BRPI0616894B1 - polipeptídeo de seda recombinante, polinucleotídeo exógeno, vetor de expressão, célula hospedeira bacteriana ou de levedura, processo para preparar um polipeptídeo de seda, produto, composição, uso e kit - Google Patents

Abstract

proteínas da seda. a presente invenção provê proteínas da seda, bem como ácidos nucléicos que codificam essas proteínas. a presente invenção também provê células recombinantes e/ou organismos que sintetizam proteínas da seda. proteínas da seda da invenção podem ser utilizadas para uma variedade de finalidades como na fabricação de produtos de higiene pessoal, plásticos, artigos têxteis e produtos biomédicos.

Description

POLIPEPTÍDEO DE SEDA RECOMBINANTE, POLINUCLEOTÍDEO EXÓGENO, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA BACTERIANA OU DE LEVEDURA, PROCESSO PARA PREPARAR UM POLIPEPTÍDEO DE SEDA, PRODUTO, COMPOSIÇÃO, USO E KIT

Campo da invenção [001] A presente invenção refere-se a proteinas da seda, bem como a ácidos nucléicos que codificam tais proteinas. A presente invenção também se refere a células recombinantes e/ou organismos que sintetizam proteinas da seda. Proteinas da seda da invenção podem ser utilizadas para uma variedade de finalidades como na produção de produtos de higiene pessoal, plásticos, artigos têxteis e produtos biomédicos.

Antecedentes da invenção [002] Sedas são secreções de proteína fibrosa que apresentam resistência e tenacidade excepcionais e como tal têm sido o alvo de extenso estudo. Sedas são produzidas por mais de 30.000 espécies de aranhas e por muitos insetos. Uma quantidade bem pequena dessas sedas tem sido caracterizada, com a maior parte da pesquisa se concentrando em seda de casulo do bicho-da-seda domesticado, Bombyx mori e na seda de linha de arrasto da aranha de tecedura redonda Nephila clavipes.

[003] Em Lepidóptera e em aranha, os genes de seda de fibroína codificam para proteínas que são genericamente grandes com domínios de terminal hidrofílicos predominantes em qualquer extremidade cobrindo uma região extensa de blocos hidrofóbicos e hidrofílicos alternados (Bini e outros; 2004). Genericamente, essas proteínas compreendem diferentes combinações de conjuntos cristalinos de folhas β-pregueadas associadas de forma solta a folhas-β, espirais-βιη hélices-α e regiões amorfas (vide Craig e Riekel, 2002 para exame).

[004] Como fibras de seda representam algumas das fibras naturais mais fortes conhecidas, têm sido submetidas à extensa pesquisa em tentativas para reproduzir sua síntese. Entretanto, um problema recorrente com expressão de genes de fibroína de aranha e Lepidópteras tem sido baixas taxas de expressão em vários sistemas de expressão recombinante devido à combinação dos motivos de nucleotídeo de repetição no gene de seda que levam a eventos de recombinação prejudiciais, tamanho grande, gene e número pequeno de códons utilizados para cada aminoácido no gene que leva à depleção de reuniões de tRNA nas células hospedeiras. Expressão recombinante leva a dificuldades durante translação como pausas traducionais como resultado de preferências de códon e demandas de códon e taxas de recombinação extensas que levam a truncamento dos genes. Seqüências menos repetitivas e mais curtas evitariam vários dos problemas associados à expressão de gene de seda até a presente data.

[005] Em contraste com o conhecimento extenso que acumulou sobre Lepidópteras (em particular a seda de casulo de Bombyx mori) e aranha (em particular a seda de linha de arrasto de Nephila clavipes) pouco se sabe sobre a composição química e organização molecular de outras sedas de insetos.

[006] No início da década de 60, a seda de himenóptero aculeado foi mostrada como tendo uma estrutura alfa-helicoidal por padrões de difração de raios X obtidos a partir de fibras de seda tiradas da glândula salivar de abelha de mel de larva (Rudall, 19 62) . Além de demonstrar que essa seda era helicoidal, os padrões obtidos foram indicativos de um sistema de de espiral enrolada de cadeias alfa-helicoidal (Altkins, 1967). Padrões de difração de raios X similares foram obtidos para sedas de casulo a partir de outras espécies Aculeadas incluindo a vespa Pseudopompilus humbolti (Rudall, 1962) e abelhão, Bombus lucorum (Lucas e Rudall, 1967).

[007] Em contraste com a estrutura alfa-helicoidal descrita nas sedas Aculeadas, as sedas caracterizadas a partir de um clade relacionado à aculeada, Ichneumonoidea, têm estruturas β-paralelas. Diagramas de raios X para quatro exemplos dessa estrutura foram descritos em Braconidae (Cotesia (=Apenteles) glomerate; Cotesia (=Apenteles) gonopterygis; Apenteses bignelli) e três em Ichneumonidae (Dusona sp.; Phytodietris sp.; Branchus femoralis) (Lucas e Rudall, 1967) . Além da seqüência de uma única seda de Branconidade (Cotesia glomerate) foi descrita (número de acessão de banco de dados Genbank AB188680; Yamada e outros; 2004). Essa seqüência de proteína parcial consiste em uma repetição de X-asparagina 28, altamente conservada (onde X é alanina ou serina) e não é predita como contendo repetições heptavalentes contendo espiral enrolada. Análise extensa da composição de aminoácido das sedas de casulo da Braconidae mostrou que as sedas a partir da subfamília Microgastrinae são exclusivas em seu teor elevado de asparagina e serina (Lucas e outros; 1960; Quicke e outros; 2004) . Subfamílias relacionadas produzem sedas com composições de aminoácido significativamente diferentes sugerindo que as sedas Microgastrinae se desenvolveram especificamente nessa subfamilia (Yamada e outros, 2004). O cDNA parcial de Cotesia glomerata foi isolado utilizando iniciadores PCR designados a partir da seqüência obtida de peptídeos internos derivados de proteínas da seda de casulo isoladas. A composição de aminoácidos predita dessa seqüência parcial lembra de perto a composição de aminoácidos da seda extensamente lavada dessa espécie.

[008] A estrutura de muitas das sedas dentro de outra Apocrita não aculeada e dentro do texto de Himenópteros (Symphata) são mais comumente folhas-β paralelas, com sedas tanto semelhantes a colágeno como poliglicina produzidas pela Tenthredinidae (Lucas e Rudall, 1967).

[009] Proteínas da seda de abelha de mel são sintetizadas no meio do instar final e podem ser imageadas como uma mistura de proteínas da seda despolimerizadas (Silva-Zacarin e outros; 2003). À medida que o instar progride, água é retirada da glândula e a desidratação resulta na polimerização da proteína de seda para formar filamentos de seda insolúveis e bem organizados rotulados tactóides (Silva-Zacarin e outros; 2003). A desidratação progressiva leva a reorganização adicional dos tactóides (Silva-Zacarin e outros, 2003) e possivelmente nova ligação interfilamentos entre filamentos (Rudall, 1962). Imagens de microscópio de elétron de fibrilas isolados a partir da glândula de seda de abelha de mel mostram estruturas com diâmetro de aproximadamente 20-25 angstroms (Flower e Kenchington, 1967). Esse valor é compatível com espiras enroladas com três, quatro ou cinco fitas.

[0010] A composição de aminoácidos das sedas de várias espécies de Himenóptero aculeado foi determinada por Lucas e Rudall (1967) e verificada como contendo elevados teores de alanina, serina, os resíduos de ácido, ácido aspártico, e ácidos glutâmicos, e quantidades reduzidas de glicina em comparação com fibroínas clássicas. Foi considerado que o teor helicoidal da seda de Himenóptero aculeado era uma conseqüência de um teor reduzido de glicina e teor aumentado de resíduos acídicos (Rudall e Kenchington, 1971).

[0011] Pouco se sabe sobre a seda larval de lagartas verdes (Ordem: Neuroptera). O casulo é compreendido de duas camadas, uma camada sólida interna e uma camada fibrosa externa. Anteriormente o casulo foi descrito como sendo compreendido de uma seda de cuticulina (Rudall e Kenchington, 1971); uma descrição que somente se relacionada à camada sólida interna. LaMunyon (1988) descreveu uma substância excretada a partir dos túbulos de malpighi que compunham as fibras externas. Após depósito dessa camada, a parede interna sólida foi construída a partir de secreções das células epiteliais no lúmen altamente viloso (LaMunyon, 1988).

[0012] Também é sabido que larvas de lagartas verdes produzem uma substância adesiva proteinácea a partir dos túbulos de malpighi através de todos os instares para aderir às larvas aos substratos, para colar itens de camuflagem no dorso das larvas ou reter a presa (Speilger, 1962). No gênero Lomamyia (Bethothidae), as larvas produzem a seda e substância adesiva ao mesmo tempo e foi postulado que essas duas substâncias podem bem ser o mesmo produto (Speilger, 1962). A secreção adesiva é altamente solúvel e também se pensa que é associada à defesa contra predadores (LaMunyon & Adams; 1987).

[0013] Considerando as propriedades exclusivas de sedas produzidas por insetos como Himenópteros e Neuropteros, há necessidade para identificação de novos ácidos nucléicos que codificam proteínas da seda a partir desses organismos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0014] Os presentes inventores identificaram inúmeras proteínas da seda a partir de insetos. Essas proteínas da seda são surpreendentemente diferentes de outras proteínas da seda conhecidas em sua seqüência primária, estrutura secundária e/ou teor de aminoácidos.

[0015] Desse modo, em um primeiro aspecto a presente invenção provê um polipeptídeo de seda substancialmente purificado e/ou recombinante, onde pelo menos uma porção do polipeptídeo tem uma estrutura de espiral enrolada.

[0016] Como sabido na técnica, estruturas de espiral enrolada de polipeptídios são caracterizadas por repetições heptavalentes representadas pela seqüência de consenso (abcdefg)n, com resíduos genericamente hidrofóbicos em posição a e d, e resíduos genericamente polares nas posições restantes. Surpreendentemente, os heptavalentes dos polipeptideos da presente invenção têm uma composição nova quando vistos coletivamente - com uma abundância incomumente elevada de alanina nas posições heptavalentes 'hidrofóbicas' a e d. Adicionalmente, há níveis elevados de resíduos polares pequenos nessas posições. Além disso, a posição e tem também níveis elevados de alanina e resíduos hidrofóbicos pequenos.

[0017] Por conseguinte, em uma modalidade particularmente preferida, a porção do polipeptídeo que tem uma estrutura de espiral enrolada compreende pelo menos 10 cópias da seqüência heptavalente abcdefg, e pelo menos 25% dos aminoácidos nas posições a e d são resíduos de alanina.

[0018] Em uma modalidade adicional, preferida, a porção do polipeptídeo que tem uma estrutura de espiral enrolada compreende pelo menos 10 cópias da seqüência heptavalente abcdefg, e pelo menos 25% dos aminoácidos nas posições a, d e e são resíduos de alanina.

[0019] Em uma modalidade adicional, preferida, a porção do polipeptídeo que tem uma estrutura de espiral enrolada compreende pelo menos 10 cópias da seqüência heptavalente abcdefg, e pelo menos 25% dos aminoácidos na posição a são resíduos de alanina.

[0020] Em uma modalidade adicional, preferida, a porção do polipeptídeo que tem uma estrutura de espiral enrolada compreende pelo menos 10 cópias da seqüência heptavalente abcdefg, e pelo menos 25% dos aminoácidos na posição d são resíduos de alanina.

[0021] Em uma modalidade adicional, preferida, a porção do polipeptídeo que tem uma estrutura de espiral enrolada compreende pelo menos 10 cópias da seqüência heptavalente abcdefg, e pelo menos 25% dos aminoácidos na posição e são resíduos de alanina.

[0022] Em uma modalidade particularmente preferida, pelo menos 10 cópias da seqüência heptavalente são contíguas.

[0023] Em uma modalidade adicional, preferida, a porção do polipeptídeo que tem uma estrutura de espiral enrolada compreende pelo menos 5 cópias da seqüência heptavalente abcdefg, e pelo menos 15% dos aminoácidos nas posições a e d são resíduos de alanina.

[0024] Em uma modalidade adicional, preferida, a porção do polipeptídeo que tem uma estrutura de espiral enrolada compreende pelo menos 5 cópias da seqüência heptavalente abcdefg, e pelo menos 15% dos aminoácidos nas posições a, d e e são resíduos de alanina.

[0025] Em uma modalidade adicional, preferida, a porção do polipeptídeo que tem uma estrutura de espiral enrolada compreende pelo menos 5 cópias da seqüência heptavalente abcdefg, e pelo menos 15% dos aminoácidos na posição a são resíduos de alanina.

[0026] Em uma modalidade adicional, preferida, a porção do polipeptídeo que tem uma estrutura de espiral enrolada compreende pelo menos 5 cópias da seqüência heptavalente abcdefg, e pelo menos 15% dos aminoácidos na posição d são resíduos de alanina.

[0027] Em uma modalidade adicional, preferida, a porção do polipeptídeo que tem uma estrutura de espiral enrolada compreende pelo menos 5 cópias da seqüência heptavalente abcdefg, e pelo menos 15% dos aminoácidos na posição e são resíduos de alanina.

[0028] Em uma modalidade particularmente preferida, pelo menos 5 cópias da seqüência heptavalente são contíguas.

[0029] Em uma modalidade, o polipeptídeo compreende uma seqüência selecionada a partir de: i) uma seqüência de aminoácidos como fornecido em qualquer uma entre SEQ ID N° : 1; SEQ ID N° : 2; SEQ ID N°: 22; SEQ ID N°: 23; SEQ ID N°: 40; SEQ ID N°: 41; SEQ ID N°: 56 e SEQ ID N°: 57; ii) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 30% idêntica a qualquer uma ou mais entre SEQ ID N°: 1; SEQ ID N°: 2; SEQ ID N°:22; SEQ ID N°:23; SEQ ID N°:40; SEQ ID N°:41; SEQ ID N°:56 e SEQ ID N°:57; e iii) um fragmento biologicamente ativo de i) ou ii).

[0030] Em outra modalidade, o polipeptídeo compreende uma seqüência selecionada a partir de: i) uma seqüência de aminoácidos como fornecido em qualquer uma entre SEQ ID N° : 3; SEQ ID N° : 4; SEQ ID N° : 24; SEQ ID N°: 25; SEQ ID N°: 42; SEQ ID N°: 43; SEQ ID N°: 58 e SEQ ID N°: 59; ii) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 30% idêntica a qualquer uma ou mais das SEQ ID N° : 3; SEQ ID

N ° : 4; SEQ ID N°:24; SEQ ID N°:25; SEQ ID N°:42; SEQ ID N° : 43; SEQ ID N°:58 e SEQ ID N°:59; e iii) um fragmento biologicamente ativo de i) ou ii).

[0031] Em outra modalidade, o polipeptídeo compreende uma seqüência selecionada a partir de: i) uma seqüência de aminoácidos como fornecido em qualquer uma entre SEQ ID N° : 5; SEQ ID N° : 6; SEQ ID N°: 26; SEQ ID N°: 27; SEQ ID N°: 44; SEQ ID N°: 45; SEQ ID N°: 60 e SEQ ID N°: 61; ii) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 30% idêntica a qualquer uma ou mais das SEQ ID N° : 5, SEQ ID

N°:6, SEQ ID N°:26, SEQ ID N°:27, SEQ ID N°:44, SEQ ID N° : 45, SEQ ID N°:60 e SEQ ID N°:61; e iii) um fragmento biologicamente ativo de i) ou ii).

[0032] Em outra modalidade, o polipeptideo compreende uma seqüência selecionada entre: i) uma seqüência de aminoácidos como fornecido em qualquer uma entre SEQ ID N° : 7; SEQ ID N° : 8; SEQ ID N° : 28; SEQ ID N°: 29; SEQ ID N°: 46; SEQ ID N°: 47; SEQ ID N°: 62 e SEQ ID N°: 63; ii) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 30% idêntica a qualquer uma ou mais das SEQ ID N°: 7, SEQ ID

N° : 8, SEQ ID N°:28, SEQ ID N°:29, SEQ ID N°:46, SEQ ID N° : 47, SEQ ID N°:62 e SEQ ID N°:63; e iii) um fragmento biologicamente ativo de i) ou ii).

[0033] Em uma modalidade adicional, o polipeptideo compreende uma seqüência selecionada entre: i) uma seqüência de aminoácidos como fornecido em SEQ ID N°: 72 ou SEQ ID N°: 73; ii) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 30% idêntica a SEQ ID N°: 72 e/ou SEQ ID N°: 73; e iii) um fragmento biologicamente ativo de (i) ou (ii).

[0034] Proteínas da seda adicionais que co-associam a proteínas do primeiro aspecto foram identificadas. Uma dessas proteínas (SEQ ID N°: 10) é predita como tendo 41% alfa-helicoidal, 8% beta-folha e 50% de estrutura secundária de laço por PROFsec, e portanto, é classificada como uma proteína de estrutura misturada. A análise de MARCOIL dessa proteína previu somente uma região curta de repetições heptavalentes características de proteínas com uma estrutura de espiral enrolada.

[0035] Por conseguinte, em um segundo aspecto, a presente invenção provê um polipeptídeo de seda substancialmente purificado e/ou recombinante que compreende uma seqüência selecionada de: i) uma seqüência de aminoácido como fornecido em qualquer uma das SEQ ID N° : 9; SEQ ID N° : 10 e SEQ ID N°: 30; ii) uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 30% idêntico a qualquer um ou mais das SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10 e SEQ ID N°: 30; e iii) um fragmento biologicamente ativo de i) ou ii).

[0036] Sem desejar ater-se à teoria, parece que quatro proteínas do primeiro aspecto se tornam entrelaçadas para formar um feixe com eixos helicoidais quase paralelos entre si, e esse feixe estende-se axialmente para dentro de uma fibrila. Além disso, é previsto que pelo menos em algumas espécies como abelha de mel e abelhão as proteínas do segundo aspecto atuam como uma "cola" auxiliando a ligar vários feixes de proteínas de espiral enrolada do primeiro aspecto, juntos, para formar um complexo de proteína fibrosa. Entretanto, fibras e copolímeros de seda podem ainda ser formados sem um polipeptídeo de segundo aspecto.

[0037] Em uma modalidade preferida, um polipeptídeo da invenção pode ser purificado a partir de, ou é um mutante de um polipeptideo purificado a partir de uma espécie de Himenóptera ou Neuroptera. Preferivelmente, a espécie de himenóptera é Apis mellifera, Oecophylla smaragdina, Myrmecia foricata ou Bombus terrestris. Preferivelmente, a espécie de Neuroptera é Mallada signata.

[0038] Em outro aspecto, a presente invenção provê um polipeptideo da invenção fundido com pelo menos outro polipeptideo.

[0039] Em uma modalidade preferida, pelo menos outro polipeptideo é selecionado do grupo que consiste em: um polipeptideo que aumenta a estabilidade de um polipeptideo da presente invenção, um polipeptideo que auxilia na purificação da proteína de fusão e um polipeptideo que auxilia no polipeptideo da invenção sendo secretado a partir de uma célula (por exemplo, secretado a partir de uma célula de planta).

[0040] Em outro aspecto, a presente invenção provê um polinucleotídeo isolado e/ou exógeno que codifica um polipeptideo de seda, onde pelo menos uma porção do polipeptideo tem uma estrutura de espiral enrolada.

[0041] Em uma modalidade, o polinucleotídeo compreende uma seqüência selecionada entre: i) uma seqüência de nucleotídeos como fornecido em qualquer uma de SEQ ID N° : 11; SEQ ID N° : 12; SEQ ID N° : 31; SEQ ID N°: 32; SEQ ID N°: 48; SEQ ID N°: 49; SEQ ID N°: 64 e SEQ ID N°: 65; ii) uma seqüência de nucleotídeos codificando um polipeptideo da invenção, iii) uma seqüência de nucleotídeos que é pelo menos 30% idêntica qualquer um ou mais das SEQ ID N°: 11; SEQ ID N° : 12; SEQ ID N°: 31; SEQ ID N°: 32; SEQ ID N°: 48; SEQ ID N° : 49; SEQ ID N°: 64 e SEQ ID N°: 65; e iv) uma seqüência que hibridiza com qualquer um entre i) a iii) sob condições rigorosas.

[0042] Em outra modalidade, o polinucleotideo compreende uma seqüência selecionada de: i) uma seqüência de nucleotídeos como fornecido em qualquer uma das SEQ ID N°: 13; SEQ ID N° : 14; SEQ ID N° : 33; SEQ ID N°: 34; SEQ ID N°: 50; SEQ ID N°: 51; SEQ ID N°: 66 e SEQ ID N°: 67; ii) uma seqüência de nucleotídeos codificando um polipeptídeo da invenção, iii) uma seqüência de nucleotídeos que é pelo menos 30% idêntico a qualquer uma ou mais entre SEQ ID N° : 13; SEQ ID N°: 14; SEQ ID N°: 33; SEQ ID N°: 34; SEQ ID N°: 50; SEQ ID N°: 51; SEQ ID N°: 66 e SEQ ID N°: 67; e iv) uma seqüência que hibridiza com qualquer um entre i) a iii) sob condições rigorosas.

[0043] Em outra modalidade, o polinucleotideo compreende uma seqüência selecionada de: i) uma seqüência de nucleotídeos como fornecido em qualquer uma entre SEQ ID N°: 15; SEQ ID N°: 16; SEQ ID N°: 35; SEQ ID N°: 36; SEG ID N°: 52; SEQ ID N°: 53; SEQ ID N°: 68 e SEQ ID N°: 69, ii) uma seqüência de nucleotídeos codificando um polipeptídeo da invenção, iii) uma seqüência de nucleotídeos que é pelo menos 30% idêntica a qualquer um ou mais das SEQ ID N° : 15; SEQ ID N°: 16; SEQ ID N°: 35; SEQ ID N°: 36; SEG ID N°: 52; SEQ ID N°: 53; SEQ ID N°: 68 e SEQ ID N°: 69, e iv) uma seqüência que hibridiza com qualquer um de i) a iii) sob condições rigorosas.

