BRPI0611316A2

BRPI0611316A2 - processo para a preparacão e isolamento de fosfatìdeos, suas composicões farmacêuticas e respectivos usos

Info

Publication number: BRPI0611316A2
Application number: BRPI0611316-8A
Authority: BR
Inventors: Anna Maria Zanellato; Mara Pittarello; Antonio Gambillara; Susanna Vaccaro
Original assignee: Fidia Farmaceutici
Priority date: 2005-05-30
Filing date: 2006-05-26
Publication date: 2010-08-31
Also published as: PL2431020T3; AU2006254376B2; ITPD20050164A1; JP5113042B2; WO2006128639A2; ES2382748T3; WO2006128639A3; NO20076158L; CA2610575A1; HK1119584A1; ATE546145T1; CN101184494A; PL1890706T3; EP1890706A2; EP2431020A1; EP2431020B1; JP2008545420A; EP1890706B1; IL187749A; AU2006254376A1

Abstract

PROCESSO PARA A PREPARAcãO E ISOLAMENTO DE FOSFATìDEOS, SUAS COMPOSIcõES FARMACêUTICAS E RESPECTIVOS USOS. A presente invencao refere-se ao processo para a preparacao de fosfatidilserina de formula CH2OR1 CHOR2 CH2O-P(=O)-OCH2-CH(NH2)- COOH X em que R1 e R2 independentemente uma acila C10-C30 saturada, monoinsaturada ou poliinsaturada, X = OH ou OM onde M = metal alcalino ou alcalino terroso, amonio, alquliamonio (incluindo o sal interno) incluindo a reacao de transfosfatidilacao entre fosfatidilcolina da formula geral CH2OR1 CHOR2 CH2O-P(=O)-0R3 X em que R1 e R2 e X possuem os significados especificados acima, R3 = CH2-CH2- NH2 ou CH2-CH2-N+(CH3)3 e Serina na forma D, L ou rac²mica catalisada pela enzima fosfolipase D (PLD), caracte- rizado pelo fato de que dita reacao é realizada em um meio hidroalcoolico contendo um álcool alifático e na presenca de oxido de metal bivalente.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSOPARA A PREPARAÇÃO E ISOLAMENTO DE FOSFATÍDEOS, SUASCOMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E RESPECTIVOS USOS".

Objeto da Invenção

A presente invenção refere-se aos processos para a produção epurificação de fosfatidilserina (PS), para obter o produto final com rendimen-to elevado por meio de óxidos de metal bivalentes (BMO).

Campo da Invenção

O declínio funcional do Sistema Nervoso Central (CNS) que o-corre durante o processo fisiológico do envelhecimento cerebral freqüente-mente causa deterioração das funções cognitivas no idoso que pode por suavez causar distúrbios e alterações de comportamento da memória temporale espacial.

Este declínio funcional na atividade do CNS é ligado com o co-15 meço das alterações tanto bioquímicas quanto estruturais na composição delipídeo das membranas neuronais e atividade reduzida das enzimas cere-brais que podem reduzir as sinapses neuronais.

A fosfatidilserina (PS) é o principal fosfolipídeo acídico no cére-bro. A pesquisa científica tem portanto sido focalizada durante algum tempona descoberta de um tratamento farmacolôgico para os distúrbios cognitivosrelacionados com a idade, com base nos fosfolipídeos que podem prevenir(e/ou parcialmente reconstruir) o déficit estrutural e funcional das que enve-lhecem as membranas neuronais.

Estudos pré-clínicos e clínicos em seres humanos demonstra-ram que a administração de PS oralmente pode, especialmente no idoso,determinar um aumento significativo na capacidade de aprendizado e namemória temporal e espacial, mesmo no caso de patologias particularmenteincapacitantes tais como a doenças de Alzheimer (Cenacchi T. et al.; AgingClin Exp Res; 1993; 5:123-133; Nunzi MG et al.; Adv Exp Med Biol; 1992;318:393-8).

Além do mais, foi demonstrado que a fosfatidilserina é capaz decombater o aumento no hormônio cortisol em indivíduos que sofrem de es-tresse físico (Monteleone P. et al.; Neuroendocrinology; 1990; 52(3):243-8),desse modo reduzindo o catabolismo da glicose, com maior recuperaçãofuncional após esforço físico intenso.

A presente invenção se refere a um processo para a síntese epurificação de PS e ao uso de PS como o princípio ativo nos fármacos (e/ousuplementos alimentícios) para a prevenção das patologias relacionadascom a idade supracitadas, e na preparação de suplementos alimentíciosindicados para todos os casos de estresse físico intenso e, além disso, naprodução de Iipossomas para uso no campo de cosméticos e/ou como umsistema de liberação controlada para os fármacos que eles contêm.

Os processos para a produção e purificação de PS anteriormen-te conhecidos da literatura científica e patentes descrevem a conversão en-zimática de fosfatidilcolina (PC) em PS por uma reação de transfosfatidila-ção catalisada pela enzima fosfolipase D (PLD)1 com purificação subseqüen-te efetuada principalmente pela extração da PS com solventes orgânicos.

Nos últimos anos, vários processos foram aperfeiçoados para asintetização de PS mediante a conversão enzimática em sistemas de duasfases de solvente água/orgânico ou em um meio aquoso.

A EP 0776976 descreve um processo para a preparação enzi-mática de PS em um sistema consistindo em água/tolueno em que a faseorgânica contém o fosfolipídeo de partida do qual a PS é formada, a faseaquosa contém o aceitante de hidróxi e a reação de síntese ocorre na inter-face água/solvente na presença de fosfolipase D bruta a partir dos caldos defermentação de cepas de microorganismos que produzem PLD.

Pela primeira vez, em 1990, os pesquisadores tentaram evitar osistema de duas fases por que ele requeria grandes quantidades de solven-te que era depois difícil para se eliminar, conseqüentemente com custos e-Ievados para a produção e purificação da PS (Comfurius P. et al., Journal ofLipid Research 1990, 31:1719-1721).

