BRPI0616439A2 - complexo polìmero anfifìlico-pdgf, processo de preparação e utilização do mesmo, composição terapêutica, e, uso da mesma - Google Patents
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Abstract
COMPLEXO POLIMERO ANFIFìLICO-PDGF, PROCESSO DE PREPARAçãO E UTILIZAçãO DO MESMO, COMPOSIçãO TERAPêUTICA, E, USO DA MESMA. A presente invenção refere-se a novos complexos de Platelet - Derived Growth Factor (PDGF) associados a polímeros anfifihicos permitindo melhora a estabilidade fisica e química in vitro e in vivo da proteína terapêutica para aplicações farmacêuticas. Ela refere-se igualmente ao processo de preparação do complexo polímero anfifilico-PDGF caracterizado em que se prepara o complexo polimero/PDGF-BB em meio aquoso e em ausência de solvente orgânico susceptível de desnaturar a proteína e a utilização do referido complexo polímero anfifilico-PDGF para a preparação de uma composição terapêutica com ação cicatrizante destinada ao tratamento de úlceras por via tópica.
Description
"COMPLEXO POLÍMERO ANFIFÍLICO-PDGF, PROCESSO DEPREPARAÇÃO E UTILIZAÇÃO DO MESMO, COMPOSIÇÃOTERAPÊUTICA, E, USO DA MESMA"
A presente invenção refere-se a novos complexos de fator decrescimento derivado de plaquetas (PDGF sigla para Platelet-Derived GrowthFactor) associados aos polímeros anfifílicos permitindo melhorar aestabilidade física e química in vitro e in vivo da proteína terapêutica para asaplicações farmacêuticas.
Os PDGF são glicoproteínas de cerca de 30.000 Daltons,compostas de duas cadeias polipeptídicas ligadas entre si por duas pontesdissulfeto. Quatro tipos de cadeias foram identificados A,, C e D. A proteínanativa existe sob a forma de homodímero ou de heterodímero de tipo AB(Oefner C. EMBO J. 11 , 3921-2926, 1992).
O PDGF foi isolado pela primeira vez nas plaquetas. Estes sãofatores de crescimento liberados quando da coagulação sangüínea, capazes depromover o crescimento de diferentes tipos de células (Ross R. et al., Proc.Natl. Acad. Sei. USA, 1974, 71 , 1207 ; Kohler N. & Lipton A., Exp. CellRes., 1974, 87, 297). Sabe-se agora que o PDGF é produzido por umdeterminado número de células diferentes de plaquetas e que é mitogênicopara a maior parte das células derivadas de mesenquimas, isto é, as célulassangüíneas, musculares, ósseas e cartilaginosas, assim como as células do tipoconjuntivo (Raines E.W., em "Biology of Platelet-Derivated Growth Factor",1993, Westermark, B. et C. Sorg, Ed. Basel, Kerger, p. 74). Numerososartigos tendem igualmente a demonstrar que o PDGF proveniente dosmacrófagos se comporta como um agente quimiotáctico e mitogênico para ascélulas musculares lisas, que ele contribui ao espessamento miointimal dasparedes arteriais característico da arteriosclerose (Ross R. et al., Science,1990, 248, 1009). As atividades do PDGF incluem, por outro lado enotadamente o estímulo da liberação dos grânulos pelos monócitos neutrófilos(Tzeng D.Y. et al., Blood, 1985, 66, 179), a facilitação da síntese esteroidalpelas células de Leydig (Risbridger G. P., Mol. Cell. Endocrinol., 1993, 97,125), o estímulo de fagocitose neutrófila Wilson E. et al., Proc. Natl. Acad.Sei. USA, 1987, 84, 2213), a modulação da expressão e da secreção detrombospondina (Majak R.A. et al., J. Biol. Chem., 1987, 262, 8821 ), e após-regulação do gene ICAM-I nas células musculares lisas vasculares(Morisaki N. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1994, 200, 612).
Levando-se em conta estas diversas propriedades, a utilizaçãode PDGFs recombinantes no domínio farmacêutico já foi visada. A utilizaçãode PDGF foi notadamente aprovada para o tratamento de úlceras do pédiabético (Regranex, J&J) e para a reparação periodontal (GEM 21 S,Biomimetic).
A cicatrização de úlceras, como a cicatrização cutânea emgeral, é um fenômeno complexo que necessita a intervenção coordenada notempo e no espaço de numerosos tipos celulares, que pode se resumida emtrês fases: uma fase de inflamação, uma fase de proliferação e uma fase deremodelagem.
Na fase inflamação, cerca de 7 dias para uma cicatrizaçãonormal, os macrófagos matam as bactérias, debridam os tecidos danificados eregeneram os tecidos. Para isto, os macrófagos secretam as colagenases, ascitocinas e os fatores de crescimento.
Durante a fase de proliferação, do terceiro dia à terceirasemana para uma cicatrização normal, três eventos se sucedem. A ferida seenche do tecido de granulação, a angiogenese se desenvolve e a ferida secobre de células epiteliais. O tecido de granulação cresce nas bordas para ocentro. Os fibroblastos produzem de modo abundante colágeno de tipo III.
Durante a remodelagem, da terceira semana a 1 ou mesmo 2anos, os tecidos de granulação amadurecem, os fibroblastos produzem menoscolágeno. Os vasos sangüíneos formados durante a granulação que são inúteissão eliminados por apoptose. O colágeno de tipo III é substituído porcolágeno de tipo I que se organiza de acordo com as linhas de tensão e sereticula.
Neste processo, o PDGF desempenha um papel primordial.
Quando da formação de uma ferida, as plaquetas se agregam e liberam oPDGF. O PDGF atrai os neutrófilos, os macrófagos e os fibroblastos sobre aferida e é um potente mitogênico. Os macrófagos, as células endoteliaissintetizam e secretam, por sua vez, o PDGF. O PDGF estimula a produção danova matriz extracelular pelos fibroblastos, essencialmente os compostos nãocolagênicos como os glucosaminoglicanos e as proteínas de adesão (J. F.Norton et al, Essential practice of surgery, Springer, 2003, cap. 7, 77- 89).
As feridas crônicas como as úlceras do pé diabético, as úlcerasvenosas e as úlceras de pressão apresentam a particularidade de cicatrizarmuito lentamente e às vezes de modo incompleto porque o método decicatrização não se desenvolve normalmente (R. Lobmann et al, J. of Diabètesand its complications, 2006, 20, 329-335).
O processo de cicatrização é de fato um equilíbrio delicadoentre um processo de destruição necessária a fim de eliminar os tecidosdanificados e o processo de reparação que conduz à formação de novostecidos. As proteases e os fatores de crescimento desempenham um papelcrucial no processo ao regular este equilíbrio. No caso de feridas crônicas,este equilíbrio é rompido em favor da degradação o que explica seu retardo àcicatrização. Então como existem diferentes tipos de feridas crônicas,bioquimicamente elas são relativamente similares no sentido em que sãocaracterizadas por fases prolongadas de inflamação conduzindo a níveiselevados de proteases e diminuindo assim a atividade dos fatores decrescimento (G. Lauer et al. J. Invest. Dermatol. 115 (2000) 12-18). Estadegradação dos fatores de crescimento contribui para uma perda global detecidos associados com as feridas crônicas não favorecendo a cicatrização. (D.R. Yager et al. J. Invest. Dermatol. 107(1996) 743-748).