[0044] Em uma modalidade adicional, o polinucleotideo compreende uma seqüência selecionada de: i) uma seqüência de nucleotideos como fornecido em qualquer uma entre SEQ ID N°: 17; SEQ ID N°: 18; SEQ ID N°: 37; SEQ ID N°: 38; SEG ID N°: 54; SEQ ID N°: 55; SEQ ID N°: 70; SEQ ID N°: 71 e SEQ ID N°: 76, ii) uma seqüência de nucleotideos codificando um polipeptideo da invenção, iii) uma seqüência de nucleotideos que é pelo menos 30% idêntica a qualquer um ou mais das SEQ ID N°: 17; SEQ ID N°: 18; SEQ ID N°: 37; SEQ ID N°: 38; SEG ID N°: 54; SEQ ID N°: 55; SEQ ID N°: 70; SEQ ID N°: 71 e SEQ ID N°: 76, e iv) uma seqüência que hibridiza com qualquer um de i) a iii) sob condições rigorosas.

[0045] Em outra modalidade, o polinucleotideo compreende uma seqüência selecionada de: i) uma seqüência de nucleotideos como fornecido na SEQ ID N°: 74 ou SEQ ID N°: 75, ii) uma seqüência de nucleotideos codificando um polipeptideo da invenção, iii) uma seqüência de nucleotideos que é pelo menos 30% idêntica a SEQ ID N°: 74 e/ou SEQ ID N°: 75; e iv) uma seqüência que hibridiza com qualquer um de i) a iii) sob condições rigorosas.

[0046] Em um aspecto adicional, a presente invenção provê um polinucleotideo isolado e/ou exógeno, o polinucleotídeo compreendendo uma sequência selecionada de: i) uma seqüência de nucleotideos como fornecido em qualquer um entre SEQ ID N°: 19; SEQ ID N°: 20; SEQ ID N°: 21; e SEQ ID N°: 39; ii) uma seqüência de nucleotideos codificando um polipeptideo da invenção, iii) uma seqüência de nucleotideos que é pelo menos 30% idêntica a qualquer uma ou mais de SEQ ID N°: 19; SEQ ID N°: 20; SEQ ID N°: 21 e SEQ ID N°: 39; e iv) uma seqüência que hibridiza com qualquer um de i) a iii) sob condições rigorosas.

[0047] Em uma modalidade preferida, um polinucleotídeo pode ser isolado a partir de, ou é um mutante de um polinucleotídeo isolado a partir de uma espécie de himenóptera ou Neuroptera. Preferivelmente, a espécie de himenóptera é Apis mellifera, Oecophylla smaragdina, Myrmecia foricata ou Bombus terrestris. Preferivelmente, a espécie de Neuroptera é Mallada signata.

[0048] Em um aspecto adicional, a presente invenção provê um vetor que compreende pelo menos um polinucleotídeo da invenção.

[0049] Preferivelmente, o vetor é um vetor de expressão.

[0050] Em outro aspecto, a presente invenção provê uma célula hospedeira compreendendo pelo menos um polinucleotídeo da invenção, e/ou pelo menos um vetor da invenção.

[0051] A célula hospedeira pode ser qualquer tipo de célula. Os exemplos incluem, porém não são limitados a, uma célula bacteriana, de levedo ou de planta.

[0052] Também é fornecido um processo para preparar um polipeptideo de acordo com a invenção, o processo compreendendo cultivar uma célula hospedeira da invenção, ou um vetor da invenção sob condições que permitem expressão do polinucleotideo codificando o polipeptideo, e recuperar o polipeptideo expresso.

[0053] Considera-se que plantas transgênicas serão particularmente úteis para a produção de polipeptídeos da invenção. Desse modo, ainda em outro aspecto, a presente invenção provê uma planta transgênica compreendendo um polinucleotideo exógeno, o polinucleotideo codificando pelo menos um polipeptideo da invenção.

[0054] Em outro aspecto, a presente invenção provê um animal não humano transgênico compreendendo um polinucleotideo exógeno, o polinucleotideo codificando pelo menos um polipeptideo da invenção.

[0055] Ainda em outro aspecto, a presente invenção provê um anticorpo que especificamente liga um polipeptideo da invenção.

[0056] Em um aspecto adicional, a presente invenção provê uma fibra de seda compreendendo pelo menos um polipeptideo da invenção.

[0057] Preferivelmente, o polipeptideo é um polipeptideo recombinante.

[0058] Em uma modalidade, pelo menos alguns dos polipeptídeos são reticulados. Em uma modalidade, pelo menos alguns dos resíduos de lisina dos polipeptídeos são reticulados.

[0059] Em outro aspecto, a presente invenção provê um copolimero compreendendo pelo menos dois polipeptideos da invenção.

[0060] Preferivelmente, os polipeptideos são polipeptideos recombinantes.

[0061] Em uma modalidade, o copolimero compreende pelo menos quatro polipeptideos diferentes do primeiro aspecto. Em outra modalidade, o copolimero compreende ainda um polipeptideo do segundo aspecto.

[0062] Em uma modalidade, pelo menos alguns dos polipeptideos são reticulados. Em uma modalidade, pelo menos alguns dos resíduos de lisina dos polipeptideos são reticulados.

[0063] Como a pessoa versada reconhecerá, os polipeptideos da invenção têm uma ampla variedade de usos como sabido na técnica para outros tipos de proteínas da seda. Desse modo, em um aspecto adicional, a presente invenção provê um produto que compreende pelo menos um polipeptideo da invenção, uma fibra de seda da invenção e/ou um copolimero da invenção.

[0064] Os exemplos de produtos incluem, porém não são limitados a produtos de higiene pessoal, artigos têxteis, plásticos e produtos biomédicos.

[0065] Ainda em um aspecto adicional, a presente invenção provê uma composição que compreende pelo menos um polipeptideo da invenção, uma fibra de seda da invenção e/ou um copolimero da invenção, e um ou mais veículos aceitáveis.

[0066] Em uma modalidade, a composição compreende ainda um fármaco.

[0067] Em outra modalidade, a composição é utilizada como um remédio, em um dispositivo médico ou um cosmético.

[0068] Em outro aspecto, a presente invenção provê uma composição compreendendo pelo menos um polinucleotideo da invenção, e um ou mais veículos aceitáveis.

[0069] Em uma modalidade preferida, uma composição, fibra de seda, copolímero e/ou produto da invenção não compreende uma proteína de geléia real produzida por um inseto.

[0070] Em um aspecto adicional, a presente invenção provê um método de tratar ou evitar uma doença, o método compreendendo administrar uma composição que compreende um fármaco para tratar ou evitar a doença e um veículo farmaceuticamente aceitável, em que o veículo farmaceuticamente aceitável é selecionado de pelo menos um polipeptídeo da invenção, uma fibra de seda da invenção e/ou um copolímero da invenção.

[0071] Ainda em outro aspecto, a presente invenção provê para o uso de pelo menos um polipeptídeo da invenção, uma fibra de seda da invenção e/ou um copolímero da invenção, e um fármaco, para a fabricação de um medicamento para tratar ou evitar uma doença.

[0072] Em um aspecto adicional, a presente invenção provê um kit compreendendo pelo menos um polipeptídeo da invenção, pelo menos um polinucleotideo da invenção, pelo menos um vetor da invenção, pelo menos uma fibra de seda da invenção e/ou um copolímero da invenção.

[0073] Preferivelmente, o kit compreende ainda informação e/ou instruções para uso do kit.

[0074] Como será evidente, aspectos e características preferidas de um aspecto da invenção são aplicáveis a muitos outros aspectos da invenção.

[0075] Em todo esse relatório descritivo a palavra "compreender" ou variações como "compreende" ou "compreendendo" serão entendidas como abrangendo a inclusão de um elemento mencionado, número inteiro ou etapa, ou grupo de elementos, números inteiros ou etapas, porém não a exclusão de qualquer outro elemento, número inteiro ou etapa, ou grupo de elementos, números inteiros ou etapas.

[0076] A invenção é descrita a seguir por intermédio dos seguintes exemplos não limitadores e com referência às figuras em anexo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS EM ANEXO

[0077] Figura 1. Espectros infravermelhos de transformação Fourier das regiões de amida I e II das sedas: 1) seda de abelha de mel, 2) seda de abelhão, 3) seda de formiga bulldog, 4) seda de formiga tecelã 5) seda larval de lagarta verde. Todas as sedas têm espectros esperados de proteínas helicoidais. As sedas de Himenóptero (formigas e abelhas) têm máximos espectrais em 1645-1646 cm-1 (rotulados), deslocados aproximadamente 10 cm-1 mais baixos do que um sinal alfa-helicoidal clássico e alargado, como é típico de proteínas de espiral enrolada (Heimburg e outros, 1999).

[0078] Figura 2. Comparação de composição de aminoácido de seda de abelha de mel de favo de progênie lavado com SDS com composição de aminoácido de proteínas Xenospira (a saber, Xenospiral, Xenospira2, Xenospira3 e Xenospira4) (quantidades equimolares totalizando 65%) e Xenosin (35%).

[0079] Figura 3. Comparação de composição de aminoácidos de seda com composição de aminoácidos predita de proteínas codificadas por genes de seda.

[0080] Figura 4. Predição de regiões de espiral enrolada em proteínas da seda de abelha de mel. COILS é um programa que compara uma seqüência com um banco de dados de espiras enroladass de duas fitas, paralelas, conhecidas e deriva uma marcação de similaridade. Pela comparação dessa marcação com a distribuição de marcações em proteínas globulares e espiral enrolada, o programa então calcula a probabilidade de que a seqüência adotará uma conformação de espiral enrolada como descrito em Lupas e outros (1991). Utilizando um tamanho de janela de 28 esse programa prevê os seguintes números de resíduos existentes em cada proteína em domínios de espiral enrolada: Xenospira3: 77; Xensopira4: 35; Xenospiral: 28; Xenospira2: 80.

[0081] Figura 5. Alinhamento de proteínas da seda de abelha de mel mostrando predição MARCOIL dos principais heptavalentes que formam uma estrutura de espiral enrolada. Seqüências heptavalentes são mostradas acima dos aminoácidos, e resíduos de alanina em posições a e d são acentuados.

[0082] Figura 6. Alinhamento de regiões de espiral enrolada com predição Marciol de proteínas da seda de himenóptero (abelhas e formigas) mostrando a atribuição de posição heptavalente. Amei, abelha de mel. BB, abelhão; BA, formiga bulldog; WA, formiga tecelã; Fl-4, fibroinas de seda 1-4. As seqüências heptavalentes são mostradas acima dos aminoácidos, e resíduos de alanina nas posições a, d e e são acentuados.

[0083] Figura 7. O caráter de aminoácidos de posições heptavalentes nas regiões de espiral enrolada preditas da proteína de seda larval Mallada signata e os agrupamentos ortólogos das proteínas da seda de Himenóptero.

[0084] Figura 8. Eletroforese de gel de poliacrilamida SDS de proteínas de glândula salivar de último instar tardio. As proteínas foram identificadas após digestão tríptica e análise de conjunto de dados espectrais de massa utilizando software Spectrum Mill de Agilent para casar os dados com predições de seqüências de proteínas a partir de proteínas identificadas de seqüências de cDNA. O software gerou marcações para a qualidade de cada casamento entre conjuntos experimentalmente observados de massas de fragmentos de peptídeos e as predições de fragmentos que poderíam ser geradas de acordo com as seqüências de proteínas em um banco de dados fornecido. Todos os casamentos de seqüência mostrados aqui receberam marcações maiores do que 2 0 pelo software Spectrum Mill, onde uma marcação de 20 seria suficiente para aceitação automática, segura de um casamento válido.

[0085] Figura 9. Análise com parcimônia da região de de espiral enrolada de proteínas da seda. A relação das quatro proteínas de espiral enrolada sugere que os genes desenvolvidos a partir de um ancestral comum que pré-data a divergência de Euaculeata. A área ligada pela linha tracejada indica variação que ocorreu antes das formigas e vespas (Vespoidea) divergirem das abelhas (Apoidea) no Jurássico tardio (155 myrs; Grimaldi e Engel, 2005) . Os números indicando valores de alça a partir de 1000 iterações são mostrados.

[0086] Figura 10. A) Proteínas da seda Apis mellifera identificados por análise espectral de massa de peptídeos gerados a partir de seda de abelha após digestão com tripsina. O sombreamento indica peptídeos identificados pela análise espectral de massa. Todos os casamentos de seqüência mostrados aqui receberam marcações maiores do que 20 pelo software Spectrum Mill, onde uma marcação de 20 seria suficiente para aceitação automática, segura de um casamento válido. B) Seqüências de amino de comprimento total de proteínas da seda de abelhão, formiga bulldog, formiga tecelã e lagarta verde.

[0087] Figura 11. Quadros de leitura aberta codificando proteínas da seda de abelha de mel, abelhão, formiga bulldog, formiga tecelã e lagarta verde.

[0088] Figura 12. Seqüência de gene codificando Xenosin. A seqüência de codificação inteira fornecida que é interrompida por um intron único (acentuado).

[0089] Figura 13. Expressão de proteína de seda em tabaco. Detecção de proteínas marcadas com histidina após análise de western blot de proteínas a partir de: 1. E. coli transformado com vetor de expressão vazio, 2. E.coli transformado com vetor de expressão contendo região de codificação AmelF4 (Xenospira4), 3. Tabaco transformado com vetor de expressão vazio, 4. Tabaco transformado com vetor de expressão contendo região de codificação AmelF4.

[0090] Figura 14. Fibras feitas a partir de proteínas da seda de abelha de mel recombinantes mostrando fios birrefringentes. Biorrefringência indica que estrutura está presente nos fios. Fios de abelha de mel recombinantes diferentes são mostrados em cada painel A-D, e fio de lagarta verde recombinante é mostrado no painel E.

CHAVE PARA A LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

[0091] SEQ ID N°: 1 - proteína de seda de abelha de mel denominada aqui Xenospiral (também denominada aqui AmelFl) (peptídeo de sinal menos).

[0092] SEQ ID N°: 2 - proteína de seda de abelha de mel denominada aqui Xenospiral.

[0093] SEQ ID N°: 3 - proteína de seda de abelha de mel denominada aqui Xenospira2 (também denominada aqui AmelF2) (peptídeo de sinal menos).

[0094] SEQ ID N°: 4 - proteína de seda de abelha de mel denominada aqui Xenospira2.

[0095] SEQ ID N°: 5 - proteína de seda de abelha de mel denominada aqui Xenospira3 (também denominada aqui AmelF3) (peptídeo de sinal menos).

[0096] SEQ ID N°: 6 - proteína de seda de abelha de mel denominada aqui Xenospira3.

[0097] SEQ ID N°: 7 - proteína de seda de abelha de mel denominada aqui Xenospira4 (também denominada aqui AmelF4) (peptídeo de sinal menos).

[0098] SEQ ID N°: 8 - proteína de seda de abelha de mel denominada aqui Xenospira4.

[0099] SEQ ID N°: 9 - proteína de seda de abelha de mel denominada aqui xenosin (também denominada aqui AmelSAl) (peptídeo de sinal menos).

[00100] SEQ ID N°: 10 - proteína de seda de abelha de mel denominada aqui xenosin.

[00101] SEQ ID N° : 11 - seqüência de nucleotídeos codificando proteína de seda de abelha de mel Xenospiral (peptídeo de sinal de codificação de região menos).

[00102] SEQ ID N°: 12 - seqüência de nucleotídeos codificando proteína de seda de abelha de mel Xenospiral.

[00103] SEQ ID N°: 13 - seqüência de nucleotídeos codificando proteína de seda de abelha de mel Xenospira2 (peptídeo de sinal de codificação de região menos).

[00104] SEQ ID N°: 14 - seqüência de nucleotídeos codificando proteína de seda de abelha de mel Xenospira2.

[00105] SEQ ID N°: 15 - seqüência de nucleotídeos codificando proteína de seda de abelha de mel Xenospira3 (peptídeo de sinal de codificação de região menos).

[00106] SEQ ID N°: 16 - seqüência de nucleotídeos codificando proteína de seda de abelha de mel Xenospira3.

[00107] SEQ ID N°: 17 - seqüência de nucleotídeos codificando proteína de seda de abelha de mel Xenospira4 (peptídeo de sinal de codificação de região menos).

[00108] SEQ ID N°: 18 - seqüência de nucleotídeos codificando proteína de seda de abelha de mel Xenospira4.

[00109] SEQ ID N°: 19 - seqüência de nucleotídeos codificando proteína de seda de abelha de mel xenosin.

[00110] SEQ ID N°: 20 - seqüência de nucleotídeos codificando proteína de seda de abelha de mel xenosin.

[00111] SEQ ID N°: 21 - seqüência de genes codificando proteína de seda de abelha de mel xenosin.

[00112] SEQ ID N°: 22 - proteína de seda de abelhão denominado aqui BBF1 (menos peptídeo de sinal).

[00113] SEQ ID N°: 23 - proteína de seda de abelhão denominado aqui BBF1.

[00114] SEQ ID N°: 24 - proteína de seda de abelhão denominado aqui BBF2 (menos peptídeo de sinal).

[00115] SEQ ID N°: 25 - proteína de seda de abelhão denominado aqui BBF2.

[00116] SEQ ID N°: 26 - proteína de seda de abelhão denominado aqui BBF3 (menos peptídeo de sinal).

[00117] SEQ ID N°: 27 - proteína de seda de abelhão denominado aqui BBF3.

[00118] SEQ ID N°: 28 - proteína de seda de abelhão denominado aqui BBF4 (menos peptídeo de sinal).

[00119] SEQ ID N°: 29 - proteína de seda de abelhão denominado aqui BBF4.

[00120] SEQ ID N°: 30 - seqüência de aminoácidos parciais de proteína de seda de abelhão denominada aqui BBSAl.

[00121] SEQ ID N°: 31 - seqüência de nucleotídeos codificando proteína de seda de abelhão BBFl (menos peptídeo de sinal de codificação de região).

[00122] SEQ ID N°: 32 - seqüência de nucleotídeos codificando proteína de seda de abelhão BBFl.

[00123] SEQ ID N°: 33 - seqüência de nucleotídeos codificando proteína de seda de abelhão BBF2 (menos peptídeo de sinal de codificação de região).

[00124] SEQ ID N° : 34 - seqüência de nucleotídeos codificando proteína de seda de abelhão BBF2.

[00125] SEQ ID N° : 35 - seqüência de nucleotídeos codificando proteína de seda de abelhão BBF3 (menos peptídeo de sinal de codificação de região).

[00126] SEQ ID N° : 36 - seqüência de nucleotídeos codificando proteína de seda de abelhão BBF3.

[00127] SEQ ID N°: 37 - seqüência de nucleotídeos codificando proteína de seda de abelhão BBF4 (menos peptídeo de sinal de codificação de região).

[00128] SEQ ID N°: 38 - seqüência de nucleotídeos codificando proteína de seda de abelhão BBF4.

[00129] SEQ ID N°: 39 - seqüência de nucleotídeos parcial codificando proteína de seda de abelhão BBSA1.

[00130] SEQ ID N°: 40 - proteína de seda de formiga bulldog denominada aqui BAF1 (menos peptídeo de sinal).

[00131] SEQ ID N°: 41 - proteína de seda de formiga bulldog denominada aqui BAF1.

[00132] SEQ ID N°: 42 - proteína de seda de formiga bulldog denominada aqui BAF2 (menos peptídeo de sinal).

[00133] SEQ ID N°: 43 - proteína de seda de formiga bulldog denominada aqui BAF2.

[00134] SEQ ID N°: 44 - proteína de seda de formiga bulldog denominada aqui BAF3 (menos peptídeo de sinal).

[00135] SEQ ID N°: 45 - proteína de seda de formiga bulldog denominada aqui BAF3.

[00136] SEQ ID N°: 46 - proteína de seda de formiga bulldog denominada aqui BAF4 (menos peptídeo de sinal).

[00137] SEQ ID N° : 47 - proteína de seda de formiga bulldog denominada aqui BAF4.

[00138] SEQ ID N° : 48 - seqüência de nucleotideos codificando proteína de seda de formiga bulldog BAF1 (menos peptídeo de sinal de codificação de região).

[00139] SEQ ID N° : 49 - seqüência de nucleotideos codificando proteína de seda de formiga bulldog BAF1.

[00140] SEQ ID N°: 50 - seqüência de nucleotideos codificando proteína de seda de formiga bulldog BAF2 (menos peptídeo de sinal de codificação de região).

[00141] SEQ ID N°: 51 - seqüência de nucleotideos codificando proteína de seda de formiga bulldog BAF2.

[00142] SEQ ID N°: 52 - seqüência de nucleotideos codificando proteína de seda de formiga bulldog BAF3 (menos peptídeo de sinal de codificação de região).

[00143] SEQ ID N°: 53 - seqüência de nucleotideos codificando proteína de seda de formiga bulldog BAF3.

[00144] SEQ ID N°: 54 - seqüência de nucleotideos codificando proteína de seda de formiga bulldog BAF4 (menos peptídeo de sinal de codificação de região).

[00145] SEQ ID N°: 55 - seqüência de nucleotideos codificando proteína de seda de formiga bulldog BAF41.

[00146] SEQ ID N°: 56 - proteína de seda de formiga tecelã denominada aqui GAFl (menos peptídeo de sinal).

[00147] SEQ ID N°: 57 - proteína de seda de formiga tecelã denominada aqui GAFl.

[00148] SEQ ID N°: 58 - proteína de seda de formiga tecelã denominada aqui GAF2 (menos peptídeo de sinal).

[00149] SEQ ID N°: 59 - proteína de seda de formiga tecelã denominada aqui GAF2.

