BRPI0616362A2

BRPI0616362A2 - composiÇÕes e mÉtodos por tratar tumores que apresentam antÍgenos de survivina

Info

Publication number: BRPI0616362A2
Application number: BRPI0616362-9A
Authority: BR
Inventors: Thore A O Hettmann; Pascal Andre Stein; Stephan G Klinz; Stephen D Gillies
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 2005-09-27
Filing date: 2006-09-27
Publication date: 2011-06-14
Also published as: CA2623497A1; RU2411040C2; PL2260862T3; ES2386411T3; EP2260862B1; JP2009509991A; RU2008114624A; DK2260862T3; KR20080054415A; ZA200803672B; CN101267833A; EP2260862A1; WO2007039192A3; US20070104689A1; AU2006299106B2; AU2006299106A1; WO2007039192A2; PT2260862E; EP1931376A2; CN103169959A

Abstract

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS POR TRATAR TUMORES QUE APRESENTAM ANTÍGENOS DE SURVIVINA. A presente invenção refere-se a composições de vacina que estimulam em um ser humano uma resposta imune à survivina humana, desse modo atacando as células doentes de tumor superexpressando survivina. Em particular, a presente invenção fornece composições de vacina compreendendo peptídeos derivado de survivina não-mamífera bem como de survivina mamífera modificada, especialmente humana.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSI-ÇÕES E MÉTODOS POR TRATAR TUMORES QUE APRESENTAM ANTÍGENOS DE SURVIVINA".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se às estratégias de vacinação paratratamento de tumor. Especificamente, a invenção se refere às composiçõesde vacina que estimulam em um ser humano uma resposta imune à survivi-na humana, desse modo atacando as células doentes de tumor superex-pressando survivina. Em particular, a presente invenção se refere às compo-sições de vacina que compreendem peptídeos derivados de survivina de nãomamífero como também de mamífero modificado, especialmente ser huma-no, survivina.

ANTECEDENTES

O sistema imune realiza sua função de vigilância em parte moni-torando as composições de proteína de célula. Em um processo referidocomo apresentação de antígeno de célula T, proteínas dentro de uma célulasão processadas em peptídeos. Um subgrupo dos peptídeos processados,os antígenos, é exportado para a superfície de célula, em uma associaçãoespecífica com um membro de uma classe de receptores conhecidos comoos receptores de complexo de histocompatibilidade principal (MHC). Estescomplexos de MHC-peptídeo são amostrados por células imunes especiali-zadas, células T, por uma interação com proteínas de superfície de célula Tconhecidas como Receptores de Célula T (TCRs). Cada determinada célulaT leva um único TCR em sua superfície. Em uma interação produtiva doTCR da célula T com o complexo de MHC-peptídeo, uma resposta imune éativada que conduz à eliminação da célula que apresenta aquele complexode MHC-peptídeo particular. Geralmente a interação é não produtiva se osantígenos apresentados são derivados do hospedeiro, denominado "auto"antígenos. Geralmente, as respostas imunes são ativadas pela interaçãocom um antígeno derivado de uma proteína estrangeira, por exemplo, comum antígeno derivado de üma proteína constituinte de um vírus infectante.

O objetivo de tratar tumores através de imunização ativa é indu-zir o sistema imune a reconhecer e eliminar as células de tumor. Da mesmamaneira que em qualquer outra célula, os antígenos de peptídeo em célulasde tumor são derivados do repertório de proteínas expressas. Os antígenosenriquecidos de tumor derivados de proteínas diferencialmente expressasem tumores são em princípio um alvo de vigilância imune da mesma manei-ra que antígenos virais estão em células infectadas. Conseqüentemente,seria útil para canalizar ramificações do sistema imune que evoluíram parase opor a uma infecção intracelular com a finalidade de eliminar um tumor.

Uma tal proteína enriquecida de tumor é survivina. As células detumor freqüentemente superexpressam a proteína de survivina que é acredi-tada bloquear a apoptose e desse modo interferir com os mecanismos queprevinem o crescimento anormal de células de tumor. Por outro lado, as cé-lulas normais expressam muito pouca survivina. (vide, por exemplo, Ambro-sini e outros, (1997) Nat. Med., 3:917-921). Entretanto, a survivina é um an-tígeno enriquecido de tumor ou específico de tumor ideal. Seria útil para libe-rar uma forma antigênica da proteína de survivina às células de apresenta-ção de antígeno, de forma que uma resposta imune para survivina pudesseser estimulada. Entretanto, em contraste com células viroticamente infecta-das, survivina, como muitas outras proteínas diferencialmente expressadasem tumores, são proteínas hospedeiras e não ativam o sistema imune. En-tretanto, permanece uma necessidade na técnica de desenvolver composi-ções e métodos eficazes que extraem uma resposta imune eficaz para célu-las de tumor, particularmente aquelas caracterizadas com a superexpressãode survivina.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece composições e métodos eficazesque extraem uma resposta imune eficaz para células de tumor. Especifica-mente, a presente invenção fornece estratégias de vacinação empregandoformas antigênicas de proteínas enriquecidas de tumor como antígenos decélula T. Em particular, a presente invenção fornece uma forma antigênicade uma proteína enriquecida de tumor, survivina.

Conseqüentemente, a presente invenção, em um aspecto, serefere a uma vacina incluindo um ácido nucléico que codifica pelo menos umpeptídeo derivado de uma survivina de não mamífero. Alternativamente, apresente invenção se refere a uma vacina que inclui pelo menos um peptí-deo derivado de uma survivina de não mamífero. A "survivina de não mamí-fero", como empregado aqui, abrange pelo menos qualquer proteína de sur-vivina que tenha um domínio BIR (ou um domínio IAP) com mais do que50% de identidade de aminoácido porém menos do que 90% de identidadede aminoácido com um domínio BIR de survivina humana, por exemplo pelomenos 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% ou 85% de identidade com um do-mínio BIR de survivina humana. A "survivina de não mamífero" também in-clui qualquer proteína de survivina identificada em espécies de não mamífe-ro conhecidas por alguém de experiência ordinária na técnica. O "peptídeo",como empregado aqui, abrange peptídeos com qualquer número de amino-ácidos, incluindo proteína de survivina de tamanho natural. Em particular, umpeptídeo pode conter pelo menos 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30 ou mais aminoáci-dos.

Em uma modalidade preferida, a vacina da presente invençãoinclui um ácido nucléico que codifica um peptídeo derivado de uma survivinade não mamífero. O ácido nucléico pode incluir um promotor de mamífero.Em uma modalidade, o ácido nucléico é um DNA nu. Em outra modalidade,o ácido nucléico é formulado com um reagente que realça a transfecção decélulas de mamífero. A vacina da presente invenção também pode incluir umadjuvante.

Em uma modalidade, o ácido nucléico é parte de uma partículavirótica, por exemplo, uma partícula adenoviral. As partículas adenoviraisadequadas para a invenção incluem aquelas derivadas de adenovírus capa-zes de replicação, ou aquelas derivadas de adenovírus condicionalmentereplicantes ("CRADs") que replica em somente certas células ou somentesob certas condições, ou aquelas derivadas de adenovírus que são incom-petentes para replicação. Outras partículas virais adequadas incluem, porémnão estão limitadas a, partículas virais derivadas de lentivírus ou outros vírusde RNA, vírus adenoassociados, rotavírus, ou vírus da vacínia, para desig-nar entretanto alguns.

Em uma modalidade, a vacina inclui uma bactéria que contém oácido nucléico. Preferivelmente1 a bactéria é uma bactéria entérica, tal comouma Salmonella, Escherichia, ou Klebsiella. Outras bactérias, tal como es-pécies de Listeria, também podem ser empregadas para hospedar tais áci-dos nucléicos. A bactéria pode ser uma bactéria tipo silvestres ou pode con-ter mutações que, por exemplo, atenue sua patogenicidade. Geralmente, épreferido usar uma forma mutante de uma bactéria, como um auxótrofo.

Em outra modalidade preferida, a vacina da presente invençãocodifica ou inclui um peptídeo derivado de uma survivina de não mamífero.Preferivelmente, o peptídeo derivado de uma survivina de não mamífero in-clui um domínio BIR. Tipicamente, o domínio BIR derivado de uma survivinade não mamífero tem mais do que 50% de identidade de aminoácido porémmenos do que 80% de identidade de aminoácido com um domínio BIR desurvivina humana. A survivina de não mamífero é derivada de um pássaro,peixe, réptil, anfíbio, ou outro vertebrado. Em uma modalidade preferida, asurvivina de não mamífero é derivada de frango.

Em algumas modalidades, a vacina da presente invenção codifi-ca ou inclui um peptídeo derivado de uma survivina de não mamífero comuma mutação que promove a apresentação de antígeno de célula T. Por e-xemplo, o peptídeo de mutação de survivina de não mamífero pode conteruma substituição de aminoácido em uma posição que corresponde a Asn97,Thr99, VaM 00, ou Gln101 de survivina humana. Mais especificamente, umasurvivina de não mamífero derivada de frango ou outras espécies pode con-ter uma das seguintes substituições de aminoácido: N97E, T99M, V100L, ouQ101G. Em outro exemplo, um peptídeo derivado da survivina SIX de rãcontém substituições em posições equivalentes Thrl 10 e/ou Serl 12. Em umexemplo específico, um peptídeo derivado de survivina SIX de rã contémsubstituições Thrl IOMet e/ou Serl 12Gly.

Em outras modalidades, a vacina da presente invenção codificaou inclui um peptídeo derivado de uma survivina de não mamífero com umamutação que potencialmente abole a atividade biológica do domínio BIR. Porexemplo, o peptídeo derivado de uma survivina de não mamífero pode con-ter pelo menos uma substituição de aminoácido em uma posição que cor-responde a Arg18, Cys57, Cys60, His77, ou Cys84 de survivina humana.

Além disso, a survivina de não mamífero pode opcionalmenteconter deleções de aminoácido. Em um exemplo, a porção de survivina denão mamífero contém uma deleção de terminal C. Em outro exemplo, a sur-vivina de não mamífero contém uma deleção de terminal N.

Em outras modalidades, a vacina da presente invenção é capazde ativar células T reconhecendo uma seqüência de peptídeo de survivinahumana quando complexa com uma molécula de MHC em uma célula decâncer. Especificamente, uma tal seqüência de peptídeo de survivina huma-na pode ser, por exemplo, LTLGEFLKL (SEQ ID NO:1), CPTENEPDL (SEQID NO:2), ou EPDLAQCFF (SEQ ID NO:3).

Em algumas modalidades, o peptídeo derivado de uma survivinade não mamífero é fundido ou conjugado para uma porção de Fe. Uma por-ção de Fc preferida é derivada de uma região Fc de mamífero, mais preferi-velmente de uma região Fc humana. A porção de Fc pode conter mutaçõesque melhoram a montagem, por exemplo, substituição da cisteína na se-qüência EPKSCDK (SEQ ID NO:4) da articulação de IgGI com uma serina.Como resultado, a porção de Fc pode conter uma seqüência modificadaEPKSSDK (SEQ ID NO:5). A porção de Fc também podem conter mutaçõesque reduzem a imunogenicidade de regiões para as quais uma resposta i-mune não é desejada, por exemplo, a junção entre as porções de proteínade fusão.

Em modalidades selecionadas, o peptídeo derivado de uma sur-vivina de não mamífero funciona de comum acordo com uma molécula efeto-ra que contribui com a resposta imune. Por exemplo, uma tal molécula efeto-ra pode ser uuma porção de citocina incluindo, porém não limitada a, IL-2,IL-7, IL-12, IL-18, IL-21, IL-23, GM-CSF, ou qualquer outra citocina, particu-larmente uma capaz de ativar uma resposta imune de Th1. Uma tal moléculaefetora também pode ser um inibidor de uma citocina que reprime o sistemaimune, por exemplo, um inibidor de STAT3 (por exemplo, uma proteínaSTAT3 negativa dominante tal como STAT3P). As citocinas ou outras molé-culas efetoras também podem conter mutações. Por exemplo, uma citocinapode conter uma substituição de Ser em uma posição que corresponde aCys125 de IL-2.

Desse modo, em modalidades preferidas, a vacina da invençãoinclui um ácido nucléico que codifica um peptídeo derivado de uma survivinade não mamífero e um segundo peptídeo incluindo uma molécula efetoradescrita acima que contribui com a resposta imune. As regiões que codifi-cam o peptídeo de survivina de não mamífero e o peptídeo de molécula efe-tora podem estar em uma única unidade de transcrição, ou em duas unida-des de transcrição separadas. Alternativamente, a vacina da invenção incluium ácido nucléico que codifica um peptídeo derivado de uma survivina denão mamífero e um ácido nucléico separado que codificam um segundo pep-tídeo incluindo uma molécula efetora descrita acima que contribui com aresposta imune.

Em outras modalidades, a vacina da invenção inclui um peptídeoderivado de uma survivina de não mamífero e um segundo peptídeo incluin-do uma molécula efetora descrita acima que contribui com a resposta imune.Em uma modalidade, o peptídeo derivado de uma survivina de não mamíferoé fundido ou conjugado ao peptídeo incluindo uma molécula efetora. A prote-ína de fusão de molécula efetora e survivina de não mamífero pode ser tam-bém fundida ou pode ser conjugada para uma porção de Fc como descritoacima.

Em outro aspecto, a presente invenção se refere a uma vacinaincluindo um ácido nucléico que codifica um peptídeo de survivina de mamí-fero modificada. Alternativamente, a presente invenção se refere a uma va-cina incluindo um peptídeo de survivina de mamífero modificado. O peptídeode survivina de mamífero modificado é biologicamente inerte porém imuno-logicamente substancialmente similar à survivina de mamífero. Como em-pregado aqui, por "biologicamente inerte" é significado um peptídeo de sur-vivina que não é capaz de substancialmente exercer ou afetar uma atividadenormalmente associada à survivina normal. Por exemplo, um peptídeo desurvivina "biologicamente inerte" não tem uma atividade antiapoptótica signi-ficativa, nem é capaz de substancialmente interferir com uma atividade anta-poptótica normalmente associada a uma proteína de survivina endógena.Uma survivina biologicamente inerte tipicamente não teria um efeito domi-nante-negativo significativo. Como empregado aqui, por "imunologicamentesubstancialmente similar à survivina de mamífero" é significado um peptídeode survivina modificado capaz de obter pelo menos uma resposta imune àmesma seqüência-alvo como é o peptídeo de survivina de mamífero nãomodificado correspondente. Uma resposta imune pode ser medida, por e-xemplo, pela população de célula T CD8+ ou a liberação de IFNy pelas célu-las T CD8+ em resposta a uma seqüência-alvo.

Em uma modalidade preferida, a vacina da invenção inclui umácido nucléico que codifica um peptídeo de survivina de mamífero modifica-do. O ácido nucléico pode incluir um promotor de mamífero. Em uma moda-lidade, o ácido nucléico é um DNA nu. Em outra modalidade, o ácido nucléi-co é formulado com um reagente que realça a transfecção de células demamífero. A vacina da presente invenção também pode incluir um adjuvante.

Em uma modalidade, o ácido nucléico que codifica um peptídeode survivina de mamífero modificado é parte de uma partícula virótica, porexemplo, uma partícula adenoviral. As partículas adenovirais adequadaspara a invenção incluem aquelas derivadas de adenovírus capazes de repli-cação, ou aquelas derivadas de adenovírus condicionalmente replicante("CRADs") que replicam em somente certas células ou somente sob certascondições, ou aquelas derivadas de adenovírus que são incompetentes parareplicação. Outras partículas virais adequadas incluem, porém não estãolimitadas, a partículas virais derivadas de lentivírus ou outros vírus de RNA,vírus adenoassociados, rotavírus, ou vírus da vacínia, para designar entre-tanto alguns.

Em uma modalidade, a vacina inclui uma bactéria que contém oácido nucléico que codifica um peptídeo de survivina de mamífero modifica-do. Preferivelmente, a bactéria é uma bactéria entérica, tal como uma Sal-monella, Escherichia, ou Klebsiella. Outras bactérias, tal como espécies deListeria, também podem ser empregadas para hospedar tais ácidos nucléi-cos. A bactéria pode ser uma bactéria tipo silvestre ou pode conter mutaçõesque, por exemplo, atenue sua patogenicidade. Geralmente, é preferido usaruma forma mutante de uma bactéria, tal como um auxótrofo.

Em outra modalidade preferida, a vacina da invenção inclui umpeptídeo de survivina de mamífero modificado. PreferiveImente, o peptídeode survivina de mamífero modificado inclui um domínio BIR modificado. Odomínio BIR modificado pode incluir pelo menos uma substituição de amino-ácido em uma posição que corresponde a Arg18, Cys57, Cys60, His77 eCys84 de survivina humana. Alternativamente, ou além disso o peptídeo desurvivina de mamífero modificado inclui um domínio helicoidal modificado. Odomínio helicoidal modificado pode incluir pelo menos uma substituição deaminoácido em uma posição que corresponde a Lys122, Ala128, e Iíe135 desurvivina humana. Por exemplo, o domínio helicoidal modificado pode conterum Pro em uma posição que corresponde a Ala128 de survivina humana. Odomínio helicoidal modificado também pode incluir um Pro em uma posiçãoque corresponde a IIeI35. O peptídeo de survivina de mamífero modificadopreferivelmente contém um ou mais epitopos de célula T de Classe I deMHC. Por exemplo, o peptídeo de survivina de mamífero modificado podeincluir a seqüência de aminoácido LTLGEFLKL (SEQ ID NO:1) ou LMLGE-FLKL (SEQ ID NO:6).

Em algumas modalidades, o peptídeo de survivina de mamíferomodificado é fundido a um porção de Fe. Um porção de Fc preferida é deri-vada de uma região Fc de mamífero, mais preferivelmente de uma região Fchumana. A porção Fc pode conter mutações que melhoram a montagem, porexemplo, substituição da cisteína na seqüência EPKSCDK (SEQ ID NO:4)da articulação de IgGI com uma serina. Como resultado, a porção Fc podeconter uma seqüência modificada EPKSSDK (SEQ ID NO:5). A porção Fctambém pode conter mutações que reduzem a imunogenicidade de regiõespara as quais uma resposta imune não é desejada, por exemplo, a junçãoentre as porções de proteína de fusão.Em certas modalidades, o peptídeo de survivina de mamíferomodificado funciona de comum acordo com uma molécula efetora que con-tribui com a resposta imune. Por exemplo, uma tal molécula efetora pode seruma porção de citocina incluindo, porém não limitada a, IL-2, IL-7, IL-12, IL-18, IL-21, IL-23, GM-CSF, ou qualquer outra citocina, particularmente umacapaz de ativar uma resposta imune de Th1. Uma tal molécula efetora tam-bém pode ser um inibidor de uma citocina que reprime o sistema imune, porexemplo, um inibidor de STAT3 (por exemplo, uma proteína STAT3 domi-nante negativa tal como STAT3P). As citocinas ou outras moléculas efetorastambém podem conter mutações. Por exemplo, uma citocina pode conteruma substituição de Ser em uma posição que corresponde a Cys125 de IL-2.

Desse modo, em modalidades preferidas, a vacina da invençãoinclui um ácido nucléico que codifica um peptídeo de survivina de mamíferomodificado e um segundo peptídeo incluindo uma molécula efetora descritaacima que contribui com a resposta imune. As regiões que codificam o pep-tídeo de survivina de mamífero modificado e o peptídeo de molécula efetorapodem estar em uma única unidade de transcrição, ou em duas unidades detranscrição separadas. Alternativamente, a vacina da invenção inclui um áci-do nucléico que codifica um peptídeo de survivina de mamífero modificado eum ácido nucléico separado que codifica um segundo peptídeo incluindouma molécula efetora descrita acima que contribui com a resposta imune.

Em outras modalidades, a vacina da invenção inclui um peptídeode survivina de mamífero modificado e um segundo peptídeo incluindo umamolécula efetora descrita acima que contribui com a resposta imune. Emuma modalidade, o peptídeo de survivina de mamífero modificado é fundidoou conjugado para o peptídeo incluindo uma molécula efetora. A proteína defusão de molécula efetora e peptídeo de survivina de mamífero modificadopodem ser também fundidos ou podem ser conjugados para um porção deFc como descrito acima.

Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um ácido nu-cléico capaz de obter uma resposta imune contra células que expressamsurvivina humana. O ácido nucléico codifica um peptídeo incluindo uma se-qüência de aminoácido com mais do que 50% de identidade porém menosdo que 80% de identidade com o domínio BIR de survivina humana e o ácidonucléico contém um promotor capaz de expressar o peptídeo em uma célulade mamífero.

A presente invenção também se refere a um método de trata-mento compreendendo administrar uma vacina ou um ácido nucléico comodescrito acima. Em particular, a invenção fornece métodos de tratamentopara câncer e outras doenças que envolvem a proliferação de célula nãodesejada. Os métodos de tratamento da invenção podem opcionalmenteincluir outras etapas, por exemplo, uma primeiro etapa testa o tumor do pa-ciente para expressão de níveis elevados de survivina. Outra etapa opcionalé o pré-tratamento do paciente com agente ligeiramente imunossupressor,tal como uma dose baixa de ciclofosfamida, antes de administrar uma vacinaou um ácido nucléico da invenção. Sem desejar estar ligado através de teo-ria, um efeito de um tal pré-tratamento é reduzir o número de células T regu-ladoras. Entretanto, outros pré-tratamentos que têm efeito similar são abran-gidos na invenção.

