BRPI0615049A2 - processo para a preparação de conjugados de medicamento purificado - Google Patents

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Yong Dai
Yong Wang
Shengjin Jin
Deborah H Meshulam
Godfrey W Amphlett
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Immunogen Inc
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Abstract

PROCESSO PARA A PREPARAçAO DE CONJUGADOS DE MEDICAMENTO PURIFICADO A invenção fornece um processo para a preparação de um agente de ligação a célula quimicamente unido a um medicamento. O processo compreende a ligação de forma covalente de um ligante a um agente de ligação a célula, uma etapa de purificação, conjugação de um medicamento ao agente de ligação a célula e uma etapa de purificação subseqúente.

Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE CONJUGADOS DE MEDICAMENTO
PURIFICADOCAMPO DA INVENÇÃO
Esta invenção pertence a um processo para a preparaçãode conjugados de pureza e estabilidade substancialmenteelevadas, em que os conjugados compreendem um agente deligação celular quimicamente unido a um fármaco.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
O tratamento de câncer progrediu significativamentecom o desenvolvimento de substâncias farmacêuticas que sedirecionam eficientemente e matam células cancerosas. Paraessa finalidade, os pesquisadores se beneficiaram dosreceptores e antígenos da superfície celular expressosseletivamente por células cancerosas para o desenvolvimentode fármacos que se baseiam em anticorpos que se ligam aantígenos com especificidade tumoral ou associados atumores. A esse respeito, moléculas, citotóxicas como, porexemplo, toxinas de bactérias e de plantas, radionuclídeos,e certos fármacos quimioterápicos, foram ligadasquimicamente a anticorpos monoclonais que se ligam aantígenos de superfície celular com especificidade tumoralou associados a tumores (veja, por exemplo, Pedidos dePatente Internacional WO 00/02587, WO 02/060955 e WO02/092127, Patentes U.S. 5.475.092, 6.340.701 e 6.171.586,Publicação do Pedido de Patente U.S. N0 2003/0004210 Al, eGhetie e cols., J. Immunol. Methods, 112: 267-277 (1988)).Tais compostos são tipicamente denominados toxinas,radionuclídeos e "conjugados" de fármacos, respectivamente.Freqüentemente, eles também são denominadosimunoconjugados, radioimunoconjugados e imunotoxinas. Amorte da célula tumoral ocorre mediante a ligação doconjugado de fármaco a uma célula tumoral e liberação e/ouativação da atividade citotóxica do fármaco. A seletividadegerada pelos conjugados de fármacos minimiza a toxicidadepara as células normais aumentando, dessa forma, atolerabilidade do fármaco no paciente.
Processos para a conjugação de anticorpos a agentescitotóxicos contendo sulfidril como, por exemplo,maitansinóides, foram descritos previamente (veja, porexemplo, Patentes U.S. 5.208.020, 5.416.064 e 6.441.163).
Por exemplo, as Patentes U.S. 5.208.020 e 5.416.064 revelamum processo para a fabricação de conjugados anticorpo-maitansinóide, em que o anticorpo inicialmente é modificadocom um reagente heterobifuncional, como descritos nasPatentes U.S. 4.149.003, 4.563.304 e na Publicação doPedido de Patente U.S. N0 2004/0241174 Al. As Patentes U.S.5.208.020 e 5.416.064 ainda descrevem a conjugação de umanticorpo modificado com um excesso de um agente citotóxicocontendo sulfidril em pH 7, seguido por purificação emcolunas de cromatografia Sephadex™ G25. A purificação deconjugados de anticorpo-fármaco por cromatografia porexclusão de tamanho (SEC) também foi descrita (veja, porexemplo, Liu e cols., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93:8.618-8.623 (1996), e Chari e cols., Câncer Research, 52:127-131 (1992)).
Os processos que foram descritos previamente para afabricação dos conjugados de anticorpo-fármaco sãocomplexos, pois são sobrecarregados com etapas que são derealização trabalhosa ou que produzem imunoconjugados quesão menos puros ou menos estáveis do que os otimamentedesejados. Por exemplo, a conjugação em um pH entre 6,0 e6,5 não é ótima para a produção de conjugados puros eestáveis. Além disso, a reações de conjugação sob essascondições são geralmente lentas e ineficientes, levando ànecessidade de um tempo excessivo e grande uso de material.
Seria desejável modificar ou eliminar uma ou maisetapas de fabricação, sem comprometer a qualidade doproduto, por exemplo, sua pureza e/ou estabilidade. Seriaainda desejável ter opções de purificação adicionais alémdaquelas que foram até hoje descritas na medida em quealgumas opções serão mais eficazes com certas combinaçõesde agentes de ligação celular, ligantes e fármacos, do quecom outras.
Tendo em vista o que foi apresentado anteriormente, háuma necessidade na técnica do desenvolvimento de métodosaperfeiçoados de preparação de composições de conjugado deagente de ligação celular-fármaco que sejam de purezasubstancialmente elevada e, ao mesmo tempo, possuam umaestabilidade maior. A invenção fornece um método dessetipo. Essas e outras vantagens da invenção, bem comocaracterísticas adicionais da invenção, ficarão evidentes apartir da descrição da invenção aqui fornecida.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A invenção fornece um processo para a preparação de umconjugado de pureza e estabilidade substancialmenteelevadas que compreende um agente de ligação celularquimicamente unido a um fármaco. 0 processo compreende: (a)o contato de um agente de ligação celular com um reagentede entrecruzamento bifuncional para anexar de formacovalente um ligante ao agente de ligação celular e dessaforma preparar uma primeira mistura que compreende osagentes de ligação celular que têm ligantes ligados a eles,(b) submissão da primeira mistura à filtração de fluxotangencial, cromatografia adsortiva, filtração adsortiva,precipitação seletiva, ou combinação destas e, dessa forma,preparar uma primeira mistura purificada de agentes deligação celular que têm ligantes ligados a eles, (c)conjugação de um fármaco aos agentes de ligação celular quetêm ligantes ligados a eles na primeira mistura purificadapor reação dos agentes de ligação celular que têm ligantesligados a eles com um fármaco em uma solução que tem um pHde cerca de 4 a cerca de 9, para preparar uma segundamistura que compreende: (i) agente de ligação celularquimicamente unido através do ligante ao fármaco, (ii)fármaco livre, e (iii) subprodutos da reação, e (d)submissão da segunda mistura à filtração de fluxotangencial, cromatografia adsortiva, filtração adsortiva,precipitação seletiva, ou combinação destas, para purificaros agentes de ligação celular quimicamente unidos atravésdos ligantes ao fármaco dos outros componentes da segundamistura e, dessa forma, preparar uma segunda misturapurificada.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A invenção fornece um processo para a preparação deconjugados de agente de ligação celular-fármaco de pureza eestabilidade substancialmente elevadas. Essas composiçõespodem ser usadas para o tratamento de doenças por causa dapureza e estabilidade elevadas dos conjugados. Composiçõesque compreendem um agente de ligação celular como, porexemplo, um anticorpo, quimicamente unido a um fármacocomo, por exemplo, maitansinóide, são descritas, porexemplo, na Publicação do Pedido de Patente U.S. Nc2004/0241174 Al. Nesse contexto, pureza substancialmenteelevada é considerada como sendo: (a) maior que 90%,preferivelmente maior que 95%, das espécies conjugadas sãomonoméricas e/ou (b) o nível de fármaco livre na preparaçãode conjugado é de menos de 2% (em relação ao fármacototal).
A esse respeito, o processo da invenção compreende:
(a) a modificação do agente de ligação celular com umreagente de entrecruzamento bifuncional para anexar deforma covalente um ligante ao agente de ligação celular e,dessa forma, preparar uma primeira mistura que compreendeos agentes de ligação celular que têm ligantes ligados aeles, (b) submissão da primeira mistura à filtração defluxo tangencial, cromatografia adsortiva, filtraçãoadsortiva, precipitação seletiva, ou combinações destas,para purificar os agentes de ligação celular que têmligantes ligados a eles dos outros componentes da primeiramistura e, dessa forma, preparar uma primeira misturapurificada de agentes de ligação celular que têm ligantesligados a eles, (c) conjugação de um fármaco aos agentes deligação celular que têm ligantes ligados a eles na primeiramistura purificada, por reação dos agentes de ligaçãocelular que têm ligantes ligados a eles com o fármaco, emuma solução que tem um pH de cerca de 4 a cerca de 9, parapreparar uma segunda mistura que compreende: (i) agente deligação celular quimicamente unido através do ligante aofármaco, (ii) fármaco livre, e (iii) subprodutos da reação,e (d) submissão da segunda mistura à filtração de fluxotangencial, cromatografia adsortiva, filtração adsortiva,precipitação seletiva, ou combinação destas, para a remoçãodos fármacos não conjugados, reagentes e subprodutos, bemcomo para se obter conjugados substancialmente purificadosde agente de ligação celular-fármaco. Opcionalmente, oprocesso da invenção ainda compreende manter a misturaentre pelo menos uma das etapas a-b, etapas b-c e/ou etapasc-d para liberar os ligantes instavelmente ligados doagente de ligação a célula.
Preferivelmente, utiliza-se filtração de fluxotangencial (TFF, também conhecida como filtração de fluxocruzado, ultrafiltração e diafiltração) e/ou resinas decromatografia adsortiva nas etapas de purificação. Noentanto, quando se usa TFF na primeira etapa de purificação(etapa b), na (etapa c) , é utilizada uma conjugação em pHde 6,0-6,5, e uma resina de cromatografia adsortiva éutilizada na segunda etapa de purificação (etapa d),preferindo-se que a resina de cromatografia adsortiva nãoseja uma resina de troca iônica. Em outras modalidadespreferidas, TFF é utilizada em ambas as etapas depurificação, ou resinas de cromatografia adsortiva sãoutilizadas em ambas as etapas de purificação.
Alternativamente, uma resina de cromatografia adsortiva éutilizada na primeira etapa de purificação e TFF éutilizada na segunda etapa de purificação. Também pode serutilizada uma combinação de TFF e uma resina decromatografia adsortiva na primeira e/ou segunda etapa depurificação.
Qualquer sistema de TFF adequado pode ser utilizado,incluindo um sistema do tipo Pellicon (Millipore,Billerica, ΜΑ) , ura sistema de Cassete Sartocon (SartoriusAG, Edgewood, NY) e um sistema do tipo Centrasette (PallCorp., East Hillsi NY).
Qualquer resina de cromatografia adsortiva adequadapode ser utilizada. Resinas de cromatografia adsortivapreferidas incluem resinas para cromatografia comhidroxiapatita, cromatografia de indução de cargahidrofóbica (HCIC), cromatografia de interação hidrofóbica(HIC), cromatografia de troca iônica, cromatografia detroca iônica de modo misto, cromatografia por afinidade demetal imobilizado (IMAC), cromatografia de ligante decorante, cromatografia por afinidade, cromatografia de fasereversa, e combinações destas. Exemplos de resinas dehidroxiapatita adequadas incluem hidroxiapatita cerâmica(CHT Tipo I e Tipo II, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA),hidroxiapatita HA Ultrogel (Pall Corp., East Hills, NY) ef luorapatita cerâmica (CFT Tipo I e Tipo II, Bio-RadLaboratories, Hercules, CA) . Um exemplo de uma resina deHCIC adequada é a resina MEP Hypercel (Pall Corp., EastHills, NY) . Exemplos de resinas de HIC adequadas incluemresinas de Butil-Sefarose, Hexil-Sefarose, Fenil-Sefarose eOctil Sefarose (todas de GE Healthcare, Piscataway, NJ) ,bem como as resinas Macro-prep Metil e Macro-Prep t-Butil(Biorad Laboratories, Hercules, CA). Exemplos de resinas detroca iônica adequadas incluem as resinas SP-Sefarose, CM-Sefarose e Q-Sefarose (todas de GE Healthcare, Piscataway,NJ) e a resina Unosphere S (Bio-Rad Laboratories, Hercules,CA). Um exemplo de trocador iônicos do modo misto adequadoinclui a resina Bakerbond ABx (JT Baker, Phillipsburg NJ).
Exemplos de resinas de IMAC adequadas incluem resinaQuelante de Sefarose (GE Healthcare, Piscataway, NJ) e aresina Profinity IMAC (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).
Exemplos de resinas de ligante de corante adequadas incluema resina Blue Sefarose (GE Healthcare, Piscataway, NJ) e aresina Affi-gel Blue (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).
Exemplos de resinas de afinidade adequadas incluem a resinaProteína A Sefarose (por exemplo, MabSelect, GE Healthcare,Piscataway, NJ), em que o agente de ligação celular é umanticorpo, e resinas de afinidade de lectina, por exemplo,a resina Lentil Lectina Sefarose (GE Healthcare,Piscataway, NJ), em que o agente de ligação celular abrigasítios de ligação de lectina apropriados. Alternativamente,pode ser usado um anticorpo específico para o agente deligação celular. Um anticorpo desse tipo pode serimobilizado, por exemplo, à resina de Fluxo Rápido Sefarose4 (GE Healthcare, Piscataway, NJ) . Exemplos de resinas defase reversa adequadas incluem as resinas C4, C8 e C18(Grace Vydac, Hesperia, CA).
