BRPI0614430A2 - anticorpo ou uma porção de ligação de antìgeno do mesmo, e, kit - Google Patents

Abstract

ANTICORPO OU UMA PORçãO DE LIGAçãO DE ANTIGENO DO MESMO, E, KIT A presente invenção provê um anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo tendo uma região variável compreendendo pelo menos duas regiões de determinação da complementaridade (CDRs) e pelo menos três regiões de estrutura. As regiões de estrutura são, ou são derivadas de regiões de estrutura de primata do Novo Mundo, e pelo menos um dos CDRs é uma CDR de primata não pertencendo ao Novo Mundo.

Description

"ANTICORPO OU UMA PORÇÃO DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENO DOMESMO, E, KIT"

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um anticorpo ou uma porçãode ligação de antígeno do mesmo tendo uma região variável compreendendopelo menos duas regiões de determinação da complementaridade (CDRs) epelo menos três regiões de estrutura. As regiões de estrutura são, ou sãoderivadas de regiões de estrutura de primata do Novo Mundo, e pelo menosuma das CDRs é ou uma CDR modificada e primata do Novo Mundo ou umaCDR de primata não pertencendo ao Novo Mundo.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Anticorpos (imunoglobulinas) desempenham um papelimportante no sistema imune de um mamífero. Eles são produzidos porcélulas do plasma que se desenvolveram de células B precursoras. Osanticorpos consistem de duas cadeias leves de polipeptídeo idênticas e duascadeias pesadas de polipeptídeos idênticas que são unidas por pontesdissulfeto. As cadeias leves são referidas como ou cadeias leves capa oulambda e as cadeias pesadas como gama, mu delta, alfa ou epsilon. Cadacadeia consiste de uma região constante ou variável. A região variável dá aoanticorpo sua especificidade. Dentre de cada região variável estão regiões dehipervariabilidade ou regiões de determinação da complementaridade (CDRs)que são flanqueadas por regiões mais conservadas referidas como regiões deestrutura. Dentro de cada região variável estão três CDRs e quatro regiões deestrutura.

Os anticorpos são moléculas bifuncionais, os segmentosvariáveis N-terminais das cadeias pesada e leve se associam juntos em ummodo específico para gerar uma estrutura tri-dimensional com afinidade paraum epítopo em particular sobre a superfície de um antígeno. Os segmentos deregião constante são responsáveis por meia-vida no soro prolongada e asfunções efetuadoras do anticorpo e estão relacionados com a ligação docomplemento, estímulo de fagocitose, citotoxicidade celular dependente doanticorpo, e disparo da liberação de grânulos granulócitos.

O desenvolvimento da tecnologia de hibridoma tem facilitadoa produção de anticorpos monoclonais de uma especificidade particular.Tipicamente, estes hibridomas são hibridomas de murinos.

Os anticorpos quiméricos humano/camundongo foram criadosem que as seqüências de região variável do anticorpo do genoma docamundongo são combinadas com seqüências de região constante deanticorpo do genoma humano. Os anticorpos quiméricos demonstramcaracterísticas de ligação do anticorpo do camundongo parental, e as funçõesde efetuador associadas com a região constante humana. Os anticorpos sãoproduzidos por expressão em uma célula hospedeira, incluindo, por exemplo,células de ovário de hamster chinês (CHO), células de mieloma NSO, célulasCOS e células SP2.

Estes anticorpos quiméricos tem sido usados em terapiahumana, no entanto anticorpos para estes anticorpos quiméricos tem sidoproduzidos pelo recipiente humano. Estes anticorpos anti-quiméricos sãoprejudiciais para a terapia contínua com os anticorpos quiméricos.

Foi sugerido que os anticorpos monoclonais humanos sãoesperados como sendo uma melhora sobre os anticorpos monoclonais decamundongos para terapia humana in vivo. A partir do trabalho realizado comanticorpos de primatas do Novo Mundo (macacos rhezus e chimpanzés), foipostulado que estes anticorpos de primatas não humanos serão tolerados emhumanos porque eles são estruturalmente similares aos anticorpos humanos(Ehrlich PH et al., Clin Chem. 34:9 pg 1681- 1688). Além disso, porque osanticorpos humanos são não imunogênicos em macacos Rhesus (Ehrich PH etal.. Hybridoma 1987; 6:15.1-60), é provável que o inverso é também aplicávele que os anticorpos de primatas serão não imunogênicos em humanos. Estesanticorpos monoclonais são secretados por hibridomas construídos por fusãode linfócitos para um heteromieloma humano χ camundongo.

EP 0 605 442 descreve anticorpos quiméricos que ligam aantígenos humanos. Estes anticorpos compreendem a região variávelcompleta de um macaco do Novo Mundo e a região constante de umanticorpo humano ou chimpanzé. Uma das vantagens sugeridas nestareferência para estas construções é a capacidade de criar anticorpos emmacacos do Novo Mundo em antígenos humanos que são menosimunogênicos em humanos comparados com os anticorpos criados em umhospedeiro de camundongo.

Os primatas do Novo Mundo (infraordem-Platyrrhini)compreende pelo menos 53 espécies comumente divididas em duas famílias, aCallithricidae e Cebidae. A Callithrieidae consiste de sagüis e macacostamarins. Cebidae inclui o macaco-de-cheiro, macaco titi, macaco aranha,macaco barrigudo, macaco capuchin, uakaris, sakis, macaco da noite emacaco guariba.

Os primatas evolucionariamente distantes, como primatas doNovo Mundo, não são apenas suficientemente diferentes dos humanos parapermitir a geração de anticorpos contra antígenos humanos, mas sãosuficientemente similares aos humanos para terem anticorpos similares aosanticorpos humanos, de modo que o hospedeiro não gera uma resposta imuneanti-anticorpo quando estes anticorpos derivados de primatas são introduzidosem um humano.

Estudos anteriores têm caracterizado o repertório de cadeiaspesadas de imunoglobulina expressadas do sagüi Callithrix jacchus (vonBudingen H-C et al., Immunogenetics 2001; 53:557-563). Seis sub-grupos deIGHV foram identificados que mostraram um alto grau de similaridade deseqüência para suas contra-partes IGHV humanas. As regiões de estruturaforam mais conservadas quando comparadas com as regiões de determinaçãoda complementaridade (CDRs). O grau de similaridade entre as seqüênciasIGHV de C. jacchus e humanos foi menor do que entre os primatas do NovoMundo não humanos e humanos.

Anticorpos de domínio

Os anticorpos de domínio (dAb) são unidades de ligaçãofuncionais que podem ser criadas usando estruturas de anticorpos ecorrespondem às regiões variáveis de cadeias ou pesadas (Vh) ou leves (Vl)de anticorpos. Os anticorpos de domínio tem um peso molecular deaproximadamente 13 kDa, ou menos do que um décimo do tamanho de umanticorpo completo.

As cadeias leves de imunoglobulina são referidas como oucadeias leves capa ou lambda e as cadeias pesadas como gama, mu, delta, alfaou epsilon. A região variável dá ao anticorpo sua especificidade. Dentro decada região variável, estão regiões de hipervariabilidade, de outra formaconhecidas como regiões de determinação da complementaridade (CDRs) quesão flanqueadas por regiões mais conservadas referidas como as regiões deestrutura. Dentro de cada região variável de cadeia leve e pesada estão trêsCDRs e quatro regiões de estrutura.

Em contraste com anticorpos convencionais, os anticorpos dedomínio são bem expressados em sistemas bacterianos, leveduras emamíferos. Seu tamanho pequeno permite que maiores quantidades molarespor grama de produto, assim provendo um aumento significante em potência.Além disso, os anticorpos de domínio podem se usados como um bloco deconstrução para criar produtos terapêuticos como dAbs de marcação múltipla,em que uma construção contendo duas ou mais domínios variáveis ligam adois ou mais alvos terapêuticos, ou anticorpos de domínio marcados paraadministração pulmonar ou oral.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção verificou que os primatas do NovoMundo provêem uma fone de seqüências de anticorpos que são previstas como tendo uma baixa imunogenicidade em humanos.

Os primatas do Novo Mundo foram selecionados como umrepositário de seqüências de imunoglobulina que existiam no ponto deramificação dos primatas do Novo Mundo e do Velho Mundo. A idéia chavefoi que este repositário poderia assim dar seqüências de imunoglobulinaprimordiais para posteriores divergências nas seqüências de imunoglobulina,como encontradas nos primatas do Velho Mundo. Estas seqüênciasprimordiais poderiam ter co-existindo com o repertório de células T, com ésubseqüentemente evolvido no caminho até o homem, durante os 35 milhõesde anos atrás (MYA) estimados como sendo o ponto de ramificação dosprimatas do Velho e do Novo Mundo (Schneider H et al, Mol. PhylogenetEvol., 1993 Sep;2(3):225-42.). Isto representa um período demorado deseleção para tolerância imunológica e, assim, estas seqüências primordiaisforam previstas, pelos inventores, como sendo isentas de alguns epítopos decélulas T auxiliares que poderiam ter evolvido mais recentemente.

Conseqüentemente, em um primeiro aspecto, a presenteinvenção provê um anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno domesmo tendo uma região variável compreendendo pelo menos duas regiõesde determinação de complementaridade (CDRs) e pelo menos três regiões deestrutura, em que as regiões de estrutura são, ou são derivadas de regiões deestrutura de primata do Novo Mundo e em que pelo menos uma das CDRs éde uma CDR de um primata não pertencendo ao Novo Mundo.

Em um segundo aspecto, a invenção provê composiçãofarmacêutica compreendendo uma quantidade efetiva do anticorpo ou umaporção de ligação de antígeno do mesmo de acordo com a presente invenção,junto com um ou mais excipiente(s) farmaceuticamente aceitável(veis) oudiluente(s).

Em um terceiro aspecto, a invenção provê o uso de umanticorpo ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo da presenteinvenção em uma aplicação diagnostica para detectar um antígeno associadocom uma doença ou distúrbio particular.

Em um quarto aspecto, a presente invenção provê um métodopara o tratamento de uma doença ou distúrbio caracterizado por atividade deTNF-α em um indivíduo humano, compreendendo a administração aoindivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade efetiva do anticorpo ouuma porção de ligação de antígeno do mesmo como aqui descrito (ou umacomposição farmacêutica do mesmo) em que o anticorpo ou uma porção deligação de antígeno do mesmo liga TNF-a.

Em um outro aspecto da invenção, provê-se o uso deanticorpos, e porções de ligação de antígeno dos mesmos, e composiçõesfarmacêuticas dos mesmos como aqui descrito na fabricação de ummedicamento. Particularmente, a fabricação de um medicamento para uso notratamento ou diagnóstico de doenças ou distúrbios como aqui descrito.

Em um outro aspecto, a presente invenção provê umaanticorpo ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo de primata doNovo Mundo designado, que liga um antígeno de superfície de célula ou umacitocina em que o anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno do mesmocompreende uma região variável compreendendo pelo menos duas regiões dedeterminação de complementaridade(CDRs) e pelo menos três regiões deestrutura, em que as CDRs são selecionadas de modo que o anticorpo ou umaporção de ligação de antígeno do mesmo liga ao antígeno de superfície decélula ou à citocina.

Salvo especificado em contrário ou claramente indicado nocontexto, pretende-se que os anticorpos e porções de ligação de antígeno dosmesmos, como aqui descrito, possam ser usados sem limitação nascomposições farmacêuticas descritas aqui e incorporadas nos kits aquidescritos. E, ainda, os anticorpos e porções de ligação de antígeno dosmesmos, assim como as composições farmacêuticas e kits, como aquidescritos, podem ser usados nos métodos de tratamento e diagnósticos aquidescritos, salvo especificado em contrário ou claramente indicado nocontexto.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1 demonstra a ligação de AB138 a MOG de ratopresente no lisado de medula espinhal do rato (trilha 2) e não para o lisadoCHOKl SV (trilha 3). A trilha 1 contém marcadores de peso molecular.

Figura 2 demonstra a falta de ligação não específica de umanticorpo monoclonal anti-TNF-α para a mesma amostra de MOG de ratopresente no lisado de medula espinhal do rato (trilha 2) lisado CHOKlSV(trilha 3). A trilha 1 contém marcadores de peso molecular.

Figura 3 é um alinhamento das seqüências de aminoácidos Vhde doador e receptor.

Figura 4 é um alinhamento das seqüências de aminoácidos Vlde doador e receptor.

Figura 5. Ligação de anticorpos AB164, AB103, AB197 aTNF-α por ELISA.

Figura 6. neutralização por AB164, AB197, AB103, decitotoxicidade de células L-929 induzida por TNF-a.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Em um primeiro aspecto, a presente invenção provê umanticorpo ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo tendo uma regiãovariável compreendendo pelo menos duas regiões de determinação decomplementaridade (CDRs) e pelo menos três regiões de estrutura, em que asregiões de estrutura são, ou são derivadas de regiões de estrutura de primatado Novo Mundo e em que pelo menos uma das CDRs é de uma CDR de umprimata não pertencendo ao Novo Mundo.

Em um segundo aspecto, a invenção provê composiçãofarmacêutica compreendendo uma quantidade efetiva do anticorpo ou umaporção de ligação de antígeno do mesmo de acordo com a presente invenção,junto com um ou mais excipiente(s) farmaceuticamente aceitável(veis) oudiluente(s).

Em um terceiro aspecto, a invenção provê o uso de umanticorpo ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo da presenteinvenção em uma aplicação diagnostica para detectar um antígeno associadocom uma doença ou distúrbio particular.

Em um quarto aspecto, a presente invenção provê um métodopara o tratamento de uma doença ou distúrbio caracterizado por atividade deTNF-α em um indivíduo humano, compreendendo a administração aoindivíduo em necessidade do mesmo de uma quantidade efetiva do anticorpoou uma porção de ligação de antígeno do mesmo como aqui descrito (ou umacomposição farmacêutica do mesmo) em que o anticorpo ou uma porção deligação de antígeno do mesmo liga TNF-a.

Em algumas formas de realização da invenção, a regiãovariável compreende três CDRs e quatro regiões de estrutura. Tambémprefere-se que o anticorpo tem uma baixa imunogenicidade prevista emhumanos.

A região variável do anticorpo ou uma porção de ligação deantígeno do mesmo pode compreender uma combinação de CDRs dediferentes fontes.

Em algumas formas de realização a região variávelcompreende CDRs selecionadas dentre o grupo consistindo de pelo menosuma seqüência de CDR de murinos (preferivelmente ou de camundongo ourato), pelo menos uma seqüência de CDR humana, pelo menos uma seqüênciade CDR sintética, pelo menos uma seqüência de CDR de coelho, pelo menosuma seqüência modificada de CDR de primata do Novo Mundo ecombinações de duas ou mais das acima, pelo menos uma CDR de humano epelo menos uma CDR de murino, pelo menos uma CDR de humano e pelomenos uma CDR sintética, e menos uma CDR de humano e pelo menos umaCDR de coelho, pelo menos uma CDR de humano e pelo menos uma CDR deprimata do Novo Mundo, pelo menos uma CDR de murino e pelo menos umaCDR sintética, pelo menos uma CDR de murino e pelo menos uma CDR decoelho, pelo menos uma CDR de murino e pelo menos uma CDR de primatado Novo Mundo, pelo menos uma CDR sintética e pelo menos uma CDR decoelho, pelo menos uma CDR sintética e pelo menos uma CDR de primata doNovo Mundo, e pelo menos uma CDR de coelho e pelo menos, uma CDR deprimata do Novo Mundo.

Em uma forma preferida, a região variável compreende 3seqüências de CDR de murinos, em particular 3 seqüências de CDR demurinos.

Em uma forma de realização alternativa, a região variávelcompreende 3 seqüências de CDR de humanos.

Em uma outra forma de realização preferida, a região variávelcompreende 4 regiões de estrutura de primata do Novo Mundo ou 4 regiõesde estrutura em que as regiões são derivadas de regiões de estrutura deprimata do Novo Mundo.

