BRPI0610958A2

BRPI0610958A2 - método para produzir uma forma obtida por bioengenharia do ativador de plasminogênio tecidual

Info

Publication number: BRPI0610958A2
Application number: BRPI0610958-6A
Authority: BR
Inventors: Villoo Morawala Patell
Original assignee: Avestha Gengraine Tech Pvt Ltd
Priority date: 2005-06-02
Filing date: 2006-05-31
Publication date: 2010-08-03
Also published as: RU2007147921A; CN101218344A; AP2007004251A0; CA2610391A1; MX2007015091A; JP2009507467A; EP1891214A2; AU2006253855A1; IL187401A0; ZA200711008B; KR20080036561A; WO2006129191A3; WO2006129191A2; US20090246188A1

Abstract

A presente invenção refere-se ao método recombinante usado para a produção de uma forma solúvel de uma variante do ativador de piasminogénlo tecidual. Nesta variante, a treonina na posição 103 do ativador de plasminogênio tecidual endógeno é substituida por uma asparagina, levando a um novo sitio de glicosliação. Na posição 117 do ativador de piasminogifio tecidual, a asparagina foi substituida por glutamina, levando à remoção de um sitio de glicosilação ligado a N. Na posição 296-299, os aminoácidos usina, histidina, arginina, e arginina foram substituidos por quatro aminoácidos alanina. A Invenção refere-se ainda à síntese inusitada da seqüência de ácidos nuclélcos que codifica o ativador do plasminogênio tecidual, transformação das seqúinclas de ácidos nucléicos construídas em bactérias competentes e subclonagem das mesmas em vetores de expressão em mamíferos para a expressão da proteína desejada. As construções de DNA que compreendem os elementos de controle associados com o gene de laresse foram descritas. O ativador do plasminogênio tecidual humano recombinante, de acordo com a invenção, e os seus sais e derivados funcionais, podem compreender o lngredlea ativo de composições farmacêuticas para o tratamento de Infarto do miocárdio e acidea vascular cerebral em pacientes. Estas composições são ainda outro aspecto da pressa invenção.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOPARA PRODUZIR UMA FORMA OBTIDA POR BIOENGENHARIA DOATIVADOR DE PLASMINOGÊNIO TECIDUAL".

Campo Técnico da Invenção

A presente invenção refere-se ao método recombinante usadopara produzir uma forma solúvel de uma variante do ativador de plasmino-gênio tecidual humano. Nesta variante, a treonina na posição 103 do ativa-dor de plasminogênio tecidual endógeno é substituída por uma asparagina,levando a um novo sítio de glicosilação. Na posição 117 do ativador deplasminogênio tecidual, a asparagina foi substituída por glutamina, levando àremoção de um sítio de glicosilação ligado a N. Na posição 296-299, os ami-noácidos lisina, histidina, arginina, e arginina foram substituídos por quatroaminoácidos alanina.

A invenção refere-se ainda à síntese inusitada da seqüência deácidos nucléicos que codifica o ativador do plasminogênio tecidual, transfor-mação das seqüências de ácidos nucléicos construídas em bactérias com-petentes e subclonagem das mesmas em vetores de expressão em mamífe-ros para a expressão da proteína desejada.

As construções de DNA que compreendem os elementos decontrole associados com o gene de interesse foram descritas.

O ativador do plasminogênio tecidual humano recombinante, deacordo com a invenção, e os seus sais e derivados funcionais, podem com-preender o ingrediente ativo de composições farmacêuticas para o tratamen-to de infarto do miocárdio e acidente vascular cerebral em pacientes. Estascomposições são ainda outro aspecto da presente invenção.

Antecedentes da Invenção

Os ativadores de plasminogênio são enzimas que ativam oplasminogênio zimógeno para gerar a serina proteinase plasmina, que de-grada a fibrina. Dentre os ativadores de plasminogênio estudados estão aestreptocinase, urocinase e o ativador de plasminogênio tecidual (t-PA).

