BRPI0615087A2 - métodos e composições para a expressão de um polinucleotìdeo de interesse - Google Patents

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Donglong Liu
Albert L Lu
Wayne J Mehre
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Abstract

MéTODOS E COMPOSIçõES PARA A EXPRESSãO DE UM POLINUCLEOTìDEO DE INTERESSE. Métodos e composições para a expressão de um polinucleotídeo de interesse são fornecidos. As composições compreendem um domínio intensificador apresentado em Id. de Seq. N : 1, 10, 15 ou 16 e variantes e fragmentos ativos destes. Também são fornecidas construções de DNA que compreendem pelo menos uma sequência intensificadora de transcrição que compreende a sequência de nucleotídeos apresentada em Id. de Seq. N :1, 10, 15 ou 16 ou uma variante e fragmento ativo destes, operacionalmente ligados a um promotor heterólogo. Tais regiões reguladoras de transcrição quiméricas podem ser operacionalmente ligadas a qualquer polinucleotídeo de interesse. Também são fornecidas células, plantas, partes de plantas, e germeplasma que compreendem a construção de DNA. Métodos de uso da região reguladora de transcrição quimérica são também fornecidos. Em modalidades específicas, métodos de expressão de um polinucleotídeo de interesse, incluindo, por exemplo, sequências que conferem tolerância a herbicidas, e métodos para selecionar uma célula que tem a construção de DNA, são fornecidos.

Description

MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA A EXPRESSÃO DE UMPOLINUCLEOTÍDEO DE INTERESSECampo da invenção
A presente invenção é dirigida ao campo de genética ebiologia molecular, mais particularmente, as composições emétodos são direcionados ã expressão de polinucleotídeos deinteresse.
Fundamento da invenção
Expressão de seqüências de DNA heterólogo em umhospedeiro de planta é dependente da presença de umpromotor operacionalmente ligado que é funcional em umhospedeiro de planta. A escolha da seqüência do promotordeterminará quando e onde no organismo a seqüência de DNAheterólogo é expressa. Quando a expressão em tecidos ouórgãos específicos é desejada, promotores com preferênciapara tecido podem ser usados. Quando a expressão de gene emresposta a um estímulo é desejada, promotores indutíveissão o elemento regulador de escolha. Em contraste, quandoexpressão contínua é desejada através das células de umaplanta, são utilizados promotores constitutivos. Seqüênciasreguladoras adicionais acima e/ou abaixo da seqüência depromotor de núcleo podem ser incluídas nas construções deexpressão de vetores de transformação para realizar níveisvariáveis de expressão de seqüências de nucleotídeosheterólogos em uma planta transgênica.
Freqüentemente é desejável expressar uma seqüência deDNA em tecidos ou órgãos em particular de uma a planta. Porexemplo, resistência aumentada de uma planta à infecção porpatógenos que nascem no solo e ar deve ser realizada pormanipulação genética do genoma da planta para compreenderum promotor com preferência para tecido operacionalmenteligado a um gene de resistência a patógeno heterólogo demodo que as proteínas de resistência a patógeno sejamproduzidas no tecido de planta desejado.
Alternativamente, deve ser desejável inibir aexpressão de uma seqüência de DNA nativa em tecidos deplanta para atingir um fenótipo desejado. Nesse caso, talinibição deve ser realizada com transformação de uma plantapara compreender um promotor com preferência para tecidooperacionalmente ligado a uma seqüência de nucleotídeosanti-senso, de modo que a expressão da seqüência anti-sensoproduz um transcrito de RNA que interfere com a tradução domRNA da seqüência de DNA nativo.
Portanto, a isolação e caracterização de seqüênciasreguladoras que podem ser posicionadas acima e/ou abaixo daseqüência de promotor de núcleo e que geram níveisvariáveis de expressão de seqüências de nucleotídeosheterólogos em uma planta transgênica são necessárias paraa manipulação genética de plantas.
Breve sumário da invenção
Métodos e composições para expressão de umpolinucleotídeo de interesse são fornecidos. As composiçõescompreendem um domínio intensificador apresentado em Id. deSeq. N0 :1, 10, 15, 16, 17 ou 18 e variantes e fragmentosativos desses. Também são fornecidas construções DNA quecompreendem pelo menos uma seqüência intensificadora detranscrição que compreende a seqüência de nucleotídeosapresentada em Id. de Seq. N0 :1, 10, 15, 16, 17, ou 18 ouuma variante e fragmento ativo desses, operacionalmenteligado a um promotor heterólogo. Tais regiões reguladorasde transcrição quiméricas podem ser operacionalmenteligadas a qualquer polinucleotídeo de interesse. Também sãofornecidas células, plantas, partes de plantas egermeplasma que compreendem a construção de DNA.
Métodos de uso da região reguladora de transcriçãoquimérica são também fornecidos. Em modalidadesespecíficas, métodos de expressão de um polinucleotídeo deinteresse, que incluem, por exemplo, seqüências queconferem tolerância a herbicidas, e métodos para selecionaruma célula que tem a construção de DNA são fornecidos.
Breve descrição dos desenhos
A Figura 1 fornece exemplos de construções que têmelementos intensificados 35S.
A Figura 2 fornece um esquema que demonstra o efeitode intensificadores 35S sobre a eficácia de TX.
A Figura 3 fornece um esquema que demonstra o efeitode intensificadores 35S sobre a eficácia de TO.
A Figura 4 fornece um esquema que demonstra o efeitode intensificadores 35S sobre número de cópia de eventos.
A Figura 5 fornece um esquema que demonstra o efeitode intensificadores 35S sobre a expressão.
A Figura 6 fornece um ensaio de avaliação de geneinseticida.
A Figura 7 fornece um esquema que mostra odesenvolvimento de um esquema de seleção de GAT.
A Figura 8 demonstra que GAT pode ser usado como ummarcador selecionável.
A Figura 9 fornece um esquema que demonstra aseficiências de transformação de GAT.Descrição detalhada da invenção
A presente invenção será agora descrita maiscompletamente com referência aos desenhos em anexo, em quealgumas, mas não todas as modalidades da invenção sãomostradas. De fato, essas invenções podem ser englobadas emvárias diferentes formas e não devem ser interpretadas comolimitadas às modalidades aqui apresentadas; ao contrário,essas modalidades são fornecidas de modo que essa revelaçãosatisfaça requisitos legais aplicáveis. Números semelhantesreferem-se a elementos semelhantes.
Várias modificações e outras modalidades da invençãoaqui apresentadas estarão óbvias para a pessoa habilitadana técnica a qual essa invenção pertence tendo o benefíciodos ensinamentos apresentados na descrição antecedente e osdesenhos associados. Portanto, deve-se compreender que ainvenção não deve ser limitada às modalidades específicasaqui reveladas e que modificações e outras modalidadesdevem ser incluídas no escopo das modalidades aquireveladas. Embora termos específicos sejam aqui empregados,eles são usados em um sentido genérico e descritivo apenase não com o objetivo de limitação.
I. Polinucleotídeos
Composições da invenção compreendem um domíniointensificador de uma região de controle de transcrição evariantes e fragmentos daquele domínio intensificador.Quando o domínio intensificador é operacionalmente ligado aum promotor, uma região de regulação de transcriçãofuncional é formada que pode direcionar a expressão de umpolinucleotídeo operacionalmente ligado de interesse. Emparticular, a presente invenção gera polinucleotídeosisolados que compreendem o domínio intensificadorapresentado em Id. de Seq. N°: 1, 10, 15, 16, 17 ou 18;variantes e fragmentos ativos desses; e, polinucleotídeosque consistem na seqüência de Id. de Seq. Nc:1, 10, 15, 16,17 ou 18. Ainda em modalidades adicionais, o domíniointensificador empregado não compreende a região para opromotor 35S de cerca de posição -90 a cerca de -46. Aregião de -90 a -46 do promotor é apresentada em Id. deSeq. N°:5.
0 termo "promotor" deve significar uma regiãoreguladora de DNA que compreende uma região de iniciação detranscrição, que, em algumas modalidades, compreende umacaixa TATA capaz de direcionar RNA polimerase II parainiciar a síntese de RNA no sítio de iniciação detranscrição adequado para uma seqüência codificadoraparticular. 0 promotor também pode ser operacionalmenteligado a elementos reguladores adicionais que influenciam atranscrição, incluindo, sem limitação, íntrons, regiões nãotraduzidas 5' e elementos intensificadores. Como aquiusado, uma "seqüência intensificadora", "domíniointensificador", "elemento intensificador" ou
"intensificador", quando operacionalmente ligados a umpromotor adequado, modularão o nível de transcrição de umpolinucleotídeo de interesse operacionalmente ligado. Emmodalidades específicas, o intensificador da invenção podealterar padrões de expressão de promotor normais. Por
<formula>formula see original document page 6</formula> exemplo, um promotor preferido/específico para tecido,quando operacionalmente ligado a um intensificador dainvenção, demonstrará expressão ectópica que não énormalmente observada com o promotor isoladamente. Porexemplo, o promotor de oleosina é um promotor compreferência por semente mas mostra expressão de folha napresença do intensificador da invenção ou variante efragmento ativo desses. Em um outro exemplo, o promotorZrp2, que é um promotor com preferência para folha, torna-se constitutivo quando operacionalmente ligado à seqüênciaintensificadora da invenção ou uma variante e fragmentobiologicamente ativo desses, e o promotor RM2, um promotorde raiz, quando operacionalmente ligado ao intensificadorda invenção ou variante e fragmento biologicamente ativodesses mostrará expressão em folha. Portanto, ascomposições da presente invenção também compreendem umpolinucleotideo que compreende uma região de controle detranscrição quimérica que compreende o promotoroperacionalmente ligado a pelo menos uma, duas, três,quatro ou mais cópias do domínio intensificador ou umavariante ou fragmento ativo do domínio. Tais composiçõespermitem a expressão de um polinucleotideo operacionalmenteligado de interesse.
A invenção engloba polinucleotideo isolado ousubstancialmente purificado ou composições da proteína. Umpolinucleotideo "isolado" ou "purificado" ou porçõesbiologicamente ativas desse, é substancial ouessencialmente livre de componentes que normalmenteacompanham ou interagem com o polinucleotideo comoencontrado em seu ambiente de ocorrência natural. Dessaforma, um polinucleotideo isolado ou purificado ésubstancialmente livre de outro material celular ou meio decultura quando produzido por técnicas recombinantes, ousubstancialmente livre de precursores químicos ou outrassubstâncias químicas quando sintetizado quimicamente.
Otimamente, um polinucleotídeo "isolado" é livre deseqüências (preferivelmente seqüências codificadoras deproteína) que flanqueiam naturalmente o polinucleotídeo (ouseja, seqüências localizadas nas extremidades 5' e 3' dopolinucleotídeo) no DNA genômico do organismo do qual opolinucleotídeo é derivado. Por exemplo, em váriasmodalidades, o polinucleotídeo isolado pode conter menos doque cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, ou 0,1kb de seqüências de nucleotídeos que flanqueiamnaturalmente o polinucleotídeo no DNA genômico da célula daqual o polinucleotídeo é derivado.
Um polinucleotídeo que é substancialmente livre dematerial celular inclui preparações que têm menos que cercade 30%, 20%, 10%, 5%, ou 1% (em peso seco) de proteína oupolinucleotídeos contaminantes. Quando o polinucleotídeo dainvenção ou porção biologicamente ativa desse érecombinantemente produzido, o meio de cultura representamenos que cerca de 30%, 20%, 10%, 5%, ou 1% (em peso seco)de precursores químicos.
Fragmentos e variantes da seqüência intensificadorarevelada são também englobados pela presente invenção. Emparticular, fragmentos e variantes do domíniointensificador de Id. de Seq. N0 :1, 10, 15, 16, 17 ou 18são fornecidos. Como aqui usado, o termo "fragmento"significa uma porção do polinucleotídeo. Fragmentos de umdomínio intensificador podem reter a atividade biológica demodulação (aumento ou diminuição) do nível de transcriçãoquando operacionalmente ligado a um promotor adequado.
Alternativamente, fragmentos de um polinucleotídeo que sãoúteis como marcadores de hibridização podem não reternecessariamente a atividade biológica. Fragmentos de umpolinucleotídeo para o domínio intensificador podem variarde pelo menos cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 100nucleotídeos, cerca de 150 nucleotídeos, cerca de 200nucleotídeos, cerca de 250 nucleotídeos, cerca de 300nucleotídeos, cerca de 350 nucleotídeos, cerca de 400nucleotídeos, cerca de 450 nucleotídeos, cerca de 500nucleotídeos, e até a seqüência de nucleotídeos decomprimento total da invenção para o domínio intensificadorda invenção. Em outras modalidades, um fragmento do domíniointensificador compreende um comprimento de cerca de 50 acerca de 100, 100 a cerca de 150, 150 a cerca de 200, 200 acerca de 250, cerca de 250 a cerca de 300, cerca de 300 acerca de 350, cerca de 350 a cerca de 400, cerca de 400 acerca de 450, cerca de 450 a cerca de 500, cerca de 500 acerca de 535 nucleotídeos.
Em modalidades específicas, as variantes ativas efragmentos do intensificador compreendem regiõesconservadas. Tais regiões incluem uma ou mais dasseqüências sublinhadas apresentadas abaixo
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(Id. de Seq. N°:l). Veja, também, Fang e cols. (1989) ThePlant Cell 1:141-150, aqui incorporado por referência.
Uma porção biologicamente ativa do domíniointensificador pode ser preparada por isolação da porção dodomínio intensificador da invenção e avaliação da atividadede regulação da transcrição do fragmento. Métodos paradetectar regulação de transcrição incluem, por exemplo,avaliação do nível do polinucleotídeo operacionalmenteligado de interesse ou avaliação da expressão de umpolipeptídeo codificado por uma seqüência operacionalmenteligada de interesse. Tais ensaios podem medir diretamente onível do polinucleotídeo ou polipeptídeo ou eles podemavaliar a atividade ou um fenótipo esperado quando aexpressão da seqüência é alterada. Tais ensaios sãoconhecidos na técnica.
Como aqui usado, o termo "variantes" refere-se aseqüências substancialmente similares. Parapolinucleotídeos, variantes de ocorrência natural podem seridentificadas com o uso de técnicas de biologia molecularbem conhecidas, como, por exemplo, com reação de cadeia depolimerase (PCR) e técnicas de hibridização como aquiapontado. Para polinucleotídeos, uma variante compreendeuma deleção e/ou adição de um ou mais nucleotídeos em um oumais sítios internos no polinucleotídeo nativo e/ou umasubstituição de um ou mais nucleotídeos em um ou maissítios no polinucleotídeo nativo. Como aqui usado, umpolinucleotídeo "nativo" compreende uma seqüência denucleotídeos de ocorrência natural. Para polinucleotídeos,variantes de ocorrência natural podem ser identificadas como uso de técnicas de biologia molecular bem conhecidas ,como por exemplo, com reação de cadeia de polimerase (PCR)e técnicas de hibridização como apontado abaixo.Polinucleotídeos variantes também incluem seqüências denucleotídeos sinteticamente derivadas, como aquelasgeradas, por exemplo, pelo uso de mutagênese direcionada asítio.
Geralmente, variantes de um polinucleotídeo particularda invenção terão pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%,60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüênciaàqueles polinucleotídeos particulares como determinado porprogramas de alinhamento de seqüência e parâmetrosdescritos em outra parte nessa. Uma variante biologicamenteativa de um polinucleotídeos da invenção pode diferirdaquela seqüência em 1-15 resíduos de ácido nucleico, as 1-10, 6-10, e tão poucos quantos 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2,ou mesmo 1 resíduo de ácido nucleico.
Portanto, os genes e polinucleotídeos da invençãoincluem as seqüências de ocorrência natural bem como formasmutantes. Tais variantes continuarão a possuir a atividadereguladora de transcrição desejada. As deleções, inserções,e substituições das seqüências englobadas nessa não devemproduzir mudanças radicais nas características daseqüência. Entretanto, quando é difícil prever o efeitoexato da substituição, deleção, ou inserção comantecedência, uma pessoa habilitada na técnica perceberáque o efeito será avaliado por ensaios rotineiros derastreamento. Ou seja, a atividade pode ser avaliada com ouso de ensaios em outra parte nessa.
Polinucleotídeos variantes também englobam seqüênciasderivadas de um procedimento mutagênico e recombinogênicocomo embaralhamento de DNA. Com tal procedimento, uma oumais diferentes seqüência de domínio intensificador para opromotor podem ser manipuladas para criar um novo domíniointensificador. Desse modo, bibliotecas de polinucleotídeosrecombinantes são geradas a partir de uma população depolinucleotídeos de seqüência relacionados que compreendemregiões de seqüência que têm identidade de seqüênciasubstancial e podem ser recombinados de forma homóloga invitro ou in vivo. Estratégias para tal embaralhamento deDNA são conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Stemmer(1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: 10747-10751; Stemmer(1994) Nature 370: 389-391; Crameri e cols. (1997) NatureBiotech. 15: 436-438; Moore e cols. (1997) J. Mol. Biol.272: 336-347; Zhang e cols. (1997) Proc. Natl. Acad. Sei.USA 94: 4504-4509; Crameri e cols. (1998) Nature 391: 288-291; e Patentes U.S. Nos. 5.605.793 e 5.837.458.
Os polinucleotídeos da invenção podem ser usados paraisolar seqüências correspondentes de outros organismos,particularmente outras plantas, mais particularmente outrasmonocotiledôneas. Dessa forma, podem ser usados métodostais como PCR, hibridização, e semelhantes para identificartais seqüências com base em sua homologia de seqüência comas seqüências aqui apresentadas. As seqüências isoladas combase em sua identidade de seqüência com o domíniointensificador inteiro aqui apresentado ou a fragmentos ouvariantes dessas são englobadas pela presente invenção.
Em uma abordagem de PCR, podem ser projetadosiniciadores de oligonucleotídeo para uso em reações de PCRpara amplificar seqüências de DNA correspondentes a partirde DNA genômico extraído de qualquer planta de interesse.Métodos para o projeto de iniciadores de PCR e clonagem porPCR são geralmente conhecidos na técnica e revelados emSambrook e cols. (198 9) Molecular Cloning: A LaboratoryManual (2a ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview, Nova York) aqui referido a seguir comowSambrook". Veja também Innis e cols., eds. (1990) PCRProtocols: A Guide to Methods and Applications (AcademicPress, Nova York); Innis e Gelfand, eds. (1995) PCRStrategies (Academic Press, Nova York); e Innis e Gelfand,eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nova York).Métodos de PCR conhecidos incluem, sem limitação, métodosque usam iniciadores pareados, iniciadores abrigados,iniciadores únicos específicos, iniciadores degenerados,iniciadores gene-específicos, iniciadores vetor-específicos, iniciadores parcialmente não combinados eoutros.
Em técnicas de hibridização, toda ou parte de umpolinucleotídeo conhecido é usada como um marcador quehibridiza seletivamente para outras seqüências denucleotídeos correspondentes presentes em uma população defragmentos clonados de DNA genômico de um organismoescolhido. Os marcadores de hibridização podem serrotulados com um grupo detectável como por exemplo 32P, ouqualquer outro marcador detectável. Dessa forma, porexemplo, podem ser feitos marcadores para hibridizaçãorotulando -se oligonucleotideos sintéticos com base domíniointensificador da invenção. Métodos para a preparação demarcadores para hibridização e para a construção debibliotecas genômicas são geralmente conhecidos na técnicae revelados em Sambrook.
Por exemplo, a seqüência de domínio intensificadorinteira aqui revelada, ou uma ou mais porções dessa, podeser usada como um marcador capaz de hibridizarespecificamente para seqüência de domínio intensificadorcorrespondentes. Para se obter hibridização específica sobvárias condições, esses marcadores incluem seqüências quesão exclusivas dentre seqüências de domínio intensificadortêm comprimento preferivelmente de pelo menos cerca de 10nucleotídeos ou pelo menos cerca de 20 nucleotídeos. Taismarcadores podem ser usados para amplificar seqüênciasintensificadoras 35S correspondentes de um certo organismopor PCR. Essa técnica pode ser usada para isolar seqüênciascodificadoras adicionais de um organismo desejado ou comoum ensaio diagnóstico para determinar a presença deseqüências codificadoras em um organismo. Técnicas dehibridização incluem seleção de hibridização de bibliotecasde DNA plaqueadas (placas ou colônias; veja, por exemplo,Sambrook e cols. (1989) Molecular Cloning: A LaboratoryManual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview, Nova York)).
A hibridização de tais seqüências pode ser realizadasob condições rigorosas. Os termos "condições rigorosas" ou"condições rigorosas de hibridização" significa condiçõessob as quais um marcador irá hibridizar para sua seqüênciaalvo em um grau passível de detecção maior do que outrasseqüências (por exemplo, pelo menos 2 vezes em relação aonível de base). Condições rigorosas são dependentes deseqüência e serão diferentes em circunstâncias diferentes.Controlando-se o rigor da hibridização e/ou as condições delavagem, podem ser identificadas seqüências alvo que são100% complementares ao marcador (marcação homóloga).Alternativamente, as condições de rigor podem ser ajustadaspara permitir alguma não combinação nas seqüências de formaque graus menores de similaridade sejam detectados(marcação heteróloga). De forma geral, um marcador temcomprimento menor do que cerca de 1.000 nucleotídeos,preferivelmente menor do que 500 nucleotídeos.
Tipicamente, condições rigorosas são aquelas nas quaisa concentração de sal é de pelo menos cerca de 1,5 M de íonNa, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M concentração de íonNa (ou outros sais) em pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é depelo menos cerca de 30°C para marcadores curtos (porexemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e de pelo menos cerca de600C para marcadores longos (por exemplo, maiores do que 50nucleotídeos). Condições rigorosas também podem ser obtidascom a adição de agentes de desestabilização como porexemplo formamida. Condições de baixo rigor exemplaresincluem hibridização com uma solução tampão de formamida 3 0a 35%, 1 M NaCl, SDS 1% (sódio dodecil sulfato) a 37°C, euma lavagem em IX a 2X SSC (2OX SSC = 3,0 M NaCl/0,3 Mcitrato trissódico) a 50 a 55°C. Condições de rigormoderado exemplares incluem hibridização em formamida 4 0 a45%, 1,0 M NaCl, SDS 1% a 37°C, e uma lavagem em 0,5X a IXSSC a 55 a 60°C. Condições de alto rigor exemplares incluemhibridização em formamida 50%, 1 M NaCl, SDS 1% a 370C porpelo menos 4 horas mais preferivelmente até 12 horas oumais e uma lavagem em 0,1X SSC a 60 a 65°C por pelo menoscerca de 3 0 minutos. A duraçao da hibridização é geralmentemenor do que cerca de 24 horas, normalmente cerca de 4 acerca de 12 horas. A duração do tempo de lavagem será pelomenos de um tempo suficiente para atingir o equilíbrio.
A especificidade é tipicamente a função de lavagenspós-hibridização, os fatores críticos sendo a força iônicae temperatura da solução de lavagem final. Para híbridosDNA-DNA, o ponto de fusão térmica (Tm) pode ser aproximadoa partir da equação de Meinkoth e Wahl (1984) Anal.Biochem. 138:267-284: Tm = 81,5°C + 16,6 (log M) + 0,41(%GC) - 0,61 (% form) - 500/L; onde M é a molaridade decátions monovalentes, %GC é a percentagem de nucleotídeosguanosina e citosina no DNA, % form é a percentagem deformamida na solução de hibridização, e L é o comprimentodo híbrido em pares de base. A Tm é a temperatura (sobforça iônica e pH definidos) na qual 50% de uma seqüênciaalvo complementar hibridiza para um marcador que combinaperfeitamente. A Tm é reduzida em cerca de 1°C para cada 1%de não combinação; dessa forma, Tm, condições dehibridização, e/ou de lavagem podem ser ajustadas para sehibridizar seqüências da identidade desejada. Por exemplo,caso se procure seqüências com >90% identidade, a Tm podeser diminuída em 10°C. De forma geral, as condiçõesrigorosas são selecionadas para serem cerca de 5°C maisbaixas do que ponto térmico de fusão (Tm) para a seqüênciaespecífica e seu complemento em uma força iônica e pHdefinidos. No entanto, condições severamente rigorosaspodem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 1, 2, 3, ou4°C mais baixa do que o ponto térmico de fusão (Tm) ;condições moderadamente rigorosas podem utilizar umahibridização e/ou lavagem em 6, 7, 8, 9, ou 10°C mais baixado que a Tm; condições de baixo rigor podem utilizar umahibridização e/ou lavagem em 11, 12, 13, 14, 15, ou 20°Cmais baixa do que o Tm. Usando a equação, as composições dehibridização de lavagem, e a Tm desejada, aqueles comhabilidade na técnica entenderão que são inerentementedescritas variações no rigor de hibridização e/ou desoluções de lavagem. Se o grau desejado de não combinaçãoresulta em um Ttn de menos do que 450C (solução aquosa) ou32 °C (solução de formamida), prefere-se aumentar aconcentração de SSC de forma que possa ser usada umatemperatura mais elevada. Um guia detalhado para ahibridização de ácidos nucléicos é encontrado em Tijssen(1993) Laboratory Technigues in Biochemistry and MolecularBiology Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I,Capítulo 2 (Elsevier, Nova York); e Ausubel e cols., eds.(1995) Current Protocols in Molecular Biologyl Capítulo 2(Greene Publishing e Wiley- Interscience, Nova York). VejaSambrook.
