BRPI0615466A2 - peptìdios associados a tumores que se ligam a moléculas de classe i ou ii do antìgeno leucocitário humano (hla) e correspondente vacina anticáncer - Google Patents

Abstract

PEPTìDIOS ASSOCIADOS A TUMORES QUE SE LIGAM A MOLéCULAS DE CLASSE I OU II DO ANTìGENO LEUCOCITáRIO HUMANO (HLA) E CORRESPONDENTE VACINA ANTICáNCER. A presente invenção refere-se a métodos imunoterápicos e a moléculas e células para utilização em métodos imunoterápicos. Em particular, a presente invenção refere-se a imunoterapia do câncer. A presente invenção refere-se ainda a epitopos peptídicos de célula T auxiliar associados a tumores, isoladamente ou combinados com outros peptídeos associados a tumores, que sirvam de ingredientes farmacêuticos ativos em composições de vacinas estimuladoras das respostas imunes antitumor. Em particular, a presente invenção refere-se a duas novas seqúências peptídicas derivadas de moléculas HLA de classe II de linhagens de células tumorais humanas que podem ser utilizadas em composições de vacinas para provocar respostas imunes antitumor.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PEPTIDIOSASSOCIADOS A TUMORES QUE SE LIGAM A MOLÉCULAS DE CLASSEI OU Il DO ANTÍGENO LEUCOCITÁRIO HUMANO (HLA) E CORRES-PONDENTE VACINA ANTICÂNCER".

DESCRIÇÃO

A presente invenção refere-se a métodos imunoterápicos e amoléculas e células para utilização em métodos imunoterápicos. Em particu-lar, a presente invenção refere-se especificamente à imunoterapia do cân-cer, em especial do câncer renal. A presente invenção refere-se ainda a epi-topos peptídicos de célula T auxiliar associados a tumores, isoladamente oucombinados com outros peptídeos associados a tumores, que sirvam de in-gredientes farmacêuticos ativos em composições de vacinas estimuladorasdas respostas imunes antitumor. Em particular, a presente invenção refere-se a duas novas seqüências peptídicas derivadas de moléculas HLA declasse I ou Il de linhagens de células tumorais humanas utilizáveis em com-posições de vacinas para provocar respostas imunes antitumor.

Para os fins da presente invenção, todas as referências aqui ci-tadas passam a fazer parte integral deste documento por referência.

Antecedentes da invenção

A estimulação de uma resposta imune depende da presença deantígenos que sejam reconhecidos como estranhos pelo sistema imune dohospedeiro. A descoberta da existência de antígenos associados a tumoresabriu a possibilidade de utilizar o sistema imune do hospedeiro para intervirno crescimento do tumor. Vários mecanismos de aproveitamento das armashumorais e;celulares do sistema imunológico estão sendo explorados naatualidade na imunoterapia do câncer.

Elementos específicos da resposta imune celular são capazesde reconhecer e destruir células tumorais. O isolamento de células T citotó-xicas (CTL) a partir de populações celulares que se infiltram no tumor ou apartir do sangue periférico sugere que essas células desempenham um pa-pel importante nas defesas imunes naturais contra o câncer (Cheever et al.,Annals NY Acad. Sei. 1993 690:101-112). As células T CD8+ (TCD8+) emparticular, que reconhecem as moléculas de classe I dos peptídeos do Com-plexo Principal de Histocompatibilidade (MHC), formados normalmente por 8a 10 resíduos derivados de proteínas localizadas no citosol, desempenhamum papel importante nessa resposta. As moléculas MHC dos seres humanostambém são chamadas de antígenos leucocitários humanos (HLA).

Há duas classes de moléculas MHC: moléculas MHC de classeI, que podem ser encontradas na maioria das células nucleadas que apre-sentem peptídeos resultantes de clivagem proteolítica de proteínas endóge-nas e peptídeos maiores. Moléculas MHC de classe Il que podem ser encon-tradas somente em células profissionais apresentadoras de antígenos (APC)e apresentam proteínas exógenas que são absorvidas pelas APCs durante aendocitose e depois são processadas. Os complexos de peptídeos e MHC-Isão reconhecidos por linfócitos T citotóxicos CD8+, enquanto que os com-plexos de peptídeos e MHC-II são reconhecidos por células auxiliares TCD4+.

As células T auxiliares CD4+ desempenham um papel importan-te em administrar as funções efetoras de respostas de células T antitumoraise por isso a identificação de epitopos de célula T CD4+ derivadas de antíge-nos associados a tumores (TAA) pode ser de grande importância para o de-senvolvimento de produtos farmacêuticos para provocar respostas imunesantitumorais (Kobayashi, H., R. Omiya, M. Ruiz, E. Huarte, P. Sarobe, J. J.Lasarte1 M. Herraiz, B. Sangro, J. Prieto, F. Borras-Cuesta, e E. Celis. 2002.Identification of an antigenic epitope for helper T Iymphocytes from carcino-embryonic antigen. Clin. Câncer Res. 8:3219-3225., Gnjatic, S., D. Atanac-kovic, E. Jáger, M. Matsuo, A. Selvakumar1 N.K. Altorki, R.G. Maki, B. Du-pont, G. Ritter, Y.T. Chen, A. Knuth, e L.J. Old. 2003. Survey of naturally oc-curring CD4+ T-cell responses against NY-ESO-1 in câncer patients: Correlati-on with antibody responses. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A . 100(15):8862-7).

Foi demonstrado em modelos com mamíferos, por exemplo ca-mundongos, que mesmo na ausência de células efetoras de linfócito T cito-tóxico (ou seja, linfócitos T CD8+), as células T CD4+ são suficientes parainibir a manifestação de tumores através da inibição da angiogênese pelasecreção de gama-interferon (IFNy) (Qin, Z. e T. Blankenstein. 2000. CD4+T-cell-mediated tumour rejection involves inhibition of angiogenesis that isdependent on IFN gamma receptor expression by nonhematopoietic cells.Immunity. 12:677-686). Além disso, foi demonstrado que as células T CD4+que reconhecem peptídeos de antígenos associados a tumores apresenta-dos por moléculas HLA de classe Il podem impedir o avanço de tumores pe-la indução de resposta dos anticorpos (Kennedy, R.Ç., M.H. Shearer, A.M.Watts, e R.K. Bright. 2003. Os linfócitos T CD4+ desempenham um papelvital na produção de anticorpos e na imunidade tumoral contra o antígenotumoral grande do vírus 40 dos símios. Câncer Res. 63:1040-1045). Ao con-trário dos peptídeos associados a tumores que se ligam a moléculas HLA declasse I, somente um pequeno número de Iigantes de classe Il de TAA foramdescritos até agora (www.cancerimmunity.org, www.syfpeithi.de). Conside-rando que a expressão constitutiva das moléculas HLA de classe Il normal-mente se limita a células do sistema imunológico (Mach, B., V. Steimle, E.Martinez-Soria, e W. Reith. 1996. Regulation of MHC de class Il genes: Ies-sons from a disease. Annu. Rev. Immunol. 14:301-331), não se consideravapossível isolar peptídeos classe Il diretamente a partir de tumores primários.

Por isso, descreveram-se várias estratégias para atingir antígenos na via deprocessamento classe Il de células apresentadoras de antígenos (APCs),como por exemplo a incubação de APCs com o antígeno de interesse parapermitir que seja absorvido, processado e apresentado (Chaux, P., V. Van-tomme, V. Stroobant, K. Thielemans, J. Corthals, R. Luiten, A.M. Eggermont,T. Boon, e B.P. van der Bruggen. 1999. Identification of MAGE-3 epitopespresented by HLA-DR molecules to CD4(+) T lymphocytes. J. Exp. Med.189:767-778), ou a transfecção de células com genes ou minigenes codifi-cadores do antígeno de interesse e associado com a cadeia invariável queintermedia a translocação de antígenos para o compartimento lisossômicoMHC de classe Il de processamento e montagem (MIIC).

Para que um peptídeo dispare (provoque) uma resposta imuno-lógica celular, é preciso que ele se ligue a uma molécula MHC. Esse proces-so depende dos alelos da molécula MHC e dos polimorfismos específicos daseqüência de aminoácidos do peptídeo. Os peptídeos que se ligam às MHCsde classe I normalmente têm comprimento de 8-10 resíduos e contêm dois re-síduos conservados ("âncoras") em sua seqüência primária de aminoácidosque interagem com a correspondente tenda de ligação da molécula MHC.

Na ausência de inflamação, a expressão de moléculas MHC declase II se restringe principalmente a células do sistema imunológico, emespecial às células profissionais apresentadoras de antígenos (APC), comopor exemplo, os monócitos, células derivadas de monócitos, macrófagos,células dendríticas.

Os antígenos que são reconhecidos pelos linfócitos T específi-cos do tumor, ou seja, os seus epitopos, podem ser moléculas derivadas detodas as classes de proteínas, tais como enzimas, receptores, fatores detranscrição, etc. Além disso, os antígenos associados a tumores tambémpodem estar presentes apenas em células tumorais, por exemplo, sob aforma de produtos de genes mutados. Outra importante classe de antígenosassociados a tumores são estruturas teciduais específicas como, por exem-plo, antígenos de câncer testicular que são expressos em diferentes tipos detumores e em tecido testicular sadio.

Foram identificados diversos antígenos associados a tumores.Além disso, tem-se dispendido grande esforço em pesquisas para identificaroutros antígenos associados a tumores. Alguns grupos de antígenos associ-ados a tumores, também chamados no estado da técnica de antígenos es-pecíficos de tumores, são específicos de tecidos. Os exemplos incluem masnão se restringem à tirosinase no melanoma, PSA e. PSMA no câncer dapróstata e as cromossômicâs (translocações interseções), còmo por exem-plo bcr/abl no linfoma. No entanto, vários antígenos associados a tumoresque foram identificados ocorrem em diversos tipos de tumores e alguns de-les, tais como as proteínas oncogênicas e/ou os genes supressores de tu-mor (uma análise dos genes supressores de tumores para o câncer renal,por exemplo, foi feita em Linehan WM1 Walther MM, Zbar B. The genetic ba-sis of câncer of the kidney. J Urol. 2003 Dec; 170(6 Pt 1):2163-72), que sãoos verdadeiros causadores do evento de transformação, ocorrem em quasetodos os tipos de tumores. Por exemplo, as proteínas celulares normais quecontrolam o crescimento e a diferenciação das células, tais como a p53 (e-xemplo de gene supressor de tumores), ras, c-met, myc, pRB, VHL, e HER-2/neu, podem acumular mutações que resultam na regulação da expressãodesses produtos genéticos, tornando-os oncogênicos (McCartey et al. Cân-cer Research 1998 15:58 2601-5; Disis et al. Ciba Found. Symp. 1994187:198-211). I

A mucina-1 (MUC1) é uma glicoproteína transmembrana tipo 1altamente glicosilada, abundantemente superexpressa na superfície celularde vários adenocarcinomas humanos, tais como os cânceres de mama e deovário. A desglicosilação anormal em tumores malignos é comum e desmas-cara epitopos em células tumorais que podem não estar presentes em célu-las normais. Além disso, foi demonstrada a expressão de MUC1 em mielomamúltiplo e alguns Iinfomas não-Hodgkin de células B (Gendler S, Taylor-Papadimitriou J, Duhig T, Rothbard J, and Burchell J. A highly immunogenicregion of a human polymorphic epithelial mucin exprêssed by carcinomas ismade up of tandem repeats. J. Biol. Chem. 263:12820-12823 (1988); Siddi-qui 1988; Girling A, Bartkova J, Burchell J1 Gendler S, Gillett C, and Taylor-Papadimitriou J. A core protein epitope of the polymorphic epithelial mucindetected by the monoclonal antibody SM-3 is selectively exposed in a rangeof primary carcinomas. Int. J. Câncer 43:1072-1076 (1989); Brossart 1999;Duperray 1989; Mark 1989; Delsol 1988; Apostolopoulos V and McKenzie IF.Cellular mucins: targets for immunotherapy. Crit Rev. Immunol. 14:293-309(1994); Finn OJ, Jerome KR, Henderson RA, Pecher G, Domenech N, Maga-rian-Blander J, and Barratt-Boyes SM. MUC-1 epithelial tumor mucin-basedimmunity and câncer vaccines. Immunol. Rev. 145:61-89 (1995)). Diversosrelatórios recentes (Apostolopoulos V and McKenzie IF. Cellular mucins: tar-gets for immunotherapy. Crit Rev. Immunol. 14:293-309 (1994); Finn OJ, Je-rome KR, Henderson RA, Pecher G, Domenech N, Magarian-Blander J, andBarratt-Boyes SM. MUC-1 epithelial tumor mucin-based immunity and câncervaccines. Immunol. Rev. 145:61-89 (1995); Barnd 1989; Takahashi 1994;Noto 1997) demonstraram que células T citotóxicas MHC não restritas detumores de ovário, mama, pâncreas e mieloma múltiplo podem reconhecerepitopos do cerne de proteína MUC1 localizado na repetição em tandem.Foram identificados dois epitopos de célula T restritas a HLA-A2 derivadosda proteína MUC1 (Brossart 1999, EP 1484397). Um peptídeo é derivado daregião de repetição em tandem da proteína MUC1. O segundo peptídeo Io-caliza-se dentro da seqüência de sinais de MUC1. Tem-se obtido êxito naindução de respostas in vivo de linfócitos T citotóxicos após a vacinação comcélulas dendríticas pulsadas com peptídeos em câncer avançado de mamaou de ovário usando esses peptídeos (Brossart 2000) (Wierecky 2005). Comrelação ao carcinoma de células renais, a expressão de MUC1 é usual emtumores convencionais e foi relatado que ela está associada ao grau e aoestágio do tumor (Fujita 1999; Kraus 2002; Leroy 2002; Bamias 2003; Cao2000). No caso da MUC1, a sobreexpressão de proteína não está correla-cionada à sobreexpressão do mRNA.

A adipofilina é um marcador de células diferenciadas especiali-zadas contendo gotículas lipídicas e de doenças associadas a células acu-muladoras de gordura (Heid 1998). A adipofilina ocorre em uma grande vari-edade de linhagens de células cultivadas, incluindo os fibroblastos, bem co-mo em células endoteliais e epiteliais. No entanto, nos tecidos, a expressãoda adipofilina restringe-se a certos tipos de células, tais como as células epi-teliais mamárias lactantes, células do córtex adrenal, células de Sertoli e Leydigdo sistema reprodutor masculino e na esteatose ou hepatócitos de degenera-ção gordurosa na cirrose hepática alcoólica (Heid 1998). Há relatos de adipofili-na superexpressa em câncer colorretal (Saha 2001), carcinoma hepatocelular(Kurpkawa 2004) e em carcinoma de células renais (Young 2001).

O c-Met codifica um receptor transmembrana heterodiméricocom atividade de tirosina quinase composta de uma cadeia α ligada por dis-sulfito a uma subunidade β (Bottaro 1991; Rubin 1993). Ambas subunidadessão expressas na superfície, sendo a subunidade β pesada responsável porligar o ligante, o fator de crescimento dos hepatócitos (HGF), enquanto que asubunidade,α contém um domínio intracelular que media a ativação de dife-rentes vias de transdução de sinais. A sinalização de c-Met está implicadana regeneração de órgãos, como foi constatado no fígado e rim, na embrio-gênese, hematopoiese, desenvolvimento muscular e na regulação da migra-ção e adesão de células B normalmente ativadas e monócitos (Zarnegar1995; Naldini 1991; Montesano 1998; Schmidt 1995; Uehara 1995; Bladt1995; Takayama 1996; Mizuno 1993; van, V 1997; Beilmann 2000). Alémdisso, diversos estudos apontaram para o envolvimento da superexpressãode c-Met na transformação maligna e na invasividade de células malignas.

O c-Met medea as atividades multifuncionais e de potencial on-cogênico do fator HGF/SF incluindo a promoção do crescimento, motilidadee sobrevivência das células, na dissolução da matriz extracelular e na angio-gênese (Bottaro 1991; Rubin 1993; Zarnegar 1995). A ligação do HGF aoreceptor induz a autofosforilação de c-Met e ativa eventos de sinalização ajusante, incluindo ras, fosfatidilinositol 3'-quinase, fosfolipase Cy e vias rela-cionadas com proteína quinase ativadas por mitógeno (Naldini 1991; Monte-sano 1998; Furge 2000; Ponzetto 1993; Dong 2001; Furge 2001).

O gene c-Met é expresso predominantemente em células epiteli-ais e é superexpresso em diversos tecidos e linhagens de células malignos(Di Renzo 1995; Ferracini 1995; Tuck 1996; Koochekpour 1997; Li 2001;Fischer 1998; Maulik 2002; Qian 2002; Ramirez 2000).

Um crescente número de relatórios mostrou que células não epi-teliais, tais como células hematopoiéticas, neurais e do esqueleto respon-dem ao HGF e que malignidades hematológicas tais como o mieloma múlti-plo, doença de Hodgkin, leucemia e Iinfoma expressam a proteína c-Met(Gherardi 1991; Teofili 2001; Borset 1999; Jucker 1994; Pons 1998). O con-trole désregulado do fenótipo de crescimento invasivo por c-Met ativado on-cogenicamente provocado por mutações ativadoras de c-Met, amplificaçãoou superexpressão de c-Met e aquisição de Ioops autócrinos de HGF/c-Metconfere propriedades metastáticas e invasivas às células malignas. Notada-mente, a ativação constitutiva de c-Met em camundongos transgênicos quesuperexpressam o HGF promove ampla gênese tumoral (Wang 2001; Taka-yama 1997).

O regulador de sinalização 5 da proteína G (RGS5) é um regula-dor negativo de vias sinalizadoras da proteína G heterotrimérica, embora suafunção in vivo ainda seja desconhecida. As proteínas RGS compreendemuma família de moléculas com função catalítica unificadora, mas de distribui-ção tecidual variada. Elas estimulam a atividade intrínseca da guanosinatrifosfatase (GTPase) de subunidades Ga ativadas e desse modo acelerama inativação da proteína G. Assim, as moléculas RGS inibem a sinalização ajusante dos receptores acoplados à proteína G (De 2000). Recentemente,demonstrou-se que a indução do regulador de sinalização 5 da proteína Gem pericitos coincide com a remodelagem vascular ativa durante a neovas-cularização tumoral. Em um modelo de carcinogênese das ilhotas pancreáti-cas em camundongos, bem como em astrocitomas altamente angiogênicos,demonstrou-se a superexpressão de RGS5 em pericitos no processo de"angiogenic switch" que acompanha a remodelagem vascular ativa. A super-expressão restringiu-se aos vasos tumorais quando comparada a uma ilhotade Langerhans normal. No entanto, a RGS5 também é regulada na cicatri-zação de feridas e na ovulação (Berger 2005).

A expressão da RGS5 é aumentada no RCC (Rae 2000). Emoutro estudo, a RT-PCR mostrou forte expressão de RGS5 em todos RCCsexaminados, e a expressão foi muito fraca ou não detectável em rins nor-mais (6.6:1 em PCR em tempo real). No RCC, o RGS5 foi encontrado princi-palmente nas células endoteliais dos tumores (Furuya 2004). Além disso, foirelatado que a RGS5 é um marcador de células endoteliais dos sinusóidesem carcinoma hepatocelular (Chen 2004).

A apolipoproteína L1 (APOL1) é uma lipoproteína secretada, dealta densidade, que se liga à apolipoproteína A-!-. A apolipoproteína A-I éuma proteína plasmática relativamente abundante e é a principal apoproteí-na do HDL. Ela se envolve na formação da maioria dos ésteres de colesterolno plasma e também promove a saída do colesterol das células. A apolipo-proteína L1 pode ter função na troca e transporte lipídicos no corpo, bemcomo no transporte reverso de colesterol das células periféricas para o fíga-do. A proteína plasmática é um polipeptídeo de cadeia simples com massamolecular aparente de cerca de 40 kDa (Duchateau 1997; Duchateau 2001).O cDNA da AP0L1 foi isolado a partir de uma banco de cDNA de célulasendoteliais ativadas e foi constatado ser regulado pela TNF-α, uma potentecitoquina pró-inflamatória. (Monajemi 2002).

O KIAA0367 foi identificado no Projeto cDNA Kazusa que buscaidentificar longos transcritos humanos desconhecidos que codificam supos-tas proteínas (Ohara 1997). Embora a função da suposta seqüência peptídi-ca de 820 aminoácidos correspondente ao produto do gene KIAA0367 sejadesconhecida, ela contém um domínio de ligação a lipídio do tipo CRAL-TRIO próximo à região c-terminal que se liga a pequenas moléculas hidrofó-bicas e que está presente em vários fatores de troca de nucleotídeos e naproteína 2 de interação com proteína (BNIP-2) presenteem BCL2/adenovírus E1B 19-KDa. O BNIP-2 está envolvido no controle dediversas funções celulares incluindo a morfologia, migração, endocitose ce-lular e progressão do ciclo celular (Zhou 2005). O KIAA0367 está situado naregião cromossômica 9q21. Essa região é descrita como alvo comum dedeleção homozigótica em diversos tumores (Gursky 2001; Weber 2001) ouperda de heterozigosidade (Louhelainen 2000; Tripathi 2003).

A guanilato ciclase solúvel (GCs) é uma proteína heterodiméricaque consiste em uma subunidade alfa e uma subunidade beta (1 grupo he-me) e cataliza a conversão da GTP para o segundo cGMP mensageiro, fun-cionando como o principal receptor de oxido nítrico e nitrovasodilatadores(Zabel 1998). GUCYa3 e b3 estão superexpressos em gliomas humanos. Atransfecção de GUCY1A3 ou GUCY1B3 antisenso reduziu a vascularizaçãoe o crescimento de tumores em camundongos glabros. Isso pode se deverao fato de que VEGF é induzido,por cGMP (Saino 2Ú04). GUCY1A3 promo-ve a migração das células tumorais em uma linhagem de células de tumorde mama em camundongos (Jadeski 2003).

A ciclina D1 pertence à família altamente conservada de ciclinas,mas especificamente à subfamília de ciclina D (Xiong 1991; Lew 1991). Asciclinas funcionam como reguladores de CDKs (quinases dependentes deciclina). As diferentes ciclinas apresentam diferentes padrões de expressãoe degradação que contribuem para a coordenação temporal de cada eventomitótico (Deshpande 2005). A ciclina D1 forma um complexo com, e agecomo, uma subunidade reguladora de CDK4 ou CDK6 cuja atividade é ne-cessária para a transição G1/S de ciclo celular. CCND1 forma com CDK4 eCDK6 um complexo de holoenzimas serina/treonina quinase conferindo es-pecificidade de substrato ao complexo (Bates 1994). Foi demonstrado que aproteína interage com a proteína Rb supressora de tumor (Loden 2002) e aexpressão desse gene é regulada de forma positiva pela Rb (Halaban 1999).Freqüentemente são observadas mutações, amplificação e superexpressãodesse gene, que altera o avanço do ciclo celular, em uma série de diferentestumores, podendo contribuir para a gênese tumoral (Hedberg 1999; Vasef1999; Troussard 2000).

As proteínas da família da metaloproteinase matricial (MMP) es-tão envolvidas na quebra da matriz extracelular em processos fisiológicosnormais, tais como desenvolvimento embrionário, reprodução e remodela-gem tecidual, bem como em processos mórbidos, como artrite e metástase(Mott 2004). A matriz metaloproteinase 7 (MMP7) é secretada como pró-proteína inativa com 29,6 kDa, que é ativada quando clivada por proteinasesextracelulares. A enzima ativa tem peso molecular 19,1 kDa e se liga a doisíons zinco e dois íons cálcio por subunidade (Miyazaki 1990; Browner 1995).

A MMP7 decompõe gelatinas, fibronectinas e caseína (Miyazaki 1990; Quan-tin 1989) e difere da maioria dos membros da família de MMP por nao ter umdomínio de proteína conservado de terminal C (Gaire 1994). A MMP7 fre-qüentemente está superexpressa em tecido maligno (Lin 2004; Bramhall1997; Denys 2004) e supõe-se que ela facilite a invasão de células tumoraisin vivo (Wang.2005).

Essas proteínas podem ser alvo de uma resposta imune especí-fica do tumor em diversos tipos de câncer.

O peptídeo HBV-001 do antígeno do cerne do vírus da hepatiteB não deriva de um antígeno endógeno humano associado a tumor, mas doantígeno do cerne do vírus da hepatite B. Em primeiro lugar, ele permitecomparar qualitativamente a extensão das respostas das células T induzidaspor peptídeos associados a tumor e portanto permite tirar importantes con-clusões sobre a capacidade de provocar respostas antitumor. Segundo, elaage como um importante controle positivo no caso de ausência de respostasdas células T no paciente. Terceiro, ela também permite tirar conclusõessobre a situação de imunocompetência do paciente.