O mecanismo de ação de cada um desses ativadores de plasminogênio dife-re. A estreptocinase forma um complexo com plasminogênio, gerandoatividade de plasmina, a urocinase cliva o plasminogênio diretamente, e t-PAforma um complexo ternário com fibrina e plasminogênio, levando à ativaçãode plasminogênio no local do coágulo.

O ativador de plasminogênio do tipo tecidual (t-PA), uma serinaprotease glicosilada com múltiplos domínios, é um ativador de plasminogê-nio específico de fibrina e um agente trombolítico muito eficaz. t-PA é umaproteína recombinante cuja aplicação principal é no tratamento de pacientescom infarto do miocárdio e acidente vascular cerebral. Ele foi caracterizadopela primeira vez em 1979, como um agente farmacêutico biológico impor-tante e potente no tratamento de várias doenças vasculares devido à suaalta especificidade por fibrina e capacidade potente de dissolver coágulossangüíneos in vivo.

O t-PA natural tem uma meia-vida plasmática de cerca de seusminutos ou menos. Devido à sua rápida depuração da circulação, t-PA temde ser infundido para conseguir a trombolise. A administração de dosagenscom carga precoce e concentrações aumentadas de t-PA demonstrou lisemais rápida e completa em comparação com o protocolo de infusão usual ea potência precoce está correlacionada com melhor taxa de sobrevida. Aadministração maciça poderia melhorar ainda mais a velocidade da lise ex-pondo rapidamente o coágulo-alvo a uma concentração mais alta da enzima,mas uma única administração maciça de t-PA natural ou do tipo selvagemnão pode ser geralmente usada devido à sua taxa de depuração.

Muitos pesquisadores produziram versões com meia-vida maislonga de t-PA que poderiam ser administradas maciçamente, mas quasetodas as variantes vieram a ter atividades fibrinolíticas significativamentediminuídas.

Assim sendo, é um objeto da presente invenção fornecer ummétodo recombinante usado para a produção de uma molécula com taxa dedepuração reduzida, e ao mesmo tempo, retendo a atividade fibrinolíticacompleta, e estudos sistemáticos de mutagênese foram aplicados a t-PA emseus vários domínios. Tal fármaco teria também uma alta especificidade commaior afinidade por um trombo recente e produziria menos plasmina circu-lante. Conseqüentemente, a incidência de hemorragia intracerebral (ICH) eoutros episódios de sangramento não-cerebrais seria mais baixa. O fármacoteria resistência a PAI-1 e seria também produtivo.

Sumário da Invenção

Um aspecto específico da invenção refere-se à síntese inusitadada seqüência de ácidos nucléicos que codifica o ativador do plasminogêniotecidual, transformação das seqüências de ácidos nucléicos construídas embactérias competentes e subclonagem das mesmas em vetores de expres-são em mamíferos para a expressão da proteína desejada.

Ainda outro aspecto da invenção fornece vetores de DNA plas-mídicos vitais e circulares biologicamente funcionais que incorporam as se-qüências de DNA da invenção e organismos hospedeiros transformados deforma estável ou transfectados com os ditos vetores.

A invenção fornece correspondentemente métodos inovadorespara a produção de polipeptídeos úteis, compreendendo o desenvolvimentocultivado dessas células hospedeiras transformadas, particularmente célulasde mamíferos, sob condições que facilitam a expressão em larga escala dasseqüências de DNA exogenas veiculadas por vetores e o isolamento dospolipeptídeos desejados a partir do meio de crescimento, lisados celularesou frações de membranas celulares.