Existe atualmente o mercado um medicamento à base dePDGF-BB recombinante humano correspondendo à denominação comuminternacional "becaplermin", vendido sob a designação comercial Regranex®.Este medicamento é indicado para o tratamento das úlceras dos membrosinferiores de diabéticos. Ele se apresenta sob a forma de um gel comaplicação tópica e permite promover a cicatrização das úlceras. Permite,particularmente, como o PDGF endógeno, favorecer a proliferação celular eportanto a formação de novos tecidos.
Este tratamento tem uma eficácia limitada. (Cullen et al. Theinternational journal of biochemistry & Cell Biology 34,1544-1556,2002)mesmo se os estdos clínicos demonstraram melhoras da cicatrização e daduração necessária à cicatrização (Greenhalgh et al., American Journal ofpathology,136,1235-1246 1990 ; Ladin Plastic and Reconstructive Surgery,105, 1230-1231 2000 ; Holloway et al. Wounds. 5/4,198-206 ; Mandracchiaet al. Clinics in Pediatric Médecine and Surgery, 18,189-209 2001 ; WiemanTJ. AmericanDianalofSurgery, 176,74S-79S 1998).
O produto Regranex que contém o PDGF -BB comercializadopela J&J, demonstrou sua eficácia ao aumentar a taxa de cura a 50% dospacientes tratados contra apenas 36% para os pacientes que receberam apenasum tratamento padrão da ferida. Apesar desta melhora significante dotratamento da úlcera do pé diabético, é necessário constatar que apenas 50%dos pacientes se curam após um tratamento longo e oneroso. No caso de nãocura, conseqüências podem ser extremamente graves e conduzir emnumerosos casos à amputação do membro inferior. E necessário acrescentarque a duração média do tratamento é muito longa, cerca de 20 semanas e suaaplicação é onerosa e difícil devido a uma limpeza da ferida e uma aplicaçãode Regranex de manhã seguida de 12 mais tarde de uma limpeza da ferida.Estas duas intervenções necessitam com freqüência dos cuidados de umenfermeiro. Além disso, o custo médio de um tratamento de uma duração devinte semanas é excessivamente elevado (da ordem de 1400 dólaresamericanos).
A eficácia parcial pode se explicar por uma degradação rápidado PDGF sobre a ferida a tratar. Esta degradação resulta no caso de umaferida crônica de um estado de inflamação prolongado gerando, ao nível daferida, um ambiente hostil ao PDGF por estímulo de uma super-produção deproteases.
Apesar do controle da degradação ser necessário para acicatrização das feridas, uma atividade proteolítica excessiva é prejudicialconduzindo à degradação da matriz extracelular (F. Grinnell et ai. J. Invest.Dermatol. 106 (1996) 335-341 et CN. Rao et al. J. Invest. Dermatol. 105(1995) 572-578) e as molécula tendo um papel funcional chave como osfatores de crescimento (V. Falanga et al. J. Derm. Surg. One. 18(1992) 604-606 ;D.R. Yager et al. Wound Rep. Reg. 5 (1997) 23-32. et M. Wlaschek et al.
Br. J. Dermatol. 137 (1997) 646-647). Com efeito, os fatoresde crescimento, como o PDGF, o TGF β ou o bFGF são elementos chaves noprocesso de cicatrização devido a suas capacidades de induzir a migração dascélulas, a proliferação, a síntese de proteína, a formação da matriz e maisgeralmente o controle do processo de reparação. No entanto, estes fatores decrescimento são moléculas protéicas, e conseqüentemente sensíveis àdegradação proteolítica. Vários estudos mostram que a degradação dos fatoresde crescimento como o PDGF é bem mais rápida enquanto são colocados emcontato com os fluidos provenientes de feridas crônicas porque eles contémconcentrações elevadas em metaloprotéinases (D. R. Yager et al. J. Invest.Dermatol. 107(1996) 743-748).
Para o tratamento de úlceras venosas Regranex quando de umestudo clínico piloto relatado na publicação (TJ. Wieman, Wounds, 2003,vol15, n°8, 257-264) só mostrou uma melhora pequena dos tratamentos reais àbase de uma limpeza regular da ferida com uma terapia de compressão.
O problema da instabilidade do PDGF por exemplo foirevelado quando da produção da proteína. Sabe-se que o PDGF éparticularmente sensível à proteólise pós-traducional (Hart et ai.,Biochemistry 29 :166- 172, 1990 e Patente U.S. 07/ 557 219) e notadamenteao nível da ligação entre o aminoácido arginina em posição 79 e a lisina emposição 80 ou ainda a ligação entre a arginina em posição 27 e a arginina emposição 28 da cadeia do PDGF.
Esta instabilidade proteolítica coloca um problema principalno quadro da obtenção desta proteína que é produzida de modo recombinantena levedura de acordo com o processo descrito na Patente U.S. 4,845,075.Com efeito a Patente U.S. 7,084,262 ensina que a análise e a purificação doPDGF-BB, conduz à obtenção de 21 isoformas resultando de clivagensendoproteolíticas pós-traducionais. Esta grande heterogeneidade estruturaltem por conseqüência acarretar uma diminuição de 50% da atividade daproteína produzida por engenharia genética em relação à proteína intacta deforma madura.
Assim, os resultados clínicos recentes de Cardium, após umcomunicado de impressa datado de 14 de agosto de 2006(www.prnewswire.com) sobre as úlceras do pé diabético não curadas após 14semanas mostram o potencial que pode oferecer um tratamento com o PDGF-BB. A solução proposta por Cardium consiste em introduzir o gene deexpressão do PDGF -BB nas células da ferida para super-expressarlocalmente o mesmo. Esta terapia gênica com a ajuda de um adenovetorpermitiu cicatrizar perto de 80% destas úlceras do pé diabético resistentes aostratamentos correntes, em um coorte de 15 pacientes. Esta solução terapêuticaé promissora. Mas os desenvolvimentos farmacêuticos de tratamentos à basede terapia gênica são atualmente ainda muito perigosos por razões desegurança ligadas ao emprego de vetores virais de tipo adenovírus.
Portanto se nota a necessidade e uma possibilidade de melhorados tratamentos atuais da úlcera do pé diabético com o PDGF.
No caso do tratamento da úlcera do pé diabético, o objetivo
último é triplo:
- acelerar a cura,
- aumentar a taxa de cura,
- simplificar o protocolo de tratamento.
Também se nota o caso de úlceras venosas e úlceras depressão, causas de dores fortes e complicações médicas muito graves.