De acordo com o método da invenção, é produzida umaprimeira mistura que compreende o agente de ligação celularque tem ligantes ligados a ele, além dos reagentes e outrossubprodutos. A purificação do agente de ligação celularmodificado dos reagentes e subprodutos é realizada porsubmissão da primeira mistura e um processo de purificação.
A esse respeito, a primeira mistura pode ser purificada como uso de filtração de fluxo tangencial (TFF), por exemplo,um processo de filtração de fluxo tangencial baseada emmembrana, cromatografia adsortiva, filtração adsortiva ouprecipitação seletiva, ou qualquer outro processo depurificação adequado, bem como combinações destes. Essaprimeira etapa de purificação fornece uma primeira misturapurificada, ou seja, uma concentração aumentada dos agentesde ligação celular que têm ligantes ligados a eles e umaquantidade diminuída de reagente de entrecruzamentobifuncional não ligado, quando comparada com a primeiramistura, antes da purificação de acordo com a invenção.
Após a purificação da primeira mistura para se obteruma primeira mistura purificada de agentes de ligaçãocelular que tem ligantes ligados a eles, um fármaco éconjugado aos agentes de ligação celular que têm ligantesligados a eles na primeira mistura purificada por reaçãodos agentes de ligação celular que têm ligantes ligados aeles com um fármaco, em uma solução que possui um pH decerca de 4 a cerca de 9, gerando uma segunda mistura quecompreende: (i) o agente de ligação celular quimicamenteacoplado através do ligante ao fármaco, (ii) fármaco livre,e (iii) são produzidos subprodutos da reação. Embora areação de conjugação seja realizada em um pH de cerca de 4a cerca de pH 9, a reação é realizada preferivelmente em umpH de cerca de 6 ou abaixo, ou em um pH de cerca de 6,5 oumais, mais pref erivelmente em um pH de cerca de 4 a cercade 6, ou em um pH de cerca de 6,5 a cerca de 9 e,especialmente, em um pH de 4 a menos de 6, ou em um pH demaior que 6,5 a 9. Quando a etapa de conjugação é realizadaem um pH de cerca de 6,5 ou mais, um pouco dos fármacoscontendo sulfidril pode tender a dimerizar por formação deligação dissulfeto. A remoção de metais residuais e/ou deoxigênio da mistura de reação, além da adição opcional deantioxidantes, ou o uso de ligantes com mais gruposabandonadores reativos, ou a adição de fármaco em mais deuma alíquota, pode ser necessária para permitir uma reaçãoeficiente em uma situação como esta.
Opcionalmente, a purificação do agente de ligaçãocelular modificado pode ser omitida. Nesta situação, ofármaco pode ser adicionado simultaneamente ao reagente deentrecruzamento ou em algum momento mais tarde, porexemplo, 1, 2, 3 ou mais horas após a adição do reagente deentrecruzamento ao agente de ligação celular.
O método da invenção pode opcionalmente incluir aadição de sacarose à etapa de conjugação usada no método dainvenção para aumentar a solubilidade e recuperar osconjugados de agente de ligação celular-fármaco. Depreferência, a sacarose é adicionada em uma concentração decerca de 0,1% (p/v) a cerca de 20% (p/v) (por exemplo,cerca de 0,1% (p/v), 1% (p/v), 5% (p/v), 10% (p/v), 15%(p/v) ou 20% (p/v)). Preferivelmente, a sacarose éadicionada em uma concentração de cerca de 1% (p/v) a 10%(p/v) (por exemplo, cerca de 2% (p/v) , cerca de 4% (p/v) ,cerca de 6% (p/v) ou cerca de 8% (p/v) ) . Além disso, areação de conjugação também pode compreender a adição de umagente de tamponamento. Pode ser utilizado qualquer agentede tamponamento adequado conhecido na técnica. Agentes detamponamento adequados incluem, por exemplo, um tampão decitrato, um tampão de acetato, um tampão de succinato e umtampão de fosfato.
Após a etapa de conjugação, a segunda mistura ésubmetida a uma etapa de purificação. A esse respeito, asegunda mistura pode ser purificada com o uso de filtraçãode fluxo tangencial (TFF), por exemplo, um processo defiltração de fluxo tangencial baseada em membrana,cromatografia adsortiva, filtração absorvente, precipitaçãoseletiva, ou qualquer outro processo de purificaçãoadequado, bem como combinações destes, que são apresentadosnessa especificação. Essa segunda etapa de purificaçãofornece uma segunda mistura purificada, ou seja, umaconcentração aumentada dos agentes de ligação celularquimicamente unidos através dos ligantes ao fármaco, e umaquantidade diminuída de um ou mais outros componentes dasegunda mistura, quando comparada com a segunda mistura,antes da purificação de acordo com a invenção.
O processo da invenção opcionalmente ainda compreendeuma etapa de manutenção após a modificação do agente deligação a célula com um reagente de entrecruzamentobifuncional. A etapa de manutenção compreende manter asolução a uma temperatura adequada por um período de tempoadequado para liberar os ligantes instavelmente ligados doagente de ligação a célula enquanto libera, de forma nãosubstancial, os ligantes estavelmente ligados do agente deligação a célula. Desejavelmente, a etapa de manutençãocompreende manter a solução a uma temperatura de cerca de20C a cerca de 80C por um período de pelo menos cerca de 12horas até 3 0 dias ou mais. Alternativamente, a duração daetapa de manutenção pode ser substancialmente reduzida pelaexecução da etapa de manutenção à temperatura elevada, coma temperatura máxima limitada pela estabilidade doconjugado de agente de ligação a célula-medicamento. Porexemplo, para um conjugado anticorpo-medicamento, a etapade manutenção pode ser executada a até cerca de 370C poraté cerca de quatro semanas, preferivelmente, entre duas equatro semanas, mais preferivelmente entre uma e duassemanas, mais preferivelmente por uma semana ou menos (porexemplo, duas horas a cerca de seis dias) . Valores de pHpreferidos para a etapa de manutenção variam de cerca de 6-10. Valores de pH mais preferidos estão entre 6,5 e 8,5.
Preferivelmente, a etapa de manutenção compreende incubar amistura compreendendo o agente de ligação a célulamodificado a 4°C e pH 6,5 por pelo menos 12 horas a 4semanas. Mais preferivelmente, a etapa de manutençãocompreende incubar a mistura compreendendo o agente deligação a célula modificado a uma faixa de 20-30°C a pH 6,5por cerca de 12 horas a cerca de 1 semana. A etapa demanutenção pode ser executada antes ou depois da conjugaçãodo agente de ligação a célula com o medicamento.Preferivelmente, a etapa de manutenção é executadadiretamente após a modificação do agente de ligação acélula com o reagente de entrecruzamento bifuncional.
Em uma modalidade, o processo da invenção compreendeuma etapa de manutenção após a modificação do agente deligação à célula com um reagente de entrecruzamentobifuncional e antes da conjugação. A etapa de manutençãocompreende manter a solução a uma temperatura adequada porum período de tempo adequado para liberar os ligantesinstavelmente ligados do agente de ligação a célulaenquanto libera, de modo não substancial, os ligantesestavelmente ligados do agente de ligação a célula.Desejavelmente, a etapa de manutenção compreende manter asolução a uma temperatura de cerca de 2°C a cerca de 8°Cpor um período de pelo menos 5 horas até 5 dias ou mais,por exemplo 30 dias. Alternativamente, a duração da etapade manutenção pode ser substancialmente reduzida pelaexecução da etapa de manutenção à temperatura elevada com atemperatura máxima limitada pela estabilidade do conjugadode agente de ligação a célula-medicamento. Por exemplo,para um conjugado de anticorpo-medicamento, a etapa demanutenção pode ser executada a até cerca de 370C por atécerca de 4 semanas, preferivelmente entre duas e quatrosemanas, mais preferivelmente entre uma e duas semanas, emais preferivelmente por cerca de uma semana ou menos (porexemplo, 2 horas a cerca de seis dias). O valor de pH paraa etapa de manutenção é pref erivelmente cerca de 4 ou mais,porém menos do que 6 (por exemplo, 4-5,9) . 0 valor de pHpara a etapa de manutenção é, mais pref erivelmente, cercade 5 ou mais, porém inferior a cerca de 6 (por exemplo, 5-5,9). Preferivelmente, a etapa de manutenção compreendeincubar a mistura compreendendo o agente de ligação acélula modificado a 40C a pH 5 por pelo menos 5 horas até 5dias ou mais, por exemplo 10 dias. Mais preferivelmente, aetapa de manutenção compreende a incubação da misturacompreendendo o agente de ligação de célula modificada auma faixa entre 20-30°C a um pH de cerca de 5 a cerca de 5horas a cerca de 1 a 3 dias, pref erivelmente 1 dia. Depoisda modificação do agente de ligação a célula, a etapa depurificação pode ser executada antes da etapa de manutençãoe/ou após a etapa de manutenção, porém antes da etapa deconjugação. Estas etapas de purificação, tal comocromatografia não adsortiva ou adsortiva, são bemconhecidas por uma pessoa com habilidade na técnica.
Em uma modalidade, a duração da etapa de manutençãopode ser substancialmente reduzida pela adição denucleófilos. Os nucleófilos podem ser adicionados durante aetapa de conjugação e a etapa de manutenção pode serexecutada simultaneamente com a conjugação. No contexto dainvenção, nucleófilos são grupamentos químicos que podemreagir com grupamentos éster e amidas imidazóis em agentesde ligação a célula modificados em soluções aquosas.
Nucleófilos apropriados são conhecidos na técnica eincluem, por exemplo, aminas primárias, isto é, RNH2, emque R é um alquil ou grupo aromático; ou aminassecundárias, isto é, RR'NH, em que ReR' são grupos alquilou grupos aromáticos. Aminas também pode ser aminoácidos,peptídeos contendo aminoácidos lisina, peptídeos contendoalfa-amino ou grupos aminos secundários não naturais, ouaminas solúveis em água. Nucleófilos podem estar emsolução, em um estado polimérico, ou em forma imobilizadacomo um reagente de fase sólida. Exemplos de nucleófilosapropriados em solução incluem, mas não se limitam,glicilglicina, glicina, taurina de 2-aminoetanosulfonato desódio, etanolamina, dietanolamina, lisina, hidroxilamina,hidrazina, imidazol, histidina, etilamina, 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol e 4-amino-l-butanol.
Concentrações apropriadas de nucleófilos solúveis variam decerca de 0,1 mM ao limite de solubilidade para o nucleófiloem particular. Exemplos de nucleófilos em um estadopolimérico incluem, mas não se limitam, poli(etilenoimina),poli-lisina, e peptídeos com aminoácido lisina e peptídeoscontendo alfa-amino ou grupos amino secundários nãonaturais. Exemplos de nucleófilos em forma imobilizada comoreagente de fase sólida incluem, mas não se limitam, aminasligadas em fase sólida, tais como EAH Sepharose 4B e eesferas de poliestireno aminometil. Para um nucleófilo defase sólida, a quantidade molar de amina de fase sólidadeve estar em excesso em relação à quantidade do liganteintercruzado à célula.
O agente de ligação celular pode ser qualquer agenteadequado que se ligue a uma célula, típica epreferivelmente, uma célula animal (por exemplo, uma célulahumana). O agente de ligação celular preferivelmente é umpeptídeo ou um polipeptídeo. Agentes de ligação celularadequados incluem, por exemplo, anticorpos (por exemplo,anticorpos monoclonais e fragmentos destes), linfocinas,hormônios, fatores do crescimento, moléculas de transportede nutrientes (por exemplo, transferrina), e qualquer outroagente ou molécula que se ligue especificamente a umamolécula-alvo na superfície de uma célula.
O termo "anticorpo", como aqui usado, refere-se aqualquer imunoglobulina, qualquer fragmento deimunoglobulina, por exemplo, Fab, F(ab')2, dsFv, sFv,idiabodies e triabodies, ou quimeras de imunoglobulinas, quepodem se ligar a um antígeno na superfície de uma célula(por exemplo, que contenha uma região determinante decomplementaridade (CDR)). Qualquer anticorpo adequado podeser usado como agente de ligação celular. Aqueleshabilitados na técnica observarão que a seleção de umanticorpo apropriado dependerá da população de célulasvisada. A esse respeito, o tipo e o número de moléculas dasuperfície celular (ou seja, antígenos) que sãoseletivamente expressos em uma população de células emparticular (típica e preferivelmente uma população decélulas doentes) determinarão a seleção de um anticorpoapropriado para uso na composição da invenção. Sãoconhecidos perfis de expressão da superfície celular parauma ampla gama de tipos de células, incluindo tipos decélulas tumorais ou, se desconhecidos, pode ser determinadocom a utilização de técnicas rotineiras de biologiamolecular e histoquímica.