[00150] SEQ ID N°: 60 - proteína de seda de formiga tecelã denominada aqui GAF3 (menos peptídeo de sinal).

[00151] SEQ ID N°: 61 - proteína de seda de formiga tecelã denominada aqui GAF3.

[00152] SEQ ID N°: 62 - proteína de seda de formiga tecelã denominada aqui GAF4 (menos peptídeo de sinal).

[00153] SEQ ID N°: 63 - proteína de seda de formiga tecelã denominada aqui GAF4.

[00154] SEQ ID N°: 64 - seqüência de nucleotídeos codificando proteína de seda de formiga tecelã GAF1 (menos peptídeo de sinal de codificação de região).

[00155] SEQ ID N°: 65 - seqüência de nucleotídeos codificando proteína de seda de formiga tecelã GAF1.

[00156] SEQ ID N°: 66 - seqüência de nucleotídeos codificando proteína de seda de formiga tecelã GAF2 (menos peptídeo de sinal de codificação de região).

[00157] SEQ ID N°: 67 - seqüência de nucleotídeos codificando proteína de seda de formiga tecelã GAF2.

[00158] SEQ ID N°: 68 - seqüência de nucleotídeos codificando proteína de seda de formiga tecelã GAF3 (menos peptídeo de sinal de codificação de região).

[00159] SEQ ID N°: 69 - seqüência de nucleotídeos codificando proteína de seda de formiga tecelã GAF3.

[00160] SEQ ID N°: 70 - seqüência de nucleotídeos codificando proteína de seda de formiga tecelã GAF4 (menos peptídeo de sinal de codificação de região).

[00161] SEQ ID N°: 71 - seqüência de nucleotídeos codificando proteína de seda de formiga tecelã GAF4.

[00162] SEQ ID N° : 72 - proteína de seda de lagarta verde denominada aqui MalFl (menos peptideo de sinal).

[00163] SEQ ID N°: 73 - proteína de seda de lagarta verde denominada aqui MalFl.

[00164] SEQ ID N° : 74 - seqüência de nucleotídeos codificando proteína de lagarta verde MalFl (menos peptideo de sinal de codificação de região).

[00165] SEQ ID N°: 75 - seqüência de nucleotídeos codificando proteína de seda de lagarta verde MalFl.

[00166] SEQ ID N°: 76 - seqüência de nucleotídeos codificando proteína de seda de abelha de mel denominada aqui códon Xenospira4 otimizado para expressão de planta (antes de subclonagem em pET14b e pVEC8).

[00167] SEQ ID N°: 77 - quadro de leitura aberta de proteína de seda de abelha de mel (Xenospira4) otimizado para expressão de planta (sem fusão traducional). DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Técnicas gerais e definições [00168] A menos que especificamente definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos utilizados aqui serão assumidos como tendo o mesmo significado como comumente compreendido por uma pessoa com conhecimentos comuns na técnica (por exemplo, em cultura de células, genética molecular, imunologia, imunoistoquímica, química de proteína e bioquímica).

[00169] A menos que indicado de outro modo, a proteína recombinante, cultura de células e técnicas imunológicas utilizadas na presente invenção são procedimentos padrão, bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Tais técnicas são descritas e explicadas em toda literatura em fontes como, J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editores), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), e F.M. Ausubel e outros (editores), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, incluindo todas as atualizações até o presente), Ed Harlow e David Lane (editores) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), and J.E. Coligan e outros, (editores) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (incluindo todas as atualizações até o presente), e são incorporados aqui a titulo de referência.

[00170] Como utilizado aqui, os termos "proteína de seda" e "polipeptídeo de seda" se referem à proteína/polipeptídeo fibroso, que pode ser utilizada para produzir uma fibra de seda e/ou um complexo de proteína fibrosa. Proteínas da seda de ocorrência natural da invenção fazem parte da seda de favo de progênie de insetos como abelhas de mel, entretanto, como descrito aqui, variantes dessas proteínas poderíam ser facilmente produzidas que executariam a mesma função se expresso em um inseto apropriado.

[00171] Como utilizado aqui, uma "fibra de seda" se refere a filamentos compreendendo proteínas da invenção que podem ser trançadas em vários itens como artigos têxteis.

[00172] Como utilizado aqui, um "copolímero" é uma composição que compreende duas ou mais proteínas da seda da invenção. Esse termo exclui copolímeros de ocorrência natural como o favo de proqênie de insetos.

[00173] O termo "planta" inclui plantas inteiras, estruturas vegetativas (por exemplo, folhas, caules), raízes, estruturas/órgãos florais, sementes (incluindo embriões, endosperma e tegumento), tecido de planta (por exemplo, tecido vascular, tecido de base e similares), células e progênie das mesmas.

[00174] Uma "planta transgênica" se refere a uma planta que contém uma construção de gene ("transgene") não encontrada em uma planta do tipo selvagem da mesma espécie, variedade ou cultivar. Um "transgene" como mencionado aqui tem o significado normal na técnica de biotecnologia e inclui uma seqüência genética que foi produzida ou alterada por tecnologia de DNA ou RNA recombinante e que foi introduzida na célula da planta. O transgene pode incluir seqüências genéticas derivadas de uma célula de planta. Tipicamente, o transgene foi introduzido na planta por manipulação humana como, por exemplo, por transformação porém qualquer método pode ser utilizado como uma pessoa versada na técnica reconhece.

[00175] "Polinucleotídeo" se refere a um oligonucleotídeo, molécula de ácido nucléico ou qualquer fragmento da mesma. Pode ser DNA ou RNA de origem genômica ou sintética, de fita dupla ou fita única, e combinada com carboidrato, lipídeos, proteína ou outros materiais para executar uma atividade específica definida aqui.

[00176] "Operativamente ligado", como utilizado aqui, se refere a uma relação funcional entre dois ou mais segmentos de ácido nucléico (por exemplo, DNA). Tipicamente, se refere à relação funcional de elemento regulador de transcrição com uma seqüência transcrita. Por exemplo, um promotor é operativamente ligado a uma seqüência de codificação, como um polinucleotideo definido aqui, se estimular ou modular a transcrição da seqüência de codificação em uma célula hospedeira apropriada. Genericamente, elementos reguladores de transcrição de promotor que são operativamente ligados a uma seqüência transcrita são fisicamente contíguos à seqüência transcrita, isto é, são de atuação-cis. Entretanto, alguns elementos reguladores de transcrição, como intensificadores, não necessitam estar fisicamente contíguos ou localizados em proximidade estreita às seqüências de codificação cuja transcrição eles intensificam.

[00177] O termo "peptídeo de sinal" se refere a um polipeptídeo de terminal amino precedendo uma proteína madura secretada. O peptídeo de sinal é clivado a partir de e, portanto, não está presente na proteína madura. Peptídeos de sinal têm a função de orientar e trans-locar proteínas secretadas através de membranas de células. O peptídeo de sinal também é mencionado como seqüência de sinais.

[00178] Como utilizado aqui, "transformação" é a aquisição de genes novos em uma célula pela incorporação de um polinucleotideo.

[00179] Como utilizado aqui, o termo "fármaco" se refere a qualquer composto que pode ser utilizado para tratar ou evitar uma doença especifica, exemplos de fármacos que podem ser formuladas com uma proteina de seda da invenção incluem, porém não são limitados a proteínas, ácidos nucléicos, aqentes antitumor, analgésicos, antibióticos, compostos antiinflamatórios (tanto esteroidais como não esteroidais), hormônios, vacinas, substâncias rotuladas, e similares.

Polipeptídeos [00180] Por "polipeptídeo substancialmente purificado" se quer dizer um polipeptídeo que foi genericamente separado dos lipídeos, ácidos nucléicos, outros polipeptídeos, e outras moléculas de contaminação como cera com as quais está associado em seu estado nativo. Com a exceção de outras proteínas da invenção, prefere-se que o polipeptídeo substancialmente purificado seja pelo menos 60% livre, mais preferivelmente pelo menos 75% livre, e mais preferivelmente ainda pelo menos 90% livre de outros componentes com os quais é naturalmente associado.

[00181] O termo "recombinante" no contexto de um polipeptídeo se refere ao polipeptídeo quando produzido por uma célula, ou em um sistema de expressão livre de células, em uma quantidade alterada ou em uma taxa alterada em comparação com seu estado nativo. Em uma modalidade a célula é uma célula que não produz naturalmente o polipeptídeo. Entretanto, a célula pode ser uma célula que compreende um gene não endógeno que faz com que uma quantidade alterada, preferivelmente aumentada do polipeptideo seja produzida. Um polipeptídeo recombinante da invenção inclui polipeptideos que não foram separados a partir de outros componentes da célula transgênica (recombinante), ou sistema de expressão livre de células, no qual é produzido, e polipeptideos produzidos em tais células ou sistemas livres de células que são subseqüentemente purificados para longe de pelo menos alguns outros componentes.

[00182] Os termos "polipeptideo" e "proteína" são genericamente utilizados de forma intercambiável e se referem a uma única cadeia de polipeptideos que pode ou não ser modificada pela adição de grupos de ácido não amino. Os termos "proteínas" e "polipeptideos", como utilizados aqui, também incluem variantes, mutantes, modificações, análogos e/ou derivados dos polipeptideos da invenção, como descrito aqui.

[00183] A % de identidade de um polipeptídeo é determinada por análise GAP (Needleman e Wunsch, 1970) (programa GCG) com uma penalidade de criação de lacuna=5, e uma penalidade de extensão de lacuna=0,3. A seqüência de consulta tem pelo menos 15 aminoácidos de comprimento, e a análise GAP alinha as duas seqüências sobre uma região de pelo menos 15 aminoácidos. Mais preferivelmente a seqüência de consulta tem pelo menos 50 aminoácidos em comprimento, e a análise GAP alinha as duas seqüências sobre uma região de pelo menos 50 aminoácidos. Mais preferivelmente, a seqüência de consulta tem pelo menos 100 aminoácidos em comprimento e a análise GAP alinha as duas seqüências sobre uma região de pelo menos 100 aminoácidos. Ainda mais preferivelmente, a seqüência de consulta tem pelo menos 250 aminoácidos em comprimento e a análise GAP alinha as duas sequências sobre uma região de pelo menos 250 aminoácidos. Mais preferivelmente ainda, a análise GAP alinha as duas sequências sobre seu comprimento inteiro.

[00184] Como utilizado aqui um fragmento "biologicamente ativo" é uma porção de um polipeptídeo da invenção que mantém uma atividade definida do polipeptídeo de comprimento total, a saber, a capacidade de ser utilizado para produzir seda. Fragmentos biologicamente ativos podem ser de qualquer tamanho desde que mantenham a atividade definida.

[00185] Com relação a um polipeptídeo definido, será reconhecido que algarismos de % de identidade mais elevados do que aqueles fornecidos acima abrangerão modalidades preferidas. Desse modo, onde aplicável, à luz dos algarismos de % de identidade mínimos, prefere-se que o polipeptídeo compreenda uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 40%, mais preferivelmente pelo menos 45%, mais preferivelmente pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 55%, mais preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 65%, mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 91%, mais preferivelmente pelo menos 92%, mais preferivelmente pelo menos 93%, mais preferivelmente pelo menos 94%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 96%, mais preferivelmente pelo menos 97%, mais preferivelmente pelo menos 98%, mais preferivelmente pelo menos 99%, mais preferivelmente pelo menos 99,1%, mais preferivelmente pelo menos 99,2%, mais preferivelmente pelo menos 99,3%, mais preferivelmente pelo menos 99,4%, mais preferivelmente pelo menos 99,5%, mais preferivelmente pelo menos 99,6%, mais preferivelmente pelo menos 99,7%, mais preferivelmente pelo menos 99,8%, e ainda mais preferivelmente pelo menos 99,9% idêntico a SEQ ID N° nomeada relevante.

[00186] Mutantes de seqüência de aminoácidos dos polipeptideos da presente invenção podem ser preparados pela introdução de mudanças de nucleotideo apropriadas em um ácido nucléico da presente invenção, ou por síntese in vitro do polipeptídeo desejado. Tais mutantes incluem, por exemplo, deleções, inserções ou substituições de resíduos dentro da seqüência de aminoácidos. Uma combinação de deleção, inserção e substituição, pode ser feita para chegar à construção final, com a condição de que o produto de polipeptídeo final possua as características desejadas.

[00187] Polipeptideos mutantes (alterados) podem ser preparados utilizando qualquer técnica conhecida na arte. Por exemplo, um polinucleotídeo da invenção pode ser submetido a mutagênese in vitro. Tais técnicas de mutagênese in vitro incluem subclonagem do polinucleotídeo em um vetor apropriado, transformação do vetor em uma cepa "mutator" como E.coli XL-1 red (Stratagene) e propagação das bactérias transformadas por um número apropriado de gerações. Em outro exemplo, os polinucleotídeos da invenção são submetidos a técnicas de mistura de DNA como amplamente descrito por Harayama (1998). Essas técnicas de mistura de DNA podem incluir genes da invenção possivelmente além dos genes relacionados àqueles da presente invenção, como genes de seda a partir das espécies: Himenóptero ou Neuroptera, diferentes das espécies especificas caracterizadas aqui. Produtos derivados a partir de DNA alterado/mudado podem ser facilmente classificados utilizando técnicas descritas aqui para determinar se podem ser utilizados como proteínas da seda.

[00188] Ao projetar mutantes de seqüência de aminoácidos, a localização do sítio de mutação e a natureza da mutação dependerão da(s) característica(s) a serem modificadas. Os sítios para mutação podem ser modificados individualmente ou em série, por exemplo, por (1) substituir primeiramente com escolhas de aminoácidos conservativos e então com seleções mais radicais dependendo dos resultados obtidos, (2) deleção do resíduo alvo, ou (3) inserção de outros resíduos adjacentes ao sítio localizado.

[00189] Deleções de seqüência de aminoácidos variam genericamente de aproximadamente 1 a 15 resíduos, mais preferivelmente aproximadamente 1 a 10 resíduos e tipicamente aproximadamente 1 a 5 resíduos contíguos.

[00190] Mutantes de substituição têm pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula de polipeptídeo removida e um resíduo diferente inserido em seu lugar. Os sítios de maior interesse para mutagênese de substituição incluem sítios identificados como importante para função. Outros sítios de interesse são aqueles nos quais os resíduos específicos obtidos a partir de várias cepas ou espécies sao idênticos, Essas posições podem ser importantes para atividade biológica. Esses sítios, especialmente aqueles compreendidos em uma seqüência de pelo menos três outros sítios identicamente conservados, sâo preferivelmente substituídos era um modo relativamente conservativo. Tais substituições conservativas são mostradas na Tabela 1 sob o cabeçalho de "substituições exemplares", [00191] Como delineado acima, uma porção de alguns dos polipeptídeos da invenção tem uma estrutura de espiral enrolada. Estruturas de espiral enrolada de polipeptídeos sao caracterizadas por repetições heptavalentes representadas pela sequência de consenso {abcdefg) r.- Em uma modalidade preferida, a porção do polipeptídeo que tem uma estrutura de espiral enrolada compreende pelo menos 10 cópias da seqüência heptavalente abcdefg, e pelo menos 25% doo aminoácídos em posições a e d são resíduos de alanina.

Tabela 1. Substituições exemplares [00192] Em uma modalidade preferida, o polipeptídeo que tem uma estrutura de espiral enrolada compreende pelo· menos 12 cópias consecutivas, mais preferivelmente pelo menos 15 cópias consecutivas, e ainda mais preferivelmente pelo menos 18 cópias consecutivas do heptavalente. Em modalidades adicionais, o polipeptídeo que tem uma estrutura de de espiral enrolada pode ter até pelo menos 28 cópias do heptavalente. Típícameente, as cópias do· heptavalente serão repetidas em tandem. Entretanto, não têm necessariamente que ser repetições em tandem perfeitas, por exemplo, como mostrado· nas figuras 5 e 6 alguns aminoácidos podem ser encontrados entre dois heptavalentes, ou alguns heptavalentes truncados podem ser encontrados (vide, por exemplo, Xenospíral na figura 5).

[00193] A orientação em relação a substituições de aminoácidos que podem ser feitas nos polípeptídeos da invenção que têm uma estrutura de espiral enrolada é fornecida nas figuras 5 e 6, bem como tabelas 6 a 10. Onde uma substituição de aminoácidos útil, predita com base em dados experimentais fornecidos aqui está de algum modo em conflito com as substituições exemplares fornecidas na Tabela 1 prefere-se que uma substituição baseada nos dados experimentais seja utilizada.

[00194] Estruturas de espiral enrolada de polipeptideos da invenção têm um elevado teor de resíduos de alanina, particularmente em posições de aminoácidos a, d e e do heptavalente. Entretanto, as posições b, c, f e g têm também uma freqüência elevada de resíduos de alanina. Em uma modalidade preferida, pelo menos 15% dos aminoácidos nas posições a, d e/ou e dos heptavalentes são resíduos de alanina, mais preferivelmente pelo menos 25%, mais preferivelmente pelo menos 30%, mais preferivelmente pelo menos 40%, mais preferivelmente pelo menos 50%. Em uma modalidade preferida, pelo menos 25% dos aminoácidos nas duas posições a e d dos heptavalentes são resíduos de alanina, mais preferivelmente pelo menos 30%, mais preferivelmente pelo menos 40%, e ainda mais preferivelmente pelo menos 50%. Adicionalmente, prefere-se que pelo menos 15% dos aminoácidos nas posições b, c, f e g dos heptavalentes sejam resíduos de alanina, mais preferivelmente pelo menos 20%, e ainda mais preferivelmente pelo menos 25%.

[00195] Tipicamente, os heptavalentes não compreenderão nenhum resíduo de prolina ou histidina. Além disso, os heptavalentes compreenderão poucos (1 ou 2) , se algum, resíduos de fenil alanina, metionina, tirosina, cisteína, glicina triptofano. Além de alanina, aminoácidos comuns (por exemplo, maiores do que 5% mais preferivelmente maiores do que 10%) nos heptavalentes incluem leucina (particularmente nas posições b e d) , serina (particularmente nas posições b, e e f) , ácido glutâmico (particularmente nas posições c, e e f) , lisina (particularmente nas posições b, c, d, f e g) bem como arginina na posição g.

[00196] Polipeptídeos (e polinucleotídeos) da invenção podem ser purificados (isolados) a partir de uma ampla variedade de espécies Himenóptera e Neuroptera. Os exemplos de Himenópteros incluem, porém não são limitados a qualquer espécie de Subordem Apocrita (abelhas, formigas e vespas), que incluem as seguintes famílias de insetos: Chrysididae (vespas-cuco), Formicidae (formigas), Mutillidae (formigas aveludadas), Pompilidae (vespas-aranha), Scoliidae, Vespidae (paper vespas de papel, vespas potter, vespões), Agaonidae (vespas de figueira), Chalcididae (calcidide) , Eucharitidae (eucharitids), Eupelmidae (eupelmids), Pteromalidae (pteromalids), Evaniidae (vespas-bandeira), Braconidae, Ichneumonidae (ichneumons), Megachilidae, Apidae, Colletidae, Halictidae, e Melittidae (abelhas que coletam óleo). Os exemplos de Neuropteros incluem espécies a partir das seguintes famílias de insetos: Mantispidae, Chrysopidae (lagartas verdes), Myrmeleontidae (formiga-leão), e Ascalaphidae (moscas-coruja). Tais polipeptídeos adicionais (e polinucleotídeos) podem ser caracterizados utilizando os mesmos procedimentos descritos aqui para sedas a partir de Bombus terrestris, Myrmecia forficata, Oecophylla smaragdina and Mallada signata.

[00197] Além disso, se desejado, aminoácidos não naturais ou análogos de aminoácidos quimicos podem ser introduzidos como uma substituição ou adição nos polipeptideos da presente invenção. Tais aminoácidos incluem, porém não são limitados a, D-isômeros dos aminoácidos comuns, ácido 2,4-diaminobutirico, ácido examino isobutirico, ácido 4-aminobutírico, ácido 2-aminobutírico, ácido 6-amino hexanóico, ácido 2-amino isobutirico, ácido 3-amino propiônico, ornitina, norleucina, norvalina, hidróxi prolina, sarcosina, citrulina, homocitrilumina, ácido cistéico, t-butil glicina, t-butil alanina, fenil glicina, ciclo hexil alanina, β-alanina, ácidos flúor-amino, aminoácidos designer como aminoácidos β-metila, aminoácidos Ca-metila, aminoácidos Να-metila, e análogos de aminoácidos em geral.

[00198] Também compreendido no escopo da invenção são polipeptideos da presente invenção que são diferencialmente modificados durante ou após síntese, por exemplo, por biotinilação, benzilação, glicosilação, acetilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos de bloqueio/proteção conhecidos, divagem proteolítica, ligação a uma molécula de anticorpo ou outro ligando celular, etc. Essas modificações podem servir para aumentar a estabilidade e/ou bioatividade do polipeptídeo da invenção.

[00199] Polipeptideos da presente invenção podem ser produzidos em uma variedade de modos, incluindo produção e recuperação de polipeptideos naturais, produção e recuperação de polipeptideos recombinantes, e síntese química dos polipeptídeos. Em uma modalidade, um polipeptídeo isolado da presente invenção é produzido por cultura de uma célula capaz de expressar o polipeptídeo sob condições eficazes para produzir o polipeptídeo, e recuperar o polipeptídeo. Uma célula preferida para cultura é uma célula recombinante da presente invenção. Condições de cultura efetivas incluem, porém não são limitadas a meios efetivos, biorreator, temperatura, pH e condições de oxigênio que permitem produção de polipeptídeos. Um meio eficaz se refere a qualquer meio no qual uma célula é cultivada para produzir um polipeptídeo da presente invenção. Tal meio compreende tipicamente um meio aquoso tendo fontes de carbono, nitrogênio e fosfato assimiláveis, e sais, minerais, metais e outros nutrientes apropriados, como vitaminas. Células da presente invenção podem ser cultivadas em biorreatores de fermentação convencionais, frascos de agitação, tubos de teste, pratos de microtítulo, e placas petri. A cultura pode ser realizada em uma temperatura, pH e teor de oxigênio apropriado para uma célula recombinante. Tais condições de cultura estão compreendidas nos conhecimentos de uma pessoa com conhecimentos comuns na técnica.