Além de survivina, a presente invenção pode ser aplicada a umaampla variedade de proteínas que podem ser empregadas como antígenos,tal como antígenos específicos de tumor, antígenos virais, e outros antíge-nos. Entre os antígenos específicos de tumor, além de survivina, a invençãopode ser aplicada às moléculas de adesão de célula epitelial, oncogenes, talcomo Ras, antígeno carcinoembrionário, e outras proteínas específicas detumor ou enriquecidas de tumor. Entre os antígenos virais, a invenção podeser aplicada a p24 de HIV, hemaglutinina de gripe, e outras proteínas virais.

Em sumário a invenção está relacionada a os seguintes:

• Uma vacina para o uso de tratamento de tumor e doenças relaciona-das ao tumor em um ser humano compreendendo:

(a) um peptídeo derivado de uma survivina de não mamífero ouum ácido nucléico codificando o referido peptídeo, onde a referida survivinade não mamífero compreende um domínio BIR que tem entre 50% e 90% deidentidade de aminoácido com um domínio BIR abrangendo de Asp 16 aLeu87 de survivina humana, ou (b) um peptídeo derivado de uma survivinade mamífero modificada ou um ácido nucléico codificando o referido peptí-deo, onde a referida survivina de mamífero modificada compreende umamutação dentro do domínio BIR que abole substancialmente a atividade bio-lógica designada para o domínio BIR, e (c) opcionalmente um adjuvante; areferida vacina obtém em um ser humano uma resposta imune para survivi-na humana.

• Uma vacina correspondente, onde a referida resposta imune causadapela vacina gera células T CD8+que atacam as células expressando a survi-vina humana.

• Uma vacina correspondente, onde o peptídeo deriva de uma survivinade não mamífero.

• Uma vacina correspondente, onde o referido domínio BIR tem entre50% e 80% de identidade de aminoácido com o referido domínio BIR de sur-vivina humana.

• A vacina correspondente, onde a survivina de não mamífero é deriva-da de pássaro, peixe, réptil ou anfíbio, preferivelmente de frango.

• Uma vacina correspondente, onde o peptídeo derivado de survivinade não mamífero inclui uma ou mais mutações que promovem a apresenta-ção de antígeno de célula T ligando-se às moléculas de MHC.

• Uma vacina correspondente, onde a survivina de não mamífero éfrango e a mutação é uma substituição de aminoácido em uma ou mais dasposições Asn97, Thr99, VaUOO, ou Gln101 de Survivina de Frango . Umamutação preferida é N97E, e/ou T99M, e/ou V100L, e/ou Q101G.

• A vacina de SEQ ID NO 12, onde a mutação é N97E, T99M, V100L eQ101G.

• Uma vacina correspondente, onde a survivina de não mamífero incluiuma mutação dentro do domínio BIR que abole substancialmente a atividadebiológica designada ao domínio BIR.

• Uma vacina correspondente, onde a referida atividade biológica sen-do abolida é apoptose.• Uma vacina correspondente, onde o referido peptídeo derivado desurvivina de não mamífero contém uma substituição de aminoácido em umaou mais das posições que correspondem a Arg18, Pro47, Cys57, Cys60,His77 e Cys84 de survivina humana.

• Uma vacina correspondente, onde a vacina é capaz de ativar as célu-las T que reconhecem uma seqüência de peptídeo de survivina humanaquando complexa com uma molécula de MHC1 a referida seqüência de pep-tídeo de suvivina humana é selecionada preferivelmente do grupo de peptí-deos que consistem em: LTLGEFLKL, CPTENEPDL e EPDLAQCFF.

• Uma vacina correspondente, onde o peptídeo deriva de uma survivinade mamífero modificada, preferivelmente survivina humana.

• Uma vacina correspondente, onde o referido peptídeo derivado desurvivina humana modificado contém uma substituição de aminoácido emuma ou mais das posições Arg18, Pro47, Cys57, Cys60, His77 e Cys84 desurvivina humana.

• Uma vacina correspondente, onde o peptídeo derivado de survivinade mamífero modificada inclui um domínio helicoidal modificado, e contémuma substituição de aminoácido na posição Lys12 e/ou Ala128 e/ou Ilel 35de survivina humana.

• Uma vacina correspondente, onde a mutação é pelo menos Ala128Pe/ou 112135P.

• Uma vacina da SEQ ID NO 56 que inclui uma survivina humana modi-ficado que tem as seguintes mutações R18E, P47L, Q56L, H77A, C84A,A128P e I135P.

• Uma vacina correspondente, onde o peptídeo de survivina de mamífe-ro modificada compreende a seqüência de aminoácido LTLGEFLKL ou L-MLGEFLKL.

• Uma vacina correspondente, onde o peptídeo derivado de survivinade não mamífero e o peptídeo derivado de survivina de mamífero modificadaé fundido a um porção Fc.

• Uma vacina correspondente, onde a vacina também codifica ou incluium peptídeo derivado de uma molécula efetora, preferivelmente uma citoci-na selecionada do grupo que consiste em IL-2, IL-7, IL-12, IL-18, IL-21, IL-23e GM-CSF.

• Uma vacina correspondente, onde o ácido nucléico que codifica opeptídeo derivado de survivina de não mamífero ou de survivina de mamífe-ro modificada compreende um promotor de mamífero, e é preferivelmenteum DNA nu.

• Uma vacina correspondente, onde o ácido nucléico é formulado comum reagente que realça a transfecção de células de mamífero.

• Uma vacina correspondente, onde o ácido nucléico faz parte de umapartícula viral preferivelmente uma partícula adenoviral.

• Uma vacina correspondente, onde a vacina inclui uma bactéria queinclui o ácido nucléico, onde a bactéria é preferivelmente uma bactéria enté-rica, mais preferivelmente uma Salmonella.

• Uma composição farmacêutica para a imunização de um ser humanocontra survivina superexpressando células de tumor que compreendem umavacina como especificado em quaisquer das reivindicações e na especifica-ção, opcionalmente junto com um veículo, diluente ou excipiente aceitável.

• Uso de uma vacina correspondente para a fabricação de um medica-mento para imunizar um paciente contra células de tumor superexpressandosurvivina humana.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

figura 1 é um alinhamento de seqüências de proteína homólogade survivina. Os alinhamentos foram realizados pelo método de CIustaIW(vide Thompson e outros (1994) Nucl. Acid Res. 22:4673-4680). As seqüên-cias foram obtidas do banco de dados de NCBI, empregando os seguintesnúmeros de Acessão: survivina humana (Acessão No.: NM_001168, SEQ IDNO:8), survivina de cachorro (NP_001003019, SEQ ID NO:9), survivina deporco (NP_999306, SEQ ID NO:39), survivina de vaca (NP_001001855,SEQ ID N0:40), survivina de gato (NP_001009280, SEQ ID NO:41), survivi-na de camundongo (NP_033819, SEQ ID N0:10), survivina de rato (A-AF82586, SEQ ID NO:42), survivina de orangotango (CAH91231, SEQ IDNO:43), Survivina de Frango (NP_001012318, SEQ ID NO:11), XenopusIaevis SIX (ΑΑ020085, SEQ ID N0:13), homólogo de survivina de XenopusIaevis (AAM76714, SEQ ID NO:46), homólogo de survivina de Xenopus Iae-vis 2 (AAH89271, SEQ ID NO:47), homólogo de survivina de peixe-gato(CK419466, SEQ ID NO:52), homólogo de survivina de zebrafish(NP_919378, SEQ ID NO:48), homólogo como de survivina de zebrafish 2(NP_660196, SEQ ID NO:49), homólogo de survivina como de baiacu(CAG04432, SEQ ID N0:50), e homólogo como de survivina de baiacu 2(CAG07433, SEQ ID N0:51). O domínio BIR é sublinhado; asteriscos indi-cam resíduos de assinatura envolvidos em coordenação de Zn; e hífens in-dicam aberturas no alinhamento. Nas seqüências não humanas, os resíduosque são idêntico aos resíduos humanos são representados por períodos;outros resíduos são representados em código de aminoácido de letra única.

Figure 2 é uma tabela de identidades de porcentagem de ami-noácido para comparações de domínios de BIR de várias survivinas homó-logas. Seqüência 1 é a seqüência humana; seqüência 2 é de cachorro; se-qüência 3 é de porco; seqüência 4 é de vaca; seqüência 5 é de gato; se-qüência 6 é de camundongo; seqüência 7 é de rato; seqüência 8 é de oran-gotango; seqüência 9 é de frango; seqüência 10 é da proteína SIX de Xeno-pus Iaevis de rã; seqüência 11 é de um homólogo de Xenopus Iaevis de rã;seqüência 12 é de homólogo de Xenopus Iaevis de rã 2; seqüência 13 é deum homólogo de peixe-gato; seqüência 14 é de um homólogo de zebrafish·,seqüência 15 é de homólogo de zebrafish 2; seqüência 16 é de proteína co-mo de survivina de baiacu 1; e seqüência 17 é de proteína como de survivi-na de baiacu 2.

figura 3 é um alinhamento de seqüências de domínio BIR de in-vertebrados com survivina humana. A seqüência de domínio BIR de survivi-na humana é mostrada na SEQ ID NO:63. Os alinhamentos foram realizadospelo método de CIustaIW (vide Thompson e outros (1994) Nucl. Acid Res.22:4673-4680). As seqüências foram obtidas do banco de dados de NCBI,usando os seguintes números de acessão: survivina humana (NM_001168,seqüência de domínio BIR mostrada em SEQ ID NO:63), D. melanogaster(AAF55399, homólogo de domínio BIR mostrado em SEQ ID NO: 53) e C.elegans (NP_505949, homólogo de domínio BIR mostrado em SEQ IDNO:54). O domínio BIR é sublinhado; asteriscos indicam resíduos de assina-tura envolvidos na coordenação de Zn; e hífens indicam aberturas no ali-nhamento. Nas seqüências não humanas, os resíduos que são idêntico aosresíduos humanos são representados por períodos; outros resíduos são re-presentados em código de aminoácido de letra única.

figura 4 é uma representação esquemática de modos de vacina-ção de DNA por Salmonella transportando plasmídeos que codificam umpolipetídeo de survivina. A Salmonella no lúmen intestinal invade o epitéliode intestino por células M dos emplastros de Peyer. Uma vez através do epi-télio, a Salmonella invade as células tal como macrófagos e células dendríti-cas. A morte bacteriana e transferência de plasmídeo permitem a expressãodo plasmídeo pelos macrófagos, levando a apresentação de peptídeos dopolipeptídeo de survivina codificado em moléculas de Classe I de MHC. A-lém disso, a captação por células dendríticas de macrófagos apoptóticos queexpressam o polipeptídeo de survivina leva a preparação cruzada resultanteda apresentação dos peptídeos nas moléculas de Classe I de MHC e classeII de MHC.

figura 5 é um gráfico de barra que descreve liberação de IFN γde células T isoladas de camundongos vacinados com survivina sob exposi-ção às células de câncer. A liberação de IFNy foi medida em um ensaio deELISpot. Os camundongos C57BI/6 foram vacinados com Salmonella trans-portando um plasmídeo de expressão de survivina de camundongo ou fran-go, ou não foram vacinados (x-eixo), e o número de manchas de IFNy por 5χ 105 de células T semeadas foi medido (y-eixo) após as células T terem si-do expostas a linhagens de célula de câncer ou B16/KSA (barras listradas)ou LLC/KSA (barras pretas).

figura 6 é um gráfico de barra que descreve a liberação de IFNyde células T isoladas de camundongos vacinados com survivina em exposi-ção às células de câncer. A liberação de IFNy foi medida em um ensaio deELISpot. Os camundongos Balb/c foram vacinados com Salmonella trans-portando um plasmídeo de expressão de survivina de camundongo ou fran-go, ou não foram vacinados (x-eixo), e o número de manchas de IFNy por 5χ 105 de células T semeadas foi medido (y-eixo) após as células T terem si-do expostas às linhagens de célula de câncer ou 4T1/KSA (barras listradas)ou A20 (barras pretas).

figura 7 é um plote de sobrevivência de camundongos vacinadoscom Survivina de Frango Salmonella SL7207 ou survivina de camundongo.A porcentagem de camundongos Balb/c sobreviventes (y-eixo) é plotadacontra o número de dias pós-desafio com CT26/KSA (x-eixo) para camun-dongos vacinados com qualquer Salmonella carregando um plasmídeo deexpressão para survivina de camundongo (triângulos cheios) ou uma Survi-vina de Frango (quadrados cheios), ou PBS (losangos cheios).

figura 8 é um plote de sobrevivência de camundongos vacinadoscom survivina de camundongo ou Survivina de Frango de SalmonellaSL7207. O % de camundongos C57BI/6 sobreviventes (y-eixo) é plotadocontra o número de dias pós-desafio com LLC/KSA (x-eixo) para camundon-gos vacinados com qualquer Salmonella carregando um plasmídeo de ex-pressão para survivina de camundongo (triângulos cheios) ou um mutantede Survivina de Frango, Survivina de Frango (N97E, T99M, V100L, Q101G)(quadrados cheios), ou PBS (losangos cheios).

figura 9 é uma representação esquemática de um horário de do-sagem para avaliar o efeito do tempo de vacinação relativo a um desafio detumor no dia 10. "D" é uma abreviação para "dia". Desse modo, por exem-plo, alguns camundongos receberam a vacinação oral no dia 1, um desafiode tumor no dia 10, e vacinação oral no dia 13; outros camundongos recebe-ram um desafio de tumor e uma vacinação oral no dia 10, e uma segundavacinação oral no dia 18. Os cargas de tumor pulmonares foram avaliadasno dia 29.

figura 10 é um gráfico que descreve os pesos pulmonares paracamundongos recebendo vacinações nos dias 1 e 13; 7 e 13; 10 e 18; ou 13e 21; ou recebendo PBS. Todos os camundongos receberam desafios detumor de células LLC/KSA intravenosamente no dia 10. Os escores de me-tástase pulmonar para cada dos camundongos também são fornecidos.figura 11 é uma representação esquemática de um horário dedosagem, incluindo vacinações mediadas por Salmonella com frangos so-brevivendo nos dias 1 e 15; desafio de tumor intravenoso com células L-LC/KSA no dia 4; e ciclofosfamida intraperitoneal (CTX) no dia 11 e trata-mento de indometacina nos dias 12-15. Os pulmões foram classificadosquanto à carga de tumor no dia 28.

figura 12 é um gráfico descrevendo pesos pulmonares para ca-mundongos recebendo desafio de tumor (veículo); vacinação com Survivinade Frango no dia 1 (principal) e 15 (reforço) e desafio de tumor no diá 4(PCB); CTX e indometacina e desafio de tumor C(CI); principal, desafio,CTX, indometacina, e reforço (PC(CI)B); principal, desafio, CTX, e indome-tacina (PC(CI))1 ou desafio, CTX, indometacina e reforço C(CI)B. Os escoresde metástase pulmonar para cada dos camundongos também são forneci-dos.

figura 13 fornece representações de dados de citometria de fluxode células do sangue periférico demonstrando o aparecimento de uma novapopulação de células QD44brilhante, CD3baiX0 em ratos após a vacinação comSalmonella carregando um plasmídeo que codifica survivina de não mamífe-ro. O x-eixo representa as células CD3 e o y-eixo representa as célulasCD44.

figura 14 é uma representação esquemática de um horário dedosagem, incluindo desafio de tumor subcutâneo no dia 1; vacinações medi-adas por Salmonella com survivina de não mamífero nos dias 4, 11, 18, e25; e tratamento de imunocitocina intravenoso nos dias 8, 9 e 10.figura 15 é um gráfico descrevendo os volumes de tumor com opassar do tempo para camundongos tratados com PBS; imunocitocina; sur-vivina de não mamífero; ou imunocitocina e survivina de não mamífero.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção melhora o tratamento de câncer ou outrasdoenças fornecendo-se composições e métodos que eficazmente obtêmresposta imune contra células doentes. O câncer é a doença-alvo primária,embora a invenção de aplique a outras doenças e condições tal como proli-feração não desejada de células normais, tal como tecido de fibróide. A in-venção também contempla composições e métodos para tratamento de in-fecção viral, tal como infecções de HIV1 infecções de vírus influenza, e ou-tras infecções virais.

Em particular, para o tratamento de câncer ou outros tumores, apresente invenção fornece composições e métodos para a apresentação deum peptídeo relacionado a uma proteína específica de tumor ou enriquecidade tumor em células de apresentação de antígeno para obter uma respostaimune adaptável em um mamífero contra câncer ou células de tumor. Umantígeno específico de tumor ou enriquecido de tumor preferido para estainvenção é survivina.

Avaliação da Apresentação de Antígeno de Célula T

A apresentação de antígeno é um processo celular no qual asproteínas em células são processadas em peptídeos e então traficadas aolongo da via secretória para a superfície de célula. Os peptídeos processa-dos são traficados como um complexo estável com proteínas de membranade apresentação de peptídeo especializadas, conhecidas como MHCs. Esteprocesso permite os componentes do sistema imune, por exemplo, as célu-las T indutoras (células T CD4+) e células T citotóxicas (células T CTL ouCD8+), para sobrevivência das composições de célula por amostragem deum complexo de MHC-peptídeo. As células T indutoras interagem com oscomplexos de MHC ll-peptídeo, considerando que as células T citotóxicasinteragem com complexos de MHC l-peptídeo. A interação ocorre por umreceptor de célula T (TCR) expresso na superfície de uma Célula T. CadaCélula T expressa um único TCR. Análogo aos anticorpos, diversidade deTCR é gerada por redisposição nos lugares de TCR cromossômicos. Comocom células produtoras de anticorpo, o encontro com um auto-antígeno (istoé, um peptídeo de antígeno gerado de uma proteína endógena presente nacélula) durante a diferenciação de célula T leva à seleção negativa daquelacélula T particular. Essas células T que não são eliminadas durante a sele-ção negativa também se desenvolvem em células T maduras. Eventualmen-te, a interação com um antígeno estrangeiro complexo com MHCs leva aativação de célula T, especialmente na presença de um estímulo secundária.

Survivina

A proteína de Survivina é caracterizada por um domínio de apro-ximadamente 70 aminoácidos, conservado, conhecido como um domínioBIR (ou domínio IAP). Em survivina humana, o domínio BIR corresponde àabrangência da região de Asp16 a Leu87. As células de tumor ou câncerfreqüentemente superexpressam a proteína de survivina, a qual acredita-sebloquear a apoptose destas células e desse modo interferir com mecanis-mos que previnem o crescimento anormal de câncer ou células de tumor.Por outro lado, as células normais expressam muito pouca survivina. Então,a survivina é um antígeno específico de tumor ou enriquecido de tumor ideal.É então um objeto da presente invenção liberar uma forma antigênica daproteína de survivina para células de apresentação de antígeno, de formaque uma resposta imune para células de tumor expressando survivina possaser estimulada. Os genes e proteínas de survivina humana e de mamíferosão descritos em detalhes na Patente U.S. Nq 6.245.523 ou WO2004/067023.

Survivina de Não Mamífero

Um aspecto da invenção gira em torno da surpreendente desco-berta que genes e/ou proteínas de survivina de não mamífero podem serempregados em vacinas para câncer e outras doenças. Por exemplo, a imu-nização de um camundongo ou um ser humano com um ácido nucléico quecodifica Survivina de Frango pode gerar células T CD8+ que atacarão célulasque expressam survivina de camundongo ou humana, respectivamente. Estadescoberta indica que a proteína de Survivina de Frango é imunologicamen-te substancialmente similar àsurvivina humana, sugerindo que a Survivina deFrango pode ser empregada como uma forma antigênica da proteína de sur-vivina obter resposta imune em um mamífero.

As proteínas de survivina de espécies de mamífero e não mamí-fero estão alinhadas na figura 1. As proteínas de survivina incluídas no ali-nhamento são survivina humana (Número de Acessão Genbank NM_001168ou 015392, SEQ ID NO:8), survivina de cachorro (Número de AcessãoGenbank ΝΡ_001003019, SEQ ID ΝΟ:9), survivina de porco (Número deAcessão Genbank NP_999306, SEQ ID NO:39), survivina de vaca (Númerode Acessão Genbank NP_001001855, SEQ ID N0:40), survivina de gato(Número de Acessão Genbank NP_001009280, SEQ ID NO:41), survivinade camundongo (Número de Acessão Genbank NP_033819, SEQ IDN0:10), survivina de rato (Número de Acessão Genbank AAF82586, SEQ IDNO:42), survivina de orangotango (Número de Acessão GenbankCAH91231, SEQ ID NO:43), Survivina de Frango (Número de Acessão Gen-bank NP_001012318, SEQ ID NO:11, "tipo silvestre"), survivina de XenopusIaevis SIX (Número de Acessão Genbank AA020085, SEQ ID NO: 13), ho-mólogo de survivina de Xenopus Iaevis (Número de Acessão Genbank A-AM76714, SEQ ID NO:46), homólogo de survivina 2 de Xenopus Iaevis(Número de Acessão Genbank AAH89271, SEQ ID NO:47), homólogo desurvivina de peixe-gato (Número de Acessão Genbank CK419466, SEQ IDNO:52), homólogo de survivina de zebrafish (Número de Acessão GenbankNP_919378, SEQ ID NO:48), homólogo de survivina 2 de zebrafish (Númerode Acessão Genbank NP_660196, SEQ ID NO:49), homólogo como de sur-vivina de baiacu (Número de Acessão Genbank CAG04432, SEQ ID N0:50),e homólogo como de survivina de baiacu 2 (Número de Acessão GenbankCAG07433, SEQ ID NO:51). Todas as seqüências descritas aqui por Núme-ro de Acessão Genbank estão incorporadas por referência. As seqüênciasincluídas na figura 1 também estão listadas na listagem de seqüência daespecificação.

