 351 CCCACCATCC AGTGAGCAGT TAACATCTGG AGGTGCCTCA GTCGTGTGCT 401 TCTTGAACAA CTTCTACCCC AAAGACATCA ATGTCAAGTG GAAGATTGAT 451 GGCAGTGAAC GACAAAATGG CGTCCTGAAC AGTTGGACTG ATCAGGACAG 501 CAAAGACAGC ACCTACAGCA TGAGCAGCAC CCTCACGTTG ACCAAGGACG 551 AGTATGAACG ACATAACAGC TATACCTGTG AGGCCACTCA CAAGACATCA 601 ACTTCACCCA TTGTCAAGAG CTTCAACAGG AATGAGTGTT AG (SEQ ID n°.: 190) Sequência de aminoácidos de Ab-1l LC incluindo peptídeo sinal: 1 MDFQVQIFSF LLISASVIMS RGQIVLSQSP AFLSVSPGDK VTMTCRASSS 51 ISYIHWFQQK PGSSPRSWIY ATSNLASGVP GRFSGSGSGT SYSLTISRVE 101 AEDAATYYCQ QWSSDPLTFG AGTKLELKRA DAAPTVSIFP PSSEQLTSGG 151 ASVVCFLNNF YPKDINVKWK IDGSERQNGV LNSWTDQDSK DSTYSMSSTL 201 TLTKDEYERH NSYTCEATHK TSTSPIVKSF NRNEC (SEQ ID n°.:191) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-11 LC incluindo a sequência de codificação de peptídeo sinal: 1 ATGGATTTTC AAGTGCAGAT TTTCAGCTTC CTGCTAATCA GTGCTTCAGT 51 CATAATGTCC AGAGGACAAA TTGTTCTCTC CCAGTCTCCA GCATTCCTGT 101 CTGTATCTCC AGGGGATAAG GTCACAATGA CTTGCAGGGC CAGCTCAAGT 151 ATAAGTTACA TACACTGGTT TCAGCAGAAG CCAGGATCCT CCCCCAGATC 201 CTGGATTTAT GCCACATCCA ACCTGGCTTC TGGAGTCCCT GGTCGCTTCA 251 GTGGCAGTGG GTCTGGGACC TCTTACTCTC TCACAATCAG CAGAGTGGAG 301 GCTGAGGATG CTGCCACTTA TTACTGCCAG CAGTGGAGTA GTGACCCACT 351 CACGTTCGGT GCTGGGACCA AGCTGGAGCT GAAACGGGCT GATGCTGCAC 401 CAACTGTATC CATCTTCCCA CCATCCAGTG AGCAGTTAAC ATCTGGAGGT 451 GCCTCAGTCG TGTGCTTCTT GAACAACTTC TACCCCAAAG ACATCAATGT 501 CAAGTGGAAG ATTGATGGCA GTGAACGACA AAATGGCGTC CTGAACAGTT 551 GGACTGATCA GGACAGCAAA GACAGCACCT ACAGCATGAG CAGCACCCTC 601 ACGTTGACCA AGGACGAGTA TGAACGACAT AACAGCTATA CCTGTGAGGC 651 CACTCACAAG ACATCAACTT CACCCATTGT CAAGAGCTTC AACAGGAATG 701 AGTGTTAG (SEQ ID n°.: 192) Ab-11 Cadeia pesada: Sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab- 11 HC: 1 EVQLQQSGAD LVQPGASVKV SCTASGFDIK DYYIHWMKQR PDQGLEWIGR 51 VbPDNGETEF APKFPGKATF TTDTSSNTAY LQLRGLTSED TAIYYCGRED 101 YDGTYTWFPY WGQGTLVTVS AAKTTPPSVY PLAPGSAAQT NSMVTLGCLV 151 KGYFPEPVTV TWNSGSLSSG VHTFPAVLQS DLYTLSSSVT VPSSTWPSET 201 VTCNVAHPAS STKVDKKIVP RDCGCKPCLC TVPEVSSVFI FPPKPKDVLT 251 ITLTPKVTCV VVDISKDDPE VQFSWFVDDV EVHTAQTQPR EEQFNSTFRS 301 VSELPIMHQD WLNGKEFKCR VNSAAFPAPI EKTISKTKGR PKAPQVYTIP 351 PPKEQMAKDK VSLTCMITDF FPEDITVEWQ WNGQPAENYK NTQPIMDTDG 401 SYFIYSKLNV QKSNWEAGNT FTCSVLHEGL HNHHTEKSLS HSPGK(SEQ ID n°.: 193) Sequência de ácidos nucléicos codificando a forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-11 HC: 1 GAAGTTCAGC TGCAACAGTC TGGGGCAGAC CTTGTGCAGC CAGGGGCCTC 51 AGTCAAGGTG TCCTGCACAG CTTCTGGCTT CGACATTAAG GACTACTATA 101 TACACTGGAT GAAACAGAGG CCTGACCAGG GCCTGGAGTG GATTGGAAGG 151 GTTGATCCTG ACAATGGTGA GACTGAATTT GCCCCGAAGT TCCCGGGCAA 201 GGCCACTTTT ACAACAGACA CATCCTCCAA CACAGCCTAC CTACAACTCA 251 GAGGCCTGAC ATCTGAGGAC ACTGCCATCT ATTACTGTGG GAGAGAAGAC 301 TACGATGGTA CCTACACCTG GTTTCCTTAT TGGGGCCAAG GGACTCTGGT 351 CACTGTCTCT GCAGCCAAAA CGACACCCCC ATCTGTCTAT CCACTGGCCC 401 CTGGATCTGC TGCCCAAACT AACTCCATGG TGACCCTGGG ATGCCTGGTC 451 AAGGGCTATT TCCCTGAGCC AGTGACAGTG CTGGATCCCT 501 GTCCAGCGGT GTGCACACCT TCCCAGCTGT GACCTCTACA 551 CTCTGAGCAG CTCAGTGACT GTCCCCTCCA CAGCGAGACC 601 GTCACCTGCA ACGTTGCCCA CCCGGCCAGC TGGACAAGAA 651 AATTGTGCCC AGGGATTGTG GTTGTAAGCC ACAGTCCCAG 701 AAGTATCATC TGTCTTCATC TTCCCCCCAA TGTGCTCACC 751 ATTACTCTGA CTCCTAAGGT CACGTGTGTT TCAGCAAGGA 801 TGATCCCGAG GTCCAGTTCA GCTGGTTTGT GAGGTGCACA 851 CAGCTCAGAC GCAACCCCGG GAGGAGCAGT TTTCCGCTCA 901 GTCAGTGAAC TTCCCATCAT GCACCAGGAC GCAAGGAGTT 951 CAAATGCAGG GTCAACAGTG CAGCTTTCCC GAGAAAACCA 1001 TCTCCAAAAC CAAAGGCAGA CCGAAGGCTC CACCATTCCA 1051 CCTCCCAAGG AGCAGATGGC CAAGGATAAA CCTGCATGAT 1101 AACAGACTTC TTCCCTGAAG ACATTACTGT TGGAATGGGC 1151 AGCCAGCGGA GAACTACAAG AACACTCAGC CCATCATGGA CACAGATGGC 1201 TCTTACTTCA TCTACAGCAA GCTCAATGTG CAGAAGAGCA ACTGGGAGGC 1251 AGGAAATACT TTCACCTGCT CTGTGTTACA TGAGGGCCTG CACAACCACC 1301 ATACTGAGAA GAGCCTCTCC CACTCTCCTG GTAAATGA (SEQ ID n°.:194) Sequência de aminoácidos de Ab-11 HC incluindo peptídeo sinal: 1 MKCSWVIFFL MAVVTGVNSE VQLQQSGADL VQPGASVKVS CTASGFDIKD 51 YYIHWMKQRP DQGLEWIGRV DPDNGETEFA PKFPGKATFT TDTSSNTAYL 101 QLRGLTSEDT AIYYCGREDY DGTYTWFPYW GQGTLVTVSA AKTTPPSVYP 151 LAPGSAAQTN SMVTLGCLVK GYFPEPVTVT WNSGSLSSGV HTFPAVLQSD 201 LYTLSSSVTV PSSTWPSETV TCNVAHPASS TKVDKKIVPR DCGCKPCICT 251 VPEVSSVFIF PPKPKDVLTI TLTPKVTCVV VDISKDDPEV QFSWFVDDVE 301 VHTAQTQPRE EQFNSTFRSV SELPIMHQDW LNGKEFKCRV NSAAFPAPIE 351 KTISKTKGRP KAPQVYTIPP PKEQMAKDKV SLTCMITDFF PEDITVEWQW 401 NGQPAENYKN TQPIMDTDGS YFIYSKLNVQ KSNWEAGNTF TCSVLHEGLH 451 NHHTEKSLSH SPGK (SEQ ID n°.: 195) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-11 HC incluindo codificação de peptídeo sinal: 1 ATGAAATGCA GCTGGGTCAT CTTCTTCCTG TTACAGGGGT 51 CAATTCAGAA GTTCAGCTGC AACAGTCTGG GTGCAGCCAG 101 GGGCCTCAGT CAAGGTGTCC TGCACAGCTT CATTAAGGAC 151 TACTATATAC ACTGGATGAA ACAGAGGCCT TGGAGTGGAT 201 TGGAAGGGTT GATCCTGACA ATGGTGAGAC CCGAAGTTCC 251 CGGGCAAGGC CACTTTTACA ACAGACACAT AGCCTACCTA 301 CAACTCAGAG GCCTGACATC TGAGGACACT ACTGTGGGAG 351 AGAAGACTAC GATGGTACCT ACACCTGGTT GGCCAAGGGA 401 CTCTGGTCAC TGTCTCTGCA GCCAAAACGA TGTCTATCCA 451 CTGGCCCCTG GATCTGCTGC CCAAACTAAC CCCTGGGATG 501 CCTGGTCAAG GGCTATTTCC CTGAGCCAGT TGGAACTCTG 551 GATCCCTGTC CAGCGGTGTG CACACCTTCC GCAGTCTGAC 601 CTCTACACTC TGAGCAGCTC AGTGACTGTC CCCTCCAGCA CCTGGCCCAG 651 CGAGACCGTC ACCTGCAACG TTGCCCACCC GGCCAGCAGC ACCAAGGTGG 701 ACAAGAAAAT TGTGCCCAGG GATTGTGGTT GTAAGCCTTG CATATGTACA 751 GTCCCAGAAG TATCATCTGT CTTCATCTTC CCCCCAAAGC CCAAGGATGT 801 GCTCACCATT ACTCTGACTC CTAAGGTCAC GTGTGTTGTG GTAGACATCA 851 GCAAGGATGA TCCCGAGGTC CAGTTCAGCT GGTTTGTAGA TGATGTGGAG 901 GTGCACACAG CTCAGACGCA ACCCCGGGAG GAGCAGTTCA ACAGCACTTT 951 CCGCTCAGTC AGTGAACTTC CCATCATGCA CCAGGACTGG CTCAATGGCA 1001 AGGAGTTCAA ATGCAGGGTC AACAGTGCAG CTTTCCCTGC CCCCATCGAG 1051 AAAACCATCT CCAAAACCAA AGGCAGACCG AAGGCTCCAC AGGTGTACAC 1101 CATTCCACCT CCCAAGGAGC AGATGGCCAA GGATAAAGTC AGTCTGACCT 1151 GCATGATAAC AGACTTCTTC CCTGAAGACA TTACTGTGGA GTGGCAGTGG 1201 AATGGGCAGC CAGCGGAGAA CTACAAGAAC ACTCAGCCCA TCATGGACAC 1251 AGATGGCTCT TACTTCATCT ACAGCAAGCT CAATGTGCAG AAGAGCAACT 1301 GGGAGGCAGG AAATACTTTC ACCTGCTCTG TGTTACATGA GGGCCTGCAC 1351 AACCACCATA CTGAGAAGAG CCTCTCCCAC TCTCCTGGTA AATGA (SEQ ID n°.: 196) Ab-12 As sequências de Anticorpo 12 (também referido aqui como Ab-12) LC e HC são como segue: Ab-12 Cadeia leve: Sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab- 12 LC: 1 DLQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIFY 51 TSTLQSGVPS RFSGSGSGTN YSLTITNLEQ DDAATYFCQQ GDTLPYTFGG 101 GTKLEIKRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA SVVCFLNNFY PKDINVKWKI 151 DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT LTKDEYERHN SYTCEATHKT 201 STSPIVKSFNRNEC (SEQ ID n°.: 197) Sequência de ácidos nucléicos codificando a forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-12 LC: 1 GATCTCCAGA TGACACAGAC TACTTCCTCC CTGTCTGCCT CTCTGGGAGA 51 CAGAGTCACC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA GGACATTAGC AATTATTTAA 101 ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTG TTAAGCTCCT GATCTTCTAC 151 ACATCAACAT TACAGTCAGG AGTCCCATCG AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC 201 TGGAACAAAT TATTCTCTCA CCATTACCAA CCTGGAGCAA GATGATGCTG 251 CCACTTACTT TTGCCAACAG GGTGATACGC TTCCGTACAC GTTCGGAGGG 301 GGGACCAAGC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA CTGTATCCAT 351 CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC TCAGTCGTGT 401 GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA GTGGAAGATT 451 GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA CTGATCAGGA 501 CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG TTGACCAAGG 551 ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC TCACAAGACA 601 TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT GTTAG (SEQ ID NO: 198) Sequência de aminoácidos de Ab-12 LC incluindo peptídeo sinal: 1 MMSSAQFLGL LLLCFQGSRC DLQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS 51 NYLNWYQQKP DGTVKLLIFY TSTLQSGVPS RFSGSGSGTN YSLTITNLEQ 101 DDAATYFCQQ GDTLPYTFGG GTKLEIKRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA 151 SVVCFLNNFY PKDINVKWKI DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT 201 LTKDEYERHN SYTCEATHKT STSPIVKSFN RNEC (SEQ ID n°.: 199) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-12 LC incluindo a sequência de codificação de peptídeo sinal: 1 ATGATGTCCT CTGCTCAGTT CCTTGGTCTC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG 51 TTCCAGATGT GATCTCCAGA TGACACAGAC TACTTCCTCC CTGTCTGCCT 101 CTCTGGGAGA CAGAGTCACC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA GGACATTAGC 151 AATTATTTAA XCTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTG TTAAGCTCCT 201 GATCTTCTAC ACATCAACAT TACAGTCAGG AGTCCCATCG AGGTTCAGTG 251 GCAGTGGGTC TGGAACAAAT TATTCTCTCA CCATTACCAA CCTGGAGCAA 301 GATGATGCTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGTGATACGC TTCCGTACAC 351 GTTCGGAGGG GGGACCAAGC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA 401 CTGTATCCAT CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC 451 TCAGTCGTGT GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA 501 GTGGAAGATT GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA 551 CTGATCAGGA CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG 601 TTGACCAAGG ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC 651 TCACAAGACA TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT 701 GTTAG (SEQ ID n°.:200) Ab-12 Cadeia pesada: Sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab- 12 HC: 1 EVQLQQSGPE LMKPGASVKM SCKASGYTFT DYNMHWMKQN QGKSLEWIGE 51 INPNSGGSGY NQKFKGKATL TVDKSSSTAY MELRSLTSED SAVYYCARLG 101 YYGNYEPWYF DVWGAGTTVT VSSAKTTPPS VYPLAPGSAA QTNSMVTLGC 151 LVKGYFPEPV TVTWNSGSLS SGVHTFPAVL QSDLYTLSSS VTVPSSTWPS 201 ETVTCNVAHP ASSTKVDKKI VPRDCGCKPC ICTVPEVSSV FIFPPKPKDV 251 LTITLTPKVT CVVVDISKDD PEVQFSWFVD DVEVHTAQTQ PREEQFNSTF 301 RSVSELPIMH QDWLNGKEFK CRVNSAAFPA PIEKTISKTK GRPKAPQVYT 351 IPPPKEQMAK DKVSLTCMIT DFFPEDITVE WQWNGQPAEN YKNTQPIMDT 401 DGSYFIYSKL NVQKSNWEAG NTFTCSVLHE GLHNHHTEKS LSHSPGK (SEQ ID n°.:201) Sequência de ácidos nucléicos codificando a forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-12 HC: 1 GAGGTCCAGT TGCAACAGTC TGGACCTGAA CTAATGAAGC CTGGGGCTTC 51 AGTGAAGATG TCCTGCAAGG CTTCTGGATA CACATTCACT GACTACAACA 101 TGCACTGGAT GAAGCAGAAC CAAGGAAAGA GCCTAGAGTG GATAGGAGAG 151 ATTAATCCTA ACAGTGGTGG TTCTGGTTAC AACCAGAAGT TCAAAGGCAA 201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AGTCCTCCAG CACAGCCTAC ATGGAGCTCC 251 GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGATTGGGC 301 TACTATGGTA ACTACGAGGA CTGGTATTTC GATGTCTGGG GCGCAGGGAC 351 CACGGTCACC GTCTCCTCTG CCAAAACGAC ACCCCCATCT GTCTATCCAC 401 TGGCCCCTGG ATCTGCTGCC CAAACTAACT CCATGGTGAC CCTGGGATGC 451 CTGGTCAAGG GCTATTTCCC TGAGCCAGTG ACAGTGACCT GGAACTCTGG 501 ATCCCTGTCC AGCGGTGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTG CAGTCTGACC 551 TCTACACTCT GAGCAGCTCA GTGACTGTCC CTGGCCCAGC 601 GAGACCGTCA CCTGCAACGT TGCCCACCCG CCAAGGTGGA 651 CAAGAAAATT GTGCCCAGGG ATTGTGGTTG ATATGTACAG 701 TCCCAGAAGT ATCATCTGTC TTCATCTTCC CAAGGATGTG 751 CTCACCATTA CTCTGACTCC TAAGGTCACG TAGACATCAG 801 CAAGGATGAT CCCGAGGTCC AGTTCAGCTG GATGTGGAGG 851 TGCACACAGC TCAGACGCAA CCCCGGGAGG CAGCACTTTC 901 CGCTCAGTCA GTGAACTTCC CATCATGCAC TCAATGGCAA 951 GGAGTTCAAA TGCAGGGTCA ACAGTGCAGC CCCATCGAGA 1001 AAACCATCTC CAAAACCAAA GGCAGACCGA GGTGTACACC 1051 ATTCCACCTC CCAAGGAGCA GATGGCCAAG GTCTGACCTG 1101 CATGATAACA GACTTCTTCC CTGAAGACAT TGGCAGTGGA 1151 ATGGGCAGCC AGCGGAGAAC TACAAGAACA CATGGACACA 1201 GATGGCTCTT ACTTCATCTA CAGCAAGCTC AGAGCAACTG 1251 GGAGGCAGGA AATACTTTCA CCTGCTCTGT GTTACATGAG GGCCTGCACA 1301 ACCACCATAC TGAGAAGAGC CTCTCCCACT CTCCTGGTAA ATGA (SEQ ID n°.:202) Sequência de aminoácidos de Ab-12 HC incluindo peptídeo sinal: 1 MGWSWTFLFL LSGTSGVLSE VQLQQSGPEL MKPGASVKMS CKASGYTFTD 51 YNMHWMKQNQ GKSLEWIGEI NPNSGGSGYN QKFKGKATLT VDKSSSTAYM 101 ELRSLTSEDS AVYYCARLGY YGNYEDWYFD VWGAGTTVTV SSAKTTPPSV 151 YPLAPGSAAQ TNSMVTLGCL VKGYFPEPVT VTWNSGSLSS GVHTFPAVLQ 201 SDLYTLSSSV TVPSSTWPSE TVTCNVAHPA SSTKVDKKIV PRDCGCKPCI 251 CTVPEVSSVF IFPPKPKDVL TITLTPKVTC VVVDISKDDP EVQFSWFVDD 301 VEVHTAQTQP REEQFNSTFR SVSELPIMHQ DWLNGKEFKC RVNSAAFPAP 351 IEKTISKTKG RPKAPQVYTI PPPKEQMAKD KVSLTCMITD FFPEDITVEW 401 QWNGQPAENY KNTQPIMDTD GSYFIYSKLN VQKSNWEAGN TFTCSVLHEG 451 LHNHHTEKSL SHSPGK (SEQ ID n°.:203) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-12 HC incluindo a sequência de codificação de peptídeo sinal: 1 ATGGGATGGA GCTGGACCTT TCTCTTCCTC CTTCGGGTGT 51 CCTCTCTGAG GTCCAGTTGC AACAGTCTGG ATGAAGCCTG 101 GGGCTTCAGT GAAGATGTCC TGCAAGGCTT ATTCACTGAC 151 TACAACATGC ACTGGATGAA GCAGAACCAA TAGAGTGGAT 201 AGGAGAGATT AATCCTAACA GTGGTGGTTC CAGAAGTTCA 251 AAGGCAAGGC CACATTGACT GTAGACAAGT AGCCTACATG 301 GAGCTCCGCA GCCTGACATC TGAGGACTCT ACTGTGCAAG 351 ATTGGGCTAC TATGGTAACT ACGAGGACTG GTCTGGGGCG 401 CAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCTGCCA CCCATCTGTC 451 TATCCACTGG CCCCTGGATC TGCTGCCCAA TGGTGACCCT 501 GGGATGCCTG GTCAAGGGCT ATTTCCCTGA GTGACCTGGA 551 ACTCTGGATC CCTGTCCAGC GGTGTGCACA TGTCCTGCAG 601 TCTGACCTCT ACACTCTGAG CAGCTCAGTG CCAGCACCTG 651 GCCCAGCGAG ACCGTCACCT GCAACGTTGC AGCAGCACCA 701 AGGTGGACAA GAAAATTGTG CCCAGGGATT GTGGTTGTAA GCCTTGCATA 751 TGTACAGTCC CAGAAGTATC ATCTGTCTTC ATCTTCCCCC CAAAGCCCAA 801 GGATGTGCTC ACCATTACTC TGACTCCTAA GGTCACGTGT GTTGTGGTAG 851 ACATCAGCAA GGATGATCCC GAGGTCCAGT TCAGCTGGTT TGTAGATGAT 901 GTGGAGGTGC ACACAGCTCA GACGCAACCC CGGGAGGAGC AGTTCAACAG 951 CACTTTCCGC TCAGTCAGTG AACTTCCCAT CATGCACCAG GACTGGCTCA 1001 ATGGCAAGGA GTTCAAATGC AGGGTCAACA GTGCAGCTTT CCCTGCCCCC 1051 ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AACCAAAGGC AGACCGAAGG CTCCACAGGT 1101 GTACACCATT CCACCTCCCA AGGAGCAGAT GGCCAAGGAT AAAGTCAGTC 1151 TGACCTGCAT GATAACAGAC TTCTTCCCTG AAGACATTAC TGTGGAGTGG 1201 CAGTGGAATG GGCAGCCAGC GGAGAACTAC AAGAACACTC AGCCCATCAT 1251 GGACACAGAT GGCTCTTACT TCATCTACAG CAAGCTCAAT GTGCAGAAGA 1301 GCAACTGGGA GGCAGGAAAT ACTTTCACCT GCTCTGTGTT ACATGAGGGC 1351 CTGCACAACC ACCATACTGA GAAGAGCCTC TCCCACTCTC CTGGTAAATG 1401 A (SEQ ID n°.:204) Ab-13 As sequências da Anticorpo 13 (também referido aqui como Ab-13) LC e HC são como segue: Ab-13 Cadeia leve: Sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-13 LC: 1 QIVLTQSPAI MSASPGEKVT MTCRASSSVT SSYLNWYQQK PGSSPKLWIY NSYTCEATHK 201 TSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID n°.:205) Sequência de ácidos nucléicos codificando a forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-13 LC: 1 CAGATTGTTC TCACCCAGTC TCCAGCAATC ATGTCTGCAT CTCCAGGGGA 51 GAAGGTCACC ATGACCTGCA GGGCCAGCTC AAGTGTAACT TCCAGTTACT 101 TGAACTGGTA CCAGCAGAAG CCAGGATCTT CCCCCAAACT CTGGATTTAT 151 AGCACATCCA ACCTGGCTTC AGGAGTCCCA GCTCGCTTCA GTGGCAGTGG 201 GTCTGGGACC TCTTACTCTC TCACAATCAG CAGTGTGGAG GCTGAGGATG 251 CTGCCACTTA TTACTGCCAG CAGTATGATT TTTTCCCATC GACGTTCGGT 301 GGAGGCACCA AGCTGGAAAT CAAGCGGGCT GATGCTGCAC CAACTGTATC 351 CATCTTCCCA CCATCCAGTG AGCAGTTAAC ATCTGGAGGT GCCTCAGTCG 401 TGTGCTTCTT GAACAACTTC TACCCCAAAG ACATCAATGT CAAGTGGAAG 451 ATTGATGGCA GTGAACGACA AAATGGCGTC CTGAACAGTT GGACTGATCA 501 GGACAGCAAA GACAGCACCT ACAGCATGAG CAGCACCCTC ACGTTGACCA 551 AGGACGAGTA TGAACGACAT AACAGCTATA CCTGTGAGGC CACTCACAAG 601 ACATCAACTT CACCCATCGT CAAGAGCTTC AACAGGAATG AGTGT (SEQ ID n°:206) Sequência de aminoácidos de Ab-13 LC incluindo peptídeo sinal: 1 MDSQVQIFSF LLISALVKMS RGQIVLTQSP AIMSASPGEK VTMTCRASSS 51 VTSSYLNWYQ QKPGSSPKLW IYSTSNLASG VPARFSGSGS GTSYSLTISS 101 VEAEDAATYY CQQYDFFPST FGGGTKLEIK RADAAPTVSI FPPSSEQLTS 151 GGASVVCFLN NFYPKDINVK WKIDGSERQN GVLNSWTDQD SKDSTYSMSS 201 TLTLTKDEYE RHNSYTCEAT HKTSTSPIVK SFNRNEC (SEQ ID n°.:207) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-13 LC incluindo a sequência de codificação de peptídeo sinal: 1 ATGGATTCTC AAGTGCAGAT TTTCAGCTTC GTGCCTTAGT 51 CAAAATGTCC AGAGGACAGA TTGTTCTCAC GCAATCATGT 101 CTGCATCTCC AGGGGAGAAG GTCACCATGA CAGCTCAAGT 151 GTAACTTCCA GTTACTTGAA CTGGTACCAG GATCTTCCCC 201 CAAACTCTGG ATTTATAGCA CATCCAACCT GTCCCAGCTC 251 GCTTCAGTGG CAGTGGGTCT GGGACCTCTT AATCAGCAGT 301 GTGGAGGCTG AGGATGCTGC CACTTATTAC ATGATTTTTT 351 CCCATCGACG TTCGGTGGAG GCACCAAGCT CGGGCTGATG 401 CTGCACCAAC TGTATCCATC TTCCCACCAT GTTAACATCT 451 GGAGGTGCCT CAGTCGTGTG CTTCTTGAAC CCAAAGACAT 501 CAATGTCAAG TGGAAGATTG ATGGCAGTGA GGCGTCCTGA 551 ACAGTTGGAC TGATCAGGAC AGCAAAGACA CATGAGCAGC 601 ACCCTCACGT TGACCAAGGA CGAGTATGAA GCTATACCTG 651 TGAGGCCACT CACAAGACAT CAACTTCACC CATCGTCAAG AGCTTCAACA 701 GGAATGAGTG T (SEQ ID n°.:208) Ab-13 Cadeia pesada: Sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab- 13 HC: 1 EVQLQQSGPE LVKPGASVKM SCKASGYTFT DYYMNWVKQS HGESLEWIGD 51 INPYNDDTTY NHKFKGKATL TVDKSSNTAY MQLNSLTSED SAVYYCARET 101 AVITTNAMDY WGQGTSVTVS SAKTTPPSVY PLAPGSAAQT NSMVTLGCLV 151 KGYFPEPVTV TWNSGSLSSG VHTFPAVLQS DLYTLSSSVT VPSSTWPSET 201 VTCNVAHPAS STKVDKKIVP RDCGCKPCLC TVPEVSSVFI FPPKPKDVLT 251 ITLTPKVTCV VVDISKDDPE VQFSWFVDDV EVHTAQTQPR EEQFNSTFRS 301 VSELPIMHQD WLNGKEFKCR VNSAAFPAPI EKTISKTKGR PKAPQVYTIP 351 PPKEQMAKDK VSLTCMITDF FPEDITVEWQ WNGQPAENYK NTQPIMDTDG 401 SYFIYSKLNV QKSNWEAGNT FTCSVLHEGL HNHHTEKSLS HSPGK (SEQ ID n°.:209) Sequência de ácidos nucléicos codificando a forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-13 HC: 1 GAGGTCCAGC TGCAACAATC TGGACCTGAG CTGGTGAAGC CTGGGGCTTC 51 AGTGAAGATG TCCTGTAAGG CTTCTGGATA CACATTCACT GACTACTACA 101 TGAACTGGGT GAAGCAGAGC CATGGAGAGA GCCTTGAGTG GATTGGAGAT 151 ATTAATCCTT ACAACGATGA TACTACCTAC AACCACAAGT TCAAGGGCAA 201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AATCCTCCAA CACAGCCTAC ATGCAGCTCA 251 ACAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGAGAGACG 301 GCCGTTATTA CTACGAATGC TATGGACTAC TGGGGTCAAG GAACCTCAGT 351 CACCGTCTCC TCAGCCAAAA CGACACCCCC ATCTGTCTAT CCACTGGCCC 401 CTGGATCTGC TGCCCAAACT AACTCCATGG TGACCCTGGG ATGCCTGGTC 451 AAGGGCTATT TCCCTGAGCC AGTGACAGTG ACCTGGAACT CTGGATCCCT 501 GTCCAGCGGT GTGCACACCT TCCCAGCTGT CCTGCAGTCT GACCTCTACA 551 CTCTGAGCAG CTCAGTGACT GTCCCCTCCA GCACCTGGCC CAGCGAGACC 601 GTCACCTGCA ACGTTGCCCA CCCGGCCAGC AGCACCAAGG TGGACAAGAA 651 AATTGTGCCC AGGGATTGTG GTTGTAAGCC TTGCATATGT ACAGTCCCAG 701 AAGTATCATC TGTCTTCATC TTCCCCCCAA AGCCCAAGGA TGTGCTCACC 751 ATTACTCTGA CTCCTAAGGT CACGTGTGTT GTGGTAGACA TCAGCAAGGA 801 TGATCCCGAG GTCCAGTTCA GCTGGTTTGT AGATGATGTG GAGGTGCACA 851 CAGCTCAGAC GCAACCCCGG GAGGAGCAGT TCAACAGCAC TTTCCGCTCA 901 GTCAGTGAAC TTCCCATCAT GCACCAGGAC TGGCTCAATG GCAAGGAGTT 951 CAAATGCAGG GTCAACAGTG CAGCTTTCCC TGCCCCCATC GAGAAAACCA 1001 TCTCCAAAAC CAAAGGCAGA CCGAAGGCTC CACAGGTGTA CACCATTCCA 1051 CCTCCCAAGG AGCAGATGGC CAAGGATAAA GTCAGTCTGA CCTGCATGAT 1101 AACAGACTTC TTCCCTGAAG ACATTACTGT GGAGTGGCAG TGGAATGGGC 1151 AGCCAGCGGA GAACTACAAG AACACTCAGC CCATCATGGA CACAGATGGC 1201 TCTTACTTCA TCTACAGCAA GCTCAATGTG CAGAAGAGCA ACTGGGAGGC 1251 AGGAAATACT TTCACCTGCT CTGTGTTACA TGAGGGCCTG CACAACCACC 1301 ATACTGAGAA GAGCCTCTCC CACTCTCCTG GTAAA (SEQ ID n°.:210) Sequência de aminoácidos de Ab-13 HC incluindo peptídeo sinal: 1 MGWNWIFLFL LSGTAGVYSE VQLQQSGPEL VKPGASVKMS CKASGYTFTD 51 YYMNWVKQSH GESLEWIGDI NPYNDDTTYN HKFKGKATLT VDKSSNTAYM 101 QLNSLTSEDS AVYYCARETA VITTNAMDYW GQGTSVTVSS AKTTPPSVYP 151 LAPGSAAQTN SMVTLGCLVK GYFPEPVTVT WNSGSLSSGV HTFPAVLQSD 201 LYTLSSSVTV PSSTWPSETV TCNVAHPASS TKVDKKIVPR DCGCKPCICT 251 VPEVSSVFIF PPKPKDVLTI TLTPKVTCVV VDISKDDPEV QFSWFVDDVE 301 VHTAQTQPRE EQFNSTFRSV SELPIMHQDW LNGKEFKCRV NSAAFPAPIE 351 KTISKTKGRP KAPQVYTIPP PKEQMAKDKV SLTCMITDFF PEDITVEWQW 401 NGQPAENYKN TQPIMDTDGS YFIYSKLNVQ KSNWEAGNTF TCSVLHEGLH 451 NHHTEKSLSH SPGK (SEQ ID n°.:211) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-13 HC incluindo a sequência de codificação de peptídeo sinal: 1 ATGGGATGGA ACTGGATCTT TCTCTTCCTC TTGTCAGGAA CTGCAGGTGT 51 CTACTCTGAG GTCCAGCTGC AACAATCTGG ACCTGAGCTG GTGAAGCCTG 101 GGGCTTCAGT GAAGATGTCC TGTAAGGCTT CTGGATACAC ATTCACTGAC 151 TACTACATGA ACTGGGTGAA GCAGAGCCAT TTGAGTGGAT 201 TGGAGATATT AATCCTTACA ACGATGATAC CACAAGTTCA 251 AGGGCAAGGC CACATTGACT GTAGACAAAT AGCCTACATG 301 CAGCTCAACA GCCTGACATC TGAGGACTCT ACTGTGCAAG 351 AGAGACGGCC GTTATTACTA CGAATGCTAT GGTCAAGGAA 401 CCTCAGTCAC CGTCTCCTCA GCCAAAACGA TGTCTATCCA 451 CTGGCCCCTG GATCTGCTGC CCAAACTAAC CCCTGGGATG 501 CCTGGTCAAG GGCTATTTCC CTGAGCCAGT TGGAACTCTG 551 GATCCCTGTC CAGCGGTGTG CACACCTTCC GCAGTCTGAC 601 CTCTACACTC TGAGCAGCTC AGTGACTGTC CCTGGCCCAG 651 CGAGACCGTC ACCTGCAACG TTGCCCACCC ACCAAGGTGG 701 ACAAGAAAAT TGTGCCCAGG GATTGTGGTT CATATGTACA 751 GTCCCAGAAG TATCATCTGT CTTCATCTTC CCAAGGATGT 801 GCTCACCATT ACTCTGACTC CTAAGGTCAC GTAGACATCA 851 GCAAGGATGA TCCCGAGGTC CAGTTCAGCT GGTTTGTAGA TGATGTGGAG 901 GTGCACACAG CTCAGACGCA ACCCCGGGAG GAGCAGTTCA ACAGCACTTT 951 CCGCTCAGTC AGTGAACTTC CCATCATGCA CCAGGACTGG CTCAATGGCA 1001 AGGAGTTCAA ATGCAGGGTC AACAGTGCAG CTTTCCCTGC CCCCATCGAG 1051 AAAACCATCT CCAAAACCAA AGGCAGACCG AAGGCTCCAC AGGTGTACAC 1101 CATTCCACCT CCCAAGGAGC AGATGGCCAA GGATAAAGTC AGTCTGACCT 1151 GCATGATAAC AGACTTCTTC CCTGAAGACA TTACTGTGGA GTGGCAGTGG 1201 AATGGGCAGC CAGCGGAGAA CTACAAGAAC ACTCAGCCCA TCATGGACAC 1251 AGATGGCTCT TACTTCATCT ACAGCAAGCT CAATGTGCAG AAGAGCAACT 1301 GGGAGGCAGG AAATACTTTC ACCTGCTCTG TGTTACATGA GGGCCTGCAC 1351 AACCACCATA CTGAGAAGAG CCTCTCCCAC TCTCCTGGTA AA (SEQ ID n°.:212) Ab-13 foi humanizado para gerar Ab-14. As sequências da Anticorpo 14 (também referido aqui como Ab-14) LC e HC são como segue: Ab-14 Cadeia leve: Sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab- 14 LC: 1 DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASSSVT SSYLNWYQQK PGKAPKLLIY 51 STSNLASGVP SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PEDFATYYCQ QYDFFPSTFG 101 GGTKVEIKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT ASCCCLLNNF YPREAKVQWK 151 VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL TLSKADYEKH KVYACEVTHQ 201 GLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID n°.:213) Sequência de ácidos nucléicos codificando a forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-14 LC: 1 GACATCCAGC TGACCCAGAG CCCCAGCTTC CTTTCCGCAT CCGTTGGTGA 51 CCGAGTAACA ATCACATGCC GCGCCTCATC TTCAGTTACA TCTTCTTATC 101 TTAATTGGTA TCAACAAAAA CCAGGAAAAG CACCTAAACT TCTTATATAC 151 TCTACATCTA ATCTCGCATC AGGAGTTCCC TCTCGATTTT CAGGATCTGG 201 ATCAGGCACA GAATTTACAC TTACTATATC ATCACTCCAA CCAGAAGACT 251 TCGCCACTTA TTACTGCCAA CAATACGATT TTTTTCCAAG CACATTCGGA 301 GGAGGTACAA AAGTAGAAAT CAAGCGTACG GTGGCTGCAC CATCTGTCTT 351 CATCTTCCCG CCATCTGATG AGCAGTTGAA ATCTGGAACT GCCTCTGTTG 401 TGTGCCTGCT GAATAACTTC TATCCCAGAG AGGCCAAAGT ACAGTGGAAG 451 GTGGATAACG CCCTCCAATC GGGTAACTCC CAGGAGAGTG TCACAGAGCA 501 GGACAGCAAG GACAGCACCT ACAGCCTCAG CAGCACCCTG ACGCTGAGCA 551 AAGCAGACTA CGAGAAACAC AAAGTCTACG CCTGCGAAGT CACCCATCAG 601 GGCCTGAGCT CGCCCGTCAC AAAGAGCTTC AACAGGGGAG AGTGT (SEQ ID n°.:214) Sequência de aminoácidos de Ab-14 LC incluindo peptídeo sinal: 1 MDMRVPAQLL GLLLLWLPGA RCDIQLTQSP SFLSASVGDR VTITCRASSS 51 VTSSYLNWYQ QKPGKAPKLL IYSTSNLASG VPSRFSGSGS GTEFTLTISS 101 LQPEDFATYY CQQYDFFPST FGGGTKVEIK RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS 151 GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS 201 TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC (SEQ ID n°.:215) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-14 LC incluindo a sequência de codificação de peptídeo sinal: 1 ATGGACATGA GGGTCCCCGC TCAGCTCCTG GGGCTCCTGC TACTCTGGCT 51 CCCAGGTGCC AGATGTGACA TCCAGCTGAC CCAGAGCCCC AGCTTCCTTT 101 CCGCATCCGT TGGTGACCGA GTAACAATCA CATGCCGCGC CTCATCTTCA 151 GTTACATCTT CTTATCTTAA TTGGTATCAA CAAAAACCAG GAAAAGCACC 201 TAAACTTCTT ATATACTCTA CATCTAATCT CGCATCAGGA GTTCCCTCTC 251 GATTTTCAGG ATCTGGATCA GGCACAGAAT TTACACTTAC TATATCATCA 301 CTCCAACCAG AAGACTTCGC CACTTATTAC TGCCAACAAT ACGATTTTTT 351 TCCAAGCACA TTCGGAGGAG GTACAAAAGT AGAAATCAAG CGTACGGTGG 401 CTGCACCATC TGTCTTCATC TTCCCGCCAT CTGATGAGCA GTTGAAATCT 451 GGAACTGCCT CTGTTGTGTG CCTGCTGAAT AACTTCTATC CCAGAGAGGC 501 CAAAGTACAG TGGAAGGTGG ATAACGCCCT CCAATCGGGT AACTCCCAGG 551 AGAGTGTCAC AGAGCAGGAC AGCAAGGACA GCACCTACAG CCTCAGCAGC 601 ACCCTGACGC TGAGCAAAGC AGACTACGAG AAACACAAAG TCTACGCCTG 651 CGAAGTCACC CATCAGGGCC TGAGCTCGCC CGTCACAAAG AGCTTCAACA 701 GGGGAGAGTG T (SEQ ID n°.:216) Ab-14 Cadeia pesada: Sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab- 14 HC: 1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DYYMNWVRQA PGQRLEWMGD 51 INPYNDDTTY NHKFKGRVTI TRDTSASTAY MELSSLRSED TAVYYCARET 101 AVITTNAMDY WGQGTTVTVS SASTKGPSVF PLAPCSRSTS ESTAALGCLV 151 KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSNFGTQ 201 TYTCNVDHKP SNTKVDKTVE RKCCVECPPC PAPPVAGPSV FLFPPKPKDT 251 LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTF 301 RVVSVLTVVH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPA PIEKTISKTK GQPREPQVYT 351 LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPMLDS 401 DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK (SEQ ID n°.:217) Sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab- 14 HC sem terminal carbóxi-lisina: 1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DYYMNWVRQA PGQRLEWMGD 51 INPYNDDTTY NHKFKGRVTI TRDTSASTAY MELSSLRSED TAVYYCARET 101 AVITTNAMDY WGQGTTVTVS SASTKGPSVF PLAPCSRSTS ESTAALGCLV 151 KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSNFGTQ 201 TYTCNVDHKP SNTKVDKTVE RKCCVECPPC PAPPVAGPSV FLFPPKPKDT 251 LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTKP REEQFNSTF 301 RVVSVLTVVH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPA PIEKTISKTK GQPREPQVYT 351 LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPMLDS 401 DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG (SEQ ID n°.:393) Sequência de ácidos nucléicos codificando a forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-14 HC: 1 GAGGTGCAGC TGGTGCAGAG CGGCGCCGAG GTCAAGAAAC CTGGAGCAAG 51 CGTAAAGGTT AGTTGCAAAG CATCTGGATA CACATTTACC GACTACTACA 101 TGAATTGGGT ACGACAAGCC CCTGGACAAA GACTTGAATG GATGGGAGAC 151 ATTAACCCTT ATAACGACGA CACTACATAC AATCATAAAT TTAAAGGAAG 201 AGTTACAATT ACAAGAGATA CATCCGCATC AACCGCCTAT ATGGAACTTT 251 CCTCATTGAG ATCTGAAGAC ACTGCTGTTT ATTACTGTGC AAGAGAAACT 301 GCCGTTATTA CTACTAACGC TATGGATTAC TGGGGTCAAG GAACCACTGT 351 TACCGTCTCT AGTGCCTCCA CCAAGGGCCC CCCCTGGCGC 401 CCTGCTCCAG GAGCACCTCC GAGAGCACAG CTGCCTGGTC 451 AAGGACTACT TCCCCGAACC GGTGACGGTG CAGGCGCTCT 501 GACCAGCGGC GTGCACACCT TCCCAGCTGT TCAGGACTCT 551 ACTCCCTCAG CAGCGTGGTG ACCGTGCCCT CGGCACCCAG 601 ACCTACACCT GCAACGTAGA TCACAAGCCC AGGTGGACAA 651 GACAGTTGAG CGCAAATGTT GTGTCGAGTG CCAGCACCAC 701 CTGTGGCAGG ACCGTCAGTC TTCCTCTTCC CAAGGACACC 751 CTCATGATCT CCCGGACCCC TGAGGTCACG TGGACGTGAG 801 CCACGAAGAC CCCGAGGTCC AGTTCAACTG GGCGTGGAGG 851 TGCATAATGC CAAGACAAAG CCACGGGAGG CAGCACGTTC 901 CGTGTGGTCA GCGTCCTCAC CGTTGTGCAC TGAACGGCAA 951 GGAGTACAAG TGCAAGGTCT CCAACAAAGG CCCATCGAGA 1001 AAACCATCTC CAAAACCAAA GGGCAGCCCC GGTGTACACC 1051 CTGCCCCCAT CCCGGGAGGA GATGACCAAG AACCAGGTCA GCCTGACCTG 1101 CCTGGTCAAA GGCTTCTACC CCAGCGACAT CGCCGTGGAG TGGGAGAGCA 1151 ATGGGCAGCC GGAGAACAAC TACAAGACCA CACCTCCCAT GCTGGACTCC 1201 GACGGCTCCT TCTTCCTCTA CAGCAAGCTC ACCGTGGACA AGAGCAGGTG 1251 GCAGCAGGGG AACGTCTTCT CATGCTCCGT GATGCATGAG GCTCTGCACA 1301 ACCACTACAC GCAGAAGAGC CTCTCCCTGT CTCCGGGTAA A (SEQ ID n°.:218) Sequência de aminoácidos de Ab-14 HC incluindo peptídeo sinal: 1 MDWTWRILFL VAAATGAHSE VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTD 51 YYMNWVRQAP GQRLEWMGDI NPYNDDTTYN HKFKGRVTIT RDTSASTAYM 101 ELSSLRSEDT AVYYCARETA VITTNAMDYW GQGTTVTVSS ASTKGPSVFP 151 LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS 201 GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KCCVECPPCP 251 APPVAGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVQFNWYVDG 301 VEVHNAKTKP REEQFNSTFR VVSVLTVVHQ DWLNGKEYKC KVSNKGLPAP 351 IEKTISKTKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN FYPSDIAVEW 401 ESNGQPENNY KTTPPMLDSD GSFFLYSKLT VFSCSVMHEA 451 LHNHYTQKSL SLSPGK (SEQ ID n°.:219) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-14 HC incluindo codificação de peptídeo sinal: 1 ATGGACTGGA CCTGGAGGAT CCTCTTCTTG CCACAGGAGC 51 CCACTCCGAG GTGCAGCTGG TGCAGAGCGG AAGAAACCTG 101 GAGCAAGCGT AAAGGTTAGT TGCAAAGCAT ATTTACCGAC 151 TACTACATGA ATTGGGTACG ACAAGCCCCT TTGAATGGAT 201 GGGAGACATT AACCCTTATA ACGACGACAC CATAAATTTA 251 AAGGAAGAGT TACAATTACA AGAGATACAT CGCCTATATG 301 GAACTTTCCT CATTGAGATC TGAAGACACT ACTGTGCAAG 351 AGAAACTGCC GTTATTACTA CTAACGCTAT GGTCAAGGAA 401 CCACTGTTAC CGTCTCTAGT GCCTCCACCA GGTCTTCCCC 451 CTGGCGCCCT GCTCCAGGAG CACCTCCGAG CCCTGGGCTG 501 CCTGGTCAAG GACTACTTCC CCGAACCGGT GACGGTGTCG TGGAACTCAG 551 GCGCTCTGAC CAGCGGCGTG CACACCTTCC CAGCTGTCCT ACAGTCCTCA 601 GGACTCTACT CCCTCAGCAG CGTGGTGACC GTGCCCTCCA GCAACTTCGG 651 CACCCAGACC TACACCTGCA ACGTAGATCA CAAGCCCAGC AACACCAAGG 701 TGGACAAGAC AGTTGAGCGC AAATGTTGTG TCGAGTGCCC ACCGTGCCCA 751 GCACCACCTG TGGCAGGACC GTCAGTCTTC CTCTTCCCCC CAAAACCCAA 801 GGACACCCTC ATGATCTCCC GGACCCCTGA GGTCACGTGC GTGGTGGTGG 851 ACGTGAGCCA CGAAGACCCC GAGGTCCAGT TCAACTGGTA CGTGGACGGC 901 GTGGAGGTGC ATAATGCCAA GACAAAGCCA CGGGAGGAGC AGTTCAACAG 951 CACGTTCCGT GTGGTCAGCG TCCTCACCGT TGTGCACCAG GACTGGCTGA 1001 ACGGCAAGGA GTACAAGTGC AAGGTCTCCA ACAAAGGCCT CCCAGCCCCC 1051 ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AACCAAAGGG CAGCCCCGAG AACCACAGGT 1101 GTACACCCTG CCCCCATCCC GGGAGGAGAT GACCAAGAAC CAGGTCAGCC 1151 TGACCTGCCT GGTCAAAGGC TTCTACCCCA GCGACATCGC CGTGGAGTGG 1201 GAGAGCAATG GGCAGCCGGA GAACAACTAC AAGACCACAC CTCCCATGCT 1251 GGACTCCGAC GGCTCCTTCT TCCTCTACAG CAAGCTCACC GTGGACAAGA 1301 GCAGGTGGCA GCAGGGGAAC GTCTTCTCAT GCTCCGTGAT GCATGAGGCT 1351 CTGCACAACC ACTACACGCA GAAGAGCCTC TCCCTGTCTC CGGGTAAA (SEQ ID n°.-220) As sequências CDR na região variável da cadeia pesada de Ab-14 são: CDR-H1 : DYYMN (SEQ ID n°.:296) CDR-H2: DINPYNDDTTYNHKFKG (SEQ ID n°.:297) CDR-H3 : ETAVITTNAMD (SEQ ID n°.:298) As sequências de região variável CDR de cadeia leve de Ab-14 são: CDR-L1 : RASSSVTSSYLN (SEQ ID n°.284) CDR-L2: STSNLAS (SEQ ID n°.:285) CDR-L3 : QQYDFFPST (SEQ ID n°.:286) Ab-14 Domínio variável: Sequência de aminoácidos de Ab-14 de cadeia leve de domínio variável (sem sequência sinal): 1 DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASSSVT SSYLNWYQQK PGKAPKLLIY 51 STSNLASGVP SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PEDFATYYCQ QYDFFPSTFG 101 GGTKVEIK (SEQ ID n°.:380) Sequência de DNA de Ab-14 de cadeia leve de domínio variável(sem sequência sinal): 1 GACATCCAGC TGACCCAGAG CCCCAGCTTC CTTTCCGCAT CCGTTGGTGA 51 CCGAGTAACA ATCACATGCC GCGCCTCATC TTCAGTTACA TCTTCTTATC 101 TTAATTGGTA TCAACAAAAA CCAGGAAAAG CACCTAAACT TCTTATATAC 151 TCTACATCTA ATCTCGCATC AGGAGTTCCC TCTCGATTTT CAGGATCTGG 201 ATCAGGCACA GAATTTACAC TTACTATATC ATCACTCCAA CCAGAAGACT 251 TCGCCACTTA TTACTGCCAA CAATACGATT TTTTTCCAAG CACATTCGGA 301 GGAGGTACAA AAGTAGAAAT CAAG (SEQ ID n°.:381) Sequência de aminoácidos de Ab-14 de cadeia pesada de domínio variável (sem sequência sinal): 1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DYYMNWVRQA PGQRLEWMGD 51 INPYNDDTTY NHKFKGRVTI TRDTSASTAY MELSSLRSED TAVYYCARET 101 AVITTNAMDY WGQGTTVTVS S (SEQ ID n°.382) Sequência de DNA de Ab-14 de cadeia pesada de domínio variável(sem sequência sinal): 1 GAGGTGCAGC TGGTGCAGAG CGGCGCCGAG GTCAAGAAAC CTGGAGCAAG 51 CGTAAAGGTT AGTTGCAAAG CATCTGGATA CACATTTACC GACTACTACA 101 TGAATTGGGT ACGACAAGCC CCTGGACAAA GACTTGAATG GATGGGAGAC 151 ATTAACCCTT ATAACGACGA CACTACATAC AATCATAAAT TTAAAGGAAG 201 AGTTACAATT ACAAGAGATA CATCCGCATC AACCGCCTAT ATGGAACTTT 251 CCTCATTGAG ATCTGAAGAC ACTGCTGTTT ATTACTGTGC AAGAGAAACT 301 GCCGTTATTA CTACTAACGC TATGGATTAC TGGGGTCAAG GAACCACTGT 351 TACCGTCTCT AGT (SEQ ID n°.:383) Ab-3 foi humanizado para gerar Ab-15. Ab-15 As sequências da Anticorpo 15 (também referido aqui como Ab-15) LC e HC são como segue: Ab-15 Cadeia leve: Sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab- 15 LC: PGKAPKSLIY QWSSYPLTFG YPREAKVQWK KVYACEVTHQ 201 GLSSPVTKSF NRGEC(SEQ ID n°.:221) Sequência de ácidos nucléicos codificando a forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-15 LC: 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTCTCAGCAT CCGTAGGCGA 51 TAGAGTTACA ATAACATGCA GCGTATCATC AACTATATCA TCAAATCATC 101 TTCATTGGTT CCAACAGAAA CCCGGCAAAG CACCTAAATC ACTTATATAC 151 GGCACATCAA ATCTCGCATC AGGCGTTCCT TCAAGATTTT CAGGCTCTGG 201 CTCAGGCACC GACTTTACTC TTACAATATC CTCCCTCCAA CCCGAAGACT 251 TCGCAACCTA TTACTGTCAA CAATGGTCCT CATATCCACT CACATTTGGC 301 GGCGGCACAA AAGTAGAAAT TAAACGTACG GTGGCTGCAC CATCTGTCTT 351 CATCTTCCCG CCATCTGATG AGCAGTTGAA ATCTGGAACT GCCTCTGTTG 401 TGTGCCTGCT GAATAACTTC TATCCCAGAG AGGCCAAAGT ACAGTGGAAG 451 GTGGATAACG CCCTCCAATC GGGTAACTCC CAGGAGAGTG TCACAGAGCA 501 GGACAGCAAG GACAGCACCT ACAGCCTCAG CAGCACCCTG ACGCTGAGCA 551 AAGCAGACTA CGAGAAACAC AAAGTCTACG CCTGCGAAGT CACCCATCAG 601 GGCCTGAGCT CGCCCGTCAC AAAGAGCTTC AACAGGGGAG AGTGT (SEQ ID n°.:222) Sequência de aminoácidos de Ab-15 LC incluindo peptídeo sinal: 1 MDMRVPAQLL GLLLLWLRGA RCDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCSVSST 51 ISSNHLHWFQ QKPGKAPKSL IYGTSNLASG VPSRFSGSGS GTDFTLTISS 101 LQPEDFATYY CQQWSSYPLT FGGGTKVEIK RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS 151 GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS 201 TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC (SEQ ID n°.:223) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-15 LC incluindo a sequência de codificação de peptídeo sinal: 1 ATGGACATGA GGGTCCCCGC TCAGCTCCTG GGGCTCCTGC TACTCTGGCT 51 CCGAGGTGCC AGATGTGACA TCCAGATGAC CCAGTCTCCA TCCTCCCTCT 101 CAGCATCCGT AGGCGATAGA GTTACAATAA CATGCAGCGT ATCATCAACT 151 ATATCATCAA ATCATCTTCA TTGGTTCCAA CAGAAACCCG GCAAAGCACC 201 TAAATCACTT ATATACGGCA CATCAAATCT CGCATCAGGC GTTCCTTCAA 251 GATTTTCAGG CTCTGGCTCA GGCACCGACT TTACTCTTAC AATATCCTCC 301 CTCCAACCCG AAGACTTCGC AACCTATTAC TGTCAACAAT GGTCCTCATA 351 TCCACTCACA TTTGGCGGCG GCACAAAAGT AGAAATTAAA CGTACGGTGG 401 CTGCACCATC TGTCTTCATC TTCCCGCCAT CTGATGAGCA GTTGAAATCT 451 GGAACTGCCT CTGTTGTGTG CCTGCTGAAT AACTTCTATC CCAGAGAGGC 501 CAAAGTACAG TGGAAGGTGG ATAACGCCCT CCAATCGGGT AACTCCCAGG 551 AGAGTGTCAC AGAGCAGGAC AGCAAGGACA GCACCTACAG CCTCAGCAGC 601 ACCCTGACGC TGAGCAAAGC AGACTACGAG AAACACAAAG TCTACGCCTG 651 CGAAGTCACC CATCAGGGCC TGAGCTCGCC CGTCACAAAG AGCTTCAACA 701 GGGGAGAGTG T (SEQ ID n°.-224) Ab-15 Cadeia pesada Sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab- 15 HC. 1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASDFNIK DFYLHWVRQA PGQGLEWIGR 51 IDPENGDTLY DPKFQDKVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCAREA 101 DYFHDGTSYW YFDVWGRGTL YTVSSASTKG PSVFPLAPCS RSTSESTAAL 151 GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL SSVVTVPSSN 201 FGTQTYTCNV DHKPSNTKVD KTVERKCCVE CPPCPAPPVA GPSVFLFPPK 251 PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVQFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQF 301 NSTFRVVSVL TVVHQDWLNG KEYKCKVSNK GLPAPIEKTI SKTKGQPREP 351 QVYTLPPSRE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP 401 MLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG 451 JT(SEQ ID n°.:225) Sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab- 15 HC sem terminal carbóxi-lisina: 1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASDFNIK DFYLHWVRQA PGQGLEWIGR 51 IDPENGDTLY DPKFQDKVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCAREA 101 DYFHDGTSYW YFDVWGRGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPCS RSTSESTAAL 151 GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL SSVVTVPSSN 201 FGTQTYTCNV DHKPSNTKVD KTVERKCCVE CPPCPAPPVA GPSVFLFPPK 251 PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVQFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQF 301 NSTFRVVSVL TVVHQDWLNG KEYKCKVSNK GLPAPIEKTI SKTKGQPREP 351 QVYTLPPSRE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP 401 MLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG 451 (SEQ ID n°.:394) Sequência de ácidos nucléicos codificando a forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-15 HC: 1 GAGGTGCAGC TGGTGCAGTC TGGGGCTGAG GTGAAGAAGC CTGGGGCCTC 51 AGTGAAGGTC TCCTGCAAGG CTTCTGACTT CAACATTAAA GACTTCTATC 101 TACACTGGGT GCGACAGGCC CCTGGACAAG GGCTTGAGTG GATTGGAAGG 151 ATTGATCCTG AGAATGGTGA TACTTTATAT GACCCGAAGT TCCAGGACAA 201 GGTCACCATG ACCACAGACA CGTCCACCAG CACAGCCTAC ATGGAGCTGA 251 GGAGCCTGAG ATCTGACGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTGC GAGAGAGGCG 301 GATTATTTCC ACGATGGTAC CTCCTACTGG TACTTCGATG TCTGGGGCCG 351 TGGCACCCTG GTCACCGTCT CTAGTGCCTC CACCAAGGGC CCATCGGTCT 401 TCCCCCTGGC GCCCTGCTCC AGGAGCACCT CCGAGAGCAC AGCGGCCCTG 451 GGCTGCCTGG TCAAGGACTA CTTCCCCGAA CCGGTGACGG TGTCGTGGAA 501 CTCAGGCGCT CTGACCAGCG GCGTGCACAC GTCCTACAGT 551 CCTCAGGACT CTACTCCCTC AGCAGCGTGG CTCCAGCAAC 601 TTCGGCACCC AGACCTACAC CTGCAACGTA CCAGCAACAC 651 CAAGGTGGAC AAGACAGTTG AGCGCAAATG TGCCCACCGT 701 GCCCAGCACC ACCTGTGGCA GGACCGTCAG CCCCCCAAAA 751 CCCAAGGACA CCCTCATGAT CTCCCGGACC CGTGCGTGGT 801 GGTGGACGTG AGCCACGAAG ACCCCGAGGT TGGTACGTGG 851 ACGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA GGAGCAGTTC 901 AACAGCACGT TCCGTGTGGT CAGCGTCCTC ACCAGGACTG 951 GCTGAACGGC AAGGAGTACA AGTGCAAGGT GGCCTCCCAG 1001 CCCCCATCGA GAAAACCATC TCCAAAACCA CCGAGAACCA 1051 CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAG AGAACCAGGT 1101 CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA ATCGCCGTGG 1151 AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA CACACCTCCC 1201 ATGCTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TACAGCAAGC TCACCGTGGA 1251 CAAGAGCAGG TGGCAGCAGG GGAACGTCTT CTCATGCTCC GTGATGCATG 1301 AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACGCAGAAGA GCCTCTCCCT GTCTCCGGGT 1351 AAA (SEQ ID n°.:226) Sequência de aminoácidos de Ab-15 HC incluindo peptídeo sinal: 1 MDWTWRILFL VAAATGAHSE VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASDFNIKD 51 FYLHWVRQAP GQGLEWIGRI DPENGDTLYD PKFQDKVTMT TDTSTSTAYM 101 ELRSLRSDDT AVYYCAREAD YFHDGTSYWY FDVWGRGTLV TVSSASTKGP 151 SVFPLAPCSR STSESTAALG CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV 201 LQSSGLYSLS SVVTVPSSNF GTQTYTCNVD HKPSNTKVDK TVERKCCVEC 251 PPCPAPPVAG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVQFNW 301 YVDGVEVHNA KTKPREEQFN STFRVVSVLT VVHQDWLNGK EYKCKVSNKG 351 LPAPIEKTIS KTKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI 401 AVEWESNGQP ENNYKTTPPM LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV 451 MHEALHNHYT QKSLSLSPGK (SEQ ID n°.:227) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-15 HC incluindo codificação de peptídeo sinal: 1 ATGGACTGGA CCTGGAGGAT CCTCTTCTTG CCACAGGAGC 51 CCACTCCGAG GTGCAGCTGG TGCAGTCTGG AAGAAGCCTG 101 GGGCCTCAGT GAAGGTCTCC TGCAAGGCTT CATTAAAGAC 151 TTCTATCTAC ACTGGGTGCG ACAGGCCCCT TTGAGTGGAT 201 TGGAAGGATT GATCCTGAGA ATGGTGATAC CCGAAGTTCC 251 AGGACAAGGT CACCATGACC ACAGACACGT AGCCTACATG 301 GAGCTGAGGA GCCTGAGATC TGACGACACG ACTGTGCGAG 351 AGAGGCGGAT TATTTCCACG ATGGTACCTC TTCGATGTCT 401 GGGGCCGTGG CACCCTGGTC ACCGTCTCTA CAAGGGCCCA 451 TCGGTCTTCC CCCTGGCGCC CTGCTCCAGG AGAGCACAGC 501 GGCCCTGGGC TGCCTGGTCA AGGACTACTT GTGACGGTGT 551 CGTGGAACTC AGGCGCTCTG ACCAGCGGCG CCCAGCTGTC 601 CTACAGTCCT CAGGACTCTA CTCCCTCAGC CCGTGCCCTC 651 CAGCAACTTC GGCACCCAGA CCTACACCTG CACAAGCCCA 701 GCAACACCAA GGTGGACAAG ACAGTTGAGC TGTCGAGTGC 751 CCACCGTGCC CAGCACCACC TGTGGCAGGA TCCTCTTCCC 801 CCCAAAACCC AAGGACACCC TCATGATCTC GAGGTCACGT 851 GCGTGGTGGT GGACGTGAGC CACGAAGACC GTTCAACTGG 901 TACGTGGACG GCGTGGAGGT GCATAATGCC CACGGGAGGA 951 GCAGTTCAAC AGCACGTTCC GTGTGGTCAG GTTGTGCACC 1001 AGGACTGGCT GAACGGCAAG GAGTACAAGT CAACAAAGGC 1051 CTCCCAGCCC CCATCGAGAA AACCATCTCC GGCAGCCCCG 1101 AGAACCACAG GTGTACACCC TGCCCCCATC ATGACCAAGA 1151 ACCAGGTCAG CCTGACCTGC CTGGTCAAAG CAGCGACATC 1201 GCCGTGGAGT GGGAGAGCAA TGGGCAGCCG ACAAGACCAC 1251 ACCTCCCATG CTGGACTCCG ACGGCTCCTT AGCAAGCTCA 1301 CCGTGGACAA GAGCAGGTGG CAGCAGGGGA ACGTCTTCTC ATGCTCCGTG 1351 ATGCATGAGG CTCTGCACAA CCACTACACG CAGAAGAGCC TCTCCCTGTC 1401 TCCGGGTAAA (SEQ ID n°.:228) As sequências CDR na região variável da cadeia pesada de Ab-15 são: CDR-H1 : DFYLH (SEQ ID n°.:290) CDR-H2: RIDPENGDTLYDPKFQD (SEQ ID n°.:291) CDR-H3 : EADYFHDGTSYWYFDV (SEQ ID n°.:292) As sequências de região variável CDR de cadeia leve de Ab-15 são: CDR-L1: SVSSTISSNHLH (SEQ ID n°.:278) CDR-L2: GTSNLAS (SEQ ID n°.:279) CDR-L3: QQWSSYPLT (SEQ ID n°.:280) Ab-15 Domínio variável: Sequência de aminoácidos de Ab-15 de cadeia leve de domínio variável (sem sequência sinal): 1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCSVSSTIS SNHLHWFQQK PGKAPKSLIY 51 GTSNLASGVP SRFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFATYYCQ QWSSYPLTFG 101 GGTKVEIK (SEQ ID n°.:384) Sequência de DNA de Ab-15 de cadeia leve de domínio variável(sem sequência sinal): 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTCTCAGCAT CCGTAGGCGA 51 TAGAGTTACA ATAACATGCA GCGTATCATC AACTATATCA TCAAATCATC 101 TTCATTGGTT CCAACAGAAA CCCGGCAAAG CACCTAAATC ACTTATATAC 151 GGCACATCAA ATCTCGCATC AGGCGTTCCT TCAAGATTTT CAGGCTCTGG 201 CTCAGGCACC GACTTTACTC TTACAATATC CTCCCTCCAA CCCGAAGACT 251 TCGCAACCTA TTACTGTCAA CAATGGTCCT CATATCCACT CACATTTGGC 301 GGCGGCACAA AAGTAGAAAT TAAA (SEQ ID n°.:385) Sequência de aminoácidos de Ab-15 de cadeia pesada de domínio variável (sem sequência sinal): 1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASDFNIK DFYLHWVRQA PGQGLEWIGR 51 IDPENGDTLY DPKFQDKVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCAREA 101 DYFHDGTSYW YFDVWGRGTL VTVSS (SEQ ID n°.