Em algumas formas de realização, a porção de ligação deantígeno é um anticorpo de domínio. Em formas de realização particulares, oanticorpo ou uma porção de ligação de antígeno ainda compreende umaseqüência de região constante de primata do Velho Mundo humano ou nãohumano, ou uma combinação das mesmas.

Os exemplos de primatas do Velho Mundo incluem, mas nãosão limitados a chipanzés, babuínos, orangotangos, macacos e gorilas.

Em uma outra forma de realização da presente invenção, odAb pode ser multimerizado, como por exemplo multimerizado, como porexemplo, hetero- ou homodímeros, (por exemplo, Vh/ Vh, Vl/ Vl ou Vh/Vl),hetero- ou homodímeros (por exemplo, VII/ Vh/ Vh5 Vl/ Vl/ V l, Vh/ Vh/ Vlou Vh/ Vl/ Vl), hetero- ou homotetrâmeros (por exemplo, Vh/Vh/ Vh/ Vh,Vl/ Vl/ Vl/Vl Vh/Vh/Vh,Vl, Vh/ Vh/ Vl/ Vl ou Vh/Vl/Vl/Vl), ou hetero- ouhomomultímeros de ordem superior. A multimerização pode aumentar aresistência da ligação de antígeno, em que a resistência da ligação estárelacionada com a soma das afinidades de ligação dos sítios de ligaçãomúltiplos.

Por exemplo, a invenção provê um anticorpo de domínio emque o anticorpo de domínio é ligado a pelo menos um outro anticorpo dedomínio. Cada dAb pode ligar ao mesmo ou diferentes antígenos.

Os multímeros do dAb podem ainda compreender um ou maisdAbs que são ligados e em que cada dAb liga a um antígeno diferente,ligandos multi-específicos incluindo os assim chamados "ligandos específicosduais". Por exemplo, os ligandos específicos duais podem compreender umpar de domínios Vh ou um par de domínios VL. Estes ligandos específicosduais são descritos em WO 2004/003019 (PCT/GB2003/002804) em nome deDomantis Ltd incorporado aqui por referência em sua totalidade.

A seqüência de região de estrutura de primata do Novo Mundoé preferivelmente de um primata do Novo Mundo selecionado dentre o grupoconsistindo de sagüis, tamarins, macaco-de-cheiro, macaco titi, macacoaranha, macaco barrigudo, macaco capuchin, uakaris, sakis, macaco da noite eo macaco guariba, o mais preferivelmente um sagüi.

Preferivelmente, o antígeno ao qual o anticorpo quimérico ouporção de ligação de antígeno do mesmo liga, é peptídeo, proteína,carboidrato, glicoproteína, lipídeo ou glicolipídeo na natureza, selecionadodentre um antígeno associado com tumor incluindo antígenocarcinoembriônico, receptores de EpCAM, Lewis-Y, Lewis-Y/b, PMSA,CD20, CD30, CD33, CD38, CD52, CDl54, EGF-R, Her-2, TRAIL e VEGF,um antígeno envolvido em uma doença ou distúrbio imune ou inflamatórioincluindo CD3, CD4, CD25, CD40, CD49d, MHC classe II, MHC classe II,GM- CSF, interferon-γ. IL-I, IL-12, IL-13, IL-23, TNF-α, e IgE, um antígenoexpressado em uma célula hospedeira incluindo glicoproteína Ilb/IIIa, P-glicoproteína, receptores purinérgicos e receptores de adesão incluindoCDl Ia CD 1 lb, CD 1 lc, CD18, CD56, CD58, CD62 ou CD144, um antígenocompreendendo uma citocina, fator de crescimento de quimiocinas, ou outromodulador fisiológico solúvel ou um receptor do mesmo incluindo eotaxina,IL-6, IL-8, TGF- β, C3a, C5a, VEGF, NGF e seus receptores, um antígenoenvolvido em doenças ou distúrbios do sistema nervoso central incluindo β-amilóide e prions, um antígeno de origem não humana como antígenosmicrobianos, nanobiais ou virais ou toxinas incluindo proteína F de vírussincicial respiratório, toxina de antrax, veneno de cascavel e digoxina; em queo anticorpo quimérico atua como um agonista ou antagonista ou é ativo paraou depletar (matar ou eliminar) células indesejadas (por exemplo anti-CD4)atuando com complemento, ou células exterminadoras (por exemplo célulasNK) ou é ativo como um agente citotóxico ou para causar ligação do receptorFc por um fagócito ou neutraliza atividade biológica de seu alvo.

Prefere-se que a seqüência de pelo menos uma região deestrutura seja modificada para aumentar a ligação ou potência ou paradiminuir a imunogenicidade prevista em humanos. Um aumento na ligação oupotência ou uma diminuição em imunogenicidade prevista em humanos deum anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno da invenção é relativa aum anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno em que a estrutura deestrutura não é modificada.

Em outras formas de realização, a seqüência de uma ou maisdas CDRs são modificadas para aumentar a ligação ou potência ou paradiminuir a imunogenicidade prevista em humanos. Um aumento na ligação oupotência ou uma diminuição em imunogenicidade prevista em humanos deum anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno da invenção é relativa aum anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno em que a estrutura deestrutura não é modificada.

Um aumento na ligação é demonstrado por uma diminuição noKu (KofiZkon) para o anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno domesmo. Um aumento em potência é demonstrado em testes biológicos. Porexemplo, testes que podem ser usados para medir a potência do anticorpo ouuma porção de ligação de antígeno do mesmo incluem o teste de neutralizaçãode citotoxicidade de L929 induzida por TNF a, teste de proliferação decélulas mononucleares de sangue periférico ativado por PHA humano,induzido por IL-12 (PBMC), e diferenciação de osteoclastos mediado porRANKL de esplenócitos de camundongos (Stem, Proc. Natl. Acad. Sei. USA87:6808 - 6812 (1990); Kong, Y-Y. et al. Nature 397:315 - 323 (1990);Matthews, N. e ML. Neale em Lymphokines and Interferons, a PracticalApproach, 1987, MJ. Clemens, A.G. Morris e AJ.H. Gearing, eds., JRL Press,p. 221).

O termo "anticorpo" como usado aqui, se destina a fazerreferência a moléculas de imunoglobulina compostas de quatro cadeias depolipeptídeo, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L)interconectadas por ligações dissulfeto. Cada cadeia pesada é composta deuma região variável de cadeia pesada (HCVR ou VH) e uma região constantede cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada compreende trêsdomínios, ChI, CH2, e Ch3. Cada cadeia leve é composta de uma regiãovariável de cadeia leve (LCVR ou VL) e uma região constante de cadeia leve.

A região constante de cadeia leve é composta de um domínio Cl- As regiõesVh e Vl podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade,chamadas regiões de determinação da complementaridade (CDR),interdispersas com regiões que são mais conservadas, chamadas regiões deestrutura (FR). Cada Vh e Vl é composto de três CDRs e quatro FRs,dispostos de amino-término para carbóxi término na seguinte ordem: FRl,CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

O termo "porção de ligação de antígeno" de um anticorpo,como usado aqui, refere-se a um ou mais componentes ou derivados de umaimunoglobulina que demonstra a capacidade de ligar a um antígeno. Foidemonstrado que a função de ligação de antígeno de um anticorpo pode serrealizada por fragmentos de anticorpo de comprimento completo. Osexemplos de fragmentos de ligação englobados no termo "porção de ligaçãode antígeno" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmentomonovalente consistindo dos domínios Vl, Vh5 Cl e Ch 1; (ii) um fragmentoF(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligadospor um ponte dissulfeto na região de gancho; (iii) um fragmento Fdconsistindo dos domínios Vh e Ch 1; (iv) um fragmento Fv consistindo dosdomínios Vl e Vh do braço único de um anticorpo; (v) um fragmento dAb(Ward et al, 1989, Nature 341 :544-54G) que consiste de um domínio Vhúnico, ou um domínio Vl (van den Beuken T et al, 2001, J. Mol. Biol, 310,591); e (vi) uma região de determinação da complementaridade (CDR)isolada. Além disso, apesar dos dois domínios de fragmento Fv, Vl e VH,serem codificados por genes separados, eles podem ser unidos, usandométodos recombinantes, por um ligador sintético que permite que os mesmossejam feitos como uma cadeia de proteína única em que as regiões Vl e Vhestão em pares para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv decadeia única (scFv); (ver, por exemplo, Bird el al, 1988, Science 242:423-426e Huston el al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883). Estes Fvs decadeia única são também destinados a serem englobados no termo "porção deligação de antígeno" de um anticorpo. Outras formas de Fvs de cadeia única emoléculas relacionadas como diacorpos ou triacorpos podem também serenglobados. Os diacorpos são anticorpos bivalentes em que os domínios Vh eVl são expressados em uma cadeia de polipeptídeo única, mas usando umligador que é muito curto para permitir a formação dos pares entre os doisdominós na mesma cadeia, assim forçando os domínios a formarem parescom domínios de complementaridade de outra cadeia e criando dois sítios deligação de antígeno (ver, por exemplo, Holliger, P., et al.r 1993, Proc. Natl.Acad. Sei. USA, 90:6444-6448; Poljak, RJ., et al, 1994, Structure, 2:1121-1123).

Os métodos para a produção de anticorpos de acordo com ainvenção serão familiares para os versados na arte, ver por exemplo, patenteUS 4 816 567, patente US 5 585 089 e US 2003/0039649, que sãoincorporados aqui por referência em sua totalidade. Estes métodos requerem ouso de técnicas recombinantes padrões.

Prefere-se que o anticorpo ou uma porção de ligação deantígeno do mesmo de acordo com à presente invenção tenha umaimunogenicidade baixa prevista em um hospedeiro humano.

Por "imunogenicidade baixa" significa-se que o anticorpo nãocria uma resposta ao anticorpo em pelo menos a maior parte dos indivíduosrecebendo o anticorpo de grandeza suficiente para reduzir a efetividade deadministração continuada do anticorpo durante um tempo suficiente paraobter uma eficácia terapêutica.

O nível de imunogenicidade em humanos pode ser previstousando o programa de previsão de ligação de MHC classe II Propred(http://www.imtech.res.in/raghava/propred) usando uma análise de valor delimiar a 1% de todos os alelos. Outros programas que podem ser usadosincluem:

Rankpep (http://bio.dfci. harvard.edu/Tools/rankperxhtml)

Epibase (Algonomies proprietary software: algonomics.com)

As moléculas de imunogenicidade reduzida não irão conter ouirão conter números reduzidos de peptídeos previstos para ligar a alelos deMHC classe II que são altamente expressados na população alvo, com relaçãoà molécula do doador de partida (Fmenor DR, Doytchinova IA. (2004)Immunoinformatics and the prediction of imunogenicity, Drug Discov Today,9(2): 82-90).

A análise funcional de ligação de MHC classe II pode serrealizada por geração de peptídeos de sobreposição correspondendo à proteínade interesse e teste das mesmas para sua capacidade de evocar a ativação decélulas T (teste de proliferação de células T) ou deslocar um peptídeorepórter, um peptídeo de ligação de MHC classe II conhecido (Hammer J elat., 1994, J. Kxp. Med., 180:2353).

O termo "derivado de", como usado aqui, com relação àsregiões de estrutura de primata do Novo Mundo significa que a seqüência daregião de estrutura do primata do Novo Mundo é alterada da seqüência nativa.Tipicamente, as mudanças serão feitas para aumentar a ligação de mododescrito nas patentes US 5 585 089 e US 2003/0039649 ou para reduzir aimunogenicidade prevista em humano. O termo "derivado de" não incluimudanças que resultam na seqüência total das regiões de estrutura presentesna região variável sendo idênticas às seqüências de estrutura humana. Umabase de dados que pode ser usada para comparação éhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/.

Em um outro aspecto, a presente invenção provê um anticorpoou uma porção de ligação de antígeno do mesmo de um primata do NovoMundo designado que liga a um antígeno de superfície de células ou umacitocina em que o anticorpo ou ligação de antígeno do mesmo compreendeuma região variável compreendendo pelo menos duas regiões dedeterminação de complementaridade (CDRs) e pelo menos três regiões deestrutura, em que as CDRs são selecionadas de modo que o anticorpo ou umaporção de ligação de antígeno liga ao antígeno de superfície de célula ou à citocina.

Como usado aqui, o termo "designado" significa que as CDRsdo primata do Novo Mundo foram selecionadas usando os métodos deimpressão de epítopos descritos em Hoogenboom et al, publicação PCT . WO93/06213 e Jespers et al, BIO/TECHNOLOGY Vol. 12 1994, pp 899-903,que são aqui incorporados em sua totalidade. As bibliotecas de anticorposusadas neste método são preferivelmente bibliotecas scFv preparadas e tríadascomo descrito em McCafferty et al, publicação PCT No, WO 92/01047,McCafferty et al, 1990, Nature, 348:552-554; e Griffiths et al, 1993, EMBO J,12:725-734 que são aqui incorporados por referência em sua totalidade.

Por exemplo, uma vez que os segmentos Vl e Vh humanosiniciais foram selecionados, as experiências de "misturar e corresponder" emque diferentes pares de segmentos Vl e Vh inicialmente selecionados sãotriados para a ligação de hTNF-α, são realizados para selecionar ascombinações de pares de Vl/Vh preferidos. Adicionalmente, para aindamelhorar a afinidade e/ou abaixar a constante de taxa desligado para hTNF- a,a ligação dos segmentos Vl e Vh do(s) par(es) de VL/VH preferido(s) pode seraleatoriamente mudada, preferivelmente dentro da região de CDR3 de Vle/ou Vh em um processo análogo ao processo de mutação somática in vivoresponsável para maturação por afinidade de anticorpos durante uma respostaimune natural. Esta maturação por afinidade in vitro pode ser obtida poramplificação de regiões de Vh e Vl usando os iniciadores de PCRcomplementares ao CDR3 de Vh ou CDR3 de VL, respectivamente, cujosiniciadores foram "salpicados" com uma mistura aleatória das quatro bases denucleotídeos em algumas posições como que os produtos de PCR resultantescodifiquem os segmentos de Vh e Vl em que as mutações aleatórias foramintroduzidas nas regiões de CDR3 de Vh e/ou Vl . Estes segmentos de Vh eVl aleatoriamente mudados podem ser re-triados por ligação de antígeno eseqüências que demonstram uma alta afinidade e uma baixa taxa de desligadopara a ligação de antígeno poder ser selecionada.

Após a triagem e isolamento de um anticorpo ou uma porçãode ligação de antígeno do mesmo que liga o antígeno de interesse de umabiblioteca de mostra de imunoglobulina recombinante, o ácido nucleicocodificando o anticorpo selecionado pode ser recuperado do pacote de mostra(por exemplo de genoma de fago) e subclonado em outros vetores deexpressão pó técnicas de DNA recombinante padrões. Se desejado, o ácidonucleico pode ser ainda manipulado para criar outras formas de anticorpo dainvenção (por exemplo, ligado ao ácido nucleico codificando domínios deimunoglobulina adicionais, como regiões constantes adicionais). Paraexpressar um anticorpo humano recombinante isolado por triagem de umabiblioteca combinatorial, o DNA codificando o anticorpo é clonado em umvetor de expressão recombinante e introduzido em células hospedeiras demamíferos.

Os exemplos de antígenos de superfície de células que podemser marcados e anticorpos que podem ser usados na impressão incluem masnão são limitados a

<table>table see original document page 18</column></row><table>A presente invenção é ainda baseada em um método paraamplificação de genes de imunoglobulina de primata do Novo Mundo, porexemplo reação de cadeia polimerase (PCR) do ácido nucleico extraído doslinfócitos do primata do Novo Mundo usando iniciadores específicos parafamílias de genes de região variável de cadeia pesada e leve. A região variávelamplificada é então clonada em um vetor de expressão contendo um gene deregião constante de humano ou primata para a produção de anticorporecombinante quimérico de primata do Novo Mundo. As metodologias deDNA recombinantes padrões são usadas para obter genes de cadeia pesada eleve de anticorpos, incorporar estes genes em vetores de expressãorecombinante e introduzir os vetores em células hospedeiras, como asdescritas em Sambrook, Fritsch e Maniatis (eds), Molecular Cloning: alaboratory manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor, N.Y (1989).