A infecção com o vírus da hepatite B (HBV) é uma das principaiscausas das doenças hepáticas, atingindo cerca de 350 milhões de pessoasao redor do mundo (Rehermann 2005). Devido à facilidade da transmissãohorizontal e vertical e o potencial de a doença se tornar crônica, levando àcirrose hepática e ao carcinoma hepatocelular, o HBV representa um grandeimpacto no sistema público de saúde de inúmeros países. O genoma doHBV (Previsani 2002) é formado de DNA circular parcialmente de fita dupla.Nos vírions de HBV, ele é conjugado com a proteína do capsídeo HBc e ou-tras proteínas para formar o nucleocapsídeo que é cercado por um envelopeexterno contendo lipídios e a família HBs de proteínas de superfície (tambémchamada de proteína do envelope). Os determinantes antigênicos que sãoassociados a HBc e HBs são observadas como HBcAg e HBsAg1 respecti-vamente. Esses antígenos são associados a respostas sorológicas, ou seja,de anticorpos encontrados no sangue do paciente e estão entre os sistemasantígeno-anticorpo mais úteis para o diagnóstico de infecção com HBV. OHBc irá representar um novo antígeno estranho para todos aqueles que naotenham um histórico de infecção com HBV. Como os peptídeos imunogêni-cos para esse antígeno são bem-conhecidos (Bertoletti 1993; Livingston1997), selecionou-se um peptídeo de 10 aminoácidos do HBcAg como antí-geno de controle positivo dentro do IMA. A indução de Células T citotóxicasespecíficos do peptídeo HBc será então utilizada como marcador da imuno-competência e vacinação bem-sucedida.

A imunoterapia em pacientes de câncer visa ativar especifica-mente células do sistema imunológico, em especial as chamadas células Tcitotóxicas, (CTL, também conhecidas como "células de eliminação" ou célu-las T CD8+), contra células tumorais, mas não contra tecido sadio. As célu-las malignas diferem das células sadias pela expressão das proteínas asso-ciadas a tumores. As moléculas HLA na superfície da célula apresentam oconteúdo celular para o exterior, assim permitindo que a célula T citotóxicapossa diferenciar entre a célula sadia e a célula maligna. Isso é feito que-brando-se todas as proteínas dentro da célula em peptídeos de cadeia curtaos quais são anexados a moléculas HLA e apresentados na superfície celu-lar (Rammensee 1993). Os peptídeos que são apresentados nas células tu-morais e não - ou em menor grau - em células sadias do corpo, são chama-dos de peptídeos associados a tumores (TUMAPs).

Os primeiros ensaios clínicos usando peptídeos associados atumores iniciaram em meados da década de 1990 por Boon et al., principal-mente como indicação para o melanoma. As melhores respostas clínicasvariaram entre 10% e 30%. Não foram relatados efeitos colaterais graves ouautoimunidade severa em nenhum ensaio clínico que usou monoterapia comvacina baseada em peptídeos. Foram relatadas formas suaves de vitiligo emalguns pacientes tratados com peptídeos associados a melanoma.

No entanto, o priming de um tipo de linfócito T citotóxico (CTL)normalmente não é suficiente para eliminar todas as células tumorais. Ostumores são extremamente mutagênicos e por isso são capazes de reagirrapidamente a ataques de linfócitos T citotóxicos mudando seu padrão pro-téico para evitar serem reconhecidos por CTLS. Para contra-atacar os me-canismos evasivos dos tumores, utilizam-se diversos peptídeos específicosna vacinação. Dessa forma, pode-se preparar um grande ataque simultâneocontra o tumor, utilizando diversos clones de linfócito T citotóxico ao mesmotempo. Isso pode diminuir as chances do tumor driblar a resposta imune.Esta hipótese foi confirmada recentemente em um estudo clínico para tratarpacientes com melanoma em estágio avançado. Exceto alguns poucos ca-sos, os pacientes que mostraram no mínimo 3 respostas distintas das célu-las T apresentaram respostas clínicas objetivas ou estabilização da doença(Banchereau 2001) bem como um aumento de sobrevida (comunicação pesso-al com J. Banchereau), enquanto que a grande maioria dos pacientes com me-nos de 3 respostas das células T tiveram diagnóstico de avanço da doença.

Até hoje foram descritas numerosas estratégias para introduzirantígenos nas vias de processamento classe de II ou I. É possível incubarcélulas apresentadoras de antígenos (APCs) com o antígeno em questãopara que seja assumido e processado (Chaux, P., Vantomme, V., Stroobant1V., Thielemans, K., Corthals, J., Luiten1 R., Eggermont1 A. M., Boon1 T. & vander, Β. P. (1999) J. Exp. Med. 189, 767-778. Dengjel J1 Schoor O1 Fischer R1Reich M, Kraus M, Muller M, Kreymborg K, Altenberend F, Brandenburg J,Kalbacher H, Brock R, Driessen C, Rammensee HG, Stevanovic S. Auto-phagy promotes MHC class Il presentation of pept^des from intracellularsource proteins. Proc Natl Acad Sci USA. 2005 May 31;102(22):7922-7.).Outras estratégias utilizam proteínas de fusão contendo seqüências-alvolisossômicas. Quando expressas em células APCs1 essas proteínas de fusãodirecionam os antígenos para o compartimento de processamento de classeII (Marks, M. S., Roche, Ρ. A., van Donselaar, E., Woodruff, L., Peters, P. J.& Bonifacino1 J. S. (1995) J. Cell BioL 131, 351-369, Rodriguez, F., Harkins1S., Redwine1 J. M., de Pereda, J. M. & Whitton, J. L. (2001) J. ViroL 75,10421-10430).

Para que as proteínas sejam reconhecidas pelos linfócitos T cito-tóxicos como antígenos específicos do tumor, e para que sejam usadas emum tratamento, precisam atender a certos pré-requisitos. O antígeno deveser expresso principalmente por células tumorais e não por tecidos saudá-veis normais ou preferivelmente em quantidades pequenas. Além disso, édesejável que o respectivo antígeno esteja presente não só em um tipo es-pecífico de tumor, mas também que esteja presente em altas concentrações(por exemplo, número de cópias por célula). É essencial a presença de epi-topos na seqüência de aminoácidos do antígeno, uma vez que esse peptí-deo ("peptídeo imunogênico"), derivado de. um antígeno associado a tumor,deve induzir uma resposta da célula T in vitro ou in vivo.

Cerca de 30% dos pacientes sofrem (de doença metastásica naapresentação e outros 25% dos pacientes apresentam tumor em estágioavançado localmente. Quarenta por cento dos indivíduos que se submetemà ressecção cirúrgica irão desenvolver metástase. Entre os indivíduos comdoença metastática, cerca de 75% apresentam metástase pulmonar, 36%comprometimento de Iinfonodos e/ou partes moles, 20% comprometimentoósseo e 18% comprometimento hepático. A taxa de 5 anos de sobrevida va-ria de acordo com o sistema de estágios de Robson. De modo geral, o RCCainda é fatal em cerca de 80% dos pacientes (Senn HJ1 Drings P, Glaus A,Jungi WF1 Pralle HB1 Sauer R, and Schlag PM. Checkliste Onkologie, 5thedition. Georg Thieme Verlag, Stuttgart/New York (2001), Vokes EE1 andGolomb HM. Oncologic Therapies, 2nd edition. Sprihger-Verlag, Ber-lin/Heidelberg (2003)).

O carcinoma de células renais segue a classificação TNM (Gui-

nan P. TNM Staging of Renal Cell carcinoma. Presented at 'Diagnosis and

prognosis of Renal Cell Carcinoma: 1997 Workshop', Rochester, Minnesota,

March 21-22, Communication of the UICC - Union Internationale Contre Ie

Câncer, and AJCC - American Joint Committee on Câncer, published by

ASC - American Society Câncer (1997), Communication of the UICC); vide

as tabelas AeBa seguir.

<table>table see original document page 15</column></row><table>O tratamento-padrão para o RCC é a nefrectomia radical (emtodos os estágios). A radioterapia pode ser usada para diminuir o avanço docâncer, mas os carcinomas de células renais em geral são resistentes à ra-diação. A terapia hormonal pode reduzir o crescimento do tumor em algunscasos (menos de 10%). Até o momento, a quimioterapia não mostrou ativi-dade importante nessa doença. Vimblastina, 5-FU (5-fluorouracil) e floxuridi-na (FUDR) são os fármacos quimioterápicos mais estlidados, mas somentea 5-FU e seu metabólito FUDR mostraram uma taxa de atividade de 10-12%(Vokes EE1 and Golomb HM. Oncologic Therapies, 2nd edition. Springer-Verlag, Berlin/Heidelberg (2003)). A combinação de gencitabina e 5-FU re-sultou em resposta de 17%.

Os tratamentos imunológicos para RCC em estágio avançadocomo, por exemplo, o alfa-interferon (IFNa) ou interleucina-2 (IL-2), foramavaliados nos últimos anos pelas autoridades reguladoras nos EUA e na Eu-ropa. Até o presente momento, o tratamento com alta dosagem de IL-2 aindaé o único regime imunológico aprovado pelo FDA. Inicialmente, relatou-seque a monoterapia com IFNa apresentava um índice de resposta de 25-30%, porém estudos adicionais sugeriram que o índice real de resposta seriade apenas uns 10% (Vokes EE, and Golomb HM. Oncologic Therapies, 2ndedition. Springer-Verlag, Berlin/Heidelberg (2003)). A IL-2 parece ter um ín-dice global de resposta similar ao INFa, com aproximadamente 5% dos pa-cientes obtendo remissão completa permanente (Rosenberg 1987). Umarecente meta-análise com mais de 6.000 pacientes com RCC em estágioavançado concluiu que, em média, é possível obter um índice de respostaclínica de somente 12,9% com a terapia com citoquinas, como por exemploo IFN-α, injeções de bolo de IL-2 de alta dosagem ou inalação de IL-2. Amesma análise obteve uma resposta de 4,3% para o placebo e 2,5% para osbraços de controle de não-imunoterapia (Cochrane Database Syst Rev.2000;(3):CD001425. Immunotherapy for advanced renal cell câncer. CoppinC, Porzsolt F, Awa A, Kumpf J, Coldman A, Wilt T).

Embora as novas terapias tenham mostrado uma eficácia clínicaem diversas entidades tumorais e tenham sido aprovadas nos últimos anos,as taxas de sobrevida para o carcinoma de células renais não se alterou sig-nificativamente na última década. As opções atuais de tratamento sistêmicodisponíveis, ou seja a quimioterapia e os tratamentos imunológicos, mostra-ram relativamente poucos resultados eficazes e o que é mais importante,eles são limitados por uma toxicidade sistêmica importante. Conseqüente-mente, existe considerável demanda médica - que não está sendo atendidapor novas opções de tratamento do carcinoma de células renais.

As células T auxiliares desempenham um importante papel nacoordenação da função efetora das células T citotóxicas na imunidade anti-tumoral. Os epitopos das células T auxiliares que provocam uma respostadas células T auxiliares do tipo TH1 apoiam as funções efetoras das célulasT assassinas CD8+, que incluem funções citotóxicas dirigidas contra as célu-las tumorais que apresentam complexos peptídeo/MHC associados ao tumornas superfícies celulares. Desta forma, os epitopos peptídicos de célula Tauxiliar associados a tumores, isoladamente ou em combinação com outrospeptídeos associados a tumores, podem servir como ingredientes farmacêu-ticos ativos em composições de vacinas estimuladoras das respostas imu-nes antitumor.

O principal objetivo no desenvolvimento de uma vacina antitumo-ral é, portanto, identificar e caracterizar novos antígenos associados a tumo-res e epitopos T auxiliares imunogênicos derivados desses novos antígenos,que possam ser reconhecidos por células T citotóxicas CD8+, ou células TCD4+, em especial células T CD4+ do tipo Tm. Portanto, objeto da presenteinvenção é apresentar novas seqüências de aminoácidos para esses peptí-deos que têm a capacidade de se ligar a uma molécula do complexo princi-pal de histocompatibilidade (MHC) humano de classe I (HLA de classe I) ouIl (HLA classe 2). Outro objetivo da presente invenção é oferecer uma vacinaanticancerígena eficiente que seja, ao menos em parte, baseada nos referi-dos novos peptídeos.

De acordo com a presente invenção, atinge-se o primeiro objeti-vo ao se produzir um peptídeo associado a tumor escolhido do grupo depeptídeos contendo ao menos uma seqüência de acordo com qualquer umadas SEQ ID N- 1 ou SEQ ID N- 2 da listagem de seqüências anexa, ondeum peptídeo tem a capacidade de se ligar a uma molécula do principal com-plexo de histocompatibilidade (MHC) humano classe I (HLA de classe I),desde que o peptídeo não seja o polipeptídeo intacto associado a tumor hu-mano.

Na presente invenção, os inventores demonstram que é possívelisolar e caracterizar peptídeos que se ligam a moléculas HLA de classe I ouIl diretamente de tumores de mamíferos, preferencialmente tumores huma-nos, preferencialmente carcinomas de células renais.

A presente invenção oferece peptídeos que se originam de antí-genos associados com a gênese de tumores e que têm a capacidade de seligar de tal modo a moléculas HLA de classe Il para desencadear uma res-posta imune de leucócitos humanos, especialmente em linfócitos, em linfóci-tos T, em linfócitos T CD4+, em linfócitos T CD4+ que intermediam respos-tas imunes do tipo THi.

A presente invenção também oferece peptídeos que se originamde antígenos associados com a gênese de tumores e que têm a capacidadede se ligar de tal modo a moléculas HLA de classe Il de forma a provocaruma resposta imune de leucócitos humanos, especialmente em linfócitos,em linfócitos T, em linfócitos T citotóxicos CD8+.

Os peptídeos se originam de antígenos associados a tumores,especialmente de antígenos associados a tumores com função por exemplona proteólise, angiogênese, crescimento celular, regulação do ciclo celular,divisão celular, regulação da transcrição, regulação da translação, invasãotecidual, incluindo, por exemplo, peptídeos associados a tumor da metalo-proteinase matricial 7 (MMP7; SEQ ID No. 1) e da apolipoproteína L1 (A-P0L1; SEQ ID N°. 4).

Na presente invenção, os inventores dão provas conclusivas deque os peptídeos associados a tumores que se ligam de forma promíscua amoléculas HLA de classe II, especialmente aqueles alelos de HLA de classeIl geneticamente codificados por Ioci HLA DR do genoma humano, são ca-pazes de provocar respostas imunes mediadas por células humanas TCD4+. As células T CD4+ foram isoladas a partir de sangue periférico, mos-trando que os peptídeos objeto das reivindicações são capazes de provocarrespostas de células T do sistema imunológico humano contra peptídeosselecionados do peptidoma das células tumorosas. Como mostrado maisadiante com um peptídeo do MMP7 (SEQ ID No. 1), esse peptídeo associa-do a tumor que se liga promiscuamente a HLA DR foi reconhecido pelas cé-lulas T CD4+.

De forma semelhante, descobriu-se que os peptídeos associa-dos a tumor suficientemente ligados a moléculas HLA de classe I podemprovocar respostas imunes mediadas por linfócitos T citotóxicos CD8+, i-gualmente demonstrando que os peptídeos reivindicados são capazes deprovocar respostas do sistema imunológico humano contra peptídeos sele-cionados do peptidoma das células do tumor.

Como os peptídeos podem ser sintetizados quimicamente e serusados como ingredientes farmacológicos ativos de preparações farmacêuti-cas, os peptídeos da presente invenção podem ser usados em imunoterapia,preferencialmente em imunoterapia oncológica.

Com o intuito de identificar Iigantes HLA de classe I ou Il do an-tígeno associado a tumor para o desenvolvimento de imunoterapia baseadaem peptídeos, os inventores procuraram isolar peptídeos diretamente detumores sólidos, em especial do carcinoma de células renais (RCC) (videexemplos abaixo).

Os motivos para focar no RCC para apresentar provas técnicasdo conceito foram os seguintes: cerca de 150.000 novas pessoas no mundopor ano recebem diagnóstico de R.CC; a doença está associada a um eleva-do índice de mortalidade que resulta em cerca de 78.000 óbitos por ano.(Pavlovich, C.P. and L.S. Schmidt. 2004. Searching for the hereditary causesof renal-cell carcinoma. Nat. fíev. Câncer 4:381-393). Quando são diagnosti-cadas metástases, o índice de sobrevida de um ano cai para cerca de 60%(Jemal, A., R.C. Tiwari, T. Murray, A. Ghafoor, A. Samuels, E. Ward, E.J.Feuer, and M.J. Thun. 2004. Câncer statistics, 2004. CA Câncer J. Clin.54:8-29), enfatizando a grande demanda médica não atendida nessa indica-ção. Pelo fato de o RCC aparentemente ser um tumor imunogênico (OliverRTD1 Mehta A, Barnett MJ. A phase 2 study of surveillance in patients withmetastatic renal cell carcinoma and assessment of response of such patientsto therapy on progression. Mol Biother. 1988;1:14-20. Gleave M, Elhilali M,Frodet Y, et al. Interferon gamma-1b compared with placebo in metastaticrenal cell carcinoma. N Engl J Med. 1998;338:1265), como indicado pela e-xistência de linfócito T citotóxico que reage e se infiltraino tumor (Finke, J.H.,P. Rayman, J. Alexander, M. Edinger, R.R. Tubbs, R. Connelly, E. Pontes,and R. Bukowski. 1990. Characterization of the cytolytic activity of CD4+ andCD8+ tumor-infiltrating Iymphocytes in human renal cell carcinoma. CâncerRes. 50:2363-2370), foram iniciados ensaios clínicos para desenvolver vaci-nas antitumor baseadas em peptídeos (Wierecky J, Mueller M, Brossart P.Dendritic cell-based câncer immunotherapy targeting MUC-1. Câncer Immu-nol Immunother. 2005 Apr 28). No entanto, devido à ausência de epitopos decélula T auxiliar de antígeno associado a tumor, as vacinas definidas mole-cularmente em geral englobam peptídeos que funcionam somente como Ii-gantes classe I.

Atinge-se o segundo objetivo da presente invenção ao forneceruma preparação farmacêutica, preferentemente sob forma de vacina, eficien-te contra células cancerígenas, em especial células de tumores sólidos, comuma quantidade eficaz de peptídeo de acordo com a invenção, ou com umácido nucléico codificando o referido peptídeo. Além disso, a vacina podeconter peptídeos adicionais e/ou excipientes para ser mais eficiente, comoserá melhor explicado mais adiante.

O peptídeo ou o ácido nucléico que codifica o peptídeo tambémpodem constituir uma vacina contra tumor ou câncer. Ele pode ser aplicadodiretamente no paciente, no órgão afetado ou de forma sistêmica, ou aplica-do ex vivo a células oriundas do paciente ou a uma linhagem de células hu-manas que são posteriormente aplicadas ao paciente, ou usado in vitro paraselecionar uma subpopulação das células imunes do paciente as quais sãoentão novamente aplicadas a ele.

Em um primeiro aspecto da invenção, apresenta-se um peptídeocompreendendo uma seqüência de aminoácidos de acordo com a SEQ IDNo. 1 (SQDDIKGIQKLYGKRS) ou SEQ ID No. 2 (VMAGDIYSV) ou uma desuas variantes, desde que o peptídeo não seja o polipeptídeo humano intac-to do qual se origina a seqüência de aminoácidos (isto é, uma das seqüên-cias completas conforme listadas nas IDs de link de Iocus (vide os númerosde acesso na Tabela 1 abaixo).

Como descrito1 mais adiante, os peptídeos que formam a baseda presente invenção foram todos identificados como sendo apresentadospor células veículos de MHC de classe I ou Il (RCC). Assim, todos estespeptídeos específicos, bem como outros peptídeos contendo a seqüência(isto é, peptídeos derivados) provocam uma resposta específica de célula T,embora o grau de indução da resposta possa variar de peptídeo para peptí-deo. As diferenças, por exemplo, poderiam ser causadas por mutações nosreferidos peptídeos (vide abaixo). O técnico neste assunto conhece bem osmétodos passíveis de serem aplicados para determinar o grau de indução deuma resposta pelo peptídeo individual, em particular com referência aos e-xemplos aqui contidos e à respectiva literatura.

De preferência, um peptídeo de acordo com a presente invençãoconsiste essencialmente em uma seqüência de aminoácidos de acordo coma SEQ ID No 1 ou a SEQ ID No 2 ou uma variante das mesmas.

A expressão "consiste essencialmente em" significa que um pep-tídeo de acordo com a presente invenção, em combinação com a seqüênciade acordo com a SEQ ID No 1 ou a SEQ ID No 11 ou uma variante delas,contém alongamentos complementares de aminoácidos localizados no ter-minal N e/ou no terminal C que não formam necessariamente parte do pep-tídeo que funciona como a seqüência principal do peptídeo compreendendoo motivo de ligação e como epitopo auxiliar T imunogênico.

No entanto, esses alongamentos podem ser importantes parapermitir uma introdução eficiente do peptídeo de acordo com a presente in-venção nas células. Em uma modalidade da presente invenção, o peptídeoda presente invenção compreende os 80 aminoácidos de terminal N da ca-deia invariante HLA-DR associada a antígeno (p33, no "li" a seguir) confor-me derivado do NCBI, número de acesso GenBank X00497 (Strubin, M.,Mach, B. and Long1 E.O. The complete sequence of the mRNA for the HLA-DR-associated invariant chain reveals a polypeptide with an unusual trans-membrane polarity EMBO J. 3 (4), 869-872 (1984)).

Com o termo "variante" da seqüência de aminoácidos em ques-tão, pode-se dizer que as cadeias laterais de, por exemplo, um ou dois dosresíduos de aminoácidos estão alteradas (por exemplo, ao substituí-las pelacadeia lateral de outro resíduo de aminoácido ocorrendo naturalmente oupor outra cadeia lateral) de tal forma que o peptídeo ainda seja capaz de seligar a uma molécula HLA de modo substancialmente igual ao peptídeo for-mado pela seqüência de aminoácidos em questão. Por exemplo, um peptí-deo pode ser modificado de modo a pelo menos manter, se não melhorar,sua capacidade de interagir com e de ligar-se a uma molécula MHC apropri-ada, como a HLA-DRB1 no caso das moléculas HLA de classe II, ou HLA-A2no caso de moléculas de classe I, e de tal modo que pelo menos mantenha,ou melhore, a capacidade de gerar linfócitos T citotóxicos ativados que pos-sam reconhecer e eliminar as células que expressem de maneira anormalum polipeptídeo que contenha uma seqüência de aminoácidos como a defi-nida nos aspectos da invenção, ou a capacidade de estimular as células Tauxiliares que podem ajudar as células T CD8+ ou atacar diretamente célu-las-alvo ao secretarem citoquinas. Como se pode deduzir da base de dadosdescrita a seguir, certas posições de peptídeos que se ligam a HLA-DR sãotipicamente resíduos âncora que formam uma seqüência cerne que se en-caixa no motivo de ligação da fenda de ligação do HLA. Modificações destes.oü de outros resíduos envolvidos na ligação de HLA-DR podem melhorar aligação sem alterar o reconhecimento de linfócitos T citotóxicos.

Os resíduos de aminoácidos que não são essenciais para a inte-ração com o receptor de células T podem ser modificados mediante substitu-ição por outro aminoácido cuja incorporação não gere substancial reativida-de da célula T e não elimine a ligação ao MHC relevante. Assim, indepen-dentemente da ressalva acima, o peptídeo da invenção pode ser qualquerpeptídeo (termo esse em que incluímos os oligopeptídeos ou polipeptídeos)que inclua as seqüências de aminoácidos, uma parte ou uma variante delas,conforme indicado.

É sabido que os peptídeos apresentados por MHC de classe Ilsão compostos por uma "seqüência cerne" que têm um determinado motivoaminoacídico específico para o HLA e, opcionalmente, extensões de terminalN e/ou C que não interferem na função da seqüência cerne (isto é, que se-jam considerados irrelevantes para a interação do peptídeo e da célula T).As extensões de terminal N e/ou C podem ter um comprimento de 1 a 10aminoácidos, respectivamente. Assim, um peptídeo preferencial da presenteinvenção exibe um comprimento total entre 9 e 100 aminoácidos, de prefe-rência entre 9 e 30 aminoácidos e de preferência maior entre 9 e 16 aminoá-cidos. Esses peptídeos podem ser usados tanto diretamente para carregarmoléculas MHC de classe Il como a seqüência pode ser clonada para dentrodos vetores de acordo com a descrição dada mais adiante. Como essespeptídeos formam o produto final do processamento de peptídeos maioresdentro da célula, também é possível utilizar peptídeos mais longos. Os pep-tídeos da invenção podem ser de qualquer tamanho, mas tipicamente po-dem ser de menos de 100.000 Da em peso molecular, de preferência menosde 50.000 Da, com maior preferência menos de 10.000 e, tipicamente, cercade 5.000 Da. Em termos do número de resíduos de aminoácidos, os peptí-deos da invenção podem ter menos de 1000 resíduos, preferentemente me-nos de 500 resíduos, e com maior preferência menos de 100 resíduos.