-386) Sequência de DNA de Ab-15 de cadeia pesada de domínio variável(sem sequência sinal): 1 GAGGTGCAGC TGGTGCAGTC TGGGGCTGAG GTGAAGAAGC CTGGGGCCTC 51 AGTGAAGGTC TCCTGCAAGG CTTCTGACTT CAACATTAAA GACTTCTATC 101 TACACTGGGT GCGACAGGCC CCTGGACAAG GGCTTGAGTG GATTGGAAGG 151 ATTGATCCTG AGAATGGTGA TACTTTATAT GACCCGAAGT TCCAGGACAA 201 GGTCACCATG ACCACAGACA CGTCCACCAG CACAGCCTAC ATGGAGCTGA 251 GGAGCCTGAG ATCTGACGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTGC GAGAGAGGCG 301 GATTATTTCC ACGATGGTAC CTCCTACTGG TACTTCGATG TCTGGGGCCG 351 TGGCACCCTG GTCACCGTCT CTAGT (SEQ ID n°.:387) Ab-11 foi humanizado para gerar Ab-16. Ab-16 As sequências da Anticorpo 16 (também referido aqui como Ab-16) LC e HC são como segue: Ab-16 Cadeia leve: Sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab- 16 LC: 1 DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASSSTS YIHWYQQKPG KAPKLLIYAf 51 SNLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLQPE DFATYYCQQW SSDPLTFGGG 101 TKVEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD 151 NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL 201 SSPVTKSFNR GEC (SEQ ID n°.:229) Sequência de ácidos nucléicos codificando a forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-16 LC: 1 GACATCCAGT TGACCCAGTC TCCATCCTTC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA 51 CAGAGTCACC ATCACTTGCA GGGCCAGCTC AAGTATAAGT TACATACACT 101 GGTATCAGCA AAAACCAGGG AAAGCCCCTA AGCTCCTGAT CTATGCCACA 151 TCCAACCTGG CTTCTGGGGT CCCATCAAGG TTCAGCGGCA GTGGATCTGG 201 GACAGAATTC ACTCTCACAA TCAGCAGCCT GCAGCCTGAA GATTTTGCAA 251 CTTATTACTG TCAGCAGTGG AGTAGTGACC CACTCACGTT CGGCGGAGGG 301 ACCAAGGTGG AGATCAAACG TACGGTGGCT GCACCATCTG TCTTCATCTT 351 CCCGCCATCT GATGAGCAGT TGAAATCTGG AACTGCCTCT GTTGTGTGCC 401 TGCTGAATAA CTTCTATCCC AGAGAGGCCA AAGTACAGTG GAAGGTGGAT 451 AACGCCCTCC AATCGGGTAA CTCCCAGGAG AGTGTCACAG AGCAGGACAG 501 CAAGGACAGC ACCTACAGCC TCAGCAGCAC CCTGACGCTG AGCAAAGCAG 551 ACTACGAGAA ACACAAAGTC TACGCCTGCG AAGTCACCCA TCAGGGCCTG 601 AGCTCGCCCG TCACAAAGAG CTTCAACAGG GGAGAGTGT (SEQ ID n°.:230) Sequência de aminoácidos de Ab-16 LC incluindo peptídeo sinal: 1 MDMRVPAQLL GLLLLWLPGA RCDIQLTQSP SFLSASVGDR VTITCRASSS 51 ISYIHWYQQK PGKAPKLLIY ATSNLASGVP SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ 101 PEDFATYYCQ QWSSDPLTFG GGTKVEIKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT 151 ASVVCLLNNF YPREAKVQWK VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL 201 TLSKADYEKH KVYACEVTHQ GLSSPVTKSF NRGEC (SEQ ID n°.:231 ) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-16 LC incluindo a sequência de codificação de peptídeo sinal: 1 ATGGACATGA GGGTCCCCGC TCAGCTCCTG GGGCTCCTGC TGCTCTGGCT 51 CCCAGGTGCC AGATGTGACA TCCAGTTGAC CCAGTCTCCA TCCTTCCTGT 101 CTGCATCTGT AGGAGACAGA GTCACCATCA CTTGCAGGGC CAGCTCAAGT 151 ATAAGTTACA TACACTGGTA TCAGCAAAAA CCAGGGAAAG CCCCTAAGCT 201 CCTGATCTAT GCCACATCCA ACCTGGCTTC TGGGGTCCCA TCAAGGTTCA 251 GCGGCAGTGG ATCTGGGACA GAATTCACTC TCACAATCAG CAGCCTGCAG 301 CCTGAAGATT TTGCAACTTA TTACTGTCAG CAGTGGAGTA GTGACCCACT 351 CACGTTCGGC GGAGGGACCA AGGTGGAGAT CAAACGTACG GTGGCTGCAC 401 CATCTGTCTT CATCTTCCCG CCATCTGATG AGCAGTTGAA ATCTGGAACT 451 GCCTCTGTTG TGTGCCTGCT GAATAACTTC TATCCCAGAG AGGCCAAAGT 501 ACAGTGGAAG GTGGATAACG CCCTCCAATC GGGTAACTCC CAGGAGAGTG 551 TCACAGAGCA GGACAGCAAG GACAGCACCT ACAGCCTCAG CAGCACCCTG 601 ACGCTGAGCA AAGCAGACTA CGAGAAACAC AAAGTCTACG CCTGCGAAGT 651 CACCCATCAG GGCCTGAGCT CGCCCGTCAC AAAGAGCTTC AACAGGGGAG 701 AGTGT (SEQ ID n°.:232) Ab-16 Cadeia pesada: Sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab- 16 HC: 1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGFDIK BYYIHWVRQA PGQGLEWIGR 51 VDPDNGETEF APKFPGKVTM TTDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARED 101 YDGTYTWFPY WGQGTLVTVS SASTKGPSVF PLAPCSRSTS ESTAALGCLV 151 KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSNFGTQ 201 TYTCNVDHKP SNTKVDKTVE RKCCVECPPC PAPPVAGPSV FLFPPKPKDT 251 LMISRTPEVT CWVDVSHED PEVQFNVVYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTF 301 RVVSVLTVVH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPA PIEKTISKTK GQPREPQVYT 351 LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPMLDS 401 DGSFFLYSKL TVbKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK (SEQ ID NO:233) Sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab- 16 HC sem terminal carbóxi-lisina: 1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGFDIK DYYIHWVRQA PGQGLEWIGR 51 VDPDNGETEF APKFPGKVTM TTDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARED 101 YDGTYTWFPY WGQGTLVTVS SASTKGPSVF PLAPCSRSTS ESTAALGCLV 151 KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSNFGTQ 201 TYTCNVDHKP SNTKVDKTVE RKCCVECPPC PAPPVAGPSV FLFPPKPKDT 251 LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTF 301 RVVSVLTVVH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPA PIEKTISKTK GQPREPQVYT 351 LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPMLDS 401 DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG (SEQ ID n°.:395) Sequência de ácidos nucléicos codificando a forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-16 HC: 1 GAGGTGCAGC TGGTGCAGTC TGGGGCTGAG CTGGGGCCTC 51 AGTGAAGGTC TCCTGCAAGG CTTCTGGATT GACTACTATA 101 TACACTGGGT GCGACAGGCC CCTGGACAAG GATCGGAAGG 151 GTTGATCCTG ACAATGGTGA GACTGAATTT TCCCGGGCAA 201 GGTCACCATG ACCACAGACA CGTCCATCAG ATGGAGCTGA 251 GCAGGCTGAG ATCTGACGAC ACGGCCGTGT GAGAGAAGAC 301 TACGATGGTA CCTACACCTG GTTTCCTTAT GGACTCTGGT 351 CACCGTCTCT AGTGCCTCCA CCAAGGGCCC CCCCTGGCGC 401 CCTGCTCCAG GAGCACCTCC GAGAGCACAG CTGCCTGGTC 451 AAGGACTACT TCCCCGAACC GGTGACGGTG CAGGCGCTCT 501 GACCAGCGGC GTGCACACCT TCCCAGCTGT TCAGGACTCT 551 ACTCCCTCAG CAGCGTGGTG ACCGTGCCCT CGGCACCCAG 601 ACCTACACCT GCAACGTAGA TCACAAGCCC AGGTGGACAA 651 GACAGTTGAG CGCAAATGTT GTGTCGAGTG CCCACCGTGC CCAGCACCAC 701 CTGTGGCAGG ACCGTCAGTC TTCCTCTTCC CCCCAAAACC CAAGGACACC 751 CTCATGATCT CCCGGACCCC TGAGGTCACG TGCGTGGTGG TGGACGTGAG 801 CCACGAAGAC CCCGAGGTCC AGTTCAACTG GTACGTGGAC GGCGTGGAGG 851 TGCATAATGC CAAGACAAAG CCACGGGAGG AGCAGTTCAA CAGCACGTTC 901 CGTGTGGTCA GCGTCCTCAC CGTTGTGCAC CAGGACTGGC TGAACGGCAA 951 GGAGTACAAG TGCAAGGTCT CCAACAAAGG CCTCCCAGCC CCCATCGAGA 1001 AAACCATCTC CAAAACCAAA GGGCAGCCCC GAGAACCACA GGTGTACACC 1051 CTGCCCCCAT CCCGGGAGGA GATGACCAAG AACCAGGTCA GCCTGACCTG 1101 CCTGGTCAAA GGCTTCTACC CCAGCGACAT CGCCGTGGAG TGGGAGAGCA 1151 ATGGGCAGCC GGAGAACAAC TACAAGACCA CACCTCCCAT GCTGGACTCC 1201 GACGGCTCCT TCTTCCTCTA CAGCAAGCTC ACCGTGGACA AGAGCAGGTG 1251 GCAGCAGGGG AACGTCTTCT CATGCTCCGT GATGCATGAG GCTCTGCACA 1301 ACCACTACAC GCAGAAGAGC CTCTCCCTGT CTCCGGGTAA A (SEQ ID n°:234) Sequência de aminoácidos de Ab-16 HC incluindo peptídeo sinal: 1 MDWTWRILFL VAAATGAHSE VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGFDIKD 51 YYIHWVRQAP GQGLEWIGRV DPDNGETEFA PKFPGKVTMT TDTSISTAYM 101 ELSRLRSDDT AVYYCAREDY DGTYTWFPYW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP 151 LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS 201 GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KCCVECPPCP 251 APPVAGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVQFNWYVDG 301 VEVHNAKTKP REEQFNSTFR VVSVLTVVHQ DWLNGKEYKC KVSNKGLPAP 351 IEKTISKTKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW 401 ESNGQPENNY KTTPPMLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA 451 LHNHYTQKSL SLSPGK (SEQ ID n°.:235) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-16 HC incluindo a sequência de codificação de peptídeo sinal: 1 ATGGACTGGA CCTGGAGGAT CCTCTTCTTG GTGGCAGCAG CCACAGGAGC 51 CCACTCCGAG GTGCAGCTGG TGCAGTCTGG GGCTGAGGTG AAGAAGCCTG 101 GGGCCTCAGT GAAGGTCTCC TGCAAGGCTT CATTAAGGAC 151 TACTATATAC ACTGGGTGCG ACAGGCCCCT TTGAGTGGAT 201 CGGAAGGGTT GATCCTGACA ATGGTGAGAC CCGAAGTTCC 251 CGGGCAAGGT CACCATGACC ACAGACACGT AGCCTACATG 301 GAGCTGAGCA GGCTGAGATC TGACGACACG ACTGTGCGAG 351 AGAAGACTAC GATGGTACCT ACACCTGGTT GGCCAAGGGA 401 CTCTGGTCAC CGTCTCTAGT GCCTCCACCA GGTCTTCCCC 451 CTGGCGCCCT GCTCCAGGAG CACCTCCGAG CCCTGGGCTG 501 CCTGGTCAAG GACTACTTCC CCGAACCGGT TGGAACTCAG 551 GCGCTCTGAC CAGCGGCGTG CACACCTTCC ACAGTCCTCA 601 GGACTCTACT CCCTCAGCAG CGTGGTGACC GCAACTTCGG 651 CACCCAGACC TACACCTGCA ACGTAGATCA AACACCAAGG 701 TGGACAAGAC AGTTGAGCGC AAATGTTGTG ACCGTGCCCA 751 GCACCACCTG TGGCAGGACC GTCAGTCTTC CAAAACCCAA 801 GGACACCCTC ATGATCTCCC GGACCCCTGA GGTCACGTGC GTGGTGGTGG 851 ACGTGAGCCA CGAAGACCCC GAGGTCCAGT TCAACTGGTA CGTGGACGGC 901 GTGGAGGTGC ATAATGCCAA GACAAAGCCA CGGGAGGAGC AGTTCAACAG 951 CACGTTCCGT GTGGTCAGCG TCCTCACCGT TGTGCACCAG GACTGGCTGA 1001 ACGGCAAGGA GTACAAGTGC AAGGTCTCCA ACAAAGGCCT CCCAGCCCCC 1051 ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AACCAAAGGG CAGCCCCGAG AACCACAGGT 1101 GTACACCCTG CCCCCATCCC GGGAGGAGAT GACCAAGAAC CAGGTCAGCC 1151 TGACCTGCCT GGTCAAAGGC TTCTACCCCA GCGACATCGC CGTGGAGTGG 1201 GAGAGCAATG GGCAGCCGGA GAACAACTAC AAGACCACAC CTCCCATGCT 1251 GGACTCCGAC GGCTCCTTCT TCCTCTACAG CAAGCTCACC GTGGACAAGA 1301 GCAGGTGGCA GCAGGGGAAC GTCTTCTCAT GCTCCGTGAT GCATGAGGCT 1351 CTGCACAACC ACTACACGCA GAAGAGCCTC TCCCTGTCTC CGGGTAAA (SEQ ID n°.:236) As sequências CDR na região variável da cadeia pesada de Ab-16 são: CDR-H1 : DYYIH (SEQ ID n°.:293) CDR-H2: RVDPDNGETEFAPKFPG (SEQ ID n°.:294) CDR-H3 : EDYDGTYTWFPY (SEQ ID n°.:295) As sequências CDR na região variável de cadeia leve de Ab-16 são: CDR-L1 : RASSSISYIH (SEQ ID n°.:281) CDR-L2: ATSNLAS (SEQ ID n°.:282) CDR-L3 : QQWSSDPLT (SEQ ID n°.:283) Domínio variável Ab-16: Sequência de aminoácidos de Ab-16 de cadeia leve de domínio variável (sem sequência sinal): 1 DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASSSIS YIHWYQQKPG KAPKLLIYAT 51 SNLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLQPE DFATYYCQQW SSDPLTFGGG 101 TKVEIK (SEQ ID n°.:388) Sequência de DNA de Ab-16 de cadeia leve de domínio variável(sem sequência sinal): 1 GACATCCAGT TGACCCAGTC TCCATCCTTC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA 51 CAGAGTCACC ATCACTTGCA GGGCCAGCTC AAGTATAAGT TACATACACT 101 GGTATCAGCA AAAACCAGGG AAAGCCCCTA AGCTCCTGAT CTATGCCACA 151 TCCAACCTGG CTTCTGGGGT CCCATCAAGG TTCAGCGGCA GTGGATCTGG 201 GACAGAATTC ACTCTCACAA TCAGCAGCCT GCAGCCTGAA GATTTTGCAA 251 CTTATTACTG TCAGCAGTGG AGTAGTGACC CACTCACGTT CGGCGGAGGG 301 ACCAAGGTGG AGATCAAA (SEQ ID n°.:389) Sequência de aminoácidos de Ab-16 de cadeia pesada de domínio variável (sem sequência sinal): 1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGFDIK DYYIHWVRQA PGQGLEWIGR 51 VDPDNGETEF APKFPGKVTM TTDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARED 101 YDGTYTWFPY WGQGTLVTVS S (SEQ ID n°.-390) Sequência de DNA de Ab-16 de cadeia pesada de domínio variável(sem sequência sinal): 1 GAGGTGCAGC TGGTGCAGTC TGGGGCTGAG GTGAAGAAGC CTGGGGCCTC 51 AGTGAAGGTC TCCTGCAAGG CTTCTGGATT CGACATTAAG GACTACTATA 101 TACACTGGGT GCGACAGGCC CCTGGACAAG GGCTTGAGTG GATCGGAAGG 151 GTTGATCCTG ACAATGGTGA GACTGAATTT GCCCCGAAGT TCCCGGGCAA 201 GGTCACCATG ACCACAGACA CGTCCATCAG CACAGCCTAC ATGGAGCTGA 251 GCAGGCTGAG ATCTGACGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTGC GAGAGAAGAC 301 TACGATGGTA CCTACACCTG GTTTCCTTAT TGGGGCCAAG GGACTCTGGT 351 CACCGTCTCT AGT (SEQ ID n°.:391) Anticorpos adicionais são referidos aqui como anticorpos 17-22 (também referidos aqui como Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, e Ab-22). A região de constante Kapa para todas as regiões VK de Ab-17, Ab-19, e Ab-21 é como segue: TDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGV LNSWTDQD SKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID n°-323) A região constante pesada para todas as regiões VH de anticorpos 17, 19 e 21 é como segue: AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGV HTFPAVLQS DLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSS VFIF PPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREE QFNSTFRS VSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMA KD KVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSN WEA GNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK (SEQ ID n°.:324) Nas seguintes sequências de aminoácidos de anticorpos, os aminoácidos assinalados representam regiões de determinação de complemento (CDRs) e os aminoácidos sublinhados representam peptídeo sinal. Ab-17 Sequência de aminoácidos de Ab-17 LC incluindo peptídeo sinal: MDFQVOIFSFMLISVTVILSSGEIVLTQSPALMAASPGEKVTITCSVSSSISSS NLHWSQQK SGTSPKLWIYGTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWTTTY TFG SGTKLELKR (SEQ ID n°.:299) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-17 LC incluindo peptídeo sinal: ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCATGCTAATCAGTGTCACAGT CATATTG TCCAGTGGAGAAATTGTGCTCACCCAGTCTCCAGCACTCATGGCTGCATCTCCA GGG GAGAAGGTCACCATCACCTGCAGTGTCAGCTCGAGTATAAGTTCCAGCAACTTA CA CTGGTCCCAGCAGAAGTCAGGAACCTCCCCCAAACTCTGGATTTATGGCACATC CA ACCTTGCTTCTGGAGTCCCTGTTCGCTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACCTCTT ATTC TCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGTCAACA GT GGACTACTACGTATACGTTCGGATCGGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGT (SEQ ID n°:300) Sequência de aminoácidos de Ab-17 HC incluindo peptídeo sinal: MGWNWIIFFLMAWTGWSEVQLRQSGADLVKPGASVKLSCTASGFNIKDY YIHWVK QRPEQGLEWIGRIDPDNGESTYVPKFQGKATITADTSSNTAYLQLRSLTSEDTAIYY CGR EGLDYGDYYAVDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID n°.:301) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-17 HC incluindo peptídeo sinal: ATGGGATGGAACTGGATCATCTTCTTCCTGATGGCAGTGGTTACAGGGG TCAATTCA GAGGTGCAGTTGCGGCAGTCTGGGGCAGACCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAG TCAA GTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTACTATATACACTGGGTG AA GCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGATAATG GTG AAAGTACATATGTCCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACAT CA TCCAACACAGCCTACCTACAACTCAGAAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCATC TA GTCAAGGAACCTCGGTCACAGTCTCGAGC (SEQ ID n°.:302) Ab-17 foi humanizado para gerar Ab-18. Ab-18 Sequência de aminoácidos de Ab-18 LC incluindo peptídeo sinal: MDMRVPAOLLGLLLLWLPGARCDIOLTOSPSFLSASVGDRVTITCSVSSSIS SSNLHWYQ QKPGKAPKLLIYGTSNLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQWTTT YTF GQGTKLEIKR (SEQ ID n°.:303) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-18 LC incluindo peptídeo sinal: ATGGATATGCGCGTGCCGGCGCAGCTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTG GCTGCCGGG CGCGCGCTGCGATATTCAGCTGACCCAGAGCCCGAGCTTTCTGAGCGCGAGCG TGG GCGATCGCGTGACCATTACCTGCAGCGTGAGCAGCAGCATTAGCAGCAGCAAC CTG CATTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAAGCGCCGAAACTGCTGATTTATGGCACC AG CAACCTGGCGAGCGGCGTGCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACC GAAT TTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATTTTGCGACCTATTATTGCC AGC AGTGGACCACCACCTATACCTTTGGCCAGGGCACCAAACTGGAAATTAAACGT (SEQ ID n°.:304) Sequência de aminoácidos de Ab-18 HC incluindo peptídeo sinal: MDWTWSILFLVAAPTGAHSEVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKD YYIHWVR QAPGQGLEWMGRIDPDNGESTYVPKFQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAV YY CAREGLDYGDYYAVDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID n°.:305) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-18 HC incluindo peptídeo sinal: ATGGATTGGACCTGGAGCATTCTGTTTCTGGTGGCGGCGCCGACCGGC GCGCATAG CGAAGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGC GTG AAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTTTAACATTAAAGATTATTATATTCATTGGG T GCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATGGGCCGCATTGATCCGGAT AACG GCGAAAGCACCTATGTGCCGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCACCGAT ACC AGCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGCGCAGCCTGCGCAGCGATGATACCGC GGT GTATTATTGCGCGCGCGAAGGCCTGGATTATGGCGATTATTATGCGGTGGATTA TTG GGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTCTCGAGC (SEQ ID n°.-306) Sequência de aminoácidos de Ab-18 de cadeia leve de domínio variável (sem sequência sinal): DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSVSSSISSSNLHWYQQKPGKAPKLLIYGT SNLASGVPS RFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQWTTT[Upsilon]TFGQGTKLEIKR (SEQ ID n°.:368) Sequência de DNA de Ab-18 de cadeia leve de domínio variável(sem sequência sinal): GATATTCAGCTGACCCAGAGCCCGAGCTTTCTGAGCGCGAGCGTGGGC GATCGCGT GACCATTACCTGCAGCGTGAGCAGCAGCATTAGCAGCAGCAACCTGCATTGGT ATC AGCAGAAACCGGGCAAAGCGCCGAAACTGCTGATTTATGGCACCAGCAACCTG GCG AGCGGCGTGCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGAATTTACCC TGAC CATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATTTTGCGACCTATTATTGCCAGCAGTGGAC CA CCACCTATACCTTTGGCCAGGGCACCAAACTGGAAATTAAACGT (SEQ ID n°.:369) Sequência de aminoácidos de Ab-18 de cadeia pesada de domínio variável (sem sequência sinal): EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDYYIHWVRQAPGQGLEWMG RIDPDNGE STYVPKFQGRVTMTTDTSTSTAYM ELRSLRSD DTAVYYCAREGLDYGDYYAVDYW G QGTLVTVSS (SEQ ID n°.:370) Sequência de DNA de Ab-18 de cadeia pesada de domínio variável(sem sequência sinal): GAAGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGC GAGCGTGA AAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTTTAACATTAAAGATTATTATATTCATTGGGT G CGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATGGGCCGCATTGATCCGGATA ACGG CGAAAGCACCTATGTGCCGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCACCGATA CCA GCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGCGCAGCCTGCGCAGCGATGATACCGCG GTG TATTATTGCGCGCGCGAAGGCCTGGATTATGGCGATTATTATGCGGTGGATTAT TGG GGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTCTCGAGC (SEQ ID n°.:371) Ab-19 Sequência de aminoácidos de Ab-19 LC incluindo peptídeo sinal: MMSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIQMTQTTSSLSASLGDRVNISCRASQDISS YLNWYQQK PDGTVKLLIYSTSRLNSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLAQEDIATYFCQQDIKHPTF GGG TKLELKR (SEQ ID n°.:307) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-19 LC incluindo peptídeo sinal: ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGG TACCAGAT GTGATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACA GAG TCAACATCAGCTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAGTTATTTAAACTGGTATC AG CAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTCCACATCAAGATTAAACT C AGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTATTCTCTCAC TAT TAGCAACCTGGCACAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGATATTAAG C ATCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGTTGGAGCTGAAACGT (SEQ ID n°.:308) Sequência de aminoácidos de Ab-19 HC incluindo peptídeo sinal: MEWIWIFLFLLSGTAGVHSEVOLOQSGPELVKPGASVKMSCKASGFTFTDY IMHWVKQ KPGQGLEWIGYINPYNDDTEYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMDLSSLTSEGSAVYY CA RSIYYYDAPFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID n°.:309) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-19 HC incluindo peptídeo sinal: ATGGAATGGATCTGGATATTTCTCTTCCTCCTGTCAGGAACTGCAGGTG TCCACTCT GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGT GAA GATGTCCTGCAAGGCTTCTGGGTTCACATTCACTGACTACATTATGCACTGGGT GAA GCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATATTAATCCTTACAATGA TG ATACTGAATACAATGAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAAT CC TCCAGCACAGCCTACATGGATCTCAGCAGTCTGACCTCTGAGGGCTCTGCGGT CTAT TACTGTGCAAGATCGATTTATTACTACGATGCCCCGTTTGCTTACTGGGGCCAA GGG ACTCTGGTCACAGTCTCGAGC (SEQ ID n°.:310) Ab-19 foi humanizado para gerar o anticorpo 20 (também referido aqui como Ab-20) e Anticorpo 23 (também referido aqui como Ab-23). versão Ab-20 IgG4 Sequência de aminoácidos de Ab-20 LC incluindo peptídeo sinal: MMSSAOFLGLLLLCFQGTRCDIOMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASODISS YLNWYQQK PGKAPKLLIYSTSRLNSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDIKHPTF GQG TKVEIKR (SEQ ID n°.:311) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-20 LC incluindo peptídeo sinal: ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGG TACCAGAT GTGATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGTGACC GTG TCACCATCACTTGCCGCGCAAGTCAGGATATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCA GC AGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTCTACTTCCCGTTTGAATA GTG GGGTCCCATCACGCTTCAGTGGCAGTGGCTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCA TCA GCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGGATATTAAACA CC CTACGTTCGGTCAAGGCACCAAGGTGGAGATCAAACGT (SEQ ID n°.:312) Sequência de aminoácidos de Ab-20 HC incluindo peptídeo sinal: MEWIWIFLFLLSGTAGVHSEVOLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFTFTDY IMHWVRQ APGQGLEWMGYINPYNDDTEYNEKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYY CA RSIYYYDAPFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID n°.:313) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-20 HC incluindo peptídeo sinal: ATGGAATGGATCTGGATATTTCTCTTCCTCCTGTCAGGAACTGCAGGTG TCCACTCT GAGGTGCAGCTGCTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGG TGAA GGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTTTACCTTCACCGACTATATTATGCACTGGGT GCG TCAGGCCCCTGGTCAAGGGCTTGAGTGGATGGGCTATATCAACCCTTATAATGA TG ACACCGAATACAACGAGAAGTTCAAGGGCCGTGTCACGATTACCGCGGACAAAT CC ACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGCGCTCTGAGGACACGGCCGT GTA TTACTGTGCGCGTTCGATTTATTACTACGATGCCCCGTTTGCTTACTGGGGCCA AGG GACTCTGGTCACAGTCTCGAGC (SEQ ID n°.:349) Ab-23 versão IgG2 Cadeia leve: Sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-23 LC: GKAPKLLIYS DIKHPTFGQG REAKVQWKVD YACEVTHQGL 201 SSPVTKSFNR GEC (SEQ ID n°.:341) Sequência de ácidos nucléicos codificando a forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-23 LC: 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGTGA 51 CCGTGTCACC ATCACTTGCC GCGCAAGTCA GGATATTAGC AGCTATTTAA 101 ATTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATTCT 151 ACTTCCCGTT TGAATAGTGG GGTCCCATCA CGCTTCAGTG GCAGTGGCTC 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG 251 CAACTTACTA CTGTCAACAG GATATTAAAC ACCCTACGTT CGGTCAAGGC 301 ACCAAGGTGG AGATCAAACG TACGGTGGCT GCACCATCTG TCTTCATCTT 351 CCCGCCATCT GATGAGCAGT TGAAATCTGG AACTGCCTCT GTTGTGTGCC 401 TGCTGAATAA CTTCTATCCC AGAGAGGCCA AAGTACAGTG GAAGGTGGAT 451 AACGCCCTCC AATCGGGTAA CTCCCAGGAG AGTGTCACAG AGCAGGACAG 501 CAAGGACAGC ACCTACAGCC TCAGCAGCAC CCTGACGCTG AGCAAAGCAG 551 ACTACGAGAA ACACAAAGTC TACGCCTGCG AAGTCACCCA TCAGGGCCTG 601 AGCTCGCCCG TCACAAAGAG CTTCAACAGG GGAGAGTGT (SEQ ID n°.:342) Sequência de aminoácidos de Ab-23 LC incluindo peptídeo sinal: 1 MDMRVPAQLL GLLLLWLRGA RCDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRASQD 51 ISSYLNWYQQ KPGKAPKLLI YSTSRLNSGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL 101 QPEDFATYYC QQDIKHPTFG QGTKVEIKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT 151 ASVVCLLNNF YPREAKVQWK VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL 201 TLSKADYEKH KVYACEVTHQ GLSSPVTKSF NRGEC (SEQ ID n°.:343) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-23 LC incluindo a sequência de codificação de peptídeo sinal: 1 ATGGACATGA GGGTGCCCGC TCAGCTCCTG TGCTGTGGCT 51 GAGAGGTGCC AGATGTGACA TCCAGATGAC TCCTCCCTGT 101 CTGCATCTGT AGGTGACCGT GTCACCATCA AAGTCAGGAT 151 ATTAGCAGCT ATTTAAATTG GTATCAGCAG AAGCCCCTAA 201 GCTCCTGATC TATTCTACTT CCCGTTTGAA CCATCACGCT 251 TCAGTGGCAG TGGCTCTGGG ACAGATTTCA CAGCAGTCTG 301 CAACCTGAAG ATTTTGCAAC TTACTACTGT TTAAACACCC 351 TACGTTCGGT CAAGGCACCA AGGTGGAGAT GTGGCTGCAC 401 CATCTGTCTT CATCTTCCCG CCATCTGATG ATCTGGAACT 451 GCCTCTGTTG TGTGCCTGCT GAATAACTTC AGGCCAAAGT 501 ACAGTGGAAG GTGGATAACG CCCTCCAATC CAGGAGAGTG 551 TCACAGAGCA GGACAGCAAG GACAGCACCT CAGCACCCTG 601 ACGCTGAGCA AAGCAGACTA CGAGAAACAC CCTGCGAAGT 651 CACCCATCAG GGCCTGAGCT CGCCCGTCAC AAAGAGCTTC AACAGGGGAG 701 AGTGT (SEQ ID n°.:344) Cadeia pesada: Sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab- 23 HC: 1 EVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGFTFT DYIMHWVRQA PGQGLEWMGY 51 JNPYNDDTEY NEKFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARSI 101 YYYDAPFAYW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK 151 DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT 201 YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KCCVECPPCP APPVAGPSVF LFPPKPKDTL 251 MLSRTPEVTC VVVDVSHEDP EVQFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQFNSTFR 301 VVSVLTVVHQ DWLNGKEYKC KVSNKGLPAP IEKTISKTKG QPREPQVYTL 351 PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIA VEWESNGQPENNY KTTPPMLDSD 401 GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK (SEQ ID n°.:345) Sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab- 23 HC sem terminal carbóxi-lisina: 1 EVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGFTFT DYIMHWVRQA PGQGLEWMGY 51 INPYNDDTEY NEKFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARSI 101 YYYDAPFAYW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK 151 DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT 201 YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KCCVECPPCP APPVAGPSVF LFPPKPKDTL 251 MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVQFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQFNSTFR 301 VVSVLTVVHQ DWLNGKEYKC KVSNKGLPAP IEKTISKTKG QPREPQVYTL 351 PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPMLDSD 401 GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPG (SEQ ID n°.:396) Sequência de ácidos nucléicos codificando a forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-23 HC: 1 GAGGTGCAGC TGGTGCAGTC TGGGGCTGAG GTGAAGAAGC CTGGGTCCTC 51 GGTGAAGGTC TCCTGCAAGG CTTCTGGTTT TACCTTCACC GACTATATTA 101 TGCACTGGGT GCGTCAGGCC CCTGGTCAAG GGCTTGAGTG GATGGGCTAT 151 ATCAACCCTT ATAATGATGA CACCGAATAC AACGAGAAGT TCAAGGGCCG 201 TGTCACGATT ACCGCGGACA AATCCACGAG ATGGAGCTGA 251 GCAGCCTGCG CTCTGAGGAC ACGGCCGTGT GCGTTCGATT 301 TATTACTACG ATGCCCCGTT TGCTTACTGG CTCTGGTCAC 351 CGTCTCTAGT GCCTCCACCA AGGGCCCATC CTGGCGCCCT 401 GCTCCAGGAG CACCTCCGAG AGCACAGCGG CCTGGTCAAG 451 GACTACTTCC CCGAACCGGT GACGGTGTCG GCGCTCTGAC 501 CAGCGGCGTG CACACCTTCC CAGCTGTCCT GGACTCTACT 551 CCCTCAGCAG CGTGGTGACC GTGCCCTCCA CACCCAGACC 601 TACACCTGCA ACGTAGATCA CAAGCCCAGC TGGACAAGAC 651 AGTTGAGCGC AAATGTTGTG TCGAGTGCCC GCACCACCTG 701 TGGCAGGACC GTCAGTCTTC CTCTTCCCCC GGACACCCTC 751 ATGATCTCCC GGACCCCTGA GGTCACGTGC ACGTGAGCCA 801 CGAAGACCCC GAGGTCCAGT TCAACTGGTA GTGGAGGTGC 851 ATAATGCCAA GACAAAGCCA CGGGAGGAGC CACGTTCCGT 901 GTGGTCAGCG TCCTCACCGT TGTGCACCAG GACTGGCTGA ACGGCAAGGA 951 GTACAAGTGC AAGGTCTCCA ACAAAGGCCT CCCAGCCCCC ATCGAGAAAA 1001 CCATCTCCAA AACCAAAGGG CAGCCCCGAG AACCACAGGT GTACACCCTG 1051 CCCCCATCCC GGGAGGAGAT GACCAAGAAC CAGGTCAGCC TGACCTGCCT 1101 GGTCAAAGGC TTCTACCCCA GCGACATCGC CGTGGAGTGG GAGAGCAATG 1151 GGCAGCCGGA GAACAACTAC AAGACCACAC CTCCCATGCT GGACTCCGAC 1201 GGCTCCTTCT TCCTCTACAG CAAGCTCACC GTGGACAAGA GCAGGTGGCA 1251 GCAGGGGAAC GTCTTCTCAT GCTCCGTGAT GCATGAGGCT CTGCACAACC 1301 ACTACACGCA GAAGAGCCTC TCCCTGTCTC CGGGTAAA (SEQ ID n°.:346) Sequência de aminoácidos de Ab-23 HC incluindo peptídeo sinal: 1 MDWTWRILFL VAAATGAHSE VQLVQSGAEV KKPGSSVKVS CKASGFTFTD 51 YIMHWVRQAP GQGLEWMGYI NPYNDDTEYN EKFKGRVTIT ADKSTSTAYM 101 ELSSLRSEDT AVYYCARSIY YYDAPFAYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL 151 APCSRSTSES TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG 201 LYSLSSVVTV PSSNFGTQTY TCNVDHKPSN CCVECPPCPA 251 PPVAGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VQFNWYVDGV 301 EVHNAKTKPR EEQFNSTFRV VSVLTVVHQD VSNKGLPAPI 351 EKTISKTKGQ PREPQVYTLP PSREEMTKNQ YPSDIAVEWE 401 SNGQPENNYK TTPPMLDSDG SFFLYSKLTV FSCSVMHEAL 451 HNHYTQKSLS LSPGK (SEQ ID n°.:347) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-23 HC incluindo codificação de peptídeo sinal: 1 ATGGACTGGA CCTGGAGGAT CCTCTTCTTG CCACAGGAGC 51 CCACTCCGAG GTGCAGCTGG TGCAGTCTGG AAGAAGCCTG 101 GGTCCTCGGT GAAGGTCTCC TGCAAGGCTT CTTCACCGAC 151 TATATTATGC ACTGGGTGCG TCAGGCCCCT TTGAGTGGAT 201 GGGCTATATC AACCCTTATA ATGATGACAC GAGAAGTTCA 251 AGGGCCGTGT CACGATTACC GCGGACAAAT AGCCTACATG 301 GAGCTGAGCA GCCTGCGCTC TGAGGACACG ACTGTGCGCG 351 TTCGATTTAT TACTACGATG CCCCGTTTGC TTACTGGGGC CAAGGGACTC 401 TGGTCACCGT CTCTAGTGCC TCCACCAAGG GCCCATCGGT CTTCCCCCTG 451 GCGCCCTGCT CCAGGAGCAC CTCCGAGAGC ACAGCGGCCC TGGGCTGCCT 501 GGTCAAGGAC TACTTCCCCG AACCGGTGAC GGTGTCGTGG AACTCAGGCG 551 CTCTGACCAG CGGCGTGCAC ACCTTCCCAG CTGTCCTACA GTCCTCAGGA 601 CTCTACTCCC TCAGCAGCGT GGTGACCGTG CCCTCCAGCA ACTTCGGCAC 651 CCAGACCTAC ACCTGCAACG TAGATCACAA GCCCAGCAAC ACCAAGGTGG 701 ACAAGACAGT TGAGCGCAAA TGTTGTGTCG AGTGCCCACC GTGCCCAGCA 751 CCACCTGTGG CAGGACCGTC AGTCTTCCTC TTCCCCCCAA AACCCAAGGA 801 CACCCTCATG ATCTCCCGGA CCCCTGAGGT CACGTGCGTG GTGGTGGACG 851 TGAGCCACGA AGACCCCGAG GTCCAGTTCA ACTGGTACGT GGACGGCGTG 901 GAGGTGCATA ATGCCAAGAC AAAGCCACGG GAGGAGCAGT TCAACAGCAC 951 GTTCCGTGTG GTCAGCGTCC TCACCGTTGT GCACCAGGAC TGGCTGAACG 1001 GCAAGGAGTA CAAGTGCAAG GTCTCCAACA AAGGCCTCCC AGCCCCCATC 1051 GAGAAAACCA TCTCCAAAAC CAAAGGGCAG CCCCGAGAAC CACAGGTGTA 1101 CACCCTGCCC CCATCCCGGG AGGAGATGAC CAAGAACCAG GTCAGCCTGA 1151 CCTGCCTGGT CAAAGGCTTC TACCCCAGCG ACATCGCCGT GGAGTGGGAG 1201 AGCAATGGGC AGCCGGAGAA CAACTACAAG ACCACACCTC CCATGCTGGA 1251 CTCCGACGGC TCCTTCTTCC TCTACAGCAA GCTCACCGTG GACAAGAGCA 1301 GGTGGCAGCA GGGGAACGTC TTCTCATGCT CCGTGATGCA TGAGGCTCTG 1351 CACAACCACT ACACGCAGAA GAGCCTCTCC CTGTCTCCGG GTAAA (SEQ ID n°.:348) As sequências de CDR (região determinante de complementaridade) na região variável da cadeia pesada de Ab-23 são como segue: CDR-H1 : DYIMH (SEQ ID n°.:269) CDR-H2: YINPYNDDTEYNEKFKG (SEQ ID n°.:270) CDR-H3: SIYYYDAPFAY (SEQ ID n°.:271) As sequências de região variável CDR de cadeia leve de Ab-23 são: CDR-L1 : RASQDISSYLN (SEQ ID n°.:239) CDR-L2: STSRLNS (SEQ ID n°.:240) CDR-L3 : QQDIKHPT (SEQ ID n°.:241) Domínios variáveis Ab-23: Sequência de aminoácidos de Ab-23 de cadeia leve de domínio variável (sem sequência sinal): DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS SYLNWYQQKP GKAPKLLIYS TSRLNSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ DIKHPTFGQG TKVEIK (SEQ ID n°.:364) Sequência de DNA de Ab-23 de cadeia leve de domínio variável(sem sequência sinal): GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGTG ACCGTGTC ACC ATCACTTGCC GCGCAAGTCA GGATATTAGC AGCTATTTAAATTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATTCTACTTCCCGTT TGAATAGTGG GGTCCCATCA CGCTTCAGTG GCAGTGGCTCTGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTGCAACTTACTA CTGTCAACAG GATATTAAAC ACCCTACGTT CGGTCAAGGCACCAAGGTGG AGATCAAA (SEQ ID n°.:365) Sequência de aminoácidos de Ab-23 de cadeia pesada de domínio variável (sem sequência sinal): EVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGFTFT DYIMHWVRQA PGQGLEWMGYINPYNDDTEY NEKFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARSIYYYDAPFAYW GQGTLVTVSS (SEQ ID n°.:366) Sequência de DNA de Ab-23 de cadeia pesada de domínio variável(sem sequência sinal): GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTC CTCGGTGAA GGTC TCCTGCAAGG CTTCTGGTTT TACCTTCACC GACTATATTATGCACTGGGT GCGTCAGGCC CCTGGTCAAG GGCTTGAGTG GATGGGCTATATCAACCCTT ATAATGATGA CACCGAATAC AACGAGAAGT TCAAGGGCCGTGTCACGATT ACCGCGGACA AATCCACGAG CACAGCCTAC ATGGAGCTGAGCAGCCTGCG CTCTGAGGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTGC GCGTTCGATTTATTACTACG ATGCCCCGTT TGCTTACTGG GGCCAAGGGACTCTGGTCACCGTCTCTAGT (SEQ ID n°.:367) Ab-21 Sequência de aminoácidos de Ab-21 LC incluindo peptídeo sinal: MKSOTOVFVYMLLWLSGVEGDIVMTOSHKFMSTSVGDRVTITCKASODVF TAVAWYQ QKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCQQYSS YPLT FGAGTKLELKR (SEQ ID N0:315) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-21 LC incluindo peptídeo sinal: ATGAAGTCACAGACCCAGGTCTTTGTATACATGTTGCTGTGGTTGTCTG GTGTTGAA GGAGACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACGTCAGTAGGAGAC AG GGTCACCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTCTTTACTGCTGTAGCCTGGTA TCA ACAGAAACCAGGACAATCTCCTAAACTACTGATTTACTGGGCATCCACCCGGCA CA CTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCA CCA TTAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGATTATTTCTGTCAACAATATAGCAG CT ATCCTCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGTTGGAGCTGAAACGT (SEQ ID n°.:316) Sequência de aminoácidos de Ab-21 HC incluindo peptídeo sinal: MGWNWIIFFLMAVVTGVNSEVOLOOSGAELVRPGALVKLSCKASGFNIKDY YMHWV KQRPEQGLEWIGRIDPENGDIIYDPKFQGKASITTDTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYY CA YDAGDPAWFTYWGQGTLVTVSS (SEQ ID n°.:317) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-21 HC incluindo peptídeo sinal: ATGGGATGGAACTGGATCATCTTCTTCCTGATGGCAGTGGTTACAGGGG TCAATTCA GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTTAGT CAA GTTGTCCTGCAAAGCTTCTGGCTTCAATATTAAAGACTACTATATGCACTGGGTG AA GCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGAGAATG GTG ATATTATATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCAGTATAACAACAGACACAT CC TCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACGTCTGAGGACACTGCCGT CTAT TACTGTGCTTACGATGCTGGTGACCCCGCCTGGTTTACTTACTGGGGCCAAGG GACT CTGGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID n°.:318) Ab-21 foi humanizado para render Ab-22. Ab-22 Sequência de aminoácidos de Ab-22 LC incluindo peptídeo sinal: MDMRVPAOLLGLLLLWLRGARCDIOMTOSPSSLSASVGDRVTITCKASOD VFTAVAW YQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQY SSYP LTFGGGTKVEIKR (SEQ ID n°.:319) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-22 LC incluindo peptídeo sinal: ATGGATATGCGCGTGCCGGCGCAGCTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTG GCTGCGCGG CGCGCGCTGCGATATCCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCGAGC GTGG GCGATCGCGTGACCATTACCTGCAAAGCGAGCCAGGATGTGTTTACCGCGGTG GCG TGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAAGCGCCGAAACTGCTGATTTATTGGGCGAG CAC CCGCCATACCGGCGTGCCGAGTCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGAT TTTA CCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATTTTGCGACCTATTATTGCCAGC AGT ATAGCAGCTATCCGCTGACCTTTGGCGGCGGCACCAAAGTGGAAATTAAACGT (SEQ ID n°:320) Sequência de aminoácidos de Ab-22 HC incluindo peptídeo sinal: MDWTWSILFLVAAPTGAHSEVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKD YYMHWV RQAPGQGLEWIGRIDPENGDIIYDPKFQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAV YYC AYDAGDPAWFTYWGQGTLVTVSS (SEQ ID n°.:321) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-22 HC incluindo peptídeo sinal: ATGGATTGGACCTGGAGCATTCTGTTTCTGGTGGCGGCGCCGACCGGC GCGCATAG CGAAGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGC GTG AAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTTTAACATTAAAGATTATTATATGCATTGGG T GCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATCGGCCGCATTGATCCGGAA AAC GGCGATATTATTTATGATCCGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCACCGAT ACC AGCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGCGCAGCCTGCGCAGCGATGATACCGC GGT GTATTATTGCGCGTATGATGCGGGCGATCCGGCGTGGTTTACCTATTGGGGCC AGGG CACCCTGGTGACCGTCTCGAGC (SEQ ID n°.:322) Sequência de aminoácidos de cadeia leve de Ab-22 de domínio variável (sem sequência sinal): DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVF TAVAWYQQKP GKAPKLLIYW ASTRHTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YSSYPLTFGG GTKVEIKR (SEQ ID n°.:336) Sequência de DNA de cadeia leve de Ab-22 de domínio variável (sem sequência sinal): GATATCCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCGAGCGTGGG CGATCGCGT GACCATTACCTGCAAAGCGAGCCAGGATGTGTTTACCGCGGTGGCGTGGTATC AGC AGAAACCGGGCAAAGCGCCGAAACTGCTGATTTATTGGGCGAGCACCCGCCAT ACC GGCGTGCCGAGTCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGAC CAT TAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATTTTGCGACCTATTATTGCCAGCAGTATAGCAG CT ATCCGCTGACCTTTGGCGGCGGCACCAAAGTGGAAATTAAACGT (SEQ ID n°.:.337) Sequência de aminoácidos de cadeia pesada Ab-22 de domínio variável (sem sequência sinal): EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGFNIK DYYMHWVRQA PGQGLEWIGRIDPENGDIIY DPKFQGRVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCAYDAGDPAWFTYWG QGTLVTVSS (SEQ ID n°.:338) Sequência de DNA de cadeia pesada de Ab-22 de domínio variável (sem sequência sinal): GAAGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGC GAGCGTGA AAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTTTAACATTAAAGATTATTATATGCATTGGGT G CGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATCGGCCGCATTGATCCGGAAA ACG GCGATATTATTTATGATCCGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCACCGATA CCA GCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGCGCAGCCTGCGCAGCGATGATACCGCG GTG TATTATTGCGCGTATGATGCGGGCGATCCGGCGTGGTTTACCTATTGGGGCCA GGGC ACCCTGGTGACCGTCTCGAGC (SEQ ID n°.:339). Para Ab-18, Ab-20, e Ab-22, a constante de região de cadeia leve humana kapa é como segue: TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS QESVTEQD SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC* (SEQ ID n°.: 325) e a constante gama-4 da região de cadeia pesada humana é como segue: ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH TFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLG GPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQF NS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS QEE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVD KSR WQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK* (SEQ ID n°.326) A região da articulação contem a mutação Ser-241-Pro para melhorar a estabilidade da articulação (Angal S et al, (1993), Mol Immunol, 30(1), 105-108). Ab-24 As sequências de Anticorpo 24 (também referido aqui como Ab-24) LC e HC são como segue: Cadeia leve: Sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab- 24 LC: QQKPGQPPKL YCQQSNEDPF NNFYPKDINV ERHNSYTCEA 201 THKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID n°.:350) Sequência de ácidos nucléicos codificando a forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-24 LC: 1 GACATTGTGT TGACCCAGTC TCCAGCTTCT TTGGCTGTGT CTCTAGGGCA 51 GAGGGCCACC ATCGCCTGCA AGGCCAGCCA AAGTGTTGAT TATGATGGTA 101 CTAGTTATAT GAATTGGTAC CAACAGAAAC CAGGACAGCC ACCCAAACTC 151 CTCATCTATG CTGCATCCAA TCTAGAATCT GAGATCCCAG CCAGGTTTAG 201 TGGCACTGGG TCTGGGACAG ACTTCACCCT CAACATCCAT CCTGTGGAGG 251 AGGAGGATAT CACAACCTAT TACTGTCAGC AAAGTAATGA GGATCCGTTC 301 ACGTTCGGAG GGGGGACCAA GTTGGAAATA AAACGGGCTG ATGCTGCACC 351 AACTGTATCC ATCTTCCCAC CATCCAGTGA GCAGTTAACA TCTGGAGGTG 401 CCTCAGTCGT GTGCTTCTTG AACAACTTCT ACCCCAAAGA CATCAATGTC 451 AAGTGGAAGA TTGATGGCAG TGAACGACAA AATGGCGTCC TGAACAGTTG 501 GACTGATCAG GACAGCAAAG ACAGCACCTA CAGCATGAGC AGCACCCTCA 551 CGTTGACCAA GGACGAGTAT GAACGACATA ACAGCTATAC CTGTGAGGCC 601 ACTCACAAGA CATCAACTTC ACCCATTGTC AAGAGCTTCA ACAGGAATGA 651 GTGTTAG (SEQ ID n°.:354) Sequência de aminoácidos de Ab-24 LC incluindo peptídeo sinal: 1 METDTILLWV LLLWVPGSTG DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT IACKASQSVD 51 YDGTSYMNWY QQKPGQPPKL LIYAASNLES EIPARFSGTG SGTDFTLNIH 101 PVEEEDITTY YCQQSNEDPF TFGGGTKLEI KRADAAPTVS IFPPSSEQLT 151 SGGASVVCFL NNFYPKDINV KWKIDGSERQ NGVLNSWTDQ DSKDSTYSMS 201 STLTLTKDEY ERHNSYTCEA THKTSTSPIV KSFNRNEC (SEQ ID n°.:355) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-24 LC incluindo a sequência de codificação do peptídeo sinal: 1 ATGGAGACAG ACACAATCCT GCTATGGGTG CTGCTGCTCT GGGTTCCAGG 51 CTCCACTGGT GACATTGTGT TGACCCAGTC TCCAGCTTCT TTGGCTGTGT 101 CTCTAGGGCA GAGGGCCACC ATCGCCTGCA AGGCCAGCCA AAGTGTTGAT 151 TATGATGGTA CTAGTTATAT GAATTGGTAC CAACAGAAAC CAGGACAGCC 201 ACCCAAACTC CTCATCTATG CTGCATCCAA TCTAGAATCT GAGATCCCAG 251 CCAGGTTTAG TGGCACTGGG TCTGGGACAG ACTTCACCCT CAACATCCAT 301 CCTGTGGAGG AGGAGGATAT CACAACCTAT TACTGTCAGC AAAGTAATGA 351 GGATCCGTTC ACGTTCGGAG GGGGGACCAA GTTGGAAATA AAACGGGCTG 401 ATGCTGCACC AACTGTATCC ATCTTCCCAC CATCCAGTGA GCAGTTAACA 451 TCTGGAGGTG CCTCAGTCGT GTGCTTCTTG AACAACTTCT ACCCCAAAGA 501 CATCAATGTC AAGTGGAAGA TTGATGGCAG TGAACGACAA AATGGCGTCC 551 TGAACAGTTG GACTGATCAG GACAGCAAAG ACAGCACCTA CAGCATGAGC 601 AGCACCCTCA CGTTGACCAA GGACGAGTAT GAACGACATA ACAGCTATAC 651 CTGTGAGGCC ACTCACAAGA CATCAACTTC ACCCATTGTC AAGAGCTTCA 701 ACAGGAATGA GTGTTAG (SEQ ID n°.:356) Cadeia pesada Ab-24: Sequência de aminoácidos de forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab- 24 HC: 1 QVQLQQPGTE LVRPGTSVKL SCKASGYIFT TYWMNWVKQR PGQGLEWIGM 51 IHPSASEERL DQKFKDKATL TLDKSSSTAY MHLSGPTSVD SAVYYCARSG 101 EWGSMDYWGQ GTSVTVSSAK TTPPSVYPLA PGSAAQTNSM VTLGCLVKGY 151 FPEPVTVTWN SGSLSSGVHT FPAVLQSDLY TLSSSVTVPS STWPSETVTC 201 NVAHPASSTK VDKKIVPRDC GCKPCICTVP EVSSVFIFPP KPKDVLTITL 251 TPKVTCVVVD ISKDDPEVQF SWFVDDVEVH TAQTQPREEQ FNSTFRSVSE 301 LPIMHQDWLN GKEFKCRVNS AAFPAPIEKT ISKTKGRPKA PQVYTIPPPK 351 EQMAKDKVSL TCMITDFFPE DITVEWQWNG QPAENYKNTQ PIMDTDGSYF 401 IYSKLNVQKS NWEAGNTFTC SVLHEGLHNH HTEKSLSHSP GK(SEQ ID n°.-357) Sequência de ácidos nucléicos codificando a forma madura (peptídeo sinal removido) de Ab-24 HC: 1 CAGGTCCAAC TACAGCAGCC TGGGACTGAG CTGGTGAGGC CTGGAACTTC 51 AGTGAAGTTG TCCTGTAAGG CTTCTGGCTA CATCTTCACC ACCTACTGGA 101 TGAACTGGGT GAAACAGAGG CCTGGACAAG GCCTTGAGTG GATTGGCATG 151 ATTCATCCTT CCGCAAGTGA AATTAGGTTG GATCAGAAAT TCAAGGACAA 201 GGCCACATTG ACTCTTGACA AATCCTCCAG CACAGCCTAT ATGCACCTCA 251 GCGGCCCGAC ATCTGTGGAT TCTGCGGTCT ATTACTGTGC AAGATCAGGG 301 GAATGGGGGT CTATGGACTA CTGGGGTCAA GGAACCTCAG TCACCGTCTC 351 CTCAGCCAAA ACGACACCCC CATCTGTCTA TCCACTGGCC CCTGGATCTG 401 CTGCCCAAAC TAACTCCATG GTGACCCTGG GATGCCTGGT CAAGGGCTAT 451 TTCCCTGAGC CAGTGACAGT GACCTGGAAC TCTGGATCCC TGTCCAGCGG 501 TGTGCACACC TTCCCAGCTG TCCTGCAGTC TGACCTCTAC ACTCTGAGCA 551 GCTCAGTGAC TGTCCCCTCC AGCACCTGGC CCAGCGAGAC CGTCACCTGC 601 AACGTTGCCC ACCCGGCCAG CAGCACCAAG GTGGACAAGA AAATTGTGCC 651 CAGGGATTGT GGTTGTAAGC CTTGCATATG TACAGTCCCA GAAGTATCAT 701 CTGTCTTCAT CTTCCCCCCA AAGCCCAAGG ATGTGCTCAC CATTACTCTG 751 ACTCCTAAGG TCACGTGTGT TGTGGTAGAC ATCAGCAAGG ATGATCCCGA 801 GGTCCAGTTC AGCTGGTTTG TAGATGATGT GGAGGTGCAC ACAGCTCAGA 851 CGCAACCCCG GGAGGAGCAG TTCAACAGCA CTTTCCGCTC AGTCAGTGAA 901 CTTCCCATCA TGCACCAGGA CTGGCTCAAT GGCAAGGAGT TCAAATGCAG 951 GGTCAACAGT GCAGCTTTCC CTGCCCCCAT CGAGAAAACC ATCTCCAAAA 1001 CCAAAGGCAG ACCGAAGGCT CCACAGGTGT ACACCATTCC ACCTCCCAAG 1051 GAGCAGATGG CCAAGGATAA AGTCAGTCTG ACCTGCATGA TAACAGACTT 1101 CTTCCCTGAA GACATTACTG TGGAGTGGCA GTGGAATGGG CAGCCAGCGG 1151 AGAACTACAA GAACACTCAG CCCATCATGG ACACAGATGG CTCTTACTTC 1201 ATCTACAGCA AGCTCAATGT GCAGAAGAGC AACTGGGAGG CAGGAAATAC 1251 TTTCACCTGC TCTGTGTTAC ATGAGGGCCT GCACAACCAC CATACTGAGA 1301 AGAGCCTCTC CCACTCTCCT GGTAAATGA (SEQ ID n°.:361) Sequência de aminoácidos de Ab-24 HC incluindo peptídeo sinal: 1 MGWSSIILFL VATATGVHSQ VQLQQPGTEL VRPGTSVKLS CKASGYIFTT 51 YWMNWVKQRP GQGLEWIGMI HPSASEIRLD QKFKDKATLT LDKSSSTAYM 101 HLSGPTSVDS AVYYCARSGE WGSMDYWGQG TSVTVSSAKT TPPSVYPLAP 151 GSAAQTNSMV TLGCLVKGYF PEPVTVTWNS GSLSSGVHTF PAVLQSDLYT 201 LSSSVTVPSS TWPSETVTCN VAHPASSTKV DKKIVPRDCG CKPCICTVPE 251 VSSVFIFPPK PKDVLTITLT PKVTCVVVDI SKDDPEVQFS WFVDDVEVHT 301 AQTQPREEQF NSTFRSVSEL PIMHQDWLNG KEFKCRVNSA AFPAPIEKTI 351 SKTKGRPKAP QVYTIPPPKE QMAKDKVSLT CMITDFFPED ITVEWQWNGQ 401 PAENYKNTQP IMDTDGSYFI YSKLNVQKSN WEAGNTFTCS VLHEGLHNHH 451 TEKSLSHSPG K (SEQ ID n°.:362) Sequência de ácidos nucléicos de Ab-24 HC incluindo a sequência de codificação de peptídeo sinal: 1 ATGGGATGGA GCTCTATCAT CCTCTTCTTG CTACAGGTGT (51) CCACTCCCAG GTCCAACTAC AGCAGCCTGG GTGAGGCCTG 101 GAACTTCAGT GAAGTTGTCC TGTAAGGCTT CTTCACCACC 151 TACTGGATGA ACTGGGTGAA ACAGAGGCCT TTGAGTGGAT 201 TGGCATGATT CATCCTTCCG CAAGTGAAAT CAGAAATTCA 251 AGGACAAGGC CACATTGACT CTTGACAAAT AGCCTATATG 301 CACCTCAGCG GCCCGACATC TGTGGATTCT ACTGTGCAAG 351 ATCAGGGGAA TGGGGGTCTA TGGACTACTG ACCTCAGTCA 401 CCGTCTCCTC AGCCAAAACG ACACCCCCAT ACTGGCCCCT 451 GGATCTGCTG CCCAAACTAA CTCCATGGTG GCCTGGTCAA 501 GGGCTATTTC CCTGAGCCAG TGACAGTGAC GGATCCCTGT 551 CCAGCGGTGT GCACACCTTC CCAGCTGTCC CCTCTACACT 601 CTGAGCAGCT CAGTGACTGT CCCCTCCAGC GCGAGACCGT 651 CACCTGCAAC GTTGCCCACC CGGCCAGCAG GACAAGAAAA 701 TTGTGCCCAG GGATTGTGGT TGTAAGCCTT GCATATGTAC AGTCCCAGAA 751 GTATCATCTG TCTTCATCTT CCCCCCAAAG CCCAAGGATG TGCTCACCAT 801 TACTCTGACT CCTAAGGTCA CGTGTGTTGT GGTAGACATC AGCAAGGATG 851 ATCCCGAGGT CCAGTTCAGC TGGTTTGTAG ATGATGTGGA GGTGCACACA 901 GCTCAGACGC AACCCCGGGA GGAGCAGTTC AACAGCACTT TCCGCTCAGT 951 CAGTGAACTT CCCATCATGC ACCAGGACTG GCTCAATGGC AAGGAGTTCA 1001 AATGCAGGGT CAACAGTGCA GCTTTCCCTG CCCCCATCGA GAAAACCATC 1051 TCCAAAACCA AAGGCAGACC GAAGGCTCCA CAGGTGTACA CCATTCCACC 1101 TCCCAAGGAG CAGATGGCCA AGGATAAAGT CAGTCTGACC TGCATGATAA 1151 CAGACTTCTT CCCTGAAGAC ATTACTGTGG AGTGGCAGTG GAATGGGCAG 1201 CCAGCGGAGA ACTACAAGAA CACTCAGCCC ATCATGGACA CAGATGGCTC 1251 TTACTTCATC TACAGCAAGC TCAATGTGCA GAAGAGCAAC TGGGAGGCAG 1301 GAAATACTTT CACCTGCTCT GTGTTACATG AGGGCCTGCA CAACCACCAT 1351 ACTGAGAAGA GCCTCTCCCA CTCTCCTGGT AAATGA (SEQ ID n°.:363) As sequências na região variável CDR da cadeia leve de Ab-24 são como segue: CDR-L1: KASQSVDYDGTSYMN (SEQ ID n°.:351) CDR-L2: AASNLES (SEQ ID n°.:352) CDR-L3: QQSNEDPFT (SEQ ID n°.:353) As sequências de CDR na região variável da cadeia pesada de Ab-24 são como segue: CDR-H1: TYWMN (SEQ ID n°.:358) CDR-H2: MIHPSASEIRLDQKFKD (SEQ ID n°.:359) CDR-H3: SGEWGSMDY (SEQ ID NC-.360)
[00111] A tabela 1 abaixo fornece as SEQ ID n°. e sequências de aminoácidos das CDR's de Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab- 6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23, e Ab-24. L1, L2, e L3 se referem às CDR's de cadeia leve 1, 2, e 3, e H1, H2, e H3 se referem às CDR's de cadeia pesada 1, 2, e 3 de acordo com o sistema de numeração de Kabat (Kabat et al, 1987 em Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, NIH, EUA).
