BRPI0617224A2 - metodos para produzir semente hìbrida - Google Patents

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BRPI0617224A2
BRPI0617224A2 BRPI0617224-5A BRPI0617224A BRPI0617224A2 BR PI0617224 A2 BRPI0617224 A2 BR PI0617224A2 BR PI0617224 A BRPI0617224 A BR PI0617224A BR PI0617224 A2 BRPI0617224 A2 BR PI0617224A2
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BR
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rna
plant
gene
herbicide
mirna
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BRPI0617224-5A
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Edwards Allen
Larry A Gilbertson
Nancy M Houmard
Shihshieh Huang
Sergey I Ivashuta
James K Roberts
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Monsanto Technology Llc
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Abstract

<B>MéTODOS PARA PRODUZIR SEMENTE HìBRIDA.<D> A presente invenção refere-se a métodos para a produção de uma semente híbrida não natural. São também descritos miRNAs específicos e sítios de reconhecimento de miRNA úteis para conferir esterilidade induzida em uma plantação, e construto de DNA recombinante incluindo tais sítios de reconhecimento de miRNA exógeno.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOSPARA PRODUZIR SEMENTE HÍBRIDA".
REIVINDICAÇÕES DE PRIORIDADE E REFERÊNCIA A PEDIDOS RELA-CIONADOS
Esse pedido reivindica o benefício de prioridade dos Pedidos dePatente Provisórios U.S. No. 60/726.106, depositado em 13 de outubro de2005, e 60/836.246, depositado em 7 de agosto de 2006, que estão incorpo-rados por referência na sua totalidade.INCORPORAÇÃO DE LISTAGENS DE SEQÜÊNCIA
As listagens de seqüência contidas nos arquivos "38-21 (54232)A.rpt" (tamanho de arquivo de 61 kilobytes, gravado em 12 de outubro de2005, e depositado com o Pedido Provisório U.S. 60/726.106 em 13 de ou-tubro de 2005), "38-21 (54232)B.rpt" (tamanho de arquivo de 68 kilobytes,gravado em 7 de agosto de 2006, e depositado com o Pedido Provisório U.S. 60/836.246 em 7 de agosto de 2006), e "38-21 (54232)C.rpt" (tamanho dearquivo de 70 kilobytes, gravado em 19 de setembro de 2006, e depositadocom o Pedido Provisório U.S. xx/xxx.xxx em 20 de setembro de 2006) estãoincorporadas aqui por referência nas suas totalidades.
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a métodos para produzir sementehíbrida, e plantas transgênicas indutivamente estéreis e constructos molecu-lares úteis em tais métodos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Semente híbrida, isto é, semente produzida por hibridização oufertilização cruzada de plantas intimamente relacionadas, pode ser cultivadaem plantas híbridas de progênie que possuem um "vigor híbrido" ou umacombinação desejável de características não possuídas por nenhuma desuas plantas progenitoras (que são tipicamente plantas naturais). Plantashíbridas podem apresentar características de desempenho agronômico su-periores, incluindo melhoria do tamanho da planta, rendimento, composiçãonutricional, resistência a doença, tolerância a herbicida, tolerância ao estres-se (calor, frio, seca, nutriente, sal), adaptação climática, e outras características desejáveis.
Produção eficaz de semente híbrida requer que a polinizaçãocruzada predomine sobre a autopolinização. Uma limitação importante naprodução de semente híbrida para muitas espécies de cultivo é a falta demétodos simples, confiáveis e econômicos de gerar esterilidade em pelomenos um progenitor (especialmente no progenitor macho, para resultar emmacho-esterilidade enquanto se deixa os gametas femininos intactos e a-cessíveis para polinização por um doador de pólen adequado). Macho esteri-lidade também e útil onde o espalhamento de pólen não é desejável, porexemplo, a partir de uma planta doméstica aos seus parentes selvagens, ouonde a fertilização da flor não é desejável, por exemplo, no caso de floresornamentais que deterioram em condição após polinização.
Macho esterilidade pode ser obtida, por exemplo, por remoçãofísica dos órgãos que contêm os gametas masculinos. Em algumas espé-cies, isso é um processo direto embora trabalhoso e, portanto caro (por e-xemplo, despendoamento em milho). Em outras espécies, tal emasculaçãofísica é difícil por causa da anatomia da planta. Técnicas alternativas quenão envolvem emasculação manual ou física poderiam fornecer economiassubstanciais.
Gametocidas químicos também foram descritos como um méto-do de gerar plantas macho-estéreis. Tipicamente, tal gametocida químico éum composto herbicida que quando aplicado a uma planta em um estágio dodesenvolvimento apropriado ou antes da maturidade sexual é capaz de ma-tar ou exterminar eficazmente o desenvolvimento de gametas masculinos deuma planta enquanto deixa os gametas femininos, ou pelo menos uma por-ção significativa deles, capazes de sofrer polinização cruzada. Por exemplo,tolerância ao glifosato foi manipulada geneticamente em milho (Patente U.S.Número 5.554.798), e uso do herbicida glifosato (/V-fosfonometilglicina) co-mo um gametocida, e plantas transgênicas que são vegetativamente- e fê-mea-tolerantes ao glifosato, mas macho-sensíveis ao glifosato, é descrito naPatente U.S. Número 4.735.649 e na Publicação de Pedido de Patente In-ternacional PCT W099/46396A2. Entretanto, os níveis de glifosato necessá-rios para matar a maioria dos gametas masculinos enquanto deixa um nú-mero suficiente de gametas femininos ainda capazes de fertilização resultoufreqüentemente em atrofia ou clorose das plantas. Dessa forma, um obstá-culo importante de usar glifosato como um gametocida, como é geralmenteverdadeiro com a maioria dos gametocidas químicos, são os efeitos colate-rais fitotóxicos que resultam da falta de seletividade suficiente para gametas.
Produção comercial de semente híbrida usando gametocidasquímicos é limitada primariamente por sua falta de seletividade por gametasem geral. Compostos que possuem alguma seletividade em atingir gametasem uma quantidade maior do que tecidos vegetativos são geralmente não-discriminativos com relação ao sexo dos gametas destruídos. Dessa forma,métodos para melhorar a seletividade de um gametocida químico seriamaltamente desejáveis. Ainda mais desejáveis seriam métodos que fornecemuma primeira planta parental que é macho-estéril, e uma segunda plantaparental que é fêmea-estéril, garantindo assim que as sementes produzidassejam o resultado de hibridização as duas plantas parentais, e não de auto-fertilização.
Essa invenção fornece métodos de produzir semente híbrida, efornece adicionalmente constructos de DNA recombinantes, cromossomosde planta, células, plantas e sementes transgênicas, que contêm tais cons-tructos úteis nesses métodos. Os constructos de DNA recombinantes, cro-mossomos de planta, células, plantas e sementes transgênicas e métodospara seu uso ao fazer semente híbrida fornecem uma forma grandementemelhorada de usar herbicidas como gametocidas químicos. Os constructosde DNA recombinantes dessa invenção incluem um sítio de reconhecimentode microRNA exógeno, que permite que a expressão de um RNA mensagei-ro que codifica uma proteína que confere tolerância a um herbicida seja con-trolada por um microRNA endógeno para uma planta na qual o constructo deDNA recombinante é transcrito.
MicroRNAs (miRNAs) são RNAs não codificantes de proteína,geralmente de cerca de 19 a cerca de 25 nucleotídeos (comumente cerca de20 - 24 nucleotídeos em plantas), que guiam a clivagem in trans de transcri-tos alvo, regulando negativamente a expressão de genes envolvidos em vá-rias vias de regulação e desenvolvimento (Bartel (2004) Cell, 116:281-297).Em alguns casos, miRNAs servem para guiar processamento in phase detranscritos primários de siRNA (vide Allen et al. (2005) Cell, 121:207-221).
Alguns genes de microRNA (genes MIR) foram identificados etornados disponíveis ao público em uma base de dados ("miRBase", dispo-nível na rede em microrna.sanger.ac.uk/sequences). Os requerentes des-creveram novos genes MIR, miRNAs maduros, e sítios de reconhecimentode miRNAs no Pedido de Patente U.S. 11/303.745, depositado em 15 dedezembro de 2005. Genes MIR adicionais e miRNAs maduros também sãodescritos nas Publicações de Pedido de Patente U.S. 2005/0120415 e2005/144669A1. Genes MIR foram relatados ocorrer em regiões intergêni-cas, tanto isolados como em grupos no genoma, mas também podem estarlocalizados inteiramente ou parcialmente dentro de íntrons de outros genes(codificantes de proteína ou não codificantes de proteína). Para uma revisãorecente de biogênese de miRNA, vide Kim (2005) Nature Rev. MoL Cell Bi-ol., 6:376-385. A transcrição de genes MIR pode estar, pelo menos em al-guns casos, sob o controle promocional de um promotor do próprio geneMIR. A transcrição do gene MIR é provavelmente geralmente mediada pelaRNA polimerase Il (vide, por exemplo, Aukerman & Sakai (2003) Plant Cell,15:2730-2741; Parizotto et ai (2004) Genes Dev., 18:2237-2242), e portantopoderia ser sensível a abordagens de silenciamento gênico que foram usa-das em outros genes transcritos por RNA polimerase II. O transcrito primário(que pode ser policistrôniço) chamado um "primRNA", uma molécula precur-sora de miRNA que pode ser bem grande (vários quilobases) e contém umaou mais regiões locais de duplo filamento ou "alça" assim como o usual"cap" 5' e cauda poliadenilada de um mRNA. Vide por exemplo, Figura 1 emKim (2005) Nature Rev. Moi Cell Biol., 6:376-385.
Em células de planta, acredita-se que moléculas precursoras demicroRNA sejam basicamente processadas no núcleo. Em plantas, miRNAse siRNAs são formados por enzimas do tipo DICER (DCL) distintas, e emArabidopsis acredita-se que uma enzima DCL nuclear seja necessária paraa formação de miRNA maduro (Xie et al. (2004) PLoS Biol., 2:642-652). Re-visões adicionais sobre a biogênese e função de microRNA são encontra-das, por exemplo, em Bartel (2004) Cell, 116:281-297; Murchison & Hannon(2004) Curr. Opin. Cell Biol., 16:223-229; e Dugas & Bartel (2004) Curr. O-pin. PIantBioI., 7:512-520. MicroRNAs podem assim ser descritos em termosde RNA (por exemplo, seqüência de RNA de um miRNA maduro ou umamolécula de RNA precursora de miRNA), ou em termos de DNA (por exem-pio, seqüência de DNA que corresponde a uma seqüência de RNA de miR-NA maduro ou uma seqüência de DNA que codifica um gene MIR ou frag-mento de um gene MIRou um precursor de miRNA).
Famílias de gene MIR são estimadas ser responsáveis por 1%de pelo menos alguns genomas e capazes de influenciar ou regular a ex-pressão de cerca de um terço de todos os genes (vide, por exemplo, Tomariet al. (2005) Curr. Biol., 15:R61-64; G. Tang (2005) Trends Biochem. Sci.,30:106-14; Kim (2005) Nature Rev. Mol. Cell Biol., 6:376-385). Pelo fato dosmiRNAs serem elementos regulatórios importantes em eucariotos, incluindoanimais e plantas, a supressão transgênica de miRNAs poderia, por exem-pio, levar ao entendimento de processos biológicos importantes ou permitir amanipulação de certas vias (por exemplo, regulação da diferenciação celu-lar, proliferação e apoptose) úteis, por exemplo, em aplicações biotecnológi-cas. Vide, por exemplo, O1DonneII et al. (2005) Nature, 435:839-843; Cai etal. (2005) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 102:5570-5575; Morris & McManus(2005) Sei. STKE, pe41 (stke.sciencemag.org/cgi/reprint/sigtrans; 2005/297/pe41.pdf). Genes de microRNA (MIR) têm características identificadoras,incluindo conservação entre espécies de planta, uma estrutura de "foldback"estável, e processamento de uma dúplice de miRNA/miRNA* específica porenzimas do tipo Dicer (Ambros et ai (2003) RNA, 9:277-279). Essas caracte-rísticas foram usadas para identificar miRNAs e seus genes correspondentesem plantas (Xie et al. (2005) Plant Physiol., 138:2145-2154; Jones-Rhoades& Bartel (2004) Mol. CeH, 14:787-799; Reinhart et al. (2002) Genes Dev.,16:1616-1626; Sunkar & Zhu (2004) Plant Cell, 16:2001-2019). Genes demicroRNA disponíveis ao publico estão catalogados na miRBase (Griffiths-Jones et al. (2003) Nucleic Aeids Res., 31:439-441).
MiRNAs são expressos em tipos celulares muito específicos emArabidopsis (vide, por exemplo, Kidner & Martienssen (2004) Nature, 428:81-84, Millar & Gubler (2005) Plant Cell, 17:705-721). A supressão pode serlimitada a um lado, borda ou outra divisão entre tipos celulares, e acredita-seque seja necessária para a padronização e especificação do tipo celular a-propriado (vide, por exemplo, Palatnik et al. (2003) Nature, 425:257-263).Supressão de um gene repórter de GFP contendo um sítio de reconheci-mento de miR171 endógeno foi descoberto limitar a expressão a células es-pecíficas em Arabidopsis transgênica (Parizotto et al. (2004) Genes Dev.,18:2237-2242). Sítios de reconhecimento de miRNAs foram validados emtodas as regiões de um mRNA, incluindo a região 5' não traduzida, regiãocodificante, e região 3' não traduzida, indicando que a posição do sítio alvode miRNA em relação a seqüência codificante pode não necessariamenteafetar a supressão (vide, por exemplo, Jones-Rhoades & Bartel (2004). Mol.Celll 14:787-799, Rhoades et al. (2002) Cell, 110:513-520, Allen et al. (2004)Nat. Genet., 36:1282-1290, Sunkar & Zhu (2004) Plant Cell, 16:2001-2019).
Os miRNAs maduros descritos aqui são processados a partir degenes MIR que geralmente pertencem a famílias canônicas conservadasentre espécies de planta distantemente relacionadas. Esses genes MIR eseus miRNAs maduros codificados também são úteis, por exemplo, paramodificar vias de desenvolvimento, por exemplo, por afetar a diferenciaçãoou morfogênese celular (vide, por exemplo, Palatnik et al. (2003) Nature,425:257-263; Mallory et al. (2004) Curr. Biol., 14:1035-1046), para servir co-mo fontes de seqüências para miRNAs manipulados (que não ocorrem natu-ralmente) que são feitos para silenciar seqüências diferentes dos transcritosatingidos pela seqüência de miRNA de ocorrência natural (vide, por exem-plo, Parizotto et al. (2004) Genes Dev., 18:2237-2242; vide também Publica-ções de Pedido de Patente U.S. 2004/3411A1 e 2005/0120415), e para es-tabilizar dsRNA. Um gene MIR em si (ou suas regiões 5' ou 3' não traduzi-das, ou seu promotor nativo ou outros elementos envolvidos na sua transcri-ção) é útil como um gene alvo para supressão gênica (por exemplo, pelosmétodos da presente invenção), onde a supressão do miRNA codificado pe-lo gene MIR é desejada. Promotores de genes MIR podem ter padrões deexpressão muito específicos (por exemplo, célula-específico, tecido-específico, ou temporalmente específico) e dessa forma são úteis em cons-tructos recombinantes para induzir tal transcrição específica de uma se-qüência de DNA à qual eles são operativamente ligados.
Essa invenção fornece métodos para produzir semente híbrida,usando constructos de DNA recombinantes incluindo sítios de reconheci-mento que correspondem a novos miRNA maduros que tem padrões de ex- pressão específicos em plantas de cultivo. Os constructos de DNA recombi-nantes da invenção transcrevem RNA incluindo: (a) pelo menos um sítio dereconhecimento de miRNA exógeno reconhecível por um miRNA maduroque é expresso especificamente em tecido reprodutivo da planta; e (b) RNAmensageiro que codifica uma proteína que confere tolerância a um herbici- da. Esses constructos são úteis para fazer e usar cromossomos de planta,células, plantas e sementes transgênicas, incluindo plantas transgênicasindutivamente estéreis, úteis, por exemplo, na produção de semente híbrida.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Em um aspecto, a invenção fornece um método para produziruma semente híbrida não-natural, incluindo as etapas de: (a) fornecer umaprimeira planta parental transgênica, indutivamente estéril que contém noseu genoma um constructo de DNA recombinante que transcreve RNA queinclui: (i) pelo menos um sítio de reconhecimento de miRNA exógeno reco-nhecível por um miRNA maduro que é especificamente expresso em tecido reprodutivo da primeira planta parental; e (ii) um primeiro RNA mensageiroque codifica uma proteína que confere tolerância a um primeiro herbicida,em que o miRNA maduro suprime especificamente a expressão da proteínano tecido reprodutivo, e em que a esterilidade da primeira planta parental éinduzível pela aplicação do primeiro herbicida a primeira planta parental; (b)cruzar a primeira planta parental com uma segunda planta parental sob con-dições onde a esterilidade tenha sido induzida na primeira planta parental,assim produzindo semente híbrida não natural.
Em outro aspecto, essa invenção fornece um método para pro-duzir uma semente híbrida incluindo as etapas de: (a) fornecer uma primeira planta parental incluindo uma planta transgênica cultivada a partir de umacélula de planta transgênica contendo no seu genoma um primeiro construc-to de DNA recombinante que transcreve RNA que inclui (i) pelo menos umsítio de reconhecimento de miRNA exógeno reconhecível por um primeiromiRNA maduro, e (ii) um primeiro RNA mensageiro que codifica uma proteí-na que confere tolerância a um primeiro herbicida, em que o primeiro miRNAmaduro é expresso especificamente em tecido reprodutivo masculino daprimeira planta parental, assim suprimindo especificamente a expressão daproteína no tecido reprodutivo masculino, e em que a macho esterilidade daprimeira planta parental é induzível pela aplicação do primeiro herbicida aprimeira planta parental; (b) fornecer uma segunda planta parental que incluiuma planta transgênica cultivada a partir de uma segunda célula de plantatransgênica que contém no seu genoma uma segundo constructo de DNArecombinante que transcreve RNA que inclui (i) pelo menos um sítio de re-conhecimento de miRNA exógeno reconhecível por um segundo miRNAmaduro, e (ii) um segundo RNA mensageiro que codifica uma proteína queconfere tolerância a m segundo herbicida, em que o segundo miRNA madu-ro é especificamente expresso no tecido reprodutivo feminino da segundaplanta parental, assim suprimindo especificamente a expressão da proteínano tecido reprodutivo feminino, e em que a fêmea esterilidade da segundaplanta parental é induzível pela aplicação do segundo herbicida a segundaplanta parental; (c) aplicar o primeiro herbicida e o segundo herbicida àsplantas parentais, assim induzindo macho esterilidade na primeira plantaparental e fêmea esterilidade na segunda planta parental; (d) cruzar a pri-meira e segunda plantas parentais, em que óvulos da primeira planta paren-tal são polinizados por pólen da segunda planta parental, produzindo assimsemente híbrida.
Em um aspecto independente, essa invenção fornece uma plan-ta transgênica, indutivamente estéril que contém no seu genoma um cons-tructo de DNA recombinante que transcreve RNA que inclui: (a) pelo menosum sítio de reconhecimento de miRNA exógeno reconhecível por um miRNAmaduro que é expresso especificamente no tecido reprodutivo da planta; e(b) RNA mensageiro que codifica uma proteína que confere tolerância a umherbicida; em que o miRNA maduro suprime especificamente a expressãoda proteína no tecido reprodutivo, e em que a esterilidade da planta transgê-nica é induzível pela aplicação do herbicida a planta.
Em um aspecto adicional, essa invenção fornece um constructode DNA recombinante que transcreve RNA que inclui: (a) pelo menos umsítio de reconhecimento de miRNA exógeno reconhecível por um miRNAmaduro que é expresso especificamente no tecido reprodutivo da planta; e(b) RNA mensageiro que codifica uma proteína que confere tolerância a umherbicida.
Outras modalidades específicas da invenção estão descritas naseguinte descrição detalhada.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Figura 1A representa esquematicamente constructos de DNArecombinantes não Iimitantes da invenção como descrito no Exemplo 1. Pa-ra uso na transformação mediada por Agrobacterium de células de planta,pelo menos uma borda de T-DNA está geralmente incluída em cada cons-tructo (não mostrado). Esses constructos incluem um elemento promotor("pro"), um íntron flanqueado em um ou ambos os lados por um DNA nãocodificante de proteína, um elemento terminador opcional ("ter"), pelo menosum primeiro elemento de supressão de gene ("GSE" ou "GSE1") para supri-mir pelo menos um primeiro gene alvo, e pode incluir opcionalmente pelomenos um segundo elemento de supressão de gene ("GSE2") para suprimirpelo menos um segundo gene alvo, pelo menos um elemento de expressãogênica ("GEE") para expressar pelo menos um gene de interesse, ou ambos.Em modalidades que contêm um elemento de expressão gênica, o elementode expressão gênica pode estar localizado adjacente ao (ou fora do) íntron.Em uma variação dessa modalidade (não mostrada), o elemento de supres-são gênica (inserido em um íntron flanqueado em um ou ambos os lados porDNA não codificante de proteína) está localizado 3' ao terminador. Em ou-tros constructos da invenção (não mostrados), um elemento de supressãogênica (não inserido no íntron) está localizado 3' ao terminador (vide Exem-plo 22). Figura 1B representa esquematicamente exemplos de constructosde DNA distintos daqueles da presente invenção. Esses constructos podemconter um elemento de supressão gênica que está localizado adjacente aum íntron ou entre dois íntrons distintos (isto quer dizer, não inseridos dentrode um único íntron), ou pode incluir um elemento de expressão gênica queinclui um elemento de supressão gênica inserido dentro de um íntron queestá flanqueado em ambos os lados por DNA codificante de proteína (porexemplo, éxons codificantes de proteína que formam um elemento de ex-pressão gênica).
Figura 2 representa vários exemplos não Iimitantes de elemen-tos de supressão gênica e DNAs exógenos capazes de serem transcritosúteis nos constructos de DNA recombinantes da invenção como descrito noExemplo 1. Onde desenhado como um filamento simples (Figuras 2A até2E), estes estão convenientemente representados na direção transcricional5' para 3' (esquerda para direita), onde as setas indicam seqüência anti-sentido (a ponta da seta apontando para a esquerda), ou seqüência sentido(ponta da seta apontando para a direita). Onde desenhado como transcritosde duplo filamento (antiparalelos) (Figures 2F e 2G), a direcionalidadetranscricional 5' e 3' é mostrada. Linhas sólidas, linhas tracejadas, e linhaspontilhadas indicam seqüências que atingem diferentes genes alvo.