Dessa forma, seqüências isoladas que têm atividade depromotor com preferência para embrião e que hibridizam sobcondições rigorosas às seqüências de domíniointensificador aqui reveladas, ou para fragmentos dessas,são englobadas pela presente invenção. Geralmente,condições de alto rigor são selecionadas para serem cercade 5°C menores que o Tm para a seqüência específica em umaforça iônica definido e pH. No entanto, condições de altorigor englobam temperaturas na faixa de cerca de 1°C acerca de 20°C menores que a Tm, dependendo do grau desejadode rigor como aqui qualificado.
Os seguintes termos são usados para descrever osrelacionamentos de seqüência entre dois ou maispolinucleotídeos ou polipeptídeos: (a) "seqüência dereferência", (b) "janela de comparação", (c) "identidade deseqüência" e (d) "percentagem de identidade de seqüência".(a) Como aqui usado, "seqüência de referência" é umaseqüência definida usada como uma base para comparação deseqüência. A seqüência de referência pode ser umsubconjunto ou a totalidade de uma seqüência especificada;por exemplo, como um segmento de uma seqüência decomprimento total de cDNA ou de gene, ou a seqüênciacompleta de cDNA ou de gene.
(b) Como aqui usado, "janela de comparação" fazreferência a um segmento contíguo e especificado de umaseqüência de polinucleotídeos, em que a seqüência depolinucleotídeos na janela de comparação pode compreenderadições ou deleções (ou seja, intervalos), comparada àseqüência de referência (que não compreende adições oudeleções) para alinhamento ótimo dos dois polinucleotídeos.Geralmente, a janela de comparação tem pelo menos de 20nucleotídeos contíguos de comprimento, e opcionalmente podeter 30, 40, 50, 100, ou mais. Aqueles habilitados natécnica compreendem que, para evitar uma alta similaridadea uma seqüência de referência devido à inclusão deintervalos na seqüência de polinucleotídeos, uma penalidadede intervalo é tipicamente introduzida e é subtraída donúmero de combinações.
Métodos de alinhamento de seqüências para comparaçãosão bem conhecidos na técnica. Assim, a determinação depercentual de identidade de seqüência entre quaisquer duasseqüências pode ser realizada com o uso de um algoritmomatemático. Exemplos não limitantes de tais algoritmosmatemáticos são o algoritmo de Myers e Miller (1988) CABIOS4:11-17; o algoritmo de alinhamento local de Smith e cols.(1981) Adv. Appl. Math. 2:482; o algoritmo de alinhamentoglobal de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; o método de procura-por-alinhamento local de Pearson eLipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. 85:2444-2448; oalgoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad.Sei. USA 87:2264, modificado como em Karlin e Altschul(1993) Proe. Natl. Acad. Sei. USA 90:5873-5877.
Implementações de computador desses algoritmosmatemáticos podem ser utilizadas para comparação deseqüências para determinar identidade de seqüência. Taisimplementações incluem, mas não são limitadas a: CLUSTAL noprograma PC/Gene (disponível por Intelligenetics, MountainView, Califórnia); o programa ALIGN (Versão 2.0) e GAP,BESTFIT, BLAST, FASTA, e TFASTA no pacote de programas decomputador de Wisconsin Genetics, Versão 10 (disponível porAccelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, Califórnia,USA). Alinhamentos que usam esses programas podem serrealizados usando os parâmetros padrão. 0 programa CLUSTALé bem descrito por Higgins e cols. (1988) Gene 73:237-244(1988); Higgins e cols. (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet ecols. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang e cols.(1992) CABIOS 8:155-65; e Pearson e cols. (1994) Meth. Mol.Biol. 24:307-331. 0 programa ALIGN é baseado no algoritmode Myers e Miller (1988) supra. Uma tabela de peso deresíduo PAM120, uma penalidade de comprimento de intervalode 12, e uma penalidade de intervalo de 4 podem ser usadascom o programa ALIGN quando da comparação de seqüências deaminoácidos. 0 programa BLAST de Altschul e cols (1990) J.Mol. Biol. 215:403 é baseado no algoritmo de Karlin eAltschul (1990) supra. Pesquisas de nucleotídeo de BLASTpodem ser realizadas com o programa BLASTN, pontuação =100, comprimento de palavra = 12, para obter seqüências denucleotídeos homólogas à seqüência de nucleotídeos quecodifica uma proteína da invenção. Pesquisas de proteína deBLAST podem ser realizadas com o programa BLASTX, pontuação= 50, comprimento de palavra = 3, para obter seqüências deaminoácidos homólogas a uma proteína ou polipeptídeo dainvenção. Para obter alinhamentos com intervalos paraobjetivos de comparação, Gapped BLAST (em BLAST 2.0) podeser utilizado como descrito em Altschul e cols. (1997)Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, PSI-BLAST (emBLAST 2.0) pode ser usado para realizar uma pesquisarepetida que detecta relações distantes entre moléculas.Veja Altschul e cols. (1997) supra. Quando da utilização deBLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, os parâmetros padrão dosrespectivos programas (por exemplo, BLASTN para seqüênciasde nucleotídeos, BLASTX para proteínas) podem ser usados. 0programa BLAST é publicamente disponível no endereço da webde NCBI O alinhamento também pode ser realizado manualmentepor inspeção.
A menos que determinado de outro modo, valores deidentidade/similaridade de seqüência aqui fornecidos sereferem ao valor obtido usando GAP versão 10 usando osseguintes parâmetros: % de identidade e % de similaridadepara a seqüência de nucleotídeos usando GAP Weight de 50 eLength Weight de 3 e a matriz de pontuação nwsgapdna.cmp; %de identidade e % de similaridade para a seqüência deaminoácidos usando GAP Weight de 8 e Length Weight de 2 e amatriz de pontuação BLOSUM62; ou qualquer programaequivalente. Por "programa equivalente", entende-sequalquer programa de comparação de seqüência que, paraquaisquer duas seqüências em questão, gera um alinhamentotendo combinações de nucleotídeo ou de resíduos deaminoácidos idênticas e um percentual de identidade deseqüência idêntico quando comparado ao alinhamentocorrespondente gerado por GAP Versão 10.
GAP usa o algoritmo de Needleman e Wunsch (1970) J.Mol. Biol. 48: 443-453, para descobrir o alinhamento deduas seqüências completas que maximizam o número decombinações e minimizam o número de intervalos. GAPconsidera todos os possíveis alinhamentos e posições deintervalo e cria o alinhamento com o maior número de basescombinadas e os menores intervalos. Ele permite ofornecimento de uma penalidade de criação de intervalo euma penalidade de extensão de intervalo em unidades debases combinadas. GAP deve se beneficiar do número decombinações de penalidades de criação de intervalo paracada intervalo que ele insere. Se uma penalidade deextensão de intervalo maior que zero é escolhida, GAP deve,em adição, se beneficiar para cada intervalo inserido docomprimento do intervalo vezes a penalidade de extensão deintervalo. Valores padrão de penalidade de criação deintervalo e valores de penalidade de extensão de intervalona Versão 10 do pacote de programa de computador WisconsinGenetics para seqüências de proteína são 8 e 2,respectivamente. Para seqüências de nucleotídeos, apenalidade de criação de intervalo padrão é 50, enquanto apenalidade de extensão de intervalo padrão é 3. Aspenalidades de extensão de intervalo e de criação deintervalo podem ser expressas como um número inteiroselecionado do grupo de números inteiros que consiste em 0a 200. Assim, por exemplo, as penalidades de extensão deintervalo e de criação de intervalo podem ser 0, 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55,60, 65 ou maiores.
GAP apresenta um membro da família de melhoresalinhamentos. Pode haver vários membros dessa família, masnenhum outro membro tem a melhor qualidade. GAP exibequatro figuras de mérito para alinhamentos: Qualidade,Proporção, Identidade e Similaridade. A qualidade é amétrica maximizada a fim de alinhar as seqüências. Aproporção é a qualidade dividida pelo número de bases nosegmento mais curto. Percentual de Identidade é opercentual dos símbolos que realmente combinam. Percentualde Similaridade é o percentual dos símbolos que sãosimilares. Símbolos que são transversais dos intervalos sãoignorados. A similaridade é pontuada quando o valor dematriz de pontuação para um par de símbolos é maior que ouigual a 0,50, o limiar de similaridade. A matriz depontuação usada na Versão 10 do pacote de programa decomputador GCG Wisconsin Genetics é BLOSUM62 (veja Henikoffe Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10915).
(c) Como aqui usado, "identidade de seqüência" ou"identidade" no contexto de duas seqüências depolinucleotídeos ou polipeptídeos faz referência aosresíduos nas duas seqüências que são os mesmos quandoalinhados para correspondência máxima e por uma janela decomparação especificada. Quando a percentagem de identidadede seqüência é usada em referência a proteínas, éreconhecido que posições de resíduos que não são idênticasfreqüentemente diferem por substituições de aminoácidosconservadoras, em que resíduos de aminoácidos sãosubstituídos por ouros resíduos de aminoácidos comsimilares propriedades químicas (por exemplo, carga ouhidrofobia) e, portanto não mudam as propriedadesfuncionais da molécula. Quando seqüências diferem emsubstituições conservadoras, o percentual de identidade deseqüência pode ser ajustado acima para corrigir para anatureza conservadora da substituição. Seqüências quediferem em tais substituições conservadoras são ditas comotendo "similaridade de seqüência" ou "similaridade" . Meiospara fazer esse ajuste são bem conhecidos por aqueleshabilitados na técnica. Tipicamente, isso envolve apontuação de uma substituição conservadora como umaparcial, em vez de uma descombinação completa, dessa formaaumentando o percentual de identidade de seqüência. Assim,por exemplo, quando um aminoácido idêntico recebe umapontuação de 1 e uma substituição não conservadora recebeuma pontuação de zero, uma substituição conservadora recebeuma pontuação entre zero e 1. A pontuação de substituiçõesconservadoras é calculada, por exemplo, como implementadono programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View,Califórnia).
(d) Como aqui usado, "percentagem de identidade deseqüência" significa o valor determinado por comparação deduas seqüências alinhadas de forma ótima por uma janela decomparação, em que a porção da seqüência depolinucleotídeos na janela de comparação pode compreenderadições ou deleções (ou seja, intervalos) quandocomparada à seqüência de referência (que não compreendeadições ou deleções) para alinhamento ótimo das duasseqüências. A percentagem é calculada por determinação donúmero de posições nas quais o ácido nucléico, base ouresíduo de aminoácido idêntico ocorre em ambas asseqüências para produzir o número de posições combinadas,dividindo o número de posições combinadas pelo número totalde posições na janela de comparação, e multiplicando oresultado por 100 para produzir a percentagem de identidadede seqüência.
II. Construções de DNA
0 uso de o termo "polinucleotídeo" não deve serlimitar a presente invenção a polinucleotídeos quecompreendem DNA. Aqueles de habilidade comum na técnicareconhecerão que polinucleotídeos podem compreenderribonucleotídeos e combinações de ribonucleotídeos edesoxirribonucleotídeos. Tanto desoxirribonucleotídeosquanto ribonucleotídeos incluem moléculas de ocorrêncianatural e análogos sintéticos. Os polinucleotídeos dainvenção também englobam todas as formas de seqüências queincluem, sem limitação, formas de filamento único, formasde filamento duplo, hairpins, estruturas em ramo e alça, eoutros.
0 polinucleotídeo revelado na presente invenção, bemcomo variantes e fragmentos desse, são úteis na manipulaçãogenética de qualquer planta. 0 domínio intensificador ou ofragmento ativo ou variante desse são úteis nesse aspectoquando operacionalmente ligado a um promotor heterólogo.Tais regiões de controle regulador de transcrição são aquireferidas como regiões de controle regulador de transcrição"quiméricas".
As regiões de controle de transcrição quiméricas podemser operacionalmente ligadas a um polinucleotídeo cujaexpressão deve ser controlada para tingir uma respostafenotípica desejada. Desse modo, o polinucleotídeo para odomínio intensificador ou a região de controle reguladorade transcrição quimérica da invenção podem ser fornecidosem cassetes de expressão junto com um polinucleotídeo deinteresse para expressão no organismo de interesse.
A região reguladora de transcrição quimérica podecompreender múltiplas cópias do domínio intensificador ouvariantes e fragmentos ativos desses. Em modalidadesespecíficas, a região de controle reguladora de transcriçãoquimérica compreende pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou maiscópias do domínio intensificador. Em modalidadesadicionais, o domínio intensificador empregado nãocompreende a seqüência apresentada em Id. de Seq. N°:5.
A distância entre o promotor e o domíniointensificador pode variar, contanto que a regiãoreguladora de transcrição quimérica continue a direcionar atranscrição do polinucleotídeo de interesseoperacionalmente ligado na maneira desejada. Por exemplo,um domínio intensificador pode ser posicionado pelo menoscerca de 10.000 a cerca de 15.000, cerca de 10.000 a cercade a 9.000, cerca de 9.000 a cerca de 8.000, cerca de 8.000a cerca de 7.000, cerca de 7.000 a cerca de 6.000, cerca de6.000 a cerca de 5.000, cerca de 5.000 a cerca de 4.000,cerca de 4.000 a cerca de 3.000, cerca de 3.000 a cerca de2.000, cerca de 2.000 a cerca de 1.000, cerca de 1.000 acerca de 500, cerca de 500 a cerca de 250, cerca de 250 aimediatamente adjacente ao promotor. É também reconhecidoque uma ou mais cópias do intensif icador podem sercolocadas acima (5') do promotor, ou, alternativamente, umaou mais cópias do intensificador podem ser localizadas 3'ao promotor. Em modalidades específicas, quando localizado3' do promotor, o intensificador é abaixo da regiãoterminadora. Ainda em modalidades adicionais, um ou maisdos intensificadores podem ser arrumados na orientação 5'ou 3' (como mostrado no Id. de Seq. N0:1) ou na orientação3' para 5'.
Se múltiplos intensificadores são empregados, osintensificadores podem ser posicionados na construção comrelação ao promotor de modo que o efeito desejado sobre aexpressão seja atingido. Por exemplo, os intensificadorespodem ser imediatamente adjacentes um ao outro ou pelomenos entre 1 a 100, 100 a 300, 300 a 500, 500 a 1.000nucleotídeos afastados.
Tais construções podem ser fornecidas em cassetes deexpressão para expressão no organismo de interesse. Ocassete pode incluir seqüências reguladoras 3' e seqüênciasreguladoras 5' operacionalmente ligadas a umpolinucleotídeo de interesse. "Ligada operacionalmente"significa uma ligação funcional entre dois ou maiselementos. Por exemplo, uma ligação operável entre umpolinucleotídeo de interesse e uma seqüência reguladora (ouseja, um promotor) é uma ligação funcional que permite aexpressão do polinucleotídeo de interesse. Uma ligaçãooperável entre um intensificador e uma região de iniciaçãode transcrição é uma ligação que a região de controle detranscrição transcreva um polinucleotídeo operacionalmenteligado de interesse. Elementos operacionalmente ligadospodem ser contíguos ou não contíguos. Quando usados para sereferir à união de duas regiões de codificação de proteína,entende-se por operacionalmente ligado que as regiõescodificadoras estão na mesma estrutura de leitura. 0cassete pode conter adicionalmente pelo menos um geneadicional a ser co-transformado no organismo.
Alternativamente, o gene(s) adicional pode ser fornecido emmúltiplos cassetes de expressão. Tal cassete de expressão éfornecido com vários sítios de restrição e/ou sítios derecombinação para que a inserção da seqüência esteja sob aregulação de transcrição das regiões reguladoras. 0 cassetede expressão pode conter adicionalmente genes de marcadorselecionável.
O cassete de expressão irá incluir na direção 5' para3' de transcrição, a região reguladora de transcriçãoquimérica que compreende o domínio intensificador ou umavariante e fragmento ativo desses, um promotor, ou variantee fragmento ativo desses, uma região de iniciação detradução, um polinucleotídeo de interesse, uma região determinação de tradução e, opcionalmente uma região determinação de transcrição funcional no organismohospedeiro. As regiões reguladoras (ou seja, domíniosintensificadores e regiões de terminação de tradução etc)e/ou polinucleotídeo de interesse podem ser nativos ouanálogos à célula hospedeira ou um ao outro.
Alternativamente, as regiões reguladoras e/ou opolinucleotídeo de interesse podem ser heterólogos à célulahospedeira ou um ao outro.
Como aqui usado, "heterólogo" em referência a umaseqüência é uma seqüência que se origina de uma espécieestranha, ou, se da mesma espécie, é substancialmentemodificada de sua forma nativa em composição e/ou lócusgenômico por intervenção humana deliberada. Por exemplo, umpromotor operacionalmente ligado a um polinucleotídeoheterólogo é de uma espécie diferente daquela da qual opolinucleotídeo é derivado, ou, se da mesma espécie (ouseja, análogo), um ou ambos são substancialmentemodificados de sua forma original e/ou lócus genômico, ou opromotor não é o promotor nativo para o polinucleotídeooperacionalmente ligado. Um "polinucleotídeo heterólogo"uma vez que se relaciona a um domínio intensificador devesignificar uma seqüência que não é de ocorrência naturalcom a seqüência de domínio intensificador da invenção.Embora esse promotor seja heterólogo à seqüência de domíniointensificador, ele pode ser homólogo, ou nativo, ouheterólogo, ou estranho a um hospedeiro de planta.
A região de terminação pode ser nativa com o domíniointensificador ou região de iniciação de transcrição, podeser nativa com o polinucleotídeo operacionalmente ligado deinteresse, pode ser nativa com um hospedeiro de planta, oupode ser derivada de uma outra fonte (ou seja, estranha ouheteróloga) ao domínio intensificador, a região deiniciação de transcrição, o polinucleotídeo de interesse,um hospedeiro de planta ou qualquer combinação desses.Regiões de terminação convenientes estão disponíveis apartir do Ti-plasmídeo de A. tumefaciens, tais como asregiões de terminação de octopina sintase e nopalinasintase. Veja também Guerineau e cols. (1991) Mol. Gen.Genet. 262: 141-144; Proudfoot (1991) Cell 64: 671-674;Sanfacon e cols. (1991) Genes Dev. 5: 141-149; Mogen ecols. (1990) Plant Cell 2: 1261-1272; Munroe e cols. (1990)Gene 91: 151-158; Bailas e cols. (1989) Nucleic Acids Res.17: 7891-7903; e Joshi e cols. (1987) Nucleic Aeid Res. 15:9627-9639.
O cassete de expressão que compreende as seqüências dapresente invenção também pode conter pelo menos umaseqüência de nucleotídeos adicional para um gene a sercotransformado no organismo. Alternativamente, aseqüência(s) adicional pode ser fornecida em um outrocassete de expressão.
Modificações adicionais de seqüência são conhecidaspor aumentarem a expressão de gene em um hospedeirocelular. Essas incluem a eliminação de seqüências quecodificam falsos sinais de poliadenilação, sinais de sítiode junção éxon-íntron, repetições semelhantes a transposon,e outras seqüências bem caracterizadas que podem serdanosas à expressão de gene. 0 conteúdo de GC da seqüênciapode ser ajustado a níveis médios para um certo hospedeirocelular, como calculado com relação a genes conhecidosexpressos na célula hospedeira. Quando possível, aseqüência é modificada para evitar estruturas de mRNAsecundárias em hairpin previstas.
Os cassetes de expressão podem conter adicionalmenteseqüências líderes 5'. Tais seqüências líderes podem atuarpara aumentar a tradução. Líderes de tradução sãoconhecidos na técnica e incluem: líderes de picornavírus,por exemplo, líder de EMCV (região não codificadora 5' deencefalomiocardite) (Elroy-Stein e cols. (1989) Proc. Natl.Acad. Sei. USA 86: 6126-6130); líderes de potivírus, porexemplo, líder de TEV (Vírus Etch do Tabaco) (Gallie ecols. (1995) Gene 165(2): 233-238), líder de MDMV (Vírus emMosaico do Nanismo do Milho) (Virology 154:9-20), e aproteína de ligação de cadeia pesada da imunoglobulinahumana (BiP) (Macejak e cols. (1991) Nature 353: 90-94);líder não traduzido do mRNA da proteína de revestimento dovírus do mosaico da alfafa (AMV RNA 4) (Jobling e cols.(1987) Nature 325: 622-625); vírus do mosaico do tabaco(TMV) (Gallie e cols. (1989) em Molecular Biology of RNA1ed. Cech (Liss, Nova York) , pp. 237-256) ; e líder de vírusda matiz clorótica do milho (MCMV) (Lommel e cols. (1991)Virology 81: 382-385). Veja também, Della-Cioppa e cols.(1987) Plant Physiol. 84: 965-968.
Na preparação do cassete de expressão, os váriosfragmentos de DNA podem ser manipulados de forma afornecerem as seqüências de DNA na orientação adequada e,quando necessário, na estrutura de leitura aberta adequada.Para esse objetivo, podem ser empregados adaptadores ouligantes para unir os fragmentos de DNA ou podem ser usadasoutras manipulações para o fornecimento de sítios derestrição convenientes, remoção de DNA supérfluo, remoçãode sítios de restrição, ou outros. Para essa finalidade,pode-se utilizar mutagênese in vitro, reparo de iniciador,restrição, enrijecimento, re-substituições, por exemplo,transições e transversões.
0 cassete de expressão também pode compreender um genede marcador selecionável para a seleção de célulastransformadas. Genes de marcador selecionável são utilizadospara a seleção de células transformadas ou tecidos. Genesmarcadores incluem genes que codificam resistência aantibióticos, tais como aqueles que codificam neomicinafosfotransferase II (NEO) e higromicina fosfotransferase(HPT), assim como genes que conferem resistência a compostosherbicidas, tais como glifosinato amônio, bromoxinil,imidazolinonas, e 2,4-dicloro-fenoxiacetato (2,4-D).Marcadores selecionáveis adicionais incluem marcadoresfenotípicos como β-galactosidase e proteínas fluorescentescomo proteína fluorescente verde (GFP) (Su e cols. (2004)Biotechnol Bioeng 85: 610-9 e Fetter e cols. (2004) PlantCell 16: 215-28), proteína fluorescente ciano (CIP) (Boltee cols. (2004) J. Cell Science 117: 943-54 e Kato e cols.(2002) Plant Physiol 129: 913-42), e proteína fluorescenteamarela (PhiYFP de Evrogen, veja, Bolte e cols. (2004) J.Cell Science 117: 943-54). Para marcadores selecionáveisadicionais, veja, de modo geral, Yarranton (1992) Curr.Opin. Biotech. 3: 506-511; Christopherson e cols. (1992)Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 6314-6318; Yao e cols.(1992) Cell 71: 63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley e cols. (1980) in The Operon, pp. 177-220; Hu e cols. (1987) Cell 48: 555- 566; Brown e cols.(1987) Cell 49: 603-612; Figge e cols. (1988) Cell 52: 713-722; Deuschle e cols. (198 9) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:5400-5404; Fuerst e cols. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA86: 2549-2553; Deuschle e cols. (1990) Science 248: 480-483; Gossen (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg;Reines e cols. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 1917-1921; Labow e cols. (1990) Mol. Cell. Biol. 10: 3343-3356;Zambretti e cols. (1992) Proc. Nall. Acad. Sei. USA 89:3952-3956; Bairn e cols., (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA88: 5072-5076; Wyborski e cols. (1991) Nucleic Acids Res.19: 4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc.Biol. 10: 143-162; Degenkolb e cols. (1991) Antimicrob.Agents Chemother. 35: 1591-1595; Kleinschnidt e cols.(1988) Biochemistry 27: 1094-1104; Bonin (1993) Ph.D.Thesis, University of Heidelberg; Gossen e cols. (1992)Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 55475551; Oliva e cols.(1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36: 913-919; Hlavka ecols. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78(Springer-Verlag, Berlin); Gill e cols. (1988) Nature 334:721-724. Tais revelações são aqui incorporadas porreferência. A lista acima de genes de marcador selecionávelnão deve ser limitante. Qualquer gene de marcadorselecionável pode ser usado na presente invenção.