Polinucleotídeos [00200] Por um "polinucleotídeo isolado", incluindo DNA, RNA ou uma combinação desses, de fita única ou dupla, na orientação de sentido ou anti-sentido ou uma combinação de ambos, dsRNA ou de outro modo, quer se dizer um polinucleotídeo que seja pelo menos parcialmente separado a partir das seqüências de polinucleotídeos com as quais é associado ou ligado em seu estado nativo. Preferivelmente, o polinucleotideo isolado é pelo menos 60% livre, preferivelmente pelo menos 75% livre, e mais preferivelmente pelo menos 90% livre de outros componentes com os quais são naturalmente associados. Além disso, o termo "polinucleotideo" é utilizado de forma intercambiável aqui com o termo "ácido nucléico".

[00201] O termo "exógeno" no contexto de um polinucleotideo se refere ao polinucleotideo quando presente em uma célula, ou em um sistema de expressão livre de células, em uma quantidade alterada em comparação com seu estado nativo. Em uma modalidade, a célula é uma célula que não compreende naturalmente o polinucleotideo. Entretanto, a célula pode ser uma célula que compreende um polinucleotideo não endógeno resultando em uma quantidade alterada preferivelmente aumentada, de produção do polipeptideo codificado. Um polinucleotideo exógeno da invenção inclui polinucleotideos que não foram separados de outros componentes da célula transgênica (recombinante), ou sistema de expressão livre de células, no qual está presente, e polinucleotideos produzidos em tais células ou sistemas livres de células que são subseqüentemente purificados para longe a partir de pelo menos alguns outros componentes.

[00202] A % de identidade de um polinucleotideo é determinada por análise GAP (Needleman e Wunsch, 1970) (programa GCG) com uma penalidade de criação de lacuna=5, e uma penalidade de extensão de lacuna=0,3. A menos que de outro modo mencionado, a seqüência de consulta tem pelo menos 45 nucleotídeos de comprimento, e a análise GAP alinha as duas seqüências sobre uma região de pelo menos 45 nucleotídeos. Preferivelmente a seqüência de consulta tem pelo menos 150 nucleotídeos em comprimento, e a análise GAP alinha as duas seqüências sobre uma região de pelo menos 150 nucleotídeos. Mais preferivelmente, a seqüência de consulta tem pelo menos 300 nucleotídeos em comprimento e a análise GAP alinha as duas seqüências sobre uma região de pelo menos 300 nucleotídeos. Ainda mais preferivelmente, a análise GAP alinha as duas seqüências sobre seu comprimento inteiro.

[00203] Com relação aos polinucleotídeos definidos, será reconhecido que os algarismos de % de identidade mais elevados do que aqueles fornecidos acima abrangerão modalidades preferidas. Desse modo, onde aplicável, à luz dos algarismos de % de identidade mínimos, prefere-se que um polinucleotídeo da invenção compreenda uma seqüência que é pelo menos 40%, mais preferivelmente pelo menos 45%, mais preferivelmente pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 55%, mais preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 65%, mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 91%, mais preferivelmente pelo menos 92%, mais preferivelmente pelo menos 93%, mais preferivelmente pelo menos 94%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 96%, mais preferivelmente pelo menos 97%, mais preferivelmente pelo menos 98%, mais preferivelmente pelo menos 99%, mais preferivelmente pelo menos 99,1%, mais preferivelmente pelo menos 99,2%, mais preferivelmente pelo menos 99,3%, mais preferivelmente pelo menos 99,4%, mais preferivelmente pelo menos 99,5%, mais preferivelmente pelo menos 99,6%, mais preferivelmente pelo menos 99,7%, mais preferivelmente pelo menos 99,8%, e ainda mais preferivelmente pelo menos 99,9% idêntico a SEQ ID N° nomeada relevante.

[00204] Polinucleotideos da presente invenção podem possuir, quando comparado com moléculas de ocorrência natural, uma ou mais mutações que são deleções, inserções, ou substituições de resíduos de nucleotídeo. Os mutantes podem ser de ocorrência natural (isto quer dizer, isolados de uma fonte natural); ou sintéticos (por exemplo, pela execução de mutagênese dirigida ao sítio no ácido nucléico).

[00205] Os oligonucleotídeos e/ou polinucleotídeos da invenção hibridizam com um gene de seda da presente invenção, ou uma região flanqueando o gene, sob condições rigorosas. O termo "condições de hibridização rigorosas" e similares como utilizado aqui, se refere a parâmetros com os quais a técnica está familiarizada, incluindo a variação da temperatura de hibridização com comprimento de um oligonucleotídeo. Parâmetros de hibridização de ácido nucléico podem ser encontrados em referências que compilam tais métodos, Sambrook e outros (supra) e Ausubel, e outros (supra). Por exemplo, condições de hibridização rigorosas, como utilizado aqui, podem se referir à hibridização a 65°C em tampão de hibridização (3,5xSSC, 0,02% Ficoll, 0,02% polivinil pirrolidona, 0,02% Albumina de soro bovino (BSA), 2,5 mM NaH2P04 (pH 7), 0,5% SDS, 2 mM EDTA) , seguido por uma ou mais lavagens em 0,2xSSC, 0,01% BSA a 50°C. Alternativamente, o ácido nucléico e/ou oligonucleotideos (que podem ser também mencionados como "iniciadores" ou "sondas") hibridizam com a região de um genoma de inseto de interesse, como o genoma de uma abelha de mel, sob condições utilizadas em técnicas de amplificação de ácido nucléico como PCR.

[00206] Oligonucleotideos da presente invenção podem ser RNA, DNA ou derivados de qualquer um. Embora os termos polinucleotideo e oligonucleotideo tenham significado sobreposto, oligonucleotideos são tipicamente moléculas de fita única; relativamente curtas. O tamanho mínimo de tais oligonucleotideos é o tamanho exigido para a formação de um híbrido estável entre um oligonucleotideo e uma seqüência complementar em uma molécula de ácido nucléico alvo. Preferivelmente, os oligonucleotideos são pelo menos 15 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 18 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 19 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 20 nucleotídeos, ainda mais preferivelmente pelo menos 25 nucleotídeos em comprimento.

[00207] Normalmente, monômeros de um polinucleotideo ou oligonucleotideo são ligados por ligações de fosfodiéster ou análogos do mesmo para formar oligonucleotideos que variam em tamanho a partir de uma unidade monomérica relativamente curta, por exemplo, 12-18, a várias centenas de unidades monoméricas. Análogos de ligações de fosfodiéster incluem: fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilidato, fosforamidato.

[00208] A presente invenção inclui oligonucleotideos que podem ser utilizados como, por exemplo, sondas para identificar moléculas de ácido nucléico, ou iniciadores para produzir moléculas de ácido nucléico. Oligonucleotideos da presente invenção utilizados como sonda são tipicamente conjugados com um rótulo detectável como radioisótopo, uma enzima, biotina, uma molécula fluorescente ou uma molécula quimiluminescente.

Vetores recombinantes [00209] Uma modalidade da presente invenção inclui um vetor recombinante, que compreende pelo menos uma molécula de polinucleotideo isolada da presente invenção, inserida em qualquer vetor capaz de fornecer a molécula de polinucleotideo em uma célula hospedeira. Tal vetor contém seqüências de polinucleotideos heterólogas, isto é seqüências de polinucleotideo que não são naturalmente encontradas adjacentes a moléculas de polinucleotideos da presente invenção e que preferivelmente são derivadas de uma espécie diferente da espécie da qual a(s) molécula(s) de polinucleotideo (s) são derivadas. O vetor pode ser RNA ou DNA, procariótico ou eucariótico, e tipicamente é um transposon (como descrito na Patente US 5.792.294), um virus ou um plasmideo.

[00210] Um tipo de vetor recombinante compreende uma molécula de polinucleotideos da presente invenção operativamente ligado a um vetor de expressão. O termo "operativamente ligado" se refere à inserção de uma molécula de polinucleotideos em um vetor de expressão em um modo tal que a molécula seja capaz de ser expressa quando transformada em uma célula hospedeira. Como utilizado aqui, um vetor de expressão é um vetor de DNA ou RNA que é capaz de transformar uma célula hospedeira e de efetuar expressão de uma molécula de polinucleotideos especificada. Preferivelmente, o vetor de expressão também é capaz de replicar dentro da célula hospedeira. Vetores de expressão podem ser procarióticos ou eucarióticos, e são tipicamente vírus ou plasmídeos. Vetores de expressão da presente invenção incluem quaisquer vetores que funcionam (isto é, dirigir a expressão de gene) em células recombinantes da presente invenção, incluindo em células bacterianas, fúngicas, endoparasitos, artrópodes, de animais e plantas. Vetores de expressão particularmente preferidos da presente invenção podem dirigir a expressão de genes em células de plantas. Vetores da invenção também podem ser utilizados para produzir o polipeptídeo em um sistema de expressão livre de células, tais sistemas são bem conhecidos na técnica.

[00211] Em particular, vetores de expressão da presente invenção contêm seqüências reguladoras como seqüências de controle de transcrição, seqüências de controle traducionais, origens de replicação, e outras seqüências reguladoras que são compatíveis com a célula recombinante e que controlam a expressão de moléculas de polinucleotideos da presente invenção. Em particular, moléculas recombinantes da presente invenção incluem sequências de controle de transcrição. Seqüências de controle de transcrição são seqüências que controlam a iniciação, alongamento e terminação de transcrição. Seqüências de controle de transcrição particularmente importantes são aquelas que controlam iniciação de transcrição, como seqüências promotora, intensificadora, operadora e repressora. Seqüências de controle de transcrição apropriadas incluem qualquer seqüência de controle de transcrição que possa funcionar pelo menos em uma das células recombinantes da presente invenção. Uma variedade de tais seqüências de controle de transcrição é conhecida por aqueles versados na técnica. Seqüências de controle de transcrição preferidas incluem aquelas que funcionam em células bacterianas, de levedo, artrópodes, plantas ou mamíferos, como, porém não limitadas a, tac, lac, trp, trc, oxy-pro, omp/lpp, rrnB, lambda bacteriófago, bacteriófago T7, T71ac, bacteriófago T3, bacteriófago SP6, bacteriófago SP01, metalotioneína, fator de casamento-alfa, Pichia álcool oxidase, promotores subgenômicos alfavírus (como promotores subgenômicos de vírus Sindbis), gene de resistência a antibiótico, baculovírus, vírus de inseto Heliothis zea, vírus de vacínia, vírus de herpes, raccoon poxvirus, outros poxvirus, adenovírus, citomégalovirus (como promotores prematuros intermediários), vírus símio 40, retrovírus, actina, repetição terminal longa retroviral, vírus de Rous sarcoma, choque térmico, seqüências de controle de transcrição de nitrato e fosfato bem como outras seqüências capazes de controlar expressão de gene em células procarióticas ou eucarióticas.

[00212] Seqüências de controle de transcrição particularmente preferidas são promotores ativos em dirigir transcrição em plantas, quer constitutivamente ou especifica em estágio e/ou tecido, dependendo do uso da planta ou partes da mesma. Esses promotores de planta incluem, porém não são limitados a, promotores que mostram expressão constitutiva, como o promotor 35S de Vírus de Mosaico de Couve-flor (CaMV), aqueles para expressão específica de folha, como o promotor do gene de subunidade pequena de carboxilase bifosfato ribulose, aqueles para expressão específica de raiz, como o promotor a partir do gene glutamina sintase, aqueles para expressão específica de semente, como o promotor curciferin A a partir de Brassica napus, aqueles para expressão específica de túber, como o promotor patatin classe I a partir de batata ou aqueles para expressão específica de frutas, como o promotor poligalacturonase (PG) a partir de tomate.

[00213] Moléculas recombinantes da presente invenção podem conter também (a) sinais secretores (isto é, seqüências de ácido nucléico de segmento de sinal) para permitir que um polipeptídeo expresso da presente invenção seja secretado a partir da célula que produz o polipeptídeo e/ou (b) contém seqüências de fusão que levam à expressão de moléculas de ácido nucléico da presente invenção como proteínas de fusão. Os exemplos de segmentos de sinais apropriados incluem qualquer segmento de sinal capaz de dirigir a secreção de um polipeptídeo da presente invenção. Segmentos de sinais preferidos incluem, porém não são limitados a, ativador de plasminogênio de tecido (t-PA), interferon, interleucina, hormônio de crescimento, segmentos de sinal de glicoproteina de envelope viral, peptideo de sinal Nicotiana nectarin (US 5.939.288), sinal de extensin de tabaco, o sinal de proteína de ligação de corpo de óleo de oleosina de soja, peptideo de sinal quitinase básico vacuolar Arabidopsis thaliana, bem como seqüências de sinais nativos de um polipeptídeo da invenção. Além disso, uma molécula de ácido nucléico da presente invenção pode ser unida a um segmento de fusão que orienta o polipeptídeo codificado para o proteossoma, como segmento de fusão de ubiquitina. Moléculas recombinantes também podem incluir seqüências intermediárias e/ou não traduzidas circundando e/ou dentro das seqüências de ácido nucléico da presente invenção. Células hospedeiras [00214] Outra modalidade da presente invenção inclui uma célula recombinante que compreende uma célula hospedeira transformada com uma ou mais moléculas recombinantes da presente invenção, ou células de progênie das mesmas. A transformação de uma molécula de polinucleotídeo em uma célula pode ser realizada por qualquer método pelo qual uma molécula de polinucleotídeo pode ser inserida na célula. Técnicas de transformação incluem, porém não são limitadas a transfecção, eletroporação, microinjeção, lipofecção, adsorção e fusão de protoplasto. Uma célula recombinante pode permanece unicelular ou pode crescer em um tecido, órgão ou um organismo multicelular. Moléculas de polinucleotídeo transformadas da presente invenção podem permanecer extracromossômicas ou podem integrar em um ou mais sítios dentro de um cromossomo da célula transformada (isto é, recombinante) de tal modo que sua capacidade a ser expressa é retida.

[00215] Células hospedeiras apropriadas para transformação incluem qualquer célula que possa ser transformada com um polinucleotídeo da presente invenção. Células hospedeiras da presente invenção podem ser endogenamente (isto é, naturalmente) capazes de produzir polipeptídeos da presente invenção ou podem ser capazes de produzir tais polipeptídeos após serem transformadas com pelo menos uma molécula de polinucleotídeos da presente invenção. As células hospedeiras da presente invenção podem ser qualquer célula capaz de produzir pelo menos uma proteína da presente invenção, e incluem células bacterianas, fúngicas (incluindo levedo), parasita, artrópodes, de animais e plantas. Os exemplos de células hospedeiras incluem Salmonella, Escherichia, Bacillus, Listeria, Saccharomyces, Spodoptera, Mycobacteria, Trichplusia, células BHK (rim de filhote de hamster), células MDCK, células CRFK, células CV-1, células COS (por exemplo, COS-7) e células vero. Exemplos adicionais de células hospedeiras são E.coli, incluindo derivados de E.coli K-12; Salmonella typhi; Salmonella typhimurium, incluindo cepas atenuadas; Spodoptera frugiperda; Trichoplusia ni; e células G8 de mioblasto de camundongo não tumorigênico (por exemplo, ATCC CRL 1246). Hospedeiros de células de mamíferos apropriadas adicionais incluem outras linhagens de células de rim, outras linhagens de células de fibroblasto (por exemplo, linhagens de células de fibroblasto de embrião de ser humano, murino ou galinha), linhagens de células de mieloma, células de ovário de hamster chinês, células NIH/3T3 de camundongo, células LMTK e/ou células HeLa. Células hospedeiras particularmente preferidas são células de plantas como aquelas disponíveis a partir de Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures).

[00216] Tecnologias de DNA recombinantes podem ser utilizadas para melhorar a expressão de uma molécula de polinucleotídeo transformada por manipulação, por exemplo, do número de cópias da molécula de polinucleotídeo em uma célula hospedeira, a eficiência com a qual aquelas moléculas de polinucleotídeo são transcritas, a eficiência com a qual os transcritos resultantes são traduzidos, e a eficiência de modificações pós-translação. Técnicas recombinantes úteis para aumentar a expressão de moléculas de polinucleotídeos da presente invenção incluem, porém não são limitados a, ligar operativamente moléculas de polinucleotídeo a plasmídeos com número de cópia elevado, integração da molécula de polinucleotídeo em um ou mais cromossomos de células hospedeiras, adição de seqüências de estabilidade de vetor a plasmídeos, substituições ou modificações de sinais de controle de transcrição (por exemplo, promotores, operadores, intensificadores), substituições ou modificações de sinais de controle traducionais (por exemplo, sítios de ligação de ribossomo, seqüências Shine-Dalgarno), modificação de moléculas de polinucleotideos da presente invenção para corresponder ao uso de códon da célula hospedeira, e a deleção de sequências que desestabilizam transcritos.

Plantas transgênicas [00217] O termo "planta" se refere a plantas inteiras, órgãos de plantas (por exemplo, folhas, caules raizes, etc.), sementes, células de plantas e similares. Plantas consideradas para uso na prática da presente invenção incluem tanto monocotilédones como dicotilédones. Plantas alvo incluem, porém não são limitadas as seguintes: cereais (trigo, cevado, centeio, aveia, arroz, sorgo e culturas relacionadas); beterraba (beterraba e beterraba para forragem); pomos, frutas com caroço e fruta macia (maçãs, pêras, ameixas, pêssegos, amêndoas, cerejas, morangos, framboesas e amoras pretas); plantas leguminosas (feijões, lentilhas, ervilhas, sojas); plantas de óleo (colza, mostarda, papoula, azeitonas, girassóis, coco, plantas de óleo de mamona, sementes de cacau, amendoins); plantas de pepino (polpa, pepinos, melões); plantas de fibras (algodão, linho, cânhamo, juta); frutas citricas (laranjas, limões, toranja, tangerinas); legumes (espinafre, alface, aspargos, repolhos, cenouras, cebolas, tomates, batatas, páprica); laurácea (abacates, canela, cânfora); ou plantas como milho, fumo, nozes, café, cana de açúcar, chá, videiras, lúpulos, turfa, bananas e plantas de borracha natural, bem como ornamentais (flores, arbustos, árvores com folhas largas e sempre-vivas, como coníferas).

[00218] Plantas transgênicas, como definido no contexto da presente invenção incluem plantas (bem como partes e células das plantas) e sua progênie que foram genericamente modificadas utilizando técnicas recombinantes para causar a produção de pelo menos um polipeptideo da presente invenção na planta desejada ou órgão da planta. Plantas transgênicas podem ser produzidas utilizando técnicas conhecidas na arte, como aquelas descritas genericamente por A. Slater e outros, Plant Biotechnology -The Genetic Manipulation of Plants, Oxford University Press (2003), e P. Christou e H. Klee, Handbook of Plant Biotechnology, John Wiley and Sons (2004).

[00219] Um polinucleotideo da presente invenção pode ser expresso de forma constitutiva nas plantas transgênicas durante todos os estágios de desenvolvimento. Dependendo do uso da planta ou órgãos de planta, os polipeptídeos podem ser expressos em um modo especifico de estágio. Além disso, os polinucleotideos podem ser expressos especificamente para tecido.

[00220] Seqüências reguladoras que são conhecidas ou são verificadas como causando expressão de um gene codificando um polipeptideo de interesse em plantas podem ser utilizadas na presente invenção. A escolha das seqüências reguladoras utilizadas depende da planta alvo e/ou órgão alvo de interesse. Tais seqüências reguladoras podem ser obtidas a partir de plantas ou virus de plantas, ou podem ser quimicamente sintetizadas. Tais seqüências reguladoras são bem conhecidas por aqueles versados na arte.

[00221] Promotores de planta constitutivos são bem conhecidos. Além dos promotores previamente mencionados, alguns outros promotores apropriados incluem, porém não são limitados ao promotor de sintase de nopalina, o promotor de sintase de octopina, promotor caMV 35S, o promotor ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase, pEmu baseado em Adhl, Actl, o promotor sintase SAM e promotores Ubi e o promotor da proteína de ligação a/b de clorofila. Alternativamente, pode ser desejável ter o(s) transgene(s) expresso em um modo regulado. A expressão regulada dos polipeptídeos é possível pela colocação da següência de codificação da proteína de seda sob o controle de promotores que são específicos para tecido, específicos para desenvolvimento, ou induzíveis. Vários genes e/ou promotores regulados específicos de tecido foram reportados em plantas. Esses incluem genes que codificam as proteínas de armazenagem de semente (como napin, cruciferin, β-conglicinina, glicinina e faseolina), zeína ou proteínas de corpo de óleo (como oleosina), ou genes envolvidos em biossíntese de ácido graxo (incluindo proteína portadora de acila, desaturase de ACP-estearoíla, e desaturases de ácido graxo (fad 2-1)), e outros genes expressos durante desenvolvimento de embrião (como Bce4). Particularmente útil para expressão específica de semente é o promotor vicilina de ervilha. Outros promotores úteis para expressão em folhas maduras são aqueles que são ligados no início de senescência, como o promotor SAG a partir de Arabidopsis. Uma classe de promotores específicos de frutas expressos em ou durante antese através do desenvolvimento de frutas, pelo menos até o início de amadurecimento, é discutida em US 4.943.674. Outros exemplos de promotores específicos de tecido incluem aqueles que dirigem expressão em túberes (por exemplo, promotor de gene patatin) e em células de fibras (um exemplo de uma proteína de célula de fibra regulada no modo de desenvolvimento é fibra E6).