Os vetores de expressão apropriados serão bem conhecidosdos versados. Os linfócitos de primata do Novo Mundo produzindo asimunoglobulinas são tipicamente imortalizados por fusão com uma linhagemde células de mieloma para gerar um hibridoma.

As células hospedeiras de mamíferos preferidas para expressaros anticorpos recombinantes da invenção incluem ovário de hamster chinês(CH), células de mieloma NSO, células COS e células SP2.

Além dos sistemas de expressão de mamíferos, a presenteinvenção também contempla o uso de sistemas de expressão não mamíferoscomo os que são derivados de plantas ou procarióticos (bacterianos). Estessistemas de expressão serão bem conhecidos dos versados.

O repertório de domínios de região constante VH, Vl pode serum repertório de ocorrência natural de seqüências de imunoglobulina ou umrepertório sintético. Um repertório de ocorrência natural é um preparado, porexemplo, a partir de células expressando imunoglobulina coletadas de um oumais primatas. Estes repertórios podem ser nativos, isto é, preparados a partirdas células expressando imunoglobulina de recém-nascidos, ou rearranjados,isto é, preparados a partir de, por exemplo, células B de primatas adultos. Sedesejado, os clones identificados de um repertório natural, ou qualquerrepertório que liga ao antígeno de marcação são então submetidos amutagenes e ainda triagem para produzir e selecionar variantes comcaracterísticas de ligação melhoradas.

Os repertórios sintéticos de domínios variáveis deimunoglobulina são preparados por introdução artificial de diversidade em umdomínio variável clonado. Estas técnicas de maturação por afinidade serãofamiliares para os versados, como as descritas por R. A. Irving et al, 2001,Journal of Immunological Methods, 248: 31-45).

A região variável, ou uma CDR da mesma, de um gene deanticorpo de primata do Novo Mundo pode ser clonada ao prover ácidonucléico, por exemplo cDNA, provendo um iniciador complementar àseqüência de cDNA codificando uma seqüência líder 5' de um gene deanticorpo, contatando este cDNA e o iniciador para formar um complexohíbrido e amplificando o cDNA para produzir ácido nucleico codificando aregião variável (ou região CDR) do gene de anticorpo de primata do NovoMundo.

Em vista do ensinamento do presente relatório, será notadopelos versados na arte da presente invenção, que a seqüência de regiãovariável de primata do Novo Mundo pode ser usada como receptores paraenxertar seqüências de primata não pertencendo ao Novo Mundo,particularmente, seqüências de CDR usando técnicas recombinantes padrões.Por exemplo, a patente US 5,585,089 descreve métodos para criar anticorposquiméricos de baixa imunogenicidade que retém a elevada afinidade doanticorpo parental não humano e contém um ou mais CDRs de umaimunoglobulina do doador e uma região de estrutura de uma imunoglobulinahumana. A publicação US no. 20030039649 descreve um método dehumanização para criar anticorpos quiméricos de baixa imunogenicidadecontendo seqüências de CDR de um anticorpo não humano e seqüências deestrutura de anticorpos humanos com base em uso de tipos de estrutura deCDR canônico do anticorpo não humano em comparação com os tipos deestrutura de CDR canônico de linhagem germinal de anticorpos humanos,como a base para selecionar as seqüências de estrutura humanas apropriadaspara um anticorpo humanizado. Conseqüentemente, estes princípios podemser aplicados ao enxerto de uma ou mais CDRs de primata não pertencendoao Novo Mundo em uma região variável de receptor de primata do NovoMundo.

As seqüências de CDR podem ser obtidas de um DNAgenômico isolado de um anticorpo, ou de seqüências presentes em uma basede dados, por exemplo, as bases de dados de proteínas e nucleotídeos de

The National Centre for Biotechnology Information, a base dedados Kabat de seqüências de proteínas de interesse imunológico. Aseqüência CDR pode ser um DNA genômico ou um cDNA.

Os métodos para enxertar CDR(s) de substituição em umaseqüência variável de receptor serão familiares para os versados na arte dapresente invenção. Tipicamente, os CDRs serão enxertados em seqüências deregião variável de receptor para cada uma dentre a cadeia leve variável e umacadeia pesada variável ou uma cadeia única no caso de um anticorpo dedomínio. O método preferido da presente invenção envolve a substituição deou CDRl ou, mais preferivelmente, CDR2 em uma seqüência de regiãovariável via mutagênese dirigida por iniciador. O método consiste deanelamento de um oligonucleotídeo sintético codificando uma mutaçãodesejada para uma região de marcação onde ele serve como um iniciador parainiciar a síntese de DNA in vitro, estendendo o oligonucleotídeo por umaDNA polimerase para gerar um DNA de filamento duplo que transporta amutação desejada, e ligando e clonando a seqüência em um vetor deexpressão apropriado (Sambrook, Joseph; e David W. Russell (2001).Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3 a. ed, Cold Spring Harbor, N. Y.:Cold Spring Harbor Laboratory Press)..

Ainda mais, um anticorpo ou uma porção de ligação deantígeno do mesmo pode ser uma parte de uma molécula de imunoadesãomaior, formada por associação covalente ou não covalente do anticorpo ouporção de anticorpo com uma ou mais de outras proteínas ou peptídeos. Osexemplos de tais moléculas de imunoadesão incluem o uso de região denúcleo de estreptavidina para fazer uma molécula scFv tetramérica(Kipriyanov, S. M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) e uso de um resíduo de cisteína, um peptídeo marcador e uma etiqueta depoli-histidina C-terminal para fazer moléculas scFv bivalentes e biotiniladas(Kipriyanov, S. M., el al. (1994) Mol. Immunol. 31 :1047-1058). As porçõesde anticorpo, como fragmentos Fab e F(ab')2, podem ser preparadas deanticorpos completos usando técnicas convencionais, como digestão depapaína ou pepsina, respectivamente, de anticorpos completos. Além disso, osanticorpos, porções de anticorpo e moléculas de imunoadesão podem serobtidos usando técnicas de DNA recombinantes padrões, como descrito aqui econhecido do versado na arte.

A seqüência de região constante (porção Fc) é preferivelmenteobtida de uma seqüência de imunoglobulina de humano ou primata. Aseqüência de primata pode ser de uma seqüência de primata do Novo Mundoou de primata do Velho Mundo. Os primatas do Velho Mundo apropriadosincluem chimpanzés, ou outros macacos hominídeos, por exemplo gorila ouorangotango, que devido à sua proximidade filogenética próxima comhumanos, compartilham um elevado grau de homologia com a seqüência deregião constante humana. As seqüências que codificam para regiõesconstantes de humanos ou primatas são disponíveis de bases de dadosincluindo por exemplo as bases de dados de proteínas e nucleotídeos do TheNational Centre for Biotechnology Information, a base de dados Kabat deseqüências de proteínas de interesse imunológico.

O anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno de acordocom a invenção é capaz de ligar a um antígeno humano ou não humano.

Preferivelmente, o antígeno ao qual o anticorpo quimérico ouporção de ligação de antígeno do mesmo liga, é peptídeo, proteína,carboidrato, glicoproteína, lipídeo ou glicolipídeo na natureza, selecionadodentre um antígeno associado com tumor incluindo antígenocarcinoembriônico, receptores de EpCAM, Lewis-Y, Lewis-Y/b, PMSA,CD20, CD30, CD33, CD38, CD52, CD154, EGF-R, Her-2, TRAIL e VEGF,um antígeno envolvido em uma doença ou distúrbio imune ou inflamatórioincluindo CD3, CD4, CD25, CD40, CD49d, MHC classe II, MHC classe II,GM- CSF, interferon-γ. IL-I, IL-12, IL-13, IL-23, TNF-α, e IgE, um antígenoexpressado em uma célula hospedeira incluindo glicoproteína Ilb/IIIa, P-glicoproteína, receptores purinérgicos e receptores de adesão incluindoCDl Ia CD 1 lb, CD 1 lc, CD18, CD56, CD58, CD62 ou CD144, um antígenocompreendendo uma citocina, fator de crescimento de quimiocinas, ou outromodulador fisiológico solúvel ou um receptor do mesmo incluindo eotaxina,IL-6, IL-8, TGF- β, C3a, C5a, VEGF, NGF e seus receptores, um antígenoenvolvido em doenças ou distúrbios do sistema nervoso central incluindo β-amilóide e prions, um antígeno de origem não humana como antígenosmicrobianos, nanobiais ou virais ou toxinas incluindo proteína F de vírussincicial respiratório, toxina de antrax, veneno de cascavel e digoxina; em queo anticorpo quimérico atua como um agonista ou antagonista ou é ativo paraou depletar (matar ou eliminar) células indesejadas (por exemplo anti-CD4)atuando com complemento, ou células exterminadoras (por exemplo célulasNK) ou é ativo como um agente citotóxico ou para causar ligação do receptorFc por um fagócito ou neutraliza atividade biológica de seu alvo.

Mais preferivelmente, o antígeno é TNF-α, preferivelmenteTNF-α humano.

Alternativamente, o anticorpo ou uma porção de ligação deantígeno do mesmo pode ligar a um antígeno não humano. Preferivelmente, oantígeno não humano é selecionado dentre o grupo consistindo de proteína Fde vírus sincicial respiratório, citomegalovírus, venenos de cobra e digoxina.

O termo "liga a1 como usado aqui destina-se a fazer referênciaà ligação de um antígeno por uma região variável de imunoglobulina de umanticorpo com uma constante de dissociação (Kp) de 1 μΜ ou menor, comomedido por análise de ressonância de plasmon de superfície usando, porexemplo, um sistema de ressonância de plasmon de superfície Biacore ™ esoftware de avaliação de cinética BIAcore ™ (por exemplo versão 2.1). Aafinidade ou constante de dissociação (Ku) para uma interação de ligaçãoespecífica é preferivelmente cerca de 500 nM a cerca de 50 pM, maispreferivelmente cerca de 500 nM ou menor, mais preferivelmente cerca de300 nM ou menor e preferivelmente pelo menos cerca de 300 nM a cerca de50 pM, cerca de 200 nM a cerca de 50 pM, e mais preferivelmente pelomenos cerca de 100 nM a cerca de 50 pM, cerca de 75 nM a cerca de 50 pM,cerca de 10 nM a cerca de 50 pM.

Os anticorpos da presente invenção são vantajosos em terapiahumana devido à possibilidade de indução de uma resposta anti-anticorpohumana ser reduzida.

Os anticorpos recombinante produzidos de acordo com ainvenção que ligam a um antígeno de marcação podem ser identificados eisolados por triagem de uma biblioteca de imunoglobulina combinatorial (porexemplo uma biblioteca de mostra de fagos) para isolar os membros dabiblioteca que demonstram especificidade de ligação desejada ecomportamento funcional. Será entendido que todas as abordagens ondeporções de ligação a antígeno ou derivados de anticorpo são usados, porexemplo domínios Fabs, scFv e V ou anticorpos de domínio, estão no escopoda presente invenção. A técnica de mostra de fagos foi descritaextensivamente na arte e exemplos de métodos e compostos para gerar e triarestas bibliotecas e maturação por afinidade de seus produtos podem serencontrados em, por exemplo, Barbas et ai. 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA,88:7978-7982: Clarkson et al. 1991 Nature 352:624:628; Dower et al.Publicação PCT. 91/17271, Patente US No. 5,427,908, Patente US No.5,580,717 e EP 527,839; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372;Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9: 1373:1377; Garrard et al. PublicaçãoPCT WO 92/09690; Gram et al. 1992, Proc. Natl. Acad. Sic. USA, 89:3576-3580; Griffiths et al. 1993 EMBO J 12:725:734; Grittiths et al. Patente USNo. 5,885,793 e EP 589,877; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896;Hay et al, (1992) Hum Antibody Hybridomas 3:81 -85; Hoogenboom et al.1991 Nuc Acid Res 19:4133-4137; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Knappik et al. 2000 J MoI Biol 296:57-86; Knappik el al. PCT WO97/08320; Ladner et al. Patente US no. 5.223.409, No. 5.403.484, No.5.571.698, No. 5.837.500 e EP 436.597; McCafferty et al (1990) Nature348:552-554; McCafferty et al. Publicação PCT. WO 92/01047, Patente USNo. 5.969.108 e EP 589,877; Salfeld et al PCT WO 97/29131, pedidoprovisório US No. 60/126.603; e Winter et al. PCT WO 92/20791 e EP368.684.

As bibliotecas recombinantes expressando os anticorpos dainvenção podem ser expressados na superfície de microorganismos, porexemplo levedura ou bactérias (ver publicação PCT W099/36569 e98/49286).

O método de anticorpos de linfócitos selecionados ou SLAMcomo é referido no estado na arte, é outro meio de gerar rapidamenteanticorpos de alta afinidade. Diferente das abordagens de mostra de fagos,todos os anticorpos são totalmente divalentes. A fim de gerar anticorpos deprimata do Novo Mundo, os primatas do Novo Mundo são imunizados comum antígeno humano, por exemplo, um polipeptídeo TNF-α . Apósimunização, as células são removidas e seletivamente proliferadas em micro-cavidades individuais. Os sobrenadantes são removidos das cavidades etestados tanto para ligação como função. As seqüências de genes podem serrecuperadas para subseqüentes manipulações, por exemplo humanização,fragmento Fab,ou geração de anticorpo de domínio scFv. Assim, outroexemplo é a derivação do ligando da invenção por SLAM e seus derivados(Babcook, J.S. et al 1996, Proc. Natl. Acad. Sei, USA 93; 7843-7848, PatenteUS 5,627,052 e publicação PCT W092/0255t). As adaptações de SLAMcomo o uso de alternativas para testar sobrenadantes como por bateia tambémestão no escopo da invenção.

Em um sistema de expressão, a bibliotecas depeptídeo/proteína recombinante é mostrada em ribossomas (por exemplo, verRoberts, RW e Szostak, J.W.I 997. Proc.Natl. Acad. Sci.USA. 94:12297 -123202 e publicação PCT No. W098/31700). Assim, outro exemplo envolvea geração e a transcrição in vitro de uma biblioteca de DNA (por exemplo deanticorpos e derivados) preferivelmente preparados a partir de célulasimunizadas, mas não assim limitadas), tradução da bibliotecas como que aproteína e mRNAs "imunizados" estejam no ribossoma, seleção por afinidade(por exemplo por ligação a RSP), isolamento de mRNA, tradução reversa esubseqüente amplificação (por exemplo por reação de cadeia polimerase outecnologia relacionada. Os ciclos adicionais de seleção e amplificação podemser acoplados, como necessário à maturação por afinidade através deintrodução de mutação somática neste sistema ou por outros métodos dematuração por afinidade, com bem conhecido no estado da arte (R.A. Irvinget al, Journal of Immunological Methods, 248, 31-45 (2001)).

Outro exemplo parece a aplicação de tecnologia decompartimentalização em emulsão para a geração dos anticorpos da invenção.Em compartimentalização em emulsão, os métodos de classificação in vitro eópticos são combinados com co- compartimentalização de proteína traduzidae sua seqüência de codificação de nucleotídeos em fase aquosa dentro de umagotícula de óleo em uma emulsão. Ver publicações PCT W099026711 eW00040712). Os elementos principais para a geração e seleção de anticorpossão essencialmente similares ao método in vitro de mostra de ribossomas.

O anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno do mesmode acordo com a invenção pode ser derivado ou ligado a outra moléculafuncional. Por exemplo, o anticorpo ou uma porção de ligação de antígenopode ser funcionalmente ligado por copulação química, fusão genética,associação não covalente ou de outra forma, a uma ou mais entidadesmoleculares, como outro anticorpo, um agente detectável, um agentecitotóxico, um agente farmacêutico, e/ou uma proteína ou peptídeo quepodem mediar a associação do anticorpo ou uma porção de ligação deantígeno do mesmo com outra molécula (como região de núcleo deestreptavidina ou uma etiqueta de poli-histidina).