Esses elementos de supressão gênica e DNAs exógenos capa-zes de ser transcritos podem incluir: DNA que inclui pelo menos um segmen-to de DNA anti-sentido que é anti-sentido a pelo menos um segmento doprimeiro gene alvo, ou DNA que inclui múltiplas cópias de pelo menos umsegmento de DNA anti-sentido que é anti-sentido a pelo menos um segmen-to do pelo menos um primeiro gene alvo (Figura 2A); DNA que inclui pelomenos um segmento de DNA sentido que é pelo menos um segmento dopelo menos um primeiro gene alvo, ou DNA que inclui múltiplas cópias depelo menos um segmento de DNA sentido que é pelo menos um segmentodo pelo menos um primeiro gene alvo (Figura 2B); DNA que transcreve RNApara suprimir o pelo menos um primeiro gene alvo pela formação de RNAduplo filamento e inclui pelo menos um segmento de DNA anti-sentido que éanti-sentido a pelo menos um segmento do pelo menos um gene alvo e pelomenos um segmento de DNA sentido que é pelo menos um segmento dopelo menos um primeiro DNA alvo (Figura 2C); DNA que transcreve RNApara suprimir o pelo menos um primeiro gene alvo pela formação de um úni-co RNA duplo filamento e inclui múltiplos segmentos de DNA anti-sentidoseriados que são anti-sentido a pelo menos um primeiro gene alvo e múlti-plos segmentos de DNA sentido seriados que são pelo menos um segmentodo pelo menos um primeiro gene alvo (Figura 2D); DNA que transcreve RNApara suprimir o pelo menos um primeiro gene alvo pela formação de múlti-plos filamentos duplos de RNA e inclui múltiplos segmentos de DNA anti-sentido que são anti-sentido a pelo menos um segmento do pelo menos umprimeiro gene alvo e múltiplos segmentos de DNA sentido que são pelo me-nos um segmento do pelo menos um primeiro gene alvo, e em que os ditosmúltiplos segmentos de DNA anti-sentido e os múltiplos segmentos de DNAsentido são dispostos em uma serie de repetições invertidas (Figura 2E); eDNA que inclui nucleotídeos derivados de um miRNA, ou DNA que inclui nu-cleotídeos de um siRNA (Figura 2F). Figura 2F representa vários arranjosnão Iimitantes de filamento duplo RNA (dsRNA) que podem ser transcritos apartir de modalidades dos elementos de supressão gênica e DNAs exógenoscapazes de ser transcritos úteis nos constructos de DNA recombinantes dainvenção. Quando tal dsRNA é formado, ele pode suprimir um ou mais ge-nes alvo, e pode formar um único filamento duplo RNA ou múltiplos filamen-tos duplos de RNA, ou um único "stem" ou múltiplos "stems" de dsRNA. On-de múltiplos "stems" de dsRNA são formados, eles podem ser arranjados emarranjos de "cabeça de martelo" ou "folha de trevo". DNA espaçador é op-cional e pode incluir seqüência que transcreve um RNA (por exemplo, umagrande alça de seqüência anti-sentido do gene alvo ou um aptâmero) queassume uma estrutura secundária ou configuração tridimensional que confe-re ao transcrito uma característica desejada, tal como estabilidade aumenta-da, meia-vida aumentada in vivo, ou especificidade por célula ou tecido.
Figura 3 representa níveis de expressão dos miRNAs madurosindicados em vários tecidos de milho, como descrito em detalhe no Exemplo 2.
Figura 4 representa um exemplo não Iimitante de seqüência deDNA capaz de ser transcrita que inclui um sítio de reconhecimento de miR-NA exógeno, TIC809 direcionado para cloroplasto com um sítio de reconhe-cimento de miRNA162 (texto em negrito) localizado na região 3' não traduzi-da (SEQ ID NO. 176), como descrito em detalhe no Exemplo 3. A seqüênciade aminoácido traduzida também é mostrada.
Figura 5 representa um exemplo não Iimitante de seqüência deDNA capaz de ser transcrita que inclui um sítio de reconhecimento de miR-NA exógeno, TIC809 não direcionado para cloroplasto com um sítio de reco-nhecimento de miRNA164 (texto em negrito) localizado na região 3' não tra-duzida (SEQ ID NO. 177), como descrito em detalhes no Exemplo 3. A se-qüência de aminoácido traduzida também é mostrada.
Figura 6 representa a expressão de endosperma forte e especí-fica do microRNA miR167g (SEQ ID NO. 178) clonado a partir de endosper-ma de milho, como descrito em detalhe no Exemplo 4. Northern blots deRNA de tecidos de milho (LH59) marcados com uma sonda de LNA de 22-mer de miR167 maduro com a extremidade marcada específica para SEQ IDNO. 178 (Figura 6A) ou com uma sonda gene de miR167g-específica de~400bp (Figura 6B). O perfil de transcrição de tecidos de milho confirmou osresultados de Northern blot (Figura 6C); o transcrito que corresponde amiR167g foi abundantemente e especificamente expresso em tecido de en-dosperma (abundâncias são categorizadas como segue: >5000, alta abun-dância, 97° percentil; 700 - 5000, abundância moderada, 20° percentil; 400- 700, abundância média; 200 - 400, baixa abundância; <200, não detecta-do). Abreviações selecionadas: "DAP" ou "DA", dias após polinização; "WK",grão inteiro, "endo", endosperma.
Figura 7 representa um mapa de anotação parcial, incluindo aslocalizações dos genes de miR167a e miR167g e miRNAs maduros, e ele-mentos promotores (por exemplo, TATA boxes), do grupo genômico dentrodo qual foram identificadas as seqüências promotoras de miR167g comodescrito em detalhe no Exemplo 4. Abreviações: "PBF", fator de ligação"prolamin box"; "ARF" fator responsivo a auxina (de ligação a auxina);"NIT2", ativador de genes relacionados ao nitrogênio; "LYS14", elementoque se liga a UASLYS, um elemento ativador à montante que confere ativa-ção e repressão aparente dependente de Lys14 e de adipato semialdeído;"GLN3", elemento que se liga ao nitrogênio à montante da seqüência de ati-vação de glutamina sintetase.
Figura 8 representa resultados descritos em detalhe no Exem-plo 5. Figura 8A representa a estrutura de "fold-back" de SEQ ID NO. 186, oprecursor de miRNA previsto para SEQ ID NO. 184; o miRNA maduro estálocalizado nas bases 106 - 126, o miRNA* correspondente nas bases 156 -175, e outro miRNA abundante foi descoberto estar localizado nas bases100 - 120 na haste da estrutura de "fold-back". "Contagem" refere-se aonúmero de ocorrências de um pequeno RNA no grupo filtrado de 381.6335 seqüências de miRNA putativas que foi analisado. Figura 8B representa umperfil de transcrição em tecidos de soja para o precursor de miRNA SEQ IDNO. 186. Figura 8C representa um perfil de transcrição em tecidos de sojapara um alvo previsto, polifenol oxidase (SEQ ID NO. 200) para o miRNAmaduro (SEQ ID NO. 184).
Figura 9 representa os resultados descritos em detalhe no E-xemplo 5. Figura 9A representa a estrutura de "fold-back" de SEQ ID NO.189, o precursor de miRNA previsto para SEQ ID NO. 187; o miRNA maduroestá localizado nas bases 163 - 183, e o miRNA* nas bases 18-63. "Con-tagem" refere-se ao número de ocorrências de um pequeno RNA no grupofiltrado de 381.633 seqüências de miRNA putativas que foi analisado. Figura9B representa um perfil de transcrição em tecidos de soja para um alvo pre-visto, polifenol oxidase (SEQ ID NO. 251) para o miRNA maduro (SEQ IDNO. 187).
Figura 10 representa os resultados descritos em detalhe no E-xemplo 5. Figura 10A representa a estrutura de "fold-back" de SEQ ID NO.192, o precursor de miRNA previsto para SEQ ID NO. 190; o miRNA maduroestá localizado nas bases 87 - 107, e o miRNA* nas bases 150 - 169. "Con-tagem" refere-se ao número de ocorrências de um pequeno RNA no grupofiltrado de 381.633 seqüências de miRNA putativas que foi analisado.
Figura 11 representa os resultados descritos em detalhes noExemplo 5. Figura 11A representa a estrutura de "fold-back" de SEQ IDNO. 195, o precursor de miRNA previsto para SEQ ID NO. 193; o miRNAmaduro está localizado nas bases 61 - 81, e o miRNA* nas bases 109 -129. "Contagem" refere-se ao número de ocorrências de pequeno RNA nogrupo filtrado de 381.633 seqüência de miRNA putativas que foi analisado.
Figura 12 representa os resultados descritos em detalhe no E-xemplo 5. Figura 12A (superior) representa a estrutura de "fold-back" deSEQ ID NO. 198, um dos precursores de miRNA previstos para SEQ ID NO.196; o miRNA maduro está localizado nas bases 157 - 178, e o miRNA* nasbases 72 - 93. Figura 12A (inferior) representa a estrutura de "fold-back"de SEQ ID NO. 199, outro precursor de miRNA previsto para SEQ ID NO.196; o miRNA maduro está localizado nas bases 123 - 144, e o miRNA* nasbases 58 - 79. "Contagem" refere-se ao número de ocorrências de um pe-queno RNA no grupo filtrado de 381.633 seqüências de miRNA putativasque foi analisado. Figura 12B (superior) representa um perfil de transcriçãoem tecidos de soja para o miRNA precursor SEQ ID NO. 198. Figura 12B(inferior) representa um perfil de transcrição em tecidos de soja para omiRNA precursor SEQ ID NO. 199.
Figuras 13 e 14 representam os perfis de transcrição de conjun-tos de sondas de seqüências que foram identificadas como incluindo genesde miRNA (dados na Tabela 6) especialmente úteis em métodos dessa in-venção e que têm os padrões de expressão desejados, isto é, em tecido re-produtivo feminino (Figura 13) ou em tecido reprodutivo masculino (Figura14), conforme descrito em detalhe no Exemplo 6.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A menos que definido de outra maneira, todos os termos técni-cos e científicos usados têm o mesmo significado que o comumente com-preendido por um versado na técnica a qual essa invenção pertence. Geral-mente, a nomenclatura usada e os procedimentos de fabricação ou laborato-riais descritos abaixo são bem-conhecidos e comumente empregados natécnica. Métodos convencionais são usados para esses procedimentos, taiscomo aqueles fornecidos na técnica e várias referências gerais. A menosque estabelecido de outra maneira, seqüências de ácido nucléico no textodesse pedido são dadas, quando lidas da esquerda para a direita, na direção5' ou 3'. Onde um termo é fornecido no singular, os inventores também con-templam aspectos da invenção descritos pelo plural daquele termo. Onde hádiscrepâncias em termos e definições usadas nas referências que são incor-poradas por referência, os termos usados nesse pedido devem ter as defini-ções dadas. Outros termos técnicos usados têm seu significado comum natécnica em que eles são usados, como exemplificado por uma variedade dedicionários técnicos. Os inventores não pretendem ser limitados a um meca-nismo ou modo de ação. Referência a isso é fornecida apenas para fins ilus-trativos.
MÉTODO PARA PRODUZIR SEMELHANTE HÍBRIDA NÃO-NATURAL
Um primeiro aspecto dessa invenção fornece um método paraproduzir uma semente híbrida não natural, incluindo as etapas de: (a) forne-cer uma primeira planta parental transgênica, indutivamente estéril que con-tém no seu genoma um constructo de DNA recombinante que transcreveRNA que inclui: (i) pelo menos um sítio de reconhecimento de miRNA exó-geno reconhecível por um miRNA maduro que é especificamente expressoem tecido reprodutivo da primeira planta parental; e (ii) um primeiro RNAmensageiro que codifica uma proteína que confere tolerância a um primeiroherbicida, em que o miRNA maduro suprime especificamente a expressãoda proteína no tecido reprodutivo, e em que a esterilidade da primeira plantaparental é induzível pela aplicação do primeiro herbicida a primeira plantaparental; (b) cruzar a primeira planta parental com uma segunda planta pa-rental sob condições onde a esterilidade tenha sido induzida na primeiraplanta parental, assim produzindo semente híbrida não natural.
Plantas: o método dessa invenção inclui fornecer uma plantatransgênica, indutivamente estéril, útil como uma planta parental, que é pre-ferivelmente uma planta de cultivo propagada por semente, tal como aquelasdescritas sob o título "Fazendo e Usando Células de Planta Transgênicas ePlantas Transgênicas". Exemplos não Iimitantes de plantas preferidas inclu-em milho, arroz, trigo, aveia, cevada, centeio, triticale, painço, sorgo, quinoa,amaranto, trigo sarraceno, grama de forragem, turfa, alfafa, algodão, açafro-a, girassol, soja, canola, colza, linho, amendoim, feijão, ervilha, lentilha, alfa-fa, alface, aspargo, alcachofra, aipo, cenoura, rabanete, repolho, couve ga-lega, mostarda, brócolis, couve flor, couve de Bruxelas, nabo, couve rábano,pepino, melões, abóbora moranga, abóbora menina, cebola, alho-poró, cha-lotas, cebolinha, tomate, berinjela, pimenta, fisális, beterraba, acelga, espina-fre, plantas ornamentais, e árvores florestais. Plantas particularmente prefe-ridas incluem milho, arroz, trigo, algodão, açafroa, girassol, canola, e colza.Em uma modalidade particularmente preferida, o método é útil para produzira semente de milho híbrida não natural.Esterilidade: por "esterilidade" entende-se a incapacidade deproduzir com sucesso semente de progênie viável. Macho esterilidade inclui,por exemplo, a incapacidade de produzir gametas masculinos (por exemplo,grãos de pólen férteis, maduros) capazes de fertilizar gametas femininos, oua incapacidade de produzir as estruturas reprodutivas masculinas, (por e-xemplo, anteras, estames, filamentos) necessários para gametas masculinosserem capazes de fertilização normal de gametas femininos. Fêmea esterili-dade inclui, por exemplo, a incapacidade de produzir gametas femininos ca-pazes de ser fertilizados, ou a incapacidade de produzir uma semente com-pletamente desenvolvida (seja viável ou estéril), ou a incapacidade de pro-duzir semente de progênie viável capaz de ser germinada e se desenvolverem uma planta de progênie normal.
Tecido reprodutivo: em modalidades da planta transgênica indu-tivamente estéril, onde a esterilidade é macho esterilidade, o tecido reprodu-tivo é tecido reprodutivo masculino. Tecido reprodutivo masculino incluiqualquer tecido que é necessário para o desenvolvimento de gametas mas-culinos para fertilidade (isto é, que tem a capacidade de fertilizar um gametafeminino), por exemplo, pólen ou gametas masculinos em qualquer estágiodo desenvolvimento, anteras, estames, filete, pendões, e outras partes flo-rais masculinas, tecidos nutritivos, e outras estruturas envolvidas na capaci-dade de uma planta parental masculina fertilizar uma planta parental feminina.
Em modalidades da planta transgênica indutivamente estéril on-de a esterilidade é fêmea esterilidade, o tecido reprodutivo é tecido reprodu-tivo feminino. Tecido reprodutivo feminino inclui qualquer tecido que é ne-cessário para o desenvolvimento de gametas femininos para fertilidade (istoé, que têm a capacidade de ser fertilizados por um gameta masculino, maispreferivelmente que têm a capacidade de produzir uma semente completa-mente desenvolvida (seja viável ou estéril), e em muitas modalidades o maispreferivelmente tendo a habilidade de produzir semente de progênie viávelcapaz de ser germinada e desenvolvida em uma planta de progênie normal).Tecido reprodutivo feminino inclui, por exemplo óvulos ou gametas femininosem qualquer estágio de desenvolvimento, estigmas, pistilos, e outras partesflorais femininas, revestimentos de semente, frutos, raques, espigas, ou ou-tros tecidos nutritivos, de suporte ou protetores, e qualquer outra estruturaenvolvida na capacidade de uma planta parental feminina ser fertilizada poruma planta parental masculina, produzir uma semente completamente de-senvolvida, ou produzir uma semente de progênie viável. Em certas modali-dades, esterilidade resulta em falha de um óvulo fertilizado se desenvolverpara uma semente viável, e "tecido reprodutivo" refere-se a um óvulo fertili-zado (por exemplo, um zigoto ou um embrião de qualquer estágio de desen-volvimento, ou os tecidos maternos necessários para o desenvolvimento deum óvulo fertilizado em uma semente tal como um endosperma ou outrostecidos nutritivos).
miRNA maduro: por "miRNA maduro" entende-se o pequenoRNA ("microRNA") processado a partir de um precursor de miRNA (por e-xemplo, primRNA ou pré-miRNA), que é capaz de reconhecer e se ligar auma seqüência específica ("sítio de reconhecimento de miRNA") dentro deum transcrito de RNA, e guiar a clivagem daquele transcrito. miRNAs madu-ros preferidos incluem miRNAs maduros que são expressos especificamenteno tecido reprodutivo de uma planta. Em uma modalidade não Iimitante dainvenção, o miRNA maduro é um miRNA de uma planta de cultivo, tal comomiRNA de milho ou um miRNA de soja. Exemplos não Iimitantes de miRNAsúteis nessa invenção são fornecidos nos Exemplos de trabalho e incluem,mas não são limitados, aos miRNAs identificados nas Tabelas 1, 2, 3, 4, 5 e6, incluindo os miRNAs que têm SEQ ID NO. 297, SEQ ID NO. 302, SEQ IDNO. 314, SEQ ID NO. 319, SEQ ID NO. 323, SEQ ID NO. 328, SEQ ID NO.333, ou SEQ ID NO. 338.
Sítios de reconhecimento de miRNA: o constructo de DNA re-combinante transcreve RNA que inclui um ou mais sítios de reconhecimentode miRNA exógenos, que podem ser uma ou mais cópias do mesmo sítio dereconhecimento de miRNA exógeno ou uma ou mais copias de diferentessítios de reconhecimento de miRNA exógeno. O sítio de reconhecimento demiRNA exógeno pode estar localizado em qualquer local no RNA transcritoonde, quando o miRNA maduro não está presente, a transcrição produz umRNA mensageiro que é traduzível para a proteína de tolerância a herbicidadesejada, e onde o miRNA maduro está presente, o miRNA maduro se ligaao transcrito de RNA e suprime a expressão do RNA mensageiro. Um oumais sítios de reconhecimento de miRNA exógenos podem estar localizadosem regiões codificantes ou em regiões não codificantes do RNA mensageiro.
Em várias modalidades, o sítio de reconhecimento de miRNA exógeno estálocalizado dentro de pelo menos um de (a) uma região a 5' da seqüênciacodificante do RNA mensageiro; (b) uma região a 3' da seqüência codifican-te do RNA mensageiro; e (c) o RNA mensageiro. Em uma modalidade prefe-rida, o pelo menos um sítio de reconhecimento de miRNA está localizado naregião 3' não traduzida do RNA mensageiro. Em várias modalidades, o cons-tructo de DNA recombinante ainda inclui pelo menos um elemento selecio-nado a partir de: (a) um promotor de planta; (b) um elemento de supressãogênica; (c) um íntron; (d) um elemento de expressão gênica; (e) DNA quetranscreve um aptâmero de RNA capaz de se ligar a um ligante; (f) DNA quetranscreve um aptâmero de RNA capaz de se ligar a um ligante e DNA quetranscreve RNA regulatório capaz de regular a expressão de uma seqüênciaalvo, caracterizado em que a regulação é dependente da conformação doRNA regulatório, e a conformação do RNA regulatório é afetada alosterica-mente pelo estado de ligação do aptâmero de RNA, e (g) pelo menos umaborda de T-DNA. Esses elementos adicionais são descritos em detalhe abai-xo sob o título "Plantas Transgênicas Indutivamente Estéreis que Contêmum Constructo de DNA Recombinante".
Qualquer sítio de reconhecimento de miRNA que é reconhecidopor um miRNA maduro que tem o padrão de expressão desejado (isto é,expressão específica em tecido reprodutivo masculino ou feminino) é útil emmodalidades dessa invenção. Múltiplos sítios de reconhecimento de miRNApodem ser usados para suprimir especificamente a expressão da proteínaem uma combinação desejada de tecidos reprodutivos. Por exemplo, umconstructo de DNA recombinante pode incluir múltiplos sítios de reconheci-mento, em que cada um dos quais é reconhecido por um miRNA que temexpressão específica em um tecido reprodutivo masculino (ou feminino) dife-rente (por exemplo, um miRNA expresso em pólen e um miRNA expresso nopendão). A seleção de um miRNA maduro apropriado ou seu sítio de reco-nhecimento de miRNA correspondente é realizada por métodos conhecidosdos versados na técnica, incluindo aqueles ilustrados em detalhe nos exem-plos de trabalho fornecidos aqui. Métodos incluem clonagem de moléculasde miRNA maduro ou precursoras de miRNA (pré-miRNAs, primRNAs) deplantas inteiras ou sementes ou de tecidos selecionados, informação demiRNA baseada em bioinformática, Southern blots de miRNA ou moléculasprecursoras de miRNA, determinar os padrões de expressão de promotor demiRNA, etc. Em modalidades não limitantes, o sítio de reconhecimento demiRNA é reconhecido por um miRNA maduro derivado da estrutura de "fold-back" de uma seqüência de MIR identificada nas Tabelas 1 até 6; particu-larmente preferidos são os sítios de reconhecimento de miRNA reconheci-dos pelos miRNAs maduros identificados na Tabela 6.
Clivagem de um transcrito de RNA alvo e a subseqüente su-pressão do RNA alvo é dependente de pareamento de base entre o miRNAmaduro e seu sítio de reconhecimento de miRNA cognato. Dessa forma, opelo menos um sítio de reconhecimento de miRNA exógeno é desenhadopara ter complementaridade de seqüência suficiente ao miRNA maduro parapermitir o reconhecimento e ligação pelo miRNA maduro. Em plantas, com-plementaridade de seqüência de um miRNA e seu sítio de reconhecimento étipicamente alta, por exemplo, complementaridade perfeita entre 19, 20 ou21 de 22 nucleotídeos (no caso de um miRNA maduro que tem 21 nucleotí-deos de extensão), isto é, complementaridade de cerca de 90% ou mais. Umgrau similar de complementaridade é preferível para sítios de reconhecimen-to para miRNAs de planta de qualquer extensão (por exemplo, 20, 21, 22,23, e 24 nucleotídeos). Os requisitos de seqüência para ligação de miRNAmaduro a um sítio de reconhecimento, e métodos para prever ligação demiRNA a uma dada seqüência, são discutidos, por exemplo, em Llave et al.(2002) Science, 297:2053-2056, Rhoades et al. (2002) Cell, 110:513-520,Jones-Rhoades and Bartel (2004) Mol. Cell, 14:787-799, Schwab et a/(2005)Developmental Cell, 8:517-527, e Xie et al. (2005) Plant Physiol., 138:2145-2154. Quando se desenha um sítio de reconhecimento de miRNA assim co-mo sua localização exata em, ou adjacente a, um RNA mensageiro, tambémé preferível evitar seqüências que têm características indesejáveis, tais se-qüências codificando polipeptídeos indesejáveis, conforme descrito abaixosob o título "Genes Alvo". Ao desenhar RNA mensageiro como um transge-ne a ser expresso, a introdução não intencional de um sítio de reconheci-mento de miRNA exógeno é evitada onde supressão por um miRNA maduronão é desejada.