Figure img0001
Figure img0002
Figure img0003
Figure img0004
[00112] Um oligopeptídeo ou polipeptídeo está no âmbito de aplicação da invenção se ele tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84 %, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ao menos a um de CDR's da tabela 1 supra, e/ou a uma CDR de um agente de ligação à esclerostina que bloqueia de modo cruzado a ligação de pelo menos um dos anticorpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, AbD, Ab -1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23, e Ab-24 para esclerostina, e/ou seja bloqueado de modo cruzado de se ligar a esclerostina em pelo menos um dos anticorpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab- 6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab -18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23, e Ab-24; e/ou de uma CDR de um agente de ligação à esclerostina onde o agente de ligação pode bloquear o efeito inibitório da esclerostina Em um ensaio de mineralização com base na célula (isto é, um agente de ligação que neutraliza a esclerostina), e/ou a uma CDR de um agente de ligação à esclerostina que se liga a uma alça 2 epítopo; e/ou de uma CDR de um agente de ligação à esclerostina que se liga a um epítopo T20.6; e/ou de uma CDR de um agente de ligação à esclerostina que se liga a uma “epítopo derivado T20.6 (nó de cistina + 4 braços)”.
[00113] Os agentes de ligação à esclerostina polipeptídeos e anticorpos estão no âmbito da invenção se tiverem sequências de aminoácidos que são pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas a uma região variável de pelo menos um dos anticorpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab- 11, Ab-12, Ab -13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23, e Ab-24, e bloquearem de modo cruzado a ligação de pelo menos um dos anticorpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23, e Ab-24 para esclerostina, e/ou são bloqueados de modo cruzado desde a ligação à esclerostina em pelo menos um dos anticorpos Ab-A, AbB, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-1 litro, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab- 23, E Ab-24; e/ou podem bloquear o efeito inibitório de esclerostina em um ensaio de mineralização com base na célula (isto é, um agente de ligação que neutraliza a esclerostina), e/ou ligar para um epítopo de volta 2; e/ou ligar para um epítopo T20.6; e/ou ligar para um “ epítopo T20.6 derivado (nó de cistina + 4 braços)”.
[00114] A codificação de polinucleotídeos de agentes de ligação à esclerostina está no âmbito da invenção se tiverem sequências polinucleotídicas que são pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma codificação polinucleotídicas uma variável região de pelo menos um dos anticorpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab -2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab- 17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23, e Ab-24, e onde os agentes de ligação de esclerostina codificados bloqueiam de modo cruzado a ligação de pelo menos um dos anticorpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab- 8, Ab-9, Ab-10, Ab-1l, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab- 20, Ab-21, Ab-22, Ab-23, e Ab-24 para esclerostina, e/ou são bloqueados de modo cruzado desde a ligação à esclerostina em pelo menos um dos anticorpos Ab-A, AbB, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab- 23, e Ab-24; e/ou podem bloquear o efeito inibitório da esclerostina em um ensaio de mineralização com base em célula (ou seja, um agente de ligação que neutraliza a esclerostina), e/ou ligar a um epítopo de volta 2; e/ou ligar para um epítopo T20.6; e/ou ligar para um “ epítopo derivado T20.6 (nó de cistina + 4 braços)”.
[00115] Anticorpos, de acordo com a invenção pode ter um carácter de afinidade de ligação para esclerostina humana igual ou inferior a 1 x 10 -7 M, inferior ou igual a 1 x 10 -8 M, inferior ou igual a 1 x 10 -9 M, inferior ou igual a 1 x 10 -10 M, inferior ou igual a 1 x 10 -11 M, ou inferiores ou iguais a Ix 10 -12 M.
[00116] A afinidade de um agente de ligação, como um anticorpo ou parceiro de ligação, bem como a medida em que um agente de ligação (como um anticorpo) inibe a ligação, pode ser determinado por alguém versado na técnica utilizando técnicas convencionais, por exemplo as mesmas descritas por Scatchard et al. (Ann. KY. Acad. Sci. 51:660-672 (1949)) ou pela ressonância de plásmons de superfície (SPR; BIAcore, Biosensor, Piscataway, NJ). Para ressonância de plasmon de superfície, moléculas alvo são imobilizadas em uma fase sólida e expostas a ligantes em uma fase móvel correndo junto a um fluxo de células. Se a ligação do ligante ao alvo imobilizado ocorre, o índice de refração local se altera, levando a uma mudança no ângulo SPR, que pode ser acompanhada em tempo real pela deteção de variações na intensidade da luz refletida. As taxas de variação do sinal SPR podem ser analisadas para render as constantes de taxa aparente para as fases de associação e dissociação da reação de ligação. A proporção destes valores dá a constante de equilíbrio aparente (afinidade) (veja, por exemplo, Wolff et al., Cancer Res. 53:2560-65 (1993)).
[00117] Um anticorpo, de acordo com a presente invenção pode pertencer a qualquer classe de imunoglobina, por exemplo IgG, IgE, IgM, IgD, ou IgA. Ele pode ser obtido a partir de ou proveniente de um animal, por exemplo, aves (por exemplo, frango) e mamíferos, que inclui mas não se limita a um camundongo, rato, hamster, coelho, ou de outros roedores, vaca, cavalo, ovelha, cabra, camelo, ser humano, ou de outros primatas. O anticorpo pode ser um anticorpo de internalização. A produção de anticorpos é geralmente divulgada na Publicação de Patente US No. 2004/0146888 Al.
Ensaios de Caracterização
[00118] Nos métodos descritos acima para gerar anticorpos, de acordo com a invenção, incluindo a manipulação de CDRs específicas Ab-A, Ab-B, Ab-C, AbD, e Anticorpo 1.24 (Ab-1 a Ab-24) em novos frameworks e/ou regiões constantes, estão disponíveis ensaios adequados para selecionar os agentes de ligação ou anticorpos desejados (isto é, ensaios para a determinação da afinidade de ligação para esclerostina; ensaios de bloqueio cruzado; “ensaio de ligação de competiçãode de epítopo de peptídeo de esclerostina humana” baseado em Biacore; ensaio MC3T3- E1 baseada na célula; in vivo).
Ensaio de Ligação ao Epítopo
[00119] A esclerostina humana de forma madura é uma glicoproteína de 190 aminoácidos com uma estrutura em nó de cistina (Figuras 8 e 9). Para além da estrutura em nó de cistina, a proteína é caracterizada como tendo três voltas designado volta 1, volta 2 e volta 3. A esclerostina Humana foi submetida a digestão proteolítica para produzir fragmentos. Resumidamente, utilizando diferentes proteases, incluindo tripsina, aspN, e lysC, fragmentos com diversos tamanhos e sítios de clivagem foram gerados. As sequências e massa para várias peptídeos de esclerostina humana foram determinados. A proteção do anticorpo foi avaliada para determinar o efeito sobre a acessibilidade para proteólise, incluindo o mascaramento do sítio retirado e troca de peptídeo. Finalmente, um “ensaio de ligação de competiçãode de epítopo de peptídeo de esclerostina humana” baseado em Biacore foi realizada.
[00120] A exposição de esclerostina da clivagem da tripsina resultou em um padrão de fragmentos de peptídeo como resumido na figura 13. Os fragmentos são referidos como T19.2, T20, T20.6, e T21-22. Como demonstrado esquematicamente na figura 19B, o epítopo T20.6 é um complexo de quatro sequências de peptídeos distintas que estão unidas por três ligações dissulfeto na região do nó de cistina. Dois dos peptídeos são ligados por duas ligações dissulfeto. Os outros dois peptídeos estão ligados por uma ligação dissulfeto que, esquematicamente, divide os dois primeiros polipeptídeos.
[00121] O epítopo T20.6 que foi gerado por digestão por tripsina mantém a estrutura de nó de cistina do polipeptídeo nativo e é reconhecido por anticorpos Ab e Ab-C-D. O epítopo T20.6 derivado consiste em região de nó de cistina e aminoácidos 58-64, 73-81, 112-117 e 138-141 em posição de sequência com referência à SEQ ID n°.: 1. Este epítopo derivado é mostrado na Figura 21. Um epítopo compreendendo a região do nó de cistina pode ter um ou mais aminoácidos, que estão presentes no epítopo T20.6 (Figura 19B), mas que não estão presentes na Epítopo derivado T20.6 (Figura 21).
[00122] Outra região contendo epítopo foi identificada na região de volta 2 de esclerostina humana (Figura 19A) e é reconhecida por anticorpos Ab-A, Ab-B. O epítopo de volta 2 compreende os aminoácidos 86-111 da SEQ ID n°.: 1 (C4GPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRC5, SEQ ID n°.: 6). Etericamente, com referência à esclerostina de extensão completa da SEQ ID n°.: 1, a estrutura contendo volta 2 é definida em uma extremidade por uma ligação dissulfeto entre a cisteína na posição 86 (C4) e a cisteína na posição 144 (C8), e no outro extremo por uma ligação dissulfeto entre cisteína na posição 111 (C5) e a cisteína na posição 57 (C1).
[00123] Os peptídeos gerados pela clivagem aspN da esclerostina humana são mostrados na Figura 12. Na figura, esses peptídeos são designados como AspN14.6, AspN18.6, e AspN22.7-23,5, e também são mencionados neste documento como N14.6, N18.6, N22.7-23,5, respectivamente.
[00124] Um grupo de anticorpos específicos exibe um padrão de ligação a certos epítopos como evidenciado por um “ensaio de ligação de competiçãode de epítopo de peptídeo de esclerostina humana” baseado em Biacore. Resumidamente, o anticorpo é preincubado com o epítopo a ser testado, em concentrações que vão saturar os sítios de ligação ao epítopo sobre o anticorpo. O anticorpo é então exposto à esclerostina ligada à superfície de um chip. Após os procedimentos adequados de incubação e lavagem, um padrão de competitividade de ligação é estabelecido. Como mostrado na Figura 18, anticorpos Ab-D exemplares ligados a moléculas de esclerostina ligadas à superfície do chip. A preincubação de anticorpo Ab-D com esclerostina diminuiu a ligação do anticorpo à esclerostina sobre o chip para próximo de zero. A preincubação com um peptídeo constituído por epítopo T19.2 mostrou que T19.2 não compete com esclerostina para ligação com anticorpos. No entanto, a preincubação com qualquer um dos epítopos designados T20, T20.6, T21-22, ou N22.7-23,5 aboliu uma grande proporção de ligação do anticorpo à esclerostina no chip. Em contraste, a preincubação do anticorpo com qualquer um dos epítopos designados T19.2, N14.6 ou N18.6 não aboliu a capacidade de produção de anticorpos para ligar à esclerostina. Um segundo anticorpo exemplar com este perfil de ligação (Fig. 17) é Ab-C.
[00125] O anticorpo Ab-D, portanto, é exemplar e representante de um grupo de anticorpos que se ligam aos epítopos T20, T20.6, T21-22, e N22.7-23,5, e têm ligação detectável mínima para epítopos T19,2, N14.6 e N18,6, conforme medido pela capacidade de bloquear a ligação anticorpo à esclerostina. Os anticorpos que têm esta ligação padrão característica podem ou não compartilhar sequências de aminoácidos de uma ou mais regiões da molécula de anticorpo. A similaridade do anticorpo é determinada funcionalmente, como pela capacidade de se ligar à esclerostina em seguida à preincubação com cada um dos epítopos descritos acima. Os anticorpos que apresentam uma ligação padrão ou idêntica àquela do anticorpo Ab-D estão incluídos na invenção. Por “similar a” se entende, por exemplo, que o anticorpo exibrá ligações para cada um dos polipeptídeos T20, T20.6, T21-22 e N22.7- 23,5 no qual essa ligação competirá especificamente com pelo menos 50% das ligações ao anticorpo para esclerostina que, de outra forma, ocorreria na ausência de preincubação com esclerostina ou um peptídeo de esclerostina. O anticorpo também apresenta pouca ou nenhuma ligação detectável para polipeptídeos T19,2, N14.6 e N18,6, resultando em uma redução de 30% ou menos do que seria ligação ocorrer na ausência de a preincubação com esclerostina ou um peptídeo esclerostina.
[00126] Por exemplo, sem estar ligado por um mecanismo especial, o padrão de ligação do anticorpo da Figura 18 sugere que o epítopo do espaço a que o anticorpo Ab-D e outros anticorpos com o padrão de ligação do epítopo de Ab-D ligar consiste de um polipeptídeo compreendendo a região do nó de cistina de esclerostina.
[00127] Assim, e como divulgado aqui e com referência à figura 19B, um epítopo T20.6 exemplar compreende quatro cadeias peptídicas ligadas através de três ligações dissulfeto distintas. A cadeia peptídica SAKPVTELVC3SGQC4GPAR (SEQ ID n°.: 3) é anexada à cadeia peptídica LVASC7KC8KRLTR (SEQ ID n°.: 5) por ligações dissulfeto de C3 para C1 e, a partir C4 a C8. A cadeia peptídica DVSEYSCIRELHFTR (SEQ ID n°.: 2) é anexada à cadeia peptídica WWRPSGPDFRC5IPDRYR (SEQ ID n°.: 4) por uma ligação dissulfeto de C1 a C5. Os polipeptídeos de SEQ ID n°.s: 3 e 5 permanecem associados aos polipeptídeos de SEQ ID n°.s: 2 e 4 através de uma construção estérica pelo qual a ligação C1-C5 cruza o plano das ligações C4-C8 e C3-C7 e está localizada entre as mesmas, conforme ilustrado na Figura 19B.
[00128] Como divulgado aqui e com referência à Figura 21, um epítopo exemplar derivado de T20.6 compreende quatro cadeias peptídicas ligadas através de três ligações dissulfeto distintas. A cadeia peptídica SAKPVTELVC3SGQC4 (SEQ ID n°.: 70) é anexada à cadeia peptídica LVASC7KC8 (SEQ ID n°.: 71) por ligações dissulfeto de C3 a C7 e, a partir C4 a C8. A cadeia peptídica C1RELHFTR (SEQ ID n°.: 72) é anexada à cadeia peptídica C5IPDRYR (SEQ ID n°.: 73) por uma ligação dissulfeto de C1 para C5. Os polipeptídeos de SEQ ID n°: 70 e 71 permanecem associados aos polipeptídeos de SEQ ID n°.s: 72 e 73 através de uma construção estérica pelo qual a ligação C1-C5 cruza o plano das ligações C4-C8 e C3-C7 e está localizado entre as mesmoas, conforme ilustrado na Figura 21.
[00129] O anticorpo Ab-A é exemplar e representante de um segundo grupo de anticorpos que têm uma ligação padrão característica para peptídeos de esclerostina humana que é distinta da que obteve para anticorpos Ab e Ab-C-D. AbA, e o grupo de anticorpos que representa se liga ao epítopo N22.7-23.5 e têm ligação mínima detectável para epítopos T19.2, T20, T20.6, T21-22, N14.6 ou N18,6, conforme medido pela capacidade de bloquear a ligação anticorpo à esclerostina (Fig 15). Um segundo anticorpo exemplar com este perfil de ligação (Fig. 16) é Ab-B. Anticorpos ter esta característica ligação padrão pode ou não partes sequência aminoacídica de uma ou mais regiões da molécula do anticorpo. A similaridade do anticorpo é determinada funcionalmente, como pela capacidade de se ligar à esclerostina em seguida à preincubação com cada um dos epítopos descritos acima. Os anticorpos que apresentam um padrão de ligação similar ou idêntico àquele do anticorpo Ab-A são incluídos na invenção. Por “similar a” se entende, por exemplo, que o anticorpo irá exibir a ligação ao polipeptídeo N22.7-23.5 onde essa ligação competirá especificamente com pelo menos 50% do anticorpo da ligação à esclerostina que, de outra forma, ocorre na ausência da preincubação com esclerostina ou um peptídeo esclerostina. O anticorpo também apresenta pouca ou nenhuma ligação detectável para polipeptídeos T19.2, T20, T20.6, T21-22, N14.6 e N18.6, resultando em uma redução de 30% ou menos da ligação que ocorreria na ausência de preincubação com esclerostina ou um peptídeo esclerostina.
[00130] Por exemplo, sem estar ligado por um mecanismo especial, a ligação padrão do anticorpo da Figura 15 sugere que o espaço do epítopo a que o anticorpo Ab-A e outros anticorpos com a ligação padrão ao epítopo da ligação Ab-A consiste de um polipeptídeo compreendendo a região da volta 2 de esclerostina. Assim, e como divulgado aqui e com referência à figura 19A, a região de volta 2 pode ser descrita como um peptídeo linear, mas adquire uma estrutura terciária quando está presente em esclerostina nativa ou uma porção de esclerostina contendo nó de cistina em que a estrutura de ligação dissulfeto nativa é mantida. A estrutura linear ou terciária da epítopo de volta 2 pode afetar ligação do anticorpo a mesma, como discutido nos Exemplos. A região de volta 2 pode incluir a seguinte sequência de aminoácidos: C4GPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRC5 (SEQ ID N0: 6). “C4” se refere a um resíduo cisteína localizado na posição 86 com referência a SEQ ID n°.: 1. “C5” se refere a um resíduo cisteína localizado na posição 111 com referência à SEQ ID n°.: 1. Em proteína escelrostina nativa, C4 está ligado a uma cisteína na posição 144 (C8) por uma ligação dissulfeto, e C5 está ligado a uma cisteína na posição 57 (C1) por uma ligação dissulfeto. Epítopos derivados da região de volta 2 incluem CGPARLLPNAIGRGKWWRPS (SEQ ID n°.: 63); GPARLLPNAIGRGKWWRPSG (SEQ ID n°.: 64); PARLLPNAIGRGKWWRPSGP (SEQ ID n°.: 65);ARLLPNAIGRGKWWRPSGPD (SEQ ID n°.: 66); RLLPNAIGRGKWWRPSGPDF (SEQ ID n°.: 67); LLPNAIGRGKWWRPSGPDFR (SEQ ID n°.: 68); e LPNAIGRGKWWRPSGPDFRC (SEQ ID n°.: 69)
Ensaios de Bloqueio Cruzado
[00131] Os termos “bloquear cruzado”, “bloqueado de modo cruzado” e “bloqueio de modo cruzado” são utilizados indiferentemente aqui para significar a capacidade de um anticorpo ou outro agente de ligação de interferir com a ligação de anticorpos ou outros agentes de ligação para esclerostina.
[00132] A extensão a qual um anticorpo ou outro agente de ligação é capaz de interferir com a ligação de um outro para esclerostina, e, portanto, pode-se dizer que o mesmo bloqueia de modo cruzado, de acordo com a invenção, pode ser determinada utilizando a ensaios de competição de ligação. Um ensaio quantitativo particularmente adequado utiliza um máquina Biacore que permite medir o grau de interações com tecnologia de ressonância de plasmon de superfície. Outro teste quantitativo adequado de bloqueio cruzado utiliza uma abordagem baseada em ELISA para medir a concorrência entre os anticorpos ou outros agentes de ligação em termos da sua ligação à esclerostina.
Ensaio de Bloqueio Cruzado Biacore
[00133] O seguinte geralmente descreve um ensaio Biacore adequado para determinar se um anticorpo ou outro agente de ligação bloqueia de modo cruzado ou é capaz de bloquear de modo cruzado, de acordo com a invenção. Por conveniência é feita referência a dois anticorpos, mas será apreciado que o teste pode ser usado com qualquer dos agentes de ligação à esclerostina aqui descritos. A máquina Biacore (por exemplo, Biacore 3000) é operada em conformidade com as recomendações do fabricante.
[00134] Assim, em um ensaio de bloqueio cruzado, a esclerostina é acoplada a um chip Biacore CM5 utilizando acoplamento químico amina padrão para gerar uma esclerostina-revestidos superfície. Tipicamente 200-800 unidades de ressonância de esclerostina seria acoplado à pastilha (um valor que dá facilmente mensuráveis níveis de carácter ligação, mas que é facilmente saturável pelas concentrações do reagente de ensaio sendo usado).
[00135] Os dois anticorpos (denominados A* e B*), a serem avaliados por sua capacidade de bloquear-se de modo cruzado mutuamente são misturados em uma razão molar um para um de sítios de ligação em um tampão adequado para criar a mistura teste. Ao calcular a concentração em base no sítio de ligação o peso molecular de um anticorpo é considerado como o total de peso molecular do anticorpo dividido pelo número de sítios de ligação à esclerostina naquele anticorpo.
[00136] A concentração de cada anticorpo na mistura teste deve ser alta o suficiente para saturar facilmente os sítios de ligação para aquele anticorpo nas moléculas de esclerostina capturadas no chip Biacore. Os anticorpos na mistura são na mesma concentração molar (em base na ligação), e que a concentração estaria tipicamente entre 1,00 e 1,5 micromolar (em base na ligação local).
[00137] Soluções separadas contendo o anticorpo A* sozinho e o anticorpo B* sozinho também são preparados. O anticorpo A* e o anticorpo B* nestas soluções devem estar no mesmo tampão e na mesma concentração como na mistura teste.
[00138] A mistura teste é passada ao longo do chip Biacore revestido com esclerostina e a quantidade total de ligações é registrada. O chip são depois tratados de forma adequada para remover os anticorpos ligados sem danificar a esclerostina ligado ao chip. Tipicamente, isto é feito pelo tratamento do chip com HCl 30 mM por 60 segundos. A solução de anticorpos A* sozinhos é, então, passada ao longo da superfície revestida com esclerostina e a quantidade de ligação é registrada. O chip são novamente tratados para remover todos os anticorpos ligados sem danificar a esclerostina ligada ao chip.
[00139] A solução de anticorpo B* sozinho é, então, passada ao longo da superfície revestida com esclerostina e a quantidade de ligações é registrada. A ligação máxima teórica da mistura de anticorpo A* e anticorpo B* é então calculada, e é a soma da ligação de cada anticorpo quando passado sozinho sobre a superfície com esclerostina. Se a ligação real registrada da mistura é inferior a esse máximo teórico, em seguida, os dois anticorpos são mutuamente bloqueados de modo cruzado.
[00140] Assim, em geral, um anticorpo ou outros agente de ligação bloqueado de modo cruzado, de acordo com a invenção é aquele que vai se ligar a esclerostina no referido ensaio de bloqueio cruzado biacore tal que, durante o ensaio e na presença de um segundo anticorpo ou outro agente de ligação da invenção a ligação registrada é de 80% e 0,1% (por exemplo, 80% para 4%) da ligação máxima teórica, especificamente entre 75% e 0,1% (por exemplo, 75% para 4%) da ligação máxima teórica, e muito mais especificamente entre 70% e 0,1% (por exemplo, 70% para 4%), da ligação teórica máxima (tal como acima definido) dos dois anticorpos ou agentes de ligação em combinação.
[00141] O ensaio Biacore descrito acima, é um ensaio primário utilizado para determinar se anticorpos ou outros agentes de ligação se bloqueiam mutuamente de modo cruzado, de acordo com a invenção. Em raras ocasiões particulares anticorpos ou outros agentes de ligação não podem se ligar à esclerostina acoplada através de grupo amina a um chip CM5 Biacore (isto geralmente ocorre quando o respectivo sítio de ligação sobre esclerostina é mascarado ou destruído pelo acoplamento ao chip). Nesses casos o bloqueio cruzado pode ser determinado utilizando uma versão codificada de esclerostina, por exemplo esclerostina de terminal N marcada com His (R & D Systems, Minneapolis, MN, E.U.A.; n° cat 2005 1406-ST- 025). Neste formato específico, um anticorpo anti-His seria acoplado ao chip Biacore e, em seguida, a esclerostina marcada com His seria transmitida ao longo da superfície do chip e capturado pelos anticorpos anti-His. A análise do bloqueio cruzado seria efetuada essencialmente como descrito acima, exceto pelo fato de que, após cada volta de regeneração do chip, nova esclerostina marcada com His seria carregado de volta para a superfície revestida de anticorpo anti-His. Além do exemplo dado usando esclerostina de terminal N marcada com His, esclerostina de terminal C marcada com His poderia ser utilizada como alternativa. Além disso, várias outras combinações de marcadores e proteínas de ligação que são conhecidas na técnica poderiam ser usadas para uma tal análise de bloqueio cruzado (por exemplo, marcador HA com anticorpo anti-HA; marcador FLAG com anti- anticorpo FLAG; marcador biotina com estreptavidina).
Ensaio de Bloqueio Cruzado Baseado em ELISA
[00142] O seguinte geralmente descreve um teste ELISA para determinar se um anticorpo anti-esclerostina ou outra agente de ligação à esclerostina bloqueia de modo cruzado ou é capaz de bloquear de modo cruzado, de acordo com a invenção. Por conveniência, é feita referência a dois anticorpos (Ab-X e Ab-Y), mas será apreciado que o teste pode ser usado com qualquer dos agentes de ligação à esclerostina aqui descritos.
[00143] O princípio geral do ensaio é ter um anticorpo anti-esclerostina revestido nos poços de uma placa ELISA. Uma quantidade excessiva de um segundo anticorpo anti-esclerostina que bloqueia de modo cruzado potencialmente é adicionada em solução (ou seja, que não esteja ligado à placa ELISA). Uma quantidade limitada de esclerostina é então adicionada aos poços. O anticorpo revestido e o anticorpo em solução competem nesta ligação ao número limitado de moléculas de esclerostina. A placa é lavada para remover a esclerostina que não tenha sido ligada ao anticorpo revestido e também para retirar o segundo anticorpo em fase em solução, bem como quaisquer complexos formados entre o segundo anticorpo em fase em solução e a esclerostina. A quantidade de esclerostina ligada depois é medido através de um reagente de deteção de esclerostina adequado. Um anticorpo em solução que é capaz de bloquear de modo cruzado o anticorpo revestido será capaz de provocar uma diminuição do número de moléculas de esclerostina que o anticorpo revestido pode ligar em relação ao número de moléculas de esclerostina que o anticorpo revestido pode ligar na ausência do segundo anticorpo em fase em solução.
[00144] Este ensaio é descrito com mais detalhe mais adiante para Ab-X e Ab-Y. No exemplo, quando Ab-X é escolhido para ser o anticorpo imobilizado, é revestido nos poços da placa ELISA, depois do que as placas são bloqueadas com uma solução de bloqueio adequada para minimizar a ligação não específica de reagentes que são posteriormente acrescentados. Uma quantidade excessiva de Ab- Y é então adicionada à placa ELISA tal que os moles de sítios de ligação de Ab-Y a esclerostina por poço seja pelo menos 10 vezes superior aos moles de sítios de ligação de Ab-X a esclerostina que foram usados, por poço, durante o revestimento da placa ELISA. Esclerostina é em seguida adicionada de modo que os moles de esclerostina acrescentados assim sejam pelo menos 25 vezes inferiores aos moles de sítios de ligação de Ab-X a esclerostina que foram utilizados para o revestimento de cada poço. Após um período de incubação adequado a placa ELISA é lavada e um reagente de deteção de esclerostina é adicionado para medir a quantidade de esclerostina ligada especificamente pelo revestimento anticorpo anti-esclerostina (neste caso Ab-X). O sinal antecedente para o ensaio é definido como o sinal obtido em poços revestidos com o anticorpo (neste caso Ab-X), segundo anticorpo em fase em solução (neste caso Ab-Y), apenas tampão esclerostina (ou seja, sem esclerostina) e reagente de deteção de esclerostina. O controle sinal positivo para o ensaio é definido como o sinal obtido em poços revestidos com o anticorpo (neste caso Ab-X), apenas tampão de segundo anticorpo em fase se solução (ou seja, nenhum segundo anticorpo em fase em solução), esclerostina e reagente de deteção de esclerostina. O teste ELISA deve ser executado de tal maneira, de modo a ter o controle sinal positivo de pelo menos 6 vezes o sinal antecedente.
[00145] Para evitar quaisquer artefatos (por exemplo, afinidades significativamente diferentes entre Ab-X e Ab-Y para esclerostina) resultantes da escolha de qual anticorpos usar como o anticorpo de revestimento e qual usar como o segundo anticorpo (competidor), o ensaio de bloqueio cruzado precisa ser executado em dois formatos:(52) formato 1 é onde Ab-X é o anticorpo que é revestido para a placa ELISA e Ab-Y é o anticorpo competidor, que está em solução e (53) formato 2 é onde Ab-Y é o anticorpo que é revestido para a placa ELISA e Ab-X é o anticorpo competidor que está em solução.
[00146] Ab-X e Ab-Y são definidos como bloqueadores em modo cruzado se, tanto em formato 1 ou em formato 2, o anticorpo anti-esclerostina na fase em solução é capaz de provocar uma redução entre 60% e 100 %, especificamente entre 70% e 100%, e mais especificamente entre 80% e 100%, os sinais de deteção de esclerostina (ou seja, a quantidade de esclerostina ligada pelos anticorpos revestidos), em comparação com o sinal de deteção de esclerostina obtido na ausência do anticorpo na fase em solução anti-esclerostina (ou seja, os poços controle positivo).
[00147] Um exemplo deste ensaio de bloqueio cruzado baseado em ELISA pode ser encontrada em Exemplo 7 (“ ensaio de bloqueio cruzado baseado em ELISA “).
Ensaio de Neutralização com Base na Célula
[00148] A mineralização por células em cultura de linhagem de osteoblastos, tanto células primárias como linhagens celulares, é usada como um modelo da formação in vitro do osso. A mineralização leva cerca de uma a seis semanas para ocorrer com a indução da diferenciação de células de linhagem de osteoblastos através de um ou mais agentes de diferenciação. A sequência global de eventos envolve a proliferação celular, diferenciação, produção de matriz extracelular, a maturação da matriz e finalmente deposição de minerais, que se refere à cristalização e/ou deposição de fosfato de cálcio. Esta sequência de eventos que começa com a proliferação celular e diferenciação, e que termina com a deposição de minerais é aqui referida como mineralização. A medição de cálcio (mineral), é o resultado do ensaio.
[00149] Células MC3T3-E1 (Sudo H, Kodama H-A, Amagai Y, Yamamoto S, Kasai S. 1983. In vitro differentiation and calcification in a new clonal osteogenic cell line derived fi'om newborn mouse calvaria. J. Cell Biol. 96:191-198) E subclones da linhagem celular original pode formar minerais na cultura em crescimento na presença de agentes diferenciadores. Tais subclones incluem MC3T3-E1-BF (Smith E, Redman R, Logg C, Coetzee G, Kasahara N, Frenkel B. 2000. Glucocorticoids inhibit developmental stage-specific osteoblast cell cycle. J. Biol. Chem. 275:1999220001). Para ambos os subclones MC3T3-E1-BF, bem como as células originais MC3T3-E1, a esclerostina pode inibir uma ou mais das sequências de acontecimentos que levam à deposição de minerais, inclusive a própria (ou seja, a esclerostina inibe mineralização). Anticorpos anti-esclerostina que são capazes de neutralizar a atividade inibitória esclerostina permitir a mineralização da cultura na presença de esclerostina tal, que não há um aumento estatisticamente significativo na deposição de fosfato de cálcio (medido como cálcio), em comparação com a quantidade de cálcio medido na grupo de tratamento de apenas esclerostina (ou seja, nenhum anticorpo). Os anticorpos utilizados nas experiências do ensaio de mineralização com base na célula mostradas nas Figuras 22, 23 e 24 têm um peso molecular de cerca de 145 kD e têm 2 esclerostina sítios de ligação por molécula de anticorpo.