O anticorpo pode ser policlonal ou monoclonal, mas é,mais preferivelmente, um anticorpo monoclonal. Como aquiusados, anticorpos "policlonais" referem-se às populaçõesheterogêneas de moléculas de anticorpo, tipicamentecontidas no soro de animais imunizados. Anticorpos"monoclonais" referem-se às populações homogêneas demoléculas de anticorpo que são específicas para um antígenoem particular. Anticorpos monoclonais são tipicamenteproduzidos por um único clone de linfócitos B ("célulasB"). Anticorpos monoclonais podem ser obtidos com o uso dediversas tecnologias conhecidas por aqueles habilitados natécnica, incluindo a tecnologia padronizada de hibridoma(veja, por exemplo, Kõhler e Milstein, Eur. Iwmunol., 5:511-519 (1976), Harlow e Linha (eds.), "Antibodies: ALaboratory Manual", CSH Press (1988) e C.A. Janeway e cols.(eds.), Immunobiology, 5a Ed., Garland Publishing, NovaYork, NY (2001) ). Resumidamente, o método de hibridoma deprodução de anticorpos monoclonais tipicamente envolve ainjeção em qualquer animal adequado, típica epreferivelmente um camundongo, de um antígeno (ou seja, um"imunógeno"). 0 animal é subseqüentemente sacrificado, e ascélulas B isoladas de seu baço são fundidas às células demieloma humano. É produzida uma célula híbrida (ou seja, um"hibridoma"), que se prolifera indefinidamente e secretacontinuamente altas titulações de um anticorpo com aespecificidade desejada in vitro. Qualquer métodoapropriado conhecido na técnica pode ser usado paraidentificar células de hibridoma que produzem um anticorpocom a especificidade desejada. Tais métodos incluem, porexemplo, ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA),análise Western blot, e radioimunoensaio. A população dehibridomas é rastreada para isolar clones individuais, cadaum dos quais secreta uma única espécie de anticorpo para oantígeno. Como cada hibridoma é um clone derivado da fusãocom uma única célula B, todas as moléculas de anticorpo queele produz são idênticas em termos de estrutura, incluindoseu sitio de ligação de antígeno e isótipo. Os anticorposmonoclonais também podem ser gerados com a utilização deoutras técnicas adequadas, incluindo a tecnologia de EBV-hibridoma (veja, por exemplo, Haskard e Archer, Immnunol.Methods, 74(2): 361-67 (1984), e Roder e cols., MethodsEnzymol., 121: 140-67 (1986)), sistemas de expressão devetor de bacteriófago (veja, por exemplo, Huse e cols.,Science, 246: 1.275-81 (1989)), ou bibliotecas de exibiçãode fago que compreendem fragmentos de anticorpo, porexemplo, Fab e scFv (região variável de cadeia única)(veja, por exemplo, as Patentes U.S. 5.885.793 e 5.969.108,e Pedidos de Patente Internacional WO 92/01047 e WO99/06587) .
O anticorpo monoclonal pode ser isolado de, ouproduzido em, qualquer animal adequado, mas épreferivelmente produzido em um mamífero, maispreferivelmente um camundongo ou um ser humano e,principalmente, um ser humano. Métodos para a produção deum anticorpo em camundongos são bem conhecidos por aqueleshabilitados na técnica, e são aqui descritos. Com relaçãoaos anticorpos humanos, aqueles habilitados na técnicaobservarão que anticorpos policlonais podem ser isolados dosoro de indivíduos humanos vacinados ou imunizados com umantígeno apropriado. Alternativamente, anticorpos humanospodem ser gerados por adaptação de técnicas conhecidas paraa produção de anticorpos humanos em animais não humanoscomo, por exemplo, camundongos (veja, por exemplo, asPatentes U.S. 5.545.806, 5.569.825 e 5.714.352, e aPublicação do Pedido de Patente U.S. N° 2002/0197266 Al).
Embora sendo a escolha ideal para aplicaçõesterapêuticas em seres humanos, os anticorpos humanos,particularmente os anticorpos humanos monoclonais,tipicamente são mais difíceis de serem gerados do queanticorpos monoclonais de camundongos. Anticorposmonoclonais de camundongos, no entanto, induzem uma rápidaresposta de anticorpos pelo hospedeiro quando administradosseres humanos, o que pode reduzir o potencial terapêuticoou diagnóstico do conjugado de anticorpo-fármaco. Paracontornar essas complicações, um anticorpo monoclonalpreferivelmente não é reconhecido como "estranho" pelosistema imunológico humano.
Para essa finalidade, a exibição de fago pode serusada para gerar o anticorpo. A esse respeito, bibliotecasde fago que codificam domínios variáveis (V) de ligação deantígeno de anticorpos podem ser geradas com o uso detécnicas padronizadas de biologia molecular e DNArecombinante (veja, por exemplo, Sambrook e cols. (eds.),"Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 3a Edição, ColdSpring Harbor Laboratory Press, Nova York (2001)). Fagosque codifica uma região variável com a especificidadedesejada são selecionados quanto à ligação especifica aoantígeno desejado, e é reconstituído um anticorpo humanocompleto que compreende o domínio variável selecionado.
Seqüências de ácido nucléico que codificam o anticorporeconstituído são introduzidas em uma linhagem celularadequada, por exemplo, uma célula de mieloma usada para aprodução de hibridoma, de forma que anticorpos humanos quepossuam as características de anticorpos monoclonais sejamsecretados pela célula (veja, por exemplo, Janeway e cols.,supra, Huse e cols., supra e Patente U.S. 6.265.150).Alternativamente, podem ser gerados anticorpos monoclonaispor camundongos que são transgênicos para genes específicosda cadeia pesada e leve de imunoglobulina humana. Taismétodos são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo,nas Patentes U.S. 5.545.806 e 5.569.825, e Janeway e cols.,supra.
De preferência, o anticorpo é um anticorpo humanizado.Como aqui usado, um anticorpo "humanizado" é aquele em queas regiões determinantes de complementaridade (CDR) de umanticorpo monoclonal de camundongo, que formam as alças deligação de antígeno do anticorpo, são enxertados naestrutura central de uma molécula de anticorpo humano. Emfunção da similaridade das estruturas centrais deanticorpos de camundongo e humanos, é geralmente aceito natécnica que essa abordagem produz um anticorpo monoclonalque é antigenicamente idêntico a um anticorpo humano, masque se liga ao mesmo antígeno que o anticorpo monoclonal decamundongo do qual as seqüências da CDR foram derivadas.
Métodos para a geração de anticorpos humanizados são bemconhecidos na técnica, e são descritos detalhadamente, porexemplo, em Janeway e cols., supra, nas Patentes U.S.5.225.539, 5.585.089 e 5.693.761, na Patente Européia N00239400 BI e na Patente do Reino Unido N0 2188638.
Anticorpos humanizados também podem ser gerados com o usoda tecnologia de revestimento da superfície do anticorpodescrita na Patente U.S. 5.639.641 e Pedersen e cols., J.Mol. Biol., 235: 959-973 (1994). Embora o anticorpoempregado no conjugado da composição da invenção seja, depreferência, um anticorpo monoclonal humanizado, umanticorpo monoclonal humano e um anticorpo monoclonal decamundongo, como descritos acima, também estão incluídos noescopo da invenção.
Fragmentos de anticorpo que possuem pelo menos umsítio de ligação de antígeno e, portanto, reconhecem e seligam a pelo menos um antígeno ou receptor presente nasuperfície de uma célula-alvo, também estão incluídos noescopo da invenção. A esse respeito, a clivagemproteolítica de uma molécula de anticorpo intacta podeproduzir diversos fragmentos de anticorpo que retêm ahabilidade para reconhecer e se ligar aos antígenos. Porexemplo, a digestão limitada de uma molécula de anticorpocom a protease papaína produz tipicamente três fragmentos,dois dos quais são idênticos, e são denominados fragmentosFab, na medida em que retêm a atividade de ligação deantígeno da molécula de anticorpo original. A clivagem deuma molécula de anticorpo com a enzima pepsina normalmenteproduz dois fragmentos de anticorpo, um dos quais retémambos os braços de ligação de antígeno da molécula deanticorpo e é, portanto, denominado fragmento F(ab')2· Aredução de um fragmento F(ab')2 com ditiotreitol oumercaptoetilamina produz um fragmento denominado fragmentoFab'. Um fragmento de anticorpo de fragmento da regiãovariável de cadeia única (sFv), que consiste em umfragmento Fab truncado que compreende o domínio variável(V) de uma cadeia pesada de anticorpo ligada a um domínio Vde uma cadeia leve de anticorpo por meio de um peptídeosintético, pode ser gerado com o uso de técnicas rotineirasde tecnologia de DNA recombinante (veja, por exemplo,Janeway e cols. , supra.) . Da mesma forma, fragmentos daregião variável estabilizados por dissulfeto (dsFv) podemser preparados por tecnologia de DNA recombinante (veja,por exemplo, Reiter e cols., Protein Engineering, 7: 697-704 (1994)) . Fragmentos de anticorpo no contexto dainvenção, no entanto, não se limitam a esses ti-posexemplares de fragmentos de anticorpo. Qualquer fragmentode anticorpo adequado que reconheça e se ligue a umreceptor ou antígeno da superfície celular desejado podeser empregado. Fragmentos de anticorpo são ainda descritos,por exemplo, em Parham, J. Inwnunol., 131: 2.895-2.902(1983), Spring e cols., J. Immunol., 113: 470-478 (1974) eNisonoff e cols., Arch. Blochem. Biophys., 89: 230-244(1960) . A ligação anticorpo-antígeno pode ser testada com ouso de qualquer método adequado conhecido na técnica como,por exemplo, radioimunoensaio (RIA), ELISA, Western blot,imunoprecipitação e ensaios de inibição competitiva (veja,por exemplo, Janeway e cols., supra e a Publicação doPedido de Patente U.S. N0 2002/0197266 Al).
Além disso, o anticorpo pode ser um anticorpoquimérico ou um fragmento de ligação de antígeno deste. 0termo "quimérico" significa que o anticorpo compreende pelomenos duas imunoglobulinas, ou fragmentos destas, obtidasou derivadas de pelo menos duas espécies diferentes (porexemplo, duas imunoglobulinas diferentes como, por exemplo,uma região constante de imunoglobulina humana combinada auma região variável de imunoglobulina murídea). 0 anticorpotambém pode ser um anticorpo de domínio (dAb) ou umfragmento de ligação de antígeno deste como, por exemplo,um anticorpo de camelideo (veja, por exemplo, Desmyter ecols., Nature Struct. Biol., 3: 752, (1996)), ou umanticorpo de tubarão como, por exemplo, um novo receptor deantígeno (IgNAR) (veja, por exemplo, Greenberg e cols.,Nature, 374: 168 (1995), e Stanfield e cols., Science, 305:1.770-1.773 (2004) ).
Qualquer anticorpo adequado pode ^ser usado πσ contextoda invenção. Por exemplo, o anticorpo monoclonal J5 é umanticorpo IgG2a murídeo que é específico para antígenocomum da leucemia Iinfoblástica aguda (CALLA) (Ritz ecols., Nature, 283: 583-585 (1980)), e pode ser usado paravisar células que expressam CALLA (por exemplo, células deleucemia Iinfoblástica aguda). O anticorpo monoclonal MY9 éum anticorpo IgGl murídeo que se liga especificamente aoantígeno CD33 (Griffin e cols., Leukemia Res., 8: 521(1984)), e pode ser usado para visar células que expressamCD3 3 (por exemplo, células de leucemia mielógena aguda (LMA)).
Da mesma forma, o anticorpo monoclonal anti-B4 (tambémconhecido como B4) é um anticorpo IgGl murídeo que se ligaao antígeno CD19 em células B (Nadler e cols., J. Immunol.,131: 244-250 (1983)), e pode ser usado para visar células Bou células doentes que expressam CD19 (por exemplo, célulasde linfoma não Hodgkin e células de leucemia linfoblásticacrônica). N901 é um anticorpo monoclonal murídeo que seliga ao antígeno CD56 (molécula de adesão de célula neural)encontrado em células de origem neuroendócrina, incluindotumor pulmonar de pequenas células, que pode ser usado noconjugado para direcionar os fármacos às células de origemneuroendócrina. Os anticorpos J5, MY9 e B4 preferivelmentetêm sua superfície retrabalhada ou são humanizados, antesde seu uso como parte do conjugado. 0 tratamento dasuperfície ou a humanização de anticorpos é descrito, porexemplo, em Roguska e cols., Proc. Natl. Acad. Sei. USA,91: 969-73 (1994) .
Além disso, o anticorpo monoclonal C242 se liga aoantígeno CanAg (veja, por exemplo, a Patente U.S.5.552.293), e pode ser usado para direcionar o conjugadoaos tumores que expressam CanAg, por exemplo, câncercólon-retal, pancreático, pulmonar de células não pequenase gástrico. HuC242 é uma forma humanizada do anticorpomonoclonal C242 (veja, por exemplo, a Patente U.S.5.552.293). 0 hibridoma do qual HuC242 é produzido édepositado com o Número de Identificação no ECACC 90012601.HuC242 pode ser preparado com o uso da metodologia deenxerto de CDR (veja, por exemplo, as Patentes U.S.5.585.089, 5.693.761 e 5.693.762) ou com a tecnologia derevestimento da superfície (veja, por exemplo, a PatenteU.S. 5.639.641). HuC242 pode ser usado para direcionar oconjugado às células tumorais que expressam o antígenoCanAg como, por exemplo, células de câncer cólon-retal,pancreático, pulmonar de células não pequenas e gástrico.Para ter como alvo uma célula cancerosa de câncerovariano e de próstata, um anticorpo anti-MUCl pode serusado como agente de ligação celular no conjugado.