Em um outro aspecto da presente invenção, semelhante à situa-ção explicada acima a respeito das moléculas MHC de classe II, os peptí-deos da presente invenção podém ser utilizados para provocar uma respostaespecífica de MHC de classe I, já que os peptídeos podem apresentar se-qüências simultâneas de núcleo ou parciais de moléculas HLA de classe I.Um peptídeo específico de MHC de classe I preferencial da presente inven-ção exibe um comprimento total entre 9 e 16 aminoácidos, e de preferênciaentre 9 e 12 aminoácidos. Fica entendido que os peptídeos podem ser usa-dos (por exemplo em uma vacina) como peptídeos mais longos, de modosemelhante aos peptídeos MHC de classe II. Os métodos para identificar"seqüências cerne" específicas de MHC de classe I contendo um determina-do motivo aminoacídico específico para moléculas HLA de classe I são deconhecimento do profissional versado nessa arte e podem ser previstos, porexemplo, pelos softwares PAProC (http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/) eSYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de) (vide abaixo).

Os peptídeos da presente invenção são particularmente úteis emmétodos imunoterápicos para permitir que células T reiconheçam células queexpressem de maneira anormal polipeptídeos que formam a base dos peptí-deos da presente invenção. Uma vez que esses peptídeos específicos queconsistem em determinadas seqüências de aminoácidos se ligam a molécu-las HLA de classe I ou II, prefere-se que os peptídeos da presente invençãosejam peptídeos que se liguem a moléculas HLA de classe I ou HLA declasse Il e quando assim ligados o complexo de peptídeos HLA esteja pre-sente na superfície de célula apropriada apresentando antígeno, seja capazde provocar a estimulação de células T que reconhecem células que expres-sam de maneira anormal um polipeptídeo formado pela seqüência dada deaminoácidos.

Se for utilizado diretamente um peptídeo maior do que aproxi-madamente 12 resíduos de aminoácidos para se ligar a uma molécula MHC,é preferível que os resíduos que flanqueiam a região de ligação do HLA cer-ne sejam do tipo que não afetem substancialmente a capacidade do peptí-deo de se ligar especificamente à fenda de ligação da molécula MHC ou deapresentar o peptídeo para as células T. Contudo, como já indicado acima,perceber-se-á que é possível utilizar peptídeos maiores, especialmente quandocodificados por um polinucleotídeo, já que estes peptídeos maiores podem serfragmentados por células apresentadoras de antígenos apropriadas.

Exemplos de peptídeos de Iigantes de MHC, motivos, variantes,bem como certos exemplos de extensões de terminais N e/ou C podem ser,por exemplo, derivados do banco de dados SYFPEITHI (Rammensee H, Ba-chmann J, Emmerich NP, Bachor OA, Stevanovic S. SYFPEITHI: databasefor MHC Iigands and peptide motifs. Immunogenetics. 1999 Nov; 50(3-4):213-9. Review.) em http://syfpeithi.bmi-heidelberg.com/ e as referênciasali citadas.

Como exemplos não limitantes, certos tipos de peptídeos paraHLA-DR no banco de dados são K H K V YACEVTHQG LSS deriva-dos da cadeia kappa de Ig 188-203 (Kovats et al. Eur J Immunol. 1997 A-pr;27(4): 1014-21); KVQ WKVDNALQS GNS derivados da cadeiakappa de Ig 145-159 (Kovats et al. Eur J Immunol. 1997 Apr;27(4): 1014-21),LPRLI AFTSEHSHF derivados de GAD65 270-283 (Endl et al. J ClinInvest. 1997 May 15;99(10):2405-15) ou F FRMVISNPA A T H Q D I DF L I derivados de GAD65 556-575 (Endl et al. J Clin Invest. 1997 May15;99(10):2405-15). Além disso, os peptídeos podem também derivar-se deseqüências mutadas de antígenos, como no caso de ATGFKQSSKA LQRPVAS derivada da proteína de fusão bcr-abl 210 kD (ten Bosch et al.Blood. 1996 Nov 1;88(9):3522-7), G YKVLVLNPS VAAT derivada deHCV-1 NS3 28-41 (Diepolder et al. J Virol. 1997 Aug;71 (8):6011 -9), ou FRKQNPDIV IQYMDDLYVG derivada de HIV-1 (HXB2) RT 326-345(van der Burg et al. J Immunol. 1999 Jan 1;162(1 ):152-60). Todos aminoáci-dos "âncora" (vide Friede et al., Biochim Biophys Acta. 1996 Jun7;1316(2):85-101; Sette et al. J Immunol. 1993 Sep 15;151(6):3163-70.;Hammer et al. Cell. 1993 Jul 16;74(1):197-203., and Hammer et al. J ExpMed. 1995 May 1 ;181 (5):1847-55). Como os exemplos de HLA-DR4 foramindicados em negrito, as supostas seqüências cerne foram sublinhadas.

O termo "variantes" da seqüência de aminoácidos dada englobatodos os peptídeos descritos acima.

No termo "peptídeo" os inventores incluem não só moléculas nasquais osjesíduos de aminoácidos são unidos por ligações peptídicas (-CO-NH-), mas também moléculas onde a ligação peptídica está invertida. É pos-sível produzir esta peptidomimética retroinversa utilizando métodos conheci-dos no estado da técnica, por exemplo, os métodos descritos em Meziere etal (1997) J. Immunol. 159,3230-3237, incorporados a este documento porreferência. Esta abordagem implica fazer pseudopeptídeos contendo altera-ções relacionadas com o esqueleto e não com a orientação das cadeias late-rais. Meziere et al (1997) mostram que, pelo menos no que refere-se às res-postas de célula T auxiliar e MHC de classe II, esses pseudopeptídeos sãoúteis. Os peptídeos retroinversos contendo ligações NH-CO ao invés de li-gações peptídicas CO-NH são muito mais resistente à proteólise.

Tipicamente, o peptídeo da invenção, se expresso em uma célu-la apresentadora de antígeno, pode ser processado de modo a produzir umfragmento capaz de ligar-se a uma molécula MHC apropriada e pode serapresentado por uma célula adequada e provocar umia resposta da célula Tapropriada. Como poderá ser observado, um fragmento produzido a partir dopeptídeo também pode ser um peptídeo da invenção. Convenientemente, opeptídeo da invenção contém uma fração que inclui a seqüência de aminoá-cidos dada, ou uma parte ou variante desta, e uma porção adicional queconfere propriedades desejáveis. Por exemplo, a porção adicional pode in-cluir outro epitopo de célula T (quer seja derivado ou não do mesmo polipep-tídeo da primeira porção contendo o epitopo de célula T) ou uma proteínaveículo ou peptídeo. Assim, em uma variante da invenção, o peptídeo é umaproteína humana truncada ou uma proteína de fusão de um fragmento deproteína e outra parte polipeptídica, desde que a parte humana inclua umaou mais seqüências de aminoácidos conforme a invenção.

Em uma modalidade particularmente preferida, os peptídeos dainvenção incluem as seqüências de aminoácidos da invenção e pelo menosmais um epitopo de célula T, sendo esse epitopo adicional de célula T capazde facilitar a produção de uma resposta da célula T dirigida ao tipo de tumorque expresse de maneira anormal um antígeno associado ao tumor. Assim,os peptídeos da invenção incluem polipeptídeos do tipo "colar de contas",que também podem ser usados como vacina. Esses peptídeos podem serespaçados por Iigandos químicos que podem conter aminoácidos (como porexemplo alongamentos G), mas que podem compreender - adicionalmenteou alternativamente - grupos de ligação química (ou seja, sem função, exce-to a de proporcionar um espaçamento em particular).

Com o termo "expresso de maneira anormal" os inventores in-cluem o sentido de que o polipeptídeo está superexpresso em comparaçãocom os níveis normais de expressão ou de que o gene está silencioso notecido do qual se deriva o tumor, mas que está expresso no tumor. Por "su-perexpresso" os inventores entendem que o polipeptídeo está presente emnível pelo menos 1,2 χ a mais que o nível apresentado pelo tecido normal;de preferência, pelo menos 2 χ a mais e, com maior preferência, pelo menos5 χ ou 10 χ a mais que o nível presente no tecido normal.

Os peptídeos (ao menos aqueles que contêm ligações peptídi-cas entre resíduos de aminoácidos) podem ser sintetizados pelo métodoFmoc-poliamida de síntese peptídica em fase sólida descrito por Lu et al.(1981) J. Org. Chem. 46, 3433-3436, e referências ali contidas. A proteçãotemporária do grupo N-amino é viabilizada pelo grupo 9-fluorenilmetiloxicar-bonila (Fmoc). A clivagem repetitiva desse grupo protetor altamente instávelem meio básico é alcançada utilizando-se piperidina a 20% em N, N-dimetilformamida. As funcionalidades da cadeia lateral podem ser protegidascomo os seus éteres butílicos (no caso de serina treonina e tirosina), ésteresbutílicos (no caso de ácido glutâmico e ácido aspártico), derivado de butiloxi-carbonila (no caso de Iisina e histidina), derivado de tritila (no caso de cisteí-na) e derivado de 4-metóxi-2,3,6-trimetilbenzenossulfonila (no caso de argi-nina). Onde a glutamina ou a asparagina forem resíduos de terminal C, utili-za-se o grupo 4,4'-dimetoxibenzidrila para proteger as funcionalidades doamido da cadeia lateral. O suporte de fase sólida se baseia em um polímeropolidimetil-acrilamida formado pelos três monômeros dimetilacrilamida (mo-nômero da cadeia principal), bisacriloiletileno diamina (agente reticulante) eacriloilsarcosina metil éster (agente funcionalizante). O agente reticulanteclivável peptídeo-resina utilizado é o derivado de ácido 4-hidroximetil-fenoxiacético, instável em meio ácido. Todos os derivados de aminoácidosão adicionados na forma dos seus derivados anidridos simétricos pré-formados, exceto a asparagina e a glutamina, que são adicionadas utilizandoum procedimento de acoplamento reverso mediado por N, N-diciclohexil-carbodiimida/lhidroxibenzotriazola. Todas as reações de acoplamento edesproteção são monitoradas utilizando os procedimentos de teste ninidrina,ácido trinitrobenzeno sulfônico ou isotina. Ao concluir a síntese, os peptídeossão clivados do suporte de resina com remoção concomitante dos gruposprotetores da cadeia lateral mediante tratamento com ácido trifluoracético a95% contendo uma mistura de agente depurador a 50%. Os depuradorescomumente usados são etanoditiol, fenol, anisol e água, sendo que a esco-lha exata depende dos aminoácidos que constituem o peptídeo que estásendo sintetizado.

O ácido trifluoracético é removido por evaporação em vácuo,com subseqüente trituração com éter dietílico, produzjndo o peptídeo bruto.Todos os agentes depuradores presentes são removidos através de um sim-ples procedimento de extração que, na liofilização da fase aquosa, produz opeptídeo bruto livre de depuradores. Os reagentes para a síntese peptídicasão fornecidos, geralmente, pela empresa Calbiochem-Novabiochem (RU)Ltd, Nottingham NG7 2QJ, Reino Unido.

A purificação pode ser feita por qualquer técnica ou combinaçãode técnicas, tais como cromatografia por exclusão de tamanho, cromatogra-fia de troca de íons e, normalmente, cromatografia líquida de alto desempe-nho de fase reversa.

A análise dos peptídeos pode ser feita utilizando-se cromatogra-fia de camada fina, cromatografia líquida de alto desempenho de fase rever-sa, análise de aminoácido posterior a hidrólise ácida, espectrometria demassa por bombardeio de átomos rápidos (FAB), bem como por espectro-metria de massa MALDI e ESI-Q-TOF.

Outro aspecto da invenção apresenta um ácido nucléico (porexemplo, um polinucleotídeo) que codifica o peptídeo da invenção. O ácidonucléico de acordo com a presente invenção pod,e ser DNA, cDNA, PNA,CNA, RNA ou combinações destes, podendo conter ou não íntrons, contantoque codifique o peptídeo. Naturalmente, apenas os peptídeos contendo resí-duos de aminoácidos de ocorrência natural, unidos pelas ligações peptídicastambém de ocorrência natural, podem ser codificados por um polinucleotí-deo. Ainda outro aspecto da invenção apresenta um vetor de expressão ca-paz de expressar um polipeptídeo de acordo com a invenção.

Foi desenvolvida uma série de métodos para ligar funcionalmen-te os polinucleotídeos, especialmente o DNA, aos vetores, por exemplo viaterminais coesivos complementares. Por exemplo, é possível juntar trechoshomopoliméricos ao segmento do DNA a ser inserido no DNA do vetor. Pos-teriormente, o vetor e o segmento de DNA são unidos por ligações de hidro-gênio entre as caudas homopoliméricas para formar moléculas de DNA re-combinante.

Os ligantes sintéticos que contêm um ou mais sítios de restriçãooferecem um método alternativo para unir o segmento de DNA aos vetores.O segmento de DNA gerado por digestão de endonuclease de restrição,conforme descrito anteriormente, é tratado com DNA Polimerase do bacte-riófago T4 ou DNA polimerase I da E. coli, enzimas que removem os termi-nais proeminentes de cadeias simples de 3' com as suas atividades exonu-cleolíticas de 3'-5' e preenchem extremidades de 3' com as suas atividadespolimerizadoras.

Portanto, a combinação dessas atividades gera segmentos deDNA de extremidades truncadas. Os segmentos de extremidades truncadassão então incubados com um grande excedente molar de moléculas de liga-ção na presença de enzima capaz de catalizar a ligação de moléculas deDNA de extremidades truncadas, tais como DNA Iigase de bacteriófago T4.Assim, os produtos da reação são segmentos de DNA com seqüências deligantes poliméricos em suas extremidades. Esses segmentos de DNA sãoentão clivados com a enzima de restrição apropriada e ligados a um vetor deexpressão que tenha sido clivado com uma enzima produtora de terminaiscompatíveis com aqueles do segmento de DNA.

Os ligantes sintéticos contendo uma série de sítios de endonu-clease de restriçãq podem ser adquiridos de diversos fornecedores, inclusiveda International Biotechnologies Inc., New Haven, CN1 EUA.

Uma forma desejável de modificar o DNA que codifica o polipep-tídeo da presente invenção é usar a reação em cadeia da polimerase, comoproposto por Saiki et al. (1988) Science 239,487-491. Esse método pode serusado para introduzir o DNA em um vetor apropriado, por exemplo, atravésde técnicas de engenharia genética em sítios de restrição apropriados, oupara modificar o DNA de outras formas proveitosas conhecidas no estado datécnica. Nesse método, o DNA, para ser amplificado enzimaticamente, éflanqueado por dois iniciadores específicos que são incorporados ao DNAamplificado. Os referidos iniciadores específicos podem conter sítios de reco-nhecimento de endonuclease de restrição utilizáveis para clonagem de vetoresde expressão por meio de métodos conhecidos no estado da técnica.

O DNA (ou, no caso dos vetores retrovirais, o RNA) é então ex-presso em um hospedeiro adequado para produzir urri polipeptídeo que en-globe o composto da invenção. Assim, o DNA que codifica o polipeptídeoconstitutivo do composto da invenção pode ser usado de acordo com as téc-nicas conhecidas e modificado de maneira apropriada à luz dos ensinamen-tos contidos na presente descrição para formar um vetor de expressão queposteriormente será utilizado para transformar uma célula hospedeira apro-priada para a expressão e produção do polipeptídeo da invenção. Essastécnicas incluem as descritas nas patentes dos Estados Unidos de números4.440.859 concedida em 3 de abril de 1984 a Rutter et al., 4.530.901 conce-dida em 23 de julho de 1985 a Weissman, 4.582.800 concedida em 15 deabril de 1986 a Crowl, 4.677.063 concedida em 30 de junho de 1987 a Market al., 4.678.751 concedida em 7 de julho de 1987 a Goeddel, 4.704.362concedida em 3 de novembro de 1987 a Itakura et al., 4.710.463 concedidaem 1 de dezembro de 1987 a Murray, 4.757.006 concedida em 12 de julhode 1988 a Toole, Jr. et al., 4.766.075 concedida em 23 de agosto de 1988 aGoeddel et al., e 4.810.648 concedida em 7 de março de 1989 a Stalker1todas elas passando a fazer parte do presente documento por referência.

O DNA (ou, no caso dos vetores retrovirais, o RNA) que codificaQ- polipeptídeo constitutivo do composto da invenção pode ser associado auma grande variedade de outras seqüências de DNA para a introdução emum hospedeiro apropriado. O DNA associado dependerá da natureza dohospedeiro, da maneira como o DNA é introduzido no hospedeiro e de se oobjetivo em vista é a permanência ou a integração epissomal.

Em geral, o DNA é inserido em um vetor de expressão, comopor exemplo um plasmídio, na orientação correta e dentro da estrutura certapara a expressão. Se necessário, o DNA pode ser ligado às seqüências nu-cleotídicas de controle regulatório transcricional e translacional apropriadas,reconhecidas pelo hospedeiro desejado, embora esses controles estejamgeralmente disponíveis no vetor de expressão. Depois, o vetor é introduzidono hospedeiro por meio de técnicas-padrão. Em geral, nem todos os hospe-deiros serão transformados pelo vetor. Portanto, será necessário selecionarcélulas hospedeiras transformadas. Uma técnica de seleção consiste emincorporar uma seqüência de DNA no vetor de expressão, com todos os e-Iementos de controle necessários, seqüência esta que codifique uma carac-terística selecionável na célula transformada, como por exemplo a resistên-cia a antibióticos.

Alternativamente, o gene para esta característica selecionávelpode estar em outro vetor, usado para conjuntamente transformar a célulahospedeira desejada.

Depois, as células hospedeiras transformadas pelo DNA recom-binante da invenção são cultivadas por tempo suficiente sob condições a-propriadas conhecidas dos especialistas, à luz dos ensinamentos aqui des-critos, para permitir a expressão do polipeptídeo, que poderá, então, ser re-cuperado.

São conhecidos muitos sistemas de expressão, inclusive bacté-rias (por exemplo E. colie Bacillus subtilis), leveduras (por exemplo Saccha-romyces cerevisiaé), fungos filamentosos (por exemplo, Aspergillus), célulasde plantas, de animais e de insetos. De preferência, o sistema pode ser decélulas de RCC ou Awells.

Um promotor é um elemento de controle de expressão formado ,.por uma seqüência de DNA que permite haver a ligação do RNA- polimerasee a transcrição. As seqüências promotoras compatíveis com hospedeirosbacterianos exemplares são apresentadas normalmente nos vetores plasmí-dicos que contenham sítios convenientes de restrição para a inserção de umsegmento de DNA da presente invenção. Os vetores plasmídicos procarióti-cos característicos são pUC18, pUC19, pBR322 e pBR329, comercializadospor Biorad Laboratories (Richmond, CA1 EUA), bem como pTrc99A epKK223-3, comercializados por Pharmacia, Piscataway, NJ, EUA.Um plasmídio vetor de célula de mamífero é o pSVL, comerciali-zado por Pharmacia, Piscataway, NJ1 EUA. Esse vetor usa o promotor tardioSV40 para dirigir a expressão de genes clonados, sendo o nível máximo deexpressão encontrado em células produtoras de antígeno T1 como por e-xemplo as células COS-1. Um exemplo de vetor de expressão induzível demamífero é o pMSG, também fornecido por Pharmacia. Esse vetor utiliza opromotor induzível por glicocorticóide do vírus de longo terminal repetido dotumor mamário de camundongos para dirigir a expressão do gene clonado.

Os plasmídios vetores de levedura úteis são pRS403-406 e pRS413-416,que podem geralmente ser obtidos da Stratagene Cloning Systems, La Jolla,CA 92037, EUA. Os plasmídios pRS403, pRS404, pRS405 e pRS406 sãoplasmídios integradores de leveduras (YIps) e incorporam os marcadoresselecionáveis de levedura HIS3, TRP1, LEU2 e URA3. Os plasmídiospRS413-416 são plasmídios centrômeros de levedura (Ycps). Outros vetorese sistemas de expressão são conhecidos no estado da técnica para uso comsérie de células hospedeiras.

A presente invenção também refere-se a uma célula hospedeiratransformada com uma variante de polinucleotídeo vetor da presente inven-ção. A célula hospedeira pode ser procariótica ou eucariótica. As célulasbacterianas podem ser células hospedeiras procarióticas preferidas em al-gumas circunstâncias e, normalmente, são uma cepa de E. coli, tais como,por exemplo, a cepa DH5 de E. coli, que pode ser obtida dos Bethesda Re-search Laboratories Inc., Bethesda, MD, EUA, e RR1, da American TypeCulture Collection (ATCC) e Rockville1 MD, EUA (No ATCC 31343). Entre ascélulas hospedeiras eucarióticas preferidas estão as células de levedura, deinsetos e de mamíferos, de preferência células de vertebrados, como ca-mundongos, ratos, macacos, ou linhagens de células renais e fibroblásticashumanas. Entre as células hospedeiras de levedura estão YPH499, YPH500e YPH501, que podem ser obtidas da Stratagene Cloning Systems, La Jolla,CA YPH501, EUA. Entre as células hospedeiras preferidas de mamíferosestão células de ovário de hamster chinês (CHO), obteníveis da coleçãoATCC sob referência CCL61, células de embrião de camundongo suíçoΝΙΗ/3Τ3, obteníveis da ATCC sob referência CRL 1658, células COS-1 deri-vadas de rins de macaco, obteníveis da ATCC sob referência CRL 1650, ecélulas 293, que são células renais embrionárias de seres humanos. As cé-lulas de insetos preferidas são as células Sf9, que podem ser transfectadascom vetores de expressão de baculovírus.

A transformação de células hospedeiras apropriadas com umaconstrução de DNA da presente invenção é obtida por métodos bem-conhecidos que normalmente dependem do tipo de vetor utilizado. Com re-lação à transformação das células hospedeiras procarióticas, vide, por e-xemplo, Cohen et al. (1972) Proc.Natl. Acad. Sei. USA 69.2110 e Sambrooket al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor, NY. A transformação de células de leveduraé descrita em Sherman et al. (1986) Methods In Yeast Genetics, A Labora-tory Manual, Cold Spring Harbor, NY. O método de Beggs (1978) Nature275,104-109 também é útil. Com relação às células de vertebrados, reagen-tes úteis para a transfecção dessas células, por exemplo, fosfato de cálcio eDEAE-dextrana ou formulações lipossomais, podem ser obtidas da Strata-gene Cloning Systems ou da Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD20877, EUA. A electroporação também é útil para transformar e/ou transfec-tar células e é bem-conhecida no estado da técnica para transformar célulasde levedura, de bactérias, de insetos e de vertebrados.

As células transformadas com sucesso, isto é, células que con-têm uma construção de DNA da presente invenção, podem ser identificadasutilizando técnicas bem-conhecidas. Por exemplo, as células resultantes daintrodução de uma construção de expressão da presente invenção pode sercultivada para produzir o polipeptídeo da invenção. As células podem sercolhidas e Iisadas e o seu conteúdo de DNA pode ser examinado quanto àpresença do DNA utilizando um método como o descrito por Southern (1075)J.Mol. Biol. 98.503 ou Berent et al. (1985) Biotech. 3,208. Alternativamente,é possível detectar a presença da proteína no sobrenadante utilizando anti-corpos, conforme descrito abaixo.

Além do exame direto para detectar a presença do DNA recom-binante, é possível confirmar a transformação bem-sucedida por meio demétodos imunológicos conhecidos, nos casos em que o DNA recombinanteé capaz de dirigir a expressão da proteína. Por exemplo, as células trans-formadas com sucesso com um vetor de expressão produzem proteínas queapresentam antigenicidade adequada. As amostras de células tidas comoprovavelmente transformadas são colhidas e examinadas quanto à presençada proteína utilizando anticorpos apropriados. Assim, ^lém das próprias célu-las hospedeiras transformadas, a presente invenção também contempla acultura dessas células, de preferência uma cultura monoclonal (com homo-geneidade clonal), uma cultura derivada de uma cultura monoclonal, emmeio nutriente.

Observar-se-á que certas células hospedeiras da invenção sãoúteis na preparação dos peptídeos da invenção, por exemplo, as células debactérias, leveduras e insetos. No entanto, outras células hospedeiras po-dem ser úteis em certos métodos terapêuticos. Por exemplo, as células a -presentadoras de antígenos, tais como as células dendríticas, podem serusadas com proveito para expressar os peptídeos da invenção de modo apoderem ser carregados em moléculas MHC apropriadas.

As células hospedeiras preferenciais são as células de RCC ouas células Awells. Dá-se preferência a um método de produzir um peptídeoassociado a tumor de acordo com a presente invenção, compreendendo es-se método a cultura da célula hospedeira de acordo com a presente inven-ção e isolando o peptídeo da célula hospedeira ou de seu meio de cultivo, deacordo com os métodos-padrão.