[00222] Outras sequências reguladoras como seqüências terminadoras e sinais de poliadenilação incluem qualquer tal seqüência funcionando como tal em plantas, cuja escolha seria óbvia para o destinatário versado. A região de terminação utilizada no cassete de expressão será escolhida principalmente por conveniência, uma vez que as regiões de terminação parecem ser relativamente intercambiáveis. A região de terminação que é utilizada pode ser nativa com a região de iniciação de transcrição, pode ser nativa com a seqüência de polinucleotídeo de interesse, ou pode ser derivada de outra fonte. A região de terminação pode ser de ocorrência natural, ou total ou parcialmente sintética. Regiões de terminação convenientes são disponíveis a partir do plasmídeo Ti de A. tumefaciens, como as regiões de terminação octopina sintase e nopalina sintase ou a partir dos genes para β-faseolina, o gene lant quimicamente induzível, pIN.

[00223] Várias técnicas são disponíveis para a introdução de uma construção de expressão contendo uma seqüência de ácidos nucléicos que codifica um polipeptídeo de interesse nas plantas alvo. Tais técnicas incluem, porém não são limitadas à transformação de protoplastos utilizando o método de cálcio/polietileno glicol, eletroporação e microinjeção ou bombardeio de partículas (revestidas). Além desses denominados métodos de transformação de DNA direto, sistemas de transformação envolvendo vetores são amplamente disponíveis, como vetores virais e bacterianos (por exemplo, a partir do gênero Agrobacterium) . Após seleção e/ou classificação, os protoplastos, células ou partes de plantas que foram transformados podem ser regenerados em plantas inteiras, utilizando métodos conhecidos na técnica. A escolha das técnicas de transformação e/ou regeneração não é crítica para essa invenção.

[00224] Para confirmar a presença dos transgenes em células transgênicas e plantas, uma amplificação de reação de cadeia polimerase (PCR) ou análise de Southern blot pode ser executada utilizando métodos conhecidos por aqueles versados na arte. Produtos de expressão dos transgenes podem ser detectados em qualquer de uma variedade de modos, dependendo da natureza do produto, e incluem ensaio de enzima e Western blot. Um modo particularmente útil para quantificar expressão de proteína e detectar replicação em diferentes tecidos de planta é utilizar um gene repórter, como GUS. Após obtenção das plantas transgênicas, as mesmas podem ser cultivadas para produzir tecidos ou partes de plantas tendo o fenótipo desejado. As partes de planta, ou tecido de planta, podem ser colhidos e/ou a semente coletada. A semente pode servir como uma fonte para cultivar plantas adicionais com tecidos ou partes tendo as características desejadas.

Animais Hon-humanos transgênicos [00225] Técnicas para produzir animais transgênicos são bem conhecidas na arte. Um livro geral útil sobre esse assunto é Houdebine, Transgenic animais - generation and use (Harwood Academic, 1997) .

[00226] DNA heterólogo pode ser introduzido, por exemplo, em ovos de mamífero fertilizados. Por exemplo, células-tronco totipotentes ou pluripotentes podem ser transformadas por microinjeção, precipitação mediada por fosfato de cálcio, fusão de lipossoma, infecção retroviral ou outro meio, as células transformadas são então introduzidas no embrião, e o embrião então se desenvolve em um animal transgênico. Em um método altamente preferido, embriões em desenvolvimento são infectados com um retrovírus contendo o DNA desejado, e animais transgênicos produzidos a partir do embrião infectado. Em um método mais preferido, entretanto, os DNAs apropriados são co-injetados no pronúcleo ou citoplasma de embriões, preferivelmente no estágio de célula única, e os embriões deixados desenvolver em animais transgênicos maduros.

[00227] Outro método utilizado para produzir um animal transgênico envolve micro-injetar um ácido nucléico em ovos de estágio pró-nuclear por métodos padrão. Ovos injetados são então cultivados antes da transferência para dentro de ovidutos de receptores pseudográvidas.

[00228] Animais transgênicos podem ser produzidos também por tecnologia de transferência nuclear. Utilizando esse método, fibroblastos a partir de animais doadores são estavelmente transfectados com um plasmídeo que incorpora as seqüências de codificação para um domínio de ligação ou partner de ligação de interesse sob o controle de seqüências reguladoras. Meios de transfecção estáveis são então fundidos para oocitos enucleados, cultivados e transferidos para receptoras fêmeas. Métodos de recuperação e produção de seda [00229] As proteínas da seda da presente invenção podem ser extraídas e purificadas a partir de células recombinantes, como células de planta, bactérias ou levedo, produzindo a proteína por uma variedade de métodos. Em uma modalidade, o método envolve a remoção de proteínas de células nativas a partir de células/tecidos/plantas homogeneizadas, etc. diminuindo o pH e aquecimento, seguido por fracionamento de sulfato de amônio. Resumidamente, proteínas solúveis totais são extraídas por homogeneização de células/tecidos/plantas. Proteínas nativas são removidas por precipitação em pH 4,7 e então a 60°C. O sobrenadante resultante é então dividido com sulfato de amônio a 40% de saturação. A proteína resultante será da ordem de 95% pura. Purificação adicional pode ser obtida com cromatografia de afinidade ou gel convencional.

[00230] Em outro exemplo, lisados de célula são tratados com concentrações elevadas de ácido, por exemplo, HC1 ou ácido propiônico para reduzir o pH para ~l-2 por 1 hora ou mais que solubilizará as proteínas da seda porém precipitará outras proteínas.

[00231] Agregados fibrilares formarão a partir de soluções por automontagem espontânea de proteínas da seda da invenção quando a concentração de proteína excede um valor crítico. Os agregados podem ser reunidos e fiados mecanicamente em fibras macroscópicas de acordo com o método de 0'Brien e outros (I. 0'Brien e outros, "Design Synthesis and fabrication of novel self-assembling fibrillar proteins", em Silk Polymers: Materials Science and Biotechnology, pág. 104-117, Kaplan, Adams, Farmer e Viney, eds., c. 1994 por American Chemical Society, Washington, D.C.).

[00232] Por natureza da estrutura secundária de espiral enrolada inerente, proteínas como Xenospiral-4, BBF1-4, BAF1-4 e GAF1-4 formarão espontaneamente a estrutura secundária de espiral enrolada após desidratação. Como descrito abaixo, a resistência de espiral enrolada pode ser intensificada através de reticulação enzimática ou química de resíduos de lisina em proximidade estreita.

[00233] Fibras de seda e/ou copolímeros da invenção têm uma baixa exigência de processamento. As proteínas da seda da invenção exigem processamento mínimo, por exemplo, fiação para formar uma fibra forte visto que espontaneamente formam espiras enroladas fortes que podem ser reforçados com reticulações como reticulações de lisina. Isso contrasta com polipeptídeos de seda recombinante de aranha e B. mori que exigem técnicas de fiação sofisticadas para obter a estrutura secundária (β-folha) e resistência da fibra.

[00234] Entretanto, fibras podem ser fiadas a partir de soluções tendo propriedades características de uma fase de cristal líquida. A concentração de fibra na qual a transição de fase pode ocorrer depende da composição de uma proteína ou combinação de proteínas presentes na solução. A transição de fase, entretanto, pode ser detectada por monitoração da claridade e birrefringência da solução. O inicio de uma fase de cristal liquida pode ser detectado quando a solução adquire uma aparência translúcida e registra birrefringência quando visualizado através de filtros de polarização cruzados.

[00235] Em uma técnica de formação de fibras, fibras podem ser primeiramente extrusadas a partir da solução de proteína através de um orifício para dentro de metanol, até que um comprimento suficiente para ser coletado por um meio mecânico é produzido. A seguir uma fibra pode ser puxada por tal meio mecânico através de uma solução de metanol; coletada, e seca. Métodos para estirar fibras são considerados bem conhecidos na técnica.

[00236] Exemplos adicionais de métodos que podem ser utilizados para produzir fibras de seda e/ou copolímeros da presente invenção são descritos em US 2004/0170827 e US 2005/0054830.

[00237] Em uma modalidade preferida, fibras de seda e/ou copolímeros da invenção são reticulados. Em uma modalidade, as fibras de seda e/ou copolímeros são reticulados em uma superfície/artigo/produto etc. de interesse utilizando técnicas conhecidas na arte. Em outra modalidade (ou em combinação com a modalidade anterior), pelo menos algumas proteínas da seda nas fibras de seda e/ou copolímeros são reticulados entre si. Preferivelmente, as proteínas da seda são reticuladas através de resíduos de lisina nas proteínas. Tal reticulação pode ser executada utilizando técnicas químicas e/ou enzimáticas conhecidas na arte. Por exemplo, reticulações enzimáticas podem ser catalisadas por lisil oxidase, ao passo que reticulações não enzimáticas podem ser geradas a partir de resíduos de lisina glicada (Reiser e outros; 1992).

Anticorpos [00238] A invenção também provê anticorpos monoclonais ou policlonais para polipeptídeos da invenção ou fragmentos dos mesmos. Desse modo, a presente invenção provê ainda um processo para a produção de anticorpos monoclonais ou policlonais para polipeptídeos da invenção.

[00239] O termo "se liga especificamente" se refere à capacidade do anticorpo de se ligar em pelo menos um polipeptídeo da presente invenção, porém não a outras proteínas da seda conhecidas.

[00240] Como utilizado aqui, o termo "epítopo" se refere a uma região de um polipeptídeo da invenção que é ligada pelo anticorpo. Um epítopo de ser administrado a um animal para gerar anticorpos contra o epítopo, entretanto, anticorpos da presente invenção ligam preferivelmente especificamente a região de epítopo no contexto do polipeptídeo inteiro.

[00241] Se anticorpos policlonais forem desejados, um mamífero selecionado (por exemplo, camundongo, coelho, cabra, cavalo, etc.) é imunizado com um polipeptídeo imunogênico da invenção. Soro a partir do animal imunizado é coletado e tratado de acordo com procedimentos conhecidos. Se soro contendo anticorpos policlonais contiver anticorpos para outros antígenos, os anticorpos policlonais podem ser purificados por cromatografia de imunoafinidade. As técnicas para se produzir e processar o anti-soro policlonal são conhecidas na arte. Para que tais anticorpos possam ser feitos, a invenção também provê polipeptideos da invenção ou fragmentos dos mesmos haptenizados com outro polipeptideo para uso como imunógenos em animais.

[00242] Anticorpos monoclonais dirigidos contra polipeptideos da invenção também podem ser prontamente produzidos por uma pessoa versada na técnica. A metodologia geral para fazer anticorpos monoclonais por hibridomas é bem conhecida. Linhagens de células que produzem anticorpos imortais podem ser criadas por fusão de células, e também por outras técnicas como transformação direta de linfócitos B com DNA oncogênico, ou transfecção com virus Epstein-Barr. Painéis de anticorpos monoclonais produzidas podem ser classificados para várias propriedades, isto é, para afinidade de epítopo e isotipo.

[00243] Uma técnica alternativa envolve classificação de bibliotecas de exibição de fagos onde, por exemplo, os fagos expressam fragmentos scFv na superfície de seu revestimento com uma grande variedade de regiões de determinar complementaridade (CDRs). Essa técnica é bem conhecida na arte.

[00244] Para fins da presente invenção, o termo "anticorpo", a menos que especificado ao contrário, inclui fragmentos de anticorpos inteiros que retêm sua atividade de ligação para um antígeno alvo. Tais fragmentos incluem fragmentos Fv, F(ab') e F(ab')2, bem como anticorpos de cadeia única (scFv). Além disso, os anticorpos e fragmentos dos mesmos podem ser anticorpos humanizados, por exemplo, como descrito em EP-A-239400.

[00245] Anticorpos da invenção podem ser ligados a um suporte sólido e/ou embalados em kits em um recipiente apropriado juntamente com reagentes apropriados, controles, instruções e similares.

[00246] Preferivelmente, anticorpos da presente invenção são rotulados de forma detectável. Rótulos detectáveis exemplares que permitem medição direta de ligação de anticorpo incluem radiorrótulos, fluoróforos, corantes, contas magnéticas, meios de quimiluminescência, partículas coloidais, e similares. Os exemplos de rótulos que permitem medição indireta de ligação incluem enzimas onde o substrato pode fornecer um produto colorido ou fluorescente. Rótulos detectáveis exemplares adicionais incluem enzimas covalentemente ligadas capazes de fornecer um sinal de produto detectável após adição de substrato apropriado. Os exemplos de enzimas apropriadas para uso em conjugados incluem peroxidase da raiz forte, fosfatase alcalina, desidrogenase malato e similares. Onde não estão comercialmente disponível, esses conjugados de enzima-anticorpo são prontamente produzidas por técnicas conhecidas por aqueles versados na arte. Rótulos detectáveis exemplares, adicionais incluem biotina, que se liga com afinidade elevada a avidina ou estreptavidina; fluorocromos (por exemplo, ficobiliproteínas, ficoeritrina e aloficocianinas; fluoresceína e vermelho Texas), que podem ser utilizados com um separador de células ativado por fluorescência; haptenos; e similares. Preferivelmente, o rótulo detectável permite medição direta em um luminômetro de placa, por exemplo, biotina. Tais anticorpos rotulados podem ser utilizados em técnicas conhecidas na arte para detectar polipeptideos da invenção.

Composições [00247] Composições da presente invenção podem incluir um "veiculo aceitável". Os exemplos de tais veículos aceitáveis incluem água, solução salina, solução de Ringer, solução de dextrose, solução de Hank, e outras soluções de sal fisiologicamente equilibradas, aquosas. Veículos não aquosos, como óleos fixos, óleo de gergelim, oleato de etila ou triglicerídeos podem ser também utilizados.

[00248] Em uma modalidade, o "veículo aceitável" é um "veículo farmaceuticamente aceitável". O termo veículo farmaceuticamente aceitável se refere a entidades moleculares e composições que não produzem uma reação alérgica, tóxica ou de outro modo adversa quando administrada a um animal, particularmente um mamífero, e mais particularmente um ser humano. Exemplos úteis de veículos farmaceuticamente aceitáveis ou diluentes incluem, porém não são limitados a, solventes, meios de dispersão, revestimentos, estabilizadores, colóides de proteção, adesivos, espessantes, agentes tixotrópicos, agentes de penetração, agentes sequestrantes e agentes de retardo de absorção e isotônicos que não afetam a atividade dos polipeptideos da invenção. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, como lecitina, pela manutenção do tamanho exigido de partículas no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. Mais genericamente, os polipeptideos da invenção podem ser combinados com qualquer aditivo liquido ou sólido não tóxico correspondendo às técnicas de formulação usuais.

[00249] Como delineado aqui, em algumas modalidades um polipeptideo, uma fibra de seda e/ou um copolimero da invenção é utilizada como um veiculo farmaceuticamente aceitável.

[00250] Outras composições apropriadas são descritas abaixo com referência especifica a usos específicos dos polipeptídeos da invenção.

Usos [00251] Proteínas da seda são úteis para a criação de novos biomateriais devido a sua excepcional tenacidade e resistência. Entretanto, até a presente data as proteínas fibrosas de aranhas e insetos são proteínas grandes (mais de 100 kDa) e consistem em seqüências de aminoácidos altamente repetitivos. Essas proteínas são codificadas por genes grandes contendo códons altamente polarizados tornando os mesmos particularmente difíceis de se produzir em sistemas recombinantes. Por comparação, as proteínas da seda da invenção são curtas e não repetitivas. Essas propriedades tornam os genes que codificam essas proteínas particularmente atraentes para produção recombinante de novos biomateriais.

[00252] As proteínas da seda, fibras de seda e/ou copolímeros da invenção podem ser utilizados para um conjunto amplo e diverso de aplicações médicas, militares, industriais e comerciais. As fibras podem ser utilizadas na fabricação de dispositivos médicos como suturas, enxertos de pele, matrizes de crescimento celular, ligamentos de substituição, e malha cirúrgica, e em uma ampla gama de produtos industriais e comerciais, como, por exemplo, cabo, corda, rede, linha de pescar, pano de roupas, revestimento de colete à prova de balas, pano de recipiente, mochilas, mochilas de soldados, tiras de bolsa ou carteira, material de ligação adesivo, material de ligação não adesivo, material de tiras, tecido de tenda, lonas, coberturas de piscinas, coberturas para carros, material de cerca, vedante, material de construção, material à prova de condições climáticas, material de divisão flexível, equipamento esportivo; e, na realidade, em quase qualquer uso de fibra ou tecido para o qual a elasticidade e a resistência à tração, elevadas, são características desejáveis. As proteínas da seda, fibras de seda e/ou copolímeros da presente invenção têm também aplicações em composições para produtos de higiene pessoal como cosméticos, tratamento de pele, tratamento de cabelos e coloração de cabelos; e em revestimento de partículas, como pigmentos.

[00253] As proteínas da seda podem ser utilizadas em sua forma nativa ou podem ser modificadas para formar derivados, que fornecem um efeito mais benéfico. Por exemplo, a proteína de seda pode ser modificada por conjugação com um polímero para reduzir alergenicidade como descrito em US 5.981.718 e US 5.856.451. Polímeros modificadores apropriados incluem, porém não são limitados a óxidos de polialquileno, álcool de polivinil, poli-carboxilatos, poli(vinil pirrolidona) e dextranos. Em outro exemplo, as proteínas da seda podem ser modificadas por digestão seletiva e junção de outros modificadores de proteína. Por exemplo, as proteínas da seda podem ser clivadas em unidades menores de peptídeo por tratamento com ácido em uma temperatura elevada de aproximadamente 60°C. Os ácidos úteis incluem, porém não são limitados a, ácidos clorídrico, sulfúrico ou fosfórico diluídos. Alternativamente, a digestão das proteínas da seda pode ser feita por tratamento com uma base, como hidróxido de sódio, ou digestão enzimática utilizando uma protease apropriada pode ser utilizada.

[00254] As proteínas podem ser adicionalmente modificadas para fornecer características de desempenho que são benéficas em aplicações específicas para produtos de higiene pessoal. A modificação de proteínas para uso em produtos de higiene pessoal é bem conhecida na técnica. Por exemplo, métodos comumente utilizados são descritos em US 6.303.752, US 6.284.246, e US 6.358.501. Os exemplos de modificações incluem, porém não são limitados a, etoxilação para promover intensificação de emulsão de água-óleo, siloxilação para fornecer compatibilidade lipofílica, e esterificação para auxiliar em compatibilidade com composições de detergente e sabão. Adicionalmente, as proteínas da seda podem ser derivadas com grupos funcionais incluindo, porém não limitados a, aminas, oxiranes, cianatos, ésteres de ácido carboxílico, copolióis de silicone, ésteres de siloxano, alifáticos de Amina quaternizada, uretanos, poliacrilamidas, ésteres de ácido dicarboxílico e ésteres halogenados. As proteínas da seda também podem ser derivadas por reação com diiminas e pela formação de sais de metal.

[00255] Compatível com as definições acima de "polipeptídeo" (e "proteína"), tais moléculas derivadas e/ou modificadas são também mencionadas aqui amplamente como "polipeptídeos" e "proteínas".

[00256] Proteínas da seda da invenção podem ser fiadas juntas e/ou em feixes ou trançadas com outros tipos de fibras. Os exemplos incluem, porém não são limitados a, fibras poliméricas (por exemplo, polipropileno, náilon, poliéster), fibras e sedas de outras fontes de planta e animal (por exemplo, algodão, lã, seda de aranha ou Bombyx mori) e fibras de vidro. Uma modalidade preferida é fibra de seda trançada com 10% de fibra de polipropileno. A presente invenção considera que a produção de tais combinações de fibras pode ser prontamente posta em prática para aumentar quaisquer características desejadas, por exemplo, aparência, maciez, peso, durabilidade, propriedades de repelir água, custo de fabricação aperfeiçoado, que podem ser genericamente buscadas na fabricação e produção de fibras para aplicações médica, industrial ou comercial.

Produtos de higiene pessoal [00257] Composições para tratamento da pele e cosméticos podem ser composições anidras compreendendo uma quantidade eficaz de proteína de seda em um meio cosmeticamente aceitável. Os usos dessas composições incluem, porém não são limitadas a, produtos para tratamento de pele, limpeza de pele, maquiagem e anti-rugas. Uma quantidade eficaz de uma proteína de seda para composições de tratamento de pele e cosméticas é aqui definida como uma proporção de aproximadamente IO-4 a aproximadamente 30% em peso, porém preferivelmente de aproximadamente 10-3 a 15% em peso, em relação ao peso total da composição. Essa proporção pode variar como uma função do tipo de composição para tratamento de pele ou cosmética. Composições apropriadas para um meio cosmeticamente aceitável são descritas em US 6.280.747. Por exemplo, o meio cosmeticamente aceitável pode conter uma substância graxa em uma proporção genericamente de aproximadamente 10 a aproximadamente 90% em peso em relação ao peso total da composição, onde a fase graxa contendo pelo menos uma substância graxa liquida, sólida ou semi-sólida. A substância graxa inclui, porém não é limitada a, óleos, ceras, gomas, e as substâncias graxas denominadas pastosas. Alternativamente, as composições podem estar na forma de uma dispersão estável como uma emulsão de água em óleo ou óleo em água. Adicionalmente, as composições podem conter um ou mais aditivos ou adjuvantes cosméticos ou dermatológicos convencionais, incluindo, porém não limitados a, antioxidantes, agentes conservantes, cargas, tensoativos, filtros solares UVA e/ou UVB, fragrâncias, espessantes, agentes umectantes e polímeros aniônicos, não iônicos e anfotéricos, e corantes ou pigmentos.