Anticorpos anti-MUCl incluem, por exemplo, anti-HMFG-2(veja, por exemplo, Taylor-Papadimitriou e cols. , Int. J.Câncer, 28: 17-21 (1981)), hCTMOl (veja, por exemplo, vanHof e cols., Câncer Res., 56: 5.179-5.185 (1996)) e DS6.Células de câncer de próstata também podem ser visadas peloconjugado com o uso de um anti-antígeno de membranaespecífico para a próstata (PSMA) como o agente de ligaçãocelular, por exemplo, J591 (veja, por exemplo, Liu e cols.,Câncer Res., 57: 3.629-3.634 (1997)). Além disso, célulascancerosas que expressam o antígeno Her2, por exemplo, decélulas de câncer de mama, de próstata e de ovário, podemser direcionadas com o uso do anticorpo trastuzumab.Anticorpos anti-IGF-IR que se ligam ao receptor do fator decrescimento insulina-Iike também podem ser usados noconjugado.
Anticorpos particularmente preferidos são anticorposmonoclonais humanizados, cujos exemplos incluem huN901,huMy9-6, huB4, huC24 2, trastuzumab, bivatuzumab,sibrotuzumab e rituximab (veja, por exemplo, as PatentesU.S. 5.639.641 e 5.665.357, Pedido Provisório de PatenteU.S. N0 60/424.332 (que está relacionado ã Publicação doPedido de Patente U.S. N0 2005/0118183 Al), Pedido dePatente Internacional WO 02/16401, Pedersen e cols., supra,Roguska e cols., supra, Liu e cols., supra, Nadler e cols.,supra, Colomer e cols., Câncer Invest., 19: 49-56 (2001),Heider e cols., Eur. J. Câncer, 31A: 2.385-2.391 (1995),Welt e cols., J. Clin. Oncol., 12: 1.193-1.203 (1994) eMaloney e cols., Blood, 90: 2.188-2.195 (1997)).Principalmente, ο anticorpo é o anticorpo monoclonalhumanizado huN901 ou o anticorpo monoclonal humanizadohuMy9-6. Outros anticorpos preferidos incluem CNT095,huDS6, huB4 e huC242. Outros anticorpos monoclonaishumanizados são conhecidos na técnica e podem ser usadosrelacionados à invenção.
Embora o agente de ligação celular sejapreferivelmente um anticorpo, o agente de ligação celulartambém pode ser outra molécula que não um anticorpo.Moléculas adequadas que não sejam anticorpo incluem, porexemplo, interferons (por exemplo, interferon alfa, beta ougama) , linfocinas (por exemplo, interleucina 2 (IL-2) , IL-3, IL-4 ou IL-6), hormônios (por exemplo, insulina),fatores do crescimento (por exemplo, EGF, TGF-alfa, FGF eVEGF), fatores de estimulação de colônias (por exemplo, G-CSF, M-CSF e GM-CSF (veja, por exemplo, Burgess, ImmunologyTodayl 5: 155-158 (1984))), somatostatina e transferrina(veja, por exemplo, 0'Keefe e cols., Biol. Chem., 260: 932-937 (1985)). Por exemplo, GM-CSF, que se liga às célulasmielóides, pode ser usado como agente de ligação celularque tem como alvo células de leucemia mielógena aguda. Alémdisso, IL-2, que se liga às células T ativadas, pode serusada para a prevenção de rejeição a enxerto detransplante, para terapia e prevenção da doença enxertoversus hospedeiro e para o tratamento de leucemia aguda decélulas T. O fator de crescimento epidérmico (EGF) pode serusado para ter como alvo cânceres de células escamosascomo, por exemplo, câncer de pulmão e câncer da cabeça epescoço. Somatostatina pode ser usada para ter como alvocélulas de neuroblastoma e outros tipos de célulastumorais.
O conjugado pode compreender qualquer fármacoadequado, tipicamente um agente citotóxico. O termo "agentecitotóxico", como aqui usado, refere-se a qualquer compostoque resulte na morte de uma célula, induza morte celular oudiminua a viabilidade celular. Agentes citotóxicosadequados incluem, por exemplo, maitansinóides e análogosde maitansinóide, taxóides, CC-1065 e análogos de CC-1065,e dolastatina e análogos de dolastatina. Em uma modalidadepreferida da invenção, o agente citotóxico é ummaitansinóide, incluindo maitansinol e análogos demaitansinol. Maitansinóides são compostos que inibem aformação de microtúbulos e são altamente tóxicos paracélulas de mamíferos. Exemplos de análogos de maitansinoladequados incluem aqueles que possuem um anel aromáticomodificado e aqueles que possuem modificações em outrasposições. Esses maitansinóides são descritos, por exemplo,nas Patentes U.S. 4.256.746, 4.294.757, 4.307.016,4.313.946, 4.315.929, 4.322.348, 4.331.598, 4.361.650,4.362.663, 4.364.866, 4.424.219, 4.371.533, 4.450.254,5.475.092, 5.585.499, 5.846.545 e 6.333.410.
Exemplos de análogos de maitansinol que possuem umanel aromático modificado incluem: (1) C-19-decloro(Patente U.S. 4.256.74 6) (preparado por redução LAH deansamitocina P2), (2) C-20-hidróxi (ou C-20-demetil) + /-C-19-decloro (Patentes U.S. 4.361.650 e 4.307.016) (preparadopor desmetilação com o uso de Streptorayces ou Actinomycesou desclorinação com o uso de LAH), e (3) C-20-demetóxi, C-20-acilóxi (-OCOR), +/-decloro (Patente U.S. 4,294,757)(preparado por acilação com o uso de cloretos de acila).
Exemplos de análogos de maitansinol que possuemmodificações de outras posições diferentes de um anelaromático incluem: (1) C-9-SH (Patente U.S. 4.424.219)(preparado por uma reação de maitansinol com H2S ou P2S5),(2) C-14-alcoximetil (demetóxi/CH2OR) (Patente U.S.4.331.598), (3) C-14-hidroximetil ou aciloximetil (CH2OH ouCH2OAc) (Patente U.S. 4.450.254) (preparado por Nocardia),(4) C-15-hidróxi/acilóxi (Patente U.S. 4.364.866)(preparado pela conversão de maitansinol por Streptomyces),(5) C-15-metóxi (Patentes U.S. 4.313.946 e 4.315.929)(isolado de Trewia nudiflora), (6) C-18-N-demetil (PatentesU.S. 4.362.663 e 4.322.348) (preparado pela desmetilação demaitansinol por Streptomyces) e (7) 4,5-desóxi (PatenteU.S. 4.371.533) (preparado pelo tricloreto detitânio/redução LAH de maitansinol).
Em uma modalidade preferida da invenção, o conjugadoutiliza o maitansinóide contendo tiol DM1, também conhecidocomo N2'-deacetil-N2'- (3-mercapto-l-oxopropil) -maitansina,como agente citotóxico. A estrutura de DMl é representadapela fórmula (!):
<formula>formula see original document page 28</formula>
Em outra modalidade preferida da invenção, o conjugadoutiliza o maitansinóide contendo tiol DM4, também conhecidocomo
N2 -deacetil-N2 -(4-metil-4-mercapto-loxopentil)-maitansina, como agente citotóxico. A estrutura de DM4 érepresentada pela fórmula (II):
<formula>formula see original document page 29</formula>
Outras maitansinas podem ser usadas no contexto dainvenção, incluindo, por exemplo, maitansinóides contendotiol e dissulfeto que abrigam uma substituição mono ou di-alquil no átomo de carbono que abriga o átomo de enxofre. Éparticularmente preferido um maitansinóide que possui naposição C-3: (a) funcionalidade C-14 hidroximetil, C-15hidróxi ou C-2 0 desmetil, e (b) uma cadeia lateral aciladade aminoácido com um grupo acil que abriga um gruposulfidril inibido, em que o átomo de carbono do grupo acilque abriga a funcionalidade tiol possui um ou doissubstituintes, os referidos substituintes sendo CH3, C2H5,alquil ou alquenil linear ou ramificado que possui de 1 a10 átomos de carbono, alquil ou alquenil cíclico que possuide 3 a 10 átomos de carbono, fenil, fenil substituído ouradical heterocíclico aromático ou heterocicloalquil, eainda em que um dos substituintes pode ser H, e em que ogrupo acil possui um comprimento da cadeia linear de pelomenos três átomos de carbono entre a funcionalidadecarbonil e o átomo de enxofre.
Maitansinas adicionais para uso no contexto dainvenção incluem compostos representados pela fórmula(III) :
<formula>formula see original document page 30</formula>
em que Y' representa
(CR7R8) χ (CR9=CRi0) pC=CqA0 (CR5R6) mDu (CRn=CR12) r (C=C) sBt (CR3R4Jn-CR1R2SZ, em que R1 e R2 são, cada um independentemente,CH3, C2H5, alquil ou alquenil linear que possui de 1 a 10átomos de carbono, alquil ou alquenil ramificado ou cíclicoque possui de 3 a 10 átomos de carbono, fenil, fenilsubstituído ou radical heterocíclico aromático ouheterocicloalquil, e em que R2 também pode ser H,
em que A, B, D são cicloalquil ou cicloalquenil quepossui de 3-10 átomos de carbono, aril simples ousubstituído, ou radical heterocíclico aromático ouheterocicloalquil, em que R3, R4, R5, R6, R7, Rs/ R9/ Rio / Rne R12 são, cada um independentemente, H, CH3 , C2H5 , alquilou alquenil linear que possui de 1 a 10 átomos de carbono,alquil ou alquenil ramificado ou cíclico que possui de 3 a10 átomos de carbono, fenil, fenil substituído ou radicalheterocíclico aromático ou heterocicloalquil,
em que 1, m, n, o, p, q, r, s e t são, cada umindependentemente, zero ou um número inteiro de 1 a 5,desde que pelo menos dois de 1, m, n, o, p, q, r, s e t nãosejam zero em um momento, e em que Z é H, SR ou COR, em queR é alquil ou alquenil linear que possui de 1 a 10 átomosde carbono, alquil ou alquenil ramificado ou cíclico quepossui de 3 a 10 átomos de carbono, ou aril simples ousubstituído ou radical heterocíclico aromático ouheterocicloalquil.
Modalidades preferidas da fórmula (III) incluemcompostos de fórmula (III) em que: (a) Ri é H, R2 é metil eZ é H, (b) Ri e R2 são metil e Z é H, (c) R1 é H, R2 é metile Z é -SCH3, e (d) Ri e R2 são metil e Z é -SCH3.
Essas maitansinas adicionais também incluem compostosrepresentados pela fórmula (IV-L), (IV-D) ou (IV-DiL):C2H5, alquil linear ou alquenil que possui de 1 a 10 átomosde carbono, alquil ou alquenil ramificado ou cíclico quepossui de 3 a 10 átomos de carbono, fenil, fenilsubstituído ou radical heterocíclico aromático ouheterocicloalquil, e em que R2 também pode ser H,em que R3, R4, R5, R6, R7 e R8 são, cada umindependentemente, H, CH3, C2H5, alquil ou alquenil linearque possui de 1 a 10 átomos de carbono, alquil ou alquenilramificado ou cíclico que possui de 3 a 10 átomos decarbono, fenil, fenil substituído ou radical heterocíclicoaromático ou heterocicloalquil,
<formula>formula see original document page 31</formula>
em que Y representa (CR7R8)1(CR5R6)m(CR3R4)nCRiR2SZ,em que R1 e R2 são, cada um independentemente, CH3,em que 1, m e η são, cada um independentemente, umnúmero inteiro de 1 a 5 e, além disso, η pode ser zero,
em que Z é H, SRf ou COR em que R é alquil ou alquenillinear ou ramificado que possui de 1 a 10 átomos decarbono, alquil ou alquenil cíclico que possui de 3 a 10átomos de carbono, ou aril simples ou substituído ouradical heterocíclico aromático ou heterocicloalquil, e emque May representa um maitansinóide que abriga a cadeialateral em C-3, C-14 hidroximetil, C-15 hidróxi, ou C-20desmetil.
Modalidades preferidas das fórmulas (IV-L), (IV-D) e(IV-D,L) incluem compostos de fórmulas (IV-L), (IV-D) e(IV-DiL) em que: (a) Ri é H, R2 é metil, R5, R6, R7 e R8são, cada um, Η, 1 e m são, cada um, 1, η é 0 e Z é H; (b)R1 e R2 são metil, R5, R6, R7, Rs são, cada um, H,Iem são4, néOeZéH; (c) R1 é H, R2 é metil, R5, R6, R7 e R8são, cada um, H, Iem são, cada um, 1, néOeZé -SCH3;ou (d) R1 e R2 são metil, R5, R6, R7, R8 são, cada um, H,Iem são 1, η é 0 e Z é -SCH3.
De preferência, o agente citotóxico é representadopela fórmula (IV-L).