Além disso, duas variantes de Survivina de Frango também sãoincluídas na listagem de seqüência de acompanhamento, variante 1 (Núme-ro de Acessão Genbank NM_001012319,SEQ ID NO:44) que difere come-çando no resíduo de aminoácido 116 da seqüência de Survivina de Frangotipo silvestre mostrada em SEQ ID NO:11 para determinar uma terminaçãoC diferente, e variante 2 (Número de Acessão Genbank NP_001012317,SEQ ID NO:45) que difere começando no resíduo de aminoácido 38 da se-qüência de Survivina de Frango tipo silvestre mostrada em SEQ ID NO:11.

As seguintes seqüências adicionais são incluídas na listagem deseqüência: survivina humana (Número de Acessão Genbank NM_001168.2,SEQ ID NO:64); survivina de Homo sapiens (Número de Acessão Genbank015392, SEQ ID NO:65); survivina de Canis familiaris (Número de AcessãoGenbank NM_001003019.1, SEQ ID NO:66); survivina de Susscrofa (Núme-ro de Acessão Genbank NP_999306.1, SEQ ID NO:67); survivina de Bostaurus (Número de Acessão Genbank NP_001001855.2, SEQ ID NO:68);survivina de Felis catus (Número de Acessão Genbank NP_001009280.1,SEQ ID NO:69); survivina de Mus musculus (Número de Acessão GenbankNP_033819.1, SEQ ID N0:70); survivina de Rattus norvegicus (Número deAcessão Genbank AAF82586.1, SEQ ID NO:71); survivina de Pongo pyg-maeus (Número de Acessão Genbank CAH91231.1, SEQ ID NO:72); survi-vina de Gallus gallus (Número de Acessão Genbank NP_001012318.1, SEQID NO:73); survivina de Xenopus Iaevis SIX (Número de Acessão GenbankAA020085.1, SEQ ID NO:74); homólogo de survivina de Xenopus Iaevis(Número de Acessão Genbank AAM76714.1, SEQ ID NO:75); homólogo desurvivina 2 de Xenopus Iaevis (Número de Acessão Genbank AAH89271.1,SEQ ID NO:76); ácido nucléico que codifica survivina Ictalurus punctatus(Número de Acessão Genbank CK419466.1, SEQ ID NO:77); homólogo desurvivina de Danio rerio (Número de Acessão Genbank NP_919378.1, SEQID NO:78); homólogo de survivina de Danio rerio 2 (Número de AcessãoGenbank NP_660196.1, SEQ ID NO:79); homólogo como de survivina deTetraodon nigroviridis (Número de Acessão Genbank CAG04432.1, SEQ IDN0:80); homólogo como de survivina 2 de Teraodon nigroviridis (Número deAcessão Genbank CAG07433.1, SEQ ID NO:81); survivina de Drosophilamelanogaster (Número de Acessão Genbank AAF55399.1, SEQ ID NO:82);e survivina de Caenorhabditis elegans (Número de Acessão GenbankNP_505949.1, SEQ ID NO:83).

A invenção contempla usar não somente as seqüências de sur-vivina que são encontradas na natureza, tal como seqüências de survivinadescritas na FIG. 1, porém também outras seqüências de aminoácido quetêm, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelomenos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% de identidade de amino-ácido com pelo menos uma das seqüências descrita na FIG. 1.

Como ilustrado na figura 1, considerando que as proteínas desurvivina de mamífero no alinhamento são mais do que 80% idênticas a sur-vivina humana, os homólogos de não mamífero de survivina no alinhamentosão menos do que 60% idênticos a survivina humana. Dentro do domínioBIR (a região sublinhada no alinhamento da figura 1), porém as proteínas desurvivina de não mamífero são mais do que 60%, porém menos do que 80%idênticas a survivina humana, ao mesmo tempo em que as proteínas de sur-vivina de mamífero são mais do que 90% idênticas à survivina humana. Asidentidades de porcentagem de par de seqüência de domínios BIR de homó-logos de survivina são resumidas na figura 2. Por exemplo, a Survivina deFrango aproximadamente 78% idêntica à survivina humana através do do-mínio BIR.

De modo importante, como mostrado na figura 1, há somenteum peptídeo 9-mer (18-26: STRAATFRN) (SEQ ID NO:7) em Survivina deFrango dentro do domínio BIR que contém mais do que 50% de variação deaminoácido relativo à seqüência humana correspondente (5 de 9 aminoáci-dos são diferentes neste peptídeo 9-mer particular). A maioria dos peptídeos9-mer dentro do domínio BIR de Survivina de Frango contêm dois ou menosalterações de seqüência (48 de 64 peptídeos). Sem desejar estar ligado porteoria, é contemplado que este grau de conservação de seqüência eficaz-mente torna a Survivina de Frango imunologicamente substancialmente simi-lar à survivina humana.

Em geral, a porcentagem de identidade entre domínio BIR deSurvivina de Frango e os domínios BIR de survivina de mamífero mostradosna figura 2 varia entre aproximadamente 72% e aproximadamente 78%. A-lém disso, cerca de 75% de peptídeos 9-mer derivados de Survivina deFrango do domínio BIR contêm duas ou menos alterações de seqüênciacomparadas aos peptídeos 9-mer de mamífero correspondentes. Por exem-pio, a Survivina de Frango é 75% por cento idêntica à survivina de rato atra-vés do domínio BIR, que é consistente com o resultado que Survivina deFrango é imunologicamente substancialmente similar à survivina de rato,como descrito no Exemplo 6 abaixo.

A eficácia de uma composição de survivina de não mamífero,como uma composição de Survivina de Frango, para induzir uma respostaimune em um camundongo contra um tumor que expressa survivina de rato,como ilustrado nos Exemplos a seguir, sublinha um princípio da invenção,isto é, que a vacinação de um mamífero com uma molécula de survivina denão mamífero é útil para induzir uma resposta imune contra survivina demamífero ou contra células que superexpressam a de mamífero. Desse mo-do, a Survivina de Frango também é útil para a geração de uma respostaimune eficaz em seres humanos contra células que em superexpressamsurvivina humana, tal como muitas células de tumor, uma vez que a respostaimunológica é conservada suficientemente entre mamíferos.

Em contraste, um alinhamento de domínios de BIR de inverte-brados com o domínio BIR de survivina humana mostra que os domínios BIRD melanogaster (AAF55399, SEQ ID N0:53) e C. elegans (NP_505949,SEQ ID NO:54) são 50% ou menos idêntico a seqüência de domínio BIR desurvivina humana (figura 3), embora resíduos críticos para quelação de Znsejam conservado (vide asteriscos no alinhamento na figura 3). Por exemplo,o domínio BIR de survivina de mosca é de cerca de 50% idêntico ao domínioBIR de survivina humana. Importantemente, o domínio BIR de mosca con-tém somente três (3 de 64) peptídeos 9-mer que têm duas ou menos substi-tuições de aminoácido comparado aos peptídeos humanos correspondentes.

De acordo com a invenção, o termo "survivina de não mamífero",como empregado aqui, abrange qualquer proteína de survivina que tenhapelo menos um domínio BIR (ou um domínio IAP) com pelo menos mais doque 50% de identidade de aminoácido mas menos do que 90% de identida-de de aminoácido com um domínio BIR de survivina humana, por exemplopelo menos 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% ou 85% de identidade com umdomínio BIR de survivina humana.

Para calcular uma porcentagem de identidade, os aminoácidosalinhados de cada seqüência são comparados consecutivamente. Se os a-minoácidos forem não idênticos, o escore de identidade em par é zero; casocontrário o escore de identidade em par é 1.0. O escore de identidade brutaé a soma dos aminoácidos alinhados idênticos. O escore bruto é então nor-malizado dividindo-o pelo número de aminoácidos dentro da menor das se-qüências de referência ou candidata e multiplicando o resultado por 100. Oescore bruto normalizado é a porcentagem de identidade. As inserções edeleções são ignoradas com a finalidade de calcular a porcentagem de iden-tidade. Conseqüentemente, as penalidades gap não são empregadas nestecálculo.

Os métodos para gerar múltiplos alinhamentos de seqüência sãobem-conhecidos por médicos da técnica. Para alinhar seqüências de survivi-na, o módulo Megalign 6.1 do pacote de software DNASTAR Lasergene® 6foi empregado, aplicando o algoritmo de alinhamento ClustalV, empregandoparâmetros básicos (Higgins e Sharp (1989) Comput Appl Biosci. 5:151-3).Para o subalinhamento dos domínios de BIR survivina, o método CIustaIW("lento-preciso") foi aplicado, empregando parâmetros básicos (Thompson eoutros (1994) Nucleic Acid Res. 22:4673-80).

É contemplado que a survivina de não mamífero também podemconter mais peptídeos com o potencial de gerar uma resposta de célula indu-tora T do que uma survivina de mamífero. Sem desejar estar ligado por teo-ria, é contemplado que um efeito imunizante realçado pode ser alcançadopor compromisso de ambas as células T citotóxicas, através de MHC I, e decélulas indutoras T, através de MHC II, na resposta imune. As diferenças deseqüência entre a survivina humana endógena e a survivina de não mamífe-ro são provavelmente para produzir alguns peptídeos sendo apresentadopelo qual o sistema imune humano não foi tolerado. A presença de epitoposMHC Il potenciais pode ser analisada empregando algoritmos preditivos pu-blicamente disponíveis, tal como ProPred Analysis(www.imtech.res.in/raghava/propred; Singh e outros, (2001) Bioinformatics17:1236-1237, os conteúdos do qual está por meio desta incorporado porreferência). Empregando um tal algoritmo, descobriu-se que relativo às pro-teínas de survivina de mamífero tal como survivina de humana ou de cachor-ro, as proteínas de survivina de não mamífero, tal como Survivina de Frangoou survivina SIX de rã são preditas conter mais peptídeos que ligam e/oupeptídeos com afinidade de ligação mais elevada para moléculas de MHC Il(vide Tabela 1).

Tabela 1. Predição de ligação de peptídeo para HLA-DR humano

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A Tabela 1 mostra a posição inicial (No.) e seqüência (Peptídeode cada peptídeo 9-mer que se liga a pelo menos um alelo HLA-DR. Ne deligação se refere ao número de alelos que os peptídeos ligam a (fora de 50),acima de um limiar de ligação arbitrário, neste caso 20%. O limiar de 20% serefere a 20% de um escore de ligação máximo teórico, como calculado porum algoritmo como implementado em Propred. O escore de refere a um es-core cumulativo por todos os alelos de HLA aos quais para aquelas ligaçõesde peptídeo. Como uma referência, o peptídeo de proteína básica de mielinahumana (MBP) VVHFFKNIV (SEQ ID NO:14), derivado de uma porção daproteína conhecida por dar origem a anticorpos anti-MBP em seres humanos(MBP(85-99)) se liga aos 29 alelos de HLA, com um escore cumulativo de 1087,6.É desejável fornecer uma vacina incluindo ou codificando umpeptídeo derivado de uma survivina de não mamífero que seja capaz de ati-var as células T reconhecendo uma seqüência de peptídeo de survivina hu-mana quando complexa com uma molécula de MHC. Tais peptídeos de sur-vivina humana ou peptídeos derivados desta incluem, porém não estão limi-tados a, EPDLAQCFF (SEQ ID NO:3), EPDLAQCFY (SEQ ID NO:15), CP-TENEPDL (SEQ ID NO:2), e CPTENEPDY (SEQ ID NO:16). Os peptídeoshumanos adicionais e modificação útil para ativar células T ou realçar a ati-vação de células T são descritos na Publicação de Pedido dos Estados Uni-dos N9 2004-0210035, o conteúdo da qual está por meio desta incorporadopor referência.

Desse modo, pode ser útil introduzir em uma seqüência de sur-vivina de não mamífero mutações que correspondem aos epitopos de survi-vina humana conhecidos, ou que podem realçar as ligações daquelas se-qüências de peptídeo a MHCs. Por exemplo, pode ser útil introduzir substitu-ições de aminoácido na seqüência de Survivina de Frango nas posiçõesAsn97, Thr99, VaM 00, ou Gln101. Sem desejar estar ligado por teoria, umasubstituição na posição Thr99 em Survivina de Frango pode realçar a liga-ção de um peptídeo derivado às moléculas de MHC. Em um exemplo espe-cífico, um peptídeo derivado de Survivina de Frango pode conter pelo menosuma das seguintes substituições de aminoácido: Asn97Glu, Thr99Met,VaIIOOLeu, e Gln101Gly. Em outro exemplo, pode ser útil introduzir nassubstituições de aminoácido de survivina de rã SIX a Thr110 ou Serl 12. Aseqüência de amino para survivina de Xenopus SIX (Τ110M, S112G) é mos-trada na SEQ ID NO:55. Sem desejar estar ligado por teoria, uma substitui-ção na posição Thr110 pode realçar a ligação de um peptídeo derivado auma molécula de MHC. Em um exemplo específico, um peptídeo derivadode uma survivina de rã pode conter pelo menos uma das seguintes substitui-ções: Thrl 10Met, Serl 12Gly.

Um peptídeo de survivina de não mamífero adequado para ainvenção pode conter também deleções de aminoácido. Por exemplo, o pep-tídeo de survivina de não mamífero pode conter uma truncação de terminalC ou uma truncação de terminal N.

É possível que certas extensões de seqüência mal conservadasem uma proteína de survivina de não mamífero possam ser compartilhadascom outras proteínas humanas de não survivina, que podem não ter o mes-mo perfil de expressão como survivina humana e assim podem não ser co-mo específico de tumor. Isto pode ser avaliado de uma maneira inicial reali-zando-se uma pesquisa BLAST com a seqüência de região divergente dasurvivina de não mamífero contra o banco de dados de proteína humana nãoredundante, com parâmetros que identificam pares curtos, quase exatos. Porexemplo, a pesquisa com o domínio de terminal C da seqüência de Survivinade Frango (aa90-aa142) identifica somente algumas proteínas humanas compares quase exatos (menos do que cinco ocorrências). Essas proteínas hu-manas podem então ser também analisadas com respeito ao seu padrão deexpressão e com respeito ao seu potencial para gerar um peptídeo antigêni-co, inicialmente por métodos in silico descritos abaixo.

Survivina Modificada

Em outro aspecto, a invenção fornece formas antigênicas daproteína de survivina introduzindo-se modificações em proteínas de survivinade mamífero. Especificamente, a invenção contempla peptídeos de survivinade mamífero modificados que são biologicamente inertes, porém imunologi-camente substancialmente similares a survivina de mamífero. Este aspectoda invenção também se volta a dois problemas particulares com uma abor-dagem naíve de simplesmente expressar uma proteína de survivina no cito-plasma de uma célula de apresentação de antígeno. O primeiro problema éque a proteína de survivina biologicamente ativa pode romper a fisiologia dacélula de apresentação de antígeno. O segundo problema é que quando asurvivina ou essencialmente qualquer outra proteína é expressada em umacélula, somente uma fração pequena da proteína é degradada de um talmodo que sejam apresentados peptídeos antigênicos por MHC Classe I nasuperfície de célula.

Desse modo, a invenção contempla proteínas de survivina demamífero modificadas, incluindo as versões mutantes de survivina humanaou versões mutantes de survivina de mamífero de não humaN0 A invençãotambém contempla não somente o uso de seqüências de survivina que sãoencontradas in nature, tal como seqüências de survivina descritas na FIG. 1,porém também outras seqüências de aminoácido que têm, por exemplo, pe-lo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelomenos 90%, ou pelo menos 95% de identidade de aminoácido com pelomenos uma das seqüências descritas na FIG. 1.

A estrutura de survivina humana foi determinada (Chantalat eoutros, (2000) Mol. Cell 6:183-189; Protein Data Bank (PDB) repositório deestruturas de proteína número de Acessão: PDB ID 1E31; Verdecia e outros,(2000) Nat. Struct. Bio. 7:602-608; Protein Data Bank (PDB) repositório deestruturas de proteína número de Acessão: PDB ID 1F3H, os ensinos decada dos quais está por este meio incorporado por referência). Baseado naestrutura 3-D, a survivina humana contém pelo menos dois domínios: umdomínio globular de terminal N que inclui um sítio de ligação de zinco, referi-do como domínio BIR ou IAP, e uma alfa-hélice de terminal C prolongada,referida aqui como o domínio helicoidal. Em uma modalidade preferida, ainvenção fornece formas de survivina com uma mutação no domínio BIR determinal N e/ou no domínio helicoidal de terminal C. É uma perspicácia dainvenção que um ótimo efeito possa ser alcançado transformando os domí-nios. Sem desejar estar ligado por teoria, o domínio BIR de terminal Neodomínio helicoidal de terminal C cada tem uma atividade biológica. Por e-xemplo, o domínio BIR tem algum nível de atividade antiapoptótica, atémesmo na ausência do domínio helicoidal. Além disso, o domínio helicoidaltem uma atividade de ligação citoesqueletal, e pode ter uma atividade bioló-gica distinta.

Especificamente, no domínio BIR, por exemplo, as mutaçõespreferidas incluem, porém não estão limitadas a, substituições de aminoáci-do nas posições que correspondem a Cys57, Cys60, His77, ou Cys84 desurvivina humana. Por exemplo, um domínio BIR modificado pode conterpelo menos uma das seguintes substituições: Cys57Ser, Cys60Ser,His77Phe, e Cys84Ser. Também são preferidas substituições de quaisquerdestes aminoácidos para alanina ou prolina. Acredita-se que estas mutaçõesrompem o sítio de ligação de zinco no domínio BIR. Outras mutações quetêm o efeito de romper o sítio de ligação de zinco também podem ser em-pregadas. Além disso, as mutações na posição que corresponde a survivinahumana Arg18, preferivelmente para ácido aspártico ou ácido glutâmico, po-dem ser empregadas para gerar um domínio BIR inativo. Os domínios deBIR modificados nos quais os aminoácidos de ligação de zinco são mutadosem duas, três, ou quatro posições são particularmente preferidos.

É geralmente útil introduzir resíduos de prolina em qualquer Iu-gar no domínio helicoidal para romper sua função. Em particular, podem serintroduzidas substituições de prolina nas posições que correspondem a sur-vivina humana Ala128 ou Ile135. Também são preferidas outras substitui-ções de aminoácido que podem romper o domínio helicoidal.

Uma survivina de mamífero modificada preferida pode conteruma mutação em Arg18, Cys57, Cys60, His77, e/ou Cys84 e uma prolina nodomínio helicoidal. Cada um dos aminoácidos acima mencionados nas posi-ções Arg18, Cys57, Cys60, His77, Cys84, Ala128, e Ile135 são conservadosentre a survivina humana e de frango, e assim mutações idênticas podemser introduzidas para gerar uma Survivina de Frango biologicamente inerte.Também podem ser introduzidas mutações similares nas posições corres-pondentes em outras proteínas de survivina de não mamífero.

Quaisquer das mutações anteriores pode ser combinada comuma mutação na posição que corresponde a Leu98 de survivina humana, talcomo, por exemplo, Leu98Arg, Leu98Lys, e Leu98Ala. Em survivina de fran-go , a posição que corresponde a Leu98 humana é VaH 00.

Outras mutações úteis podem ser identificadas através de expe-rimentação rotineira, como descrito nos Exemplos. Por exemplo, uma muta-ção é introduzida em uma proteína de survivina e é testada, por exemplo,quanto à falta de atividade biológica, e/ou degradação aumentada, e/ou ca-pacidade de induzir uma resposta imune contra células de tumor. Ensaiosexemplares para estes testes são descritos nos exemplos abaixo e são co-nhecidos na técnica.Geralmente, um peptídeo de survivina modificado preferido con-tém três, quatro, cinco ou mais mutações. Entretanto, uma utilidade da survi-vina modificada contemplada pela invenção é apresentar peptídeos de epi-topo de célula T derivados de survivina através de moléculas de Class I deMHC. Conseqüentemente, é geralmente preferido mutar menos do que cin-qüenta (ou menos do que trinta ou menos do que vinte) aminoácidos paramanter similaridade imunologicamente significativa com survivina de mamí-fero.

Apresentação de Antfgeno

A invenção fornece diretrizes para idealmente introduzir muta-ções em survivina ou outras seqüências de proteína de forma que o proces-samento de epitopos de Classe I de MHC seja relativamente desimpedido.