[00258] Cosméticos emulsifiçados e quase fármacos que são produzíveis com o uso de materiais emulsifiçados compreendendo pelo menos uma proteína de seda da presente invenção incluem, por exemplo, cosméticos de limpeza (sabonete de beleza, lavagem facial, xampu, enxágüe e similares),produtos para tratar os cabelos (tinta de cabelos, cosméticos dos cabelos e similares), cosméticos básicos (creme geral, emulsão, creme de barbear, condicionador, colônia, loção de barbear, óleo cosmético, máscara facial, e similares), cosméticos de maquiagem (base, lápis de sobrancelha, creme para os olhos, sombra para os olhos, máscara, e similares), cosméticos aromáticos (perfume e similares), cosméticos de filtro solar e bronzeamento (creme de filtro solar e bronzeamento, loção de filtro solar e bronzeamento, óleo de filtro solar e bronzeamento, e similares), cosméticos para as unhas (creme para as unhas e similares), cosméticos de eyeliner (eyeliner e similares), cosméticos para os lábios (batom, creme para os lábios e similares), produtos para higiene oral (pasta de dente e similares), cosméticos para o banho (produtos de banho e similares) e similares.

[00259] A composição de cosmético também pode estar na forma de produtos para tratamento das unhas, como esmalte. Esmaltes são aqui definidos como composições para o tratamento e coloração de unhas, compreendendo uma quantidade eficaz de proteína de seda em um meio cosmeticamente aceitável. Uma quantidade eficaz de uma proteína de seda para uso em uma composição de esmalte é aqui definida como uma proporção de aproximadamente 10-4 a aproximadamente 30% em peso em relação ao peso total do esmalte. Componentes de um meio cosmeticamente aceitável para esmaltes são descritos em US 6.280.747. O esmalte contém tipicamente um solvente e uma substância de formação de filme, como derivados de celulose, derivados de polivinil, polímeros ou copolímeros acrílicos, copolímeros de vinil e polímeros de poliéster. A composição também pode conter um pigmento orgânico ou inorgânico.

[00260] Composições para tratamento dos cabelos são aqui definidas como composições para o tratamento de cabelos, incluindo, porém não limitadas a xampus, condicionadores, loções, aerossóis, géis e mousses, compreendendo uma quantidade eficaz de proteína de seda em um meio cosmeticamente aceitável. Uma quantidade eficaz de uma proteína de seda para uso em uma composição para tratamento dos cabelos é aqui definida como uma proporção de aproximadamente 10-2 a aproximadamente 90% em peso em relação ao peso total da composição. Componentes de um meio cosmeticamente aceitável para composições de tratamento de cabelos são descritas em US 2004/0170590, US 6.280.747, US 6.139.851 e US 6.013.250. Por exemplo, essas composições de tratamento de cabelos podem ser soluções aquosas, alcoólicas ou aquosas-alcoólicas, o álcool sendo preferivelmente etanol ou isopropanol, em uma proporção de aproximadamente 1 aproximadamente 75% em peso em relação ao peso total, para as soluções aquosas-alcoólicas. Adicionalmente, as composições de tratamento de cabelos podem conter um ou mais aditivos ou adjuvantes cosméticos ou dermatológicos, convencionais, como dado acima.

[00261] Composições para coloração de cabelos são aqui definidas como composições para a coloração, fingimento ou clareamento de cabelos, compreendendo uma quantidade eficaz de proteína de seda em um meio cosmeticamente aceitável. Uma quantidade eficaz de uma proteína de seda para uso em uma composição de coloração de cabelos é aqui definida como uma proporção de aproximadamente 10-4 a aproximadamente 60% em peso em relação ao peso total da composição. Componentes de um meio cosmeticamente aceitável para composições de coloração de cabelos são descritos em US 2004/0170590, US 6.398.821 e US 6.129.770. Por exemplo, composições de coloração de cabelos contêm genericamente uma mistura de agente de oxidação de corante baseado em peroxigênio inorgânico e um agente de coloração oxidável. O agente de oxidação de corante baseado em peroxigênio é mais comumente peróxido de hidrogênio. Os agentes de coloração de cabelos oxidativos são formados por acoplamento oxidativo de intermediários primários (por exemplo, p-fenilenodiaminas, p-aminofenóis, p-diaminopiridinas, hidróxi indóis, amino indóis, aminotimidinas, ou cianofenóis) com intermediários secundários (por exemplo fenóis, resorcinóis, m-aminofenóis, m-fenilenodiaminas, naftóis, pirazolonas, hidróxi indóis, catecóis ou pirazóis). Adicionalmente, composições de coloração de cabelos podem conter ácidos de oxidação, sequestrantes, estabilizadores, espessantes, tampões veículos, tensoativos, solventes, antioxidantes, polímeros, corantes não oxidativos e condicionadores.

[00262] As proteínas da seda podem ser também utilizadas para revestir pigmentos e partículas de cosmético para melhorar a capacidade de dispersão das partículas para uso em cosméticos e composições de revestimento. Partículas de cosmético são aqui definidas como materiais em partículas como pigmentos ou partículas inertes que são utilizadas em composições cosméticas. Pigmentos e partículas de cosméticos apropriados incluem, porém não são limitados a, pigmentos de cor inorgânicos, pigmentos orgânicos e partículas inertes. Os pigmentos de cor inorgânicos incluem, porém não são limitados a, dióxido de titânio, óxido de zinco, e óxidos de ferro, magnésio, cobalto e alumínio. Pigmentos orgânicos incluem, porém não são limitados a, D&C Vermelho no. 36; D&C Laranja no. 17; pigmentos de cálcio de D&C Vermelho nos. 7, 11, 31 e 34, o pigmento de bário de D&C Vermelho no. 12, o pigmento de estrôncio D&C vermelho no. 13, o pigmento de alumínio de FD&C Amarelo no. 5 e partículas de negro de fumo. Partículas inertes incluem, porém não são limitados a, carbonato de cálcio, silicato de alumínio, silicato de cálcio, silicato de magnésio, mica, talco, sulfato de bário, sulfato de cálcio, Nylon™ em pó, alcanos perfluorados, e outros plásticos inertes.

[00263] As proteínas da seda podem ser utilizadas também em fio dental (vide, por exemplo, US 2005/0161058). O fio pode ser fio monofilamento ou fio multifilamento, e as fibras podem ser ou não torcidas. O fio dental pode ser embalado como pedaços individuais ou em um rolo com um cortador para cortar pedaços em qualquer comprimento desejado. O fio dental pode ser fornecido em uma variedade de formatos diferentes de filamentos como tiras, folhas e similares, porém não limitados a eles. O fio pode ser revestido com materiais diferentes como cera; fio de monofilato de politetrafluoroetileno para fio, porém não limitados a eles.

[00264] As proteínas da seda também podem ser utilizadas em sabonete (vide, por exemplo, US 2005/0130857).

Revestimento de partícula de cosmético e pigmento [00265] A quantidade eficaz de uma proteína de seda para uso em revestimento de partícula de cosmético e pigmento é aqui definida como uma proporção de aproximadamente IO-4 a aproximadamente 50%, porém preferivelmente de aproximadamente 0,25 a aproximadamente 15% em peso em relação ao peso seco de partícula. A quantidade ótima da proteína de seda a ser utilizada depende do tipo de pigmento ou partícula de cosmético sendo revestida. Por exemplo, a quantidade de proteína de seda utilizada com pigmentos de cor inorgânicos é preferivelmente entre aproximadamente 0,01% e 20% em peso. No caso de pigmentos orgânicos, a quantidade preferida de proteína de seda está entre aproximadamente 1% e aproximadamente 15% em peso, enquanto para partículas inertes, a quantidade preferida está entre aproximadamente 0,25% a aproximadamente 3% em peso. Os métodos para a preparação de pigmentos revestidos e partículas são descritos em US 5.643.672. Esses métodos incluem: adicionar uma solução aquosa da proteína de seda às partículas enquanto giram ou se misturam; formar uma pasta da proteína de seda e das partículas e secagem, secar por pulverização uma solução da proteína de seda sobre as partículas ou liofilizar uma pasta da proteína de seda e as partículas. Esses pigmentos revestidos e partículas de cosmético podem ser utilizados em formulações cosméticas, tintas, e similares .

Biomédico [00266] As proteínas da seda podem ser utilizadas como revestimento em uma bandagem para promover cura de ferimento. Para essa aplicação, o material de bandagem é revestido com uma quantidade eficaz da proteína de seda. Para fins de uma bandagem de cura de ferimento, uma quantidade eficaz de proteína de seda é definida aqui como uma proporção de aproximadamente IO-4 a aproximadamente 30% em peso em relação ao peso do material de bandagem. 0 material a ser revestido pode ser qualquer pano ou fibra macio, biologicamente inerte, poroso. Os exemplos incluem, porém não são limitados a, algodão, seda, raiom, acetato, acrílico, polietileno, poliéster, e combinações dos mesmos. O revestimento do pano ou fibra pode ser realizado por diversos métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o material a ser revestido pode ser mergulhado em uma solução aquosa contendo a proteína de seda. Alternativamente, a solução contendo a proteína de seda pode ser pulverizada sobre a superfície do material a ser revestido utilizando uma pistola de pulverização. Adicionalmente, a solução contendo a proteína de seda pode ser revestida sobre a superfície utilizando um processo de impressão de cobertura de rolo. A bandagem de ferimento pode incluir outros aditivos incluindo, porém não limitados a: desinfetantes como o iodo, iodeto de potássio, iodo povidon, acrinol, peróxido de hidrogênio, cloreto de benzalcônio, e cloroexidina; agentes de aceleração de cura como alantoína, cloridrato de dibucaína, e malato de clorofenil amina; agentes vasoconstritores como cloridrato de nafozolina; agentes adstringentes como óxido de zinco; e agentes de geração de crosta como ácido bórico.

[00267] As proteínas da seda da presente invenção também podem ser utilizadas na forma de um filme como um material de curativo de ferimento. O uso de proteínas da seda, na forma de um filme amorfo, como um material de curativo de ferimento é descrito em US 6.175.053. O filme amorfo compreende um filme denso e não poroso de uma cristalinidade abaixo de 10% que contém uma quantidade eficaz de proteína de seda. Para um filme para tratamento de ferimento, uma quantidade eficaz de proteína de seda é aqui definida como entre aproximadamente 1 e 99% em peso. O filme também pode conter outros componentes incluindo, porém não limitados a outras proteínas como sericina, e desinfetantes, agentes de aceleração de cura, agentes vasoconstritores, agentes adstringentes, e agentes de geração de crosta, como descrito acima. Outras proteínas como sericina podem compreender 1 a 99% em peso da composição. A quantidade dos outros ingredientes listados é preferivelmente abaixo de um total de aproximadamente 30% em peso, mais preferivelmente entre aproximadamente 0,5 e 20% em peso da composição. O filme de curativo de ferimento pode ser preparado pela dissolução dos materiais acima mencionados em uma solução aquosa, remoção dos insolúveis por filtração ou centrifugação, e emissão da solução em uma superfície sólida lisa como uma placa acrílica, seguido por secagem.

[00268] As proteínas da seda da presente invenção também podem ser utilizadas em suturas (vide, por exemplo, US 2005/005051). Tais suturas podem apresentar uma camisa trançada feita de fibras de seda e fibras com peso molecular ultraelevado. O polietileno fornece resistência. Fibras de poliéster podem ser tecidas com o polietileno com elevado peso molecular para fornecer propriedades de amarrar aperfeiçoadas. A seda pode ser fornecida em uma cor contrastante para fornecer um traço para o reconhecimento e a identificação, aperfeiçoados, de sutura. A seda também é mais adaptável ao tecido do que outras fibras, permitindo que as extremidades sejam cortadas próximas ao nó sem preocupação com interação prejudicial entre as extremidades da sutura e tecido em volta. Propriedades de manipulação da sutura com resistência elevada também podem ser aumentadas utilizando vários materiais para revestir a sutura. A sutura tem vantajosamente a resistência de sutura Ethibond no. 5, ainda assim tem o diâmetro, sensação e capacidade de amarar da sutura no. 2. Como resultado, a sutura é ideal para a maioria dos procedimentos ortopédicos como reparo de manquito rotador, reparo de tendão de Aquiles, reparo de tendão patelar, reconstrução de ACL/PCL, procedimentos de reconstrução de ombro e quadril, e substituição por sutura utilizada em ou com âncoras de sutura. A sutura pode ser não revestida, ou revestida com cera (cera de abelha, cera de petróleo, cera de polietileno, ou outros), silicone (fluido de silicone Dow Corninq 202A ou outros), borrachas de silicone, PBA (ácido polibutilato), etil celulose (Filodel) ou outros revestimentos, para melhorar a capacidade lubrificante da trança, segurança de nó, ou resistência à abrasão, por exemplo.

[00269] As proteínas da seda da presente invenção também podem ser utilizadas em stents (vide, por exemplo, US 2004/0199241). Por exemplo, um enxerto de stent é fornecido que inclui um stent endoluminal e um enxerto, onde o enxerto de stent inclui seda. A seda induz uma resposta em um hospedeiro que recebe o enxerto de stent, onde a resposta pode levar à adesão aumentada entre o enxerto de stent de seda e o tecido do hospedeiro que está adjacente à seda do enxerto de stent de seda. A seda pode ser fixada ao enxerto por qualquer um de vários meios, por exemplo, por intertecer a seda no enxerto ou por aderência da seda ao enxerto (por exemplo, por intermédio de um adesivo ou por intermédio de sutura). A seda pode estar na forma de um fio, uma trança, uma folha, pó, etc. Com relação à localização da seca no enxerto de stent, a seda pode ser fixada somente no exterior do stent, e/ou a seda pode ser fixada nas regiões distais do enxerto de stent, para auxiliar a fixar essas regiões distais em tecido vizinho no hospedeiro. Uma ampla variedade de enxertos de stent pode ser utilizada no contexto da presente invenção, dependendo do sítio e natureza de tratamento desejado. Enxertos de stent podem ser, por exemplo, enxertos de tubo ou bifurcados, cilíndricos ou afilados, de auto-expansão ou expansíveis por balão, unicorpo ou modular, etc.

[00270] Além de seda, o enxerto de stent pode conter um revestimento em um pouco ou toda a seda, onde o revestimento degrada após inserção do enxerto de stent em um hospedeiro, o revestimento desse modo retardando o contato entre a seda e o hospedeiro. Revestimentos apropriados incluem, sem limitação, gelatina, poliésteres degradáveis (por exemplo, PLGA, PLA, MePEG-PLGA, PLGA-PEG-PLGA, e copolimeros e misturas dos mesmos), celulose e derivados de celulose (por exemplo, hidróxi propil celulose, polissacarideos (por exemplo, ácido hialurônico, dextrano, sulfato de dextrano, quitosana), lipideos, ácidos graxos, ésteres de açúcar, ésteres de ácido nucléico, polianidridos, poliortoésteres e álcool de polivinil (PVA). Os enxertos de stent contendo seda podem conter um agente biologicamente ativo (fármaco), onde o agente é liberado a partir do enxerto de stent e então induz uma resposta celular aumentada (Por exemplo, depósito de matriz celular ou extracelular) e/ou resposta fibrótica em um hospedeiro no qual o enxerto de stent foi inserido.

[00271] As proteínas da seda da presente invenção podem ser utilizadas também em uma matriz para produzir ligamentos e tendões ex vivo (vide, por exemplo, US2005/0089552). Uma matriz baseada em fibra de seda pode ser semeada com células pluripotentes, como células estromais de medula óssea (BMSCs). O tendão ou ligamento bioconstruído é vantajosamente caracterizado por um padrão de orientação celular e/ou ondulação de matriz na direção de forças mecânicas aplicadas, e também pela produção de marcadores específicos de tendão e ligamento incluindo colágeno tipo I, colágeno tipo III, e proteínas de fibronectina ao longo do eixo geométrico de carga mecânica produzida pelas forças mecânicas ou estimulação, se tais forças forem aplicadas. Em uma modalidade preferida, o ligamento ou tendão é caracterizado pela presença de feixes de fibras que são dispostos em uma organização helicoidal. Alguns exemplos de ligamentos ou tendões que podem ser produzidos incluem ligamento cruciforme anterior, ligamento cruciforme posterior, tendões de manguidor rotador, ligamento colateral mediai do cotovelo e joelho, tendões flexores da mão, ligamentos laterais do tornozelo e tendões e ligamentos da mandibula ou junta temporomandibular. Outros tecidos que podem ser produzidos pelos métodos da presente invenção incluem cartilagem (tanto articular como meniscal), osso, músculo, pele e vasos sanguíneos.

[00272] As proteínas da seda da presente invenção também podem ser utilizadas em hidrogéis (vide, por exemplo, US 2005/0266992). Hidrogéis de fibroína de seda podem ser caracterizados por uma estrutura de poros abertos que permite seu uso como armações de engenharia de tecido, substrato para cultura de célula, curativo para queimadura e ferimento, substitutos de tecido mole, enchimento de osso, e bem como suporte para compostos biologicamente ativos ou farmacêuticos.

[00273] As proteínas da seda também podem ser utilizadas em composições dermatológicas (vide, por exemplo, US 2005/0019297). Além disso, as proteínas da seda da invenção e derivados das mesmas também podem ser utilizadas em composições de liberada controlada (vide, por exemplo, US 2004/0005363).

Artigos têxteis [00274] As proteínas da seda da presente invenção também podem ser aplicadas à superfície de fibras para uso subsequente em artigos têxteis. Isso provê uma monocamada do filme de proteína na fibra, resultando em um acabamento liso. US 6.416.558 e US 5.232.611 descrevem a adição de um revestimento de acabamento em fibras. Os métodos descritos nessas revelações fornecem exemplos da versatilidade de acabamento da fibra para fornecer uma boa sensação e uma superfície lisa. Para essa aplicação, a fibra é revestida com uma quantidade eficaz da proteína de seda. Para fins de revestimento de fibra para uso em artigos têxteis, uma quantidade eficaz de proteína de seda é aqui definida como uma proporção de aproximadamente 1 a aproximadamente 99% em peso em relação ao peso do material de fibra. Os materiais de fibra incluem, porém não são limitados a fibras têxteis de algodão, poliésteres como raiom e Lycra™, náilon, lã, e outras fibras naturais incluindo seda nativa. Composições apropriadas para aplicar a proteína de seda sobre a fibra podem incluir co-solventes como etanol, isopropanol, hexafluoranóis, isotiocianouranatos e outros solventes polares que podem ser misturados com água para formar soluções ou microemulsões. A solução contendo proteína de seda pode ser pulverizada sobre a fibra ou a fibra pode ser imersa na solução. Embora não seja necessária, a secagem instantânea do material de revestimento é preferida. Um protocolo alternativo é aplicar a composição de proteína de seda sobre fibras trançadas. Uma modalidade ideal dessa aplicação é o uso de proteínas da seda para revestir teceduras estiráveis como utilizadas para meias.

Materiais compósitos [00275] Fibras de seda podem ser adicionadas a poliuretano, outras retinas ou cargas termoplásticas para preparar placas de painel e outros materiais de construção, ou como móveis moldados e bancadas que substituem madeira e placa de partículas. Os compósitos também podem ser utilizados em construção de edifícios e automotiva especialmente tetos e painéis de porta. As fibras de seda reforçam a resina tornando o material muito mais forte e permitindo construção de peso leve que é de resistência igual ou superior a outras placas de partículas e materiais compósitos. Fibras de seda podem ser isoladas e adicionadas a uma resina de formação de compósito sintética ou serem utilizadas em combinação com proteínas derivadas de planta, amido e óleos para produzir um material compósito de base biológica. Os processos para a produção de tais materiais são descritos em JP 2004284246, US 2005175825, US 4.515.737, JP 47020312 e WO 2005/017004.

Aditivos de papel [00276] As propriedades de fibras da seda da invenção podem acrescentar resistência e textura de qualidade à fabricação de papel. Papéis de seda são feitos por mosquear fios de seda em polpa de algodão para preparar papéis feitos à mão extra-suaves utilizados para presentes, capas de cadernos, bolsas. Os processos para produção de produtos de papel que podem incluir proteínas da seda da invenção são genericamente descritos em JP 2000139755.

Materiais avançados [00277] Sedas da invenção têm tenacidade considerável e se destacam entre outras sedas para manter essas propriedades quando umedecidas (Hepburn e outros, 1979).

[00278] Áreas de crescimento substancial na indústria têxtil de roupas são os artigos têxteis técnicos e inteligentes. Há uma demanda crescente para produtos têxteis saudáveis, com elevado valor funcional, favoráveis ao meio ambiente e personalizados. Fibras, como aquelas da invenção, que não mudam propriedades quando umedecidas e em particular mantêm sua resistência e capacidade de extensão, são úteis para roupas funcionais para esportes e lazer bem como roupas de trabalho e roupas de proteção.

[00279] Os desenvolvimentos em tecnologias de vigilância e armas e são induzindo inovações em equipamentos de proteção individuais e sistemas e estruturas relacionados a campo de batalha. Além de exigências convencionais como durabilidade de material à exposição prolongada, desgaste intenso e proteção contra ambiente externo, os artigos têxteis de seda da invenção podem ser processados para resistir a projéteis balísticos, incêndio e produtos químicos. Os processos para a produção de tais materiais são descritos em WO 2005/045122 e US 2005268443.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 - Preparação e análise de cDNAs de glândula salivar do último instar tardio [00280] As proteínas que são encontradas em sedas de euaculeatan e neuroptera (Apis mellifera, Bombus terrestris, Myrmecia forficata, Oecophylla smaragdina, Mallada signata) foram identificadas pelo casamento de padrões de fragmentação espectral de massa consecutiva de retenção de íon (MS/MS) de peptídeos obtidos por digestão de tripsina da seda com os dados espectrais de massa preditos de proteínas codificadas por cDNAs isolados a partir da glândula salivar de larvas de instar final tardio. Para confirmação de que não se perdeu nenhuma proteína por essa análise para a abelha de mel, os dados espectrais de massa de peptídeo também foram comparados com digestões trípticas virtuais de proteínas de Apis mellifera preditas pelo projeto de genoma de abelha e translações das seqüências genômicas de abelha de mel Amel3 em todos os seis quadros de leitura.