O problema a resolver é portanto no essencial uma proteção doPDGF sobre a ferida crônica.
Diversas soluções foram propostas.
A Patente U.S. 5 905 142 descreve um meio de remediar estesproblemas de proteólise com referência ao PDGF gerando mutantes daproteína tendo uma resistência aumentada frente aos ataques proteolíticos aosubstituir ou suprimir um ou vários aminoácidos lisina ou arginina próximosdos sítios de clivagem potenciais. Esta estratégia para tornar a proteína maisresistente às proteases não é satisfatória. Esta modificação genética do PDGFpode acarretar modificações da atividade biológica com as afinidadesdiferentes frente aos diferentes receptores o que pode também induzirproblemas toxicológicos. Além disso, uma tal modificação do PDGFnecessita de um novo desenvolvimento farmacêutico, extremamente oneroso e perigoso.
Nos anos 1970 quando esta proteína foi muito estudada, foirevelado que a purificação era extremamente delicada porque o PDGF " éuma proteína muito aderente", devido às suas propriedades catiônicas ehidrófobas (Heldin.C.H. EMBO J. 11 :4251-4259 ,1992 ; Raines andRoss,J.Biol.Chem. 257(9):5154-5160,1982 ; Antoniades, PNAS 78 :7314,1981 ; Deuel et ai. J. Biol. Chem. 256:8896, 1981 ). O PDGF é, com efeito,uma proteína fortemente catiônica cujo ponto isoelétrico está compreendidoentre 9,8 e 10,5. Outros autores confirmam este comportamento como Wei etal (Dianal of controlled release 112: 103-110, 2006) que explicam que oPDGF é adsorvido facilmente sobre as superfícies do contentor em que ele seencontra em solução. Os autores solucionam o problema adicionando namistura seja BSA a 0,1%, seja uma mistura 0,1% BSA/ Tween 20. Estassoluções resolvem em grande parte o problema porque até 95% da proteína seencontram em solução. Mas estas soluções não são satisfatórias de um pontode vista farmacêutico sendo dada a origem animal da BSA e os riscos ligadosà encefalopatia espongiforme bovina.
Uma outra solução proposta pelos mesmos autores consiste emadicionar um tensoativo aniônico mais potente (SDS) que permite manter oPDGF em solução . Infelizmente, o SDS induz igualmente uma desnaturaçãoparcial da proteína conduzindo a uma perda de bioatividade. Esta solução nãoé portanto satisfatória para estabilizar a proteína.
Na patente WO 93/08825, os inventores evidenciaram que oPDGF purificado apresenta uma forte instabilidade quando ele é formuladosob a forma de um gel para uma aplicação tópica. Eles dão como exemplouma incompatibilidade do PDGF com um certo número de produtos usadosclassificamente para formar os produtos farmacêuticos como a métilceluloseou a hidroxipropilcelulose assim como alguns conservantes convencionaiscomo o álcool benzílico. Os autores colocam o problema explicando queexiste uma necessidade de formular o PDGF sob a forma de um gel para aadministração tópica tendo ao mesmo tempo uma boa estabilidade a longoprazo. Os mesmos autores mostram que o PDGF em solução se degrada porum processo de desaminação a pH neutro e que a proteína é mais estável a umpH levemente ácido. Os autores mostram que combinando vários parâmetros,um polímero não apresentando interações com a proteína, um tampão em pHlevemente ácido permitindo limitar a reação de desaminação e umconservante neutro frente à proteína. É possível formular o PDGF a fim deobter uma formulação estável de um ponto de vista farmacêutico.
Os autores mostram que é possível obter uma formulaçãoestável ao armazenamento por adição de um polímero não apresentandointerações com a proteína em condições de manter a formação a um pHlevemente ácido a fim de evitar as reações de degradação por desamidação daproteína, esta solução não é todavia satisfatória porque ele não permiteproteger o fator de crescimento das degradações proteolíticas in vivo em pHfisiológico.
Na patente W097/12601 que descreve as formulações dePDGF sob a forma de gel, os autores explicam que o derivado da celulose queeles utilizam é capaz de estabilizar os fatores de crescimento para uma eventual perda de atividade quando do armazenamento. Para isto, eles sebaseiam sobre os resultados obtidos previamente com PDGF na Patente U.S.4,717,717. No entanto, eles explicam igualmente que a estabilidade do gel decelulose contendo o PDGF pode ser muito melhorada adicionando-se àformulação uma espécie química carregadas como os aminoácidos carregadosou íons metálicos. Ai, ainda, esta solução permite estabilizar os fatores decrescimento na formulação quando do armazenamento do produto mas nãopermite uma estabilização destes fatores de crescimento frente às proteasespresentes ao nível das feridas crônicas em pH fisiológico.
Existe, portanto, um interesse terapêutico para estabilizar eproteger os fatores de crescimento, notadamente o PDGF, a fim de aumentarsua eficácia no quadro de um tratamento das feridas crônicas e maisparticularmente o das feridas de úlceras do pé diabético. A invenção refere-seportanto à estabilização do PDGF frente às degradações químicas ou físicaspodendo intervir no pH fisiológico in vitro e in vivo para a elaboração de umcomplexo entre um polímero anfifílico e um PDGF.
A invenção refere-se portanto à formação de um complexoentre um polímero anfifílico e um PDGF (polímero anfifílico-PDGF ) estecomplexo suprindo uma estabilização química e física à proteína frente àdegradação em pH fisiológico in vitro e in vivo.
A presente invenção refere-se portanto a um complexopolímero anfifílico-PDGF estável física e quimicamente, solúvel em água,caracterizado em que
- os polímeros anfifílicos são constituídos por um esqueletopolimérico hidrofílico funcionalizado por substituintes hidrofóbicos egrupamentos hidrofílicos de acordo com a fórmula geral seguinte.
Polímero
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DP = m unidades monômero
• R, R' sendo uma ligação ou uma cadeia compreendendoentre 1 e 18 carbonos, eventualmente ramificada e/ou insaturadacompreendendo um ou vários heteroátomos, como O, N e/ou S,R e R' sendo idênticos ou diferentes entre si
• F, F' sendo um éster, um tioéster, uma amida, um carbonato,um carbamato, um éter, um tioéter, uma amina,F e F1 sendo idênticos ou diferentes entre si
• X sendo um grupamento hidrofílico podendo ser:
o um carboxilato
o um sulfato
o um sulfonato
o um fosfatoo um fosfonato
• Y sendo um grupamento hidrofílico podendo sero um sulfato
o um sulfonato
o um fosfato
o um fosfonato
• Hy sendo um grupamento hidrofóbico podendo ser
o uma alquila linear ou ramificada em C8 a C30,eventualmente insaturada e/ou contendo um ou vários heteroátomos como O,N ou S,
o uma alquilarila ou uma arilalquila linear ou ramificada emC8 a Cl 8, eventualmente insaturada e/ou contendo eventualmente umheteroátomo
o um policiclo em C8 a C30 eventualmente insaturado,
η e o estão compreendidos entre 1 e 3,
h representa a fração molar de motivo hidrofóbico em relaçãoa uma unidade monomérica compreendida entre 0,01 e 0,5,
χ representa a fração molar de grupamentos hidrofílicos emrelação a uma unidade monomérica compreendida entre 0 e 2,0,
y representa a fração molar de grupamentos hidrofílicos emrelação a uma unidade monomérica, compreendida entre 0 e 0,5,
- o PDGF é selecionado dentre o grupo consistindo de PDGFs(Platelet-derivated growth factors).
