BRPI0617053A2

BRPI0617053A2 - processo para a produção de uma composição aerada congelada e uso de uma hidrofobina

Info

Publication number: BRPI0617053A2
Application number: BRPI0617053-6A
Authority: BR
Inventors: Andrew Richard Cox; Jennifer Elizabeth Homan; Andrew Baxter Russel
Original assignee: Unilever Nv
Priority date: 2005-09-23
Filing date: 2006-09-13
Publication date: 2011-07-19
Also published as: HK1116997A1; DE602006005253D1; EP1926399B1; CA2616282C; CA2616282A1; EP1926399B2; ES2321032T5; EP1926399A1; IL188804A0; AU2006299223A1; ES2321032T3; ATE422827T1; JP4740336B2; AU2006299223B2; PT1926399E; JP2009508503A; IL188804A; US20070071866A1; WO2007039066A1

Abstract

<B>PROCESSO PARA A PRODUçãO DE UMA COMPOSIçãO AERADA CONGELADA E USO DE UMA HIDROFOBINA.<D> A presente invenção refere-se a um processo para a produção de uma composição aerada congelada, sendo que o processo compreende a aeração de uma mistura aquosa, seguida pelo congelamento quiescente da mistura aerada, caracterizado em que a mistura compreende a hidrofobina.

Description

"PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO AERADACONGELADA E USO DE UMA HIDROFOBINA"

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se aos processos para a produção dascomposições aeradas congeladas, em particular, aos processos quecompreendem as etapas de aeração da mistura aquosa para formar uma espuma,seguido pelo congelamento quiescente da espuma.

Antecedentes da Invenção

As composições aeradas congeladas, por exemplo, sorvetes,sorbet e iogurte congelado, são produzidas convencionalmente por umprocesso onde a aeração e o congelamento ocorrem simultaneamente. A fimde obter a aeração, deve ser aplicado o cisalhamento ou a agitação àcomposição durante o congelamento. Isto requer equipamentos deprocessamento caros e complexos, tais como trocadores de calor de superfícieraspada, e a restrição de seu uso; por exemplo, tal equipamento não está, emgeral, disponível aos consumidores em suas cozinhas.

Uma abordagem alternativa é separar as etapas de aeração econgelamento, isto é, formando uma mistura aerada (isto é, uma espuma) eentão congelando sua espuma em uma etapa do processo subseqüente. Aetapa de congelamento pode, portanto, ser quiescente, isto é, semcisalhamento ou agitação, uma vez que a aeração já foi obtida. Odocumento US 6.187.365 descreve um processo para a produção de umabarra congelada aerada moldada pela preparação de uma mistura deingredientes apropriados para uma barra aerada congelada, espumando amistura para obter uma mistura aerada possuindo um aumento de volume(overrun) entre cerca de 20% e cerca de 250%, moldando a mistura aeradapara gerar uma mistura moldada e congelando a mistura aerada moldadapara produzir a barra aerada congelada moldada.Há dois problemas com esta abordagem. Em primeiro lugar, asespumas não congeladas são instáveis por longos períodos de tempo. Odesproporcionamento e a coalescência levam ao crescimento da bolha, e acremeação (devido à flutuabilidade das bolhas de ar) leva à separação da fasevertical resultando em uma grande proporção de bolhas próximas à superfíciesuperior e à depleção das bolhas no fundo. Isto normalmente significa que a etapade congelamento deve seguir a etapa de aeração quase que imediatamente paraminimizar o efeito desta instabilidade no produto final. Em segundo lugar, umaperda significativa de gás pode ocorrer durante o congelamento quiescenteconforme os cristais de gelo que crescem empurram fisicamente as bolhas de gáspara fora da mistura. Este efeito é mais pronunciado para bolhas de gás grandesporque os cristais de gelo são menos capazes de crescer ao redor das bolhas.Assim, ainda permanece uma demanda por um método simples e barato deprodução de composições congeladas aeradas por congelamento.

Descrição Resumida da Invenção

No nosso pedido de patente WO 06/010425, foi revelado que umaproteína fúngica, designada hidrofobina, possibilita a produção de espuma comexcelente estabilidade com relação ao desproporcionamento e a coalescência.A hidrofobina é um ativo de superfície que age como um agente de aeração,enquanto que também parece conferir uma natureza altamente viscoelástica nasuperfície das bolhas de ar.

É revelado agora que é possível reter o gás durante um processo quecompreende uma etapa de aeração seguida por uma etapa de congelamentoquiescente quando a hidrofobina é utilizada. A hidrofobina estabiliza as bolhas degás durante o armazenamento entre as etapas de aeração e congelamento, etambém durante o congelamento. Conseqüentemente, a presente invenção forneceum processo para a produção de uma composição aerada congelada, em que oprocesso compreende a aeração de uma mistura aquosa, seguida pelocongelamento quiescente da mistura aerada, caracterizado pelo fato de que amistura compreende a hidrofobina.

De preferência, a hidrofobina está presente em uma quantidade depelo menos 0,001 % em peso e, de mais preferência, de pelo menos 0,01 % em peso.

De preferência, a hidrofobina está em uma formasubstancialmente isolada.

De preferência, a hidrofobina é uma hidrofobina de classe II.

De preferência, a composição aerada congelada possui umaumento de volume de pelo menos 25%.