Abelha de mel [00281] Larvas de Apis mellifera foram obtidas a partir de colméias domésticas. Anteriormente foi mostrado que a produção de seda em Apis mellifera é confinada à glândula salivar durante a metade posterior do instar final (Silva-Zacarin e outros; 2003). Durante esse período, RNA é mais abundante na extremidade posterior da glândula (Flower e Kenchington, 1967). As regiões de célula cúbica de 50 glândulas salivares foram dissecadas a partir do quinto instar tardio Apis mellifera imerso em solução salina tamponada com fosfato. A extremidade posterior da glândula dissecada foi imediatamente colocada em RNAlater® (Ambion, Austin, TX, EUA) para estabilizar o mRNA, e subseqüentemente armazenada a 4°C.

[00282] RNA total (35 μρ) foi isolado a partir das glândulas salivares de instar final tardio utilizando o RNAqueous para kit de PCR a partir de Ambion (Austin, TX, EUA) . RNA de mensagem foi isolado a partir do RNA total utilizando o kit de isolamento de Micro-FastTrack™ 2.0 mRNA a partir de Invitrogen (Calsbad, CA, EUA) de acordo com as orientações do fabricante com o mRNA isolado sendo eluído em lOul de água isenta de RNAse.

[00283] Uma biblioteca de cDNA foi construída a partir de mRNA isolado a partir das larvas de Apis mellifra utilizando o kit de construção de biblioteca de cDNA CloneMiner™ de Invitrogen (Calsbad, CA, EUA) com as seguintes modificações a partir do protocolo padrão: para a síntese da primeira fita, 0,5 μΐ de iniciador de Biotin-attB2-01igo (dT) e βριηοΐ.μΐ-1 e 0,5 μΐ de dNTPs em 2mM cada foi adicionado a 10 μΐ de mRNA. Após incubação a 65°C por 5 min. então 45°C por 2 min., 2 μΐ de tampão de fita 5Xfirst, 1 μΐ de 0.1M DTT, e 0,5 μΐ SuperScript™ II RT a 200υ.μ1_1 foram adicionados. Para síntese de segunda fita, o volume total de todos os reagentes foi dividido ao meio e após precipitação de etanol, o cDNA foi ressuspenso e 5 μΐ de água tratada com DEPC. O adaptador aatBl (Ιμΐ) foi ligado em um volume total de 10 μΐ de ao 5 μΐ de cDNA com 2μ1 5X tampão Adapter, Ιμΐ 0.1M DTT e Ιμΐ de ligase de DNA T4 (ΐυ.μΐ-1) a 16°C por 48 h com 0,5 μΐ de ligase de DNA T4 adicional (1U. μΐ-1) adicionado após 16 horas. O cDNA foi fracionado em tamanho de acordo com as instruções de fabricação com amostras eluindo entre 300-500 μΐ sendo precipitadas com etanol, ressuspensas e transformadas nas células resistentes a fagos Tl DH10B™ E.coli como recomendado. A biblioteca de cDNA compreendia aproximadamente 1.200.000 unidades de formação de colônia (cfu) com aproximadamente 1% do vetor original. O tamanho médio de inserção foi de 1,3 ± 1,4 kbp.

[00284] Oitenta e dois clones foram aleatoriamente selecionados e seqüenciados utilizando o kit de partida GenomeLab™ DTCS Quick (BeckmanCoulter, Fullerton CA EUA) e passados em um seqüenciador CEQ8000 Biorad. Esses se agruparem em cinqüenta e quatro grupos (Tabela 2). A identificação dos cDNAs que codificaram as proteínas da seda é descrita abaixo.

Outras espécies [00285] RNA total foi isolado a partir de 4 abelhão (Bombus terrestris) (2 μρ RNA), 4 formigas bulldog (Myrmecia forficata) (3μg RNA), aproximadamente 100 formigas Tecelãs (Oecophyla smaragdina) (0,4 μg RNA) e aproximadamente 50 glândulas labiais de larvas tardias de lagarta verde (Mallada signata) utilizando o RNAqueous para kit PCR a partir de Ambion (Austin, TX, EUA) . MRNA foi isolado a partir do RNA total utilizando o Kit de Isolamento Micro-FastTrack™ 2.0 mRNA a partir de Invitrogen (Calsbad, CA, EUA) em um volume final de 10 μΐ de água. Bibliotecas de cDNA foram construídas a partir do mRNA utilizando o kit de cDNA CloneMiner™ de Invitrogen (Calsbad,CA, EUA) com as seguintes modificações a partir do protocolo padrão: para a síntese de primeira fita, 3pmol de iniciador Biotin-attB2-01igo(dT) e lnmol cada dNTPs foram adicionados a 10 μΐ de mRNA. Após 5 min. a 65°C seguido por 2 min. a 45°C, 2 μΐ de tampão de fita 5Xfirst, 50 nmol DTT, e 100U SuperScript™ II RT foram adicionados.

Tabela 2. cDNAs de glândula salivar de instarr final de A. mellifera e padrões de fragmentção de retenção de ion MS de peptideos a aprtir de digestão de tripsina de seda de favo de progênie tratada com SDS.

[00286] Para síntese de segunda fita, o volume total de todos os reagentes foi dividido ao meio em relação às quantidades recomendadas pelo fabricante e após precipitação de etanol, o cDNA foi ressuspenso em 5 μΐ de água tratada com DEPC. O adaptador aatBl (1 μΐ) foi ligado em um volume total de 10 μΐ a 5 μΐ de cDNA com 2 μΐ de 5X tampão de Adaptador, 50 nmol DTT e 1CJ ligase de DNA T4 a 16°C por 12 horas. As bibliotecas de cDNA compreendiam aproximadamente 2,4 x 107 (abelhão) , 5,0 x 107 (formiga bulldog) e 6000 (formiga verde) unidades de formação de colônia (cfu) com uma quantidade menor do que 1% do vetor original para as bibliotecas de abelhão· e formiga bulldog e maior do que 80% de vetor original na biblioteca de formiga verde. O tamanho médio de inserção nas bibliotecas foi de 1,3 Kbp.

[00287] Dados de seqüência foram obtidos a partir de mais de 100 clones aleatórios a partir das bibliotecas de cDNA de abelhão e formiga bulldog, 82 clones a partir de abelha de mel e 60 clones de lagarta verde. As dificuldades técnicas de se obter glândulas salivares a partir das minúsculas formigas verdes (aproximadamente 1 mm de comprimento) reduziram a eficiência da biblioteca dessa espécie e como tal somente 40 seqüêncías foram examinadas. Um sumário das proteínas da seda identificadas é fornecido na Tabela 3, Tabela 3. Identificação e propriedades das proteínas da seda de euaculeatan * também mencionado aqui como Xenspirail-4 e Xenosin respectivamente, ** predito por PRGFsec, *** predito por MARCOIL em limite de 90% EXEMPLO 2 - Preparação e análise proteõmica de seda nativa [00288] Favo de progênie de abelha de mel após a retirada de larvas, casulos de abelhão após a retirada de larvas, casulos de formiga bulldog após a retirada de larvas, ou folhas de seda de formiga tecelã foram lavadas extensamente três vezes em água morna para retirar contaminantes solúveis em água e então lavadas extensamente três vezes em clorofórmio para retirar cera. Clorofórmio foi removido por enxágüe em água destilada e um subconjunto dessa seda foi retido para análise. Um subconjunto das amostras de seda de Himenóptero (formigas e abelhas) foi adicionalmente lavado por fervura por 30 minutos e 0,05% de solução de carbonato de sódio, um procedimento padrão para retirar goma de seda de bicho-da-seda, então enxaguado em água destilada. Seda de lagarta verde foi enxaguada somente em água destilada. Retirou-se a goma de um subconjunto das amostras de seda de lagarta verde por fervura durante 30 minutos em 0,05% de solução de carbonato de sódio.

[00289] Um subconjunto do material de abelha de mel foi embebido durante a noite em 2% SDS a 95°C, seguido por três lavagens em água destilada. A extração em solução de SDS quente solubiliza a maioria das proteínas, porém nesse caso as folhas de seda retiveram sua conformação.

[00290] As sedas limpas foram analisadas por cromatografia líquida seguida por espectrometria de massa tandem (LCMS) como descrito abaixo.

[00291] Pedaços de seda limpa foram colocados em uma cavidade de um 'zipplate' Millipore, uma bandeja de microtítulo com 96 cavidades contendo um tampo de meio de cromatografia de fase inversa C18 através do fundo de cada cavidade na qual se adicionram 20 μΐ de 25 mM de bicarbonato de amônio contendo 160 ng de tripsina do tipo sequenciamento (Promega). A seguir a bandeja foi incubada durante a noite em um saco plástico umidificado a 30°C.

[00292] O material C18 foi umedecido por pipetar acetonitrila (10 μΐ) nos lados de cada cavidade e incubar a placa a 37°C por 15 min. Solução de ácido fórmico (130 μΐ, 1% v/v) foi adicionada a cada cavidade e após 30 min. os peptideos a partir das proteínas de abelha digeridas foram capturados no material C18 extraindo lentamente as soluções de cada cavidade através da base da placa sob um vácuo reduzido. O material C18 foi lavado duas vezes por extração através de 100 μç de solução de ácido fórmico. Peptideos foram eluídos com 6 μΐ de ácido fórmico a 1% em 70% de metanol pipetado diretamente sobre o material C18 e imediatamente centrifugado através do tampo Cl 8 em uma bandeja de microtítulo subjacente. Essa bandeja foi colocada sob vácuo até que o volume em cada cavidade foi reduzido aproximadamente 2 vezes por evaporação. Solução de ácido fórmico (10 μΐ) foi adicionada em cada cavidade e a bandeja foi transferida para o amostrador de placa de cavidade de um sistema de cromatografia líquida capilar Agilent 1100.

[00293] Peptideos (8 μΐ) a partir do extrato de seda foram ligados a uma coluna de 150x0,5 mm de 5 μπι Agilent Zorbax SB-C18 com uma taxa de fluxo de 0,1% de ácido fórmico/5% de acetonitrila em 20μ1.ιηίη_1 por um min. a seguir eluídos com gradientes de concentração crescente de acetonitrila para 0,1% ácido fórmico/20% de acetonitrila durante um min. a 5 μΙ.Γηίη-1, então a 0,1% de ácido fórmico/50% de acetonitrila durante 28 minutos, a seguir a 0,1% de ácido fórmico/95% de acetonitrila durante um minuto. A coluna foi lavada com 0,1% de ácido fórmico/95% -100% de acetonitrila durante 5 min. a 20μ1.Γηίη_1 e reequilibrada com 0,1% de ácido fórmico/5% de acetonitrila durante 7 min. antes da amostragem dos peptideos a partir da cavidade seguinte.

[00294] Eluato a partir da coluna foi introduzido em um espectrômetro de massa de retenção de ions Agilent XCT através da fonte de ions de eletropulverização do instrumento adaptada com um micronebulizador. Resumidamente, à medida que os peptideos estavam eluindo a partir da coluna, as varreduras de ion positivo de espectro total coletado por retenção de ions (100-2200m/z); seguidas por duas varreduras MS/MS de ions, observadas no espectro total evitando a seleção de ions que continham somente uma única carga. Quando um ion era selecionado para análise de MS/MS todos os outros foram excluídos a partir do coletor de ions, o ion selecionado foi fragmentado de acordo com os ajustes de "SmartFrag" e "Peptide Scan" recomendados do instrumento. Após coleta de dois espectros de fragmentação para qualquer valor m/z específico foi excluído da seleção para análise para um período adicional de 30 segundos a fim de evitar coleta de dados redundantes.

[00295] Conjuntos de dados espectrais de massa a partir do experimento inteiro foram analisados utilizando software Spectrum Mill da Agilent para casar os dados com predições de seqüências de proteína a partir das bibliotecas de cDNA. O software gerou marcações em relação à qualidade de cada casamento entre conjuntos experimentalmente observados de massas de fragmentos de peptideos e as predições de fragmentos que poderíam ser geradas de acordo com as seqüências de proteínas em um banco de dados fornecido. Todos os casamentos de seqüência reportados aqui receberam marcações maiores do que 20, o ajuste default para aceitação automática, segura de casamentos válidos.

[00296] Essa análise identificou que cinco proteínas expressas em elevados níveis na glândula labial casavam com a seda de cada uma das espécies de abelha cognata (mostradas nas Tabelas 2 e 3) e quatro proteínas expressas em níveis elevados na glândula labial casaram com a seda de cada uma das espécies de formiga cognata (mostradas na Tabela 3) . A abundância de RNA de mensagem codificando essas proteínas na glândula labial das lavas foi compatível com as proteínas sendo abundantemente produzidas (abundância de mensagem mostrada na Tabela 3).

[00297] Para assegurar que nenhuma das proteínas da seda de abelha de mel foi perdida por esse processo de identificação, os inventores compararam também os dados espectrais de massa de peptídeo de tripsina de seda de abelha de mel com um conjunto de seqüências de proteína preditas disponíveis para o público a partir do projeto de genoma de abelha de mel, gerado por um algoritmo de computador que tenta reconhecer genes transcritos nas seqüências de DNA genômico completo da abelha. Adicionalmente, os inventores geraram um banco de dados de translações nos seis quadros de leitura possíveis de cada seqüência de DNA genômica contígua fornecida pelo projeto de genoma de abelha (Amel3 release) . Essas seqüências de DNA traduzidas foram apresentadas ao software Spectrum Mill como se fossem as seqüências de proteínas muito grandes. O casamento de dados de peptídeo MS/MS identificou quadros de leitura aberta nas seqüências genômicas que tinham partes codificadas das proteínas de abelha isoladas sem a necessidade de primeiramente prever a organização dos genes. Nenhuma proteína adicional foi identificada na seda por essa análise. EXEMPLO 3 - Análise estrutural da seda nativa [00298] Amostras de seda nativa foram preparadas como descrito no Exemplo 2. Amostras de seda foram examinadas utilizando um espectrômetro infravermelho de transformação Fourier Bruker Tensor 37 com um acessório de reflexão total atenuado por diamante Pike Miracle. A análise das regiões de amida I e II dos espectros de sedas de abelha de mel, abelhão, formiga verde e formiga bulldog e seda larval de lagarta verde (figura 1) mostra que todas essas sedas têm uma estrutura secundária predominantemente alfa-helicoidal. As sedas das espécies Euaculeatan têm picos dominantes nos espectros FT-IR a 1645-1646 cm-1, deslocados aproximadamente 10 cm-1 mais baixos do que um sinal a-helicoidal clássico e alargados. Esse deslocamento no sinal α-helicoidal é típico de proteínas de espiral enrolada (Heimburg e outros; 1999). Os espectros de amostras que tiveram a goma retirada ficaram inalterados. EXEMPLO 4 - a composição de aminoácido de sedas nativas lembra muito aquela das proteínas da seda identificadas [00299] A composição de aminoácidos das sedas nativas foi determinada após 24 g de hidrólise de fase de gás a 110°C utilizando a química Wates AccQTag da Australian Proteome Analysis Facility Ltd. (Macquarie University, Sidney).

[00300] A composição de aminoácidos medida da seda lavada com SDS era similar àquela prevista a partir das sequências de proteína de sedas identificadas (figuras 2 e 3) . EXEMPLO 5 - Análise estrutural das proteínas da seda Peptídeos secretores previstos [00301] Como esperado para proteínas da seda, o programa de previsão de sinal SignalP 3.0 (Bendsten e outros, 2004), que utiliza dois modelos para identificar peptídeos de sinais previu que todos os genes de seda identificados codificaram proteínas que contêm peptídeos de sinais que alvejaram as mesmas para secreção a partir de uma célula (dados não mostrados) . Os sítios de divagem previstos dos polipeptídeos são como a seguir: Xenospiral (AmelFl) - entre pos 19 e 20 (ASA-GL), Xenospira2 (AmelF2) - entre pos 19 e 20 (AEG-RV), Xenospira3 (AmelF3) - entre pos 19 e 20 (VHA-GV), Xenospira4 (AmelF4) - entre pos 19 e 20 (A8G-AR), Xenosin (AmelSAl) - entre pos 19 e 20 (VCA-GV), BBF1 - entre pos 19 e 20 (ASA-GQ), BBF2 - entre pos 20 e 21 (AEG-HV), BBF3 - entre pos 19 e 20 (VHA-GS), BBF4 - entre pos 19 e 20 (ASA-GK), BAFl - entre pos 19 e 20 (ASA-SG), BAF2 - entre pos 19 e 20 (ASG-RV), BAF3 - entre pos 19 e 20 (ASG-NL), BAF4 - entre pos 19 e 20 (VGA-SE), GAF1 - entre pos 19 e 20 (ADA-SK), 6AF2 - entre pos 19 e 20 (ASG-GV), GAF3 - entre pos 19 e 20 (ASG-GV), GAF4 - entre pos 19 e 20 (VGA-SE), MalFi - entre pos 26 e 2? (ΞΞΤ-AV).

[00302] Todas as quatro formigas e quatro das cinco proteínas da seda de abelha são heiicoidai s e formaram espiras enroladas, [00303] A modelagem de proteína e os resultados a partir de algoritmos de reconhecimento padrão confirmaram que a maior parte das proteínas da seda de abelha de mel identificadas era proteínas helicoidais que formaram espiras enroladas, [00304] Algoritmos PROFsec (Rost e Sander, 1993) e NNPredict (McClelland e Rumelhart, 1988; Kneller e outros, 1990) foram utilizados para investigar a estrutura secundária dos genes de seda identificados, Esses algoritmos identificaram Xenospiral [GB12184-PA] (SEQ ID N°: 1), Xenospira2 [GB12348-PA] (SEQ ID N°: 3), Xenospira3 [GB17818-PA] (SEQ ID NO"5), e Xenospiral (GB19585-PA] (SEQ ID N°: 7), como proteínas altamente helicoidais, com entre 76-85% de estruturas helicoidais (Tabela 4). Xenosin [GB15233-PA] (SEQ ID 10) tinha estrutura significativamente menos helicoidais.

Tabela 4. A estrutura secundária de proteínas da seda Apis atei li fera previstas por PROFsec (Rost e Sander, 1993) mostrando percentagens de hélices, folhas estendidas e laços.

[00305] Modelagem de proteína adicional e resultados a partir dos algoritmos de reconhecimento de padrão confirmaram que a maior parte das proteínas da seda identificadas era proteínas helicoídais que formaram espiras enroladas. Algoritmos de PredíctProteín {Rost e outros, 2004) foram utilizados para investigar a estrutura secundária dos genes de seda identificados. Esses algoritmos identificaram Xenospiral {SEQ ID N°: 1), Xenospira2 (SEQ ID 11°: 3), Xenospira3 (SEQ ID N°:5), Xenospira4 [SEQ ID N°:7), BBF1 (SEQ ID N°:22), BBF2 {SEQ ID :24) , BBF3 {SEQ ID N°:26), BBF4 {SEQ ID N°:28), BAF1 {SEQ ID N°:40) , BAF2 (SEQ ID N° :42) , BAF3 (SEQ ID N° :44) , BAF4 {SEQ ID N°:46) , GAF1 (SEQ ID N°:56) , GAF2 {SEQ ID H°:58), GAF3 (SEQ ID N°:60), GAF4 {SEQ ID :62), e MalFl {SEQ ID N°:72) como proteínas altamente helicoídais, cora entre 6988% de estrutura helicoidal (Tabela 3). AmelSAl [GB15233-PA] (Xenosin) (SEQ ID N°:10) e BBSA1 (SEQ ID N°:30) tinham estrutura significativamente menos helicoidal.

[00306] Super-enrolamento de proteínas helicoídais {espiras enroladas) se origina de uma seqüência de repetição heptavalente característica normalemnte indicada como {abcdefg) n. com resíduos genericametne hidrofóbicos em posição a e d, e resíduos polares ou genericametne carregados nas posições rstantes. Os programas de reconhecimento de padrão (MARCOIL (Delorenzi e Speed, 2002)), COILS (Lupas e outros, 1991) identificaram inúmeras repetições heptavalentes típicas de de espiral enrolada em Xenospiral [GB12184-PA] (SEQ ID N° : 1), Xenospira2 [GB12348-PA] (SEQ ID N°: 3), Xenospira3 [GB17818-PA] (SEQ ID N°: 5), e Xenospira4 [GB19585-PA] (SEQ ID N°: 7) (MARCOIL: Tabela 5; COILS: Figura 4), bem como BBF1 (SEQ ID N°: 22), BBF2 (SEQ ID N°: 24), BBF3 (SEQ ID N°: 26), BBF4 (SEQ ID N° : 28), BAF1 (SEQ ID N° : 40), BAF2 (SEQ ID N° : 42), BAF3 (SEQ ID N°: 44), BAF4 (SEQ ID N°: 46), GAF1 (SEQ ID N° : 56), GAF2 (SEQ ID N° : 58), GAF3 (SEQ ID N° : 60), GAF4 (SEQ ID N° : 62), e MalFl (SEQ ID N°:72) (MARCOIL: Tabela 3).

[00307] Idnetificação de uma seqüência de espiral enrolada nova nas proteínas da seda de abelha de mel [00308] As repetições heptavalentes de resíduos de aminoácidos identificadas nas seqüências de Xenospiral [GB12184-PA], Xenospira2 [GB12348-PA], Xenospira3 [GB17818-PA] , Xenospira4 [GB19585-PA], foram altamente indicativas, individualmente, de uma estrutura secundária de espiral enrolada (figura 5) (vide a Tabela 5 para níveis de confiança) . O fato de que os heptavalentes são encontrados de forma consecutiva e numerosa sugere que as proteínas adotam uma estutura muito regular. Heptavalentes de sobreposição foram identificados em duas das proteínas de abelha de mel: a maior região de espiral enrolada de Xenospiral continha heptavalentes de sobreposição com uma descentragem de 3 resíduos seguido por um espaço de 5 resíduos e então quatro heptavalentes consecutivos; e a região de espiral enrolada inteira de Xenospira2 tinha múltiplos heptavalentes de sobreposição com uma única descentragem e descentragem de 4 resiudos (equivalente a descentragem de 3 resíduos). A composição de aminoácidos nas várias posições do· hepta va lente principal é mostrada na primeira coluna na Tabewla 6, com as posições dos heptavalentes em sobreposição indicadas em colunas adjacentes.