Ela refere-se a um complexo caracterizado em que o PDGF éselecionado dentre o grupo consistindo de PDGFs recombinantes humanoscomportando duas cadeias B (rh PDGF -BB).
Ela refere-se a um complexo caracterizado em que o PDGF éPDGF-BB.
Os substituintes dos polímeros anfifílico são divididos demodo controlado ou estatístico. Dentre os polímeros tendo uma repartiçãocontrolada dos substituintes, pode-se citar, por exemplo, os copolímeros emblocos e os copolímeros alternados.
Copolímero estatístico
<formula>formula see original document page 13</formula>
Assim, em uma forma de realização, a invenção refere-seigualmente a um complexo polímero anfifílico-PDGF caracterizado em que opolímero é selecionado dentre os polímeros cujos substituintes são repartidosde modo estatístico.
Em uma forma de realização, a invenção refere-se igualmentea um complexo polímero anfifílico-PDGF caracterizado em que o polímeroanfifílico é selecionado dentre os poliaminoácidos.
Em uma forma de realização, os poliaminoácidos sãoselecionados no grupo constituído por poliglutamatos ou poliaspartatos.
Em uma forma de realização, os poliaminoácidos sãohomopoliglutamatos.
Em uma forma de realização, os poliaminoácidos são oshomopoliaspartatos.
Em uma forma de realização, os poliaminoácidos sãocopolímeros de aspartato e glutamato. Estes copolímeros são seja em blocosseja estatísticos.
Em uma forma de realização, a invenção refere-se igualmentea um complexo polímero anfifílico-PDGF caracterizado em que o polímero éselecionado dentre os polissacarídeos.
Em uma forma de realização, os polissacarídeos sãoselecionados dentre o grupo consistindo de hialuronanos, os alginatos, asquitosonas, os galacturonanos, a condroitina- sulfato, os dextratos, asceluloses.
O grupo de celuloses é constituído por celulosesfuncionalizadas pelos ácidos como carboximetil celulose.
O grupo de dextranos é constituído por dextranosfuncionalizados pelos ácidos como carboximetil dextrano.
Em uma forma de realização, o polissacarídeo é um derivadode dextrano solúvel respondendo à fórmula (I) seguinte
DMCaBbSuc (I)
em que
D representa uma cadeia polissacarídica, preferivelmenteconstituída por encadeamentos de unidades glucosídicas,
- MC representa grupos metilcarboxílicos,
- B representa grupos N-benzilmetileno carboxamida
- Su representa grupos sulfatos (sulfatação de funçõeshidroxila livres, portadas pelas unidades glucosídicas),
- a, b e c representam o grau de substituição (ds)respectivamente dos grupamentos MC, B e Su com
i) uma restrição superior a 0,
ii) b é tal que
- seja b é superior ou igual a 0,3 e c está compreendido entre-0,1 e 0,5,
- seja b é estritamente inferior a 0,3 e c responde à equação (1)seguinte
c > 8,5 b2-5,41 b + 0,86 (1)Estes derivados de dextrano de fórmula (I) assim como seuprocesso de preparação são descritos mais geralmente no pedido de patenteWO 99/ 29734. Estes derivados de dextrano de fórmula (I) são trivialmentechamados DMCBSu e são considerados como sendo copolímeros constituídospor sub-unidades R-OH e R-OX5 X podendo ser um grupamentometilcarboxílico (MC), benzilamida (B) ou sulfato (Su). Assim um dextratometilcarboxílico (DMC) com um grau de substituição (ds) de 0,6 emgrupamentos metilcarboxílicos contém 0,6 grupamento substituído (R-MC) e2,4 de grupamentos hidroxilas (R-OH) por unidade glucosídica.
Em uma forma de realização, D apresenta uma massa molarcompreendida entre 1000 e 2 000 000 Da, e em uma forma de realização,inferior a 70.000 Da.
Em uma forma de realização, os derivados de dextrano sãoselecionados dentre os compostos de fórmula (I) em que b é superior ou iguala 0,35.
Neste caso, e de acordo com a forma de realização, osderivados de dextrato são selecionados dentre os compostos de fórmula (I) emque a está compreendido entre 0,5 e 0,8 e c está compreendido entre 0,1 e 0,5.
Em uma forma de realização, os polissacarídeos sãoselecionados dentre o grupo consistindo de hialuronanos, os alginatos e osquitosanos.
Estes diferentes polissacarídeos podem ser representados comoa seguir:
<formula>formula see original document page 15</formula><formula>formula see original document page 16</formula>
Hialuronano
<formula>formula see original document page 16</formula>
R = H, Dextrano
R = CH2COOH ou Η, Carboximetil Dextrano
<formula>formula see original document page 16</formula>
Quitosano
<formula>formula see original document page 16</formula>
Alginato
O polissacarídeo pode ter um grau de polimerização médio mcompreendido entre IOelO 000.
Em uma forma de realização, ele tem um grau depolimerização médio compreendido entre IOe 5000.
Em uma outra forma de realização, ele tem um grau depolimerização médio m compreendido entre 10 e 500.
Em uma forma de realização, a invenção refere-se igualmentea um complexo polímero anfifílico-PDGF caracterizado em que o grupohidrofóbico Hy é selecionado dentre o grupo consistindo de ácidos graxos,álcoois graxos, aminas graxas, aminas benzílicas, os derivados do colesterol eos fenóis.
Em uma forma de realização o derivado do colesterol é o ácidocólico.
Em uma outra forma de realização, o fenol é alfa- tocoferol.
Em uma forma de realização, o complexo polímero anfifilico-PDGF de acordo com a invenção é reversível.
Os polímeros usados são sintetizados de acordo com técnicasbem conhecidas na arte ou compradas em fornecedores como por exemploSigma- Aldrich, NOF corp. ou CarboMer Inc.
Os PDGF são selecionados dentre os PDGF recombinanteshumanos, obtidos de acordo com as técnicás bem conhecidas na arte oucompradas em fornecedores como por exemplo Gentaur (USA) ou ResearchDiagnostic Inc. (USA).
A verificação da estabilização tanto química como física podeser efetuada notadamente pela realização dos seguintes testes:
• um teste de verificação do complexo polímero anfifílico-PDGF de acordo com a invenção, realizado por eletroforese sobre gel (GelMobility Shift Assay)
• um teste de diminuição da degradação enzimática de umcomplexo polímero anfifilico-PDGF de acordo com a invenção realizado porcolocação em contato com uma protease
• um teste de estabilização física de um complexo polímeroanfifilico-PDGF de acordo com a invenção a um pH fisiológico realizado porSDS-P AGE.
