BRPI0616824A2

BRPI0616824A2 - inibidores de peptìdeo permeável à célula da via de transdução de sinal de jnk

Info

Publication number: BRPI0616824A2
Application number: BRPI0616824-8A
Authority: BR
Inventors: Bonny Christophe
Original assignee: Xigen S. A.
Priority date: 2005-09-12
Filing date: 2006-09-12
Publication date: 2011-07-05
Also published as: ZA200800848B; DK1928903T3; ES2388076T3; KR20080052586A; SI2418217T1; ME02000B; RS52379B; PL1928903T3; HK1163712A1; SI1928903T1; JP2012095657A; WO2007031280A3; CA2621337A1; US20160264630A1; HRP20120598T1; EP2418217A1; EP2418217B1; HRP20160379T1; DK2418217T3; US20140200187A1

Abstract

INIBIDORES DE PEPTIDEO PERMEáVEL à CéLULA DA VIA DE TRANSDUçãO DE SINAL DE JNK. A presente invenção refere-se a inibidores de proteína quinase e mais especificamente a inibidores da proteína quinase c-Jun amino terminal quinase. Adicionalmente, a presente invenção fornece seqúências inibidoras de JNK, peptídeos quiméricos, ácidos nucléicos que codificam os mesmos assim como composições farmacêuticas para tratar patofisiologias associadas a sinalização de JNK.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "INIBIDORESDE PEPTÍDEO PERMEÁVEL À CÉLULA DA VIA DE TRANSDUÇÃO DESINAL DE JNK".

A presente invenção refere-se a inibidores de proteína quinase emais especificamente a inibidores da proteína quinase c-Jun quinase aminoterminal. Além disso, a presente invenção fornece seqüências inibidoras deJNK, peptídeos quiméricos, ácidos nucléicos que codificam os mesmos as-sim como composições farmacêuticas para tratar patofisiologias associadascom a sinalização de JNK.

A c-Jun quinase amino terminal (JNK) é um membro do grupoativado por estresse das proteínas quinase ativadas por mitógeno (MAP).Essas quinases têm sido implicadas no controle do crescimento e diferenci-ação celular e, mais geralmente, na resposta de células a estímulos ambien-tais. A via de transdução de sinal de JNK é ativada em resposta ao estresseambiental e pela ação de diversas classes de receptores da superfície celu-lar. Esses receptores podem incluir receptores de citocina, receptores deserpentina e tirosina quinases receptoras. Em células de mamíferos, a JNKtem sido implicada em processos biológicos tais como a transformação on-cogênica e mediação de respostas adaptativas mediadas ao estresse ambi-ental. JNK também está associada com a modulação de respostas imunes,incluindo a maturação e diferenciação de células imunes assim como a efe-tuação de morte celular programada em células identificadas para destruiçãopelo sistema imune. Essa propriedade única torna a sinalização de JNK umalvo promissor para o desenvolvimento de intervenção farmacológica. Dentrediversos distúrbios neurológicos, a sinalização de JNK está particularmente im-plicada no acidente vascular cerebral isquêmico e doença de Parkinson.

Uma abordagem no combate a distúrbios fortemente relaciona-dos à sinalização de JNK é o fornecimento de inibidores da via de sinaliza-ção de JNK. Tais inibidores como já conhecidos na técnica anterior, incluemparticularmente, por exemplo, inibidores de quinase à montante (por exem-plo, CEP-1347, pequenos inibidores químicos de JNK (SP600125 eAS601245), que afetam diretamente a atividade da quinase, por exemplo,pela competição com o sítio de ligação de ATP da proteína quinase e inibi-dores de peptídeo da interação entre JNK e seus substratos (D-JNKI e l-JIP)(vide por exemplo, Kuan et ai., Current Drug Targets - CNS & NeurologicalDisorders, Fevereiro de 2005, vol. 4, no. 1, pp. 63-67(5)).

O inibidor da quinase à montante CEP-1347 (KT7515) é um ini-bidor semi-sintético da família de quinase de linhagem mista. CEP-1347(KT7515) promove a sobrevivência neuronal em dosagens que inibem a ati-vação das c-Jun quinases amino-terminais (JNKs) em culturas embrionáriasprimárias e células PC12 diferenciadas após a retirada trófica e em camun-dongos tratados com 1 -metil-4-fenil tetraidropiridina. Além disso, CEP-1347(KT7515) pode promover a sobrevivência a longo prazo de gânglio da raizdorsal, neurônios simpáticos, ciliares e motores embrionários de pinto culti-vados (vide, por exemplo, Borasio et ai, Neuroreport. 9(7): 1435-1439, 11 demaio de 1998.).

Foi descoberto que o pequeno inibidor químico de JNKSP600125 reduz os níveis de fosforilação de c-Jun, para proteger neurôniosdopaminérgicos da apoptose, e restaurar parcialmente o nível de dopaminaem PD induzida por MPTP em camundongos C57BL/6N (Wang et ai, Neu-rosci Res. 2004 Feb; 48(2); 195-202). Esses resultados indicam ainda que avia de JNK é a principal mediadora dos efeitos neurotóxicos de MPTP in vivoe a inibição da atividade de JNK pode representar uma nova e eficaz estra-tégia para tratar PD.

Um exemplo adicional de pequenos inibidores químicos é o ini-bidor de JNK AS601245 anteriormente mencionado. AS601245 inibe a viade sinalização de JNK e promove a sobrevivência celular após isquemia ce-rebral. In vivo, AS601245 forneceu proteção significativa contra a perda tar-dia de neurônios CA1 do hipocampo de um modelo de gerbo de isquemiaglobal transitória. Esse efeito é mediado pela inibição de JNK e portanto pelaexpressão e fosforilação de c-Jun (vide por exemplo, Carboni et aí., J Phar-macol Exp Ther. 2004 Jul; 310(1 ):25-32. Epub 26 Fev 2004).

Uma terceira classe de inibidores da via de sinalização de JNKrepresenta inibidores de peptídeo da interação entre JNK e seus substratos,como mencionado acima. Como ponto de partida para a construção de taispeptídeos inibidores de JNK um alinhamento de seqüência de proteínas JNKde ocorrência natural pode ser usado. Tipicamente, essas proteínas com-preendem domínios de ligação de JNK (JBDs) e ocorrem em várias proteí-nas de ligação a insulina (IB), tais como IB1 ou IB2. Os resultados de tal ali-nhamento de seqüência exemplar é, por exemplo um alinhamento de se-qüência entre os domínios de ligação de JNK de IB1 [SEQ ID NO: 13], IB2[SEQ ID NO: 14], c-Jun [SEQ ID NO: 15] e ATF2 [SEQ ID NO: 16] (vide, porexemplo figuras 1A-1C). Tal alinhamento revela uma seqüência de 8 amino-ácidos parcialmente conservada (vide, por exemplo, figura 1 A). Uma compa-ração dos JBDs de IB1 e IB2 ainda revela dois blocos de sete e três aminoá-cidos que são altamente conservados entre as duas seqüências.

Seqüências construídas com base em tal alinhamento são, porexemplo, descritas na WO 01/27268. Particularmente, WO 01/27268 descre-ve pequenos peptídeos de fusão permeáveis à célula, que compreendemuma assim chamada seqüência TAT de permeação celular derivada da se-qüência de tráfego básica da proteína HIV-TAT e um mínimo de 20 aminoá-cidos da seqüência inibidora de IB1. Ambos os componentes estão covalen-temente ligados um ao outro. Inibidores exemplares (e até o momento osúnicos) da via de sinalização de MAPK-JNK descritos na WO 01/27268, são,por exemplo, L-JNK11 (peptídeo inibidor de JNK composto de L aminoáci-dos) ou os peptídeos D-JNK11 resistentes a protease (peptídeo inibidor deJNK composto de D aminoácidos não nativos). Esses peptídeos inibidoresde JNK (JNKI) são específicos para JNK (JNK1, JNK2 e JNK3). Em contras-te a esses pequenos compostos inibidores como discutidos acima, as se-qüências inibidoras em WO 01/27268, por exemplo, JNKI1, inibem mais es-pecificamente a interação entre JNK e seu substrato. Pela sua seqüência detráfego derivada de TAT, o peptídeo de fusão é transportado eficientementepara as células. Devido às novas propriedades obtidas pelo componente detráfego, os peptídeos de fusão são transportados ativamente para as células,onde eles permanecem eficazes até a degradação proteolítica.

Entretanto, peptídeos de acordo com a WO 01/27268 ainda sãofacilmente acessíveis pelas fosforilases (quinases). Qualquer aminoácido deum peptídeo que serve como um alvo para quinases e, portanto, podem sersubmetidos à fosforilação, representa um fator importante para a inativaçãode tais peptídeos. Portanto, é um primeiro objetivo da presente invenção for-necer novas seqüências inibidoras para a via de sinalização de JNK1 queretêm as propriedades funcionais dos peptídeos como descrito em WO01/27268, mas fornecem estabilidade melhorada em relação a fosforilases(quinases).

Além disso, seqüências inibidoras de acordo com WO 01/27268requerem uma etapa de recuperação e purificação dispendiosa, particular-mente se preparada em quantidades em larga escala (por exemplo, paraprodução industrial). Assim é um segundo objetivo da presente invençãofornecer seqüências inibidoras que permitem produção e recuperação maisfácil e econômica do que aquelas da técnica atual.

Esses objetivos são solucionados por uma seqüência inibidorade JNK que compreende menos do que 150 aminoácidos de extensão, emque a seqüência inibidora de JNK compreende ou consiste em pelo menosuma seqüência de aminoácidos de acordo com as SEQ ID NOs: 1, 2, 3 ou 4ou uma variante, fragmento ou derivado dessas.

Preferivelmente, a seqüência inibidora de JNK da invenção seliga à JNK e/ou inibe a ativação de pelo menos um fator de transcrição ati-vado por JNK, por exemplo, c-Jun ou ATF2 (vide, por exemplo, SEQ ID NOs:15 e 16, respectivamente) ou Elk1.

Tipicamente, as seqüências inibidoras de JNK de acordo com apresente invenção compreendem uma extensão total de menos do que 150resíduos de aminoácidos, preferivelmente uma faixa de 5 a 150 resíduos deaminoácidos, mais preferivelmente de 10 a 100 resíduos de aminoácidos,ainda mais preferivelmente de 10 a 75 resíduos de aminoácidos e o maispreferivelmente numa faixa de 15 a 50 resíduos de aminoácidos.

A seqüência inibidora de JNK da invenção contém preferivel-mente ou consiste em pelo menos uma seqüência de aminoácidos de acor-do com as SEQ ID NOs: 1, 2, 3 ou 4 ou um fragmento, variante, ou derivadodessas. Mais preferivelmente, a seqüência inibidora de JNK da invençãopode conter 1, 2, 3, 4 ou ainda mais cópias de uma seqüência de aminoáci-dos de acordo com as SEQ ID NOs: 1, 2, 3 ou 4 ou uma variante, fragmentoou derivado dessas. Se presentes em mais de uma cópia, essas seqüênciasde aminoácidos da invenção de acordo com as SEQ ID NOs: 1, 2, 3 ou 4 ouvariantes, fragmentos ou derivados dessas podem estar ligadas diretamenteumas com a outras sem qualquer seqüência Iigante ou através de uma se-qüência Iigante que compreende 1 a 10, preferivelmente 1 a 5 aminoácidos.Aminoácidos que formam a seqüência Iigante são preferivelmente selecio-nados entre glicina e prolina como resíduos de aminoácidos. Mais preferi-velmente, essas seqüências de aminoácidos da invenção de acordo comSEQ ID NOs: 1, 2, 3 ou 4 ou fragmentos, variantes, ou derivados dessaspodem ser separadas umas da outras por uma dobradiça de dois, três oumais resíduos de prolina.

As seqüências inibidoras de JNK da invenção como definidasacima podem ser compostas de L-aminoácidos, D-aminoácidos ou umacombinação de ambos. Preferivelmente, as seqüências inibidoras de JNK dainvenção compreendem pelo menos 1, preferivelmente pelo menos 3, maispreferivelmente pelo menos 6 e ainda mais preferivelmente pelo menos 10D- e/ou L-aminoácidos, em que os D- e/ou L-aminoácidos podem estar dis-postos nas seqüências inibidoras de JNK da invenção em forma de blocosou não, ou de uma forma alternada.

De acordo com uma modalidade preferida as seqüências inibido-ras de JNK da invenção podem ser compostas exclusivamente de L-aminoácidos. As seqüências inibidoras de JNK da invenção podem entãocompreender ou consistir em pelo menos uma "seqüência inibidora de JNKnativa" de acordo com as SEQ ID NO: 1 ou 3. Nesse contexto, o termo "nati-va" ou "seqüência(s) inibidora(s) de JNK nativa(s)" refere-se a seqüênciasinibidoras de JNK da invenção não-alteradas de acordo com qualquer umadas SEQ ID Nos: 1 ou 3, inteiramente composta de L-aminoácidos.

Conseqüentemente, a seqüência inibidora de JNK da invençãopode compreender ou consistir em pelo menos uma seqüência de aminoáci-dos (nativa) NH2-Xnb-Xna-RPTTLXLXXXXXXXQD-Xnb-COOH [SEQ ID NO: 3].Como usado nesse contexto, cada X representa um resíduo de aminoácido,preferivelmente selecionado a partir de qualquer resíduo de aminoácido (na-tivo). Xna representa um resíduo de aminoácido, preferivelmente selecionadoa partir de qualquer resíduo de aminoácido exceto serina ou treonina, emque η é 0 ou 1. Além disso, cada Xnb pode ser selecionado a partir de qual-quer resíduo de aminoácido, em que η é 0-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-30 oumais, com a condição de que se η for 0 para Xna, Xnb não deve compreenderuma serina ou treonina na sua terminação-C, a fim de evitar uma serina outreonina nessa posição. Preferivelmente, Xnb representa uma fita contígua deresíduos de peptídeos derivada da SEQ ID NO: 1 ou 3. Mais preferivelmen-te, a seqüência inibidora de JNK da invenção pode ainda compreender ouconsistir em pelo menos um seqüência de aminoácido (nativa) NH2-RPKRPTTLNLFPQVPRSQD-COOH [SEQ ID NO: 1]. Xna e Xnb representamtanto D quanto L aminoácidos.

De acordo com outra modalidade preferida, as seqüências inibi-doras de JNK da invenção podem ser compostas em parte ou exclusivamen-te de D-aminoácidos. Mais preferivelmente, essas seqüências inibidoras deJNK da invenção compostas de D-aminoácidos são seqüências retroinver-sas D não nativas das seqüências inibidoras de JNK acima (nativas). O ter-mo "seqüências retroinversas" refere-se a um isômero de uma seqüência depeptídeos linear na qual a direção da seqüência é reversa e a quiralidade decada resíduo de aminoácido está invertida (vide, por exemplo, Jameson etai, Nature, 368,744-746 (1994); Brady et ai, Nature, 368,692-693 (1994)). Avantagem de combinar D-enantiômeros e síntese reversa é que as posiçõesdos grupos carbonila e amino em cada ligação de amida estão trocadas, en-quanto que a posição dos grupos da cadeia lateral em cada carbono alfa estápreservada. A menos que especificamente estabelecido de outra maneira, pre-sume-se que qualquer dada seqüência de L-aminoácido ou peptídeo de acordocom a presente invenção pode ser convertida em uma seqüência ou peptídeoD retroinverso pela síntese de um reverso de seqüência ou peptídeo para aseqüência ou peptídeo de L-aminoácido nativo correspondente.As seqüências D retroinversas da invenção como definido aci-ma, têm uma variedade de propriedades úteis. Por exemplo, as seqüênciasD retroinversas da invenção entram nas células tão eficientemente quanto asseqüências de L-aminoácidos de acordo com a presente invenção, emboraas seqüências D retroinversas da invenção sejam mais estáveis do que asseqüências de L-aminoácidos correspondentes.

Conseqüentemente, as seqüências inibidoras de JNK da inven-ção podem compreender ou consistir em pelo menos uma seqüência D re-troinversa de acordo com a seqüência de aminoácidos NH2-Xnb-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xna-Xnb-COOH [SEQ ID NO: 4], Como usados nessecontexto, X, Xna e Xnb são como definidos acima (preferivelmente represen-tando D aminoácidos), em que Xnb representa preferivelmente uma fita con-tígua de resíduos derivados das SEQ ID NO: 2 ou 4. Mais preferivelmente,as seqüências inibidoras de JNK da invenção podem compreender ou con-sistir em pelo menos uma seqüência D retroinversa de acordo com a seqüênciade aminoácidos NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPR-COOH [SEQ ID NO: 2],

As seqüências inibidoras de JNK da invenção como descrito a-cima estão apresentadas na Tabela 1 (SEQ ID Nos: 1-4). A tabela apresentao nome das seqüências inibidoras de JNK da invenção, assim como seusnúmeros de identificação de seqüência, suas extensões e seqüência de a-minoácidos. Adicionalmente, seqüências da técnica anterior de acordo comWO 01/27268 (SEQ ID NOs: 17-26) também são dadas por razões compara-tivas. Essas seqüências da técnica anterior não são descritas aqui como se-qüências inibidoras de JNK da invenção ou peptídeos quiméricos da inven-ção e estão portanto explicitamente excluídas do escopo da presente inven-ção por meio de uma ressalva.

TABELA 1

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(Na Tabela 1 seqüências exemplares assim como suas fórmulas genéricassão mostradas para as SEQ ID Nos: 1, 2, 5, 6, 9 e 11 e SEQ ID Nos: 3, 4, 7,8, 10 e 12, respectivamente).

De acordo com outra modalidade preferida, a seqüência inibido-ra de JNK da invenção compreende ou consiste em pelo menos uma varian-te, fragmento e/ou derivado das seqüências de aminoácidos nativas ou não-nativas da invenção definidas acima de acordo com as SEQ ID Nos: 1, 2, 3ou 4. Preferivelmente, essas variantes, fragmentos e/ou derivados retêmatividade biológica das seqüências inibidoras de JNK nativas ou não nativasda invenção descritas acima, particularmente das seqüências de aminoáci-dos nativas ou não-nativas de acordo com as SEQ ID Nos: 1, 2, 3 ou 4, istoé se ligam a JNK e/ou inibem a ativação de pelo menos um fator de transcri-ção ativado por JNK1 por exemplo c-Jun, ATF2 ou Elkl. A funcionalidadepode ser testada por vários testes, por exemplo, testes de ligação do peptí-deo a sua molécula alvo ou por métodos biofísicos, por exemplo, espectros-copia, modelagem computadorizada, análise estrutural, etc. Particularmente,uma seqüência inibidora de JNK da invenção ou variantes, fragmentos e/ouderivados dessa podem ser analisados por análise de hidrofilicidade (vide,por exemplo, Hopp & Woods, 1981. Proc Natl Acad Sci USA 78: 3824-3828)que pode ser utilizada para identificar as regiões hidrofóbicas e hidrofílicasdos peptídeos, auxiliando assim na criação de substratos para manipulaçãoexperimental, tal como em experimentos de ligação ou para síntese de anti-corpo. Análise estrutural secundária também pode ser realizada para identi-ficar regiões de uma seqüência inibidora de JNK (da invenção) ou de varian-tes, fragmentos e/ou derivados dessa que assumem motivos estruturais es-pecíficos (vide, por exemplo, Chou & Fasman, 1974, Biochem 13: 222-223).Manipulação, tradução, previsão de estrutura secundária, perfis de hidrofili-cidade e hidrofobicidade, previsão de fase de leitura aberta e plotagem edeterminação de homologias de seqüência podem ser obtidos usando pro-gramas de computador disponíveis na técnica. Outros métodos de análiseestrutural incluem, por exemplo, cristalografia por raio X (vide, por exemplo,Engstrom, 1974. Biochem Exp Biol 11: 7-13), espectroscopia de massa ecromatografia a gás (vide, por exemplo, METHODS IN PROTEIN SCIENCE,1997, J. Wiley and Sons, Nova Iorque, NY) e modelagem computadorizada(vide, por exemplo, Fletterick & Zoller, eds., 1986. Computer Graphics andMolecular Modeling, In: CURRENT COMMUNICATIONS IN MOLECULARBIOLOGY, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)também podem ser empregados.

Conseqüentemente, a seqüência inibidora de JNK da invençãopode compreender ou consistir em pelo menos uma variante (nativa ou nãonativa) de seqüências de aminoácidos de acordo com as SEQ ID Nos.: 1, 2,3 ou 4. No contexto da presente invenção, "uma variante (nativa ou não nati-va) de uma seqüência de aminoácido de acordo com as SEQ ID Nos.: 1, 2, 3ou 4" é preferivelmente uma seqüência derivada de qualquer uma das se-qüências de acordo com as SEQ ID Nos.: 1, 2, 3 ou 4, em que a variantecompreende alterações de aminoácidos das seqüências de aminoácido deacordo com as SEQ ID Nos.: 1, 2, 3 ou 4. Tais alterações compreendem tipi-camente 1 a 20, preferivelmente de 1 a 10 e mais preferivelmente 1 a 5substituições, adições e/ou deleções de aminoácidos de acordo com as SEQ IDNos.: 1, 2, 3 ou 4, em que a variante exibe uma identidade de seqüência comqualquer uma das seqüências de acordo com as SEQ ID Nos.: 1, 2, 3 ou 4 depelo menos cerca de 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ou ainda 99%.