Como discutido acima, a região reguladora detranscrição quimérica que compreende pelo menos uma cópiado domínio intensificador ou variante e fragmento ativodessa operacionalmente ligada a um promotor heterólogo éfornecida. Qualquer promotor de interesse pode seroperacionalmente ligado ao domínio intensificador dainvenção. Tais promotores podem ser selecionados com baseno resultado desejado. Ou seja, os ácidos nucléicos podemser combinados com promotores constitutivos, compreferência de tecido, ou outros para expressão na célulahospedeira de interesse. Tais promotores constitutivosincluem, por exemplo, o promotor central do promotor Rsyn7e outros promotores constitutivos revelados na WO 99/43838e Patente U.S. No. 6.072.050; o promotor central CaMV 35S(Odell e cols.(1985) Nature 313: 810-812); actina de arroz(McElroy e cols. (1990) Plant Cell 2: 163-171); ubiquitina(Christensen e cols. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 619-632 eChristensen e cols. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675-689);ρEMU (Last e cols. (1991) Theor. Appl. Genet. 81: 581-588);MAS (Velten e cols. (1984) EMBO J. 3: 2723-2730); promotorALS (Patente U.S.No. 5.659.026), e semelhantes. Outrospromotores constitutivos incluem, por exemplo, aquelesrevelados nas Patentes U.S. Nos. 5.608.149; 5.608.144;5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399,680; 5.268.463;5.608.142; e 6.177.611, aqui incorporadas por referência.
Tais promotores podem ser selecionados com base noresultado final desejado e podem compreender promotoresconstitutivos, indutíveis, de preferência para tecido, ououtros promotores para expressão em uma célula hospedeirade interesse (ou seja, uma planta). Promotoresconstitutivos incluem, por exemplo, o promotor central dopromotor Rsyn7 e outros promotores constitutivos reveladosna WO 99/43838 e na Patente U.S. N0 6.072.050; o promotorcentral CaMV 35S promotor (Odell e cols. (1985) Nature313:810-812); actina de arroz (McElroy e cols. (1990) PlantCell 2:163-171); ubiqüitina (Christensen e cols. (1989)Plant Mol. Biol. 12:619-632 e Christensen e cols. (1992)Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last e cols. (1991)Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten e cols. (1984)EMBO J. 3:2723-2730); promotor ALS (Patente U.S. N05.659.026), e semelhantes. Outros promotores constitutivosincluem, por exemplo, aqueles discutidos nas Patentes U.S.Nos 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466. 785;5.399.680; 5.268.463; 5.608.142; e 6.177.611.
Em uma modalidade, o promotor compreende um promotorindutível, particularmente a partir de um promotorindutível por patógeno. Tais promotores incluem aqueles deproteínas relacionadas à patogênese (proteínas PR), que sãoinduzidos após infecção por um patógeno; por exemplo,proteínas PR, proteínas SAR, beta-1, 3-glucanase, quitinaseetc. Veja, por exemplo, Redolfi e cols. (1983) Neth. J.Plant Pathol. 89: 245-254; Uknes e cols. (1992) Plant Cell4: 645-656; e Van Loon (1985) Plant Mol. Virol. 4: 111-116.Veja também WO 99/43819 aqui incorporada por referência.
Promotores que são expressos localmente ou próximo aosítio de infecção por patógeno podem ser usados. Veja, porexemplo, Marineau e cols. (1987) Plant Mol. Biol. 9: 335-342; Matton e cols. (198 9) Molecular Plant-MicrobeInteractions 2: 325-331; Somsisch e cols. (1986) Proc.Natl. Acad. Sei. USA 83: 2427-2430; Somsisch e cols. (1988)Mol. Gen. Genet. 2: 93-98; e Yang (1996) Proc. Natl. Acad.Sei. USA 93: 14972-14977. Veja também, Chen e cols. (1996)Plant J. 10: 955-966; Zhang e cols. (1994) Proc. Natl.Acad. Sei. USA 91: 2507-2511; Warner e cols. (1993) PlantJ. 3: 191-201; Siebertz e cols. (1989) Plant Cell 1: 961-968; Patente U.S. No. 5.750.386 (indutível-nematódeo); e asreferências nelas citadas. É de particular interesse opromotor indutível para o gene de milho PRms gene, cujaexpressão é induzida pelo patógeno Fusarium moniliforme(veja, por exemplo, Cordero e cols. (1992) Physiol. Mol.Plant Path. 41: 189-200).
Adicionalmente, uma vez que patógenos ganham entradaem plantas através de ferimento ou dano de inseto, umpromotor indutível por ferimento pode ser usado nasconstruções da invenção. Tais promotores indutíveis porferimento incluem gene inibidor de proteinase de batata(pin II) (Ryan (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28: 425-449;Duan e cols. (1996) Nature Biotechnology 14: 494-498); wunle wun2, Patente U.S. No. 5.428.148; winl e win2 (Stanford ecols. (1989) Mol. Gen. Genet. 215: 200-208); sistemain(McGurl e cols. (1992) Science 225: 1570-1573); WIPl(Rohmeier e cols. (1993) Plant Mol. Biol. 22: 783-792;Eckelkamp e cols. (1993) FEBS Letters 323: 73-76); gene MPI(Corderok e cols. (1994) Plant J. 6 (2) : 141-150); esemelhantes, aqui incorporados por referência
Promotores regulados por substância química podem serusados para modular a expressão de um gene em uma plantaatravés da aplicação de um regulador químico exógeno.
Dependendo do objetivo, o promotor pode ser um promotorindutível por substância química, onde a aplicação dasubstância química induz expressão de gene, ou um promotorreprimível por substância química, onde a aplicação dasubstância química reprime a expressão de gene. Promotoresindutíveis por substância química são conhecidos na técnicae incluem, mas não estão limitados, o promotor de milhoIn2-2, que é ativado por safeners de herbicida debenzenossulfonamida, o promotor de milho GST, que é ativadopor compostos hidrofóbicos eletrofílicos que são usadoscomo herbicidas pré-emergentes, e o promotor de tabaco PR-la, que é ativado por ácido salicílico. Outros promotoresregulados por substância química de interesse incluempromotores que respondem a esteróide (veja, por exemplo,promotor indutível por glicocorticóide em Schena ecols. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 10421-10425 eMcNellis e cols. (1998) Plant J. 14 (2) : 247-257) epromotores indutíveis por tetraciclina e reprimíveis portetraciclina (veja, por exemplo, Gatz e cols. (1991) Mol.Gen. Genet. 227: 229237, e Patentes U.S. Nos. 5.814.618 e5.789.156), aqui incorporadas por referência.
Promotores com preferência de tecido podem serutilizados para ter como alvo expressão de defensina
aumentada dentro de um tecido de plante em particular.Promotores com preferência de tecido incluemYamamoto e cols. (1997) Plant J. 12(2): 255-265; Kawamata ecols. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7): 792-803; Hansen ecols. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3): 337-343;Russell e cols. (1997) Transgenic Res. 6(2): 157-168;Rinehart e cols. (1996) Plant Physiol. 112(3): 1331-1341;Van Camp e cols. (1996) Plant Physiol. 112(2): 525-535;Canevascini e cols. (1996) Plant. Physiol. 112(2): 513-524;Yamamoto e cols. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5): 773-778;Lam (1994) Resultados Probl. Cell Differ. 20: 181-196;Orozco e cols. (1993) Plant Mol. Biol. 23 (6) :1129-1138 ;Matsuoka e cols. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90 (20):9586-9590; e Guevara-Garcia e cols. (1993) Plant J. 4(3):495-505. Tais promotores podem ser modificados, senecessário, para expressão fraca.
Promotores com preferência de folha são conhecidos natécnica. Veja, por exemplo, Yamamoto e cols. (1997) PlantJ. 12(2): 255-265; Kwon e cols. (1994) Plant Physiol.105:357-67; Yamamoto e cols. (1994) Plant Cell Physiol.35(5): 773-778; Gotor e cols. (1993) Plant J. 3: 509-18;Orozcoe cols. (1993) Plant Mol. Biol. 23 (6) :1129-1138; eMatsuoka e cols. (1993) Proc. Natl. Acad Sei. USA 90 (20) :9586-9590.
Promotores com preferência por raiz são conhecidos epodem ser selecionados dos vários disponíveis na literaturaou isolados novamente de várias espécies compatíveis. Veja,por exemplo, Hire e cols. (1992) Plant Mol. Biol. 20(2):207-218 (gene de glutamina sintetase específico para raizde soja); Keller e Baumgartner (1991) Plant Cell 3(10):1051-1061 (elemento de controle específico para raiz nogene GRP 1.8 de feijão francês); Sanger e cols. (1990)Plant Mol. Biol. 14 (3): 433-443 (promotor específico pararaiz do gene da manopina sintase (MAS) de Agrobacteriumtumefaciens); e Miao e cols. (1991) Plant Cell 3(l):ll-22(clone de cDNA de comprimento total que codifica glutaminasintetase citosólica (GS), que é expresso em raízes enódulos de raiz de soja). Veja também Bogusz e cols. (1990)Plant Cell 2 (7) : 633-641, onde dois promotores comespecificidade de raiz isolados de genes de hemoglobina donão legume fixador de nitrogênio Parasponia andersonii e donão legume fixador de nitrogênio relacionado Trematomentosa são descritos. Os promotores desses genes estavamligados a um gene repórter de β-glicuronidase eintroduzidos tanto em Nicotiana tabacum não legume quantoem Lotus corniculatus legume, e em ambos os casos aatividade de promotor com especificidade de raiz foipreservada. Leach e Aoyagi (1991) descrevem sua análise dospromotores dos genes altamente expressos indutores de raizrolC e rolD de Agrobacterium rhizogenes (veja Plant Science(Limerick) 79 (1) :69-76). Eles concluíram que determinantesde DNA intensificadores e com preferência de tecido estãodissociados daqueles promotores. Teeri e cols. (198 9)usaram fusão de gene a IacZ para mostrar que o gene T-DNAde Agrobacterium que codifica octopina sintase éespecialmente ativo na epiderme da ponta da raiz e que ogene gene TR2' tem especificidade de raiz na planta intactae é estimulado por feridas no tecido de folha, umacombinação de características especialmente desejável parauso com um gene inseticida ou larvicida (veja EMBO J.8 (2) : 343-350) . O gene TRl' fundido a nptll (neomicinafosfotransferase II) mostrou características similares.Promotores com preferência de raiz adicionais incluem opromotor do gene VfENOD-GRP3 (Kuster e cols. (1995) PlantMol. Biol. 29 (4) -.153-112) ; e o promotor rolB (Capana ecols. (1994) Plant Mol. Biol. 25 (4) :681-691. Veja tambémPatentes U.S. Nos 5.837.876; 5.750.386; 5.633.363;5.459.252; 5.401.836; 5.110.732; e 5.023.179.
Promotores com "preferência de semente" incluem tantopromotores com especificidade de semente (aquelespromotores ativos durante o desenvolvimento da semente taiscomo promotores de proteínas de estocagem de semente), bemcomo promotores de germinação de semente (aquelespromotores ativos durante germinação da semente). VejaThompson e cols. (1989) BioEssays 10: 108, aqui incorporadopor referência. Tais promotores com preferência de sementeincluem, mas não estão limitados a, Ciml (mensagem induzidapor citocinina) ; CZ19B1 (zeína de milho de 19 kDa) ; milps(mio-inositol-l-fosfato sintase); e celA (celulose sintase)(veja WO 00/11177, aqui incorporada por referência). Gama-zeína é um promotor com especificidade de endospermapreferido. Globulina 1 (Glb-I)é um promotor comespecificidade de embrião preferido. Para dicotilédones,promotores com especificidade de semente incluem, mas nãoestão limitados a, β-faseolina de feijão, napina, β-conglicinina, lectina de soja, cruciferina, e semelhantes.Para monocotilédones, promotores com especificidade desemente incluem, mas não estão limitados a, zeína de milhode 15 kDa, zeína de 22 kDa, zeína de 27 kDa, g-zeína, waxy,shrunken 1, shrunken 2, globulina 1 etc. Veja também WO00/12733, onde promotores com preferência de semente degenes endl e end 2 são revelados; aqui incorporada porreferência.
Seqüências de polinucleotídeos expressas pela regiãode controle reguladora de transcrição quimérica da invençãopodem ser usadas para a variação do fenótipo de uma planta.Várias mudanças no fenótipo são de interesse incluindo amodificação da expressão de um gene em um embrião deplanta, alteração de um patógeno de planta ou mecanismo dedefesa de inseto, aumento da tolerância das plantas aherbicidas em uma planta, alteração do desenvolvimento doembrião para responder a estresse ambiental e outros. Essesresultados podem ser atingidos pela expressão de umaseqüência de nucleotideos heteróloga de interesse quecompreende um produto de gene adequado. Em modalidadesespecíficas, a seqüência de nucleotideos heteróloga deinteresse é uma seqüência de planta endógena cujo nível deexpressão é aumentado em uma planta ou parte de planta.
Alternativamente, os resultados podem ser atingidos aofornecer uma redução da expressão de um ou maispolinucleotídeo de interesse.
A região de controle reguladora de transcriçãoquimérica da invenção também pode compreender porçõesadicionais das outras regiões reguladoras de transcrição.Portanto, o elemento de controle regulador de transcriçãoaqui revelado, que compreende o domínio intensificador e umpromotor heterólogo pode compreender elementos reguladoresacima como, aqueles responsáveis por expressão em tecido etemporal da seqüência codificadora. No contexto dessarevelação, o termo "elemento regulador" também se refere auma seqüência de DNA, comumente, mas nem sempre, acima (5')da seqüência codificadora de um gene estrutural, que incluiseqüências que modulam a expressão da região codificadora.
Deve ser entendido que as seqüências de nucleotídeos,localizadas em íntrons, ou 3' da seqüência de regiãocodificadora põem também contribuir para a regulação daexpressão de uma região codificadora de interesse. Exemplosde íntrons adequados incluem, mas não são limitados, aoíntron IVS6 de milho, ou o íntron de actina de milho. Umelemento regulador também pode incluir aqueles elementoslocalizados abaixo (3') ao sítio de iniciação detranscrição, ou em regiões transcritas, ou ambos. Nocontexto da presente invenção um elemento regulador pós-transcrição pode incluir elementos que são ativos apósiniciação da transcrição, por exemplo, intensificadores detradução e transcrição, repressores de tradução etranscrição e determinantes de estabilidade de mRNA.
É também reconhecido que o intensificador da invençãopode ser posicionado na construção de DNA entre eoperacionalmente ligado a um primeiro e um segundopromotor. Em tais modalidades, o intensificador permite amodulação na expressão do primeiro e segundo promotores deuma direção divergente. Exemplos não limitantes de taisconstruções de DNA compreendem na orientação 5' para 3' ou3' para 5': um primeiro polinucleotídeo de interesseoperacionalmente ligado a um primeiro promotor,operacionalmente ligado a pelo menos uma cópia de umintensificador da invenção, operacionalmente ligado a umsegundo promotor, operacionalmente ligado a um segundopolinucleotídeo de interesse. Em modalidades específicas, aseqüência intensificadora é heteróloga à primeira e segundaseqüência intensificadora.
III Plantas e partes dessas
Como usado aqui, o termo "planta" inclui células deplantas, protoplastos de plantas, culturas de tecidos decélula de plantas das quais as plantas podem serregeneradas, calo de planta, protuberâncias de planta, ecélulas de plantas que são intactas em plantas ou partes deplantas como embriões, pólen, óvulos, sementes, folhas,flores, galhos, frutos, sementes, espigas, cascas, caule,raízes, pontas de raiz, anteras, e outros. Grão devesignificar a semente madura produzida por cultivadorescomerciais para objetivos outros que não o crescimento oureprodução das espécies. Prole, variantes e mutantes dasplantas regeneradas são também incluídos no escopo dainvenção, desde que essas partes compreendam ospolinucleotídeos introduzidos.
A presente invenção pode ser usada para transformaçãode quaisquer espécies de planta, incluindo, mas nãolimitadas a, monocotilédones e dicotilédones. Exemplos deplantas de interesse incluem, mas não estão limitados a,milho (Zea mays, também aqui referida como "miho"),Brassica spp. (por exemplo, B. napus, B. rapa, B. juncea),particularmente aquelas espécies de Brassica úteis comofontes de óleo de semente (também referida como "canola"),flax (Linum spp.), alfafa (Medicago sativa), arroz (Oryzasativa), centeio (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor,Sorghum vulgare), painço (por exemplo, milhete (Pennisetumglaucum), proso painço (Panicum miliaceum), painço foxtail(Setaria italica), painço finger (Eleusine coracana)),girassol (Helianthus annuus) , açafroa (Carthamustinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glicina max) ,tabaco (Nicotiana tabacum), batata (Solanum tuberosum),amendoim (Arachis hypogaea) , algodão (Gossypium barbadense,Gossypium hirsutum), batata doce (Ipomoea batatus) ,mandioca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco(Cocos nucifera), abacaxi (Ananas comosus), árvorescítricas (Citrus occidentale), cacau (Theobroma cacao), chá(Camellia sinensis), banana (Musa spp.), abacate (Perseaamericana), figo (Ficus casica), goiaba (Psidium guajava),manga (Mangifera indica), oliva (Olea europaea), papaia(Carica papaya), castanha de caju (Anacardium occidentale),macadâmia (Macadamia integrifolia) , amêndoa (Prunusamygdalus), beterraba (Beta vulgaris) , cana de açúcar(Saeeharum spp.), aveias, cevada, vegetais, frutas,ornamentais e coníferas.
Vegetais incluem tomates (Lyeopersieon eseulentum),alface (por exemplo, Laetuea sativa), feijão verde(Phaseolus vulgaris), favas (Phaseolus limensis), ervilha(Lathyrus spp., Pisum spp.), e membros do gênero Cueumis,tais como pepino (C. sativus) , melão (C. eantalupensis), emelão almíscar (C. melo). Plantas ornamentais incluemazálea (Rhododendron spp.), hortênsia (Hydrangeamaerophylla) , hibisco (Hibiseus rosasanensis) , rosas (Rosaspp.), tulipas (Tulipa spp.), narcisos (Nareissus spp.),petúnias (Petunia hybrida) , cravos (Dianthus earyophyllus),copo-de-leite (Euphorbia puleherrima) , e crisântemo.
Coníferas que podem ser empregadas na prática dapresente invenção incluem, por exemplo, pinheiros tais comopinheiro loblolly (Pinus taeda), pinheiro pinus ellioti(Pinus elliotii), pinheiro ponderosa (Pinus ponderosa),pinheiro lodgepole (Pinus conforta), e pinheiro de Monterey(Pinus radiata); abeto de Douglas (Pseudotsuga menziesii);cicuta do Ocidente (Tsuga canadensis); abeto Sitka (Piceaglauca); sequóia canadense (Sequoia sempervirens) ; abetosverdadeiros, tais como abeto de prata (Abies amabilis) eabeto de bálsamo (Abies balsamea) ; e cedros, tais comocedro vermelho do ocidente (Thuja plicata) e cedro amarelodo Alaska (Chamaeciparis nootkatensis). Em modalidadesespecíficas, milho e plantas de soja são ótimas, e ainda emoutras modalidades plantas de milho são ótimas.
Outras plantas de interesse incluem plantas de grãosque fornecem sementes de interesse, plantas de sementesoleaginosas, e plantas leguminosas. Sementes de interesseincluem sementes de grãos, tais como milho, trigo, cevada,arroz, sorgo, centeio etc. Plantas de sementes oleaginosasincluem algodão, soja, açafroa, girassol, Brassica, milho,alfafa, palma, coco etc. Plantas leguminosas incluemfeijões e ervilhas. Feijões incluem guar, alfarroba, feno-grego, soja, feijões de jardim, feijão-fradinho, munguba,feijão-de-lima, feijão-fava, lentilhas, grão-de-bico etc.
Uma "planta em questão ou célula de planta" é uma emque a alteração genética, como transformação, foi efetuadacom relação a um gene de interesse, ou é uma planta oucélula de planta que e descendente de uma planta ou célulaassim alterada e que compreende a alteração. Uma planta de"controle" ou "planta de controle" ou "célula de planta decontrole" fornece um ponto de referência para medição demudanças no fenótipo de uma planta em questão ou célula deplanta.
A planta de controle ou célula de planta podecompreender, por exemplo: (a) uma planta ou célula de tiposelvagem, ou seja, do mesmo genótipo que o material deiniciação para a alteração genética que resultou na plantaou célula em questão; (b) uma planta ou célula de planta domesmo genótipo que o material de iniciação, mas que foitransformada com uma construção nula (ou seja, com umaconstrução que não tem efeito conhecido sobre o traço deinteresse, como uma construção que compreende um genemarcador) ; (c) uma planta ou célula de planta que é umsegregante não transformado entre a prole de uma planta emquestão ou célula de planta; (d) uma planta ou célula deplanta que é geneticamente idêntica à planta em questão oucélula de planta, mas que não é exposta a condições ouestímulos que induziriam a expressão do gene de interesse;ou (e) a planta em questão ou célula de planta em si, sobcondições em que o gene de interesse não é expresso.
Qualquer organismo que tem uma região de controle detranscrição quimérica que compreende um domíniointensificador da invenção ou uma variante e fragmentoativo desses é fornecido. Em modalidades específicas,plantas, partes e planta, células, e germeplasma que têmuma região de controle de transcrição quimérica quecompreende um domínio intensificador da invenção ou umavariante e fragmento ativo desses são fornecidas. Emmodalidades específicas, a região de controle detranscrição quimérica é operacionalmente ligada a apolinucleotídeo de interesse. Tais polinucleotídeosincluem, por exemplo, qualquer polinucleotídeo que conferetolerância a um herbicida. Células de planta, partes deplanta e germeplasma que compreendem tais seqüências sãotambém fornecidos.
IV Polinucleotídeos de interesse
A região de controle reguladora de transcrição quiméricaque tem o domínio intensificador ou uma variante efragmento ativo desses pode ser usada para expressarqualquer polinucleotídeo de interesse. Categorias gerais depolinucleotídeos de interesse incluem, por exemplo, aquelesgenes envolvidos na informação, como dedos de zinco,aqueles envolvidos em comunicação, como quinases, e aquelesenvolvidos em housekeeping, como proteínas heat shock.
Categorias mais específicas de transgenes, por exemplo,incluem genes que codificam importantes traços paracaracterísticas agronômicas, de resistência a insetos,resistência a doença, resistência a herbicida, eresistência a estresse ambiental Otolerancia alterada aofrio, sal, seca etc.).
Genes de resistência a insetos podem codificarresistência a pragas que têm grande impacto no rendimentocomo rootworm, cutworm, European Corn Borer e outros. Taisgenes incluem, por exemplo, genes de proteína tóxica deBacillus thuringiensis (Patentes U.S. Nos. 5.366.892;5.747.450; 5.736.514; 5.723.756; 5.593.881; e Geiser ecols. (1986) Gene 48: 109); e outros.
Genes que codificam traços de resistência a doençaincluem genes de desintoxicação, como contra fumonosin(Patente U.S. No. 5.792.931); avirulência (avr) e genes deresistência a doença (R) (Jones e cols. (1994) Science 266:789; Martin e cols. (1993) Science 262: 1432; e Mindrinos ecols. (1994) Cell 78: 1089); e outros.
Produtos exógenos incluem enzimas e produtos deplantas bem como aqueles de outras fontes incluindoprocariotas e outros eucariotas. Tais produtos incluemenzimas, co-fatores, hormônios e outros.
Exemplos de outros genes aplicáveis e de seu fenótipoassociado incluem o gene que codifica proteína de coberturaviral codificada e/ou RNA, ou outros genes virais ou deplanta que conferem resistência viral; genes que conferemresistência a fungos; genes que promovem melhoria norendimento; e genes que fornecem resistência a estresse,como frio, desidratação resultante da seca, calor esalinidade, metal tóxico ou elementos de traço ou outros.