[00150] Ao executar o teste, com o objetivo de determinar se um determinado anticorpo anti-esclerostina ou agente de ligação anti-esclerostina pode neutralizar a esclerostina (ou seja, é um anticorpo ou derivado do mesmo que neutraliza a esclerostina, ou é um agente de ligação que neutraliza a esclerostina), a quantidade de esclerostina utilizada no ensaio deve ser o valor mínimo de esclerostina que provoca pelo menos um 70%, estatisticamente significativamente, a redução da deposição de fosfato de cálcio (medido como cálcio) no grupo de apenas esclerostina, em comparação com a quantidade de cálcio deve ser medido no grupo sem esclerostina. Um anticorpo neutralizador anti-esclerostina ou um agente de ligação neutralizador anti-esclerostina é definido como aquele que provoca um aumento estatisticamente significativo na deposição de fosfato de cálcio (medido como cálcio), em comparação com a quantidade de cálcio medido no grupo de tratamento com apenas esclerostina (ou seja, sem anticorpo, sem agente de ligação). Para determinar se um anticorpo anti-esclerostina ou um anti-agente de ligação à esclerostina é neutralizado ou não, a quantidade do direito anticorpo anti-esclerostina ou anti-agente de ligação à esclerostina utilizado no ensaio deve ser tal que exista um excesso de moles de sítios de ligação esclerostina por poço, em comparação com o número de moles de esclerostina por poço. Dependendo da potência do anticorpo, o excesso que pode ser exigido podem ser de 24, 18, 12, 6, 3 ou 1,5 vezes, e alguém versado na técnica está familiarizado com a rotina prática dos testes mais de uma concentração de agente de ligação. Por exemplo, uma anticorpo anti-esclerostina muito potente neutralizador ou agente de ligação neutralizador anti-esclerostina será capaz de neutralizar a esclerostina mesmo quando há um excesso de menos de 6 vezes aos moles de sítios de ligação de esclerostina por poço, em comparação com o número de moles de esclerostina por poço. O anticorpo neutralizador anti-esclerostina ou agente de ligação neutralizador anti-esclerostina menos potente será capaz de neutralizar a esclerostina apenas a um excesso de 12, 18 ou 24 vezes. Os agentes de ligação à esclerostina dentro desta extensa variedade de potência são apropriados como agentes de ligação neutralizadores de esclerostina. Os ensaios de mineralização com base na célula exemplares são descritos em detalhes no Exemplo 8.
[00151] Os anticorpos anti-esclerostina e seus derivados que podem neutralizar a esclerostina humana, e agentes de ligação à esclerostina que pode neutralizar a esclerostina humana podem ser de uso no tratamento de condições humanas/patologias que são causadas por, associadas, ou resultantes de pelo menos uma de baixa formação óssea, baixa densidade mineral óssea, baixo conteúdo mineral ósseo, baixa massa óssea, baixa qualidade óssea e baixa força óssea.
Ensaio de Neutralização in vivo
[00152] Os aumentos em diversos parâmetros relacionados com, ou resultanetes de, a estimulação da nova formação óssea podem ser medidos como uma saída para o ensaio in vivo de agentes de ligação à esclerostina, a fim de identificar os agentes de ligação que são capazes de neutralizar a esclerostina e, portanto, capazes de causar estimulação da nova formação óssea. Esses parâmetros incluem diversos marcadores marcadores séricos anabólicos [por exemplo, osteocalcina, P1NP (propeptídeo de terminal N de procolágeno tipo 1)], marcadores histomorfométricos da formação óssea (por exemplo, superfície de osteoblastos/superfície óssea; taxa de formação óssea/superfície óssea; espessura da trabécula), a densidade mineral óssea, conteúdo mineral ósseo, massa óssea, qualidade óssea e força óssea. Um agente de ligação neutralizador de esclerostina é definido como um agente capaz de causar um aumento estatisticamente significativo, em comparação com animais tratados com veículo, em qualquer parâmetro associado, ou que resulta de, a estimulação da nova formação óssea. Tal ensaio in vivo pode ser realizado em qualquer mamífero apropriado (por exemplo, camundongo, rato, macaco). Um exemplo de tal ensaio in vivo pode ser encontrado no Exemplo 5 (“Teste in vivo de anticorpos anti-esclerostina monoclonais”).
[00153] Embora a sequência de aminoácidos de esclerostina não é 100% idêntica em todas as espécies de mamíferos (por exemplo, a esclerostina de rato não é 100% idêntica à esclerostina humana), será apreciado por alguém versado na técnica que um agente de ligação à esclerostina que pode neutralizar, in vivo, sendo a esclerostina de uma determinada espécie (por exemplo, rato) e que também pode ligar esclerostina humana, in vitro é muito provável que seja capaz de neutralizar a esclerostina humana in vivo. Assim, tal agente de ligação à esclerostina humana (por exemplo, anticorpos anti-esclerostina humana) pode ser de grande utilidade no tratamento de condições humanas/patologias que são causados por, associados a, ou resultantes de, em pelo menos um de baixa formação óssea, baixa densidade óssea mineral, baixo conteúdo mineral ósseo, baixa massa óssea, baixa qualidade óssea e baixa força óssea. Os camundongos nos quais a recombinação homóloga tenha sido utilizada para apagar os genes de esclerostina de camundongo e inserir os genes de esclerostina humana em seu lugar (ou seja, genes knock-in de camundongos de esclerostina humana ou knock-in de camundongos de SOST humano) seria um exemplo de um adicional no sistema in vivo.
[00154] As composições farmacêuticas são fornecidas, compreendendo um dos agentes de ligação acima descritos como a pelo menos um dos anticorpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, D-Ab e Ab-1 a Ab-24 para esclerostina humana, juntamente com um veículo, excipiente, ou solvente farmaceuticamente ou fisiologicamente aceitável. As composições farmacêuticas e os métodos de tratamento são divulgadas no Pedido de Patente Compêndio N° de série 10/868497, apresentado em 16 de junho de 2004, que afirma a prioridade N° de série 60/478977, que são incorporados por referência neste documento.
[00155] O desenvolvimento adequado de regimes de administração e de tratamento utilizando as composições especiais aqui descritos em uma grande variedade de regimes de tratamento, incluindo por exemplo, por via subcutânea, por via oral, parentérica, via intravenosa, via intranasal, e a administração intramuscular e formulação, é bem conhecido na técnica, algumas das quais são brevemente discutidas abaixo para fins gerais de ilustração.
[00156] Em certas aplicações, as composições farmacêuticas divulgadas neste documento poderão ser entregues através da administração oral de um animal. Como tal, estas composições podem ser formuladas com um diluente inerte ou com um veículo assimilável comestível, ou eles podem ser incluídos em cápsulas de gelatina duras ou macias, ou eles podem ser compactados em comprimidos, ou eles podem ser inseridos diretamente com o alimento da dieta.
[00157] Em determinadas circunstâncias, será desejável que a distribuição das composições farmacêuticas divulgadas aqui por via subcutânea, parenteral, via endovenosa, intramuscular, ou mesmo intraperitoneal. Essas abordagens são bem conhecidos pelo técnico versado, algumas das quais são ainda descritos, por exemplo, em Patente US n° 5543158; Patente US n° 5641515 e Patente US n° 5399363. Em certas modalidades, soluções de compostos ativos como bases livres ou sais farmacologicamente aceitáveis podem ser preparados em água devidamente misturados com um tensoativo, como hidroxipropilcelulose. Também podem ser preparadas dispersões em glicerol, polietileno glicóis líquidos, e misturas, e em óleos. Sob condições normais de armazenagem e de utilização, estes preparativos irão geralmente conter conservantes para evitar o crescimento de microorganismos.
[00158] Formas farmacêuticas ilustrativas adequadas para uso injectável estéril incluem soluções aquosas ou dispersões e pó estéril para a preparação de soluções ou dispersões injetáveis extemporâneas estéreis (por exemplo, veja Patente US n° 5.466.468). Em todos os casos, a forma deve ser estéril e devem ser fluida, na medida em que exista fácil seringabilidade. Devem ser estáveis nas condições de fabrico e de armazenamento e devem ser preservadas contra a ação contaminadora de microorganismos, como bactérias e fungos. O veículo pode ser um solvente ou dispersão média contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, líquido e polietileno-glicol, e outras), misturas adequadas, e/ou óleos vegetais. A fluidez própria pode ser mantida, por exemplo, pela utilização de um revestimento, tal como a lecitina, pela manutenção do tamanho das partículas exigida no caso de dispersão e/ou através da utilização de tensoativos. A prevenção da ação de microorganismos podem ser facilitadas por diversos agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, e similares. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou de cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis podem ser provocadas pela utilização nas composições de agentes que retardam a absorção, por exemplo, o monostearato de alumínio e gelatina.
[00159] Em uma modalidade, para administração parentérica em uma solução aquosa, a solução deve ser adequadamente tamponada se necessário e o líquido diluente primeiro prestados com suficiente isotónica salina ou glicose. Estas soluções aquosas em particular são especialmente indicadas para administração endovenosa, intramuscular, subcutânea e intraperitonial. Neste contexto, um meio aquoso estéril que pode ser empregado será conhecido por aqueles versados na técnica, à luz da presente divulgação. Por exemplo, uma dose pode ser dissolvida em 1 mL de solução isotônico de NaCl que seja adicionada a 1000 mL de fluido de hipodermóclise ou injetada no proposto sítio de infusão, (veja, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15a edição., Págs. 1035-1038 e 1570-1580). Algumas variações na dosagem ocorrerão necessariamente, dependendo da condição do indivíduo a ser tratado. Além disso, para administração humana, a preparação será naturalmente preferida por satisfazer esterilidade, pirogenicidade, e como normas gerais de segurança e pureza como exigido pelas normas do Escritório de Biologia da FDA.
[00160] Em outra modalidade da invenção, como composições divulgadas neste documento poderão ser formulados de forma neutra ou sal. Sais ilustrativos farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição ácida (formados com grupos amino livres das proteínas) e que são formados com ácidos inorgânicos como, por exemplo, ácido clorídrico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos, tais como acético, oxálico, tartárico, mandélico, e similares. Sais formados com grupos carboxila livres também podem ser obtidos a partir de bases inorgânicas como, por exemplo, de sódio, potássio, amônio, cálcio, ferro ou hidróxidos, e bases orgânicas tais como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína e similares. Após a formulação, as soluções serão administradas de forma compatível com a dosagem na formulação e em tal quantidade é terapeuticamente eficaz.
[00161] Os veículos podem ainda incluir todos e quaisquer solventes, meio de dispersão, veículos, corantes, solventes, antibacterianos e agentes antifúngicos, isotônicos e agentes de retardo de absorção, tampões, soluções veículo, suspensões, colóides, e similares. A utilização de tais meios e agentes para substâncias farmacêuticas ativas é bem conhecido na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio convencional ou agente é incompatível com o ingrediente ativo, a sua utilização na terapêutica composições é contemplada. Ingredientes ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições. A expressão “farmaceuticamente aceitável” se refere a entidades moleculares e composições que não produzem uma reação alérgica ou similar nociva quando administradas a um humano.
[00162] Em certas modalidades, lipossomas, nanocápsulas, micropartículas, partículas lipídicas, vesículas, e semelhantes, são utilizados para a introdução das composições da presente invenção em células/organismos hospedeiros adequados. Em particular, as composições da presente invenção podem ser formuladas para distribuição tanto encapsuladas em uma partícula lipídica, um lipossoma, uma vesícula, uma nanoesfera, ou um nanopartícula ou similar. Alternativamente, as composições da presente invenção podem ser ligadas, tanto covalentemente ou não-covalentemente, para a superfície de tais veículos carreadores.
[00163] A formação e utilização de lipossomas e preparações similares aos lipossomas como portadores potenciais de fármacos é geralmente conhecida por aqueles versados na técnica (veja, por exemplo, Lasic, Trends Biotechnol. 16 (7) :307- 21, 1998; Takakura, Nippon Rinsho 56 (3): 69 l de-95, 1998; Chandran et al., Indian J. Exp, Biol. 35 (8): 801-09, 1997; Margalit, Crit. Rev. There. Drug Carrier Syst. 12 (2-3) :233-61, 1995; Patente US n° 5567434; Patente US n° 5552157; Patente US n° 5565213; Patente US n° 5738868 e Patente US n° 5795587, cada especificamente incorporada neste documento por referência na sua totalidade). O uso de lipossomas não parece estar associado a respostas autoimunes ou toxicidade inaceitável após distribuição sistêmica. Em certas modalidades, os lipossomas são formados a partir de fosfolípidos que se encontram dispersos em meio aquoso e formam espontaneamente vesículas de bicamadas multilamelares concêntricas (também denominadas vesículas multilamelares (MLVs)).
[00164] Alternativamente, em outras modalidades, a invenção prevê formulações em nanocápsulas farmaceuticamente aceitáveis das composições da presente invenção. As nanocápsulas podem geralmente aprisionar compostos de uma forma estável e reprodutível (veja, por exemplo, Quintanar-Guerrero et al., DrugDev. Ind. Pharm. 24 (12): 1113-28, 1998). Para evitar efeitos colaterais devido à sobrecarga intracelular polimérica, tais partículas ultrafinas (tamanho em torno de 0,1 μm), podem ser projetados usando polímeros capazes de ser degradados in vivo. Tais partículas podem ser feitas conforme descrito, por exemplo, e Al Couvreur., Crit. Rev. There. Drug Carrier Syst. 5 (1): 1-20, 1988; zur Muhlen et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 45 (2): 149 - 55, 1998; Zambaux et al., J. Controlled Release 50 (1-3) :31-40, 1998; e Patente US n° 5145684.
[00165] Além disso, as composições farmacêuticas da presente invenção podem ser colocadas dentro de contentores, juntamente com embalagens que fornecem instruções relativas à utilização de tais composições farmacêuticas. Geralmente, essas instruções incluem uma expressão tangível descrevendo a concentração do reagente, bem como em certas modalidades, quantidades relativas de ingredientes excipientes ou solventes (por exemplo, água, solução salina ou PBS), que podem ser necessários para reconstituir a composição farmacêutica.
[00166] A dose administrada pode variar entre 0,01 mg/kg e 100 mg/kg de peso corporal. Como será evidente para alguém versado na técnica na técnica, a quantidade e a frequência da administração dependerá, naturalmente, de fatores como a natureza e a gravidade da indicação a ser tratada, a resposta desejada, a condição do paciente e, daí por diante. Tipicamente, as composições podem ser administradas por uma variedade de técnicas, conforme citado acima.
[00167] Os aumentos no conteúdo mineral ósseo e/ou na densidade mineral óssea podem ser determinado diretamente através do uso de raios-X (por exemplo, Absortometria de raios X de energia dupla ou “DEXA”), ou por inferência através da medição de 1) marcadores da formação óssea e/ou atividade de osteoblastos, tais como, mas não limitado a, fosfatase alcalina osteoblasto específica, osteocalcina, propeptídeo C procolágeno tipo 1 (PICP), fosfatase alcalina total (veja Cornier, Curr. Opin. in Rheu. 7:243(1995)) propeptídeo de terminal N de procolágeno 1 sérico (P1NP) e/ou 2) marcadores da reabsorção óssea e/ou da atividade osteoclástica, incluindo, mas não limitado a, piridinolina, deoxipriridinolina, N- telopeptídeo, hidroxiprolina urinária, fosfatase ácida resistente a tartarato plasmática, e galactosil hidroxilisina; (veja Cornier, id), TRAP 5b sérica (fosfatase ácida resistente a tartarato isoforma 5b) e C-telopeptídeo reticulado sérico (sCTXI). A quantidade de massa óssea podem também ser calculada a partir do peso corporal ou através de outros métodos (veja Guinness-Hey, Metab. Bone Dis. Relat. Res. 5:177-181, 1984). Animais e modelos animais particulares são utilizados na técnica para testar o efeito das composições e dos métodos da invenção, por exemplo, parâmetros de perda óssea, reabsorção óssea, formação óssea, força óssea ou mineralização óssea que imitam condições de doenças humanas, como a osteoporose e osteopenias. Exemplos de tais modelos incluem o modelo rato esterectomizado (Kalu, D.N., The ovariectomized rat model of postmenopausal bone loss. Bone and Mineral 15:175-192 (1991); Frost, H.M. e Jee, W.S.S. On the rat model of human osteopenias and osteoporosis. Bone and Mineral 18:227-236 (1992); e Jee, W.S.S. e Yao, W., Overview: animal models of osteopenia and osteoporosis. J. Musculoskel. Neuron. Interact. 1:193-207 (2001)).
[00168] As condições particulares que podem ser tratados pelas composições da presente invenção incluem displasias, onde o crescimento e desenvolvimento de ossos é anormal e uma grande variedade de causas de osteopenia, osteoporose e perda óssea. Exemplos representativos de tais condições incluem acondroplasia, disostose cleidocranial, encondromatose, displasia fibrosa, doença de Gaucher, hipofosfatêmica rickets, síndrome de Marfan, múltiplas hereditárias exotoses, neurofibromatose, osteogênese imperfeita, osteopetrose, osteopoiquilose, lesões escleróticas, pseudoartrose, e osteomielite piogênica, doença periodonto, perda óssea induzida por fármacos anti-epilépticos, hiperparatiroidismo secundário e primário, síndromes de hiperparatiroidismo familiar, perda óssea induzida por peso, osteoporose em homens, perda óssea pós-menopausa, osteoartrite, osteodistrofia renal, distúrbios infiltrativos do osso, perda óssea oral, osteonecrose das maxilas, doença de Paget juvenil A, melorreostose, doenças ósseas metabólicas, mastocitose, anemia/doença da célula falciforme, perda óssea relacionada com transplantes de órgãos, perda óssea relacionada a transplante renal, lúpus eritematoso sistêmico, espondilite anquilosante, epilepsia, artritide juvenil, talassemia, mucopolissacaridoses, doença de Fabry, síndrome de Turner, síndrome de Down, síndrome de Klinefelter, hanseníase, doença de Perthes, escoliose idiopática adolescente, doença inflamatória multi-sistêmica de início infantil, Síndrome de Winchester, doença de Menkes, doença de Wilson's, doença isquêmica óssea (tal como doença de Legg-Calve-Perthes, osteoporose regional migratória), estados anêmicos, condições causadas por esteróides, perda óssea induzida por glicocorticóides, perda óssea induzida por heparina, distúrbios da medula óssea, escorbuto, desnutrição, deficiência de cálcio, osteopenia ou osteoporose idiopática, osteopenia ou osteoporose congênitas, alcoolismo, doença hepática crónica, estado pós-menopausa, condições inflamatórias crônicas, artrite reumatóide, doença inflamatória intestinal, colite ulcerativa, colite inflamatória, Doença de Crohn, oligomenoréia, amenorréia, gravidez, pacientes com diabetes mellitus, hipertireoidismo, distúrbios da tiróide, distúrbios da paratiróide, síndrome de Cushing, acromegalia, hipogonadotrófico, imobilização ou desuso, síndrome da distrofia simpática reflexa, osteoporose regional, osteomalácia, perda óssea associada com substituição conjunta, perda óssea associada ao HIV, perda óssea associada com perda de hormônio de crescimento, perda óssea associada com fibrose cística, displasia fibrosa, perda óssea associada a quimioterapia, perda óssea induzido por tumor, perda óssea relacionada com o câncer, perda óssea hormônio ablativo, mieloma múltiplo, perda óssea induzida por fármaco, Anorexia nervosa, perda óssea associada a doenças faciais, perda óssea associada a doença craniana, perda óssea associada a doença do maxilar, perda óssea associada a doença do crânio, e perda óssea associada a viagens espaciais. Outras condições dizem respeito à perda óssea associada com envelhecimento, incluindo perda óssea facial associada com envelhecimento, perda óssea craniana associada ao envelhecimento, perda óssea maxilar associada com envelhecimento, e perda óssea do crânio associada com envelhecimento.
[00169] As composições da presente invenção também podem ser úteis para melhorar os resultados em procedimentos ortopédicos, procedimentos dentários, cirurgia de implante, substituição de articulações, enxerto ósseo, cirurgia plástica óssea e reparação óssea, tais como cura de fraturas, cura não consolidada, cura de consolidação atrasada e reconstrução facial. Uma ou mais composições podem ser administradas antes, durante e/ou após o processo de substituição, enxerto, cirurgia ou reparação.
[00170] A invenção também fornece um kit de diagnóstico que inclui pelo menos um agente de ligação anti-esclerostina, de acordo com a presente invenção. Um agente de ligação pode ser um anticorpo. Além disso, esse um kit pode opcionalmente incluir um ou mais dos seguintes:(54) instruções para o uso de um ou mais agentes de ligação para rastreio, diagnóstico, prognóstico, acompanhamento terapêutico ou qualquer combinação destas aplicações; (55) parceiro de ligação marcado para o agente aglutinante anti-esclerostina; (56) uma fase sólida (como uma tira reagente) na qual os agente(s) de ligação anti-esclerostina é imobilizado; e (57) um rótulo ou insersão indicando aprovação regulamentar para rastreio, diagnóstico, prognóstico ou uso terapêutico ou qualquer combinação dos mesmos.
[00171] Se não são fornecidos marcadores como parceiros de ligação para o agente de ligação, o agente de ligação em si pode ser identificado com um ou mais de um marcador detectável, por exemplo, uma fração quimioluminescente, enzimática, fluorescente, ou radioativa.
[00172] Os seguintes exemplos são oferecidos a título de ilustração, e não por meio de limitação.
Exemplos Exemplo 1 Expressão Recombinante de Esclerostina
[00173] A esclerostina humana recombinante/SOST está disponível comercialmente a partir de R & D Systems (Minneapolis, MN, E.U.A.; 2006 n° cat. 1406-ST-025). Além disso, esclerostina recombinante de rato /SOST está disponível comercialmente a partir de R & D Systems (Minneapolis, MN, E.U.A.; 2006 n° cat. 1589-ST-025).
[00174] Em alternativa, como espécies diferentes de esclerostina podem ser expressaa transitoriamente em células em suspensão adaptada 293T ou 293EBNA livres de soro. As transfeções podem ser executadas como culturas de 500 mL ou 1L. Os seguintes reagentes e materiais estão disponíveis a partir Gibco BRL (agora Invitrogen, Carlsbad, CA). Os números de catálogo são listados entre parênteses: DMEM livre de soro (21068-028); DMEM/F12 (3:1) (21068/11765); Complemento 1X Insulino-Transferina-Selênio (51500-056); 1X Pen Strep Glut (10378 -016); 1-Glutamina 2mM (25030-081), HEPES 20 mM (15630-080); Pluronic F68 0,01% (24040-032). Resumidamente, a célula inóculo (5,0-10,0 X 10-5 células/mL volumes X cultura) é centrifugadas a 2500 RPM por 10 minutos em 4 °C para remover o meio concentrado.
[00175] As células são ressuspensas no DMEM livre de soro e centrifugadas novamente em 2500 RPM por 10 minutos em 4 °C. Após aspirar solução de lavagem, as células são ressuspensas em meio de crescimento [DMEM/F12 (3:1) + Complemento 1X Insulino-Transferina-Selênio + IX Pen Strep Glut + 2mM L- Glutamina + 20 mM HEPES + 0,01% Pluronic F68] em balão de cultura de fundo redondo de 1L ou 3L. O balão de cultura de fundo redondo é mantido em placa de agitação magnética a 125 RPM, que é colocado em uma incubadora umidificada mantida a 37 °C e CO2 5%. O plasmídeo de expressão mamífero UJNA (por exemplo, pcDNA3.1, pCEP4, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), contendo a região de codificação completa (e códon de finalização) de esclerostina com uma sequência Kozak consensual (por exemplo, CCACC) diretamente 5' do início do sítio ATG, é complexado ao reagente transfeção em um tubo cônico de 50 mL.
[00176] O complexo reagente de transfeção-DNA pode ser preparado em 5-10% do volume em cultura final DMEM livre de soro ou OPTI-MEM. Os reagentes de transfeção que possam ser utilizados para esse fim incluem X-tremeGene RO-1539 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN), FuGene 6 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN), Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) e 293fectin (Invitrogen, Carlsbad, CA). 1-5 μg de cultura plasmídeo DNA/mL é primeiramente adicionada ao DMEM livre de soro, seguido por 1-5 μL de reagente de transfeção/mL de cultura. Os complexos podem ser incubados em temperatura ambiente durante cerca de 10-30 minutos e, em seguida, adicionados às células do balão de fundo redondo. A transfeção/expressão pode ser executada por 4-7 dias, após o qual o meio condicionado (CM) é colhido por centrifugação a 4000 RPM por 60 minutos a 4 °C
Exemplo 2 Purificação de Esclerostina Recombinante
[00177] esclerostina recombinante foi purificado de células hospedeiras mamíferas do seguinte modo. Todos os processos de purificação foram realizadas em temperatura ambiente. Um esquema de purificação foi utilizado para purificar várias espécies de esclerostina, incluindo esclerostina murina e humano. O esquema de purificação utilizou cromatografia de afinidade seguida por cromatografia de troca catiônica.
Cromatografia com Heparina
[00178] O meio condicionado de célula hospedeira mamífera (CM), foi centrifugadas em uma centrífuga Beckman J6-M1 a 4000 rpm durante 1 hora a 4 °C para remover detritos celulares. O CM sobrenadante foi então filtrado através de um filtro estéril 0,2 μm. (Neste ponto o CM filtrado estéril pode ser opcionalmente armazenado congelado até a purificação.) Se o CM foi congelado, foi descongelado, nas seguintes temperaturas, ou na combinação destas: 4 °C, temperatura ambiente ou água morna. Após o descongelamento, o CM foi filtrado através de um filtro estéril 0,2 μm e opcionalmente concentrado por ultrafiltração de fluxo tangencial (TFF), utilizando uma membrana de retirada de peso molecular 10 kD. O CM concentrado foi filtrado através de um filtro estéril 0,2 μm e, em seguida, carregado em uma coluna de Heparina de Alto Desempenho (Heparin HP) (GE Healthcare, antiga Amersham Biosciences) equilibrada em PBS. Alternativamente, o filtrado sobrenadante CM pode ser carregado diretamente na coluna Heparin HP equilibrada em PBS.
[00179] Após o carregamento, a coluna Heparina HP foi lavada com PBS até a absorbância a 280 nm da linha de base retornada através do fluxo (ou seja, absorbância medida antes do carregamento de sobrenadante CM). A esclerostina foi então eluída da coluna usando um gradiente linear de 150 mM de cloreto de sódio 2M em PBS. A absorbância a 280 nm do eluído foi monitorada e frações contendo proteínas foram recolhidas. As frações foram então medidas por SDS-PAGE marcado com Coomassie para identificar frações contendo um polipeptídeo que migra no tamanho de esclerostina glicosilada. As frações adequadas da coluna foram combinadas para fazer o conjunto Heparina HP.
Cromatografia de Troca Catiônica
[00180] A esclerostina eluída da coluna Heparina HP foi ainda purificada por cromatografia de troca catiônica utilizando meio de cromatografia SP de Alto Desempenho (SPHP) (GE Healthcare, antiga Amersham Biosciences). O conjunto Heparina HP foi trocado em tampão PBS por diálise usando membranas 10000 MWCO (Pierce Slide-A-Lyzer). O conjunto Heparina HP dializado foi então colocado em uma coluna SPHP equilibrada em PBS. Após o carregamento, a coluna foi lavada com PBS até a absorbância a 280 nm da linha de base retornada através do fluxo. A esclerostina foi então eluída da coluna SPHP usando um gradiente linear de 150 mM de cloreto de sódio a 1 M em PBS. A absorbância a 280 nm do eluído foi monitorada e a esclerostina eluída foi recolhida em frações. As frações foram então medidas por SDS-PAGE marcado com Coomassie para identificar frações contendo um polipeptídeo que migra no tamanho de esclerostina glicosilada. As frações adequadas da coluna foram combinadas para fazer o Conjunto SPHP.
Formulação
[00181] Após a purificação, o Conjunto SPHP foi formulado em PBS por diálise usando membranas 10000 MWCO (Pierce Slide-A-Lyzer). Se a concentração de esclerostina foi necessária, um dispositivo centrífuga (Amicon Centricon ou Centriprep), com uma membrana 10000 MWCO foi utilizado. Após a formulação a esclerostina foi filtrada através de um filtro estéril 0,2 μm e armazenada a 4 °C ou congelada.
Exemplo 3 ELISA de Ligação a Peptídeo
[00182] Uma série de peptídeos sobrepostos (cada um peptídeo tendo aproximadamente 20-25 aminoácidos), foram sintetizados baseado na conhecida sequência de aminoácidos de esclerostina de rato (SEQ ID n°.: 98). Os peptídeos foram projetados de modo a que todos eles continham um resíduo cisteína reduzido; mais uma cisteína foi incluída no terminal C de cada um peptídeo que ainda não a continha um em sua sequência. Isto permitiu que os peptídeos fossem ligados ao ensaio as placas por covalentes acoplamento, utilizando placas de ligação sulfidrila comercialmente disponíveis (Costar), em uma concentração de 1 μg/mL, em solução salina tamponada com fosfato (PBS: pH 6,5) contendo EDTA 1 mM. Após incubação durante 1 hora à temperatura ambiente, as placas foram lavadas três vezes com PBS contendo Tween 20 0,5%. As placas foram bloqueadas por incubação com uma solução de PBS contendo gelatina de pele de peixe 0,5% (Sigma) por 30 minutos à temperatura ambiente e em seguida lavada três vezes em PBS contendo Tween 20 0,5%.
[00183] Os anticorpos a serem testados foram diluídos a 1 μg/mL em PBS contendo gelatina de pele de peixe a 0,5% e incubadas com o peptídeo-revestidos placas durante 1 hora à temperatura ambiente. Excess anticorpos foi removido por três lavagens com PBS, Tween 20 a 0,5%. As placas foram então incubadas com um anticorpo secundário conjugado adequadas com peroxidase de rábano silvestre (diluído adequadamente em PBS contendo 0,5% de Tween 20) e capaz de ligar a produção de anticorpos de interesse. As placas foram então lavadas três vezes: uma vez com PBS contendo Tween 20 a 0,5%, e duas vezes com PBS. Finalmente as placas foram incubadas com um substrato cromogênico de peroxidase de rábano (TMB-Stable Stop, IDI) durante 5 minutos à temperatura ambiente, o desenvolvimento de cor foi interrompido com ácido, e a densidade ótica das placas medida a 450nm. Materiais Placas de Ligação de Sulfidrila Costar's (VWR n°. 29442-278) Tampão de Revestimento: IXPBS PH 6,5 + 1mM EDTA Tampão de Bloqueio: 1X PBS + 0,5% Gelatina de pele de peixe (PBS de CS; FSG de Sigma G n°. 7765) Tampão de lavagem: 1X PBS + Tween 20 a 0,5% peptídeos de Esclerostina de ratos Amostras Anticorpo: Ab Transiente, Ab recombinante purificado, soro de coelho, etc Ab secundário adequado: ovelha-anti-coelho/camundongo-HRP (Jackson Immuno Research, 115-036-072) TMB-Stable Stop (RDW IDI-TMBSX-1L) 0,5M HCl Os métodos foram como segue: 1. Revestir placas com 100 μL/cavidade de peptídeo de esclerostina de rato diluído em IXPBS PH 6,5 + 1mM EDTA a 1 μg/mL. Incubar as placas por 1 hora à temperatura ambiente. (as plcas devem ser utilizadas 30 minutos após a abertura). 2. Lavar as placas 3X com tampão de lavagem. 3. Bloquear as placas com 200 μL/poço de tampão de bloqueio. Incubar as placas 30 minutos a temperatura ambiente. 4. Repetir a lavagem como descrito em (2). 5. Incubar as placas com 50 μL/poço de amostras diluído em tampão de bloqueio - os títulos de soro a partir de 1:100; usar Ab Recombinante Transiente neat; purificada recombinante Ab utilização em 1 μg/mL (todas como amostras executado em duplicatas). Incubar as placas por 1h a temperatura ambiente. 6. Lavar as placas como descrito em (2). 7. Incubar as placas com 50 μL/poço apropriados Anticorpo secundário (HRP marcados) diluído 1: 1600 no tampão de bloqueio. Incubar as placas por 1 hora à temperatura ambiente. 8. Lavar as placas 1X com tampão de lavagem, 2x PBS 9. Incubar as placas com 50 μL/poço do TMB, 5 minutos a temperatura ambiente. 10. Deixar em reação com 50 μL/poço HCl 0,5M. 11. Ler as placas a 450 nm onda. Os seguintes peptídeos sequências foram selecionadas como descrito acima: QGWQAFKNDATEIIPGLREYPEPP (SEQ ID n°.: 82) TEIIPGLREYPEPPQELENN (SEQ ID n°.: 83) PEPPQELENNQTMNRAENGG (SEQ ID n°.: 84) ENGGRPPHHPYDTKDVSEYS (SEQ ID n°.: 85) CRELHYTRFVTDGP (SEQ ID n°.: 86) CRELHYTRFVTDGPSRSAKPVTELV (SEQ ID n°.: 87) CRSAKPVTELVSSGQSGPRARLL (SEQ ID n°.: 88) CGPARLLPNAIGRVKWWRPNGPDFR (SEQ ID n°.: 89) RAQRVQLLCPGGAAPRSRKV (SEQ ID n°.: 90) PGGAAPRSRKVRLVAS (SEQ ID n°.: 91) KRLTRFHNQSELKDFGPETARPQ (SEQ ID n°.: 92) IPDRYAQRVQLLSPGG (SEQ ID n°.: 93) SELKDFGPETARPQKGRKPRPRAR (SEQ ID n°.: 94) PNAIGRVKWWRPNGPDFR (SEQ ID n°.: 96) KWWRPNGPDFRCIPDRYRAQRV (SEQ ID n°.: 97).