Descrição Detalhada das Figuras e Seqüências

A Figura 1 ilustra o alinhamento emparelhado de seqüências dasversões não-otimizadas e otimizadas com códons da seqüência de nucleotí-deos do DNA que codifica o ativador de plasminogênio tecidual;

A Figura 2 ilustra o alinhamento de seqüências do DNAc TE-NECT sintetizado de forma inusitada (TNK-tPA_sintético) com a seqüênciaestabelecida do gene TNK-tPA;

A Figura 3 ilustra o alinhamento de seqüências do DNAc TE-NECT-Opt sintetizado de forma inusitada (TNK-tPA-Opt_sintético) com aseqüência estabelecida do gene TNK-tPA-Opt;

A Figura 4 ilustra os fragmentos de TENECT, TEECT-Opt epcDNA3.1 DA/5-His digeridos por restrição e purificados em gel;

A Figura 5 ilustra a análise da digestão por restrição de clonesputativos de pcDNA3.1-TENECT DA/5-His/TNK-tPA e pcDN3.1-TENECT-OptA/5-His/TNK-tPA-Opt;

A Figura 6 ilustra a análise da digestão por restrição dos clonesPcDNA3.1-TENECT/V5-His/TNK-tPA e PcDNA3.1-TENECT-OptA/5-His/TNK-tPA-Opt, usando enzimas que clivam os DNAc's de TENECT e TE-NECT-Opt internamente;

A Figura 7 ilustra o Mapa de Construções: PcDNA3.1-TENECTA/5-His/TNA-tPA;

A Figura 8 ilustra o Mapa de Construções: PcDNA3.1 -TENECT-Opt/V5-His/TNK-tPA-Opt;

SEQ ID Ne: 1 é a seqüência de nucleotídeos que codifica o ati-vador de plasminogênio tecidual recombinante;

SEQ ID N9: 2 é a versão otimizada com códons da seqüência denucleotídeos que codifica o ativador de plasminogênio tecidual recombinante.

Descrição Detalhada da Invenção

Vários métodos foram descritos para a expressão de proteínasrecombinantes em sistemas eucarióticos superiores. Os sistemas de expres-são com células CHO-K1, HEK-293 (e variantes) se estabeleceram agoracomo os sistemas predominantes de escolha para a expressão de proteínasde mamíferos. Os aprimoramentos da construção de vetores, escolha demarcadores selecionáveis e os avanços no assesto de genes e nas estraté-gias de triagem com alta produção, tornaram relativamente comum o estabe-lecimento de linhagens de células recombinantes com altas produtividadesespecíficas e reduziram o tempo necessário para o desenvolvimento de li-nhagens de células. Os avanços recentes nas tecnologias de expressão,usando vetores de expressão tradicionais baseados em promotores virais,incluem o desenvolvimento e aprimoramento de estratégias de expressãobis-cistrônica usando seqüências de sítios de entrada com ribossomas inter-nos (IRES) ou junções alternativas.

Exemplo 1

As seqüências de DNA que codificam o ativador de plasminogê-nio tecidual foram sintetizadas por uma abordagem inovadora. Esta aborda-gem permite melhor otimização de códons com relação à linhagem de célu-las específica de mamíferos a ser usada. Além disso, o DNA sintético tor-nou-se o tema da expressão eucariótica/procariótica que disponibiliza quan-tidades isoláveis de polipeptídeos que apresentam propriedades biológicasdo t-PA de ocorrência natural, bem como atividades biológicas in vivo e invitro de t-PA.

A seqüência de nucleotídeos que codifica o ativador de plasmi-nogênio tecidual recombinante (TENECT 1) foi representada em SEQ ID NQ:

1. Os códons na seqüência de DNA codificadora do ativador de plasminogê-nio tecidual, que foram alterados como parte do processo de otimização decódons para assegurar a expressão ideal de proteínas recombinantes emlinhagens de células de mamíferos tais como CHO K1 e HEK 293, foramressaltados em letras maiúsculas. SEQ ID N9: 2 representa a seqüência denucleotídeos otimizada com códons, que codifica o ativador de plasminogê-nio tecidual (TENECT 2).