Os agentes citotóxicos comumente usados para gerarimunotoxinas incluem isótopos radioativos como 111IN ou 90Y, selênio,ribonucleases, toxinas microbianas truncadas deletadas em domínio deligação, como exotoxina de Pseudomonas ou toxina de difteria, inibidores detubulina como caliceamicina (ozagamicina), maitansinóides (incluindo DM-1), auristatinas, e taxóides, proteínas inativando ribossoma como ricina,ebulina I, saporina e gelonina, e profármacos como melfalan.

Os agentes detectáveis utilizáveis com os quais um anticorpoou uma porção de ligação de antígeno do mesmo podem ser derivadosincluem compostos fluorescentes. Os agentes detectáveis fluorescentesexemplares incluem fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina,cloreto de 5-dimetil amina-l-naftelenossulfonila, ficocritrina e outros. Umanticorpo também pode ser derivado com enzimas detectáveis como fosfatasealcalina, peroxidase de raiz forte, glucose oxidase e outros. Quando umanticorpo é derivado com uma enzima detectável, ele é detectado por adiçãode reagentes adicionais que a enzima usa para produzir um produto de reaçãodetectável. Um anticorpo também pode ser derivado com biotina, e detectadoatravés de medida indireta de ligação de avidina ou estreptavidina.

A presente invenção também se estende a anticorposPEGuilados ou porção de ligação ao anticorpo que provê aumentada meia-vida e resistência à degradação sem uma perda em atividade (por exemploafinidade por ligação) com relação a polipeptídeos de anticorpo nãoPEGuilado.

O anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno comodescrito aqui pode ser copulado, usando métodos conhecidos, em moléculasde polímero (preferivelmente PEG) utilizáveis para obter a meia-vidaaumentada e propriedades de resistência à degradação. As porções depolímero que podem ser utilizadas na invenção podem ser sintéticas ou deocorrência natural e incluem, mas não são limitados a polímeros depolialquileno, polialquenileno ou polioxialquileno de cadeia reta ouramificada, ou um polissacarídeo ramificado ou não ramificado, como homo-ou heteropolissacarídeo. Os exemplos preferidos de polímeros sintéticos quepodem ser usados na invenção incluem poli (etileno glicol) de cadeira reta ouramificada (PEG), poli (propileno glicol) ou poli (álcool vinílico), e derivadosou formas substituídas dos mesmos. Os polímeros substituídosparticularmente preferidos para ligação a anticorpos como descrito aquiincluem PEG substituído, incluindo metoxi (polietileno glicol). As porções depolímero de ocorrência natural que podem ser usados além de ou em vez dePEG incluem lactose, amilose, dextrano, ou glicogênio, assim como seusderivados, que poderiam ser reconhecidos pelos versados na arte.

As formas derivadas de moléculas de polímero incluem, porexemplo, derivados que tem porções adicionais ou grupos reativos presentesna mesma para permitir a interação com resíduos de aminoácidos dospolipeptídeos do anticorpo aqui descritos. Estes derivados incluem ésteresativos de N-hidroxil succinimida (NIJS), polímeros de propionato desuccinimidila, e agentes reativos seletivos para sulfidrila como maleimida,vinil sulfona, e tiol. Os polímeros derivados particularmente preferidosincluem, mas não são limitados a polímeros PEG tendo as fórmulas: PEG-O-CH2CH2CH2-CO2-N HS; PEG-O-CH2-NHS; PEG-O- CH2CHz-C02-NHS;PEG-S-CH2CH2-CO-NHS; PEG-02CNH-CH(R)-C02-NHS; PEG- NHCO-CH2CH2-CO-NHS; e PeG-O-CH2-CO2-NHS; onde R é(CH2)4)NHC02(mPEG). Os polímeros PEG podem ser moléculas lineares, oupodem ser ramificados em que as porções PEG estão presentes em umpolímero único.

O grupo reativo (por exemplo, MAL, NHS, SPA, VS, ou Tiol)pode ser fixado diretamente ao polímero PEG ou pode ser fixado a PEG viauma molécula de ligador.

O tamanho dos polímeros utilizáveis na invenção pode estar nafaixa de entre 500 Da a 60 kDa, por exemplo, entre 1000 Da e 60 kDa, 10kDa e 60 kDa, 20 kDa e 60 kDa, 30 kDa e 60 kDa, 40 kDa e 60 kDa, e atéentre 50 kDa e 60 kDa. Os polímeros usados na invenção, particularmentePEG, podem ser polímeros de cadeia reta ou podem possuir uma conformaçãoramificada.

As moléculas de polímero (PEG) utilizáveis na invençãopodem ser fixadas a um anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno domesmo usando métodos que são bem conhecidos na arte. A primeira etapa nafixação de PEG ou outras porções de polímero para um monômero depolipeptídeo de anticorpo ou multímero da invenção é a substituição dosgrupos terminais hidroxila do polímero PEG por grupos funcionais contendoeletrófilo. Particularmente, polímeros PEG são fixados a resíduos cisteína oulisina nos monômeros de polipeptídeo de anticorpo ou multímeros. Osresíduos de cisteína e lisina podem ser de ocorrência natural ou podem serengenheirados na molécula de polipeptídeo de anticorpo. Por exemplo, osresíduos de cisteína podem ser engenheirados de modo recombinante notérmino C do polipeptídeo de anticorpo, ou resíduos em locais acessíveis aosolvente específico em um polipeptídeo de anticorpo podem ser substituídoscom cisteína ou lisina.

O anticorpo pode ser ligado a uma ou mais moléculas quepodem aumentar sua meia-vida in vivo. Estas moléculas são ligadas aoanticorpo a um sítio no anticorpo diferente do sítio de ligação de antígeno, demodo que eles não interferem/impedem estéreo-quimicamente o sítio deligação de antígeno. Tipicamente, estas moléculas são polipeptídeos deocorrência natural in vivo e que resistente à degradação ou remoção pormecanismos endógenos. Será óbvio para o versado na arte que fragmentos ouderivados destas moléculas de ocorrência natural podem ser usadas, e quealgumas podem não ser polipeptídeos. As moléculas que aumentam a meia-vida põem ser selecionadas das seguintes:

(a) proteínas de matriz extracelular, por exemplo colágeno,lamina, integrina e fibronectina,

(b) proteínas encontradas no sangue, por exemplo, fibrina a-2macroglobulina, albumina no soro, fibrinogênio A, fibrinogênio B, proteínaamilóide A no soro, heptaglobina, proteína, ubiquitina, uteroglobulina, β-2microglobulina, plasminogênio, lisozima, cistatina C, alfa-l-antitripsina einibidor de kipsina pancreática;

(c) proteínas de soro imunes, por exemplo IgE, IgG, IgM;

(d) proteínas de transporte, por exemplo proteína de ligação aretinol, a-1 microglobulina;

(e) defensinas, por exemplo beta-defensina 1, defensinas deneutrófilos 1, 2 e 3;

(f) proteínas encontradas na barreira sangue-cérebro ou emtecidos neurais, por exemplo receptor de melacortina, mielina, transportadorde ascorbato,

(g) proteínas de fusão de agente neuro-farmacêutico ligandoespecífico de receptor de transferrina (ver US5977307); receptor de célulaendotelial capilar no cérebro, transferrina, receptor de transferrina, insulina,receptor de fator de crescimento semelhante a insulina 1 (IGF 1), receptor defator de crescimento semelhante a insulina 2 (IGF 2), receptor de insulina,

(h) proteínas localizadas no fígado, por exemplo policistina,colágeno tipo IV, transportador aniônico orgânico Kl, antígeno de Heymann,

(i) proteínas localizadas no fígado, por exemplo álcooldesidrogenase (G250),

(j) fator de coagulação do sangue X,(ki) α 1- antitripsina,(1) HNF 1 a,

(m) proteínas localizadas no pulmão, por exemplo componentesecretório (liga IgA),

(n) proteínas localizadas no coração, por exemplo HSP 27,(o) proteínas localizadas na pele, por exemplo queratina,(p) proteínas específicas de osso, como proteínas morfogênicasdo osso (BMPs), por exemplo BMP-2, 4, 5, 6, 7 (também referido comoproteína osteogênica (OP-1) e -8 (OP-2),

(q) proteínas específicas de tumor, por exemplo antígeno detrofoblasto humano, receptor de herceptina, receptor de estrogênio, catepsinaspor exemplo catepsina B (encontrada no fígado e baço),

(r) proteínas específicas de doença, por exemplo antígenosexpressados apenas em células T ativadas, incluindo LAG-3 (gene de ativaçãode linfócitos, ligando de osteoprotegerina (OPGL) ver Nature 402, 304-309,199S); 0X40 (um membro da família do receptor de TNF-α, expressado emcélulas T ativadas a única molécula de células T co-estimulatórias conhecidascomo sendo especificamente reguladas de modo positivo em célulasprodutoras do vírus de leucemia de célula T humana (HTLV-I) tipo I, ver J.Immunol. 2000 JuI 1; J6561):263-70; metaloproteases (associadas comartrite/cânceres), incluindo CG6512 de Drosophila, paraplegina humana, RsHhumano, AFG3L2 humano, flsH murino; fatores de crescimentoangiogênicos, incluindo fator de crescimento de fibroblastos ácidos (FGF-2),fator de crescimento endotelial vascular/fator de permeabilidade vascular(VEGF/VPK), fator de crescimento-α de transformação (TGF-α), fator alfa denecrose de tumor (TNF-α), angiogenina, interleucina 3 (IL-3), interleucina 8(IL-8), fator de crescimento endotelial derivado de plaquetas (PD- BCGF),fator de crescimento placentário (PIGF), fator de crescimento derivado deplaquetas midkine BB (FDGF), fractalkina;

(s) proteínas de estresse (proteínas de choque térmico);(t) proteínas envolvidas no transporte Fe; e(u) vitaminas, por exemplo B12, Biotina.

Em outro aspecto, a invenção provê uma composiçãofarmacêutica compreendendo uma quantidade efetiva do anticorpo ou umaporção de ligação de antígeno do mesmo de acordo com à presente invenção,junto com um ou mais dentre excipiente ou diluente farmaceuticamenteaceitável.

Um "excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável"inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos,agentes anti-bacterianos e anti-fungicos, agentes isotônicos e de retardo deabsorção, e outros, que são fisiologicamente compatíveis. Os exemplos deveículos farmaceuticamente aceitáveis incluem um ou mais dentre água,solução salina, solução salina tamponada com fosfato, dextrose, glicerol,etanol, e outros, assim como suas combinações. Em muitos casos, prefere-seinclui agentes isotônicos, por exemplo açúcares, polialcoóis, como manitol,sorbitol, ou cloreto de sódio na composição.

O termo "quantidade efetiva" refere-se a uma quantidade deum anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo (incluindocomposições farmacêuticas compreendendo o anticorpo ou uma porção deligação de antígeno do mesmo) suficiente para tratar ou melhorar uma doençaespecífica ou distúrbio ou um ou mais dos sintomas e/ou para evitar oureduzir a ocorrência da doença ou distúrbio.

O termo "quantidade diagnosticamente efetiva" ou quantidadesefetivas para diagnóstico" e cognatos dos mesmos, refere-se a uma quantidadede um anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo (incluindocomposições farmacêuticas compreendendo o anticorpo ou uma porção deligação de antígeno do mesmo) suficientes para diagnosticar uma doença oudistúrbio específico e/ou uma ou mais de suas manifestações, onde odiagnóstico inclui a identificação da existência da doença ou distúrbio e/oudetecção da extensão ou severidade da doença ou distúrbio. Com freqüência,o diagnóstico será realizado com referência a uma linha de base ou nível dedetecção de antecedentes observado para indivíduos sem a doença oudistúrbio. Os níveis de detecção acima dos níveis de fundo ou de linha de base(níveis elevados de detecção) são indicativos da presença e, em alguns casos,da severidade da condição.

Quando usado com relação aos métodos de tratamento e o usodo anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo (incluindo ascomposições farmacêuticas compreendendo o anticorpo ou uma porção deligação de antígeno do mesmo), um indivíduo em "necessidade do mesmo"pode ser um indivíduo que foi diagnosticado com ou previamente tratado paraa doença ou distúrbio a ser tratada. Com relação aos métodos de diagnóstico,um indivíduo "em necessidade do mesmo" pode ser um indivíduo que sesuspeita tenha uma doença ou distúrbio, está em risco para uma doença oudistúrbio, ou foi previamente diagnosticado com a doença ou distúrbio (porexemplo diagnóstico pode incluir monitoração da severidade (por exemploprogressão/regressão) da doença ou distúrbio com o tempo e/ou em conjuntocom terapia.

Prefere-se que o anticorpo ou uma porção de ligação deantígeno do mesmo bloqueie ou estimule os receptores a funcionar ouneutralizar os produtos ativos, como uma ou mais de interleucinas, TNF a, ouC5a. Mais preferivelmente, o produto solúvel ativo é TNF-α humano.

A composição pode ter várias formas, incluindo formas dedosagem líquida, semi-sólida ou sólida, como soluções líquidas (por exemplosoluções injetáveis e infundíveis), dispersões ou suspensões, comprimidos,pílulas, pós, lipossomas ou supositórios. Preferivelmente, a composição estána forma de uma solução injetável para imunização. A e administração podeser intravenosa, subcutânea, intraperitoneal, intramuscular, transdermal,intratecal, e intraarterial. Preferivelmente a forma de dosagem está na faixa decerca de 0,001 mg a cerca de 10 mg/kg de peso corporal administradadiariamente, semanalmente, bi- ou tri- semanalmente, mensalmente, maispreferivelmente de cerca de 0,05 a cerca de 5 mg/kg peso do corposemanalmente.

A composição também pode ser formulada como um póestéril, para a preparação de soluções injetáveis estéreis.

Em algumas formas de realização, o composto ativo pode serpreparado com um veículo que irá proteger o composto contra liberaçãorápida, como formulação de liberação controlada, incluindo implantes,curativos transdérmicos, e sistemas de liberação microencapsulados. Ospolímeros compatíveis podem ser usados como etileno acetato de vinila,polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres ou ácidopoliláctico.

A composição também pode ser formulada para administraçãooral. Nesta forma de realização, o anticorpo pode ser encerrado em umacápsula de gelatina de envoltório duro ou mole, comprimida em comprimidos,ou incorporada diretamente na dieta do indivíduo.A composição também pode ser formulada para administraçãoretal.

O anticorpo pode ser administrado a fim de ligar e identificarcélulas selecionadas in vitro e in vivo para ligar e destruir as célulasselecionadas in vivo, ou a fim de penetrar em e destruir as célulasselecionadas in vivo. Alternativamente, o anticorpo pode ser usado como umaimunotoxina para liberar um agente citotóxico, por exemplo uma toxina ouagente quimio-terapêutico a um tipo de célula em particular, por exemplo umacélula de tumor. A produção de imunotoxinas pode ser familiar para oversado na arte.

Na forma de realização preferida, a composição é administradaa um humano.

A presente invenção também provê o uso de um anticorpo ouuma porção de ligação de antígeno do mesmo em uma aplicação diagnosticapara detectar um antígeno associado com uma doença ou distúrbio particular.

Mais particularmente, a invenção provê o uso do anticorpo ouuma porção de ligação de antígeno do mesmo em um método paradiagnosticar um indivíduo tendo um antígeno associado com uma doença oudistúrbio particular, compreendendo a administração ao referido indivíduo deuma quantidade diagnosticamente efetiva de um anticorpo, uma porção deligação de antígeno do mesmo ou composição farmacêutica, como aquidescrito, de acordo com o terceiro aspecto. Preferivelmente o indivíduo é umhumano.

O anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo,preferivelmente rotulado, pode ser usado para detectar a presença de umantígeno, ou níveis elevados de um antígeno (por exemplo TNF-α) em umaamostra biológica, como soro ou plasma usando um imunoteste convencional,como um teste imunossorvente ligado a enzima (ELISA), um radioimunoteste(RIA) ou imuno-histoquímica de tecido.Preferivelmente, o antígeno ao qual o anticorpo quimérico ouporção de ligação de antígeno do mesmo liga, é um peptídeo, proteína,carboidrato, glicoproteína, lipídeo ou glicolipídeo na natureza, selecionadodentre um antígeno associado com tumor incluindo antígenocarcinoembriônico, receptores de EpCAM, Lewis-Y, Lewis- Y/b, PMSA,CD20, CD30, CD33, CD38, CD52, CD154, EGF-R, Her-2, TRAIL e VEGF,um antígeno envolvido em uma doença ou distúrbio imune inflamatória ouincluindo CD3, CD4, CD25, CD40, CD49d, MHC classe I, MHC classe II,GM- CSF, interferon-γ, IL-I, IL- 12, IL-13, IL-23, TNF-α, e IgR, um antígenoexpressado em uma célula hospedeira incluindo glicoproteína Ilb/IIIa, P-glicoproteína, receptores purinérgicos e receptores de adesão incluindoCDl la, CDllb, CD 11c, CD 18, CD56, CD58, CD62 ou CD144, umantígeno compreendendo uma citocina, quimiocina, fator de crescimento ououtro modulador fisiológico solúvel ou um receptor do mesmo incluindoeotaxina, IL-6, IL-8, TGF-β, C3a, C5a, VEGF, NGF e seus receptores, umantígeno envolvido nas doenças ou distúrbios do sistema nervoso centralincluindo β-amilóide e prions, um antígeno de origem não humana comoantígenos microbianos, nanobiais ou virais ou toxinas incluindo proteína F devírus sincicial respiratório, toxina de antrax, veneno de cascavel e digoxina;em que o anticorpo quimérico atua como um agonista ou antagonista ou éativo ou para depletar (matar ou eliminar) células indesejadas (por exemploanti-CD4) atuando com complemento, ou células exterminadoras (porexemplo células NK) ou é ativa como um agente citotóxico ou para causarligação de receptor Fc por um fagócito ou neutraliza atividade biológica deseu alvo.

O anticorpo TNF-α anti-humano ou porção de ligação deantígeno do mesmo de acordo com a invenção também pode ser usado emaplicações de cultura de células onde se deseja inibir a atividade de TNF-α.

A presente invenção também provê um método para tratar umadoença ou distúrbio caracterizada por atividade de TNF-α humano em umindivíduo humano, compreendendo a administração ao indivíduo emnecessidade do mesmo de um anticorpo, uma porção de ligação de antígenodo mesmo, ou uma composição farmacêutica, como aqui descrito, de acordocom a presente invenção em que o anticorpo ou uma porção de ligação deantígeno do mesmo liga TNF-a.

O termo "doença ou distúrbio caracterizada por atividade deTNF-α humano" como usado aqui se destina incluir doenças ou distúrbios emque a presença de TNF-α em um indivíduo sofrendo da doença ou distúrbiofoi mostrada ou se suspeita está sendo ou responsável por ou envolvida napatofisiologia da doença ou distúrbio ou um fator que contribui para a piorada doença ou distúrbio. Conseqüentemente, uma doença ou distúrbio em quea atividade de TNF-α é prejudicial é uma doença ou distúrbio em que ainibição da atividade de TNF-α é esperada como aliviando os sintomas e/ou aprogressão da doença ou distúrbio. Estas doenças ou distúrbios podem serevidenciados, por exemplo, por um aumento na concentração de TNF-α emum fluido biológico em um indivíduo sofrendo da doença ou distúrbio (porexemplo um aumento na concentração de TNF-α no soro, plasma, fluidosinovial, etc do indivíduo), que pode ser detectada, por exemplo, usando umanticorpo da invenção específico para TNF-α.

Uma doença ou distúrbio caracterizada por atividade de TNF-αhumano se destina a incluir doenças ou distúrbios em que a presença de TNF-α em um indivíduo sofrendo da doença ou distúrbio foi mostrada como sendo,ou que se suspeita seja, ou responsável pela patofisiologia da doença oudistúrbio ou um fator que contribui para a piora da doença ou distúrbio.Preferivelmente a doença ou distúrbio caracterizada por atividade de TNF-αhumano é selecionada dentre o grupo consistindo de sepsia, incluindo choqueséptico, choque endotóxico, sepsia gram negativa, e síndrome de choquetóxico, doença autoimune, incluindo artrite reumatóide, espondilitereumatóide, osteoartrite, psoríase e artrite de gota, alergia, esclerose múltipla,diabete autoimune, uveíte autoimune e síndrome nefrótica, doença infecciosa,incluindo febre e mialgias devido a infecção e caquexia secundária a infecção,doença de enxerto versus hospedeiro, crescimento de tumor ou metástase,doença pulmonar incluindo síndrome de falta de ar do adulto, pulmão dechoque, doença inflamatória pulmonar crônica, sarcoidose pulmonar, fibrosee silicose pulmonar, doença inflamatória intestinal, incluindo doença deCrohn e colite ulcerativa, doença cardíaca, doença de osso inflamatória,hepatite, distúrbios da coagulação, queimaduras, dano de reperfusão,formação de quelóides e formação de tecido de cicatrizes.

Os compostos ativos suplementares podem ser incorporados nacomposição. O anticorpo ou fragmento de ligação ao anticorpo podem ser co-formulados com e/ou administrados simultaneamente, separadamente ouseqüencialmente, com um ou mais agentes terapêuticos adicionais porexemplo anticorpos que ligam a outros alvos como citocinas ou moléculas desuperfície celular ou alternativamente um ou mais agentes químicos queinibem a produção de TNF-α humano ou atividade.

Em outro aspecto, a invenção provê um kit compreendendouma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo ou uma porção deligação de antígeno da invenção, ou uma composição farmacêuticacompreendendo uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo ouuma porção de ligação de antígeno do mesmo, junto com embalagem einstruções para uso. Em algumas formas de realização, as instruções para usoincluem instruções de como administrar efetivamente uma quantidadeterapêutica do anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno da invenção.

Em todo o relatório, a palavra "compreender" ou variaçõescomo "compreende" ou "compreendendo" será entendida como implicando ainclusão de um elemento, número ou etapa, ou grupo de elementos, númerosou etapas, descritos mas não a exclusão de qualquer outro elemento, númeroou etapa, ou grupo de elementos, números ou etapas.

Todas as publicações mencionadas neste relatório são aquiincorporadas por referência. Qualquer discussão de documentos, atos,materiais, dispositivos, artigos ou semelhantes que podem ser incluídos nopresente relatório é apenas para o fim de prover um contexto para a presenteinvenção. Não deve ser tomado como uma admissão de que qualquer uma outodas estas matérias formam parte da base da arte anterior ou são deconhecimento geral comum no campo relevante à presente invenção, comoela existia na Austrália ou em outra parte antes da data de prioridade de cadareivindicação neste pedido.

A fim de que a natureza da presente invenção seja maisclaramente entendida, as suas formas preferidas serão agora descritas comreferência aos seguintes exemplos não limitativos.

EXEMPLO 1

Fusão de região variável de sagüi para uma região constante humanaMateriais e métodos

Síntese de genes e clonagem

A cadeia Vh (número de acesso AAM 54057, SEQ ID NO: 1)de anticorpo derivado de sagüi específico para MOG foi expressada com umaregião constante humana (domínios de cadeia pesada IgGl humana Ch 1,gancho, CH2 e CH3 (como número de acesso NCBI PO1857) (SEQ ID NO: 2).Isto foi obtido por retro-tradução da seqüência de aminoácido em umaseqüência de DNA que foi otimizada por expressão de células de mamíferousando tecnologia Gene Optimizer e sintetizadas de novo por um conjunto deoligonucleotídeos sintéticos (GeneArt, Alemanha). Durante a otimização daseqüência de DNA, os sítios de enzima de restrição específicos Asc I e Tth IIIIforam incluídos para permitir uma manipulação futura da região Vh- Após asíntese de genes, a seqüência completa incluindo uma seqüência Kozak foiclonada no sítio de clonagem múltiplo do vetor acessório pEE6.4 GS (LonzaBiologies). A cadeia Vl (Número de acesso: A AM54058, SEQ ID NO: 3) doanticorpo derivado de sagüi específico de MOG foi expressado com umaregião constante de cadeia leve Capa humana (como NCBI número de acessoAAA58989) (SEQ ID NO: 4). DNA codificando a seqüência de aminoácidode cadeia leve (VL- Capa) foi preparado como descrito acima para a cadeiapesada. Durante a otimização da seqüência de DNA e síntese dos sítios deenzima de restrição Bsi WIIRsr II foram incluídos para permitir amanipulação futura da região Vl . Após a síntese do gene, toda a seqüênciaincluindo a seqüência Kozak foi clonada no sítio de clonagem múltipla dovetor de expressão

pEE12.4 GS (Lonza Biologies). Para a expressão estável dedois vetores de genes únicos (pEE6.4-Vli-IgGI e pEE12.4-VL Capa) foramcombinados em um de gene duplo. Isto foi feito por digestão da estruturadorsal pEE6.4 do cassete de expressão de cadeia pesada (promotor hCM V-MIE, seqüência Kozak, Vh de sagüi, região constante humana e sítio S V40polyA) usando Not I e Bam HI.O resultante fragmento foi subclonadousando sítios Not I e BamH 1 no vetor pEEI2.4-VL-Capa a jusante do cassetede expressão de cadeia leve (promotor hCMV-MTE, seqüência Kozak, Vl desagüi, região constante Capa humana e sítio SV40 polyA) criando um vetorexpressando tanto as cadeias pesada como leve de AB 138 (SEQ ID Nos: 5 e6).

Transfecção

Para cada transfecção, 175μ1 de Lipofectamine 2000 foramadicionado a 5 mL de meio Optimem (Invitrogen Cat Nos. 11668-027 e31985-062) em uma cavidade de placas de 6 cavidades, Em uma segundacavidade, 70 μΐ de vetor de expressão (70 μg) foram adicionados a 5 mL demeio Optimem I. Após 5 min de incubação em temperatura ambiente, osconteúdos das duas cavidades foram misturados juntos e deixados por mais 20min de incubação. Após esta segunda incubação, toda a mistura detransfecção foi adicionada a um frasco de cultura de tecido T175 contendo ascélulas CHOKl SV. As células foram incubadas durante 72 a 96 h esobrenadantes coletados. Os sobrenadantes foram centrifugados a 4.000 χ gdurante 5 min para pelotizar os resíduos celulares, e foram esterilizados emfiltro através de um filtro de cartucho de 0,22 μηι.

Purificação de anticorpos

O sobrenadante foi passado sobre uma coluna de proteína AHiTrap (Amersham Biosciences, no. de cat. 17-0492-01) três vezes em umataxa de fluxo de 1 mL/min. A coluna foi então lavada com20 mM fosfato desódio durante 40 min a 1 mL/min. O anticorpo foi eluído com 0,1 M ácidocítrico pH 3,5 com frações coletadas e imediatamente neutralizadas com IMTris-HCl pH 9,0. As amostras de anticorpo foram então dessalinizadas emuma coluna PD-10 (Amersham Biosciences, no. de cat. 17-0851-01). Aanálise do anticorpo por SDS- PAGE e HPLC de exclusão de tamanhoconfirmaram o peso molecular correto, presença de anticorpo montado econcentração do anticorpo.

Análise Western blot

A capacidade de AB138 de reter a ligação do antígeno deM26, MOG de rato glicoproteína de oligodendrócitos - mielina) foiinvestigada por Western Blot. 130 mg de medula de rato (IMVS, Austrália)foram homogenizados em 1.8 ml de reagente de Iise de células CeLLytic M((SIGMA, C2978) e incubados durante 30 minutes a 4°C. Outrahomogeneização foi realizada passando o lisado através de uma agulha 1/2calibre 27 várias vezes seguido por centrifugação a 4°C e 13.000 g durante 30min. A pelota e sobrenadantes foram diluídos em tampão de amostra SDS-PAGE (125 mM Tris-HCl pH 6,8, 5% SDS, 0,25% azul de bromofenol, 25%glicerol). Junto com isto, 200 μΐ de células CHOKlSV a 1 χ 10 6 célulasviáveis por ml foram giradas a 13.000 χ g a 4°C durante 1 min e recolocadasem suspensão em 200 μΐ de reagente de Iise de células CelLytic M (SIGMA).Após centrifugação a 4°C e 13.000 χ g durante 30 min, o sobrenadante foimisturado com quantidade apropriada de tampão de amostra SDS-PAGE.Todas as amostras, junto com uma amostra de marcadores de peso molecular,foram cicladas em um gel pré-moldado Novez a 4-20%. (InvitrogenAustrália) durante 2 h a 120 V. As proteínas foram então transferidas paraPVDF (BioRad, Austrália), usando um aparelho de western blot em tampão 1X tris-glicina com 20% metanol (BioRad Cat 161 + 0771) a 4 0C a 250 mAdurante 2 horas. A membrana foi então bloqueada por incubação com 5%leite desnatado, em pó, em PBS durante 1 h em temperatura ambiente. Amembrana foi então lavada com 1 X PBS três vezes seguido por umaincubação durante a noite a 4 0C, com AB138 em PBS a 10 μg/mL. Apóslavagem, a membrana foi incubada com conjugado HRP IgG (μ+L) anti-humano de cabra (Sigma Austrália) diluído 1: 5.000 em 1 χ PBS durante lhatemperatura ambiente. Após lavar, o anticorpo ligado foi detectado usando osistema de análise Western Blotting ECL ((Amersham Biosciences, no. decat. RPN 2109). Uma experiência paralela foi realizada em que ABI38 foisubstituído com um anticorpo de controle negativo de especificidadeirrelevante correspondente com isótipo (anticorpo monoclonal anti-TNFa) afim de identificar quaisquer eventos de ligação não específica.

Resultados

Após a expressão e purificação de proteínas com sucesso, aanálise western blot foi realizada em AB138 para determinar se ela retinhaafinidade de ligação para MOG de rato. AB138 ligou uma proteína comtamanho aproximado de 25 kDa presente no lisado depurado de medulaespinhal de rato, uma proteína não presente em lisado CHOKISV depurado(figura 3). O anticorpo de controle negativo não liga a proteína presente emambos os lisados indicando a interação entre AB138 e a proteína de tamanhode 25 kDa não foi devido ao artefato ou a eventos de ligação não específicosassociados com a região constante humana (figura 2). Esta proteínacorresponde ao tamanho esperado de MOG de rato menos a seqüência desinal (24,9 kDa). Este resultado indica que AB138 reteve a afinidade paraMOG de rato presente no lisado de medula espinhal do rato e demonstra queum anticorpo de fusão de sagüi humano pode reter a capacidade de ligação deantígeno.

Será notado por alguns versados na arte que MOG de ratopode ser produzido usando tecnologia de DNA recombinante e a capacidadede ABI38 de ligar MOG de rato determinada em testes de ligação comoELISA ou análise Biacore.

EXEMPLO 2

Engenharia de anticorpo monoclonal1. Terminologia

Uma seqüência de doador é definida como uma seqüência deimunoglobulina derivada de uma espécie diferente da de um primata do NovoMundo.

Uma seqüência de receptor é definida como uma seqüênciade imunoglobulina derivada de um primata do Novo Mundo.

Um resíduo comum é um resíduo que é comum (por exemplo> 30%) a uma dada posição de aminoácido quando determinada porcomparação com seqüências de imunoglobulina disponíveis para uma espécie.

Um resíduo incomum é um resíduo que é incomum (porexemplo < 30%) em uma dada posição de aminoácido quando determinado porcomparação com as seqüências de imunoglobulina disponíveis para uma espécie.