Se variantes das seqüências de aminoácidos (nativa ou não na-tiva) da invenção de acordo com SEQ ID Nos.: 1, 2, 3 ou 4 são obtidas pelasubstituição de aminoácidos específicos, tais substituições compreendempreferivelmente substituições conservativas de aminoácidos. Substituiçõesconservativas de aminoácidos podem incluir resíduos de aminoácidos sinô-nimos dentro de um grupo que tem propriedades fisicoquímicas suficiente-mente similares, tal que uma substituição entre membros do grupo preserva-rá a atividade biológica da molécula (vide, por exemplo, Grantham, R.(1974), Science 185, 862-864). É evidente para a pessoa versada na técnicaque aminoácidos também podem ser inseridos e/ou deletados nas seqüên-cias definidas acima sem alterar suas funções, particularmente se as inser-ções e/ou deleções envolvem apenas poucos aminoácidos, por exemplo,menos do que vinte e preferivelmente menos do que dez e não removem oudeslocam aminoácidos que são críticos para a atividade funcional. Além dis-so, substituições devem ser evitadas em variantes da invenção, que levamtreoninas adicionais em posições de aminoácidos que são acessíveis a umafosforilase, preferivelmente uma quinase, a fim de evitar inativação das se-qüências inibidoras de JNK da invenção ou do peptídeo quimérico da inven-ção in vivo ou in vitro.

Preferivelmente, resíduos de aminoácidos sinônimos, que sãoclassificados nos mesmos grupos e são tipicamente intercambiáveis pelassubstituições conservativas de aminoácidos, são definidos na Tabela 2.

TABELA 2

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Uma forma específica de uma variante de SEQ ID NOs: 1, 2, 3ou 4 de acordo com a invenção é um fragmento das seqüências de aminoá-cidos (nativas ou não nativas) de acordo com as SEQ ID Nos.: 1, 2, 3 ou 4,que é tipicamente alterado por pelo menos uma deleção quando comparadocom as SEQ ID NOs 1, 2, 3 ou 4. Preferivelmente, um fragmento compreen-de pelo menos 4 aminoácidos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs:1, 2, 3 ou 4, uma extensão tipicamente suficiente para permitir o reconheci-mento específico de um epítopo a partir de qualquer uma dessas seqüên-cias. Ainda mais preferivelmente, o fragmento compreende 4 a 18, 4 a 15 ouo mais preferivelmente 4 a 10 aminoácidos contíguos de qualquer uma dasSEQ ID NOs: 1, 2, 3 ou 4. Aminoácidos deletados podem ocorrer em qual-quer posição das SEQ ID NOs: 1, 2, 3 ou 4, preferivelmente N- ou C-terminalmente. Em particular, peptídeos da SEQ ID NO: 2 (DQSRPVQP-FLNLTTPRKPR) podem ser deletados na sua terminação N- e/ou C- por 1,2, 3, 4, ou 5 aminoácidos. Em outras palavras, versões mais curtas preferi-das de SEQ ID NO: 2 podem ter a seqüência QSRPVQPFLNLTTPRKPR,SRPVQPFLNLTTPRKPR, RPVQPFLNLTTPRKPR, PVQPFLNLTTPRKPR,ou VQPFLNLTTPRKPR ou, respectivamente, DQSRPVQPFLNLTTPRKP,DQSRPVQPFLNLTTPRK, DQSRPVQPFLNLTTPR, DQSRPVQPFLNLTTP,DQSRPVQPFLNLTT, ou QSRPVQPFLNLTTPRKP, SRPVQPFLNLTTPRKP,SRPVQPFLNLTTPRK, RPVQPFLNLTTPRKP, RPVQPFLNLTTPRK ouPVQPFLNLTTP. Quanto mais curta a seqüência de peptídeo da invençãousada, mais baixa sua toxicidade celular inespecífica. Em certas modalida-des, os peptídeos usados devem ter a seqüência mais curta possível, queainda retém a função biológica, por exemplo, a função inibidora de JNK.

Além disso, um fragmento das seqüências de aminoácidos dainvenção (nativas ou não nativas) de acordo com as SEQ ID NOs: 1, 2, 3 ou4 pode ser definido como uma seqüência que partilha uma identidade deseqüência com qualquer uma das seqüências de acordo com as SEQ IDNOs: 1, 2, 3 ou 4 de pelo menos cerca de 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%,98%, ou mesmo 99%.

As seqüências inibidoras de JNK da invenção podem aindacompreender ou consistir em pelo menos um derivado das seqüências deaminoácidos (nativas ou não nativas) de acordo com as SEQ ID NOs: 1,2,3ou 4. Nesse contexto, "um derivado de uma seqüência de aminoácido (nati-va ou não-nativa) de acordo com as SEQ ID NOs: 1, 2, 3 ou 4" é preferivel-mente uma seqüência de aminoácido derivada de qualquer uma das se-qüências de acordo com as SEQ ID NOs: 1, 2, 3 ou 4, em que o derivadocompreende pelo menos um L- ou D-aminoácido modificado (que forma a-minoácido(s) não-natural(is)), preferivelmente 1 a 20, mais preferivelmente 1a 10 e ainda mais preferivelmente 1 a 5 L- ou D-aminoácidos modificados.Derivados de variantes ou fragmentos também caem dentro do escopo dapresente invenção.

Qualquer um dos peptídeos descritos aqui pode ter uma modifi-cação em suas terminações, tanto na terminação C quanto N ou ambas. Aterminação C pode ser preferivelmente modificada por uma modificação deamida, enquanto a terminação N pode ser modificada por qualquer grupo deproteção de NH2 adequado, tal como, por exemplo, acilação.

"Um aminoácido modificado" nesse contexto pode ser qualqueraminoácido que é alterado, por exemplo, por glicosilação diferente em váriosorganismos, por fosforilação ou por marcação específica de aminoácidos.Tal marcador é então tipicamente selecionado a partir do grupo de marcado-res que compreende:

(i) marcadores radioativos, isto é fosforilação radioativa ou um mar-cador radioativo com enxofre, hidrogênio, carbono, nitrogênio, etc.;(ii) corantes coloridos (por exemplo, digoxigenina, etc.);

(iii) grupos fluorescentes (por exemplo, fluoresceina, etc.);

(iv) grupos quimioluminescentes;(ν) grupos para imobilização em uma fase sólida (por exemplo, His-tag, biotina, estrep-tag, flag-tag, anticorpos, antígeno, etc.); e(vi) uma combinação de marcadores de dois ou mais dos marcado-res mencionados sob (i) a (v).

No contexto acima, uma seqüência de aminoácidos que temuma seqüência que "partilha uma identidade de seqüência" de, pelo menos,por exemplo, 95% com uma seqüência de aminoácidos pesquisada da pre-sente invenção, pretende significar que a seqüência da seqüência de amino-ácidos objeto é idêntica à seqüência pesquisada exceto que a seqüência deaminoácidos objeto pode incluir até cinco alterações de aminoácidos por ca-da 100 aminoácidos da seqüência de aminoácidos pesquisada. Em outraspalavras, para se obter uma seqüência de aminoácidos que tem uma se-qüência de pelo menos 95% de identidade com uma seqüência de aminoá-cidos pesquisada, até 5% (5 de 100) dos resíduos de aminoácidos na se-qüência objeto podem ser inseridos ou substituídos por outros aminoácidosou deletados.

Para seqüências sem correspondência exata, um "% de identi-dade" de uma primeira seqüência pode ser determinado com relação a umasegunda seqüência. Em geral, essas duas seqüências a ser comparadassão alinhadas para dar uma correlação máxima entre as seqüências. Issopode incluir inserir "intervalos" tanto em uma quanto em ambas as seqüên-cias para aumentar o grau de alinhamento. Uma % de identidade pode entãoser determinada sobre a extensão completa de cada uma das seqüênciassendo comparadas (o chamado alinhamento global), que é particularmenteadequado para seqüências de mesma extensão ou extensão similar, ou so-bre extensões mais curtas, definidas (o chamado alinhamento local), que émais adequado para seqüências de extensão desigual.

Métodos para comparar a identidade e homologia de duas oumais seqüências são bem-conhecidos na técnica. Assim, por exemplo, pro-gramas disponíveis no Wisconsin Sequence Analysis Package, versão 9.1(Devereux et aí., 1984, Nucleic Acids Res. 12, 387-395.), por exemplo osprogramas BESTFIT e GAP podem ser usados para determinar o % de iden-tidade entre dois polinucleotídeos e o % de identidade e % de homologiaentre duas seqüências de polipeptídeo. BESTFIT usa o algoritmo de "homo-logia local" de (Smith & Waterman (1981), J. Mol. Biol. 147, 195-197.) e en-contra a melhor região única de similaridade entre duas seqüências. Outrosprogramas para determinar a identidade e/ou similaridade entre seqüênciastambém são conhecidos na técnica, por exemplo a família de programasBLAST (Altschul et ai, 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-410), acessível atravésda página da internet do NCBI no site da rede de alcance mundial nc-bi.nlm.nih.gov) e FASTA (Pearson (1990), Methods Enzymol. 183, 63-98;Pearson & Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A 85, 2444 - 2448.).

Seqüências inibidoras de JNK de acordo com a presente inven-ção podem ser obtidas ou produzidas por métodos bem-conhecidos na téc-nica, por exemplo, por síntese química ou por métodos de manipulação ge-nética como discutido abaixo. Por exemplo, um peptídeo que corresponde auma porção de uma seqüência inibidora de JNK da invenção incluindo umaregião desejada da dita seqüência inibidora de JNK, ou que media a ativida-de desejada in vitro ou in vivo pode ser sintetizado pelo uso de um sintetiza-dor de peptídeo.

De acordo com um segundo aspecto a presente invenção forne-ce um peptídeo quimérico que inclui pelo menos um primeiro domínio e pelomenos um segundo domínio, em que o primeiro domínio compreende umaseqüência de tráfego, enquanto que o segundo domínio compreende umaseqüência inibidora de JNK da invenção como definido acima.

Tipicamente, peptídeos quiméricos de acordo com a presente invenção têm uma extensão de pelo menos 25 resíduos de aminoácidos, porexemplo, 25 a 250 resíduos de aminoácidos, mais preferivelmente de 25 a200 resíduos de aminoácidos, ainda mais preferivelmente 25 a 150 resíduosde aminoácidos, 25 a 100 e o mais preferivelmente 25 a 50 resíduos de ami-noácidos.

Como um primeiro domínio o peptídeo quimérico da invençãocompreende preferivelmente uma seqüência de tráfego, que é selecionadatipicamente a partir de qualquer seqüência de aminoácidos que direciona umpeptídeo (no qual ela está presente) para um destino celular desejado. As-sim, a seqüência de tráfego, como usada aqui, direciona tipicamente o pep-tídeo através da membrana plasmática, por exemplo, para fora da célula,através da membrana plasmática, e para dentro do citoplasma. Alternativa-mente, ou em adição, a seqüência de tráfego pode direcionar o peptídeo auma localização desejada dentro da célula, por exemplo, o núcleo, o ribos-somo, o retículo endoplasmático (ER), um Iissoma ou peroxissoma, por e-xemplo, por combinar dois componentes (por exemplo, um componente parapermeabilidade celular e um componente para localização nuclear) ou porum único componente que tem, por exemplo, propriedades de transportepela membrana celular e transporte direcionado, por exemplo, intranuclear.

A seqüência de tráfego pode compreender adicionalmente outro componen-te que é capaz de se ligar a um componente citoplasmático ou qualquer ou-tro componente ou compartimento da célula (por exemplo, retículo endo-plasmático, mitocôndria, aparelho de "gloom", vesículas lisossomais). Con-seqüentemente, por exemplo, a seqüência de tráfego do primeiro domínio ea seqüência inibidora de JNK do segundo domínio podem estar localizadasno citoplasma ou em qualquer outro compartimento da célula. Isso permitedeterminar a localização do peptídeo quimérico na célula após a absorção.

Preferivelmente, a seqüência de tráfego (estando incluída noprimeiro domínio do peptídeo quimérico da invenção) tem uma extensão de5 a 150 seqüências de aminoácidos, mais preferivelmente uma extensão de5 a 100 e o mais preferivelmente uma extensão de 5 a 50, 5 a 30 ou até 5 a15 aminoácidos.

Mais preferivelmente, a seqüência de tráfego (contida no primei-ro domínio do peptídeo quimérico da invenção) pode ocorrer como uma fitacontínua de seqüência de aminoácidos no primeiro domínio. Alternativamen-te, a seqüência de tráfego no primeiro domínio pode ser clivada em dois oumais fragmentos, em que todos esses fragmentos se assemelham a se-qüência de tráfego inteira e podem estar separados um do outro por 1 a 10,preferivelmente 1 a 5 aminoácidos, com a condição de que a seqüência detráfego como tal mantenha suas propriedades transportadoras como descritoacima. Esses aminoácidos que separam os fragmentos da seqüência de trá-fego podem, por exemplo, ser selecionados a partir de seqüências de ami-noácidos que diferem da seqüência de tráfego. Alternativamente, o primeirodomínio pode conter uma seqüência de tráfego composta por mais de umcomponente, cada componente com sua própria função para o transporte daseqüência inibidora JNK carga do segundo domínio para, por exemplo, umcompartimento celular específico.

A seqüência de tráfego como definida acima pode ser compostade L-aminoácidos, D-aminoácidos ou um combinação de ambos. Preferivel-mente, as seqüências de tráfego da invenção compreendem pelo menos 1,preferivelmente pelo menos 3, mais preferivelmente pelo menos 6 e aindamais preferivelmente pelo menos 10 L-aminoácidos e/ou D-aminoácidos, emque os D e/ou L-aminoácidos podem ser arranjados nas seqüências de trá-fego de JNK da invenção em forma de blocos ou não, ou de uma maneiraalternativa.

De acordo com uma modalidade alternativa, a seqüência de trá-fego do peptídeo quimérico da invenção pode ser composta exclusivamentede L-aminoácidos. Mais preferivelmente, a seqüência de tráfego do peptídeoquimérico da invenção compreende ou consiste em pelo menos uma se-qüência de tráfego "nativa" como definido acima. Nesse contexto, o termo"nativa" refere-se a seqüências de tráfego não alteradas, compostas inteira-mente de L-aminoácidos.

De acordo com outra modalidade alternativa, a seqüência detráfego do peptídeo quimérico da invenção pode ser composta exclusiva-mente de D-aminoácidos. Mais preferivelmente, a seqüência de tráfego dopeptídeo quimérico da invenção pode compreender um peptídeo D retroin-verso das seqüências como apresentado acima.

A seqüência de tráfego do primeiro domínio do peptídeo quimé-rico da invenção pode ser obtida a partir de fontes que ocorrem naturalmenteou pode ser produzida pelo uso de técnicas de manipulação genética ou sín-tese química (vide, por exemplo, Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis1 T.(1989) Molecular cloning: A Iaboratory manual. 2â edição. Cold Spring Har-bor Laboratory Press, Cold Spring Harbor1 N.Y.).

Fontes para a seqüência de tráfego do primeiro domínio podemser empregadas incluindo, por exemplo, proteínas nativas tais como, porexemplo, a proteína TAT (por exemplo, como descrito nas Patentes US Nos.5.804.604 e 5.674.980, cada uma dessas referências estando incorporadasaqui por referência), VP22 (descrita em, por exemplo, WO 97/05265; Elliott &O1Hare, Cell 88: 223-233 (1997)), proteínas não virais (Jackson et aí, Proc.Natl. Acad. Sei. USA 89: 10691-10695 (1992)), seqüências de tráfego deri-vadas de Antennapedia (por exemplo, a seqüência transportadora de anten-napedia) ou de peptídeos básicos, por exemplo, peptídeos que têm uma ex-tensão de 5 a 15 aminoácidos, preferivelmente 10 a 12 aminoácidos e quecompreendem pelo menos 80%, mais preferivelmente 85% ou ainda 90% deaminoácidos básicos, tais como por exemplo, arginina, Iisina e/ou histidina.

Além disso, variantes, fragmentos e derivados de uma das proteínas nativasusadas como seqüências de tráfego são descritos na presente descrição.Com relação a variantes, fragmentos e derivados refere-se à definição dadaacima para seqüências inibidoras de JNK. Variantes, fragmentos assim co-mo derivados são correspondentemente definidos como apresentado acimapara seqüências inibidoras de JNK. Particularmente, no contexto de seqüên-cia de tráfego, uma variante ou fragmento ou derivado pode ser definido co-mo uma seqüência que partilha uma identidade de seqüência com uma dasproteínas nativas usadas como seqüências de tráfego como definido acima depelo menos cerca de 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, ou mesmo 99%.

Em uma modalidade preferida do peptídeo quimérico da inven-ção, a seqüência de tráfego do primeiro domínio compreende ou consisteem uma seqüência derivada da proteína TAT do vírus da imunodeficiênciahumana (HIV) 1, particularmente alguns ou todos os 86 aminoácidos quecompõem a proteína TAT.

Para uma seqüência de tráfego da invenção, seqüências parci-ais da proteína TAT de extensão completa podem ser usadas formando umfragmento funcionalmente eficaz de uma proteína TAT, isto é, um peptídeoTAT que inclui a região que media a entrada e absorção nas células. Se talseqüência é ou não um fragmento funcionalmente eficaz da proteína TATpode ser determinado usando técnicas conhecidas (vide, por exemplo, Fran-ked et ai, Proc. Natl. Acad. Sei, USA 86: 7397-7401 (1989)). Assim, a se-qüência de tráfego no primeiro domínio do peptídeo quimérico da invençãopode ser derivada de um fragmento funcionalmente eficaz ou uma porção deuma seqüência de uma proteína TAT que compreende pelo menos 86 ami-noácidos, e que exibe absorção para dentro de células e opcionalmente ab-sorção para o núcleo da célula. Mais preferivelmente, seqüências parciais(fragmentos) de TAT a ser usadas como transportadores para mediar a per-meação do peptídeo quimérico através da membrana celular, pretendemcompreender a região básica (aminoácidos de 48 a 57 ou 49 a 57) de TATde extensão completa.

De acordo com uma modalidade mais preferida, a seqüência detráfego da invenção pode compreender ou consistir em uma seqüência deaminoácidos que contém os resíduos 48-57 ou 49 a 57 de TAT, e o maispreferivelmente uma seqüência genérica de TAT NH2-Xnb-RKKRRQRRR-Xnb-COOH [SEQ ID NO: 7], em que Xnb é como definido acima. Alternativa-mente, a seqüência de tráfego da invenção pode compreender ou consistirem um peptídeo que contém, por exemplo, a seqüência de aminoácidosNH2-GRKKRRQRRR-COOH [SEQ ID NO: 5].

De acordo com outra modalidade preferida a seqüência de tráfe-go da invenção pode compreender um peptídeo D retroinverso das seqüên-cias como apresentadas acima, isto é, a seqüência D retroinversa da se-qüência genérica de TAT que tem a seqüência NH2-Xnb-RRRQRRKKR-Xnb-COOH [SEQ ID NO: 8]. Aqui também Xnb é como definido acima (preferivel-mente representando D aminoácidos). Além disso, o número de resíduos"Xnb" em qualquer uma das SEQ ID NOs: 7-8 não é limitado àquele descritoe pode variar como descrito acima. O mais preferivelmente, a seqüência detráfego da invenção pode compreender a seqüência D retroinversa NH2-RRRQRRKKRG-COOH [SEQ ID NO: 6].

De acordo com outra modalidade a seqüência de tráfego da in-venção pode compreender ou consistir em variantes das seqüências de trá-fego como definidas acima. Uma "variante de uma seqüência de tráfego" épreferivelmente uma seqüência derivada de uma seqüência de trâns tráfegoito como definida acima, em que a variante compreende uma modificação,por exemplo adição, deleção (interna) (levando a fragmentos) e/ou substitui-ção de pelo menos um aminoácido presente na seqüência de tráfego comodefinido acima. Tal(is) modificação(ões) compreende(m) tipicamente 1 a 20,preferivelmente 1 a 10 e mais preferivelmente 1 a 5 substituições, adiçõese/ou deleções de aminoácidos. Além disso, a variante exibe preferivelmenteuma identidade de seqüência com seqüência de tráfego como definido aci-ma, mais preferivelmente com qualquer uma das SEQ ID Nos: 5 a 8, de pelomenos cerca de 30%, 50%, 70%, 80%,90%, 95%, 98% ou até 99%.

Preferivelmente, tal modificação da seqüência de tráfego leva auma seqüência de tráfego com estabilidade aumentada ou diminuída. Alter-nativamente, variantes da seqüência de tráfego podem ser desenhadas paramodular a localização intracelular do peptídeo quimérico da invenção. Quan-do adicionadas exogenamente, tais variantes como definidas acima são tipi-camente desenhadas tal que a habilidade da seqüência de tráfego de entrarnas células é mantida (isto é, a absorção da variante da seqüência de tráfe-go na célula é substancialmente similar àquela da seqüência de tráfego daproteína nativa usada). Por exemplo, alteração da região básica tida comoimportante para a localização nuclear (vide, por exemplo, Dang & Lee, J.Biol. Chem. 264: 18019-18023 (1989); Hauber et ai, J. Virol. 63: 1181-1187(1989); Ruben et ai, J. Virol. 63: 1-8 (1989)) pode resultar em uma localiza-ção citoplasmática ou localização parcialmente citoplasmática da seqüênciade tráfego, e portanto da seqüência inibidora de JNK como componente dopeptídeo quimérico da invenção. Além do acima, modificações adicionaispodem ser introduzidas na variante, por exemplo, por ligar por exemplo co-lesterol ou outras porções lipídicas à seqüência de tráfego para produzir umaseqüência de tráfego que tem solubilidade à membrana aumentada. Qual-quer uma das variantes descritas acima das seqüências de tráfego da inven-ção podem ser produzidas usando técnicas tipicamente conhecidas pelapessoa versada na técnica (vide por exemplo, Sambrook, J., Fritsch, E. F.,Maniatis, Τ. (1989) Molecular cloning: A Iaboratory manual. 2à edição. ColdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.).