É possível que certas mutações de survivina possam se situardentro de um segmento de peptídeo que é apresentado por uma moléculade Classe I de MHC e reconhecido por um receptor de T célula particular.Também é possível que uma mutação possa alterar o processamento prote-olítico de survivina em epitopos de peptídeo tal que um epitopo seja clivado,ou que um epitopo não seja clivado, porém um novo epitopo seja preferenci-almente criado. Para focar o assunto de apresentação de antígeno, é possí-vel usar bancos de dados publicamente disponíveis e informação para identi-ficar epitopos de Classe I MHC candidatos em uma proteína de survivina, epara então determinar se uma mutação altera um epitopo. Por exemplo, oalgoritmo de SYFPEITHI pode ser usado (www.uni-tuebingen.de.uni.kxi;também vide, Rammensee e outros, (1999) Immunoqenetics 50:213-219, osensinos do qual está por meio desta incorporados por referência). Alternati-vamente, o algoritmo de BIMAS pode ser empregado (bi-mas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/; também vide, Parker e outros, (1994) J.Immunol. 152:163-175, os ensinos do qual está por meio desta incorporadopor referência). Uma vez que os genes de HLA que codificam as proteínasde Classe I MHC humanas são altamente polimórficos, com proteínas deClasse I MHC diferentes que ligam aos motivos de peptídeo diferentes, umatabela de epitopos potenciais é criada, tendo sobre um eixo várias moléculasde Classe I MHC e sobre o outro eixo uma seqüência de survivina. As entra-das na mesa identificam posições de um epitopo para uma determinada mo-lécula de Classe I MHC. O efeito de uma mutação candidata é julgado combase no efeito em vários epitopos. No fim, uma mutação ou mutações sãoescolhidas com base nas necessidades de uma vacina, levando em conta,por exemplo, a freqüência alélica de alelos de HLA diferentes, ou a freqüên-cia específica de grupo de alelos de HLA. Para focar o assunto de proces-samento proteolítico, de acordo com a invenção é possível usar bancos dedados e informação publicamente disponíveis para identificar sítios de cliva-gem de proteassoma candidatos, e então determinar se uma mutação alteraum tal sítio de divisão. Por exemplo, o banco de dados publicamente dispo-nível NetChop pode ser usado (www.cbs.dtu.dk/services/NetChop /). É ge-ralmente preferível evitar alterar os sítios de clivagem.

Para propósitos ilustrativos, Exemplo 12 fornece análise exem-plar determinando substituições úteis em proteína de survivina.

De acordo com a invenção, é também útil considerar a "imuno-proteassoma". Nas células de apresentação de antígeno, o proteassomatem uma composição um pouco diferente de proteínas e sua especificidadeproteolítica é dominado por uma enzima que cliva terminal C para resíduoshidrofóbicos. Como um resultado, o proteassoma gera peptídeos que podemse ligar a Class I de MHC com um resíduo de âncora hidrofóbico de terminalC. Se for desejável manter a especificidade do padrão de clivagem de imu-noproteassoma, é preferível evitar a mutação de tais resíduos hidrofóbicos,particularmente leucina, isoleucina, metionina, tirosina, triptofano, e fenilala-nina. Da mesma maneira, também é preferível evitar mutar outros resíduos aleucina, isoleucina, metionina, tirosina, triptofano, e fenilalanina. Desse mo-do, as mutações em Arg18, Cys57, Cys60, His77, e Cys84 têm a vantagemde desestabilizar a estrutura de survivina e não eliminar sítios de clivagemde imunoproteassoma. Além disso, é preferível evitar introduzir mutaçõesnos 7 a 9 aminoácidos imediatamente terminal N para leucina, isoleucina,metionina, tirosina, triptofano, e fenilalanina na seqüência de proteína.

Desse modo, a invenção fornece um método geral de identificarsítios de mutação preferidos em uma seqüência de proteína para gerar umaproteína com imunogenicidade realçada. Com base neste método, um localde mutação preferido em uma seqüência de proteína tem as seguintes pro-priedades. Primeiro, uma ou mais mutações do sítio desestabilizam a estru-tura de proteína. Segundo, a mutação desestabilizante não introduz umaleucina, isoleucina, metionina, tirosina, triptofano, ou fenilalanina. Terceiro, oaminoácido normal naquela posição não é leucina, isoleucina, metionina,tirosina, triptofano, ou fenilalanina. Este método pode ser aplicado a umaampla variedade de proteínas que podem ser empregadas como antígenos,tal como, por exemplo, antígenos específicos de tumor, antígenos virais, eoutros antígenos. Entre os antígenos específicos de tumor, além de survivi-na, o método pode ser aplicado a molécula adesão de célula epitelial, onco-genes tal como Ras, antígeno carcinoembriônico, e outros. Entre os antíge-nos virais, o método pode ser aplicado a p24 de HIV1 hemaglutinina de gripe,e outras proteínas virais.

Proteínas de fusão compreendendo survivina de não mamífero e/ou modifi-cada

Para promover a degradação da porção de survivina e seu pro-cessamento em peptídeos que podem ser apresentados por moléculas deClass I de MHC, é desejável fundir a survivina de não mamífero ou os peptí-deos de survivina de mutante descritos acima a uma segunda proteína ade-quada. Por exemplo, ubiquitina é um par de fusão particularmente preferidopara este propósito. Uma proteína de fusão de ubiquitina-survivina pode serconstruída em um das seguintes configurações: Terminação N-ubiquitina-survivina-terminação C ou terminação N-survivina-ubiquitina-terminação C. Aterminação N-ubiquitina-survivina-terminação C é a orientação preferida.Além disso, é desejável transformar a metionina de terminal N de survivina,preferivelmente para arginina, ácido aspártico, ou ácido glutâmico. Tambémé desejável introduzir uma Iisina em uma posição que corresponde a survivi-na humana Ile19 ou Val21 dentro de uma proteína de fusão de ubiquitina-survivina.

Também é desejável fundir o survivina da presente invenção aum porção de Fe. Uma porção de Fc preferida contém domínios de CH2 eCH3 de anticorpo, e opcionalmente contém uma região de articulação. Aporção de Fc pode ser fundida ou a terminação N ou terminação C de survi-vina. A seqüência de proteína para Fc-survivina de frango humano maduro émostrada na SEQ ID NO:25. A seqüência de proteína para Fc-survivina defrango de camundongo maduro é mostrada na SEQ ID NO:27.

Além disso, uma proteína de fusão que contém as porções desurvivina e Fc pode também conter outras porções, tal como citocinas queestimulam o sistema imune como descrito na Publicação PCT WO 01/07081.Sem desejar estar ligado por teoria, a presença da porção de Fc pode au-mentar a captação de proteínas de fusão contendo survivina em células deapresentação de antígeno. É geralmente preferível que o porção de Fc sejaderivada do organismo que é tratado. Por exemplo, para tratamento de umser humano, é preferível usar uma porção de Fc humaNQ

As proteínas de fusão de Fc-survivina ou ácidos nucléicos quecodificam as proteínas de fusão podem preferivelmente conter uma seqüên-cia de sinal para secreção. A presença da seqüência de sinal facilita a ex-pressão das proteínas de fusão em linhagens de célula de mamífero, tal co-mo células NS/0, e pode permitir secreção da fusão-proteína in vivo se umácido nucléico correspondente é administrado a um paciente. As seqüênciasde codificação da proteína de fusão de Fc-survivina preferivelmente come-çam em uma direção de 5' a 3' com uma "seqüência líder" derivada, por e-xemplo, de uma cadeia leve de anticorpo (L)1 fundida na estrutura com pelomenos uma porção de uma cadeia pesada de imunoglobulina ou forma demutante desta, preferivelmente da região de Fcy 1 do gene de imunoglobuli-na γ1 humaN- A região de FcyI do gene de imunoglobulina de Fcyl incluipreferivelmente pelo menos uma porção do domínio de articulação e umdomínio CH3, e mais preferivelmente inclui pelo menos um domínio de arti-culação, um domínio de CH2 e um domínio de CH3.

A porção do DNA que codifica a seqüência de sinal preferivel-mente codifica um segmento de peptídeo que dirige a secreção da proteínade fusão Fc e depois disso é clivado longe do restante da proteína de fusãoFe. A seqüência de sinal da invenção é um polinucleotídeo que codifica umaseqüência de aminoácido que inicia transporte de uma proteína pela mem-brana do retículo endoplásmico. As seqüências de sinal que são úteis nainvenção incluem seqüências de sinal de cadeia leve de anticorpo, por e-xemplo, anticorpo 14.18 (Gillies e outros (1989) J. Immunol. Meth.. 125:191).seqüências de sinal de cadeia pesada de anticorpo, por exemplo, a seqüên-cia de sinal de cadeia de anticorpo MOPC141 (Sakano e outros. (1980) Na-ture, 286:5774), e qualquer outra seqüência de sinal que seja conhecido natécnica (vide, por exemplo, Watson (1984) Nucleic Acids Research. 12:5145).

As seqüências de sinal foram bem-caracterizadas na técnica esão conhecidas tipicamente por conter 16 a 30 resíduos de aminoácido, epodem conter mais ou menos resíduos de aminoácido. Um peptídeo de sinaltípico consiste em três regiões: uma região de terminal N básica, uma regiãohidrofóbica central, e uma região de terminal C mais polar. A região hidrofó-bica central contém 4 a 12 resíduos hidrofóbicos que ancoram o peptídeo desinal pela bicamada de lipídeo de membrana durante transporte do polipep-tídeo nascente. Seguinte a iniciação, o peptídeo de sinal normalmente é cli-vado no lúmen do retículo endoplásmico por enzimas celulares conhecidascomo peptidases de sinal. Os sítios de clivagem potenciais do peptídeo desinal geralmente seguem a regra "(-3, -1)". Desse modo, um peptídeo desinal típico tem resíduos de aminoácido pequenos, neutros nas posições -1 e-3 e necessita de resíduos de prolina nesta região. A peptidase de sinal cli-vará um tal peptídeo de sinal entre os aminoácidos -1 e +1. Desse modo, aseqüência de sinal pode ser clivada da terminação amino da proteína de fu-são durante a secreção. Isto resulta na secreção de uma proteína de fusãoFe. As seqüências de peptídeo de sinal úteis na prática da invenção sãobem-conhecidas na técnica. Por exemplo, vide, von Heijne (1986) NucleicAcids Res.. 14:4683.

Os termos "seqüência de sinal", "peptídeo de sinal", "seqüêncialíder", ou "peptídeos líderes" são aqui alternadamente empregados.

A proteína de fusão segregada geralmente pode ter um domínioFc corretamente dobrado, porém com uma porção de survivina incorreta-mente dobrada. Sem desejar estar ligado por teoria, é considerado quequando a survivina é forçada na via secretória pela porção de Fc de umaproteína de fusão de Fc-survivina, a dobra de survivina é comprometida, par-ticularmente uma vez que a survivina contém numerosas cisteínas que po-deriam se ocupar na ligação de dissulfeto. A dobra correta da porção de sur-vivina não é necessária para a atividade das vacinas da invenção.

Como uma alternativa para fusão de proteínas através de técni-cas de engenharia genéticas, a conjugação química que usa reticuladoresquímicos convencionais pode ser empregada para conectar as porções deproteína.

Ácidos Nucléicos

A invenção também fornece ácidos nucléicos que codificam asurvivina de não mamífero e/ou modificada e proteínas de fusão incluindo asurvivina como descrito acima. Por exemplo, a seqüência de nucleotídeopara survivina humana é mostrada na SEQ ID NO:57, a seqüência de nucle-otídeo para survivina de Xenopus SEIS é mostrada na SEQ ID NO:58, a se-qüência de nucleotídeo para o homólogo de survivina de Xenopus é mostra-da na SEQ ID NO:59, a seqüência de nucleotídeo para homólogo de survivi-na de zebrafish é mostrada na SEQ ID N0:60, e a seqüência de nucleotídeopara homólogo de survivina de peixe-gato é mostrada na SEQ ID NO:61. Osácidos nucléicos são preferivelmente ligados a e interdigitados com elemen-tos que permitem a expressão em células eucarióticas, particularmente, emcélulas de mamífero, para formar os cassetes de expressão. Tipicamente,um cassete de expressão que codifica survivina inclui pelo menos um dosseguintes elementos reguladores tal como promotores, realçadores, íntrons,terminadores, um sinal de poliadenilação e outros. Preferivelmente, um pro-motor de mamífero é incluído. Como empregado aqui, por "promotor demamífero" é entendido um promotor de gene que é derivado de um promotorencontrado em um mamífero ou em um vírus que normalmente se desenvol-ve em um mamífero. Por exemplo, os promotores preferidos incluem aquelesque estão presentes em vírus que se desenvolvem em células de mamífero,tal como em citomegalovírus (CMV), vírus Símio 40 (SV40), vírus Epstein-Barr (EBV), vírus do Sarcoma de Rous (RSV), vírus de Macaco Moloney,vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus do Tumor Mamário do Ca-mundongo (MMTV), ou aqueles derivados de genes de mamífero, tal comode actina mamífero, beta-globina, miosina, ou opcionalmente derivados degenes de mamífero preferencialmente expressos em células de apresenta-ção de antígeno, tal como Fascin ou outros genes específicos de APC co-nhecidos na técnica. Um exemplo de um sinal de poliadenilação útil é umsinal derivado de um sinal poliadenilação de SV40.

Os elementos de expressão podem direcionar a expressão dasproteínas de survivina em todas as células eucarióticas, ou podem ter real-çadores específicos do tipo de célula para direcionar a expressão, por e-xemplo, em células de apresentação de antígeno. As porções de codificaçãodos cassetes de expressão são também preferivelmente designados ter có-dons que são mais geralmente empregados em células eucarióticas, especi-almente em células de mamífero ou humanas.

Os cassetes de expressão da invenção podem ser empregadospara produzir proteínas da invenção em células cultivadas. Entretanto, oscassetes de expressão podem ser ligados aos genes de resistência a fárma-co apropriados, origens de replicação de DNA, e outros elementos para faci-litar a seleção e replicação dos cassetes de expressão. Em uma modalidade,as seqüências de ácido nucléico do cassete de expressão estão incorpora-das em um plasmídeo capaz de ser replicado em uma bactéria. Os plasmí-deos adequados para a invenção podem ter marcadores para seleção emcélulas bacterianas, tal como genes de resistência antibiótica. Alternativa-mente, os plasmídeos adequados podem necessitar de marcadores de resis-tência antibiótica, porém podem opcionalmente incluir um gene que codificauma enzima metabólica, um tRNA supressor, ou outro tal gene que normal-mente seria encontrado no genoma de uma bactéria de resistência a nãofármaco. Desse modo, uma modalidade exemplar da invenção é um plasmí-deo que contém um ácido nucléico que codifica um peptídeo de survivina dainvenção operativamente associado com um promotor de mamífero sem ummarcador de resistência antibiótica. Um tal plasmídeo pode ser transformadoem uma bactéria, e a bactéria pode então ser empregada para vacinar umpaciente sem introduzir um gene de resistência antibiótica no paciente. Al-ternativamente, um tal plasmídeo pode ser introduzido em um paciente semum veículo vivo. Por exemplo, um tal plasmídeo pode ser introduzido comoDNA nu ou como o DNA encapsulado dentro de contas ou coberto na super-fície de contas.

Os cassetes de expressão da invenção podem ser incorporadosem genomas virais, plasmídeos apropriados para administração de DNA nu,ou genomas bacterianos. No caso de genomas virais, é desejável usar vírusde DNA de filamento duplo tal como adenovirus e vírus adenoassociado, evírus de RNA, tal como retrovírus. Os cassetes de expressão são inseridosnos genomas de tais vírus através de técnicas padrões. Desse modo, a in-venção fornece formas de DNA e RNA de ácidos nucléicos.

Moléculas Efetoras

A presente invenção também fornece modalidades que permi-tem o peptídeo de não mamífero ou o peptídeo de survivina de mamíferomodificado funcionar de acordo com uma molécula efetora que contribui comresposta imune. Por exemplo, uma tal molécula efetora pode ser uma porçãode citocina incluindo, porém não limitado a, IL-2, IL-7, IL-12, IL-18, IL-21, IL-23, GM-CSF, ou qualquer outra citocina, particularmente uma capaz de ati-var uma resposta imune de Th1. Uma tal molécula efetora também pode serum inibidor de uma citocina que reprime o sistema imune, por exemplo, uminibidor de STAT3 (por exemplo, a proteína STAT3 negativo dominante, talcomo 8ΤΑΤ3β). As citocinas ou outras moléculas efetoras também podemconter mutações. Por exemplo, uma citocina pode conter uma substituiçãode Ser em uma posição que corresponde a Cys125 de IL-2.

Desse modo, em modalidades preferidas, a vacina da invençãoinclui um ácido nucléico que codifica um peptídeo de survivina de não mamí-fero ou de mamífero modificado e um segundo peptídeo incluindo uma mo-lécula efetora descrita acima sobre que contribui com a resposta imune. Asregiões que codificam o peptídeo de survivina de não mamífero ou de mamí-fero modificado e o peptídeo de molécula efetora podem estar em uma únicaunidade de transcrição, ou em duas unidades de transcrição separadas. Al-ternativamente, a vacina da invenção inclui um ácido nucléico que codificaum peptídeo de survivina de não mamífero ou de mamífero modificado e umácido nucléico separado que codifica um segundo peptídeo incluindo umamolécula efetora descrita acima que contribui com a resposta imune.

Em outras modalidades, a vacina da invenção inclui um peptídeode survivina de não mamífero ou de mamífero modificado e um segundopeptídeo incluindo uma molécula efetora descrita acima que contribui com aresposta imune. Em uma modalidade, o peptídeo de survivina de não mamí-fero ou de mamífero modificado é fundido ou conjugado ao peptídeo incluin-do uma molécula efetora. A proteína de fusão de molécula efetora e peptí-deo de survivina pode ser também fundida ou conjugada para uma porçãode Fc como descrito acima.

Administração

As vacinas da invenção são empregadas para tratar humanos oumamíferos que exibem ou estão a risco de doenças associadas com super-expressão de survivina. Tais doenças incluem cânceres ou outros tumorescaracterizados por células que superexpressam survivina.

As vacinas produzidas de acordo com a presente invenção po-dem ser administradas a um hospedeiro mamífero por qualquer rotina. Ainjeção de antígenos de proteína geralmente é empregada para obter res-postas imunes em mamíferos. Entretanto, as vacinas da invenção tambémpodem ser liberadas para APCs por ácido nucléico, por exemplo, DNA, inje-ção. Uma técnica geralmente empregada é injetar vetores expressão deDNA que codificam uma proteína antigênica no músculo. Acredita-se queAPCs especializados, por exemplo, células macrófagas e dendríticas, mi-grem para o sítio da injeção ou administração, se recupere e apresente oantígeno através de um processo conhecido como o processo de apresenta-ção de antígeno.

Desse modo, como apropriado, a administração pode ser oral ouparenteral, incluindo rotinas intravenosas e intraperitoneais de administra-ção. Além disso, a administração pode ser por injeções periódicas de umbolo da vacina ou pode ser feita mais contínua por administração intraveno-sa ou intraperitoneal de um reservatório que seja externo (por exemplo, umabolsa intravenosa). Em certas modalidades, as vacinas da presente inven-ção podem ser de grau farmacêutico. Isto é, certas modalidades obedecempadrões de pureza e controle de qualidade requeridos para administração ahumanos. As aplicações veterinárias também estão dentro do significadopretendido como empregado aqui.

As formulações, ambas para uso médico veterinário e humano,das vacinas de acordo com a presente invenção tipicamente incluem taisvacinas em associação com um adjuvante, veículo, e opcionalmente outro(s)ingrediente(s) farmaceuticamente aceitável. 0(s) veículo(s) podem ser "acei-tável(Hs)" no sentido de ser compatível com os outros ingredientes das for-mulações e não danoso ao recipiente deste. Os veículos farmaceuticamenteaceitáveis são pretendidos, a este respeito, incluir qualquer e todos os sol-ventes, meios de dispersão, camadas, agentes antifúngicos, agentes isotô-nicos e de demora de absorção, e outros, compatíveis com a administraçãofarmacêutica. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuti-camente ativas é conhecido na técnica. Exceto a medida em que qualquermeio ou agente convencional é incompatível com a combinação ativa ou seuvetor de administração, o uso destes nas composições é contemplado. Ascombinações ativas adicionais (identificadas de acordo com a invenção e/ouconhecidas na técnica) também podem ser incorporadas nas composições.

As formulações podem ser apresentadas convenientemente na forma deunidade de dosagem e podem ser preparadas por quaisquer dos métodosbem-conhecidos na técnica de farmácia/microbiologia. Em geral, algumasformulações são preparadas levando-se a vacina em associação com veícu-lo líquido ou veículo sólido finamente dividido ou ambos, e então, se neces-sário, formando o produto na formulação desejada.