Expressão específica: por "especificamente expresso em tecidoreprodutivo" entende-se que o miRNA maduro é transcrito em tecido repro-dutivo em um nível suficiente para permitir que o miRNA suprima especifi-camente a expressão da proteína no tecido reprodutivo, isto é, suprima es-pecificamente a expressão no tecido reprodutivo da proteína que conferetolerância a um herbicida, mas não suprima substancialmente a expressãoda mesma proteína em tecidos diferentes dos tecidos reprodutivos. Supres-são substancial de expressão inclui pelo menos 30, pelo menos 50, pelomenos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 85, pelo menos 90,pelo menos 95, ou pelo menos 98 por cento de supressão de expressão, emrelação aquela em células de controle (isto é, células que incluem um cons-tructo de DNA recombinante análogo, por exemplo, um constructo de DNArecombinante que transcreve RNA que inclui o mesmo RNA mensageiro quecodifica uma proteína que confere tolerância a um herbicida, mas que nãoinclui um sítio de reconhecimento de RNA exógeno reconhecível pelo miR-NA maduro especificamente expresso no tecido reprodutivo da planta). Emmodalidades preferidas, o miRNA maduro suprime especificamente a ex-pressão da proteína no tecido reprodutivo para um grau suficiente para re-sultar em esterilidade do tecido reprodutivo quando o herbicida é aplicado.Aqueles versados na técnica reconhecem que, em certos casos, tolerância aum herbicida pode ser adequadamente obtida em níveis de expressão mo-derados ou mesmo baixos de uma proteína de tolerância a herbicida. Por-tanto, não é uma exigência que o miRNA maduro esteja completamente au-sente em tecidos diferentes do tecido reprodutivo, nem é uma exigência quea expressão da proteína de tolerância ao herbicida esteja completamentesuprimida no tecido reprodutivo.
Proteína que confere tolerância a herbicida: qualquer proteínaque confere tolerância para uma planta a um herbicida pode ser usada. Emmuitas modalidades, o herbicida é um herbicida sistêmico. Exemplos nãoIimitantes de herbicidas úteis em aspectos dessa invenção incluem os herbi-cidas glifosato, dicamba, glufosinato, sulfoniluréias, imidazolinonas, bromo-xinil, dalapon, dicamba, cicloezanodiona, inibidores de protoporfirinogêniooxidase, e isoxaflutol. Exemplos não Iimitantes de proteínas que conferemtolerância ao glifosato incluem 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato-sintase("EPSPS" ou "aroA", vide Patentes U. S. números 5.627.061, 5.633.435,6.040.497, e 5.094.945), glifosato oxidorredutase ("GOX", vide Patente U.S.Número 5.463.175), glifosato descarboxilase (vide Publicação de Pedido dePatente U. S. 2004/0177399), glifosato N-acetil transferase ("GAT", vide Pu-blicação de Pedido de Patente U. S. 2003/0083480) ou qualquer outro geneque forneça resistência ao glifosato. Uma modalidade particularmente prefe-rida é "epsps-cp4" ou 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase da cepa CP4de Agrobacterium tumefaciens; Patente U.S. número 5.633.435 descreveseqüências de ácido nucléico e seqüências de aminoácido de epsps-cp4,vetores de transformação que contêm esse gene, e métodos de fazer plan-tas resistentes ao glifosato. Exemplos não Iimitantes de proteínas que confe-rem tolerância a outros herbicidas incluem dicamba monooxigenase, queconfere tolerância a herbicidas semelhantes a auxina tal como dicamba (videPublicações de Pedido de Patente U. S. 2003/0115626, 2003/0135879); fos-finotricina acetiltransferase ("pat" ou "bai"), que confere tolerância a fosfino-tricina ou glufosinato (vide Patente U. S. Números 5.646.024. 5.561.236.5.276.268 5.637.489, e US 5.273.894; vide também Pedido de Patente Eu-ropeu EP 275.957;); ácido 2,2-dicloropropiônico desalogenase, que conferetolerância ao ácido 2,2-dicloropropiônico ("Dalapon") (vide Publicação dePatente PCT W099/27116); acetoidroxiácido sintase ou acetolactato sintase,que confere tolerância a inibidores de acetolactato sintase tais como sulfoni-luréia, imidazolinona, triazolopirimidina, pirimidiloxibenzoatos, e ftalídeo (videPatentes U. S. números 6.225.105, 5.767.366, 4.761.373, 5.633.437,6.613.963, 5.013.659, 5.141.870, 5.378.824 e 5.605.011); haloarilnitrilase("Bxn"), que confere tolerância ao bromoxinil (vide Patente U. S. número4.810.648; vide também Publicações de Pedido de Patente PCTW089/00193 e WQ87/04181A1); acetil-coenzima A carboxilase modificada,que confere tolerância a cicloexanodiona ("setoxidim") e ariloxifenoxipropio-nato ("haloxifop") (vide Patente U. S. número 6.414.222); diidropteroato sin-tase ("sul I"), que confere tolerância a herbicidas de sulfonamida (vide Paten-te U.S. Números 5.597.717, 5.633.444, e 5.719.046); polipeptídeo de fotos-sistema Il de 32 kDa ("psbA"), que confere tolerância a herbicidas de triazina(vide Hirschberg et al. (1983) Science, 222:1346-1349); antranilato sintase,que confere tolerância a 5-metiltriptofano (vide Patente U. S. número4.581.847); ácido diidrodipicolínico sintase ("dap A"), que confere tolerânciaa aminoetil cisteína (vide Publicação de Pedido de Patente PCTW089/11789); fitoeno desaturase ("crtí), que confere tolerância a herbicidasde piridazinona tais como norflurazon (vide Publicação de Patente JaponesaJP06343473); hidroxifenil piruvato dioxigenase, que confere tolerância aherbicidas de ciclopropilisoxazol tal como isoxaflutol (vide Patente U. S. nú-mero 6.268.549; vide também Publicação de Pedido de Patente PCTW096/38567); protoporfirinogênio oxidase I modificada ("protox"), que confe-re tolerância a inibidores de protoporfirinogênio oxidase (vide Patente U. S.número 5.939.602); ariloxialcanoato dioxigenase ("AAD-1"), que confere tole-rância a um herbicida que contém uma porção de ariloxialcanoato (vide Pu-blicação de Pedido de Patente PCT W005/107437), exemplos de tais herbi-cidas incluem fenóxi auxinas (tais como 2,4-D e diclorprop), piridilóxi auxinas(tais como fluroxipir e triclopir), inibidores de ariloxifenoxipropionatos (AOPP)acetilcoenzima A carboxilase (ACCase), (tais como haloxifop, quizalofop, ediclofop) e inibidores de fenoxiacetato protoporfirinogênio oxidase IX 5-modificados (tais como piraflufen e flumiclorac).
Combinações de plantas parentais: o método dessa invençãopode ser executado usando várias combinações das primeiras plantas pa-rentais e segundas plantas parentais. Em muitas modalidades do método, asegunda planta parental é tolerante ao primeiro herbicida; por exemplo, asegunda planta parental pode conter no seu genoma um transgene que con-fere tolerância ao primeiro herbicida. Essa invenção abrange modalidadesdo método em que: (a) o tecido reprodutivo é tecido reprodutivo masculino, aprimeira planta parental é indutivamente macho estéril, e a segunda plantaparental é normalmente fértil; ou (b) o tecido reprodutivo é tecido reprodutivomasculino, a primeira planta parental é indutivamente macho-estéril, e a se-gunda planta parental é fêmea-estéril; ou (c) o tecido reprodutivo é tecidoreprodutivo masculino, a primeira planta parental é indutivamente macho-estéril, e a segunda planta parental é indutivamente fêmea-estéril; ou (d) otecido reprodutivo é tecido reprodutivo feminino, a primeira planta parental éindutivamente fêmea-estéril, e a segunda planta parental é normalmente fe-til; ou (e) o tecido reprodutivo é tecido reprodutivo feminino, a primeira plantaparental é indutivamente fêmea-estéril, e a segunda planta parental é machoestéril; ou (f) o tecido reprodutivo é tecido reprodutivo feminino, a primeiraplanta parental é indutivamente fêmea-estéril, e a segunda planta parental éindutivamente macho-estéril.
Em uma modalidade do método, o tecido reprodutivo é tecidoreprodutivo masculino, a primeira planta parental é indutivamente macho-estéril, e a segunda planta parental inclui uma segunda planta parentaltransgênica, indutivamente fêmea-estéril contendo no seu genoma um cons-tructo de DNA recombinante que transcreve RNA que inclui: (i) pelo menosum sítio de reconhecimento de miRNA exógeno reconhecível por um segun-do miRNA maduro que é especificamente expresso em tecido reprodutivofeminino da segunda planta parental; e (ii) um segundo RNA mensageiroque codifica uma segunda proteína que confere tolerância a um segundoherbicida; em que o segundo miRNA maduro suprime especificamente a ex-pressão da segunda proteína no tecido reprodutivo feminino, e em que afêmea esterilidade da segunda planta parental é induzível pela aplicação dosegundo herbicida a segunda planta parental. Em outra modalidade, o tecidoreprodutivo é tecido reprodutivo feminino, a primeira planta parental é induti-vamente fêmea estéril, e a segunda planta parental inclui uma segunda plan-ta parental transgênica, indutivamente macho estéril que contém no seu ge-noma um constructo de DNA recombinante que transcreve RNA que inclui:(i) pelo menos um sítio de reconhecimento de miRNA exógeno reconhecívelpor um segundo miRNA maduro que é especificamente expresso em tecidoreprodutivo masculino da segunda planta parental; e (ii) um segundo RNAmensageiro que codifica uma segunda proteína que confere tolerância a umsegundo herbicida, em que o segundo miRNA maduro suprime especifica-mente a expressão da segunda proteína no tecido reprodutivo masculino, eem que a macho esterilidade da segunda planta parental é induzível pelaaplicação do segundo herbicida a segunda planta parental. Nessas modali-dades, o primeiro e segundo RNAs mensageiros podem ser idênticos, oupodem ser diferentes. Nessas modalidades, o primeiro herbicida e o segun-do herbicida podem ser idênticos ou podem ser diferentes. Em alguns casos,pelo menos um do primeiro herbicida e do segundo herbicida inclui um her-bicida sistêmico. Em modalidades preferidas, pelo menos um do primeiroherbicida e do segundo herbicida inclui pelo menos um herbicida seleciona-do a partir do grupo que consiste em glifosato, dicamba, glufosinato, sulfoni-luréias, imidazolinonas, bromoxinil, ácido 2,2-dicloropropiônico, inibidores deacetolactato sintase, cicíoezanodiona, ariloxifenoxipropionato, herbicidas desulfonamida, herbicidas dé triazina, 5-metiltriptofano, aminoetil cisteína, her-bicidas de piridazinona, herbicidas de ciclopropilisoxazol, inibidores de pro-toporfirinogênio oxidase, e herbicidas que contêm uma porção de ariloxial-canoato.
Em uma modalidade do método, a primeira planta parental éuma planta transgênica indutivamente estéril que contém no seu genoma umconstructo de DNA recombinante que transcreve RNA que inclui: (i) pelomenos um sítio de reconhecimento de miRNA exógeno reconhecível por ummiRNA maduro que é especificamente expresso em tecido reprodutivo mas-culino da planta; e (ii) RNA mensageiro que codifica uma proteína que confe-re tolerância a um herbicida, em que o miRNA maduro suprime especifica-mente a expressão da proteína no tecido reprodutivo masculino, e em que amacho esterilidade da planta transgênica é induzível pela aplicação do her-bicida à planta, e a segunda planta parental é normalmente fértil. Para indu-zir macho esterilidade da primeira planta parental, o herbicida é preferivel-mente aplicado sob um regime que resulta na incapacidade da primeira plan-ta parental produzir gametas masculinos (ou as estruturas reprodutivas mas-culinas) necessárias para fertilização normal da segunda planta parental. Emtais modalidades, a segunda planta parental é geralmente tolerante aomesmo herbicida usado para induzir macho esterilidade da primeira plantaparental, e assim a primeira e segunda plantas parentais podem ser tratadascom o mesmo herbicida, preferivelmente simultaneamente (por exemplo,juntas em um campo). Um cruzamento da primeira e segunda plantas paren-tais produz semente que é o resultado de polinização da primeira planta pa-rental pela segunda planta parental.
Em outra modalidade do método, a primeira planta parental éuma planta transgênica indutivamente estéril que contém no seu genoma umconstructo de DNA recombinante que transcreve RNA que inclui: (i) pelomenos um sítio de reconhecimento de miRNA exógeno reconhecível por ummiRNA maduro; e (ii) um RNA mensageiro que codifica uma proteína queconfere tolerância a um herbicida, em que o miRNA maduro suprime especi-ficamente a expressão da proteína no tecido reprodutivo feminino ou no óvu-lo fertilizado, e em que a fêmea esterilidade da planta transgênica é induzívelpela aplicação do herbicida à planta, o herbicida é preferivelmente aplicadosob um regime que resulta, por exemplo, na incapacidade da primeira plantaparental produzir gametas femininos capazes de ser fertilizados, ou na inca-pacidade de produzir uma semente completamente desenvolvida (seja viávelou estéril), ou a incapacidade de produzir semente de progênie viável capazde ser germinada e se desenvolver em uma planta de progênie normal. Emtais modalidades, a segunda planta parental é geralmente tolerante aomesmo herbicida usado para induzir fêmea esterilidade da primeira plantaparental, e assim a primeira e segunda plantas parentais podem ser tratadascom o mesmo herbicida, preferivelmente simultaneamente. Um cruzamentoda primeira e segunda plantas parentais produz semente que é o resultadode polinização da segunda planta parental pela primeira planta parental.
Outro aspecto da invenção fornece um método para produziruma semente híbrida não natural, que inclui as etapas de: (a) fornecer umaprimeira planta parental que inclui uma planta transgênica cultivada a partirde uma primeira célula de planta transgênica (por exemplo, uma primeiracélula de milho transgênica) que contém no seu genoma um primeiro cons-tructo de DNA recombinante que transcreve RNA que inclui: (i) pelo menosum sítio de reconhecimento de miRNA exógeno reconhecível por um primei-ro miRNA maduro, e (ii) um primeiro RNA mensageiro que codifica uma pro-teína que confere tolerância a um primeiro herbicida, em que o primeiromiRNA maduro é especificamente expresso em tecido reprodutivo masculinoda primeira planta parental, assim suprimindo especificamente a expressãoda proteína no tecido reprodutivo masculino, e em que a macho esterilidadeda primeira planta parental é induzível pela aplicação do primeiro herbicida aprimeira planta parental; (b) fornecer uma segunda planta parental que incluiuma planta transgênica cultivada a partir de uma segunda célula de plantatransgênica (por exemplo, uma segunda célula de milho transgênica) quecontém no seu genoma um segundo constructo de DNA recombinante quetranscreve RNA que inclui: (i) pelo menos um sítio de reconhecimento demiRNA exógeno reconhecível por um segundo miRNA maduro, e (ii) um pri-meiro RNA mensageiro que codifica uma proteína que confere tolerância aum segundo herbicida, em que o segundo miRNA maduro é especificamenteexpresso em tecido reprodutivo feminino da segunda planta parental, assimsuprimindo especificamente a expressão da proteína no tecido reprodutivofeminino, e em que a fêmea esterilidade da segunda planta parental é indu-zível pela aplicação do segundo herbicida a segunda planta parental; (c) a-plicar o primeiro herbicida e o segundo herbicida às plantas parentais, assiminduzindo macho esterilidade na primeira planta parental e fêmea esterilida-de na segunda planta parental; (d) cruzar a primeira e segunda plantas pa-rentais, em que óvulos da primeira planta parental são polinizados por pólenda segunda planta parental, assim produzindo semente híbrida não natural(por exemplo, semente de milho híbrida não natural).
Ao praticar qualquer um dos métodos para produzir sementehíbrida, "cultivado" refere-se a cultivar uma planta transgênica por regenera-ção direta a partir da primeira célula de planta transgênica ou cultivar umaplanta de progênie transgênica da planta transgênica regenerada. Métodospara regenerar diretamente uma planta transgênica a partir de uma célula deplanta transgênica, ou para cultivar plantas de progênie transgênicas (inclu-indo plantas de progênie natural e plantas de progênie híbrida) são bem-conhecidas na técnica, e são descritas aqui sob o titulo "Fazendo e UsandoCélulas de Planta Transgênicas e Plantas Transgênicas".
O segundo RNA mensageiro pode ser o mesmo ou pode ser di-ferente do primeiro RNA mensageiro. Em várias modalidades, o primeiroRNA mensageiro e o segundo RNA mensageiro (a) são idênticos; ou (b) sãodiferentes e codificam segmentos diferentes da proteína; (c) são diferentes ecodificam segmentos de proteínas diferentes. Em modalidades preferidas, oprimeiro e segundo RNA mensageiros (sejam os mesmos ou diferentes) con-ferem tolerância ao mesmo herbicida, o que fornece a conveniência de tratarum campo da primeira e segunda plantas parentais misturadas com um úni-co herbicida; quando necessário, o herbicida é aplicado em um ou maismomentos a fim de induzir macho esterilidade da primeira planta parental efêmea esterilidade da segunda planta parental. Em alguns casos, o primeiroRNA mensageiro codifica uma primeira proteína que confere tolerância a umherbicida, e o segundo RNA mensageiro codifica uma segunda proteína dife-rente, que confere tolerância ao mesmo herbicida; um exemplo não Iimitanteé onde a primeira e segunda proteínas são selecionadas a partir de um gru-po (incluindo 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase, glifosato acetiltransfe-rase e glifosato descarboxilase) em que todos conferem tolerância ao glifo-sato. Em outras modalidades, o primeiro e o segundo RNA mensageirosconferem tolerância a dois herbicidas diferentes, e preferivelmente a primeirae a segunda plantas parentais contêm ambas no seu genoma DNA que codi-fica duas proteínas, cada uma conferindo tolerância a um dos dois herbici-das, permitindo que um campo da primeira e segunda plantas parentais sejatratado com os dois herbicidas (simultaneamente ou separadamente). Emvárias modalidades do método o primeiro herbicida e o segundo herbicida(a) são idênticos; (b) são diferentes (em que a primeira e a segunda plantasparentais preferivelmente têm tolerância tanto ao primeiro como ao segundoherbicida).
Regimes de aplicação de herbicida são usados por meio dosquais esterilidade induzível é obtida preferivelmente sem perda de campo ououtros resultados indesejáveis. Aplicação(ões) de herbicida (é)são reguladasa fim de induzir esterilidade. Em um exemplo análogo, uma linhagem de al-godão transgênico (RR1445) que contém EPSPS sob o controle de um pro-motor constitutivo de FMV 35S, foi descoberto ter alta expressão de EPSPSna maioria dos tecidos vegetativos, mas baixa expressão de EPSPS em cer-tos tipos de tecido reprodutivos masculinos (células mãe de pólen, gametófi-tos masculinos, e tapetum); aplicações de glifosato após o estágio de quatrofolhas resulta em esterilidade masculina (vide, Chen et al. (2006) Plant Bio-technol. J., 4:477-487, publicado antecipadamente online em 7 de junho de2006, doi: 10.1111/j.1467-7652.2006.00203.x).
Em modalidades preferidas, o método é útil para produzir se-mente híbrida não natural de uma planta de cultivo propagada por semente,tal como aquelas descritas sob o título "Fazendo e Usando Células de PlantaTransgênicas e Plantas Transgênicas", por exemplo, milho, arroz, trigo, a-veia, cevada, centeio, triticale, painço, sorgo, quinoa, amaranto, trigo sarra-ceno, grama de forragem, turfa, alfafa, algodão, açafroa, girassol, soja, cano-la, colza, linho, amendoim, feijão, ervilha, lentilha, alfafa, alface, aspargo,alcachofra, aipo, cenoura, rabanete, repolho, couve galega, mostarda, bróco-lis, couve flor, couve de Bruxelas, nabo, couve rábano, pepino, melões, abó-bora moranga, abobora menina, cebola, alho-poró, chalotas, cebolinha, to-mate, berinjela, pimenta, fisális, beterraba, acelga, espinafre, plantas orna-mentais, e árvores florestais. Em uma modalidade particularmente preferida,a semente híbrida não natural é semente de milho. Semente híbrida não na-tural produzida usando atividade humana que inclui qualquer uma das moda-lidades do método são especificamente adicionalmente reivindicadas.
PLANTAS TRANSGÊNICAS INDUTIVAMENTE ESTÉREIS CONTENDO UMCONSTRUCTO DE DNA RECOMBINANTE
Um aspecto independente dessa invenção inclui uma plantatransgênica indutivamente estéril que contém no seu genoma um constructode DNA recombinante que transcreve RNA que inclui: (a) pelo menos umsítio de reconhecimento de miRNA exógeno reconhecível por um miRNAmaduro que é especificamente expresso em tecido reprodutivo da planta; e(b) RNA mensageiro que codifica uma proteína que confere tolerância a umherbicida, em que o miRNA maduro suprime especificamente a expressãoda proteína no tecido reprodutivo, e em que a esterilidade da segunda plantaparental é induzível pela aplicação do herbicida à planta. Em uma modalida-de, o tecido reprodutivo é tecido reprodutivo masculino e a esterilidade émacho esterilidade. Em outra modalidade, o tecido reprodutivo é tecido re-produtivo feminino e a esterilidade é fêmea esterilidade. Em uma modalidadeadicional, o tecido reprodutivo é tecido reprodutivo inclui um óvulo fertilizado,e a esterilidade resulta na falha de óvulo fertilizado se desenvolver para umasemente viável.
Em modalidades preferidas, a planta transgênica indutivamenteestéril é uma planta de cultivo propagada por semente, por exemplo, milho,milho, arroz, trigo, aveia, cevada, centeio, triticale, painço, sorgo, quinoa,amaranto, trigo sarraceno, grama de forragem, turfa, alfafa, algodão, açafro-a, girassol, soja, canola, colza, linho, amendoim, feijão, ervilha, lentilha, alfa-fa, alface, aspargo, alcachofra, aipo, cenoura, rabanete, repolho, couve ga-lega, mostarda, brócolis, couve flor, couve de Bruxelas, nabo, couve rábano,pepino, melões, abóbora moranga, abobora menina, cebola, alho, alho-poró,chalotas, cebolinha, tomate, berinjela, pimenta, fisális, beterraba, acelga,espinafre, plantas ornamentais, e árvores florestais.
Constructos de DNA Recombinantes: a planta transgênica indu-tivamente estéril, fornecida por essa invenção tem no seu genoma um cons-tructo de DNA recombinante que transcreve RNA que inclui: (a) pelo menosum sítio de reconhecimento de miRNA exógeno que transcreve RNA queinclui: (a) pelo menos um sítio de reconhecimento de miRNA exógeno reco-nhecível por um miRNA maduro que é especificamente expresso em tecidoreprodutivo da planta; e (b) RNA mensageiro que codifica uma proteína queconfere tolerância a um herbicida, em que o miRNA maduro suprime especi-ficamente a expressão da proteína no tecido reprodutivo, e em que a esteri-lidade da segunda planta parental é induzível pela aplicação do herbicida àplanta. Esse constructo de DNA recombinante é útil para fazer cromossomosde planta, células, plantas e sementes transgênicos, que contêm tal cons-tructo, todos os quais são particularmente úteis para a produção de sementehíbrida.