De preferência, a composição aerada congelada é um produtoalimentício. De maior preferência, o produto alimentício é um produto de confeitocongelado. De maior preferência, o produto de confeito congelado é um sorvete.

De preferência, a etapa de aeração é selecionada a partir do grupoque consiste em mistura contínua, mistura em batelada, injeção de gás, gás em transporte por uma corrente fluida, geração de gás por meio de uma reação químicaou bioquímica e liberação do gás aprisionado em uma solução ou sólido.

De preferência, a etapa de congelamento é selecionada a partir dogrupo que consiste em colocar um recipiente contendo a mistura aquosa em umambiente frio; submergir um molde contendo a mistura em um banho de refrigerante frio; colocar as porções da mistura diretamente em um banho de fluidocriogênico; congelar o filme; e aspergir as gotas da mistura em um ambiente frio.

De preferência, a mistura adicional compreende um agente geradorde tensão. De preferência, o agente gerador de tensão é um polissacarídeo, demaior preferência, um polissacarídeo bacteriano, tal como a xantana e/ou a gelana.

Em um aspecto relacionado, a presente invenção fornece um processopara a produção de uma composição aerada congelada, em que o processocompreende o fornecimento de uma mistura aquosa que compreende a hidrofobina,aeração da mistura, seguido por congelamento quiescente da mistura aerada.Em um segundo aspecto, a presente invenção fornece umacomposição aerada de congelamento quiescente contendo a hidrofobina.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um produto obtidopelos processos da presente invenção. Também é fornecido um produto capazde ser obtido pelos processos da presente invenção.

Em um aspecto relacionado, a presente invenção fornece o uso deuma hidrofobina para a estabilização de uma composição aerada durante ocongelamento quiescente.

Descrição Detalhada da Invenção

A menos que esteja definido de alguma outra maneira, todos ostermos técnicos e científicos aqui empregados têm o mesmo significado que énormalmente compreendido por um técnico no assunto (por exemplo, nafabricação, na química e na biotecnologia de confeitos gelados e confeitoscongelados). As definições e as descrições dos diversos termos e técnicasempregados na fabricação de confeitos gelados/ congelados são encontradasem Ice Cream, 4a Edição, Arbuckle (1986), Van Nostrand Reinhold Company,New York, NY. As técnicas padrão utilizadas para os métodos moleculares ebioquímicos podem ser encontradas em Sambrook et al., Molecular Cloning: aLaboratory Manual, 3a ed. (2001) Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, N.Y., e em Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999)4a Ed1 John Wiley & Sons, Inc. - e a versão completa intitulada CurrentProtocols in Molecular Biology). As fontes de referências úteis que descrevemos polissacarídeos e o comportamento de suas soluções são: "Foodpolysaccharides and their applications", ed. A. M. Stephen, Mareei Dekker Inc.,2005 "Food Gels", ed P. Harris, Elsevier, 1990.

Hidrofobinas

As hidrofobinas constituem uma classe bem definida de proteínas(Wessels, 1997, Adv. Microb. Physio. 38: 1 - 45; Wosten, 2001, Annu Rev.Microbiol. 55: 625 - 646) com capacidade de auto-organização em umainterface hidrofóbica/ hidrofílica, e possui uma seqüência conservada:

(SEQIDNo. 1)onde X representa qualquer aminoácido, e η e m representamindependentemente um número inteiro positivo. Tipicamente, uma hidrofobinapossui um comprimento de até 125 aminoácidos. Os resíduos de cisteína (C) naseqüência conservada fazem parte de pontes de bissulfeto. No contexto dapresente invenção, o termo hidrofobina possui um significado mais amplo paraincluir as proteínas funcionalmente equivalentes que ainda exibem a característicade auto-organização em uma interface hidrofóbica - hidrofílica, o que resulta em umfilme de proteína, tais como as proteínas que compreendem a seqüência:

Xn-C-X-i _5()-X-Xo-5"C-C-| _1 oo-C-X1 .1 oo-C-Xl -50"C-Xo-5-C-Xi -so-C-Xm

(SEQ ID No. 2)

ou partes da mesma que ainda exibem a característica de auto-organização em uma interface hidrofóbica - hidrofílica que resulta em um filme deproteína. De acordo com a definição da presente invenção, a auto-organizaçãopode ser detectada mediante a adsorção da proteína ao Teflon e ao utilizar oDicroismo Circular para estabelecer a presença de uma estrutura secundária (emgeral, alfa-hélice) (De Vochtetal., 1998, Biophys. J. 74: 2059-68).

A formação de um filme pode ser estabelecida ao incubar umafolha de Teflon na solução da proteína seguida por pelo menos três lavagenscom água ou tampão (Wosten et al., 1994, Embo. J. 13: 5848 - 54). O filme deproteína pode ser visualizado por qualquer método apropriado, tal como amarcação com um marcador fluorescente ou através do uso de anticorposfluorescentes, tal como é bem estabelecido no estado da técnica. Tipicamente,m e η possuem valores que variam de 0 a 2.000, mas mais comumente m e ηno total são menores do que 100 ou 200. A definição de hidrofobina nocontexto da presente invenção inclui proteínas de fusão de uma hidrofobina eum outro polipeptídeo, bem como os conjugados de hidrofobina e outrasmoléculas, tais como os polissacarídeos.