Outro aspecto da invenção apresenta um método de produçãode peptídeo para uso oral, retal, nasal ou lingual, injeção intravenosa (i.v.),subcutânea (s.c.), intradérmica (i.d.), intraperitoneal (i.p.) e intramuscular(i.m.). As vias preferidas para a injeção do peptídeo são as injeções s.c., i.d.,i.p., i.m. e i.v. As vias preferidas para a injeção do DNA são as injeções i.d.,i.m., s.c., i.p. e i.v. Podem-se administrar doses entre 1 e 500 mg do peptí-deo ou do DNA, conforme descrito mais adiante.

Outro aspecto da invenção refere-se ao uso na medicina de umpeptídeo associado a tumor de acordo com a invenção, um ácido nucléicode acordo com a invenção ou um vetor de expressão de acordo com a in-venção.

O objetivo da presente invenção, sob outro aspecto da mesma, ésolucionado por um composto farmacêutico que contenha no mínimo umpeptídeo associado a tumor de acordo com a SEQ ID N°. 1 ou a SEQ ID No.2 segundo esta invenção, um ácido nucléico de acordo com a invenção ouum vetor de expressão de acordo com a invenção, bem como um veículofarmaceuticamente aceitável. O composto é usado para administração pa-renteral, como por exemplo por via subcutânea, intradérmica, intravenosa ouintramuscular, ou administração oral. Para isso, os peptídeos são dissolvidosou suspensos em um veículo farmaceuticamente aceitável, de preferênciaum veículo aquoso. Além disso, o composto pode conter excipientes comotampões, agentes ligantes, agentes desintegrantes, diluentes, flavorizantes,lubrificantes, etc. Os peptídeos podem também ser administrados juntamen-te com substâncias imunoestimulantes como, por exemplo, as citoquinas.Uma relação completa de excipientes utilizáveis nessa composição pode serconsultada, por exemplo, em A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipi-ents, 3. Ed., 2000, American Pharmacèutical Association and pharmaceuticalpress. A composição pode ser usada para a prevenção, profilaxia e/ou tera-pia de doenças adenomatosas ou cancerígenas.

A preparação farmacêutica contendo pelo menos um dos peptí-deos da presente invenção, englobando a SEQ ID No 1 e/ou SEQ ID No 2,um ácido nucléico de acordo com a invenção ou um vetor de expressão se-gundo esta invenção, é administrada a um paciente com doença adenoma-tosa ou cancerígena associada ao respectivo peptídeo ou antígeno. Dessaforma, é possível provocar uma resposta imune mediada por célula Τ. Ocomposto farmacêutico de acordo com a presente invenção preferencial-mente engloba ainda ao menos mais um peptídeo associado a tumor englo-bando uma das seqüências entre SEQ ID No. 3 e SEQ ID No. 10, um ácidonucléico correspondente ou um vetor de expressão correspondente.

Em geral, os peptídeos presentes no composto farmacêutico deacordo com a invenção têm as mesmas propriedades descritas acima paraos peptídeos da presente invenção englobando a SEQ ID N°. 1 e/ou a SEQID N°. 2. Assim, eles apresentam um comprimento total entre 9 e 100, depreferência entre 9 e 30, e com maior preferência ainda entre 9 e 16 amino-ácidos. Além disso, ao menos um peptídeo de acordo com qualquer umadas seqüências entre a SEQ ID No. 1 e a SEQ ID No. 11 pode incluir liga-ções não peptídicas. Além disso, os respectivos átiidos nucléicos podemcodificar entre 9 e 100, de preferência entre 9 e 30 e com maior preferênciaainda, entre 9 e 16 aminoácidos.

Dá-se preferência a um composto farmacêutico de acordo com ainvenção que englobe peptídeos (em especial, associados a tumores), con-sistindo em seqüências de aminoácidos de acordo com a SEQ ID No. 1 e/ouSEQ ID No. 2 e entre as seqüências SEQ ID No. 3 a SEQ ID No. 11.

Dá-se preferência a um composto farmacêutico de acordo com ainvenção, onde a quantidade de peptídeo(s) (em particular, associado(s) atumor), de ácido(s) nucléico(s) de acordo com a invenção ou vetor(es) deexpressão de acordo com a invenção conforme presente em dito compostoque seja(m) específico(s) ao tecido, câncer e/ou paciente.

O peptídeo pode também ser marcado ou ser uma proteína defusão ou uma molécula híbrida.

O peptídeo pode ser substancialmente puro, ou combinado comum adjuvante imunoestimulante, ou usado em combinação com as citoqui-nas imunoestimulantes, ou ser administrado com um sistema de administra-ção adequado, por exemplo lipossomas. Outros adjuvantes adequados sãoQS21 stimulon (Aquila Biotech, Worcester, MA, EUA), derivada da saponina,extratos micobacterianos e imitadores sintéticos da parede celular bacteria-na, e adjuvantes de marca como por exemplo Ribi1S Detox. Também se podeutilizar o Quil A, outro adjuvante derivado da saponina (Superfos, Denmark).Outros adjuvantes, como por exemplo o da Freund, também podem ser Ci-teis. O peptídeo também pode ser conjugado a um veículo adequado, talcomo a hemocianina do molusco Key Iimpet (KLH) ou manana (vide WO95/18145 e Longenecker et at (1993) Ann. NY Acad. Sei. 690,276-291). Umavez que a definição de adjuvante no dicionário médico da MedlinePIus®,NIH, é toda substância que aumenta a resposta imune do antígeno, outrassubstâncias com essa função também podem ser usadas, inclusive - massem se limitar a eles - agonistas de receptores do tipo "toll" (agonistas TLR),preferencialmente substâncias que interagem de forma antagonista com oTLR 3, 7, 8 e 9, com maior preferência ainda com o TLR 9, como por exem-plo o RNA estabilizador de protamina, oligonucleotídeos CpG1 oligonucleotí-deos CpR, DNA de bactérias, imidazoquinolinas, etc.

Outras substâncias conhecidas no estado da técnica de seremcapazes de aumentar a resposta imune incluem - sem se restringirem a elesos inibidores da oxido nítrico sintase induzível (iNOS), arginase (ARG1),indoleamina-2,3-dioxigenase (IDO), receptor 1 de fator de crescimento endo-telial vascular (VEGFR-1), fator de crescimento endotelial vascular (VEGFF),ciclooxigenase-2 (COX-2), receptor I TGF-beta (TGF-beta-RI). Esses inibido-res podem, por exemplo, ser anticorpos monoclonais contra as ditas molécu-las ou pequenas moléculas. As pequenas moléculas e anticorpos monoclo-nais sabidos do estado da técnica por exercerem uma função inibidora emrelação aos fatores antes mencionados e, portanto, um efeito de aumento deresposta imune são, por exemplo: 1-MT, NCX-4016, rofecoxib, celebrex,BEC, ABH, nor-NOHA, SB-505124, SD-208, LY580276, AMD3100, axitinib,bevacizumab, JSI-124, CPA-7, XL-999, ZD2171, pazopanib, CP-547632, eVEGF Trap.

Da mesma forma, substâncias que reduzem a quantidade decélulas T reguladoras (CD4+, CD25+, FoxP3+) também são adequadas co-mo adjuvantes. Aqui se incluem, mas não se restringem a elas, as seguintessubstâncias: ciclofosfamida (Cytoxan), ONTAK (denileucina diftitox), Sunitinib,anti-CTLA-4 (MDX-010, CP-675206), anti-CD25, anti-CCL22 e anti-GITR.

Em outra modalidade preferencial, a vacina é uma vacina de á-cido nucléico. É sabido que a inoculação com uma vacina de ácido nucléico,como uma vacina DNA, que codifica um polipeptídeo provoca uma respostadas células T. Pode ser aplicada diretamente no paciente, no órgão afetadoou de forma sistêmica, ou aplicada ex vivo em células derivadas do pacienteou em uma linhagem de células humanas que, posteriormente, são adminis-tradas ao paciente, ou pode ainda ser usada in vitro para selecionar umasubpopulação a partir de células imunes derivadas do paciente que são de-pois novamente administradas ao paciente. Se o ácido nucléico for adminis-trado a células in vitro, pode ser conveniente transfectar as células de formaque co-expressem as citoquinas imunoestimulantes, tais como a interleuci-na-2 ou GM-CSF.

A vacina de ácido nucléico pode também ser administrada comum adjuvante como por exemplo BCG ou alume. No entanto, é preferívelque a vacina de ácido nucléico seja administrada sem adjuvante.

O polinucleotídeo pode ser puro ou ser combinado com vetor ousistema de administração apropriados. Entre os vetores e sistemas de admi-nistração apropriados estão os de tipo viral, baseados no adenovírus, vírusda vaccinia, retrovírus, vírus da herpes, vírus adeno-associado ou híbridocontendo elementos de mais de um vírus. Os sistemas de administração nãovirais incluem lipídios catiônicos e polímeros catiônicos e são bem-conhecidos no estado da técnica da administração de DNA. Também é pos-sível recorrer à administração física, por exemplo, por meio de "canhão degenes". O peptídeo ou o peptídeo codificado pelo ácido nucléico pode seruma proteína de fusão, por exemplo, com um epitopo de toxóide de tétanoque estimule as células T CD4+.

Assim, convenientemente, todo ácido nucléico administrado aopaciente é estéril e livre de pirogênios. O DNA nu pode ser administrado porvia intramuscular, intradérmica ou subcutânea. Os peptídeos podem ser ad-ministrados por via intramuscular, intradérmica ou subcutânea.

Assim, convenientemente, a vacina de ácido nucléico pode en-globar qualquer meio apropriado de administração de ácido nucléico. O áci-do nucléico, de preferência DNA, pode estar nu, isto é, praticamente semqualquer outro componente a ser administrado) ou pode ser administradoem um Iipossoma ou como parte integrante de um sistema de administraçãode vetores virais.

Acredita-se que a absorção do ácido nucléico e a expressão dopolipeptídeo codificado pelas células dendríticas. podem ser o mecanismo depriming da resposta imune; no entanto, as células dendríticas podem nãoestar transfectadas, mas permanecem importantes, porque podem captar opeptídeo expressado das células transfectadas no tecido, ("cross-priming",e.g., Thomas AM, Santarsiero LM, Lutz ER, Armstrong TD, Chen YC, HuangLQ, Laheru DA, Goggins M, Hruban RH, Jaffee EM. Mesothelin-specificCD8(+) T-cell responses provide evidence of in vivo cross-priming by anti-gen-presenting cells in vaccinated pancreatic câncer patients. J Exp Med.2004 Aug 2;200(3):297-306).

É preferível que a vacina de ácido nucléico, como, por exemplo,a vacina de DNA, seja administrada no músculo, enquanto que as vacinaspeptídicas são aplicadas preferencialmente na forma subcutânea ou intra-dérmica. Também é preferido que a vacina seja administrada na pele. A va-cina de ácido nucléico pode ser administrada sem adjuvante. A vacina deácido nucléico pode também ser administrada com um adjuvante, como porexemplo BCG ou alume. Outros adjuvantes adequados são o QS21 stimulon(Aquila Biotech, Worcester1 MA, EUA), derivado da saponina, extratos mico-bacterianos e imitadores sintéticos da parede celular bacteriana, e adjuvan-tes de marca como por exemplo o Detox de Ribi. Também se pode utilizar oQuil A, outro adjuvante derivado da saponina (Superfos, Denmark). De pre-ferência, a vacina de ácido nucléico é administrada sem adjuvante. Outrosadjuvantes, como por exemplo o da Freund, também podem ser úteis. Tam-bém pode ser conveniente administrar o peptídeo conjugado com hemocia-nina do molusco Key hole Iimpet (KLH), de preferência também com um ad-juvante.

A imunoterapia do câncer mediada por polinucleotídeo é descritaem Conry et al. (1996) Seminars in Oncology 23,135-147; Condon et al.(1996) Nature Medicine 2,1122-1127; Gong et al. (1997) Nature Medicine3,558-561; Zhai et al. (1996) J. Immunol. 156,700-710; Graham et al. (1996)Int J. Câncer 65,664-670; and Burchell et al. (1996) pp 309-313 In: BreastCâncer, Advances in biology and therapeutics, Calvo et al. (eds), John Lib-bey Eurotext, todas aqui incorpadas como referência em sua plenitude.Também pode ser útil concentrar a vacina para populações celu-lares específicas, por exemplo, células apresentadoras de antígenos, querseja pelo sítio da injeção, pela utilização de vetores e sistemas de adminis-tração concentradores, quer seja pela purificação seletiva de tal populaçãode células do paciente e administração ex vivo do peptídeo ou do ácido nu-cléico (por exemplo, células dendríticas podem ser selecionadas, conforme adescrição apresentada em Zhou et al. (1995) Blood 86,3295-3301; Roth etal. (1996) Scand. J. Immunology 43,646-651). Por exemplo, os vetores con-centradores podem compreender um promotor específico do tecido ou dotumor que oriente a expressão do antígeno em um local apropriado.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um composto farma-cêutico que contém um ou mais dos referidos peptídeos de acordo com ainvenção. A composição é usada para administração parenteral, como porexemplo por via subcutânea, intradérmica ou intramuscular ou para adminis-tração oral. Para isso, os peptídeos são dissolvidos ou suspensos em veícu-lo em forma farmacêutica aceitável, de preferência em forma aquosa. Alémdisso, o composto pode conter excipientes como tampões, agentes ligantes,agentes desintegrantes, diluentes, flavorizantes, lubrificantes etc. Os peptí-deos também podem ser administrados juntamente com substâncias imuno-estimulantes tais como as citoquinas. Uma relação completa de excipientesutilizáveis nessa composição pode ser obtida, por exemplo, de A. Kibbe,Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3- ed., 2000, da American Pharma-ceutical Association e da imprensa farmacêutica. A composição pode serusada para a prevenção, profilaxia e/ou terapia de doenças adenomatosasou cancerígenas.

A preparação farmacêutica contendo pelo menos um dos peptí-deos da presente invenção, compreendendo as seqüências SEQ ID No 1e/ou SEQ ID No 2, é administrada a paciente de doença adenomatosa oucancerígena associada ao respectivo peptídeo ou antígeno. Desta forma épossível provocar uma resposta imune específica ao linfócito T citotóxico.

Em outro aspecto da presente invenção, é possível utilizar umacombinação de dois ou mais peptídeos de acordo com a presente invençãosob forma de vacina, tanto em combinação direta como dentro do mesmoregime de tratamento. Além disso, é possível utilizar combinações com ou-tros peptídeos, por exemplo, peptídeos específicos de MHC de classe I ou II.O profissional versado saberá selecionar as combinações preferenciais depeptídeos imunogênicos ao testar, por exemplo, a geração de células T invitro, bem como sua eficiência e presença total, a proliferação, afinidade eexpansão de certas células T para certos peptídeos, e a funcionalidade dascélulas T, por exemplo ao analisar a produção de IFN-γ (vide também exem-plos mais adiante). Normalmente, os peptídeos mais eficientes são entãocombinados sob forma de vacina para os fins acima descritos.

Uma vacina apropriada conterá preferencialmente entre 1 a 20peptídeos, com maior preferência 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 peptídeosdiferentes, com mais preferência ainda 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 peptídeos diferen-tes, e com maior preferência ainda 11 peptídeos diferentes. O comprimentodo peptídeo para uso em vacina anticâncer pode ser qualquer peptídeo a-propriado. Em particular, pode ser um peptídeo adequado de 9-mer ou umpeptídeo adequado de 7-mer ou 8-mer ou 10-mer ou 11-mer ou 12-mer.Peptídios mais longos também podem ser apropriados, mas dá-se preferên-cia aos peptídeos de 9-mer ou 10-mer, conforme descrito na Tabela 1 ane-xa, para peptídeos MHC de classe I.

O(s) peptídeo(s) constitue(m) uma vacina antitumor ou anticân-cer. Pode ser aplicada diretamente no paciente, no órgão afetado ou de for-ma sistêmica, ou aplicada ex vivo em células derivadas do paciente ou li-nhagem de células humanas que são posteriormente administradas ao paci-ente, ou pode ainda ser usada in vitro para selecionar uma subpopulação apartir de células imunes derivadas do paciente as quais são então novamen-te administradas ao paciente. O peptídeo também pode ser conjugado a umveículo adequado, tal como a hemocianina KLH (do molusco Key Iimpet (K-LH)) ou manana (vide WO 95/18145 e Longenecker e at (1993) Ann. NY A-cad. Sei. 690,276-291). A vacina de peptídeo pode ser administrada semadjuvante. A vacina de peptídeo também pode ser administrada com adju-vante, como por exemplo BCG ou alume. Outros adjuvantes adequados sãoo QS21 stimulon (Aquila Biotech, Worcester, MA, EUA), derivado da saponi-na, extratos micobacterianos e imitadores sintéticos da parede celular bacte-riana, e adjuvantes de marca como por exemplo o Detox de Ribi. Tambémse pode utilizar o Quil A, outro adjuvante derivado da saponina (Superfos,Denmark). Outros adjuvantes, como por exemplo o da Freund, também po-dem ser úteis. Também pode ser conveniente administrar o peptídeo conju-gado com hemocianina do molusco keyhole Iimpet (Mègathura crenulata), depreferência também com um adjuvante. Outros adjuvantes, como os men-cionados acima, também podem ser usados. O peptídeo pode também sermarcado, ser uma proteína de fusão ou uma molécula híbrida. Espera-seque os peptídeos cujas seqüências são dadas na presente invenção estimu-lem os linfócitos T citotóxicos CD8+. No entanto, a estimulação é mais efici-ente quando houver ajuda de células T CD4+. Assim, o parceiro de fusão ouas secções de uma molécula híbrida apropriada produzem epitopos que es-timulam as células T CD4+. Os epitopos que estimulam as CD4+ são bem-conhecidos no estado da técnica, e incluem aqueles identificados no toxóidetetânico.

Em uma variante particularmente preferencial da vacina peptídi-ca de acordo com a invenção, ela é uma vacina antitumoral multipeptídicapara o tratamento de carcinoma de células renais, Preferencialmente, a refe-rida vacina compreende um conjunto de peptídeos associados a tumor deacordo com as SEQ ID No. 1 a 10, localizadas e identificadas em célulasprimárias de câncer renal. Esse conjunto inclui peptídeos HLA de classe I eclasse II. O conjunto de peptídeos também pode conter ao menos um peptí-deo, como por exemplo do antígeno do cerne do HBV, usado como peptídeode controle positivo e atuando como marcador imunológico para testar a efi-ciência da administração intradérmica. Em uma variante em particular, a va-cina consiste em 11 peptídeos individuais (de acordo com as SEQ ID No. 1 a11) com cerca de 1500 pg a 750 pg, de preferência entre aproximadamente100pg a aproximadamente 750 pg, com mais preferência ainda entre a-proximadamente 500 pg a aproximadamente 600 pg, e com preferência má-xima com cerca de 578 pg de cada peptídeo, todos eles purificados por H-PLC e cromatografia de troca de íons e tem aparência de cor entre branco eesbranquiçado. O produto liofilizado é dissolvido preferencialmente em hi-drogeno carbonato de sódio e é usado em injeção intradérmica dentro de 30min após reconstituição em temperatura ambiente. De acordo com a presen-te invenção, as quantidades preferenciais de peptídeos podem variar entreaproximadamente 0,1 e 100 mg, de preferência entre aproximadamente 0,1e 1 mg, e com maior preferência ainda entre aproximadamente 300 pg e800 pg por 500 μl de solução. No presente documento, o termo "aproxima-damente" significa +/- 10 por cento do referido valor, exceto onde menciona-do de forma diferente. O profissional versado saberá ajustar a quantidadeeficaz de peptídeo a ser usada com base em diversos fatores, tais como, porexemplo, a situação imunológica do paciente individual e/ou a quantidade deTUMAP presente em um tipo de câncer em particular. Os peptídeos da pre-sente invenção podem ser fornecidos em outras formas apropriadas (solu-ções estéreis, etc.) ao invés de liofilizado.

Espera-se que os peptídeos cujas seqüências são dadas napresente invenção estimulem as células T CD8+. No entanto, a estimulaçãoé mais eficiente quando houver ajuda de células T CD4+. Assim, o parceirode fusão ou as secções de uma molécula híbrida apropriada produzem epi-topos que estimulam as células T CD4+. Os epitopos que estimulam asCD4+ são bem-conhecidos no estado da técnica e incluem aqueles identifi-cados no toxóide tetânico ou peptídeo de MMP7 fornecido pela presente in-venção.

Por fim, a vacina de acordo com esta invenção pode ser depen-dente do tipq específico dê câncer de que o paciente a ser tratado está aco-metido, bem como do estado da doença, dos regimes de tratamento anterio-res, do estado imune do paciente e, naturalmente, do haplótipo HLA do pa-ciente. Além disso, a vacina de acordo com a invenção pode conter compo-nentes individualizados, segundo necessidades pessoais do paciente emparticular. Exemplo disso são as diferentes quantidades de peptídeos deacordo com a expressão de TAAs relacionados naquele paciente em particu-lar, efeitos colaterais indesejados devido a alergias pessoais ou outros tra-tamentos, e ajustes para tratamentos secundários após uma primeira rodadaou esquema de tratamento.

Ainda outro aspecto desta invenção refere-se ao uso de um pep-tídeo de acordo com a invenção, ou de um polinucleotídeo ou vetor de ex-pressão codificador desse peptídeo, na produção de um medicamento paraeliminar células-alvo no paciente, células-alvo essas que expressem de for-ma anormal um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidoda invenção. Dá-se preferência ao uso de composto farmacêutico que sejauma vacina anticancerígena.

Ainda outro aspecto da presente invenção apresenta o uso deum peptídeo de acordo com a invenção, ou de um polinucleotídeo ou vetorde expressão codificador desse peptídeo, na produção de um medicamentoinduzir uma resposta imune, em particular de uma resposta imune celular,mais particularmente uma resposta imune mediada por célula T contra célu-las de tumores sólidos cujas células expressem uma molécula MHC de clas-se I ou II em sua superfície e apresentem um polipeptídeo que englobe umaseqüência de aminoácidos da invenção.

Foi surpreendente descobrir no escopo da presente invençãoque as células tumorais de tumores sólidos, ao contrário das células sadiasdo mesmo tecido, expressam uma molécula HLA de classe Il humana emsua superfície. Isso foi descrito somente uma vez em Brasanac et al.. (Bra-sanac D, Markovic-Lipkovski J, Hadzi-Djokic J, Muller GA, Muller CA. Immu-nohistochemical analysis of HLA class Il antigens and tumor infiltrating mo-nonuclear cells in renal cell carcinoma: correlation with clinicai and histopa-thological data. Neoplasma. 1999;46(3): 173-8.), onde as seções criostáticas -Vde 37 carcinomas de células renais (RCC) - sendo 25 do tipo células claras,10 de células granulosas e 2 de células cromófobas - foram estudadas pelométodo de imunoperoxidase indireta aplicando anticorpos monoclonais aantígenos HLA-DR, -DP e -DQ para análise de antígenos HLA de classe Il eanticorpos monoclonais anti-CD14, -CD3, -CD4 e -CD8 para células mono-nucleares infiltrantes. O número de células positivas foi estimado de formasemiquantitativa e os resultados da investigação imunohistológica foram cor-relacionados com características clínicas (idade e sexo do paciente, tama-nho do tumor e estágio TNM) e histopatológicos (citologia, histologia, grau)do RCC. Todos os RCCs expressaram antígenos de HLA-DR, 92% antíge-nos HLA-DQ e 73% antígenos -DP, com nível de expressão em hierarquia -DR>-DQ>-DP, mas não possível determinar nenhuma correlação de impor-tância estatística com nenhum dos parâmetros histopatológicos ou clínicosanalisados. Os monócitos foram mais abundantes do que os linfócitos T e ascélulas T CD4+ foram mais abundantes que as CD8+, enquanto que os tu-mores com predominância de linfócitos T e aproximadamente a mesmaquantidade de células T CD4+ e CD8+ apresentaram o maior diâmetro mé-dio. Uma ativação inadequada de linfócitos T pelas células tumorais (apesarda capacidade de apresentação de antígenos) poderia ser o motivo da asso-ciação de parâmetros que indicam um comportamento tumoral mais agressi-vo com expressão anormal de antígeno HLA de classe Il sobre o RCC.

Ainda outro aspecto desta invenção refere-se ao uso de um pep-tídeo de acordo com a invenção, ou de um polinucleotídeo ou vetor de ex-pressão codificador desse peptídeo, na produção de medicamento para eli-minar células-alvo no paciente, células-alvo essas que expressem de formaanormal um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidosconforme uma das seqüências SEQ ID No. 1 a 10.