O solvente orgânico foi portanto substituído por um detergen-te/tensoativo capaz de dispersar o fosfolipídeo de partida na forma de mice-la a fim de efetuar a reação enzimática da síntese exclusivamente em ummeio aquoso.De fato, a EP 1048738 se refere a um processo para a sínteseenzimática da PS em um meio aquoso absolutamente livre de qualquer con-taminação por solventes orgânicos, na presença de dadas concentrações dedetergentes específicos e sais de cálcio.

A DE 19917249 descreve um método para a produção enzimáti-ca de PS em um meio aquoso sem usar tensoativos, exclusivamente com aadição de sal de cloreto de cálcio (CaCk)1 no entanto, a porcentagem daconversão enzimática e o grau de pureza da PS obtida não são específicas.

A EP 1310563 descreve um processo para a preparação de PSem uma fase aquosa sem usar detergentes e/ou sais de cálcio, com base nahomogeneização da mistura de partida consistindo em fosfolipídeo, aceitan-te de hidróxi e PLD em água, para fornecer um homogeneizado final comuma estrutura similar àquela de uma membrana de fosfolipídeo bilamelar emque a reação de transfosfatidilação pode subseqüentemente ocorrer.

A EP 1427839 descreve a síntese enzimática de fosfolipídeos,incluindo a PS, em água, sem detergentes, mas na presença de íons de me-tal que são liberados dos sais correspondentes quando eles forem prepara-dos/dissolvidos em água. Dito processo ocorre em duas fases distintas emque, partindo das misturas de fosfolipídeos, uma primeira reação de hidróli-se enzimática é catalisada por PLD para produzir ácido fosfatídico, seguidopor uma segunda reação de transfosfatidilação em que a PS é formada napresença de um excesso de serina.

Por último, a EP 12312134 reivindica um processo para a sínte-se enzimática de PS usando, em água, uma fração da enzima PLD produzi-da e purificada a partir da cepa de Streptoverticillium hachijoense para umaprodução mais abundante na produção final de PS.

Com referência à purificação de PS (obtida por transfosfatidila-ção em um meio aquoso/solvente orgânico ou em um meio aquoso), a EP1213294 reivindica um processo de purificação com base no uso de umamistura consistindo em água/solvente orgânico polar (tal como isopropanol)para extrair o fosfolipídeo acima mencionado da solução que o contém, queé por sua vez representada por um solvente de hidrocarboneto (tal comotolueno), enquanto a EP 0922707 se refere a um processo para a extra-ção/purificação de PS a partir de uma mistura de fosfolipídeos usando umsistema difásico de solventes orgânicos tais como heptano e metanol.

A presente invenção refere-se aos processos para a produção epurificação de fosfatidilserina (PS) que proporciona o produto final em umrendimento muito elevado graças a uma conversão eficiente de PC em PSpela ação específica de Óxidos de Metal Bivalentes (BMO).

Além do mais, o processo de transfosfatidilação catalisada pelaenzima PLD, permite uma porcentagem elevado de PC ser convertida emPS independente do meio em que a reação enzimática ocorre.

Portanto, a presente invenção se refere a um processo para aprodução de PS catalisada por PLD e BMO, cujo processo é caracterizadopelo fato de que é realizado

em um meio hidroalcoólico consistindo em água/álcoois alifáticos, ouem um meio aprótico consistindo em água/solventes apróticos polares, ouem um sistema de duas fases consistindo em água/solventes orgânicos.Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção se refere a um processo para a preparaçãode PS (fórmula I), em que uma transfosfatidilação é realizada pela enzimaPLD, na presença de BMO, desse modo conseguindo a transferência de umcomponente de fosfatidila da fosfatidilcolina (PC) (fórmula II) para serina(que neste caso representa o aceitante de hidróxi); esta reação enzimáticafornece a conversão de PC em PS em um grau muito elevado, independen-te do meio em que a reação enzimática ocorre. Dita reação pode portantoocorrer:

• em um meio hidroalcoólico consistindo em água/álcoois alifáticos quenão formam um sistema de duas fases, ou

• em um meio aprótico consistindo em água/solventes apróticos polaresque não formam um sistema de duas fases, ou

em um sistema de duas fases consistindo em água/solventes orgânicos.Fórmula I

<formula>formula see original document page 6</formula>

em que R1 e R2 independentemente representam uma acila C10-C30 satura-da, monoinsaturada e/ou poliinsaturada, X = OH ou OM onde M = metal al-calino ou alcalino terroso, amônio, alquilamônio (incluindo o sal interno).

Fórmula Il

<formula>formula see original document page 6</formula>

em que R1 e R2 e X significam como definido acima e R3 = CH2-CH2-NH2 ouCH2-CH2-N+(CH3)3-

Foi surpreendentemente observado que o BMO drasticamentemodifica o substrato de reação representado pela fosfatidilcolina de partidaque determina uma mudança tal que a ação da enzima PLD significativa-mente aumenta em termos de rendimento final em PS, assim permitindouma produção de PS em uma escala industrial. Esta mudança substancialocorre na estrutura do próprio substrato, independente do meio em que areação enzimática ocorre. De fato, o BMO favorece a fissuração das vesícu-las de PC e, desse modo, a penetração da enzima nele, determinando umaumento na porcentagem de conversão de PC em PS visto que, mediante apenetração dentro das vesículas, a enzima PLD pode também atuar sobre acamada de lipídeo dentro da vesícula, que não pode anteriormente ser pe-netrado por soluções hidrófilas tais como aquelas que contêm a enzima em si.

De acordo com a invenção, vários óxidos de metal bivalentesforam testados, tais como óxido de cálcio (CaO), óxido de magnésio (MgO)e óxido de zinco (ZnO)1 em meio tanto hidroalcoólico quanto aprótico, assimcomo em sistemas de duas fases em que eles deram excelentes resultados,como mostrado nos Exemplos que seguem, comparados com os resultadosobtidos por meio dos mesmos processos, mas na presença de cloreto decálcio (CaCI2).