As hidrofobinas identificadas até a presente data são, em geral,classificadas como classe I ou classe II. Ambos os tipos foram identificados nos fungos como as proteínas secretadas que se auto-organizam em interfaceshidrofóbicas em filmes anfipáticos. As organizações de hidrofobinas da classe Isão relativamente insolúveis, enquanto que aquelas hidrofobinas de classe Il sedissolvem de imediato em uma variedade de solventes.

As proteínas do tipo hidrofobinas também foram identificadas nas bactérias filamentosas, tais como Actinomycete e Steptomyces sp. (documento WO01/74864). Estas proteínas bacterianas, ao contrário das hidrofobinas fúngicas,formam somente até uma ponte de dissulfeto, uma vez que elas possuem apenasdois resíduos de cisteína. Tais proteínas são um exemplo de equivalentesfuncionais para as hidrofobinas que possuem as seqüências de consenso mostradas nas SEQ ID no. 1 e 2, e estão dentro do escopo da presente invenção.

As hidrofobinas podem ser obtidas pela extração de fontes nativas,tais como fungos filamentosos, por qualquer processo apropriado. Por exemplo, ashidrofobinas podem ser obtidas através da cultura de fungos filamentosos quesecretam a hidrofobina no meio de crescimento ou pela extração das micelas fúngicas com etanol a 60%. É particularmente preferível o isolamento dashidrofobinas a partir de organismos hospedeiros que secretam hidrofobinasnaturalmente. Os hospedeiros preferidos são os hipomicetes (por exemplo,Trichoderma), basidiomicetes e ascomicetes. Os hospedeiros particularmentepreferidos são organismos de grau alimentício, tais como o Cryphonectria parasitica, que secreta uma hidrofobina denominada criparina (MacCabe e Van Alfen, 1999,App. Environ. Microbiol. 65: 5431 - 5435).

Alternativamente, as hidrofobinas podem ser obtidas pelo uso datecnologia recombinante. Por exemplo, as células hospedeiras, tipicamentemicro-organismos, podem ser modificadas para que expressem hidrofobinas, eas hidrofobinas podem então ser isoladas e utilizadas de acordo com apresente invenção. As técnicas para introduzir as construções de ácidonucléico que codificam hidrofobinas em células hospedeiras são bemconhecidas no estado da técnica. Mais de 34 genes que codificam ashidrofobinas foram clonados, mais de 16 espécies fúngicas (vide, por exemplo,o documento WO 96/41882 que fornece a seqüência de hidrofobinasidentificadas em Agaricus bisporus; e em Wosten, 2001, Annu Rev. Microbiol.55: 625 - 646). A tecnologia recombinante também pode ser utilizada paramodificar seqüências de hidrofobina ou sintetizar novas hidrofobinas quepossuem propriedades desejadas/ aprimoradas.

Tipicamente, uma célula ou um organismo hospedeiro apropriado étransformado por uma construção de ácido nucléico que codifica a hidrofobinadesejada. A codificação da seqüência de nucleotídeo para o polipeptídeo pode serinserida em um vetor de expressão apropriado que codifica os elementosnecessários para a transcrição e a tradução e de uma maneira tal que serãoexpressos sob condições apropriadas (por exemplo, na orientação apropriada ena estrutura de leitura correta e com seqüências apropriadas de seleção e deexpressão). Os métodos requeridos para construir estes vetores de expressão sãobem conhecidos pelos técnicos no assunto.

Uma série de sistemas da expressão pode ser utilizada para expressara seqüência de codificação de polipeptídeo. Estes incluem, mas não estão limitadosa, bactérias, fungos (incluindo leveduras), sistemas celulares de insetos, sistemas decultura de células vegetais, e plantas, todos transformados com os vetores deexpressão apropriados. Os hospedeiros preferidos são aqueles que sãoconsideradas de grau alimentício - 'geralmente considerados como seguros' (GRAS).

As espécies fúngicas apropriadas incluem as leveduras, tais como(mas sem ficar a elas limitadas) aquelas dos gêneros Saccharomyces,Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Candida, Schizo saccharomyces, e similares,e espécies filamentosas, tais como (mas sem ficar a elas limitadas) aquelas dosgêneros Aspergillus, Trichoderma1 Mucor, Neurospora, Fusarium, e similares.

As seqüências que codificam as hidrofobinas são, depreferência, pelo menos 80% idênticas ao nível de aminoácido em relação auma hidrofobina identificada na natureza, de maior preferência, pelo menos95% ou 100% idênticas. No entanto, os técnicos no assunto podem fazersubstituições conservativas ou outras mudanças de aminoácidos que nãoreduzem a atividade biológica da hidrofobina. Para a finalidade da presenteinvenção, estas hidrofobinas que possuem este nível elevado de identidadecom uma hidrofobina que ocorre naturalmente também estão englobadasdentro do termo "hidrofobinas".

As hidrofobinas podem ser purificadas a partir dos meios de culturaou dos extratos celulares, por exemplo, o procedimento descrito no documento WO01/57076 que envolve a adsorção da hidrofobina presente em uma solução quecontém hidrofobina na superfície e então o contato da superfície com um tensoativo,tais como Tween 20, para eluir a hidrophobia da superfície. Consultar tambémCollen et al., 2002, Biochim BiophysActa 1569: 139 - 50; Calonje et al., 2002, Can.J. Microbiol. 48: 1030 - 4; Askolin et al., 2001, Appi Microbioi Biotechnol. 57: 124 -30; e De Vries et al., 1999, Eur. J. Biochem. 262: 377 - 85.