Uma composição de vacina da invenção é formulada para sercompatível com sua rotina pretendida de administração. Os exemplos derotinas de administração incluem administração oral ou parenteral, por e-xemplo, intravenosa, intradérmica, inalação, transdérmica (tópica), transmu-cosal e retal. As soluções ou suspensões empregadas para aplicação paren-teral, intradérmica, ou subcutânea podem incluir os seguintes componentes:um diluente estéril, tal como água para injeção, solução solução salina, óleosfixos, polietileno glicóis, glicerina, propilene glicol ou outros solventes sintéti-cos; antioxidantes, tal como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; os agen-tes de quelação, tal como ácido etilenodiaminatetraacético; tampões, tal co-mo acetato, citratos ou fosfato e agentes para o ajuste de tonicidade, tal co-mo cloreto de sódio ou dextrose. O pH pode ser ajustado com ácidos ou ba-ses, tal como ácido clorídrico ou hidróxido de sódio.

As soluções úteis para administração oral ou parenteral podemser preparadas por quaisquer dos métodos bem-conhecidos na técnica far-macêutica, descrita, por exemplo, em Remington Pharmaceutics Sciences,(Gennaro, A., ed.), Mack Bar, 1990. As formulações para administração pa-renteral também podem incluir glicolato para administração bucal, metoxis-salicilato para administração retal, ou ácido cítrico para administração vagi-nal. A preparação parenteral pode ser incluída em ampolas, seringas descar-táveis ou frascos de dose múltiplas feitos de vidro ou plástico. Os supositó-rios para administração retal também podem ser preparados misturando-sefármaco com um excipiente não irritante, tal como manteiga de cacau, outrosglicerídeos, ou outras composições que sejam sólidas em temperatura am-biente e líquidas em temperaturas corporais. Por exemplo, as formulaçõestambém podem incluir polialquileno glicóis, tal como polietileno glicol, óleosde origem vegetal, naftalenos hidrogenados, e outros. As formulações paraadministração direta podem incluir glicerol e outras composições de viscosi-dade elevada. Outros veículos parenterais potencialmente úteis para estasvacinas incluem partículas de copolímero de etileno-acetato de vinila, bom-bas osmóticas, sistemas de infusão implantáveis, e lipossomas. As formula-ções para administração de inalação podem conter como excipientes, porexemplo, lactose, ou podem ser soluções aquosas contendo, por exemplo,éter de polioxietileno-9-laurila, glicocolato e deoxicolato, ou soluções oleosaspara administração na forma de gotas nasais, ou como um gel a ser aplicadointranasalmente. Enemas de retenção também podem ser usados para libe-ração retal.

As formulações da presente invenção adequadas para adminis-tração oral podem estar na forma de unidades discretas, tal como cápsulas,cápsulas de gelatina, sachês, comprimidos, pastilhas, ou losangos, cadacontendo uma quantia predeterminada do fármaco; na forma de um pó ougrânulos; na forma de uma solução ou uma suspensão em um líquido aquo-so ou líquido não aquoso; ou na forma de uma emulsão de óleo em água ouuma emulsão de água em óleo. A vacina também pode ser administrada emBolus, eletuário ou pasta. Um comprimido pode ser feito, prensando-se oumoldando-se ao fármaco opcionalmente com um ou mais ingredientes adi-cionais. Os comprimidos prensados podem ser preparados prensando-se,em uma máquina adequada, fármaco em uma forma de fluxo livre, tal comoum pó ou grânulo, opcionalmente misturada por um agente aglutinante, Iubri-ficante, diluente inerte, tensoativo ou dispersão. Os comprimidos moldadospodem ser feitos moldando-se, em uma máquina adequada, uma mistura dofármaco pulverizada e o veículo adequado umedecido com um diluente lí-quido inerte.

As composições orais geralmente incluem um diluente inerte ouum veículo comestível. Com a finalidade de administração de vacina oral, ocomposto ativo pode ser incorporado com excipientes. As composições oraispreparadas empregando um veículo fluido para uso como um colutório inclu-em o composto no veículo fluido e são oralmente aplicadas e bochechar eexpectoradas ou engolidas. Os agentes aglutinantes farmaceuticamentecompatíveis e/ou materiais adjuvantes, podem ser incluídos como parte dacomposição. Os comprimidos, pílulas, cápsulas, pastilhas e outros podemconter quaisquer dos seguintes ingredientes, ou compostos de uma naturezasimilar: um aglutinante, tal como celulose microcristalina, goma de tragacan-to ou gelatina; um excipiente, tal como goma ou lactose; agente desintegran-te, tal como ácido algínico, Primogel, ou amido de milho; um lubrificante, talcomo estearato de magnésio ou Sterotes; um deslizante, tal como dióxido desilício coloidal; agente adoçante, tal como sacarose ou sacarina; ou agenteflavorizante, tal como flavorizante de hortelã, salicilato de metila, ou laranja.

As composições de vacina adequadas para uso injetável incluemsoluções aquosas estéreis (onde solúvel em água) ou dispersões e pós esté-reis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveisestéreis. Para administração intravenosa, os veículos adequados incluemsolução solução salina fisiológica, água bacteriostática, Cremophor ELTM(BASF, Parsippany1 NJ) ou fosfato de solução salina tamponada (PBS). Emtodos os casos, as composição podem ser estéreis e podem ser fluidas namedida em que seringabilidade fácil existe. Pode ser estável sob as condi-ções de fabricação e armazenamento e pode ser preservado contra a açãode microorganismos contaminantes, tal como fungos. O veículo pode ser ummeio de solvente ou dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol(por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietileno glicol líquido, e outros), emisturas adequadas destes. A fluidez apropriada pode ser mantida, por e-xemplo, pelo uso de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção dotamanho de partícula exigido no caso de dispersão e pelo uso de tensoati-vos. Em muitos casos, será preferível incluir os agentes isotônicos, por e-xemplo, açúcares, poliálcoois, tal como manitol, sorbitol, e cloreto de sódiona composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode serrealizada incluindo na composição um agente que retarde a absorção, porexemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorpo-rando o composto ativo na quantidade exigida em um solvente apropriadocom um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, quandoexigido, seguido por esterilização filtrada. Geralmente, as dispersões sãopreparadas incorporando o composto ativo em um veículo estéril que contémum meio de dispersão básico e os outros ingredientes exigidos daquelesenumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluçõesinjetáveis estéreis, os métodos de preparação incluem secagem a vácuo eliofilização que produz um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingredientedesejado adicional de uma solução previamente estéril-filtrada disto.

As formulações adequadas para administração intra-articularpodem estar na forma de uma preparação aquosa estéril da vacina que podeestar na forma microcristalina, por exemplo, na forma de uma suspensãomicrocristalina aquosa. As formulações lipossômicas ou sistemas de políme-ro biodegradáveis também podem ser empregadas para apresentar a vacinapara administração tanto intra-articular quanto oftálmica.

As formulações adequadas para administração tópica incluempreparações líquidas ou semi-líquidas, tal como ungüentos, loções, géis,candidatos, emulsões de óleo em água ou água em óleo, tal como cremes,ungüentos ou pastas; ou soluções ou suspensões, tais como gotas. As for-mulações para administração tópica a superfície da pele podem ser prepa-radas por dispersão da vacina com um veículo dermatologicamente aceitá-vel, tal como uma loção, creme, ungüento ou sabão. Em algumas modalida-des, úteis são os veículos capazes de formar uma película ou camada sobrea pele para localizar a aplicação e inibir a remoção. Onde a adesão a umasuperfície de tecido é desejada, a composição pode incluir a vacina disper-sada em uma composição de fibrinogênio-trombina ou outro bioadesivo. Avacina pode ser então pintada, pulverizada ou de outro modo aplicada à su-perfície de tecido desejada. Para administração tópica às superfícies de te-cido internas, o agente pode ser disperso em um adesivo de tecido líquidoou outra substância conhecida para realçar a adsorção a uma superfície detecido. Por exemplo, as soluções de hidroxipropilcelulose ou fibrinogê-nio/trombina podem ser empregadas para vantagem. Alternativamente, assoluções de revestimento de tecido, tal como formulações contendo pectinapodem ser empregadas.

Para tratamentos de inalação, a inalação de pó (formulaçõesautopropelentes ou pulverizantes) dispensada com uma lata de spray , umnebulizador, ou um atomizador pode ser empregada. Tais formulações po-dem estar na forma de um pó finamente fragmentado para administraçãopulmonar de um dispositivo de inalação de pó ou formulações autopropelen-tes ou de dispersão de pó. No caso de solução autopropelente e formula-ções de spray, o efeito pode ser obtido ou por escolha de uma válvula quetem as características de spray desejadas (isto é, sendo capaz de produzirum spray que tem o tamanho de partícula desejado), ou incorporando-se oingrediente ativo como um pó suspenso no tamanho de partícula controlado.Para administração através de inalação, as vacinas podem ser liberadastambém na forma de um spray aerossol de um recipiente ou distribuidorpressionado que contêm um propulsor adequado, por exemplo, um gás, talcomo dióxido de carbono, ou um nebulizador. As gotas nasais também po-dem ser empregadas.

A administração sistêmica também pode ser por meios transmu-cosal ou transdérmico. Para administração transmucosal ou transdérmica, ospenetrantes apropriados para a barreira a ser penetrada são empregados naformulação. Tais penetrantes geralmente são conhecidos na técnica, e in-cluem, por exemplo, para administração transmucosal, detergentes, sais bili-ares, e derivados de ácido filsídicos. A administração transmucosal pode serrealizada pelo uso de sprays nasais ou supositórios. As vacinas são formu-ladas tipicamente em ungüentos, pomadas, géis, ou cremes como geralmen-te conhecido na técnica para administração transdérmica.

Em uma modalidade, as vacinas são preparadas com veículosque protegerão contra a eliminação rápida do corpo, tal como uma formula-ção de liberação controlada, incluindo implantes e sistemas de liberação mi-croencapsulados. Os polímeros biodegradáveis, biocompatíveis podem serempregados, tal como acetato de etileno vinila, polianidretos, ácido poliglicó-lico, colágeno, poliortoésteres, e ácido polilático. Os métodos para prepara-ção de tais formulações serão evidentes para aqueles versados na técnica.Os materiais também podem ser obtidos comercialmente de Alza Corporati-on e Nova Pharmaceuticals, Inc. As suspensões lipossômicas também po-dem ser empregadas como veículos farmaceuticamente aceitáveis. Estespodem ser preparados de acordo com os métodos conhecidos por aquelesversados na técnica, por exemplo, como descrito na Patente dos EstadosUnidos Nq 4.522.811. Os microssomas e micropartículas também podem serempregados.

As composições parenterais ou orais podem ser formuladas naforma de unidade de dosagem para facilidade de administração e uniformi-dade de dosagem. A forma de unidade de dosagem se refere a unidadesfisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para o indivíduo aser tratado; cada unidade que contém uma quantidade predeterminada decomposto ativo calculada para produzir o efeito de vacina desejado em as-sociação com o veículo farmacêutico exigido. A especificação para as for-mas de unidade de dosagem da invenção é ditada por e diretamente depen-dente das características únicas do composto ativo e do efeito de vacina par-ticular a ser alcançado, e das limitações inerentes na técnica de composiçãode um tal composto ativo para o tratamento de indivíduos.

Geralmente, as vacinas identificadas de acordo com a invençãopodem ser formuladas para administração parenteral ou oral para seres hu-manos ou outros mamíferos, por exemplo, em quantidades terapeuticamenteeficazs, por exemplo, quantidades que forneçam concentrações apropriadasdo fármaco para o tecido alvo durante um tempo suficiente para induzir oefeito desejado. Adicionalmente, as vacinas da presente invenção podemser administradas sozinhas ou em combinação com outras moléculas co-nhecidas por ter um efeito benéfico na doença particular ou indicação deinteresse. Por meio de exemplo somente, os co-fatores úteis incluem co-fatores de alívio de sintoma, incluindo agentes anti-sépticos, antibióticos,antivirais e antifúngicos e analgésicos e anestésicos.

A concentração eficaz das vacinas identificadas de acordo coma invenção que será liberada em uma composição de vacina variará, depen-dendo de vários fatores, incluindo a dosagem desejada final do fármaco aser administrado e da rotina de administração. A dosagem preferida a seradministrada também é provável depender de tais variáveis como o tipo eextensão de doença ou indicação a ser tratada, o estado de saúde total dopaciente particular, a eficácia biológica relativa da vacina liberada, a formu-lação da vacina, a presença e tipos de excipientes na formulação, e a rotinade administração. Em algumas modalidades, as vacinas desta invenção po-dem ser fornecidas a um indivíduo usando unidades de dose típicas deduzi-das dos estudos de mamífero descritos anteriormente empregando primatase roedores não humanos. Como descrito acima, uma unidade de dosagemse refere a uma dose unitária, isto é, uma única dose que é capaz de seradministrada a um paciente, e que pode ser facilmente controlada e empa-cotada, permanecendo como uma dose de unidade biologicamente e fisica-mente estável que compreende ou a vacina como tal ou uma mistura delacom veículos ou diluentes farmacêuticos sólidos ou líquidos.

Configuração de liberação de um ácido nucléico de survivina com uma conta

Em outra modalidade, ácidos nucléicos da invenção podem serconfigurados com um veículo de liberação, tal como uma conta. Por exem-plo, um ácido nucléico da invenção pode ser coberto sobre as contas de ce-Iulose de acordo com o método como descrito na Publicação de Pedido dosEstados Unidos N9 2003-0166594, os ensinos da qual está por este meioincorporados por referência. Um ácido nucléico da invenção pode ser incor-porado dentro de contas poliméricas de acordo com o método descrito naPatente dos Estados Unidos N9 5.783.567, os ensinos da qual está por estemeio incorporados por referência.

Em certas modalidades, os organismos (por exemplo, célulasbacterianas, de mamífero, e partículas virais) são construídos para produzira survivina da invenção. Estes organismos podem liberar a survivina paracolheita ou podem ser introduzidos como vacinas diretamente a um pacien-te.

Configuração de liberação de um ácido nucléico de survivina dentro de umvírus

Os ácidos nucléicos da invenção podem ser configurados comum veículo de liberação viral. O veículo de liberação viral pode opcionalmen-te ter um efeito adjuvante. Por exemplo, os vírus adequados incluem, porémnão estão limitados a adenovírus, vírus adenoassociado, retrovírus, ou vírusda vacínia. É freqüentemente preferível usar um mutante ou forma danifica-da de um vírus, tal como um vírus incompetente para replicação. Os ácidosnucléicos da invenção são inseridos nos genomas virais e são também in-corporados em partículas de vírus. Os ácidos nucléicos são embalados em-pregando sistemas de vírus auxiliar que são bem-conhecidos na técnica deterapia de gene.Configuração de liberação de um ácido nucléico de survivina dentro de umabactéria

Os ácidos nucléicos da invenção podem ser configurados paraliberação dentro de um hospedeiro microbiano, tal como, por exemplo, des-crito por Gentschev e outros (2000) J. Biotechnol., 83:19-26; ou por StockerBAD (2000) J. Biotechnol.. 83:45-50, os ensinos de cada das quais está poreste meio incorporado por referência. As bactérias adequadas para liberaçãode ácido nucléico (por exemplo, DNA) incluem, porém não estão limitadas a,Saimonella, Shigelia, Listeria, ou E. coii. É freqüentemente preferível usaruma forma mutante, atenuada de uma bactéria, tal como um auxótrofo. Porexemplo, as linhagens de Saimonella adequadas incluem, porém não estãolimitadas a, auxótrofo de Saimonella typhimurium aroA SL7202 (vide, porexemplo, Darji e outros, (1997) Cell, 91:765-775), auxótrofo de Saimonellatyphimurium aroA, dam" RE88 (vide, por exemplo, Heithoff e outros, (1999)Sciences, 284:967-70), auxótrofo de Saimonella typhimurium msb", purlVNP20009 (vide, por exemplo, Clairmont e outros, (2000) J. Infect. Dis..181 (6): 1996-2002; Low, e outros, (2004) Methods Mol. Med.. 90:47-60), ouprotótrofo de Saimonella typhimurium LT2 (ATCC No.700720). Um modoexemplar de vacinação de DNA através de Saimonella é ilustrado na figura4.

Terapia de combinação

A vacina da invenção pode ser combinada com outras modali-dades de tratamento empregadas no cuidado do paciente. Em uma modali-dade do tratamento, a vacina é empregada de acordo com a resseção cirúr-gica do tumor. Em outro grupo de modalidades do tratamento, a vacina éempregada em combinação com quimioterapia ou terapia de radiação quereduzem o tamanho de tumor, potencialmente danifica a vasculatura do tu-mor, ou torna o tumor suscetível às respostas imunes. Os agentes de quimi-oterapia ou terapia de radiação particularmente úteis para terapia de combi-nação com a vacina da invenção incluem, porém não estão limitados a, a-gentes de danificação de DNA, tal como ciclofosfamida; antimetabólitos, talcomo gemcitibina; e agentes que rompem as funções citoesqueléticas, talcomo taxóis. Tais agentes reduzem o crescimento de tumor e podem danifi-car a vasculatura de tumor o que, sem desejar estar ligado por teoria, acredi-ta-se tornar o tumor mais suscetível às respostas imunes.

Em terapia de combinação, a quimioterapia ou irradiação é.tipi-camente seguida por administração da vacina de um tal modo que a forma-ção de uma resposta imune antitumor eficaz não seja comprometida pelosefeitos residuais potenciais do tratamento anterior.

Em uma outra modalidade de terapia de combinação, o trata-mento de vacina pode ser combinado com tratamentos de imunocitocina.Sem desejar estar ligado por teoria, acredita-se que uma vacina gere umaresposta imune mais eficaz, quando uma citocina que promove a respostaimune estiver presente no microambiente de tumor. Por exemplo, as imuno-citocinas úteis particular são aquelas que obtêm resposta de Th1, tal comoIL-2 ou IL-12. Durante uma terapia de combinação, por exemplo, um pacien-te pode primeiro receber uma vacina da invenção para gerar uma respostaimune para o tumor, então uma imunocitocina que pode alvider o tumor epode suportar a resposta imune no tumor. As imunocitocinas preferidas tipi-camente têm, por exemplo, uma porção de anticorpo que reconhece umacaracterística de antígeno de superfície do tumor, tal como EpCAM, ou quereconhece uma característica do núcleo necrótico de um tumor, tal comoDNA. As imunocitocinas tipicamente também têm uma porção de citocina talcomo IL-2, IL-12, ou outras que preferencialmente direcionam uma respostade Th1. As imunocitocinas adequadas para a invenção são descritas na Pa-tente dos Estados Unidos N9 5.650.150, o conteúdo da qual é pelo pressenteincorporado por referência.

EXEMPLOS

A prática da invenção será mais totalmene entendida a partir dosseguintes exemplos, que são apresentados aqui para os propósitos ilustrati-vos apenas, e não devem ser construídos como Iimitantes da invenção demodo algum.

Exemplo 1. Clonagem de survivina de frango, geração de variantes de survi-vina de frango, construção de plasmídeos gue replicam-se em Salmonella eexpressam survivina de frango em células de mamífero.

Métodos para isolar moléculas de DNA desejadas são familiarespara pessoas versadas na técnica. Por exemplo, onde a seqüência da molé-cula de DNA desejada é conhecida, transcrição reversa e reação de cadeiade polimerase (RT-PCR) são comumente empregadas, ou a molécula deDNA pode ser obtida por síntese química usando um fornecedor comercialtal como Blue Heron Biotechnology Inc. (Bothwell1 WA). Para obter DNA co-dificando survivina de frango do tipo silvestre, RT-PCR foi realizado em pol-yA+ mRNA isolado de fígado de frango (BD Biosciences cat N9 636307),empregando a RT-PCR de Uma Etapa Subscrita para o Kit de Padrões Lon-gos (Invitrogen, Carlsbad, CA) e um grupo de iniciadores externos em umprimeiro ciclo de transcrição reversa e amplificação, e o Kit Supermix HighFidelity Kit (Invitrogen) e um grupo de iniciadores internos para o segundociclo de amplificação. Os iniciadores externos foram o iniciador de sentido 5'-GAAAAATGGCGGCCTATGC- 3' (SEQ ID NO: 17) e o iniciador anti-sentido5' -CACCGTAGACCCAGAGGAACC- 3' (SEQ ID NO: 18), e os iniciadoresinternos foram o iniciador de sentido 5'-CTCTAGAATGGCGGCCTATGCTG-3' (SEQ ID NO: 19), incorporando um sítio de restrição Xba I (sublinhado), eo iniciador anti-sentido 5' -CÇTÇGAGACCTAAGGGCCCATGTTCTC- 3'(SEQ ID N0:20), incorporando um sítio de restrição Xho I (sublinhado), res-pectivamente. O produto de PCR amplificado foi separado por eletroforesede gel, isolado, clonado em um vetor pCR2.1 (Invitrogen), e sua seqüênciaverificada. As seqüências de nucleotídeo e aminoácido de survivina de fran-go do tipo silvestre são mostradas na listagem de seqüência como SEQ IDN0:21 e SEQ ID N0:11, respectivamente.

O fragmento de ácido nucléico codificando survivina de frangodo tipo silvestre de tamanho natural foi transferido para vetores de expres-são apropriados para sua expressão em células de mamífero. Por exemplo,o fragmento digerido de Xba I /Xho I da seqüência de codificação de survivi-na de frango do tipo silvestre foi inserido no igualmente digerido plasmídeopdCs (vide Lo e outro, (1998) Protein Enqineerinq 11:495), colocando o genede survivina de frango do tipo silvestre sob o controle de um promotor deCMV.