De fato, é sabido que os sais de cálcio, e em particular CaCI2,como fontes de íons de cálcio adicionados ao meio em que a reação detransfosfatidilação ocorre (Comfurius P. et al., Journal Acta, Research 1990,31:1719-1721; Comfurius P. et al., Biochim Biophys Acta, 1977, 488:36-42),promovem a atividade catalítica da enzima PLD e desse modo aumentam aconversão de fosfatidilcolina em PS (Okawa Y. et al.; J. Biochem.;1975;78:363-372).

De modo a diferençar e clarificar que os BMOs são completa-mente diferentes dos sais de metal e para demonstrar a sua eficácia nosnovos sistemas de produção que são o objeto da presente invenção, a Re-querente executou experiências que comparam os diferentes rendimentosda conversão de PC em PS na presença de sais de cálcio e na presença deBMO.

Como pode ser visto dos resultados obtidos, o rendimento daconversão de fosfatidilcolina em PS consistentemente comprovou ser nãoapenas muito diferente, mas também decidida e significativamente mais ele-vado do que aquele obtido com CaCI2.

Além dos óxidos descritos acima, vários BMO diferentes podemser utilizados no novo processo para a produção de PS, tais como oxido demanganês, oxido de ferro bivalente, óxido de cobalto, oxido de cobre e to-dos os óxidos de metal bivalentes remanescentes na Tabela dos Elementos.

Exemplo de solventes em que o processo da presente invençãopode ser realizado são álcoois alifáticos, tais como metila, etila, n-propila,isopropanóis; solventes apróticos, tais como dimetilsulfóxido (DMSO), dime-tilformamida, acetonitrila, N-metil-pirrolidona; e solventes orgânicos, tais co-mo n-hexano, tolueno, n-butanol, benzeno.

O álcool preferido é isopropanol, o solvente aprótico preferido éDMSO e o solvente orgânico preferido é hexano.O Exemplo 1 descreve a conversão de PC em PS partindo demeio hidroalcoólico de partida contendo as porcentagens dadas de isopro-panol adicionado a uma solução de partida consistindo em tampão de ace-tato em que o CaO (ou MgO ou ZnO) foi dissolvido, comparado com o pro-cesso de produção de PS executado no mesmo meio hidroalcoólico, mas napresença de sal de CaCI2.

A porcentagem de álcool (isopropanol em particular) que podeser usado no presente processo (expresso como % em volume sobre o vo-lume do tampão de partida) pode variar de 0,1 a 50 %, preferivelmente de1,25 a 20 %, e mais preferivelmente 10 %, em um meio hidroalcoólico con-tendo uma concentração de BMO (em particular, CaO) variando entre 0,1 e1 M, preferivelmente entre 0,3 e 0,6 M, e mais preferivelmente igual a 0,54 M.

O rendimento máximo da conversão de PC em PS é de 90 %,que é removido do rendimento obtido pelo mesmo processo de produção,mas na presença de CaCI2.

O Exemplo 2, por outro lado, demonstra que é possível obterrendimentos ainda mais elevados do que 80 % da conversão de PC/PS,mediante a adição das quantidades dadas de DMSO (expressas como %em volume sobre o volume de tampão usado) na solução de tampão de par-tida contendo as concentrações molares dadas de CaO (ou MgO ou ZnO), eque os rendimentos supracitados de PS são muito diferentes daqueles obti-dos pelo mesmo processo de produção, mas na presença de CaCI2.

A porcentagem de solvente aprótico (e DMSO em particular) ase usada pode variar de 0,1 a 50 %, preferivelmente de 1,25 a 10 %, e maispreferivelmente ser de 1,25 %, em um meio aprótico contendo uma concen-tração de BMO (CaO em particular) variando entre 0,1 e 1 M, preferivelmen-te entre 0,3 e 0,6 M, e ainda mais preferivelmente, pode ser igual a 0,33 M.

A reação enzimática da transfosfatidilação fornece um rendi-mento muito elevado de conversão de PC/PS, mesmo em um sistema deduas fases consistindo em água/solvente orgânico.

O Exemplo 3 descreve a produção de PS em um sistema deduas fases consistindo em água/hexano, novamente na presença de CaO,MgO e ZnO. A quantidade de solvente usada nos novos processos que sãoo objeto da presente invenção é muito baixa (como demonstrado mais adi-ante), tão baixa que os custos de produção são limitados e não é difícil eli-minar o solvente do produto final.

A concentração de solvente a ser usada em dito processo podevariar de 0,1 a 40 % v/v (expressa como % em volume sobre o volume dotampão de partida), preferivelmente de 1 a 5 % v/v, e mais preferivelmente1,25 % v/v e 2,5 % v/v, na presença de BMO (e CaO em particular) em umaconcentração variando entre 0,1 e 1 M, preferivelmente entre 0,3 e 0,6 M emais preferivelmente igual a 0,54 M.

Neste caso também o rendimento máximo da conversão de PCem PS era mais de 80 %, muito diferente daquele obtido pelo mesmo pro-cesso, mas na presença de CaCl2.

A reação de transfosfatidilação pode ser conduzida em diferen-tes temperaturas, variando entre 20 e 70 0C, preferivelmente em 45 ou 55°C.

O substrato de fosfatídeo de partida é representado pela fosfati-dilcolina de origem animal e/ou vegetal, natural ou sintética, presente naforma purificada ou como a matéria prima, em concentrações de partida va-riando entre 10 e 500 mg/ml, preferivelmente entre 200 e 300 mg/ml.

O meio aquoso de partida a ser misturado/associado com o ál-cool, o solvente aprótico ou o solvente orgânico para obter um meio finalhidroalcoólico, aprótico ou de duas fases, é representado por água ou umasolução de salina não tamponada ou uma solução tamponada formada, porexemplo, por acetato triidrato de sódio e ácido acético em concentraçõesentre 0,02 e 0,2M.