[00184] O anticorpo neutralizador de alta afinidade (Ab-19) ligado a duas sequências de peptídeos sobrepostas: PNAIGRVKWWRPNGPDFR (SEQ ID n°.: 96) e KWWRPNGPDFRCIPDRYRAQRV (SEQ ID n°.: 97).
[00185] Este procedimento permite o reconhecimento de epítopos de anticorpos que reagem com epítopos aparentes lineares. Os peptídeos que contenham a totalidade ou parte do sítio de ligações com anticorpos vão se ligar aos anticorpos e, assim, ser detectados.
Exemplo 4 Identificação de Epítopos de Esclerostina Humana
[00186] A esclerostina humana de forma madura (peptídeo sinal removido) é uma proteína de 190 aminoácidos (Figura 8). A Figura 9 mostra um diagrama da estrutura geral de esclerostina com um braço terminal N (a partir do terminal N Q à cisteína 1) e um braço terminal C (a partir de Cistina8 para o terminal Y). Localizada entre estes dois braços, existe a estrutura de nó de cistina e três voltas, que são designadas Volta 1, Volta 2 e volta 3. As quatro ligações dissulfeto na esclerostina são Cis1 em posição de sequência 57 ligados a Cis5 em posição de sequência 111 (designado por C1-C5), Cis2 em posição de sequência 71 ligados a Cis6 em posição de sequência 125 (referido como C2-C6), Cis3 Na posição de sequência 82 ligados a Cis7 em posição de sequência 142 (designado por C3-C7), Cis4 em posição de sequência 86 ligados a Cis8 em posição de sequência 144 (referido como C4-C8). A estrutura anelar de 8 membros é formada por ligação dissulfeto C3-C7 e C4-C8. Esta estrutura anelar, em conjunto com a ligação dissulfeto C1-C5 que penetra através do anel, faz um típico nó de cistina. C2-C6, que não é parte do nó de cistina, traz duas grandes estruturas de volta, volta 1 (resíduos 57 a 82) e volta 3 (resíduos 111 a 142) juntos. A volta 2 vai do C4 (resíduo 86) a C5 (resíduo 111).
Experimento
[00187] A abordagem geral para caracterizar os epítopos ligados por anticorpos anti-esclerostina monoclonais envolveu a fragmentação de esclerostina humana em peptídeos com diferentes proteases, a determinação da sequência dos diversos peptídeos de esclerostina humana, isolando estes peptídeos e testando cada uma deles para a sua capacidade de se ligar a um determinado anticorpo monoclonal usando um “ensaio de ligação de competição ao epítopo de peptídeo de esclerostina humana” baseado em Biacore. Os dados resultantes do estudo permitiu a localização da ligação ao epítopo a ser determinado.
[00188] Os digeridos de peptídeo foram submetidos a mapeamento de peptídeo com HPLC; os picos individuais foram coletados, e os peptídeos identificados e mapeados pelas análises de espectrometria de massa com dessorção a laser assistida por matriz (MALDI-MS) e de ionização eletrospray LC-MS (ESI-LC-MS) e/ou por sequenciação de terminal N. Todas as análises HPLC para estes estudos foram realizadas utilizando uma coluna de fase reversa C8 (2,1 mm id x 15 cm de comprimento). O mapeamento de peptídeo com HPLC foi realizado com um gradiente linear de ácido trifluoracético 0,05% (fase móvel A) para acetonitrila 90% em ácido trifluoracético 0,05%. As colunas foram desenvolvidos mais de 50 minutos com uma taxa de fluxo de 0,2 mL/minuto.
Digestão por Tripsina e AspN Endoproteinase
[00189] A esclerostina humana de forma madura foi digerida com tripsina, que cliva após arginina e lisina, ou com AspN. Aproximadamente 200 μg de esclerostina em 0,5-1,0 mg/mL foram incubados em PBS (pH 7,2) por 20 horas a 37 °C com 8 μg de tanto com tripsina ou AspN.
Digestão por Tripsina
[00190] Cromatografia HPLC dos digeridos de tripsina renderam vários picos grandes (Fig. 10A). A análise da sequência foi realizada sobre os picos de peptídeo recuperado de HPLC após digestão com tripsina. Uma análise On-Line ESI LC-MS do peptídeo digerido também foi realizada para determinar com precisão a massa de peptídeos, que foram separados por HPLC. A identidade dos peptídeos presentes nos picos de peptídeo foi assim determinada (Fig. 11). A Figura 13 mostra o alinhamento das várias sequências de peptídeo (T19.2, T20, T20.6, T21-22) ao longo da sequencia de esclerositna. O número seguinte a cada T (por exemplo, T19.2) reflete o tempo de retenção. T19.2 contém dois peptídeos (um da volta 1 e um da volta 3) ligados pela ligação dissulfeto C2-C6. T20 contém dois peptídeos, realizada em conjunto pela estrutura em nó de cistina, com voltas 1 e 3 intactas, realizada em conjunto pela ligação dissulfeto C2-C6 e com a maior parte do volta 2 ausente. T20.6 contém quatro sequências realizadas em conjunto pela estrutura em nó de cistina, mas está faltando parte do volta 1 e 3 (a parte T19.2) e está faltando mais da volta 2. T21-22 é praticamente idêntico ao T20 mas tem 3 aminoácidos adicionais na região do laço 2.
Digestão com AspN
[00191] Cromatografia HPLC dos digeridos com AspN renderam vários picos grandes (Fig. 10B). A análise da sequência foi realizada sobre os picos de peptídeo recuperado de HPLC. Uma análise On-Line ESI LC-MS do digerido de peptídeo também foi realizada para determinar com precisão a massa de peptídeos, que foram separados por HPLC. A identidade dos peptídeos presentes nos picos de peptídeo da digestão com AspN foi assim determinada (Fig. 12). A Figura 14 mostra o alinhamento das várias sequências de peptídeos (AspN14.6, AspN18.6, AspN22.7- 23,5), na sequencia de esclerositna. O número após cada AspN (por exemplo, AspN18-6) reflete a tempo de retenção. AspN14.6 contém três peptídeos curtos, tanto do braço terminal N como C de esclerostina, enquanto AspN18.6 é um dos maiores peptídeos de braço terminal N de esclerostina. AspN22.7-23,5 contém um único fragmento de peptídeo de 104 aminoácidos a engloba todos as oito cisteínas (as quatro ligações dissulfeto), o nó de cistina e de todos os circuitos 1, 2 e 3.
[00192] A estratégia para caracterizar os epítopos foi a utilizar estes diferentes peptídeos gerados com tripsina e AspN de esclerostina humana e determinar quais peptídeos poderiam ainda ser ligados pelos vários anticorpos (Ab-A, Ab-B, Ab e Ab-C-D). Especificamente isso foi testado em um “ensaio de ligação de competição ao epítopo de peptídeo de esclerostina humana” baseado em Biacore, onde a ligação de um anticorpo monoclonal específico para esclerostina humana imobilizada no Chip Biacore era determinar, na presença ou ausência de cada um das diferentes frações de peptídeo HPLC isoladas de tripsina e AspN. Na ausência de qualquer competidor peptídeos, nomeadamente o anticorpo monoclonal foi capaz de ligar a esclerostina humana sobre o chip e produzir uma unidade de ressonância, RU, resposta. A preincubação do anticorpo monoclonal particular com esclerostina humana intacta em solução, seguido de testes de ligação ao chip, demonstraram que a ligação do Mab para esclerostina humana na solução impediu “a ligação do Mab para a esclerostina humana sobre o chip, assim, a validação dos princípio geral desse ensaio de competição.
[00193] Este procedimento geral foi repetido individualmente para cada um peptídeo. Uma resposta RU robusta foi tomada para indicar que o peptídeo particular sendo testados não poderia ligar a Mab na solução (daí o Mab foi gratuita para ligar a esclerostina humana que tinha sido imobilizada no chip). Inversamente, a ausência de uma resposta vigorosa RU indicou que o Mab foi capaz de ligar ao peptídeo de esclerostina em solução. Estes padrões de ligação, junto com a identidade conhecida dos diversos peptídeos de esclerostina, foram utilizados para determinar os epítopos de esclerostina que estavam ligados por anticorpos anti- esclerostina Ab-A, Ab-B, C-Ab e Ab-D.
Ensaio de Ligação de Competição ao Epítopo de Peptídeo de Esclerostina Humana Baseado em Biacore Preparação de Superfície de Esclerostina Humana:
[00194] A imobilização de forma madura de esclerostina humana à superfície de um chip sensor BIAcore (CM5) foi realizada de acordo com instruções do fabricante. Resumidamente, grupos carboxila sobre a superfície de um chip sensor foram ativados por injeção de 60 μL de uma mistura contendo N-etil-N'- (dimetilaminopropil) carbodimida (CED) 0,2 M e N-hidroxiuccinimida (NHS) 0,05 M. A esclerostina humana foi diluída em acetato de sódio 10 mM, o pH 4,0 em uma concentração de 20 μg/mL seguido por injeção sobre a superfície ativada CM5. Os grupos reativos em excesso sobre a superfície foram desativados por injeção de 60 μL de etanolamina 1 M. Os níveis finais imobilizadas foram de ~ 5000 unidades de ressonância (RU) para a superfície de esclerostina humana. Uma superfície referência em branco, simuladamente acoplada também foi preparada sobre o chip sensor.
Análise Especificidade de Ligação:
[00195] 1X salina tamponada fosfato sem cloreto de cálcio ou cloreto de magnésio foi de Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA. Albumina sérica bovina, fração V, livre de IgG foi de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. Cada Mab (2 nM) foi separadamente incubado com esclerostina humana 20 nM ou de uma determinada amostra em tampão (1X PBS + 0,005% P-20 + 0,1 mg de/mL BSA)peptídeo de esclerostina humano (nota: há 3 peptídeos não ligados em AspN14.6) antes da injeção sobre superfície de esclerostina humana imobilizada. A taxa de fluxo da amostra de injeção foi 5 μL/minuto seguido por regeneração de superfície utilizando NaCl 1 M em Glicina 8 mM, o pH 2,0 a 30 μL/min durante 30 segundos. Os dados foram analisados usando BIAevaluation 3.2, e é apresentado na Figura 15 (Ab-A), Figura 16 (Ab-B), Figura 17 (Ab-C) e Figura 18 (Ab-D).
Epítopos de volta 2 e T20.6:
[00196] O padrão de ligação de peptídeo de esclerostina para dois anticorpos representantes (Ab- A e Ab-B) foi praticamente idêntico (Fig. 15 e Fig. 16) e mostrou que ambos os anticorpos só poderiam ligar ao peptídeo AspN22.7-23,5. A única diferença entre AspN22.7-23,5 e todos os outros peptídeos de esclerostina é que AspN22.7-23,5 contém uma volta 2 intacta. Isto mostra que Ab-A, Ab-B liga a região da volta 2 da esclerostina, definindo assim o epítopo de volta 2 (Fig. 19A). O padrão de ligação de peptídeo de esclerostina para Ab e Ab-C-D foi praticamente idêntico um ao outro (Fig. 17 e Fig. 18), mas completamente distinto do que se verifica para Ab-A, Ab-B. Dos peptídeos testados neste exemplo, o peptídeo mais diminutivo a que Ab-C e Ab -D poderia se ligar era o peptídeo T20.6. Este resultado define o epítopo T20.6 (Fig. 19B).
Ensaio de Proteção de Protease:
[00197] O princípio geral deste ensaio é que a ligação de um Mab para esclerostina pode resultar na proteção de determinados sítios da clivagem com protease e esta informação pode ser usada para determinar a região de esclerostina para onde o Mab se liga.
Epítopo “derivado 1 T20.6 1 (nó de cistina + 4 braços)”:
[00198] A figura 20 mostra os mapas HPLC de um complexo de peptídeo de esclerostina humana Ab-D (Fig. 20A: a esclerostina humana foi preincubada em uma relação 1:1 molar com Ab-D antes da digestão com tripsina como descrito acima) e esclerostina humana sozinha (Fig. 20B : Esclerostina Humana foi digerida com tripsina como descrito acima). Os picos de peptídeos T19.2 e T20.6 na Figura 20A revelam uma clara redução nos respectivos picos de altura, em comparação com a Figura 20B. Esta redução nas alturas do pico foi acompanhada por um aumento na altura do pico dos peptídeos T20 e T21-22. Estes dados indicam que os resíduos básicos de aminoácido no volta 1 e volta 3, que na ausência de Ab-D foram clivados por tripsina para gerar peptídeos T19.2 e T20.6, eram resistentes à clivagem por tripsina quando Ab-D foi pré-ligado à esclerostina. A presença de T20, T20.6 e T21- 22 indica que a volta 2 foi ainda clivada eficientemente quando Ab-D foi pré-ligado à esclerostina. Estes dados indicam que Ab-D ligado ao lado da volta 1 e volta 3 do epítopo T20.6 definindo, assim, o menor epítopo “derivado 1 T20.6 (nó de cistina + 4 braços)” mostrado na Figura 21.
Exemplo 5 Testes in vivo de Anticorpos Anti-esclerostina Monoclonais em Camundongos
[00199] Camundongos machos BDF1 com quatro semanas de idade foram obtidos a partir de Charles River Laboratories (Raleigh, NC) e alojados em gaiolas limpas, cinco animais por gaiola. A temperatura ambiente foi mantida entre 20 e 22,2 ° F, e a umidade relativa foi mantida entre 34 e 73%. O laboratório abrigando as gaiolas tinha um ciclo claro/escuro de 12 horas e reuniu todas as especificações AAALAC. As observações clínicas de todos os camundongos em estudo ocorreram uma vez por dia.
[00200] Os anticorpos monoclonais anti-esclerostina purificados (Ab-A Fig.1; Ab-B Fig.2; Ab-C Fig. 3; Ab-D Fig.4) foram diluídos em salina tamponada com fosfato estéril de Dulbecco. Os camundongos foram sensibilizados com anticorpos anti-esclerostina em veículo PBS ou por via subcutânea em 21 μL por grama de peso corporal, duas vezes por semana (segunda e quinta-feira) a 25 mg/Kg. PTH humano (1-34) foi diluído em tampão PTH (0,001 N HCl, 0,15 M NaCl, 2% BSA), e administrado por via subcutânea em 21 μL de por grama de peso corporal, cinco vezes por semana (segunda, terça, quarta-feira, quinta-feira, sexta-feira) a 100 μg/kg de como um controle positivo (Figuras 5 e 6). O número de camundongos por grupo foi N = 5 na Fig 5 e 6, e N = 6 na Figura 7.
Densiometria Óssea in vivo PIXImus
[00201] A densidade mineral óssea (DMO) foi determinada semanalmente na metáfise tibial proximal e vértebras lombares por Absortometria de raiso X de dupla energia (pDEXA) periférica, com o sistema PIXImus2 da GE/Lunar Medical Systems, Madison, WI. Uma região de interesse (ROI) com 25 mm2, foi colocada para incluir a superfície articular proximal, a epífise, e a extremidade proximal sobre a metáfise da tíbia. A região de interesse (ROI), foi colocada a fim de incluir as vértebras lombares (L1-L5). As regiões proximais tibial e lombar foram analisados para determinar a densidade mineral óssea total. As médias dos grupos foram relatadas + Desvio Padrão e, em comparação com o grupo em tratamento com veículo para análise estatística.
Análise Estatística
[00202] A análise estatística foi realizada com um Dunnett's e Tukey- Kramer (usando o MS Excel e JMP v. 5.0. para os Dados DMO). As médias dos grupos para cada conjunto de dados foram consideradas significativamente diferentes quando o valor P era inferior a 0,05 (P <0,05).
Atividade Neutralizadora de Esclerostina dos Anticorpos
[00203] Os aumentos estatisticamente significativos em DMO em comparação com o veículo visto para cada um de Ab-A (Figura 5), Ab-B (Figura 5), Ab-C (Figura 6) e Ab-D (Figura 7) demonstra que estes quatro anticorpos são anticorpos neutralizadores de esclerostina. Além disso, este dados mostram que, para anticorpos anti-esclerostina que se ligam à esclerostina de rato, o tratamento e a análise de camundongos, tal como descrito acima podem ser usados para identificar anticorpos neutralizadores de esclerostina.
Exemplo 6 Ensaio de Rastreio para anticorpos que Bloqueiam a Ligação de um Anticorpo à Esclerostina Humana
[00204] A esclerostina humana foi acoplada a um Chip Biacore CM5 utilizando acoplamento químico amina padrão para gerar uma superfície revestida com esclerostina. 300 unidades de ressonância de esclerostina foram acopladas à superfície.
[00205] Os anticorpos a serem testados foram diluídos a uma concentração de 200 μg/mL em BH-EP-tampão (sendo HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, 0,005% (V/V) Tensoativo P20) e, em seguida, e então misturados a uma razão molar um para um (em base em um sítio de ligação) para gerar a mistura teste. Esta mistura teste, assim, cada anticorpo contido em uma concentração de 100 μg/mL (1,3 μm em uma base de sítio de ligação). As soluções separadas contendo cada um dos anticorpos na mistura teste sozinha também foram preparados. Estas soluções individuais continham os anticorpos em BH-EP-tampão em uma concentração de 100 μg/mL (1,3 μm em uma base de sítio de ligação).
[00206] 20 μL da mistura teste foi passada sobre o chip revestido comesclerostina com uma taxa de fluxo de 10 μL/min e a quantidade de ligação registrada. O chip, em seguida, foi tratado com dois pulsos de 60 segundos de HCl 30 nM para a eliminação de todos os anticorpos ligados. Uma solução que contêm apenas um dos anticorpos da mistura teste (1,3 μM no mesmo tampão como a mistura teste em base no sítio de ligação) Foi então passado sobre o chip da mesma maneira que a mistura teste e a quantidade de ligação registrada. O chip foi novamente tratado para remover todos os anticorpos ligados e finalmente uma solução contendo outros anticorpos da mistura teste sozinha (1,3 μM no mesmo tampão como a mistura teste em base no sito de ligação), foi passada sobre o chip e a quantidade de ligações é registrada.
[00207] A tabela abaixo mostra os resultados de ensaios de bloqueio cruzado em uma variedade de anticorpos diferentes. Os valores em cada quadro da tabela representam a quantidade de ligação (em RU) observada quando os anticorpos (1,3 μM sobre uma base de sítio de ligação) ou tampão indicado na linha superior da tabela foram misturados com os anticorpos (1.3uM em uma base de sítio de ligação) ou tampão indicada na primeira coluna da tabela.
Figure img0005
Figure img0006
[00208] Usando o valor médio de ligação (em RU) para cada combinação de anticorpos na tabela supra (uma vez que cada combinação aparece duas vezes), é possível calcular o percentual do teórico ligação demonstrado por cada combinação de anticorpos. A ligação teórica sendo calculada como a soma dos valores médios para os componentes de cada mistura teste quando medidos isoladamente (isto é, anticorpos e tampão).
Figure img0007
[00209] Dos dados acima referidos, é evidente que Ab-4, Ab-A e Ab-19 se bloqueiam mutuamente de modo cruzado. Do mesmo modo Ab-13 e Ab-3 se bloqueiam mutuamente de modo cruzado.
Exemplo 7 Ensaio de Bloqueio Cruzado Baseado em ELISA
[00210] Os volumes líquidos utilizados neste exemplo seriam aqueles tipicamente utilizados em placas ELISA de 96 poços (por exemplo, 50-200 μL/cavidade). Ab-X e Ab -Y, neste exemplo são assumidas por ter pesos moleculares de aproximadamente 145 kD e para ter 2 esclerostina sítios de ligação por anticorpos molécula. Um anticorpo anti-esclerostina (Ab-X) é revestido (por exemplo, 50 [mu], de 1 μg/mL) em uma placa ELISA de 96 poços [por exemplo: microplaca de 96 Poços de fundo chato Corning EIA/RIA (Produto n°. 3590), Corning Inc., Acton, MA] durante pelo menos uma hora. Após essa etapa a solução de revestimento de anticorpo é removida, a placa é lavada lavagem uma ou duas vezes com solução (por exemplo, PBS e Tween 20 a 0,05%) e, em seguida, é bloqueada usando uma solução de bloqueio apropriada (por exemplo, PBS, BSA 1%, Cabra soro 1% e Tween 20 a 0,5%) e procedimentos conhecidos na técnica. A solução de Bloqueio é então removida da placa ELISA e um segundo anticorpo anti-esclerostina (Ab-Y), que está sendo testado por sua capacidade de bloquear de modo cruzado o anticorpo revestido, é adicionado em excesso (por exemplo, 50 μL de 10 μg/mL) de solução para o bloqueio apropriado das cavidades da placa ELISA. Após isto, uma quantidade limitada (por exemplo, 50 μL de 10 ng/mL) de esclerostina na solução de bloqueio é então adicionada aos poços adequados e a placa é incubada durante pelo menos uma hora à temperatura ambiente, enquanto agitada. A placa é então lavada 2-4 vezes com solução de lavagem. Um quantidade adequada de um reagente de deteção de esclerostina [por exemplo, anticorpo anti-esclerostina policlonal biotinilado que tenha sido pré- complexado com um quantidade adequada de um estreptavidina peroxidase de rábano (HRP) conjugada] na solução de bloqueio é adicionado à placa ELISA e incubado por pelo menos uma hora à temperatura ambiente. A placa é então lavada, pelo menos 4 vezes com solução de lavagem e é revelada com um reagente adequado [por exemplo, substratos HRP, como TMB (colorimétrico) ou vários substratos HRP luminescentes]. O sinal de fundo para o ensaio é definido como o sinal obtido em poços revestidos com o anticorpo (neste caso Ab-X), segundo fase em solução anticorpo (neste caso Ab-Y), esclerostina tampão só (ou seja, não esclerostina) e reagente de deteção de esclerostina. O controle positivo sinal para o ensaio é definido como o sinal obtido em poços revestidos com o anticorpo (neste caso Ab-X), segundo anticorpo em fase de solução (neste caso Ab-Y), tampão apenas (ou seja, nenhum segundo anticorpo em fase de solução), esclerostina e reagente de deteção de esclerostina. O teste ELISA deve ser executado de tal maneira, de modo que o controle sinal positivo seja de pelo menos 6 vezes o sinal antecedente.
[00211] Para evitar quaisquer artefatos (por exemplo, afinidades significativamente diferentes entre Ab-X e Ab-Y para esclerostina) resultantes da escolha de anticorpos que se usa como anticorpos de revestimento e que se usa como o segundo anticorpo (competidor), o ensaio de bloqueio cruzado Precisa ser executado em dois formatos: 1) formato 1 é onde Ab-X é o anticorpo que é revestido para a placa ELISA e Ab-Y é o anticorpo competidor, que está em solução e 2) formato 2 é onde Ab-Y é o anticorpo que é revestido para a placa ELISA e Ab-X é o anticorpo competidor que está em solução.
[00212] Ab-X e Ab-Y são definidos como bloqueadores em modo cruzado se, tanto em formato 1 ou em formato 2, o anticorpo anti-esclerostina na fase em solução é capaz de provocar uma redução entre 60% e 100 %, especificamente entre 70% e 100%, e mais especificamente entre 80% e 100%, os sinais de deteção de esclerostina (ou seja, a quantidade de esclerostina ligada pelos anticorpos revestidos), em comparação com o sinal de deteção de esclerostina obtido na ausência do anticorpo na fase em solução anti-esclerostina (ou seja, os poços controle positivo).
[00213] No caso de uma versão marcada de esclerostina ser utilizada no ELISA, tal como uma Esclerostina terminal N marcada com His (R & D Systems, Minneapolis, MN, E.U.A.; 2005 n° cat. 1406-ST-025), em seguida, um tipo adequado de reagente de detecção de esclerostina incluiria uma HRP marcada como anticorpo anti-His. Além de usar Esclerostina terminal N marcada com His, pode-se também usar Esclerostina terminal C marcada com His. Além disso, vários outros marcadores e combinações de proteínas de ligação marcadas que são conhecidos na técnica podem ser utilizados neste ensaio bloqueio cruzado ELISA (por exemplo, marcador HA com anticorpos anti-HA; marcador FLAG com anticorpos anti-FLAG; marcador biotina com Estreptavidina).
Exemplo 8 Ensaio de Mineralização com Base na Célula para Identificar Agentes Capazes de Antagonizar a Atividade de Esclerostina Introdução
[00214] A mineralização por células em cultura de linhagem de osteoblastos, tanto células primárias como linhagens celulares, é usada como um modelo da formação in vitro do osso. A mineralização leva cerca de uma a seis semanas para ocorrer com a indução da diferenciação de células de linhagem de osteoblastos através de um ou mais agentes de diferenciação. A sequência global de eventos envolve a proliferação celular, diferenciação, produção de matriz extracelular, a maturação da matriz e finalmente deposição de minerais, que se refere à cristalização e/ou deposição de fosfato de cálcio. Esta sequência de eventos que começa com a proliferação celular e diferenciação, e que termina com a deposição de minerais é aqui referida como mineralização. A medição de cálcio (mineral), é o resultado do ensaio.
[00215] A deposição de minerais tem uma forte característica biofísica, onde uma vez que “sementes” minerais começam a se formar, a quantidade total de minerais que será depositada em toda a cultura pode, por vezes, ser depositada muito rapidamente, como alguns dias depois. O tempo e a extensão de deposição de minerais em cultura são influenciados, em parte, pelas linhagem de células osteoblastos/linhagem de células especial a ser utilizada, as condições de crescimento, a escolha de agentes de diferenciação e o número de lote em especial de soro utilizados no meio de cultura celular. Para culturas de mineralização de linhagem de células osteoblastos/linhagem de células, pelo menos oito a quinze lotes de soro de mais de um fornecedor devem ser testados, a fim de identificar um determinado lote de soro que permita que a mineralização ocorra.
[00216] Células MC3T3-E1 (Sudo H, Kodama H-A, Amagai Y, Yamamoto S, Kasai S. 1983. In vitro differentiation and calcification in a new clonal osteogenic cell line derived fi'om newborn mouse calvaria. J. Cell Biol. 96:191-198) E subclones da linhagem celular original pode formar minerais na cultura em crescimento na presença de agentes diferenciadores. Tais subclones incluem MC3T3-E1-BF (Smith E, Redman R, Logg C, Coetzee G, Kasahara N, Frenkel B. 2000. Glucocorticoids inhibit developmental stage-specific osteoblast cell cycle. J. Biol. Chem. 275:1999220001).
Identificação de Anticorpos Neutralizadores Esclerostina
[00217] Células MC3T3-E1-BF foram usadas para o ensaio de mineralização. Ácido ascórbico e B-glicerofosfato foram usados para induzir a diferenciação celular em MC3T3-E1-BF levando a deposição minerais. O rastreio específico protocolo, em formato de 96-poços, envolveu plaquear as células em uma Quarta-feira, seguido por sete mudanças de meio (conforme descrito mais adiante) ao longo de 12 dias com a maioria da deposição mineral acontecendo ao fim de aproximadamente dezoito horas (por exemplo, da noite de domingo até segunda- feira). Para qualquer tratamento, 3 poços foram utilizados (N = 3). O tempo específico, e extensão, de deposição mineral pode variar dependendo, em parte, do número de lote do soro em especial a ser utilizado. Experimentos controle permitirão que tais variáveis sejam contabilizadas, como é sabido na técnica da experimentação geral de cultura celular.
[00218] Nesse sistema de ensaio a esclerostina inibiu uma ou mais das sequência de acontecimentos que levaram à deposição mineral e inclusive (ou seja, a esclerostina inibiu a mineralização). Os anticorpos anti-esclerostina que foram capazes de neutralizar a atividade inibitória da esclerostina permitida para mineralização da cultura na presença de esclerostina tal que houve um aumento estatisticamente significativo na deposição de fosfato de cálcio (medido como cálcio), em comparação com a quantidade de cálcio medido no grupo de tratamento com esclerostina apenas (ou seja, nenhum anticorpo). Para a análise estatística (usando o MS Excel e JMP) uma comparação ANOVA em 1 sentido seguida por comparação de Dunnett foi utilizada para determinar as diferenças entre os grupos. As médias dos grupos para cada conjunto de dados foram consideradas significativamente diferentes quando o valor P era inferior a 0,05 (P <0,05). Um resultado representante para a execução desse ensaio é mostrado na Figura 22. Na ausência de esclerostina recombinante de camundongo, a sequência de eventos que levaram à deposição de mineral incluindo a mesma procedeu normalmente. Os níveis de cálcio em cada grupo de tratamento são mostrados como meio + Média de Erro Padrão (SEM). Neste experimento exemplar, os níveis de cálcio do ensaio de cálcio foram -31 μg/mL. No entanto, a adição da esclerostina recombinte de camundongo causou inibição da mineralização, e o cálcio foi reduzido em ~ 85%. A adição de anticorpo anti- esclerostina monoclonal Ab-19 ou Ab-4, juntamente com a esclerostina recombinante resultou em um aumento estatisticamente significativo de deposição de minerais, em comparação com o grupo de apenas esclerostina, porque a atividade inibitória da esclerostina foi neutralizada por um ou por outro anticorpo. Os resultados deste experimento indicam que Ab-19 e Ab-4 são anticorpos neutralizadores de esclerostina monoclonais (Mabs).
[00219] A Figura 23 mostra um resultado muito semelhante usando esclerostina recombinante humana e dois Mabs anti-esclerostina humanizados. A Figura 24 também mostra um resultado muito semelhante usando esclerostina recombinante humana e Mabs anti-esclerostina de camundongo e humanizados como indicado.
[00220] Os anticorpos utilizados para as experiências mostradas na Fig 22, 23 e 24 têm um peso molecular de cerca de 145 kD e têm 2 sítios de ligação à esclerostina por molécula de anticorpo. Um protocolo detalhado de cultura celular MC3T3-E1-BF é descrito abaixo.
Figure img0008
[00221] Alfa-MEM é normalmente fabricado com um 1 ano de vencimento. Foi utilizado Alfa-MEM que não era tivesse mais do que 6 meses após a data de fabricação para a cultura celular.
[00222] O Meio de Expansão (Alfa-MEM/10% FBS/PenStrepGlu) foi preparado do seguinte modo: Um frasco com 500 mL de FBS foi descongelado e esterilizado por filtragem através de um filtro de 0,22 microns. 100 mL desse FBS foram adicionados a 1 litro de Alfa-MEM seguido pela adição de 10 mL de 100 x PenStrepGlutamine. FBS inutilizado foi aliquotado e recongelado para uso posterior. Meio de Diferenciação (Alfa-MEM/10% FBS/PenStrepGlu, + 50 μg/mL de ácido ascórbico, + 10 mM versão beta-glicerofosfato) foi preparado do seguinte modo: 100 mL de Meio de Diferenciação foi elaborado completando 100 mL de Meio de Expansão com ácido ascórbico e beta-glicerofosfato como segue:
Figure img0009
[00223] O Meio de Diferenciação foi feito complementando o Meio de Expansão apenas no dia em que o Meio de Diferenciação seria utilizado para a cultura celular. A concentração final de ácido ascórbico em Meio de Diferenciação é 100 μg/mL, porque Alfa-MEM já contém 50 μg/mL de ácido ascórbico. A solução-mãe de Ácido ascórbico (10 mg/mL) foi feita e aliquotada para congelamento em -80 °C. Cada alíquota foi utilizada apenas uma vez (isto é, não foi recongelada). A solução-mãe de Beta-glicerofosfato (1 M) foi feita e aliquotada para congelamento a -20 °C. Cada alíquota foi congelada e descongelada um máximo de 5 vezes antes de ser descartada.