Outro aspecto da invenção apresenta métodos para produzirlinfócitos T ativados in vivo ou in vitro, sendo que um método inicial compre-ende o contato in vitro de células T com moléculas MHC humanas de classeI ou Il carregadas com antígenos e expressas na superfície de uma célulaapresentadora de antígeno adequada durante'tempo suficiente para ativar,de maneira específica para o antígeno, a referida célula T, sendo o antígenoum peptídeo de acordo com a invenção. Dá-se maior preferência a um segundométodo, descrito por Walter et al.. (Walter S1 Herrgen L, Schoor O, Jung G,Wernet D, Buhring HJ1 Rammensee HG, Stevanovic S. Cutting edge: predeter-mined avidity of human CD8 T-cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres. J Immunol. 2003 Nov 15;171(10):4974-8).

As moléculas MHC de classe Il podem estar expressas na su-perfície de qualquer célula apropriada e é preferível que a célula seja umaque não expresse naturalmente moléculas MHC de classe Il (caso esse emque a célula é transfectada para expressar essa molécula) ou, se o for, queseja defeituosa nas vias de processamento ou de apresentação dos antíge-nos. Dessa forma, é possível que a célula que expressa a molécula MHC declasse II seja iniciada ("primed") praticamente por completo com um antíge-no peptídico antes de ativar o linfócito T citotóxico. ί

A célula apresentadora do antígeno (ou a célula estimuladora)em geral tem uma molécula MHC de classe I ou Il em sua superfície e, depreferência, é praticamente incapaz de carregar por si só a referida moléculaMHC de classe I ou Il com o antígeno selecionado. Como descrito maispormenorizadamente abaixo, a molécula MHC de classe I ou Il pode facil-mente ser carregada com o antígeno selecionado in vitro.

De preferência, a célula de mamífero não possui ou somenteapresenta um nível reduzido ou função reduzida do transportador peptídicoTAP. Entre as células apropriadas que não têm o transportador peptídicoTAP incluem T2, RMA-S e células de drosófila. O TAP é o TransportadorAssociado ao Processamento do antígeno.

O peptídeo humano que carrega a linha de células defeituosasT2 pode ser obtido da American Type Culture Collection, 12301 ParklawnDrive, Rockville, Maryland 20852, EUA, sob o número de catálogo CRL1992; a linhagem Schneider 2 de células de drosófila pode ser obtida da ATCCsob o número de catálogo CRL 19863; a linhagem de células RMA-S de ca-mundongos é descrita em Karre e Ljunggren (1985) J. Exp. Méd. 162,1745.

Convenientemente, a referida célula hospedeira não expressa,antes da transfecção, praticamente nenhuma molécula MHC de classe I.Também é preferível que a célula estimuladora expresse uma molécula im-portante para a co-estimulação da célula T, como por exemplo qualquer umadentre B7.1, B7.2, ICAM-1 e LFA 3.

Em outra modalidade, é possível usar combinações de molécu-las H LA.

O uso de vacinas à base de poliepitopos recombinantes para aadministração de múltiplos epitopos de linfócito T citotóxico CD8+ é descritoem Thomson et al. (1996) J. Immunol. 157, 822-826 e WO 96/03144, ambosincorporados ao presente documento por referência. Em relação à presenteinvenção, pode ser desejável incluir em uma única vacina, um peptídeo (ouum ácido nucléico codificador de peptídeo), onde o peptídeo inclui, em qual-quer ordem, uma seqüência de aminoácidos da presente invenção e um epi-topo estimulador de célula T CD4-positiva (como por exemplo de MMP-7).Uma vacina assim seria particularmente útil para o tratamento de câncer.

Inúmeros outros métodos podem ser utilizados para gerar linfóci-to T citotóxico in vitro. Por exemplo, os métodos descritos em Peoples et al.(1995) Proc. NatL Acad. Sei. USA 92,432-436 and Kawakami et al. (1992) J.Immunol. 148, 638643 usa linfócitos autólogos que infiltram tumores paragerar linfócito T citotóxico. Plebanski et al. (1995) Eur. J. Immunol. 25, 1783-1787 usa linfócitos autólogos do sangue periférico (PLBs) na preparação delinfócito T citotóxico. Jochmus et al. (1997) J. Gen. Viroi 78,1689-1695 des-creve a produção de linfócito T citotóxico autólogo usando células dendríti-cas pulsantes com peptídeo ou polipeptídeo ou via infecção com vírus re-combinante. Hill et al. (1995) J. Exp. Med. 181, 2221-2228 e Jerome et al.(1993) J. Immunol. 151,1654-1662 utilizam células B na produção de linfócitoT citotóxico autólogo. Além disso, é possível utilizar macrófagos pulsadoscom peptídeo, ou polipeptídeo ou infectadas com vírus recombinante, napreparação de linfócito T citotóxico autólogo.

Células alogênicas também podem ser usadas no preparo delinfócito T citotóxico, e esse método é descrito detalhadamente em WO97/26328,incorporada.a este documento por referência. Por exemplo, alémdas células de drosófila e células T2, outras células podem ser usadas paraapresentar antígenos, como por exemplo as células CHO, células de insetosinfectadas com baculovírus, células-alvo infectadas com vacínia, bactérias eleveduras. Além disso, podem-se utilizar vírus de plantas (vide por exemploPorta et al. (1994) Virology 202, 449-955, que descreve o desenvolvimentodo vírus do mosaico do feijão como um sistema de grande rendimento paraa apresentação de peptídeos estranhos.De preferência, no método de acordo com a presente invenção,a célula apresentadora de antígeno compreende um vetor de expressão con-forme mencionado acima.

As células T ativadas e dirigidas contra os peptídeos da inven-ção são úteis em terapia. Assim, um outro aspecto da invenção proporcionacélulas T ativadas que podem ser obtidas pelos métodos da invenção acimacitados.

Um outro aspecto ainda da invenção apresenta células T ativa-das que reconhecem de forma seletiva uma célula que expresse de modoanormal um polipeptídeo englobando uma seqüência de aminoácidos dainvenção. De preferência, as células T reconhecem a referida célula intera-gindo com o complexo HLA/peptídeo (por exemplo, por ligação). As célulasT são úteis em um método para eliminar células-alvo de um paciente, célu-las-alvo estas que expressam de forma anormal um polipeptídeo compreen-dendo uma seqüência de aminoácidos da invenção, sendo administrada aopaciente uma quantidade eficaz de células T ativadas. As células T adminis-tradas ao paciente podem ser oriundas do paciente e ativadas conformedescrito acima, (isto é, são células T autólogas). Alternativamente, as célulasT não provêm do paciente, mas de outro indivíduo. Obviamente, a preferên-cia é que sejam de um indivíduo saudável. Por "paciente saudável" os inven-tores entendem que o indivíduo tem uma boa saúde geral, com um sistemaimunológico competente e, com maior preferência, que não esteja acometidode nenhuma doença prontamente identificável por meio de testes e detectável.

As células T ativadas expressam um receptor de células T (TCR)que participa do reconhecimento das células que expressam o polipeptídeoanormal. É útil que o cDNA que codifica o TCR seja clonado a partir da célu-la T ativada e transferido para outras células T para serem expressas.

In vivo, as células-alvo para as células T CD4+ de acordo com apresente variante da invenção podem ser células de tumor (que eventual-mente expressem MHC de classe II) e/ou células do estroma localizadas aoredor do tumor (células tumorais) (que por vezes também expressam MHCde classe II).Os TCRs dos clones de células T da invenção, específicos paraos peptídeos da invenção, são clonados. O uso de TCR nos clones de célu-las T é determinado empregando (i) regiões variáveis de TCR de anticorposmonoclonais específicos (ii) RT PCR com iniciadores específicos para asfamílias de genes Va e Vp. A biblioteca de cDNA é preparada a partir demRNA poli-A extraído dos clones de células T. São utilizados iniciadoresespecíficos para a porção do terminal C das cadeias TCR a e P e para aporção do terminal N dos segmentos Va e P identificados. O cDNA completopara a cadeia TCR aePé amplificado com DNA polimerase de alta fidelida-de e os produtos amplificados são clonados para um vetor de clonagem a-propriado. Os genes clonados de cadeia a e P podem ser montados paraformar uma única cadeia TCR usando o método descrito por Chung et al.(1994) Proc. NatL Acad. Sei. EUA 91,12654-12658. Nesta construção decadeia individual o segmento VaJ é seguido pelo segmento V DJ, seguidopelo segmento Cp seguido pela transmembrana e pelo segmento citoplásmi-co da cadeia CD3. Esta cadeia TCR simples é então inserida em um vetorde expressão retroviral (pode-se usar um grupo de vetores com base em suacapacidade de infectar linfócitos T CD8+ humanos maduros e de mediar aexpressão de genes: o sistema Kat de vetores retrovirais é uma das possibi-Iidades preferenciais (vide Finer et al. (1994) Blood 83, 43). Retrovírus anfo-tróficos de alto título são usados para infectar os linfócitos T CD8+ ou CD4+purificados isolados a partir de sangue periférico de pacientes com tumores(de acordo com um protocolo publicado por Roberts et al. (1994) Blood 84,2878-2889, incorporado aqui por referência). Utilizam-se anticorpos Anti-CD3 para provocar a proliferação de células T CD8+ purificadas, o qoe facili-ta a integração retroviral e a expressão estável de TCRs de cadeia simples.

A eficiência da transdução retroviral é determinada por tingimento das célu-las T CD8+ infectadas com anticorpos específicos para o receptor de célulaT de cadeia simnples. A análise in vitro das células T CD8+ transduzidasmostra que elas apresentam o mesmo extermínio específico de tumores co-mo o observado com o clone de célula T com restrição alogênica a partir doqual as cadeias TCR foram originalmente clonadas. Populações de células TCD8+ transduzidas com a especificidade esperada podem ser usadas para aimunoterapia adotiva de pacientes com tumores. Os pacientes podem sertratados com células T autólogas transduzidas entre 108 e 1011. De modosemelhante como no caso das células T auxiliares CD8+, pode-se gerar cé-lulas T auxiliares CD4+ contendo construtos correspondentes.

Outros sistemas apropriados para introduzir genes em células Tsão descritos em Moritz et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 91, 4318-4322, incorporados ao presente documento por referência. Eshhar et al.(1993) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 90, 720-724 e Hwu et al. (1993) J. Exp.Med. 178, 361-366 também descrevem a transfecção de células T. Assim,outro aspecto da invenção apresenta um TCR que reconhece uma célulaque expressa de forma anormal um polipeptídeo compreendendo uma se-qüência de aminoácidos da invenção, TCR esse que é obtido a partir dascélulas T ativadas.

Adicionalmente ao TCR, moléculas funcionalmente equivalentesao TCR são incluídas na invenção. Entre elas se incluem todas moléculasque sejam funcionalmente equivalentes a um TCR e que possam exercer amesma função de um TCR. Em particular, essas moléculas incluem TCRsde cadeia simples e três domínios desenvolvidos por meio de engenhariagenética, tais como as obtidas pelo método descrito por Chung et al. (1994)Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 91, 12654-12658, incorporado ao presente do-cumento por referência. A invenção também inclui um polinucleotídeo quecodifica o TCR ou a molécula funcionalmente equivalente e também um ve-tor de expressão que codifica o TCR ou uma molécula funcionalmente equi-valente do mesmo. Entre os vetores de expressão apropriados para expres-sar o TCR da invenção estão os descritos acima relativamente à expressãodos peptídeos da invenção.

No entanto, os vetores preferenciais de expressão são os capa-zes de expressar o TCR em uma célula T após a transfecção.

Outro aspecto da invenção apresenta um método para eliminarcélulas-alvo em um paciente, células-alvo essas que expressem de formaanormal um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos dainvenção, o método incluindo a administração ao paciente de uma quantida-de eficaz de peptídeo de acordo com a invenção, ou uma quantidade eficazde polinucleotídeo ou de vetor de expressão que codifique o referido peptí-deo, ou uma quantidade eficaz de linfócitos T conforme definido acima, sen-do a quantidade do referido peptídeo ou do referido polinucleotídeo ou dovetor de expressão suficiente para eficazmente provocar uma resposta imu-ne da célula antialvo no paciente. A célula alvo normalmente é uma célulatumoral ou cancerígena, em especial células de tumores sólidos que expres-sem uma molécula MHC de classe I ou Il em sua superfície e apresentemum polipeptídeo que englobe uma seqüência de aminoácidos conformemencionado acima.

Um outro aspecto ainda da invenção apresenta um método paraeliminar células-alvo de um paciente, células-alvo essas que expressam umpolipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos da invenção, ométodo compreendendo as etapas (1) obter células T do paciente; (2) intro-duzir nas referidas células um polinucleotídeo que codifica um TCR ou umamolécula funcionalmente equivalente, conforme definido acima; e (3) intro-duzir no paciente as células produzidas na etapa (2).

Outro aspecto ainda da invenção apresenta um método paraeliminar células-alvo em um paciente, células-alvo essas que expressam umpolipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos conforme defi-nido acima, método esse que compreende as etapas (1) obter células apre-sentadoras de antígenos, como por exemplo células dendríticas, do referidopaciente; (2) pôr ditas células apresentadoras de antígenos em contato comum peptídeo conforme definido no primeiro ou segundo ou terceiro aspectosda invenção ou com um polinucleotídeo que codifique esse peptídeo, ex vi-vo·, e (3) reintroduzir no paciente as células apresentadoras de antígenosassim tratadas.

De preferência, as células apresentadoras de antígenos devemser células dendríticas. De forma adequada, as células dendríticas são célu-las dendríticas autólogas pulsadas com um peptídeo antigênico. O peptídeoantigênico pode ser qualquer peptídeo antigênico apropriado que provoqueuma resposta adequada das células Τ. A terapia com células T utilizandocélulas dendríticas autólogas pulsadas com peptídeos provenientes de umantígeno associado a tumor é descrita em Murphy et al. (1996) The Prostate29 e Tjua et al. (1997) The Prostate, 32, 272-278.

Em outra modalidade, as células apresentadoras de antígenos,como por exemplo as células dendríticas, são postas em contato com umpolinucleotídeo que codifica um peptídeo da invençãoÍ O polinucleotídeo po-de ser qualquer polinucleotídeo apropriado, sendo preferível um que sejacapaz de transduzir a célula dendrítica, resultando assim em apresentaçãode um peptídeo e indução de imunidade.

Convenientemente, o polinucleotídeo pode estar contido em umpolinucleotídeo viral ou vírus. Por exemplo, observou-se que as células den-dríticas transduzidas pelo adenovírus induzem a imunidade antitumoral es-pecífica do antígeno em relação a MUC1 (vide Gong et al. (1997) GeneTher. 4,1023-1028). De modo semelhante, é possível utilizar sistemas à ba-se de adenovírus (vide por exemplo Wan et al. (1997) Hum. Gene Ther. 8,1355-1363); pode-se usar sistemas retrovirais used (Specht et al. (1997) J.Exp. Med. 186, 1213-1221 e Szabolcs et al. (1997) Também se pode usartransferência mediada por partícula de sangue para células dendríticas (Tu-ting et al. (1997) Eur. J. Immunol. 27, 2702-2707); e pode-se usar ainda RNA(Ashley et al. (1997) J. Exp. Med. 186, 1177 1182).

Observar-se-á, em relação aos métodos para eliminar células-alvo de um paciente, que é particularmente preferível que as células-alvosejam células cancerígenas,, mais preferivelmente ainda células canceríge-nas renais ou de cólon.

Em uma modalidade preferencial, o haplótipo HLA do paciente édeterminado antes do tratamento. A haplotipagem HLA pode ser efetuadautilizando qualquer método apropriado; tais métodos são bem-conhecidos noestado da técnica.

A invenção inclui particularmente o uso dos peptídeos da inven-ção (ou dos polinucleotídeos que os codificam) para a vacinação ativa in vi-vo; para a manipulação das células dendríticas autólogas in vitro seguida daintrodução das células dendríticas assim manipuladas in vivo para ativar asrespostas das células T; para ativar células T autólogas in vitro seguido deterapia adotiva (isto é, as células T assim manipuladas são introduzidas nopaciente); e para ativar células T de doadores saudáveis (quer com MHC cor-respondentes ou não correspondentes) in vitro seguido de terapia adotiva.

Em uma modalidade preferencial, as vacinas da presente inven-ção são administradas a um hospedeiro quer individualmente ou em combi-nação com outra terapia contra o câncer, para inibir ou suprimir a formaçãode tumores.

A vacina de peptídeo pode ser administrada sem adjuvante. Avacina de peptídeo também pode ser administrada com adjuvante, como porexemplo BCG ou alume. Outros adjuvantes apropriados são descritos acima.

Os peptídeos de acordo com a invenção também podem ser u-sados como reagentes de diagnósticos. Com os peptídeos é possível anali-sar se em uma população de células T estão presentes células T dirigidasespecificamente contra um peptídeo ou se são induzidas pela terapia. Alémdisso, o aumento das células T precursoras pode ser testado com os peptí-deos que apresentem reatividade contra o peptídeo definido. Além disso, o pep-tídeo pode ser usado como marcador para monitorar o avanço da doença nocaso de um tumor que expresse o antígeno do qual o peptídeo se origina.

A Tabela 1 anexa relaciona os peptídeos conforme identificados.Além disso, a tabela informa as proteínas das quais se origina o peptídeo,bem como a respectiva posição do peptídeo dentro da proteína correspon-dente. Além disso, são informados os respectivos números Acc relacionadosao banco genético Genbank do "National Centre for Biotechnology Informati-on" do National Institute of Health (vide http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Em outra modalidade preferencial, os peptídeos são usados pa-ra tingir leucócitos, nomeadamente os linfócitos T. Esse uso é particularmen-te vantajoso quando se quer provar que em uma população de Células Tcitotóxicas estão presentes Células T citotóxicas específicos dirigidos contraum peptídeo. Além disso, o peptídeo pode ser usado como marcador paradeterminar o avanço de uma terapia em doenças ou distúrbios adenomato-sos ou cancerígenos.

Em outra modalidade preferencial da presente invenção, os pep-tídeos são utilizados para a produção de anticorpo. É possível obter anticor-pos policlonais de forma padrão pela imunização de animais via injeção dopeptídeo e posterior purificação da imunoglobulina. Os anticorpos monoclo-nais podem ser obtidos de acordo com protocolos padrão, como por exem-plo em Methods Enzymol. (1986), 121, Hybridoma tecíhnology and monoclo-nal antibodies.

A identificação aos epitopos de células T auxiliares de TAA con-tinua sendo tarefa importante na imunoterapia antitumoral. Até o momento,foram utilizadas diversas estratégias para identificar peptídeos de classe I ouII de TAA, variando desde a incubação de APCs com o antígeno de interes-se â fim de serem absorvidos e processados (Chaux, P., V. Vantomme, V.Stroobant, K. Thielemans, J. Corthals, R. Luiten, A.M. Eggermont, T. Boon, eB.P. van der Bruggen. 1999. Identification of MAGE-3 epitopes presented byHLA-DR molecules to CD4(+) T lymphocytes. J. Exp. Med. 189:767-778), atédiversas estratégias de transfecção com proteínas de fusão (Dengjel, J.,P.Decker, O. Schoor, F. Altenberend, T. Weinschenk, H.G. Rammensee, eS. Stevanovic. 2004. Identification of a naturally processed cyclin D1 T-helper epitope by a novel combination of HLA class II targeting and differen-tial mass spectrometry. Eur. J. Immunol. 34:3644-3651). Todos esses méto-dos demandando muito tempo e muitas vezes não fica claro se os IigantesHLA identificados são efetivamente apresentados in vivo em tecido humano.

Os inventores identificaram um Iigante responsável por uma se-qüência cerne de MMP7. Os inventores descobriram que essa proteína estásuperexpressa em carcinomas de células renais, tendo sido ainda descritacomo sendo associada a tumor (Miyamoto, S., K. Yano, S. Sugimoto, G. Ishi-i, T. Hasebe, Y. Endoh, K. Kodama, M. Goya, T. Chiba, and A. Ochiai. 2004.Matrix metalloproteinase-7 facilitates insulin-like growth factor bioavailabilitythrough its proteinase activity on insulin-like growth factor binding protein 3.Câncer Res. 64:665-671; Sumi, T., T. Nakatani, H. Yoshida, Y. Hyun, T. Ya-sui, Y. Matsumoto, E. Nakagawa, K. Sugimura, H. Kawashima, and O. Ishi-ko. 2003. Expression of matrix metalloproteinases 7 and 2 in human renalcell carcinoma. Oncoi Rep. 10:567-570). O peptídeo se ligou de forma pro-míscua a moléculas HLA de classe Il e foi capaz de ativar células T CD4+ dediferentes doadores sadios. Assim, a abordagem dos inventores será útil naidentificação de novos candidatos a peptídeos de classe Il de TAA para usoem protocolos clínicos de vacinação.

Subentende-se que os recursos da invenção, tal como relevadose descritos neste documento, podem ser utilizados não só na respectivacombinação indicada, mas também de modo singular, sem se afastar do es-copo pretendido da presente invenção.

A invenção será agora descrita com mais detalhes, fazendo refe-rências às figuras, à lista de seqüências e aos exemplos. Os exemplos aseguir são dados exclusivamente para fins ilustrativos, sem intenção de limi-tar a invenção.

As SEQ ID No 1 e SEQ ID No 2 mostram seqüências peptídicasde epitopos de célula T contendo peptídeos apresentados por MHC de clas-se I ou Il de acordo com a presente invenção.

As SEQ ID No. 3 a 11 mostram seqüências de peptídeos usadosna vacina da presente invenção, posteriormente chamada de "IMA".

A figura 1 mostra a apresentação do peptídeo IMA-MET-001 de-rivado do protooncoge c-Met em amostra de tumor primário CCR013. Foirealizada HPLC ESI MS nanocapilar em peptídeos eluídos de CCR013. Ocromatograma de massa para 1006,54 ± 0,5 Da mostra um pico no tempo deretenção de 47,8 min. O espectro de decaimento de massa induzido por co-lisão de 1006,54, registrado em uma segunda operação/passagem LC-MS aum certo tempo de retenção e mostrado no quadro, confirmou a presença deIMA-MET-001 (Weinschenk 2002).

A figura 2 mostra a expressão tecidual do protooncogene c-Met(MET). A expressão foi analisada por microarranjos de oligonucleotídeos. Onúmero de cópias refere-se ao rim, e foi ajustado em 1,0."P" significa que ogene está presente, "A" que ele está ausente e "M" que ele é marginal se-gundo os algoritmos estatísticos de call absoluto. "I" significa que a expres-são do gene está significativamente aumentada em relação ao rim, "D" que aexpressão está diminuída e "NC" que não há variação de expressão. O valorde expressão relativo ao rim é calculado a partir da razão logarítmica do si-nal e mostrado acima das barras. A linha horizontal tracejada mostra a ex-pressão máxima em tecidos normais (nesse caso, do pulmão).

A figura 3 mostra a eliminação de células-alvo carregadas depeptídeos por Células T citotóxicas condicionadas com IMA-MET-001.

A figura 4 mostra a eliminação de células malignas por Células Tcitotóxicas condicionadas com IMA-MET-001.

A figura 5 mostra o ensaio de inibição do alvo a frio.

A figura 6 mostra a análise tetramérica de expansões promovi-das por microesferas.

A figura 7 mostra a imunogenicidade de IMA-MMP-001 - IFNgamma intracelular representativo versus colorações de CD4 de quatro doa-dores sadios. Os doadores 1, 2 e 3 apresentaram células T CD4+ reativascontra IMA-MMP-001 após a terceira e quarta estimulações. O doador 4sempre apresentou resultado negativo.

A figura 8 mostra a apresentação diferencial de peptídeos sobretecido tumoral e sadio - (A) Espectro de massa de duas espécies de peptí-deos m/z 739.96 e 741.95 derivados de rim normal e de tecido de carcinomade células renais de paciente de CCR001. O espectro de massa demonstrauma superapresentação de aproximadamente 4 vezes o peptídeo adipofilinano tecido de carcinoma de células renais em comparação com o tecido nor-mal autólogo correspondente (Β). A análise por espectrometria de massa dedecaimento induzido por colisão de m/z 741,95 (tumor) revelou a seqüênciapeptídica IMA-ADF-003, derivada da adipofilina.

A figura 9 mostra a imunidade in vivo contra IMA-ADF-001 - i-munidade de célula T em 2 pacientes de RCC contra diversos peptídeos nãovacinados em pacientes vacinados com células dendríticas autólogas pulsa-das com dois TUMAPs oriundos de MUC. As células T específicas para IMA-ADF-001 ("adipofilina") não estavam presentes antes da vacinação e foramdetectadas no paciente No. 3 (painel superior) após 6 vacinações e no paci-ente No. 8 (painel inferior) após 8 vacinações.