O aceitante de hidroxila é representado por serina, que podeestar presente na forma D, L ou racêmica. A concentração ideal de serina,preferivelmente na forma L, pode variar enter 1 g/g (gg) de fosfatídeo departida, até 5 gg, preferivelmente entre 2 e 3 gg/gg de fosfatídeo.

O pH ideal da solução tampão pode variar entre 4 e 9 porquedepende da origem da PLD usada, preferivelmente entre 5 e 6, e mais pre-ferivelmente igual a 5,6 se uma PLD de origem fermentativa derivada domicroorganismo Streptoverticillium hachijoense for usada.

Dita enzima pode ser usada na forma purificada ou parcialmentepurificada, ou em uma forma não purificada após a filtração do microorga-nosmo de seu caldo de cultura.

O Exemplo 4 (e Figura 1) descreve um novo sistema para a puri-ficação parcial de PLD para obter uma enzima que não é substancialmentecontaminada por proteínas de uma natureza diferente que possa interferircom a atividade cataiítica de PLD, um processo que não envolve igualmentemuitas etapas, visto que os processos prolongados resultam em custos in-dustriais excessivos e uma conseqüente falta de praticabilidade em umaescala industrial.

A enzima parcialmente purificada descrita no Exemplo 4 foi tes-tada no processo de produção descrito no Exemplo 3, em comparação comuma enzima presente na forma não purificada (após a eliminação simplesdo microorganismo produtor) e com as preparações enzimáticas altamentepurificadas (obtidas usando resinas cromatográficas de troca de íon e anti-corpos mono/policlonais direcionados sobre a enzima PLD, mas que podemtambém ser purificadas usando todos os métodos de purificação conhecidospor uma pessoa versada na técnica): a porcentagem de conversão dePC/PS foi igual para todas as preparações enzimáticas testadas (purifica-das, parcialmente purificadas e não purificadas).

A quantidade ideal de PLD para garantir mais de 80 % de con-versão de PC em PS varia entre 1 e 100 unidades/g de fosfatídeo de parti-da, porque depende da origem da PLD usada. Por exemplo, quando a PLDde Streptoverticillium hachijoense for usada, a concentração ideal varia entre1 e 10 unidades/g de fosfatídeo.

Um outro objetivo da presente invenção é um processo para aseparação e purificação de PS de serina, PC e PLD (que representam impu-rezas) remanescentes no meio em que a reação de transfosfatidilação ocorre.

De modo a separar e purificar a PS, os seguintes métodos fo-ram desenvolvidos.1. no final da reação de transfosfatidilação enzimática, a PS éseparada pela adição de uma solução de cloreto de sódio, em uma concen-tração entre 2 e 6 % (preferivelmente 5 %), ao meio de reação em que ofosfolipídeo recentemente produzido está presente: duas fases assim serãoobtidas porque a PS permanece insolúvel nesta solução enquanto os com-ponentes do resíduo (que são mais solúveis) principalmente permanecemno subnadante. A PS1 que foi depositada na parte superior do meio de rea-ção, é depois isolado pela separação e eliminação do subnadante.

Alternativamente, é possível começar um novo processo de se-paração e purificação de PS, objetivo da presente invenção, mediante a fil-tração do recipiente de PS no meio de reação para eliminar imediatamentetodos os seus componentes residuais. Uma solução de NaCI é depois adi-cionada. Duas fases se formam e o sobrenadante é eliminado porque a PSé encontrada no subnadante. As lavagens de NaCI podem ser repetidas du-as vezes ou mais, ajustando a concentração de sal se necessário. Estesprocedimentos de lavagem permitem a eliminação completa dos álcoois,solventes apróticos e orgânicos usados nos processos para produzir PSdescritos acima, como demonstrado no Exemplo 5. Subseqüentemente, a-pós o tratamento dos íons presentes no meio de reação com um agente dequelação, o produto é precipitado/lavado com uma solução de etanol (emuma porcentagem entre 50 e 100 %, preferivelmente 95 %), ou com umamistura de solventes de cetona (tais como acetona) em água (em uma por-centagem entre 50 e 95 %); a lavagem com etanol pode ser repetida váriasvezes (ajustando a porcentagem de etanol presente, se necessário). Porfim, uma lavagem final é executada com etanol entre 90 e 100 %, após oque o produto acabado pode ou não pode ser secado;

2. a separação e a purificação de PS são realizadas por ultrafil-tração, no final da reação enzimática de transfosfatidilação, usando umamembrana porosa de tamanho de poro tal como para permitir a passagemde pequenas moléculas enquanto ficam pressas aquelas grandes. Por estarazão, é preferível utilizar filtros com poros pequenos o bastante para aprisi-onar as moléculas com peso molecular de 100.000/300.000 Dáltons oumais.

Ditos procedimentos para o isolamento e purificação de PSpermitem a eliminação dos resíduos das substâncias que são deixados apósa reação enzimática e estavam inicialmente contidos no meio de transfosfa-tidilação tal como serina, PC, sais minerais, colina que é liberada de PC, PA,sais/óxidos, e, acima de tudo, permitem a purificação completa da PS daenzima PLD, nenhum traço da qual, como demonstrado no Exemplo 5, per-manece. A PS final assim obtida possui um grau muito elevado de pureza.

Alguns antioxidantes tais como ácido ascórbico e/ou vitamina Epodem ser incluídos no processo de preparação e purificação de PS.

A invenção é apresentada com maiores detalhes nos exemplosque seguem.

Exemplo 1

Preparação de PS a partir de PC vegetal em um meio hidroalcoólico (pela pre-sença de isopropanol) com CaO, MgO e ZnO 0,54 M ou com CaCIp 0,54 M

Duas soluções hidroalcoólicas diferentes foram preparadas,formadas por duas concentrações de isopropanol (igual a 1,25 e 10 % dovolume do tampão de partida) em tampão de acetato contendo CaO (ouMgO ou ZnO) 0,54 M, comparado com a preparação de PS pelo mesmoprocedimento, mas na presença de sal de CaCI2, 0,54 M.