Como observado, o polinucleotídeo operacionalmenteligado à região de controle de transcrição que compreende odomínio intensificador que aqui pode ser uma seqüênciaanti-senso para um gene direcionado. Assim, as seqüênciaspromotoras aqui reveladas podem ser operacionalmenteligadas a seqüências de DNA anti-senso para reduzir ouinibir a expressão de uma proteína nativa em um embrião deplanta planta.
"RNAi" refere-se a uma série de técnicas relacionadaspara reduzir a expressão de genes (veja, por exemploPatente U.S. No. 6.506.559). Acredita-se que técnicas maisantigas referidas por outros nomes se baseiem no mesmomecanismo, mas recebem diferentes nomes na literatura.Essas incluem "inibição anti-senso" a produção detranscrições de RNA anti-senso capazes de suprimir aexpressão da proteína alvo e "Co-supressão" ou "supressãosenso" que se refere à produção de transcrições de RNAsenso capazes de suprimir a expressão de genes endógenos ouestranhos idênticos ou substancialmente similares (PatenteU.S. No. 5.231.020, aqui incorporada por referência). Taistécnicas se baseiam no uso de construções que resultam noacúmulo de RNA de duplo filamento com um filamentocomplementar ao gene alvo a ser silenciado. 0intensificador 3 5S no contexto da região de controle detranscrição das modalidades pode ser usado para dirigir aexpressão de construções que resultarão em interferência deRNA incluindo microRNAs e siRNAs.
Quando adequado, os polinucleotídeos podem serotimizados para aumentar a expressão na plantatransformada. Ou seja, o polinucleotídeo pode sersintetizado com o uso de códons com preferência por plantapara melhor expressão. Veja, por exemplo, Campbell e Gowri(1990) Plant Physiol. 92:1-11 para uma discussão de uso decódon com preferência por hospedeiro. Métodos sãodisponíveis na técnica para síntese de genes preferidos deplanta. Veja, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 5.380.831, e5.436.391, e Murray e cols. (1989) Nucleic Acids Res.17:477-498, aqui incorporado por referência.
Em uma modalidade, o polinucleotídeo que conferetolerância ao herbicida de interesse compreende umpolipeptídeo inibidor-tolerante a ALS que conferetolerância a uma dose de herbicidas de sulfoniluréia,imidazolinona, triazolpirimidinas,pirimidinioxi(tio)benzoatos, e/ou sulfonilamino-carbonil-triazonlina. Herbicidas de sulfoniluréia e imidazolinonainibem o crescimento de plantas superiores por bloqueio daacetolactato sintase (ALS), também conhecida como ácidoacetohidroxi sintase (AHAS). Por exemplo, plantas contendomutações particulares em ALS (por exemplo, as mutações S4e/ou HRA) são tolerantes a herbicidas de sulfoniluréia. Aprodução de plantas tolerantes a sulfoniluréia e plantastolerantes a imidazolinona é descrita mais completamentenas Patentes U.S. Nos. 5.605.011; 5.013.659; 5.141.870;5.767.361; 5.731.180; 5.304.732; 4.761.373; 5.331.107;5.928.937; e 5.378.824; e publicação internacional WO96/33270, que são aqui incorporadas em suas totalidades porreferência para todos objetivos. Em modalidadesespecíficas, o polipeptídeo inibidor-tolerante a ALScompreende uma acetolactato sintase tolerante asulfonamida, uma ácido acetohidroxi sintase tolerante asulfonamida, uma acetolactato sintase tolerante aimidazolinona ou uma ácido acetohidroxi sintase tolerante aimidazolinona.
Polinucleotídeos que codificam para resistência aherbicidas que agem inibindo a ação de glutamina sintase,como fosfinotricina ou basta (por exemplo, o gene bar) ,glifosato (por exemplo, o gene EPSPS e o gene GAT; veja,por exemplo, Publicação U.S. No. 20040082770 e WO03/092360) ou outros genes conhecidos na técnica tambémpodem ser usados. 0 gene bar codifica resistência aoherbicida basta, o gene nptll codifica resistência aoantibiótico kanamicina e geneticina, e os mutantes de geneALS codificam resistência herbicida clorsulfurona.
Resistência a glifosato é transmitida por genes de 5-enolpiruvil-3-fosfiquiimato sintase (EPSP) e aroA mutantes.Veja, por exemplo, Patente U.S. No. 4.94 0.835 para Shah ecols., que revela uma seqüência de nucleotídeos de umaforma de EPSPS que pode conferir resistência a glifosato.Patente U.S. No. 5.627.061 para Barry e cols. tambémdescreve genes que codificam enzimas de EPSPS. Veja tambémPatentes U.S. Nos. 6.248.876 BI; 6.040.497; 5.804.425;5.633.435; 5.145.783; 4.971.908; 5.312.910; 5.188.642;4.940.835; 5.866.775; 6.225.114 BI; 6.130.366; 5.310.667;4.535.060; 4.769.061; 5.633.448; 5.510.471; Re. 36.449; RE37.287 E; e 5.491.288; e publicações internacionais WO97/04103; WO 97/04114; WO 00/66746; WO 01/66704; WO00/66747 e WO 00/66748, que são aqui incorporadas em suastotalidades por referência para todos os objetivos.Resistência a glifosato também pode ser transmitida aplantas que expressam um gene que codifica uma enzima deglifosato óxido-redutase, como descrito mais completamentenas Patentes U.S. Nos. 5.776.760 e 5.463.175, que são aquiincorporadas em suas totalidades por referência para todosos objetivos. Adicionalmente, resistência a glifosatotambém pode ser transmitida a plantas pela superexpressãode genes que codificam glifosato N-acetiltransferase.
Veja, por exemplo, Pedido de Patente U.S. Nos. de série10/004.357 e 10/427.692, cada um desses aqui incorporadopor referência.
Polipeptideos que conferem tolerância a herbicidas queinibem a enzima glutamina sintase, como fosfinotricina ouglifosinato (por exemplo, o gene bar) também podem serusados. Glutamina sintetase (GS) parece ser uma enzimaessencial necessária para o desenvolvimento e vida damaioria das células de plantas, e inibidores de GS sãotóxicos para células de plantas. Herbicidas de glifosinatoforam desenvolvidos baseados no efeito tóxico devido àinibição de GS em plantas. Esses herbicidas são nãoseletivos; ou seja, eles inibem o crescimento de todas asdiferentes espécies de plantas presentes. 0 desenvolvimentode plantas que contêm uma fosfinotricina acetiltransferaseexógena é descrito nas Patentes U.S. Nos. 5.969.213;5.489.520; 5.550.318; 5.874.265; 5.919.675; 5.561.236;5.648.477; 5.646.024; 6.177.616; e 5.879.903, que são aquiincorporadas em suas totalidades por referência para todosos objetivos. Fosfinotricina acetiltransferase mutada quetem essa atividade é também revelada.
Ainda em outras modalidades, polipeptídeos queconferem tolerância a herbicidas que inibem protox(protoporfirinogênio oxidase) podem ser usados. Protox énecessário para a produção de clorofila, que é necessáriapara a sobrevivência de todas as plantas. A enzima protoxserve como um alvo para vários compostos herbicidas. Essesherbicidas também inibem o crescimento de todas asdiferentes espécies de plantas presentes. 0 desenvolvimentode plantas que contêm atividade alterada de protox que sãoresistentes a esses herbicidas é descrito nas Patentes U.S.Nos. 6.288.306; 6.282.837; e 5.767.373; e publicaçãointernacional WO 01/12825, que são aqui incorporadas emsuas totalidades por referência para todos os objetivos.
Ainda em outras modalidades, os polipeptídeos queenvolvem outros modos de resistência a herbicida sãoempregados. Por exemplo, hidroxifenilpiruvatodioxigenasessão enzimas que catalisam a reação em queparahidroxifenilpiruvato (HPP) é transformado emhomogentisato. Moléculas que inibem essa enzima e que seligam à enzima para inibir a transformação do HPP emhomogentisato são úteis como herbicidas. Plantas maisresistentes a certos herbicidas são descritas nas PatentesU.S. Nos. 6.245.968; 6.268.549; e 6.069.115; e publicaçãointernacional WO 99/23886, que são aqui incorporadas emsuas totalidades por referência para todos os objetivos.Hidroxifenilpiruvatodioxigenases mutados que têm essaatividade são também revelados.
Herbicidas adicionais, incluem, sem limitação, uminibidor de acetil Co-A carboxilase como quizalofop-P-etil,uma auxina sintética como quinclorac, um herbicida inibidorde protoporfirinogênio oxidase (PPO) (como sulfentrazona) ,um herbicida inibidor da síntese de pigmento como uminibidor de hidroxifenilpiruvato dioxigenase (por exemplo,mesotriona ou sulcotriona) , uma fosfinotricinaacetiltransferase, ou um inibidor de fitoeno desaturasecomo diflufenican ou inibidor da síntese de pigmento.
V. Métodos de Introdução
A construção de DNA que compreende o domíniointensificador da presente invenção operacionalmente ligadoa um promotor heterólogo pode ser usada para transformarqualquer organismo de interesse. Em modalidadesespecíficas, o organismo compreende uma planta ou partedessa. Dessa maneira, plantas geneticamente modificadas,célula de plantas, tecido de planta, semente, embriões, eoutros podem ser obtidos.
Os métodos da invenção envolvem a introdução de umpolipeptídeo ou polinucleotídeo em uma planta. "Introdução"deve significar a apresentação a uma planta dopolinucleotídeo em uma tal maneira que a seqüência ganhaacesso ao interior de uma célula da planta. Os métodos dainvenção não dependem de um método particular paraintrodução de uma seqüência em uma planta, apenas que opolinucleotídeo ou polipeptideo ganhe acesso ao interior depelo menos uma célula da planta. Métodos para introdução depolipeptideos em plantas são conhecidos na técnicaincluindo, sem limitação, métodos de transformação estável,métodos de transformação transitória, métodos mediados porvírus e reprodução.
"Transformação estável" deve significar que aconstrução de nucleotídeo introduzida em um planta seintegra no genoma da planta e é capaz de ser herdada pelaprole dessa. "Transformação transitória" deve significarque um polinucleotídeo é introduzido na planta e não seintegra no genoma da planta ou um polipeptideo éintroduzido em uma planta.
Protocolos de transformação, bem como protocolos paraa introdução de polipeptideos ou seqüências depolinucleotídeos em plantas podem variar dependendo do tipode planta ou célula de planta (ou seja, monocotiledônea oudicotiledônea), visada para transformação. Métodosadequados de introdução de polipeptideos e polinucleotídeosem células de planta incluem microinjeção (Crossway ecols. (1986) Biotechnigues 4: 320-334), eletroporação (Riggse cols. (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83: 5602-5606,transformação mediada por Agrobacterium (Patente U.S. N05.563.055; Patente U.S. N0 5.981.840), transferência diretade gene (Paszkowski e cols. (1984) EMBO J. 3: 2717-2722)),e aceleração balística de partícula (veja, por exemplo,Patentes U.S. N° 4.945.050; Patente U.S. No. 5.879.918;Patente U.S. No. 5.886.244; e 5.932.782; Tomes e cols.(1995) em Plant Cell, Tissuef and Organ Culture:Fundamental Methods, ed. Gamborg e Phillips (Springer-Verlag, Berlim); e McCabe e cols. (1988) Biotechnology 6:923-926) ; e transformação Lecl (WO 00/28058) . Veja tambémWeissinger e cols. (1988) Ann. Rev. Genet. 22: 421-477;Sanford e cols. (1987) Particulate Science and Technology5: 27-37 (cebola); Christou e cols. (1988) Plant Physiol87: 671-674 (soja); McCabe e cols. (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soja); Finer e McMullen (1991) In Vitro Cell Dev.Biol. 27P: 175-182 (soja); Singh e cols. (1998) Theor.Appl. Genet. 96: 319-324 (soja); Datta e cols. (1990)Biotechnology 8: 736-740 (arroz); Klein e cols. (1988)Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 4305-4309 (milho); Klein ecols. (1988) Biotechnology 6: 559-563 (milho); PatentesU.S. Nos 5.240.855; 5.322.783 e 5.324.646; Klein e cols.(1988) Plant Physiol. 91: 440-444 (milho); Fromm e cols.(1990) Biotechnology 8: 833-839 (milho); protocolospublicados eletronicamente por "IP.com" sob osidentificadores de publicação permanentes IPCOM000033402D,IPCOM000033402D, e IPCOM000033402D e disponíveis noendereço da internet "IP.com" (algodão); Hooykaas-VanSlogteren e cols. (1984) Nature (Londres) 311: 763-764;Patente U.S. N0 5.736.369 (cereais); Bytebier e cols.(1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: 5345-5349(Liliaceae) ; De Wet e cols. (1985) em The ExperimentalManipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman e cols.(Longman, Nova York), pp. 197-209 (pólen); Kaeppler e cols.(1990) Plant Cell Reports 9: 415-418 e Kaeppler e cols.(1992) Theor. Appl. Genet. 84: 560-566 (transformaçãomediada por bigode de animal); D'Halluin e cols. (1992)Plant Cell 4: 1495-1505 (eletroporação) ; Li e cols. (1993)Plant Cell Reports 12: 250-255 e Christou e Ford (1995)Annals of Botany 75: 407-413 (arroz); Osjoda e cols. (1996)Nature Biotechnology 14: 745-750 (milho por meio deAgrobacterium tumefaciens); todos são aqui incorporados porreferência.
Em modalidades específicas, a construção de DNA dainvenção pode ser fornecida a uma planta que usa váriosmétodos de transformação transitória. Tais métodos detransformação transitória incluem, a construção de DNA quecompreende o domínio intensificador que pode sertransitoriamente transformado na planta usando técnicasconhecidas na prática. Tais técnicas incluem sistema devetor viral e a precipitação do polinucleotídeo em um modoque impeça subseqüente liberação do DNA. Portanto, atranscrição do DNA ligado a partícula pode ocorrer, mas afreqüência com a qual ele é liberado para se tornarintegrado no o genoma é amplamente reduzida. Tais métodosincluem o uso de partículas revestidas com polietilimina(PEI; Sigma #P314 3).
Em outras modalidades, o polinucleotídeo da invençãopode ser introduzido em plantas por contato de plantas comum vírus ou ácidos nucleicos virais. Geralmente, taismétodos envolvem a incorporação de uma construção denucleotídeo da invenção em um DNA viral ou molécula de RNA.Também, é reconhecido que promotores da invenção tambémenglobam promotores utilizados para transcrição por RNApolimerases virais. Métodos para introdução depolinucleotídeos em plantas e expressão de uma seqüênciaoperacionalmente ligada, que envolve DNA viral ou moléculasde RNA, são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo,Patentes U.S. Nos. 5.889.191, 5.889.190, 5.866.785,5.589.367, 5.316.931 e Porta e cols. (1996) MolecularBiotechnology 5: 209-221; aqui incorporado por referência.
Métodos são conhecidos na técnica para a inserçãodirecionada de um polinucleotídeo em uma localizaçãoespecífica em um genoma de planta. Em uma modalidade, ainserção do polinucleotídeo em uma localização genômicadesejada é realizada com o uso de um sistema derecombinação específico para sítio. Veja, por exemplo,W099/25821, W099/25854, W099/25840, W099/25855, eW099/25853, todos são aqui incorporados por referência. Demodo breve, o polinucleotídeo pode estar contido em umcassete de transferência flanqueado por dois sítios derecombinação não recombinogênicos. 0 cassete detransferência é introduzidos em uma planta que temincorporada de forma estável em seu genoma um sítio alvoque é flanqueado por dois sítios de recombinação nãorecombinogênicos que correspondem aos sítios do cassete detransferência. Uma recombinase adequada é fornecida e ocassete de transferência é integrado no sítio alvo. 0polinucleotídeo de interesse é assim integrado em umaposição cromossômica específica em um genoma de planta.
As células que foram transformadas podem crescer emplantas de acordo com meios convencionais. Veja, porexemplo, McCormick e cols. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84. Essas plantas podem então crescer, e serem polinizadascom a mesma cepa transformada ou com cepas diferentes, e ohíbrido resultante tem expressão constitutiva dacaracterística fenotípica desejada identificada. Duas oumais gerações podem crescer para assegurar que a expressãoda característica fenotípica desejada seja mantida de formaestável e herdada e, então, terem as sementes colhidas paraassegurar que a expressão da característica fenotípicadesejada foi obtida. Dessa forma, a presente invençãofornece semente transformada (também referida como "sementetransgênica") que tem um polinucleotídeo da invenção, porexemplo, um cassete de expressão da invenção, incorporadode forma estável em seu genoma.
Em certas modalidades, os polinucleotídeos da presenteinvenção podem ser empilhados com qualquer combinação deseqüências de polinucleotídeos de interesse para criarplantas com um traço desejado. Um traço, como aqui usado,refere-se ao fenótipo derivado de uma seqüência ou gruposde seqüências em particular. Por exemplo, ospolinucleotídeos da presente invenção podem ser sobrepostocom quaisquer outros polinucleotídeos que codificampolipeptídeos tendo atividade pesticida e/ou inseticidae/ou atividade herbicida,, como outras proteínas tóxicas deBacillus thuringiensis (descrito nas Patentes U.S. Nos.5.366.892; 5.747.450; 5.737.514; 5.723.756; 5.593.881;Geiser e cols (1986) Gene 48: 109, lectinas (Van Damme ecols. (1994) Plant Mol. Biol. 24:825, pentina (descrita naPatente U.S. No. 5.981.722) e outros. As combinaçõesgeradas também podem incluir múltiplas cópias de qualquerum dos polinucleotídeos de interesse. Os polinucleotídeosda presente invenção também podem ser empilhado comquaisquer outros genes ou combinação de genes para produzirplantas com várias combinações de traços desejadosincluindo, sem limitação, traços desejáveis paraalimentação animal, como alto conteúdo de óleo (porexemplo, Patente U.S. No. 6.232.529); conteúdo equilibradode aminoácidos (por exemplo, hordotioninas (Patentes U.S.Nos. 5.990.389; 5.885.801; 5.885.802; e 5.703.409); cevadade alta lisina (Williamson e cols. (1987) Eur. J. Biochem.165: 99-106; e WO 98/20122) e altas proteínas de metionina(Pedersen e cols. (1986) J Biol. Chem. 261: 6279; Kiriharae cols. (1988) Gene 71: 359; e Musumura e cols. (1989)Plant Mol. Biol. 12:123)); digestibilidade aumentada (porexemplo, proteínas de estocagem modificadas (Pedido U.S.No. de série 10/053.410, depositado em 7 de novembro de2001); e t iorredoxinas (Pedido U.S. No. de série10/005,429, depositado em 3 de dezembro de 2001)); essasrevelações são aqui incorporadas por referência.
Os polinucleotídeos da presente invenção também podemser empilhados com traços desejáveis para herbicidaresistência a doença ou a herbicidas, (por exemplo, genesde desintoxicação de fumonisim (Patente U.S. No.5.792.931), genes de avirulência e resistentes a doença(Jones e cols. (1994) Science 266: 789; Martin e cols.(1993) Science 262: 1432; Mindrinos e cols. (1994) Cell 78:108 9), mutantes de acetolactato sintase (ALS) que levam aresistência a herbicidas como as mutações S4 e HRA;inibidores de glutamina sintase como fosfinotricina oubasta (por exemplo, gene bar); e resistência a glifosato(EPSPS gene)); e traços desejáveis para processamento ouprodutos de processo como alto conteúdo de óleo (porexemplo, Patente U.S. No. 6.232.529 ); óleos modificados(por exemplo, genes de ácido graxo desaturase (Patente U.S.No. 5.952.544; WO 94/11516)); amidos modificados (porexemplo, ADPG pirofosforilases (AGPase), amido sintases(SS), enzimas de ramificação de amido (SBE), e enzimas dedesramificação de amido (SDBE)); e polímeros oubioplásticos (por exemplo, Patente U.S. No. 5.602.321;beta-cetotiolase, polihidroxibutirato sintase, eacetoacetil-CoA redutase (Schubert e cols. (1988) JBacteriol. 170:5837-5847) facilitam a expressão depolihidroxialcanoatos (PHAs)); cujas revelações são aquiincorporadas por referência. Uma pessoa também podecombinar os polinucleotídeos da presente invenção compolinucleotídeos que fornecem traços agronômicos comoesterilidade masculina (por exemplo, veja a Patente U.S.No. 5.583.210),traços de alongamento do caule, tempo defloração, ou tecnologia de transformação como regulação dociclo celular ou alvo de gene (por exemplo, WO 99/61619, WO00/17364, e WO 99/25821); cujas revelações são aquiincorporadas por referência.
Essas combinações empilhadas podem ser criadas porquaisquer métodos, que incluem, sem limitação, reproduçãode plantas por qualquer metodologia convencional ouTopCross, ou transformação genética. Se as seqüências sãoempilhadas por transformação genética das plantas, asseqüências de polinucleotídeos de interesse podem sercombinadas em qualquer momento e em qualquer ordem. Porexemplo, uma planta transgênica que compreende um ou maistraços desejados pode ser usada como o alvo para introduzirtraços adicionais por subseqüente transformação. Os traçospodem ser introduzidos simultaneamente em um protocolo deco-transformação com os polinucleotídeos de interessefornecidos por qualquer combinação de cassetes detransformação. Por exemplo, se duas seqüências sãointroduzidas, as duas seqüências podem ser contidas emcassetes de transformação separados (trans) ou contidas nomesmo cassete de transformação (eis). A expressão dasseqüências pode ser dirigida pelo mesmo promotor ou pordiferentes promotores. Em certos casos, pode ser desejávelintroduzir um cassete de transformação que suprimirá aexpressão do polinucleotídeo de interesse. Isso pode sercombinado com qualquer combinação de outros cassetes desupressão ou cassetes de superexpressão para gerar acombinação desejada de traços na planta. É tambémreconhecido que seqüências de polinucleotídeos podem serempilhadas em uma localização genômica desejada com o usode um sistema de recombinação sítio-específico. Veja, porexemplo, W099/25821, W099/25854, W099/25840, W099/25855, eW099/25853, todos aqui incorporados por referência.VI Métodos de Uso
Um método para modular a concentração e/ou atividadede qualquer polinucleotídeo ou polipeptídeo aqui codificadoé fornecido. Em geral, a concentração e/ou atividade éaumentada ou diminuída em pelo menos 1%, 5%, 10%, 20%, 30%,40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ou 90% em relação a uma planta decontrole nativa, parte de planta, ou célula que não tem aseqüência da invenção introduzida. A modulação na presenteinvenção pode ocorrer durante e/ou subseqüente aocrescimento de uma planta ao estágio de desenvolvimentodesejado. O nível de expressão do polinucleotídeo oupolipeptídeo de interesse pode ser medido diretamente, porexemplo, por avaliação do nível do polipeptídeo oupolinucleotídeo no organismo, ou indiretamente, porexemplo, por medição da atividade do polipeptídeo oupolipeptideo no organismo.
Em modalidades específicas, a construção de DNA quecompreende o domínio intensificador é introduzida na célulade planta. Subseqüentemente, a célula de planta que tem aseqüência introduzida da invenção é selecionada com o usode métodos conhecidos por aqueles habilitados na técnicacomo, sem limitação, análise de Southern blot,seqüenciamento de DNA, análise de PCR, ou análisefenotípica. Em um método, a população de células éfornecida e a construção de DNA que compreende uma regiãoreguladora de transcrição quimérica da invençãooperacionalmente ligada ao polinucleotídeo que compreendeum marcador selecionável é introduzida em pelo menos umacélula da população. A população de células faz entãocontato com uma concentração eficaz de um agente de seleçãoadequado; e, a célula de planta que Expressa opolinucleotídeo é selecionada. As células de planta que têma construção de DNA são assim identificadas. Uma planta ouparte de planta alterada ou modificada pelas modalidadesanteriores cresce sob condições de formação de planta porum tempo suficiente para modular a concentração e/ouatividade do polinucleotídeo operacionalmente ligado àregião de controle de transcrição que compreende o domíniointensificador. As condições de formação de planta são bemconhecidas na técnica e são discutidas brevemente em outraparte nessa.