A figura 10 mostra exemplos representativos de uma respostade célula T induzida por IMA identificada pelo ensaio ELISPOT amplificadopara o mesmo paciente e antígeno. As colunas superior e inferior represen-tam respectivamente o antígeno de controle negativo HIV-001 e o TUMAPIMA-CCN-001 simples usado para leitura. A coluna à esquerda mostra osELISPOTs de amostras agrupadas, obtidas antes da vacinação no segundodia de triagem (S2) e imediatamente antes da primeira injeção (V1). A colunaà direita mostra os ELISPOTs de amostras agrupadas, obtidas durante oprotocolo de vacinação no dia 22 (V6) e dia 36 (V7). O número de célulaspositivas é informado para cada experimento.

figura 11: Exemplos representativos de respostas de células Tinduzidas por IMA identificadas pelo ensaio de coloração ampliado Tetramer.Os painéis superiores e intermediários representam diagramas de pontosbidimensionais referentes aos linfócitos CD3+, enquanto que os painéis infe-riores estão referentes aos linfócitos CD3+ CD8+. Os pacientes, os pontosno tempo e as colorações são indicados em cada coluna. S1+V1: amostrastiradas antes da vacinação; V4+V5: amostras tiradas no 89 dia e 15e dia;V6+V7: amostras tiradas no 22e dia e 36Q dia; V8+FU: amostras tiradas no64e dia (última vacinação) e após 85 e 92 dias (fim do estudo).

A: Dados do paciente 03-004 confirmando a resposta imunológi-ca ao IMA-CCN-001 mostrado na figura 10. É possível identificar uma popu-lação de células positivas para CD3+ e o tetrâmero IMA-CCN-001 após a 4ee 59 injeções de IMA (V6+V7; painel intermediário) sendo responsável por0,78% :dos linfócitos (V6+V7: painel inferior). Não foi identificada nenhumapopulação positiva para o tetrâmero K67-001 (painel superior).

B: dados do paciente 03-003 não evidenciando nenhuma res-posta imunológica contra o peptídeo IMA-RGS-001 (painel superior), masdesenvolvendo uma resposta positiva para o tetrâmero IMA-CCN-001 duran-te o curso do protocolo de vacinação (painel intermediário, colunas 3 e 4)sendo responsável por até 0,8% dos linfócitos (painel inferior; coluna 3).

figura 12: Cinética observada da magnitude das células T emensaios com tetrâmeros amplificados de um só ponto no tempo ("single timepoint"). Os resultados são mostrados para leituras em momento único para opaciente 05-001 que demonstrou resposta de célula T induzida por vacinadetectada por ensaio de tetrâmeros amplificados de rotina com amostrasagrupadas. Os resultados são dados para todos os antígenos associados atumor presentes em IMA (pool TUMAP) e em particular para o peptídeo IMA-CCN-001. Além disso, são mostrados os controles HJV-001 e IMA-HBV-001dentro do mesmo ensaio de ponto único no tempo (time point).

Exemplos

Glossário

Termo ou abreviatura Descrição

AE Evento Adverso

AJCC American Joint Committee on Câncer

BfArM Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte (A-

gência Alemã de Controle de Medicamentos e ProdutosMedicinais)

CTL Células T citotóxicas

DC Células Dendríticas

GM-CSF rhuGM-CSF (recombinant human Granulocyte-

rhuGM-CSF Macrophage Colony-Stimulating Factor) (fator recombi-nante humano estimulador das colônias de granulócitose macrófagos)

HBV VirusdaHepatiteB

HLA Antígeno Leucocitário Humano

IARC Agência Internacional de Pesquisa sobre o Câncer

IMP Produto medicinal em investigação

INF Interferon

MAA Pedido de Autorização para Comercialização

MHC Complexo Principal de Histocompatibilidade

RCC Carcinoma de Células Renais

SAE Sério Evento Adverso

SmPC Resumo das Características do Produto

TUMAP Peptídio Associado a Tumor

I. Caracterização dos peptídeos da presente invenção

Dados referentes à expressão de produtos dos genes dos quais se derivamos peptídeos IMA

Os peptídeos identificados a partir de tecido de RCC foram sele-cionados por inclusão na vacina IMA (vide mais adiante) de acordo com umsistema interno de classificação baseado principalmente em análise de ex-pressão de genes, na literatura e em pesquisa de bancos de dados por pro-priedades conhecidas de um antígeno a partir do qual foi identificado umpeptídeo derivado. Todos os peptídeos apresentados naturalmente encon-tram-se bastante superexpressos no tecido do RCC em comparação ao teci-do renal normal bem como em uma série de outros tecidos e órgãos vitais.Essa seleção é essencial para (1) escolher peptídeos que sejam capazes deinduzir as células T com alta especificidade para reconhecerem o tumor masnão o tecido, para minimizar a possibilidade de autoimunidade induzida pelavacinação com IMA e (2) para assegurar que a maioria dos tumores em umapopulação de pacientes seja reconhecida pela célula T induzida.

A prevalência média de antígenos dos quais os peptídeos deri-vados estão contidos no IMA é de 68% (superexpressão no RCC vs. tecidose órgãos vitais em n=24 amostras de RCC) variando de 54% a 96% para osantígenos individuais. Isso é bem mais do que em antígenos tumorais pa-drão, como por exemplo o Her-2/neu (prevalência de 25-30%).

O estudo do perfil global da expressão gênica foi realizado comum sistema de microarranjos de alta densidade que pode ser obtido comer-cialmente (Affymetrix). O RNA foi isolado dos tecidos, processado e hibridi-zado para microarranjos de oligonucleotídeos de alta densidade. Depois decorados e lavados, os arranjos foram submetidos à varredura e à intensida-de da fluorescência de cada ponto no arranjo representou o grau de expres-são do gene que combina com a seqüência de DNA do oligonucleotídeo.Diversos oligonucleotídeos dos arranjos cobrem a seqüência de cada gene.Depois da análise com software estatístico, é possível obter para cada genevalores de expressão relativos aos pares entre duas amostras. A normaliza-ção de todos os dados de diferentes amostras usando uma amostra cons-tante como base possibilita uma quantificação de níveis de expressão entretodas as amostras.

Fontes de RNA - O RNA total de tecidos humanos foram obtidoscomercialmente (Ambion, Huntingdon, RU; Clontech, Heidelberg, Alemanha;Stratagene, Amsterdam, Holanda, BioChain, Heidelberg, Alemanha). O RNAtotal de diversos indivíduos foi misturado de forma que o RNA de cada indi-víduo tinha peso igual. A qualidade e a quantidade foram confirmadas nobioanalisador Agilent 2100 (Agilent, Waldbronn, Alemanha) usando o kitRNA 6000 Nano LabChip da Agilent.

Análise de Microarranjo de Nucleotídeos de Alta Densidade -DNA de fita dupla foi sintetizado a partir de 5-8 pg de RNA total, usando Su-perScript RTII (Life Technologies, Inc., Karlsruhe, Alemanha) e o iniciador(Eurogentec, Seraing, Bélgica) conforme informado no manual Affymetrix. Atranscrição in vitro com o kit BioArray® High Yield® RWA Transcript Labelling(ENZO Diagnostics, Inc., de Farmingdale, NY, EUA), fragmentação, hibridi-zação em Affymetrix U133A ou U133 Plus 2,0 GeneChips (Affymetrix, SantaClara, CA) e coloração com streptavidina-ficoeritrina e anticorpo antistrepta-vidina biotinilada (Molecular Probes, Leiden, Holanda) foi seguida pelos pro-tocolos do fabricante (Affymetrix). Usou-se o Affymetrix GeneArray Scannere os dados foram analizados com o software Microarray Analysis Suite 5.0ou GeneChip® Operating Software (GCOS). Para a normalização, foramusados 100 genes de manutenção ("housekeeping") fornecidos pela Affyme-trix. Comparações de pares foram calculadas usando os valores de expres-são no rim como base. Portanto, todos os valores de expressão calculados apartir das faixas de Iog signal referem-se ao rim, ajustado para 1. A impor-tância da expressão diferencial foi avaliada pelos valores de "mudança" da-dos pelos algoritmos estatísticos implementados no software. Para a detec-ção absoluta da expressão, os dados foram novamente analisados com al-goritmos estatísticos. A presença ou ausência de expressão genética foi de-terminada por algoritmos de call absoluto.

Um exemplo de painel de expressão, tecidual para a expressãodo protooncogene c-Mét (MET) é mostrado na figura 2. O MET estava su-perexpresso em 96% dos carcinomas de células renais analisados (n=24,lado direito), mas não - ou em menor extensão - em diversos tecidos e ór-gãos vitais sadios selecionados, bem como em células e tecidos imunologi-camente importantes (lado esquerdo na figura 2).

A Tabela 1 apresenta um resumo dos peptídeos contidos na va-cina IMA da invenção, compreendendo também os peptídeos de acordo coma invenção.Tabela 1: Peptídios de acordo com a presente invenção

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A Tabela 2 apresenta um resumo dos resultados de expressãode todos os antígenos que codificam peptídeos contidos na vacina IMA dainvenção, bem como os peptídeos de acordo com a invenção.

Tabela 2: Freqüências de superexpressão de antígenos no RCC (n=24)

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1 De acordo com os valores de "mudança" dados pelos algoritmos estatísticos implementados no software (númerode Ts)

2 Número de RCCs com mais expressão quando comparados com o tecido normal com a maior expressão entreos tecidos normais

3 O cérebro é imuno-privilegiado e por esse motivo não levado em consideração

A superexpressão mínima no RCC versus todos os tecidos nor-mais é de 54% e a máxima é de 96%. Isso é bem mais do que em antígenostumorais padrão, como por exemplo o Her-2/neu (prevalência de 25-30%).

Exceção disso é o MUC, pois não foi detectada superexpressãopara o MUC mRNA. No entanto, é preciso levar em conta os seguintes rela-tórios publicados:

1. A desglicosilação anormal em tumores malignos é comum edesmascara epitopos em células tumorais que podefn não estar presentesem células normais. É muito provável que esse mecanismo também ocorreno RCC. Isso explicaria a eliminação específica de linhagens de células tu-morais que expressam MUC (Brossart 1999). Vide também o capítulo 4.1.5sobre as propriedades do MUC.

2. O IMA-MUC-001 foi administrado junto com células dendríti-cas autólogas em um teste iniciado por pesquisador na Universidade de Tü-bingen, na Alemanha. Nesse teste, recentemente apresentado na ASCO2003 (Mueller 2003) e os dados de acompanhamento (follow-up) apresenta-dos na reunião da ASCO 2005 (Wierecky 2005), não foram relatados efeitosauto-imunes.

3. Outros relatórios de estudos clínicos mostram que as célulasT citotóxicas específicas para IMA-MUC-001 ocorrem naturalmente (semimunização) no carcinoma de mama (Rentzsch 2003) e pacientes de carci-noma colorretal (Dittmann 2004). Nesses pacientes, não foram relatadosefeitos auto-imunes. Isso enfatiza o papel natural das células T específicasdo IMA-MUC-001.

Com base nesses dados de apoio, a administração de IMA-MUC-001 pode ser considerada segura, embora não pode ser detectadasuperexpressão do antígeno MUC somente no nível do mRNA.Ligação promíscua do IMA-MMP-001 a diversos alelos HLA-DR

O IMA-MMP-001 é um peptídeo que se liga a HLA-DR, uma mo-lécula HLA de classe II. TUMAPs classe Il ativam células T auxiliares asquais desempenham uma papel essencial em auxiliar a função das células Tcitotóxicas ativadas pelas TUMAPs de classe II. A ligação promíscua do pep-tídeo HLA-DR é importante para garantir que a maioria (>50%) dos pacien-tes HLA-A*02-positivos tratados com IMA também possam provocar umaresposta de célula T ao IMA-MMP-001. A análise in silico da ligação do IMA-MMP-001 indica que o IMA-MMP-001 se liga de forma promíscua a diversosalelos HLA-DR (DBR1*0101, *0301, *0401, *1101 e *1501) cobrindo um totalde no mínimo 69,6% da população caucasiana positiva para HLA-A2. A liga-ção promíscua do IMA-MMP-001 é confirmada de forma experimental pordados de imunogenicidade in vitro.Princípio de teste

Com o uso do algoritmo SYFPEITHI desenvolvido na Universi-dade de Tübingen (Rammensee 1997; Rammensee 1999), classificou-se aligação do IMA-MMP-001 a diversos alelos HAL-DR comuns (vide a tabela aseguir). O algoritmo foi usado com êxito para identificar epitopos de classe Ie II da ampla gama de antígenos, por exemplo dos TAA TRP2 (classe I)(Sun 2000) e SSX2 (classe II) (Neumann 2004) humanos. Os alelos HLA-DRanalisados cobrem no mínimo 69,6% da população caucasiana HLA-A2 po-sitiva (Mori 1997). O limiar de ligação foi definido a escore de 18 com basena análise de escores de ligações de Iigantes HLA-DR promíscuos conheci-dos e publicados. Ligação promíscua é definida como uma ligação de peptí-deo HLA-DR com diversos alelos HLA-DR expressos em pelo menos 50%da população caucasiana.

Os Ioci de HLA-A e HLA-DR estão em desequilíbrio de ligação,produzindo combinações de HLA-A2 e HLA-DRs específicas que são favo-recidas em relação a outras (Tabela 3).

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Tabela 3: As freqüências dos haplótipos em indivíduos caucasianos na Amé-rica do Norte - São mostrados os haplótipos sorológicos N.a. significa nãoatribuído (Mori 1997).

Os Iigantes de determinadas moléculas MHC contêm aminoáci-dos quimicamente relacionados em determinadas poèições de sua seqüên-cia primária, o que permite definir o motivo de um peptídeo para cada aleloMHC (Falk 1991). O SYFPEITHI usa matrizes de motivos deduzidos a partirde motivos refinados, baseados exclusivamente na análise de Iigantes natu-rais via degradação de Edman e espectrometria de massa em linha (Schirle2001). Essas matrizes permitem prever exatamente os peptídeos de deter-minada seqüência de proteínas apresentados em moléculas MHC de classeI ou II (Rotzschke 1991).

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Tabela 4: Escores de ligação de IMA-MMP-001 a alelos HLA-DR comuns.

São mostrados os escores de ligação de IMA-MMP-001 SYF-PEITHI para os alelos HLA-DRB1 mais comuns na população caucasiana.As freqüências dos haplótipos sorológicos correspondentes de indivíduoscaucasianos HLA-A2 positivos são dadas entre parênteses. Considerou-seque o peptídeo se ligava a uma molécula HLA quando o escore era igual oumaior que 18.

Com base na previsão por meio de algoritmo SYFPEITHI, o IMA-MMP-001 provavelmente se ligará a diversos alelos HLA-DR (DRB1*0101,*0301, *0401, *1101 e *1501) cobrindo pelo menos 69,6% da populaçãocaucasiana positiva para HLA-A2. Como não há dados disponíveis sobre afreqüência do HLA-DR15, esse alelo foi omitido do cálculo. Assim, é bemprovável que a cobertura da população seja ainda maior do que 69,9%. Aconfirmação experimental da ligação promiscua do IMA-MMP-001 é obtidapor dados de imunogenicidade in vitro (vide abaixo).Comparação da expressão do antígeno e apresentação do peptídeo deriva-do em tumor e tecido normal autólogo.

Parte-se do princípio de que os antígenos superexpressos este-jam superexpressos nas moléculas HLA na superfície da célula. Por exem-plo, descobriu-se que o peptídeo HLA-A*03 derivado da adipofilina, um antí-geno superexpresso do qual se derivam os peptídeos IMA-ADF-001 e IMA-ADF-002 de HLA-A*02, ambos contidos em IMA1 estava altamente superex-presso no tecido de RCC em comparação ao tecido normal autólogo do pa-ciente RCC100 que utilizava a estratégia QUALITEA. Nesse exemplo, vê-seque a superexpressão de um antígeno (nesse caso a adipofilina) se correlacio-na com a superapresentação de peptídeos derivados do mesmo antígeno.

O método é detalhadamente descrito por (Lemmel 2004). QUA-LITEA é uma estratégia de quantização diferencial de peptídeos eluídos deHLA a partir de tecido tumoral e tecido normal. Os ligãntes HLA derivadosdas duas fontes diferentes são derivados no terminal N por um reagente 1Hx-ou 2Dx e combinados. Após a redução da complexidade dos peptídeos porcromatografia líquida de alto desempenho, os peptídeos são quantizados poranálise ESI-MS segundo suas áreas de pico. O par de peptídeos derivados(1Hx-derivatização e 2Dx-derivatização) é idêntico em termos físico-químicose pode ser facilmente detectado, pois ele essencialmente co-elui em siste-mas cromatográficos. Além disso, há uma diferença constante de massamedida nas varreduras de espectrometria de massa. Essa diferença depen-de do número de isótopos estáveis no derivativo.: A identificação seqüencialde um Iigante é revelada pela análise ESI-MSMS e pesquisa do espectrogravado em bancos de dados e assistida por computador. Portanto, a análi-se fornece informações sobre os aspectos qualitativos e quantitativos da a-presentação do peptídeo em tecido tumoral e tecido normal.

A figura 8 mostra um exemplo de apresentação diferencial depeptídeo HLA em tecido tumoral e tecido normal de um antígeno superex-presso. O peptídeo IMA-ADF-003, que estava superexpresso quadruplamen-te no tecido tumoral em relação ao tecido renal sadio do paciente RCC100,foi identificado por análise de espectrometria de decaimento de massa indu-zido por colisão entre os muitos peptídeos igualmente apresentados. Essepeptídeo superapresentado em tecido tumoral derivou da adipofilina. A aná-lise de expressão de genes do mesmo paciente RCC100 revelou tambémuma superexpressão de 2,64 vezes de adipofilina nesse tecido tumoral emrelação ao rim sadio (dados não exibidos). Esses dados confirmam nessecaso em particular que a superexpressão no tecido turporal em nível de geneleva à superexpressão do peptídeo na superfície da célula tumoral.

Imunoqenicidade in vivo contra o IMA-ADF-001

A células dendríticas autólogas (DCs) produzidas por pacientesde RCC foram pulsadas com dois TUMAPs derivados de MUC, entre esseso IMA-MUC-001. O IMA-ADF-001 não foi vacinado. As vacinações foramrealizadas de forma subcutânea a cada duas semanas quatro vezes e repe-tidas mensalmente até a progressão do tumor. Após a quinta injeção comcélulas dendríticas, os pacientes receberam adicionalmente 3 injeções/se-mana, aplicadas de forma subcutânea, de IL-2 de baixa dosagem (1Mio I-E/m2). A ativação do precursor de célula T foi monitorada com ELISPOTIFN-gama. Além da indução de células T contra os dois peptídeos vacina-dos, também foi testada a atividade das células-T contra diversos outrosTUMAPs conhecidos, entre eles o IMA-ADF-001.

Os resultados foram mostrados recentemente em uma apresen-tação do Dr. Peter Brossart (Universidade de Tübingen) na Reunião Anualda Sociedade Americana de Oncologia Clínica (ASCO) em 2005, a apresen-tação completa foi publicada na página da ASCO na Internet. Em dois paci-entes (paç No. 8 e pae No. 13), vacinados com dois peptídeos MUC pulsa-dos em células dendríticas autólogas foi detectada imunidade da célula Tdiferente daquela encontrada nos vacinados com outros peptídeos (figura 9).Como não havia imunidade antes da vacinação, é muito provável que essascélulas T foram induzidas por espalhamento dos epitopos. Pode haver espa-lhamento dos epitopos quando as células tumorais são destruídas (por e-xemplo por necrose, Iise por células T induzidas por vacina etc.) liberandoantígenos que são absorvidos por células apresentadoras de antígenos(APCs, por exemplo DCs). Essas células apresentadoras de antígenos(APCs) podem então processar o antígeno dentro da célula e apresentar umepitopo de célula T (por exemplo um TUMAP) para iniciar as respostas dascélulas T. Esses dados enfatizam o grande papel reservado ao IMA-ADF-001 como antígeno de célula T de ocorrência natural.

II. Produção e uso da vacina "IMA" de acordo com a invenção

A vacina IMA é uma vacina que contém um conjunto de peptí-deos associados a tumor, localizados e identificados em células de câncerrenal primário. Esse conjunto inclui peptídeos HLA de classe I e classe II. Oconjunto de peptídeos também contém um peptídeo do antígeno do cerne doHBV, usado como peptídeo de controle positivo e atuando como marcadorimunológico para testar a eficiência da administração intradérmica. A vacina-ção com peptídeo em geral precisa de adjuvante e, portanto, no presenteesquema de vacinação será usado o GM-CSF como adjuvante (o GM-CSFhumano é comercializado como Sargramostim, Leukine®, Berlex).

8 dos 10 peptídeos associados a tumor contidos no IMA foramidentificados com a tecnologia XPRESIDENT descrita mais adiante. Paraesses peptídeos, a apresentação natural no contexto das moléculas HLAexpressas pelo tumor é portanto demonstrada por meio de prova direta. Ospeptídeos IMA-MUC-001 e IMA-CCN-001 foram identificados por meio deoutras tecnologias. Para os dois últimos peptídeos, a apresentação naturaldesses peptídeos por linhagens de células tumorais é demonstrada com ba-se em provas indiretas no ensaio de imunogenicidade in vitro (vide abaixo).

Princípio de teste

As moléculas HLA de tecido de carcinoma renál primário pro-cessado por congelamento por choque ("shock-freeze") são purificadas e ospeptídeos associados ao HLA são isolados. Esses peptídeos são separadosoff-line por HPLC e as frações são analisadas ou seqüencialmente analisa-das por espectrometria de massa é feita por meio de experimentos online deHPLC-MSMS. As seqüências resultantes são confirmadas por síntese dospeptídeos identificados e a comparação dos espectros dos fragmentos dospeptídeos identificados e sintetizados. Como os peptídeos identificados deri-vam diretamente de moléculas HLA dos tumores primários, esses resultadosapresentam provas diretas do processamento e apresentação naturais dospeptídeos identificados no tecido do RCC primário.

Método

O método é descrito detalhadamente por (Weinschenk 2002).

Em resumo, as amostras tiradas dos pacientes e ultracongeladas ("shock-freezed"), obtidas do Departamento de Urologia da Universidade de Tübin-gen (com aprovação do comitê local de ética) foram lisadas, as moléculasHLA foram purificadas por cromatografia de afinidade usando o anticorpoW6/32 específico para HLA de classe I, ou o anticorpo BB7.2 específico paraHLA-A*02, ou (no caso do IMA-MMP-001) o anticorpo L243 específico deHLA-DR. Os peptídeos associados a HLA foram eluídos com tratamentocom ácido e isolados da proteína MHC de cadeia alfa por ultrafiltração. Ospeptídeos isolados são separados off-line por cromatografia líquida de altodesempenho de fase reversa e as frações são analisadas por espectrometriade massa nano-ESI em um espectrômetro de massa híbrido em tandem Q-TOF de aceleração ortogonal (Q-TOF I ou Q-TOF Ultima, Waters) ou foi feitaanálise cromatografia líquida MSMS on-line usando os mesmos instrumen-tos. Todas as vezes incluiu-se uma operação em vazio para ter-se certezade que o sistema estava livre de peptídeos. As calibrações foram feitas pelomenos uma vez por dia e análises com compostos padrão foram realizadasa intervalos apropriados para assegurar um desempenho perfeito dos siste-mas. A interpretação dos espectros dos fragmentos foi feito manualmente. Aconfirmação da análise foi obtida por pesquisas em bancos de dados e pelasíntese da fase sólida da suposta seqüência de peptídeos e comparação dosespectros dos fragmentos dos peptídeos identificados e sintetizados. Todospeptídeos contidos em IMA (dados não exibidos), exceto o IMA-MUC-001 eIMA-CCN-001 foram identificados de modo idêntico, confirmando a apresen-tação natural desses peptídeos em tecido de carcinoma primário de célulasrenais.

Inqredientesdo IMA

Os peptídeos deste desenvolvimento clínico são sintetizados pormeio de química Fmoc padrão e tradicional. A purificação é feita com HPLCe troca de íons. O importante é que a identidade e a pureza dos peptídeospode ser determinada facilmente e com grande precisão usando espectro-metria de massa e HPLC. A formulação do IMA consiste em 11 substânciasde fármacos individuais descritas mais detalhadamente a seguir.

Tabela 5: Antíaenos no IMA

<table>table see original document page 69</column></row><table>

Todos os peptídeos são sintetizados por química Fmoc de fasesólida e são purificados por HPLC e cromatografia de troca de íons até umgrau de pureza > 95%. A estrutura correta é determinada por análise de a-minoácidos e espectrometria de massa.<table>table see original document page 70</column></row><table>O fármaco é apresentado na forma liofilizada, para aplicaçãointradérmica, contendo 11 peptídeos - 578 μς de cada peptídeo - na formade seus sais (acetatos). Para a aplicação da fórmula de teste clínico nos pa-cientes, o pó para injeção, contendo 578 pg de cada peptídeo, é dissolvidoem 700 μΙ de hidrogeno carbonato de sódio (4,2%). Depois da reconstituiçãoda solução, são injetados via intradérmica 500 μΙ (equivalente a uma doseúnica de 413 μg de cada peptídeo por injeção e uma dose única total de4,5 mg de IMA por injeção).