Como um segundo domínio, o peptídeo quimérico da invençãocompreende tipicamente uma seqüência inibidora de JNK da invenção, sele-cionada a partir de qualquer uma das seqüências inibidoras de JNK da in-venção como definido acima, incluindo variantes, fragmentos e/ou derivadosdessas seqüências inibidoras de JNK da invenção.

Ambos os domínios, isto é o primeiro e segundo domínio(s) dopeptídeo quimérico da invenção podem estar ligados tal como para formaruma unidade funcional. Qualquer método para ligar o primeiro e segundodomínio(s) como geralmente conhecido na técnica pode ser aplicado.

De acordo com uma modalidade, o primeiro e segundo domí-nio(s) do peptídeo quimérico da invenção estão preferivelmente ligados poruma ligação covalente. Uma ligação covalente, como definida aqui, podeser, por exemplo, uma ligação peptídica, que pode ser obtida pela expressãoda proteína quimérica da invenção como uma proteína de fusão. Proteínasde fusão, como descritas aqui, podem ser formadas e usadas de maneirasanálogas ou prontamente adaptáveis a partir de técnicas de DNA recombi-nante, como descrito abaixo. Entretanto, ambos os domínios também podemser ligados através de cadeias laterais ou podem ser ligados por uma porçãoquímica ligante.

O primeiro e/ou segundo domínios do peptídeo quimérico da in-venção podem ocorrer em uma ou mais cópias no peptídeo quimérico dainvenção. Se ambos os domínios estão presentes em uma única cópia, oprimeiro domínio pode estar ligado tanto a terminação N quanto C do segun-do domínio. Se estiver presente em múltiplas cópias, o primeiro e segundodomínios podem estar arranjados em qualquer ordem possível. Por exemplo,o primeiro domínio pode estar presente no peptídeo quimérico da invençãoem um número múltiplo de cópias, por exemplo, em duas, três ou mais có-pias, que estão arrumadas preferivelmente em ordem consecutiva. Então, osegundo domínio pode estar presente em uma única cópia que ocorre naterminação N ou C da seqüência que compreende o primeiro domínio. Alter-nativamente, o segundo domínio pode estar presente em um número múlti-plo de cópias, por exemplo, em duas, três ou mais cópias, e o primeiro do-mínio pode estar presente em uma única cópia. De acordo com ambas asalternativas, o primeiro e segundo domínios podem ocupar qualquer lugarem um arranjo consecutivo. Arranjos exemplares são mostrados a seguir:por exemplo, primeiro domínio - primeiro domínio - primeiro domínio - se-gundo domínio; primeiro domínio - primeiro domínio - segundo domínio -primeiro domínio; primeiro domínio - segundo domínio - primeiro domínio -primeiro domínio; ou, por exemplo, segundo domínio - primeiro domínio -primeiro domínio - primeiro domínio. É bem-compreendido por uma pessoaversada que esses exemplos são apenas para fins ilustrativos e não devemlimitar o escopo da invenção a eles. Assim, o número de cópias e o arranjopodem ser variados como definido inicialmente.

Preferivelmente, o primeiro e segundo domínios podem estarligados diretamente um ao outro sem nenhum ligante. Alternativamente, elespodem estar ligados um com o outro através de uma seqüência ligante quecompreende 1 a 10, preferivelmente 1 a 5 aminoácidos. Aminoácidos queformam a seqüência ligante são preferivelmente selecionados entre glicinaou prolina como resíduos de aminoácidos. Mais preferivelmente, o primeiro esegundo domínio(s) podem estar separados um do outro por uma dobradiça dedois, três ou mais resíduos de prolina entre o primeiro e segundo domínios.

O peptídeo quimérico da invenção como definido acima, com-preendendo pelo menos um primeiro e pelo menos um segundo domínio,pode ser composto por L-aminoácidos, D-aminoácidos ou uma combinaçãode ambos. Nesse, cada domínio (assim como os Iigantes usados) pode sercomposto de L-aminoácidos, D-aminoácidos ou uma combinação de ambos(por exemplo, D-TAT e L-IB1(s) ou L-TAT e D-IB1(s), etc.). Preferivelmente,o peptídeo quimérico da invenção compreende pelo menos 1, preferivelmen-te pelo menos 3, mais preferivelmente pelo menos 6 e ainda mais preferi-velmente pelo menos 10 L-aminoácidos e/ou D-aminoácidos, em que D- e L-aminoácidos podem estar arranjados no peptídeo quimérico da invenção emforma de blocos ou não, ou de uma maneira alternada.De acordo com uma modalidade específica o peptídeo quiméricoda invenção compreende ou consiste em peptídeos quiméricos de L-aminoácidos de acordo com o peptídeo genérico L-TAT-IB [NH2-Xnb-RKKR-RQRRR-Xnb-Xna-RPTTLXLXXXXXXXQD-Xnb-COOH, SEQ ID NO: 10], em que X, Xn β Xn são preferivelmente como definido acima. Mais preferivel-mente, o peptídeo quimérico da invenção compreende ou consiste no peptí-deo quimérico de L-aminoácidos L-TAT-IB1 [NH2-GRKKRRQRRRPPRPKR-PTTLNLFPQVPRSQD-COOH, SEQ ID NO: 9].

De acordo com uma modalidade específica alternativa o peptí- deo quimérico da invenção compreende ou consiste em peptídeos quiméri-cos de D-aminoácidos dos peptídeos quiméricos de L-aminoácidos descritosacima. Exemplares de peptídeos quiméricos D retroinversos de acordo coma presente invenção são, por exemplo, o peptídeo genérico D-TAT-IB [NH2-Xnb-DQxxxxxXXLXLTTPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKR-Xnb-COOH, SEQ ID NO: 12]. Aqui, X, Xna e Xnb são preferivelmente como definidos acima (preferivel-mente representando D-aminoácidos). Mais preferivelmente, o peptídeoquimérico da invenção compreende ou consiste em peptídeos quiméricos deD-aminoácidos de acordo com o peptídeo TAT-IB1 [NH2-DQSRPVQPFL-NLTTPRKPRPPRRRQRRKKRG-COOH, SEQ ID NO: 11], Entretanto, a por- ção Iigante do primeiro e segundo domínios (ao invés de PP) pode ser com-posta por Xna - Xnb que são como definidos acima. Em particular, o(s) segun-do(s) domínio(s) da SEQ ID NO: 11, eventualmente com -Xna-Xnb- ao invésde (PP), pode(m) ser deletado(s) nas suas terminações N ou C por 1, 2, 3, 4ou 5 aminoácidos. Em outra modalidade preferida, o primeiro domínio daSEQ ID NO: 11 pode ser deletado em suas terminações N ou C por 1 ou 2aminoácidos. Essa(s) deleção(ões) pode(m) ser combinada(s) com a(s) de-leção(ões) descrita(s) para os resíduos de aminoácidos das terminações dosegundo domínio. Conseqüentemente, variantes preferidas de SEQ IDNO: 11 são, por exemplo, as seguintes seqüências com deleções do segun-do domínio em sua(s) terminação(ões) N e/ou C: QSRPVQPFLNLTTPRK-PR-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG, SRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKK-RG, RPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG, PVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG1 ou VQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG ou,respectivamente, DQSRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG, DQS-RPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG1 DQSRPVQPFLNLTTPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG1 DQSRPVQPFLNLTTP-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG, DQS-RPVQPFLNLTT-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG, ou QSRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG1 SRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG, S-RPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG, RPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG, RPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG ou PVQPFLN-LTTP-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG. Modalidades preferidas que contêm deleçõesmeramente na(s) terminação(ões) do primeiro domínio são: QSRPVQPFLN-LTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKR, QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RR-RQRRKK, QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRQRRKKRG, QSRPVQPFLN-LTTPRKPR-Xna-Xnb-RQRRKKRG, QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRQR-RKKR, QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RQRRKKR, QSRPVQPFLNLTT-PRKPR-Xna-Xnb-RQRRKK. Exemplos de combinações de deleções no primeiroe segundo domínios são: QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKR,SRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKR, RPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKR, PVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKR, ou VQP-FLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKR ou, respectivamente, DQSRPVQP-FLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRRQRRKKR, DQSRPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RR-RQRRKKR, DQSRPVQPFLNLTTPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKR, DQSRPVQPFLN-LTTP-Xna-Xnb-RRRQRRKKR, DQSRPVQPFLNLTT-Xna-Xnb-RRRQRRKKR, ouQSRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRRQRRKKR, SRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRRQRRKKR, SRPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRRQRRKKR, RPVQPFL-NLTTPRKP-Xna-Xnb-RRRQRRKKR1 RPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRRQRRK-KR ou PVQPFLNLTTP-Xna-Xnb-RRRQRRKKR1 QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKK, SRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKRG, RPVQP-FLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKK1 PVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQR-RKK1 ou VQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRRQRRKK ou, respectivamente, DQS-RPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRRQRRKK, DQSRPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRRQRRKK, DQSRPVQPFLNLTTPR-Xna-Xnb-RRRQRRKK, DQSRPVQPFL-NLTTP-Xna-Xnb-RRRQRRKK, DQSRPVQPFLNLTT-Xna-Xnb-RRRQRRKK, ouQSRRVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRRQRRKK, SRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRRQRRKK1 SRPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRRQRRKK, RPVQPFLN-LTTPRKP-Xna-Xnb-RRRQRRKK, RPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRRQRRKK ouPVQPFLNLTTP-Xna-Xnb-RRRQRRKK, QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRQRRKKR, SRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRQRRKKR, RPVQPFLN-LTTPRKPR-Xna-Xnb-RRQRRKKR1 PVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRQRRKKR,ou VQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRQRRKKR ou, respectivamente, DQS-RPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRQRRKKR, DQSRPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRQRRKKR, DQSRPVQPFLNLTTPR-Xna-Xnb-RRQRRKKR, DQSRPVQP-FLNLTTP-Xna-Xnb-RRQRRKKR, DQSRPVQPFLNLTT-Xna-Xnb-RRQRRKKR, ouQSRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRQRRKKR, SRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRQRRKKRG, SRPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRQRRKKRG, RPVQP-FLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRQRRKKRG, RPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-

RRQRRKKRG ou PVQPFLNLTTP-Xna-Xnb-RRQRRKKRG, QSRPVQPF-LNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRQRRKKRG, SRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRQ-RRKKRG, RPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRQRRKKRG, PVQPFLNLTT-PRKPR-Xna-Xnb-RRQRRKKRG1 ou VQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RRQRRKKRGou, respectivamente, DQSRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRQRRKKRG, DQ-SRPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRQRRKKRG, DQSRPVQPFLNLTTPR-Xna-Xnb-RRQRRKKRG, DQSRPVQPFLNLTTP-Xna-Xnb-RRQRRKKRG, DQSRPV-QPFLNLTT-Xna-Xnb-RRQRRKKRG, ou QSRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRQ-RRKKRG, SRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRQRRKKRG, SRPVQPFLNLTT-PRK-Xna-Xnb-RRQRRKKRG, RPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RRQRRKKRG,RPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RRQRRKKRG ou PVQPFLNLTTP-Xna-Xnb-RR-QRRKKRG, QSRPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RQRRKKRG, SRPVQPFLNL-TTPRKPR-Xna-Xnb-RQRRKKRG, RPVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RQRRKK-RG, PVQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RQRRKKRG, ou VQPFLNLTTPRKPR-Xna-Xnb-RQRRKKRG ou, respectivamente, DQSRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RQRRKKRG, DQSRPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RQRRKKRG, DQSRPVQP-FLNLTTPR-Xna-Xnb-RQRRKKRG1 DQSRPVQPFLNLTTP-Xna-Xnb-RQRRKKRG,DQSRPVQPFLNLTT-Xna-Xnb-RQRRKKRG, ou QSRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RQRRKKRG1 SRPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RQRRKKRG, SRPVQP-FLNLTTPRK-Xna-Xnb-RQRRKKRG1 RPVQPFLNLTTPRKP-Xna-Xnb-RQRRK-KRG, RPVQPFLNLTTPRK-Xna-Xnb-RQRRKKRG ou PVQPFLNLTTP-Xna-Xnb-RQRRKKRG. Novamente, quanto menores forem os peptídeos, menor suatoxicidade celular (inespecífica). Entretanto, os peptídeos devem manter suafunção biológica, isto é sua permeabilidade pela membrana celular (primeirodomínio) e sua função inibidora de JNK (segundo domínio).

O primeiro e segundo domínio(s) do peptídeo quimérico da in-venção como definido acima podem ser ligados um ao outro por acoplamen-to químico ou bioquímico realizado de qualquer maneira conhecida na técni-ca, por exemplo, pelo estabelecimento de uma ligação peptídica entre o pri-meiro e segundo domínio(s), por exemplo pela expressão do primeiro e se-gundo domínio(s)como uma proteína de fusão, ou por exemplo por reticula-ção do primeiro e segundo domínio(s)do peptídeo quimérico da invenção.

Vários métodos de reticulação química são inespecíficos, isto é,eles não se direcionam ao ponto de acoplamento de qualquer sítio em parti-cular no polipeptídeo de transporte ou macromolécula de carga. Como umresultado, o uso de agentes de reticulação inespecíficos pode atacar sítiosfuncionais ou sítios de bloqueio estericamente ativos, tornando as proteínasconjugadas biologicamente inativas. Assim, preferivelmente tais métodos dereticulação são usados, o que permite um acoplamento mais específico doprimeiro e segundo domínio(s).

Uma maneira de aumentar a especificidade do acoplamento éum acoplamento químico direto a um grupo funcional presente apenas umavez ou poucas vezes em um ou ambos o primeiro e segundo domínios a se-rem reticulados. Por exemplo, cisteína que é o único aminoácido de proteínaque contém um grupo tiol, ocorre em várias proteínas apenas poucas vezes.Também, por exemplo, se um polipeptídeo não contém resíduos de lisina,um reagente de reticulação específico para aminas primárias será seletivopara a terminação amina daquele polipeptídeo. A utilização bem-sucedidadessa abordagem para aumentar a especificidade de acoplamento requerque o polipeptídeo tenha resíduos adequadamente raros e reativos em áreasda molécula que podem ser alteradas sem perda da atividade biológica damolécula.

Resíduos de cisteína podem ser substituídos quando eles ocor-rem em partes de uma seqüência de polipeptídeo onde sua participação emuma reação de reticulação poderia provavelmente interferir de outra formacom a atividade biológica. Quando um resíduo de cisteína é substituído, étipicamente desejável minimizar as alterações resultantes no enovelamentodo polipeptídeo. Alterações no enovelamento do polipeptídeo são minimiza-das quando a substituição é quimicamente ou estericamente similar à cisteí-na. Por essas razões, a serina é preferida como substituinte para cisteína. Como demonstrado nos exemplos abaixo, um resíduo de cisteína pode serintroduzido em uma seqüência de aminoácido de um polipeptídeo para finsde reticulação.

Quando um resíduo de cisteína é introduzido, a introdução pró-xima ou na terminação amina ou carboxila é preferida. Métodos convencio- nais estão disponíveis para tais modificações de seqüência de aminoácidos,em que o polipeptídeo de interesse é produzido por síntese química ou atra-vés de expressão de DNA recombinante.

O acoplamento do primeiro e segundo domínio(s) também podeser obtido através de um agente de acoplamento ou de conjugação. Existem vários reagentes de reticulação intermolecular que podem ser utilizados (vi-de, por exemplo, Means & Feeney, CHEMICAL MODIFICATION OF PRO-TEINS, Holden-Day, 1974, pp. 39-43). Dentre esses reagentes estão, porexemplo, propionato de N-succinimidil 3-(2-piridilditio) (SPDP) ou N,N'-(1,3-fenileno) bismaleimida (ambos os quais são altamente específicos para gru- pos de sulfidrila e formam ligações irreversíveis); N, N'-etileno-bis-(iodoacetamida) ou outro reagente que tem 6 a 11 ligações de metileno decarbono (que são relativamente específicas para grupos de sulfidrila); e 1,5-diflúor-2,4-dinitrobenzeno (que forma ligações irreversíveis com grupos ami-no e tirosina). Outros reagentes de reticulação úteis para esse propósito in-cluem: ρ,ρ'-diflúor-m, m'-dinitrodifenilsulfona que forma reticulações irrever-síveis com grupos amina e fenólicos; adipimidato de dimetila (que é específi-co para grupos amino); fenol-1,4 dissulfonilcloreto (que reage principalmentecom grupos amino); hexametilenodiisocianato ou diisotiocianato, ou azofenil-p-diisocianato (que reage principalmente com grupos amina); glutaraldeído(que reage com várias cadeias laterais diferentes) e disdiazobenzidina (quereage primariamente com tirosina e histidina).

Reagentes de reticulação podem ser homobifuncionais, isto é,que tem dois grupos funcionais que sofrem a mesma reação. Um reagentede reticulação homobifuncional preferido é bismaleimidohexano ("BMH").BMH contém dois grupos funcionais de maleimida, que reagem especifica-mente com compostos que contem sulfidrila sob condições moderadas (pH6,5 - 7,7). Os dois grupos de maleimida estão conectados por uma cadeiade hidrocarboneto. Portanto, BMH é útil para reticulação irreversível de poli-peptídeos que contêm resíduos de cisteína.

Reagentes de reticulação também podem ser heterobifuncionais.Agentes de reticulação heterobifubcionais têm dois grupos funcionais dife-rentes, por exemplo um grupo que reage com amina e um grupo que reagecom tiol, que irão reticular duas proteínas que tem aminas e tióis livres, res-pectivamente.

Exemplos de agentes de reticulação heterobifuncionais são 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-l-carboxilato de succinimidila ("SMCC"), és-ter de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida ("MBS"), e butirato de suc-cinimida 4-(p-maleimidofenil) ("SMPB"), um análogo de cadeia estendida deMBS. O grupo succinimidila desses reticuladores reage com uma amina pri-mária e a maleimida que reage com tiol forma uma ligação covalente com otiol de um resíduo de cisteína.

Reagentes de reticulação geralmente têm pouca solubilidade emágua. Uma porção hidrofílica, tal como um grupo sulfonato, pode ser adicio-nada ao reagente de reticulação para melhorar sua solubilidade em água.Com relação a isso, SuIfo-MBS e SuIfo-SMCC são exemplos de reagentesde reticulação modificados quanto a solubilidade em água, que podem serusados de acordo com a presente invenção.

Muitos reagentes de reticulação produzem um conjugado que éessencialmente não clivável sob condições celulares. Entretanto, alguns re-agentes de reticulação contêm uma ligação covalente, tal como um dissulfe-to, que é clivável sob condições celulares. Por exemplo, reagente de Traut,ditiobis(succinimidilpropionato) ("DSP") e N-succinimidila 3-(2-piridilditio)pro-pionato de n-succinimidila ("SPDP") são reticuladores cliváveis bem-conhecidos. O uso de um reagente de reticulação clivável permite que a por-ção de carga se separe do polipeptídeo de transporte após a liberação nacélula-alvo. Ligação de dissulfeto direta também pode ser útil.

Vários reagentes de reticulação, incluindo aqueles discutidosacima estão disponíveis comercialmente. Instruções detalhadas para seuuso são facilmente disponíveis a partir de fornecedores comerciais. Umareferencia geral sobre reticulação de proteína e preparação de conjugado é:Wong, CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING,CRC Press (1991).

A reticulação química pode incluir o uso de braços espaçadores.Braços espaçadores fornecem flexibilidade intramolecular ou ajustam as dis-tâncias intramoleculares entre porções conjugadas e dessa maneira podemajudar na preservação da atividade biológica. Um braço espaçador pode es-tar na forma de uma porção polipeptídica que inclui aminoácidos espaçado-res, por exemplo, prolina. Alternativamente, um braço espaçador pode serparte do reagente de reticulação, tal como em "SPDP de cadeia longa" (Pi-erce Chem. Co., Rockford, IL., cat. No. 21651 H).

Além disso, variantes, fragmentos ou derivados de um dos pep-tídeos quiméricos descritos acima são descritos aqui. Com relação a frag-mentos e variantes geralmente é referida a definição dada acima para se-qüências inibidoras de JNK.