Em várias modalidades dessa invenção, incluindo modalidadesda planta transgênica indutivamente estéril, o constructo de DNA recombi-nante ainda inclui pelo menos um elemento selecionado a partir de: (a) umpromotor de planta; (b) um elemento de supressão gênica; (c) um íntron; (d)um elemento de expressão gênica; (e) DNA que transcreve um aptâmero deRNA capaz de se ligar a um Iigante (f) DNA que transcreve um aptâmero deRNA capaz de se ligar a um Iigante e DNA que transcreve RNA regulatóriocapaz de regular a expressão de um gene alvo, caracterizado em que a re-gulação é dependente da conformação do RNA regulatório, e a conformaçãodo RNA regulatório é afetada alostericamente pelo estado de ligação do ap-tâmero de RNA, e (g) pelo menos uma borda de T-DNA. Esses e outros e-lementos (por exemplo, terminadores e DNA espaçador) úteis nessa inven-ção são descritos em detalhe abaixo sob os títulos "Promotores"; "Elementosde Supressão Gênica", "íntrons", "Elementos de Expressão Gênica", "Aptâ-meros", "Ligantes", "RNA regulatório", "Bordas de T-DNA". Terminadores", e"DNA espaçador" e em outros locais nessa descrição. Exemplos não Iimitan-tes de como esses vários elementos podem ser dispostos estão descritosnas Figuras 1 e 2. Técnicas para fazer e usar constructos de DNA recombi-nantes da invenção, para fazer células de planta transgênicas que contémos constructos de DNA recombinantes e plantas, sementes e plantas de pro-gênie transgênicas derivadas delas, e para testar os efeitos de transcreveros constructos de DNA recombinantes, são descritos em detalhe sob os títu-los "Fazendo e Usando Constructos de DNA Recombinantes", "Fazendo eUsando Células de Planta Transgênicas e Plantas Transgênicas" e em ou-tros locais nessa descrição.
Promotores: geralmente, o constructo de DNA recombinante in-clui um promotor operativamente ligado ao DNA capaz de ser transcrito.Promotores adequados incluem qualquer promotor que é capaz de transcre-ver DNA na célula de planta onde a transcrição é desejada. Promotores nãoconstitutivos adequados para uso com os constructos de DNA recombinan-tes da invenção incluem promotores espacialmente específicos, promotorestemporalmente específicos e promotores induzíveis. Promotores espacial-mente específicos podem incluir promotores organela-, célula-, tecido-, ouórgão-específícos funcionais em uma planta (por exemplo, um promotorplastídeo-específico, raiz-específico, pólen-específico, ou semente-espe-cífico para suprimir a expressão do primeiro RNA alvo em plastídeos, raízes,pólen, ou sementes, respectivamente). Em muitos casos, um promotor se-mente-específico, embrião-específico, aleurona-específico, ou endosperma-específico é especialmente útil. Promotores temporalmente específicos po-dem incluir promotores que tendem a promover expressão durante certosestágios de desenvolvimento no crescimento ou ciclo reprodutivo de umaplanta, ou durante momentos diferentes do dia e da noite, ou em diferentesestações em um ano. Promotores induzíveis incluem promotores induzidospor químicos (por exemplo, químicos exógenos ou sintéticos assim comoferormônios endógenos e outras moléculas de sinalização) ou por condiçõesambientais tais como, mas não limitadas a, estresse biótico ou abiótico (porexemplo, falta de água ou seca, calor, frio, níveis de nutriente ou sal altos oubaixos, níveis de luz altos ou baixos, ou infecção por praga ou patógeno).Um promotor expressão-específico também pode incluir promotores que sãogeralmente expressos constitutivamente mas em graus ou "forças" diferen-tes de expressão, incluindo promotores comumente tidos como "promotoresfortes" ou como "promotores fracos". Pelo fato do sítio de reconhecimento demiRNA fornecer controle de expressão tecido-seletiva do RNA mensageiro,em muitas modalidades preferidas o promotor é simplesmente um promotorconstitutivo.
Exemplos específicos não Iimitantes de promotores úteis emplantas incluem um promotor de opalina sintase isolado de T-DNA de Agro-bacterium, e um promotor 35S de vírus do mosaico da couve flor, entre ou-tros, assim como elementos promotores intensificados ou elementos promo-tores quiméricos, por exemplo, um promotor 35S de vírus do mosaico dacouve flor (CaMV) intensificado ligado a um elemento intensificador (um ín-tron da proteína de choque térmico 70 de Zea mays). Muitos promotores ex-pressão-específicos funcionais em plantas e úteis em aspectos da invençãosão conhecidos na técnica. Por exemplo, Patentes U.S. 5.837.848;6.437.217 e 6.426.446 descrevem promotores específicos de raiz; PatenteU.S. 6.433.252 descreve um promotor de oleosina L3 de milho; a Publicaçãode Pedido de Patente U.S. 2004/0216189 descreve um promotor para umgene nuclear de planta que codifica uma aldolase localizada em plastídeo;Patente U.S. 6.084.089 descreve promotores induzíveis pelo frio; PatenteU.S. número 6.140.078 descreve promotores induzíveis por sal; Patente U.S.6.294.714 descreve promotores induzíveis por luz; Patente U.S. 6.252.138descreve promotores induzíveis por patógeno; e Publicação de Pedido dePatente U.S. 2004/0123347 A1 descreve promotores induzíveis por falta deágua.
O elemento promotor pode incluir seqüências de ácido nucléicoque são promotores ou elementos promotores ou homólogos desses de o-corrência não natural, mas que podem regular a expressão de um gene. E-xemplos de tais seqüências regulatórias "independentes de gene" incluemseqüências de RNA de ocorrência natural ou desenhadas artificialmente queincluem uma região de ligação a um Iigante ou aptâmero e uma região regu-latória (que pode ser cis-atuante ou transatuante). Vide, por exemplo, Isaacset al. (2004) Nat. Biotechnol., 22:841-847, Bayer & Smolke (2005) NatureBiotechnol., 23:337-343, Mandai & Breaker (2004) Nature Rev. MoL Cell Bi-ol., 5:451-463, Davidson & Ellington (2005) Trends Biotechnol., 23:109-112,Winkler et aí. (2002) Nature, 419:952-956, Sudarsan et al. (2003) RNA,9:644-647, e Mandai & Breaker (2004) Nature Struct. Mol. Biol., 11:29-35.Tais "riboreguladores" poderiam ser selecionados ou desenhados para es-pecificidade espacial ou temporal específica, por exemplo, para regular atradução do gene exógeno apenas na presença (ou ausência) de uma dadaconcentração do Iigante apropriado.
Elementos de supressão qênica: o elemento de supressão gêni-ca pode ser DNA capaz de ser transcrito de qualquer extensão adequada, eincluirá geralmente pelo menos cerca de 19 a cerca de 27 nucleotídeos (porexemplo, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 nucleotídeos) para cada gene alvo que oconstructo de DNA recombinante é planejado para suprimir. Em muitas mo-dalidades o elemento de supressão gênica inclui mais do que 23 nucleotí-deos (por exemplo, mais do que cerca de 30, cerca de 50, cerca de 100,cerca de 200, cerca 300, cerca de 500, cerca de 1000, cerca de 1500, cercade 2000, cerca de 3000, cerca de 4000, ou cerca de 5000 nucleotídeos) paracada gene alvo que o DNA recombinante é planejado para suprimir. Genesalvo são descritos sob o título "Genes Alvo".
Elementos de supressão gênica adequados úteis nos construc-tos de DNA recombinantes da invenção incluem pelo menos um elemento(e, em algumas modalidades, múltiplos elementos) selecionados a partir dogrupo que consiste em:(a) DNA que inclui pelo menos segmento de DNA anti-sentidoque é anti-sentido a pelo menos um segmento de pelo menos um primeirogene alvo;
(b) DNA que inclui múltiplas cópias de pelo menos um seg-mento de DNA anti-sentido que é anti-sentido a pelo menos um segmento depelo menos um primeiro gene alvo;
(c) DNA que inclui pelo menos um segmento de DNA sentidoque é pelo menos um segmento de pelo menos um primeiro gene alvo;
(d) DNA que inclui múltiplas cópias de pelo menos um seg-mento de DNA sentido que é pelo menos um segmento de pelo menos umprimeiro gene alvo;
(e) DNA que transcreve RNA para suprimir pelo menos umprimeiro gene alvo pela formação de RNA duplo filamento e inclui pelo me-nos um segmento de DNA anti-sentido que é anti-sentido a pelo menos umsegmento do pelo menos um primeiro gene alvo;
(f) DNA que transcreve RNA para suprimir pelo menos umprimeiro gene alvo pela formação de um RNA duplo filamento e inclui múlti-plos segmentos seriados de DNA anti-sentido que são anti-sentido a pelomenos um segmento do pelo menos um primeiro gene alvo e múltiplos seg-mentos seriados de DNA sentido que são pelo menos um segmento do pelomenos um primeiro gene alvo;
(g) DNA que transcreve RNA para suprimir pelo menos umprimeiro gene alvo pela formação de múltiplas duplos filamentos de RNA einclui múltiplos segmentos de DNA anti-sentido que são anti-sentido a pelomenos um segmento do pelo menos um primeiro gene alvo e múltiplos seg-mentos de DNA sentido que são pelo menos um segmento do pelo menosum primeiro gene alvo, e em que os ditos múltiplos segmentos de DNA anti-sentido e os múltiplos segmentos de DNA sentido estão dispostos em umasérie de repetições invertidas;
(h) DNA que inclui nucleotídeos derivados de um miRNA, pre-ferivelmente um miRNA de planta;
(i) DNA que inclui nucleotídeos de um siRNA;
(j) DNA que transcreve um aptâmero de RNA capaz de seligar a um ligante; e
(k) DNA que transcreve um aptâmero de RNA capaz de seligar a um ligante, e DNA que transcreve RNA regulatório capaz de regular aexpressão de pelo menos um primeiro gene alvo, em que a regulação é de-pendente da conformação do RNA regulatório, e a conformação do RNA re-gulatório é alostericamente afetada pelo estado de ligação do aptâmero de RNA.
Representações não Iimitantes desses elementos de supressãogênica são ilustradas na Figura 2. Qualquer um desses elementos de su-pressão gênica, transcrevendo para um único RNA duplo filamento ou paramúltiplos RNAs duplo filamento, podem ser desenhados para suprimir maisde um gene alvo, incluindo, por exemplo, mais de um alelo de um gene alvo,múltiplos genes alvo (ou múltiplos segmentos de pelo menos um gene alvo)de uma única espécie, ou genes alvo de espécies diferentes. Aptâmeros,RNA regulatório, e Iigantes são descritos sob seus respectivos títulos abaixo.
Segmentos de DNA anti-sentido: em uma modalidade, o pelomenos um segmento de DNA anti-sentido que é anti-sentido a pelo menosum segmento do pelo menos um primeiro gene alvo inclui seqüência de DNAque é anti-sentido ou complementar a pelo menos um segmento do pelomenos um primeiro gene alvo, e pode incluir múltiplos segmentos de DNAanti-sentido, isto é, múltiplas cópias de pelo menos um segmento de DNAanti-sentido que é anti-sentido a pelo menos um segmento do pelo menosum primeiro gene alvo. Múltiplos segmentos de DNA anti-sentido podem in-cluir seqüência de DNA que é anti-sentido ou complementar a múltiplossegmentos do pelo menos um primeiro gene alvo, ou a múltiplas cópias deum segmento do pelo menos um primeiro gene alvo, ou a segmentos demúltiplos primeiros genes alvo, ou a qualquer combinação desses. Múltiplossegmentos de DNA anti-sentido podem ser fundidos em uma quimera, porexemplo, que inclui seqüências de DNA que são anti-sentido a múltiplossegmentos de um ou mais primeiros genes alvo e fundidas juntas.
A seqüência de DNA anti-sentido que é anti-sentido ou comple-mentar a (isto é, pode formar pares de base de Watson Crick com) pelo me-nos um segmento do pelo menos um primeiro gene alvo tem preferivelmentepelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 85%, ou pelo menoscerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95% de complementaridade a pelomenos um segmento do pelo menos um primeiro gene alvo. Em uma moda-lidade preferida, a seqüência de DNA que é anti-sentido ou complementar a pelo menos um segmento do pelo menos um primeiro gene alvo tem entrecerca de 95% a cerca de 100% de complementaridade a pelo menos umsegmento do pelo menos um primeiro gene alvo. Onde o pelo menos umsegmento de DNA anti-sentido inclui múltiplos segmentos de DNA anti-sentido, o grau de complementaridade- pode ser, mas não precisa ser, idênti-co para todos os múltiplos segmentos de DNA anti-sentido.
Segmentos de DNA sentido: em outra modalidade, o pelo menos(. um segmento de DNA sentido que é pelo menos um segmento do pelo me-nos um primeiro gene alvo inclui seqüência de DNA que corresponde a (istoé, tem uma seqüência que é idêntica ou substancialmente idêntica a) pelo menos um segmento do pelo mènos um primeiro gene alvo, e pode incluirmúltiplos segmentos de DNA sentido, isto é, múltiplas cópias de pelo menosum segmento de DNA sentido que corresponde a (isto é, tem a seqüência denucleotídeo de) pelo menos um segmento do pelo menos um primeiro genealvo. Múltiplos segmentos de DNA sentido podem incluir seqüência de DNAque é ou que corresponde a múltiplos segmentos do pelo menos um primei-ro gene alvo, ou a múltiplas cópias de um segmento do pelo menos um pri-meiro gene alvo, ou a segmentos de múltiplos genes alvo, ou a qualquercombinação desses. Múltiplos segmentos de DNA sentido podem ser fundi-dos em uma quimera, isto é, podem incluir seqüências de DNA que corres-pondem a múltiplos segmentos de um ou mais primeiros genes alvo e fundi-das juntas.
A seqüência de DNA sentido que corresponde a pelo menos umsegmento do gene alvo tem preferivelmente pelo menos cerca de 80%, oupelo menos cerca de 85%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menoscerca de 95% de identidade de seqüência a pelo menos um segmento dogene alvo. Em uma modalidade preferida, a seqüência de DNA que corres-ponde a pelo menos um segmento do gene alvo tem entre cerca de 95% acerca de 100% de identidade de seqüência a pelo menos um segmento dogene alvo. Onde o pelo menos um segmento de DNA sentido inclui múltiplossegmentos de DNA sentido, o grau de identidade de seqüência pode, masnão precisa, ser idêntico para todos os múltiplos segmentos de DNA sentido.
Múltiplas cópias: onde o elemento de supressão gênica incluimúltiplas cópias de seqüência de DNA anti-sentido ou múltiplas de seqüên-cia de DNA sentido, essas múltiplas cópias podem ser dispostas seriada-mente em repetições em tandem. Em algumas modalidades, essas múltiplascópias podem ser dispostas seriadamente extremidade-para- extremidade,isto é, em repetições em tandem conectadas diretamente. Em algumas mo-dalidades, essas múltiplas cópias podem ser dispostas em repetições emtandem interrompidas, onde um ou mais segmentos de DNA espaçador po-dem estar localizados adjacentes a uma ou mais das múltiplas cópias. Repe-tições em tandem, conectadas diretamente ou interrompidas ou qualquercombinação de ambas, podem incluir múltiplas cópias de uma única se-qüência de DNA anti-sentido ou múltiplas cópias de uma única seqüência deDNA sentido em uma disposição seriada ou pode incluir múltiplas cópias demais de uma seqüência de DNA anti-sentido ou de mais de uma seqüênciade DNA sentido em uma disposição seriada.
RNA duplo filamento: nessas modalidades em que o elementode supressão gênica inclui pelo menos um segmento de DNA anti-sentidoque é anti-sentido a pelo menos um segmento do pelo menos um gene alvoou pelo menos um segmento de DNA sentido que é pelo menos um segmen-to do pelo menos um gene alvo, RNA transcrito a partir de qualquer um dospelo menos um DNA anti-sentido ou pelo menos um DNA sentido pode setornar duplo filamento pela ação de uma RNA polimerase dependente deRNA. Vide, por exemplo, Patente U.S. número 5.283.184.
Em outras modalidades ainda, o elemento de supressão gênicapode inclui DNA que transcreve RNA para suprimir o pelo menos um primei-ro gene alvo pela formação de RNA duplo filamento e inclui pelo menos umsegmento de DNA anti-sentido que é anti-sentido a pelo menos um segmen-to do pelo menos um gene alvo (como descrito acima sob o título "Segmen-tos de DNA Anti-sentido") e pelo menos um segmento de DNA sentido que épelo menos um segmento do pelo menos um primeiro gene alvo (como des-crito acima sob o título "Segmentos de DNA Sentido"). Tal elemento de su-pressão gênica pode incluir adicionalmente segmentos de DNA espaçador.Cada pelo menos um segmento de DNA anti-sentido é complementar a pelomenos uma parte de um segmento de DNA sentido a fim de permitir a for- mação de RNA duplo filamento por hibridização intramolecular do pelo me-nos um segmento de DNA anti-sentido e o pelo menos um segmento deDNA sentido. Tal complementaridade entre um segmento de DNA sentido eum segmento de DNA anti-sentido pode, mas não precisa ser, 100% decomplementaridade; em algumas modalidades, essa complementaridade pode ser preferivelmente de pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cercade 85%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95% decomplementaridade.
O RNA duplo filamento pode estar na forma de um único "stem"de dsRNA (região de pareamento de base entre fitas sentido e anti-sentido),ou pode ter múltiplos "stems" de dsRNA. Em uma modalidade, o elementode supressão gênica pode incluir DNA que transcreve RNA para suprimir opelo menos um primeiro gene alvo por formar essencialmente um único RNAduplo filamento e inclui múltiplos segmentos de DNA anti-sentido seriadosque são anti-sentido a pelo menos um segmento do pelo menos um primeiro gene alvo e múltiplos segmentos de DNA sentido seriados que são pelo me-nos um segmento do pelo menos um primeiro gene alvo; os múltiplos seg-mentos anti-sentido seriados e múltiplos segmentos sentido seriados podemformar um único "stem" ou múltiplos "stems" de RNA duplo filamento emuma disposição seriada (com ou sem DNA espaçador sem pareamento de base separando os múltiplos "stems"). Em outra modalidade, o elemento desupressão gênica inclui DNA que transcreve RNA para suprimir o pelo me-nos um primeiro gene alvo por formar múltiplos "stems" de dsRNA de RNA einclui múltiplos segmentos de DNA anti-sentido que são anti-sentido a pelomenos um segmento do pelo menos um primeiro gene alvo e múltiplos seg- mentos de DNA sentido que são pelo menos um segmento do pelo menosum primeiro gene alvo, e em que os ditos múltiplos segmentos de DNA anti-sentido e os múltiplos segmentos de DNA sentido são dispostos em umasérie de "stems" de dsRNA (tal como, mas não limitado a "repetições inverti-das"). Tais múltiplos "stems" de dsRNA podem ainda ser dispostos em sé-ries ou grupos para formar repetições invertidas em tandem, ou estruturasque lembram formatos de "cabeça de martelo" ou "folha de trevo". Qualquerum desses elementos de supressão gênica pode ainda incluir segmentos deDNA espaçadores encontrados dentro de um "stem" de dsRNA (por exem-plo, como um espaçador entre múltiplos segmentos de DNA anti-sentido esentido ou como um espaçador entre um segmento de DNA anti-sentido eum segmento de DNA sentido com pareamento de base) ou fora de um"stem" de RNA duplo filamento (por exemplo, como uma região de alça se-parando um par de repetições invertidas). Em casos onde segmentos deDNA anti-sentido e sentido com pareamento de base são de comprimentodesigual, o segmento mais comprido pode agir como um espaçador. A Figu-ra 2 representa ilustrações de modalidades possíveis desses constructos desupressão gênica.
miRNAs: em uma modalidade adicional, o elemento de supres-são gênica pode incluir DNA que inclui nucleotídeos derivados de um miRNA(microRNA), isto é, uma seqüência de DNA que corresponde a um miRNAnativo a um vírus ou um eucarioto de interesse (incluindo plantas e animais,especialmente invertebrados), ou uma seqüência de DNA derivada de talmiRNA nativo mas modificada para incluir seqüências de nucleotídeo quenão correspondem ao miRNA nativo. Embora miRNAs não tenham sido rela-tados até o momento em fungos, miRNAs de fungos, que devem existir,também são adequados para uso na invenção. Uma modalidade preferidainclui um elemento de supressão gênica que contém DNA que inclui nucleo-tídeos derivados de um miRNA viral ou de planta.
Em um exemplo não limitante, os nucleotídeos derivados de ummiRNA podem incluir DNA que inclui nucleotídeos que correspondem a regi-ão de alça de um miRNA nativo e nucleotídeos derivados de um miRNA po-dem incluir DNA derivado de uma seqüência precursora de miRNA, tal comoseqüência de primRNA ou pré-miRNA nativa, ou nucleotídeos que corres-pondem às regiões de um miRNA nativo e nucleotídeos que são seleciona-dos a partir de um número de seqüência de gene alvo tal que a estruturageral (por exemplo, a colocação de não pareamentos na estrutura base dopré-miRNA) seja preservada para permitir que o pré-miRNA seja processadoem um miRNA maduro. Em outra modalidade ainda, o elemento de supres-são gênica pode incluir DNA que inclui nucleotídeos derivados de um miRNAe é capaz de induzir ou guiar clivagem in-phase de um transcrito endógenoem siRNAs transatuantes, como descrito por Allen et al. (2005) Cell,121:207-221. Dessa forma, o DNA que inclui nucleotídeos derivados de ummiRNA pode incluir seqüência de ocorrência natural em um miRNA ou umamolécula precursora de miRNA, seqüência sintética, ou ambas.
siRNAs: ainda em outra modalidade, o elemento de supressãogênica pode incluir DNA que inclui nucleotídeos de um pequeno RNA de in-terferência (siRNA). O siRNA pode ser um ou mais siRNAs nativos (tais co-mo siRNAs isolados de um eucarioto não transgênico ou de um eucariototransgênico), ou pode ser uma ou mais seqüências de DNA previstas parater atividade de siRNA (tal como pelo uso de ferramentas preditivas conheci-das na técnica, vide, por exemplo, Reynolds et al. (2004) Nature Biotechnol.,22:326-330). Múltiplas seqüências de siRNA nativas ou previstas podem serunidas em uma seqüência de siRNA quimérica para supressão gênica. TalDNA que inclui nucleotídeos de um siRNA preferivelmente inclui pelo menos19 nucleotídeos, e em algumas modalidades preferivelmente inclui pelo me-nos 21, pelo menos 22, pelo menos 23, ou pelo menos 24 nucleotídeos. Emoutras modalidades, o DNA que inclui nucleotídeos de um siRNA pode con-ter substancialmente mais de 21 nucleotídeos, por exemplo, mais de cercade 50, cerca de 100, cerca de 300, cerca de 500, cerca de 1000, cerca de3000, ou cerca de 5000 nucleotídeos ou mais.