Como outro exemplo, um fragmento codificando survivina defrango do tipo silvestre foi inserido no vetor de expressão pdCs-huFc (videLo e outro, (1998) Protein Engineerinq 11:495), colocando um fragmento desurvivina de frango do tipo silvestre de tamanho natural sem a metionina departida a jusante da seqüência codificando Fc humana, gerando um plasmí-deo codificando uma proteína de fusão de Survivina de Frango huFc. Emsíntese, uma ligação tripla foi realizada com um fragmento de PfIMI/survivinade frango do tipo silvestre Xhol (o sítio de PfIMI é no nucleotídeo 26 de sur-vivina de frango do tipo silvestre), um fragmento de plasmídeo Smal/XholpdCs-huFc (vide Lo e outro, (1998) Protein Enqineerinq 11:495), e uma mo-lécula dúplex de oligonucleotídeo adaptadora que restaura a extremidade 5'da seqüência de survivina de frango do tipo silvestre, omitindo o códon departida ATG. A molécula adaptadora de dúplex foi formada por hibridizaçãode oligonucleotídeos complementares, os oligonucleotídeos 5' -GGGTGCAGCGGCCTATGCTGAAATGCTGCCCAAGGA- 3' de sentido(SEQ ID NO:22) e o 5" -TTGGGCAGCATTTCAGCATAGGCCGCTG-CACCC- 3' anti-sentido (SEQ ID NO:23) oligonucleotídeos. A geração daproteína de fusão corretamente codificada foi verificada por seqüenciamento.

A seqüência de nucleotídeo de Survivina de Frango Fcyl humana madura(Survivina de Frango menos Met de partida) é mostrada na listagem de seqüência como SEQ ID NO:24.

Para obter um vetor de expressão codificando muFc-Survivinade Frango, a survivina de frango digerida por fragmento do tipo silvestre deSma l/Xhol de pdCs-huFc-Survivina Frango foi transferida para dentro de umvetor de expressão derivado de pdCs-muFc igualmente tratado, resultandoem uma seqüência quimérica entre muFc e survivina de frango do tipo sil-vestre, com a survivina de frango colocada em estrutura, diretamente a ju-sante da seqüência codificando uma porção CH3 de muFc. A porção muFccodificada por este vetor de expressão foi do isótipo lgG2a. A seqüência denucleotídeo de muFcY2-Frango Survivina maduro (Survivina de Frango me-nos Met de partida) é mustrada em SEQ ID NO:26. A seqüência de aminoá-cido para survivina de frango mu-Fc madura é mostrada em SEQ ID NO:27.

A seqüência de survivina de frango codificando Survivina deFrango (N97E, T99M, V100L, Q101G) foi gerada por um método de PCRincorporando iniciadores mutagênicos. As substituições de códon no inicia-dor de sentido mutagênico (MutIs) 5' - CCTCTGAACTGATGTTGGGG-GAGTTCTTGAAGCTGGAT- 3' (SEQ ID NO:28) e iniciador anti-sentido(MutIa) 5' - AACTCCCCCAACATCAGTTCAGAGGGATCTTTCTG- 3' (SEQID NO:29) são mostradas sublinhadas, e uma substituição de A em G queeliminou um sítio de EcoRI é indicada em negrito. Dois fragmentos de PCRde sobreposição foram gerados de uma survivina de frango do padrão deDNA do tipo silvestre, o fragmento a montante usando iniciador de flanque-amento Prls (5' - CCGCGGCCGCCCCCTTCACCATGGCGGCCTATGCT-GAAATG- 3') (SEQ ID N0:30) e Mutla, e o fragmento a jusante usando ini-ciador de flanqueamento Prla (5' - AGATCTGGATCCCTAAGGGCC-CATGTTCTCTATC- 3') (SEQ ID NO:31) e Mutls, respectivamente, para asamplificações. Uma reação de PCR foi realizada nos fragmentos de PCRresultantes, combinados juntamente com iniciadores Prls e Pr1a, gerando oproduto de tamanho natural, que foi clonado em um vetor pCR2.1 (Invitro-gen), e sua seqüência foi verificada. O fragmento codificando Survivina deFrango (N97E, T99M, V100L, Q101G) foi excisado com Not l/Bam Hl e liga-do em um vetor de expressão pdCs igualmente digerido. A seqüência deproteína para Survivina de Frango (N97E, T99M, V100L, Q101G) é mostradacomo SEQ ID NO: 12 e a seqüência de aminoácido é mostrada como SEQ IDNO:62.

Exemplo 2. Síntese de genes de survivina de outros não-mamíferos e cons-trução de vetores de expressão mamíferos.

De acordo com a invenção, genes de survivina e proteínas deoutros não-mamíferos vertebrados são usados em composições de vacina.Por exemplo, um gene de survivina de um peixe tal como a baiacu, tubarão,bagre ou peixe-zebra, ou de um anfíbio tal como o sapo Xenopus, ou de umréptil tal como um jacaré, crocodilo, tartaruga, lagarto ou salamandra, ou deoutros pássaros além do frango, são obtidos por métodos análogos àquelesdescritos no Exemplo 1 ou por outros métodos conhecidos por aqueles ver-sados na técnica de biologia molecular. Em alguns casos, tal como os homó-logos de survivina de Xenopus, peixe-zebra, bagre e pufferbird, (as seqüên-cias dos quais são fornecidas na listagem de seqüência deste pedido), ho-mólogos de survivina foram descritos e estão disponíveis por meio das ba-ses de dados públicas tal como PubMed. Onde a seqüência de gene de umhomólogo de survivina é conhecida, o correspondente DNA pode ser obtidode uma companhia de síntese de DNA comercial, tal como Blue Heron Bio-technology (Bothell, WA).

Os homólogos de survivina de tal pássaro, anfíbios, répteis, epássaros são configurados em composições de vacinas por métodos análo-gos àqueles de Exemplos 3, 4 e 5. Por exemplo, genes de survivina de Xe-nopus, peixe-zebra, peixe-gato e pufferfish são colocados no plasmídeopdCs após a adição de um sítio 5' Xba I e um sítio 3' Xho I nas extremidadesda seqüência de codificação. Isto é feito, por exemplo, usando métodos dePCR análogos àqueles de Exemplo 1, ou por síntese de gene total da se-qüência de codificação relevante flanqueada por ligadores. O plasmídeo depdCs-survivina é então colocado em uma linhagem de Salmoriella pelos mé-todos descritos no Exemplo 3.

Alternativamente, genes de survivina são configurados em plas-mídeos expressando proteínas de fusão de Fc-survivina como no Exemplo1, e as proteínas de fusão de Fc-survivina são usadas como vacinas. Porexemplo, os genes de survivina de Xenopus, peixe-zebra, peixe-gato ou puf-ferfish são colocados no plasmídeo pdCs após a adição de um sítio 5' Xma Ie um sítio 3' Xho I nas extremidades da seqüência de codificação. Isto é fei-to, por exemplo, usando métodos de PCR análogos àqueles de Exemplo 4,ou por síntese de gene total da seqüência de codificação relevante flanque-ada por ligadores. O plasmídeo Fc-survivina é então colocado em uma li-nhagem de célula mamífera adequada para expressão de nível elevado, talcomo células NS/O, e a proteína secretada resultante é coletada e purificadacomo no Exemplo 4 e formulada com um adjuvante e usada para vacinarhumanos ou animais como no Exemplo 5.Exemplo 3. Construção de Linhagens de Salmonella contendo plasmídeosda invenção.

As linhagens de Salmonella transportando plasmídeos da inven-ção para uso em vacinação foram geradas por um protocolo de eletropora-ção padrão resumido abaixo, familiar àqueles versados na técnica. Por e-xemplo, o plasmídeo pdCs-Survivina de Frango foi transformado em umalinhagem de Salmonella livre de plasmídeo tal como a linhagem SaImoneIIatyphimurium aroA atenuada SL7207. Outras linhagens de Salmonella atenu-adas também podem ser usadas, tal como RE88, com o genótipo aroA.dam-, VNP20009, com o genótipo msb", purl, ou alternativamente a linhagem LT2prototrófica. As linhagens Salmonella typhii, preferivelmente atenuadas, po-dem também ser usadas.

Para preparar bactérias eletrocompetentes, uma cultura de faselog de 50 ml de Salmonella foi colhida em um OD6OO de pelo menos 0,5,esfriada em gelo, e as células foram seqüencialmente lavadas em um volu-me igual e em seguida em um meio volume de 1 mM HEPES gelado, e repe-lido. As células foram então ressuspensas em 1 ml de glicerol a 10% frio, 1mM de HEPES, peletizadas e finalmente ressuspensas em 0,5 ml de glicerola 10% frio, 1 mM de HEPES por pipetagem suave. As células foram manti-das sobre gelo até outro uso, ou as alíquotas foram armazenadas a - 80 0C.

Para eletroporação, 40 microlitros de bactérias eletrocompeten-tes foram adicionadas a um tubo microcentrífugo de 1,5 ml pré-resfriado,combinado com até 200 ng de plasmídeo pdCs-Survivina de Frango super-espiralado em até um volume de 2 microlitros, e misturados por batidas deleve. A mistura de bactérias-DNA foi transferida para uma cubeta com aber-tura de 0,2 cm pré-resfriada (Bio-Rad, Hercules, CA) e eletroporada com umpulso elétrico de 2500 V, 25 pF, 200 ohms, geralmente resultando em umaconstante de tempo de 4,5 +/- 0,2, em que 1 ml de meio SOC foi adicionado.Após uma incubação de 1 hora a 37 °C, 0,1 ml das células foram semeadasem placas de seleção de antibiótico LB (100 microgramas/ml de ampicilina).

Isolados de colônia simples foram obtidos e cultivados, e o DNAplasmídeo foi isolado para confirmar sua identidade por análise de restrição.Uma cultura validada recentemente desenvolvida foi suplementada por glice-rol a 15 %, congelada instantaneamente em alíquotas de 500 microlitros eestocada a -80°C.

Exemplo 4. Transfecção, expressão, caracterização preliminar, e purificaçãode proteínas de fusão de Fc-survivina

A. Transfecção e Expressão de Proteínas de Fusão de Fc-survivina.

Para rápida análise de expressão de proteína, plasmídeos ex-pressando, por exemplo, muFc-Survivina de frango ou muFc-muSurvivinasão comumente introduzidos em uma linhagem celular tal como células HEK293 de rim embriônicas humanas (ATCC# CRL-1573) por transfecção transi-tória usando Iipofectamina (Invitrogen).

Para obter clones estavelmente transfectados que expressamproteínas Fc-survivina, por exemplo, o DNA plasmídeo apropriado foi intro-duzido nas células NS/0 de mieloma de camundongo por eletroporação. Ascélulas NS/0 foram desenvolvidas em meio de Eagle modificado da Dulbec-co suplementado com soro bovino fetal inativado por calor a 10%, 2 mM deglutamina e penicilina/estreptomicina. Cerca de 5x106 células foram lavadasuma vez com PBS e ressuspensas em 0,5 ml de PBS. 10 pg de DNA plas-mídeo Iinearizado foram então incubados com as células em uma CubetaPulsadora de Gene (0,4 cm de abertura de eletrodo, BioRad, Hercules, CA)em gelo durante 10 minutos. A eletroporação foi realizada usando um Pulsa-dor de Gene Pulser (BioRad) com fixações a 0,25 V e 500 mF. As célulasforam deixadas recuperar durante 10 minutos em gelo, após o que elas fo-ram ressuspensas em meio de crescimento e semeadas sobre duas placasde 96 cavidades. Os clones estavelmente transfectados foram selecionadospor seu crescimento na presença de 100 nM de metotrexato (MTX), que fo-ram adicionados ao meio de crescimento dois dias pós-transfecção. As célu-las foram alimentadas a cada 3 dias por duas a três vezes mais, e clonesresistentes a MTX apareceram em 2 a 3 semanas. Os sobrenadantes declones foram ensaiados por ELISA anti-Fc para identificar produtores eleva-dos. Os clones de alta produção foram isolados e propagados em meio decrescimento contendo 100 nM de MTX. Tipicamente, meio de crescimentomédio de H-SFM ou CD (Invitrogen) foi usado.

Alternativamente, os clones estavelmente expressando pro-teínas de fusão de Fc-survivina são obtidos em células HEK 293 de rim em·briônico humano por seleção de metotrexato, por um método similar àqueleacima descrito. Os clones de HEK 293 são mantidos em DMEM suplemen-tado com FBS a 10%.

B. Purificação e análise de proteínas de fusão de Fc-survivina.

Uma purificação padrão de proteínas de fusão contendo Fc foirealizada com base na afinidade da porção de proteína de Fc para Protein A.Em síntese, as células transfectadas com um plasmídeo codificando umaproteína de fusão de Fc-survivina foram tipicamente desenvolvidas em fras-cos cilíndricos em H-SFM suplementado com 0,1 μΜ de MTX, e o sobrena-dante celular contendo a proteína de fusão foi carregado sobre uma colunade Fluxo Rápido de Proteína A Sefarose pré-equilibrada (50 mM de fosfatode sódio, 150 mM de NaCI, 0,01 % de Tween 80 em pH neutro). A coluna foilavada extensivamente neste tampão, e proteína presa foi eluída em um bai-xo pH (pH 2,5) no mesmo tampão como acima e as frações foram trazidaspara pH 6,7 com 1M de base Tris, pH 11.

As proteínas de fusão de Fc-Survivina purificadas por Proteína ASefarose foram analisadas por cromatografia de exclusão de tamanho analí-tica (SEC), e descobriu-se que tipicamente a maioria do material estava emum estado agregado. Este resultado não foi inesperado, visto que a survivinaé normalmente uma proteína citoplásmica. Sem desejar ser ligado por teoria,supõe-se que quando a survivina é forçada para dentro da trilha secretorapela porção Fc de uma proteína de fusão Fc-survivina, a duplicação da sur-vivina é comprometida, particularmente visto que a survivina contém nume-rosas cisteínas que podem encaixar-se em ligação de dissulfeto. Enquantoesta agregação pode interferir com a atividade biológica, a agregação não éindesejável quando a proteína deve ser usada como vacina.

A integridade e pureza das proteínas de fusão foram verificadasreduzindo a eletroforese por SDS-PAGE. A faixa mais forte foi observada emaproximadamente aproximadamente 45 kDa, o tamanho esperado da proteí-na de fusão. Uma multidão de faixas secundárias estavam presentes tam-bém: outra evidência de que a proteína teve realmente agregada.

C. Procedimentos ELISA.

A concentração de produtos de proteína contendo Fc nos sobre-nadantes de clones resistentes a MTX e outras amostras de teste foram de-terminadas por ELISA anti-Fc. Os procedimentos padrão como descrito emdetalhes abaixo foram essencialmente seguidos.

i. Placas de Revestimento.

As placas ELISA foram revestidas com IgG antimurino de cabra(H+L) (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA) a 5 pg/mLem PBS1 e 100 pL/cavidade em placas de 96 cavidades (Nunc-lmmuno plateMaxisorp). As placas revestivas foram cobertas e incubadas a 4°C durante anoite. As placas em seguida foram lavadas 4 vezes com Tween a 0,05%(Tween 20) em PBS1 e bloqueadas com 1% de BSA/1% de soro de cabraem PBS1 200 dl/cavidade. Após a incubação com o tampão de bloqueio a37°C durante 2 horas, as placas foram lavadas 4 vezes com Tween a 0,05%em PBS e tampadas secas sobre toalhas de papel.

ii. Incubação com amostras teste e anticorpo secundário

Amostras de teste foram diluídas como apropriado em tampãode amostra (1% BSA/1% soro de bezerro/0,05% Tween em PBS). Uma cur-va padrão foi preparada empregando-se um anticorpo quimérico (com umaFc humana), a concentração do qual foi conhecida. Para preparar uma curvapadrão, diluições seriais foram feitas no tampão de amostra para forneceruma curva padrão variando de 125 ng/mL a 3,9 ng/mL. As amostras diluídase padrões foram adicionados à placa, 100 μΙ/cavidade e a placa incubada a37°C durante 2 horas. Após incubação, a placa foi lavada 8 vezes com Twe-en a 0,05% em PBS. A cada cavidade foram então adicionados 100 μΙ doanticorpo secundário, a IgG anti-humana conjugada a rábano picante pero-xidase (Jackson Immuno Research), diluída para aproximadamente1:120.000 em tampão de amostra. A diluição precisa do anticorpo secundá-rio a ser usada varia para cada lote. Após incubação a 37°C durante 2 ho-ras, a placa foi lavada 8 vezes com Tween a 0,05% em PBS.iii. Desenvolvimento

A solução de substrato foi adicionada à placa a 100 pL/cavidade.A solução de substrato foi preparada dissolvendo-se 30 mg de OPD (clori-drato de o-fenilenodiamina (OPD), (1 comprimido) em 15 mL de 0,025 M deácido cítrico/0,05 M de tampão de Na2HPO4, pH 5, que continha 0,03% deperóxido de hidrogênio recentemente adicionado. A cor foi deixada desen-volver-se durante aproximadamente 30 minutos em temperatura ambienteno escuro. O tempo de desenvolvimento é submetido à alteração, depen-dendo da variabilidade de lote a lote das placas revestidas, o anticorpo se-cundário, etc. A reação foi interrompida adicionando-se 4N de ácido sulfúricoa 100 pL/cavidade. A placa foi lida por uma leitora de placa, que foi fixadatanto a 490 quanto 650 nm e programada para subtrair a OD de base a 650nm para a OD a 490 nm.

Exemplo 5. Métodos para liberação de vacina e desafio de tumor.

Camundongos C57BI/6 e Balb/c (7 a 8 semanas de idade) foramadquiridos de Jackson Laboratories (Bar Harbour, ME). Os camundongosforam mantidos em EMD Lexigen Research Center Corp., Billerica, MA, etodos os experimentos de animal foram realizados de acordo com os Proce-dimentos de Operação de Facilidades Animais aprovados.

Para preparar a amostra de vacina de Salmonella, uma culturade 5 ml de LB/AMP foi inoculada com uma colônia bacteriana transformadasimples, desenvolvida durante a noite a 37°C, centrifugada a 2000xg durante10 minutos, lavada uma vez em PBS e em seguida ressuspensa em 2 ml dePBS. A OD6OO de uma diluição de 1:10 da cultura em PBS foi avaliada, e aconcentração de cultura foi ajustada para 109 células/ml com PBS, assumin-do que 1 unidade OD6OO correspondeu a aproximadamente 109 bactérias/ml(como determinado a partir da semeadura de uma diluição serial da culturasobre placas LB/Ampicilina). A vacinação por gavagem oral foi realizada comuma seringa de 1 ml equipada com uma agulha de alimentação descartávela 20G χ 3,8 cm (1.5" que foi introduzida dentro do estômago. Os camundon-gos foram pré-tratados com uma gavagem de 0,1 ml de 10% de bicarbonatode sódio para neutralizar os ácidos do estômago, e cinco minutos depois oscamundongos foram administrados uma amostra de vacina de 0,1 ml (108bactérias).

O efeito de uma vacina foi avaliado sobre linhagens de célula detumor que expressam a survivina mamífera e apresentam antígenos deriva-dos de survivina em MHCs. As linhagens de célula de tumor usadas nos E-xemplos abaixo foram a linhagem de célula de carcinoma de pulmão murinaD121, a linhagem de célula de Iinfoma murina A20, a linhagem de tumor demama murino 4T1, a linhagem de célula de carcinoma de Pulmão Lewis mu-rina LLC, a linhagem de célula de câncer de cólon murina CT26, e a Iinha-gem de célula de melanoma murina B16, porém outras linhagens celularesexpressando survivina mamífera e apresentando antígenos derivados desurvivina podem ser usadas. Em algumas experiências, as linhagens de cé-lula de tumor foram usadas, as quais foram construídas para expressar mo-lécula de adesão de célula epitelial humana (EpCAM), designada por "KSA"(por Exemplo LLC/KSA). Expressão de survivina é convenientemente avali-ada por westem blot, por métodos padrão. O anticorpo policlonal de coelhopara survivina humana e murina (AHP604, Serotec, Raleigh, NC) foi usadoem uma diluição de 1:500.

As linhagens de célula de tumor usadas nos Exemplos abaixoforam mantidas nos seguintes meios. D121 foi desenvolvida em DMEM com10% de soro bovino fetal (FBS), suplementado com 1% penicili-na/estreptomicina (P/S), 1% L-glutamina, 1% de piruvato de Na, e 1 % deaminoácidos não-essenciais. A20 e 4T1 foram desenvolvidas em RPMI com10% de FBS, 1% de P/S, 1% de L-glutamina. LLC foi desenvolvida emDMEM com 10% FBS, 1% de P/S, 1% L-glutamina. CT26 foi desenvolvidoem DMEM com 10% de FBS, 1 % de P/S, 1% de L-glutamina, e 1% de meiode vitamina B16. Meios de CT26/KSA também incluíram 1% de piruvato deNa e 1 % de aminoácidos não-essenciais. O meio para linhagens celularesadicionalmente expressando EpCAM também continha 1 pg/ml de G418.