O alinhamento emparelhado de seqüências da seqüência denucleotídeos não-otimizada e otimizada com códons, que codificam o ativa-dor de plasminogênio tecidual, foi representado na Figura 1.Exemplo 2

Verificação da autenticidade do DNAc sintetizado inusitadamente que codifi-ca o ativador de plasminogênio tecidual

A verificação da autenticidade das moléculas do DNAc sintetiza-do inusitadamente, como supridas pelo fornecedor, foi feita por seqüencia-mento de DNA automatizado, e os resultados obtidos estão representadosnas Figuras 2 e 3.

Exemplo 3

Subclonaqem dos DNAc's de TENECT e TENECT-Opt no vetor de expres-são específico de células de mamíferos pcDNA3.1DA/5-His

Depois da verificação da autenticidade das moléculas do DNAcsintetizadas de forma inovadora (TENECT e TENECT-Opt) por seqüencia-mento de DNA automatizado, como indicado acima, TENECT e TENECT-Opt foram subclonados individualmente no vetor de expressão específico decélulas de mamíferos pcDNA3.1D/V5-His, para gerar as construções prontaspara transfecção. Os detalhes dos procedimentos são os seguintes:

A. Reagentes e Enzimas:

1. Kit de extração em gel QIAGEN e kit de purificação por PCR;

2._DNA do vetor pcDNA3.1 D/V5-His (Invitrogen)

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Todas as reações foram conduzidas como recomendado pelofabricante. Para cada reação, o tampão de reação 10x foi diluído até umaconcentração final de 1 x.

B. Digestão com restrição do vetor e do inserto

- Procedimento:

As seguintes amostras de DNA e enzimas de restrição foramusadas:<table>table see original document page 8</column></row><table>

- Reações de digestão com enzimas de restrição:

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A reação foi misturada, centrifugada e incubada por duas horasa 37°C. A digestão com restrição foi analisada por eletroforese em gel de aga-rose. Foi observado o padrão de digestão esperado com características deum corte de fragmento gênico de ~1.700 pares de base (para Rxn n— 3 e 4) eum fragmento da ceia principal do vetor com -5,5 kb para o vetor (Rxn n— 1 e2) foi observado. Os fragmentos de DNA com -1.700 pares de bases, repre-sentando os DNac's de TENECT e TENECT-Opt, foram purificados separa-damente pelo método de extração em gel, usando o kit de extração em gelQIAGEN. A cadeia principal do vetor de -5,5 kb digerido do vetor de expres-são em mamíferos, pcDNA3.1D/V5-His, também foi purificada usando mesmokit. Depois da digestão com restrição e extração em gel do do DMAc e dosfragmentos do DNA do vetor, uma alíquota (1-2 microlitros) de cada amostrade DNA purificada foi analisada usando eletroforese em gel de agarose paraverificar a pureza e a integridade, como ilustrado na Figura 4 abaixo:

C. Ligação da cadeia principal de pcDNA3.1D/V5-His com osDNAc's de TENECT e TENECT-OptA concentração do DNA do vetor digerido e purificado e dosfragmentos do inserto foi estimada (vide Figura 4 acima) e a ligação foi esta-belecida da seguinte maneira:

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As reações foram misturadas suavemente, centrifugadas e incu-badas à temperatura ambiente por 2-3 h. As células DH10 competentes fo-ram transformadas com o conteúdo das misturas da reação de ligação.

D. Análise da digestão com restrição de clones putativos de pcD-NA3.1-TENECT/V5-His/TNK-tPA e pcDNA3.1D-TENECT-Opt/V5-His/TNK-tPA-Opt

O DNA plasmídico foi purificado individualmente a partir das co-lônias obtidas emplacas de ágar L.B, contendo ampicilina, e a presença doinserto de DNAc desejado foi confirmada por análise da digestão com restri-ção do DNA plasmídico isolado, como ilustrado na Figura 5.

De acordo com os resultados obtidos depois da digestão comrestrição de vários clones putativos que contêm pcDNA3.1-TENECT/V5-His/TNK-tPA e pcDNA3.1-TENECT-Opt/V5-His/TNK-tPA-Opt, alguns dosclones que apresentavam o padrão de restrição desejado foram seleciona-dos para análise adicional da digestão pr restrição, usando enzimas de res-trição que clivam os DNAc's de TENECT e TENECT-Opt internamente paragerar fragmentos com tamanhos variáveis, como ilustrado na Figura 6.