Os óxidos testados e cloreto de cálcio são dissolvidos em 40 mlde tampão de acetato 0,2 M (pH 5,6) ao qual é depois adicionado 0,5 ml deisopropanol de modo a obter 1,25 % v/v (apenas com relação a CaO), ou 4ml de isopropanol de modo a obter 10 % v/v (os álcoois pode também seradicionados ao tampão contendo BMO após a solubilização da Serina).

As soluções resultantes são agitadas em um reator revestidocom condensador durante cerca de 10 minutos, depois 20 g de L-serina sãoadicionados em uma temperatura de 55 0C1 agitando até a dissolução com-pleta. Subseqüentemente, 10 g de fosfatidilcolina de soja são adicionados eagitados durante 10 minutos. 5,5 U de enzima PLD por gg de PC são depoisadicionados e a mistura é agitada durante 24 a 48 horas a 55 0C.

Finalmente, uma amostra de cada produto é tirada e a transfor-mação bem-sucedida de PC em PS é testada pela Cromatografia de Cama-da Fina (TLC).

Rendimento da conversão de PC em PS:

distribuição dos produtos presentes no final da reação, expressacomo % de PA (ácido fosfatídico liberado pela PC como um resultado daação de PLD) e PS obtida seguinte ao processo de transfosfatidilação. PA ePC devem ser consideradas resíduos da reação.

Rendimento da conversão de PC em PS obtida com isopropa-nol, 1,25 % v/v, na presença de CaO:

PA 8,0%PS 85,5 %PC 6,5 %

Rendimento da conversão de PC em PS obtida com isopropa-nol, 10 % v/v, na presença de CaO:

PE-OH 4,0%PA 3,5 %PS 89,5 %PC 3,0 %

Rendimento da conversão de PC em PS obtida com isopropa-nol, 10 % v/v, na presença de CaCI2:

PE-OH 15,8 %PA 10,7 %PS 70,1 %PC 3,4 %

Rendimento da conversão de PC em PS obtida com isopropa-nol, 10 % v/v, na presença de MgO:

PE-OH 9,0 %PA 4,5 %PS 84,0 %PC 2,5 %

Rendimento da conversão de PC em PS obtida com isopropa-nol, 10 % v/v, na presença de ZnO:PE-OH 10,0%

PA 8,0 %

PS 80,0 %

PC 2,0 %

(o produto definido como PE-OH se forma durante a reação detransfosfatidilação porque a reação ocorre na presença de álcool).

Exemplo 2

Preparação de PS a partir de PC vegetal em um meio aprótico (pela presen-ça de DMSO) com CaO, MqO e ZnO 0.33 M ou com CaCIp 0,33 M

DMSO foi usado em concentrações diferentes variando entreuma porcentagem de 1,25 e 10 % em termos do volume de tampão de par-tida, em todos os casos na presença de CaO (ou MgO ou ZnO) 0,33 M emcomparação com a preparação de PS pelo mesmo processo, mas na pre-sença de sal de CaCI2.

Os óxidos de cálcio testados e o cloreto de cálcio são dissolvi-dos em 40 ml de tampão de acetato 0,2 M, em pH 5,6. As soluções assimobtidas são agitadas em um reator revestido com condensador. Após cercade 10 minutos de agitação, 20 g de L-serina são adicionados em uma tem-peratura de 45 0C e depois a agitação continuou até que a solubilizaçãocompleta fosse alcançada.

Subseqüentemente, 10 g de PC de soja e 0,5 ml de DMSO (cor-respondendo a 1,25 % v/v) ou 4 ml de DMSO (correspondendo a 10 % v/v)são adicionados e a mistura é agitada (o DMSO pode ser adicionado duran-te a fase partida do processo, após a solubilização do BMO, como no E-xemplo anterior). Dez minutos mais tarde, 5,5 U de enzima PLD por gg dePC são adicionados, e a mistura é agitada durante 24 a 48 horas a 45 °C.

Subseqüentemente, as amostras dos respectivos produtos obti-dos são tiradas no final da reação e testadas com relação a transformaçãobem-sucedida de PC em PS.

Rendimento da conversão de PC em PS:

Rendimento da conversão de PC em PS obtida com DMSO 1,25% v/v na presença de CaO:PA 7,1 %

PS 86,3 %

PC 6,6 %

Rendimento da conversão de PC em PS obtida com DMSO 1,25% v/v na presença de CaCI2:

PA 8,1 %

PS 66,7 %

PC 25,2 %

Rendimento da conversão de PC em PS obtida com DMSO 10% v/v na presença de CaCfe:

PA 6 %

PS 69 %

PC 25 %

Rendimento da conversão de PC em PS obtida com DMSO 10% v/v na presença de CaO:

PA 7,5 %

PS 72,5 %

PC 20 %

Rendimento da conversão de PC em PS obtida com DMSO 10% v/v na presença de MgO:

PA 9,0 %

PS 71,0 %

PC 20 %

Rendimento da conversão de PC em PS obtida com DMSO 10% v/v na presença de ZnO:

PA 8,5 %

PS 71,5 %

PC 20 %

Exemplo 3 a

Preparação de PS a partir de PC vegetal em um sistema de duas fases (pe-la presença do solvente orgânico, hexano) com CaO, MgO e ZnO 0,54 M oucom CaCIp 0.54 MUm sistema de duas fases consistindo em tampão de acetatocontendo CaO (ou MgO ou ZnO) 0,54 M foi preparado, e depois uma quan-tidade de hexano igual a 1,25 % do volume de partida do tampão foi adicio-nada, comparado com a preparação de PS pelo mesmo processo de produ-ção, mas na presença de CaCI2, 0,54 M.