Genes alvo: o elemento de supressão gênica pode ser projetadopara suprimir qualquer primeiro gene alvo. Em algumas modalidades, oconstructo ainda inclui um segundo elemento de supressão gênica para su-primir pelo menos um segundo gene alvo, em que o segundo elemento desupressão gênica está localizado adjacente ao íntron. Seja um primeiro ouum segundo gene alvo, o gene alvo pode incluir um único gene ou parte deum único gene que é direcionado para supressão ou pode incluir, por exem-plo, múltiplos segmentos consecutivos de um gene alvo, múltiplos segmen-tos não consecutivos de um gene alvo, múltiplos alelos de um gene alvo, oumúltiplos genes alvo de uma ou mais espécies.
O gene alvo pode ser seqüência traduzível (codificante), ou podeser seqüência não codificante (tal como seqüência regulatória não codifican-te), ou ambas, e pode incluir pelo menos um gene selecionado a partir dogrupo que consiste em um gene alvo eucariótico, um gene alvo não eucarió-tico, uma seqüência de DNA precursora de microRNA, e um promotor demicroRNA. O gene alvo pode ser nativo (endógeno) à célula, (por exemplo,uma célula de uma planta ou animal) na qual o constructo de DNA recombi-nante da invenção é transcrito. O gene alvo pode ser um gene exógeno, talcomo um transgene em uma planta. Um gene alvo pode ser um gene nativodirecionado para supressão, com ou sem expressão concomitante de umtransgene exógeno, por exemplo, pela inclusão de um elemento de expres-são gênica no mesmo constructo de DNA recombinante ou em constructo deDNA recombinante separado. Por exemplo, pode ser desejável substituir umgene nativo por um transgene exógeno homólogo.
O gene alvo pode incluir um único gene ou parte de um únicogene que é direcionado para supressão, ou pode incluir, por exemplo, múlti-plos segmentos consecutivos de um gene alvo, múltiplos segmentos não-consecutivos de um gene alvo, múltiplos alelos de um gene alvo, ou múlti-plos genes alvo de uma ou mais espécies. Uma seqüência de gene alvo po-de incluir qualquer seqüência de qualquer espécie (incluindo, mas não limi-tada, a não-eucariotos tais como bactérias, e vírus; fungos, plantas; incluindomonocotiledôneas e dicotiledôneas, tais como plantas de cultivo, plantasornamentais, e plantas não-domesticadas ou selvagens; invertebrados taiscomo artrópodes, anelídeos, nematódeos, e moluscos; e vertebrados taiscomo anfíbios, peixes, aves, mamíferos domésticos ou selvagens, ou atémesmo humanos.
Um aspecto da invenção fornece constructos de DNA recombi-nante em que o gene alvo é exógeno à planta na qual o constructo deve sertranscrito, mas endógeno a uma praga ou patógeno (por exemplo, vírus,bactérias, fungos, oomicetos, e invertebrados tais como insetos, nematódeose moluscos) da planta. O gene alvo pode incluir múltiplos gene alvo, ou múl-tiplos segmentos de um ou mais genes. Em uma modalidade preferida, ogene ou genes alvo são um gene ou genes de uma praga ou patógeno inver-tebrado da planta. Esses constructos de DNA recombinantes são particular-mente úteis em fornecer plantas transgênicas que têm resistência a uma oumais pragas ou patógenos de planta, por exemplo, resistência a um nemató-deo tal como um nematódeo de cisto de soja ou nematódeo de nó de raiz oua um inseto nocivo.
O gene alvo pode ser seqüência traduzível (codificante), ou podeser seqüência não-codificante (tal como uma seqüência regulatória não-codificante), ou ambas. Exemplos não Iimitantes de um gene alvo incluemseqüência não-traduzível (não-codificante), tal como, mas não limitada a,regiões 5' não traduzidas, promotores, intensificadores, ou outras regiõestranscricionais não-codificantes, regiões 3' não traduzidas, terminadores eíntrons. Genes alvo incluem genes que codificam microRNAs, pequenosRNAs de interferência, componentes de RNA de ribossomos ou ribozimas, pequenos RNAs nucleolares, e outros RNAs não-codificantes (vide, por e-xemplo, seqüências de RNA não-codificantes fornecidas publicamente emrfam.wustl.edu; Erdmann et al. (2001) Nucleic Acids Res., 29:189-193; Got-tesman (2005) Trends Genet., 21:399-404; Griffiths-Jones et al. (2005) Nu-cleic Acids Res., 33:121-124). Um exemplo específico de um gene alvo incluium sítio de reconhecimento de microRNA (isto é, o sítio um um filamento deRNA a qual miRNA maduro se liga e induz clivagem). Outro exemplo especí-fico de um gene alvo inclui uma seqüência precursora de microRNA nativa auma praga ou patógeno da planta transgênica, isto é, o transcrito primárioque codifica um microRNA, ou os intermediários de RNA processados a par-tir desse transcrito primário (por exemplo, um primRNA ou um pré-miRNAlimitado ao núcleo que pode ser exportado a partir do núcleo para o cito-plasma). Vide, por exemplo, Lee et al. (2002) EMBO Journal, 21:4663-4670;Reinhart et al. (2002) Genes & Dev., 16:161611626; Lund et al. (2004) Sci-ence, 303:95-98; e Millar & Waterhouse (2005) Funct. Integr Genomics,5:129-135. Genes alvo também podem incluir seqüência traduzível (codifi-cante) para genes que codificam fatores de transcrição e genes que codifi-cam enzimas envolvidas na biossíntese ou catabolismo de moléculas de in-teresse (tais como, mas não limitadas a, aminoácidos, ácidos graxos, e ou-tros lipídeos, açúcares, e outros carboidratos, polímeros biológicos, e meta-bólitos secundários incluindo alcalóides, terpenóides, policetídeos, peptídeosnão-ribossomais, e metabólitos secundários de origem biossintética mista).
Em muitas modalidades preferidas, o gene alvo é um gene es-sencial da praga ou patógeno de planta. Genes essenciais incluem genesque são necessários para o desenvolvimento da praga ou patógeno para umadulto reprodutivo fértil. Genes essenciais incluem genes que, quando silen-ciados o suprimidos, resultam na morte do organismo (como um adulto ouem qualquer estágio do desenvolvimento, incluindo gametas) ou na incapa-cidade do organismo de reproduzir com sucesso (por exemplo, esterilidadeem um parente masculino ou feminino ou Ietalidade ao zigoto, embrião oularva). Uma descrição de genes essenciais de nematódeo é encontrada, porexemplo, em Kemphues K. "Essential Genes" (24 de dezembro de 2005),WormBook, ed. The C. elegans Research Community, WormBook, doi/10.1895/wormbook. 1.57.1, disponível na rede em www.wormbook.org. Exemplos nãoIimitantes de genes essenciais de nematódeos incluem proteína de espermamajor, RNA polimerase II, e quitina sintase (vide, por exemplo, Publicaçãode Pedido de Patente U.S. US20040098761 A1); genes essenciais de nema-tódeo de cisto de soja adicionais são fornecidos no Pedido de Patente U.S.11/360,355, depositado em 23 de fevereiro de 2006. Uma descrição de ge-nes de inseto está disponível publicamente na base de dados de genoma deDrosophila (disponível na rede em flybase.bio.indiana.edu/). A maioria dosgenes de Drosophila previstos foi analisada quanto à função por um rastre-amento de RNA de interferência baseado em cultura celular, resultando em438 genes essenciais sendo identificados; vide, Boutros et al. (2004) Scien-ce, 303:832-835, e material de suporte disponível na rede em www.science-mag.org/cgi/content/full/303/5659/832/DC1. Uma descrição de genes essen-ciais bacterianos ou fúngicos é fornecida na Base de Dados de Genes Es-senciais ("DEG", disponível na rede em tubic.tju.edu.cn/deg/); vide Zhang etal. (2004) Nucleic Acids Res., 32:D271-D272.
Invertebrados nocivos de planta incluem, mas não são limitadasa, nematódeos nocivos, moluscos nocivos (lesmas e caracóis), e insetos no-civos. Patógenos de planta de interesse incluem fungos, oomicetos, bacté-rias (por exemplo, a bactéria que causa manchas foliares, "fireblight", galhada coroa, e murcha bacteriana), molicutes, e vírus (por exemplo, os vírusque causam mosaicos, bandeamento de nervuras, nódoas, manchas, oucrescimento anormal). Vide também G. N. Agrios, "Plant Pathology" (QuartaEdição), Academic Press, San Diego, 1997, 635 pp., para descrições defungos, bactérias, molicutes (incluindo micoplasmas e espiroplasmas), vírus,nematódeos, plantas parasitas superiores, e protozoários flagelados, todosos quais são pragas ou patógenos de planta de interesse. Vide também, acompilação continuamente atualizada de pragas e patógenos de planta e asdoenças causadas por eles em "Common Names of Plant Diseases", daAmerican Phytopathological Society compilados pelo Committee on Stan-dardization of Common Names for Plant Diseases da American Phytopatho-Iogical Society, 1978-2005, disponível na rede em www.apsnet.org/online/common/top.asp.
Exemplos não Iimitantes de patógenos de planta fúngicos deinteresse particular incluem, por exemplo, os fungos que causam oídio, fer-rugem, nódoa e macha foliar, tombamento, podridão da raiz, podridão dacoroa, podridão da cápsula de algodão, cancro da haste, cancro do galho,murcha vascular, fuligem, mofo, incluindo, mas não limitado a, Fusariumspp., Phakospora spp., Rhizoctonia spp., Aspergillus spp., Gibberella spp.,Pyricularia spp., e Alternaria spp.. Exemplos específicos de patógenos deplanta fúngicos incluem Phakospora pachirhizi (ferrugem asiática da soja),Puccinia sorghi (ferrugem comum do milho), Puecinia polysora (ferrugem doSul do milho), Fusarium oxysporum e outros Fusarium spp., Alternaria spp.,Penieillium spp., Rhizoetonia solani, Exserohilum tureieum (mancha foliar domilho do Norte), Bipolaris maydis (mancha foliar do milho do Sul), Ustilagomaydis (fuligem do milho), Fusarium graminearum (Gibberella zeae), Fusari-um vertieilliodes (Gibberella moniliformis), F. proliferatum (G. fujikuroi var.intermedia), F. subglutinans (G. subglutinans), Diplodia maydis, Sporisoriumholei-sorghi, Colletotrichum graminieola, Setosphaeria tureiea, Aureobasidi-um zeae, Sclerotinia selerotiorum, e as várias espécies de fungo fornecidasnas Tabelas 4 e 5 da Patente U. S. 6.194.636. Exemplos não Iimitantes depatógenos de planta incluem patógenos anteriormente classificados comofungos, mas mais recentemente classificados como oomicetos. Exemplosespecíficos de oomicetos patógenos de planta de interesse particular inclu-em membros do gênero Pythium (por exemplo, Pythium aphanidermatum) ePhytophthora (por exemplo, Phytophthora infestans, Phytophthora sojae,) eorganismos que causam míldio (por exemplo, Peronospora farinosa).
Exemplos não Iimitantes de patógenos bacterianos incluem osmicoplasmas que causam amarelos e espiroplasmas tais como Spiroplasmakunkelii, que causa enfezamento do milho, eubactérias tais como Pseudo-monas avenae, Pseudomonas andropogonis, Enwinia stewartii, Pseudomo-nas syringae pv. syringae, XyieIIa fastidiosa, e as várias espécies bacteria-nas listadas na Tabela 3 da Patente U.S. 6.194.636.
Exemplos não Iimitantes de patógenos de planta virais de inte-resse particular incluem vírus do nanismo mosaico do milho (MDMV), vírusdo mosaico da cana-de-açúcar, (SCMV, anteriormente MDMV cepa B), vírusdo mosaico do estriado do trigo (wheat streak mosaic virus, WSMV), vírus donanismo clorótico do milho (maize chiorotic dwarf vírus (MCDV), vírus donanismo amarelo da cevada (BYDV), vírus da doença do cacho de banana(BBTV) e os vários vírus listados na Tabela 2 da Patente U.S. 6.194.636.
Pragas invertebradas de interesse particular, especialmente em,mas não limitado a, regiões do hemisfério sul (incluindo América do Sul eCentral) incluindo afídeos, lagarta da raiz, spodoptera, noctuidae, besouro dabatata, Lygus spp., qualquer hemíptero, ou homópteros, ou heteróptero,qualquer lepidóptero, qualquer coleóptero, nematódeos, lagartas da traça,lagarta da espiga, lagarta do cartucho, brocas, lagarta enroladeira, e outros.Pragas artrópodes especificamente abrangidas por essa invenção incluemvárias espécies de lagarta incluindo lagarta (Agrotis repleta), lagarta-rosca(Agrotis ipsilorí), lagarta (Anicla ignicans), lagarta granulada (Feltia subterrâ-nea), "gusano áspero" (Agrotis malefidá)·, traça da farinha Mediterrânea (A-nagasta kuehniellá), besouro "square-necked grain beetle" (Cathartus qua-dricollis), besouro saltador (flea beetle) (Chaetocnema spp), traça (Corcyracephalonica), lagarta da raiz do milho ou "vaquita de San Antonio" (Diabroti-ca speciosa), broca da cana de açúcar (Diatraea saccharalis), broca do colo(Elasmopalpus lignosellus), percevejo marrom (Euschistus spp.), lagarta daespiga de milho (Helicoverpa zea), besouro do grão (Laemophloeus minu-tus), curuquerê dos capinzais (Mocis Iatipes), besouro (Oryzaephilus suri-namensis), traça da farinha (Pyralis farinalis), traça indiana da farinha (Plodiainterpunctella), pulgão do milho (Rhopalosiphum maidis), percevejo castanhoou "chinche subterrânea" (Scaptocoris castanea), pulgão verde (Schizaphisgraminum), caruncho dos cereais (Sitophilus zeamais), tínea dos cereais(Sitotroga cerealella), lagarta do cartucho (Spodoptera frugiperda), besouro(cadelle beetle) (Tenebroides mauritanieus), ácaro rajado (Tetranyehus urti-eae), besouro castanho das farinhas (Triboleum eastaneum), lagarta dasfolhas do algodoeiro (Alabama argillaeea), gorgulho do algodão (Anthono-mus grandis), pulgão do algodão (Aphis gossypii), mosca branca da batatadoce (Bemisia tabaei), várias espécies de tripés (Frankliniella spp.), lagartado algodão (Helieoverpa zea), "oruga bolillera" (por exemplo, Helieoverpageletopoeon), lagarta da maçã (Heliothis virescens), percevejo verde (Neza-ra viridula), lagarta rosada (Peetinophora gossypiella), lagarta do cartucho(Spodoptera exigua), ácaros (Tetranychus spp.), tripés da cebola ( Jfrr/ps ta-baei), mosca branca das estufas (Trialeurodes vaporarium), lagarta desfo-Ihadora (Antiearsia gemmatalis), besouro machado do milho ou "astilo mote-ado" (Astylus atromaeulatus), "oruga de Ia alfalfa" (Colias lesbia), "chinchemarrom" ou "chinche de Ios cuernos" (Dichelops furcatus), "alquiche chico"(Edessa miditabundá), besouros da bolha (Epicauta spp.), "barrenador deibrote" (Epinotia aporema), "oruga verde dei yuyo colorado" (Loxostege bifi-dalis), nematódeos "root-knot" (Meloidogyne spp.), "oruga cuarteadora" (Mo-cis repanda), percevejo verde do sul (Nezara viridula), "chinche de Ia alfalfa"(Piezodorus guildinii), lagarta verde (green cloverworm) (Plathypena scabra),lagarta da soja (Pseudoplusia includens), lagarta "isoca medidora dei girasof(Rachiplusia nu), "yellow woolybear" (SpHosoma virginica), lagarta do cartu-cho listrada amarela (Spodoptera ornithogalli), vários gorgulhos da raiz (fa-mília Curculionidae), vários "wireworms" (família Elateridae), e vários corós(família Scarabaeidae). Pragas nematódeas especificamente abrangidas poressa invenção incluem pragas de milho (Belonolaimus spp., Trichodorusspp., Longidorus spp., Dolichodorus spp., Anguina spp., Pratylenchus spp.,Meloidogyne spp., Heterodera spp.), soja (Heterodera glycines, Meloidogynespp., Belonolaimus spp.), bananas (Radopholus similis, Meloidogyne spp.,Helicotylenchus spp.), cana de açúcar (Heterodera sacchari, Pratylenchusspp., Meloidogyne spp.), laranjas (Tylenchulus spp., Radopholus spp., Belo-nolaimus spp., Pratylenehus spp., Xiphinema spp.), café (Meloidogyne spp.,Pratylenehus spp.), coqueiro (Bursaphelenchus spp.), tomates (Meloidogynespp., Belonolaimus spp., Naeobbus spp.), uvas (Meloidogyne spp., Xiphine-ma spp., Tylenchulus spp., CrieonemeIIa spp.), limão e lima (Tylenchulusspp., Radopholus spp., Belonolaimus spp., Pratylenehus spp., Xiphinemaspp.), cacau (Meloidogyne spp., Rotylenchulus reniformis), abacaxi (Meloi-dogyne spp., Pratylenehus spp., Rotylenchulus reniformis), mamão (Meloi-dogyne spp., Rotylenchulus reniformis), toranja (Tylenchulus spp., Radopho-Ius spp. Belonolaimus spp., Pratylenehus spp., Xiphinema spp., e favas (Me-Ioidogyne spp.).
Genes alvo de pragas podem incluir genes de invertebrados pa-ra proteína major de esperma, alfa tubulina, beta tubulina, ATPase vacuolar,gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, RNA polimerase II, quitina sintase,citocromos, miRNAs, moléculas precursoras de miRNA, promotores demiRNA, assim como outros genes tais como aqueles descritos na Publica-ção de Pedido de Patente U.S. 2006/0021087 A1, Pedido de Patente PCTPCT/US05/11816, e na Tabela Il da Publicação de Pedido de Patente U. S.2004/0098761 A1. Genes alvo de patógenos podem incluir genes para fato-res de iniciação de tradução viral, replicases virais, miRNAs, moléculas pre-cursoras de miRNA, tubulina fúngica, ATPase vacuolar fúngica, quitina sin-tase fúngica, MAP quinases fúngicas, Pacl Tyr/Thr fosfatase fúngica, enzi-mas envolvidas no transporte de nutrientes (por exemplo, transportadores deaminoácidos ou transportadores de açúcares), enzimas envolvidas na bios-síntese de parede celular fúngica, cutinases, melanina, enzimas biossintéti-cas, poligalacturonases, pectinases, pectina liases, celulases, proteases,genes que interagem com genes de avirulência de planta, e outros genesenvolvidos em invasão e replicação do patógeno na planta infectada. Dessaforma, um gene alvo não precisa ser endógeno à planta na qual o constructode DNA recombinante é transcrito. Um constructo de DNA recombinante dainvenção pode ser transcrito em uma planta e usado para suprimir um genede um patógeno ou praga que pode infestar a planta.
Exemplos não Iimitantes específicos de genes alvo adequadostambém incluem genes catabólicos de aminoácidos (tais como, mas não li-mitados, ao gene LKR/SDH de milho que codifica lisina-cetoglutarato reduta-se (LKR) e sacaropina desidrogenase (SDH), e seus homólogos), genes dezeína de milho, genes envolvidos na síntese de ácido graxo (por exemplo,desaturases de ácido graxo microssomal e tioesterases de acil-ACP de plan-ta, tais como, mas não limitadas, àquelas descritas nas Patentes U.S. núme-ros 6.426.448, 6.372.965, e 6.872.872), genes envolvidos em vias de bios-síntese multi-etapa, onde pode ser de interesse regular o nível de um oumais intermediários, tal como genes que codificam enzimas para biossíntesede poliidroxialcanoato (vide, por exemplo, Patente U.S. No. 5.750.848); egenes que codificam proteínas de controle do ciclo celular, tal como proteí-nas com atividade semelhante a inibidor de quinase dependente de ciclina(CDK) (vide, por exemplo, genes descritos na Publicação de Pedido de Pa-tente Internacional número WO 05007829A2). Genes, alvo podem incluir ge-nes que codificam proteínas indesejáveis (por exemplo, alérgenos ou toxi-nas) ou as enzimas para a biossíntese de compostos indesejáveis (por e-xemplo, componentes de sabor ou odor indesejável). Dessa forma, uma mo·dalidade da invenção é uma planta transgênica ou tecido de tal planta que émelhorado pela supressão de proteínas alergênicas ou toxinas, por exemplo,uma semente de amendoim, soja, trigo com alergenicidade diminuída. Ge-nes alvo podem incluir genes envolvidos na maturação de frutos, tal comopoligalacturonase. Genes alvo podem incluir genes onde a expressão é pre-ferivelmente limitada a uma célula ou tecido ou estágio de desenvolvimentoparticular, ou onde a expressão é preferivelmente transitória, isto quer dizer,onde supressão constitutiva ou geral, ou supressão que se espalha por mui-tos tecidos, não é necessariamente desejada. Dessa forma, outros exemplosde genes alvo adequados incluem genes que codificam proteínas que,quando expressas em plantas transgênicas, fazem as plantas transgênicasresistentes a pragas ou patógenos (vide, por exemplo, genes para colesteroloxidase como descrito na Patente U.S. No. 5.763.245); genes onde a ex-pressão é induzida pela praga ou patógeno; e genes que podem induzir ourestaurar fertilidade (vide, por exemplo, genes barstar/barnase descritos naPatente U.S. No. 6.759.575).
Os constructos de DNA recombinantes da invenção podem serprojetados para suprimir mais especificamente o gene alvo, por desenhar oelemento ou elementos de supressão gênica para incluir regiões substanci-almente não idênticas a uma seqüência de gene não-alvo. Genes não-alvopodem incluir qualquer gene que não se pretende silenciar ou suprimir, tantoem uma planta que transcreve o constructo de DNA recombinante como emorganismos que podem entrar em contato com RNA transcrito a partir doconstructo de DNA recombinante. Uma seqüência de gene não-alvo podeincluir qualquer seqüência de qualquer espécie (incluindo, mas não limitadaa, não-eucariotos tal como bactérias, e vírus; fungos, plantas, incluindo mo-nocotiledôneas e dicotiledôneas, tal como plantas de cultivo, plantas orna-mentais, e plantas selvagens ou não-domesticadas; invertebrados tais comoartrópodes, anelídeos, nematódeos, e moluscos; e vertebrados tais comoanfíbios, peixe, aves, mamíferos domésticos ou selvagens, e até mesmo se-res humanos).
Em uma modalidade, o gene alvo é um gene endógeno parauma dada espécie, tal como uma dada planta (tal como, mas não limitado a,plantas agricolamente ou comercialmente importantes, incluindo monocotile-dôneas e dicotiledôneas), e o gene não-alvo pode ser, por exemplo, um ge-ne de uma espécie não-alvo, tal como outra espécie de planta ou um genede um vírus, fungo, bactéria, invertebrado, ou vertebrado, até mesmo um serhumano. Um exemplo não Iimitante é onde o elemento de supressão gênicaé projetado para suprimir um gene alvo que é um gene endógeno para umaúnica espécie (por exemplo, lagarta da raiz do milho Ocidental, Diabroticavirgifera virgifera LeConte) mas não suprime um gene não-alvo tal como osgenes de espécies relacionadas, até mesmo intimamente relacionadas (porexemplo, lagarta da raiz do milho do Norte, Diabrotica barberi Smith & La-wrence, ou lagarta da raiz do milho do Sul, Diabrotica undecimpunctata).