Particularmente, no contexto da presente invenção, "uma varian-te de um peptídeo quimérico" é preferivelmente uma seqüência derivada dequalquer uma das seqüências de acordo com SEQ ID NOs: 9 a 12, em que avariante quimérica compreende alterações de aminoácido dos peptídeosquiméricos da invenção de acordo com SEQ ID NOs: 9 a 12. Tais alteraçõescompreendem tipicamente 1 a 20, preferivelmente 1 a 10 e mais preferivel-mente 1 a 5 substituições, adições e/ou deleções (levando a fragmentos) deaminoácidos de acordo com SEQ ID NOs: 9 a 12, em que o peptídeo quimé-rico alterado da invenção exibe uma identidade de seqüência com qualqueruma das seqüências de acordo com as SEQ ID Nos: 9, 10, 11 ou 12 de pelomenos cerca de 30%, 50%, 70%, 80%, ou 95%, 98%, ou ainda 99%. Preferi-velmente, essas variantes mantêm a atividade biológica do primeiro e se-gundo domínio conforme contido no peptídeo quimérico da invenção, isso é,a atividade de tráfego do primeiro domínio como descrito acima, e atividadedo segundo domínio para ligação de JNK e;ou inibição da ativação de pelomenos um fator de transcrição ativado por JNK.

Conseqüentemente, o peptídeo quimérico da invenção tambémcompreende fragmentos dos peptídeos quiméricos da invenção antes men-cionados, particularmente das seqüências de peptídeo quimérico da inven-ção de acordo com SEQ ID NOs: 9, 10, 11 ou 12. Dessa forma, no contextoda presente invenção, um "fragmento do peptídeo quimérico da invenção épreferivelmente uma seqüência derivada de qualquer uma das seqüênciasde acordo com SEQ ID NOs: 9, 10, 11 ou 12, em que o fragmento compre-ende pelo menos 4 aminoácidos contíguos de qualquer uma de SEQ IDNOs: 9, 10, 11 ou 12. Esse fragmento compreende preferivelmente uma ex-tensão que é suficiente para permitir reconhecimento específico de um epí- topo de qualquer uma das seqüências e transportar a seqüência para dentrodas células, núcleo ou uma localização adicional preferida. Ainda mais prefe-rivelmente, o fragmento compreende 4 a 18, 4 a 15 ou o mais preferivelmen-te 4 a 10 aminoácidos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 9, 10,11 ou 12. Fragmentos do peptídeo quimérico da invenção ainda podem ser de-finidos como uma seqüência que partilha uma identidade de seqüência comqualquer uma das seqüências de acordo com as SEQ ID NOs: 9, 10, 11 ou 12de pelo menos cerca de 30%, 50%, 70%, 80%, ou 95%, 98%, ou ainda 99%.

Finalmente, o peptídeo quimérico da invenção compreende tam-bém derivados dos peptídeos quiméricos da invenção antes mencionados,particularmente das seqüências de peptídeo quimérico da invenção de acor-do com as SEQ ID NOs: 9, 10, 11 ou 12.

Adicionalmente, a presente invenção refere-se a seqüências deácido nucléico que codificam seqüências inibidoras de JNK da invenção,peptídeos quiméricos da invenção ou seus fragmentos, variantes ou deriva-dos como definido acima. Um ácido nucléico adequado preferível que codifi-ca uma seqüência inibidora de JNK da invenção é escolhido a partir do ácidonucléico IB1 humano (No. de Acesso do GenBank (AF074091), o ácido nu-cléico IB1 de rato (No. de Acesso do GenBank AF108959) ou IB2 humano(No. de Acesso do GenBank AF218778).

Ácidos nucléicos que codificam as seqüências inibidoras de JNKou peptídeos quiméricos da invenção podem ser obtidos por qualquer méto-do conhecido na técnica (por exemplo, por amplificação por PCR usandoiniciadores sintéticos hibridizáveis com as terminações 3' e 5' da seqüênciae/ou por clonagem de um cDNA ou biblioteca genômica usando uma se-qüência de oligonucleotídeo específica para a dada seqüência de gene).

Adicionalmente, seqüências de ácidos nucléicos também sãodescritas aqui, que hibridizam sob condições estringentes com a fita apropri-ada que codifica uma seqüência inibidora de JNK da invenção (nativa) oupeptídeo quimérico como definido acima. Preferivelmente, tais seqüênciasde ácido nucléico compreendem pelo menos 6 ácidos nucléicos (contíguos)que tem uma extensão suficiente para permitir hibridização específica. Maispreferivelmente, tais seqüências de ácido nucléico compreendem 6 a 38,ainda mais preferivelmente 6 a 30 e o mais preferivelmente 6 a 20 ou 6 a 10ácidos nucléicos (contíguos).

"Condições estringentes" são dependentes da seqüência e se-rão diferentes em circunstâncias diferentes. Geralmente, condições estrin-gentes podem ser selecionadas para ser cerca de 5eC mais baixas do que oponto de fusão térmica (TM) para a seqüência específica em uma força tôni-ca e pH definidos. A TM é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) naqual 50% da seqüência alvo hibridiza com uma sonda perfeitamente parea-da. Tipicamente, condições estringentes serão aquelas nas quais a concen-tração de sal é de pelo menos 0,02 molar em pH 7 e a temperatura é de pelomenos 609C. Como outros fatores podem afetar a estringência de hibridiza-ção (incluindo, entre outros, composição de base e tamanho das fitas com-plementares), a presença de solventes orgânicos e a extensão do não pare-amento de base, a combinação de parâmetros é mais importante do que amedida absoluta de qualquer um.

"Condições de alta estringência" podem compreender o seguin-te, por exemplo: Etapa 1: Filtros contendo DNA são pré-tratados por 8 horasdurante a noite a 65QC em tampão composto de 6*SSC, Tris-HCI 50 mM (pH7,5), EDTA 1 mM, PVP 0,02%, Ficoll 0,02%, BSA 0,02%, e 500 pg/ml deDNA de esperma de salmão desnaturado. Etapa 2: Filtros são hibridizadospor 48 horas a 65QC, na mistura de pré-hibridização acima a qual é adicio-nado 100 mg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado e 5-20*106cpm de sonda marcada com 32P. Etapa 3: Filtros são lavados por 1 hora a37gC em uma solução que contem 2*SSC, PVP 0,01%, Ficoll 0,01%, e BSA0,01%. Isso é seguido por uma lavagem em 0,1*SSC a 509C por 45 minutos.Etapa 4: Filtros são autoradiografados. Outras condições de alta estringênciaque podem ser usadas são bem-conhecidas na técnica (vide, por exemplo,Ausubel et ai, (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, JohnWiley and Sons, NY; and Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, aLaboratory Manual, Stockton Press, NY).

"Condições de estringência moderada" podem incluir o seguinte:Etapa 1: Filtros contendo DNA são pré-tratados por 6 horas a 55SC em umasolução que contem 6*SSC, 5* solução de Denhardt, SDS 0,5% e 100 mg/mlde DNA de esperma de salmão desnaturado. Etapa 2: Filtros são hibridiza-dos por 18-20 horas a 559C na mesma solução com 5-20*106 cpm de sondamarcada com 32P adicionados. Etapa 3: Filtros são lavados a 37-C por 1 ho-ra em uma solução que contem 2*SSC, SDS 0,1% e então lavados duasvezes por 30 minutos a 609C em uma solução contendo 1*SSC e SDS 0,1%.Etapa 4: Filtros são secos e expostos para auto-radiografia. Outras condi-ções de estringência moderada que podem ser usadas são bem-conhecidasna técnica (vide, por exemplo, Ausubel et ai, (eds.), 1993, Current Protocolsin Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY; e Kriegler, 1990, GeneTransfer and Expression, a Laboratory Manual, Stockton Press, NY).

Finalmente, "condições de baixa estringência" podem incluir:Etapa 1: Filtros contendo DNA são pré-tratados por 6 horas a 40QC em umasolução contendo formamida 35%, SSC 5X, Tris-HCI 50 mM (pH 7,5), EDTA5 mM, PVP 0,1%, Ficoll 0,1%, BSA 1% e 500 pg/ml de DNA de esperma desalmão desnaturado. Etapa 2: Filtros são hibridizados por 18-20 horas a40-C na mesma solução com a adição de PVP 0,02%, Ficoll 0,02%, BSA0,2%, 100 pg/ml de DNA desnaturado de esperma de salmão, dextrano 10%(p/v) e 5-20*106 cpm de sonda marcada com 32P. Etapa 3: Filtros são lava-dos por 1,5 hora a 55QC em uma solução contendo SSC 2X, Tris-HCI 25 mM(pH 7,4), EDTA 5 mM e SDS 0,1%. A solução de lavagem é trocada por so-lução nova e incubada por 1,5 hora adicional a 60-C. Etapa 4: Filtros sãosecos e expostos para auto-radiografia. Se necessário, os filtros são lavadosuma terceira vez a 65-68-C e reexpostos ao filme. Outras condições de bai-xa estringência que podem ser usadas são bem-conhecidas na técnica (porexemplo, como empregado para hibridizações entre espécies). Vide, por e-xemplo, Ausubel et ai, (eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECU-LAR BIOLOGY, John Wiley and Sons, NY; e Kriegler, 1990, GENE TRANS-FER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY.

As seqüências de ácido nucléico fornecidas pela presente inven-ção podem ser usadas para expressar peptídeos da invenção, isto é, umaseqüência inibidora de JNK da invenção ou um peptídeo quimérico da inven-ção para análise, caracterização ou uso terapêutico; como marcadores paratecidos nos quais os peptídeos (da invenção) correspondentes são preferen-cialmente expressos (tanto constitutivamente quanto em um estágio particu-lar de diferenciação ou desenvolvimento do tecido ou em estados de doença).Outros usos para o ácido nucléico incluem, por exemplo, marcadores de pesomolecular em análise baseada em eletroforese em gel de ácidos nucléicos.

De acordo com uma modalidade adicional da presente invenção,vetores de expressão também são fornecidos para expressão recombinantede uma ou mais seqüências inibidoras de JNK da invenção e/ou peptídeosquiméricos como definido acima. O termo "vetor de expressão" é usado aquipara designar DNA ou RNA circular ou linear que é tanto de fita dupla quantode fita simples. Ele compreende ainda pelo menos um ácido nucléico da in-venção a ser transferido para uma célula hospedeira ou para um organismohospedeiro unicelular ou multicelular. O vetor de expressão da invençãocompreende preferivelmente um ácido nucléico da invenção que codifica aseqüência inibidora de JNK da invenção ou um fragmento ou variante dessa, ou o peptídeo quimérico da invenção ou um fragmento ou variante desse.Adicionalmente, um vetor de expressão de acordo com a presente invençãocompreende preferivelmente elementos apropriados para suportar a expres-são incluindo vários elementos regulatórios, tais como intensificado-res/promotores de fontes viral, bacteriana, de planta, mamíferos e outrasfontes eucarióticas que direcionam a expressão do polinucleotídeo inseridona célula hospedeira, tais como isolantes, elementos limítrofes, LCRs (porexemplo, descrito por Blackwood & Kadonaga (1998), Science 281, 61-63)ou regiões de acoplamento de matriz/esqueleto (por exemplo, descrito porLi, Harju & Peterson, (1999), Trends Genet. 15, 403-408). Em algumas mo-dalidades, os elementos regulatórios são heterólogos (isto é, não o promotordo gene nativo). Alternativamente, os sinais de transcrição e tradução ne-cessários também podem ser fornecidos pelo promotor nativo para os genese/ou suas regiões flanqueadoras.

O termo "promotor" como usado aqui refere-se a uma região doDNA que funciona para controlar a transcrição de um ou mais seqüências deácido nucléico da invenção, e que é estruturalmente identificado pela pre-sença de um sítio de ligação para RNA polimerase dependente de DNA e deoutras seqüências de DNA, que interagem para regular a função do promo-tor. Um fragmento de promoção de expressão funcional de um promotor é uma seqüência promotora encurtada ou truncada que retém a atividade deum promotor. A atividade de promotor pode ser medida por qualquer ensaioconhecido na técnica (vide por exemplo, Wood, de Wet, Dewji, & DeLuca,(1984), Biochem Biophys. Res. Commun. 124, 592-596; Seliger and McEI-roy, (1960), Arch. Biochem. Biophys. 88, 136-141) ou disponibilizado comer-cialmente por Promega®).

Uma "região intensificadora" como usada no vetor de expressãoda invenção, refere-se tipicamente a uma região de DNA que funciona paraaumentar a transcrição de um ou mais genes. Mais especificamente, o termo"intensificador", como usado aqui, é um elemento regulatório de DNA queintensifica, aumenta, aprimora ou melhora a expressão de um gene inde-pendentemente de sua localização e orientação com relação ao gene a serexpresso e pode estar intensificando, aumentando, aprimorando ou melho-rando a expressão de mais de um promotor.

Seqüências promotoras/intensificadoras como definidas acimapara o vetor de expressão da invenção podem utilizar seqüências regulató-rias de planta, animal, inseto ou fungo. Por exemplo, elementos promoto-res/intensificadores podem ser usados a partir de levedura e outros fungos(por exemplo o promotor GAL4, o promotor da álcool desidrogenase, o pro-motor de fosfoglicerol quinase, o promotor de fosfatase alcalina). Alternati-vamente, ou além disso, eles podem incluir regiões de controle transcricionalde animal, por exemplo, (i) a região de controle do gene da insulina ativadentro das células β pancreáticas (vide, por exemplo Hanahan, etal., 1985.Nature 315: 115-122); (ii) a região de controle do gene da imunoglobulinaativa dentro das células linfóides (vide, por exemplo Grosschedl, etal., 1984,Cell 38: 647-658); (iii) a região de controle do gene da albumina ativa dentrodo fígado (vide, por exemplo Pinckert, et al., 1987. Genes and Dev 1: 268-276); (iv) a região de controle do gene da proteína básica da mielina ativadentro das células de oligodendrócitos do cérebro (vide, por exemplo Rea-dhead, etal., 1987, Cell 48: 703-712); e (v) a região de controle do gene dohormônio de liberação da gonadotropina ativa dentro do hipotálamo (vide,por exemplo, Mason, etal., 1986, Science 234: 1372-1378), e similares.

Além disso, o vetor de expressão da invenção pode compreen-der um marcador de amplificação. Esse marcador de amplificação pode serselecionado do grupo que consiste em, por exemplo, adenosina desaminase(ADA), diidrofolato redutase (DHFR), gene de resistência a múltiplos fárma-cos (MDR), ornitina decarboxilase (ODC) e resistência a N-(fosfonoacetil)-L-aspartato (CAD). A amplificação do gene que codifica as proteínas acimadefinidas, isto é, a proteína de interesse (POI) e/ou a proteína de fusão dainvenção, permite aumentar o nível de expressão dessas proteínas após aintegração do vetor em uma célula (Kaufman et al. (1985), Mol. Cell Biol. 5,1750-1759).

Exemplares de vetores de expressão ou seus derivados ade-quados para a presente invenção incluem particularmente, por exemplo, ví-rus humanos ou de animais (por exemplo, vírus da vacínia ou adenovírus);vírus de insetos (por exemplo, baculovírus); vetores de levedura; vetores debacteriófagos (por exemplo, fago lambda); vetores de plasmídeo e vetoresde cosmídeo.

A presente invenção fornece adicionalmente uma variedade desistemas vetor hospedeiro, que podem ser utilizados para expressar a(s)seqüência(s) codificante(s) de peptídeo dos ácidos nucléicos da invençãocomo definido acima. Esses incluem, mas não se limitam a: (i) sistemas decélulas de mamífero que são infectadas com o vírus da vacínia, adenovíruse similares; (ii) sistemas de células de inseto infectadas com baculovírus esimilares; (iii) levedura contendo vetores de levedura ou (iv) bactéria trans-formada com bacteriófago, DNA, plasmídeo de DNA ou cosmídeo de DNA.Dependendo do sistema vetor hospedeiro utilizado, qualquer um de várioselementos de transcrição e tradução adequados pode ser usado.

Preferivelmente, pode ser selecionada uma linhagem de célulahospedeira, adequada para tal sistema vetor de hospedeiro, que modula aexpressão de seqüências de interesse ou modifica ou processa peptídeosexpressos codificados pelas seqüências da maneira específica desejada.Além disso, a expressão a partir de certos promotores pode ser intensificadana presença de certos indutores em uma linhagem hospedeira selecionada;assim facilitando o controle da expressão de um peptídeo geneticamentemanipulado. Além disso, células hospedeiras diferentes possuem mecanis-mos característicos e específicos para o processamento e modificação tra-ducional e pós-traducional (por exemplo, glicosilação, fosforilação e simila-res) de peptídeos expressos. Linhagens celulares ou sistemas de hospedei-ros apropriados podem então ser escolhidos para assegurar que a modifica-ção e processamento desejados do peptídeo estranho sejam obtidos. Porexemplo, a expressão de um peptídeo dentro de um sistema bacteriano po-de ser usada para produzir um peptídeo de núcleo não-glicosilado; enquantoque a expressão dentro de células de mamíferos assegura a glicosilação"nativa" de um peptídeo heterólogo.

A presente invenção ainda fornece anticorpos direcionados con-tra as seqüências inibidoras de JNK da invenção e/ou peptídeos quiméricosda invenção. Além disso, são fornecidos meios eficazes para a produção deanticorpos específicos para seqüências inibidoras de JNK de acordo com apresente invenção, ou para peptídeos quiméricos da invenção contendo talseqüência inibidora.

De acordo com a invenção, seqüências inibidoras de JNK e/oupeptídeos quiméricos da invenção, assim como, fragmentos, variantes, ouderivados dessas, podem ser utilizados como imunógenos para gerar anti-corpos que se ligam especificamente a esses componentes de peptídeo.Tais anticorpos incluem, por exemplo, policlonal, monoclonal, quiméricos,cadeia única, fragmentos Fab e biblioteca de expressão de Fab. Em umamodalidade específica a presente invenção fornece anticorpos para peptí-deos quiméricos ou para seqüências inibidoras de JNK como definido acima.Vários procedimentos conhecidos dentro da técnica podem ser usados paraa produção desses anticorpos da invenção.

Como forma de exemplo, vários animais hospedeiros podem serimunizados para a produção de anticorpos policlonais por injeção com qual-quer peptídeo quimérico ou seqüência inibidora de JNK da invenção comodefinido acima. Vários adjuvantes podem ser usados dessa forma para au-mentar a resposta imunológica que incluem, mas não são limitados a, adju-vante de Freund (completo e incompleto), géis minerais (por exemplo, hidró-xido de alumínio), substâncias ativas na superfície (por exemplo, lisolecitina,polióis plurônicos, poliânions, peptídeos, emulsões oleosas, dinitrofenol,etc.), CpG, polímeros, Pluronics, e adjuvantes humanos tais como, BaciloCalmette-Guerin e Corynebacterium parvum.

Para a preparação de anticorpos monoclonais direcionados con-tra um peptídeo quimérico ou seqüência inibidora de JNK da invenção comodefinido acima, qualquer técnica que forneça a produção de moléculas deanticorpo por cultura de linhagem celular contínua pode ser utilizada. Taistécnicas incluem, mas não são limitadas a, técnica de hibridoma (vide, Ko-hler & Milstein, 1975. Nature 256: 495-497); a técnica de trioma; a célula dehibridoma de célula B humana (vide Kozbor, et al., 1983, Immunol Today 4: 72) e a técnica de hibridoma de EBV para produzir anticorpos monoclonaishumanos (vide Cole, et ai, 1985. In: Monoclonal Antibodies and CancerThe-rapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Anticorpos monoclonais humanos podemser utilizados na prática da presente invenção e podem ser produzidos pelouso de hibridomas humanos (vide, Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030) ou pela transformação de células B humanas com oVírus Epstein Barr in vitro (vide, Cole, et al., 1985. Irr. Monoclonal Antibodiesand CancerTherapy (Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96).

De acordo com a invenção podem ser adaptadas técnicas para aprodução de anticorpos de cadeia única específicos para as seqüências ini-bidoras de JNK e/ou peptídeos quiméricos da invenção (vide, por exemplo,Patente U.S. No. 4.946.778). Além disso, podem ser adaptados métodospara construção de bibliotecas de expressão de Fab (vide, por exemplo, Hu-se et al., 1989. Science 246: 1275-1281) para permitir identificação rápida eeficaz de fragmentos Fab monoclonais com a especificidade desejada para essas seqüências inibidoras de JNK e/ou peptídeos quiméricos da invenção,como definido acima. Anticorpos não humanos podem ser "humanizados"por procedimentos bem-conhecidos na técnica (vide, por exemplo, PatenteU.S. No. 5.225.539). Fragmentos de anticorpo que contêm os idiotipos paraseqüências inibidoras de JNK e/ou peptídeos quiméricos da invenção podem ser produzidos por procedimentos bem-conhecidos na técnica incluindo, porexemplo, (i) um fragmento F(ab')2 produzido por digestão com pepsina deuma molécula de anticorpo; (ii) um fragmento Fab gerado pela redução deligações dissulfeto de um fragmento F(ab')2; (iii) um fragmento Fab geradopelo tratamento da molécula de anticorpo com papaína e um agente redutor e (iv) fragmentos Fv.

Em uma modalidade dessa invenção, métodos para rastreamen-to de anticorpos da invenção que possuem a especificidade desejada inclu-em, mas não são limitados a, ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELI-SA) e outros procedimentos mediados imunologicamente conhecidos natécnica. Em uma modalidade específica, a seleção de anticorpos que sãoespecíficos para um epítopo em particular de uma seqüência inibidora deJNK e/ou peptídeo quimérico da invenção (por exemplo, um fragmento des-se que compreende tipicamente uma extensão de 5 a 20, preferivelmente 8a 18 e o mais preferivelmente 8 a 11 aminoácidos) é facilitada pela geraçãode hibridomas que se ligam ao fragmento de uma seqüência inibidora deJNK da invenção e/ou peptídeo quimérico da invenção que possui tal epíto-po. Esses anticorpos que são específicos para um epítopo como definidoacima também são fornecidos aqui.