Os óxidos testados e cloreto de cálcio são depois dissolvidos em40 ml de tampão de acetato 0,2 M (pH 5,6) a qual uma quantidade de hexa-no igual a 0,5 ml é depois adicionada ao tampão contendo o BMO antes ouapós a solubilização da serina).

As soluções assim obtidas são agitadas em um reator revestidocom condensador.

O procedimento depois continua como descrito no Exemplo 1.

Finalmente, uma amostra de cada produto obtido é tirada e tes-tada com relação a transformação bem sucedida de PC em PS.

Rendimento da conversão de PC em PS:

Rendimento da conversão de PC em PS obtida com hexano1,25 % v/v na presença de CaO:

PA 7,5 %PS 87,0 %PC 5,5 %

Rendimento da conversão de PC em PS obtida com hexano1,25 % v/v na presença de CaCI2:

PA 8,1 %PS 68,4 %PC 23,5 %

Rendimento da conversão de PC em PS obtida com hexano1,25 % v/v na presença de MgO:

PA 8,5 %PS 82,5 %PC 9,0 %

Rendimento da conversão de PC em PS obtida com hexano1,25 % v/v na presença de ZnO:PA 11,0 %PS 80,0 %PC 9,0 %

Exemplo 3 b

Preparação de PS a partir de PC vegetal em um sistema de duas fases (pe-la presença do solvente orgânico, hexano) com CaO 0,54 M ou com CaCI20,54 M

Um sistema de duas fases consistindo em tampão de acetatocontendo CaO 0,54 M foi preparado e depois uma quantidade de hexanoigual a 2,5 % do volume de partida do tampão foi adicionada, comparadocom a preparação de PS pelo mesmo processo de produção, mas na pre-sença de CaCI2, 0,54 Μ. A partir deste ponto, o procedimento é o mesmocomo no Exemplo 3 a.

Rendimento da conversão de PC em PS:

Rendimento da conversão de PC em PS obtida com hexano 2,5% v/v na presença de CaO:

PA 7,5 %PS 86,0 %PC 6,5 %

Rendimento da conversão de PC em PS obtida com hexano 2,5% v/v na presença de CaCI2:

PA 10,0 %PS 65,0 %PC 25,0 %

Exemplo 4

Purificação parcial da enzima PLD

A enzima PLD usada no novo processo de produção pode serparcialmente purificada pelas seguintes etapas:

• eliminação do agente de produção mediante a microfiltração de fluxotangencial através de filtros (preferivelmente com membranas de polietersul-fona: PES) com um tamanho de poro de 0,2 μηι;

• uItrafiItração de fluxo tangencial através de filtros (preferivelmente emPES) com um corte molecular de 10.000 D;

• ultrafiltração de fluxo tangencial através de filtros com membranas(preferivelmente em PES) com um corte molecular de 300.000 D;

• ultrafiltração de fluxo tangencial final através das membranas (preferi-velmente em PES) com um corte molecular de 10.000 D para reconcentrar aenzima e diálise contra o tampão TRIS-HCL, 50 mM pH = 8.

A Figura 1 mostra as descobertas das análises cromatográficasde enzima PLD parcialmente purificada como descrito acima, comparadocom a análise de um caldo de fermentação purificado somente a partir doagente que produz a própria enzima (Figura 2).

Exemplo 5 a

Separação e purificação de PS de acordo com o método 1.

O meio de reação em que a PS foi preparada é suplementadocom 1,5 volume (em termos do volume de reação de partida) de uma solu-ção a 5 % de NaCI1 e a mistura é agitada em uma temperatura de 30 0C du-rante pelo menos 30 minutos. A PS, que foi depositada na parte superior domeio de reação, é depois isolada mediante a separação e eliminação dosubnadante. O sobrenadante (PS) é suplementado com 4 volumes de umasolução a 3 % de NaCI e agitado em 30 ± 10 0C durante pelo menos 30 mi-nutos. Seguinte a isto, o sobrenadante é separado e eliminado (esta etapafoi repetida 2 vezes), enquanto ao subnadante (representado por PS) é adi-cionado 2 volumes de uma solução de EDTA (ácido etileno diaminotetraacé-tico) (em uma concentração de 40 gg/litro) preparada em um tampão de a-cetato, 0,1 M pH 7,5.

Após outra mistura (em 25 ± 10 0C durante pelo menos 1 hora)mediante agitação da mistura assim obtida, o pH é ajustado para 7/7,5 e 2volumes (em termos do volume de EDTA) de 95 % etanol são adicionados,agitando a mistura em 25 ± 10 0C durante pelo menos 1 hora.

Após um período de sedimentação da PS, ela é coletada e osobrenadante (a fase consistindo em etanol em água) é eliminada porque aPS não se dissolverá em uma fase hidroalcoólica. A lavagem com eta-nol/água (com uma porcentagem de etanol de 70 a 95 %) foi repetida apóso que uma lavagem final com 100 % etanol é executada, e como uma etapafinal a PS pode ser secada.

Produto final: distribuição das frações de lipídeo isoladas de a-cordo com o método 1, com PS preparada como descrito no Exemplo 3 comCaO 0,54 M.

PA 5,8 %PS 94,2 %

Exemplo 5 b

Separação e purificação de PS de acordo com o método 1.

O meio de reação em que a PS foi preparada é suplementadocom 1,5 volume (em termos do volume de reação de partida) de uma solu-ção a 5 % de NaCI, e a mistura é agitada em uma temperatura de 20 0C du-rante pelo menos 30 minutos. A PS, que foi depositada na parte superior domeio de reação, é depois isolada mediante a separação e eliminação dosubnadante. O sobrenadante (PS) é suplementado com 3 volumes de umasolução a 3 % de NaCI e agitado em 20 ± 10 0C durante pelo menos 30 mi-nutos. Seguinte a isto, o sobrenadante é separado e eliminado (esta etapafoi repetida 3 vezes), enquanto ao subnadante (representado por PS) é adi-cionado 3 volumes de uma solução de EDTA (em uma concentração de 30gg/litro) preparada em um tampão de acetato, 0,1 M pH 7,0.