Maitansinas preferidas adicionais também incluemcompostos representados pela fórmula (V):
<formula>formula see original document page 32</formula>em que Y representa (CR7R8)I(CR5R6)m(CR3R4)nCRiR2SZ,em que R1 e R2 são, cada um independentemente, CH3,C2H5, alquil linear ou alquenil que possui de 1 a 10 átomosde carbono, alquil ou alquenil ramificado ou cíclico quepossui de 3 a 10 átomos de carbono, fenil, fenilsubstituído ou radical heterocíclico aromático ouheterocicloalquil, e em que R2 também pode ser H,
em que R3, R4, R5, R6, R7 e R8 são, cada umindependentemente, H, CH3, C2H5, alquil ou alquenil linearque possui de 1 a 10 átomos de carbono, alquil ou alquenilramificado ou cíclico que possui de 3 a 10 átomos decarbono, fenil, fenil substituído ou radical heterocíclicoaromático ou heterocicloalquil,
em que 1, m e η são, cada um independentemente, umnúmero inteiro de 1 a 5 e, além disso, η pode ser zero,
e em que Z é H, SR ou COR, em que R é alquil oualquenil linear que possui de 1 a 10 átomos de carbono,alquil ou alquenil ramificado ou cíclico que possui de 3 a10 átomos de carbono, ou aril simples ou substituído ouradical heterocíclico aromático ou heterocicloalquil.
Modalidades preferidas da fórmula (V) incluemcompostos de fórmula (V), em que: (a) R1 é H, R2 é metil,R5, R6, R7 e R8 são, cada um, H; Iem são, cada um, 1; η é0; e Z é H; (b) Ri e R2 são metil; R5, R6, R7, R8 são, cadaum, Η, 1 e m são 1; η é 0; e Z é H; (c) Ri é H, R2 é metil,R5, R6, R7 e R8 são, cada um, H, Iem são, cada um, 1, η é0 e Z é -SCH3; ou (d) Ri e R2 são metil, R5, R6, R7, R8 são,cada um, H, Iem são 1, η é 0 e Z é -SCH3.
Adicionalmente, maitansinas preferidas incluemcompostos representados pela fórmula (VI-L), (VI-D) ou (VI-<formula>formula see original document page 34</formula>
em que Y2 representa (CR7R8)I(CR5R6)m(CR3R4)nCRiR2SZ2,em que Ri e R2 são, cada um independentemente, CH3,C2H5, alquil ou alquenil linear que possui de 1 a 10 átomosde carbono, alquil ou alquenil ramificado ou cíclico quepossui de 3 a 10 átomos de carbono, fenil, fenilsubstituído ou radical heterocíclico aromático ouheterocicloalquil, e em que R2 também pode ser H,
em que R3, R4, R5, R6, R7 e R8 são, cada umindependentemente, H, CH3, C2H5, alquil ou alquenil linearcíclico que possui de 1 a 10 átomos de carbono, alquil oualquenil ramificado ou cíclico que possui de 3 a 10 átomosde carbono, fenil, fenil substituído ou radicalheterocíclico aromático ou heterocicloalquil,
em que 1, m e η são, cada um independentemente, umnúmero inteiro de 1 a 5 e, além disso, η pode ser zero,
em que Z2 é SR ou COR, em que R é alquil ou alquenillinear que possui de 1 a 10 átomos de carbono, alquil oualquenil ramificado ou cíclico que possui de 3 a 10 átomosde carbono, ou aril simples ou substituído ou radicalheterocíclico aromático ou heterocicloalquil,e em que May é um maitansinóide.
Maitansinas preferidas adicionais incluem compostosrepresentados pela fórmula (VII):<formula>formula see original document page 35</formula>
em que Y representa
(CR7R8) ι (CR9=CR10) p (C^C) qA0 (CR5R6) mDu (CR11=CRi2)r(C=C) eBt(CR3R4)n CR1R2SZ2,
em que R1 e R2 são, cada um independentemente, CH3,C2H5, alquil ou alquenil linear ou ramificado que possui de1 a 10 átomos de carbono, alquil ou alquenil cíclico quepossui de 3 a 10 átomos de carbono, fenil, fenilsubstituído ou radical heterocíclico aromático ouheterocicloalquil e, além disso, R2 pode ser H,
em que A, BeDi cada um independentemente, sãocicloalquil ou cicloalquenil que possui 3 a 10 átomos decarbono, aril simples ou substituído ou radicalheterocíclico aromático ou heterocicloalquil,
em que R3, R4, R5, R6, R7, R8, Rg, Rio, Rn e R12 são,cada um independentemente, H, CH3, C2H5, alquil ou alquenillinear que possui de 1 a 10 átomos de carbono, alquil oualquenil ramificado ou cíclico que possui de 3 a 10 átomosde carbono, fenil, fenil substituído ou radicalheterocíclico aromático ou heterocicloalquil,
em que I1 m, n, o, p, g, r, s e t são, cada umindependentemente, zero ou um número inteiro de 1 a 5,desde que pelo menos dois de I1 m, n, o, p, q, r, s e t nãosejam zero em um momento, e
em que Z2 é SR ou -COR, em que R é alquil ou alquenillinear que possui de 1 a 10 átomos de carbono, alquil oualquenil ramificado ou cíclico que possui de 3 a 10 átomosde carbono ou aril simples ou substituído ou radicalheterocíclico aromático ou heterocicloalquil.
Modalidades preferidas da fórmula (VII) incluemcompostos de fórmula (VII), em que R1 é H e R2 é metil.
Além de maitansinóides, o agente citotóxico usado noconjugado pode ser um taxano ou derivado deste. Taxanos sãouma família de compostos que inclui paclitaxel (Taxol®), umproduto natural citotóxico, e docetaxel (Taxotere®) , umderivado semi-sintético, ambos usados amplamente notratamento de câncer. Taxanos são venenos do fuso mitóticoque inibem a despolimerização da tubulina, causando a mortecelular. Embora docetaxel e paclitaxel sejam agentes úteisno tratamento de câncer, sua atividade antitumoral élimitada por causa de sua toxicidade inespecífica para ascélulas normais. Além disso, os próprios compostos comopaclitaxel e docetaxel não são suficientemente potentespara serem usados em conjugados de agentes de ligaçãocelular.
Um taxano preferido para uso na preparação de umconjugado citotóxico é o taxano de fórmula (VIII):
<formula>formula see original document page 36</formula>Métodos para a síntese de taxanos que podem ser usadosno contexto da invenção, juntamente com métodos para aconjugação de taxanos aos agentes de ligação celular como,por exemplo, anticorpos, são descritos detalhadamente nasPatentes U.S. 5.416.064, 5.475.092, 6.340.701, 6.372.738,6.436.931, 6.596.757, 6.706.708 e 6.716.821, e naPublicação do Pedido de Patente U.S. N0 2004/0024049 Al.
O agente citotóxico também pode ser CC-1065 ou umderivado deste. CC-1065 é um antibiótico antitumoralpotente isolado do caldo de cultura de Streptomyceszelensis. CC-1065 é cerca de 1.000 vezes mais potente invitro do que os fármacos anticancerígenos comumente usadoscomo, por exemplo, doxorrubicina, metotrexato e vincristina(Bhuyan e cols., Câncer Res., 42: 3.532-3.537 (1982)). CC-1065 e seus análogos são revelados nas Patentes U.S.5.585.499, 5.846.545, 6.340.701 e 6.372.738. A potênciacitotóxica de CC-1065 foi correlacionada com sua atividadealquilante e com sua atividade de ligação de DNA ou deintercalar DNA. Essas duas atividades residem em partesseparadas da molécula. A esse respeito, a atividadealquilante é contida na subunidade ciclopropapirroloindol(CPI) , e a atividade de ligação de DNA reside em duassubunidades de pirroloindol de CC-1065.
Vários análogos de CC-1065 são conhecidos na técnica etambém podem ser usados como agente citotóxico no conjugado(veja, por exemplo, Warpehoski e cols., J. Med. Chem., 31:590-603 (1988)). Foi desenvolvida uma série de análogos deCC-1065 em que a porção CPI é substituída por uma porçãociclopropabenzindol (CBI) (Boger e cols., J. Org. Chem.,55: 5.823-5.833 (1990), e Boger e cols., Bioorg. Med. Chem.Lett., 1: 115-120 (1991)). Esses análogos de CC-1065 mantêma alta potência in vitro do fármaco original, sem causartoxicidade retardada em camundongos. Como CC-1065, essescompostos são agentes alquilantes que se ligam de formacovalente ao sulco menor do DNA para causar a mortecelular.
A eficácia terapêutica de análogos de CC-1065 pode sergrandemente aumentada trocando-se a distribuição in vivoatravés da liberação direcionada ao local de um tumor,resultando em uma menor toxicidade de tecidos não visadose, portanto, menor toxicidade sistêmica. Para essafinalidade, foram gerados conjugados de análogos ederivados de CC-1065 com agentes de ligação celular que sedirigem especificamente às células tumorais (veja, porexemplo, Patentes U.S. 5.475.092, 5.585.499 e 5.846.545).
Esses conjugados tipicamente exibem citotoxicidadeespecífica para o alvo elevada in vitro, e atividadeantiturnoral em modelos de autoenxerto de tumor humano emcamundongos (veja, por exemplo, Chari e cols., Câncer Res.,55: 4.079-4.084 (1995)).
Métodos para a síntese de análogos de CC-1065 sãodescritos com detalhes nas Patentes U.S. 5.475.092.5.585.499. 5.846.545. 6.534.660. 6.586.618 e 6.756.397 e naPublicação do Pedido de Patente U.S. N° 2003/0195365 Al.
Medicamentos como metotrexato, daunorrubicina,doxorrubicina, vincristina, vinblastina, melfalan,mitomicina C, clorambucil, caliqueamicina, tubulisina eanálogos de tubulisina, duocarmicina e análogos deduocarmicina, dolastatina e análogos de dolastatina tambémpodem ser usados no contexto da invenção. Compostos dedoxorrubicina e daunorrubicina (veja, por exemplo, PatenteU.S. 6.630.579) também podem ser usados como fármacos.
Os conjugados de fármacos podem ser preparados pormétodos in vitro. A fim de ligar um fármaco ou pró-fármacoao anticorpo, é utilizado um grupo de ligação. Grupos deligação adequados são bem conhecidos na técnica, e incluemgrupos dissulfeto, grupos ácidos lábeis, grupos fotolábeis,grupos peptidase lábeis e grupos esterase lábeis. Grupos deligação preferidos são grupos dissulfeto. Por exemplo, osconjugados podem ser construídos com o uso de uma reação detroca de dissulfeto entre o anticorpo e o fármaco ou pró-fármaco. As moléculas do fármaco também podem ser ligadas aum agente de ligação celular através de uma moléculatransportadora intermediária como, por exemplo, albuminasérica.
De acordo com a invenção, o agente de ligação celularé modificado por reação de um reagente de entrecruzamentobifuncional com o agente de ligação celular resultando,dessa forma, na adesão covalente de uma moléculavinculadora ao agente de ligação celular. Como aqui usado,um "reagente de entrecruzamento bifuncional" é qualquerporção química que se liga de forma covalente um agente deligação celular a um fármaco como, por exemplo, os fármacosaqui descritos. Em uma modalidade preferida da invenção,uma porção da porção de ligação é fornecida pelo fármaco. Aesse respeito, o fármaco compreende uma porção de ligaçãoque é parte de uma molécula vinculadora maior que é usadapara unir o agente de ligação celular ao fármaco. Porexemplo, para formar o maitansinóide DM1, a cadeia lateralno grupo C-3 hidroxil de maitansina é modificada para terum grupo sulfidril (SH) livre. Essa forma tiolada demaitansina pode reagir com um agente de ligação celularmodificado para formar um conjugado. Portanto, o ligantefinal é montado a partir de dois componentes, um delessendo fornecido pelo reagente de entrecruzamento, enquantoo outro é fornecido pela cadeia lateral de DM1.
Qualquer reagente de entrecruzamento bifuncionaladequado pode ser usado em relação à invenção, desde que oreagente ligante permita a retenção da atividadeterapêutica, por exemplo, as características decitotoxicidade e de direcionamento do fármaco e do agentede ligação celular, respectivamente. Preferivelmente, amolécula vinculadora une o fármaco ao agente de ligaçãocelular através de ligações químicas (as descrito acima),de tal forma que o fármaco e o agente de ligação celularsejam acoplados quimicamente (por exemplo, ligado de formacovalente) entre eles. Preferivelmente, o reagente deligação é um ligante passível de clivagem. Maispreferivelmente, o ligante é clivado sob condições suaves,ou seja, condições dentro de uma célula sob as quais aatividade do fármaco não é afetada. Exemplos de ligantescliváveis adequados incluem ligantes de dissulfeto,ligantes ácidos lábeis, ligantes fotolábeis, ligantes depeptidase lábeis e ligantes de esterase lábeis. Ligantesque contêm dissulfeto são ligantes cliváveis através detroca de dissulfeto, o que pode ocorrer sob condiçõesfisiológicas. Ligantes ácidos lábeis são ligantes cliváveisem pH ácido. Por exemplo, certos compartimentosintracelulares como, por exemplo, endossomos e lisossomos,possuem um pH ácido (pH 4-5), e fornecem condiçõesadequadas para a clivagem de ligantes ácidos lábeis.Ligantes fotolábeis são úteis na superfície corporal e emmuitas cavidades do corpo que são acessíveis à luz. Alémdisso, a luz infravermelha pode penetra no tecido. Ligantesde peptidase lábeis podem ser usados para clivar certospeptídeos dentro ou fora das células (veja, por exemplo,Trouet e cols., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 79: 626-629(1982) e Umemoto e cols., Int. J. Câncer, 43: 677-684(1989)).