Em uma modalidade, o intensificador da invenção éempregados para modular a expressão de doispolinucleotídeos de interesse. Em tais métodos, aconstrução de DNA que tem o intensif icador da invençãoposicionado entre e operacionalmente ligada a um primeiro eum segundo promotor é introduzida em uma planta. Em taismétodos, o intensificador gera a modulação na expressão doprimeiro e segundo promotores a partir de uma direçãodivergente. Exemplos não limitantes de tais construções deDNA compreendem a orientação 5' para 3' ou 3' para 5' : umprimeiro polinucleotídeo de interesse operacionalmenteligado a um primeiro promotor, operacionalmente ligado apelo menos uma cópia de um intensificador da invenção,operacionalmente ligado a um segundo promotor,operacionalmente ligado a um segundo polinucleotídeo deinteresse. Em modalidades específicas, a seqüênciaintensificadora é heteróloga à primeira e segunda seqüênciaintensificadora.
Em algumas modalidades, a região reguladora detranscrição quimérica que compreende o domíniointensificador pode ser usada em construções de DNA que sãooperacionalmente ligadas a um marcador selecionável, comoum polinucleotídeo que pode conferir tolerância a umherbicida. Por exemplo, a construção de DNA que compreendeuma região reguladora de transcrição quimérica quecompreende um domínio intensificador da invenção éoperacionalmente ligada a um polinucleotídeo que podeconferir tolerância a um herbicida que pode funcionar comoum marcador selecionável, por exemplo, em uma planta,bactéria, actinomiceto, levedura, algas ou outros fungos.Por exemplo, um organismo que foi transformado com talconstrução de DNA pode ser selecionado com base em suacapacidade de crescer na presença de um herbicida que nãopermitiria que um organismo de controle crescesse. Comoaqui usado "uma concentração eficaz" de um agente seletivoé a concentração de um agente que permite que células queexpressam o polinucleotídeo de interesse sobrevivam, mas ascélulas que não expressam a seqüência de polinucleotídeosde interesse ao sobreviverão na presença do agente naquelaconcentração.
Como demonstrado no Exemplo 4 e Figura 6, tais métodosde seleção permitem que uma pessoa avalie a expressão de umpolinucleotídeo de interesse. Por exemplo, em modalidadesespecíficas tais métodos permitem que uma pessoa chegue aproblemas potenciais com a expressão de um polinucleotídeode interesse em estágios precoces no processo detransformação. Em tais modalidades, a construção quecompreende a região reguladora de transcrição quimérica éoperacionalmente ligada a um polinucleotídeo que codificaum marcador selecionável. A mesma construção tambémcompreende um polinucleotídeo de interesse que é tambémoperacionalmente ligado à região reguladora de transcriçãoquimérica ou a um promotor de interesse separado. Emboraqualquer polinucleotídeo de interesse possa ser empregado,em exemplos específicos, polinucleotídeos inseticidas sãoempregados.
Em outras modalidades, uma construção que compreendeuma região reguladora de transcrição quimérica quecompreende um domínio intensificador operacionalmenteligada a um polinucleotídeo de interesse pode exibir umaeficiência de transformação muito alta, como uma eficiênciade pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, ou 60% ou maior. Emmodalidades específicas, o polinucleotídeo de interesseconfere tolerância a um marcador selecionável, e em umamodalidade mais específica, a seqüência confere tolerânciaa um herbicida de interesse). Dessa forma, métodosmelhorados de transformação são fornecidos. Além disso,quando uma construção que compreende um domíniointensificador da invenção operacionalmente ligado a umpolinucleotídeo que pode conferir tolerância to um marcadorselecionável (como a seqüência que confere tolerância aherbicida), os transformantes que são obtidos podem exibiruma freqüência muito alta de tolerância ao marcador, demodo que, por exemplo, pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%,70%, 80%, 90%, ou 100% dos transf ormantes são tolerantesaos marcadores. Como aqui usado, "eficácia detransformação" é definida como a percentagem de eventos TOque apresenta o fenótipo desejado do polinucleotídeo deinteresse (ou seja, apresenta tolerância a um herbicida).
Além disso, quando uma construção que compreende umdomínio regulador de transcrição quimérico que compreendepelo menos uma cópia do domínio intensificador éoperacionalmente ligada a um polinucleotídeo de interesse,a freqüência de eventos de transformação em que apenas umaúnica cópia da construção é inserida no genoma pode ser tãoalta quanto pelo menos 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%,ou maior. Dessa maneira, a invenção também fornece métodosaperfeiçoados de transformação. É reconhecido que múltiplascópias do domínio intensificador podem ser usadas,incluindo 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais. Em tais métodos, ostransformantes podem ser selecionados com o uso do métodoadequado com base no polinucleotídeos introduzido noorganismo.A invenção ainda fornece um kit que compreende pelomenos uma construção de ácido nucleico que compreende aregião reguladora de transcrição quimérica um quecompreende pelo menos uma cópia do domínio intensificadorda invenção ou uma variante e fragmento ativo desses. Emalguns aspectos, uma construção da invenção compreenderáuma seqüência de T DNA.
Os exemplos a seguir são oferecidos por via deilustração e não por via de limitação
EXPERIMENTAL
Exemplo 1. Métodos de transformação que empregam umaseqüência GAT em milho
I. Preparação de uma placa máster de Agrobacterium1. Obter cepa construída de Agrobacterium tumefaciens comcomponentes de GAT (Id. de Seq. N°: 7 ou 8) e estocada emcongelador a -800C como um estoque a 50% de glicerol. Aregião de controle de transcrição usada foi a 3X35S ENH (-operacionalmente ligada ao promotor de intron 1 ZmUbiPRO-5UTR-ZmUbi (Id. de Seq. N°:9). Essa região de controlede transcrição (Id. de Seq. N°:9) é apresentada abaixoindicando a localização das várias regiões da regiãoreguladora: a) o intensificador 35S (3X) na direção reversatem sublinhado único; b) o promotor UBI tem um sublinhadoduplo, e c) o intron UBI está em itálico.
atcacatcaatccacttectttgaagaccrtgettggaacgtcttcttmccacaatffctcctc^aeetaggggtccatcttigetraccactgtcggcagagecatcffi<table>table see original document page 65</column></row><table>ccigitgtttggtgUacttctgca (Id- de Seq. N°: 9)
2. Preparar a placa máster a partir de um estoque deglicerol fazendo tiras das bactérias para produzir colôniasúnicas em meio #800 e incubar as bactérias a 28°C no escuropor 3-4 dias.
3. Preparar uma placa de trabalho fazendo tiras de 1colônia a partir da placa máster por todo o meio #810.Incubar as bactérias a 280C no escuro por 1-2 dias.
II. Preparação de bactérias para infecção em embrião
1. Preparar cultura líquida de Agrobacterium 1 dia antesda isolação do embrião. Preparar um frasco com 3 0 mis demeio 557A, 30 μΐ de 2% acetosiringona e 30 μΐ 5%espectinomicina.
2. Inocular com uma alça cheia de Agrobacteriwn de meio810 e colocar em agitador (200 rpm) em sala escura a 280Cde um dia para outro.
3. Na manhã da infecção, retirar amostras da culturalíquida de Agrobacterium e fazer uma diluição a 1/4 com557A. Usar a cultura líquida diluída para fazer leitura deOD usando uma luz visível a 550 nm.
4. Fazer diluições na cultura de Agrobacterium comoadequado de acordo com a leitura OD para manter a leituraOD entre 0,2-0,8 durante a isolação do embrião.
5. Quando da preparação do Agrobacterium para infecção,repetir a leitura OD da cultura líquida. Usando a leituraOD calcular o número de mis necessários para obter 5 ElOcfu/ml (cfu = unidades de formação de colônias) pelo uso dafórmula EXPONENT (1,755 * (InOD) + 21,77) como derivada deuma curva padrão. Pipetar a quantidade calculada de culturalíquida de Agrobacterium em ura tubo de 14 ml e centrifugara 4.500 rpm a 4—200C por dez minutos. Remover osobrenadante e ressuspender Agrobacterium em quantidadeadequada de 100 uM de solução de acetosiringona em 561Q.
III. Isolação de embrião imaturo
1. Colher espigas GS3 com 9-11 dias após polinização comtamanho de embrião de 1-2 mm de comprimento.
2. Esterilizar a espiga em 50% alvejante e 1 gota Tweenpor 20-30 minutos. Enxaguar 3-5 vezes em água estéril .
3. Isolar embriões dos grãos e colocar em microtubocontendo 2 mis 561Q.
VI. Infecção por Agrobacteriiam dos embriões.
1. Remover 561Q com pipeta do microtubo com embriõesisolados e adicionar 1 ml de suspensão de Agrobacterium emOD acima descrito.
2. Misturar por turbilhonamento por cerca de 30 segundos.
3. Deixar por 5 minutos para infecção em temperaturaambiente.
V. Co-cultivo
1. Após remoção do meio líquido, transferir embriões eorientar os embriões cora eixos embriônicos para baixo nasuperfície de meio de co-cultivo 562P.
2. Colocar os embriões em incubador a 20°C por 3 dias.Transferir a 28°C por 3 dias adicionais.
VI. Seleção de eventos de calo transgênico suposto
1. Depois de co-cultivo, transferir os embriões para meiode seleção 5631 contendo 1 mM glifosato. Cultivar osembriões a 280C no escuro.
2. A cada 14-21 dias transferir os embriões para meiofresco 5631. O processo de seleção pode durar cerca de 2meses até que crescimento ativo de eventos do calo supostopossam ser identificados. Manter eventos do calo supostoem meio 5631 e retirar amostra do calo para PCR.
VII. Regeneração de plantas T0
1. Transferir eventos de calo para meio 2871 contendo 0,1mM Glifosato até embriões somáticos maduros. Cultivar ocalo a 280C no escuro.
2. Transferir eventos de calo para meio 2731 degerminação de embrião contendo 0,1 mM glifosato em placas.Cultivar as placas a 28°C em luz.
3. Quando ramos e raízes surgirem, transferir plantasindividuais para 2731 contendo 0,125 mM Glifosato em tubos.Cultivas os tubos a 280C em luz.
4. Brotos com ramos e raízes estabelicidos devem sertransferidos para estufa para posterior crescimento eprodução de semente Tl.
Exemplo 2. Efeito de intensificador 35S sobre a eficiênciade transformação e eficácia de GAT e ALS em milhoMateriais e Métodos
Quatro construções de intensificador 35S(PHP20118, PHP20120, PHP20122, PHP20124) e uma construçãonão-35S (PHP19288) foram usadas para produzir eventos paraavaliar o efeito de intensificador 35S sobre a eficiênciade transformação e eficácia de GAT (Id. de Seq. N°:7) (Fig.1). As diferenças entre as quatro construções deintensificador 35S são os números de cópia dointensificador 35S e as orientações do intensificador 35Snas construções. Um resumo de cada construção deintensificador 3 5S é fornecido abaixo.
PHP20118 compreende 35S ENH(+):ZmUBI PRO-5UTR-UBIINTR0N1 (+ denota direção adiante do intensificador 35S) .Essa região de controle de transcrição (Id. de Seq.N°:11) é apresentada abaixo indicando a localização dasvárias regiões da região reguladora: a) o intensificador5S na direção adiante tem sublinhado único; b) o promotorUBI tem um sublinhado duplo, e c) o intron UBI está emitálico.
fltqrecctctctapaaataataaacattqratatGtaaatgctcaccctgttgtttggtgttacttctgca (id. de Seq. N°:ii)PHP20122 compreende 3X35S ENH (+):ZmUBI PRO-5UTR-UBIINTR0N1 (+ indica direção adiante do intensificador 35S) .Essa região de controle de transcrição (Id. de Seq. N°:12)é apresentada abaixo indicando a localização das váriasregiões da região reguladora: a) o intensificador 35S nadireção adiante tem sublinhado único; b) o promotor UBI temum sublinhado duplo, e c) o intron UBI está em itálico.
aaagactggcgaacagttcatacagaetotcttacacacttfnctactccaaaaa
ecRsa^cetcctc^»attccattecccaectatctgtcacmattgt^aagatagtgpaaaaggaaggtagctcCta^aa
tgcgtggcggagcggcagacateagocggcaeggcaggcggcctcctcctcctctciacpocaccppcapKtacgppp(Id. de Seq. N0: 12)
PHP2 012 0 compreende 35S ENH (-) :ZmUBI PRO-5UTR-UBIINTRON1 (- indica direção reversa do intensificador 35S) .Essa região de controle de transcrição (Id. de Seq. Ne:13)é apresentada abaixo indicando a localização das váriasregiões da região reguladora: a) o intensificador 35S nadireção reversa tem sublinhado único; b) o promotor UBI temum sublinhado duplo, e c) o íntron UBI está em itálico.
2McttcacaataaagtgacapalagctpppnaafppTaatccgaggag^ccggatattaccctttgttgaaaagtclcaat(Id. de Seq. N°: 13)
PHP20124 compreende 3X35S ENH (-): ZmUBI PRO- 5 UTR-UEINTRON1 (indica direção reversa do intensificador 35S)Essa região de controle de transcrição (id. de Seq. N°14) é apresentada abaixo indicando a localização das váriaregiões da região reguladora: a) o intensificador 35S ηdireção reversa tem sublinhado único; b) o promotor UBI te,um sublinhado duplo, e c) o íntron UBI está em itálico.<table>table see original document page 73</column></row><table>cctgttgmggtgttacttctgca (Id. de Seq. N°: 14)
Os experimentos de transformação foram conduzidoslado-a-lado usando os mesmos embriões das mesmas espigas.Embriões imaturos de linhagem GS3 foram assepticamenteremovidos de cada espiga e divididos em cinco porções. Cadaporção dos embriões foi então infectada com A. tumefacienscepa LBA44 04 contendo os cassetes de expressão de cada umadas cinco construções, respectivamente. Depois de 6 dias deco-cultivo, os embriões foram transferidos para meio deseleção fresco contendo glifosato. As célulastransformadas, que sobreviveram à seleção de glicofosato,proliferaram e produziram calos embriogênicos somáticos.Depois de cerca de dois meses de subcultura, os calos forammanipulados para regenerar plantas transgênicas inteirascom presença de glifosato e foram transferidos para aestufa. Plantas TO foram então submetidas a spray deglifosato a 6X (156 oz/ac) Roundup Ready UltraMaxTMatestágios V3 ou V4 na estufa. Plantas positivas tiveramamostras retiradas para PCR quantitativo para número decópia e western para expressão. Plantas TO foram entãocruzadas com linhagens inatas para obter sementes paraposterior avaliação.
Resultados
A eficiência da transformação foi medida como apercentagem dos embriões infectados que produziram calosresistentes após seleção. As eficiências de transformaçãomédias para PHP19288, PHP20118, PHP20120, PHP20122, ePHP20124 foram de 58%, 63%, 59%, 57%, and 51%,respectivamente. Os dados indicaram que todas asconstruções tinham eficiências de transformação bastantealtas e similares, embora PHP20118 mostrasse um leveaumento(Fig 2).
A eficácia da planta TO foi definida como apercentagem dos eventos TO que foram completamenteresistentes ao spray de 6x glifosato. A eficácia daconstrução não-35S (PHP19288) foi de 48,1%. Em contraste,as eficácias das construções de intensificador 35S(PHP20118, PHP20120, PHP20122, e PHP20124) foram 96,6%,93,5%, 89,1%, e 91,1%, respectivamente (Fig. 3). Os dadosmostraram que todas as construções de intensificador 35Saumentaram significativamente a eficácia da planta contraglifosato.
Uma outra melhoria significativa do uso deintensificador 35S foi no padrão de integração dotransgene. A percentagem dos eventos testados que foramcópia única para a construção de intensificador não-35Sfoi de apenas 38%, mas para as quatro construções deintensificador 35S (PHP20118, PHP20120, PHP20122, ePHP20124) os eventos de cópia única representaram 65%, 63%,71%, e 88% dos eventos, respectivamente (Fig. 4).
Foi feita uma amostra do subconjunto de eventos detodas as cinco construções por análise Western paraobservar quaisquer diferenças comparativas em expressão deGAT entre eventos não 35S e 35S. Essa análise mostrou queeventos da construção de intensificador não-35S tiveramníveis muito baixos de expressão de GAT enquanto a maioriados eventos das construções de intensificador 35S mostrouníveis muito altos de expressão de GAT (Fig. 5).
Exemplo 3. Uso de GAT de Intensificador 35S nodesenvolvimento de um novo sistema de Avaliação deGene/Construção baseado em calo.
Materiais e Métodos
Esse ensaio está sendo desenvolvido para melhorar aavaliação da expressão de um gene inseticida em um estágiomuito precoce no processo de transformação para identificarproblemas potenciais com a expressão. A base desse ensaio éo uso de the glifosato acetil transferase (GAT) gene (Id.de Seq. N°:55) as a marcador selecionável. Tanto o gene deGAT e quanto o gene de teste inseticida serão dirigidos porum forte promotor constitutivo e ligado na mesmaconstrução. 0 promotor empregado compreende ZmUBI PRO-5UTR-UBI INTR0N1 com o intensificador 3X35S como acima descritono Exemplo 7. Como um resultado é esperado que a seleção emaltos níveis de glifosato identificará expressores de genede teste altamente inseticida. 0 tecido do calo dessesaltos expressores supostos serão então usados em bioensaiosde inseto para determinar se o produto do gene é funcional.
Aquelas construções que mostram eficácia podem seravançadas na transformação. Se a construção não mostraeficácia então acompanhamento bioquímico e análisemolecular podem ser conduzidos para identifica o problema eo gene será redesenhado e novamente testado no sistema(Fig. 6) .
Resultados
Dados preliminares mostraram que a atividade de umgene de controle de inseto eficaz pode ser detectada noestágio de calo. A correlação entre a atividade do calo e aeficácia da planta está atualmente sendo avaliada.Exemplo 4. GAT como um marcador selecionávelMateriais e métodos
Transformação mediada por Agrobacterium foi usada paraintroduzir o cassete de expressão GAT (Id. de Seq. N°:8) nogenoma do milho. 0 cassete de expressão GAT compreende,promotor que compreende ZmUBI PR0-5UTR-UBI INTR0N1 com ointensificador 3X355 (como descrito acima no Exemplo 1)operacionalmente ligado ao gene de GAT, e terminador pinll.Agrobacterium tumefaciens, cepa LBA4404, foipatogenicamente desarmado por remoção de seu T-DNA nativo.Ao contrário, o sitio de T-DNA no plasmídeo Ti continha ocassete de expressão GAT.
Embriões imaturos de milho foram assepticamenteremovidos do caryopsis em desenvolvimento e tratados com A.tumefaciens cepa LBA4404 contendo cassetes de expressãoGAT. Depois de um período de co-cultivo do embrião eAgrobacterium em meio de cultura sólido sem presença deglifosato, os embriões foram transferidos para meio deseleção fresco que continha antibióticos e glifosato. Osantibióticos matam qualquer Agrobacterium restante. 0 meiode seleção é estimulante para embriogênese somática demilho e seletivo para aquelas células que contêm um gene deGAT integrado. Portanto, o calo que sobrevive a glifosatopara proliferar e produzir tecido embriogênico épresumivelmente geneticamente transformado. Amostras decalo foram feiras para análise molecular para verificar apresença do transgene por PCR. 0 tecido embriônico é entãomanipulado para regenerar plantas transgênicas na presençade glifosato que são então transferidas para a estufa.Plantas TO são pulverizadas com glifosato em diferentesconcentrações. Plantas positivas tiveram amostras retiradaspara análise molecular para número de cópia de transgene ecruzadas com linhagens inatas para obter sementes dasplantas inicialmente transformadas.
Uma curva de morte de glifosato foi estabelecida porteste de resposta de embriões não transformados em meio comdiferentes níveis de glifosato. Embriões GS3 foram isoladosde uma espiga imatura e colocados em um meio contendoglifosato a 0,0, 0,5, 1,0, e 2,0 mM. Depois de cerca de 40dias de cultura, a resposta dos embriões foi observada eregistrada. De modo similar, embriões GS3 infectados com aconstrução GAT foram colocados em meio contendo glifosato a0,0, 0,5, 1,0, e 2,0 mM. Depois de cerca de 40 dias decultura, a resposta dos embriões infectados foi observada eregistrada. (Fig. 7).
Um experimento lado-a-lado foi conduzido para comparar aseficiências de transformação de GAT, bar e mopat. Embriõesimaturos de linhagem GS3 foram assepticamente removidos decada espiga e divididos em três porções. Cada porção dosembriões foi então infectada com A. twnefaciens cepaLBA4404 contendo os cassetes de expressão de GAT, bar, oumopat, respectivamente. Depois de co-cultivo, os embriõesinfectados com construção GAT foram selecionados em meio deglifosato rotineiro e os embriões infectados comconstruções bar ou mopat foram selecionados em meio deglifosato rotineiro. As subculturas foram feitas a cada 2semanas. Em cerca de 50 dias a seleção das respostas dosembriões foi observada e registrada.
Resultados
A partir do experimento de curva de morte deglifosato, todos os embriões em meio com 0,0 mM glifosatoiniciaram calo saudável, enquanto cerca de metade dosembriões no meio com 0,5 mM de glifosato mostraram iníciodo calo. Houve muito pouco crescimento de calo com embriõesem meio que contém 1,0 e 2,0 mm de glifosato. Isso indicouque 0,5 mM não é suficiente para inibir todo o crescimentodos embriões, mas 1 mM ou 2 mM é forte o suficiente paramatar os embriões não transformados. No experimento deembrião infectado, mais calo cresceu em meio com 0,0 e 0,5mM de glifosato, mas alguns embriões iniciaram caloresistente em meio com .1,0 mM ou 2,0 mM de glifosato.
Análise de Western ou PCR confirmaram que esses calosresistentes foram transformados. Atualmente, GAT tem agidoconsistentemente como um marcador selecionável eficaz comexcelente eficiência de transformação em genótipos GS 3 eintroEF09B (Fig. 9 e Tabela 1).
Tabela 1 Eficiência de transformação de GAT em introEF09Bgenotipo construção
<table>table see original document page 79</column></row><table>
No experimento lado-a-lado para comparar GAT, bar emopat, GAT teve a melhor eficiência de transformação emcerca de 64%, bar a 34%, e mopat a 30%. Calo com seleção deGAT parece crescer mais rápido que aqueles selecionados emglifosinato (Fig. 9)Exemplo 5: Transformação e regeneração de plantastransgênicas
Embriões imaturos de milho de plantas doadoras deestufa são bombardeados com um plasmídeo que contém aregião reguladora de transcrição quimérica que compreende odomínio intensificador de Id. de Seq. N0:l operacionalmenteligado a ZmUBI PR0-5UTR-ZmUBI INTR0N1 (Id. de Seq. N°:6). Aregião reguladora de transcrição quimérica éoperacionalmente ligado a um polinucleotídeo de interesse eo gene de marcador selecionável PAT (Wohlleben e cols.(1988) Gene 70:25-37), que confere resistência ao herbicidaBialafos. Alternativamente, o gene de marcador selecionávelé fornecido em um plasmídeo separado. A transformação érealizada como se segue. Receitas de meios estão abaixo.
Preparação de tecido alvo
As espigas são descascadas e a superfície éesterilizada em 30% alvejante Clorox mais 0,5% Microdetergente por 20 minutos, e enxaguadas duas vezes com águaestéril. Os embriões imaturos são retirados e colocados como lado do eixo do embrião para baixo (lado do escutelo paracima), 25 embriões por placa, em meio 560Y por 4 horas eentão alinhados com a zona alvo de 2,5 cm na preparaçãopara bombardeamento.
Um vetor de plasmídeo que compreende a construçãoacima descrita é feito. Esse DNA de plasmídeo mais DNA deplasmídeo que contém um marcador selecionável PAT éprecipitado em um pélete de tungstênio de 1,1 μm (diâmetromédio) usando um procedimento de precipitação de CaCl2 comose segue: 100 μl de partículas de tungstênio preparadas emágua; 10 μl (1 μ9) DNA em tampão Tris EDTA (1 μ5 DNAtotal); 100 μΐ 2,5 M CaCl2; e 10 μΐ 0,1 M espermidina.
Cada reagente é adicionado seqüencialmente à suspensãode partículas de tungstênio, enquanto são mantidas novortexer de multitubos. A mistura final é sonifiçadabrevemente e deixada para incubar sob turbilhonamentoconstante por 10 minutos. Depois do período deprecipitação", os tubos são centrifugados brevemente, olíquido removido, lavados com 500 ml 100% etanol, ecentrifugados por 30 segundos. Novamente o líquido éremovido, e 105 μΐ 100% etanol é adicionado às partículasfinais de pélete de tungstênio. Para bombardeamento depistola de partículas, as partículas de tungstênio/DNA sãobrevemente sonificadas e 10 μΐ são salpicados no centro decada macrocarreador e deixados para secar cerca de 2minutos antes do bombardeamento.