Aeração

O termo "aerado" significa que o gás foi incorporado intencionalmente àmistura para formar a espuma, por exemplo, por meios mecânicos. O gás pode serqualquer gás, mas é, de preferência, no contexto particular dos produtos alimentícios,um gás de grau alimentício, tal como o ar, o nitrogênio ou o dióxido de carbono. Aextensão da aeração é tipicamente definida em termos de "aumento de volume". Nocontexto da presente invenção, a % de aumento de volume é definida em termos dovolume do produto aerado e o volume da mistura não aerada da qual ele foi formado:Aumento de volume (overrun) =Volume do produto aerado final - Volume da mistura não aerada X100

Volume da mistura não aerada

A quantidade de aumento de volume presente no produto irávariar dependendo das características desejadas do produto. De preferência, onível do aumento de volume é de pelo menos 10%, de maior preferência, pelomenos 25 ou 50%. De preferência, o nível do aumento de volume é inferior a400%, de maior preferência, inferior a 300 ou 200%.

De preferência, a espuma é substancialmente homogênea.

A etapa de aeração pode ser realizada por qualquer métodoapropriado. Os métodos de aeração incluem (mas não estão limitados a):

- mistura contínua em um dispositivo rotor-estator, tal como um misturador Oakes (E.T. Oakes Corp), um misturador Megatron (Kinematica AG)ou um misturador Mondomix (Haas-Mondomix BV);

- mistura em batelada em um dispositivo que envolve o transporteem fluido de superfície de gás, tal como um misturador Hobart ou um tanque deagitação;

- injeção do gás, por exemplo, através de um pulverizador,misturador a jato ou dispositivo microfluidico;

- injeção do gás seguida pela mistura e dispersão em umdispositivo de fluxo contínuo, tal como um trocad or de calor de superfícieraspada, um misturador estático ou uma bomba;

- injeção do gás à temperatura elevada, onde um gás ésolubilizado sob pressão e então forma uma fase gasosa dispersa na reduçãoda pressão. Isto poderia ocorrer na distribuição a partir de um recipienteaerossol;

- transporte por fluido de gás (gás entrainment), por exemplo, pormeio de uma válvula venturi;- geração de gás por meio de uma reação bioquímica, porexemplo, a reação entre um ácido e um carbonato;

- liberação do gás aprisionado a partir de uma solução ou umsólido, por exemplo, um material vítreo (conforme descrito no documento EP1.206.193) ou um hidrato de clatrado.

Período entre a Aeração ε as Etapas de Congelamento

A presente invenção possibilita a separação das etapas deaeração e congelamento. Assim, as composições aeradas congeladas podemser produzidas de diversas maneiras diferentes. Por exemplo, as etapas de aeração e congelamento podem ambas ocorrer dentro de uma fábrica tal que acomposição aerada congelada é produzida na fábrica e o consumidor compra acomposição aerada congelada em sua forma final. Alternativamente, a etapade aeração é realizada em uma fábrica, tal que os consumidores compram umamistura aerada previamente não congelada, que, então, eles congelam em casa. Uma terceira possibilidade é que o consumidor compra uma mistura nãoaerada e não congelada que é aerada e congelada em casa.

Particularmente, no segundo destes casos (mas potencialmente nosoutros também) há um período significante de tempo entre as etapas de aeração econgelamento. Em tais casos, onde as composições aeradas são armazenadasantes do congelamento, ou mesmo onde o processo de congelamento toma umtempo longo, é necessário que as espumas sejam estáveis nodesproporcionamento e na coalescência, e também na cremeação durante estetempo. As hidrofobinas fornecem à espuma uma boa estabilidade com relação aodesproporcionamento e a coalescência. A cremeação (que é devido à flutuabilidadedas bolhas de ar) pode levar à separação da fase vertical resultando em umagrande proporção de bolhas próximas à superfície superior e à depleção das bolhasno fundo. A cremeação também pode levar à perda de ar subseqüente devido aoempacotamento próximo das bolhas na espuma e ao colapso das espumas quepode resultar das mesmas. A cremeação é inibida quando a fase contínua daespuma possui uma tensão de rendimento aparente.

Conseqüentemente, em uma realização, a mistura compreendeainda um agente ou agentes de tensão de rendimento que proporcionampropriedades reológicas apropriadas à fase contínua, inibindo assim acremeação das bolhas de ar, tal que a espuma permanece homogênea por umperíodo de tempo prolongado. Os agentes de tensão de rendimento sãodefinidos no presente como um ingrediente ou ingredientes (moleculares ouparticulados) que fornecem uma tensão de rendimento aparente à fase contínua.