Os anticorpos da invenção podem ser usados em métodos co-nhecidos dentro da técnica que refere-se à localização e/ou quantificação deuma seqüência inibidora de JNK da invenção (e/ou que corresponde a umpeptídeo quimérico da invenção), por exemplo, para uso na medição dosníveis do peptídeo dentro de amostras fisiológicas apropriadas, para uso emmétodos de diagnostico, ou para uso em visualização por imagem do peptí-deo e similares.

As seqüências inibidoras, peptídeos quiméricos e/ou ácidos nu-cléicos de JNK da invenção podem ser formulados em composições farma-cêuticas, também abrangidas aqui. As composições podem compreender,além de uma dessas substâncias, um excipiente, veículo, tampão, estabili-zante ou outros materiais farmaceuticamente aceitáveis bem-conhecidos dosversados na técnica. Tais materiais devem ser atóxicos e não devem interfe-rir com a eficácia do ingrediente ativo. A natureza precisa do veículo ou outromaterial pode depender da via de administração, por exemplo, vias, oral,intravenosa, cutânea, ou subcutânea, nasal, intramuscular, intraperitoneal oupor emplastro.

Composições farmacêuticas para administração oral podem serem forma de comprimido, cápsula, pó ou líquido. Um comprimido pode inclu-ir um veículo sólido tal como gelatina ou um adjuvante. Composições farma-cêuticas líquidas geralmente incluem um veículo líquido tal como água, pe-tróleo, óleos animais ou vegetais, óleo mineral ou óleo sintético. Soluçãosalina fisiológica, dextrose ou outra solução de sacarídeo, ou glicóis tais co-mo etileno glicol, propileno glicol, ou polietileno glicol podem, ser incluídos.

Para injeção intravenosa, cutânea, ou subcutânea, ou injeção nolocal de afecção, o ingrediente ativo estará na forma de uma solução aquosaparenteralmente aceitável que é livre de pirogênio, e tem pH, isotonicidade eestabilidade aceitáveis. Aqueles versados na técnica serão capazes de pre-parar soluções adequadas usando, por exemplo, veículos isotônicos, taiscomo Injeção de Cloreto de Sódio, Injeção de Ringer, Injeção de Ringer Lac-tato. Conservantes, estabilizantes, tampões, antioxidantes e /ou outros aditi-vos podem ser incluídos, como necessário. Quer seja um polipeptídeo, pep-tídeo, ou molécula de ácido nucléico, ou outro composto farmaceuticamenteútil de acordo com a presente invenção que for para ser dado a um indiví-duo, a administração será preferivelmente uma "quantidade profilaticamenteeficaz" ou uma "quantidade terapeuticamente eficaz" (como for o caso), issosendo suficiente para mostrar benefício para o indivíduo. A quantidade realadministrada, a taxa e curso de tempo de administração, dependerão da na-tureza e severidade do que está sendo tratado.

Prescrição de tratamento, por exemplo, decisões sobre a dosa-gem etc., está dentro da responsabilidade do clínico geral ou outros médi-cos, e tipicamente leva em consideração a desordem a ser tratada, a condi-ção do paciente individual, o local de liberação, o método de administração eoutros fatores conhecidos dos médicos. Exemplos das técnicas e protocolosmencionados acima podem ser encontrados em REMINGTON1S PHARMA-CEUTICAL SCIENCES, 16â edição Osol, A. (ed), 1980.

Alternativamente, terapias direcionadoras podem ser usadaspara liberar as seqüências inibidoras de JNK, peptídeos quiméricos e ácidosnucléicos da invenção mais especificamente a certos tipos de célula, pelouso de sistemas direcionadores tais como um anticorpo (direcionador) ouligantes específicos de células. Anticorpos usados para direcionar são tipi-camente específicos para proteínas da superfície de células associadas comqualquer uma das doenças como definido abaixo. Como forma de exemplo,esses anticorpos podem ser direcionados para anticorpos de superfície celu-lar tais como proteínas de superfície associadas à célula B tais como proteí-na DR de MHC classe II, CD18 (cadeia beta de LFA-1), CD45RO, CD40 ouBgp95, ou proteínas de superfície celular selecionadas a partir de, por e- xemplo, CD2, CD2, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD10, CD13, CD16, CD19,CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD30, CD33, CD34, CD38, CD39,CD4, CD43, CD45, CD52, CD56, CD68, CD71, CD138, etc. Construtos dire-cionadores podem ser preparados tipicamente ligando-se covalentemente asseqüências inibidoras de JNK, peptídeos quiméricos e ácidos nucléicos da invenção a um anticorpo específico para uma proteína de superfície celularou pela ligação a um Iigante específico de uma célula. Proteínas podem ser,por exemplo, ligadas a tal anticorpo ou podem ser acopladas a ele por umaligação de peptídeo ou por acoplamento químico, reticulação, etc. A terapiadirecionadora pode ser então realizada pela administração do construto dire-cionador em uma quantidade farmaceuticamente eficaz a um paciente porqualquer uma das vias de administração definidas abaixo, por exemplo, viasintraperitoneal, nasal, intravenosa, oral e por emplastro. Preferivelmente, asseqüências inibidoras de JNK da invenção, peptídeos quiméricos ou ácidosnucléicos da invenção ligados aos anticorpos direcionadores ou Iigantes es- pecíficos de célula como definido acima, podem ser liberados in vitro ou invivo, por exemplo, por hidrólise da ligação covalente, por peptidases ou porqualquer outro método adequado. Alternativamente, se as seqüências inibi-doras de JNK, peptídeos quiméricos ou ácidos nucléicos da invenção, foremligados a um pequeno Iigante específico de célula, a liberação do Iigante po- de não ocorrer. Se presente na superfície celular, os peptídeos quiméricosda invenção podem entrar na célula pela atividade de sua seqüência de trá-fego. O direcionamento pode ser desejável por uma variedade de razões;por exemplo, se as seqüências inibidoras de JNK, peptídeos quiméricos, eácidos nucléicos da invenção forem inaceitavelmente tóxicos ou se de outra forma, eles necessitarem de uma dosagem alta demais.

Ao invés de administrar as seqüências inibidoras de JNK e/oupeptídeos quiméricos da invenção diretamente, eles poderiam ser produzi-dos nas células-alvo pela expressão a partir de um gene codificante introdu-zido nas células, por exemplo, a partir de um vetor viral a ser administrado.O vetor viral codifica tipicamente as seqüências inibidoras de JNK da inven-ção e/ou peptídeos quiméricos da invenção. O vetor poderia ser direcionadopara as células específicas a ser tratadas. Além disso, o vetor conteria ele-mentos regulatórios, que são ligados mais ou menos seletivamente pelascélulas-alvo por regulação definida. Essa técnica representa uma variante datécnica de VDEPT (terapia de pró-fármaco direcionado por vírus), que utilizaproteínas maduras ao invés das suas formas precursoras.

Alternativamente as seqüências inibidoras de JNK e/ou peptí-deos quiméricos da invenção poderiam ser administrados em uma formaprecursora pelo uso de um anticorpo ou um vírus. As seqüências inibidorasde JNK da invenção e/ou peptídeos quiméricos podem então ser convertidosna forma ativa por um agente ativador produzido, ou direcionado para, ascélulas a ser tratadas. Esse tipo de abordagem é algumas vezes conhecidacomo ADEPT (terapia de pró-fármaco direcionada por anticorpo) ou VDEPT(terapia de pró-fármaco direcionada por vírus); o primeiro envolvendo dire-cionamento do agente ativador para as células por conjugação a um anticor-po célula-específico, enquanto que o último envolve a produção do agenteativador, por exemplo, uma seqüência inibidora de JNK ou o peptídeo qui-mérico, em um vetor pela expressão a partir de um DNA codificante em umvetor viral (vide, por exemplo, EP-A-415731 e WO 90/07936).

A presente invenção ainda abrange o uso de seqüências inibido-ras de JNK da invenção, peptídeos quiméricos da invenção e/ou seqüênciasde ácido nucléico da invenção, para preparar uma composição farmacêutica,por exemplo, como definido acima, para prevenir e/ou tratar distúrbios deproliferação celular associadas com ativação de JNK em um indivíduo ("de-sordem associada a JNK"). Tipicamente, tal composição farmacêutica usadade acordo com a presente invenção inclui um componente ativo, por exem-pio, (i) qualquer uma ou mais das seqüências inibidoras de JNK da invençãoe/ou peptídeos quiméricos da invenção, e/ou variantes, fragmentos ou deri-vados desses; e/ou (ii) ácidos nucléicos que codificam uma seqüência inibi-dora de JNK da invenção e/ou peptídeo quimérico da invenção e/ou varian-tes ou fragmentos desses, e/ou (iii) células que compreendem qualquer umaou mais das seqüências inibidoras de JNK da invenção e/ou peptídeos qui-méricos da invenção, e/ou variantes, fragmentos ou derivados desses e/ou(iv) células transfectadas com um vetor e/ou ácidos nucléicos que codificamuma seqüência inibidora de JNK da invenção e/ou um peptídeo quimérico dainvenção e/ou variantes ou fragmentos desses.

Prevenção e/ou tratamento de acordo com a presente invençãoinclui tipicamente administração de uma composição farmacêutica da inven-ção como definido acima. O termo "modular" também inclui supressão decomplexos hetero- e homoméricos de fatores de transcrição formados de c-jun, ATF2, ou NFAT4 e seus parceiros relacionados, tais como, por exemplo,o complexo AP-1 que é formado de c-jun, AFT2 e c-fos. Quando uma desor-dem de proliferação celular está associada com a superexpressão de JNK,tais seqüências inibidoras de JNK supressoras podem ser introduzidas emuma célula. Em alguns casos, "modular" pode incluir o aumento da expres-são de JNK, por exemplo, pelo uso de um anticorpo peptídeo IB-específicoque bloqueia a ligação de um peptídeo IB à JNK, assim evitando a inibiçãode JNK pelo peptídeo relacionado a IB.

Prevenção e/ou tratamento de um indivíduo com a composiçãofarmacêutica da invenção como descrito acima pode ser realizado tipicamen-te pela administração (in vivo) de uma quantidade ("terapeuticamente efi-caz") da dita composição farmacêutica a um indivíduo, em que o indivíduopode ser, por exemplo, qualquer mamífero, por exemplo, um ser humano,um primata, camundongo, rato, cachorro, gato, vaca, cavalo ou porco. Otermo "terapeuticamente eficaz" significa que o componente ativo da compo-sição farmacêutica é de quantidade suficiente para melhorar a desordemassociada com JNK.

O termo "desordem de proliferação celular" ou "desordem asso-ciada a JNK" como usado acima denota tipicamente populações malignas enão malignas de células in vivo e in vitro que freqüentemente parecem diferirmorfologicamente e funcionalmente do tecido vizinho e que são caracteriza-das tipicamente por níveis aberrantes de JNK. Um "nível aberrante de JNK"pretende significar um nível aumentado ou diminuído de JNK em uma partedo indivíduo a ser tratado em relação àquele presente em uma parte análoganão afetada de um indivíduo que não tem a desordem.

Por exemplo, as composições farmacêuticas da invenção podemser úteis em prevenir, e/ou tratar malignidades dos vários sistemas de ór-gãos, nos quais a ativação de JNK foi freqüentemente demonstrada, por e-xemplo, pulmão, mama, linfóide, trato gastrointestinal, e genito-urinário as-sim como adenocarcinomas que incluem malignidades tais como cânceresde cólon, carcinoma de célula renal, câncer de próstata, carcinoma de célulanão pequena do pulmão, câncer do intestino delgado, câncer de esôfago.Leucemia, distúrbios ou patofisiologias associadas com transformação on-cogênica assim como cânceres com transformações oncogênicas Bcr-Ablque requerem claramente ativação de JNK também estão incluídas.

As composições farmacêuticas da invenção também são aplicá-veis em prevenir e/ou tratar doenças de proliferação de célula não malignasou relacionadas à imunidade tais como psoríase, pênfigo vulgar, síndromede Behcet, síndrome do desconforto respiratório agudo (ARDS), doença car-díaca isquêmica, síndrome pós-diálise, artrite reumatóide, síndrome da imu-nodeficiência adquirida, vasculite, choque séptico, e outros tipos de inflama-ção aguda, e histiocitose lipídica. Especialmente preferidos são distúrbiosimunopatológicas. Essencialmente, qualquer desordem, que é ligada ecolo-gicamente à atividade quinase de JNK, é considerada suscetível à preven-ção ou tratamento, por exemplo, distúrbios ou patofisiologias associadas aativação de JNK em uma célula ou células como definido acima, por exem-plo, reestenose, perda de audição, trauma de ouvido, isquemia, derramee/ou distúrbios ou patofisiologias associadas com maturação e diferenciaçãode células imunes, injúrias de reperfusão, hipóxia, doenças relacionadas aapoptose (por exemplo, que ocorrem em infecções virais (por exemplo,AIDS), doenças autoimunes, distúrbios neurodegenerativas (por exemplo,acidente vascular cerebral, trauma cerebral, injúria de medula espinhal, es-clerose lateral amiotrófica (ALS), doença de Huntington, doença de Alzhei-mer, e doença de Parkinson), doença cardiovascular, osteoporose e enve-lhecimento), resposta a estímulos estressantes, e com efeitos secundáriosdevido ao tratamento com, por exemplo, citocinas pró-inflamatórias. A com-posição farmacêutica da invenção também pode ser usada para tratar ou prevenir efeitos associados com diabetes ou com tensão mecânica celular,tais como em estados patológicos induzidos por hipertensão arterial, incluin-do hipertrofia do coração e cardíaca e lesões ateroscleróticas, e em bifurca-ções de vasos sangüíneos, e similares, por radiação ionizante, como usadoem radioterapia e luz ultravioleta (luzes UV), por radicais livres, agentes que danificam o DNA, incluindo fármacos quimioterápicos, por injúrias de isque-mia/reperfusão, por hipóxia; e/ou hipo- e hipertemia. Finalmente, no contextodas doenças, distúrbios ou patofisiologias mencionadas acima, a composi-ção farmacêutica da invenção pode ser usada para inibir a expressão degenes cuja expressão aumenta na presença de um polipeptídeo de JNK ati- vo. Esses genes e produtos gênicos incluem tipicamente, por exemplo, cito-cinas pró-inflamatórias. Tais citocinas são encontradas em todas as formasde doenças inflamatórias, autoinflamatórias, imunes e autoimunes, doençasdegenerativas, miopatias, cardiomiopatias e rejeição de enxerto.

As seqüências inibidoras de JNK da invenção, peptídeos quimé- ricos da invenção ou seqüências de ácido nucléico da invenção podem aindaser usadas em qualquer situação na qual a inibição da atividade de JNK fordesejada, já que JNKs e todas as suas isoformas participam no desenvolvi-mento e estabelecimento de estados patológicos ou em vias desses. Tal usopode incluir aplicações in vitro, ex vivo ou aplicações in vivo.

Conseqüentemente, ácidos nucléicos da invenção como definidoacima, podem ser utilizados em uma modalidade específica da presente in-venção para modular as vias ativadas de sinalização de JNK por meio deterapia gênica, preferivelmente para tratar uma das condições, doenças,e/ou distúrbios como definido acima. Nesse contexto, terapia gênica refere- se à terapia que é realizada pela administração de um ácido nucléico da in-venção a um indivíduo, por exemplo, por meio de uma composição farma-cêutica como definido acima, em que o(s) ácido(s) nucléico(s) da invençãocompreende(m) exclusivamente L-aminoácidos. Nessa modalidade da pre-sente invenção, o ácido nucléico produz seu(s) peptídeo(s) codificado(s),que então serve(m) para exercer um efeito terapêutico pela modulação dafunção da doença ou desordem. Qualquer um dos métodos relacionadosà terapia gênica disponíveis dentro da técnica podem ser usados na práti-ca da presente invenção (vide, por exemplo Goldspiel, et ai, 1993. ClinPharm 12: 488-505).

Em uma modalidade preferida, o ácido nucléico da invenção u-sado para terapia gênica é parte de um vetor de expressão que expressaqualquer um ou mais dos peptídeos relacionados a IB da invenção, isto é,uma seqüência inibidora de JNK da invenção e/ou peptídeo quimérico dainvenção, ou fragmentos ou derivados desses, dentro de um hospedeiro a-dequado. Em uma modalidade específica tal vetor de expressão possui umpromotor que é operativamente ligado a região(ões) codificante(s) de umaseqüência inibidora de JNK. O promotor pode ser definido como acima, porexemplo, induzível ou constitutivo, e opcionalmente, tecido-específico.

Em outra modalidade específica, uma molécula de ácido nucléi-co da invenção é usada para terapia gênica, na qual as seqüências codifi-cantes da molécula de ácido nucléico da invenção (e quaisquer outras se-qüências desejadas dessas) são flanqueadas por regiões que promovemrecombinação homóloga em um local desejado dentro do genoma, assimfornecendo expressão intracromossômica de ácidos nucléicos (vide, por e-xemplo, Koller & Smithies, 1989. Proc Natl Acad Sci USA 86: 8932-8935).

Liberação do ácido nucléico da invenção em um paciente com afinalidade de terapia gênica pode ser tanto direta (isto é, o paciente é expos-to diretamente ao ácido nucléico ou vetor contendo ácido nucléico) ou indire-ta (isto é, as células são primeiro transformadas com o ácido nucléico in W-tro, e então transplantadas para o paciente). Essas duas abordagens sãoconhecidas, respectivamente, como terapia gênica in vivo ou ex vivo. Emuma modalidade específica da presente invenção, um ácido nucléico é ad-ministrado diretamente in vivo, onde ele é expresso para produzir o produtocodificado. Isso pode ser realizado por qualquer um de vários métodos co-nhecidos na técnica incluindo, por exemplo, construir o ácido nucléico comoparte de um vetor de expressão de ácido nucléico apropriado e administrar omesmo de uma maneira tal que ele se torne intracelular (por exemplo, porinfecção usando um vetor retroviral ou outro vetor viral defeituoso ou atenu-ado, vide, Patente U.S. No. 4.980.286); injetar diretamente DNA nu; usarbombardeio de micropartículas (por exemplo, um "GeneGun"; Biolística, Du-Pont); revestir os ácidos nucléicos com lipídeos; usar receptores de superfí-cie celular/agentes transfectantes; encapsular em lipossomos, micropartícu-las ou microcápsulas; administrá-lo em ligação a um peptídeo que é conhe-cido por entrar no núcleo; ou administrá-lo ligado a um Iigante predisposto aendocitose mediada por receptor (vide, por exemplo, Wu & Wu, 1987.J BiolChem 262: 4429-4432), que pode ser usado para "direcionar" tipos celularesque expressam especificamente os receptores de interesse, etc.

Uma abordagem adicional para terapia gênica na prática da pre-sente invenção envolve transferir um gene para dentro de células em culturade tecido in vitro por tais métodos, como eletroporação, lipofecção, transfec-ção mediada por fosfato de cálcio, infecção viral, ou similar. Geralmente, ométodo de transferência inclui a transferência concomitante de um marcadorselecionável para as células. As células são então colocadas sob pressãoseletiva (por exemplo, resistência a antibiótico) de modo a facilitar o isola-mento dessas células que absorveram, e que estão expressando, o genetransferido. Essas células são então liberadas para um paciente. Em umamodalidade específica, antes da administração in vivo da célula recombinan-te resultante, o ácido nucléico é introduzido em uma célula por qualquer mé-todo conhecido dentro da técnica, incluindo, por exemplo, transfecção, ele-troporação, microinjeção, infecção com vetor viral ou bacteriófago contendoas seqüências de ácido nucléico de interesse, fusão celular, transferênciagene mediada por cromossomo, transferência de gene mediada por microcé-lula, fusão de esferoplasto, e métodos similares que garantem que as fun-ções do desenvolvimento e fisiológicas necessárias das células receptorasnão são interrompidas pela transferência. Vide, por exemplo, Loeffler & Behr,1993. Meth Enzymol 217: 599-618. A técnica escolhida deve fornecer atransferência estável do ácido nucléico para a célula, tal que o ácido nucléicoseja capaz de ser expresso pela célula. Preferivelmente, o ácido nucléicotransferido é hereditário e capaz de ser expresso pela progênie da célula.

Em modalidades preferidas da presente invenção, as célulasrecombinantes resultantes podem ser liberadas a um paciente por váriosmétodos conhecidos dentro de técnica incluindo, por exemplo, injeção decélulas epiteliais (por exemplo subcutaneamente), aplicação de células dapele recombinantes como um enxerto de pele ao paciente, e injeção intrave-nosa de células vermelhas do sangue (por exemplo células-tronco ou proge-nitoras hematopoiéticas). A quantidade total de células que são considera-das para uso depende do efeito desejado, do estado do paciente, e simila-res, e pode ser determinada por um versado na técnica. As células dentrodas quais um ácido nucléico pode ser introduzido para fins de terapia gênicaabrangem qualquer tipo celular desejado disponível, e pode ser xenogenei-co, heterogeneico, singeneico ou autogeneico. Os tipos celulares incluem,mas não são limitados a, células diferenciadas, tais como células epiteliais,células endoteliais, queratinócitos, fibroblastos, células musculares, hepatóci-tos, e células sangüíneas, ou várias células-tronco ou progenitoras, em particu-lar células musculares cardíacas embrionárias, células-tronco do fígado (Publi-cação de Patente Internacional WO 94/08598), células-tronco neurais (Stemple& Anderson, 1992,Cell 71: 973-985), células-tronco ou progenitoras hematopoi-éticas, por exemplo obtidas da medula óssea, sangue de cordão umbilical,sangue periférico, fígado fetal, e similares. Em uma modalidade preferida, ascélulas utilizadas para terapia gênica são autólogas para o paciente.