A invenção refere-se igualmente a um complexo polímeroanfifílico- PDGF caracterizado em que ele atende aos testes de verificação daestabilização química e física, a saber um teste de verificação do complexo(Gel Mobility Shift Assay), o teste de retardo da velocidade da degradaçãoenzimática por colocação em contato com uma protease e o teste deestabilização física em pH fisiológico realizada por SDS-Page.
O teste de verificação do complexo realizado por Gel MobilityShift Assay baseado no deslocamento de íons sob o efeito de um campoelétrico. Os complexos aniônicos migram para o anodo e os complexoscatiônicos se deslocam para o catodo. Após a migração, as proteínas sãotransferidas por capilaridade sobre membrana de PVDF e revelados por umanticorpo específico da proteína reconhecida por um segundo anticorpocopulado na peroxidase. A proteína sozinha não migra ou migra pouco, aproteína complexada do polímero anfifílico migra para o anodo ou o catodoem função da carga global do complexo.
O teste de retardo da velocidade de degradação enzimática ébaseado sobre a verificação da integridade da proteína após colocação emcontato do complexo polímero anfifílico-PDGF de acordo com a invençãocom uma protease. Uma solução de protease (tripsina, quimo tripsina...) éadicionada à solução de complexo e uma cinética é realizada. A reação éparada por adição de um inibidor específico da enzima (indol, benzamidina).A integridade da proteína é em seguida analisada por eletroforese sobre gel depoliacrilamida (SDS- page).
O teste de estabilização física de um PDGF é baseado sobre averificação da integridade da proteína por comparação de uma solução docomplexo polímero anfifílico-PDGF de acordo com a invenção a uma soluçãode PDGF sozinho a pH 7,4 em termos de concentração em proteína nasolução. Estas duas soluções são colocadas sobre um banco de agitaçãodurante 48 h a temperatura ambiente depois centrifugadas. A concentração emPDGF em cada uma das soluções é avaliada por SDS- Page.
O complexo polímero anfifílico-PDGF de acordo com ainvenção é formado por colocação em solução aquosa de um PDGF e de umpolímero anfifílico em um pH fisiológico sem utilizar um solvente orgânicosusceptível de desnaturar a proteína. A formação do complexo polímeroanfifílico-PDGF é espontânea e não implica a ligação covalente entre o PDGFe o polímero anfifílico. Esta associação é feita por ligações fracas que sãoessencialmente interações hidrofóbicas e interações iônicas.
A invenção refere-se igualmente ao processo de preparação docomplexo polímero anfifílico-PDGF de acordo com a invenção, caracterizadoem que se coloca em contato em solução a pH fisiológico um PDGF e umpolímero anfifílico.
Outros testes podem ser empregados para realizar a verificaçãoda formação do complexo polímero anfifílico-PDGF de acordo com ainvenção.
• um teste de manutenção da estrutura terciária do PDGFdeterminada por dicroísmo circular,
• um teste de estabilidade de um PDGF no complexo polímeroanfifílico-PDGF de acordo com a invenção em pH fisiológico sob estresse. Oestresse pode ser um modo de agitação particular, a presença de sais, etc.
A invenção refere-se igualmente a um complexo polímeroanfifílico-PDGF caracterizado em que a relação PDGF/polímero anfifílicoestá compreendida entre 1/5 e 1/5.000.
Em uma forma de realização, ele está compreendido entre1/100 e 1/5.000.
Em uma outra forma de realização, está compreendido entre1/300 e 1/700.
A invenção refere-se igualmente a uma composiçãoterapêutica caracterizada em que ela compreende um complexo polímeroanfifílico-PDGF de acordo com a invenção.
Entende-se por composição terapêutica uma composiçãoutilizável em medicina humana ou veterinária.
A composição farmacêutica de acordo com a invenção épreferivelmente uma composição com aplicação tópica podendo se apresentarsob a forma de um gel, creme, uma pulverização ou uma pasta, ou umcurativo adesivo.
A natureza dos excipientes susceptíveis de ser formulados como complexo polímero anfifílico-PDGF de acordo com a invenção éselecionada em função de sua forma de apresentação de acordo com osconhecimentos gerais do farmacêutico.
Assim, quando a composição de acordo com a invenção estásob a forma de um gel, este é, por exemplo, um gel realizado a partir depolímeros, como carboximetil celuloses (CMC), os polímeros vinílicos, oscopolímeros de tipo PEO_PPO, os polissacarídeos, os PEO, as acrilamidas, ouos derivados de acrilamidas.
Outros excipientes podem ser usados nesta invenção a fim deajustar os parâmetros da formulação como um tampão para ajustar o pH, umagente permitindo ajustar a isotonicidade, conservantes como o parahidroxibenzoato de metila, o parahidroxi benzoato de propila, o m-cresol, ou o fenolou ainda um agente anti-oxidante como o cloridrato de L-lisina.
De acordo com a invenção, a composição terapêutica écaracterizada em que ela permite uma administração de cerca de 100 μg porml de PDGF.
A presente invenção refere-se igualmente à utilização de umcomplexo polímero anfifílico-PDGF de acordo com a invenção para apreparação de uma composição terapêutica com ação cicatrizante destinada aotratamento de úlceras por via tópica.
Ela refere-se igualmente a um método de tratamentoterapêutico com uso humano ou veterinário caracterizado pelo fato de queconsiste em administrar no sítio de tratamento uma composição terapêuticacompreendendo o complexo polímero anfifílico-PDGF de acordo com a invenção.
EXEMPLOSExemplo 1 : Complexo PDGF-BB/DMCBSu
Síntese do carboximetil dextrano sulfatado modificado pelabenzilamina (DMCBSu)
O polímero anfifílico é sintetizado à partir de um carboximetildextrano tendo um grau de substituição em carboximetil por unidadesacarídica de 1,0 e uma massa molar média de 40000 g/mol. A benzilamina éenxertada sobre os ácidos deste polímero de acordo com um método clássicode copulação em água em presença de uma carbodiimida hidrossolúvel. Ograu de substituição em benzilamina por unidade sacarídica é de 0.4,determinada por RMN 1H. Este polímero é em seguida sulfatado por umcomplexo S03/piridina. O grau de substituição em sulfate por unidadesacarídica é de 0,3.
Preparação do complexo PDGF-BB/DMCBSu
10 μl de uma solução de PDGF-BB à 0,1 mg/ml é adicionada à90 μl de uma solução de DMCBSu à 50 mg/ml. As soluções de PDGF-BB ede DMCBSu são tamponadas a pH 7,4 et 300 mOsm. Esta solução é colocadasob agitação suave durante duas horas em temperatura ambiente depoisarmazenada à 4°C.