Os ingredientes apropriados que podem ser utilizados comoagentes de tensão de rendimento, em particular, nos sistemas alimentícios,incluem os agentes geleificantes, alguns exemplos não limitantes, os quaissão resumidos abaixo:

- Biopolímeros geleificantes termoreversíveis, tais como iota ekappa carragenas, e agar;

- Biopolímeros geleificantes quimicamente definidos que derivamsua estrutura em gel de uma interação entre o polissacarídeo e um íon apropriado,tal como Ca2+. Os exemplos incluem o alginato de sódio e a pectina;

- Polissacarídeos bacterianos, tais como xantana ou gelana quepodem formar o comportamento fraco do tipo gel que é rompido pelocisalhamento. De preferência, tais polissacarídeos são adicionados parafornecer uma quantidade final de pelo menos 0,2% em peso, na misturaaerada. Se a mistura aerada for armazenada por um tempo longo antes docongelamento, tal como um dia ou mais, maiores quantidades, de preferência,pelo menos 0,4% em peso são adicionadas;

- Polissacarídeos fúngicos, tais como schizophyllan;

- Géis sinergísticos que compreendem dois ou mais biopolímerosque podem ser individualmente não geleificantes, mas na mistura irão formarum gel ou um gel de um módulo maior. Os exemplos incluem: alginato de sódiocom pectina, xantana com goma de alfarroba, agar com goma de alfarroba ekappa carragena com goma de alfarroba.

Uma série de agentes de tensão de rendimento descritos acimasão utilizados convencionalmente para produtos em gel, tal conforme eles sãodefinidos. Os polissacarídeos geleificantes não são os únicos ingredientes quepodem ser utilizados como agentes de tensão de rendimento no contexto dapresente invenção. Qualquer ingrediente (molecular ou partícula) que resultaem uma tensão de rendimento aparente da fase continua pode ser utilizado.

Outros exemplos de agentes de tensão de rendimento incluem:

- Lipogéis. Estes incluem, mas não estão limitados a, ésteres depoliglicerol de ácidos graxos saturados e misturas de monoglicerídeos deácidos graxos com ésteres de ácido cítrico de ácidos graxos saturados, ésteresde ácido láctico de ácidos graxos saturados ou ésteres de ácido diacetiltartárico de ácidos graxos saturados. Tipicamente, a quantidade do ingredienteIipogel seria menos de cerca de 2 a 5% em peso na mistura pré-aerada. Osexemplos de como produzir os lipogéis podem ser encontrados em Heertje etal., Food Science and Technology, 1998, 31, 387 - 396.

- Proteínas geleificantes (termicamente ou quimicamente), porexemplo, proteína do soro do leite, gelatina.

- Emulsões óleo-em-água onde as partículas de óleo dispersasinteragem entre si, de modo a apresentar a fase contínua com uma naturezageleificada.

- Fibras, por exemplo, de frutas ou de origem vegetal, celulosemodificada etc.

De preferência, uma composição aerada retém pelo menos 50% deseu aumento de volume original, de maior preferência, 75%, por um período de pelomenos uma semana, de maior preferência, ainda, pelo menos um mês (tipicamentemedido após o armazenamento em temperaturas frias (cerca de 5°C)).

Etapa de Congelamento Quiescente

Congelamento quiescente (ou estático) refere-se a qualquer processoonde um líquido aquoso (por exemplo, uma solução ou suspensão) é resfriadoabaixo de seu ponto de congelamento, tal que a solidificação total ou parcial ocorreatravés da formação de cristais de gelo, na ausência de um campo de cisalhamentoimposto. Assim, o líquido é congelado sem ser deliberadamente agitado, misturadoou sacudido durante o congelamento. A etapa de congelamento quiescente podeser obtida por uma série de métodos que incluem (mas não estão limitados a):

- colocar um recipiente contendo o líquido a ser congelado em umambiente frio onde a temperatura está abaixo do ponto de congelamento do líquido(tal como um congelador doméstico, um armazém frio comercial ou um congeladorrápido ou um refrigerador de varejo) até ocorrer o grau desejado de solidificação;

- preencher um molde com o líquido a ser congelado e submergiro molde em um banho de meio líquido gelado (tal como salmoura, glicol ounitrogênio líquido) até ocorrer o grau desejado de solidificação;

- colocar ou gotejar uma porção do nitrogênio líquido a sercongelado diretamente em um banho de fluido criogênico (tal como nitrogêniolíquido) por um tempo suficiente para que ele se solidifique antes de removê-lo.

- congelamento do filme, isto é, espalhamento do líquido comouma camada em uma superfície fria, possibilitando que a camada congele naausência de cisalhamento e, então, raspagem da camada congelada a partir dasuperfície fria. Os exemplos dos congeladores de filme incluem oscongeladores de tambor e os pratos frios giratórios.

- pulverização das gotas do líquido em um ambiente frio dentro de umacâmara fechada, tal que o grau requerido de solidificação ocorreu no momento emque as gotas caíram na base da câmara sob gravidade. Neste caso, embora as gotasestejam se movendo, não há um campo de cisalhamento imposto no líquido na gota.Composições

A quantidade de hidrofobina presente na composição irá variargeralmente dependendo da formulação do produto e do volume da fase de ar.Tipicamente, a composição irá conter pelo menos 0,001% em peso de hidrofobina, de maior preferência, pelo menos 0,005 ou 0,01% em peso. Tipicamente, o produtoirá conter menos de 1% em peso de hidrofobina. A hidrofobina pode ser de umaúnica fonte ou uma pluralidade de fontes, por exemplo, a hidrofobina pode ser umamistura de dois ou mais polipeptídeos de hidrofobina diferentes.