Em outras modalidades (por exemplo, onde é desejável suprimirum gene alvo entre múltiplas espécies), pode ser desejável desenhar o ele-mento de supressão gênica para suprimir uma seqüência de gene alvo co-mum às múltiplas espécies nas quais o gene alvo deve ser silenciado. Dessaforma, um elemento de supressão gênica pode ser selecionado para ser es-pecífico para um táxon (por exemplo, específico para um gênero, família, oumesmo um táxon maior tal como um filo, por exemplo, artrópodes), mas nãopara outros táxons (por exemplo, plantas ou vertebrados ou mamíferos). Emum exemplo não Iimitante dessa modalidade, um elemento de supressãogênica para silenciamento gênico pode ser selecionado a fim de atingir fun-gos patogênicos (por exemplo, um Fusarium spp.), mas não atingir qualqueroutra seqüência gênica de fungos benéficos.
Em outro exemplo não Iimitante dessa modalidade, um elementode supressão gênica para silenciamento gênico em lagarta da raiz do milhopode ser selecionado para ser específico para todos os membros do gêneroDiabrotica. Em um exemplo adicional dessa modalidade, tal elemento desupressão gênica direcionado para Diabrotica pode ser selecionado a fim denão atingir nenhuma seqüência gênica de coleópteros benéficos (por exem-plo, besouros coccinelídeos predatórios, comumente. conhecidos como joa-ninhas) ou outras espécies de insetos benéficos.
O grau necessário de especificidade de um RNA para silenciarum gene alvo depende de vários fatores. Por exemplo, o RNA para silenciarum gene alvo inclui RNA duplo filamento (dsRNA), e assim fatores podemincluir o tamanho dos menores fragmentos de dsRNA que são esperados serproduzidos pela ação de proteínas Dicer ou semelhantes a Dicer, e a impor-tância relativa de diminuir o potencial das dsRNAs suprimirem genes não-alvo. Por exemplo, onde se espera que os fragmentos de dsRNA tenham 21pares de base de tamanho, uma modalidade particularmente preferida incluiRNA para silenciar um gene alvo que codifica regiões substancialmente não-idênticas a uma seqüência de gene não-alvo, tais como regiões dentro dasquais cada fragmento contíguo que inclui pelo menos pareamentos de 21nucleotídeos de menos do que 21 (por exemplo, de menos do que 21, ou demenos do que 20, ou de menos do que 19, ou de menos do que 18, ou demenos do que 17) dos 21 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de genenão-alvo. Em outra modalidade, regiões substancialmente não idênticas auma seqüência gênica não-alvo inclui regiões dentro das quais cada frag-mento contíguo que inclui pelo menos pareamentos de 19 nucleotídeos me-nores do que 19 (por exemplo, 19, ou menores do que 18, ou menores doque 17, ou menores do que 16) dos 19 nucleotídeos contíguos de uma se-qüência de gene não-alvo.
Em algumas modalidades, pode ser desejável desenhar o RNApara silenciar um gene alvo para incluir regiões previstas para não gerar po-lipeptídeos indesejáveis, por exemplo, por rastrear o RNA para silenciar umgene alvo para seqüências que podem codificar polipeptídeos indesejáveisconhecidos ou homólogos próximos desses. Polipeptídeos indesejáveis in-cluem, mas não são limitados a, polipeptídeos homólogos a polipeptídeosalergênicos conhecidos e polipeptídeos homólogos a toxinas polipeptídicasconhecidas. Seqüências disponíveis publicamente que codificam tais peptí-deos potencialmente alergênicos estão disponíveis, por exemplo, a base dedados de alergenos de Food Allergy Research and Resource Program(FARRP) (disponível em allergenonline.com) ou as bases de dados Biotech-nology Information for Food Safety Databases (disponível emwww.iit.edu/~sgendel/fa.htm) (vide também, por exemplo, Gendel (1998)Adv. Food Nutr. Res., 42:63-92). Seqüências indesejáveis também podemincluir, por exemplo, aquelas seqüências de polipeptídeo apontadas comotoxinas conhecidas ou como alergenos potenciais ou conhecidos e contidasem bases de dados publicamente disponíveis tais como GenBank, EMBL,SwissProt, e outras, que são pesquisáveis pelo sistema Entrez(www.ncbi.nih.gov/Entrez). Exemplos não Iimitantes de seqüências de peptí-deos potencialmente alergênicos incluem glicinina de soja, oleosina e agluti-nina de amendoim, gluteninas de trigo, caseína, lactalbumina, e Iactoglobuli-na de leite bovino e tropomiosina de vários moluscos (allergenonline.com).Exemplos não Iimitantes de peptídeos potencialmente tóxicos indesejáveisincluem toxina tetânica tetA de Clostridium tetani, toxinas diarréicas de Sta-phylococcus aureus, e venenos tais como conotoxinas de Conus spp. e neu-rotoxinas de artrópodes e repteis (www.ncbi.nih.gov/Entrez).
Em um exemplo não limitante, um RNA para silenciar um genealvo é rastreado para eliminar aquelas seqüências capazes de ser traduzi-das que codificam polipeptídeos com homologia perfeita a um alergeno outoxina conhecida por 8 aminoácidos contíguos, ou com pelo menos 35% deidentidade por pelo menos 80 aminoácidos; tais rastreamentos podem serrealizados em qualquer e todas as possíveis fases de leitura em ambas asdireções, em fases abertas de leitura potenciais que começam com AUG(ATG no DNA correspondente), ou em todas as fases abertas de leitura pos-síveis, independente de se elas começam com um AUG (ou ATG) ou não.Quando um "acerto" ou pareamento é feito, isto é, quando uma seqüênciaque codifica um polipeptídeo potencial com homologia perfeita a um alerge-no ou toxina conhecida por 8 aminoácidos consecutivos (ou pelo menos cer-ca de 35% de identidade por pelo menos cerca de 80 aminoácidos), é identi-ficado, as seqüências de ácido nucléico que correspondem ao acerto podemser evitadas, eliminadas, ou modificadas ao selecionar seqüências a ser u-sadas em um RNA para silenciar um gene alvo. s
Evitar, eliminar, ou modificar uma seqüência indesejada podeser obtido por qualquer um de vários métodos conhecidos daqueles versa-dos na técnica. Em alguns casos, o resultado pode. ser novas seqüênciasque são acreditadas não existirem naturalmente. Por exemplo, evitar certasseqüências pode ser obtido por unir seqüências "limpas" em novas seqüên-cias quiméricas para ser usadas em um RNA para silenciar um gene alvo.
Já que o RNA para silenciar um gene alvo inclui RNA duplo fila-mento (dsRNA), os requerentes reconhecem que em algum silenciamentomediado por dsRNA, é possível que seqüências de dsRNA que não pareiamperfeitamente sejam eficazes no silenciamento gênico. Por exemplo, foimostrado que não pareamentos próximo ao centro de um sítio complementarde miRNA tem efeitos mais fortes sobre o silenciamento gênico do miRNAdo que pareamentos localizados mais distalmente. Vide, por exemplo, Figura4 em Mallory et al. (2004) EMBO J., 23:3356-3364. Em outro exemplo, foirelatado que, tanto a posição de um par de base não pareado quanto a iden-tidade dos nucleotídeos que formam o não pareamento influenciam a habili-dade de um dado siRNA silenciar um gene alvo, e que não pareamentosadenina-citosina, além do par de base oscilante G:U, foram bem-tolerados(vide Du et al. (2005) Nucleic Acids Res., 33:1671-1677). Dessa forma, odsRNA que está incluído no RNA para silenciar um gene alvo não precisasempre ter 100% de identidade de seqüência com o gene alvo pretendido,mas geralmente teria preferivelmente identidade de seqüência substancialcom o gene alvo pretendido, tal como cerca de 95%, cerca de 90%, cerca de85%, ou cerca de 80% de identidade de seqüência com o gene alvo preten-dido. Um versado na técnica seria capaz de julgar a importância dada aorastreamento por regiões previstas para ser mais altamente específicas aogene alvo ou previstas para não gerar polipeptídeos indesejáveis, em rela-ção à importância dada a outros critérios, tais como, mas não limitados a,porcentagem de identidade de seqüência com o gene alvo pretendido ou aeficiência de silenciamento gênico prevista de uma dada seqüência. Por e-xemplo, pode ser desejável para um RNA para silenciar um gene alvo serativo entre várias espécies e, portanto um versado na técnica pode determi-nar que é mais importante incluir no RNA para silenciar um gene alvo regi-ões específicas para as várias espécies de interesse, mas menos importanterastrear por regiões previstas para ter maior eficiência de silenciamento gê-nico ou para regiões previstas para gerar polipeptídeos indesejáveis.
Aptâmeros de RNA: aptâmeros de ácido nucléico são moléculasde ácido nucléico que se ligam a um Iigante através de mecanismo de liga-ção que não é primariamente baseado em pareamento de base de Watson-Crick (ao contrário, por exemplo, ao pareamento de base que ocorre entrefitas de ácido nucléico complementares, anti-paralelas parra formar uma es-trutura de ácido nucléico duplo filamento). Vide, por exemplo, Ellington &Szostak (1990) Nature, 346:818-822. Um aptâmero de ácido nucléico geral-mente inclui uma seqüência de nucleotídeo primária que permite que o ap-tâmero forme uma estrutura secundária (por exemplo, por formar estruturas"stem-loop") que permite que o aptâmero se ligue ao seu ligante. A ligaçãodo aptâmero ao seu ligante é preferivelmente específica, permitindo ao ap-tâmero distinguir entre duas ou mais moléculas que são estruturalmente si-milares (vide, por exemplo, Bayer & Smolke (2005) Nature Biotechnol.,23:337-343). Aptâmeros úteis na invenção podem, entretanto, ser monova-lentes (se ligar a um único ligante) ou multivalentes (se ligar a mais de umligante individual, por exemplo, se ligar a uma unidade de dois ou mais Iigan-tes diferentes). Vide, por exemplo, Di Giusto & King (2004) J. BioL Chem.,279:46483-46489, que descreve o desenho e construção de aptâmeros deDNA circular, multivalentes.
Aptâmeros úteis na invenção podem incluir DNA, RNA1 análogosde ácido nucléico (por exemplo, ácidos peptídeo nucléico), ácidos nucléicosbloqueados, ácidos nucléicos modificados quimicamente, ou combinaçõesdesses. Vide, por exemplo, Schmidt et al. (2004) Nucleic Acids Res.,32:5757-5765, que descrevem aptâmeros de ácido nucléico bloqueado. Emuma modalidade preferida da invenção, o aptâmero é um aptâmero de RNA.Em uma modalidade particularmente preferida, o aptâmero é produzido portranscrição in planta. Exemplos de aptâmeros podem ser encontrados, porexemplo, na Base de Dados de Aptâmero pública, disponível na rede emaptamer.icmb.utexas.edu (Lee et al. (2004) Nucieic Acids Res., 32(1):D95-100).
Aptâmeros podem ser desenhados para um dado Iigante porvários procedimentos conhecidos na técnica, incluindo técnicas de seleçãoin vitro ou de evolução direcionada. Vide, por exemplo,/1SELEX" ("evoluçãosistemática de Iigantes por enriquecimento exponencial"), como descrito emTuerk & Gold (1990) Science, 249:505-510, Ellington & Szostak (1990) Natu-re, 346:818-822, Ellington & Szostak (1992) Nature, 355:850-852, seleção deaptâmeros de RNA bifuncionais por SELEX quimérico, como descrito porBurke & Willis (1998), RNA, 4:1165-1175, seleção usando Iigantes ligados apartículas magnéticas como descrito por Murphy et al. (2003) Nucleic AcidsRes., 31:e110, uma técnica de SELEX automática descrita por Eulberg et al.(2005) Nucleie Aeids Res., 33(4):e45, e uma técnica semelhante a SELEXpara obter aptâmeros criados contra moléculas recombinantes expressassobre superfícies celulares, como descrito por Ohuchi et al. (2005) NucleicAcid Symposium Series, 49:351-352. A seleção pode começar com um con-junto aleatório de RNAs, de um conjunto parcialmente estruturado de RNAs(vide, por exemplo, Davis & Szostak (2002) Proc. NatL Acad. Sei. USA, 99:11616-11621), ou a partir de um conjunto de RNAs degenerados (vide, porexemplo, Geiger et al. (1996) Nueleic Acids Res., 24: 1029-1036). Modelosde estrutura secundária, dobramento, e comportamento de hibridização parauma dada seqüência de RNA podem ser previstos usando algoritmos, porexemplo, como descrito por Zuker (2003) Nucleic Acids Res., 31: 3406-3415.Dessa forma, aptâmeros para um dado Iigante podem ser desenhados denovo usando seleção adequada. Um exemplo não Iimitante de desenho eseleção de aptâmero é descrito em detalhe em Weill et ai (2004) NucleicAeids Res., 32:5045-5058, que descreve o isolamento de vários aptâmerosde ligação de ATP e seleção secundária de aptâmeros que se ligam a cordi-cepina (3' desoxiadenosina). Outro exemplo não Iimitante de desenho deaptâmero é dado em Huang & Szostak (2003) RNA1 9:1456-1463, que des-crevem a evolução in vitro de novos aptâmeros com novas especificidades enovas estruturas secundárias a partir de um aptâmero inicial.
Liqantes: Iigantes úteis na invenção podem incluir aminoácidosou seus intermediários biossintéticos ou catabólicos, peptídeos, proteínas,glicoproteínas, lipoproteínas, carboidratos, ácidos graxos e outros lipídios,esteróides, terpenóides, hormônios, ácidos nucléicos, aromáticos, alcalóides,produtos naturais ou compostos sintéticos (por exemplo, corantes, farmacêu-ticos, antibióticos, herbicidas), íons inorgânicos, e metais, em qualquer mo-lécula curta (ou parte de uma molécula) que podem ser reconhecidos e serligados por uma estrutura secundária de ácido nucléico por um mecanismonão primariamente baseado no pareamento de Watson-Crick. Dessa forma,o reconhecimento e ligação de Iigante e aptâmero é análogo àquele de antí-geno e anticorpo, ou de efetor biológico e receptor. Ligantes podem incluirmoléculas únicas (ou parte de uma molécula), ou uma combinação de duasou mais moléculas (ou partes de uma molécula) e podem incluir um ou maiscomplexos macromoleculares (por exemplo, polímeros, bicamadas lipídicas,lipossomos, membranas celulares, ou outras estruturas celulares, ou super-fícies celulares). Vide, por exemplo, Plummer et al. (2005) Nueleie AeidsRes., 33:5602-5610, que descrevem seleção de aptâmeros que se ligam aum compósito pequena molecula-proteína de superfície; Zhuang etal. (2002)J. Biol. Chem., 277:13863-13872, que descrevem a associação de proteínasde receptor do intestino médio de insetos com "rafts" de lipídios, o que afetaa ligação de endotoxinas inseticidas de Bacillus thuringiensis; e Homann &Goringer (1999) Nueleie Aeids Res., 27:2006-2014, que descrevem aptâme-ros que se ligam a tripanossomas vivos.Exemplos não Iimitantes de Iigantes específicos incluem vitami-nas tais como coenzima Bi2 e tiamina pirofosfato, flavina mononucleotídeo,guanina, adenosina, S-adenosilmetionina, S-adenosilomocisteína, coenzimaA, lisina, tirosina, dopamina, glicosamina-6-fosfato, cafeína, teofilina, antibió-ticos tais como cloranfenicol e neomicina, herbicidas tais como glifosato edicamba, proteínas que incluem proteínas de revestimento viral ou de fago eproteínas epidérmicas ou da superfície do trato digestivo, e RNAs que inclu-em RNA viral, RNAs de transferência (t-RNAs), RNA ribossomal (rRNA), eRNA polimerases tais como RNA polimerase dependente de RNA (RdRP).Ligantes adequados para uso nessa invenção incluem as proteínas de re-ceptor da borda em escova do intestino médio de inseto que são reconheci-das por endotoxinas inseticidas de Bacillus thuringiensis. Vide, por exemplo,Knight et al. (1995) J. Biol. Chem., 270:17765- 17770, e Gill et al. (1995) J.BioL Chem., 270:27277-27282, que descrevem o isolamento, identificação, eclonagem de exemplos de tais proteínas receptoras; Gomez et al. (2001) J.Biol, Chem., 276:28906-28912, e Daniel et al. (2002) Appl. Env. MicrobioL,68:2106-2112, que descrevem técnicas para identificar epítopos de ligaçãode tais proteínas receptoras e para estudar suas afinidades de ligação; Ju-rat-Fuentes & Adang (2001) Appl. Env. Microbiol., 67:323-329, e Jurat-Fuentes et al. (2001), Appl. Env. Microbiol., 67:872-879, que descrevem en-saios de ligação de receptor de endotoxina envolvendo ligação medida tantopor blots de membrana quando ressonância de plasma de superfície de ve-sículas da membrana da borda em escova a endotoxina. Outros exemplosde Iigantes adequados aos quais aptâmeros de RNA da invenção se ligamincluem receptores de esteróides, tais como receptores de estrogênio, re-ceptores de androgênio, receptores de retinóides, e receptores de ecdisona(vide, por exemplo, Saez et al. (2000) Proc. NatL Acad. Sei. USA, 97:14512-14517. Quando Iigantes são moléculas receptoras ou complexos receptores,aptâmeros de RNA da invenção podem agir opcionalmente como antagonis-tas ou agonistas. Uma classe de aptâmeros de RNA útil na invenção são"termoswitches" que não se ligam a um Iigante mas são responsivos termi-camente, isto quer dizer, a conformação do aptâmero é determinada pelatemperatura. Vide, por exemplo, Quadro 3 in Mandai & Breaker (2004) Natu-re Reν. MoL Cell Biol., 5:451 -463.
Um aptâmero pode ser descrito por seu estado de ligação, istoé, se o aptâmero está ligado (ou desligado) ao seu respectivo ligante. O sítiode ligação (ou domínio ou domínios de ligação tridimensional) de um aptâ-mero pode ser descrito como ocupado ou não ocupado pelo ligante. De for-ma semelhante, uma população de um dado aptâmero pode ser descritapela fração da população que está ligada ou desligada do ligante. A afinida-de de um aptâmero pelo seu ligante pode ser descrita em termos da taxa deassociação (ligação) do aptâmero com o ligante e a taxa de dissociação doligante do aptâmero, por exemplo, pela constante de associação de equilí-brio (K) ou pela sua recíproca, a constante de afinidade (Ka) como é bem-conhecido na técnica. Essas taxas podem ser determinadas por métodossimilares àqueles comumente usados para determinar a cinética de ligaçãode Iigantes e receptores ou antígenos e anticorpos, tais como, mas não limi-tados a, ensaios de equilíbrio, ensaios de competição, ressonância de plas-ma de superfície, e modelos preditivos. A afinidade de um aptâmero peloseu ligante pode ser selecionada, por exemplo, durante a evolução in vitrodo aptâmero, ou modificada adicionalmente por alterações à seqüência pri-maria do aptâmero, onde tais alterações podem ser guiadas por cálculos deenergia de ligação ou por algoritmos, por exemplo, como descrito por Zuker(2003) Nucleic Acids fles.,31:3406-3415 ou Bayer & Smolke (2005) NatureBiotechnol., 23:337-343.
O estado de ligação de um aptâmero preferivelmente determinapelo menos parcialmente a estrutura secundária (por exemplo, a formaçãode regiões duplo filamento ou filamento única) e a conformação tridimensio-nal do aptâmero. Em modalidades onde o DNA capaz de ser transcrito aindainclui DNA que transcreve RNA regulatório capaz de regular a expressão deuma seqüência alvo, o estado de ligação do aptâmero afeta alostericamentea conformação do RNA regulatório e assim a habilidade do RNA regulatórioregular a expressão da seqüência alvo.
Em uma modalidade preferida, o aptâmero (RNA transcrito) éflanqueado por DNA que transcreve RNA capaz de formar RNA duplo fila-mento (dsRNA). Em algumas dessas modalidades, o dsRNA é processadopor um mecanismo de RNAi (siRNA ou miRNA), por meio do qual o aptâme-ro é clivado do resto do transcrito. Em outras modalidades particularmentepreferidas, as duas regiões de RNA transcritas que flanqueiam o aptâmeroformam pelo menos parcialmente um "stem" de RNA duplo filamento entreelas, em que o aptâmero serve como um "espaçador" ou "alça" em uma es-trutura "stem-loop"; tal arranjo é esperado aumentar a estabilidade ou meia-vida do transcrito de uma maneira análoga àquela observada para DNA (vi-de, por exemplo, Di Giusto & King (2004) J. Bioi Chem., 279:46483-46489).Plantas transgênicas que têm no seu genoma DNA que transcreve tais ap-tâmeros que têm estabilidade aumentada são particularmente desejáveis,por exemplo, onde o aptâmero funciona para inibir ou matar um patógeno oupraga da planta transgênica.
RNA requlatório: em muitas modalidades, o DNA capaz de sertranscrito ainda inclui DNA que transcreve RNA regulatório capaz de regulara expressão de uma seqüência alvo em que a regulação da seqüência alvoé dependente da conformação do RNA regulatório, e a conformação do RNAregulatório é afetada alostericamente pelo estado de ligação do aptâmero deRNA. Tais combinações de um aptâmero com um domínio de RNA regulató-rio são comumente conhecidas como "riboswitches". O RNA regulatório estátipicamente à jusante do aptâmero, mas dos dois domínios podem se sobre-por; vide, por exemplo, Najafi-Shoushtari & Famulok (2005) RNA, 11:1514-1520, que descreve uma ribozima em forma de grampo que inclui um domí-nio de aptâmero e é regulada competitivamente por flavina mononucleotídeoe um oligonucleotídeo complementar ao domínio do aptâmero. Em algumasmodalidades, o RNA regulatório é operativamente ligado à seqüência alvo, eage "in eis". Em outras modalidades, o RNA regulatório não é operativamen-te ligado a seqüência alvo e age "in trans".
Qualquer seqüência alvo pode ser escolhida, incluindo uma oumais seqüências alvo selecionadas a partir de um gene nativo à plantatransgênica da invenção, um transgene na planta transgênica, e um genenativo a uma praga ou patógeno da planta transgênica. A seqüência alvopode incluir uma seqüência que expressa um gene de interesse (por exem-plo, um RNA que codifica uma proteína), ou uma seqüência que suprime umgene de interesse (por exemplo, um RNA que é processado para um siRNAou miRNA que por sua vez suprime o gene de interesse). A seqüência alvopode ser seqüência capaz de ser traduzida (codificante), ou pode ser se-qüência não codificante (tal como seqüência regulatória não codificante), ouambas. A seqüência alvo pode incluir pelo menos uma seqüência alvo euca-riótica, pelo menos uma seqüência alvo não-eucariótica, ou ambas. Umaseqüência alvo pode incluir qualquer seqüência de qualquer espécie (inclu-indo, mas não limitado a, não-eucariotos, tais como bactérias e vírus; fun-gos, plantas; incluindo monocotiledôneas e dicotiledôneas, tais como plantasde cultivo, plantas ornamentais, e plantas não-domesticadas ou selvagens;invertebrados tais como artrópodes, anelídeos, nematódeos, e moluscos; evertebrados tais como anfíbios, peixe, aves, mamíferos domésticos ou sel-vagens e até mesmo humanos. Seqüências alvo adequadas são ainda des-critas como "genes alvo" sob o título "Genes Alvo".