A placas de amostra são bombardeadas no nível #4 napistola de partículas. Todas as amostras recebem um únicotiro a 4481,59 kPa, com um total de dez alíquotas tomadasde cada tubo de partículas/DNA preparados.
Após o bombardeamento, os embriões são mantidos em meio560Y por 2 dias, e então são transferidos para meio deseleção 560R contendo 3 mg/litro de Bialaphos, esubcultivados a cada 2 semanas. Após aproximadamente 10semanas de seleção, clones de calo resistentes à seleçãosão transferidos para meio 288J para iniciar a regeneraçãoda planta. Após a maturação somática do embrião (2-4semanas), embriões somáticos bem desenvolvidos sãotransferidos para meio para germinação e transferidos paraa sala de cultura iluminada. Aproximadamente 7-10 dias maistarde, as plântulas em desenvolvimento são transferidaspara meio 272V livre de hormônios em tubos por 7-10 diasaté que as plântulas estejam bem estabelecidas. As plantassão então transferidas para inserções em planos(equivalente a pote de 6,35 cm) contendo solo envasado ecrescem por 1 semana em uma câmara de crescimento,subseqüentemente crescem por mais 1-2 semanas na estufa, eentão são transferidas para 600 potes clássicos (6,05litros) e crescem até a maturidade. As plantas sãomonitoradas e pontuadas para o fenótipo desejado com baseno polinucleotídeo de interesse.
0 meio de bombardeamento (560Y) compreende 4,0 g/L desais basais N6 (SIGMA C-1416) , 1,0 ml/L de Mistura deVitamina de Eriksson (lOOOx SIGMA-1511), 0,5 mg/L de HCl detiamina, 120,0 g/L de sacarose, 1,0 mg/12,4-D, e 2,88 g/Lde L-prolina (trazida ao volume com D-I H2O após ajuste atéPH 5,8 com KOH) ; 2,0 g/L de Gelrite™ (adicionados apóstrazer ao volume com dl H2O); e 8,5 mg/L de nitrato deprata (adicionados após esterilização do meio eresfriamento até a temperatura ambiente). 0 meio de seleção(560R) compreende 4,0 g/L de sais basais N6 (SIGMA C-1416),1,0 ml/L Mistura de Vitamina de Eriksson (lOOOx SIGMA-1511), 0,5 mg/L de HCl de tiamina, 30,0 g/L de sacarose, e2,0 mg/L de 2,4-D (trazida ao volume com dl H2O após ajusteaté pH 5,8 com KOH) ; 3,0 g/L Gelrite™ (adicionados apóstrazer ao volume com dl H2O); e 0,85 mg/L de nitrato deprata e 3,0 mg/L de Bialaphos (ambos adicionados apósesterilização do meio e resfriamento até a temperaturaambiente).
O meio de regeneração de planta (288J) compreende 4,3g/L de sais MS (GIBCO 11117-074), 5,0 mL de MS solução deestoque de vitaminas (0,100 g ácido nicotínico, 0,02 g/L deHCl de tiamina, 0,10 g/L de HCl de piridoxina, e 0,40 g/Lde Glicina trazida ao volume com D-I H2O polida) (Murashigee Skoog (1962) Physiol. Plant. 15:473), 100 mg/L demioinositol, 0,5 mg/L de zeatina, 60 g/L de sacarose, e 1,0ml/L de 0,1 mM ácido abscísico (trazido ao volume com dlH2O polido após ajuste até pH 5,6); 3,0 g/L de Gelrite™(adicionados após trazer ao volume com dl H2O); e 1,0 mg/Lde ácido indolacético e 3,0 mg/L de Bialaphos (adicionadosapós esterilização do meio e resfriamento até 60°C) . Meiolivre de hormônio (272V) compreende 4,3 g/L MS de sais(GIBCO 11117-074), 5,0 ml/L solução de estoque de vitaminasMS (0,100 g/L de ácido nicotínico, 0,02 g/L de HCl detiamina, 0,10 g/L de HCl de piridoxina, e 0,40 g/L deGlicina trazida ao volume com dl H2O polido), 0,1 g/L demioinositol, e 40,0 g/L de sacarose (trazida ao volume comdl H2O polido após ajuste do pH até 5,6); e 6 g/L deBactoagar (adicionados após trazer ao volume com dl H2Opolido), esterilizado e resfriado até 60° C.
Exemplo 6. Transformação de embrião de soja
Condições de cultura
As culturas de suspensão embriogênica de soja (cv.Jack) são mantidas em 35 ml de meio líquido SB 196 (vejareceitas abaixo) em um agitador rotatório, a 150 rpm, a26°C, com luzes fluorescentes frias brancas em um esquemade dia/luz de 16:8 horas em intensidade de luz de 60-85ME/m2/s. As culturas são subcultivadas a cada sete dias aduas semanas por inoculação de aproximadamente 35 mg detecido em 35 ml de meio líquido SB 196 (o intervalo desubcultura preferido é a cada 7 dias).As culturas de suspensão embriogênica de soja sãoentão transformadas com os plasmídeos e fragmentos de DNAdescritos nos exemplos a seguir pelo método debombardeamento com pistola de partículas (Klein e cols.(1987) Nature 327: 70).
Iniciação da cultura de suspensão de soja embriogênica
Culturas de soja são iniciadas duas vezes a cada mêscom 5-7 dias entre cada iniciação.
Vagens com sementes imaturas de plantas de sojadisponíveis de 45-55 dias após a plantação são colhidas,removidas de suas cascas e colocadas em uma caixa magentaesterilizada. As sementes de soja são esterilizadas poragitação delas por 15 minutos em uma solução a 5% de Cloroxcom uma gota de sabão "ivory" (95 ml de água destiladaautoclavada mais 5 ml Clorox e 1 gota de sabão) . Misturarbem. As sementes são enxaguadas com o uso de 2 garrafas de1 litro de água destilada estéril e aquelas com menos que 4mm são colocadas em laminas de microscópio individuais. Aspequenas extremidades da semente são cortadas e oscotilédones pressionados do revestimento da semente. Oscotilédones são transferidos para placas contendo meio SBl(25-30 cotilédones por placa). As placas são envolvidas comfita de fibra e estocadas por 8 semanas. Depois desse tempoos embriões secundários são cortados e colocados em meio SB196 líquido por 7 dias.
Preparação de DNA para bombardeamento
Um plasmídeo intacto ou um ou fragmento de DNA deplasmídeo contendo os genes de interesse e o gene demarcador selecionável são usados para bombardeamento. DNAde plasmídeo para bombardeamento é rotineiramente preparadoe purificado com o uso do método descriro no Promega™Protocols and Applictions Guide, Segunda Edição (página106). Fragmentos dos plasmideos que carregam a regiãoreguladora de transcrição quimérica que compreende odomínio intensificador de Id. de Seq. N0:1 operacionalmenteligado a ZmUBI PRO-5UTR-ZmUBI INTRONl (Id. de Seq. N0 :6)que é operacionalmente ligado a um polinucleotídeo deinteresse são obtidos por isolação de gel de plasmideosduplamente digeridos. Em cada caso, 100 μg de DNA deplasmídeo são digeridos em 0,5 ml da mistura de enzimaespecífica que é adequada para o plasmídeo de interesse. Osfragmentos de DNA resultantes são separados poreletroforese de gel em 1% SeaPlaque GTG agarose(BioWhitaker Molecular Apllications) e os fragmentos de DNAque contêm a construção acima descrita são cortados do gelde agarose. DNA é purificado da agarose com o uso da enzimade digestão GELase seguindo o protocolo do fabricante.
Uma alíquota de 50 μΐι de água destilada estérilcontendo 3 mg de partículas de ouro (3 mg de ouro) éadicionado a 5 μΐϋ de uma solução de DNA de 1 μg/μL(plasmídeo intacto ou fragmento de DNA preparado como acimadescrito), 50 μΙ, de CaCl2 2,5 M e 20 ml de 0,1 M deespermidina. A mistura é então agitada por três minutos nonível 3 de um agitador de turbilhonamento e centrifugada emuma microfuga por 10 segundos. Após uma lavagem com 400 μ]^de etanol 100% o pélete é suspenso por sonificação em 40 μΐde 100% etanol. Cinco μΐ de suspensão de DNA são colocadosem cada disco do instrumento Biolistic PDS 1000/HE. Cadaalíquota de 5 μΐι conte aproximadamente 0,375 mg de ouro porbombardeamento (ou seja, por disco).Preparação de tecido e bombardeamento com DNA
Aproximadamente 150-200 mg de culturas de suspensãoembriônicas de 7 dias de idade são colocados em uma placade petri vazia, estéril de 60 χ 15 mm e a placa é cobertacom trama plástica. O tecido é bombardeado 1 ou 2 vezes porplaca com pressão para ruptura da membrana ajustada em7,584 MPa, e a câmara foi evacuada até um vácuo de 711,20milímetros de mercúrio. O tecido foi colocadoaproximadamente 8,8 9 cm afastado da tela de retenção.
Seleção de Embriões Transformados
Embriões transformados foram selecionados com o uso dehigromicina (quando a higromicina fosfotransferase, HPT,gene foi usada como o marcador selecionável) ouclorsulfurona (quando a acetolactato sintase, ALS, gene foiusada como o marcador selecionável).
Seleção de Higromicina (HPT)
Após bombardeamento, o tecido é colocado em meiofresco SB 196 e cultivado como acima descrito, seis diaspós-bombardeamento, o SB 196 é trocado por SB 196 frescocontendo um agente de seleção de 3 0 mg/L higromicina. 0meio de seleção é trocado semanalmente. Quatro a seissemanas pós-seleção, tecido verde, transformado pode serobservado crescendo a partir de grupos embriogênicosnecróticos, não transformados. Tecido verde isolado éremovido e inoculado em placas de várias cavidades paragerar novas culturas de suspensão embriogênica, clonalmentepropagadas, transformadas.
Seleção de Clorsulfurona (ALS)
Após bombardeamento, o tecido é dividido entre 2frascos com meio fresco SB 196 e cultivado como acimadescrito. Seis a sete dias pós-bombardeamento, o SB 196 étrocado por SB 196 fresco contendo um agente de seleção de100 mg/L Clorsulf urona. 0 meio de seleção é trocadosemanalmente. Quatro a seis semanas pós-seleção, tecidoverde, transformado pode ser observado crescendo a partirde grupos embriogênicos necróticos, não transformados.Tecido verde isolado é removido e inoculado em placas devárias cavidades contendo SB 196 para gerar novas culturasde suspensão embriogênica, clonalmente propagadas,transformadas.
Regeneração de embriões somáticos de soja em plantas
Para obter plantas inteiras a partir de culturas desuspensão embriogênica, o tecido deve ser regenerado.
Maturação do Embrião
Os embriões são cultivados por 4-6 semanas a 260C emSB 196 sob luz fluorescente fria branca (Phillips Econowattbranca fria F40/CW/RS/EW) e Agro (Phillips F40 Agro) (40watt) em um esquema de dia/luz de 16:8 horas em intensidadede luz de 90-120 μΕ/ιτ^/ε. após esses tempo os grupos deembrião são removidos para um meio de Agar sólido, SB 166,por 1-2 semanas. Os grupos são então subcultivados parameio SB103 'por 3 semanas. Durante esse período, embriõesindividuais podem ser removidos dos grupos e rastreadospara o fenótipo desejado com base no polinucleotídeo deinteresse empregado. Deve ser observado que qualquerfenótipo detectável, resultante da expressão do gene deinteresse, pode ser rastreado nesse estágio.Dissecação e germinação do embrião
Embriões individuais maduros são dissecados colocando-se em pequenas placas de petr vazias (35 χ 10 mm) poraproximadamente 4-7 dias. As placas são seladas com fita defibra (criando uma pequena câmara de umidade). Os embriõesdissecados são plantados em meio SB71-4 em que eles foramdeixados para germinar sob as mesmas condições de culturaacima descritas. As plântulas germinadas são removidas domeio de germinação e enxaguadas completamente com água eentão plantadas em Redi-Earth em bandeja de 24 células,cobertas com cobertura de plástico transparente. Depois de2 semanas a cobertura é removida e as plantas endurecidaspor mais uma semana. Se as plântulas parecem fortes elassão transplantadas para um pote de 10" de Redi-Earth comaté 3 plântulas por pote. Depois de 10 a 16 semanas, assementes maduras são colhidas, picadas e analisadas paraproteínas.
Receitas de meio
<table>table see original document page 88</column></row><table>1 MS Fe EDTA IOOx estoque
Na2 EDTA* 3,724 g 1,862 g
FeSO4 - 7H20 2,784 g 1,3 92 g
* Adicionar primeiramente, dissolver em, frasco escuro comagitação
2 MS Sulfato IOOx estoque
MgSO4 - 7H20 37,0 g 18,5 g
MnSO4 - H2O 1,69 g 0,845 g
ZnSO4 - 7H20 0,86 g 0,43 g
CuSO4 - 5H20 0,0025 g 0,00125 g
0,0025 g 0,00125 g
3 FN Lite Haletos IOOx estoque
CaCl2 - 2H20 30,0 g 15,0 g
KI 0,083 g 0,0715 g
CaCl2- 6H20
4 FN Lite P,B,Mo IOOx estoque
KH2PO4 18,5 g 9,25 g
H3BO3 0,62 g 0,31 g
Na2MoO4 - 2H20 0,025 g 0,0125 g
Meio sólido SBl (por litro) compreende: 1 pkg. Sais MS(Gibco/ BRL - Cat# 11117-066); 1 ml de vitaminas B5 1.000 Xestoque; 31,5 g sacarose; 2 ml 2,4-D (20 mg/L concentraçãofinal); pH 5.7; e, 8 g TC agar.
Meio sólido SB 166 (por litro) compreende: 1 pkg. SaisMS (Gibco/ BRL - Cat# 11117-066) ; 1 ml de vitaminas B51.000 X estoque; 60 g maltose; 750 mg hexahidrato de MgCl2;5 g carvão ativado; pH 5,7; e 2 g gelrite.
Meio sólido SB 103 (por litro) compreende: 1 pkg. SaisMS (Gibco/BRL - Cat# 11117-066); 1 ml de vitaminas B5 1.000X estoque; 60 g maltose; 750 mg hexahidrato de MgCl2; pH5,7; and, 2 g gelrite.
Meio sólido SB 71-4 (por litro) compreende: 1 frascode sais B5 de Gamborg com sacarose (Gibco/BRL - Cat# 21153-036); pH 5,7; e 5 g TC agar.
Estoque de 2,4-D é obtido preparado anteriormente porPhytotech cat# D 295 — concentração é 1 mg/ml.
Estoque de Vitaminas B5 (por 100 ml) que é estocada emalíquotas a -20C compreende: 10 g mio-inositol; 100 mgácido nicotínico; 100 mg piridoxina HCl; e 1 g tiamina. 25Se a solução não se dissolve rapidamente, aplicar um baixonível de calor por meio da placa de agitação quente.Estoque de clorsulfurona compreende 1 mg/ml em 0,01 Nhidróxido de amônio.
0 artigo "um" e "uma" são aqui utilizados para sereferir a um ou mais de um (ou seja, a pelo menos um) doobjeto gramatical do artigo. Como forma de exemplo, "umelemento" significa um ou mais elementos.
Todas as publicações e pedidos de patente mencionadosna especificação são indicativos do nível daqueles comhabilidade na técnica à qual essa invenção pertence. Todasas publicações e pedidos de patente são aqui incorporadospor referência na mesma extensão como se cada publicação oupedido de patente individual fosse específica eindividualmente indicado para ser incorporado porreferência.
Embora a invenção precedente tenha sido descrita emalgum detalhe como forma de ilustração e exemplo para finsde clareza de compreensão, estará óbvio que certas mudançase modificações podem ser praticadas dentro do escopo dasmodalidades aqui descritas.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS
<110> McCutchen, Billy FredHazel, Christine B.Liu, DonglongLu, Albert L.Mehre( Wayne J.Olson, Paul D.Wong, James F. H.
<120> Métodos e composições para a expressão de um polinucleotídeo deinteresse
<130> 035718/315230
<150> 60/710,854<151> 24-08-2005
<150> 60/817,011<151> 28-06-2006
<160> 18
<170> FastSEQ for Windows Versão 4.0
<210> 1
<211> 438
<212> DNA
<213> Vírus mosaico de couve-flor
<220>
<221> Intensificador
<222> (0) . . . (0)
<223> Intensificador 35S
<400> 1
cccatggagt caaagattca aatagaggac ctaacagaac tcgccgtaaa gactggcgaa 60cagttcatac agagtctctt acgactcaat gacaagaaga aaatcttcgt caacatggtg 120
gagcacgaca cgcttgtcta ctccaaaaat atcaaagata cagtctcaga agaccaaagg 180
gcaattgaga cttttcaaca aagggtaata tccggaaacc tcctcggatt ccattgccca 240gctatctgtc actttattgt gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta caaatgccat 300cattgcgata aaggaaaggc catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat 360ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag 420caagtggatt gatgtgat 43 8
<210> 2<211> 534<212> DNA
<213> Vírus mosaico de couve-flor<220>
<221> promotor<222> (0)...(0)<223> Intensificador 35S com promotor central mínimo
<400> 2
cccatggagt caaagattca aatagaggac ctaacagaac tcgccgtaaa gactggcgaa 60cagttcatac agagtctctt acgactcaat gacaagaaga aaatcttcgt caacatggtg 120gagcacgaca cgcttgtcta ctccaaaaat atcaaagata cagtctcaga agaccaaagg 180gcaattgaga cttttcaaca aagggtaata tccggaaacc tcctcggatt ccattgccca 240gctatctgtc actttattgt gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta caaatgccat 300
cattgcgata aaggaaaggc catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat 360
ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag 420
caagtggatt gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc ccactaagct 480
tcgcaagacc cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt tggagaggac aggg 534
<210> 3
<211> 52
<212> DNA
<213> Vírus mosaico de couve-flor
<220>
<221> promotor
<222> (0)...(0)
<223> promotor central mínimo
<400> 3
gcaagaccct tcctctatat aaggaagttc atttcatttg gagaggacag gg
52
<210> 4
<211> 162<212 > DNA
<213> Vírus mosaico de couve-flor<400> 4
catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag 60catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat 120ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc ccactaagct tc 162
<210> 5
<211> 44
<212> DNA
<213> Vírus mosaico de couve-flor
<400> 5
atctccactg acgtaaggga tgacgcacaa tcccactaag cttc
44
<210> 6
<211> 1991
<212> DNA
<213> seqüência artificial
<220>
<223> seqüência de promotor que compreende ZmUBI PRO-5'UTR-ZMUBIINTRON 1
<400> 6
gcagtgcagc gtgacccggtttataaaaaa ttaccacatatttatacata tatttaaact
tcagtgttttattttgacaattgcaaatagttagggttaacctctaaattaaatagaatactaaggaaacagtctaacgggcacggcatcttgctccgctcaggcggcct
agagaatcatcaggactctacttcacctattggtttttataagaaaactaaaataaagtgatttttcttgacaccaaccatctgtcgctggtcggcatcccctcctcctc
cgtgcccctcttttttttgtttactctacgataaatgaaccagttttatcataatacttcagactaatttaaactctattactaaaaatttttcgagtaggcgaaccagccctctggaccagaaattgcgtcacggcacc
tctagagatacacacttgttaataatataaagttagacattttttagtgtatccattttattttagtacattagttttttaaacaaatacataatgccagagcgtcgcgtcctctcgagatggcggagcgggcagctacg
atgagcattgtgaagtgcagtctatagtacggtctaaagggcatgtgttcttagtacatctctattttattatttaataacctttaagaacctgttaaaccgggccaagcgttccgctccgcagacgtgaggggattcct
catgtctaag 60tttatctatc 120tacaataata 180acaattgagt 240tccttttttt 300catttagggt 360tctattttag 420tttagatata 480attaaaaaaa 540gccgtcgacg 600gaagcagacg 660accgttggac 720gccggcacgg 780ttcccaccgc 840tccttcgctt tcccttcctc gcccgccgta ataaatagac accccctcca caccctcttt 900ccccaacctc gtgttgttcg gagcgcacac acacacaacc agatctcccc caaatccacc 960
cgtcggcacc tccgcttcaa ggtacgccgc tcgtcctccc ccccccccct ctctaccttc 1020tctagatcgg cgttccggtc catggttagg gcccggtagt tctacttctg ttcatgtttg 1080tgttagatcc gtgtttgtgt tagatccgtg ctgctagcgt tcgtacacgg atgcgacctg 1140
tacgtcagac acgttctgat tgctaacttg ccagtgtttc tctttgggga atcctgggat 1200ggctctagcc gttccgcaga cgggatcgat ttcatgattt tttttgtttc gttgcatagg 1260
gtttggtttg cccttttcct ttatttcaat atatgccgtg cacttgtttg tcgggtcatc 1320ttttcatgct tttttttgtc ttggttgtga tgatgtggtc tggttgggcg gtcgttctag 1380
atcggagtag aattctgttt caaactacct ggtggattta ttaattttgg atctgtatgt 1440gtgtgccata catattcata gttacgaatt gaagatgatg gatggaaata tcgatctagg 1500
ataggtatac atgttgatgc gggttttact gatgcatata cagagatgct ttttgttcgc 1560ttggttgtga tgatgtggtg tggttgggcg gtcgttcatt cgttctagat cggagtagaa 1620tactgtttca aactacctgg tgtatttatt aattttggaa ctgtatgtgt gtgtcataca 1680
tcttcatagt tacgagttta agatggatgg aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt 1740
gatgtgggtt ttactgatgc atatacatga tggcatatgc agcatctatt catatgctct 1800aaccttgagt acctatctat tataataaac aagtatgttt tataattatt ttgatcttga 1860
tatacttgga tgatggcata tgcagcagct atatgtggat ttttttagcc ctgccttcat 1920
acgctattta tttgcttggt actgtttctt ttgtcgatgc tcaccctgtt gtttggtgtt 1980
acttctgcag g 1991
<210> 7
<211> 441
<212 > DNA
<213> seqüência artificial
<220>
<223> seqüência GAT otimizada (GAT4 602)
<221> CDS
<222> (1)...(441)
<400> 7
atg ata gag gtg aaa ccg att aac gca gag gat acc tat gaa cta agg 4 8
Met Ile Glu Val Lys Pro Ile Asn Ala Glu Asp Thr Tyr Glu Leu Arg
15 10 15
cat aga ata ctc aga cca aac cag ccg ata gaa gcg tgt atg ttt gaa 96His Arg Ile Leu Arg Pro Asn Gln Pro Ile Glu Ala Cys Met Phe Glu40 20 25 30
age gat tta ctt cgt ggt gca ttt cac tta ggc ggc tat tac ggg ggc 144Ser Asp Leu Leu Arg Gly Ala Phe His Leu Gly Gly Tyr Tyr Gly Gly35 40 45
aaa ctg att tcc ata gct tca ttc cac cag gcc gag cac tca gaa ctc 192Lys Leu Ile Ser Ile Ala Ser Phe His Gln Ala Glu His Ser Glu Leu50 55 60
50 caa ggc cag aaa cag tac cag ctc cga ggt atg gct acc ttg gaa ggt 240Gln Gly Gln Lys Gln Tyr Gln Leu Arg Gly Met Ala Thr Leu Glu Gly65 70 75 80