Verificação da formação de um complexo PDGF-BB/DMCBSu
10 μl da solução do complexo PDGF-BB/ DMCBSu descritoacima são depositados sobre um gel de agarose. A migração dos compostos éefetuada sob o efeito de um campo elétrico (200 mA-4 horas). Após amigração, o PDGF-BB é transferido sobre uma membrana de PVDF duranteuma noite , depois revelado por immunoblotting com anticorpo de cabra anti-PDGF- BB sobre os quais serão fixados anticorpos secundários anti-IgG decabra copulados a peroxidase HRP revelado por um substrato (5-bromo-4-cloro-3- indolil fosfato/nitro blue tetrazólio).
O complexo PDGF-BB/DMCBSu migra em direção do anodo.Sua carga negativa é explicada por uma composição bem mais rica emDMCBSu do que em PDGF-BB. O controle, constituído apenas de PDGF-BB, não migra .
Verificação da estabilidade da solução do complexo PDGF-
DMCBSu
10 μl de uma solução de PDGF-BB à 0,01 mg/ml à pH 7,4 e10 μl da solução do complexo PDGF-BB /DMCBSu a pH 7,4 descrita acimasão colocados sobre um banco de agitação durante 48h à temperaturaambiente. Após a centrifugação, a concentração em PDGF-BB em cada umadas soluções é avaliada por SDS-Page. Parece que a concentração em PDGF-BB em solução no caso do complexo PDGF-BB /DMCBSu não mudouenquanto que a da solução de PDGF-BB sozinha diminuiu.
Verificação da proteção do PDGF-BB contra a tripsina nestecomplexo PDGF-BB/ DMCBSu
10 μl da solução do complexo BMP-2/DMCTrpOMe descritoacima são despejados em 90 μΐ de uma solução de tripsina à 10 ng/ml à 37°C.
Por uma retirada de amostra de 10 μl, a concentração emPDGF-BB é medida todos os 30 minutos por Elisa após ter parado a reaçãoenzimática por adição de 10 μl de uma solução de indol a 10 μg/ml.
Esta cinética revela que o PDGF-BB sozinho é totalmentedegradado em 1 h30 enquanto que ele não é no complexo PDGF-BB/DMCB Su.
Validação da atividade biológica do complexo PDGF-BB/DMCBSu
Uma cultura primária dos fibroblastos de derme humana(Human Dermal Fibroblast adult (HDFa) é realizada a uma temperatura de 37°Cno meio aMEM com 10% de soro de bezerro fetal (SVF) e 1 % depenicilina- estreptomicina em uma atmosfera saturada em umidade eenriquecida em C02 (5%). O meio é renovado todos os 4 dias. Uma diluiçãoda suspensão celular no meio de cultura foi em seguida realizada para semearas placas de cultura a uma densidade de 5.000 células /cavidades para placasde 96 cavidades (empresa Nunc).
Para cada lote de células, o efeito estabilizante do PDGF-BBpelo complexo em diferentes concentrações, foi verificado por incorporaçãode timidina tritiada (5000 células/cavidades em 100 μΐ). Após a 24 horas deprivação, os fibroblastos são estimulados por adição de PDGF-BB, emdiferentes concentrações indo de 0,1 à 100 ng/ml, em presença ou não dopolímero anfifílico, a uma concentração de 1 μ§/ηι1. A incorporação datimidina tritiada é efetuada 18 horas após a estimulação por PDGF-BB empresença ou não do complexo, por adição de uma solução à 50 μΟί/ηύ, seja0,5 μCi/cavidades, um radioatividade é recuperada em frascos de contagem,as cavidades foram enxaguadas por 100 μΐ de NaOH 100 mM e aradioatividade é contada após a adição de 1 ml de líquido de cintilação(Zinsser Analitic), sobre um calculador automático.
Os resultados obtidos são representados na figure 1 anexasobre a qual a quantidade de timidina tritiada incorporada pelos fibroblastos(em Dpm χ 103), é expressada em função da concentração em PDGF-BB emμg/ml.
A curva de traço cheio representa os resultados do complexode acordo com a invenção à uma concentração de 1 μg/ml em derivado dedextrano e a curva em traços pontilhados os resultados em ausência doderivado de dextrano.
LED50 corresponde à concentração em PDGF-BB para ter 50% de proliferação dos fibroblastos humanos, A relação de R é a relação dosED50 calculados como a seguir:
R = ED50 (PDGF-BB)/ED50 (PDGF-BB + DMCBSu)
Estes resultados mostram que quando o PDGF-BB é usadosozinho, é necessário empregar 6 μg/ml para obter 50 % de proliferação,enquanto que quando o PDGF-BB é complexado por um derivado dedextrano de fórmula (I), bastam 2 μg/ml para atingir 50 % de proliferação. Arelação R, neste caso é igual a 3.
Exemplo 2 : Complexo PDGF-BB/DMCTrpOMe
Síntese do carboximetil dextrano modificado por éster metiIicodo triptofano (DMCTrpOMO)
O polímero anfifílico é sintetizado à partir de carboximetildextrano tendo um grau de substituição em carboximetil por unidadesacarídica de 1.0 e uma massa molar média de 40000 g/mol. O éster metilicodo triptofano é enxertado sobre os ácidos deste polímero de acordo com ummétodo clássico de copulação em água em presença de carbodiimidahidrossolúvel. O grau de substituição em triptofano por unidade sacarídica éde 0.3 determinado por RMN 1 H.
Preparação do complexo PDGF-BB/DMCTrpOMe
10 μl de uma solução de PDGF-BB à 0,1 mg/ml é adicionada à90 μl de uma solução de DMCTrpOMe à 50 mg/ml. As soluções de PDGF-BB e de DMCTrpOMe são tamponados à pH 7,4 e 300 mOsm. Esta solução écolocada sob agitação suave duas horas à temperatura ambiente depoisarmazenada a 4°C.
Verificação da formação de um complexo PDGF-BB/DMCTrpOMe
10 μl da solução do complexo PDGF-BB/DMCTrpOMedescrita acima são depositados sobre um gel de agarose para uma eletroforesesobre gel com uma revelação imunológica. A migração dos compostos éefetuada sob o efeito de um campo elétrico (200 mA-4 horas). Após amigração, o PDGF-BB é transferido sobre uma membrana de PVDF duranteuma noite, depois revelado por immunoblotting com anticorpo de cabra anti-PDGF-BB sobre os quais serão fixados anticorpos secundários anti-IgG decabra copulados à peroxidase revelada por um substrato (5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato/nitro blue tetrazólio)
O complexo PDGF-BB/DMCTrpOMe migra em direção doanodo. Sua carga negativa é explicada por uma composição bem mais rica emDMCTrpOMe que em PDGF-BB. I controle, constituído apenas de PDGF-BB, não migra.