De preferência, o fármaco é ligado a um agente deligação celular através de uma ligação dissulfeto. Amolécula vinculadora compreende um grupo químico reativoque pode reagir com o agente de ligação celular. Gruposquímicos reativos preferidos para reação com o agente deligação celular são ésteres de N-succinimidil e ésteres deN-sulfossuccinimidil. Adicionalmente, a moléculavinculadora compreende um grupo químico reativo,preferivelmente um grupo ditiopiridil, que pode reagir como fármaco para formar uma ligação dissulfeto. Moléculasvinculadoras particularmente preferidas incluem, porexemplo, N-succinimidil 3-(2-piridilditio)propionato (SPDP)(veja, por exemplo, Carlsson e cols., Biochem. Jr., 173:723-737 (1978)), N-succinimidil 4-(2-piridilditio)butanoato(SPDB) (veja, por exemplo, a Patente U.S. 4.563.304), N-succinimidil 4-(2-piridilditio)pentanoato (SPP) (veja, porexemplo, número de registro CAS 341498-08-6) e outrosagentes de entrecruzamento que são descritos na PatenteU.S. 6.913.748, que é aqui incorporada em sua totalidadepor referência).
Embora sejam usados preferivelmente ligantes cliváveispreferivelmente no método da invenção, um ligante nãoclivável também pode ser usado para gerar os conjugadosdescritos acima. Um ligante não clivável é qualquer porçãoquímica que é capaz de se ligar um fármaco como, porexemplo, um maitansinóide, um taxano ou um análogo de CC-1065, a um agente de ligação celular de forma estável ecovalente. Portanto, ligantes não cliváveis sãosubstancialmente resistentes à clivagem induzida por ácido,à clivagem induzida pela luz, à clivagem induzida porpeptidase, à clivagem induzida por esterase e à clivagempor ligação dissulfeto, em condições sob as quais o fármacoou o agente de ligação celular permanece ativo.
Reagentes de entrecruzamento adequados que formamligantes não cliváveis entre um fármaco e o agente deligação celular são bem conhecidos na técnica. Exemplos deligantes não cliváveis incluem ligantes que possuem umaporção éster de N-succinimidil ou éster de N-sulfossuccinimidil para reação com o agente de ligaçãocelular, além de uma porção com base em maleimido ouhaloacetil para reação com o fármaco. Reagentes deentrecruzamento que compreendem uma porção com base emmaleimido incluem N-succinimidil 4 -(maleimidometil)ciclohexanocarboxilato (SMCC), N-succinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-l-carbóxi-(6-amidocaproato) ,que é um análogo de "cadeia longa" de SMCC (LC-SMCC), ésterde ácido κ-maleimidoundecanóico de N-succinimidil (KMUA),éster de ácido γ-maleimidobutírico de N-succinimidil(GMBS), N-hidroxisuccinimida éster de ácido ε-maleimidocapróico (EMCS), éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS), éster de N-(α-maleimidoacetoxi)-succinimida (AMAS), succinimidil-6-(β-maleimidopropionamido)hexanoato (SMPH), N-succinimidil 4-(p-maleimidofenil)-butirato (SMPB) e N-(p-maleimidofenil)isocianato (PMPI). Reagentes deentrecruzamento que compreendem uma porção com base emhaloacetil incluem N-succinimidil-4-(iodoacetil) -aminobenzoato (STAB), N-succinimidil iodoacetato (SIA), N-succinimidil bromoacetato (SBA), e N-succinimidil 3-(bromoacetamido)propionato (SBAP).
Outros reagentes de entrecruzamento desprovidos de umátomo de enxofre que formam ligantes não cliváveis tambémpodem ser usados no método da invenção. Esses ligantespodem ser derivados de porções com base no ácidodicarboxllico. Porções com base no ácido dicarboxilicoadequadas incluem, sem limitação, ácidos α,τσ-dicarboxilicos da fórmula geral (IX):
<formula>formula see original document page 43</formula>
em que X é um grupo alquil, alquenil ou alquinillinear ou ramificado que possui 2 a 20 átomos de carbono, Yé um grupo cicloalquil ou cicloalquenil que abriga 3 a 10átomos de carbono, Z é um grupo aromático substituído ounão substituído que abriga 6 a 10 átomos de carbono, ou umgrupo heterocíclico substituído ou não substituído em que oheteroátomo é selecionado de Ν, 0 ou S, e em que 1, m e ηsão, cada um, 0 ou 1, desde que 1, m e η não sejam todoszero ao mesmo tempo.
Muitos dos ligantes não cliváveis aqui revelados sãodescritos em detalhes no Pedido de Patente U.S. N010/960.602, que corresponde à Publicação do Pedido dePatente U.S. N0 2005/0169933 Al.
Alternativamente, como revelado na Patente U.S.6.441.163 BI, o fármaco inicialmente pode ser modificadopara introduzir um éster reativo adequado para reagir comum agente de ligação celular. A reação dessesmaitansinóides que contêm uma porção ligante ativada com umagente de ligação celular fornece outro método de produçãode um conjugado de agente de ligação celular clivável ounão clivável-maitansinóide.
Informações adicionais relacionadas aosmaitansinóides, aos agentes citotóxicos que o compreendem,aos conjugados de fármacos e aos métodos de preparaçãorelacionados são reveladas no Pedido de Patente U.S. N011/352.121 e no Pedido de Patente U.S. N0 10/849.136, quecorresponde à Publicação do Pedido de Patente U.S. N02004/0235840 Al.
Os exemplos a seguir ilustram adicionalmente ainvenção, mas, evidentemente, não devem ser considerados deforma alguma como limitantes de seu escopo.
EXEMPLO 1
Esse exemplo demonstra a purificação de um anticorpomodificado com a reagente de modificação heterobifuncionalcom a utilização de TFF.
O anticorpo monoclonal huN901 (concentração final de 8mg/ml) foi incubado com N-succinimidil 4-(2-piridilditio)pentanoato (SPP, excesso molar de 5,6 vezes)por aproximadamente 180 minutos a 20°C em 50 mM de tampãode fosfato de potássio (pH 7,5) contendo 50 mM de NaCl, 2mM de EDTA e etanol 5%. Em um primeiro grupo, a mistura dereação foi purificada com o uso de uma coluna de resinaSephadex™ G25F equilibrada e eluída em 50 mM de tampão defosfato de potássio (pH 6,5) contendo 50 mM de NaCl e 2 mMde EDTA. Em um segundo grupo, a mistura de reação foipurificada com o uso de um sistema de TFF Pellicon XL(Millipore, Billerica, MA) , e o anticorpo foi diafiltrado(5 volumes) em 50 mM de fosfato de potássio, 50 mM de NaCl(pH 6,5) e 2 mM de EDTA, com a utilização de uma membranacom valor de corte do peso molecular de 10.000 (Ultracel™membrana de celulose regenerada, Millipore, Billerica, MA).
Ambas as amostras foram conjugadas com DMl (excesso molarde 1,7 vez em relação ao ligante não ligado) por 18 horasem pH 6,5 em tampão de fosfato de potássio contendo 50 mMde NaCl e uma concentração final de DMA 3%.
Em ambos os grupos, foram determinados os rendimentospor espectrofotometria (comprimento de onda de 280 nm) paraa etapa combinada de modificação e purificação. Asproporções de ligante/anticorpo também foram determinadaspor tratamento com ditiotreitol para liberar piridina-2-tiona, que possui um coeficiente de extinção de 8.080 M-1Cm"1 a 343 nM. As proporções de medicamento/anticorpo foramdeterminadas por espectrofotometria (comprimentos de ondade 280 nm e 252 nm) para a etapa de conjugação. Além disso,a remoção de espécies de pequena molécula relacionadas aSPP foi medida por HPLC Hisep.
Os dados resultantes são apresentados na Tabela 1.
Tabela 1: Métodos de purificação para huN901 modificado como uso de G-2 5F versus TFF
<table>table see original document page 45</column></row><table><table>table see original document page 46</column></row><table>
Como mostrado na Tabela 1, o uso de TFF gera produtoconjugado de fármaco de qualidade pelo menos equivalente aoprocesso de cromatografia não adsortiva (G25) sendo, porém,mais conveniente e escalonável.
EXEMPLO 2
Esse exemplo demonstra a purificação de um anticorpomodificado com um reagente de modificação heterobifuncionalcom a utilização de cromatografia adsortiva.
O anticorpo huB4 foi modificado com N-succinimidil 4-(2-piridilditio)butanoato (SPDB, excesso molar de 5,4vezes) por 12 0 minutos em temperatura ambiente em 5 0 mM detampão de fosfato de potássio (pH 6,5) contendo 50 mM deNaCl, 2 mM de EDTA e etanol 5%. Em um primeiro grupo, amistura de reação foi purificada com o uso da resinaSephadex™ G25F, como descrito no Exemplo 1. Em um segundogrupo, a mistura de reação foi carregada em uma coluna dehidroxiapatita cerâmica (CHT, Bio-Rad Laboratories,Hercules, CA), que foi equilibrada em 12,5 mM de tampão defosfato de potássio (pH 6,5) e eluída com 8 0 mM de tampãode fosfato de potássio (pH 6,5).
Em ambos os grupos, os rendimentos e as proporções deligante/anticorpo foram determinados como descrito noExemplo 1. O primeiro grupo teve um rendimento de 91% e umaproporção de ligante/anticorpo de 4,2. O segundo grupo teveum rendimento de 89% e uma proporção de ligante/anticorpode 4,2.
O anticorpo CNT095 (concentração final de 10 mg/ml)foi modificado com N-succinimidil 4-(2-piridilditio)butanoato (SPDB, excesso molar de 4,5 vezes)por 120 minutos a 20°C em 10 mM de tampão de fosfato desódio (pH 7,5), contendo 2,7% de sacarose e etanol 5%. Emum primeiro grupo, a mistura de reação foi purificada com ouso de resina Sephadex™ G25F em 12,5 mM de tampão defosfato de potássio (pH 6,6) contendo 12,5 mM de NaCl e 0,5mM de EDTA. Em um segundo grupo, a mistura de reação foicarregada em uma coluna de SP Sefarose Fast Flow (GEHealthcare, Piscataway, NJ) , que foi equilibrada em 10 mMde tampão de fosfato de sódio (pH 7,5), e eluída com 50 mMde tampão de fosfato de potássio (pH 7,5) contendo 50 mM deNaCl.
Em ambos os grupos, os rendimentos e as proporções deligante/anticorpo foram determinados como descrito noExemplo I. O primeiro grupo teve um rendimento de 96% e umaproporção de ligante/anticorpo de 4,0. 0 segundo grupo teveum rendimento de 97% e uma proporção de ligante/anticorpode 4,1.
Os dados obtidos nesse exemplo demonstram que acromatografia adsortiva pode ser usada para purificar um25 anticorpo modificado com um reagente de modificaçãoheterobifuncional.
EXEMPLO 3
Esse exemplo demonstra os efeitos benéficos daconjugação de um anticorpo modificado com um fármaco em um3 0 pH de acima 6,5.Em um primeiro experimento, o anticorpo CNT095 foimodificado e purificado como descrito no Exemplo 2. 0anticorpo modificado foi então dividido em dois grupos. Noprimeiro grupo, a conjugação foi realizada em 12,5 mM defosfato de potássio em pH 6,5 contendo 12,5 mM de NaCl, 0,5mM de EDTA, DMA 3% e excesso molar de 1,7 vez de fármacopor ligante a 20°C. No segundo grupo, a reação deconjugação ocorreu em pH 7,5. 0 anticorpo conjugado foipurificado sobre colunas NAP-IO.
A proporção de fármaco/anticorpo foi medida para ambosos grupos. Os dados resultantes são apresentados na Tabela 2.
Tabela 2: Proporção de medicamento/anticorpo na reação deconjugação de pH 6,5 versus 7,5
<table>table see original document page 48</column></row><table>
Como mostrado pelos dados apresentados na Tabela 2,conjugação evolui mais rápido em pH 7,5 do que em pH 6,5.
Em um segundo experimento, o anticorpo monoclonalhumanizado huB4 foi modificado com: (a) um excesso molar de4,9 vezes de SPDB em relação ao anticorpo, ou (b) umexcesso molar 4,8 vezes de SPDB era relação ao anticorpo. Emambas as situações, a reação ocorreu em 50 mM de fosfato depotássio, 50 mM de cloreto de potássio e 2 mM de EDTA (pH6,5) em etanol 5% por um total de 120 minutos emtemperatura ambiente. A amostra (a) foi purificada sobreuma coluna de resina Sephadex™ G25F equilibrada em 50 mMde fosfato de potássio, 50 mM de cloreto de sódio e 2 mM deEDTA em pH 6,5. A amostra (b) foi purificada de formaequivalente, exceto que o tampão de cromatografia foiajustado ao pH 7,5. Ambas as amostras foram conjugadas comDM4 (excesso molar de 1,7 vez em relação ao ligante ligado)por 18 horas em temperatura ambiente, em uma concentraçãofinal de dimetilacetamida (DMA) de 3%.