Para avaliar um efeito de vacina sobre sobrevivência de camun-dongo ou sobre a carga de tumor de pulmão de camundongos tratados, ascélulas de tumor foram administradas intravenosamente. As linhagens decélula de tumor foram lavadas com PBS1 tripsinizadas durante 3 minutos, e atripsina foi neutralizada com meio condicionado. As células foram peletiza-das e lavadas duas vezes com PBS, ou no caso de células D121, com PBS,1% de albumina de soro bovino, 50 μΜ de EDTA. Uma suspensão celularsimples foi obtida aplicando-se as células ressuspensas sobre peneiras demaíha de náilon de 100 μΜ descartáveis múltiplas (BD Falcon). Os camun-dongos foram injetados intravenosamente na veia do rabo com a suspensãocelular em um volume de 200 μΙ por camundongo usando uma agulha degauge 27. Os pulmões foram removidos, pesados e classificados avaliando-se a área percentual de pulmão coberta pelo tumor para comparar a cargade tumor metastática.

Exemplo 6. Imunização com DNA codificando survivina de frango geraanticorpos gue interagem com a survivina mamífera.

Para testar se a vacinação com ácidos nucléicos codificandosurvivina de frango pode gerar anticorpos que interagem com survivina ma-mífera, os seguintes experimentos foram realizados. Um protocolo de imuni-zação descrito por Davis ((1996) Adv. Drug Delivery Reviews 21:33) foi usa-do como uma base para as experiências. Camundongos Balb/c fêmeas com7-8 semanas de idade (n = 2 por grupo de tratamento) foram imunizadosuma vez (Dia 1) ou três vezes (Dia 1, 21, e 46) com plasmídeos de expres-são codificando survivina de frango do tipo silvestre (ChSur) ou muFc- Survi-vina de Frango (FcChSur) ou com um plasmídeo de expressão de controlecodificando antígeno muFc-carcinoembriônico (CEA) (FcCEA). Os camun-dongos foram injetados no músculo anterior tibial com 100 μΙ de uma solu-ção de 10 μΜ de cardiotoxina, seguida cinco dias após por injeção com 100μg de DNA plasmídeo. No dia 62, os camundongos foram sangrados e osoro foi ensaiado quanto aos anticorpos contra survivina murina. O soro se-rialmente diluído foi aplicado as uma placa ELISA revestida com proteína defusão muFc-muSurvivina, a placa foi lavada, as amostras foram incubadascom um anticorpo lgG2a anti-camundongo conjugado à peroxidase. O ELI-SA detectou a presença de anticorpos anti-survivina por um ensaio colorimé-trico comparado aos camundongos ingênuos de controle negativo. Os resul-tados mostrados na Tabela 2 indicam que as vacinas de DNA de survivinaforam eficazes na eliciação de anticorpos reativos à survivina murina en-quanto que a vacina de DNA não foi.

Tabela 2: Titu os de anticorpo de survivina anlimurino.

<table>table see original document page 65</column></row><table>

Os anticorpos anti-survivina de camundongo são também testa-dos quanto à inter-reatividade com a survivina humana em ou uma westernblot ou um ELISA. É esperado que os anticorpos de survivina de camundon-go, obtidos por vacinação de camundongos com a composição de vacina desurvivina de frango, também ligam-se à proteína humana de survivina.

Exemplo 7. Vacinação de um mamífero com DNA codificando survivinaelicia a resposta imune de célula T à células de câncer.

Para determinar a capacidade de uma vacina de survivina combase em Salmonella para estimular uma resposta de célula T contra as célu-las de câncer, as seguintes experiências foram realizadas. CamundongosBalb/c foram vacinados com a linhagem de SL7207 Salmonella transportan-do uma mutação AroA (Medina e outro, (1999) Infection e Immunitv, pp.1093-1099) e também transportando um vetor de expressão mamífero codi-ficando survivina de murino (n = 2) ou survivina de frango do tipo silvestre (n= 2) no dia 0 e dia 14, como descrito no Exemplo 5. Camundongos não imu-nizados ingênuos (n = 2) foram usados como controle negativo nesta experi-ência.

Um mês após a primeira vacinação, esplenócitos de cada grupoforam extraídos e agrupados. As células T CD8+ foram purificadas e usadascomo respondedores em um ensaio de pote ELISA de IFNy murino, essenci-almente como descrito abaixo. Neste ensaio, linhagens de célula de tumorΑ20 e 4Τ1 foram usadas como as células efetoras (figura 6). As células 4T1foram construídas para expressar molécula de adesão de célula epitelialhumana (EpCAM), porém esta não foi considerada ser relevante para a ex-periência. Houve significantemente mais células T responsivas ao IFNy decamundongos vacinados do que os animais de controle. Vacinação comSalmonella contendo um plasmídeo de expressão de murino ou survivina defrango correlacionado com um número elevado de células T precursoras se-cretoras de IFNyem resposta às linhagens de célula de tumor diferentes.

O mesmo protocolo de vacinação foi também realizado nos ca-mundongos C57BI/6. As células T CD8+ do baço destes camundongos foramincubadas com células de carcinoma de pulmão Lewis (LLC) ou células demelanoma B16 no ensaio de pote ELISA de IFNy muriN2 As células LLC eB16 foram construídas para expressar molécula de adesão de célula epitelialhumana (EpCAM), porém isto não foi considerado ser relevante para a expe-riência. Ambas as vacinas resultaram em um aumento no número relativo decélulas T responsivas direcionadas contra peptídeos do antígeno alvo ex-presso no contexto de MHC classe I quando comparado aos animaisC57BI/6 ingênuos (Figure 5). Houve significantemente mais células secreto-ras de IFNyproduzidas em camundongos vacinados com survivina de frangoSL7207 do que camundongos com survivina murina SL7207 tanto contracélulas de tumor LLC e B16.

Juntos, estes resultados indicam que ambos os métodos de va-cinação eliciam um aumento no número de precursores de célula T CD8+reativos com células de câncer exibindo peptídeos de survivina mamífera nocontexto de epitopos de MHC classe I. Estas observações também sugeremque a imunização com survivina de frango pode ser mais potente em tole-rância ao rompimento e gerando uma resposta imune direcionada contracélulas alvo expressando survivina mamífera.

Neste Exemplo e em diversos dos seguintes Exemplos, a Iinha-gem de Salmonella typhimurium linhagem SL7207 foi usada, porém outraslinhagens de Salmonella podem ser usadas, tal como Salmonella typhi.Quando tratando humanos com Salmonella typhi em seres humanos, é ge-ralmente preferível usar auxótrofos que opcionalmente transportar mutaçõesde atenuação adicionais.

Protocolo de ensaio de pote ELISA de IFNyMurino:

O ensaio de pote ELISA foi realizado essencialmente como des-crito por Power e outro, (Power e outro, (1999) J.-ImmiinoI. Meth. 227:99-107). As células T CD8+ foram isoladas de esplenócitos usando um kit deisolamento de célula T Miltenyi CD8+ (Miltenyi Biotech, Aubum, CA) e classi-ficadas em uma classificadora de conta magnética Automacs, pelas instru-ções do fabricante. As células T CD8+ foram mantidas em RPMI suplemen-tado com 0,7 ng/ml IL-2 (R&D Systems). Dentro de 24 horas, células viáveisforam purificadas em um gradiente Lympholyte® e ressuspensas em umaconcentração final de 106 células/ml. As células T CD8+ foram semeadas emdiluições seriais começando em 105 células/cavidade em uma placa de E-LISpot de IFNy murino (BD Biosciences, San Jose1 CA), pré-revestidas com5 pg/ml de anticorpo IFNyantimurino. Todas as linhagens de célula de tumorforam adicionadas em uma concentração de 5 χ 104 células/cavidade. Após18-24 horas, as células foram removidas, as membranas revestidas comanti-lFNy foram lavadas com 0,05% de Tween em PBS, incubadas com umanticorpo biotinilado secundário para IFNy em PBS com 2% de soro bovinofetal, e anticorpo secundário ligado foi visualizado por exposição a HRP con-jugado à estreptavidina e AEC solução de (3-amino-9-etilcarbazol)acetato.As manchas correspondendo à células T CD8+ secretoras de IFNy foramquantificadas usando o sistema Zeiss KS ELISpot (Muenchen-Hallergmoss,Alemanha).

Exemplo 8. In vitro imunização de células imunes derivadas de humanocom survivina de frango.

Para confirmar a capacidade de uma seqüência não-mamíferade survivina, tal como a seqüência de survivina de frango, para eliciar umaresposta anti-survivina em seres humanos, um ensaio de imunização in vitroé realizado usando células sangüíneas periféricas do paciente (hu PBMCs).Em essência, células dendríticas (DCs) e células T são purificadas de huPBMCs, as DCs são carregadas com um antígeno de escolha e incubadascom células T, e a resposta de células T à exposição a peptídeos de survivi-na, por exemplo, na forma de células alvo expressando survivina humana, éensaiada, empregando métodos padrão familiares àqueles versados na téc-nica.

Por exemplo, DCs (de huPBMCs de pacientes de HLA-A2+ ederivadas usando IL-4 e GM-CSF), são pulsadas com uma seqüência depeptídeo de survivina de controle conhecida ser um epitopo para alelos HLA-A2+, tal como LMLGEFLKL (SEQ ID NO:6), ou são pulsadas com peptídeosexperimentais, tal como (i) uma survivina de 30-mer de peptídeo derivado defrango GCAFAALQKDPSELMLGEFLKLDRERAKNV (SEQ ID NO:32); (ii) umpeptídeo de survivina de frango do tipo silvestre; ou (iii) um peptídeo de sur-vivinas de frango mutado tal como Survivina de Frango(N97E,T99M,V100L,Q101G) (SEQ ID NO:12). Alternativamente, construçõesde DNA expressando estas seqüências são introduzidas em DCs. Após aincubação com os peptídeos ou proteína, ou expressão do DNA introduzido,as DCs são irradiadas e lavadas para remover o excesso de peptídeo exo-genamente adicionado, e são em seguida misturadas com células T singe-néicas na presença de IL-7 e IL-2. As células T são re-estimuladas em umabase semanal misturando-se as células T cultivadas com as DCs recente-mente tratadas e irradiadas.

Em um ensaio, a presença de célula T reativas à survivina é de-tectada por um ensaio ELISpot de IFNy, essencialmente como descrito noExemplo 7. Alternativamente, um ensaio de liberação de [51Cr] convencionalé usado para avaliar a atividade funcional destas células, em que as célulasde tumor alvo, apresentando peptídeos de survivina no contexto de molécu-las de MHC classe I, são carregadas com [51Cr] e incubadas com estas célu-las T1 e a Iise de célula de tumor é quantificada por liberação de [51Cr]. Umalinhagem de célula alvo de controle que não expressa a survivina é usadacomo um controle negativo. Espera-se que as preparações experimentaissejam pelo menos tão eficazes quanto a preparação de controle na geraçãode células T que são responsivas à survivina, indicando que as seqüênciasderivadas de survivina de frango podem servir como epitopos que direcio-nam uma resposta específica imune às células expressando survivina hu-mana.

Exemplo 9. Efeitos de vacinação sobre cânceres de pulmão.

Para determinar se a resposta imune eliciada pela vacina pode-ria inibir o crescimento de tumor metastático quando o segundo tratamentofoi retardado até após desafio de tumor, as seguintes experiências foramrealizadas.

No Dia 0, camundongos C57BI/6 (n = 5 por condição de trata-mento) foram vacinados oralmente com 100 μΙ de 10% bicarbonato de sódioseguido por 108 SL7207 Salmonella contendo: um plasmídeo codificandouma survivina de frango mutante (Survivina de Frango ((N97E, T99M,V100L, Q101G)); um plasmídeo codificando muFc-Survivina de Frango; ouum plasmídeo com duas unidades transcricionais, uma codificando Survivinade Frango ((N97E, T99M, V100L, Q101G) e uma codificando a proteína defusão muFc-mulL2 como um adjuvante. Os camundongos de controle foramtratados com PBS.

Os camundongos foram oralmente pré-dosados com 100 μΙ de10% bicarbonato de sódio, e a Salmonella SL7207 foi administrada em PBS(preparado como descrito acima). Dez dias após a primeira vacinação, oscamundongos foram injetados intravenosamente com uma suspensão decélula única de 1x106 células LCC/KSA em 200 μΙ de PBS, e reforçados comuma segunda vacinação oral, usando a mesma concentração de Salmonella.Os camundongos foram sacrificados no Dia 32.

Resultados típicos são mostrados na Tabela abaixo (Tabela 3).Os resultados indicam que a vacinação com Salmonella transportando umvetor de expressão para qualquer construção de survivina de frango fornecesimilar proteção contra o câncer de pulmão metastático.

Tabela 3. Pesos do Pulmão e escores de metástase de camundongos comcâncer de pulmão tratados com uma vacina de survivina.<table>table see original document page 70</column></row><table>

Na Tabela 3, (*) Carga de Tumor foi classificada em uma escalade 0-3 (0 = ausência de tumor nos pulmões, 1 = <5% de carga de tumor, 2= 5- 50% de carga de tumor, 3= >50 % de pulmões cobertos com tumor.) Osescores de tumor italizados e negritados indicam camundongos com a des-coberta de um tumor extrapulmonar na base de rabo.

Exemplo 10. Vacinação com survivina de frango SL7207 ou survivinamurina significantemente retarda a mortalidade

Para determinar se a vacinação com Salmonella SL7207 trans-portando plasmídeos de expressão de survivina poderiam reduzir a carga detumor e aumentar a sobrevivência, os camundongos Balb/c (n = 5 por condi-ção de tratamento) foram dosados duas vezes por gavagem oral como pre-viamente descrito, duas semanas de distância, com PBS, SalmonellaSL7207 com um plasmídeo de expressão de survivina de murino, ou Salmo-nella SL7207 com um plasmídeo de expressão de survivina de frango do tiposilvestre. Duas semanas após a segunda vacinação os camundongos foraminjetados intravenosamente com 200 μΙ de uma suspensão de PBS de 5x105 células/ml de células singenéicas CT26/KSA (que também expressa-ram a proteína humana EpCAM1 que não foi considerada ser relevante paraa experiência). Os camundongos foram monitorados quanto à sobrevivência.Como ilustrado na. figura 7, houve um perfil de sobrevivência maior nos ca-mundongos tratados com survivina de frango SL7207 em comparação aotratamento com PBS ou survivina de murino SL7207.Exemplo 11. Sobrevivência prolongada de mamíferos com metástasesde câncer como um resultado de vacinação com Salmonella transpor-tando vetores de expressão de survivina.

Para definir se mamíferos com câncer pré-existente poderiam ser vacinados com plasmídeos de expressão de survivina transportandoSalmonella, a seguinte experiência foi realizada. Nesta experiência, os ca-mundongos C57BI/6 foram pretratados com 0,1 ml de 10 % de bicarbonatode sódio e em seguida oralmente vacinados com cerca de 100 milhões deSalmonella SL7207 contendo um vetor para survivina de murino (n=5) ouSurvivina de Frango (N97E, T99M, V100L, Q101G) (n=5) em PBS (prepara-do como acima descrito) no dia 0. Os camundongos de controle foram gava-dos com bicarbonato de sódio e PBS (n=5). Dez dias após a primeira vaci-nação, os camundongos foram injetados intravenosamente com 200 μΙ deuma suspensão de PBS de 1 x106 de células LLC/KSA (que também ex-pressaram a proteína humana EpCAM, que não foi considerada ser relevan-te para a experiência). Todos os camundongos foram reforçados com umasegunda vacinação oral administrada 4 horas após a injeção de tumor usan-do a mesma concentração de Salmonella administrada para prover a respos-ta imune.

A sobrevivência foi seguida durante o curso de um período de 12semanas após o desafio de tumor. Todos os camundongos de controle esta-vam mortos dentro de 35 dias de administração de tumor. De modo impor-tante, todos os camundongos vacinados com uma das construções de survi-vina estavam ainda vivos no dia 35. Todos os camundongos no grupo detratamento de Survivina de Frango SL7207 (N97E, T99M, V100L, Q101G)estavam mortos dentro de 10 semanas a partir da injeção de LLC/KSA. Ha-via um animal sobrevivente no grupo tratado com survivina murina SL7027após 3 meses. Não houve nenhuma diferença significante em sobrevivênciaentre os dois grupos de tratamento (p= 0,243).

Na figura 8, as curvas de sobrevivência para vacinação contraum desafio de tumor com células LLC/KSA são mostradas.Exemplo 12. Uso de algoritmos preditivos para estimar as substituiçõesem seqüências de survivina.

Os algoritmos preditivos podem ser usados para avaliar se asvariantes de survivina da invenção comprometem os epitopos antigênicospotenciais, ou ao contrário, se epitopos antigênicos subdominantes potenci-almente podem ser melhorados. Por exemplo, a variante de huSurvivina hu-Sur(R18E, H77A, C84A, A128P) (SEQ ID NO:84) é analisada usando umabase de dados publicamente disponível para predição do sítio de clivagemproteassômica, por Exemplo NetChop (www.cbs.dtu.dk/NetChop), bem co-mo uma para a predição de epitopo para os supertipos de MHC I HLA maio-res, por exemplo, SYFPEITHI (www.syfpheithi.de). Usando NetChop, desco-briu-se que o padrão de clivagem não é drasticamente alterado pela introdu-ção das substituições R18E, H77A, C84A, A128P na survivina humana ("S"indica os sítios de clivagem potenciais acima de um limiar de 0,8), comomostrado:

Emgaptlppawqpflkdhristfknwpflegcactpermaeagfihcptenepdl

S....S...S..SSSS..S..SS......S.......S...............Stiposilvestre

S....S....S.SSSS..S..SS......S.......S...............Svariante

A A

aacffcfkeleqwepdddpieehkkhssqcaflsvkkqfeeltlqeflkldrer

...SS.SS.S............SSS.......S........S.SS...SS.... tipo silvestre

...SS.SS.S............SS........S...S....S.SS...SS.... variante

P

Aknkiaketnnkkkefeetakkvrraieqlaamd (SEQ ID NO:8)

....S.......SS.....S.SS......S..S. tipo silvestre

....S.......SS.S.....SS.S....S..S. variante

Uma ligação de epitopo antigênico previamente identificado aosubtipo HLA-A0201 é mostrada em negrito e sublinhado, e NetChop predizum sítio de clivagem de terminal C para este epitopo.

Usando SYFPEITHI, a seqüência huSur(R18E, H77A, C84A,A128P) (SEQ ID NO:84) é analisada quanto aos epitopos que ligam-se aossupertipos de HLA A2, A3, e B7, que juntos abrangem cerca de pelo menos85 % da população humana (vide Sette e outro, (1999) Immunogen. 50:201-212). Quando comparado à huSurvivina tipo silvestre, o epitopos ordenadosde topo são idênticos para HLA-A 0201 e HLA-A 03, porém para HLA-B0702, a seqüência de survivina variante produz um epitopo ordenado de to-po, devido a um resíduo ancorando o terminal C mais favorável obtido pelasubstituição H77A. Desse modo, o peptídeo EPDDDPIEEA (SEQ ID NO:33)pode ser um peptídeo antigênico melhor do que o peptídeo EPDDDPIEEH(SEQ ID NO:34).

Outras substituições, quando sugeridas a partir da análise deNetChop, tais como P47L e Q56L, podem ser introduzidas em huSur(R18E,H77A, C84A, A128P), e a seqüência pode ser reanalisada por SYFPEITHIcomo anteriormente. A seqüência para Survivina Humana (R18E, H77A,C84A, A128P) é mostrada em SEQ ID NO:84. A seqüência para SurvivinaHumana(R18E, P47L, Q56L, H77A, C84A, A128P, I135P) é mostrada emSEQ ID NO:56. Especificamente, a mutação P47L fortalece a posição deâncora 2 no peptídeo CPTENEPDL (SEQ ID NO:2) que é mudado para CL-TENEPDL (SEQ ID NO:35).

Semelhantemente, a substituição Q56L cria o peptídeoALCFFCFKEL (SEQ ID NO:36) com um resíduo de âncora preferido na po-sição 2 comparado a AQCFFCFKEL (SEQ ID NO:37) que é predito ser umaglutinante bastante inferior a HLA-A 0201. Quando comparada à huSurvivi-na tipo silvestre, a seqüência de survivina de variante de Q56L produz umpeptídeo que é predito ser como forte um antígeno como o peptídeo antigê-nico de huSurvivina validado ELTLGEFLKL (SEQ ID NO:38) (Andersen eoutros, (2001) Câncer Res. 61:869-872).

De acordo com a invenção, uma tal análise pode produzir se-qüências de survivina que contêm peptídeos altamente antigênicos em queCTLs são menos prováveis de ser tolerados, por exemplo, promovendo-serespostas aos epitopos subdominantes.