A hidrofobina é adicionada em uma forma e em uma quantidade tal que fica disponível para estabilizar a fase de ar. Pelo termo "adicionada", entende-se que a hidrofobina é introduzida deliberadamente na composição alimentíciapara o propósito de se tirar vantagem de suas propriedades de estabilização daespuma. Conseqüentemente, onde estão presentes ou são adicionadosingredientes que contêm contaminantes fúngicos, que podem conter polipeptídeos de hidrofobina, isto não constitui a adição de hidrofobina dentro do contexto dapresente invenção. Tipicamente, a hidrofobina é adicionada à composição de umaforma tal que é capaz de auto-organização em uma superfície ar - líquido.

Tipicamente, a hidrofobina é adicionada em uma forma isolada,tipicamente pelo menos parcialmente purificada, tal como pelo menos 10% pura, com base no peso dos sólidos. Por "adicionada na forma isolada", entende-se que ahidrofobina não é adicionada como parte de um organismo de ocorrência natural, talcomo um cogumelo, que expressa naturalmente as hidrofobinas. Ao invés disto,tipicamente, a hidrofobina terá sido tipicamente extraída de uma fonte de ocorrêncianatural ou obtida pela expressão recombinante em um organismo hospedeiro.

Em uma realização, a hidrofobina é adicionada à composição naforma monomérica, dimérica e/ou oligomérica (isto é, que consiste em 10 unidadesmonoméricas ou menos). De preferência, pelo menos 50% em peso da hidrofobinaadicionada estão em pelo menos uma dessas formas, de maior preferência, pelomenos 75, 80, 85 ou 90% em peso. Uma vez adicionada, a hidrofobina, tipicamentepassará por uma organização na interface de ar/ líquido e, portanto, é esperado quea quantidade de monômero, dímero e oligômero diminua.

Os produtos alimentícios aerados congelados podem conteropcionalmente outros ingredientes, tais como um ou mais dos seguintes: outrasproteínas tais como proteínas lácteas, como ingredientes puros ou comoingredientes líquidos, por exemplo, leite ou creme; óleo ou gordura,notadamente na forma de uma fase emulsificada; açúcares; sais; colorantes eflavorizantes; emulsificantes químicos, tais como monoglicerídeos, purê/extratos/ sucos de frutas ou vegetais; estabilizantes ou espessantes, tais comopolissacarídeos; conservantes; inclusões, tais como nozes, frutas, balas decaramelo.

A presente invenção será descrita agora com referência aosseguintes exemplos que são apenas ilustrativos e não limitantes.

Exemplos

Os experimentos foram realizados a fim de comparar aretenção de gás em composições aeradas durante o congelamentoquiescente.

Exemplo 1

Preparação da Mistura

Uma mistura apropriada para a produção de uma composiçãoaerada congelada foi preparada contendo a hidrofobina HFBII (Exemplo 1).Um exemplo comparativo, em que leite desnatado em pó foi utilizado aoinvés da hidrofobina, também foi preparado. O exemplo comparativo érepresentativo de uma mistura que deve mostrar boa estabilidade daespuma, devido ao alto nível de proteína do leite. As composições demistura são dadas na Tabela 1. As fontes dos ingredientes são dadas na

Tabela 2.Tabela 1Composição das Misturas

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Tabela 2

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A hidrofobina HFBII foi purificada da Trichoderma reeseiessencialmente conforme descrito no documento WO 00/58342 e Linder et al.,2001, Biomacromolecules 2: 511 - 517. A xantana foi incluída de modo a evitara cremeação da espuma durante o armazenamento.

As misturas foram preparadas em bateladas de 100 g. A sacarose, agoma xantana e o leite desnatado em pó (onde utilizado) foram misturados a secoe adicionados lentamente na água agitada à temperatura ambiente. As misturasforam aquecidas a 55° C e agitadas por cerca de 30 minutos para assegurar que axantana e as proteínas do leite (onde utilizadas) fossem completamentehidratadas. As misturas foram então resfriadas à temperatura ambiente. O HFBII(onde utilizado) foi adicionado à mistura como uma alíquota de uma solução de 5mg/ mL para fornecer a concentração final requerida. As soluções foram entãolentamente agitadas por um período adicional.

Etapa de Aeração

100 mL de cada mistura foi lentamente sonicada em um banhosônico por 30 segundos para dispersar completamente o HFBII (onde utilizado) ecolocado em um equipamento de recipiente de agitação que foi resfriado a 5o C.

O equipamento consiste em um recipiente de aço inoxidável cilíndrico, montado verticalmente, revestido com proporções internas de 105 mm de altura e 72mm de diâmetro, que contém um agitador. O agitador consiste em um impulsorretangular (dimensões de 72 mm χ 41,5 mm) que raspa a superfície interna dorecipiente conforme ele rotaciona e duas lâminas semi-circulares (60 mm dediâmetro) posicionadas em um ângulo de 45° ao impulsor. A mistura foi aerada pela rotação do agitador a 1.200 rpm até um aumento de volume de 100% ter sidoatingido (60 segundos, por exemplo, 1 e 120 segundos para o exemplo comparativo).

O aumento de volume das misturas aeradas foi medidoimediatamente após a preparação, utilizando a técnica esquematizada abaixo.As misturas aeradas foram então armazenadas em béqueres em um refrigerador a 5o C por 7 dias e o aumento de volume foi medido novamente.