A maioria dos clones de pcDNA3.1-TENECT/V5-His/TNK-tPA epcDNA3.1-TENECT-OptA/5-His/TNK-tPA-Opt selecionados para análise domapeamento de restrição produziu os tamanhos esperados dos fragmentos,baseado na ocorrência de sítios de restrição internos conhecidos, e assimsendo, estes clones serão verificados adicionalmente por análise de se-qüenciamento de DNA.

Os mapas das construções de expressão recombinante feitosusando os DNAc's de TENECT e TENECT-Opt sintetizados de forma inusi-tada estão representados de forma pictórica nas Figuras 7 e 8.

Exemplo 4

Manutenção e Propagação da Construção de t-PA Humano

A manutenção e propagação da construção do DNAc que codifi-ca t-PA humano serão feitas em culturas bacterianas usuais. Os estoquesem glicerina de todos os clones seriam mantidos e estocados a -70°C.

Exemplo 5

Expressão Transiente e Estável de Proteínas Recombinantes em CélulasCHO-K1

A expressão transiente e estável do t-PA humano foi feita usandocélulas do ovário do hamster chinês (CHO), uma linhagem de células de mamí-fero que tem aprovação da FDA para produzir proteínas terapêuticas. A ex-pressão transiente é útil para verificar a expressão de uma construção e paraobter rapidamente pequenas quantidades de uma proteína recombinante.

A expressão das proteínas seria analisada adicionalmente usan-do ferramentas analíticas, tais como Western blot, e ensaios funcionais.

Exemplo 6

Purificação do Ativador de Plasminoqênio Tecidual Recombinante

Depois do estabelecimento de uma linhagem de células isentasde contaminantes, conforme as orientações das agências reguladoras, quesuperexpressam a proteína recombinante desejada, as estratégias de purifi-cação almejarão a economia do processo, rapidez para lançar no mercado,capacidade de alta produção, reprodutibilidade, e pureza máxima do produtocom estabilidade funcional e integridade estrutural, como os objetivos maisimportantes. Para esta finalidade, deveria ser explorada uma abordagemcombinatória com filtração (filtração com fluxo normal e tangencial) e croma-tografia. Os requisitos para qualificação do processo e os estudos dos crité-rios de aceitação serão conduzidos em 3 lotes.Conseqüentemente, a presente invenção considera as seguintesetapas no processo de purificação e/ou métodos usuais conhecidos por sipróprios:

a. Clarificação e concentração inicial do caldo de cultura bruto, u-sando procedimentos de filtração com fluxo normal e tangencial;

b. Ultrafiltração/Filtração por Diálise (baseadas em filtração sobfluxo tangencial);

c. Etapa Cromatográfica I: cromatografia por afinidade usando he-parina, lisina, quelato metálico (zinco) em Sepharose, e Mabs imobilizadosobre Sepharose. Mais preferivelmente, será usada lisina em Sepharose nasoperações unitárias a jusante;

e. Etapa Cromatográfica II: cromatografia de troca aniônica, usan-do DEAE-celulose;

f. Remoção dos vírus e filtração estéril;

g. Remoção de endotoxinas.

Nota: Adicionalmente, será usado um fluxo para atravessar baseado em tro-cadores de ânions tais como sulfato de celufina, para a ligação seletiva decontaminantes do processo, virus endógenos/adventícios e frações extraí-veis da coluna.