Engenharia é o processo de transferência de aspectosde ligação estruturais de uma seqüência de doador em uma seqüência dereceptor como que os aspectos de ligação estrutural mantém sua atividade deligação.

Um aminoácido de estrutura é definido como umaminoácido localizado em uma região variável de anticorpo mas nãolocalizado em um CDR.

2. Abreviaturas

CDR região de determinação de complementaridade, MOGmielina/oligodendrócito glicoproteína TNF-α fator de necrose de tumor - alfa,Vh cadeia pesada variável, Vl cadeia leve variável, BSA albumina de sorobovino.

3. Processo de engenharia

A. Produção de um anticorpo monoclonal (diferente de umanticorpo monoclonal de primata do Novo Mundo).

B. Seleção de uma seqüência de imunoglobulina de receptorderivada de primata do Novo Mundo, com base na homologia de seqüência deaminoácido elevada e imunogenicidade baixa previstas.

C. Identificação das CDRs para tanto as seqüências deimunoglobulina de doador como de receptor de acordo com o sistema denumeração de Kabat (ver "Sequences of Proteins of Immunological Interest"E. Kabat et al., U.S. Department of Health and Human Services, 1983).

D. Determinação das diferenças na seqüência de estrutura poralinhamento de seqüências de doador e receptor.

E. Previsão de estrutura de imunoglobulina de doador pormodelagem tri-dimensional e determinação de proximidade das diferenças deseqüência de estrutura com relação às CDRs. A substituição opcional deresíduos de receptor com resíduos de doador de acordo com os critérios desubstituição 1 e 2 (abaixo).

F. Substituição das seqüências de CDR de receptor completascom seqüências de CDR de doador completas.

G. Determinação de resíduos comuns por comparação daseqüência de aminoácido de estrutura doador/ receptor com a linhagemgerminal e seqüências de estrutura de imunoglobulina de receptor disponíveis.A substituição opcional de resíduos de receptor com resíduos de doador deacordo com os critérios de substituição 3 e 4 (abaixo).

H. Produção de anticorpo quimérico com regiões variáveis dereceptor e regiões constantes humanas.

I. Expressão de proteína de imunoglobulina engenheirada.

J. Análise de teste de proteína de imunoglobulinaengenheirada.

Critérios de substituição:

Na geração de um anticorpo engenheirado com base emdiferenças nas seqüências de estrutura, as substituições de um aminoácidoreceptor com o aminoácido doador correspondente podem ser feitas emposições que estão dentro dos seguintes critérios.

(i) se o resíduo do doador é previsto como sendo capaz deinteragir com o antígeno com base em uma modelagem tri-dimensional

(ii) se o resíduo do doador é determinado como estando em 3,2Â das CDRs do doador com base em modelagem tri-dimensional,

(iii) se o resíduo do doador é comum em espécies de receptorde seqüências de imunoglobulina,

(iv) se o resíduo do doador é incomum na linhagem germinaldo doador.

O anticorpo engenheirado é previsto para ser nãoimunogênico ou de baixa imunogenicidade em humanos por seleção deseqüências de receptor apropriadas com base em homologia de seqüênciade aminoácido com seqüências humanas equivalentes e baixaimunogenicidade prevista. O anticorpo engenheirado irá ligar ao antígenoda imunoglobulina do doador com uma afinidade de ligação similar para aimunoglobulina do doador. A afinidade de ligação do anticorpoengenheirado pode ainda aumentar por métodos de maturação porafinidade (R. A. Irving et al Journal of Immunological Methods, 248, 31-45 (2001)).A ENGENHARIA DO ANTICORPO DE MURINOS AB164 PARA DARANTICORPO AB197

4. Seqüências de imunoglobulina do doador

A produção de um hibridoma de murinos secretando um5 anticorpo monoclonal AB164 contra TNF-α humano foi produzida usandotecnologia de hibridoma e serviu como as seqüências de imunoglobulina dodoador (SEQ ID Nos: 7 e 8).

5. Seleção de seqüências de imunoglobulina do receptor

A seqüência de anticorpo monoclonal contra MOG de rato10 (mielina/oligodendrócitos glicoproteína) foi obtida de PubMed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) e foi usada como a seqüência do recetpOro.Este monoclonal anticorpo foi derivado de um sagüi comum (sagüi de orelhascom tufos brancos) (Callithrix jacchus), um primata do Novo Mundo. Asregiões de estrutura da cadeia Vh (Número de acesso: AAM54057,15 SEQ ID NO: 1) e a cadeia Vl (Número de acesso: AAM54058, SEQ ID No:3) foram examinadas para sua imunogenicidade prevista em humanospelo programa de previsão de ligação de MHC classe II Propred(http://www.imtech.res.in/raghava/propred) usando uma análise de valor delimiar de 1% de todos os alelos. Uma análise BLAST da seqüência, excluindo20 as CDRs, da cadeia Vh (Número de acesso: AAM54057, SEQ TD NO: 1) eda cadeia Vl (Número de acesso: AAM54058, SEQ ID No: 3) doanticorpo específica MOG identificou a seqüência de cadeia pesada dehomólogo humano mais próximo (Número de acesso AAH19337.1 ; SEQ IDNO: 9) e a cadeia de seqüência leve (Número de acesso: BAC53922.1 ; SEQ25 ID NO: 10).

Notavelmente, esta análise de previsão indica que a regiãovariável de estrutura de cadeia pesada do receptor selecionada éprovavelmente menos imunogênica que seu equivalente humano. A regiãovariável de cadeia pesada do receptor tem um peptídeo na estrutura,LRPEDTAVY, que é previsto para ligar MHC classe II, codificado por alelosDRB1_0101, DRBl O 102, DRBl _ 0309, enquanto a cadeia pesada dehomólogo humano mais próximo tem três peptídeos, na estrutura, que foramprevistos para ligar a MHC classe II. Isto incluía o peptídeo WVRQAPGQGLque é prevista para ligar MHC classe 11 codificado por alelos DRBl _ 0101,DRB1_0102 e DRB1 0309; o peptídeo VYMELTS que é previsto para ligarclasse MHC II codificado por alelos DRBl _ 0401, DRBl _ 0408,DRBl 0421, DRB1_0426, DRBMIOl, DRBl _ 1128, DRB 1_ 1305; e opeptídeo LRSEDTAVY, que é previsto para ligar MHC classe II codificadopelos alelos DRB 1_ 0401, DRB 1_ 0421, DRB 1_ 0426.

A região variável de estrutura de cadeia leve específica deMOG e o homólogo humano mais próximo foram previstos como sendo nãoimunogênicos.

6. Identificação de CDRs nas regiões variáveis doador/ receptor

Usando as regras de Kabat (Ver " Sequences of Proteins ofImmunological Interest" E. Kabat el ai., U.S. Department of Health andHuman Services, 1983) os CDRs foram determinados para as cadeias Vh e Vlde AB 164 (SEQ ID Nos: 7 e 8 respectivamente) e para as cadeias Vh e Vl daimunoglobulina específica MOG de sagüi (SEQ ID No: 1 e 3 respectivamente(Tabela 1).

Cadeia SEQ ID NO: CDR-I CDR-2 CDR-3Vii 1 26-35 50-66 99-107Vh 7 26-35 50-66 99-108Vl 3 24-38 54-60 93-101Vl 8 24-34 50-56 89-97

Tabela 1: Posições de aminoácido para as cadeias CDRs de Vh e Vl deAB164 (SEQ ID Nos: 7 e 8) e imunoglobulina específica de MOG (SEQID Nos: 1 e 3)

7. Alinhamento de seqüências de doador e receptorAlinhamento de cadeia Vh

As seqüências de aminoácidos para as cadeias Vh de AB 164 eimunoglobulina específica de MOG (SEO ID Nos; 7 e 1) foram alinhadas(Figura 3). O número de resíduos diferente por um com um aminoácido extralocalizado na CDR3 da cadeia Vh de imunoglobulina específica de MOG.Identidade de seqüência entre as duas seqüências é 63,6 %. As seqüências deaminoácidos das CDRs diferem como esperado dadas as diferentesespecificidades dos antígenos dos anticorpos do doador e do receptor.

Existem 22 diferenças de aminoácidos entre as seqüências nas regiões deestrutura.

Alinhamento de cadeia Vl

As seqüências de aminoácidos para as cadeias Vl de AB164 e imunoglobulina específica de MOG (SEO ID Nos; 8 e 3) foramalinhadas (Figura 4). O número de resíduos diferente por quatroaminoácido adicionais localizados na CDRl de AB164. Identidade deseqüência entre as duas seqüências é 62,3 %. As seqüências deaminoácidos das CDRs diferem como esperado dadas as diferentesespecificidades dos antígenos dos anticorpos do doador e do receptor.

Existem 23 diferenças de aminoácidos entre as seqüências nas regiões deestrutura.

8. Modelagem tri-dimensional prevista das cadeias Vh e Vl de AB164

Usando o software de modelagem de previsão tri-dimensional SWISS-PROT e Deep View (http://swissmodel.expasy.org/)um modelo tri-dimensional das cadeias Vh e Vl de AB164 foideterminado. As CDRs foram identificadas. As diferenças deaminoácidos entre as seqüências de doador e receptor na região deestrutura, como determinado por alinhamento previamente descrito,foram identificadas e uma previsão feita em sua proximidade para asCDRs (tabelas 3 e 4).

9. Substituição de CDRs de receptor com CDRs de doador

As CDRs das cadeias Vh e Vl de imunoglobulina específicade MOG foram substituídas com CDRs de cadeias Vh e Vl de AB164 (Tabela 2).

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Tabela 2: A substituição das CDRs da seqüência de receptor

(imunoglobulina específica de MOG) com as CDRs da seqüência dedoador (AB164)

10. Determinação de resíduos comuns na linhagem germinal de murinos eseqüências Ig de sagüi e seleção de seqüência de estrutura engenheiradaCadeia Vh

O alinhamento da linhagem germinal de murinos das regiõesVh pode ser encontrado emhttp://www.ibt.unam.inx/vir/vh mice directory.html#GL

As seqüências Vh de sagüi podem ser obtidas dehttp://www.ncbi.nhn nih.gov/entrez/query.fegi?dh=Protein&itool-toolbarpesquisando para todas as seqüências de aminoácidos Vh de Callithrixjacchus e alinhando estas seqüências usando ferramentas de alinhamento osresíduos comuns em tanto as linhagens germinais de murinos como asseqüências de Callithrix jacchus disponíveis, foram determinados em cadaposição de aminoácido onde uma diferença em aminoácidos na seqüência deestrutura entre a seqüência de doador e receptor ocorreu (tabela 3)

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Tabela 3 : Diferenças de estrutura Vh na seqüência de doador/ receptor,sua proximidade para as CDRs e seus resíduos comuns relativos nasespécies de doador/ receptor.

Uma determinação dos resíduos comuns em cada posição emlinhagem germinal de murinos respectiva e as seqüências Yh de sagüidisponíveis foi realizada. Em posições selecionadas que atendem aos critériosparticulares, o aminoácido do receptor foi substituído com um aminoácido dedoador e o número destes critérios é dado:

1. se o resíduo do doador for previsto capaz de interagir com oantígeno com base em modelagem tri-dimensional;

2. se o resíduo do doador for determinado para estar em 3,2 Âdas CDRs do doador com base em modelagem tri-dimensional,

3. se o resíduo do doador for um resíduo comum nasseqüências de imunoglobulina da espécie do receptor,

4. se o resíduo do doador for incomum na linhagem germinaldo doador.

Em posições que não atendem aos critérios, a seqüência dereceptor foi usado e os critérios relacionados como SEM.Nota. Resíduos incomuns são sombreados em cinza e assubstituições estão em negrito. *A linhagem germinal de murinos não contémdados de seqüência na posição 113 e como tal a seqüência de sagüi foi usadaaqui.

Em resumo, se tem 8 substituições de aminoácidos de estruturaem que a seqüência do receptor foi substituída com a seqüência do doador. Setem quatro aminoácidos em que a seqüência do receptor foi substituída com aseqüência do doador porque o resíduo do doador foi determinado comoestando em 3,2 Â das CDRs do doador, com base em modelagem tri-dimensional. Duas substituições de aminoácidos foram feitas porque osresíduos do doador foram previstos capazes de interagir com o antígenoestando localizado na volta de um laço que está em proximidade íntima(apesar de não menos do que 3,2 Â) com CDR-2. Além disso, duassubstituições de aminoácidos foram feitas porque o resíduo do doador foiverificado ser comum com as seqüências de imunoglobulina da espécie doreceptor disponível. Uma outra mudança também pode ser feita na posição97.

Cadeia Vl

O alinhamento da linhagem germinal de murinos das regiõesVl pode ser encontrada em

http://www.ibt.unam.mx/vir/vk mice directory.html#GLvk

As seqüências Vl de sagüi podem ser obtidas dehttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Protein&itool=toolbar

pesquisando para todas as seqüências de aminoácidos deCallithrix jacchus e alinhando estas seqüências. Usando ferramentas dealinhamento os resíduos comuns em tanto as linhagens germinais de murinoscomo as seqüências de imunoglobulina de sagüi disponíveis, foramdeterminados em cada posição de aminoácido relativa a diferenças emaminoácidos na seqüência de estrutura entre a seqüência de doador e receptorocorreu (tabela 4)

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Tabela 4 : Diferenças de estrutura Vl na seqüência de doador/ receptor,sua proximidade para as CDRs e seus resíduos comuns relativos nasespécies de doador/ receptor.

Uma determinação dos resíduos comuns em cada posição emlinhagem germinal de murinos respectiva e as seqüências Vl de sagüidisponíveis foi realizada. Em cada posição, os critérios para selecionardiferenças em seqüência de estrutura dada acima foram aplicados. Em umaposição que atendia um critério particular, o aminoácido do receptor foisubstituído com um aminoácido de doador e o número destes critérios é dado:

1. se o resíduo do doador for previsto capaz de interagir com oantígeno com base em modelagem tri-dimensional;

2. se o resíduo do doador for determinado para estar em 3,2 Âdas CDRs do doador com base em modelagem tri-dimensional,3. se o resíduo do doador for um resíduo comum nasseqüências de imunoglobulina da espécie do receptor,

4. se o resíduo do doador for incomum na linhagem germinaldo doador.

Em posições que não atendem aos critérios, a seqüência dereceptor foi usada e os critérios relacionados como SEM.

Nota. Resíduos incomuns são sombreados em cinza e assubstituições estão em negrito. *A linhagem germinal de murinos não contémdados de seqüência na posição 104 e seguintes e como tal a seqüência desagüi foi usada aqui.

Em resumo, se tem 1 substituição de aminoácido de estruturaem que a seqüência do receptor foi substituída com a seqüência do doadorcomo o resíduo do doador foi determinado para estar em 3,2 Â das CDRs dodoador, com base em modelagem tri-dimensional.

MATERIAIS E MÉTODOS

O hibridoma AB 164 foi gerado por fusão de esplenócitos decamundongos imunizados com TNF- α humano com a linhagem de células demieloma SP2/0-Agl4 por métodos padrões (Fazekas de St. Groth, S., el al.Journal of Immunological Methods 35: 1-21 (1980); Sugasawara, R., Journalof Tissue Culture Methods 12: 93-95 (1989)).

11. Seqüenciamento de anticorpo monoclonal AB164

RNA total (tRNA) foi extraído de células viáveisusando colunas RNeasy Mini ou Midi (QIAgen) de acordo com asinstruções do fabricante. Após quantificação, o tRNA foi usado como umgabarito para a síntese de cDNA de primeiro filamento usando um iniciadoroligo (dT) e Superscript II Reverse Transcriptase (Invitrogen) de acordo comas instruções do fabricante. Finalmente, o tRNA foi degradado usando RNaseHeo cDNA de filamento único restante etiquetado com uma cauda poly-Gusando transferase terminal e dGTP (Roche).As reações PCR foram realizadas usando Herculase(Stratagene), uma mistura de polimerase de alta fidelidade. Em cada caso,um oligo (dC) foi usado como o iniciador dianteiro com uma cadeia pesadaIgGi específica ou um iniciador reversos específico de cadeia leve Capa.