Exemplo 13. Tratamento de um paciente com câncer humano com umavacina que contém um vetor para expressar survivina não mamífera.De acordo com a invenção, um ser humano com câncer é trata-do com uma vacina da invenção como segue. Primeiro, os candidatos paratratamento são categorizados opcionalmente com um agente diagnósticoque testa se suas células de câncer superexpressam a survivina. Por exem-pio, uma amostra de tumor pode ser analisada por imunofluorescência comanticorpos anti-survivina. Alternativamente, uma amostra de tumor de umpaciente candidato pode ser analisada por hibridização quanto a um frag-mento de gene que detecta os níveis de mRNA de survivina, por PCR detranscriptase reversa, ou por qualquer outro método que detecta os níveis deproteína ou mRNA de survivina. Pacientes podem, da mesma forma, ser ca-tegorizados como prováveis de responder com base em outros testes diag-nósticos, tais como testes para níveis de expressão de MHC, níveis de mo-léculas de transdução de sinal conhecidas por estar envolvidas no extermí-nio mediado por célula T, ou com base em níveis de moléculas que cuja fun-ção não é compreendida mas que é empiricamente conhecida por correla-cionar-se com receptividade à imunoterapia.

É, particularmente, útil escolher pacientes humanos que sofre-ram uma resseção cirúrgica de quase a mesma do tumor. Esta permite aná-lise diagnostica do tumor como descrito acima. Além disso, sem desejar es-tar ligado por teoria, é vantajoso tratar depois da resseçãoão cirúrgica por-que um tumor grande, volumoso pode simplesmente titular o sistema imune.Além disso, tumores segregam-se fatores imunossupressores difusíveis quealcançam as concentrações mais altas em massas grandes que em metás-tases pequenas.

Pacientes que são escolhidos para o tratamento têm melanoma,carcinoma de cólon, câncer de mama, câncer de próstata, câncer de pul-mão, câncer renal, glioblastoma, câncer de cabeça e pescoço, e outros cân-ceres.

Depois do diagnóstico e seleção de pacientes, um paciente étratado com uma cepa de Salmonella que suporta um vetor de expressão desurvivina não mamífero (um vetor para expressar survivina não mamífero emuma célula de mamífero). Por exemplo, um paciente pode receber 109 a 1013de Salmonella viva LT2 que suporta um plasmídeo com expressão de Survi-vina de Frango direcionada de um promotor de mamífero. Preferivelmente,cerca de 1010 -1012 de bactérias são empregadas, e mais preferivelmentecerca de 2x1011 de Salmonella são administradas. A cepa de Salmonella épreferivelmente auxotrófica, e quaisquer das cepas mencionadas nos Exem-plos podem ser empregados.

Dois métodos alternativos são empregados para tratar a questãode sobrevivência das bactérias de Salmonella no ambiente ácido do estô-mago. Pelo primeiro método, um paciente primeiro ingere uma quantidadesegura e eficaz de bicarbonato de sódio para neutralizar o ácido de estôma-go. Pelo segundo método, bactérias Salmonella são formuladas como umapílula com um revestimento entérico que permite a passagem através doestômago e dissolução no intestino delgado.

Efeitos colaterais podem incluir diarréia moderada quando cepasbacterianas de Salmonella typhimurium são empregadas; Salmonella typhi-murium é naturalmente um patógeno de camundongo e não é normalmentepatogênico a humanos. É preferível para tratar tal diarréia moderada sinto-maticamente, mas não tratar com antibióticos, visto que o último tratamentopode destruir o efeito de vacina.

Exemplo 14. Temporizacão da vacinação relativa ao desafio de tumor.

Uma experiência foi realizada para testar a importância da tem-porização da vacinação com Survivina de Frango relativo ao tempo de desa-fio de tumor. Camundongos foram dosados com Salmonella contendo umplasmídeo que codifica Survivina de Frango (N97E, T99M, V100L, Q101G)por gavagem oral. O horário da dosagem é mostrado na figura 9. Comomostrado, gavagem oral foi realizada nos dias 1 e 13; dias 7 e 13; dias 10 e18; ou dias 13 e 21, relativo a um desafio intravenoso por células de L-LC/KSA no dia 10 e uma avaliação de carga pulmonar de tumor no dia 29.Como mostrado na figura 10, gavagem oral com Salmonella contendo umplasmídeo que codifica Survivina de Frango (N97E, T99M, V100L, Q101G)foi eficaz para reduzir a carga de tumor pulmonar independente do horáriode dosagem empregado. O efeito da vacina foi mais pronunciado quando adose de vacina de preparação foi administrada mais de três dias antes dodesafio de tumor.

Os efeitos da variação dos horários de dosagem sobre as me·tástases pulmonares foram da mesma forma avaliados. Metástases pulmo-nares foram marcadas como segue: a um camundongo com mais que 50%de cobertura de sua superfície pulmonar com tumor foi dado um escore de 3;a um camundongo com 5-50% de sua superfície pulmonar coberta com tu-mor foi dado um escore de 2; a um camundongo com menos de 5% de su-perfície pulmonar coberto com tumor foi dado um escore de 1; e a um ca-mundongo sem colônias de tumor pulmonar visíveis foi dado um escore dezero. Como mostrado na figura 10, horários de dosagem que incluíram umaprimeira dose antes do desafio de tumor serviram para reduzir o escore demetástase pulmonar comparado com horários de dosagem mais tarde oucom camundongos que não foram imunizados oralmente com Survivina deFrango (N97E, T99M, V100L, Q101G).

Exemplo 15. Terapia de combinação com vacina de survivina e quimio-terapia.

Os efeitos de combinação de vacinação contra survivina e qui-mioterapia da mesma forma foram avaliados. O protocolo de teste é mostra-do na figura 11. Como mostrado na figura, camundongos que recebem otratamento completo com foram preparados com Salmonella que suporta umplasmídeo que codifica Survivina de Frango tipo silvestre no dia 1. Célulasde LLC/KSA foram introduzidas intravenosamente (desafio) no dia 4. Ciclo-fosfamida (CTX) foi administrada intraperitonealmente no dia 11 e indometa-cina foi administrada nos dias 12-15. No dia 15, aos camundongos foi dadouma segunda gavagem oral (reforço) com Salmonella que suporta o plasmí-deo de Survivina de Frango tipo silvestre e carga de tumor pulmonar foi ava-liada no dia 28.

Outros camundongos receberam apenas porções do tratamento,receberam por exemplo: apenas a primeira, o desafio, e o reforço (PCB); odesafio, a CTX e a indometacina, mas não a primeira ou o reforço (C(CI)); aprimeira, o desafio, a CTX, e a indometacina, mas não o reforço (PC(CI)); ouo desafio, a CTX, a indometacina, e o reforço, mas não a primeira (C(CI)B).

Como mostrado na figura 12, camundongos que receberam a-penas a primeira, desafio e reforço mostraram uma carga de tumor reduzidae escore de metástase pulmonar reduzido comparado ao controle negativo.CTX e indometacina tiveram efeitos similares no escore de metástase pul-monar e maior redução total da carga de tumor. As cargas de tumor maisbaixas e os escores de metástase pulmonar mais baixos foram observadosem camundongos que recebem pelo menos a primeira e a CTX e indometa-cina, demonstrando que o tratamento de vacinação e a quimioterapia podemcooperar para reduzir as cargas de tumor e metástases pulmonares.

Exemplo 16. Vacinação com base em Salmonella com DNA que codificasurvivina não mamífera correlaciona-se com aparecimento de células Tcom um fenótipo de memória ativada.

Linfócitos de sangue periférico foram isolados de camundongossubmetidos ao PCB, Cl, PC(CI), C(CI)B, ou tratamentos com (PC(CI)B)completos descritos no exemplo anterior. As células foram analisadas porcitometria de fluxo para determinar se os tratamentos conduziram ao apare-cimento de células T de memória ativada. A presença ou ausência de célu-las T de memória foi determinada monitorando-se células com expressãoalta de CD44 e expressão baixa de CD3 (CD44brilhan,e CD3baix0). Como mos-trado na figura 13, camundongos tratados com protocolo da primeira-desafio-reforço (PCB) demonstraram células T com um perfil de expressãode CD44bnlhante indicativo do aparecimento de células T de memória ativada .Perfis similares foram observados em cada dos protocolos que incluíramimunização com Salmonella que suporta um plasmídeo que codifica Survivi-na de Frango , mas não nos camundongos tratados apenas com quimiotera-pia (e não nos controles negativos).

Exemplo 17. Terapia de combinação com uma imunocitocina e uma va-cinação com DNA que codifica survivina não mamífera.

Para determinar se a vacinação que usa uma survivina não ma-mífera pode realçar a eficácia de um tratamento de tumor com base em imu-nocitocina, camundongos foram desafiados no dia 1 com células de L-LC/KSA subcutaneamente e tratados de acordo com o horário mostrado nafigura 14. Ratos que receberam gavagem oral com Salmonella que abrigaum plasmídeo que codifica Survivina de Frango (N97E, T99M, V100L,Q101G) foram dosados nos dias 4, 11, 18, e 25. A imunocitocina seleciona-do para uso nesta experiência foi uma fusão de IL-2 com um anticorpo anti-EpCAM desimunizado, como descrito na publicação do pedido de patenteUS 2003-0157054, Camundongos que recebem a imunocitocina receberam20 μg da imunocitocina intravenosamente nos dias 8, 9 e 10.

Os volumes de tumor resultantes são mostrados com o passardo tempo na figura 15. Vacinação ou tratamentos com imunocitocina foramsuficientes para retardar a velocidade do crescimento de tumor com o passardo tempo. Camundongos que recebem tanto a vacina quanto a imunocitoci-na fizeram ainda melhor, demonstrando mais reduções na taxa de cresci-mento de tumor comparada apenas à vacinação ou ao tratamento apenascom imunocitocina.

Exemplo 18: Avaliação de atividade biológica de construções de survivina dainvenção

Certas variantes de survivina da invenção são projetadas paraser biologicamente inertes. Assim, as próprias proteínas não exibem ativida-de antiapoptótica quando expressas em células sob condições que normal-mente induzem apoptose evitável por uma proteína de survivina tipo silves-tre. Semelhantemente, as proteínas não interferem com a atividade de survi-vina tipo silvestre endógeno ao proteger as células do efeito de agentes in-dutores de apoptose.

A inércia biológica de uma proteína de survivina pode ser testa-da empregando-se células precursoras de linfócito de BaF3. Células deBaF3 são dependentes de IL-3 para crescimento e sofrem apoptose na reti-rada de fator de crescimento, as quais podem ser contrariadas pela atividadede survivina (vide, por exemplo, Ambrosini e outros, (1997) Nat. Med. 3:917-921). Células de BaF3 são transfectadas com plasmídeos que codificamuma construção de survivina da invenção, uma proteína de survivina tiposilvestre ou uma inserção vazia, e adicionalmente uma proteína marcadoratal como GFP, de forma que as células que expressam o DNA exogenamen-te introduzido possam ser monitoradas. Depois da recuperação da transfec-ção, IL-3 é retirada do meio e as células de BaF3 são monitoradas para a-poptose por, por exemplo, avaliando-se % de viabilidade nos dias 1, 2, 3 e 4,ou por um ensaio indicativo de apoptose familiar àqueles versados na técni-ca, tal como por morfologia nuclear (condensação e fragmentação de DNA).É constatado que enquanto as células BaF3 transfectada com survivina tiposilvestre permanecem em grande parte viáveis durante período de 4 dias,células BaF3 transfectadas com um plasmídeo vazio ou uma variante desurvivina da invenção não permanecem viáveis e em grande parte exibemuma morfologia nuclear indicativa de apoptose.

A inércia biológica de uma construção de survivina da invençãopode da mesma forma ser testado empregando-se células HeLa. CélulasHeLa expressam survivina endógena em níveis significantes, e sabe-se quemutações particulares, tal como huSurvivin(C84A), age como uma formanegativa dominante de survivina (Survivina de DN) e induz apoptose nestescélulas (vide, por exemplo, Li e outros, (1999) Nat. Cell Biologia 1:461-466).Células HeLa são transfectadas com plasmídeos que codificam uma Survivi-na de DN ou uma construção de survivina da invenção, além de uma proteí-na de marcador tal como GFP, de forma que células que expressam o DNAexogenamente introduzido possam ser monitoradas. Depois da recuperaçãoda transfecção, as células HeLa são cultivadas durante 48 horas, fixadas, osnúcleos são manchados com DAPI, e a morfologia nuclear das células é a-nalisada por microscopia de imunofluorescência. É constatado que enquantoas células HeLa transfectadas com Survivina de DN tipicamente têm marcasoficiais de sofrimento de apoptose, tais como núcleos condensados e frag-mentados, células HeLa transfectadas com construções de survivina da in-venção crescem normalmente.

Exemplo 19: Avaliação da estabilidade de construções de survivina da in-venção.

Para avaliar a estabilidade de uma construção de survivina, po-de ser expressa a partir de um vetor que adicionalmente expressa uma pro-teína de marcador tal como GFP de forma que a quantidade de proteína desurvivina expressa possa ser medida relativa a um padrão. Células de cultu-ra de tecido, tais como células BHK1 são transitoriamente transfectadas e onível de expressão da construção de survivina é analisado em um westernblot, normalizado para expressão de marcador. Se anticorpos anti-survivinadisponíveis não reconhecem a proteína, versões C-terminalmente rotuladasdestas variantes podem ser empregadas. É constatado que comparadas àsurvivina tipo silvestre, certas construções de survivina modificadas preferi-das da invenção, tais como aquelas com mutações de desestabilização múl-tiplas, são detectadas em níveis muitos reduzidos.

Além de analisar níveis em estado constante, a taxa de degra-dação pode ser avaliada em uma experiência de curso de tempo. O inibidorde translação cicloeximida é adicionado às células no tempo 0 e as célulassão incubadas durante 4 horas. Ao O, 2, 5, 10, 20, 60 e 240 minutos, amos-tras são removidas para análise de western blot. Para comparar taxas entreconstruções de survivina modificadas e survivina tipo silvestre, as quantida-des são normalizadas ao ponto de tempo 0. É constatado que certas cons-truções de survivina modificadas preferidas da invenção são degradadasmais rapidamente que a survivina tipo silvestre.

Para avaliar se a degradação está procedendo pela trilha medi-ada por proteassoma, as células são incubadas opcionalmente na presençaou ausência de um inibidor de proteassoma tal como Iactacistina (2 h, 100μΜ), e novamente níveis de survivina são analisados por western blot. Napresença de lactacistina, é constatado que variantes de survivina da inven-ção e huSurvivina tipo silvestre são detectadas em níveis similares.

Claims

1. Vacina para o uso de tratamento de tumor e doenças rela-cionadas com tumor em um ser humano compreendendo:(a) um peptídeo derivado de uma survivina não-mamífera ou um ácido nu-cléico codificando o referido peptídeo, onde a referida survivina não-mamífera compreende um domínio de BIR tendo entre 50% e 90% de identi-dade de aminoácido com um domínio de BIR abrangendo de Asp 16 aLeu87 de survivina humana, ou(b) um peptídeo derivado de uma survivina mamífera modificada ou um áci-do nucléico codificando o referido peptídeo, onde a referida survivina mamí-fera modificada compreende uma mutação dentro do domínio de BIR queabole substancialmente a atividade biológica designada para o domínio BIR1e(c) opcionalmente um adjuvante;a referida vacina elicia em um ser humano uma resposta imune à survivinahumana.

2. Vacina de acordo com a reivindicação 1, em que a referidaresposta imune causada pela vacina gera células CD8+ T que atacam célu-las expressando survivina humana.

3. Vacina de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o pep-tídeo deriva de uma survivina não-mamífera.

4. Vacina de acordo com a reivindicação 3, em que o referidodomínio de BIR tem entre 50% e 80% de identidade de aminoácido com oreferido domínio de BIR de survivina humana .

5. Vacina de acordo com a reivindicação 3 ou 4, em que a sur-vivina não-mamífera é derivada de pássaro, peixe, réptil ou anfíbio.

6. Vacina de acordo com a reivindicação 5, em que a survivinanão-mamífera é derivada de frango.

7. Vacina de acordo com qualquer das reivindicações 3 - 6, emque o peptídeo derivado de survivina não-mamífera compreende uma oumais mutações que promove a apresentação de antígeno de célula T porligação às moléculas MHC.

8. Vacina de acordo com a reivindicação 7, em que a survivinanão-mamífera é de frango e a mutação é uma substituição de aminoácidoem uma ou mais das posições Asn97, Thr99, VaM 00, ou Gln101 de survivinade frango.

9. Vacina de acordo com a reivindicação 8, em que a mutaçãoé uma ou mais das seguintes: N97E, T99M, V100L, ou Q101G.

10. Vacina de acordo com a reivindicação 9, em que a mutaçãoé N97E, T99M, V100L e Q101G e tem a seqüência de aminoácido de SEQID NO 12.

11. Vacina de acordo com qualquer das reivindicações 3-10,em que a survivina não-mamífera compreende uma mutação dentro do do-mínio de BIR que abole substancialmente a atividade biológica designadapara o domínio BIR.

12. Vacina de acordo com a reivindicação 11, em que a referidaatividade biológica a ser abolida é apoptose.

13. Vacina de acordo com a reivindicação 11 ou 12, em que oreferido peptídeo derivado de survivina não-mamífera contém uma substitui-ção de aminoácido em uma ou mais das posições correspondendo a Arg18,Pro47, Cys57, Cys60, His77 e Cys84 de survivina humana.

14. Vacina de acordo com qualquer das reivindicações 3-13,em que a vacina é capaz de ativar as células T reconhecendo uma seqüên-cia de peptídeo de survivina humana quando complexada com uma molécu-la de MHC .

15. Vacina de acordo com a reivindicação 14, em que a seqüên-cia de peptídeo de survivina humana é selecionada do grupo de peptídeosconsistindo em :LTLGEFLKL, CPTENEPDL e EPDLAQCFF.

16. Vacina de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o pep-tídeo deriva de uma survivina mamífera modificada.

17. Vacina de acordo com a reivindicação 16, em que a survivi-na mamífera modificada é survivina humana.

18. Vacina de acordo com a reivindicação 17, em que o referidopeptídeo derivado de survivina humana modificada contém uma substituiçãode aminoácido em uma ou mais das posições Arg18, Pro47, Cys57, Cys60,His77 e Cys84 de survivina humana.

19. Vacina de acordo com qualquer das reivindicações 16-18,em que o peptídeo derivado de survivina mamífera modificada compreendeum domínio helicoidal modificado.

20. Vacina de acordo com a reivindicação 19, em que o peptí-deo derivado de survivina humana modificada contém uma substituição deaminoácido em uma ou mais das posições Lys122, Ala128 e IIeI 35 de survi-vina humana.

21. Vacina de acordo com a reivindicação 20, em que a muta-ção é uma ou mais das seguintes Ala128P e 112135P.

22. Vacina de acordo com qualquer das reivindicações 17-21compreendendo a survivina humana modificada tendo as seguintes muta-ções R18E, P47L, Q56L, H77A, C84A, A128P e I135P, e a seqüência deaminoácido como especificado em SEQ ID NO 56.

23. Vacina de acordo com a reivindicação 16 ou 17, em que asurvivina mamífera modificada peptídeo compreende a seqüência de amino-ácido LTLGEFLKL ou LMLGEFLKL.

24. Vacina de acordo com qualquer das reivindicações 1 - 23,em que o peptídeo derivado de survivina não-mamífera e o peptídeo deriva-do de survivina mamífera modificada são fundidos a uma porção de Fc .

25. Vacina de acordo com qualquer das reivindicações 1 - 24,em que uma vacina mais codifica ou inclui um peptídeo derivado de umamolécula efetora.

26. Vacina de acordo com a reivindicação 25, em que a molécu-la efetora é uma citocina selecionada do grupo consistindo em IL-2, IL-7, IL-- 12, IL-18, IL-21, IL-23 e GM-CSF.

27. Vacina de acordo com qualquer das reivindicações 1 - 26,em que o ácido nucléico codificando o peptídeo derivado de survivina não-mamífera ou de survivina mamífera modificada compreende um promotormamífero.

28. Vacina de acordo com a reivindicação 27, em que o ácidonucléico é um DNA nu.

29. Vacina de acordo com qualquer das reivindicações 1 - 28,em que o ácido nucléico é formulado com um reagente que realça a trans-fecção de células mamíferas.

30. Vacina de acordo com qualquer das reivindicações 1 - 29,em que o ácido nucléico é parte de uma partícula viral.

31. Vacina de acordo com a reivindicação 30, em que a partícu-la viral é uma partícula adenoviral.

32. Vacina de acordo com qualquer das reivindicações 1-31,em que a vacina compreende uma bactéria compreendendo o ácido nucléi-co.

33. Vacina de acordo com a reivindicação 32, em que a bactériaé uma bactéria entérica.

34. Vacina de acordo com a reivindicação 33, em que a bactériaé uma Salmonella.

35. Composição farmacêutica para a imunização de um ser hu-mano contra células de tumor superexpressando survivina compreendendovacina como definida em qualquer das reivindicações 1 - 34 opcionalmentejuntamente com um veículo, diluente ou excipiente aceitável.

36. Uso de vacina como definido em qualquer das reivindica-ções 1 a 34, para a fabricação de um medicamento para imunizar um paci-ente contra células de tumor superexpressando survivina humana.