Exemplo 7

Estabelecimento da Identidade da Proteína-alvo Usando Métodos Bioquími-cos, Imunológicos e Físico-químicos

A recuperação percentual da proteína total em cada estágio seráquantificada usando o procedimento com ácido bicinonínico (BCA) e o méto-do de ligação com corante de Bradford. A concentração da proteína-alvoserá determinada rotineiramente em cada estágio da purificação, usandoensaios baseados em enzimas altamente específicos e confiáveis, tal comocaptura por ELISA, usando anticorpos policlonais/monoclonais padronizadospara t-PA com seqüência nativa. A análise Western qualitativa e específicapara o alvo será seguida em cada estágio. Serão empregadas cromatografiaem fase reversa, focalização isoelétrica e eletroforese bidimensional em gelpara avaliar o produto purificado. A análise estrutural secundária seria exa-minada usando dicroísmo circular de UV extremo. A massa molecular e oestado oligomerico serão investigados usando exclusão por tamanho eMALDI-TOF. As investigações focarão também sobre a estabilidade da pro-teína em relação ao pH e temperatura.<110> ftvestha Gengraine Technologies .í?*t Ltd.Môíawala Pátell, Villoo

<120> Método para produzir uma forma obtida por bioengenharia

do ativador de plasminogênio tecidual<130> 1

<150> 673/CHE/2005<151> 2005-06-02

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ate ate tet tgg-ggc ctg ggc tgc ggc cag aag gat gtg cca ggc1632

gtc tac acc aag gtg acg aac tac ctg gac tgg att cgc gac aac atg1680

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545 550 555 560

agg cec tga

1683Arg Pro

Claims

1. Processo para a preparação de um Ativador de Plasminogê-nio Tecidual biologicamente ativo in vivo, compreendendo as etapas de:(a) desenvolver, sob condições nutrientes apropriadas, célulashospedeiras transformadas ou transfectadas com uma seqüência de DNAisolada selecionada no grupo que consiste em (i) as seqüências de DNA e-nunciadas em SEQ ID N9: 1 e SEQ ID N9: 2, ou (ii) seqüências de DNA quehibridizam sob condições severas para as seqüências de DNA definidas em(i) e (ii) ou seus filamentos complementares; e(b) isolar o dito produto do Ativador de Plasminogênio Tecidualrecombinante a partir delas.

2. Processo para a preparação de um produto do Ativador dePlasminogênio Tecidual biologicamente ativo in vivo, compreendendo asetapas de transformar uma célula hospedeira com uma seqüência de DNAsintetizada representada em SEQ ID NQ: 1 ou 2, codificar o Ativador de Plas-minogênio Tecidual e isolar o dito produto da dita célula hospedeira ou domeio do seu crescimento.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, onde as di-tas células hospedeiras são células de mamífero.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, onde as di-tas células hospedeiras são, de preferência, células CHO Kl.

5. Processo para a produção de uma forma solúvel de Ativadorde Plasminogênio Tecidual, que tem a propriedade biológica in vivo de tratarinfarto de miocárdio e acidente vascular cerebral, compreendendo as etapasde:(a) desenvolver, sob condições nutrientes apropriadas, célulasde mamífero que compreendem DNA promotor que não o DNA promotor deativador de plasminogênio tecidual, ligado operacionalmente ao DNA quecodifica a seqüência de aminoácidos de eritropoietina madura de SEQ ID N9:-3; e(b) isolar o dito polipeptídeo eritropoietina glicosilado expressadopelas ditas células.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 5, onde o dito DNApromotor é um DNA promotor viral.

7. Processo para a preparação de um produto de Ativador dePlasminogênio Tecidual biologicamente ativo in vivo, compreendendo asetapas de transformar ma célula hospedeira com uma construção de vetorda Figura 7 ou 8 e isolar o dito produto de Ativador de Plasminogênio Teci-dual da dita célula hospedeira ou do meio de seu crescimento.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 7, onde o dito vetoré um vetor de expressão específico de células de mamífero e mais preferi-velmente o vetor representado nas Figuras 7 e 8.

9. Composição farmacêutica que compreende uma quantidadeterapeuticamente eficaz de Ativador de Plasminogênio Tecidual e um diluen-te, adjuvante ou carreador farmaceuticamente aceitável, onde o dito Ativadorde Plasminogênio Tecidual é purificado a partir de células de mamífero de-senvolvidas em cultura.