Após 30 ciclos, as reações PCR foram incubadas na presença de Taqpolimerase para adicionar bases A penduradas. O produto PCR resultantefoi então clonado em pGemT-Easy (Promega) e transformado em células E.coli Top 10 competentes (Invitrogen). Os plasmídeos foram extraídos decultura noturna de colunas únicas QIAquick Miniprep (QIAgen) equantificado. 100 a 500 ng foram misturados em duplicata com <5,4pmolde iniciador ou pUC3 dianteiro ou pUC3 reverso e submetidos a umseqüenciamento de ciclo usando química BigDye v3.1 (AppliedBiosystems). Eletroforetogramas foram resolvidos em analisador de DNAABI PRISM 3700 e seguindo o alinhamento de seqüências derivadas, acorreção pelo manual de chamada de bases aberrantes foi realizada. Umavez obtidas quatro seqüências de correspondência (2 dianteiras e 2reversas) uma seqüência da região variável de anticorpos foi confirmada.

Estas seqüências foram então traduzidas em seqüências de aminoácidospara as cadeias pesada e leve de f AB 164 (SEQ ID NOS: 7 e 8).12. Criação de AB138 (quimeras de região variável derivado de sagüiespecífico de MOG - região constante humana e AB103 (quimeras de regiãovariável de murinos anti-TNF α - região constante humana)

A região Vh (Número de acesso: AAM54057, SEQ ID No: 1)da seqüência de receptor foi expressada com uma região constante humana(cadeia pesada de IgGl humano Ch 1, gancho, domínios CH2 e CH3 (comoNCBI número de acesso PO 1.857) (SEQ ID No:2), A região Vl (Número deacesso: AAM54058, SEQ ID No: 3) da seqüência de receptor foi expressadacom um domínio constante de cadeia leve capa humano (como NCBI númerode acesso AAA58989) (SEQ ID No:4), O resultante anticorpo quimérico foidesignado AB 138 (SEQ ID Nos: 5 e 6). Este anticorpo foi usado como umgabarito em que alterações nas cadeias Vh e VL, foram feitas.

As regiões Vh e Vl do AB 164 (SEQ ID No: 7 e 8)completamente murino foram expressados com as mesmas regiões constanteshumanas, como descrito acima. Este anticorpo quimérico recebeu adesignação AB 103.

Clonagem de AB103

As regiões Vh e Vl de AB 164 (SEQ ID No: 7 e 8)completamente murino foram retro-traduzidas em seqüências de DNA queforam otimizadas para expressão de células de mamíferos usando tecnologiaGeneOptimizer, e sintetizados de novo por montagem de oligonucleotídeossintéticos (GeneArt, Alemanha). Para o gene VH, cada seqüência foiflanqueada na terminação 5' com um sítio Ase I, uma seqüência Kozak(GCCACC) e uma seqüência líder IgG gama humana (seqüência deaminoácido MEWSWVFLFFLSVTTGVHS). Na terminação 3', a seqüênciade DNA foi manipulada para introduzir um sítio de enzima de restrição TthIllI sem comprometer a seqüência de aminoácido requerida. Para o gene VL,cada seqüência foi flanqueada pela terminação 5' com um sítio Bsi WI, umaseqüência Kozak (GCCACC) e uma seqüência líder capa humana (seqüênciade aminoácido MSVPTQVLGLLLLWLTDARDC). Na terminação 3', aseqüência de DNA foi manipulada para introduzir um sítio de enzima derestrição Rsr II sem comprometer a seqüência de aminoácido requerida. Apósa síntese de novo, a região variável foi provida clonada em um vetorpCRScript (Stratagene) e foram ligadas por digestão de Asc HTth IllI e BsiWI/Rsr II para as seqüências Vh e Vl respectivamente. As seqüênciasliberadas foram ligadas em estruturas de vetor de gene único derivadas dosvetores criados para expressar AB138 preparado por Asc VTth IllI paradigestão PEE6.4-Vh- IgG1 e Bsi WI/Rsr para PEE12.4 - Vl Capa.

Cada gene foi ligado na estrutura preparada usando o sistemade ligação de DNA LigaFast Rapid de Promega (Cat. No. M8221). Asligações foram então transformadas em One Shot Top 10 (célulasquimicamente competentes (Invitrogen Cat. NO. C4040-03) e colôniaspositivas identificadas por técnicas padrões. Um vetor de gene duplo paraexpressão estável foi preparado como descrito acima (exemplo 1). Grandesquantidades de vetores resultantes foram preparadas por midiprep de culturasnoturnas usando colunas midiprep QIafilter (QIAgen no. Cat. 12243). Osvetores foram preparados para transfecção por precipitação de 20 μg em100% etanol com volume 1/10 de acetato de sódio 3M (pH 5,2). Sigma nos.Cat. E7023- 500 ML e S2889, respectivamente). Após uma lavagem em 70%etanol, os vetores foram recolocados em suspensão em 40 μΐ de T.E. pH 8,0(Sigma, No. de Cat. T9285- 100ML) a uma concentração de trabalho de 0,5Hg/ μΐ.

13. Criação de anticorpo monoclonal engenheirado ABI 97

Usando a imunoglobulina específica de MOG como umaseqüência de receptor e substituindo as CDRs e resíduos nominados naestrutura com as da seqüência de doador (AB164), as seqüências de anticorpoVh e Vl engenheiradas foram determinadas. Estas seqüências de proteína deregião variável foram expressadas com regiões constantes humanas (SEQ IDNos: 2 e 4). O anticorpo engenheirado resultante foi designado AB197 (SEQED Nos: 11 e 12).

A Tabela 5 descreve a origem da espécie das CDRs, estruturaVH/VL e as regiões constantes para cada anticorpo.

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Tabela 5 - Origem de espécies das CDRs, estrutura Vh/Vl e as regiõesconstantes para AB138, AB164, AB197, AB103Clonagem de AB197

Ao substituir as CDRs e resíduos nominados na estrutura daseqüência de receptor com os da seqüência de doador, as seqüências deanticorpo Vh e Vl engenheiradas foram determinadas (SEQ ID NO: 11 e 12).

A seqüência de anticorpo foi retro-traduzida em seqüências de DNA esintetizado de novo por montagem de oligonucleotídeos sintéticos (GeneArt,Alemanha). Durante a síntese, os sítios de enzima de restrição relevantesforam incorporados na seqüência para permitir a clonagem a geração de vetorde gene duplo expressando AB197 como previamente descrito (exemplo 1).

14. Expressão de AB 103, AB197 e AB164Transfeccão de AB 103 e AB197

Para cada transfecção, 175μ1 de Lipofectamine 2000 foramadicionado a 5 mL de meio Optimem (Invitrogen Cat Nos. 11668-027 e31985-062) em uma cavidade de placas de 6 cavidades, Em uma segundacavidade, 70 μΐ de vetor de expressão (70 μg) foram adicionados a 5 mL demeio Optimem I. Após 5 min de incubação em temperatura ambiente, osconteúdos das duas cavidades foram misturados juntos e deixados por mais 20min de incubação. Após esta segunda incubação, toda a mistura detransfecção foi adicionada a um frasco de cultura de tecido Tl 75 contendo ascélulas CHOKl SV. As células foram incubadas durante 72 a 96 h esobrenadantes coletados. Os sobrenadantes foram centrifugados a 4.000 χ gdurante 5 min para pelotizar os resíduos celulares, e foram esterilizados emfiltro através de um filtro de cartucho de 0,22 μιη.

Produção de anticorpo monoclonal murino AB164

As células de hibridoma expressando AB164 foram cultivadasusando métodos de cultura de tecido padrões e o sobrenadante coletado ecentrifugado a 4.000 χ g durante 5 minutos para pelotizar os resíduoscelulares seguido por esterilização no filtro através de filtros de cartucho de0,22 μιη.Purificação de anticorpos de AB103, AB1097 e AB164

O sobrenadante foi passado sobre uma coluna de proteína AHiTrap (Amersham Biosciences, no. de cat. 17-0492-01) três vezes em umataxa de fluxo de 1 mL/min. A coluna foi então lavada com 20 mM fosfato desódio durante 40 min a 1 mL/min. O anticorpo foi eluído com 0,1 M ácidocítrico pH 3,5 com frações coletadas e imediatamente neutralizadas com IMTris-HCl pH 9,0. As amostras de anticorpo foram então dessalinizadas emuma coluna PD-10 (Amersham Biosciences, no. de cat. 17-0851-01). Aanálise do anticorpo por SDS- PAGE e HPLC de exclusão de tamanhoconfirmaram o peso molecular correto, presença de anticorpo montado econcentração do anticorpo.

15. Métodos de ligação por afinidade

Métodos ELISA

TNF-α (Peprotech Cat No: 300-01A) foi diluído em 1 μg/mLem tampão de revestimento de carbono (10 mM fosfato de dissódio, 20 mMhidrogeno-fosfato de sódio pH 9,6). 100 pL of desta solução foramadicionadas a cada cavidade de uma placa de 96 cavidade e incubados a 4 0C,durante a noite em um recipiente umedecido. A placa foi então lavada trêsvezes com tampão de lavagem (0,0IM PBS pH 7,2, 0,05% Tween-20) e entãotrês vezes com 0,01 M PBS pH 7,2. As cavidades foram então bloqueadas poradição de 200 μί de tampão de bloqueio (1% pv BSA em 0,01 M PBS pH7,2) para cada cavidade e incubando a placa a 25 0C em um recipienteumedecido durante 1 hora. O anticorpo foi diluído em diluente de anticorpo(1% p/v BSA, 0,05% Tween-20 em 0,01 M PBS -pH 7,2) suficiente paragerar uma curva de titulação cobrindo as faixas de 6,00 μg/mL a 0,0578ng/mL. As cavidades foram incubadas com anticorpo durante 1 hora a 25 0C .A placa foi então lavada como previamente descrito. 100 μΕ de conjugadoAnti-IgG K + L anticorpo HRP (Zymed, Cat No: 81-71200) a 1:2000 emdiluente de anticorpo foi usada para detectar os AB 197 e AB 103 ligados.100 μί de conjugado HRP anticorpo de imunoglobulina anti-murino (Dako,Cat No: P0260) a 1:2000 em diluente de anticorpo foi usado para detectarAB164 ligado. As cavidades com diluente de anticorpo foram somente usadaspara medir a absorbância de fundo. Após a incubação a 25°C, em umrecipiente umedecido, durante 1 hora, a placa foi lavada novamente comopreviamente descrito. 100 μΐ. de solução de substrato TMB (Zymed, Cat No:00-2023) foram adicionados a cada cavidade e a cor deixada revelar durante 4min. 100 μΐ, de IM HCI foram adicionados para terminar a reação derevelação de cor e a absorbância foi determinada a 450 nm (referência 620nm).

Resultados ELISA

ELISA foi usado para comparar a ligação de AB164, AB 197 eAB103 a TNF-α revestido em fase sólida. A partir destes resultados, todos osanticorpos mostraram uma forte ligação para TNF-α com todos os valoresEC50 menores ou iguais a 0,68 μg/ml (Figura 5, Tabela 6). A substituição deuma região constante de murinos (AB164) com região de IgGi constantehumano (AB103) não diminui de modo significante a afinidade de ligaçãocomo pode ser visto por comparação dos perfis de ligação dos anticorposAB164 e AB103. A engenharia de AB164 para dar AB197 não resultou emqualquer perda significante de ligação de TNF-α, como pode ser visto porcomparação dos perfis de ligação dos anticorpos AB164 e AB197 (figura 5).

<table>table see original document page 59</column></row><table>

Tabela 6

Método de teste de neutralização de citotoxicidade de TNF-qusando células vivas (teste de neutralização L-929)

As células L929 (ATCC no. CCL-1) foram cultivadas emRPMI 1640 (Invitrogen Cat. No. 21870) (Invitrogen Cat No: 21870- 076)contendo 10% soro bovino fetal, 50 μg/mL Penicilina/estreptomicina (SigmaCat No: Ρ0781), 2 mM L-glutamina (Invitrogen Cat No: 25030-081) e 10 μΜ2- mercaptoetanol (Invitrogen Cat No: 21985-023) até as células alcançaremum nível de confluência de 70 %. Em cada cavidade de uma placa de culturade 96 cavidades, 50 uL de meio foram adicionados.

Para investigar a citotoxicidade de TNF-α em células L929, 50μΐ, of TNF-α de solução de trabalho por cavidade (30 ng/mL) foramadicionados à primeira coluna da placa em triplicata com diluições em sériesemi-log realizadas através da placa alcançando uma concentração final de 9fg/mL. As cavidades de controle com 50 μΐ de meio sem TNF-α foramtambém preparadas (V = 100%). A todas as cavidades, 50 μΐ. de células L929a 5 χ IO"5 células/mL foram adicionados. Outras cavidades de controletambém foram preparadas contendo 100 μί de meio sem células adicionaisou TNF-α (fundo). Para todas as cavidades, Actinomicina D (Sigma Cat. No.Al410) a 40 μg/ mL foi adicionada.

Para investigar a neutralização por anticorposengenheirados contra TNF-α, um teste de neutralização foi realizado. 23μΕ de anticorpo a 10 μg/mL foram adicionados à primeira coluna de umaplaca separada em triplicata e diluições Iog em série foram realizadasatravés da placa alcançando uma concentração final de 30,4 pg/mL. Aestas cavidades, 50 μί, de células L-929 a 5 χ IO"5 células /mL foiadicionado. Mais 25 μΐ. de actinomicina D foram adicionados a todas ascavidades.

Todas as placas foram incubadas a 37 0C com 5% CO2 durante20 h. Após incubação, 25 uL de reagente MATERIAIS PES Cell Titer 96AQuous One Solution (Promega Cat. No. G358B) foram adicionados a todas ascavidades e incubados durante 2 h a 37 0C. A absorbância foi lida a 492 nm(ref 630 nm) usando uma leitora de placa ELISA. A absorbância média detodos os tratamentos em replicata foi subtraída da absorbância média decavidades de controle sem células e sem TNF (fundo). A partir disto, a % deviabilidade de células L-929 foi calculada como:

<formula>formula see original document page 61</formula>

Resultados de tese de citotoxicidade neutralização TNF-ausando composição vivas (teste de neutralização L-929)AB164, AB197 e AB103 foram capazes de neutralizar acitotoxicidade induzida por TNF-α (fig 6, tabela 7).