Etapa de Congelamento QuiescenteApós a armazenagem por 7 dias, as amostras de cada misturaaerada foram preenchidas em moldes de borracha retangulares e colocadas em umcongelador a -25° C por 24 horas. As amostras foram então colocadas em um refrigerador a -80° C por 30 minutos para aumentar sua dureza antes da medida doaumento de volume. Três amostras foram medidas para cada mistura. A quartaamostra foi armazenada a -80° C antes de ser examinada pelo microscópioeletrônico de varredura (SEM) para estudar a microestrutura.Medida do Aumento de VolumeAmostras Aeradas

O aumento de volume foi determinado conforme segue para asamostras não congeladas aeradas. Em primeiro lugar, um recipienteplástico de volume conhecido (0,7 mL) foi preenchido cuidadosamente coma mistura não aerada e pesada em uma balança de laboratório (Mnão aerada)·Então, o procedimento foi repetido com uma amostra do mesmo volume damistura aerada (Maerada)· O aumento de volume foi determinado a partir daequação:

Aumento de volume = Mnan ^nd3 - Maerada x 100%

Maerada

(Isto é equivalente à definição acima de aumento de volume quandoas amostras de volume fixo são utilizadas ao invés das amostras de massa fixa).Amostras Aeradas Congeladas

O aumento de volume foi determinado conforme segue para asamostras aeradas congeladas. A mistura aerada foi pesada em moldes demodo a fornecer amostras de massa conhecida (cerca de 5 g). As amostrasforam congeladas conforme descrito acima. Após o congelamento, asamostras foram removidas do moldes e cada uma foi imediatamentecolocada em um recipiente plástico pré-resfriado. Uma tampa de roscacontendo dois orifícios pequenos foi colocada no recipiente. O volume doespaço delimitado dentro do recipiente foi previamente determinado comosendo de 61,95 mL. O recipiente foi cuidadosamente preenchido com 60%em peso de solução de sacarose a -10° C por meio de um dos pequenosorifícios utilizando uma seringa graduada. O segundo orifício na tampapermitiu que o ar deslocado escapasse. O volume de solução de sacaroseinjetado requerido para preencher completamente o recipiente foideterminado a partir das gradações da seringa. O volume da amostra deespuma congelada (Vaerado) foi dado pela diferença entre o volumeconhecido do recipiente e o volume medido da solução de injeção. O testefoi completado em um minuto de modo a evitar o derretimento da espumacongelada. O procedimento foi repetido com as amostras de mistura nãoaeradas congeladas possuindo a mesma massa (Vnâo aerado)· O aumento devolume foi determinado a partir da equação (isto é, para as amostras demassa fixa):

<formula>formula see original document page 20</formula>

Microscopia Eletrônica de Varredura

A microestrutura dos produtos foi visualizada ao utilizar MicroscopiaEletrônica de Varredura (SEM) a baixa temperatura. Para preparar os espécimespara a imicroscopia, a amostra foi resfriada até -80° C em gelo seco e uma seçãoda amostra foi cortada. Essa seção, cerca de 5 mm χ 5 mm χ 10 mm de tamanho,foi montada em um suporte de amostra ao utilizar um composto de Tissue Tek:OCT™ (11% de PVA, 5% de Carbowax e 85% de componentes não reativos). Aamostra incluindo o suporte foi imersa em lama de nitrogênio líquido e transferidaa uma câmara de preparação de baixa temperatura (Oxford InstrumentCT1500HF), mantida sob vácuo, em cerca de 10"4 bar. A amostra foi entãoaquecida até -90°C, por cerca de 60 a 90 segundos, tal que o gelo sublimoulentamente para revelar os detalhes da superfície. Ela foi então resfriada até -110°C para encerrar a sublimação. A amostra foi depois revestida com ouro ao usarplasma de argônio. Este processo também ocorre sob vácuo com uma pressãoaplicada de 10~1 milibars e uma corrente de 6 miliamperes por 45 segundos. Aamostra foi então transferida então a um Microscópio Eletrônico de Varreduraconvencional (JSM 5600), dotado de um estágio frio da Oxford Instruments a umatemperatura de -160°C. A amostra foi examinada e as áreas de interesse foramcapturadas através de um software de aquisição de imagem digital.Resultados

Os aumentos de volume após a aeração, após oarmazenamento e após o congelamento são mostradas na Tabela 3. NoExemplo Comparativo contendo um alto nível de leite desnatado em pó, háuma redução significativa do aumento de volume durante oarmazenamento e como um resultado do congelamento. Entretanto, oExemplo 1 contendo a hidrofobina não mostrou nenhuma perda deaumento de volume durante o armazenamento e uma redução muito menordurante o congelamento. (De fato, pelo menos parte desta diminuição podeser por causa da mudança no volume do gás devido à redução natemperatura e não resulta da perda de gás pela amostra). Os resultadosmostram que a utilização de hidrofobina no lugar das proteínas do leitemelhora consideravelmente a retenção de ar durante o armazenamento e ocongelamento da solução com espumas.