Após outra mistura (em 20 ± 10 0C durante pelo menos 1 hora)mediante agitação da mistura assim obtida, o pH é ajustado para 7/7,5 e 2volumes (em termos do volume de EDTA) de 100 % etanol são adicionados,agitando a mistura em 20 ± 10 0C durante pelo menos 1 hora.

Após um período de sedimentação da PS, ela é coletada e osobrenadante (a fase consistindo em etanol em água) é eliminada. A lava-gem com etanol/água (com uma porcentagem de etanol de 70 %) foi repeti-da após o que uma lavagem final com 100 % etanol é executada, e comouma etapa final a PS pode ser secada.

Produto final: distribuição das frações de lipídeo isoladas de a-cordo com o método 1, com PS preparada como descrito no Exemplo 3 comCaO 0,54 M.PA 6,8 %PS 93,2 %

Exemplo 5 c

Separação e purificação de PS de acordo com o método 1.

Antes da adição da solução de NaCI1 a PS é filtrada para elimi-nar imediatamente todo os componentes residuais do meio de reação. De-pois NaCI é adicionado e o processo de isolamento e purificação continuacomo descrito no Exemplo 5 a.

PA 5,0 %PS 95,0 %

Após a reação de transfosfatidilação, análise de TLC do produtoobtido (Vitello F. et al.; J Chromatog; 1978; 166(2):637-40) mostra uma con-centração de 2 % de resíduo serina.

A quantidade de PDL nesta fase foi determinada pelo estadodos métodos da técnica (Aurich I. et al.; Anal Biochem; 1999; 268:337-342)e comprovou ser 2 U/g.

A concentração de serina foi medida novamente no final do pro-cesso com relação à purificação de PS descrita anteriormente e comprova-da ser mais baixa do que/igual a 0,2 %.

A atividade de resíduo da enzima PLD foi também determinadanovamente e comprovada estar abaixo do limite para determinação por estemétodo.

Para demonstrar que a ausência total de até o traço menor desolvente orgânico usado no processo de preparação de PS (descrito no E-xemplo 3) e assim confirmar a inovação e etapa inventiva da presente in-venção, a Requerente analisou a PS parcialmente purificada descrita no E-xemplo 5, na fase imediatamente precedente a adição da solução alcoólica.

A análise foi executada pela técnica conhecida de "Gas chroma-tography with static head-space injection" como descriton na EuropeanPharmacopoeia 5.0, section 2.4.24: Identification and control of residual sol-vente.

O cromatograma de calibragem (figura 3) foi obtido usando umpadrão consistindo em acetato de etila e n-hexano correspondendo a 1000ppm cada, equivalente a 100 mg de produto de teste.

A figura 4 mostra a ausência total de n-hexano na PS purificadade acordo com o Método 1.

Exemplo 6

Separação e purificação de PS de acordo com o método 2.

O meio de reação em que a PS foi preparada é suplementadocom 1,5 volume (em termos do volume de reação de partida) de uma solu-ção a 5 % de NaCI e o conjunto é agitado em uma 45 0C durante pelo me-nos 30 minutos, seguido por um período de separação da PS permanecen-do pelo menos 1 hora.

Duas fases são formadas: elas são separadas e o subnadante édescartado, enquanto o sobrenadante é suplementado com 2,5 volumes deuma solução de EDTA 22 gg/litro, preparada em água. Assim que uma tem-peratura de 28 0C tenha sido alcançada, a ultrafiltração é executada. Prefe-rivelmente, os filtros devem ser usados os quais possuem poros de um ta-manho que aprisionará as moléculas com um peso molecular de100.000/300.000 Dáltons.

O produto final pode depois ser secado por congelamento.

Produto final: distribuição das frações de lipídeo isoladas de a-cordo com o método 2, com PS preparada, por exemplo, de acordo com oExemplo 1 com CaO 0,54 M.

PA 6,0 %

PS 94,0 %

A concentração de serina foi medida no final do processo depurificação de PS anteriormente descrito e comprovada ser mais baixa doque/igual a 0,2 %, enquanto outra determinação da atividade de resíduo daenzima PLD mostrou estar abaixo do limite para determinação por este mé-todo.

Claims

1. Processo para a preparação de fosfatidilserina de fórmula <formula>formula see original document page 22</formula> em que R1 e R2 independentemente representam uma acila C10-C30 satura-da, monoinsaturada e/ou poliinsaturada, X = OH ou OM onde M = metal al-calino ou alcalino-terroso, amônio, alquilamônio (incluindo o sal interno) in-cluindo a reação de transfosfatidilação entre fosfatidilcolina da fórmula geral <formula>formula see original document page 22</formula> em que R1 e R2 e X possuem os significados especificados acima, R3 = CH2-CH2-NH2 ou CH2-CH2-N+(CH3)3 e Serina na forma D, L ou racêmica catalisa-da pela enzima fosfolipase D (PLD),caracterizado pelo fato de que a dita reação é realizada em um meio hidroal-coólico contendo um álcool alifático e na presença de oxido de metal biva-lente.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a dita reação ocorre em um meio contendo um solvente polaraprótico e na presença de um óxido de metal bivalente.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a dita reação é realizada em um meio consistindo em um siste-ma de duas fases formado por água/solvente orgânico e na presença de ó-xido de metal bivalente.

4. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que os álcoois alifáticos são selecionados de metanol, etanol, n-propanol, isopropanol.

5. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelofato de que o álcool alifático é isopropanol em uma concentração entre 0,1 e 50 % expressa como uma % em volume sobre o volume do tampão de partida.

6. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelofato de que a concentração de isopropanol é 10 %.

7. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de que os solventes polares apróticos são selecionados de dimetilsulfó-xido, acetonitrila, dimetilformamida e N-metil-pirrolidona.