tat cgt gag cag aag gcg gga tcg agt cta att aaa cac gct gaa gaa 288Tyr Arg Glu Gln Lys Ala Gly Ser Ser Leu Ile Lys His Ala Glu Glu
85 90 95
att ctt cgt aag agg ggg gcg gac ttg ctt tgg tgt aat gcg cgg aca 336Ile Leu Arg Lys Arg Gly Ala Asp Leu Leu Trp Cys Asn Ala Arg Thr60 100 105 110tcc gcc tca ggc tac tac aaa aag tta ggc ttc age gag cag gga gag 3 84Ser Ala Ser Gly Tyr Tyr Lys Lys Leu Gly Phe Ser Glu Gln Gly Glu115 120 125
gta ttc gac acg ccg cca gta gga cct cac ate ctg atg tat aaa agg 432Val Phe Asp Thr Pro Pro Val Gly Pro His Ile Leu Met Tyr Lys Arg130 135 140
ate aca taa 441
Ile Thr *145
<210> 8
<211> 444
<212> DNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> seqüência GAT otimizada -- GAT4621
<221> CDS
<222> (1)...(444)
<400> 8
atg gct att gag gtt aag cct ate aac gea gag gat acc tat gac ctt 48Met Ala Ile Glu Val Lys Pro Ile Asn Ala Glu Asp Thr Tyr Asp Leu1 5 10 15
agg cat aga gtg ctc aga cca aac cag cct ate gaa gcc tgc atg ttt 96Arg His Arg Val Leu Arg Pro Asn Gln Pro Ile Glu Ala Cys Met Phe20 25 30
gag tet gac ctt act agg agt gea ttt cac ctt ggt gga ttc tac gga 144Glu Ser Asp Leu Thr Arg Ser Ala Phe His Leu Gly Gly Phe Tyr Gly35 40 45
ggt aaa ctg att tcc gtg gct tca ttc cac caa gct gag cac tet gaa 192Gly Lys Leu Ile Ser Val Ala Ser Phe His Gln Ala Glu His Ser Glu50 55 60
ctt caa ggt aag aag cag tac cag ctt aga ggt gtg gct acc ttg gaa 24 0Leu Gln Gly Lys Lys Gln Tyr Gln Leu Arg Gly Val Ala Thr Leu Glu65 70 75 80
ggt tat aga gag cag aag gct ggt tcc agt ctc gtg aaa cac gct gaa 288Gly Tyr Arg Glu Gln Lys Ala Gly Ser Ser Leu Val Lys His Ala Glu85 90 95
gag att ctc aga aag aga ggt gct gac atg ate tgg tgt aa.t gcc agg 336Glu Ile Leu Arg Lys Arg Gly Ala Asp Met Ile Trp Cys Asn Ala Arg100 105 110
aca tet gct tca gga tac tac agg aag ttg gga ttc agt gag caa gga 384Thr Ser Ala Ser Gly Tyr Tyr Arg Lys Leu Gly Phe Ser Glu Gln Gly115 120 125
gag gtg ttc gat act cct cca gtt gga cct cac ate ctg atg tat aag 432Glu Val Phe Asp Thr Pro Pro Val Gly Pro His Ile Leu Met Tyr Lys130 135 140agg ate aca taa 444
Arg Ile Thr *145
<210> 9<211> 3359<212> DNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> intensificador 35S operacionalmente ligado ao promotor de íntron1 ZmUbi RO-5UTR-ZmUbi; intensificador 35S na direção reversa
<4 0 0 > 9
atcacatcaa
cctcgtgggt
ctttccttta
aataaagtga
ttgaaaagtc
gacaagcgtg
gagactctgt
aatctttgac
tttgaagacg
tctttgggac
tggcatttgt
gggcaatgga
ctttggtctt
accatgttga
tcgccagtct
gaattatcac
atgctcctcg
atggcctttc
ttcacaataa
ctttgttgaa
gagtagacaa
cgtaagagac
atttgaatct
gtgacccggt
ttaccacata
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caggactcta
cttcacctat
tggtttttat
aagaaaacta
aaataaagtg
atttttcttg
acaccaacca
tctgtcgctg
gtcggcatcc
cctcctcctc
tcccttcctc
gtgttgttcg
tccgcttcaa
cgttccggtc
gtgtttgtgt
acgttctgat
gttccgcaga
cccttttcct
tttttttgtc
tccacttgctgggggtccattcgcaatgatcagatagctgtcaattgccctcgtgctccaatgaactgtttccatggacgtggttggaaccactgtcggcaggagccaccatccgaggagctgagactgtcgaagattttttacggcgagatcaatccactgggtgggggctttatcgcaagtgacagataagtctcaatgcgtgtcgtgtctgtatgaattgactccatcgtgcccctcttttttttgtttactctacgataaatgaaccagttttatcataatacttcagactaatttaaactctattactaaaaatttttcgagtaggcgaaccagccctctggaccagaaattgcgtcacggcaccgcccgccgtagagcgcacacggtacgccgccatggttaggtagatccgtgtgctaacttgcgggatcgatttatttcaatttggttgtga
ttgaagacgtctttgggaccggcatttgtaggcaatggaatttggtcttcccatgttgaccgccagtcttgtatcgataagtcttcttttagaggcatctttccttttccgtttccggatatctttgatacttcttgtcattctgttaggttgctttgaatccatctttgatgatggcatagctgggcaatgccctttggctccaccatgctgttcgccagggaattccttetagagatacacacttgttaataatataaagttagacattttttagtgtatccattttattttagtacattagttttttaaacaaatacataatgccagagcgtcgcgtcctctcgagatggcggagcgggcagctacgataaatagacacacacaacctcgtcctcccgcccggtagtctgctagcgtccagtgtttcttcatgatttatatgccgtgtgatgtggtc
ggttggaacgactgtcggcaggagccaccttccgaggaggtgagactgtagaagattttctacggcgagtgctagcttgatccacgatgctcaacgatggactatcttcaattacccttttttttggagtttgagtcgtatcctctatttgacgtggttgggaccactgtttgtaggagctggaatccgatcttctgagattgacgaagagtctttacgggcagcccagcatgagcattgtgaagtgcagtctatagtacggtctaaagggcatgtgttcttagtacatctctattttattatttaataacctttaagaacctgttaaaccgggccaagcgttccgctccgcagacgtgaggggattcctaccccctccaagatctcccccccccccccttctacttctgtcgtacacggtctttggggatttttgtttccacttgtttgtggttgggcg
tcttctttttgaggcatctttccttttccatttccggatatctttgatatttcttgtcattctgttaggttatcacatcatcctcgtgggcctttcctttcaataaagtggttgaaaagtagacaagcgtagagactctggaatctttgagaacgtcttccggcagaggccaccttccttggaggtttccctgtatctttttttcttcttcgagttctgtttgcatgcctcatgtctaagtttatctatctacaataataacaattgagttcctttttttcatttagggttctattttagtttagatataattaaaaaaagccgtcgacggaagcagacgaccgttggacgccggcacggttcccaccgccaccctctttcaaatccaccctctaccttcttcatgtttgatgcgacctgatcctgggatgttgcataggtcgggtcatcgtcgttctag
ccacgatgctcaacgatggcctatcttcacttaccctttgttttggagtatgagtcgtaacctctatttgatccacttgctgggggtccaatcgcaatgaacagatagctctcaattgccgtcgtgctcctatgaactgtctccatgatctttttccacgatcttcaacgttccactatcggatattaccgatatttttggtcattgagttaggtcctctgcagtgcagcttataaaaaatttatacatatcagtgttttattttgacaattgcaaatagttagggttaacctctaaattaaatagaatactaaggaaacagtctaacgggcacggcatcttgctccgctcaggcggccttccttcgcttccccaacctccgtcggcacctetagateggtgttagatcctacgtcagacggctctagccgtttggtttgttttcatgctatcggagtag
60
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
1860
1920
1980
2040
2100
2160
2220
2280
2340
2400
2460
2520
2580
2640
2700
2760aattctgttt caaactacct ggtggattta ttaattttgg atctgtatgt gtgtgccata 2820
catattcata gttacgaatt gaagatgatg gatggaaata tcgatctagg ataggtatac 2880atgttgatgc gggttttact gatgcatata cagagatgct ttttgttcgc ttggttgtga 2 94 0tgatgtggtg tggttgggcg gtcgttcatt cgttctagat cggagtagaa tactgtttca 3 000
aactacctgg tgtatttatt aattttggaa ctgtatgtgt gtgtcataca tcttcatagt 3060
tacgagttta agatggatgg aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt gatgtgggtt 3120
ttactgatgc atatacatga tggcatatgc agcatctatt catatgctct aaccttgagt 3180acctatctat tataataaac aagtatgttt tataattatt ttgatcttga tatacttgga 3240tgatggcata tgcagcagct atatgtggat ttttttagcc ctgccttcat acgctattta 3300
tttgcttggt actgtttctt ttgtcgatgc tcaccctgtt gtttggtgtt acttctgca 3359
<210> 10
<211> 1343
<212> DNA
<213> Vírus mosaico de couve-flor<220>
<221> intensificador
<222> (0) . . . (0)
<223> intensificador 35S 3X na direção reversa
<400> 10
atcacatcaa tccacttgct ttgaagacgt ggttggaacg tcttcttttt ccacgatgct 60cctcgtgggt gggggtccat ctttgggacc actgtcggca gaggcatctt caacgatggc 120ctttccttta tcgcaatgat ggcatttgta ggagccacct tccttttcca ctatcttcac 180aataaagtga cagatagctg ggcaatggaa tccgaggagg tttccggata ttaccctttg 24 0ttgaaaagtc tcaattgccc tttggtcttc tgagactgta tctttgatat ttttggagta 300gacaagcgtg tcgtgctcca ccatgttgac gaagattttc ttcttgtcat tgagtcgtaa 360gagactctgt atgaactgtt cgccagtctt tacggcgagt tctgttaggt cctctatttg 420aatctttgac tccatggacg gtatcgataa gctagcttga tatcacatca atccacttgc 480tttgaagacg tggttggaac gtcttctttt tccacgatgc tcctcgtggg tgggggtcca 540tctttgggac cactgtcggc agaggcatct tcaacgatgg cctttccttt atcgcaatga 600tggcatttgt aggagccacc ttccttttcc actatcttca caataaagtg acagatagct 660gggcaatgga atccgaggag gtttccggat attacccttt gttgaaaagt ctcaattgcc 720
ctttggtctt ctgagactgt atctttgata tttttggagt agacaagcgt gtcgtgctcc 780
accatgttga cgaagatttt cttcttgtca ttgagtcgta agagactctg tatgaactgt 840tcgccagtct ttacggcgag ttctgttagg tcctctattt gaatctttga ctccatgatc 900gaattatcac atcaatccac ttgctttgaa gacgtggttg gaacgtcttc tttttccacg 960atgctcctcg tgggtggggg tccatctttg ggaccactgt cggcagaggc atcttcaacg 1020
atggcctttc ctttatcgca atgatggcat ttgtaggagc caccttcctt ttccactatc 1080
ttcacaataa agtgacagat agctgggcaa tggaatccga ggaggtttcc ggatattacc 114 0ctttgttgaa aagtctcaat tgccctttgg tcttctgaga ctgtatcttt gatatttttg 1200gagtagacaa gcgtgtcgtg ctccaccatg ttgacgaaga ttttcttctt gtcattgagt 1260cgtaagagac tctgtatgaa ctgttcgcca gtctttacgg cgagttctgt taggtcctct 1320atttgaatct ttgactccat ggg 1343
<210> 11
<211> 2479
<212> DNA
<213> seqüência artificial
<220>
<223> intensificador 35S( + ): íntron 1 ZmUbi RO-SUTR-ZmUbi;intensificador 3 5S na direção reversa
<400> 11
cccatggagt caaagattca aatagaggac ctaacagaac tcgccgtaaa gactggcgaa 60cagttcatac agagtctctt acgactcaat gacaagaaga aaatcttcgt caacatggtg 120gagcacgaca cgcttgtcta ctccaaaaat atcaaagata cagtctcaga agaccaaagg 180gcaattgaga cttttcaaca aagggtaata tccggaaacc tcctcggatt ccattgccca 240gctatctgtc actttattgt gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta caaatgccat 3 00cattgcgata aaggaaaggc catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat 360ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag 420caagtggatt gatgtgatat caagcttatc gataccgtcg acctcgaggg ggggcccagc 480ttgcatgcct gcagtgcagc gtgacccggt cgtgcccctc tctagagata atgagcattg 54 0catgtctaag ttataaaaaa ttaccacata ttttttttgt cacacttgtt tgaagtgcag 600tttatctatc tttatacata tatttaaact ttactctacg aataatataa tctatagtac 660tacaataata tcagtgtttt agagaatcat ataaatgaac agttagacat ggtctaaagg 720acaattgagt attttgacaa caggactcta cagttttatc tttttagtgt gcatgtgttc 780tccttttttt ttgcaaatag cttcacctat ataatacttc atccatttta ttagtacatc 840catttagggt ttagggttaa tggtttttat agactaattt ttttagtaca tctattttat 900tctattttag cctctaaatt aagaaaacta aaactctatt ttagtttttt tatttaataa 960tttagatata aaatagaata aaataaagtg actaaaaatt aaacaaatac cctttaagaa 1020attaaaaaaa ctaaggaaac atttttcttg tttcgagtag ataatgccag cctgttaaac 1080gccgtcgacg agtctaacgg acaccaacca gcgaaccagc agcgtcgcgt cgggccaagc 1140gaagcagacg gcacggcatc tctgtcgctg cctctggacc cctctcgaga gttccgctcc 1200accgttggac ttgctccgct gtcggcatcc agaaattgcg tggcggagcg gcagacgtga 1260gccggcacgg caggcggcct cctcctcctc tcacggcacc ggcagctacg ggggattcct 1320ttcccaccgc tccttcgctt tcccttcctc gcccgccgta ataaatagac accccctcca 1380caccctcttt ccccaacctc gtgttgttcg gagcgcacac acacacaacc agatctcccc 144 0caaatccacc cgtcggcacc tccgcttcaa ggtacgccgc tcgtcctccc ccccccccct 1500ctctaccttc tctagatcgg cgttccggtc catggttagg gcccggtagt tctacttctg 1560ttcatgtttg tgttagatcc gtgtttgtgt tagatccgtg ctgctagcgt tcgtacacgg 1620atgcgacctg tacgtcagac acgttctgat tgctaacttg ccagtgtttc tctttgggga 1680atcctgggat ggctctagcc gttccgcaga cgggatcgat ttcatgattt tttttgtttc 1740gttgcatagg gtttggtttg cccttttcct ttatttcaat atatgccgtg cacttgtttg 1800tcgggtcatc ttttcatgct tttttttgtc ttggttgtga tgatgtggtc tggttgggcg 1860gtcgttctag atcggagtag aattctgttt caaactacct ggtggattta ttaattttgg 1920atctgtatgt gtgtgccata catattcata gttacgaatt gaagatgatg gatggaaata 1980tcgatctagg ataggtatac atgttgatgc gggttttact gatgcatata cagagatgct 2 04 0ttttgttcgc ttggttgtga tgatgtggtg tggttgggcg gtcgttcatt cgttctagat 2100cggagtagaa tactgtttca aactacctgg tgtatttatt aattttggaa ctgtatgtgt 2160gtgtcataca tcttcatagt tacgagttta agatggatgg aaatatcgat ctaggatagg 2220tatacatgtt gatgtgggtt ttactgatgc atatacatga tggcatatgc agcatctatt 2280catatgctct aaccttgagt acctatctat tataataaac aagtatgttt tataattatt 2340ttgatcttga tatacttgga tgatggcata tgcagcagct atatgtggat ttttttagcc 2400ctgccttcat acgctattta tttgcttggt actgtttctt ttgtcgatgc tcaccctgtt 2460gtttggtgtt acttctgca 2479
<210> 12<211> 3331<212> DNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> intensificador 35S( + ): íntron 1 ZmUbi RO-5UTR-ZmUbi;intensificador 3 5S na direção reversa
<400> 12
cccatggagt caaagattca aatagaggac ctaacagaac tcgccgtaaa gactggcgaa 60
cagttcatac agagtctctt acgactcaat gacaagaaga aaatcttcgt caacatggtg 120
gagcacgaca cgcttgtcta ctccaaaaat atcaaagata cagtctcaga agaccaaagg 180
gcaattgaga cttttcaaca aagggtaata tccggaaacc tcctcggatt ccattgccca 240
gctatctgtc actttattgt gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta caaatgccat 3 00
cattgcgata aaggaaaggc catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat 360
ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag 420
caagtggatt gatgtgataa ttcgatcatg gagtcaaaga ttcaaataga ggacctaaca 480
gaactcgccg taaagactgg cgaacagttc atacagagtc tcttacgact caatgacaag 54 0
aagaaaatct tcgtcaacat ggtggagcac gacacgcttg tctactccaa aaatatcaaa 600
gatacagtct cagaagacca aagggcaatt gagacttttc aacaaagggt aatatccgga 660
aacctcctcg gattccattg cccagctatc tgtcacttta ttgtgaagat agtggaaaag 720
gaaggtggct cctacaaatg ccatcattgc gataaaggaa aggccatcgt tgaagatgcc 780tctgccgacagacgttccaagccatggagtcagttcatacgagcacgacagcaattgagagctatctgtccattgcgataggacccccaccaagtggatttaatgagcattttgaagtgcaatctatagtatggtctaaagtgcatgtgttattagtacacatctatttttttatttaataccctttaagagcctgttaagtcgggccaagagttccgctcggcagacgtcgggggattcacaccccctcccagatctccccccccccccgttctacttcgttcgtacactctctttgggtttttttgtttgcacttgtttctggttgggtattaatttttggatggaaatacagagatgttcgttctagaactgtatgtatctaggatagcagcatctatttataattaatttttttaggctcaccctg
gtggtcccaaccacgtcttccaaagattcaagagtctcttcgcttgtctacttttcaacaactttattgtaaggaaaggcccacgaggaggatgtgatgttgcatgtctaagtttatctaactacaataaggacaattgatctccttttttccatttaggattctattttaatttagataaaattaaaaaacgccgtcgagcgaagcagaccaccgttgggagccggcacctttcccacccacaccctctcccaaatccactctctaccttgttcatgttggatgcgaccgaatcctgggtcgttgcatatgtcgggtcacggtcgttctggatctgtattatcgatctactttttgttcatcggagtaggtgtgtcataggtatacatgttcatatgctttttgatcttccctgccttcttgtttggtg
agatggacccaaagcaagtgaatagaggacacgactcaatctccaaaaataagggtaatagaagatagtgcatcgttgaacatcgtggaactgcagtgcaagttataaaatctttatacatatcagtgttgtattttgacttttgcaaatgtttagggttagcctctaaataaaatagaaaactaaggaacgagtctaaccggcacggcaacttgctccgggcaggcggcgctccttcgcttccccaacccccgtcggcatctctagatctgtgttagattgtacgtcagatggctctaggggtttggtttcttttcatgagatcggagtgtgtgtgccaggataggtatgcttggttgtaatactgtttcatcttcatattgatgtgggctaaccttgagatatacttgatacgctattttacttctgc
ccacccacgagattgatgtgctaacagaacgacaagaagaatcaaagatatccggaaaccgaaaaggaaggatgcctctgaaagaagacggcgtgacccgaattaccacatatatttaaattagagaatcaacaggactcagcttcacctaatggtttttttaagaaaactaaaataaagacatttttctggacaccaactctctgtcgcctgtcggcatctcctcctcctttcccttcctcgtgttgttcctccgcttcggcgttccggccgtgtttgtacacgttctgccgttccgcatgcccttttccttttttttgagaattctgttacatattcaacatgttgatgatgatgtggcaaactacctgttacgagttttttactgatgtacctatctgatgatggcatatttgcttg
ggagcatcgtatatcaagcttcgccgtaaaaaatcttcgtcagtctcagatcctcggattgtggctcctaccgacagtggttccaaccacgtcgtgcccctattttttttctttactctaatataaatgatacagttttaatataatactatagactaattaaaactctatgactaaaaatgtttcgagtcagcgaaccatgcctctggaccagaaattgtctcacggcatcgcccgccgcggagcgcacaaggtacgcctccatggttagttagatccgattgctaactgacgggatcgctttatttcatcttggttgtttcaaactactagttacgaagcgggttttatgtggttgggggtgtatttataagatggatgcatatacatattataataatatgcagcaggtactgtttc
ggaaaaagaatatcgataccgactggcgaacaacatggtgagaccaaaggccattgcccacaaatgccattcccaaagatgtcttcaaagtctctagagagtcacacttgcgaataatatacagttagactctttttagttcatccatttttttttagtattttagttttttaaacaaatagataatgccgcagcgtcgccccctctcgacgtggcggagccggcagctataataaatagacacacacaagctcgtcctcgggcccggtatgctgctagctgccagtgttatttcatgatatatatgccggatgatgtggctggtggattttgaagatgactgatgcatacggtcgttcattaattttggggaaatatcggatggcatatacaagtatgtctatatgtggttttgtcgat
840
900
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1860
1920
1980
2040
2100
2160
2220
2280
2340
2400
2460
2520
2580
2640
2700
2760
2820
2880
2940
3000
3060
3120
3180
3240
3300
3331
<210> 13
<211> 2454
<212> DNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> intensificador 35S(-): íntron 1 ZmUbi RO-5UTR-ZmUbi;intensificador 35S na direção reversa
<400> 13
atcacatcaa
cctcgtgggt
ctttccttta
aataaagtga
ttgaaaagtc
gacaagcgtg
gagactctgt
tccacttgctgggggtccattcgcaatgatcagatagctgtcaattgccctcgtgctccaatgaactgtt
ttgaagacgtctttgggaccggcatttgtaggcaatggaatttggtcttcccatgttgaccgccagtctt
ggttggaacgactgtcggcaggagccaccttccgaggaggtgagactgtagaagattttctacggcgagt
tcttctttttgaggcatctttccttttccatttccggatatctttgatatttcttgtcattctgttaggt
ccacgatgct 60caacgatggc 120ctatcttcac 180ttaccctttg 240ttttggagta 300tgagtcgtaa 360cctctatttg 420aatctttgacccggtcgtgcacatatttttaaactttactatcatataaactctacagttcctatataattttatagactaactaaaactaagtgactaatcttgtttcgaaccagcgaacgctgcctctcatccagaaatcctctcacgtcctcgcccggttcggagcgttcaaggtaccggtccatggtgtgttagatctgattgctagcagacgggattcctttattttgtcttggttgtttcaaactcatagttacgatgcgggtttggtgtggttcctggtgtatgtttaagatggatgcatatatctattataagcatatgcagttggtactgt
tccatgggaaccctctctagtttgtcacacctacgaataatgaacagttattatctttttacttcatccaaatttttttactattttagtaaattaaacaagtagataatccagcagcgtggacccctctttgcgtggcggcaccggcagccgtaataaacacacacacagccgctcgtcttagggcccgccgtgctgctacttgccagttcgatttcattcaatatatgtgtgatgatgtacctggtgggaattgaagattactgatgcgggcggtcgtttattaatttgatggaaatacatgatggcataaacaagtacagctatatgttcttttgtc
ttcctgcagcagataatgagttgtttgaagtataatctatgacatggtctagtgtgcatgttttattagtgtacatctatttttttatttaataccctttgccagcctgtcgcgtcgggccgagagttccgagcggcagactacgggggatagacacccccaaccagatcctccccccccgtagttctacagcgttcgtagtttctctttgattttttttccgtgcactttggtctggttatttattaattgatggatggatatacagagtcattcgttctggaactgtatcgatctaggtatgcagcattgttttataatggattttttgatgctcacc
ccagcttgcacattgcatgttgcagtttatagtactacaaaaaggacaattgttctccttacatccattttttattctataataatttagaagaaattaataaacgccgtcaagcgaagcgctccaccgtcgtgagccggttcctttcccctccacaccctcccccaaatcccctctctattctgttcatcacggatgcgggggaatcctgtttcgttgcgtttgtcggggggcggtcgttttggatctgaaatatcgatatgctttttgtagatcggagtgtgtgtgtcataggtatacctattcatatttattttgattagccctgccctgttgtttg
tgcctgcagtctaagttatactatctttattaatatcagttgagtatttttttttttgcaagggtttaggtttagcctctatataaaataaaaaactaagcgacgagtctagacggcacgtggacttgctcacggcaggcaccgctcctttctttccccaccacccgtcgccttctctaggtttgtgttaacctgtacgtgggatggctcatagggtttgtcatcttttctctagatcggtatgtgtgtgctaggataggttcgcttggttagaatactgatacatcttcatgttgatgtgctctaacctcttgatatacttcatacgctgtgttacttc
gcagcgtgacaaaaattaccacatatatttgttttagagagacaacaggaaatagcttcagttaatggttaaattaagaagaataaaatagaaacattttaacggacaccgcatctctgtccgctgtcggggcctcctcccgctttccctacctcgtgttgcacctccgcatcggcgttcgatccgtgttcagacacgtttagccgttccgtttgcccttatgcttttttagtagaattcccatacatattatacatgtttgtgatgatgtttcaaactaatagttacgagggttttacttgagtacctattggatgatgatttatttgctgca
4805406006607207808409009601020108011401200126013201380144015001560162016801740180018601920198020402100216022202280234024002454
<210> 14<211> 3359<212> DNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> intensificador 35S(-) : íntron 1 ZmUbi RO-5UTR-ZmUbi;intensificador 35S na direção reversa
<400> 14
atcacatcaa
cctcgtgggt
ctttccttta
aataaagtga
ttgaaaagtc
gacaagcgtg
gagactctgt
aatctttgac
tttgaagacg
tctttgggac
tggcatttgt
gggcaatgga
ctttggtctt
accatgttga
tcgccagtct
gaattatcac
tccacttgctgggggtccattcgcaatgatcagatagctgtcaattgccctcgtgctccaatgaactgtttccatggacgtggttggaaccactgtcggcaggagccaccatccgaggagctgagactgtcgaagattttttacggcgagatcaatccac
ttgaagacgtctttgggaccggcatttgtaggcaatggaatttggtcttcccatgttgaccgccagtcttgtatcgataagtcttcttttagaggcatctttccttttccgtttccggatatctttgatacttcttgtcattctgttaggttgctttgaa
ggttggaacgactgtcggcaggagccaccttccgaggaggtgagactgtagaagattttctacggcgagtgctagcttgatccacgatgctcaacgatggactatcttcaattacccttttttttggagtttgagtcgtatcctctatttgacgtggttg
tcttctttttgaggcatctttccttttccatttccggatatctttgatatttcttgtcattctgttaggttatcacatcatcctcgtgggcctttcctttcaataaagtggttgaaaagtagacaagcgtagagactctggaatctttgagaacgtcttc
ccacgatgct 60caacgatggc 120ctatcttcac 180ttaccctttg 240ttttggagta 300tgagtcgtaa 360cctctatttg 420atccacttgc 480tgggggtcca 540atcgcaatga 600acagatagct 660ctcaattgcc 720gtcgtgctcc 780tatgaactgt 840ctccatgatc 900tttttccacg 960atgctcctcg tgggtggggg tccatctttg ggaccactgt cggcagaggc atcttcaacg 102 0atggcctttc ctttatcgca atgatggcat ttgtaggagc caccttcctt ttccactatc 1080ttcacaataa agtgacagat agctgggcaa tggaatccga ggaggtttcc ggatattacc 1140ctttgttgaa aagtctcaat tgccctttgg tcttctgaga ctgtatcttt gatatttttg 1200gagtagacaa gcgtgtcgtg ctccaccatg ttgacgaaga ttttcttctt gtcattgagt 1260cgtaagagac tctgtatgaa ctgttcgcca gtctttacgg cgagttctgt taggtcctct 1320atttgaatct ttgactccat gggaattcct gcagcccagc ttgcatgcct gcagtgcagc 1380gtgacccggt cgtgcccctc tctagagata atgagcattg catgtctaag ttataaaaaa 1440ttaccacata ttttttttgt cacacttgtt tgaagtgcag tttatctatc tttatacata 1500tatttaaact ttactctacg aataatataa tctatagtac tacaataata tcagtgtttt 1560agagaatcat ataaatgaac agttagacat ggtctaaagg acaattgagt attttgacaa 1620caggactcta cagttttatc tttttagtgt gcatgtgttc tccttttttt ttgcaaatag 1680cttcacctat ataatacttc atccatttta ttagtacatc catttagggt ttagggttaa 1740tggtttttat agactaattt ttttagtaca tctattttat tctattttag cctctaaatt 1800aagaaaacta aaactctatt ttagtttttt tatttaataa tttagatata aaatagaata 1860aaataaagtg actaaaaatt aaacaaatac cctttaagaa attaaaaaaa ctaaggaaac 1920atttttcttg tttcgagtag ataatgccag cctgttaaac gccgtcgacg agtctaacgg 1980acaccaacca gcgaaccagc agcgtcgcgt cgggccaagc gaagcagacg gcacggcatc 2040tctgtcgctg cctctggacc cctctcgaga gttccgctcc accgttggac ttgctccgct 2100gtcggcatcc agaaattgcg tggcggagcg gcagacgtga gccggcacgg caggcggcct 2160