Tabela 5. Percentagem de resíduos nas proteínas da seda identiicadas previstas como existindo como espiral enrolada pelo algoritmo de reconhecimento de padrão MARCOIL (Delorenzi e Speed, 2002) [00309] De forma surpreendente os principais heptavalentes têm uma compsiçao nova quando vistos coletivamente - com uma abundância incomumente elevada de alanina nas posições heptavalentes 'hidrofóbicas' a e d {vide a Tabela 6 e a fiugra 5). Adicoinalmetne, uma proporção elevada heptavalente tem alanina nas posições tanto a como d compreendidas no mesmo heptavalente (33% em Xenospiral [GB1218I-PA]; 36% em Xenospira2 [GB12348-PA]; 27% em Xenospira3 [GB17818-PA]; e 38% em Xenospiral [GBl9585-PA]; vide as Tabelas 6 e 7).

Tabela 6. Sumário do número de cada resíduo de aminoácido nas várias posições heptavalentes em regiões de espiral enrolada de proteínas de seda de abelha de mel.

Tabela 7. Sumário de resíduos de alanina em heptavalentes de proteínas da seda de abelha de mel.

Predições de 1PRGFsec com predições de NHPredict mostradas em parênteses .

[00310J A composição de amino'eidos nas várias posições heptavalentes na região de espiral enrolada das sedas de himenóptero é resumida nas figuras 6 e 7. Como observado acima, as posições nos heptavalentes têm uma comosição nova - as posições heptavalentes 'hidrofóbicas' a e d das sedas de abelha e formig contêm níveis muito elevados de alanina (méida 58%) e níveis elevados de resíduos polares pequenos (média 21%) em comparação com outras espiras enroladas. Adiiconlamnete, a posição e é incomumente pequena e hidrofóbia (tabela 8, figura 7) . Topograficametne essa posição é localizada adjacente aos resíduos a nas hélices. Sua similaridade de composição com os resíduos a e d sugere que as sedas adotam uma estrutura de espiral enrolada com três resíduos de núcleo por a-helix. Núcleos de três resíduos contribuem uma interface hidrofóbica maior do que dois resíudos no núcleo (Deng e outros, 2006) - uma característica que auxiliaria a formação e estabilidade de de espiral enrolada.

[00311] Além disso, quando visto coletivamente as posições b, c, e, f e g dentro do heptavalente são genericametne mais hidrofóbicas, menos polares e menos carregadas do que regiões de espiral enrolada de proteína anteriormente caracterizadas (vide a figura 7, e as Tabelas 8 e 9) . Portanto, embora historicametne fosse considerado que o teor helicoidal da seda de Himenóptero aculeado fosse uma conseqüência de um teor reduzido de glicina e teor aumetnado de resíduos acídicos (Rudall e Kenchington, 1971), os inventores descobriram que não são os resíduos de áciod/glicina que são responsáveis pela estrutura nova de seda porém em vez disso a posição dos resíudos de alanina nas cadeias de polipeptídeos.

Tabela 8. Tamanho médio e hidrofobicidade em cada posição heptavalente das proteínas da seda de himenóptero ortólogas e da proteína de seda de lacwing verde (MalFl) mostrando que posições a, d e e (núcleo) são menores e mais hidrofóbicas do que outras posições. Em alguns casos a posição b (parcialmente submersa) também é pequena e hidrofóbica. EXEMPLO 6 - As proteínas da seda de abelha provavelmente sâo extensamente reticuladas [00312] Todas as proteínas da seda de abelha contêm uma elevada proporção de lisina (6,5% - 16,3%). Uma comparação entre a composição medida de aminoácido de seda de abelha, e as sequências das proteínas da seda identificadas revela um descasamento· substancial no número de resíduos de lisina, com uma quantidade bem menor de lisina detectada na seda do que esperado (figuras 2 e 3) . Isso sugere que resíduos de lisina na seda foram modificados, assim não sendo identificadas por análise de aminoácido padrão. Lisina é conhecida como formando uma variedade de reticulaçoes: reticulaçoes enzimáticas catalisadas por iisii oxidase ou reticulações não enzimáticas geradas a partir de resíduos de lisina gliçados (Reiser, e outros, 1992). A sub-representação de lisina na análise de aminoãcidos de seda de abelha de mel e abelhão é compatível com a presença de reticulação de lisina.

Tabela 9. Número de resíduos em cada classe de aminoácídos em várias posições heptavalentes em regiões de espiral enrolada de proteínas da seda.

Posição íieptava lente a b c d e f g a b c d e f g a b c d e f g a b c d e f g [00313] Espera-se que proteínas covalentemente reticuladas submetidas a eletroforese de gel poliacrilamida SDS {PAGE) migrem de acordo com o peso molecular do complexo reticulado. Os inventores submeteram proteínas de glândula labial de abelha de mel de último instar tardio a SDS PAGE e mediram a migração das proteínas da seda era relação a marcadores de proteína padrão. Bandas foram observadas correspondendo aos monômeros de cada uma das proteínas da seda identificadas, entretanto bandas de peso molecular mais elevado contendo essas proteínas também estavam presentes, como esperado em um sistema reticulado {figura 8).

[00314] Como descrito acima, a glândula labial de abelha de mel contém uma mistura de proteínas da seda organizada e desorganizada. As proteínas reticuladas observadas correspondem provavelmente à população de proteínas da região anterior da glândula, onde a seda é preparada para extrusão. É razoável assumir que seda de abelha de mel. extracelular contém uma proporção substancialmente mais elevada de proteínas de reticulaçâo do que é observado em uma mistura heterogênea de todos os estágios de proteínas da seda de glândula salivar. As ligações são improváveis de ser reticulações de cisteína, visto que a seda nâo foi afetada por tratamento· redutivo, e as proteínas da seda identificadas contêm poucos, ou nenhum, resíduos de cisteína. EXEMPLO 7 - as proteínas da seda euaculeatan diferem significativamente de outras proteínas da seda [00315] A seda euaculeatan é significativamente diferente de outros genes de seda descritos em relação à composição de aminoãcidos (Tabela 10) , peso molecular das proteínas envolvidas, estrutura secundária e propriedades físicas (Tabelas 11 e 12) . As sedas de lepidóptera são compostas principalmente dos resíduos de aminoãcido pequeno· alanina, serina e glicina (por exemplo, a seda de Bombyx raori, Tabela 10) e são dominados por estrutura secundária de beta folha estendida. A proteína de seda de Cotesia glomerata é elevada em asparagina e serina - a abundância do· resíduo mencionado por último· sendo característico de sericinas de seda de Lepidóptera (colas) (Tabela 10). Modelagem da proteína de seda de Cotesia glomerata não identifica hélices ou espiras enroladas na estrutura secundária. Ao contrário, as sedas de abelha, formiga e lagarta verde são elevadas em alanina (Tabela 10) e são compreendidas de um alto nível de estrutura secundária helicoidal que forma espiras enroladas.

Tabela 10. Composição de aminoãcidos de seda e vários insetos com resíduos mais abundantes mostrados em negrito Tabela 12 Solubilidade de sedas de insetos.

[00316] A análise cladística das regiões de espiral enrolada das proteínas da seda das quatro espécies De himenóptero (figura 9) sugere que os genes se desenvolveram em um ancestral comum que pré-data a divergência da Euaculeata a partir das vespas parasíticas. As sequências da seda divergiram extensamente e foram somente capazes de alinhar os 210 aminoácidos que compreendem a região de espiral enrolada de cada proteína. A identidade de sequência de aminoácidos entre as regiões de espiral enrolada de cada uma das proteínas da seda fornecidas aqui é mostrada na Tabela 13 e identidade de DNA na região correspondente é mostrada na Tabela 14. Embora as proteínas tenham teores similares de aminoácidos (especialmente níveis elevados de alanina e estrutura terciária), a identidade de seqüência de aminoácidos primária é muito baixa, Na realidade, o gene que codifica a proteína de seda de Ma 11 ada se desenvolveu independentemente e como tal a sequência de proteína de seda não pode ser alinhada com as sequências de himenóptero, Isso· indica que variedade considerável na identidade dos aminoácidos pode ocorrer, embora não afete a função biológica das proteínas.

Tabela 13. Percentagem de identidade entre sequências de proteína da região de espiral enrolada das proteínas de fibra em formigas e abelhas.

[00317] A análise cladístiea prevê que seda de vespas euaculeatan é compreendida de proteínas relacionadas com a seda de formigas e abelhas e que embora essas proteínas tenham composição e arquitetura similares às proteínas descritas aqui, as mesmas terão sequência primária altamente divergida.

[00318] As seqüências de aminoácidos das proteínas da seda fornecidas aqui {figura 10} foram submetidas a comparações com bancos de dados de proteína, entretanto, nenhuma proteína da técnica anterior foi identificada cora qualquer nível razoável de identidade de seqüêncía {por exemplo, nenhuma maior do que 30% idêntica sobre o· comprimento da sequência de proteína de sedaJ .

Tabela 14. Percentagem de identidade entre seqüêneias de nucleotideo que codificam região de espiral enrolada das proteínas de fibras em formigas e abelhas [00319] Os quadros de leitura aberta, que codificam as proteínas da seda (fornecidas na figura 11) , foram submetidos à busca de banco de dados similar como aquela descrita acima. As únicas moléculas relacionadas que foram identificadas foram publicadas como parte do projeto de genoma de abelha de mel (www.ncbl.nlm.nlh.qov/qenome/quide/bee). Os quadros de leitura aberta tinham sido previstos pelo projeto de genoma de abelha, entretanto, a função das proteínas codificadas não tinha sido sugerida. Além disso, não há evidência de que um polinucleotídeo compreendendo o quadro de leitura aberta do mRNA já tinha sido produzido para qualquer uma dessas moléculas.

[00320] Os genes que codificam Xenospiral, Xenospira2, Xenospira3 e Xenospiral compreendem um exon que cobre O quadro de leitura aberta individual inteiro, ao passo· que o gene que codifica Xenosin compreende pelo menos um intron (vide a figura 12). EXEMPLO 8 - Expressão de proteínas da seda em plantas transgênicas [00321] Um vetor de expressão de planta que codifica uma proteína de seda da invenção pode consistir em uma molécula de ácido nucléico recombinante codificando para a proteína (por exemplo, um polinucleotídeo fornecido em qualquer uma das SEQ ID NO's: 11 a 21, 31 a 39, 48 a 55, 64 a 71, 74 ou 75) colocado a jusante do promotor CaMV 35S em uma estrutura de vetor binário contendo um gene de resistência à canamicina (NptII).

[00322] Para os polinucleotídeos compreendendo qualquer uma das SEQ ID NO'S 11, 13, 15, 17, 19, 31, 33, 35, 37, 48, 50, 52, 54, 64, 66, 68, 70 ou 74 a construção pode compreender ainda uma região de codificação de peptídeo de sinais como peptídeo de sinais de quitinase básico vacuolar Arabidopsis thaliana, que é colocado em quadro e a montante da seqüência que codifica a proteína de seda.

[00323] A construção que contém um polipeptídeo de codificação de proteína de seda é transformada separadamente em Agrobacterium tumefaciens por eletroporação antes da transformação em Arabidopsis thaliana. O método de transformação de hipocótilo pode ser utilizado para transformar A. thaliana que pode ser selecionada para sobrevivência em meios seletivos compreendendo meios de canamicina. Após formação de raízes nos regeneradores as mesmas são transferidas para o solo para estabelecer plantas transgênicas primárias.

[00324] A verificação do processo de transformação pode ser obtida via classificação de PCR. A incorporação e expressão de polinucleotídeos pode ser medida utilizando PCR, análise de Southern Blot e/ou LC/MS de proteínas expressas digeridas por tripsina.

[00325] Duas ou mais construções de codificação de proteína de seda diferentes podem ser fornecidas no mesmo vetor, ou inúmeros vetores diferentes podem ser transformados na planta cada uma codificando uma proteína diferente.

[00326] Como exemplo experimental de expressão de planta, uma versão otimizada de códon de AmelF4 (Xenospira4) (SEQ ID N°: 76) foi clonada em pET14b (Novagen), gerando pET14b-6xHis:F4op, formando uma fusão traducional em quadro com um 6xhistidina no terminal-N da proteína. A seqüência codificando a proteína "6xHistidina:F4op" foi clonada em pVEC8 (Wang e outros, 1992) sob o controle do promotor CaMV 35S e aparelho regulador de poliadenilação, gerando pVEC8-35S-6xHis:F4op-ocs. PET14b-6xHis:F4op foi transformado em E.coli quimicamente competente e pVEC8-35S-6xHis:F4op foi transformado em discos de folha de fumo por transformação mediada por Agrobacterium. Proteínas a partir de E. coli resistente a antibiótico (expressão induzida) e folhas de fumo foram isoladas e submetidas à análise de western blot utilizando o anticorpo Tetra-histidina (Qiagen, Karlsrule, Alemanha) para detecção. Os vetores vazios pETl4b e pVEC8-35S-ocs foram utilizados como controles negativos em seus respectivos antecedentes hospedeiros. Como mostrado na figura 13, esses experimentos resultaram na planta produzindo a proteína Xenospira4 (AmelF4). EXEMPLO 9 - Fermentação e purificação de proteínas da seda [00327] Construções de expressão foram construídas após as regiões de codificação de seda de genes de abelha de mel AmelFl-F4 (Xenospiral a 4 respectivamente) e genes MalFl de lagarta verde serem amplificadas por PCR e clonadas em vetores de expressão pETl4b (Novagen, Madison, WI) . Os plasmídeos de expressão resultantes foram então eletroporados em células Rosetta E. coli BL21 (DE3) e cultivados durante a noite em Agar LB contendo ampicilina. Uma única colônia foi então utilizada para inocular caldo LB contendo ampicilina então cultivada a 37°C durante a noite. As células foram cultivadas por centrifugação e lisadas com detergente (Bugbuster, Novagen). Corpos de inclusão foram lavados extensamente e solubilizados novamente em guanidínio 6M.

[00328] Esse procedimento forneceu misturas de proteínas com pureza superior a 95% das proteínas de abelha de mel e pureza superior a 50% da proteína MalFl de lagarta verde. Os rendimentos de até 50% do peso úmido da pelota de célula de E. coli foram regularmente obtidos, indicando que as proteínas são fáceis de expressar desse modo.

[00329] As proteínas recombinantes de abelha de mel solubilizadas foram aplicadas a uma coluna de resina Talon preparada de acordo com orientações de fabricação. Foram então eluídas da coluna em lOOmM Tris.HCL, 250 mM imidazol pH 8. EXEMPLO 10 - Processamento de proteínas da seda em fios [00330] As proteínas da seda de abelha de mel e lagarta verde foram facilmente transformadas em fios utilizando uma variedade de métodos (vide a figura 14) utilizando o procedimento a seguir.

[00331] O segmento anterior da glândula salivar a partir de Apsi mellifera de instar final tardio foi dissecado sob solução salina tamponada com fosfato e removido para uma superfície plana em uma gotícula de tampão. Fórceps foram utilizados para segurar qualquer extremidade do segmento. Uma extremidade foi elevada para fora da gotícula e no sentido oposto à outra em uma taxa constante. Isso permitiu o estiramento de um fio fino que rapidamente se solidificou no ar.

[00332] As proteínas da seda recombinante larvais de lagarta verde e abelha de mel formaram fios ou folhas após desidratação ou concentração. Por exemplo, por deixar a proteína solúvel cair em uma solução de butanol por concentração das proteínas na coluna de resina Talon.

[00333] Fios também foram obtidos após mistura das proteínas da seda recombinante de lagarta verde ou abelha de mel com um solvente orgânico (como hexano) para concentrar os mesmos na interface na conformação correta, e então adição de um reagente para excluir os mesmos da interface (como butanol). Os fios formados por esse procedimento tiveram espectros FT-IR similares à seda nativa indicando que compreendiam a mesma estrutura de espiral enrolada.

[00334] Proteínas da seda a partir de outras espécies descritas aqui também podem ser processadas por esse procedimento.

[00335] Será reconhecido por pessoas versadas na técnica que inúmeras variações e/ou modificações podem ser feitas na invenção como mostrado nas modalidades especificas sem se afastar do espirito ou escopo da invenção como amplamente descrito. As modalidades presentes devem, portanto, ser consideradas em todos os aspectos como ilustrativas e não restritivas.

[00336] Todas as publicações discutidas acima são incorporadas aqui na integra.

[00337] Qualquer discussão de documentos, atos, materiais, dispositivos, artigos ou similares que foi incluída no presente relatório descritivo é exclusivamente para fins de fornecer um contexto para a presente invenção. Não deve ser tomado como admissão de que todos ou quaisquer desses assuntos formam parte da base da técnica anterior ou eram conhecimento geral comum no campo relevante à presente invenção como existia antes da data de prioridade de cada reivindicação desse pedido.

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REIVINDICAÇÕES

Claims (21)

1. Polipeptideo de seda recombinante, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma porção do polipeptideo tem uma estrutura de espiral enrolada, que é fundida a pelo menos outro polipeptideo.

2. Polipeptideo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos como fornecida em qualquer uma de SEQ ID N0:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID N0:8, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:40, SEQ ID N0:41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID N0:61, SEQ ID NO:62 e SEQ ID NO:63.

3. Polinucleotideo exógeno caracterizado pelo fato de que que codifica um polipeptideo de seda, em que pelo menos uma porção do polipeptideo tem uma estrutura de espiral enrolada, e em que o polinucleotideo é operativamente ligado a um promotor de modo que o polinucleotideo é capaz de ser expresso em uma célula hospedeira bacteriana ou de levedura.

4. Polinucleotideo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o polinucleotideo compreende uma sequência selecionada de uma seqüência de nucleotideos como fornecida em qualquer uma de SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:13, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID N0:18, SEQ ID N0:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO :50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70 e SEQ ID NO:71; ou suas degenerações que codificam o mesmo polipeptideo como definido na reivindicação 2.

5. Vetor de expressão caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um polinucleotideo que codifica um polipeptideo de seda, em que pelo menos uma porção do polipeptideo tem uma estrutura de espiral enrolada, e em que o pelo menos um polinucleotideo é operativamente ligado a um promotor.

6. vetor, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um polinucleotideo é como definido na reivindicação 4.

7. Vetor, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de ter uma origem de replicação.

8. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizado pelo fato de ter uma sequência de controle de tradução.

9. Célula hospedeira bacteriana ou de levedura caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um polinucleotideo que codifica um polipeptideo de seda, em que pelo menos uma porção do polipeptideo tem uma estrutura de espiral enrolada, e /ou pelo menos um vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 5 a 8.

10. Processo para preparar um polipeptideo de seda, em que pelo menos uma porção do polipeptideo tem uma estrutura de espiral enrolada, o processo caracterizado pelo fato de compreender o cultivo de uma célula hospedeira como definida na reivindicação 9, sob condições que permitam a expressão do polinucleotídeo que codifica o polipeptideo, e recuperar o polipeptideo expresso.

11. Processo para preparar um polipeptideo de seda, em que pelo menos uma porção do polipeptideo tem uma estrutura de espiral enrolada, o processo caracterizado pelo fato de compreender expressar em um sistema de expressão livre de células um vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 5 a 8 sob condições que permitam a expressão do polinucleotídeo que codifica o polipeptideo, e recuperar o polipeptideo expresso.

12. Produto caracterizado pelo fato de compreender pelo menos um polipeptideo de seda, em que pelo menos uma porção do polipeptideo tem uma estrutura de espiral enrolada, ou uma fibra de seda e/ou um copolímero compreendendo o pelo menos um polipeptideo de seda.

13. Produto, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o produto é selecionado do grupo que consiste em: um produto de higiene pessoal, artigos têxteis, plásticos, e produtos biomédicos.

14. Produto, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizado pelo fato de que o polipeptideo é como definido na reivindicação 2.

15. Composição caracterizada pelo fato de compreender pelo menos um polipeptideo de seda, em que pelo menos uma porção do polipeptideo tem uma estrutura de espiral enrolada, ou uma fibra de seda e/ou um copolímero compreendendo o pelo menos um polipeptideo de seda, e um ou mais veículos aceitáveis.

16. Composição, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de adicionalmente compreender um fármaco.

17. Composição, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de ser para uso como remédio, um dispositivo médico ou um cosmético.

18. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, caracterizada pelo fato de que o polipeptideo é como definido na reivindicação 2.

19. Composição caracterizada pelo fato de compreender pelo menos um polinucleotideo que codifica um polipeptideo de seda, em que pelo menos uma porção do polipeptideo tem uma estrutura de espiral enrolada, e um ou mais veículos aceitáveis.

20. Uso de pelo menos um polipeptideo de seda, em que pelo menos uma porção do polipeptideo tem uma estrutura de espiral enrolada, ou uma fibra de seda, e/ou um copolímero compreendendo o pelo menos um polipeptideo de seda, e um fármaco, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para tratar ou prevenir uma doença.

21. Kit caracterizado por compreender pelo menos um polipeptideo de seda, em que pelo menos uma porção do polipeptideo tem uma estrutura de espiral enrolada, pelo menos um polinucleotideo que codifica um polipeptideo de seda, em que pelo menos uma porção do polipeptideo tem uma estrutura de espiral enrolada, pelo menos um vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 5 a 8, ou uma fibra de seda e/ou um copolímero compreendendo o pelo menos um polipeptideo de seda.