8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelofato de que o solvente polar aprótico é dimetilsulfóxido em uma concentra-ção entre 0,1 e 50 % expressa como uma % em volume sobre o volume dotampão de partida.

9. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelofato de que a concentração de dimetilsulfóxido é 1,25 %.

10. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizadopelo fato de que os solventes orgânicos são selecionados de n-hexano, tolu-eno, benzeno e n-butanol.

11. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelo fato de que o solvente orgânico é n-hexano em uma concentração entre 0,1 e 40 % expressa como % em volume sobre o volume do tampão de partida.

12. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que a concentração de n-hexano é 1,25 % ou 2,5 %.

13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 12, caracterizado pelo fato de que o oxido de metal bivalente é oxido decálcio ou magnésio ou zinco em uma concentração entre 0,1 e 1 M.

14. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que a concentração dos óxidos selecionados é de 0,33 ou 0,54 M.

15. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 3, caracterizado pelo fato de que a concentração de serina varia entre 1 e-5 gg/gg de fosfatidilcolina.

16. Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizadopelo fato de que a concentração de serina varia entre 2 e 3 gg/gg de fosfati-dilcolina.

17. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 3, caracterizado pelo fato de que a fosfatidilcolina é de origem animal e/ouvegetal, natural ou sintética, presente na forma purificada ou como matéria-prima, em uma concentração de partida entre 10 e 500 mg/ml, preferivel-mente entre 200 e 300 mg/ml.

18. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 17, caracterizado pelo fato de que a reação de transfosfatidilação ocorreem uma temperatura entre 20°C e 60°C e preferivelmente em 45°C.

19. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 18, caracterizado pelo fato de que a reação de transfosfatidilação ocorreem uma temperatura entre 20°Ce 60°Ce preferivelmente em 55°C.

20. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 19, caracterizado pelo fato de que a enzima PLD é de origem fermentativaderivada do microorganismo Streptoverticillium hachijoense, usada na formapurificada, parcialmente purificada ou não purificada.

21. Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelo fato de que a concentração de PLD que é usada varia entre 1 e 100unidades/g de fosfatidilcolina.

22. Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizadopelo fato de que a concentração de PLD que é usada varia entre 1 e 10 uni-dades/g de fosfatidilcolina.

23. Processo para a purificação de fosfatidilserina (PS) de acor-do com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato deque envolve as seguintes etapas:I) adição de uma solução salina de cloreto de sódio ao meio dereação contendo a PS que foi produzida, com a subseqüente mistura e se-paração da PS;II) coleta e eliminação do subnadante;III) as etapas I e Il podem ser repetidas modificando a concen-tração de partida da solução de cloreto de sódio e eliminando o sobrenadante;IV) adição de uma solução de EDTA para quelar os íons presen-tes na solução, e subseqüente mistura;V) adição de uma solução de etanol consistindo em etanol emuma porcentagem de 50 a 100 % ou uma mistura de acetona/água consis-tindo em acetona em uma porcentagem de 50 a 95 % com subseqüente mis-tura e sedimentação da PS;VI) a etapa V pode ser repetida modificando a porcentagem deetanol;VII) adição de uma solução de etanol consistindo em etanol emuma porcentagem de 90 a 100 %;VIII) coleta e eliminação do sobrenadante;IX) secagem do produto final obtido.

24. Processo para a purificação de fosfatidilserina (PS) de acor-do com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato deque envolve as seguintes etapas:I) adição de uma solução salina de cloreto de sódio a PS que foianteriormente filtrada, com a subseqüente mistura e separação da PS;II) coleta e eliminação do sobrenadante;III) as etapas I e Il podem ser repetidas modificando a concen-tração de partida da solução de cloreto de sódio e eliminando o sobrenadante;IV) adição de uma solução de EDTA para quelar os íons presen-tes na solução, e subseqüente mistura;V) adição de uma solução de etanol consistindo em etanol emuma porcentagem de 50 a 100 % ou uma mistura de acetona/água consis-tindo em acetona em uma porcentagem de 50 a 95 % com subseqüente mis-tura e sedimentação da PS;VI) a etapa V pode ser repetida modificando a porcentagem deetanol;VII) adição de uma solução de etanol consistindo em etanol emuma porcentagem de 90 a 100 %;VIII) coleta e eliminação do sobrenadante;IX) secagem do produto final obtido.

25. Processo para a purificação de fosfatidilserina (PS) de acor-do com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato deque envolve as seguintes etapas:I) adição de uma solução salina de cloreto de sódio ao meio dereação contendo a PS que foi produzida, com subseqüente mistura e sepa-ração da PS;II) coleta e eliminação do subnadante;III) adição de uma solução salina de cloreto de sódio e execuçãoda uItrafiItração através de uma membrana porosa;IV) secagem do produto final.

26. Composições farmacêuticas, caracterizadas pelo fato de quecontêm fosfatidilserina produzida e purificada como definida em qualqueruma das reivindicações 1 a 25.

27. Uso das fosfatidilserinas produzidas e purificadas comodefinidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelofato de que é para a preparação de fármacos para a prevenção e tratamentode patologias ligadas com o envelhecimento cerebral.

28. Uso de fosfatidilserinas produzidas e purificadas comodefinidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelofato de que é para a preparação de suplementos alimentícios.

29. Uso das fosfatidilserinas produzidas e purificadas comodefinidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizado pelofato de que é para a preparação de Iipossomas para uso no campo decosmética e como um sistema para a liberação controlada de fármacos.

30. Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelo fato de que a enzima PLD derivada do microorganismoStreptoverticillium hachijoense é purificada envolvendo as seguintes etapas:I) eliminação do agente de produção mediante a microfiltraçãocom um tamanho de poro de 0,2 μιτι;II) ultrafiltração através de filtros com um corte molecular de 10.000 D;III) ultrafiltração através de filtros com membranas com um cortemolecular de 300.000 D;IV) ultrafiltração através das membranas com um cortemolecular de 10.000 D para reconcentrar a enzima e diálise em oposição aotampão acídico.