cctcctcctc tcacggcacc ggcagctacg ggggattcct ttcccaccgc tccttcgctt 2220tcccttcctc gcccgccgta ataaatagac accccctcca caccctcttt ccccaacctc 2280gtgttgttcg gagcgcacac acacacaacc agatctcccc caaatccacc cgtcggcacc 2340tccgcttcaa ggtacgccgc tcgtcctccc ccccccccct ctctaccttc tctagatcgg 2400cgttccggtc catggttagg gcccggtagt tctacttctg ttcatgtttg tgttagatcc 2460gtgtttgtgt tagatccgtg ctgctagcgt tcgtacacgg atgcgacctg tacgtcagac 2520acgttctgat tgctaacttg ccagtgtttc tctttgggga atcctgggat ggctctagcc 2580gttccgcaga cgggatcgat ttcatgattt tttttgtttc gttgcatagg gtttggtttg 2640cccttttcct ttatttcaat atatgccgtg cacttgtttg tcgggtcatc ttttcatgct 2700
tttttttgtc ttggttgtga tgatgtggtc tggttgggcg gtcgttctag atcggagtag 2760
aattctgttt caaactacct ggtggattta ttaattttgg atctgtatgt gtgtgccata 2820catattcata gttacgaatt gaagatgatg gatggaaata tcgatctagg ataggtatac 2880atgttgatgc gggttttact gatgcatata cagagatgct ttttgttcgc ttggttgtga 2940tgatgtggtg tggttgggcg gtcgttcatt cgttctagat cggagtagaa tactgtttca 3000
aactacctgg tgtatttatt aattttggaa ctgtatgtgt gtgtcataca tcttcatagt 3060
tacgagttta agatggatgg aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt gatgtgggtt 312 0ttactgatgc atatacatga tggcatatgc agcatctatt catatgctct aaccttgagt 3180acctatctat tataataaac aagtatgttt tataattatt ttgatcttga tatacttgga 3240tgatggcata tgcagcagct atatgtggat ttttttagcc ctgccttcat acgctattta 3300
tttgcttggt actgtttctt ttgtcgatgc tcaccctgtt gtttggtgtt acttctgca 3359
<210> 15<211> 1340<212> DNA<213> seqüência artificial
<220>
<223> intensifiçador 35S 3X na direção adiante<400> 15
cccatggagt caaagattca aatagaggac ctaacagaac tcgccgtaaa gactggcgaa 60
cagttcatac agagtctctt acgactcaat gacaagaaga aaatcttcgt caacatggtg 12 0
gagcacgaca cgcttgtcta ctccaaaaat atcaaagata cagtctcaga agaccaaagg 180
gcaattgaga cttttcaaca aagggtaata tccggaaacc tcctcggatt ccattgccca 240
gctatctgtc actttattgt gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta caaatgccat 300
cattgcgata aaggaaaggc catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat 360
ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag 420
caagtggatt gatgtgataa ttcgatcatg gagtcaaaga ttcaaataga ggacctaaca 480
gaactcgccg taaagactgg cgaacagttc atacagagtc tcttacgact caatgacaag 54 0
aagaaaatct tcgtcaacat ggtggagcac gacacgcttg tctactccaa aaatatcaaa 600
gatacagtct cagaagacca aagggcaatt gagacttttc aacaaagggt aatatccgga 660aacctcctcggaaggtggcttctgccgacagacgttccaagccatggagtcagttcatacgagcacgacagcaattgagagctatctgtccattgcgataggacccccaccaagtggatt
gattccattgcctacaaatggtggtcccaaccacgtcttccaaagattcaagagtctcttcgcttgtctacttttcaacaactttattgtaaggaaaggcccacgaggaggatgtgatgt
cccagctatcccatcattgcagatggacccaaagcaagtgaatagaggacacgactcaatctccaaaaataagggtaatagaagatagtgcatcgttgaacatcgtggaa
tgtcactttagataaaggaaccacccacgagattgatgtgctaacagaacgacaagaagaatcaaagatatccggaaaccgaaaaggaaggatgcctctgaaagaagacg
ttgtgaagataggccatcgtggagcatcgtatatcaagcttcgccgtaaaaaatcttcgtcagtctcagatcctcggattgtggctcctaccgacagtggttccaaccac
agtggaaaagtgaagatgccggaaaaagaatatcgataccgactggcgaacaacatggtgagaccaaaggccattgcccacaaatgccattcccaaagatgtcttcaaag
7207808409009601020108011401200126013201340
<210> 16<211> 438<212> DNA
<213> Vírus mosaico de couve-flor<220>
<221> misc_feature<222> (0) . . . (0)
<223> intensificador 35S IX na direção reversa
<400> 16
atcacatcaa
cctcgtgggt
ctttccttta
aataaagtga
ttgaaaagtc
gacaagcgtg
gagactctgt
aatctttgac
tccacttgctgggggtccattcgcaatgatcagatagctgtcaattgccctcgtgctccaatgaactgtttccatggg
ttgaagacgtctttgggaccggcatttgtaggcaatggaatttggtcttcccatgttgaccgccagtctt
ggttggaacgactgtcggcaggagccaccttccgaggaggtgagactgtagaagattttctacggcgagt
tcttctttttgaggcatctttccttttccatttccggatatctttgatatttcttgtcattctgttaggt
ccacgatgct 60caacgatggc 12 0ctatcttcac 180ttaccctttg 240ttttggagta 300tgagtcgtaa 3 60cctctatttg 420438
<210> 17
<211> 1344
<212> DNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> intensificador 35S 3X na direção adiante
<400> 17
cccatggagt
cagttcatac
gagcacgaca
gcaattgaga
gctatctgtc
cattgcgata
ggacccccac
caagtggatt
gaactcgccg
aagaaaatct
gatacagtct
aacctcctcg
gaaggtggct
tctgccgaca
gacgttccaa
taccgtccat
gcgaacagtt
tggtggagca
aaagggcaat
caaagattcaagagtctcttcgcttgtctacttttcaacaactttattgtaaggaaaggcccacgaggaggatgtgataataaagactggtcgtcaacatcagaagaccagattccattgcctacaaatggtggtcccaaccacgtcttcggagtcaaagcatacagagtcgacacgctttgagactttt
aatagaggacacgactcaatctccaaaaataagggtaatagaagatagtgcatcgttgaacatcgtggaattcgatcatgcgaacagttcggtggagcacaagggcaattcccagctatcccatcattgcagatggacccaaagcaagtgattcaaatagctcttacgacgtctactccacaacaaaggg
ctaacagaacgacaagaagaatcaaagatatccggaaaccgaaaaggaaggatgcctctgaaagaagacggagtcaaagaatacagagtcgacacgcttggagacttttctgtcactttagataaaggaaccacccacgagattgatgtgaggacctaactcaatgacaaaaaatatcaataatatccgg
tcgccgtaaaaaatcttcgtcagtctcagatcctcggattgtggctcctaccgacagtggttccaaccacttcaaatagatcttacgacttctactccaaaacaaagggtttgtgaagataggccatcgtggagcatcgtatatcaagctagaactcgccgaagaaaatcagatacagtcaaacctcctc
gactggcgaacaacatggtgagaccaaaggccattgcccacaaatgccattcccaaagatgtcttcaaagggacctaacacaatgacaagaaatatcaaaaatatccggaagtggaaaagtgaagatgccggaaaaagaaagcttatcgagtaaagactgttcgtcaacatcagaagaccggattccatt
120180240300360420480540600660720780840900960102010801140gcccagctat ctgtcacttt attgtgaaga tagtggaaaa ggaaggtggc tcctacaaat 1200gccatcattg cgataaagga aaggccatcg ttgaagatgc ctctgccgac agtggtccca 1260aagatggacc cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt 1320caaagcaagt ggattgatgt gatg 1344
<210> 18<211> 1344<212> DNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> intensificador 35S 3X na direção reversa
<400> 18
catcacatca
tcctcgtggg
cctttccttt
caataaagtg
gttgaaaagt
agacaagcgt
agagactctg
gaatctttga
ctttgaagac
atctttggga
atggcatttg
tgggcaatgg
cctttggtct
caccatgttg
ttcgccagtc
cgaattatca
gatgctcctc
gatggccttt
cttcacaata
cctttgttga
ggagtagaca
tcgtaagaga
tatttgaatc
atccacttgctgggggtccaatcgcaatgaacagatagctctcaattgccgtcgtgctcctatgaactgtctccatggacgtggttggaaccactgtcggtaggagccacaatccgaggatctgagactgacgaagattttttacggcgacatcaatccagtgggtggggcctttatcgcaagtgacagaaaagtctcaaagcgtgtcgtctctgtatgatttgactcca
tttgaagacgtctttgggactggcatttgtgggcaatggactttggtcttaccatgttgatcgccagtctggtatcgatacgtcttctttcagaggcatccttccttttcggtttccggatatctttgattcttcttgtcgttctgttagcttgctttgagtccatctttaatgatggcatagctgggcattgccctttggctccaccatactgttcgcctggg
tggttggaaccactgtcggcaggagccaccatccgaggagctgagactgtcgaagattttttacggcgagagctagcttgttccacgatgttcaacgatgcactatcttctattacccttatttttggagattgagtcgtgtcctctattagacgtggttgggaccactgtttgtaggagatggaatccggtcttctgaggttgacgaagagtctttacg
gtcttctttt tccacgatgcagaggcatct tcaacgatggttccttttcc actatcttca
gtttccggatatctttgatacttcttgtcattctgttaggatatcacatcctcctcgtgggcctttccttacaataaagttgttgaaaagtagacaagcgaagagactcttgaatctttgggaacgtctttcggcagaggccaccttcct
attacccttttttttggagtttgagtcgtatcctctatttaatccacttggtgggggtcctatcgcaatggacagatagctctcaattgctgtcgtgctcgtatgaactgactccatgatctttttccaccatcttcaactttccactat
aggaggtttc cggatattacactgtatctt tgatatttttattttcttct tgtcattgaggcgagttctg ttaggtcctc
601201802403003604204805406006607207808409009601020108011401200126013201344

Claims (47)

1. Método para a expressão de um polinucleotídeo deinteresse caracterizado pelo fato de que compreende aintrodução em uma célula de pelo menos uma construção deDNA que compreende uma região reguladora de transcriçãoquimérica que compreende pelo menos um domíniointensificador operacionalmente ligado a um promotorheterólogo, a referida região reguladora de transcriçãoquimérica operacionalmente ligada ao polinucleotídeo deinteresse, em que o referido domínio intensificador éselecionado do grupo que consiste em:(a) a seqüência de nucleotídeos que compreende Id. deSeq. N°: 1, 17;(b) a seqüência de nucleotídeos que compreende pelomenos 95% de identidade de seqüência a Id. de Seq. Nc: 1 ou 17, em que o referido polinucleotídeo tem atividadereguladora de transcrição; e,(c) a seqüência de nucleotídeos que compreende pelomenos 100 nucleotídeos consecutivos de Id. de Seq. N°: 1 ou 17.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o referido domíniointensificador não compreende a seqüência apresentada emId. de Seq. N0:5.
3. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que areferida região reguladora de transcrição quiméricacompreende pelo menos duas cópias ou pelo menos três cópiasdo referido intensificador.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3,caracterizado pelo fato de quea) as referidas cópias do referido intensificadorsão imediatamente adjacentes uma a outra; ou,b) pelo menos um dos referidos intensificadores estáorientado na orientação adiante ou reversa com relação aoreferido promotor.
5. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, ou 4, caracterizado pelo fato deque o referido polinucleotideo de interesse codifica umpolipeptideo.
6. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, ou 5, caracterizado pelo fato deque o referido polinucleotideo de interesse compreende ummarcador selecionável.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato de que o referido marcadorselecionável compreende um polinucleotideo que conferetolerância a um herbicida.
8. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, caracterizado pelofato de que a referida célula é uma célula de planta.
9. Método, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato de que o referido método tambémcompreende o cultivo da referida célula em um meio quecompreende uma concentração eficaz do herbicida.
10. Método, de acordo com a reivindicação 8,caracterizado pelo fato de que a referida célula de plantaé de uma dicotiledônea.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10,caracterizado pelo fato de que a referida dicotiledônea ésoja, trigo, canola, girassol, algodão ou alfafa.
12. Método, de acordo com a reivindicação 8,caracterizado pelo fato de que a referida célula de plantaé de uma monocotiledônea.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que a referida monocotiledônea émilho, trigo, arroz, cevada, sorgo ou centeio.
14. Método para selecionar uma célula que tem umpolinucleotídeo de interesse caracterizado pelo fato de quecompreendea) o fornecimento de uma população de células;b) a introdução em pelo menos uma célula da referidapopulação de uma construção de DNA que compreende opolinucleotídeo de interesse e também que compreende umaregião reguladora de transcrição quimérica que compreendepelo menos um domínio intensificador operacionalmenteligado a um primeiro promotor heterólogo, a referida regiãoreguladora de transcrição quimérica operacionalmente ligadaa um marcador selecionável, em que o referido domíniointensificador é selecionado do grupo que consiste em:i) a seqüência de nucleotídeos que compreendeId. de Seq. N0:1 ou 17;ii) a seqüência de nucleotídeos que compreendepelo menos 95% de identidade de seqüência a Id. de Seq. N°:-1 ou 17, em que o referido polinucleotídeo tem atividadetranscricional reguladora; e,iii) a seqüência de nucleotídeos que compreendepelo menos 100 nucleotídeos consecutivos de Id. de Seq. N°: 1 ou 17;c) o contato da referida população de células comuma concentração eficaz de um agente de seleção adequado;e,d) seleção da planta que expressa o referidomarcador selecionável, e dessa forma identificação dasplantas que têm o polinucleotídeo de interesse.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato de que o referido domíniointensificador não compreende a seqüência apresentada emId. de Seq. N°:5.
16. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que areferida região reguladora de transcrição quiméricacompreende pelo menos duas cópias ou pelo menos três cópiasdo referido intensificador.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato de quea) as cópias do referido intensificador sãoimediatamente adjacentes uma a outra; ou,b) pelo menos um dos referidos intensificadores estáorientado na orientação adiante ou reversa com relação aoreferido promotor.
18. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 14, 15, 16 ou 17, caracterizado pelo fato deque o referido marcador selecionável codifica umpolipeptídeo que confere tolerância a um herbicida.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18,caracterizado pelo fato de que o referido agente seletivocompreende um herbicida.
20. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 14, 15, 16, 17, 18 ou 19, caracterizado pelofato de que a referida célula compreende uma célula deplanta.
21. Método, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que a referida célula de plantaé de uma dicotiledônea.
22. Método, de acordo com a reivindicação 21,caracterizado pelo fato de que a referida dicotiledônea ésoja, trigo, canola, girassol, algodão ou alfafa.
23. Método, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que a referida célula de plantaé de uma monocotiledônea.
24. Método, de acordo com a reivindicação 23,caracterizado pelo fato de que a referida monocotiledônea émilho, trigo, arroz, cevada, sorgo ou centeio.
25. Método, de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato de que a referida construção de DNAcompreende na orientação 5' a 3' ou 3' a 5': o primeiropolinucleotídeo de interesse operacionalmente ligado a umsegundo promotor heterólogo, operacionalmente ligado a pelomenos um dos referidos domínios intensificadores,operacionalmente ligado ao primeiro promotor heterólogo,operacionalmente ligado ao marcador selecionável, em que oreferido primeiro polinucleotídeo de interesse e o referidomarcador selecionável são expressos em direçõesdivergentes.
26. Polinucleotídeo caracterizado por compreender umelemento regulador de transcrição quimérico que compreendeum promotor que dirige a expressão em uma célulaoperacionalmente ligada a pelo menos uma cópia de umdomínio intensificador heterólogo em que o referido domíniointensificador é selecionado do grupo que consiste em:(a) a seqüência de nucleotídeos que compreende Id. deSeq. N0: 1 ou 10;(b) a seqüência de nucleotídeos que compreende pelomenos 95% de identidade de seqüência a Id. de Seq. N°:1 ou-17, em que o referido polinucleotídeo tem atividadetranscricional reguladora; e,(c) a seqüência de nucleotídeos que compreende pelomenos 100 nucleotídeos consecutivos de Id. de Seq. N0:1 ou-17.
27. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação-26, caracterizado pelo fato de que e o referido domíniointensificador não compreende a seqüência de Id. de Seq.N0 : 5 .
28. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 26 ou 27, caracterizado pelo fato de que areferida região reguladora de transcrição quiméricacompreende pelo menos duas cópias ou pelo menos três cópiasdo referido intensificador.
29. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação-27, caracterizado pelo fato de quea) as cópias do referido intensificador sãoimediatamente adjacentes uma a outra;b) pelo menos um dos referidos intensificadores estáorientado na orientação adiante ou reversa com relação aoreferido promotor.
30. Vetor de expressão caracterizado por compreendero polinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 26,-27, 28 ou 29.
31. Célula caracterizada por compreender opolinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 26, 27,- 28, 2 9 ou 30.
32. Célula, de acordo com a reivindicação 31,caracterizada pelo fato de que a referida célula é umacélula de planta.
33. Célula, de acordo com a reivindicação 32,caracterizada pelo fato de que a referida célula de plantaé de uma dicotiledônea.
34. Célula, de acordo com a reivindicação 33,caracterizada pelo fato de que a referida dicotiledônea ésoja, trigo, canola, girassol, algodão ou alfafa.
35. Célula, de acordo com a reivindicação 32,caracterizada pelo fato de que a referida célula de plantaé de uma monocotiledônea.
36. Célula, de acordo com a reivindicação 35,caracterizada pelo fato de que a referida monocotiledônea émilho, trigo, arroz, cevada, sorgo ou centeio.
37. Planta caracterizada por compreender opolinucleotídeo de qualquer uma das reivindicações 26, 27,- 28 ou 29.
38. Planta, de acordo com a reivindicação 37,caracterizada pelo fato de que a referida planta é umadicotiledônea.
39. Planta, de acordo com a reivindicação 38,caracterizada pelo fato de que a referida dicotiledônea ésoja, trigo, canola, girassol, algodão ou alfafa.
40. Planta, de acordo com a reivindicação 37,caracterizada pelo fato de que a referida planta é umamonocotiledônea.
41. Planta, de acordo com a reivindicação 40,caracterizada pelo fato de que a referida monocotiledônea émilho, trigo, arroz, cevada, sorgo ou centeio.
42. Método para melhoria da eficiência datransformação, com o aumento de um evento de integração decópia única, ou aumento da eficácia de transformação de umaplanta caracterizado pelo fato de que compreende:a) a introdução na planta de um cassete quecompreende uma região reguladora de transcrição quiméricaque compreende pelo menos um domínio intensificadoroperacionalmente ligado a um promotor heterólogo, areferida região reguladora de transcrição quiméricaoperacionalmente ligada a um marcador selecionável em que oreferido domínio intensificador é selecionado do grupo queconsiste em:i) a seqüência de nucleotídeos que compreendeId. de Seq. N0:1 ou 17;ii) a seqüência de nucleotídeos que compreendepelo menos 95% de identidade de seqüência a Id. de Seq. N°:-1 ou 17, em que o referido polinucleotídeo tem atividadetranscricional reguladora; e,iii) a seqüência de nucleotídeos que compreendepelo menos 100 nucleotídeos consecutivos de Id. de Seq. N0: 1 ou 17;b) contato da referida planta com uma concentraçãoeficaz de um agente de seleção adequado; e,c) seleção da planta que expressa o referidomarcador selecionável.
43. Método, de acordo com a reivindicação 42,caracterizado pelo fato de que o referido intensificadornão compreende a seqüência apresentada em Id. de Seq. N°:
44. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 42 ou 43, caracterizado pelo fato de que areferida região reguladora de transcrição quiméricacompreende pelo menos duas cópias ou pelo menos três cópiasdo referido intensificador.
45. Método, de acordo com a reivindicação 44,caracterizado pelo fato de quea) as cópias do referido intensificador sãoimediatamente adjacentes uma a outra;b) pelo menos um dos referidos intensificadores estáorientado na orientação adiante ou reversa com relação aoreferido promotor.
46. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 42, 43, 44 ou 45, caracterizado pelo fato deque o referido cassete também compreende um polinucleotídeode interesse.
47. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 42, 43, 44, 45 ou 46, caracterizado pelofato de que o referido marcador selecionável conferetolerância a um herbicida.
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