<table>table see original document page 61</column></row><table>

Tabela 7

Será apreciado pelos versados na arte que numerosas variaçõese/ou modificações podem ser feitas na invenção como mostrado nas formasde realização específicas sem sair do espírito e escopo da invenção comoamplamente descrita. As presentes formas de realização são, assim,consideradas em todos os aspectos como ilustrativas e não restritivas.LISTAGEM DA SEQÜÊNCIA

<110> Peptech Limited<120> Anticorpos Engenheirados<130>. WJP 03 1403 8979<1.40> PCT<141> 2006-00-15<160> 1?.<170> PatentTn version 3.3<210> 1<211 > 118<212> PRT<213> Callithrix jacchus<400> 1

Gly Ala15

Ser Tyr

Trp Mct

T.ys Phe

Ala Tyr80

Tyr Cys195

Gln Gly

Thr Leu Val Thr Val Ser115

Gln Val Gln Leu Vel Gln Ser Gly Ala Clu Val Lys X,ys Pro15 10

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly 'IYr Thr Pho Thr20 25 30

Ala Tle Ser Trp Ala Arg Gln Pro Pro Gly Gln Gly Leu tílu35 40 45

Gly Ala Phe Aap Pro Glu Tyr Gly Ser Thr Thr Tyr Ala GlnbO 5b 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr65 70 75

Met Glu Leu Ser Ser T,eu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr85 90

Ala Arg Asp Val Asn Phe Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly100 105 110

<210> 2

<211> 330

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Lcu Ala Pro Ser Ser Lys15 10 15

Sor Thr Ser CIly Gly Thr Ala Ala Leu Gly C.'ys T,eu Val Lys Asp Tyr20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser35 40 (15

Cily Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Sor Gly Leu Tyr Ser50 55 60

Leu Ser Ser. Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr65 VO 75 60

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys1.00 105 11.0

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lye Thr Lys. Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

Ι-Ιϊ s Gln Asp Trp T.eu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn195 200 205

Lys Ala T,eu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu225 230 235 240Lou Thr I,ys Asn Gln Val Ser Leu TJtir Cys Iieu Val Lys Cly Pho Tyr

245 2b0 255

Pro Ser Asp Ilc Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phc Phe275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Lcu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glti Gly Asn290 295 300

Vai. Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Lqu His Asn 7Tis Tyr Thr305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Scr T,eu Ser Pro Gly Lys325 330

<210> 3<2:ll> 1.08<212> PRT

<213> Callibhrlx jacchus<400> 3

Glu T.eu Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Lcu Ser Leu Ser Pro Gly15 10 15

Glu Arg Ala Thr Val Scr Cys Arg Ala Gly Gln Ser Val Ser Tyr Tyr20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 Λ 0 45

Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60

Sar Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Trp Pro Pro85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile T.ys Arcr100 105<21.0> Λ

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Thr Val Ala Ala Pro Scr Val Pho Tlc Pho Pro Pro Scr Λπρ Clu Gln1 5 10 15

Leu Lys Ser Gly Thr Ma Rer Val Val Cya Leu Leu Asn Asn Phe Tyr20 25 30

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser35 40 45

Gly Aisn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr50 55 60

Tyr Scr Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys65 70 75 80

Hia Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro85 90 95

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys100 105

<210> 5

<211> 449

<2.12> PRT

<213> Artificial

<220>

<2 2 3 > Seqüência de cadeia pesada AB138

<400> 5

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Clu Val Lys Lys Pro Gly Ala15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30

•Ala Ile Ser Trp Ala Arg Gln Pro Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45

Gly Ala Phe Asp Pro Glu Tyr Gly Ser Thr Thr Tyr Ala Gln Lys Phe50 55 60Oln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Scr Thr Ala Tyr65 70 75 80

üet Glu Leu Ser Ser Lcu ftrg Pro Glu Asp Thr Ala Val T.yr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Aap Val Asn Phq Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110

Thr E.eu Val Thr Val Ser Ssr Ala Ser Thr Iys Asn Pro Asp Val Phe115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu130 1.35 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Tiir Vai. Ser Trp145 150 155 160

Asn Ser Oly Ala Leu Thr Ser Gly Val Hls Thr Phe Pro Ala Val T ,eu165 170 175

Cln Ser Ser Gly l<eu Tyr Ser Leu Snr Ser Val Val Thr Val Pro Ser180 185 1.90

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn Hi s Lys Pro195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro I.ys Ser Cya Asp T,ys210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro cVIu Leu Leu Gly Gly Pro22b 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Tjeu Met Ile Scr245 250 2b5

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser ITis Glu Asp260 26b 270

Pro Glu Val r.ys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn275 280 285

Ala T.ys Thr Lys Pro Arg Glu Gla Gln .Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val290 295 300Val Sar Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Cly Lys Glu305 3Ί.0 315 320

Tyr- Lys Cys T,ys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala fro lie Glu T,ys325 330 335

Thr IIg Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr340 345 350

Leu Pro Pro $cr Arg Aep Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser beu Thr355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu370 375 380

Ser Asn Gly G^n Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val T.eu385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phc Phc T.eu Tyr Ser Tiys Leu Thr Val Asp Lys405 410 415

Scr Axg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu420 425 430

Ala Leu His Asn IUs Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly435 '440 445

Lys

<210> 6

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial

<220> .

<223> Seqüência de cadeia leve AB138

<400> 6

Glu T.eu Val Met Tlir Gln Ser Pro Ala Thr Leu Sor Leu Ser Pro Gly15 10 15

Glu Artj Ala Thr Val Ser Cys Arg Ala Gly Gln Ser Val Ser Tyr Tyr20 25 30TiCju Ala Ττ-ρ Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Prp Arg Τ,eu T.eu Ile35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 GO

Scr Arg Scr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser T.eu Glu Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Trp Pro Pro85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr bys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala100 105 110

Pro Scr Val Phc Tle Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly115 120 125

Thr Ala Ser VaI Val Cya Leu Leu A3n Asn Phe Tyz- Pro Arg Glu Ala130 135 140

Lys Val Gln Trp Lya Val Asp Aan Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln145 150 155 160

Gl u-Scr Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser165 170 175

Ser Ttir Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lyn Val Tyr180 185 190

Ala CyH Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys210

<21.0> 7

<211> 117

<212> PRT

<213> Mug imjsculus

<400> 7

GIn VaI Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr1 5 10 15Ser Val T.ys Val Ser Cys Lya Ala Sor Gly Tyr Ala Phe Thr Aan Tyr20 25 30

Leu Ilo Glu Trp Val Lys Gln Arg Prp Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ilc35 40 45

Gly Val Xlc Apri Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Pho50 55 60

Lya Asp Lvs Ala Thr Tieu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Fhe Cys85 90 95

Val Arg Asp Tyr Gly Tyr Asp Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110

Ser Val Thr Val Ser115

<210> 8

<211> 114

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 8

Asp Xle Val Lcu Thr Gln Ser Pro Ala Ser T.eu Ala Val Ser Leu Gly1 5 10 ' 15

Cln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Sor Thr Ser20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Met TTis Trp Tyr Gln Gln T.ys Pro Gly Gln Pro Pro35 40 45

Lys T.eu T.-eu Ile Tyr Leu Ala Scr Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Th.r Asp Phe Thr Leu Aân Ile íris65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser ArgOb . 90 95Glu Lou Pro T,cu Thr Phc ΟΠγ Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Ara100 105 110

Thr Val

<210> 9

<211> 118

<212> PRT

<213> ITomo sapieng

<400> 9

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Glv Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phc.Thr Asn Tyr20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Cln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Scr Thr Asp Tyr Ala Gln Asn Phe50 bb 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Sor Thr Ser Thr Val Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Thr Scr Lou Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cyc85 90 95

Ala Arg Ile Gly Val His Asp Tyr Trp Gly Gln Cly Thr Gln Val Thr100 IOS 110

Val Ser Ser Ala Ser Thr115

<210> 1.0

<211> 110

<212> PRT

<21.3> IIomo sapiens

<400> 10

Glu Xle Val Mot Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Oly15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Cln Ser Val Asn Asn Tyr20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Ser Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ilc Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Sor Gly Thr Asp Phe Thr Jbeu Thr Ile Ser Ser Lea Glu Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Gly Asn Trp Pro His 85 90 95

Thr Pho Gly Gln Gly Thr Lys Leu Clu Tlo Lys Àrg Thr Val 100 105 110

<210> 11

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificia'

<220>

<223> Seqüência de cadeia pesada AB197 <400> 11

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15

Ser Val i.ys Val Ser Cya Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr 20 25 30

Teu Ile Glu Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly GIn Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Val Ilc Asn Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60

Tys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Scr Sor Thr Ala Tyr65 70 75 80

Mct Glu Leu Ser Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr AIa Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Asp Tyr Gly Tyr Asp Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln GIy Thr 100 105 110Iieu Val Thr Val Ser115

<210> 12

<211> 114

<212> PRT

<21.3> Artificial

<22ü>

<2 2 3> Seqüência de cadeia leve AB197

<400> 12

Ol-u T.eu Val Met Thr Gln Scr Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15

Glu Arçj Ala Thr Val Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro35 40 45

Arg Lcu T .ou Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Lcu Clu Ser Gly Val Pro Ala50 bb GO

Axg Phe Sier Cly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Scr Arg8b 90 95

Glu Leu Pro l.eu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu QI.ta Ile Lys Arg100 IOb 110

Thr Val

Claims (33)

1. Anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno do mesmotendo uma região variável, caracterizado pelo fato de compreender pelomenos duas regiões de determinação da complementaridade (CDRs) e pelomenos três regiões de estrutura, em que as regiões de estrutura são, ou sãoderivadas de regiões de estrutura de primata do Novo Mundo, e em que pelomenos um dos CDRs é uma CDR de primata não pertencendo ao NovoMundo.

2. Anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno do mesmode acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a regiãovariável compreende três CDRs e quatro regiões de estrutura.

3. Anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno do mesmode acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado pelo fatode que a região variável compreende pelo menos uma seqüência de CDR demurinos.

4. Anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno do mesmode acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fatode que a região variável compreende pelo menos uma seqüência de CDR decamundongo.

5. Anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno do mesmode acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fatode que a região variável compreende pelo menos uma seqüência de CDR derato.

6. Anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno do mesmode acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fatode que a região variável compreende pelo menos uma seqüência de CDRhumana.

7. Anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno do mesmode acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fatode que a região variável compreende pelo menos uma seqüência de CDRsintética.

8. Anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno do mesmode acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fatode que a região variável compreende pelo menos uma seqüência de CDR decoelho.

9. Anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno do mesmode acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fatode que a região variável compreende uma combinação de CDRs de fontesdiferentes.

10. Anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno domesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizadopelo fato de que a região variável compreende 3 seqüências CDR de murinos.

11. Anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno domesmo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que as 3seqüências CDR de murinos são seqüências CDR de camundongo.

12. Anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno domesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizadopelo fato de que a região variável compreende 3 seqüências CDR humanas.

13. Anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno domesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizadopelo fato de que a região variável compreende 4 seqüências de estrutura deprimata do Novo Mundo.

14. Anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno domesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizadopelo fato de que a região variável compreende 4 regiões de estrutura em queas regiões de estrutura são derivadas de regiões de estrutura de primata doNovo Mundo.

15. Anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno domesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14 caracterizadopelo fato de que a porção de ligação de antígeno é um anticorpo de domínio.

16. Anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno domesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizadopelo fato de que o anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno aindacompreende uma seqüência de região constante de um humano ou primata doVelho Mundo não humano.

17. Anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno domesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16 caracterizadopelo fato de que as regiões de estrutura de primata do Novo Mundo são de umprimata do Novo Mundo selecionado dentre o grupo consistindo de sagüis,sagüis-de-coleira, macaco-de-cheiro, macaco titi, macaco aranha, macacobarrigudo, macaco capuchin, uakaris, sakis, macaco da noite e o macacoguariba.

18. Anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno domesmo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que oprimata do Novo Mundo é um sagüi.

19. Anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno de acordocom qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que oanticorpo ou uma porção de ligação de antígeno liga a um antígeno que épeptídeo, proteína, carboidrato, glicoproteína, lipídeo ou glicolipídeo nanatureza, selecionado dentre um antígeno associado com tumor incluindoantígeno carcinoembriônico, receptores EpCAM, Lewis-Y, Uwis-Y/b, PMSA,CD20, CD30, CD33, CD38, CD52, CD154, EGF- R, Her-2, TRAIL e VBGF,um antígeno envolvido em uma doença ou distúrbio imune ou inflamatórioincluindo CD3, CD4, CD25, CD40, CD49d, classe MHC I, classe MHC IT,GM-CSF, interferon-γ, IL-I, EL-12, IL-13, IL-23, TNF-α, e IgE, um antígenoexpressado em uma célula hospedeira incluindo glicoproteína Ub/Nfa, P-glicoproteína, receptores purinérgicos e receptores de adesão incluindo CDlia, CD 11b, CD 11c, CD18, CD56, CD58, CD62 ou CD144, um antígenocompreendendo uma citocina, quimiocina, fator de crescimento ou outromodulador fisiológico solúvel ou um receptor do mesmo incluindo eotaxina,IL-6, IL-8, TGF-β, C3a, C5a, VEGF, NGF e seus receptores, um antígenoenvolvido no sistema nervoso central, doenças ou distúrbios incluindo β-amilóide e prions, um antígeno de origem não humana como antígenosmicrobianos, nanobiais ou virais ou toxinas incluindo proteína F de vírussincicial respiratório, toxina de antrax, veneno de cascavel e digoxina; em queo anticorpo quimérico atua como um agonista ou antagonista ou é ativo paraou depletar (matar ou eliminar) células indesejadas (por exemplo anti-CD4)atuando com complemento, ou células exterminadoras (por exemplo célulasNK) ou é ativo como um agente citotóxico ou para causar ligação do receptorFc por um fagócito ou neutraliza atividade biológica de seu alvo.

20.Anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno domesmo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que oantígeno é TNF-α humano.

21.Anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno domesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizadopelo fato de que a seqüência de pelo menos uma região de estrutura émodificada para aumentar a ligação.

22.Anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno domesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizadopelo fato de que a seqüência de pelo menos uma região de estrutura émodificada para diminuir imunogenicidade prevista em humanos.

23. Kit, caracterizado pelo fato de compreender um anticorpoou uma porção de ligação de antígeno do mesmo como definido em qualqueruma das reivindicações 1 a 22, ou uma composição farmacêutica do mesmo,acondicionamento e instruções para uso.

24. Anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno domesmo, o anticorpo sendo de primata, caracterizado pelo fato de que liga aum antígeno de superfície de célula ou uma citocina em que o anticorpo ouuma porção de ligação do antígeno do mesmo, compreende uma regiãovariável compreendendo pelo menos duas regiões de determinação dacomplementaridade (CDRs) e pelo menos três regiões de estrutura, em que osCDRs são selecionados de modo que o anticorpo ou uma porção de ligação deantígeno liga ao antígeno de superfície de célula ou à citocina.

25. Anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno domesmo, o anticorpo sendo de primata de acordo com a reivindicação 24,caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou uma porção de ligação deantígeno do mesmo liga a um antígeno de superfície de célula selecionadodentre o grupo consistindo de CD3, CD20, CD33, EGF-R, Her-2 e CD25.

26. Anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno domesmo, o anticorpo sendo de primata de acordo com a reivindicação 24,caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou uma porção de ligação deantígeno do mesmo liga a TNF-α ou VEGF.

27. Anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno domesmo, o anticorpo sendo do Novo Mundo designado de acordo comqualquer uma das reivindicações 24 a 26, caracterizado pelo fato de que aporção de ligação de antígeno é um anticorpo de domínio.

28. Anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno domesmo, o anticorpo sendo do Novo Mundo designado de acordo comqualquer uma das reivindicações 24 a 27, caracterizado pelo fato de que oanticorpo ou uma porção de ligação de antígeno ainda compreende umaseqüência de região constante de um humano ou primata do Velho Mundonão humano.

29. Anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno domesmo, o anticorpo sendo do Novo Mundo designado de acordo comqualquer uma das reivindicações 24 a 28, caracterizado pelo fato de que oprimata do Novo Mundo é selecionado dentre o grupo consistindo de sagüis,sagüis-de-coleira, macaco-de-cheiro, macaco titi, macaco aranha, macacobarrigudo, macaco capuchin, uakaris, sakis, macaco da noite e o macacoguariba.

30. Anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno domesmo, o anticorpo sendo do Novo Mundo designado de acordo com areivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o primata do Novo Mundo éum sagüi.

31. Anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno domesmo, o anticorpo sendo do Novo Mundo designado de acordo comqualquer uma das reivindicações 24 a 30, caracterizado pelo fato de que aseqüência de pelo menos uma região de estrutura é modificada para aumentara ligação.

32. Anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno domesmo, o anticorpo sendo do Novo Mundo designado de acordo comqualquer uma das reivindicações 24 a 31, caracterizado pelo fato de que aseqüência de pelo menos uma região de estrutura é modificada para diminuira imunogenicidade prevista em humanos.

33. Kit, caracterizado pelo fato de compreender um anticorpodo Novo Mundo designado ou uma porção de ligação de antígeno do mesmocomo definida em qualquer uma das reivindicações 24 a 32, ou umacomposição farmacêutica do mesmo, acondicionamento e instruções para uso.