De acordo com uma modalidade adicional, as seqüências inibi-doras de JNK da invenção, peptídeos quiméricos da invenção, seqüênciasde ácido nucléico da invenção, ou anticorpos para seqüências inibidoras deJNK da invenção ou para peptídeos quiméricos da invenção podem ser utili-zados em ensaios (in vitro) (por exemplo, imunoensaios) para detectar, darprognóstico, diagnosticar, ou monitorar várias condições, doenças, e /ou dis-túrbios como definido acima, ou monitorar o tratamento dessas. O imunoen-saio pode ser realizado por um método que compreende colocar uma amos-tra derivada de um paciente em contato com um anticorpo para uma se-qüência inibidora de JNK da invenção, um peptídeo quimérico da invenção,ou uma seqüência de ácido nucléico da invenção, sob condições tais que aligação imunoespecífica possa ocorrer, e subseqüentemente detectar oumedir a quantidade de qualquer ligação imunoespecífica pelo anticorpo. Emuma modalidade específica, um anticorpo específico para uma seqüênciainibidora de JNK da invenção, peptídeo quimérico da invenção ou seqüênciade ácido nucléico da invenção pode ser usado para analisar uma amostra detecido ou soro de um paciente quanto à presença de JNK ou uma seqüênciainibidora de JNK; em que um nível aberrante de JNK é indicativo de umacondição de doença. Os imunoensaios que podem ser utilizados incluem,mas não são limitados a sistemas de ensaio competitivos e não competitivosusando técnicas tais como Western Blots, radioimunoensaios (RIA), ensaioimunoabsorvente ligado à enzima (ELISA), imunoensaios "sanduíche", en-saios de imunoprecipitação, reações de precipitina, reações de precipitina dedifusão em gel, ensaios de imunodifusão, ensaios de aglutinação, imunoen-saios fluorescentes, ensaios de fixação de complemento, ensaios imunora-diometricos, e imunoensaios de proteína-A, etc. Alternativamente, ensaios(in vitro) podem ser realizados pela liberação das seqüências inibidoras deJNK da invenção, peptídeos quiméricos da invenção, seqüências de ácidonucléico da invenção ou anticorpos para seqüências inibidoras de JNK dainvenção ou para peptídeos quiméricos da invenção para direcionar células-alvo selecionadas tipicamente a partir de células animais em cultura, célulashumanas ou microorganismos, e para monitorar a resposta celular por méto-dos biofísicos tipicamente conhecidos de um versado na técnica. As células-alvo tipicamente usadas nisso podem ser células em cultura (in vitro) ou cé-lulas in vivo, isto é, células que compõem os órgãos ou tecidos de seres hu-manos ou animais vivos, ou microorganismos encontrados em seres huma-nos ou animais vivos.

A presente invenção ainda fornece kits para uso diagnóstico outerapêutico que incluem um ou mais recipientes contendo seqüências inibi-doras de JNK da invenção, peptídeos quiméricos da invenção, seqüênciasde ácido nucléico da invenção e/ou anticorpos para seqüências inibidoras deJNK da inveenção, ou para peptídeos quiméricos da invenção, por exemplo,um anticorpo anti-seqüência inibidora de JNK e, opcionalmente, um parceirode ligação marcado para o anticorpo. O marcador incorporado dessa forma no anticorpo pode incluir, mas não é limitado, uma porção quimiolumines-cente, enzimática, fluorescente, colorimétrica, ou radioativa. Em outra moda-lidade específica, são fornecidos kits para uso diagnóstico que compreendeum ou mais recipientes contendo ácidos nucléicos que codificam, ou alterna-tivamente, que são o complemento para, uma seqüência de JNK da inven- ção e/ou peptídeo quimérico da invenção, opcionalmente, um parceiro deligação marcador para esses ácidos nucléicos, também são fornecidos. Emuma modalidade específica alternativa, o kit pode compreender, em um oumais recipientes, um par de oligonucleotídeos iniciadores (por exemplo, cadaum de 6-30 nucleotídeos de extensão) que são capazes de agir como inicia-dores de amplificação para a reação em cadeia da polimerase (PCR; vide,por exemplo, Innis, et ai, 1990. PCR PROTOCOLS, Academic Press, Inc.,San Diego, CA), reação em cadeia da ligase, reação de sonda cíclica, e simila-res, ou outros métodos conhecidos dentro da técnica usados no contexto comos ácidos nucléicos da invenção. O kit pode ainda compreender, opcionalmen- te, uma quantidade predeterminada de uma seqüência inibidora de JNK da in-venção, um peptídeo quimérico da invenção, ou ácidos nucléicos que os codifi-cam, para uso como um diagnóstico, padrão ou controle nos ensaios.

A presente invenção não deve ser limitada em escopo pelasmodalidades específicas descritas aqui. De fato, várias modificações da in- venção além daquelas descritas que se tornarão claras para os versados natécnica a partir da descrição anterior e figuras anexas. Tais modificaçõescaem dentro do escopo das reivindicações anexas.

Várias publicações são citadas aqui, as descrições das quaisestão incorporadas por referência na sua totalidade.

A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos ecientíficos usados aqui têm o mesmo significado que o comumente compre-endido por um versado na técnica a qual essa invenção pertence. Emboramétodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui pos-sam ser usados na prática ou teste da presente invenção, métodos e materi-ais adequados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de pa-tente, patentes e outras referências mencionadas aqui estão incorporadaspor referência na sua totalidade. No caso de conflito, a presente especifica-ção, incluindo definições, controlará. Além disso, os materiais, métodos eexemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser limitantes. Outrascaracterísticas e vantagens da presente invenção serão claras a partir daseguinte descrição detalhada e reivindicações.

DESCRIÇÃO DE FIGURAS

Figuras 1A-C são diagramas mostrando alinhamentos de regiõesde domínio JBD conservadas nos fatores de transcrição indicados. As se-qüências inibidoras de JNK foram identificadas pela inspeção desses ali-nhamentos de seqüência. Os resultados desse alinhamento são exemplar-mente mostrados nas figuras 1A-1C. A figura 1A mostra a região de maiorhomologia entre os JBDs de IB1, IB2, c-Jun e ATF2. O painel B representa aseqüência de aminoácido dos JBDs de L-IB1(s) e L-IB1 por razões compara-tivas. Resíduos completamente conservados estão indicados por asteriscos,enquanto que resíduos trocados para Ala no vetor GFP-JBD23Mut estão indi-cados por círculos abertos. A figura 1 C mostra as seqüências de aminoáci-do de proteínas quiméricas que incluem uma seqüência inibidora de JNK euma seqüência de tráfego. No exemplo mostrado, a seqüência de tráfego éderivada do polipeptídeo TAT do vírus da imunodeficiência humana (HIV), ea seqüência inibidora de JNK é derivada de um polipeptídeo IB1(s). Seqüên-cias humanas, de camundongo, e de rato são idênticas nos Painéis B e C.

Figura 2 é um diagrama mostrando seqüências de peptídeos defusão TAT-IB genéricos de humano, camundongo e rato.

Figura 3 descreve os resultados da avaliação da neuroproteçãocontra isquemia focai cerebral em modelo MCAO permanente. A determina-ção da eficácia da proteção foi realizada em doses diferentes (vide Figura 3).Como pode ser visto a partir da Figura 3, pelo menos doses de 11 mg/kg, 3mg/kg, 0,3mg/kg e 0,03 mg/kg, contribuem para proteção cerebral. A melhorproteção é observada na dose de 0,03 mg/kg.

Figura 4 ilustra a avaliação de neuroproteção por um peptídeoquimérico da invenção de acordo com SEQ ID NO: 11 após administraçãoi.v. contra isquemia focai cerebral, em um modelo de MCAO transitório. Apósa provocação de isquemia em camundongos adultos, os camundongos fo-ram mortos 48 horas após reperfusão. Seções seriadas de criostato foram pre-paradas e volumes de infarto foram calculados. Como pode ser visto a partir daFigura 4, o peptídeo quimérico da invenção fornece neuroproteção eficaz.

Figura 5 mostra os resultados de um ensaio sobre culturas neu-ronais realizado pela medida da liberação de LDH após estímulo com NM-DA. Os resultados indicam claramente um efeito neuroprotetor do peptídeoquimérico D-JNK11 da invenção (SEQ ID NO: 11), já que alterações degene-rativas devido à exposição a NMDA foram completamente inibidas como in-dicado pela ausência de liberação significativa de LDH dos controles acima.

Figura 6 descreve os resultados da inibição da atividade de JNKendógena em células HepG2 usando peptídeos de fusão da invenção deacordo com SEQ ID NOs: 9 e 11 em uma abordagem de um poço. Comopode ser visto a partir da Figura 6, particularmente painel d na Figura 6, D-TAT-IB 1(s) de acordo com SEQ ID NO: 11 (aqui abreviado como D-JNKI)inibe eficazmente a atividade de JNK, ainda melhor do que L-TAT-IBI(s) deacordo com SEQ ID NO: 9 (aqui abreviado como L-JNKI).

Figura 7 mostra o efeito protetor de D-TAT-IBI(s). Proteção con-tra perda auditiva permanente. Alterações do nível de limiar de audição (ní-vel de pressão sonora em dB) em porcos da guiné após trauma por som(120 dB a 6 kHz durante 30 minutos) a 8 kHz, a freqüência impactada aomáximo, medida 20 minutos (alteração de limiar temporária, TTS, cinza) e 15dias após a exposição ao som (alteração de limiar permanente). Porcos daguiné receberam D-TAT-IBI(s) em um gel hialurônico depositado sobre amembrana da janela redonda coclear tanto 30 minutos antes, como 30 minu-tos depois ou 4 horas após o trauma por som; ouvidos não tratados serviramcomo controles. TTS foi medido 20 minutos após o trauma por som, enquan-to que PTS (preto), que corresponde à perda auditiva permanente, foi de-terminado após 15 dias. Como mostrado, D-TAT-IBI(s) não apenas protegesubstancialmente contra perda auditiva permanente por trauma por som seaplicado preventivamente antes da exposição ao som, mas também de umaforma dependente do tempo se administrado após o trauma. PTS em ouvi-dos tratados foi significativamente menor para a administração de D-TAT-IB1 (s)30 minutos e 4 horas após o trauma em ouvidos de controle não tratados.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Identificação de seqüências inibidoras de JNK

Seqüências de aminoácidos importantes para a interação efici-ente com JNK foram identificadas por alinhamentos de seqüências entreJBDs conhecidos. Uma comparação de seqüência entre os JBDs de IB1[SEQ ID NO: 13], IB2 [SEQ ID NO: 14], c-Jun [SEQ ID NO: 15] e ATF2 [SEQID NO: 16] definiu uma seqüência fracamente conservada de 8 aminoácidos(figura 1A). Como os JBDs de IB1 e IB2 são aproximadamente 100 vezestão eficientes quanto c-Jun ou ATF2 em se ligar a JNK (Dickens et ai Scien-ce 277: 693 (1997), foi considerado que resíduos conservados entre IB1 eIB2 devem ser importantes para conferir ligação máxima. A comparação en-tre os JBDs de IB1 e IB2 definiu dois blocos de sete e três aminoácidos quesão altamente conservados entre as duas seqüências.

Esses dois blocos estão contidos dentro de uma seqüência depeptídeos de 19 aminoácidos em L-IB1(s) [SEQ ID NO: 1] e são mostradostambém por razões comparativas em uma seqüência de peptídeos de 23 aaderivada de IB1 [SEQ ID NO: 17]. Essas seqüências são mostradas na figu-rai B, traços na seqüência L-IB1 indicam um intervalo na seqüência a fim dealinhar os resíduos conservados com L-IB1 (s).

Exemplo 2: Preparação de Proteínas de Fusão Inibidoras de JNK

Proteínas de fusão inibidoras de JNK da invenção de acordocom a SEQ ID NO: 9 foram sintetizadas por ligar covalentemente a termina-ção C de SEQ ID NO: 1 a um peptídeo veículo N-terminal de 10 aminoácidosde extensão derivado de HIV-TAT4g 57 (Vives et ai, J Biol. Chem. 272:16010 (1997)) de acordo com a SEQ ID NO: 5 através de um Iigante queconsiste em dois resíduos de prolina. Esse Iigante foi usado para permitir aflexibilidade máxima e evitar alterações estruturais secundárias indesejadas.Os construtos básicos também foram preparados e designados L-IB1(s)(SEQ ID NO: 1) e L-TAT [SEQ ID NO: 5], respectivamente.

Todos os peptídeos D retroinversos de acordo com a SEQ IDNO: 11 foram sintetizados adequadamente. Os construtos básicos tambémforam preparados e designados D-IB1(s) [SEQ ID NO: 2] e D-TAT [SEQ IDNO: 6], respectivamente.

Todos os peptídeos de fusão D e L da invenção de acordo comas SEQ ID NOs: 9, 10, 11 e 12 foram produzidos por síntese Fmock clássicae analisados ainda por Espectrometria de Massa. Eles foram finalmente puri-ficados por HPLC. Para determinar os efeitos do Iigante de prolina, dois tiposde peptídeo de TAT foram produzidos um com e um sem duas prolinas. Aadição das duas prolinas não pareceu modificar a entrada ou a localizaçãodo peptídeo TAT dentro das células. Peptídeos genéricos mostrando os re-síduos de aminoácidos conservados são dados na figura2.Exemplo 3: Inibicão de morte celular por JBD19

Efeitos da seqüência de JBD de 19 aa de extensão de IB1(s)sobre as atividades biológicas de JNK foram estudados. A seqüência de 19aa foi ligada N-terminal à Proteína Verde Fluorescente (construto GFPJBD19) e o efeito desse construto sobre a apoptose da célula β pancreáticainduzida por IL1 foi avaliado. Esse modo de apoptose foi mostrado previa-mente ser bloqueado pela transfecção com JBDi-2eo enquanto que inibidoresespecíficos de ERK1/2 ou p38 não protegeram (vide Ammendrup et ai, supra).

Oligonucleotídeos que correspondem a JDB19 e compreendemuma seqüência conservada de 19 aminoácidos assim como uma seqüênciamutada nas regiões totalmente conservadas foram sintetizados e direcio-nalmente inseridos nos sítios de EcoR\ e Sal\ do vetor pEGFP-N1 que codifi-ca Proteína Verde Fluorescente (GFP) (da Clontech). Células βΤΟ-3 produ-toras de insulina foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado comSoro Fetal Bovino 10%, 100 pg/mL de Estreptomicina, 100 unidades/mL dePenicilina, e Glutamina 2 mM. Células βΤ0-3 produtoras de insulina foramtransfectadas com os vetores indicados e ΙΙ_-1β (10 ng/mL) foi adicionado aomeio de cultura da célula. O número de células apoptóticas foi contado 48horas após a adição de IL-1 β usando um microscópio invertido de fluores-cência. Células apoptóticas foram discriminadas das células normais pelo"blebbing out" característico do citoplasma e foram contadas após dois dias.

GFP é o vetor de expressão da proteína Verde Fluorescente usadocomo um controle; JBD19 é o vetor que expressa uma GFP quimérica ligada àseqüência de 19 aa derivada de JBD de IBI; JBD19Mut é o mesmo vetor queGFP-JBD19, mas com um JBD mutado em quatro resíduos conservados mos-trado como FIG 1B; e JBD1^80 é o vetor de GFP ligado ao JBD inteiro (1-280aa). O construto que expressa GFP-JBD19 evitou a apoptose de células β pan-creáticas induzida por IL-1 β tão eficazmente quanto o JBD1^8Ocompleto.

Como controles adicionais, seqüências mutadas em resíduos deIB1(s) totalmente conservados tiveram a habilidade de evitar apoptose alta-mente diminuída.

Exemplo 4: Importação Celular de peptídeos TAT-IBKs)

A habilidade das formas enantioméricas L e D de TAT e peptí-deos TAT-IB 1(s) da invenção ("peptídeos TAT-IB") de entrar nas células foiavaliada. Peptídeos de L-TAT1 D-TAT, L-TAT-IBI(s) da invenção e D-TAT-IB1 (s) da invenção [SEQ ID NOs: 5, 6, 9 e 12, respectivamente] foram mar- cados por adição N-terminal de um resíduo de glicina conjugado com fluo-resceína. Peptídeos marcados (1 μΜ) foram adicionados a culturas de célu-las βΤΟ-3, que foram mantidas como descrito no Exemplo 3. Em períodosde tempo predeterminados as células foram lavadas com PBS e fixadas porcinco minutos em metanol-acetona gelado (1:1) antes de serem examinadas sob um microscópio de fluorescência. BSA marcado com fluoresceína (1 μΜ,12 mols/mol de BSA) foi usado como um controle. Os resultados demonstra-ram que todos os peptídeos marcados com fluoresceína acima entraram efi-cientemente e rapidamente nas células (menos do que cinco minutos) umavez adicionados ao meio de cultura. Inversamente, albumina sérica bovinamarcada com fluoresceína (1 μΜ de BSA, 12 mois de fluoresceína/mol deBSA) não entrou nas células.

Um estudo de curso de tempo indicou que a intensidade do sinalfluorescente para os peptídeos L-enantioméricos diminuiu em 70% após umperíodo de 24 horas. Pouco ou nenhum sinal estava presente em 48 horas.Em contraste, D-TAT e D-TAT-IBI(s) da invenção eram extremamente está-veis dentro da célula.

Sinais fluorescentes de todos esses peptídeos D retroinversosainda estavam muito fortes 1 semana mais tarde, e o sinal estava apenaslevemente diminuído 2 semanas após o tratamento.

Exemplo 5: Inibicão In vitro de c-JUN. ATF2 e Fosforilacão de Elkl

Os efeitos dos peptídeos sobre a fosforilação mediada por JNKsde seus fatores de transcrição alvo foram investigados in vitro. JNK1, JNK2 eJNK3 recombinantes e não ativados foram produzidos usando um kit de Ii-sado de reticulócito de coelho de TRANSCRIÇÃO E TRADUÇÃO (Promega)e usados em ensaios de quinase em fase sólida com c-Jun, ATF2 e Elk1,tanto isolados quanto fundidos com glutationa-S-transferase (GST), comosubstratos. Estudos de dose-resposta foram realizados em que os peptídeosL-TAT ou L-TAT-IBI(s) da invenção (0-25 μΜ) foram misturados com as qui-nases JNK1, JNK2, ou JNK3 recombinantes em tampão de reação (Tris-acetato 20 mM , EGTA 1mM, p-nitrofenil-fosfato 10 mM (pNPP), pirofosfatode sódio 5 mM, p-glicerofosfato 10 mM, ditiotreitol 1 mM) por 20 minutos. Asreações de quinase foram então iniciadas pela adição de MgCI2 10 mM e 5pCi 33P-Y-dATP e 1 pg tanto de GST-Jun (aa 1-89), GST-AFT2 (aa 1-96) ouGST-ELK1 (AA de 307-428). Proteínas de fusão de GST foram adquiridas deStratagene (La Jolla, CA).

Dez pL de esferas de agarose-glutationa também foram adicio-nadas à mistura. Produtos de reação foram então separados por SDS-PAGEem um gel de poliacrilamida 10% desnaturante. Os géis foram secados esubseqüentemente expostos a filmes de raio X (Kodak). A inibição quasecompleta de c-Jun, ATF2 e fosforilação de Elkl por JNKs foi observada nospeptídeos TAT-IB(s) da invenção em doses tão baixas quanto 2,5 μΜ. Entre-tanto, uma exceção acentuada foi a ausência de inibição em TAT-IB(s) daforsforilação por JNK3 de Elkl. Em geral, o peptídeo TAT-IB1(s) da invençãomostrou efeitos superiores na inibição da fosforilação pela família JNK deseus fatores de transcrição alvo. A habilidade dos peptídeos D-TAT1 D-TAT-IB1 (s) da invenção e L-TAT-IBI(s) da invenção (estudo em dosagem de 0-250 μΜ) de inibir a fosforilação de GST-Jun (aa 1 -73) por JNK1, JNK2, e JNK3recombinante foi analisada como descrito acima. Geralmente, peptídeo D-TAT-IB1 (s) diminuiu a fosforilação mediada por JNK de c-Jun, mas em níveis de a-proximadamente 10-20 vezes menos eficazmente do que L-TAT-IBI(s).Exemplo 6: Inibicão de fosforilação de c-JUN por JNKs ativadas

Os efeitos dos peptideos L-TAT ou L-TAT-IBI(s) da invençãosobre JNKs ativadas por estímulos de estresse foram avaliados usandoGST-Jun para destruir JNKs de células HeLa irradiadas com luz UV ou célu-las PTC tratadas com IL-1 β. As células PTC foram cultivadas como descritoacima. Células HeLa foram cultivadas em meio DMEM suplementado com10% de Soro Fetal Bovino, estreptomicina 100 pg/mL, penicilina 100 unida-des/ml e glutamina 2 mM. Uma hora antes de serem usadas para prepara-ção de extrato celular, as células PTC foram ativadas com IL-1 β como des-crito acima, enquanto que as HeLa foram ativadas por luz UV (20 J/m2). Osextratos celulares foram preparados a partir de células HeLa de controle,irradiadas com UV e células βΤΟ-3 tratadas com IL-1 β por fragmentar asculturas celulares em tampão de Iise (Tris-acetato 20 mM, EGTA 1 mM, Tri-ton X-100 1%, p-nitrofenil-fosfato 10 mM, pirofosfasto de sódio 5 mM, P-glicerofosfato 10 mM, ditiotreitol 1 mM). Os resíduos foram removidos porcentrifugação por cinco minutos a 15.000 rpm em um rotor Beckman SS-34.Cem pg de extratos foram incubados por uma hora em temperatura ambien-te com um pg de GST-jun (aminoácidos 1-89) e 10 pL de esferas de glutati-ona-agarose (Sigma). Após quatro lavagens com o tampão de fragmenta-ção, as esferas foram ressuspensas no mesmo tampão suplementado compeptídeos L-TAT ou L-TAT-IBI(s) da invenção (25 μΜ) por 20 minutos. Asreações de quinase foram então iniciadas pela adição de MgCI2 10 mM e33P-y-dATP 5 pCi e incubadas por 30 minutos a 30°C.