Em modalidades de riboswitch que incluem um aptâmero e umRNA regulatório, o riboswitch regula a expressão da seqüência alvo porqualquer mecanismo adequado. Um mecanismo não Iimitante é a regulaçãotranscricional pela formação dependente de Iigante de um tronco terminadorintrínseco (uma estrutura "stem-loop" estendida tipicamente seguida por umasérie de 6 ou mais resíduos de U) que faz com que a RNA polimerase abortea transcrição, por exemplo, antes do RNAm completo ser formado. Em ri-boswitches "desligados", na ausência de Iigante suficiente, o domínio do ap-tâmero não ligado permite a formação de um "tronco antiterminador", queimpede a formação do tronco terminador intrínseco e assim permite que atranscrição ocorra; dessa forma, o estado padrão do riboswitch é "ligado"(isto é, a transcrição ocorre normalmente) e o Iigante deve ser adicionado adesligar o riboswitch. Em riboswitches "ligados" que usam esse mecanismo,o domínio do aptâmero deve estar na conformação ligada (ligante ocupado)para permitir a formação do "tronco antiterminador" e permitir a transcrição.
Outro mecanismo é a regulação da tradução, onde a ligação do ligante cau-sa alterações estruturais em mRNAs de extensão completa e assim permite(ou impede) que os ribossomos se liguem ao sítio de ligação ribossomal(RBS); a formação de um tronco "anti-anti-RBS" e um tronco "anti-RBS"também é mutuamente exclusivo. Em riboswitches "ligados" que usam essemecanismo, a ausência do Iigante permite a formação de um anti-anti-RBS,e assim um RBS estruturalmente desimpedido ao qual o ribossomo pode seligar. Uma combinação da regulação transcricional e traducional também épossível. Para uma discussão detalhada de mecanismos de regulação, videMandai & Breaker (2004) Nature Rev. MoL Cell Biol., 5:451-463.
Em algumas modalidades, o RNA regulatório inclui uma ribozi-ma, por exemplo, uma ribozima de autoclivagem, uma ribozima em forma decabeça de martelo, ou uma ribozima em forma de grampo. Certas modalida-des do RNA regulatório incluem seqüência de RNA que é complementar ousubstancialmente complementar à seqüência alvo. Um exemplo não Iimitan-te é onde o RNA regulatório inclui um segmento anti-sentido que é comple-mentar ou substancialmente complementar à seqüência alvo. Vide, por e-xemplo, Bayer & Smolke (2005) Nature Biotechnol., 23:337-343, onde o RNAregulatório inclui tanto segmento anti-sentido complementar à seqüência al-vo, como um segmento sentido complementar ao segmento anti-sentido, emque o segmento anti-sentido e o segmento sentido são capazes de hibridizarum ao outro para formar um RNA duplo filamento intramolecular.
Em algumas modalidades, a regulação de uma seqüência alvoenvolve pareamento de base de Watson-Crick do RNA regulatório à seqüên-cia alvo (por exemplo, em modalidade transatuantes vide, por exemplo, Ba-yer & Smolke (2005) Nature Biotechnol., 23:337-343). Particularmente nocaso de tais modalidades transatuantes, seqüências alvo adequadas inclu-em os genes alvo descritos sob o título "Genes Alvo". Uma seqüência alvode interesse pode ser atingida mais especificamente por desenhar o RNAregulatório para incluir regiões substancialmente não idênticas a uma se-qüência não alvo. Seqüências não-alvo podem incluir qualquer gene para oqual a expressão preferivelmente não é modificada, tanto em uma plantaque transcreve o constructo de DNA recombinante como em organismos quepodem entrar em contato com o RNA transcrito a partir do constructo deDNA recombinante. Uma seqüência não-alvo pode incluir qualquer seqüên-cia de qualquer espécie (incluindo, mas não limitado a, não-eucariotos taiscomo bactérias, e vírus; fungos, plantas; incluindo monocotiledôneas e dico-tiledôneas, tais como plantas de cultivo, plantas ornamentais, e plantas não-domesticadas ou selvagens; invertebrados tais como artrópodes, anelídeos,nematódeos, e moluscos; e vertebrados tais como anfíbios, peixes, aves,mamíferos domésticos ou selvagens, ou até mesmo seres humanos).
Uma modalidade fornece uma planta transgênica que tem noseu genoma um constructo de DNA recombinante que inclui DNA capaz deser transcrito que inclui DNA que transcreve RNA capaz de se ligar a umligante, em que o constructo confere macho esterilidade ou fertilidade indu-zível ou supressível quimicamente para hibridização. Exemplos preferidosusam um riboswitch que contém um aptâmero que se liga a um ligante que éuma substância já registrada, por exemplo, um herbicida aprovado. Em umexemplo não limitante, uma planta transgênica que carrega um gene de ma-cho esterilidade sob o controle de um promotor macho-específico e um ri-boswitch "desligado" de glifosato é macho estéril a menos que seja aplicadoglifosato. Ao contrário, uma planta transgênica que carrega um gene de ma-cho esterilidade sob o controle de um promotor macho-específico e um ri-boswitch "ligado" de glifosato é macho estéril apenas quando glifosato é aplicado.
Uma aplicação da invenção é fornecer um sistema resistente aherbicida, ativado por ligante para preservação de identidade gênica ("blo-queio gênico") assim como para manter controle voluntário resistente a her-bicida. Em uma modalidade, a seqüência de DNA que codifica um riboswitch"ligado" é inserida em um cassete de expressão que contém como a se-qüência alvo "CP4", um marcador selecionável que confere resistência aoglifosato, epsps-cp4 (5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase da cepa CP4de Agrobacterium tumefaciens), para expressar condicionalmente CP4 emplantas transgênicas. Plantas transgênicas que carregam o cassete de ex-pressão de CP4 controlado por riboswitch expressam CP4 apenas na pre-sença do ligante, que é aplicado (por exemplo, por uma pulverização foliar) àplanta por meio de uma formulação de glifosato específica que contém oligante. Ao ser aplicado, o herbicida de glifosato formulado ativa a transcri-ção/tradução de CP4 e torna a planta transgênica resistente ao glifosato.Plantas transgênicas são suscetíveis a formulações de glifosato genéricasque não contêm o ligante. Da mesma forma, essa abordagem pode ser apli-cada a qualquer outra combinação de gene de resistência a herbici-da/herbicida, por exemplo, combinações de oxigenase que degrada dicam-ba/dicamba, ou gene de resistência a antibiótico/antibiótico.
Em outra modalidade, a seqüência alvo é um gene endógeno auma dada espécie, tal como uma dada planta (tal como, mas não limitado a,plantas agricolamente ou comercialmente importantes, incluindo monocotile-dôneas e dicotiledôneas) e a seqüência não-alvo pode ser, por exemplo, umgene de uma espécie não-alvo, tal como outra espécie de planta ou um genede um vírus, fungo, bactéria, invertebrado, ou vertebrado ou até mesmo umser humano. Um exemplo não Iimitante é onde é desejável desenhar o ap-tâmero, ou o RNA regulatório, ou ambos, a fim de modificar a expressão deuma seqüência alvo que é endógena do gene para uma única espécie (porexemplo, lagarta da raiz do milho Ocidental, Diabrotica virgifera virgifera Le-Conte) mas não modificar a expressão de uma seqüência não-alvo tais co-mo genes de espécies relacionadas, até mesmo intijriamentej-elacionadas(por exemplo, lagarta da raiz do Norte, Diabrotica barberi Smith & Lawrence,ou lagarta da raiz do milho do Sul, Diabrotica undecimpurictata).
Em outras modalidades (por exemplo, onde é desejável modifi-car a expressão de uma seqüência alvo entre várias espécies), pode ser de-sejável desenhar o aptâmero, ou o RNA regulatório ou ambos, para modifi-car a expressão de uma seqüência alvo comum às múltiplas espécies nasquais a expressão da seqüência alvo deve ser modificada. Dessa forma, oaptâmero, ou o RNA regulatório, ou ambos, pode ser selecionado para serespecífico para um táxon (por exemplo, específico para um gênero, família,ou até mesmo um táxon maior tal como um filo, por exemplo, artrópodes),mas não para outros táxons (por exemplo, plantas ou vertebrados ou mamí-feros). Em um exemplo não Iimitante dessa modalidade, um RNA regulatóriopode ser selecionado a fim de atingir fungos patogênicos (por exemplo, umFusarium spp.), mas não atingir qualquer seqüência gênica de fungos bené-ficos (por exemplo, fungos benéficos de micorrizas do solo).
Em outro exemplo não Iimitante dessa modalidade, o aptâmero,ou o RNA regulatório, ou ambos, para regular a expressão em lagarta de raizdo milho podem ser selecionados para ser específicos para todos os mem-bros do gênero Diabrotica. Por exemplo, um RNA regulatório que inclui umelemento de supressão gênica direcionado para Diabrotica (por exemplo,RNA anti-sentido, RNA duplo filamento, microRNA, ou repetições de RNAem tandem) podem ser selecionadas a fim de atingir qualquer seqüência degene de coleópteros benéficos (por exemplo, besouros coccinelídeos benéfi-cos, comumente conhecidos como joaninhas) ou outras espécies de insetosbenéficos.
O grau necessário de especificidade de um RNA regulatório queinclui um elemento de supressão gênica (por exemplo, RNA anti-sentido,RNA duplo filamento, microRNA, ou repetições de RNA em tandem) parasupressão de uma seqüência alvo depende de vários fatores. Por exemplo,onde o elemento de supressão gênica inclui RNA duplo filamento (dsRNA),fatores podem incluir o tamanho dos menores fragmentos de dsRNA que seespera que sejam produzidos pela ação de Dicer, e a importância relativa dediminuir o potencial de dsRNA's suprimirem as seqüências não-alvo. Porexemplo, onde os fragmentos de dsRNA são esperados ter 21 pares de ba-se de tamanho, uma modalidade particularmente preferida pode ser incluirno RNA regulatório, uma seqüência capaz de formar dsRNA e codificar regi-ões substancialmente não-idênticas a uma seqüência não-alvo, tal comoregiões dentro das quais cada fragmento contíguo que inclui pelo menospareamentos de 21 nucleotídeos de menos do que 21 (por exemplo, de me-nos do que 21, ou de menos do que 20, ou de menos do que 19, ou de me-nos do que 17) dos 21 nucleotídeos contíguos de uma seqüência não-alvo.Em outra modalidade, regiões substancialmente não-idênticas a uma se-qüência não-alvo incluem regiões dentro das quais cada fragmento contíguoque inclui pelo menos pareamentos de 19 nucleotídeos de menos que 19(por exemplo, menos do que 19, ou menos do que 18, ou menos do que 17,ou menos do que 16) dos 19 nucleotídeos contíguos de uma seqüência não-alvo.
Em algumas modalidades, pode ser desejável desenhar o aptâ-mero, o RNA regulatório, ou ambos, para incluir regiões previstas para nãogerar polipeptídeos indesejáveis, por exemplo, por rastrear o aptâmero, oRNA regulatório, ou ambos, quanto a seqüências que podem codificar poli-peptídeos indesejáveis conhecidos ou homólogos próximos desses. Polipep-tídeos indesejáveis incluem, mas não são limitados a, polipeptídeos homólo-gos a polipeptídeos alergênicos conhecidos e polipeptídeos homólogos atoxinas polipeptídicas conhecidas. Seqüências disponíveis publicamente quecodificam tais peptídeos potencialmente alergênicos estão disponíveis, porexemplo, a base de dados de alergeno do Food Allergy Research and Re-source Program (FARRP) (disponível em allergenonline.com) ou as basesde dados Biotechnology Information for Food Safety Databases (disponíveisem www.iit.edu/~sgendel/fa.htm) (vide também, por exemplo, Gendel (1998)Adv. Food Nutr. Res., 42:63-92). Seqüências indesejáveis também podemincluir, por exemplo, aquelas seqüências de polipeptídeo apontadas comotoxinas conhecidas ou como alergenos potenciais ou conhecidos e contidasem bases de dados publicamente disponíveis tais como GenBank, EMBL,SwissProt, e outras, que são pesquisáveis pelo sistema Entrez(www.ncbi.nih.gov/Entrez)., Exemplos não Iimitantes de seqüências de peptí-deos potencialmente alergênicos incluem glicinina de soja, oleosina e agluti-nina de amendoim, gluteninas de trigo, caseína, lactalbumina, e Iactoglobuli-na de leite bovino e tropomiosina de vários moluscos (allergenonline.com).Exemplos não Iimitantes de peptídeos potencialmente tóxicos indesejáveisincluem toxina tetânica tetA de Clostridium tetani, toxinas diarréicas de Sta-phylococcus aureus, e venenos tais como conotoxinas de Conus spp. e neu-rotoxinas de artrópodes e repteis (www.ncbi.nih.gov/Entrez).
Em um exemplo não limitante, um aptâmero proposto, RNA re-gulatório, ou ambos, pode ser rastreado para eliminar aquelas seqüênciascapazes de ser transcritas que codificam polipeptídeos com homologia per-feita a um alergeno ou toxina conhecida por 8 aminoácidos contíguos, oucom pelo menos 35% de identidade por pelo menos 80 aminoácidos; taisrastreamentos podem ser realizados em qualquer e todas as possíveis fasesde leitura em ambas as direções, em fases abertas de leitura potenciais quecomeçam com ATG, ou em todas as possíveis fases abertas de leitura, in-dependente de ser elas começam com um ATG ou não. Quando um "acerto"ou pareamento é feito, isto é, quando uma seqüência que codifica um poli-peptídeo potencial com homologia perfeita a um alergeno ou toxina conheci-da por 8 aminoácidos consecutivos (ou pelo menos cerca de 35% de identi-dade por pelo menos cerca de 80 aminoácidos), é identificado, as seqüên-cias de ácido nucléico que correspondem ao acerto podem ser evitadas, eli-minadas, ou modificadas ao selecionar seqüências a ser usadas em umRNA para silenciar um gene alvo.
Evitar, eliminar, ou modificar uma seqüência indesejada podeser obtido por qualquer um de vários métodos conhecidos daqueles versa-dos na técnica. Em alguns casos, o resultado pode ser novas seqüênciasque são acreditadas não existirem naturalmente. Por exemplo, evitar certasseqüências pode ser obtido por unir seqüências "limpas" em novas seqüên-cias quiméricas para ser usadas em elemento de supressão gênica.
Onde o RNA regulatório inclui RNA duplo filamento (dsRNA) pa-ra silenciar um gene alvo, os requerentes reconhecem que em algum silen-ciamento mediado por dsRNA, é possível que seqüências de dsRNA quenão pareiam perfeitamente sejam eficazes no silenciamento gênico. Por e-xemplo, foi mostrado que não pareamentos próximo ao centro de um sítiocomplementar de miRNA tem efeitos mais fortes sobre o silenciamento gêni-co do miRNA do que pareamentos localizados mais distalmente. Vide, porexemplo, Figura 4 em Mallory et ai. (2004) EMBO J., 23:3356-3364. Em ou-tro exemplo, foi relatado que, tanto a posição de um par de base não parea-do quanto a identidade dos nucleotídeos que formam o não pareamento in-fluenciam a habilidade de um dado siRNA silenciar uma seqüência alvo, eque não pareamentos adenina-citosina, além do par de base oscilante G:U,foram bem-tolerados (vide Du et ai. (2005) Nucleic Acids Res., 33:1671-1677). Dessa forma, um dsRNA regulatório que inclui RNA duplo filamentonão precisa sempre ter 100% de identidade de seqüência com a seqüênciaalvo pretendida, mas geralmente teria preferivelmente identidade de se-qüência substancial com a seqüência alvo pretendida, tal como cerca de95%, cerca de 90%, cerca de 85%, ou cerca de 80% de identidade de se-qüência com a seqüência alvo pretendida. Um versado na técnica seria ca-paz de julgar a importância dada ao rastreamento por regiões previstas paraser mais altamente específicas à primeira seqüência alvo ou previstas paranão gerar polipeptídeos indesejáveis, em relação à importância dada a ou-tros critérios, tais como, mas não limitados a, porcentagem de identidade deseqüência com a primeira seqüência alvo pretendida ou a eficiência de si-Ienciamento gênico prevista de uma dada seqüência. Por exemplo, pode serdesejável para um dado RNA regulatório que inclui RNA duplo filamento pa-ra silenciamento gênico ser ativo entre várias espécies e, portanto um ver-sado na técnica pode determinar que é mais importante incluir no RNA regu-latório regiões específicas para as várias espécies de interesse, mas menosimportante rastrear por regiões previstas para ter maior eficiência de silenci-amento gênico ou para regiões previstas para gerar polipeptídeos indesejá-veis.
Em muitas modalidades, a célula de planta transgênica tem noseu genoma DNA recombinante que inclui DNA capaz de ser transcrito queinclui: (a) DNA que transcreve um aptâmero de RNA capaz de se ligar a um ligante, e (b) DNA que transcreve RNA regulatório capaz de regular a ex-pressão de uma seqüência alvo, em que a regulação.é dependente da. con-formação do RNA regulatório, e a conformação do dito RNA regulatório éafetada alostericamente pelo estado de ligação do dito aptâmero de RNA.Nessas modalidades, ligação do aptâmero ao seu ligante resulta em uma alteração específica na expressão da seqüência alvo, que pode ser um au-mento ou uma diminuição na expressão, dependendo do desenho do DNArecombinante.
Em uma modalidade, a ligação do ligante o aptâmero de RNAresulta em um aumento da expressão da seqüência alvo em relação à ex-pressão na ausência da ligação. Em outra modalidade, a ligação do liganteao aptâmero de RNA resulta em uma diminuição da expressão da seqüênciaalvo em relação à expressão na ausência da ligação.
Algumas modalidades são caracterizadas por "auto-induci-bilidade". Em tal modalidade, a ligação do ligante ao aptâmero de RNA resul- ta em um aumento de expressão da seqüência alvo em relação à expressãona ausência da ligação, em que o aumento de expressão resulta em um ní-vel do ligante suficiente para manter o aumento de expressão. Em outra mo-dalidade, a ligação do ligante ao aptâmero de RNA resulta em uma diminui-ção de expressão da seqüência alvo em relação a expressão na ausência daligação, a diminuição da expressão resultando em um nível de Iigante sufici-ente para manter o aumento de expressão.
Dessa forma, outro aspecto da invenção é um método de modifi-car a expressão de um gene de interesse em uma célula de planta, que in-clui transcrever em uma célula de planta transgênica da invenção, ou umaplanta, planta de progênie, ou semente ou outro tecido de planta derivado detal célula de planta transgênica, DNA recombinante ou heterólogo capaz deregular a expressão de uma seqüência alvo, em que a regulação é depen-dente da conformação do RNA regulatório, e em que a conformação do RNAregulatório é afetada alostericamente pelo estado de ligação do aptâmero deRNA, pelo qual a expressão do gene de interesse é modificada em relação asua expressão na ausência de transcrição do constructo de DNA recombi-nante.
íntrons: como usado aqui, "íntron" ou "seqüência de íntron" ge-ralmente significa seqüência de DNA não-codificante de um gene natural,que mantém nos constructos de DNA recombinantes dessa invenção, suacapacidade nativa de serem retirados de transcritos de pré-mRNA, por e-xemplo, seqüências de íntron nativas encontradas associadas com regiõesde RNA que codificam proteína, em que os íntrons nativos sofrem entrança-mento, permitindo que éxons sejam agrupados em mRNAs maduros antesdo RNA deixar o núcleo. Tal íntron retirável tem um sítio de splice 5' e umsítio de splice 3'. íntrons podem sofrer "auto-entrançamento" ou não sofrer"auto-entrançamento" (isto é, que requer enzimas ou um spliceossomo paraque o entrançamento ocorra) e podem ser selecionados quanto a diferenteeficiência de entrançamento.
íntrons adequados para uso em constructos da invenção podemser íntrons virais (por exemplo, Yamada et ai (1994) Nucleic Acids Res.,22:2532-2537), íntrons eucarióticos (incluindo íntrons de animais, de fungose de plantas), íntrons arqueanos ou bacterianos (por exemplo, Belfort et al.(1995) J. Bacteriol., 177:3897-3903), ou qualquer seqüência de DNA de o-corrência natural ou artificial (por exemplo, Yoshimatsu & Nagawa (1989)Science, 244:1346-1348) com funcionalidade semelhante a íntron na plantana qual o constructo de DNA recombinante da invenção deve ser transcrito.Embora essencialmente qualquer íntron possa ser usado na pratica dessainvenção como um hospedeiro para DNA inserido, particularmente preferidossão íntrons que aumentam a expressão em uma planta ou íntrons que sãoderivados de uma seqüência líder 5' não traduzida. Quando um constructode DNA recombinante da invenção é usado para transformar uma planta,íntrons originados na planta podem ser especialmente preferidos. Exemplosde íntrons de planta especialmente preferidos incluem um íntron de actina 1de arroz (l-Os-Actl) (Wang et al. (1992) Moi Cell Biol., 12:3399-3406; McEI-roy et al. (1990) Plant Cell, 2:163-171), um íntron de proteína do choquetérmico de milho (l-Zm-hsp70) (Patentes U.S. 5.593.874 e 5,859.347), e umíntron de álcool desidrogenase de milho (l-Zm-adh1) (Callis et al. (1987) Ge-nes Dev., 1:1183-1200). Outros exemplos de íntrons adequados para uso nainvenção incluem a seqüência líder 5' do vírus do mosaico do tabaco ou líder "omega" (Gallie & Walbot (1992) Nucleic Acids Res., 20:4631 -4638), o íntronShrunken-I (Sh-1) (Vasil et al. (1989) PIantPhysioI., 91:1575-1579), o íntronde sacarose sintase de milho (Clancy & Hannah (2002) Plant Physiol.,130:918-929), o íntron da proteína de choque térmico 18 (hsp18) (Silva et al.(1987) J. Cell Biol., 105:245), e o íntron da proteína de choque térmico de 82kilodaltons (hsp82) (Semrau et al. (1989) J. Cell Biol., 109, ρ. 39A, e Mettleret al. (maio de 1990) N.A.T.O. Advanced Studies Institute on Molecular Bio-logy, Elmer, Bavaria).