Cultura celular para expansão de células MC3T3-E1-BF.
[00224] A cultura celular foi realizada a 37 °C e CO2 5%. Um banco de células foi gerado para fins de rastreio para anticorpos neutralizadores de esclerostina. O banco de células foi criado como segue:
[00225] Um frasco de células congeladas MC3T3-E1-BF foi descongelado, por agitação em um banho de água a 37 °C. As células descongeladas foram postas em 10 mL de Meio de expansão (Alfa-MEM/10% FBS/PenStrepGlu) em tubo de 50 mL e suavemente centrifugadas durante 5 minutos. As células foram então ressuspensas em 4 mL de Alfa-MEM/10% FBS/PenStrepGlu. Depois de determinar o número de células com azul de tripano e hemacitômetro, 1 x 10-6 células foram plaqueadas em 50 mL de meio Alfa-MEM/10% FBS/PenStrepGlu em um balão T175.
[00226] Quando essa passagem foi confluente (em aproximadamente 7 dias), as células foram tripsinizadas com tripsina/EDTA (Tripsina 0,05%; EDTA 0,53 mM), centrifugadas suavemente durante 5 minutos e, em seguida, ressuspensas em 5 mL de Alfa-MEM/10% FBS/PenStrepGlu. Depois de determinar o número de células com azul de tripano e hematocitômetro, as células foram plaqueadas de 1 x 10-6 células em 50 mL de meio Alfa-MEM/10% FBS/PenStrepGlu para um balão T175. O número de recipientes T175 utilizados para plaquear neste momento dependeu do número de células totais disponíveis e o número desejado de recipientes a serem usados até a próxima passagem. Células extras foram congeladas em 1-2 x 10-6 células vivas/mL em 90% FBS/10% DMSQ.
[00227] Quando esta passagem foi confluente (cerca de 3-4 dias), as células foram tripsinizadas com tripsina/EDTA (0,05% Tripsina; 0,53 mM EDTA), centrifugadas suavemente durante 5 minutos e, em seguida, ressuspensão em 5 incorretamente Alfa-MEM/10% FBS/PenStrepGlu. Depois de determinar o número de células com azul de tripano e hematocitômetro, as células foram plaqueadas de 1 x 10-6 células em 50 mL de meio Alfa-MEM/10% FBS/PenStrepGlu para um balão T175. O número de recipientes T175 utilizados para plaquear neste momento dependeu do número de células totais disponíveis e o número desejado de recipientes a serem usados até a próxima passagem. Células extras foram congeladas em 1-2 x 10-6 células vivas/mL em 90% FBS/10% DMSQ.
[00228] Quando esta passagem foi confluente (cerca de 3-4 dias), as células foram tripsinizadas com tripsina/EDTA (0,05% Tripsina; 0,53 mM EDTA), centrifugadas suavemente durante 5 minutos e, em seguida, ressuspensas em 5 mL de meio Alfa-MEM/10% FBS/PenStrepGlu. Depois de determinar o número de células com azul de tripano e hematocitômetro, as células foram plaqueadas de 1 x 10-6 células em 50 mL de meio Alfa-MEM/10% FBS/PenStrepGlu para um balão T175. O número de recipientes T175 utilizados para plaquear neste momento dependeu do número de células totais disponíveis e o número desejado de recipientes a serem usados até a próxima passagem. Células extras foram congeladas em 1-2 x 10-6 células vivas/mL em 90% FBS/10% DMSQ.
[00229] Quando esta passagem foi confluente (cerca de 3-4 dias), como células foram tripsinizadas com tripsina/EDTA (0,05% Tripsina; 0,53 mM EDTA), centrifugadas suavemente durante 5 minutos e, em seguida, ressuspensão em 5 mL de Alfa-MEM/10% FBS/PenStrepGlu. Depois de determinar o número de células com azul de tripano e hematocitômetro, as células foram congeladas em 1-2 x 10-6 células vivas/mL em 90% FBS/10% DMSO. Esta “passagem final” de células congeladas foi a passagem que foi utilizada para o ensaio de rastreio.
Cultura celular para mineralizar células MC3T3-E1-BF.
[00230] A cultura celular foi realizada a 37 °C e CO2 5%. É desejável minimizar as flutuações de temperatura e do % de CO2 durante o procedimento de cultura celular para mineralização. Isso pode ser conseguido minimizando o tempo que as placas ficam fora da incubadora durante a alimentação e também pela redução do número de vezes que a porta da incubadora é aberta e fechada durante o procedimento de cultura celular para mineralização. Neste sentido ter um incubadora de cultura de tecido que é dedicada exclusivamente para a cultura celular de mineralização (e, portanto, não é aberta e fechada mais do que o necessário) pode ser útil.
[00231] Um número adequado de frascos de “passagens finais” preparados como descrito acima foram descongelados, por agitação em um banho de água a 37 °C. As células descongeladas foram postas em 10 mL de Meio de expansão (Alfa-MEM/10% FBS/PenStrepGlu) em tubo de 50 mL e suavemente centrifugadas durante 5 minutos. As células foram então ressuspensas em 4 mL de Alfa-MEM/10% FBS/PenStrepGlu. Depois de determinar o número de células por azul de tripano e hematocitômetro, 2500 células foram plaqueadas em 200 microlitros de Meio de Expansão por poço em placas de 96 poços revestidas com colágeno 1 (Becton Dickinson Labware, n° cat. 354407).
[00232] Para evitar um efeito de mineralização da extremidade da placa, as células não foram plaqueadas na linha/coluna ultraperiférica em torno da placa. Ao invés disso, 200 microlitros de PBS foram acrescentados a estes poços.
Processo Exemplar de Cultura Celular
[00233] No procedimento seguinte, o dia de partida para plaquear as células é indicado para ser uma quarta-feira. Se um outro dia da semana é usado como o dia de partida para plaquear as células, esse dia irá acionar o cronograma diário para remover e adicionar meio durante todo o processo, como indicado abaixo. Por exemplo, se as células são plaqueadas em uma terça-feira, os meios não devem ser removidos e adicionados na primeira sexta-feira e sábado, nem na segunda sexta- feira e sábado. Com um início na terça-feira, as placas serão preparadas para o ensaio de cálcio no último domingo.
[00234] As células foram plaqueadas em uma quarta-feira em 2500 células em 200 μL de Meio de Expansão.
[00235] Na quinta-feira todo o Meio de Expansão foi removido e 200 μL de Meio de Diferenciação foi adicionado.
[00236] Na sexta-feira 100 μL do meio foi removido e 100 μL de Meio de Diferenciação fresco foi adicionado.
[00237] Na segunda-feira 100 μL do meio foi removido e 100 μL de Meio de Diferenciação fresco foi adicionado.
[00238] Na terça-feira 100 μL do meio foi removido e 100 μL de Meio de Diferenciação fresco foi adicionado.
[00239] Na quarta-feira, 100 μL do meio foi removido e 100 μL de Meio de Diferenciação fresco foi adicionado.
[00240] Na quinta-feira 100 μL do meio foi removido e 100 μL de Meio de Diferenciação fresco foi adicionado.
[00241] Na sexta-feira 100 μL do meio foi removido e 100 μL de Meio de Diferenciação fresco foi adicionado.
[00242] Na segunda-feira seguinte as placas foram preparadas para o ensaio de cálcio do seguinte modo:
[00243] As placas foram lavadas uma vez com 10 mM Tris, HCl pH 7-8. Trabalhando em uma capela, 200 μL de 0,5 N HCl foram acrescentados por poço. As placas foram então congeladas a -80 °C.
[00244] Pouco antes da medição de cálcio, as placas foram congeladas e descongeladas duas vezes e, em seguida, foi utilizada trituração com uma pipeta multicanal para dispersar o conteúdo da placa. O conteúdo da placa foi então deixado sedimentar a 4 °C durante 30 minutos quando uma adequada quantidade de sobrenadante foi removida para medir o cálcio utilizando um kit de cálcio comercialmente disponível. Um kit exemplar e não-limitante é Cálcio (CPC) Liquicolor, N°. Cat. 0150-250, Stanbio Laboratory, Boerne, TX.
[00245] Neste ensaio com base na célula, a esclerostina inibe uma ou mais das sequências de acontecimentos que levaram à deposição de minerais, inclusive a mesma (ou seja, a esclerostina inibe a mineralização). Assim, em experimentos onde a esclerostina foi incluída, em especial experimento de cultura celular, a esclerostina recombinante foi adicionada ao meio começando na primeira quinta-feira e alimentada a cada dia seguinte. Nos casos em que um anticorpo anti- esclerostina monoclonal (Mab) estava sendo testado para a capacidade de neutralizar a esclerostina, ou seja, permitir a mineralização por neutralizar a a capacidade da esclerostina de inibir a mineralização, o Mab foi adicionado ao meio começando na primeira quinta-feira e alimentada todos os dias subsequentes. De acordo com o protocolo, isso foi realizado da seguinte forma: o Mab foi preincubado com a esclerostina recombinante em Meio de Diferenciação por 45-60 minutos a 37 °C e, em seguida, esse material foi utilizado para alimento para as células.
[00246] É descrito acima um protocolo de 12 dias de mineralização para células MC3T3-E1-BF. Usando os mesmos reagentes e protocolo de alimentação, as células originais MC3T3-E1 (Sudo H, Kodama H-A, Amagai Y, Yamamoto S, Kasai S. 1983. In vitro differentiation and calcification in a new clonal osteogenic cell line derived from newborn mouse calvaria. J Cell Biol 96:191-198), que é obtida a partir do RIKEN Cell Bank (RCB 1126, RIKEN BioResource Center 3-1-1 Koyadai, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-0074 Japão) levou mais tempo para mineralizar (20 dias no total de mineralização) do que as células MC3T3-E1-BF. A mineralização da células originais MC3T3-E1 foi inibida por esclerostina recombinante e esta inibição foi bloqueada usando anticorpos neutralizadores de esclerostina.
Exemplo 9 Anticorpos Anti-Esclerostina Protegem de Perda Óssea Induzida por Inflamação no Modelo de Transferência CD4 CD45RB elevado de Colite em Camundongos SCID Resumo do modelo
[00247] Injeção do subconjunto CD45RBelevado de células T CD4+ em camundongos scid CB-17 resulta em inflamações intestinais crônicas com características semelhantes às da doença inflamatória intestinal humana (IBD). Diarréia e emaciação são notadas 3-5 semanas após a transferência das células com graves infiltrações leucocitárias no cólon acompanhadas de hiperplasia das células epiteliais e formação de granulomas. Camundongos scid CB-17 que recebem o subconjunto recíproco de células CD4 +, aqueles que expressam CD45RBbaixo, não apresentam colite e têm um peso indistinguível dos camundongos scid não sensibilizados. Além de sintomas de colite, o modelo de transferência de células T CD45RBelevado CD4 + de colite é acompanhado por uma redução da densidade mineral óssea (DMO), o que se pensa ser principalmente através de mecanismos inflamatórios, em vez de má absorção dietária (Byrne, FR et al., Out 54:78-86, 2005).
Indução da Colite e Perda Óssea Induzida por Inflamação
[00248] Os baços de camundongos balb/c fêmeas foram retirados e rompidos através de um filtro de 70 μm de células. A população CD4 + foi então enriquecida pela seleção negativa com Dynabeads utilizando anticorpos contra B220, MAC-1, CD8 e I-Ad. A população enriquecida foi então corada com conjugado FITC anti-CD4 e conjugado PE anti-CD45RB e fracionado em populações CD4 + CD45RB elevado e CD4 + CD45RBbaixo por duas ordenações em cores em um Moflo (Dakocytomation). As populações CD45RB elevado e CD45RBbaixo foram definidas como a coloração mais brilhante 40% e a coloração mais opaca 20% de células CD4 +, respectivamente. 5 x 10-5 células foram então injetadas IP em Camundongos scid CB- 17 no dia 0 e o desenvolvimento da colite foi monitorizado através do aparecimento de fezes amolecidas ou diarréia e perda de peso. As medições de densidade mineral óssea foram tomadas no encerramento do estudo (dia 88).
Efeito de Tratamento Anti-Esclerostina em Sintomas de Colite e BMP
[00249] IgG Ab-A foi administradA em 10mg/kg sc, A partir do dia antes de transferência de célula CD4 + CD45RB elevado e, em comparação com ratos que receberam o anticorpo controle negativo 101,4, em administração de também 10mg/kg sc. Os anticorpos foram dosados nas semanas subsequentes. Um grupo de camundongos que recebeu células não patogênicas CD4 + CD45RBbaixa e foram tratados com 10mg/kg 101,4 foi estudado como um controle. Ao término do estudo (88° dia) a densidade mineral óssea, foi medida e seções do cólon tomadas para análise da infiltração de células e avaliação do dano histológico.a) Nenhum efeito sobre sintomas de colite
[00250] Os sintomas típicos de colite como perda de peso e infiltração de células inflamatórias no cólon não foram afetados pelo tratamento com Ab-A. Da mesma forma não houve melhoria do dano histológico ao cólon após o tratamento com Ab-A.b) Inibição da perda da densidade mineral óssea induzida por inflamação.
[00251] No 88° dia, após transferência de células em Camundongos scid CB-17, a densidade mineral óssea foi medida (DMO total, DMO vertebral e DMO femoral). Em comparação com os camundongos controlados que receberam células não patogênicas CD4 + CD45RBbaixo, os camundongos que receberam células T CD4 + CD45RB elevado e anticorpo 101,4 controle negativo tinham redução da densidade mineral óssea, conforme mostra a Figura 25. Em contrapartida, não se observou redução da DMO após o tratamento com Ab-A. As medições da DMO total, de vértebras e de fêmur foram significativamente maiores nos ratos que receberam células T CD4 + CD45RB elevado e tratados com Ab-A do que nos camundongos que receberam células T CD4 + CD45RB elevado e foram tratados com 101,4 (P <0,001 por teste de comparação múltipla de Bonferroni).
Exemplo 10 Determinação da Afinidade (KD) com Base em KINEXA de Anticorpos Anti- Esclerostina para Esclerostina Humana
[00252] A afinidade de vários anticorpo anti-esclerostina para esclerostina humana foi avaliada por uma análise de ligação de solução em equilíbrio utilizando KinExA ® 3000 (Sapidyne Instruments Inc., Boise, ID). Para essas medições, grânulos Reacti-Gel 6x (Pierce, Rockford, IL) foram pré-revestidos com 40 μg/mL de esclerostina humana em 50 mM Na2CO3, pH 9,6 a 4 °C durante a noite. Os grânulos foram bloqueados, em seguida, com 1 mg/mL de BSA em 1 M Tris-HCl, o pH 7,5 a 4 °C durante duas horas. 10 pM, 30 pM, ou 100 pM dos anticorpos foram misturadas com diferentes concentrações de esclerostina humana, variando a concentração de 0,1 pM a 1 nM e equilibrada à temperatura ambiente por mais de 8 horas em PBS com 0,1 mg/mL de BSA e 0,005 % P20. As misturas foram então passadas sobre os grânulos revestidos com esclerostina humana. A quantidade de anticorpos anti- esclerostina ligada aos grânulos foi quantificada usando anticorpos anti-IgG de rato de cabra fluorescentes marcados com Cis ou anti-IgG humana de cabra fluorescentes marcados com Cis (Jackson Immuno Research, West Grove,) para as amostras de anticorpos de camundongos ou humanos, respectivamente. A quantidade de sinal fluorescente medido foi proporcional à concentração de anticorpos anti-esclerostina livres em cada mistura de reação em equilíbrio. A constante de equilíbrio de dissociação (Kp) foi obtida a partir da regressão não-linear das curvas de competição utilizando um modelo de ligação homogêneo de um sítio de curva n fornecido no software KinExA Pro. Os resultados dos ensaios KinExA para os anticorpos selecionados estão resumidos na tabela abaixo.
Figure img0010
Exemplo 11 Método BIACORE para Determinar a Afinidade de Anticorpos Anti- Esclerostina Humanizados para Esclerostina Humana.
[00253] A tecnologia BIAcore controla a ligação entre biomoléculas em tempo real e sem a exigência de rotulagem. Um dos interactantes, denominado o ligante, tanto é imobilizado diretamente ou capturados na superfície imobilizada, enquanto o outro, chamado analisado, flui em solução sobre a superfície capturada. O sensor detecta a mudança de massa sobre a superfície do sensor como o analisado se liga ao ligante para formar um complexo na superfície. Isto corresponde ao processo de associação. O processo de dissociação é monitorado quando o analisado é substituído por tampão. No ensaio de afinidade BIAcore, o ligante é o anticorpo anti- esclerostina e o analisado é esclerostina.
Instrumento Biacore (R) 3000, Biacore AB, Uppsala, Suécia Chip sensor
[00254] CM5 (grau de investigação) número de catálogo: BR-1001-14, Biacore AB, Uppsala, Suécia. Os Chips foram armazenados a 4 °C.
Solução BIAnormalisante
[00255] 70% (p/p) Glicerol. Parte do Kit BIAmanutenção número de catálogo: BR-1002-51, Biacore AB, Uppsala, Suécia. O Kit BIAmaintenance foi armazenado a 4 °C.
Kit de Acoplamento Amina
[00256] Número de catálogo: BR-1000-50, Biacore AB, Uppsala, Suécia.
[00257] Cloridrato de Etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC). Composto a 75 mg/mL de água destilada e armazenado em alíquotas de 200 μL em - 70 °C.
[00258] N-Hidroxisuccinimida (NHS). Composto a 11,5 mg/mL de água destilada e armazenado em alíquotas de 200 μL em -70 °C.
[00259] Cloridrato de Etanolamina-NaOH 1M pH 8,5. Armazenado em alíquotas de 200 μL em -70 °C.
Tampões
[00260] Tampão de corrida para imobilização de anticorpos capturados: BH-EP (sendo HEPES 0,01 M pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, Tensoativo P20 0,005%). Número de catálogo: BR-1001-88, Biacore AB, Uppsala, Suécia. Tampão armazenado a 4 °C.
[00261] Tampão de Imobilização: Acetato 5,0 (sendo acetato de sódio 10 mM pH 5.0). Número de catálogo: BR-1003-51, Biacore AB, Uppsala, Suécia. Tampão armazenado a 4 °C.
[00262] Tampão de corrida para ensaio de ligação: BH-EP (sendo 0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% Tensoativo P20, Número de catálogo: BR-1001-88, Biacore AB, Uppsala, Suécia), com CM-dextrano adicionado a 1 mg de/mL (Número de catálogo 27560, Fluka BioChemika, Buchs, Suiça). Tampão armazenado a 4 °C.
Captura de Ligante
[00263] Fragmento de IgG anti-humana de cabra Affinipure F (aB')2, fragmento Fc específico. Jackson ImmunoResearch Inc (Pennsylvania, E.U.A.) Número de catálogo: 109-006-098. Reagente conservado a 4 °C.
Ligante
[00264] Anticorpos humanizados anti-esclerostina humana Ab5, Ab 14 e Ab20.
Analisado
[00265] Esclerostina Recombinante humana. Alíquotas armazenada a -70 °C e descongeladas uma vez para cada ensaio.
Solução de Regeneração
[00266] HCl 40 mM preparado por diluição com água destilada de uma solução-mãe 11,6 M (BDH, Poole, Inglaterra. Catálogo: 101254H).
[00267] NaOH 5 mM preparado por diluição com água destilada a partir de solução a 50 mM. Número de catálogo: BR-1003-58, Biacore AB, Uppsala, Suécia.
Método de Ensaio
[00268] O formato do ensaio foi a captura do anticorpo anti-esclerostina imobilizado pela IgG-Fc anti-humana e então titulação de esclerostina sobre a superfície capturada.Um exemplo do procedimento é indicado a seguir:
[00269] BIA (Biamolecular Interaction Analysis), foi realizada utilizando uma BIAcore 3000 (BIAcore AB). Fragmento IgG anti-humana de cabra Affinipure F(aB')2, e fragmento Fc específico (Jackson ImmunoResearch) foram imobilizados em um Chip sensor CM5 através de acoplamento químico amina para um nível dw captação de «4000 unidades de resposta (RUs). tampão BH-EP- (HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 0,15 M, EPTA 3 mM, Tensoativo P20 0,005%, BIAcore AB) contendo 1 mg/mL CM-dextrano foi utilizado como tampão de corrida com uma taxa de fluxo de 10 μL/min. Uma injeção de 10 μL do anticorpo anti-esclerostina a ~ 5 μg/mL foi utilizada para capturar as IgG-Fc anti-humana imobilizadas. Os níveis de captura de Anticorpo eram tipicamente 100-200 RU. A esclerostina foi ajustada ao longo dos anticorpos anti-esclerostina capturados em várias concentrações com uma taxa de fluxo de 30 μL/minuto. A superfície foi regenerada por duas injeções de 10 μL de HCl 40 mM, seguidas por uma injeção de 5 μL de NaOH 5 mM com uma vazão de 10 μL/minuto.
[00270] As curvas de ligação de subtração antecedentes foram analisados utilizando o software BIAevaluation (versão 3.2) seguindo os procedimentos normalizados. Os parâmetros cinéticos foram determinados a partir do algoritmo de ajuste.
[00271] Os dados cinéticos e contantes de dissociação calculados são apresentados na tabela 2. Tabela 2: Afinidade de anticorpo anti-esclerostina para a esclerostina
Figure img0011
Exemplo 12 Testes in Vivo de Anticorpos Monoclonais Anti-Esclerostina em Macacos Da espécie cynomolgus
[00272] Trinta e três macacos da espécie cynomolgus fêmeas com cerca de 3-5 anos, (Macaca fascicularis) foram utilizados neste estudo de 2 meses. O estudo continha 11 grupos: Grupo 1: veículo (N = 4) Grupo 2: Ab-23 (N = 2, dose 3 mg/Kg) Grupo 3: Ab-23 (N = 3, dose 10 mg/Kg) Grupo 4: Ab-23 (N = 3, dose 30 mg/Kg) Grupo 5: Ab-5 (N = 3, dose 3 mg/Kg) Grupo 6: Ab-5 (N = 3, dose 10 mg/Kg) Grupo 7: Ab-5 (N = 3, dose 30 mg/Kg) Grupo 8: Ab-14 (N = 3, a dose 3 mg/Kg) Grupo 9: Ab-14 (N = 3, dose 10 mg/Kg) Grupo 10: Ab-14 (N = 3, dose 30 mg/Kg) Grupo 11: Hormônio Paratireóideo (1-34) [PTH (1-34)] (N = 3, dose 10 μg/kg)
[00273] Todas as doses foram subcutâneas. PTH (1-34) foi administrado diariamente, anticorpos monoclonais (Mabs) foram dosados em duas vezes (primeira dose no início do estudo e segunda dose no ponto de tempo de um mês). Para avaliação do parâmetros ósseos (por exemplo, a densidade mineral óssea), as varreduras pQCT (tomografia computadorizada periférica quantitativa) e DXA (absorciometria de raios-X de dupla energia) foram realizadas antes do início do estudo (para obter valores basais), e depois de um mês (antes da segunda dose de Mab) e, finalmente, no final do estudo (ponto de tempo de 2 meses), em cujo ponto os macacos foram submetidos a necrópsia para uma análise mais aprofundada (por exemplo, análise histomorfométrica). Os animais foram marcados com fluorcromo (dias 14, 24, 47 e 57) para a histomorfometria dinâmica. Foi coletado soro em vários pontos durante o período de estudo [dia 1 pré-administração (o dia da primeira dose de Mab), dia 1 doze horas após a dose, dia 2, dia 3, dia 5, dia 7, dia 14, dia 21, dia 28, dia 29 doze horas pós-administração (dia 29 foi o dia da segunda e última dose de Mab), dia 30, dia 31, dia 33, dia 35, dia 42, dia 49 e dia 56]. Três biomarcadores séricos relacionados ao osso foram medidos utilizando materiais disponíveis comercialmente:Osteocalcina (OC) (Kit de radioimunoensaio DSL Osteocalcina; Diagnostic Systems Laboratories, Inc., Webster, TX, E.U.A.) Procolágeno de Propeptídeo de terminal N do Tipo I (P1NP) (Kit de radioimunoensaio P1NP; Orion Diagnostica, Espoo, Finlândia) Fragmentos C-telopéptideos de cadeias de colágeno tipo I Al (sCTXI) (Serum CrossLaps ® ELISA; Nordic Bioscience Diagnostics AJS, Herlev, Dinamarca).
[00274] As varreduras PQCT e DXA produziram dados sobre vários parâmetros ósseos (incluindo a densidade mineral óssea (DMO) e conteúdo mineral ósseo) através de diversos sítios esqueléticos (incluindo metáfise e diáfise tibiais, metáfise e diáfise radiais, pescoço femural, vértebras lombares). A análise destes dados ósseos (alteração percentual da linha de base para cada animal) e os dados de biomarcador sérico (alteração percentual da linha de base para cada animal) anabólicos (OC, P1NP) revelaram aumentos estatisticamente significativos, versus o grupo veículo, em alguns parâmetros a alguns pontos de tempo e doses para cada Mab. Estes dados de parâmetros ósseos, dados de biomarcador sérico, bem como os dados histomorfométricos, indicaram que cada um dos 3 Mabs (Ab-23, Ab-5 e Ab-14) foi capaz de neutralizar a esclerostina em macacos da espécie cynomolgus. Esta atividade foi maior para Ab-23 e Ab-5, em particular com a dose mais elevada (30 mg/Kg), com um claro aumento na formação óssea (efeito anabólico), bem como os ganhos líquidos nos ossos (por exemplo, DMO). Aumentos estatisticamente significativos nos parâmetros ósseos e parâmetros histomorfométricos anabólicos também foram encontrados para o grupo controle positivo (PTH (1 -34)).
[00275] Marcadores séricos de formação óssea (P1NP, osteocalcina) foram aumentados (p <0,05 versus veículo (VEH)), em vários pontos de tempo e doses, mas sobretudo nos grupos 30 mg/Kg de Ab-23 e Ab-5. A análise histomorfométrica revelou um aumento dramático (p <0,05 versus VEH) nas taxas de formação óssea em osso canceloso na vértebra lombar e tíbia proximal (aumento de até 5 vezes), bem como na superfície endocortical do midshaft femoral (até 10 vezes de aumento) em doses mais elevadas de Ab-23 e Ab-5. A espessura trabecular foi aumentada com doses elevadas de Ab-23 e Ab-5 em vértebras lombares (>60%, p <0,05 versus VEH). Pelo estudo final (2 meses), DMO areal, como alteração percentual da linha de base, foi aumentada (p <0,05 versus VEH), no pescoço do fêmur, rádio ultra-distal (Ab-23, 30 mg/Kg), e vértebras lombares ( Ab-5, 30 mg/Kg). Os aumentos na DMO areal na vértebras lombares foram acompanhadas de aumentos das força vertebral (97% de aumento na carga máxima vertebral para Ab- 23, 30 mg/Kg; p <0,05 versus VEH); os valores basais para DMO areal lombar antes da dosagem de Mab foram estatisticamente semelhantes em todos os grupos. Em resumo, a administração de Mabs que neutralizam a esclerostina a curto prazo em macacos da espécie cynomolgus resultou, em parte, em aumento na formação óssea, DMO e força óssea vertebral.A partir do exposto, embora as modalidades específicas da invenção tenham sido descritas neste documento para fins de ilustração, diversas modificações podem ser feitas sem se desviar do espírito e do âmbito da invenção. Consequentemente, a invenção não é limitada, exceto pelas reivindicações anexas. Todas as publicações, pedidos de patente publicados, patentes e documentos divulgados são incorporados aqui por referência.

Claims (21)

1. Anticorpo de ligação à esclerostina CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as seguintes sequências de CDR: CDR-H1: DYNMH (SEQ ID NO: 245); CDR-H2: EINPNSGGAGYNQKFKG (SEQ ID NO: 246); CDR-H3: LGYDDIYDDWYFDV (SEQ ID NO: 247); CDR-L1: RASQDISNYLN (SEQ ID NO: 78); CDR-L2: YTSRLLS (SEQ ID NO: 79); e CDR-L3: QQGDTLPYT (SEQ ID NO: 80).
2. Anticorpo de ligação à esclerostina, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de polipeptídeos tendo a sequência da SEQ ID NO: 378.
3. Anticorpo de ligação à esclerostina, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma cadeia leve compreendendo uma sequência de polipeptídeos tendo a sequência da SEQ ID NO: 376.
4. Anticorpo de ligação à esclerostina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ambas uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de polipeptídeos tendo a sequência da SEQ ID NO: 378 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de polipeptídeos tendo a sequência da SEQ ID NO: 376.
5. Anticorpo de ligação à esclerostina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma região constante da cadeia leve e/ou da cadeia pesada.
6. Anticorpo de ligação à esclerostina, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que é uma IgG.
7. Anticorpo de ligação à esclerostina, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a IgG4 humana ou a região constante da IgG2 humana.
8. Anticorpo de ligação à esclerostina, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que possui cadeias pesadas da SEQ ID NO: 137 e cadeias leves da SEQ ID NO: 133.
9. Anticorpo de ligação à esclerostina, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de possui cadeias pesadas da SEQ ID NO: 145 ou 392 e cadeias leves da SEQ ID NO: 141.
10. Anticorpo de ligação à esclerostina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo é um fragmento de anticorpo de ligação à esclerostina compreendendo as seis CDRs definidas na reivindicação 1.
11. Anticorpo de ligação à esclerostina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que é um anticorpo completo.
12. Anticorpo de ligação à esclerostina, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo é um fragmento F(ab’)2, Fab, Fab’ ou Fv.
13. Anticorpo de ligação à esclerostina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que é um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico.
14. Anticorpo de ligação à esclerostina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo tem uma constante de dissociação para esclerostina humana como medida por ressonância plasmônica de superfície menor que ou igual a 1 x 10-9 M, menor que ou igual a 1 x 10-10 M, menor que ou igual a 1 x 10-11 M, ou menor que ou igual a 1 x 10-12 M.
15. Anticorpo de ligação à esclerostina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, CARACTERIZADO pelo fato de que está ligado a uma ou mais molécula(s) efetora(s) ou repórter(es).
16. Anticorpo de ligação à esclerostina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo pode aumentar pelo menos um dentre formação óssea, densidade mineral óssea, conteúdo mineral ósseo, massa óssea, qualidade óssea e força óssea em um mamífero.
17. Anticorpo de ligação à esclerostina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito anticorpo pode bloquear o efeito inibitório da esclerostina em um ensaio de mineralização com base em células.
18. Vetor de clonagem ou expressão CARACTERIZADO pelo fato de que compreende pelo menos uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148 e 379.
19. Processo para a produção do anticorpo de ligação à esclerostina, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende cultivar uma célula hospedeira compreendendo um ou mais vetores de clonagem ou expressão, como definido na reivindicação 18, e isolar o anticorpo de ligação à esclerostina.
20. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um anticorpo de ligação à esclerostina, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17, em combinação com um ou mais de um excipiente, diluente e veículo farmaceuticamente aceitável.
21. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADA pelo fato de que ainda compreende outros ingredientes ativos.
BRPI0610197A 2005-05-03 2006-04-28 anticorpo de ligação à esclerostina, processo para a produção do mesmo, composição farmacêutica que compreende o dito anticorpo e vetor de clonagem ou expressão BRPI0610197B8 (pt)

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