Portanto, a amostra (a) foi conjugada em pH 6,5, e aamostra (b) foi conjugada em pH 7,5. As amostras foramentão purificadas sobre uma coluna de resina Sephadex™G25F equilibrada em 9,6 mM de fosfato de potássio e 4,2 mMde cloreto de sódio em pH 6,5. Ambas as amostras foramincubadas a 40C por até 7 meses e submetidas à análise defármaco livre liberado em intervalos. Os dados resultantessão apresentados na Tabela 3.
Tabela 3: Liberação de medicamento livre ao longo de tempopor amostras conjugadas em pH 6,5 e 7,5
<table>table see original document page 49</column></row><table>
Como mostrado pelos dados apresentados na Tabela 3, aliberação de fármaco livre é substancialmente mais lentapela amostra (b), que foi conjugada em pH 7,5 em relação àamostra (a), que foi conjugada em pH 6,5. Conseqüentemente,o produto de conjugado de fármaco preparado em pH 7,5demonstrou ser estável com relação ã liberação de fármacolivre ao longo do tempo, comparado ao produto conjugado defármaco preparado em pH 6,5. A conjugação em pH 7,5 tambémmostrou uma melhor incorporação de fármaco do que em pH 6,5fazendo, dessa forma, com que menos fármaco seja utilizado.
EXEMPLO 4
Esse exemplo demonstra os efeitos benéficos daconjugação de um anticorpo modificado com um fármaco em umpH abaixo de 6,0.
O anticorpo monoclonal huN901 (concentração final de 8mg/ml) foi incubado com N-succinimidil 4-(2-piridilditio)pentanoato (SPP, excesso molar de 5,6 vezes)por aproximadamente 18 0 minutos a 200C em 50 mM de tampãode fosfato de potássio (pH 7,5) contendo 5 0 mM de NaCl, 2mM de EDTA e etanol 5%. Em um primeiro grupo, a mistura dereação foi purificada com o uso de uma coluna de resinaSephadex™ G25F equilibrada e eluída em 50 mM de tampão decitrato de sódio (pH 5,0) contendo 50 mM de NaCl e 2 mM deEDTA. Em um segundo grupo, a mistura de reação foipurificada com o uso de uma coluna de resina Sephadex™G25F equilibrada e eluída em 50 mM de tampão de fosfato depotássio (pH 6,5) contendo 50 mM de NaCl e 2 mM de EDTA.
Ambas as amostras foram conjugadas com DM4 (excesso molarde 1,7 vez em relação ao ligante ligado) por 3, 19, 25, 48,e 12 0 horas em temperatura ambiente, em uma concentraçãofinal de dimetilacetamida (DMA) de 3%.Portanto, o primeiro grupo de amostras foi conjugadoem 50 mM de tampão de citrato de sódio (pH 5,0) contendo 50mM de NaCl e 2 mM de EDTA, e o segundo grupo de amostrasfoi conjugado em 50 mM de tampão de fosfato de sódio (pH6,5), contendo 5 0 mM de NaCl e 2 mM de EDTA. As amostrasforam então purificadas com o uso de uma coluna de resinaSephadex™ G25F equilibrada e eluída em 50 mM de tampão defosfato de potássio (pH 6,5) contendo 50 mM de NaCl.
Em ambos os grupos, as proporções de ligante/anticorpoforam determinadas por tratamento com ditiotreitol paraliberar piridina-2-tiona, que possui um coeficiente deextinção de 8.080 M-1Cm"1 a 343 nM. As proporções demedicamento/anticorpo foram determinadas porespectrofotometria (comprimentos de onda de 280 nm e 252nm) para a etapa de conjugação.
0 primeiro grupo teve uma proporção deligante/anticorpo de 4,3. 0 segundo grupo teve umaproporção de ligante/anticorpo de 4,2.
As proporções de fármaco/anticorpo ao longo do tempopara os dois grupos são apresentadas na Tabela 4.
Tabela 4: Taxa de incorporação de DMl em huN901 modificadopor SPP em função do pH da conjugação
<table>table see original document page 51</column></row><table>Como fica evidente a partir dos dados apresentados naTabela 4, o conjugado feito por conjugação do anticorpomodificado com o fármaco em um pH de 5,0 alcança um nívelmaior e mais estável de fármaco ligado durante a evoluçãoda reação de conjugação do que o conjugado feito em um pHde conjugação de 6,5. Além do aumento da estabilidade, osresultados indicam que um nível maior de fármaco/anticorpoé alcançado mediante a conjugação em pH 5,0 do que quandose utiliza a mesma quantidade de fármaco em um pH deconjugação de 6,5, indicando, dessa forma, uma utilizaçãomais eficiente de fármaco em pH 5,0.
Em ambos os grupos, as quantidades de monômeroconjugado foram determinadas ao longo do tempo. Os dadosresultantes são apresentados na Tabela 5.
Tabela 5: Efeito do pH da conjugação no nível de monômeroconjugado durante a conjugação de huN901 modificado por SPPcom DMl
<table>table see original document page 52</column></row><table>
Como fica evidente a partir dos dados apresentados naTabela 5, o conjugado feito por conjugação do anticorpomodificado com o fármaco em um pH de 5,0 tem um nível maiorde monômero conjugado do que o conjugado feito em um pH deconjugação de 6,5.EXEMPLO 5
Esse exemplo demonstra ainda os benefícios daconjugação de um fármaco a um anticorpo modificado em um pHde menos que 6.
O anticorpo BIWA 4 foi modificado com SPP (excessomolar de SPP, como mostrado na Tabela 6) por 120-140minutos em temperatura ambiente em 50 mM de tampão defosfato de potássio (pH 6,5), 50 mM de NaCl, 2 mM de EDTA eetanol 5%. Alíquotas do anticorpo modificado forampurificadas em colunas NAP 25 separadas equilibradas emtampões que possuem vários valores de pH (pH 4,6 — 6,5) . Ostampões de pH 4,6 — 5,9 eram compostos por 35 mM de citratode sódio, 150 mM de cloreto de sódio e 2 mM de EDTA. 0tampão de pH 6,5 era composto por PBS com 2 mM de EDTA.
O anticorpo modificado em cada pH foi conjugado comDMl (excesso molar de 1,7 vez em relação ao ligante) emdimetilacetamida (DMA, concentração final de 3%) . Apósincubação por 17-18 horas em temperatura ambiente, asamostras de anticorpo conjugado foram purificadas porcromatografia em colunas NAP 25 equilibradas em PBS (pH6,5). As proporções de ligante/anticorpo (L/A na Tabela 6)foram determinadas por tratamento com ditiotreitol paraliberar piridina-2-tiona, que possui um coeficiente deextinção de 8.080 M-1Cm"1 a 343 nM. As proporções demedicamento/anticorpo foram determinadas porespectrofotometria (comprimentos de onda de 280 nm e 252nm) para a etapa de conjugação. O monômero conjugado, asespécies de alto peso molecular e as espécies de baixo pesomolecular foram determinados por SEC-HPLC com o uso de umacoluna TSKG30 0OSWXL equilibrada e desenvolvida em 0,2 M detampão de fosfato de potássio (pH 7,0) contendo 0,2 M decloreto de potássio e isopropanol 20%.
Os resultados dessa análise são apresentados na Tabela 6.
Tabela 6: Características do produto de conjugado defármaco Medicamento em relação ao pH
<table>table see original document page 54</column></row><table>
Os dados apresentados na Tabela 6 demonstram que aconjugação de SPF-BIWA 4 modificado com DMl foi eficienteem um pH abaixo de 6,0, comparada com a conjugação em pH6,5. As quantidades de ligante e fármaco, especificamenteligante SPP e DM1, necessárias para alcançar uma proporçãofinal de fármaco/anticorpo em particular foram reduzidas eem pH mais baixo. Além disso, os níveis de monômeroconjugado, das espécies de alto peso molecular e dasespécies de baixo peso molecular foram melhores, e osrendimentos melhoraram em pH mais baixo.
EXEMPLO 6
Esse exemplo demonstra que a etapa para a purificaçãodo anticorpo modificado pode opcionalmente ser eliminada. Ofármaco pode ser adicionado simultaneamente ao reagentebifuncional de modificação ou em algum momento mais tarde.
Como exemplo de adição de fármaco após o reagente demodificação, o anticorpo humanizado monoclonal CNT095 foimodificado em uma concentração de 2 0 mg/ml com o reagentebifuncional de modificação SPDB em um excesso molar de SPDBem relação ao anticorpo de 4,6 por 120 minutos a 20°C. Otampão de modificação era composto por 44 mM de tampão defosfato (pH 7,5) contendo 5,3% de sacarose e etanol 5%. Umaalíquota do anticorpo modificado foi purificada sobreresina Sephadex™ G25F (processo-padrão de quatro etapas),equilibrada e eluída em 12,5 mM de tampão de fosfato depotássio (pH 7,5) contendo 12,5 mM de NaCl, e foisubseqüentemente conjugada com DM4 (excesso molar de 1,7vez de fármaco em relação ao ligante ligado) em umaconcentração final de anticorpo modificado de 10 mg/ml em12,5 mM de tampão de fosfato de potássio (pH 7,5) contendo12,5 mM de NaCl e DMA 10% por 20 horas em temperaturaambiente. Uma segunda alíquota do anticorpo modificado foiconjugada imediatamente no final da reação de modificaçãode 120 minutos (processo de três etapas) , sem seradicionalmente purificada.
As concentrações de proteína e de tampão da mistura dereação de modificação foram ajustadas para gerar umaconcentração de proteína modificada de 10 mg/ml e umacomposição de tampão de 28 mM de fosfato de potássio (pH7,5) contendo 5,9 mM de NaCl e 2,7% de sacarose. A seguir,foi acrescentado DM4 (excesso molar de 1,7 vez em relaçãoao SPDB de partida) , e o DMA foi ajustado até umaconcentração final de 10%. Após incubação de 20 horas emtemperatura ambiente, ambas as alíquotas de anticorpoconjugado foram purificadas em resina Sephadex™ G25Fequilibrada em 10 mM de histidina e 10% de sacarose em pH5,5.
As proporções de ligante/anticorpo (L/A) foramdeterminadas por tratamento com ditiotreitol para liberarpiridina-2-tiona, que possui um coeficiente de extinção de8.080 M-1Cm"1 a 343 nM. As proporções e o rendimento demedicamento/anticorpo (D/A) foram determinados porespectrofotometria (comprimentos de onda de 280 nm e 252nm) para a etapa de conjugação. As percentagens de monômeroforam testadas por SEC-HPLC. As percentagens de fármacolivre foram testadas por HPLC em uma coluna Hisep. Osresultados dessas análises são apresentados na Tabela 7.
Tabela 7: Eliminação opcional da etapa de purificação paraanticorpo modificado
<table>table see original document page 56</column></row><table>
Como demonstrado pelos resultados apresentados naTabela 7, a etapa para a purificação do anticorpomodificado pode ser eliminada no contexto da invenção.
EXEMPLO 7
Esse exemplo demonstra um meio aperfeiçoado depurificação de anticorpo que foi modificado com um reagentede modificação heterobifuncional e depois conjugado com ummaitansinóide.O anticorpo huN901 modificado com SPP (excesso molarde 7 vezes) e purificado em resina Sephadex™, comodescrito no Exemplo 1, foi conjugado com o maitansinóideDMl (excesso molar de 1,7 vez em relação ao ligante,dissolvido em dimetilacetamida (DMA), concentração final de3%).
Uma primeira amostra do conjugado foi purificada porcromatografia-padrão em resina Sephadex™ G25F em tampão desoro fisiológico fosfatado (PBS, pH 6,5).
Uma segunda amostra do conjugado foi purificada por umsistema de TFF Pellicon XL (Millipore, Billerica, MA), comodescrito no Exemplo 1.
Uma terceira amostra do conjugado foi purificada com ouso de uma coluna de resina MEP Hypercell equilibrada em 50mM de Tris (pH 8,0), e eluída com 5 0 mM de acetato de sódioCpH 4,0).
Uma quarta amostra do conjugado foi purificada com ouso de uma coluna de resina UNOsphere S equilibrada em 50mM de fosfato de sódio (pH 6,5), e eluída com 0,2 M de NaCle 50 mM de fosfato de sódio (pH 6,5).
Uma quinta amostra do conjugado foi purificada com ouso de uma coluna de resina CHT (Bio-Rad Laboratories,Hercules, CA) equilibrada em 5 0 mM de fosfato de sódio (pH6,5), e eluída com 0,3 M de NaCl e 50 mM de fosfato desódio (pH 6,5).