Verificação da estabilidade do complexo PDGF-BB/DMCTrpOMe
10 μl de uma solução de PDGF-BB à 0,01 mg/ml à pH 7,4 e10 μl da solução do complexo PDGF-BB/DMCTrpOMe à pH 7,4 descritaacima são colocados sobre um banco de agitação durante 48h à temperaturaambiente. A concentração em PDGF-BB em cada uma das soluções éavaliada por SDS- Page. Nota-se que a concentração em PDGF-BB emsolução no caso do complexo PDGF-BB/DMCTrpOMe não mudou enquantoque a da solução de PDGF-BB sozinha diminuiu.
Verificação da proteção do PDGF-BB contra a tripsina nestecomplexo PDGF-BB/DMCTrpOMe
10 μl da solução do complexo PDGF-BB/DMCTrpOMedescrita acima são incubados com 90μl, de uma solução de Tripsina à 10ng/mL à 37°C. Para uma retirada de 10 μl a cada 30 minutos, a integridadeestrutural do PDGF-BB é avaliada por eletroforese sobre gel depoliacrilamida (SDS- Page) após ter parado a reação enzimática por adição de10 μl de uma solução de indol à 10 μg/ml.
Esta cinética revela que o PDGF-BB sozinho é totalmentedegradado em 1 h30 enquanto que ele não o é no complexo PDGF-B/DMCTrpOMe.
Exemplo 3 : Complexo PDGF-BB/CMCBSu
Síntese da carboximetil celulose sulfatada modificada pelabenzilamina (CMCBSu)
O polímero anfifílico é sintetizado à partir de umacarboximetil celulose tendo grau de substituição em carboximetil por unidadesacarídica de 1,2 e uma massa molar média de 30000 g/mol. A benzilamina éenxertada sobre os ácidos deste polímero de acordo com um método clássicode copulação em água em presença de uma carbodiimida hidrossolúvel. Ograu de substituição em benzilamina por unidade sacarídica é de 0,2determinado por RMN 1H. A sulfatação é realizada em presença de umcomplexo S03-Piridina, o grau de substituição em sulfato é de 0,30
Preparação do complexo PDGF-BB/CMCBSu
10 μl de uma solução de PDGF-BB à 0,1 mg/ml é adicionada à90 μl de uma solução de CMCB à 50 mg/ml. As soluções de PDGF-BB e deCMCBSu são tamponadas à pH 7,4 e 300 mOsm. Esta solução é colocada sobagitação suave duas horas à temperatura ambiente depois armazenada a 4°C.
Verificação da formação de um complexo PDGF-BB/CMCBSu
10 μl da solução do complexo PDGF-BB/CMCBSu descritaacima são depositados sobre um gel de agarose para uma eletroforese sobregel com uma revelação imunológica. A migração dos compostos é efetuadasob o efeito de um campo elétrico (200 mA-4 horas). Após a migração, oPDGF-BB é transferido sobre uma membrana de PVDF durante uma noite,depois revelado por immunoblotting com anticorpo de cabra anti-PDGF-BBsobre os quais serão fixados anticorpos secundários anti-IgG de cabracopulados à peroxidase HRP revelada por um substrato (5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato/nitro blue tetrazólio). O complexo PDGF-BB/CMCBSu migraem direção do anodo. Sua carga negativa é explicada por uma composiçãobem mais rica em CMCBSu que em PDGF-BB. O controle, constituídoapenas de PDGF-BB, não migra.
Verificação da estabilidade do complexo PDGF-BB/CMCBSu
10 μl de uma solução de PDGF-BB à 0,01 mg/ml à pH 7,4 e10 μl da solução do complexo PDGF-BB/CMCBSu à pH 7,4 descrita acimasão colocados sobre um banco de agitação durante 48h a temperaturaambiente. Após a centrifugação, a concentração em PDGF-BB em cada umadas soluções é avaliada por SDS-Page. Nota-se que a concentração em PDGF-BB em solução em caso do complexo PDGF-BB/CMCBSu não é mudadaenquanto que a da solução de PDGF-BB sozinho diminuiu.
Verificação da proteção do PDGF-BB contra a tripsina nestecomplexo PDGF-BB/CMCBSu
10 μl da solução do complexo PDGF-BB/CMCBSu descritaacima são incubados com 90μΙ, de uma solução de Tripsina à 10 ng/mL à 370C. Para uma retirada de 10 μΐ a cada 30 minutos, a integridade estrutural doPDGF-BB é avaliada por eletroforese sobre gel de poliacrilamida (SDS-Page) após ter parado a reação enzimática por adição de 10 μΐ de uma soluçãode indol à 10 μg/ml.
Esta cinética revela que o PDGF-BB sozinho é totalmentedegradado em 1 h30 enquanto que ele não o é no complexo PDGF-BB/DMCBSu.
Contra-exemplo 1 : complexo PDGF-BB/CMCB
Síntese da carboximetil celulose modificada pela benzilamina(CMCB)
O polímero anfifílico é sintetizado à partir de umacarboximetil celulose tendo um grau de substituição em carboximetil porunidade sacarídica de 1,2 e uma massa molar média de 30000 g/mol. Abenzilamina é enxertada sobre os ácidos deste polímero de acordo com ummétodo clássico de copulação em água em presença de uma carbodiimidahidrossolúvel. O grau de substituição em benzilamina por unidade sacarídicaé de 0,2 determinado por RMN1H.
Preparação do complexo PDGF-BB/CMCB
10 μl de uma solução de PDGF-BB à 0,1 mg/ml é adicionada à90 μl de uma solução de CMCB à 50 mg/ml. As soluções de PDGF-BB e deCMCB são tamponadas à pH 7,4 e 300 mOsm. Esta solução é colocada sobagitação suave duas horas a temperatura ambiente depois armazenada a 4°C.
Verificação da não formação de complexo PDGF-BB/CMCBμl da solução do complexo PDGF-BB/CMCB descritoacima são depositados sobre um gel de agarose para uma eletroforese sobregel com uma revelação imunológica. A migração dos compostos é efetuadasob o efeito de um campo elétrico (200 mA-4 horas). Após a migração, oPDGF-BB é transferido sobre uma membrana de PVDF durante uma noite ,depois revelado por immunoblotting com anticorpos de cabra anti-PDGF-BBsobre os quais serão fixados anticorpos secundários anti-IgG de cabracopulados à peroxidase HRP revelada por um substrato (5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato/nitro blue tetrazólio).
A revelação não mostra migração do PDGF-BB sozinho com opolímero anfifílico. Não ocorreu formação de complexo entre o CMCB e oPDGF-BB.