Tabela 3

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As imagens SEM das amostras congeladas mostraram que oExemplo 1 possuía uma distribuição uniforme das bolhas de ar. O ExemploComparativo sem a hidrofobina, aparentou possuir bolhas de gás distribuídasde maneira não uniforme, e em acordo com as medidas de aumento devolume, aparentava estar presente menos ar. Além disso, os cristais de gelo noExemplo Comparativo pareceram mais alongados e, de alguma forma, maioresdo que aqueles do Exemplo 1.Exemplos 2 ε 3

Duas misturas adicionais foram preparadas de acordo com amesma formulação e utilizando o mesmo procedimento que no Exemplo 1. Asmisturas foram então aeradas utilizando um misturador manual elétrico Brevillecom a "lâmina misturadora" por cerca de 1 minuto. O aumento de volume dasmisturas aeradas foi medido. As misturas aeradas foram então armazenadas a5o C por 4 dias e o aumento de volume foi medido novamente. Então, asmisturas aeradas foram congeladas de modo quiescente para produzir oproduto aerado congelado final por dois métodos diferentes, conforme segue:

Exemplo 2

A mistura aerada foi colocada em um molde e então congeladaem um banho de salmoura ajustada a -25° C por 15 minutos. Os palitos foraminseridos no produto após cerca de 30 segundos a 1 minuto do tempo decongelamento. Os produtos aerados congelados foram liberados dos moldes por imersão breve dos moldes em um banho de água morna. Os produtosforam então colocados em embalagens de papel encerado.

Exemplo 3

A mistura aerada foi colocada em um recipiente e então congeladaem um congelador doméstico ajustado a -18° C por cerca de 6 horas.

Em cada caso, os produtos aerados congelados foram entãoresfriados por 2 horas em um congelador rápido a -35° C, após o qual seuaumento de volume foi medido.

Os aumentos de volume após o armazenamento e após ocongelamento são mostradas na Tabela 4. Apenas pequenas quantidades de aumento de volume foram perdidas durante o congelamento quiescente, isto é,5 e 7% (± 1%) para os Exemplos 2 e 3 respectivamente. Os dados mostramnovamente que a hidrofobina é eficaz na estabilização da espuma durante ocongelamento.Tabela 4

Aumentos de volume í%)

<table>table see original document page 23</column></row><table>

As várias características e realizações da presente invençãocitadas nas seções individuais acima se aplicam, tal como apropriado, a outrasseções, com as mudanças necessárias. Conseqüentemente, as característicasespecificadas em uma seção podem ser combinadas com as característicasespecificadas em outras seções, tal como apropriado.

Todas as publicações mencionadas no relatório descritivo acimasão incorporadas no presente a título de referência. As diversas modificações evariações dos métodos e dos produtos descritos da presente invenção serãoevidentes aos técnicos no assunto sem que se desvie do escopo da presenteinvenção. Embora a invenção tenha sido descrita em conexão com realizaçõespreferidas específicas, deve ficar compreendido que a presente invenção, talcomo reivindicada, não deve ficar indevidamente limitada a tais realizaçõesespecíficas. De fato, as várias modificações dos modos descritos para a práticada presente invenção que são evidentes aos técnicos nos assuntoscorrespondentes devem estar enquadradas dentro do escopo dasreivindicações seguintes.

Claims

1. PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃOAERADA CONGELADA, caracterizado pelo fato de que o processo compreende aaeração de uma mistura aquosa, seguido pelo congelamento quiescente damistura aerada, em que a mistura compreende a hidrofobina.

2. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a mistura compreende pelo menos 0,001% em peso de hidrofobina.

3. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2,caracterizado pelo fato de que a hidrofobina está na forma isolada.

4. PROCESSO, de acordo com uma das reivindicações de 1a 3, caracterizado pelo fato de que a hidrofobina é uma hidrofobina de classe II.

5. PROCESSO, de acordo com uma das reivindicações de 1a 4, caracterizado pelo fato de que a composição aerada congelada possui umaumento de volume de pelo menos 25%.

6. PROCESSO, de acordo com uma das reivindicações de 1a 5, caracterizado pelo fato de que a composição é um produto alimentício.

7. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizadopelo fato de que o produto alimentício é um produto de confeito congelado.

8. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato de que o produto de confeito congelado é um sorvete.

9. PROCESSO, de acordo com uma das reivindicações de 1 a 8,caracterizado pelo fato de que a etapa de aeração é selecionada a partir do grupoque consiste em mistura contínua, mistura em batelada, injeção de gás, gás emtransporte por uma corrente fluida, geração de gás por meio de uma reação químicaou bioquímica e liberação do gás aprisionado a partir de uma solução ou um sólido.

10. PROCESSO, de acordo com uma das reivindicações de 1 a 9,caracterizado pelo fato de que a etapa de congelamento é selecionada a partir dogrupo que consiste em colocar um recipiente contendo a mistura aquosa em umambiente frio; submergir um molde contendo a mistura em um banho de refrigerantefrio; colocar as porções da mistura diretamente em um banho de fluido criogênico;congelar o filme; e aspergir as gotas da mistura em um ambiente frio.

11. PROCESSO, de acordo com uma das reivindicações de 1a 10, caracterizado pelo fato de que a mistura compreende ainda um agente detensão do rendimento.

12. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que o agente de tensão do rendimento é xantana e/ou a gelana.

13. USO DE UMA HIDROFOBINA, caracterizado pelo fato deser para a estabilização de uma composição aerada durante o congelamentoquiescente.