Uma sexta amostra do conjugado foi purificada com ouso de uma coluna de resina SP Sefarose equilibrada em 35mM de citrato de sódio, 10 mM de cloreto de sódio (pH 5,0),e eluída com 0,25 M de NaCl, 35 mM de citrato de sódio (pH 5,0).O monômero conjugado foi determinado por SEC-HPLC como uso de uma coluna de resina TSKG3000SWxL equilibrada edesenvolvida em 0,2 M de tampão de fosfato de potássio empH 7,0, contendo 0,2 M de cloreto de potássio e isopropanol20%. O rendimento da etapa de conjugação foi determinadodividindo-se o rendimento de anticorpo conjugado pelaquantidade de anticorpo modificado que foi conjugada(determinada por espectrofotometria em um comprimento deonda de 28 0 nm).
Os resultados dessas análises são apresentados naTabela 8.
Tabela 8: Comparação da etapa purificação da conjugação
<table>table see original document page 58</column></row><table>
Os resultados na Tabela 8 mostram que todos os métodosde purificação da invenção (grupos 2-6) geraram rendimentossimilares àqueles obtidos com o processo de controle (grupo1). Cada método cromatográfico da invenção gerou umamelhora no nível de monômero conjugado e pode serfacilmente escalonado.
Além da CHT (hidroxiapatita cerâmica), CFT(fluorapatita cerâmica) também pode ser usado sob condiçõescromatográficas similares. Alternativamente, tanto a resinaCHT quanto a resina CFT podem ser usadas no modo nãoadsortivo, na medida em que o produto desejado(substancialmente conjugado monomérico) não é retido pelasresinas, enquanto as espécies de alto peso molecular sãoretidas e, assim, separadas do produto desejado.
Embora uma composição padronizada de tampão/solventepara conjugação compreenda DMA 3%, 50 mM de fosfato depotássio, 50 mM de NaCl e 2 mM de EDTA em pH 6,5 (comoutilizada no Exemplo 1), outras composições são maiscompatíveis com algumas das etapas cromatográficas aquidescritas, e fornecem outros benefícios em relação aoprocesso padronizado. Por exemplo, a conjugação pode serrealizada em DMA 3%, 12,5 mM de fosfato de potássio, 12,5mM de NaCl e 0,5 mM de EDTA em pH 6,5. Sob essas condições,a quantidade de DM4 incorporada em relação à quantidade deligante incorporada no anticorpo huB4 foi cerca de 10%maior do que para as condições padronizadas. Além disso,essas condições são mais compatíveis com a carga em resinascomo, por exemplo, resinas de troca catiônica e CHT.
Todas as referências, incluindo publicações, pedidosde patentes e patentes aqui citados, são aqui incorporadospor referência, na mesma extensão como se cada referênciafosse individual e especificamente indicada para serincorporada por referência e fosse aqui apresentada em suatotalidade.
O uso de os termos "um", "uma", "o" e "a" e referentessimilares no contexto da descrição da invenção(especialmente no contexto das reivindicações a seguir)devem ser considerados como englobando as forma tanto nosingular quanto no plural, a menos que aqui especificado deforma diferente ou claramente contra-indicado pelocontexto. Os termos "que compreende", "que possui", "queinclui" e "contendo" devem ser considerados como termos emaberto (ou seja, que significam "que incluem semlimitação"), a menos que observado de forma diferente. Acitação neste pedido de intervalos de valores visasimplesmente a servir como um método abreviado de sereferir individualmente a cada valor separado incluído nointervalo, a menos que aqui especificado de formadiferente, e cada valor separado é incorporado naespecificação como se fosse individualmente aqui citado.
Todos os métodos aqui descritos podem ser realizados emqualquer ordem adequada, a menos que aqui especificado deforma diferente ou de algum outro modo claramente contra-indicado pelo contexto. 0 uso de qualquer um e de todos osexemplos ou linguagem exemplar (por exemplo, "tal como")aqui fornecidos, visa simplesmente a melhor esclarecer ainvenção, e não impõe uma limitação ao escopo da invenção,a menos que especificado de forma diferente. Nenhumalinguagem na especificação deve ser considerada comoindicativa de qualquer elemento não reivindicado como sendoessencial à prática da invenção.
São aqui descritas modalidades preferidas da invenção,incluindo o melhor modo conhecido pelos inventores para aprática da invenção. Variações dessas modalidadespreferidas podem se tornar evidentes para aqueleshabilitados na técnica mediante a leitura da descriçãoapresentada anteriormente. Os inventores esperam queaqueles habilitados na técnica empreguem essas variações daforma adequada, e os inventores desejam que a invenção sejapraticada de uma forma diferente daquelas aqui descritasespecificamente. Conseqüentemente, essa invenção incluitodas as modificações e equivalentes do assunto em telacitados nas reivindicações em anexo da forma permitidapelas leis aplicáveis. Além disso, qualquer combinação doselementos descritos acima, em todas as variações possíveisdestes, é englobada pela invenção, a menos que aquiespecificado de forma diferente ou de algum outro modoclaramente contra-indicado pelo contexto.

Claims (36)

1. Processo para a preparação de um conjugado deagente de ligação a célula-agente citotóxico caracterizadopor compreender as etapas de:(a) contato de um agente de ligação a célula com umreagente de entrecruzamento bifuncional para anexar deforma covalente um ligante ao agente de ligação a célula edessa forma preparar uma primeira mistura que compreende oagente de ligação a células que têm ligantes ligados a ele,(b) submissão da primeira mistura à filtração defluxo tangencial, precipitação seletiva, filtraçãoadsortiva ou cromatografia adsortiva e dessa forma prepararuma primeira mistura purificada de agente de ligação acélulas que têm ligantes ligados a ele,(c) conjugação de um agente citotóxico ao agente deligação a células que têm ligantes ligados a ele naprimeira mistura purificada por reação do agente de ligaçãoa células que têm ligantes ligados a ele com um agentecitotóxico em uma solução que tem um pH inferior a 6,0 ousuperior a 6,5 para preparar uma segunda mistura quecompreende (i) agente de ligação a célula quimicamenteunido através do ligante ao agente citotóxico, (ii) agentecitotóxico livre, e (iii) subprodutos da reação, e(d) submissão da segunda mistura a uma filtração defluxo tangencial, precipitação seletiva, filtraçãoadsortiva ou cromatografia adsortiva para purificar oagente de ligação a células, quimicamente unido através dosligantes ao agente citotóxico dos outros componentes dasegunda mistura e dessa forma preparar uma segunda misturapurificada.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a cromatografia adsortiva éselecionada do grupo que consiste em hidroxiapatita,cromatografia de indução de carga hidrofóbica (HCIC),cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), cromatografiade troca iônica, cromatografia de troca iônica de modomisto, cromatografia por afinidade de metal imobilizado(IMAC), cromatografia de ligante de corante, cromatografiapor afinidade, cromatografia de fase reversa, e combinaçõesdessas.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que filtração de fluxotangencial é utilizada nas etapas (b) e (d) .
4. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que acromatografia adsortiva é utilizada nas etapas (b) e (d) .
5. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que, se afiltração de fluxo tangencial for utilizada na etapa (b), acromatografia adsortiva não é utilizada na etapa (d).
6. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que acromatografia adsortiva é utilizada na etapa (b) e afiltração de fluxo tangencial é utilizada na etapa (d).
7. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, caracterizado pelo fatode que a solução na etapa (c) tem um pH de cerca de 4 a 6,0.
8. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, caracterizado pelo fatode que a solução na etapa (c) tem um pH de 6,5 a cerca de 9.
9. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, caracterizado pelofato de que a solução na etapa (c) compreende sacarose.
10. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9, caracterizadopelo fato de que a solução na etapa (c) também compreendeum agente de tamponamento selecionado do grupo que consisteem um tampão de citrato, um tampão de acetato, um tampão desuccinato e um tampão de fosfato.
11. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10,caracterizado pelo fato de ainda compreender:(e) manter a mistura entre pelo menos uma das etapasa-b, b-c ou c-d para liberar os ligantes do agente deligação a células.
12. Processo, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que a mistura é mantida entre asetapas a-b.
13. Processo, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que a mistura é mantida entre asetapas b-c.
14. Processo, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que a mistura é mantida entre asetapas c-d.
15. Processo para a preparação um conjugado de agentede ligação a célula-agente citotóxico caracterizado porcompreender as etapas de:(a) contato de um agente de ligação a célula com umreagente de entrecruzamento bifuncional para anexar deforma covalente um ligante ao agente de ligação a célula edessa forma preparar uma primeira mistura que compreende oagente de ligação a células que têm ligantes ligados a ele,(b) conjugação de um agente citotóxico ao agente deligação a células que têm ligantes ligados a ele naprimeira mistura purificada por reação do agente de ligaçãoa células que têm ligantes ligados a ele com um agentecitotóxico em uma solução que tem um pH de cerca de 6,0 acerca de 9,0 para preparar uma segunda mistura quecompreende (i) agente de ligação a célula quimicamenteunido através do ligante ao agente citotóxico, (ii) agentecitotóxico livre, e (iii) subprodutos da reação produzidosdurante a etapa (b), e(c) submissão da primeira mistura à filtração defluxo tangencial, precipitação seletiva, filtraçãoadsortiva, cromatografia adsortiva, ou uma combinaçãodestes,para purificar os agentes de ligação a célulasquimicamente acoplados através de ligantes ao agentecitotóxico de outros componentes da segunda mistura e dessaforma preparar uma segunda mistura purificada de agente deligação a células quimicamente acoplados através deligantes ao agente citotóxico,desde que a primeira mistura não seja sujeita afiltração de fluxo tangencial, precipitação seletiva,filtração adsortiva ou cromatografia adsortiva.
16. Processo, de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato de que a primeira mistura não ésujeita à purificação.
17. Processo, de acordo com as reivindicações 15 ou- 16, caracterizado pelo fato de que a croraatograf iaadsortiva é selecionada do grupo que consiste emcromatografia com hidroxiapatita, cromatografia de induçãode carga hidrofóbica (HCIC), cromatografia de interaçãohidrofóbica (HIC), cromatografia de troca iônica,cromatografia de troca iônica de modo misto, cromatografiapor afinidade de metal imobilizado (IMAC), cromatografia deligante de corante, cromatografia por afinidade,cromatografia de fase reversa, e combinações destas.
18. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 15, 16 ou 17, caracterizado pelo fato de quea solução da etapa (b) tem um pH de cerca de 4 a cerca de 6,0.
19. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 15, 16 ou 17, caracterizado pelo fato de quea solução da etapa (b) tem um pH de cerca de 6,5 a cerca de 9,0.
20. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 15, 16 ou 17, caracterizado pelo fato de quea solução da etapa (b) tem um pH inferior a 6,0 ou um pHsuperior a 6,5.
21. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 15, 16, 17, 18, 19 ou 20, caracterizado pelofato de que a solução da etapa (b) compreende sucrose.
22. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 21, caracterizadopelo fato de que a solução da etapa (b) ainda compreende umagente de tamponamento selecionado do grupo que consiste emum tampão de citrato, um tampão de acetato, um tampão desuccinato e um tampão de fosfato.
23. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22,caracterizado pelo fato de que ainda compreender:(d) manter a mistura entre pelo menos uma das etapasa-b e etapas b-c para liberar os ligantes do agente deligação a células.
24. Processo, de acordo com a reivindicação 23,caracterizado pelo fato de que a mistura é mantida entre asetapas a-b.
25. Processo, de acordo com a reivindicação 23,caracterizado pelo fato de que a mistura é mantida entre asetapas b-c.
26. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25,caracterizado pelo fato de que o agente de ligação a célulaé selecionado do grupo que consiste em anticorpos,interferons, interleucina 2 (IL-2), interleucina 3 (IL-3),interleucina 4 (IL-4), interleucina 6 (IL-6), insulina,EGF, TGF-a, FGF, G-CSF, VEGF, MCSF, GM-CSF, etransferrina.
27. Processo, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato de que o agente de ligação a célulaé um anticorpo.
28. Processo, de acordo com a reivindicação 27,caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpomonoclonal.
29. Processo, de acordo com a reivindicação 28,caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpomonoclonal humanizado.
30. Processo, de acordo com a reivindicação 29,caracterizado pelo fato de que o anticorpo é selecionado dogrupo que consiste em huN901, huMy9-6, huB4, huC242,trastuzumab, bivatuzumab, sibrotuzumab, CNT095, huDS6, erituximab.
31. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,- 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30,caracterizado pelo fato de que o agente citotóxico éselecionado do grupo que consiste em maitansinóides,taxanos, and CCl065.
32. Processo, de acordo com a reivindicação 31,caracterizado pelo fato de que o agente citotóxico é ummaitansinóide.
33. Processo, de acordo com a reivindicação 32,caracterizado pelo fato de que o maitansinóide compreendeum grupo tiol.
34. Processo, de acordo com a reivindicação 33,caracterizado pelo fato de que o maitansinóide é DM1.
35. Processo, de acordo com a reivindicação 33,caracterizado pelo fato de que o maitansinóide é DM4.
36. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,- 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30,- 31, 32, 33, 34 ou 35, caracterizado pelo fato de que o agentede ligação a célula é quimicamente ligado ao medicamento vialigações químicas selecionadas do grupo que consiste emligações de dissulfeto, ligações instáveis em ácido, ligaçõesfoto-instáveis, ligações instáveis de peptidase, ligações detioéter, e ligações instáveis de esterase.
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