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"retirado durante o processo de produção

A qualidade do IMA é assegurada pelo uso de substâncias ati-vas e excipientes que atendem as exigências da Ph. Eur.Imunoqenicidade in vitro dos peptídeos contidos no IMA

O IMA contém 9 peptídeos associados a tumor HLA de ciasse I,1 peptídeo associado a tumor HLA de classe Il e 1 peptídeo viral de controleHLA de classe I. A imunogenicidade in vitro pôde ser demonstrada para agrande maioria dos peptídeos contidos no IMA.

A imunogenicidade in vitro foi demonstrada para 8 das 10 se-qüências de HLA de classe I contidas no IMA, usando principalmente doisensaios com células T: A. eliminação citotóxica de células-alvo em ensaiosde liberação de cromo e/ou B. por detecção de células T por tetrâmerosHLA. Esses ensaios apresentam provas da presença de células precursorasespecíficas no sangue de doadores HLA-A*02 positivos, bem como a capa-cidade dessas células T específicas de eliminar células-alvo. Como no últimocaso, também são reconhecidas diversas linhagens de células tumorais queexpressam o antígeno. Isso dá indicações adicionais (indiretas) da apresen-tação natural dos peptídeos usados em células tumorais e mostra que ascélulas T citotóxicas produzidas com o uso desses peptídeos têm grandeavidez pelo reconhecimento de células tumorais. A imunogenicidade in vitrofoi demonstrada para o peptídeo HLA de classe de Il IMA-MMP-001 contidono IMA usando-se coloração da citoquina intracelular em citometria de fluxo(vide abaixo).

Tabela 8: Resumo dos dados de imonogenicidade in vitro para os peptídeoscontidos no IMA

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Ensaio "killer": eliminação citotóxica de alvo medido por ensaiode liberação de cromo; Liberação de citoquina: liberação de citoquinas porcélulas T medido por teste ELISA; Coloração de citoquina: síntese de cito-quinas por células T medida por citometria de fluxo intracelular; Detecção detetrâmero: detecção de células T específicas de peptídeos por tetrâmeros HLA.

Imunogenicidade in vitro dos peptídeos HLA de classe I contidos no IMA

O IMA contém 10 peptídeos que se ligam a HLA de classe 1.Para testar os peptídeos no que concerne sua imunogenicidade in vitro, fo-ram geradas células T citotóxicas CD8+ a partir de células mononuclearesautólogas de sangue periférico (PBMC) de doadores sadios usando peptí-deos simples contidos no IMA e a atividade dessas células T citotóxicas foitestada com ensaios de liberação de cromo e detecção de células T comtetrâmeros HLA em citometria de fluxo. Os dados detalhados para ambos osmétodos são mostrados para um peptídeo escolhido como exemplo (IMA-MET-001), e os dados para os outros peptídeos foram reunidos na Tabela 8acima.

No primeiro etapa, as células T citotóxicas foram geradas (pri-ming) in vitro por estimulação repetida de células mononucleares de sangueperiférico de doadores sadios de HLA-A*02 com o peptídeo específico a sertestado. O condicionamento pode ser feito com células dendríticas autólogasgeradas a partir de monócitos sangüíneos do doador ou com contas carre-gadas de tetrâmero HLA.

A. Eliminação citotóxica do alvo: No segundo etapa, a citoxicidade dessascélulas T citotóxicas condicionadas (iniciada ("primed")) (células T citotóxi-cas) é testada marcando-se as células-alvo com cromo radioativo e incu-bando-se as células-alvo com as Células T citotóxicas produzidas. A quanti-dade de cromo radioativo liberado no sobrenadante pode ser diretamentecorrelacionado com a proporção de células-alvo eliminadas.

B. Detecção de células T com tetrâmeros HLA: alternativamente, as CélulasT citotóxicas iniciadas ("primed") com especificidade para determinado pep-tídeo são detectados no segundo etapa usando-se tetrâmeros HLA. Os te-trâmeros são moléculas HLA-A*02 carregadas com 4 peptídeos acopladosuns aos outros. Esses construtos permitem rotulagem específica do receptorcognato de célula T que reconhece o complexo de peptídeo HLA no tetrâme-ro e por marcação do tetrâmero com fluorocromo seguido de análise em ci-tometria de fluxo (FACS).

Condicionamento (priming) de células T citotóxicas com células dendríticas

Para a indução de linfócitos T citotóxicos, células dendríticas5x105 foram pulsadas com 50 pg/ml de peptídeo IMA-MET-001 sintético du-rante 2 horas, lavadas, e incubadas com PBMNC autólogo 2,5x106 em meioRP10. Após 7 dias de cultivo, as células foram reestimuladas com PBMNCautólogo pulsado com peptídeo e'1 ng/ml de; IL-2 recombinante humano(R&D Systems) foi acrescentado no primeiro, terceiro e quinto dia. A ativida-de citolítica do linfócito T citotóxico induzido foi analisada no quinto dia apósa última reestimulação em ensaio padrão de liberação de 51Cr (Brossart1999) (vide abaixo).

Condicionamento in vitro de células T citotóxicas com contas carregadascom tetrâmero.

O priming in vitro foi feito como indicado anteriormente (Walter2003) ou com pequenas modificações. Em resumo, foram produzidas molé-culas HLA-A*0201 recombinantes biotiniladas sem o domínio transmembra-na e biotiniladas no terminal carbóxi da cadeia pesada como descrito anteri-ormente ((Altman 1996). O anticorpo 9.3 CD28 anti-humano purificado co-estimulatório de lgG2a de camundongo (Jung 1987) foi quimicamente biotini-lado com sulfo-N-hidroxissuccinimida biotina sob condições conforme reco-mendado pelo fabricante (Perbio Science, Bonn, Alerjnanha). Foram usadasmicroesferas de streptavidina com 5,60 pg de diâmetro com revestimento departículas de poliestireno com capacidade de ligação de aproximadamente0,06 pg de microesferas de biotina-FICT/mg (Bangs Iaboratories1Fishers,Illinois, EUA). Para o manuseio das microesferas, usou-se um tampão estérilde PBS/BSA/EDTA. Para poderem se acoplar às moléculas biotiniladas, asmicroesferas foram lavadas e ressupendidas a 2 χ 106 particulas/ml em tam-pão contendo MHC e/ou anticorpos biotinilados em diversas concentrações.A ligação foi realizada em temperatura ambiente durante 30 minutos sobagitação. As contas revestidas foram lavadas 3 vezes, ressuspendidas notampão acima mencionado e armazenadas por até 4 semanas a 4 0C antesde serem usadas.

Os PBMCs foram isolados dos revestimentos tamponados fres-cos com meio de separação gradiente padrão (Linaris, Wertheim-Bettingen,Alemanha ou PAA Laboratories, Linz, Áustria). Onde indicado, células T CD8intocadas foram enriquecidas magneticamente por depleção negativa pormeio do kit de isolamento de células T CD8 (Miltenyi Biotec, Bergisch Glad-bach, Alemanha) de acordo com as condições do fabricante, que resultouem uma pureza de mais de 80% das células TCR-positivas CD8+. As esti-mulações in vitro foram iniciadas em 24 placas de cavidades com 5x10®células respondedoras mais 1 χ 106 APCs ou microesferas por cavidade em1,5 ml de meio de células T. Caso não afirmado em contrário, acrescentou-se 5 ng/ml de IL-12 p70 humano (R&D) com APCs ou microesferas. Depoisde 3-4 dias de co-incubação a 37 C0, acrescentou-se meio fresco e 20 U/mlde IL-2 humano (R&D) e as células foram incubadas a 37 C0 por mais 3-4dias. Esse ciclo de estimulação foi repetido duas vezes.Eliminação de células por Células T citotóxicas usando ensaio de liberaçãode cromo

O ensaio de liberação de 51Cr padrão foi realizado conformedescrito em (Brossart 2001). As células-alvo foram pulsadas com 50 pg/mlde peptídeo por 2 h e marcadas com cromato de sódio 51Cr em RP10 por 1 ha 37°C. 104 células foram transferidas para uma cavidade de uma placa decavidade de 96 cavidades com fundo em forma redondada. Foram acrescen-tados diferentes quantidades de linfócito T citotóxico para dar o volume finalde 200 μΙ e a incubação ocorreu por 4 h a 37 0C. Ao final do ensaio, os so-brenadantes (50 μΙ/cavidade) foram colhidos e contados em contador beta.

O percentual de Iise específico foi calculado como: 100 χ (liberação experi-mental - liberação espontânea/liberação máxima-liberação espontânea). Aliberação espontânea e a liberação máxima foram calculadas na presençade meio ou Triton X-100 a 2%, respectivamente. A especificidade de antíge-no de Iise de célula tumoral também foi determinada em ensaio inibitório dealvo a frio, analisando-se a capacidade do peptídeo pulsado com células T2não marcadas de bloquear a Iise de células tumorais na razão de 20:1 (ra-zão inibidor: alvo).

Detecção de células T citotóxicas com tetrâmeros HLA.

A coloração do tetrâmero foi feito como indicado anteriormente(Walter 2003) ou com pequenas modificações. Em resumo, foram produzi-das moléculas HLA-A*0201 recombinantes biotiniladas sem o domíniotransmembrana e biotiniladas no terminal carbóxi da cadeia pesada comodescrito anteriormente (Altman 1996). Os tetrâmeros fluorescentes foramObtidos pela. co-incubação de HLA-A*0201 biotinilado com streptavidina-PEou streptavidina-APC (Molecular Probes, Leiden Holanda) em uma razãomolar de 4:1. Para as análises dos tetrâmeros, as células foram lavadas emPBS/BSA/EDTA contendo 10 mg/ml de azida de sódio (Merck, Darmstadt,Alemanha) e coloridos a 4 0C por 20 minutos no mesmo tampão contendo osanticorpos CD4FITC e CD8-PerCP clone SK1 (ambos da Becton Dickinson).Após os experimentos de estimulação de microesferas, acrescentou-se100 pg/ml de streptavidina não marcada (Sigma). As células foram lavadasem PBS contendo 2% FCS a 2% inativado por calor (PAN Biotech1 Aidenba-ch, Alemanha), 2 mM de EDTA sódico e 10 mg/ml de azida de sódio e te-trâmero colorido a 4 °C por 30 minutos em PBS/FCS/EDTA/Azida mas inclu-indo FCS a 50%. Os reagentes de tetrâmero foram sempre usados em con-centrações de MHC de 5 pg/ml. AS células coradas foram intensamente la-vadas em PBS/FCS/EDTA/Azida e fixadas com formaldeído a 1% (Merck).As células foram analisadas em um FACSCalibur de quatro cores (BectonDickinson). Os resultados são mostrados ilustrativamente em detalhe para oIMA-MET-001 tanto para o método A como o método B. Os resultados paraos outros peptídeos HLA de classe I são sintetizados na Tabela 8.

A. Eliminação citotóxica do alvo

Os resultados foram publicados por (Schag 2004). As informa-ções relevantes são sintetizadas a seguir.

No primeiro etapa, a citotoxicidade do linfócito T citotóxico indu-zido foi analisada em um ensaio padrão de liberação de 51Cr usando célulasT2 carregadas com peptídeos e células dendríticas autólogas como alvo.Como mostrado na figura 3, a linhagem de linfócito T citotóxico obtida depoisde duas semanas de re-estimulações evidenciou eliminação antígeno-específica. As células T somente reconheceram células T2 ou células den-dríticas revestidas com o peptídeo cognato, enquanto que não Iisaram célu-las-alvo pulsadas com peptídeos irrelevantes que se ligaram a HLA-A2 deri-vados de proteína sobrevivente ou transcriptase reversa de HIV-1, confir-mando a especificidade da atividade citolítica.

Na segunda etapa, a capacidade do linfócito T citotóxico induzi-do in vitro de Iisar células tumorais que expressam proteína c-Met de formaendóqena foi analisada usando com linhagens de células HLA-A*02 positi-vas HCT 116 (câncer de cólon), A498, MZ 1257 (carcinoma de células re-nais, RCC), MCF-7 (câncer de mama), Mel 1479 (melanoma maligno) eU266 (mieloma múltiplo) que expressam c-Met como alvo em um ensaio pa-drão de liberação de 51Cr. A linhagem Croft de célula B transformada EBV(HLA-2+/c-Met) e a linhagem de células de câncer de ovário SK-OV-3 (HLA-A3+/c-Met+) foram incluídas para determinar a especificidade e a restriçãoao HLA do linfócito T citotóxico. Como mostrado na figura 4, o linfócito T cito-tóxico específico de peptídeo c-Met foi capaz de Iisar de forma eficiente ascélulas malignas que expressaram o HLA-A2 e o c-Met. Não houve reconhe-cimento de células de câncer de ovário SK-OV-3 ou células Croft demons-trando que a apresentação do peptídeo c-Met no contexto de moléculasHLA-A2 nas células tumorais é necessária para uma Iise eficiente das célu-las-alvo e para confirmar a especificidade antigênica e a restrição MHC doCTL. As células T induzidas in vitro não reconheceram as células K 562, in-dicando que a atividade citotóxica não foi mediada por células NK.

Para confirmar ainda mais a especificidade antigênica e a restri-ção MHC das linhagens de linfócito T citotóxico induzidas in vitro, realiza-seensaios de inibição de alvo a frio. A Iise das células-alvo (U 266 e A 498)pôde ser bloqueada em ensaios de inibição de alvo a frio. A adição de célu-las T2 frias (não marcadas com 51Cr) pulsadas com o peptídeo cognato re-duziu a Iise das células tumorais, enquanto que as células T2 pulsadas comum peptídeo irrelevante não mostrou nenhum efeito (figura 5).

B. Detecção de células T com tetrâmeros HLA.

Células T CD8 enriquecidas de um doador A*02 sadio foram es-timuladas 3 vezes com contas revestidas na presença de 10 nM de anticorpoCD28 mais 10 nM de um complexo A*02 irrelevante (painel esquerdo) ouA*02 redobrados com os antígenos indicados (painéis central e direito). Osantígenos indicados eram os peptídeos NLVPMVATV de CMV pp65 (Wills1996), o peptídeo modificado ELAGIGILTV de Melan-A/MART-1 (Kawakami1994) e o peptídeo IMA-MET-001. Todas as linhagens de células T foramcoradas na superfície com anticorpo CD8-PérCP, tetrâmero-PE cognato (fi-gura 6, painéis esquerdo e central) e tetrâmero APC A*02/ILKEPVHGV (pai-nel direito). O percentual de células tetraméricas positivas entre os linfócitosCD8+ é indicado em cada gráfico.

Imunoqenicidade in vitro do peptídeo HLA de classe Il IMA-MMP-001 conti-dos no IMA

O IMA contém um peptídeo HLA de classe Il de metaloproteina-se matricial 7, o IMA-MMP-001. Para testar os peptídeos no que concernesua imunogenicidade in vitro e sua características de ligar-se promiscuamen-te, foram geradas células T CD4+ a partir de células mononucleares autólo-gas de sangue periférico (PBMC) de doadores sadios com diferentes genóti-pos HLA usando o peptídeo IMA-MMP-001 e a atividade dessas células Tauxiliares foi testada com coloração de citoquina intracelular em citometriade fluxo.

Primeiramente, as células T CD4+ foram geradas (iniciada ("pri-med")) in vitro por estimulação repetida de células mononucleares de san-gue periférico (PBMC) de doadores sadios com o peptídeo específico a sertestado na presença de IL-12. O priming foi feito usando-se células dendríti-cas autólogas geradas de monócitos sangüíneos dos doadores. Na segundaetapa, a atividade das células T CD4+ específicas para aquele peptídeo de-terminado foi testada via medição da produção de IFNy por coloração deIFNy intracelular usando-se anticorpo marcado com fluorescência. A análisefoi feita por citometria de fluxo (FACS).Geração de células dendríticas (CDs)

Células dendríticas humanas foram preparadas a partir dePBMCs de sangue recém tirado de doadores sadios. Os PBMCs foram iso-lados usando-se um gradiente de densidade Ficoll (Lymphocite SeparationMédium, PAA Laboratories GmbH, Pasching, Áustria). As células obtidasforam lavadas, ressuspendidas em meio X-Vivo 15 suplementado com50 U/ml de penicilina, 50 pg/ml de streptomicina e 2 mM de L-glutamina (Bi-oWhittaker, Verviers, Bélgica) e colocadas na placa a uma densidade de7 χ 106 células/ml. Depois de 2 horas a 37 0C, os monócitos aderidos foramcultivados durante 6 dias ém meio X-Vivo com 100ng/ml de GM-CSF e40 ng/ml de IL-4 (AL-lmmunoTools, Friesoythe, Alemanha). No sétimo dia,as células dendríticas imaturas foram ativadas com 10 ng/ml de TNF-α (R&DSystems, Wiesbaden, Alemanha) e 20 pg/ml de poly(IC) (Sigma Aldrich, Ste-inheim, Alemanha) por 3 dias. O estado de diferenciação das células dendrí-ticas foi examinado por citometria de fluxo, as células dendríticas madurassendo predominantemente CD14-, CD40-positivas, CD80-positivas, CD83-positivas, CD86-positivas e HLA-DR+ (dados não exibidos).Geração de células T CD4+ específicas de antíqeno

Para gerar células T CD4+, 106 PBMCs foram estimulados com2 χ 105 células dendríticas autólogas. Depois do priming, a reestimulação foifeita a cada 6 a 8 dias com PBMCs autólogos criopreservados. Para a esti-mulação, as células foram pulsadas com 5 pg/ml de peptídeo por 90 minutosa 37°C e irradiadas (60 Gy1 Gammacell 1000 Elite, Nordion International Inc.,Ontário, Canadá). AS células foram incubadas em placas de 96 cavidades (7cavidades por doador e por peptídeo) com meio para célula T: RPMI 1640contendo HEPES e L-glutamina (Gibco, Paisley, RU) suplementado com10% de soro humano inativado por calor (PAA, Cõlbe, Alemanha), 50 U/mlde penicilina, 50 pg/ml de streptomicina e 20 pg/ml de gentamicina (BioWhit-taker) na presença de 10 ng/ml de IL-12 (Promocell, Heidelberg, Alemanha).Depois de 3 a 4 dias de co-incubação a 37°C, foi acrescentado meio frescocom 80 U/ml de IL-2 (Proleukin, Chiron Corporation, Emeryville, CA, EUA) e5 ng/ml de IL-7 (Promocell). As análises foram realizadas depois da terceirae da quarta estimulação por coloração de IFNy intracelular.

Coloração de IFNy intracelular

As PBMCs criopreservadas foram descongeladas, lavadas duasvezes em meio X-Vivo 15 a 107 células/ml de meio de célula T e cultivadaspor uma noite para reduzir a produção de IFNy não específico (Provenzano2002). No dia seguinte, as PBMCs foram pulsadas com 5 pg/ml de peptídeodurante 2 horas, lavadas três vezes com meio X-Vivo 15 e incubadas comcélulas efetoras na proporção de 1:1 durante 6 horas. Acrescentou-se Golgi-Stop (Becton Dickinson, Heidelberg, Alemanha) para as últimas 4 horas deincubação. As células foram analisadas usando-se o kit Cytofix/CytopermPlus (Becton Dickinson) e anticorpos SK1 clonados CD4-FITC- (ImmunoTo-ols), IFNy-PE e CD8-PerCP (Becton Dickinson). Após coloração, as célulasforam analisadas em um FACSCaIibur de três cores (Becton Dickinson).

Para gerar células T CD4+ antígeno-específicas, as PBMCs de 4doadores sadios com diferentes alelos HLA-DR (figura 7) foram estimuladascom o uso de células dendríticas autólogas pulsadas com antígenos. O sis-tema usado para leitura de produção de células T CD4+ antígeno-específi-cas foi avaliar a produção de IFNy por citometria de fluxo. As células T foramanalisadas depois da terceira e da quarta estimulação por coloração de IFNyintracelular mais coloração de CD4-FITC e CD8-PerCP para determinar opercentual de células produtoras de IFNy em subpopulações específicas decélulas T. Em todos os experimentos, as estimulações com peptídeos irrele-vantes e sem peptídeos foram realizadas como controles negativos. A res-posta IFNy foi considerada positiva se a detecção de pélulas T CD4+ produ-toras de IFNy é mais de duas vezes maior do que o controle negativo.(Horton 2004). Em três dos quatro doadores foi possível gerar células TCD4+ que reagiam especificamente com o peptídeo objeto de interesse (fi-gura 7). Não foi possível observar respostas das células T no doador 4 nemdepois da terceira nem da quarta estimulações. As freqüências maiores decélulas T CD4+ produtoras de IFNy específicas para IMA-MMP-001 foramobservadas nos doadores 1 e 2, respectivamente.

Assim, o IMA-MMP-001 é um Iigante promíscuo capaz de provo-car respostas de células T CD4+ em 3 entre 4 doadores sadios portandodiferentes alelos HLA. De acordo com as previsões de ligação e os resulta-dos obtidos, é bem provável que o peptídeo seja apresentado por HLA-DRB1*0101, HLA-DRB1*0401/*408 e HLA-DRB1*1101. Todos os quatro ale-Ios têm resíduo glicina na posição 86 e resíduo de ácido aspártico na posi-ção 57 de suas cadeias β (dados não exibidos). Portanto, eles têm motivosde ligação bastante similares, compartilhando características de ligação paraseus bolsos de ligação P1 e P4 (Rammensee 1997; Hammer 1993; Marshall1994). O doador 4 porta junto alelos HLA-DRB1*0318 e DRB1*1401 commotiyos de ligação bem diferentes. Isso explicaria porque não foi possívelprovocar uma resposta de célula T com células desse doador, quando seutilizou os peptídeos antes mencionados.Os efeitos nos Seres Humanos

Peptídios curtos, semelhantes no comprimento e na distribuiçãodos aminoácidos àqueles aqui descritos, foram introduzidos em milhares depacientes em diferentes testes clínicos de fase 1 a 3 desde 1996. Em ne-nhum desses estudos foram relatados eventos adversos graves. Além disso,o peptídeo IMA-MUC-001 contido no IMA já foi utilizado para vacinação, ten-do sido carregado em células dendríticas em um teste iniciado pelos pesqui-sadores na Universidade de Tübingen, Alemanha, e foi muito bem tolerado(Wierecky 2005).

Os peptídeos com N0 de ID de SEQ 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10foram testados em 30 pacientes, 26 dos quais concluíram um curso de vaci-nação que se estendeu por um período de 10 semanas. Um grande índicede pacientes (74%) apresentou uma resposta imune específica contra asseqüências de peptídeos incluídas na vacina. Já com esse pequeno corte defase I, a função biológica in vivo de 8 dos 9 peptídeos (N°. de ID de SEQ 2,3, 4, 5, 6, 7, 8 e 9) que se ligaram a MHC de classe I (allelo HLA-A*02) pôdeser confirmada de acordo com os resultados de ensaio ELISPOT ampliadoe/ou coloração de tetrâmeros conduzidos conforme descrito mais adiante. Opeptídeo com N°. de ID de SEQ 1 (IMA-MMP-001), para o qual seria neces-sário um tipo de leitura diferente, não pôde ser testado devido à disponibili-dade limitada de PMBC do sangue do paciente.

Parâmetros Imunolóqicos Específicos (Monitoramento Imunológico)

Até a presente data, o monitoramento imunológico é prática co-mum em milhares de pacientes de diversos estudos de vacinação terapêuti-ca (Romero 2004). Até hoje foram reportados inúmeros métodos diferentesde monitoramento imunológico, entre eles ensaios funcionais e específicos.Os componentes imunogênicos da vacina terapêutica IMA são peptídeosque se ligam a HLA que deveriam induzir linfócitos T específicos in vivo. Es-ta ativação irá levar à sua proliferação e aquisição de funções efetoras, queincluem sua capacidade de secretar citoquinas quando do contato com antí-genos.

Como um marcador substituto da ativação de células T, é possí-vel testar por meio de ensaios ELISPOT a freqüência das células mononu-cleares secretoras de citoquinas específicas no sangue. Esses ensaios sãoespecialmente adequados para esse propósito, uma vez que se baseiam emcélula única e resultam em um parâmetro (isto é, o número de células queformam spots entre as células mononucleares) que se espera estarem dire-tamente relacionadas com a verdadeira freqüência dos linfócitos T específi-cos de antígenos secretores de citoquinas em amostras de sangue. Dessaforma, os ensaios também permitem processar quantidades relativamentegrandes de amostras e peptídeos em paralelo e eles já têm sido amplamenteusados em estudos de monitoramento imunológico em diversos estudos clí-nicos até agora (Schmittel 2000).Resposta Imune !