Claims (26)
1. Complexo polímero anfifílico-PDGF estável fisicamente equimicamente, solúvel em água, caracterizado em que- os polímeros anfifílicos são constituídos por um esqueletopolimérico hidrofílico funcionalizado por substituintes hidrofóbicos egrupamentos hidrofílicos de acordo com a fórmula geral seguinte.<formula>formula see original document page 29</formula>• R, R' sendo uma ligação ou uma cadeia compreendendoentre 1 e 18 carbonos, eventualmente ramificada e/ou insaturadacompreendendo um ou vários heteroátomos, como O, N e/ou S,ReR' sendo idênticos ou diferentes entre si• F, F1 sendo um éster, um tioéster, uma amida, um carbonato,um carbamato, um éter, um tioéter, uma amina,FeF' sendo idênticos ou diferentes entre si•X sendo um grupamento hidrofílico podendo ser:o um carboxilatoo um sulfatoo um sulfonatoo um fosfatoo um fosfonatoΥ sendo um grupamento hidrofílico podendo sero um sulfatoo um sulfonatoo um fosfatoo um fosfonatoHy sendo um grupamento hidrofóbico podendo sero uma alquila linear ou ramificada em C8 a C30,eventualmente insaturada e/ou contendo um ou vários heteroátomos como O,N ou S,o uma alquilarila ou uma arilalquila linear ou ramificada emC8 a Cl 8, eventualmente insaturada e/ou contendo eventualmente umheteroátomoo um policiclo em C8 a C30 eventualmente insaturado,η e o estão compreendidos entre 1 e 3,h representa a fração molar de motivo hidrofóbico em relaçãoa uma unidade monomérica compreendida entre 0,01 e 0,5,χ representa a fração molar de grupamentos hidrofílicos emrelação a uma unidade monomérica compreendida entre 0 e 2,0,y representa a fração molar de grupamentos hidrofílicos emrelação a uma unidade monomérica, compreendida entre 0 e 0,5,- o PDGF é selecionado dentre o grupo consistindo de PDGFs(Platelet-derivated growth factors).
2. Complexo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o PDGF é selecionado dentre o grupo consistindo de PDGFsrecombinantes humanos comportando duas cadeias B (rhPDGF-BB).
3. Complexo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o polímero é selecionado dentre ospolímeros cujos substituintes são repartidos de modo estatístico.
4. Complexo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o polímero anfifílico éselecionado dentre os poliaminoácidos.
5. Complexo de acordo com a reivindicação 4, caracterizadopelo fato de que os poliaminoácidos são selecionados dentre o grupoconsistindo de poliglutamatos ou poliaspartatos.-1 e 2, caracterizado pelo fato de que, para gerar a ordemde giro induzida pela consignação de saída e pararealizar a submissão, utilizam-se os meios que sãoformados a partir de uma teoria chamada de comando modal.
6. Complexo de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que os poliaminoácidos são homopoliglutamatos.
7. Complexo de acordo com a reivindicação 6, caracterizadopelo fato de que os poliaminoácidos são homopoliaspartatos.
8. Complexo de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de que os poliaminoácidos são copolímeros de aspartato eglutamato.
9. Complexo de acordo com uma das reivindicações 1 a 5,caracterizado pelo fato de que o polímero é selecionado dentre ospolissacarídeos.
10. Complexo de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que os polissacarídeos são selecionados dentre o grupoconsistindo de hialuronanos, os alginatos, as quitosonas, os galacturonanos, acondroitina- sulfato, os dextratos, as celuloses.
11. Complexo de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelo fato de que o grupo de celuloses é constituído por celulosesfuncionalizadas pelos ácidos como carboximetil celulose.
12. Complexo da reivindicação 10, caracterizado pelo fato deque o grupo de dextranos é constituído por dextranos funcionalizados pelosácidos como carboximetil dextrano.
13. Complexo de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que os polissacarídeos são selecionados dentre o grupoconsistindo de hialuronanos, os alginatos, as quitosanas.
14. Complexo de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que os polissacarídeos são selecionados dentre o grupoconsistindo de derivados de dextrano solúvel respondendo à fórmula (I)seguinte:<formula>formula see original document page 4</formula>em queD representa uma cadeia polissacarídica, preferivelmenteconstituída por encadeamentos de unidades glucosídicas,- MC representa grupos metilcarboxílicos,- B representa grupos N-benzilmetileno carboxamida- Su representa grupos sulfatos (sulfatação de funçõeshidroxila livres, portadas pelas unidades glucosídicas),- a, b e c representam o grau de substituição (ds)respectivamente dos grupamentos MC, B e Su comi) uma restrição superior a 0,ii) b é tal que- seja b é superior ou igual a 0,3 e c está compreendido entre-0,1 e 0,5,- seja b é estritamente inferior a 0,3 e c responde à equação (1)seguintec > 8,5 b2-5,41 b + 0,86 (1).
15. Complexo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o grupo hidrofóbico Hy éselecionado dentre o grupo consistindo de ácidos graxos, álcoois graxos,aminas graxas, as aminas benzílicas, os derivados do colesterol e os fenóis.
16. Complexo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que a formação do complexo polímeroanfifílico-PDGF é reversível.
17. Complexo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que ele atende aos testes deverificação da estabilização química e física.
18. Complexo de acordo com a reivindicação 17, caracterizadopelo fato de que os testes de verificação da estabilização química e física sãoselecionados dentre o grupo consistindo de teste de verificação do complexo(Gel Mobility Shift Assay), teste de diminuição da degradação enzimática porcolocação em contato com uma protease e um teste de estabilização física apH fisiológico realizado por SDS-PAGE.
19. Complexo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que a relação PDGF/ polímeroanfifílico está compreendida entre 1/5 e 1/5.000.
20. Complexo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que a relação PDGF/polímeroanfifílico está compreendida entre 1/100 e 1/5.000.
21. Complexo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que a relação PDGF/polímeroanfifílico está compreendida entre 1/300 e 1/700.
22. Processo de preparação do complexo polímero anfifílico-PDGF como definido em qualquer uma das reivindicações precedentes,caracterizado pelo fato de que prepara-se este complexo polímero anfifílico-PDGF em meio aquoso e em ausência do solvente orgânico susceptível dedesnaturar a proteína.
23. Composição terapêutica caracterizada pelo fato de que elacompreende um complexo polímero anfifílico-PDGF como definido emqualquer uma das reivindicações 1 a 21.
24. Composição terapêutica de acordo com a reivindicação 20,caracterizada pelo fato de que ela permite uma administração de 100 μg porml de PDGF.
25. Utilização de um complexo polímero anfifílico-PDGFcomo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizada pelofato de que é para a preparação de uma composição terapêutica com açãocicatrizante destinada ao tratamento das úlceras por via tópica.
26. Uso de uma composição terapêutica compreendendo umcomplexo polímero anfifílico-PDGF como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de ser para a manufatura de ummedicamento para tratamento terapêutico humano ou veterinário.
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Free format text: EM VIRTUDE DO ARQUIVAMENTO PUBLICADO NA RPI 2533 DE 23-07-2019 E CONSIDERANDO AUSENCIA DE MANIFESTACAO DENTRO DOS PRAZOS LEGAIS, INFORMO QUE CABE SER MANTIDO O ARQUIVAMENTO DO PEDIDO DE PATENTE, CONFORME O DISPOSTO NO ARTIGO 12, DA RESOLUCAO 113/2013. |