Os produtos de reação foram então separados por SDS-PAGEem um gel de poliacrilamida 10% desnaturante. Os géis foram secos e sub-seqüentemente expostos a filmes de raio-X (Kodak). Os peptídeos TAT-IB(s)da invenção evitaram eficazmente a fosforilação de c-Jun por JNKs ativadasnesses experimentos.

Exemplo 7: Inibição in vivo de fosforilação de c-JUN por peptídeos TAT-IB(s)da invenção

Para determinar se os peptídeos permeáveis à célula da inven-ção poderiam bloquear a sinalização de JNK in vivo, foi usado um sistemade GAL4 heterólogo. Células HeLa, cultivadas como descrito acima, foramco-transfectadas com vetor repórter 5xGAL-LUC junto com o construto deexpressão GAL-Jun (Stratagene) que compreende o domínio de ativação dec-Jun (aminoácidos 1-89) ligado ao domínio de ligação ao DNA de GAL4. Aativação de JNK foi obtida pela co-transfecção de vetores expressando asquinases MKK4 e MKK7 diretamente a montante (vide Whitmarsh et ai., Sci-ence 285: 1573 (1999)). Resumidamente, 3x105 células foram transfectadascom os plasmídeos em placas de 3,5 cm usando DOTAP (Boehringer Man-nheim) seguindo as instruções do fabricante. Para experimentos envolvendoGAL-Jun, 20 ng do plasmídeo foram transfectados com 1 pg do plasmídeorepórter pFR-Luv (Stratagene) e 0,5 pg dos plasmídeos expressando MKK4ou MKK7. Três horas após a transfecção, o meio celular foi trocado e peptí-deos TAT e TAT-IB 1(s) (1 μΜ) foram adicionados. As atividades de Iucifera-se foram medidas 16 horas mais tarde usando o "Dual Repórter System" dePromega após normalização para o conteúdo de proteína. Adição de peptí-deo TAT-IB 1(s) bloqueou a ativação de c-Jun após ativação de JNK media-da por MKK4 e MKK7. Pelo fato das células HeLa expressarem as isoformasJNK1 e JNK2 mas não JNK3, transfectou-se células com JNK3. Novamente,o peptídeo TAT-IB(s) inibiu a ativação de c-Jun mediada por JNK2.

Exemplo 8: Inibicão de morte de célula β pancreática induzida por IL-1 β porpeptídeos TAT-IB

Foi investigado o efeito dos peptídeos L-TAT-IB(s) da invençãosobre a promoção de apoptose de célula β causada por IL-I. Culturas decélulas pTC-3 foram incubadas por 30 minutos com 1 μΜ de peptídeos L-TAT-IB 1(s) da invenção seguido por 10 ng/mL de IL-1. Uma segunda adiçãode peptídeo (1 μΜ) foi realizada 24 horas mais tarde. As células apoptóticasforam contadas após dois dias de incubação com IL-1 β usando coloraçãonuclear de iodeto de propídeo (células coradas de vermelho são células mor-tas) e Hoechst 33342 (células coradas de azul são células com membranaplasmática intacta). Adição dos peptídeos TAT-IB(s) da invenção inibiu aapoptose induzida por IL-I de células βΤΟ-3 cultivadas na presença de IL-1β por dois dias.

Inibição em longo prazo da morte celular induzida por IL-1 foiexaminada pelo tratamento de células βΤΟ-3 como descrito acima, excetoque a incubação das células com os peptídeos e IL-1 β foi mantida por 12 dias. Peptídeos adicionais (1 μΜ) foram adicionados a cada dia e IL-1 β adi-cional (10 ng/mL) foi adicionada a cada 2 dias. O peptídeo TAT-IB1(s) dainvenção confere forte proteção contra apoptose nessas condições. Toma-dos juntos, esses experimentos fornecem evidencia de que os peptídeosTAT-IB(s) da invenção são moléculas biologicamente ativas capazes de evi-tar os efeitos da sinalização de JNK sobre a destruição da célula.

Exemplo 9: Síntese de peptídeos IB(s) totalmente-D retroinversos da invenção

Peptídeos da invenção podem ser peptídeos totalmente-D sinte-tizados em reverso para evitar a proteólise natural (isto é, peptídeos total-mente-D retroinversos). Um peptídeo totalmente-D retroinverso da invençãoforneceria um peptídeo com propriedades funcionais similares ao peptídeonativo, em que os grupos laterais dos aminoácidos componentes correspon-deriam ao alinhamento de peptídeo nativo, mas manteriam um esqueletoresistência à protease.

Peptídeos retroinversos da invenção são análogos sintetizados usando D-aminoácidos pela ligação dos aminoácidos em uma cadeia depeptídeo tal que a seqüência de aminoácidos no peptídeo retroinverso aná-loga seja exatamente oposta àquela no peptídeo selecionado que serve co-mo o modelo. Para ilustrar, se a proteína TAT de ocorrência natural (formadade L-aminoácidos) tem a seqüência GRKKRRQRRR [SEQ ID NO: 5], o aná-logo de peptídeo retroinverso desse peptídeo (formado de D-aminoácidos)teria a seqüência RRRQRRKKRG [SEQ ID NO: 6]. Os procedimentos parasintetizar uma cadeia de D-aminoácidos para formar os peptídeos retroinver-sos são conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Jameson et ai, Nature,368,744-746 (1994); Brady et ai, Nature, 368,692-693 (1994); Guichard etai, J. Med. Chem. 39,2030-2039 (1996)). Especificamente, os retropeptí-deos foram produzidos por síntese F-mock clássica e ainda analisados porEspectometria de Massa. Eles foram finalmente purificados por HPLC.

Já que um problema inerente aos peptídeos nativos é a degra-dação por proteases naturais e imunogenicidade inerente, os compostosheterobivalentes e heteromultivalentes dessa invenção serão preparadospara incluir o "isômero retroinverso" do peptídeo desejado. Proteger o peptí-deo de proteólise natural deve, portanto aumentar a eficácia do compostoheterobiovalente ou heteromultivalente específico, tanto por prolongar ameia-vida como por diminuir a extensão de resposta imune direcionada paradestruir ativamente os peptídeos.

Exemplo 10: Atividade biológica de longo prazo de peptídeos IB(s) totalmen-te-D retroinversos da invenção

Atividade biológica de longo prazo é prevista para o heterocon-jugado de peptídeo contendo D-TAT-IB(s) retroinverso quando comparadacom o análogo de L-aminoácido nativo devido à proteção do peptídeo D-TAT-IB(s) da invenção de degradação por proteases nativas, como mostradono Exemplo 5.

A inibição de morte de célula β pancreática induzida por IL-I βpelo peptídeo D-TAT-IBI(s) da invenção foi analisada. Células βΤΟ-3 foramincubadas como descrito acima por 30 minutos com uma única adição dospeptídeos indicados (1 μΜ), então IL-1 (10 ng/ml) foi adicionada.

As células apoptóticas foram então contadas após dois dias deincubação com IL-1 β pelo uso de coloração nuclear com Iodeto de Propídeoe Hoechst 33342. Um mínimo de 1.000 células foi contado para cada expe-rimento. O Erro Padrão das Médias (SEM) está indicado, n=5. O peptídeo D-TAT-IB1 diminuiu a apoptose induzida por IL-1 em uma extensão similar aospeptídeos L-TAT-IB.

A inibição de longo prazo de morte celular induzida por IL-1 Ppelo peptídeo D-TAT-IB1 também foi analisada. Células βΤΟ-3 foram incu-badas como acima por 30 minutos com uma única adição dos peptídeos in-dicados (1 μΜ), a seguir, IL-1 β (10 ng/ml) foi adicionada, seguida pela adi-ção da citocina a cada dois dias. Células apoptóticas foram então contadasapós 15 dias de incubação com IL-1 pelo uso de coloração nuclear com io-deto de propídeo e Hoechst 33342. Observe que uma única adição do peptí-deo TAT-IB1 não confere proteção de longo prazo. Um mínimo de 1.000 cé-lulas foi contado para cada experimento. Como um resultado, D-TAT-IBI(s)da invenção, mas não L-TAT-IBI(s) da invenção foi capaz de conferir prote-ção de longo prazo (15 dias).

Exemplo 11: Inibicão de morte de célula β pancreática induzida por irradia-ção por peptídeos TAT-IB(s)

JNK também é ativado por radiação ionizante. Para determinarse os peptídeos TAT-IB(s) da invenção forneceriam proteção contra lesão deJNK induzida por radiação, células "WiDr" foram irradiadas (30 Gy) na pre-sença ou ausência de peptídeos D-TAT, L-TAT-IBI(s) da invenção, ou D-TAT-IB1(s) da invenção (1 μΜ adicionado 30 minutos antes da irradiação).Células de controle (CTRL) não foram irradiadas. As células foram analisa-das 48 horas mais tarde por meio de coloração com Pl e Hoechst 3342, co-mo descrito acima. N = 3, SEM estão indicados. Peptídeos L-TAT-IBI(s) eD-TAT-IBI(s) da invenção foram ambos capazes de evitar a apoptose indu-zida por irradiação nessa linhagem de câncer de cólon humano.

Exemplo 12: radioprotecão à radicão ionizante por peptídeos TAT-IB(s) dainvenção

Para determinar os efeitos radioprotetores dos peptídeos TAT-IB(s) da invenção, camundongos C57B1/6 (2 a 3 meses de idade) foram ir-radiados com um Raio X Phillips RT 250 em uma dose de 0,74 Gy/min (17mA, filtro de Cu de 0,5 mm). Trinta minutos antes da irradiação, os animaisforam injetados i.p. com peptídeos TAT da invenção, L-TAT-IBI(s) da inven-ção, ou D-TAT-IB 1(s) da invenção (301 de uma solução de 1 mM). Resumi-damente, os camundongos foram irradiados como segue: os camundongosforam colocados em pequenas caixas de plástico com a cabeça para fora dacaixa. Os animais foram colocados com suas costas sob o irradiador, e seupescoço fixado em um pequeno túnel de plástico para manter sua cabeçaem uma posição correta. O corpo foi protegido com chumbo.

Antes da irradiação os camundongos foram mantidos com umaração granular de camundongo padrão, entretanto após a irradiação os ca-mundongos foram alimentados com um alimento semilíquido que foi renova-do cada dia.

A reação da mucosa dos lábios foi então avaliada por 2 obser-vadores independentes de acordo com o sistema de avaliação desenvolvidopor Parkins et aí. (Parkins et aí, Radiotherapy & Oncology, 1: 165-173, 1983), no qual o estado de eritema assim como a presença de edema, des-camação e exudação foi especificada. Adicionalmente os animais foram pe-sados antes de cada registro de seu estado de eritema/edema.

Os resultados desses experimentos indicam que os peptídeosTAT-IB(s) da invenção podem proteger contra perda de peso e eritema/ede-ma associado com radiação ionizante.

Exemplo 13: Supressão de fatores de transcrição de JNK por peptídeos L-TAT-IB1(s) da invenção

Ensaios de retardo em gel foram realizados com uma sonda du-pla marcada AP-1 (5'-CGC TTG ATG AGT CAG CCG GAA-3" (SEQ ID NO:27). Extratos nucleares de células HeLa que foram tratados ou não por umahora com 5 ng/ml de TNF-α, como indicado. Peptídeos TAT e L-TAT-IBI(s)da invenção foram adicionados 30 minutos antes de TNF-α. Apenas a partedo gel com o complexo de DNA de AP-1 específico (como demonstrado porexperimentos de competição com competidores não marcados específicos einespecífico) é mostrada.

Peptídeos L-TAT-IBI(s) da invenção diminuem a formação docomplexo de ligação de DNA de AP-1 em presença de TNF-α.Exemplo 14: Avaliação da neuroprotecão contra isauemia focai cerebral, emum modelo de MCAO permanente - Determinação da eficácia da proteçãoem doses diferentes (vide Figura 3)

Isquemia focai cerebral foi induzida em ratos de 12 dias de ida-de. Filhotes foram anestesiados em uma câmara de indução com 2% de iso-flurano e durante a operação a anestesia foi mantida usando uma máscarasob 2% de isoflurano. MCAO foi induzido por eletrocoagulação de um ramoprincipal da artéria cerebral mediai (MCA). Os ratos foram colocados do ladodireito, e uma incisão dérmica oblíqua foi feita entre a orelha e o olho. Após excisão do músculo temporal, o osso craniano foi removido da sutura frontalpara um nível abaixo do arco zigomático. O MCA restante, exposto logo a -pós sua aparição sobre a fissura nasal foi permanentemente eletrocoaguladoao nível da veia cerebral inferior antes do MCA bifurcar nos ramos frontal eparietal. A incisão de pele craniana foi então fechada. Os filhotes de rato fo-ram então colocados em uma incubadora e mantidos a 37°C até que elesacordaram, e foram então transferidos para suas mães.

6 horas mais tarde, um peptídeo D-TAT-IBI(s) da invenção deacordo com SEQ ID NO: 11 foi injetado intraperitonealmente. 24 horas apósa coagulação, os ratos foram anestesiados com hidrato de cloral e perfundi-dos através da aorta ascendente com 4% de paraformaldeído em PBS. Oscérebros foram então removidos e mantidos por 2 horas na mesma soluçãode fixação, e colocados em um gradiente de 30% de sacarose em PBS porcerca de 15 horas a 4°C. Os cérebros foram congelados em isopentano (-40°C) e armazenados a -20°C. Seções de criostato coronais de 50 μηι foram coletadas em lâminas de vidro. As seções foram coradas com violeta de cre-sil. Cada décimo de seção foi analisado e o volume total da lesão foi calcu-lado usando o programa Neuroleucida. No grupo de controle A, o volumemédio da lesão foi de 21,47 mm3. Todos os grupos tratados têm uma médiamenor do que o grupo de controle. Uma diferença estatística significativa é ob- servada entre o grupo A e os grupos C, E e F (teste-T unicaudal, p=0,030, p=0,002, p=0,001, respectivamente). Os resultados são mostrados na Figura 4.

Como um resultado, esses dados suportam a conclusão de queo peptídeo quimérico D-TAT-IBI(s) da invenção de acordo com SEQ ID NO:11, administrado em uma dose de 11 mg/kg, 3 mg/kg, 0,3mg/kg e 0,03 mg/kg, contribui para proteção cerebral. Os resultados em uma dose de 1mg/kg, 0,003 mg/kg e 0,0003 comparados com o grupo de salina sugeremque a amostra total não era grande o suficiente para atingir uma diferençasignificativa. A melhor proteção é observada em uma dose de 0,03 mg/kg.

Exemplo 15: Avaliação de neuroprotecão por peptídeos auiméricos da in-venção após administração i.v. contra isquemia cerebral focai, em um mode-lo de MCAO transitório (vide figura 4)

Isquemia transitória em camundongos adultos. Usando camun-dongos ICR-CD1 machos (6 semanas de idade; 18-37 g; Harlan), provocou-se isquemia pela introdução de um filamento desde a artéria carótida comumpara dentro da carótida interna e avançando para dentro do círculo arterial,assim ocluindo a artéria cerebral mediai. Mediu-se o fluxo sangüíneo cere-bral regional por fluxometria de laser Doppler, com uma sonda fixa sobre ocrânio por toda a isquemia até 10 min após a reperfusão. A temperatura retalfoi medida e mantida a 37°C. Os camundongos foram mortos 48h após areperfusão. Seções de criostato seriadas de 20 μιτι de espessura foram in-vestigadas usando um sistema de microscópio computadorizado equipadocom o programa Neurolucida (MicroBrightFieId) e os volumes da área is-quêmica e do cérebro total foram calculados (de forma cega) com o progra-ma Neuroexplorer.

XG-102 0,3= 0,3 mg/kg, XG-102 1= 1 mg/kg, XG-102 5= 5 mg/kg

Os tamanhos de volume de infarto (mm3) após administração demassa i.v. de placebo e XG-102 0,3; 1 e 3 mg/kg; 6 horas após a reperfusão("clamp" de 30 minutos) em um modelo de camundongos adultos foram co-mo segue.

<table>table see original document page 65</column></row><table>

Exemplo 16: Ensaio em culturas neuronais pela medição de liberação de LDHapós estímulo com NMDA (vide Figura 5)

O efeito neuroprotetor do peptídeo D-TAT-IB (genérico)(s)/D-JNKI1(SEQ ID NO: 12) foi avaliado em culturas irmãs pré-tratadas por 30 min com asconcentrações indicadas de peptídeos ou MK-801 antes de exposição contínuaa NMDA 100 μΜ. Após 12 h de tratamento com NMDA, em culturas pré-tratadas com 5 μΜ de D-TAT-IB (genérico)(s)/D-JNKI1 as alterações degenera-tivas devido à exposição a NMDA foram completamente inibidas como indicadopela ausência de liberação de LDH significativa acima dos controles (Fig. 5). Oaparecimento morfológico, número e distribuição dos neurônios não foram dis-tinguíveis a partir dos controles.

Cultura neuronal cortical. Dissecou-se pequenos pedaços de córtexdos cérebros de filhotes de rato de 2 dias de idade, incubou-se com 200 unida-des de papaína por 30 min a 34°C, e então colocou-se os neurônios em densi-dades de aproximadamente 1 χ 106 células/placa em placas pré-revestidas com100 pg/ml de poli-D-lisina. O meio de plaqueamento consistiu de B27/Neuro-basal (Life Technologies, Gaithersburg, MD) suplementado com glutamina 0,5mM, penicilina 100 U/ml e estreptomicina 100 Mg/ml.

Ensaio de citotoxicidade de Iactato desidrogenase (LDH). LDH libe-rada no meio de banho 12, 24 e 48 após a administração de NMDA foi medidausando o kit de ensaio de citotoxicidade não-radiotativo Cytotox 96 Promega,Wl) (vide Fig. 5).

Exemplo 17: Inibicão de atividade de JNK endóqena em células HepG2 usandouma abordagem de uma cavidade (vide figura 6)

Células HepG2 foram semeadas a 3.000 células/cavidade no diaantes do experimento. Então concentrações crescentes de interleucina-1 β [IL-1β (ν)] ou fator de necrose tumoral α [TNFa (·)] (a) foram adicionados para ativarJNK por 30 minutos. As células foram Iisadas em Hepes 20 mM, Tween pH 7,4e processadas por AIphaScreen JNK. (b) Z' para a atividade de JNK induzidapor 10 ng/ml de IL-1 β e medido em 384 cavidades/placa (n = 96). (c) Inibição deatividade de JNK induzida por IL-1 β endógena com inibidores químicos de JNK[estaurosporina (°) e SP600125 (·)]. (d) Efeito de inibidores peptidícos L-TAT-IB1 (s) de acordo com SEQ ID NO: 9 [aqui abreviado como L-JNKi (v)) e D-TAT-IB1 (s) de acordo com SEQ ID NO: 11 (aqui abreviado como D-JNKi (♦)) eJBDs (·) (corresponde a L-JNKI sem a seqüência TAT)] sobre a atividade deJNK dependente de IL-1 β. Todos os painéis são representativos de três expe-rimentos independentes (n=3)

Métodos: Ensaio de quinase Alphascreen

Princípio: AIphaScreen é uma tecnologia não-radioativa a base deesferas usada para estudar interações biomoleculares em um formato de mi-croplacas. O acrônimo ALPHA significa "Amplified Luminescence ProximityHomogenous Assay". Ele envolve uma interação biológica que traz uma esfera"doadora" e uma "aceptora" em proximidade, então uma cascata de reaçõesquímicas age para produzir um sinal amplificado. Por excitação por laser a 680nm, um fotossensibilizador (ftalocianina) na esfera "doadora" converte o oxigê-nio do ambiente para um estado siglete excitado. Dentro de 4 pseg de meia-vida, a molécula de oxigênio singleto pode se difundir para aproximadamente200 nm em solução e se uma esfera aceptora estiver dentro dessa proximida-de, o oxigênio singleto reage com o derivado de tioxeno em esfera "aceptora",gerando quimiluminescência a 370 nm que ainda ativa fluoróforos contidos namesma esfera "aceptora". Os fluoróforos excitados subseqüentemente emitemluz a 520-620 nm. Na ausência de uma esfera aceptora, o oxigênio singleto caipara o estado mais estável e nenhum sinal é produzido.