A atividade/eficácia imunológica pode ser descrita pela análiseda resposta das células Τ. A experiência e õs resultados de diferentes estu-dos clínicos em relação à resposta imune para diferentes indicações podeser encontrada na literatura. As respostas de células T de até 100% foramcJescritas por Disis et al.., 1999, em pacientes com câncer de ovário e demama. A disseminação de epitopos em 84% dos pacientes (n = 64) em umestudo de 3 braços com antígeno Her2/neu mais GM-CSF foi relatada porDisis et al.. em 2000 em pacientes com câncer de ovário e de mama e emcarcinoma de pulmão de células não pequenas. Outros autores publicaramresultados de respostas de células T de 33% e 83% em pacientes com me-lanoma (Keilholz/Schadendorf, 2003; Slingluff et al.., 2004). Gauder-nack/Gjertsen, 2003 reportaram acerca de resposta imune de diversos clo-nes de células T CD4-positivas e CD8+ específicas para o antígeno usadonesse estudo.

Além disso, foram apresentados resultados por Wierecky et al..;ASCO 2005: células dendríticas derivadas de monócito maduros autólogosforam pulsadas com dois peptídeos que se ligam a HLA-A2 deduzidos dopeptídeo MUC1. Para o recrutamento e a ativação das células 7 CD4+, ascélulas dendríticas foram novamente incubadas com os peptídeos PADREque se ligam a PAN-DR. As vacinações foram aplicadas de forma subcutâ-nea a cada duas semanas, quatro vezes, e repetidas mensalmente até aprogressão do tumor nessa abordagem terapêutica. Após a 5§ injeção decélulas dendríticas, os pacientes receberam ainda 3 injeções/semana de IL-2de baixa dosagem (1 Mio IE/m2). O aumento do precursor de célula T foimonitorado via IFN-γ ELISPOT e ensaios de liberação de 51Cr. Além disso, acapacidade das PBMC de produzir citoquinas em resposta a desafio comepitopos relacionados a vacina foi testada via reação em cadeia da polime-rase (PCR) quantitativa e em tempo real.

Nesse estudo de Wierecky et al.., foram detectadas respostas invivo de células T específicas do peptídeo MUC1 em células PBMC de todosos pacientes com OR. Essas células T induzidas in vivo conseguiram reco-nhecer células-alvo pulsadas com o peptídeo cognato ou células tumoraisalogênicas combinadas (A498) expressando MUC1 constitutivamenté deforma antígeno e HLA restrita depois de reestimulação in vivo. Nos pacientesque respondem ao tratamento, puderam ser detectadas respostas das célu-las T ao antígenos não usados na vacinação, como por exemplo adipofilina,telomerase ou OFA, indicando que poderia ocorrer espalhamento de epito-pos. Foi possível detectar respostas proliferativas ao peptídeo PADRE em11/16 pacientes, sendo que em alguns pacientes isso ocorreu já após a se-gunda vacinação. Conclusão: a análise da disseminação dos epitopos empacientes vacinados pode ser um parâmetro útil para correlacionar respostasclínicas e imunológicas.

RESPOSTAS IMUNES IN VIVO

Formulação do Teste Clínico

A formulação do teste clínico de IMA consiste em:

- Liofilizado, incluindo 11 peptídeos em ampolas de 3 ml

- Diluente (hidrogenocarbonato de sódio a 4,2%)

Formas de dosagem de IMA

Pó para injeção, em ampolas de, vidro de 3 ml. Informação deembalagem: 4 ampolas por caixa. O diluente consiste em 700 μΙ de hidroge-nocarbonato de sódio embalado em frascos de 250 ml. 1 ampola de IMA éreconstituída pela adição de 700 μΙ de hidrogenocarbonato de sódio a 4,2%(diluente). A fim de dissolver o IMA, a ampola e o diluente são agitados vigo-rosamente por 3 minutos e ultra-sonicados por 1 minuto. Depois disso, aampola é novamente agitada por 1 minuto. 500 μΙ dessa solução são aplica-dos até 30 minutos após a reconstituição.

VacinaçãoNo presente estudo, pacientes de carcinoma de células renaisem estágio avançado receberam oito vacinações ao longo de dez semanas.No total, foram admitidos 24 pacientes do tipo HLA-A*02 positivo. A vacinafoi aplicada na forma intradérmica (GM-CSF mais IMA) nos dias 1, 2, 3, 8,15, 22, 36 e 64. As amostras foram tiradas em diferentes time points duranteo estudo e as células T contidas nas células mononucleares do sangue peri-férico (PBMC) foram isoladas com sangue heparina por centrifugação emgradiente de densidade, contados com hemocitômetros e foram preservadospara serem armazenados sob temperatura criogênica até análise. O solici-tante da patente realizou então dois ensaios ELISPOT de rotina diferentes eum ensaio Tetramer de rotina.

Ensaio ELISPOT amplificado

No ensaio "ELISPOT ex vivo", as células são descongeladas apartir de diferentes time points, o número de células vivas é contado e asamostras são testados por um dia de incubação com diferentes peptídeos oucontroles em cavidades em triplicata. O ensaio ELISPOT ex vivo fornecedados quantitativos muito mais rapidamente se comparado com outros en-saios. Além disso, este é o único ensaio que permite medir o peptídeo HLAde classe Il (IMA-MMP-001) contido em IMA. No entanto, esse ensaio temsensibilidade limitada e só se esperou obter dados positivos no caso de res-postas muito fortes das células T em comparação a respostas imunes aosvírus a partir da memória (recall).

No ensaio "ELISPOT amplificado, as células de diferentes timepoints são agrupadas, contadas e pré-estimuladas com antígenos durantecerca de duas semanas, para permitir que células específicas se dividam. Ascélulas são então coletadas da cultura, recontadas e depois testadas, comodescrito acima, quanto à produção de mancha IFN-γ após reestimulaçãocom antígeno por um dia. As células ativadas sob essas condições secretamIFN-γ, que é detectado pelo método tipo sanduíche anticorpo-enzima. Asmanchas são visualizadas por reação formadora de cor e contadas com câ-mera automática digital de alta resolução (aqui chamada de "leitora ELIS-POT"). A quantidade de manchas que se correlaciona com a freqüência realdos linfócitos T ativados específicos de antígeno ativados na amostra é de-terminada por um algoritmo de imagens tiradas do leitor ELISPOT. Esse en-saio foi inúmeras vezes usado para detectar resposta de célula T a antíge-nos tumorais aplicados como vacina em diversos testes clínicos de terceiros.A possibilidade de dados falso-positivos devido a "priming in vitro" de célulasT foi descartada com o uso de diversos controles utilizados no presente en-saio. Em comparação ao Ensaio Tetramer abaixo, o presente ensaio forneceinformação funcional adicional, isto é sobre liberação de IFN-γ citoquina.

O ensaio ELISPOT amplificado foi realizado para os 28 pacien-tes no estudo e todos os antígenos apresentados no IMA antes e durante oprotocolo de vacinação em diferentes time points. A figura 10 mostra exem-plos representativos de uma resposta de célula T induzida por IMA identifi-cada pelo ensaio ELISPOT amplificado para o mesmo paciente e antígeno.As colunas superior e inferior representam respectivamente o antígeno decontrole negativo HIV-001 e o TUMAP IMA-CCN-001 simples usado paraleitura. O número de células positivas é informado para cada experimento. Acoluna à esquerda mostra os ELISPOTs de amostras agrupadas, tiradasantes do protocolo de vacinação enquanto que a coluna à direita mostra osELISPOTs das amostras agrupadas, tiradas durante o protocolo de vacina-ção. Embora o antígeno de controle não tenha levado a nenhum aumento donúmero de manchas após a indução de uma resposta imune, a injeção deIMA levou à multiplicação do número de manchas para IMA-CCN-001. Onúmero de células positivas, que secretam IFN-γ, aumentou de 27-34 (antesda vacinação) para 100-141 (após a quarta e quinta injeções). O tratamentocom IMA resultou em um aumento de freqüência de linfócitos T ativados es-pecíficos para o antígeno IMA-CCN-001 nesse paciente.

Ensaio amplificado com tretâmeros

No ensaio "Tetramer amplificado", células de diferentes time po-ints foram descongeladas, contadas e pré-estimuladas com antígenos duran-te cerca de duas semanas, para permitir que células T específicas do antí-geno se dividissem. As células foram então coletadas da cultura, recontadase coloridas com multímeros MHC rotulados com PE- e APC-fluorcromo maisanticorpos para definir as células T CD8+ (uma cavidade por coloração etime point). Os multímeros MHC são complexos recombinantes peptídeo-MHC que são multimerizados e conjugados com um corante fluorescente.Foram usados somente os multímeros tetraméricos HLA-A*0201 que foremtotalmente equivalentes àqueles originalmente introduzidos no campo (Alt-man 1996), aqui chamados abreviadamente de tetrâmeros. As amostras co-loridas e fixadas foram analisadas em um citômetrojde fluxo com procedi-mentos padrão bem-conhecidos no estado da técnica, resultando em umconjunto de dados baseado em célula única para cada amostra. Esse ensaio"Tetramer amplificado" é de altíssima sensibilidade, porém menos quantitati-vo em comparação aos ensaios ex vivo.

Para a análise primária dos dados dos tetrâmeros, a quantidadede células T CD8+ totalmente avaliadas, células positivas de tetrâmero sim-ples e células positivas de tetrâmeros duplos por amostra, foi contada ele-tronicamente a partir de arquivos de citometria em modo lista utilizando paratanto um software comercial. As células T CD8+ foram identificadas por"scatter gating" anterior e lateral em linfócitos vivos e "subgating" em eventosCD8+ CD3+ baseados em fluorescência de anticorpos. A definição de "ga-tes" de linfócitos e "gates" CD3/CD8 foi idêntica para todas as colorações deum paciente em um ensaio. Foram identificadas populações tetrâmero-positivas a partir de células T CD8+ pela análise de diagramas de pontosduplo tetrâmero com quadrantes ou portas ("gates"). A definição de célulastetraméricas positivas foi idêntica para cada condição de coloração para de-terminado paciente de um ensaio e se baseou em populações de célulaspassíveis de serem reconhecidas. O ensaio Tetràmer amplificado foi realiza-do para os 28 pacientes no estudo e todos os antígenos apresentados noIMA antes e durante o protocolo de vacinação em diferentes time points.

A figura 11 mostra exemplos representativos de respostas decélulas T induzidas por IMA identificadas pelo ensaio de coloração ampliadoTetramer. Os painéis superiores e intermediários representam diagramas depontos (dot plots) bidimensionais gated em linfócitos CD3+, enquanto que ospainéis inferiores são gated em linfócitos CD3+ CD8+. Os pacientes, timepoints e colorações são os indicados para cada coluna. Na figura 11 A, aresposta imunológica ao IMA-CCN-001 no paciente 03-004, já demonstradono ensaio ELISPOT (figura 10), foi confirmado pelo ensaio Tetramer. É pos-sível identificar uma população de células positivas para o tetrâmero CD3+ eIMA-CCN-001 depois da 49 e 59 injeção de IMA (V6+V7; painel intermediá-rio) ao etapa que não foi detectada população positiva para o tetrâmero K67-001 (painel superior). As células positivas IMA-CCN-001 aumentaram de0,03% (antes da vacinação) para 0,78% dos linfócitos (V6+V7; painel inferi-or) após as primeiras três injeções.

O paciente 03-003 não apresentou resposta imunológica contrao peptídeo RGS-001 (figura 11B; painel superior), mas desenvolveu respostapositiva para tetrâmero IMA-CCN-001 durante o curso do protocolo de vaci-nação (S1+V1; amostras tiradas antes da vacinação; V4+V5: amostras tira-das no 8e e 15s dia; V6+V7: amostras tiradas no 229 e 36e dia; V8+FU: a-mostras tiradas no 649 dia (última vacinação) e depois de 85 a 92 dias, finaldo estudo). No painel intermediário, as colunas 3 e 4 mostram populações celu-lares positivas para CCN-001 e CD3+ distintas. Durante o decurso da vacina-ção, a quantidade dessas células aumentou de 0,02% antes da vacinação para0,8% dos linfócitos (painel inferior; coluna 3) após as três primeiras injeções ediminuiu para 0,31 % após o 649 dia (painel inferior; coluna 4; V8+FU).

Para alguns pacientes escolhidos, o ensaio tetramer amplificadofoi realizado para time points únicos, isto é, as amostras de sangue não fo-ram agrupadas, permitindo uma avaliação mais precisa da cinética das célu-las T, exemplo do que pode ser visto na figura 12. Mostra-se a cinética demagnitude da célula T observada em ensaios tetramer amplificado de timepoint único é mostrada para o paciente 05-001. Os antígenos associados atumor apresentados em IMA (grupo TUMAP) foram mais elevados no 229,369 e 649 dias (V6, V7 e V8), enquanto que a resposta ao peptídeo IMA-CCN-001 alcançou seu pico antes no 229 dia (V6). O controle positivo HBV-001 resultou em resposta ainda mais rápida, que alcançou seu ponto máxi-mo no 159 dia (V5).

Dois pacientes que apresentaram uma resposta muito alta aoIMA-CCN-001 foram selecionados para confirmar os resultados do ensaiotetramer amplificado em um experimento não amplificado. Esses ensaiostetramer ex vivo foram realizados sem cultivar as células por duas semanas.

Os resultados foram sintetizados na Tabela 9 abaixo. São mos-trados todos os resultados que podem ser avaliados, de ensaios tetramer exvivo e ensaios tetramer amplificados paciente-antígeno-combinados, sendoque foi identificada uma resposta induzida por vacina Ino ensaio amplificado.Para o método "ex vivo", indica-se% tetramer+ entre células T CD8+ totais.Quanto ao método de avaliação "amplificado, de rotina", podem-se analisarsubpopulações de linfócitos T CD8+, e mostra-se uma segunda reavaliaçãodos dados da rotina ("amplificada, quantitativa") com os cálculos baseadosnos linfócitos T CD8+ totais. Calculou-se o "fator de amplificação" sempreque uma discreta população tetramer+ foi observada em ensaio ex vivo eensaio tetramer amplificado.

Os resultados demonstram claramente que as respostas imuno-lógicas medidas com o ensaio amplificado específico não se devem à ex-pansão celular durante as duas semanas de incubação, mas se baseiam emlinfócitos "ex vivo" anteriormente presentes no sangue do paciente.Tabela 9:Comparitivo das magnitutes de respostdas celulasT,calculadas a partir de ensaio ex vivo e ensaio tetramer amplificado.

<table>table see original document page 89</column></row><table><table>table see original document page 90</column></row><table>Resposta Global dos Pacientes

As respostas das células T medidas pelos ensaios acima descri-tos foram avaliadas para todos os peptídeos contidos em IMA para os 28pacientes em diferentes time points do estudo. Um paciente apresentou re-sultado "reativo", isto é, mostrou uma resposta imune induzida por vacina seuma das amostras de sangue coletadas em um ponto posterior à vacinaçãocontivesse linfócitos tetramer+ ou secretasse IFN-γ por ocasião de estimula-ção com um dos peptídeos.

Como esperado, os pacientes reagiram individualmente com re-lação aos diferentes peptídeos contidos em IMA. A despeito do pequenocontingente de pacientes, obteve-se um grau de resposta surpreendente-mente bom, uma vez que a maioria dos pacientes (23 dentre os 27 pacientespassíveis de avaliação) desenvolveram uma resposta imune a ao menos umpeptídeo. Oito dos 27 pacientes passíveis de avaliação (30%) até mesmomostraram resposta de célula T contra múltiplos peptídeos associados a tu-mores.

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<110> Immatics biotechnologies GmbH

<120> Peptídios associados a tumores que se ligam a moléculasde classe I ou II do antígeno leucocitário humano (HLA) ecorrespondente vacina anti-câncer

<130> I30559PCT

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Ser Gln Asp Asp Ile Lys Gly Ile Gln Lys Leu Tyr Gly Lys ArgSer

1 5 10 15

<210> 2<211> 9<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 2

Val Met Ala Gly Asp Ile Tyr Ser Val15<210> 3<211> 9<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 3

Ser Val Ala Ser Thr Ile Thr Gly Val1 5<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Ala Leu Ala Asp Gly Val Gln Lys Val

1 5

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Leu Leu Gly Ala Thr Cys Met Phe Val1 5<210> 6<211> 9<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 6

Ser Val Phe Ala Gly Val Val Gly Val

1 5

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

Ala Leu Phe Asp Gly Asp Pro His Leu15<210> 8<211> 9<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 8

Tyr Val Asp Pro Val Ile Thr Ser Ile15<210> 9<211> 9<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 9

Ser Thr Ala Pro Pro Val His Asn Val15<210> 10<211> 9<212> PRT15 <213> Homo sapiens<400> 10

Leu Ala Ala Leu Pro His Ser Cys Leu<210> 11<211> 10<212> PRT

<213> Hepatitis B virus<400> 11

Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val1 5 10

Claims (36)

1. Peptídeo associado a tumor, selecionado dentre o grupo depeptídeos compreendendo pelo menos uma seqüência de acordo com aSEQ ID N- 1 ou SEQ ID N9 2 ou uma das suas variantes das mesmas, des-de que o peptídeo não seja o polipeptídeo humano intacto associado a tumor.

2. Peptídeo associado a tumor de acordo com a reivindicação 1,em que o peptídeo consiste ou consiste essencialmente em uma seqüênciade aminoácidos de acordo a SEQ ID N9 1 ou SEQ ID N9 2 ou uma das vari-antes das mesmas.

3. Peptídeo associado a tumor de acordo com a reivindicação 1ou 2, em que o dito peptídeo tem um comprimento total entre 9 e 100, depreferência entre 9 e 30, e com maior preferência ainda entre 9 e 16 amino-ácidos.

4. Peptídeo associado a tumor de acordo com qualquer umasdas reivindicações de 1 a 3, tendo a capacidade de se ligar a uma moléculado complexo principal de histocompatibilidade humana (MHC) classe I ou II.

5. Peptídeo associado a tumor de acordo a reivindicação 4, ten-do a capacidade de se ligar a pelo menos uma molécula adicional do com-plexo principal de histocompatibilidade humana (MHC) classe II.

6. Peptídeo associado a tumor de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 5, em que o peptídeo inclui ligações não-peptídicas.

7. Peptídeo associado a tumor de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 6, em que o peptídeo é uma proteína de fusão, em par-ticular compreendendo aminoácidos de terminal N da cadeia invariante HLA-DR associada a antígeno (li).

8. Ácido nucléico codificando um peptídeo de acordo com qual-quer uma das reivindicações de 1 a 7.

9. Ácido nucléico de acordo com a reivindicação 8 que sejaDNA, cDNA, PNA, CNA1 RNA ou combinações dos mesmos.

10. Vetor de expressão capaz de expressar um ácido nucléicode acordo com a reivindicação 8 ou 9.

11. Peptídio associado a tumor de acordo com qualquer umadas reivindicações de 1 a 7, um ácido nucléico como definido na reivindica-ção 8 ou 9 ou um vetor de expressão como definido na reivindicação 10 parauso em medicina.

12. Célula hospedeira compreendendo um ácido nucléico comodefinido na reivindicação 8 ou 9 ou um vetor de expressão como definido nareivindicação 10.

13. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 12 que se-ja célula recombinante de RCC ou Awells.

14. Composição farmacêutica compreendendo ao menos umpeptídeo associado a tumor como definido em qualquer uma das reivindica-ções de 1 a 7, um ácido nucléico como definido na reivindicação 8 ou 9 ouum vetor de expressão como definido na reivindicação 10 e um veículo far-maceuticamente aceitável.

15. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 14,compreendendo ainda ao menos um peptídeo adicional compreendendouma seqüência de acordo com qualquer uma das SEQ IDs de No. 3 a 11.

16. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 14ou 15, em que os ditos peptídeos têm um comprimento total entre 9 e 100,de preferência entre 9 e 30, e com maior preferência ainda entre 9 e 16 ami-noácidos.

17. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 14 a 16, em que o no mínimo um peptídeo inclui ligaçõesnão-peptídicas.

18. Composição farmacêutica de acordo com uma das reivindi-cações entre 14 a 17, compreendendo peptídeos consistindo em seqüênciasde aminoácidos de acordo com a SEQ ID No. 1 e/ou SEQ ID.No. 2 e a SEQID No. 3 até SEQ ID. No. 11.

19. Composição farmacêutica de acordo com uma das reivindi-cações entre 14 a 18, em que a quantidade de peptídeo(s) associado(s) atumor presentes em dita composição seja(m) específico(s) de tecido, câncere/ou paciente.

20. Composição farmacêutica de acordo com uma das reivindi-cações entre 14 a 19, compreendendo ainda ao menos um adjuvante apro-priado.

21. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 20,em que dito adjuvante seja selecionado dentre o grupo de fatores estimulan-tes de colônias, tais como o fator estimulante de colônias de granulócitos emacrófagos (GM-CSF).

22. Uso de composição farmacêutica de acordo com uma dasreivindicações entre 14 a 21 como vacina anticâncer.

23. Método de produzir um peptídeo associado a tumor comodefinido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, método este compre-endendo o cultivo da célula hospedeira como definido na reivindicação 12 eo isolamento do peptídeo da célula hospedeira ou do seu meio de cultivo.

24. Método de eliminar células-alvo em um paciente, células-alvo estas que expressem de forma anormal um polipeptídeo compreenden-do uma seqüência de aminoácidos como estipulados em qualquer uma dasreivindicações de 1 a 7, o método compreendendo a administração ao paci-ente de uma quantidade eficaz de um peptídeo de acordo com qualquer umadas reivindicações de 1 a 7 ou um ácido nucléico como definido na reivindi-cação 8 ou 9, ou um vetor de expressão de acordo com a reivindicação 10,em que a quantidade do referido peptídeo ou a quantidade do referido ácidonucléico ou a quantidade do referido vetor de expressão é eficaz para provo-car uma resposta imune da célula antialvo no paciente.

25. Uso de um peptídeo associado a tumor como definido emqualquer uma das reivindicações de 1 a 7 ou de um ácido nucléico comodefinido na reivindicação 8 ou 9 ou um vetor de expressão como definido nareivindicação 10 na produção de um medicamento para destruir células-alvoem um paciente, células-alvo estas que expressem de forma anormal umpolipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos tal como indi-cado em qualquer uma das reivindicações de 1 a 6.

26. Método in vitro para produzir linfócitos T citotóxicos (CTL)ativados, método este compreendendo o contato in vitro do CTL com molé-cuias MHC humanas classe I ou II carregadas com antígenos e expressasna superfície de uma célula apresentadora de antígeno adequada durantetempo suficiente para ativar, de maneira específica para o antígeno, os refe-ridos CTLs, em que o dito antígeno é um peptídeo de acordo com qualqueruma das reivindicações de 1 a 7.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, em que o antíge-no é carregado em moléculas MHC de classe I ou Il expressas na superfíciede uma célula apresentadora de antígeno adequada ao contatar uma quan-tidade suficiente do antígeno com uma célula apresentadora de antígeno.

28. Método de acordo com a reivindicação 27, em que a célulaapresentadora do antígeno compreende um vetor de expressão como defini-do na a reivindicação 10.

29. Linfócitos T citotóxicos (CTL) ativados, produzidos pelo mé-todo como definido em qualquer uma das reivindicações de 26 a 28, quereconheçam seletivamente uma célula que expresse de forma anormal umpolipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos dada em qual-quer uma das reivindicações de 1 a 5 ou 7.

30. Receptor de célula T (TCR) que reconhece uma célula queexpresse de forma anormal um polipeptídeo compreendendo uma seqüênciade aminoácidos como definido em qualquer das reivindicações de 1 a 7, po-dendo o TCR ser obtrido a partir do linfócito T citotóxico (CTL) como definidona reivindicação 29 ou uma molécula funcionalmente equivalente ao TCR.

31. Ácido nucléico codificando um receptor de células T (TCR)como definido na,reivindicação 30.

32. Vetor de expressão capaz de expressar um receptor de célu-la T (TCR) de acordo com a reivindicação 30.

33. Método de eliminar células-alvo, células-alvo essas que ex-pressem de forma anormal um polipeptídeo compreendendo uma seqüênciade aminoácidos como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 5ou 7, método esse compreendendo administrar ao paciente uma quantidadeeficiente de linfócitos T citotóxicos (CTL) como definido na reivindicação 29.

34. Método de eliminar células-alvo, células-alvo essas que ex-pressem de forma anormal um polipeptídeo compreendendo uma seqüênciade aminoácidos como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 5e 7, método esse compreendendo as seguintes etapas:(1) obter linfócitos T citotóxicos (CTL) do paciente;(2) introduzir nas referidas células um ácido nucléico que codifi-ca um receptor de célula T (TCR)1 ou uma molécula funcionalmente equiva-lente, como definido na reivindicação 30; e(3) introduzir as células produzidas na etapa (2) no paciente.

35. Uso de um peptídeo associado a tumor como definido emqualquer uma das reivindicações de 1 a 7, um ácido nucléico como definidona reivindicação 8 a 9 ou um vetor de expressão como definido na reivindi-cação 10, uma composição farmacêutica como definido em qualquer umadas reivindicações de 14 a 21 na produção de um medicamento para destru-ir células cancerígenas em um paciente.

36. Uso de acordo com a reivindicação 35, em que as referidascélulas cancerígenas são células renais cancerígenas.