Reagentes de quinase (B-GST-cJun, anticorpo anti P-cJun e JNK3ativo) foram primeiro diluídos em tampão de quinase (Tris-HCI 20 mM pH 7.6,MgCI2 10 mM, DTT 1 mM, Na3VO4 100 μΜ, Tween-20 0,01%) e adicionadosaos cavidades (15 μΙ). As reações foram então incubadas na presença de 10μΜ de ATP por 1 ha 23°C. A detecção foi realizada por uma adição de 10 μΙ demisturas de esferas (aceptora de Proteína A 20 μg/ml e doadora de estreptavi-dina 20 μg/ml), diluída em tampão de detecção (Tris-HCI 20 mM pH 7.4, NaCI20 mM, EDTA 80 mM, BSA 0,3%), seguido por outra incubação de 1 hora a23°C no escuro para medição de atividade endógena de JNK, ensaios de qui-nase foram realizados como descrito acima exceto que JNK3 ativa foi substituí-da por Iisados de células e os componentes de quinase da reação foram adi-cionados após a Iise das células. Anticorpos de B-GST-cjun e P-cJun foramusados nas mesmas concentrações enquanto que ATP foi usado em 50 μΜ aoinvés de 10 μΜ. O sinal de AIphaScreen foi analisado diretamente no equipa-mento Fusion ou En Vision.

Exemplo 18: Tratamento de trauma por som

D-TAT-IBI(s) foi aplicado sobre a membrana da janela redondada cóclea de 3 grupos de porcos da guiné (cada grupo com 6 animais) em 2microlitros de uma formulação de gel de 2,6% de ácido hialurônico tampona-do (Hylumed, Genzyme Corp.) em uma concentração de 100 μΜ 30 minutosantes do trauma por som (120 dB a 6 kHz durante 30 minutos) ou 30 minu-tos ou 4 após isso. Ouvidos não tratados serviram como controle. As altera-ções de limiar de audição foram avaliadas por mediadas de resposta detronco cerebral auditivo 20 minutos após trauma por som (alteração de limiartemporária, TTS) e 15 dias após o trauma (alteração de limiar permanente,PTS). Administração de D-TAT-IBI(s) protegeu contra perda auditiva per-manente mesmo se aplicado após a exposição a barulho excessivo emcomparação com ouvidos não tratados. O efeito protetor foi mais forte quan-to antes D- TAT-IB1 (s) foi administrado após o trauma por som. Dessa forma D-TAT-IB1(s) é um composto otoprotetor muito eficaz o caso de trauma por som.

A partir da descrição detalhada anterior das modalidades especí-ficas da invenção, deve ficar claro que peptídeos quiméricos bioativos per-meáveis à célula e seqüências inibidoras de JNK únicos foram descritos.Embora modalidades particulares tenham sido descritas aqui em detalhe,isso foi feito como forma de exemplo para fins de ilustração apenas, e nãopretende ser Iimitante com relação ao escopo das reivindicações anexas queseguem. Em particular, é contemplado pelo inventor que várias substitui-ções, alterações, e modificações podem ser feitas à invenção sem desconsi-derar o espírito e escopo da invenção como definida pelas reivindicações.Listagem de Seqüência

<110> XIGEN S.A.

<120> inibidores de peptldeo permeável à célulada via de transdução de sinal de jnk

<130> UOOIPOO6WO

<160> 27

<170> PatentIn versão 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> peptídeo L-IB1 (s) (veja tabela 1)

<400> 1

Arg Pro Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg15 10 15

Ser Gln Asp

<210> 2

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> PeptideD-iBi(s) (veja tabela 1)

<400> 2

Asp Gln Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg1 5 10 15

Lys Pro Arg

<210> 3

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> peptídeo D-IBI(S) (veja tabela 1)

<220 região de interesse biológico

<221><222> (1)..(18)

<223> Fórmula Geral: NH2-Xnb-Xna-RPTTLXLXXXXXXXQD-Xnb-COOH, em que X é

qualquer resíduo de aminoácido (negativo), Xna ê qualquer resíduo de aminoâcidoexceto serina e tjonila e Xnb pode ser qualquer resíduo de aminoácido<220>

<2 21> repete

<222> (1)____(1)

<223>

Xaa é Xna-Xnb como definido na fóimula geral em que π é 0 ou 1 para Xnae 0-5,5-10,10-15,15-20, 20-30 ou mais paia Xnb

<220>

<221> repete

<222> ub)..;(18)

<22 3> Xaa é Xnb como definido na formula gera], em que η é 0-5, 5-10, 10-15,15-20, 20-30 ou mais paraXnb

<400> 3

Xaa Arg Pro Thr Thr Leu Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln1 5 10 15

Asp Xaa

<210> 4

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Peptídeo D-IB (Genérico) (s) (veja tabela 1)

<220>

<221> misc_feature<222> (1)..(18)< ? ? 3>

Fórmula geral: NH2-Xnb-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xna-Xnb-COOH1 em que X é qualquer resíduo de aminoácido (negativo), Xna é qualquer resíduode aminoácido exceto serina e treonina e Xnb pode ser qualquer resíduo de aminoácido

<220>

< 2 21 > repete

<222> (1)...(1)

<223> Xaa é Xnbcomo definida na fórmula geral, em que η é 0-5, 5-10,10-15,15-20, 20-30 ou mais para<220>

<221> repete

<222> (18)...(18)<223>

Xaa ó Xna-Xnb como definido na fórmula geral em que nó 0 ou 1 para Xnae 0-5, 5-10,10-15,15-20,20-30 ou mais para

<400> 4

Xaa Asp Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Leu Thr Thr Pro 1 5 10 15

Arg Xaa<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> peptfdeo L-TAT (veja tabela 1)<400> 5

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg15 10

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<22 3> PePtideo D-TAT (veja tabela 1)

<400> 6

Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly15 10

<210> 7

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> peptideo-L-genérico-TAT(s) (veja tabela 1)

<220>

<221> misc_feature<222> (1) .. (17)<2 2 3>

Xaa é Xnb como definido na fórmula geral, em que η é 0-5, 5-10,10-15,15-20, 20-30 ou mais para Xnb

<220>

<221> repele

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<223> xaa é xnbcomo definido na fórmula geral, em que η é 0-5, 5-10,10-15,15-20, 20-30 ou mais para Xnb

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<221> repeat

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<220>

<223> peptideo D-genérico-TAT (s) (veja tabela 1)

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<220>

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<22 3> Xaa é Xnb como definido na fórmula geral, em que η é 0-5, 5-10,10-15,15-20, 20-30 ou mais para Xnb

<220>

<221> rePete

<222> (14)...(17)

<223> xaa ê xnb como definido na fórmula geral, em que η é 0-5, 5-10,10-15,15-20, 20-30 ou mais para Xnb

<4 00> 8

Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Xaa Xaa Xaa15 10 15

Xaa

<210> 9

<211> 31

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> L-TAT-IBl (s) (vejatBbela υ<400> 9

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Arg Pro Lys Arg15 10 15

Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser Gln Asp20 25 30

<210> 10

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial<220>

<22 3 > peptldeo L-TAT (genérico) (s) (veja tabela 1)

<220>

<221> raisc_feature

<222> (1)..(38)

<??3> _

NH2-Xnb-RKKRRQRRR-Xnb-Xna-RPTTLXLXXXXXXXQD-Xnb-COOH, em que X é qualquer resíduo de aminoàcido (nativo), Xna é qualquer resíduo de

aminoáádo exceto serína e treonina e Xnb pode ser qualquer residuo de aminoáddo

<220>

<221> reP^e

<222> (1)...(7)<223>

Xaa é Xnb como definido na fórmula geral em que η éO-5, 5-10,10-15,15-20, 20-30 ou mais para Xnb

<220> repete<221>

<222> (17)....(21)<223>

Xaa é Xnb como definido na fórmula geral em que η é 0-5, 5-10,10-15,· 15-20, 20-30 ou mais para Xnb

<220> repete<221>

<222> (38)...(38)

<223> Xaa é Xnb como definido na fórmula geral em que η é 0-5, 5-10,10-15,15-20, 20-30 ou mais para Xnb

<400> 10

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg15 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Pro Thr Thr Leu Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa20 25 30

Xaa Xaa Xaa Gln Asp Xaa35

<210> 11

<211> 31

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> peptldeo D-TAT-IB1 (s) (vejatabela 1)<400> 11

Asp Gln Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg15 10 15

Lys Pro Arg Pro Pro Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly20 25 30

<210> 12<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

< 2 2 3 > peptideo: D-TAT (genérico) (s) (veja tabela 1)

<220>

<221> miscfeature<222> (1)..(38)

<22 3> NH2-Xnb-DQXXXXXXXLXLTTPR-Xna-Xnb-RRRQRRKKR-Xnb-COOH, em que X é qualquer resíduo de aminoicido (nativo), Xna é qualquer resíduode aminoáddo exceto serina e treorúna e Xnb pode ser qualquer aminoáddo;

<220>

<221> rePete

<222> (1)...(7)

<223> Xaa é Xnb como definido na fórmula geral, em que η é 0-5,5-10,10-15, 15-20, 20-30 ou mais para Xnb

<220>

<221> rePete

<222> (18)____(22)

<223>

Xaa é Xnb como definido na fórmula geral, em que η é 0-5, 5-10, 10-15,15-20, 20-30 ou mais para Xnb

<220>

<221> repete

<222> (38)____(38),

Xaa ê Xnb como definido na fórmula geral, em que η é 0-5, 5-10,10-15,15-20, 20-30 ou mais para Xnb

<400> 12

Xaa Asp Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Leu Thr Thr Pro15 10 15

Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Xaa20 25 30

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa35

<210> 13

<21i> 29

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> peptldeo IBI-Iongo (veja tabela 1)<400> 13

Pro Gly Thr Gly Cys Gly Asp Thr Tyr Arg Pro Lys Arg Pro Thr Thr15 10 15

Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser Gln Asp Thr<210> 14

<211> 27

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> peptideo IB2-longo (veja tabela 1)

<400> 14

Ile Pro Ser Pro Ser Val Glu Glu Pro His Lys His Arg Pro Thr Th15 10 15

Leu Arg Leu Thr Thr Leu Gly Ala Gln Asp Ser20 25

<210> 15

<211> 29

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> peptideo derivado de c-Jun (veja tabela 1)

<4 00> 15

Gly Ala Tyr Gly Tyr Ser Asn Pro Lys Ile Leu Lys Gln Ser Met Th1 5 10 15

Leu Asn Leu Ala Asp Pro Val Gly Asn Leu Lys Pro His20 25

<210> 16

<211> 29

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> peptideo derivado de ATF2 (veja tabela 1)<400> 16

Thr Asn Glu Asp His Leu Ala Val His Lys His Lys His Glu Met Th15 10 15

Leu Lys Phe Gly Pro Ala Arg Asn Asp Ser Val Ile Val20 25

<210> 17

<211> 23

<212> PRT

<213> Artificial<220>

<223> peptídeo L-IB1 (vejatabels 1)<400> 17

Asp Thr Tyr Arg Pro Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln1 5 10 15

Val Pro Arg Ser Gln Asp Thr20

<210> 18

<211> 23

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> peplldeo D-IBKveja tabelai)<400> 18

Thr Asp Gln Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro1 .5 10 15

Arg Lys Pro Arg Tyr Thr Asp20

<210> 19

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> peptídeo L-IB (genérico) (veja tabela 1)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1) . . (17)

<2 2 3> χ é selecionado de qualquer resíduo de amlnoácido (nativo)<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(18)

<22 3> χ é selecionado de serina e treonina

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(19)

<223> χ é selecionado de qualquer resíduo de aminoácido (nativo)<400> 19

Xaa Arg Pro Thr Thr Leu Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln

15 10 15

Asp Xaa Xaa<210> 20<211> 19<212> PRT<213> Artificial<220><223> peptfdeo D-IB (genérico) (veja tabela 1)<220><221> misc_feature<2Z2> (1) . . fl)<223>X é selecionado de qualquer resíduo de arninoácido (nativo),<220><221> raisc_feature<222> (2)..(2)<223> χ é selecionado de serina e treonina<220><221> misc_feature<222> (3)..(19)<223> χ e selecionado de qualquer resíduo de arninoácido (nativo),<400> 20

Xaa Xaa Asp Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Leu Thr Thr15 10 15

Pro Arg Xaa

<210> 21<211> 17<212> PRT<213> Artificial<220><223> peptldeo L-genérico-TAT (veja tabela 1)<220><221> misc_feature<222> (1)..(17)

< 2 2 3 > χ é selecionado de qualquer resíduo de arninoácido (nativo),<400> 21

Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Xaa Xaa15 10 15

Xaa

<210> 22<211> 17<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> peptideo D-genérico-TAT (veja tabela 1)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(17)

<223> X é selecionado de qualquer resíduo de aminoécido (nativo),

<400> 22

Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Xaa Xaa Xaa15 10 15

Xaa

<210> 23

<211> 35

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> peptideo L-TAT-IB1 (veja tabela 1)

<400> 23

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Asp Thr Tyr Arg1 5 10 15

Pro Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser20 25 30

Gln Asp Thr35

<210> 24

<211> 42

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

< 2 2 3 > PePtideo L-TAT (genérico) (veja tabela 1)

<220>

<221> nisc_feature

<222> Cl)..(40)

<223> X é selecionado de qualquer resíduo de aminoâcido (nativo),<220>

<221> misc_feature

<222> (41)..(41)

X é selecionado de serina e treonina<220>

<221> misc_feature<222> (42) . . (42)

<223> χ selecionado de qualquer resíduo de aminoáddo (nativo),<400> 24

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg1 5 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Pro Thr Thr Leu Xaa Leu Xaa20 25 30

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Asp Xaa Xaa35 40

<210> 25

<211> 35

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<2 2 3> peptideo D-TAT-IB1 (veja tabela 1)<400> 25

Thr Asp Gln Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro15 10 15

Arg Lys Pro Arg Tyr Thr Asp Pro Pro Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys20 25 30

Lys Arg Gly35

<210> 26

<211> 42

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

< 2 2 3 > peptideo D-TAT (genérico) (veja tabela 1)

misc_feature(1) ■ · (1)

X é selecionado de qualquer resíduo de aminoácido (nativo),<220>

<221> misc_feature<222> (2).. (2)<223> χ é selecionado de serina e treonina;

<220>

<221> misc feature

<220><221><222><223><222> (3)..(42)

X é selecionado de qualquer resíduo de aminoácido (nativo).<400> 26

Xaa Xaa Asp Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Leu Thr Thr15 10 15

Pro Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg20 25 30

Lys Lys Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa35 40

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

< 2 2 3> Sonda para ensaio de retardação em gel (veja Exemplo 13)

<400> 27

CGCTTGATGA GTCAGCCGGA A

Claims

1. Seqüência inibidora de JNK que compreende menos do que-150 aminoácidos de extensão, em que a seqüência inibidora compreende ouconsiste em pelo menos uma seqüência de aminoácidos de acordo comSEQ ID NOs: 1, 2, 3 ou 4, ou um fragmento, derivado ou variante das mesmas.

2. Seqüência inibidora de JNK de acordo com a reivindicação 1,em que a seqüência inibidora de JNK compreende uma faixa de 5 a 150 re-síduos de aminoácidos, mais preferivelmente 10 a 100 resíduos de aminoá-cidos, ainda mais preferivelmente 10 a 75 resíduos de aminoácidos e o maispreferivelmente uma faixa de 15 a 50 resíduos de aminoácidos.

3. Seqüência inibidora de JNK de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 2, em que a seqüência inibidora de JNK se liga a c-junamino terminal quinase (JNK).

4. Seqüência inibidora de JNK de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 3, em que a seqüência inibitória de JNK inibe a ativaçãode pelo menos um fator de transcrição atingido por JNK quando a seqüênciainibidora de JNK está presente em uma célula que expressa JNK.

5. Seqüência inibidora de JNK de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 4, em que o fator de transcrição atingido por JNK é sele-cionado a partir do grupo que consiste em c-Jun, ATF2, e Elkl.

6. Seqüência inibidora de JNK de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 5, em que a seqüência inibidora de JNK altera um efeitode JNK quando o peptídeo está presente em uma célula que expressa JNK.

7. Peptídeo quimérico que compreende pelo menos um primeirodomínio e pelo menos um segundo domínio ligados por uma ligação cova-lente, o primeiro domínio compreendendo uma seqüência de tráfego e o se-gundo domínio compreendendo uma seqüência inibidora de JNK.

8. Peptídeo de acordo com a reivindicação 7, em que a seqüên-cia de tráfego compreende a seqüência de aminoácidos de um polipeptídeoTAT do vírus da imunodeficiência humana.

9. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a-8, em que a seqüência de tráfego compreende a seqüência de aminoácidosdas SEQ ID NO: 5, 6, 7 ou 8.

10. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 7a 9, em que as seqüências de tráfego aumentam a absorção celular do pep-tídeo.

11. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 7a 9, em que a seqüência de tráfego direciona a localização nuclear do peptídeo.

12. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 7a 11, em que a seqüência inibidora de JNK compreende uma seqüência ini-bidora de JNK como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

13. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 7a 12, em que o peptídeo compreende a seqüência de aminoácidos de qual-quer uma das SEQ ID NOs: 9, 10, 11 ou 12, ou um fragmento, ou variantedos mesmos.

14. Ácido nucléico isolado que codifica uma seqüência inibidorade JNK como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 ou um pep-tídeo quimérico como definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 13.

15. Vetor que compreende o ácido nucléico como definido nareivindicação 14.

16. Célula que compreende o vetor como definido na reivindicação 15.

17. Anticorpo que se liga imunoespecificamente a uma seqüên-cia inibidora de JNK como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a-6 ou a um peptídeo quimérico como definido em qualquer uma das reivindi-cações 7 a 13.

18. Composição farmacêutica que compreende uma seqüênciainibidora de JNK como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6ou a um peptídeo quimérico como definido em qualquer uma das reivindica-ções 7 a 13 ou um ácido nucléico como definido na reivindicação 14, e umveículo farmaceuticamente aceitável.

19. Uso de uma seqüência inibidora de JNK como definido emqualquer uma das reivindicações 1 a 6 ou de um peptídeo quimérico comodefinido em qualquer uma das reivindicações 9 a 13 para a preparação deuma composição farmacêutica para tratar uma patofisiologia associada coma ativação de JNK em um indivíduo.

20. Uso de acordo com a reivindicação 19, em que a patofisiolo-gia é selecionada a partir de malignidades do pulmão, de mama, linfóides, edo trato gastrointestinal e genito-urinário, assim como adenocarcinomas,incluindo malignidades tais como cânceres de cólon, carcinoma de célularenal, câncer de próstata, carcinoma de células não pequenas do pulmão,câncer do intestino delgado e câncer do esôfago, assim como leucemia, dis-túrbios ou patofisiologias associadas à transformação oncogênica assim co- mo cânceres com transformações oncogênicas de Bcr-Abl, doenças prolife-rativas celulares não malignas ou relacionadas à imunidade, selecionadas apartir de psoríase, pênfigo vulgar, síndrome de Behcet, síndrome do descon-forto respiratório agudo (ARDS), doença cardíaca isquêmica, síndrome pós-diálise, artrite reumatóide, síndrome da imunodeficiência adquirida, vasculite, choque séptico, patofisiologias associadas à ativação de JNK em uma célulaselecionada a partir de reestenose-, perda da audição, trauma do ouvido, is-quemia, derrame e/ou distúrbios e/ou patofisiologias associadas à matura-ção e diferenciação de células imunes, lesões de reperfusão, hipóxia, rela-cionadas à apoptose, resposta a estímulo estressánte e com efeitos secun-dários devido à tratamento com citocinas pró-inflamatórias, efeitos associa-dos a diabetes ou com tensão mecânica da célula, selecionados entre esta-dos patológicos induzidos por hipertensão arterial, incluindo hipertrofia docoração e cardíaca e lesões ateroscleróticas e em bifurcações de vasossangüíneos, por radiação ionizante como usada em radioterapia e luz ultra- violeta (luzes UV), por radicais livres, agentes que danificam o DNA, incluin-do fármacos quimioterápicos, por lesões de isquemia/reperfusão, por hipó-xia, por hipo- e hipertermia ou para inibir doenças inflamatórias, autoinflama-tórias, imunes e auto-imunes, doenças degenerativas, miopatias, cardiomio-patias e rejeição de enxerto.

21. Uso de acordo com a reivindicação 19 ou 20, em que a com-posição farmacêutica deve ser administrada por uma via de administraçãoselecionada a partir do grupo que consiste em intraperitoneal, nasal, intrave-nosa, oral e liberação por emplastro.

22. Método para preparar um peptídeo quimérico como definidoem qualquer uma das reivindicações 7 a 13, o método compreendendo: (a)cultivar uma célula que contém um ácido nucléico como definido na reivindi-cação 14 sob condições que fornecem a expressão do peptídeo quimérico; e(b) recuperar o peptídeo expresso.

23. Kit compreendendo uma seqüência inibidora de JNK comodefinida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e/ou um peptídeo quimé-rico como definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 13 e/ou um áci-do nucléico como definido na reivindicação 14 e/ou um vetor como definidona reivindicação 15 e/ou uma célula como definida na reivindicação 16 e/ouum anticorpo como definido na reivindicação 17.