Elementos de expressão qênica: os constructos de DNA recom-binantes podem ainda incluir um elemento de expressão gênica. Qualquer gene ou genes de interesse podem ser expressos pelo elemento de expres-são gênica, incluindo seqüência codificante ou não codificante, ou ambas, epode incluir seqüências de ocorrência natural ou seqüências artificiais ouquiméricas ou ambas. Quando o elemento de expressão gênica codifica umaproteína, tais constructos incluem preferivelmente um elemento terminadorfuncional para permitir a transcrição e tradução do elemento de expressãogênica. Em modalidades que incluem plantas transgênicas indutivamenteestéreis, o elemento de expressão gênica pode incluir, ou pode estar junto,ao RNA mensageiro que codifica uma proteína de tolerância a um herbicida.Em modalidades em que o constructo de DNA recombinantecontém um íntron, o constructo pode ainda incluir um elemento de expressãogênica para expressar pelo menos um gene de interesse, em que o elemen-to de expressão gênica está localizado adjacente ao íntron. Em outras mo-dalidades, o constructo de DNA recombinante inclui um íntron no qual estáinserido um gene de interesse, em que o elemento de expressão gênicatambém está localizado dentro do íntron; em tais casos, o elemento de ex-pressão gênica pode ser operativamente ligado a um elemento terminadorfuncional que está ele próprio também dentro do íntron. O gene de interessea ser expressão pelo elemento de expressão gênica pode incluir pelo menosum gene selecionado a partir do grupo que consiste em um gene alvo euca-riótico, um gene alvo não-eucariótico, uma seqüência de DNA precursora demicroRNA. O gene de interesse pode incluir um único gene ou múltiplos ge-nes (tais como múltiplas copias de um único gene, múltiplos alelos de umúnico gene, ou múltiplos genes que incluem genes de múltiplas espécies).Em uma modalidade, o elemento de expressão gênica pode incluir seqüên-cias de peptídeo auto-hidrolizantes, por exemplo, localizadas entre múltiplasseqüências codificantes para um ou mais polipeptídeos (vide, por exemplo,as seqüências de autoclivagem 2A e "semelhante a 2A" de várias espécies,incluindo vírus, tripanossomas, e bactérias, descritas por Donnelly et al.(2001), J. Gen. Virol., 82:1027-1041). Em outra modalidade, o elemento deexpressão gênica pode incluir seqüências de "salto" ribossomal, por exem-plo, localizadas entre múltiplas seqüências para um ou mais polipeptídeos(vide, por exemplo, as seqüências de "salto" ribossomal 2A do aftovírus dadoença aftosa (FMDV) descritas por Donnelly et al. (2001), J. Gen. Virol.,82:1013-1025).
Um gene de interesse pode incluir qualquer seqüência codifican-te ou não-codificante de qualquer espécie (incluindo, mas não limitado, não-eucariotos tais como bactérias e vírus; fungos; plantas, incluindo monocoti-ledôneas e dicotiledôneas, tais como planta de cultivo, plantas ornamentais,e plantas não domesticadas ou selvagens; invertebrados tais como artrópo-des, anelídeos, nematódeos, e moluscos; e vertebrados tais como anfíbios,peixe, aves, e mamíferos. Exemplos não Iimitantes de uma seqüência não-codificante a ser expressa por um elemento de expressão gênica incluem,mas não limitados a, regiões 5' não traduzidas, promotores, intensificadores,ou outras regiões transcricionais não-codificantes, regiões 3' não-traduzidas,terminadores, íntron, microRNAs, seqüências de DNA precursoras de mi-croRNA, pequenos RNAs de interferência, componentes de RNA de ribos-somos ou ribozimas, pequenos RNAs nucleolares, e outros RNAs não codifi-cantes. Exemplos não Iimitantes de um gene de interesse ainda incluem,mas não são limitados a, seqüência capaz de ser traduzida (codificante), taiscomo genes que codificam fatores de transcrição e genes que codificam en-zimas envolvidas na biossíntese ou catabolismo de moléculas de interesse(tais como aminoácidos, ácidos graxos e outros lipídios, açúcares e outroscarboidratos, polímeros biológicos, e metabólitos de origem biossintéticamista). Um gene de interesse pode ser um gene nativo à planta na qual oconstructo de DNA recombinante da invenção deve ser transcrito, ou podeser um gene não nativo. Um gene de interesse pode ser um gene marcador,por exemplo, um gene marcador.selecionável que codifica um gene,de resis-tência a antibiótico, antifúngico, ou herbicida ou um gene marcador que codi-fica uma característica facilmente detectável (por exemplo, fitoeno sintase ououtros genes que conferem um pigmento particular à planta), ou um geneque codifica uma molécula detectável, tal como uma proteína fluorescente,luciferase, ou um polipeptídeo único ou "sinalizador" de ácido nucléico detec-tável por métodos de detecção de proteína ou ácido nucléico, respectiva-mente). Marcadores selecionáveis são genes de interesse de utilidade parti-cular em identificar processamento bem sucedido de constructos da inven-ção.
Em algumas modalidades da invenção, os constructos de DNArecombinante são desenhados para suprimir pelo menos um gene endógenoou exógeno e para expressar simultaneamente pelo menos um gene exóge-no. Em um exemplo não limitante, o constructo de DNA recombinante incluium elemento de supressão gênica para suprimir um gene de Iisina cetogluta-rato redutase/sacaropina desidrogenase (LKR/SDH) (de milho) endógeno,um elemento de expressão gênica para expressar uma proteína ácido dii-drodipicolínico sintase (bacteriana) exógena, e um DNA que transcreve RNAque inclui: (a) pelo menos um sítio de reconhecimento de miRNA exógenoreconhecível por um miRNA maduro que é expresso especificamente emtecido reprodutivo da planta; e (b) RNA mensageiro que codifica epsps-CP4,em que o miRNA maduro suprime especificamente a expressão de epsps-CP4 no tecido reprodutivo, e em que a esterilidade da planta transgênica éinduzível pela aplicação de glifosato à planta. Tal constructo seria especial-mente útil para fornecer milho com níveis aumentados de Iisina e tolerânciageral de glifosato, em que a esterilidade do milho é induzível pela aplicaçãode glifosato no(s) momento(s) do desenvolvimento apropriado(s). Em outroexemplo não limitante, o constructo de DNA recombinante inclui um elemen-to de supressão gênica para suprimir um gene de lagarta de raiz do milho, eDNA que transcreve RNA que inclui: (a) pelo menos um sítio de reconheci-mento de miRNA exógeno reconhecível por um miRNA maduro que é ex-presso especificamente em tecido reprodutivo da planta; e (b) RNA mensa-geiro que codifica epsps-CP4, em que o miRNA maduro suprime especifi-camente a expressão de epsps-CP4 no tecido reprodutivo, e em que a este-rilidade da planta transgênica é induzível pela aplicação de glifosato à plan-ta. Tal constructo seria especialmente útil para fornecer milho com resistên-cia à lagarta da raiz de milho e tolerância geral de glifosato em que a esteri-lidade do milho é induzível pela aplicação de glifosato no(s) momento(s) dodesenvolvimento apropriado(s).
Bordas de T-DNA: as bordas de T-DNA referem-se às seqüên-cias de DNA ou regiões de DNA que definem o início e o final de um T-DNAde Agrobacterium T-DNA (DNA de tumor) e funcionam in eis para transfe-rência de T-DNA no genoma de uma planta por transformação mediada porAgrobacterium (vide, por exemplo, Hooykaas & Schilperoort (1992) PlantMol. Biol., 19:15-38). Várias modalidades incluem constructo de DNA re-combinante sem bordas de T-DNA1 uma única borda de T-DNA, ou mais doque uma borda de T-DNA. Por exemplo, em modalidades onde o constructode DNA recombinante inclui um íntron no qual um elemento de supressãogênica está inserido, o íntron está localizado preferivelmente entre um par debordas de T-DNA, que podem ser um grupo de bordas de T-DNA esquerda e-direita, um grupo de duas bordas de T-DNA esquerdas, ou um grupo de du-as bordas de T-DNA direitas. Em outra modalidade, o constructo de DNArecombinante inclui uma única borda de T-DNA, um elemento de supressãogênica inserido em íntron, e pelo menos um elemento de expressão gênica.
Terminadores: muitas modalidades, particularmente onde oconstructo de DNA recombinante é projetado para ser transcrito em RNAmensageiro, incluem tanto um elemento promotor quanto um elemento ter-minador funcional que inclui um sinal de poliadenilação funcional e um sítiode poliadenilação, permitindo que o RNA transcrito a partir do constructo deDNA recombinante seja poliadenilado e processado para transporte paradentro do citoplasma.
Em modalidades gerais como descritas sob o título "Constructosde DNA Recombinantes que Incluem Sítios de Reconhecimento de MicroR-NA", um elemento terminador funcional pode estar presente ou ausente. Emmodalidades onde um elemento terminador funcional está ausente, pelo me-nos um de um sinal de poliadenilação funcional e um sítio de poliadenilaçãofuncional está ausente. Em outras modalidades, uma região 3' não traduzidaestá ausente. Nesses casos, o constructo de DNA recombinante é transcritocomo RNA não-poliadenilado e preferivelmente não é transportado para den-tro do citoplasma.
DNA espaçador: segmentos de DNA espaçador podem incluirvirtualmente qualquer DNA (tal como, mas não limitado a, seqüência de DNAcapaz de ser transcrita que codifica um gene de interesse, seqüência deDNA capaz de ser transcrita que codifica um gene marcador ou repórter;DNA capaz de ser transcrito derivado de um íntron, que na transcrição podeser retirado do RNA transcrito resultante; DNA capaz de ser transcrito quecodifica RNA que forma uma estrutura tal como uma alça ou "stem" ou umaptâmero capaz de se ligar a um Iigante específico; DNA que pode sofrerentrançamento tais como íntrons e ribozimas que sofrem "auto-entran-çamento"; DNA capaz de ser transcrito que codifica uma seqüência para de-tecção por hibridização de ácido nucléico, amplificação, ou seqüenciamento;e uma combinação desses). DNA espaçador pode ser encontrado, por e-xemplo, adjacente a um elemento de expressão gênica. Em algumas moda-lidades, o DNA espaçador é em si seqüência sentido ou anti-sentido do genealvo. Em algumas modalidades preferidas, o RNA transcrito a partir do DNAespaçador (por exemplo, uma grande alça de seqüência anti-sentido do ge-ne alvo ou um aptâmero) assume uma estrutura secundaria ou configuraçãotridimensional que confere ao transcrito uma característica desejada, tal co-mo estabilidade aumentada, meia-vida in vivo aumentada, ou especificidadede célula ou tecido.
Fazendo e Usando Constructos de DNA Recombinante
Os constructos de DNA recombinante da presente invenção po-dem ser feitos por qualquer método adequado para a aplicação pretendida,levando em consideração, por exemplo, o tipo de expressão desejada e aconveniência de uso na planta na qual o constructo deve ser transcrito. Mé-todos comuns para fazer e usar constructos de DNA e vetores são bem-conhecidos na técnica e descritos em detalhes, por exemplo, em compên-dios e manuais de laboratório incluindo Sambrook & Russell, "Molecular Clo-ning: A Laboratory Manual" (terceira edição), Cold Spring Harbor LaboratoryPress, NY, 2001. Um exemplo de tecnologia útil para construção de cons-tructos de DNA e vetores para transformação está descrito na Publicação dePedido de Patente US 2004/0115642 A1. Constructos de DNA também po-dem ser construídos usando a tecnologia de clonagem GATEWAY™ (dispo-nibilizada por Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), que usa a reaçãode clonagem de recombinase LR sítio-específica do sistema Integrase/atf daconstrução do vetor de bacteriófago lambda, ao invés de endonucleases derestrição e ligases. A reação de clonagem LR está descrita nas PatentesU.S. 5.888.732 e 6.277.608 e nas Publicações de Pedido de Patente U.S.2001/283529, 2001/282319 e 2002/0007051. O Manual de Instruções daTecnologia de Clonagem GATEWAY™, que também é fornecido pela Invi-trogen, fornece instruções resumidas para clonagem de rotina de qualquerDNA desejado em um vetor que compreende elementos de expressão emplanta operáveis. Outro método alternativo de fabricação de vetor emprega aclonagem independente de ligação como descrita por Aslandis et al. (1990)Nucleic Acids Res., 18:6069-6074 e Rashtchian et al. (1992) Biochem.,206:91-97, onde um fragmento de DNA com terminações 5' e 3' de filamentosimples é ligado a um vetor desejado que pode então ser amplificado in vivo.Em certas modalidades, a seqüência de DNA do constructo deDNA recombinante inclui uma seqüência que teve otimização de códon paraa planta na qual o constructo de DNA recombinante deve ser expresso. Porexemplo, um constructo de DNA recombinante a ser expresso em uma plan-ta pode ter toda ou parte de sua seqüência (por exemplo, o primeiro elemen-to de supressão gênica ou o elemento de expressão gênica) com otimizaçãode códon para expressão em uma planta por métodos conhecidos na técni-ca. Vide, por exemplo, Patente U.S. 5.500,365 para uma descrição de otimi-zação de códon para plantas; vide também De Amicis & Marchetti (2000)Nucleic Acid Res., 28:3339-3346.
CÉLULAS DE PLANTA TRANSGÊNICAS E PLANTAS TRANSGÊNICAS
Um aspecto adicional dessa invenção fornece uma célula deplanta transgênica que tem no seu genoma qualquer um dos constructos deDNA recombinante fornecidos por essa invenção. Ainda é fornecida umaplanta transgênica que contem célula de planta transgênica dessa invenção.A planta transgênica da invenção inclui plantas em qualquer estágio de de-senvolvimento e inclui uma planta regenerada preparada a partir de célulastransgênicas de planta aqui reivindicadas ou uma planta de progênie (quepode ser uma planta de progênie natural ou híbrida) da planta regenerada ousemente de tal planta transgênica. Também fornecida e reivindicada é umasemente transgênica que tem no seu genoma qualquer um dos constructosde DNA recombinante fornecidos por essa invenção.
Uma modalidade inclui uma planta transgênica que tem no seugenoma um constructo de DNA recombinante que transcreve RNA que in-clui: (a) pelo menos um sítio de reconhecimento de miRNA exógeno reco-nhecível por um miRNA maduro que é especificamente expresso em tecidoreprodutivo da planta (ou seja, uma planta preparada a partir de célula deplanta transgênica); e (b) RNA mensageiro que codifica uma proteína queconfere tolerância a um herbicida; em que o miRNA maduro suprime especi-ficamente a expressão da proteína no tecido reprodutivo, e em que a esteri-lidade de uma planta transgênica preparada a partir da célula de plantatransgênica é induzível pela aplicação do herbicida à planta.
A célula de planta transgênica pode ser uma célula de plantaisolada (por exemplo, células de planta individuais ou células cultivadas emou sobre um meio de cultura artificial) ou pode ser uma célula de planta emtecido não diferenciado (por exemplo, calo ou qualquer agregado de célulasde planta). A célula de planta transgênica pode ser uma célula de planta empelo menos um tecido diferenciado selecionado a partir do grupo que consis-te em folha (por exemplo, pecíolo e limbo), raiz, tronco (por exemplo, tubér-culo, rizoma, estolho, bulbo e cormo), caule (por exemplo, xilema e floema),madeira, semente, fruto (por exemplo, noz, grão, frutas frescas) e flor (porexemplo, estame, filamento, antera, pólen, carpelo, pistilo, ovário, óvulos).
A célula de planta transgênica ou planta transgênica da invençãopode ser qualquer célula de planta ou planta de interesse, tanto as célulasde planta transitoriamente transformadas quanto as estavelmente transfor-madas são abrangidas por essa invenção. Plantas transgênicas estavelmen-te transformadas são particularmente preferidas. Em muitas modalidadespreferidas, a planta transgênica é uma planta transgênica fértil da qual a se-mente pode ser colhida e a invenção ainda reivindica semente transgênicade tais plantas transgênicas, em que a semente preferivelmente tambémcontém o constructo recombinante dessa invenção.
Fazendo e Usando Células de Planta Transgênicas e Plantas Transgênicas
Quando um constructo de DNA recombinante é usado para pro-duzir uma célula de planta traosgênica, planta transgênica ou sementetransgênica dessa invenção, a transformação pode incluir qualquer um dosmétodos e composições bem-conhecidos e demonstrados. Métodos ade-quados para transformação de planta incluem virtualmente qualquer métodopelo qual o DNA pode ser introduzido em uma célula, tal como por liberaçãodireta de DNA (por exemplo, transformação de protoplastos mediada porPEG, por eletroporação, por agitação com fibras de carboneto de silicone, epor aceleração de partículas revestidas com DNA), por transformação medi-ada por Agrobacterium, por vetores virais e outros, etc. Um método preferidode transformação de planta é o bombardeio com micro-projéteis, por exem-plo, como ilustrado nas Patentes U.S. 5.015.580 (soja), 5.550.318 (milho),5.538.880 (milho), 6.153.812 (trigo), 6.160.208 (milho), 6.288.312 (arroz) e6.399.861 (milho) e 6.403.865 (milho).Outro método preferido de transformação de planta é a trans-formação mediada por Agrobacterium. Em uma modalidade preferida da in-venção, a célula de planta transgênica da invenção é obtida pela transfor-mação por meio de Agrobacterium que contem um sistema de plasmídeo Tibinário, em que o Agrobacterium carrega um primeiro plasmídeo Ti e um se-gundo plasmídeo, quimérico que contém pelo menos uma borda de T-DNAde um plasmídeo Ti selvagem, um promotor funcional na célula de plantatransformada e operativamente ligado a um constructo de supressão gênicada invenção. Vide, por exemplo, o sistema binário descrito na Patente U.S.5.159.135. Vide também De Framond (1983) Biotechnology, 1:262-269; eHoekema et al., (1983) Nature, 303:179. Em tal sistema binário, o menorplasmídeo, contendo a borda ou bordas de T-DNA, pode ser conveniente-mente construído e manipulado em um hospedeiro alternativo adequado, talcomo E. coli, e então transferido para Agrobacterium.
Procedimentos detalhados para transformação de plantas medi-ada por Agrobacterium, especialmente plantas de cultivo, incluem, por e-xemplo, os procedimentos descritos nas Patentes U.S. 5.004.863,5.159.135, e 5.518.908 (algodão); 5.416.011, 5.569.834, 5.824.877 e6.384.301 (soja); 5.591.616 (milho); 5.981.840 (milho); 5.463.174 (brássi-cas). Métodos similares foram relatados para muitas espécies de planta, tan-to dicotiledôneas como monocotiledôneas, incluindo, entre outras, amendoim(Cheng etal. (1996) Plant Cell Rep., 15: 653); aspargo (Bytebier etal. (1987)Proc. Nati Acad. Sei. U.S.A., 84:5345); cevada (Wan & Lemaux (1994) PlantPhysiol., 104:37); arroz (Toriyama etal. (1988) Bio/Technology, 6:10; Zhanget al. (1988) Plant Cell Rep., 7:379; trigo (Vasil et al. (1992) Bi-o/Technology, 10:667; Becker et al. (1994) Plant J. , 5:299), alfalfa (Masoudet al. (1996) Transgen. Res., 5:313); e tomate (Sun et al. (2006) Plant CellPhysiol., 47:426-431). Vide também a Publicação de Pedido de Patente U.S.2003/0167537 A1 para uma descrição de vetores, métodos de transforma-ção e produção de plantas transformadas de Arabidopsis thaliana onde osfatores de transcrição são expressos constitutivamente por um promotor deCaMV35S. Células de plantas transgênicas e plantas transgênicas tambémpodem ser obtidas por transformação com outros vetores, tais como, masnão limitados a vetores virais (por exemplo, potivírus "etch" do tabaco (TEV),vírus do mosaico estriado da cevada (BSMV) e os vírus referenciados emEdwardson & Christie, "The Potyvirus Group: Monograph No. 16, 1991, A-gric. Exp. Station, Univ. da Flórida), plasmídeos, cosmídeos, YACs (cromos-somos artificiais de levedura), BACs (cromossomos artificiais bacterianos) ouqualquer outro vetor de clonagem adequado, quando usado com um proto-colo de transformação apropriado, por exemplo, infecção bacteriana (porexemplo, com Agrobacterium como descrito acima), constructos de cromos-somo artificial bacteriano binário, liberação direta de DNA (por exemplo, a-través de transformação mediada por PEG, absorção de DNA mediada pordessecação/inibição, eletroporação, agitação com fibras de carboneto desilicone e bombardeio de microprojéteis). Ficará claro para o versado na téc-nica que várias metodologias de transformação podem ser usadas e modifi-cadas para a produção de plantas transgênicas estáveis a partir de qualquerquantidade de espécies de plantas de interesse.
Métodos de transformação para fornecer células transgênicas deplanta e plantas transgênicas contendo DNA recombinante estavelmenteintegrado são praticados preferivelmente em cultura de tecido em meio e emum ambiente controlado. "Meio" refere-se às várias misturas de nutrientesque são usadas para cultivar células in vitro, ou seja, fora do organismo vivointacto. Células alvo receptoras incluem, mas não estão limitadas a célulasdo meristema, calo, embriões imaturos ou partes de embriões, células degametas tais como micrósporos, pólen, esperma e células de óvulos. Qual-quer célula a partir da qual uma planta fértil pode ser regenerada é contem-plada como célula receptora útil para a prática da invenção. Calo pode seriniciado a partir de várias fontes de tecidos, incluindo, mas não limitado aembriões imaturos ou partes de embriões, meristemas apicais de plântulas,microsporos e semelhantes. Aquelas células que são capazes de proliferarcomo calo podem servir como células receptoras para transformação genéti-ca. Métodos práticos e materiais de transformação para produzir as plantastransgênicas dessa invenção (por exemplo, vários meios e células alvo re-ceptoras, transformação de embriões imaturos e subseqüente regeneraçãode plantas transgênicas férteis) estão descritos, por exemplo, nas PatentesU.S. 6.194.636 e 6.232.526 e na Publicação de Pedido de Patente U.S.2004/0216189.
Na prática da transformação comum, o DNA é introduzido ape-nas em uma pequena porcentagem das células alvo em qualquer experi-mento de transformação. Genes marcadores são geralmente usados parafornecer um sistema eficaz para identificação daquelas células que estãoestavelmente transformadas por receber e integrar um constructo de DNAtransgênico nos seus genomas. Genes marcadores preferidos fornecemmarcadores seletivos que conferem resistência a um agente seletivo, tal co-mo um antibiótico ou herbicida. Qualquer um dos antibióticos ou herbicidasaos quais uma célula de planta pode ser resistente pode ser um agente útilpara seleção. Células potencialmente transformadas são expostas ao agenteseletivo. Na população de células sobreviventes estarão aquelas células on-de, geralmente, o gene que confere resistência está integrado e expressoem níveis suficientes para permitir a sobrevivência da célula.
As células podem ser testadas adicionalmente para confirmar aintegração estável do DNA recombinante. Genes marcadores seletivos co-mumente usados incluem aqueles que conferem resistência a antibióticostais como canamicina ou paromomicina (nptll), higromicina B (aph IV) e gen-tamicina (aac3 e aacC4) ou resistência a herbicidas tais como glifosinato(bar ou pat) e glifosato (EPSPS). Exemplos de genes marcadores seletivosúteis e agentes de seleção estão ilustrados nas Patentes U.S. 5.550.318,5.633.435, 5.780.708 e 6.118.047. Marcadores ou repórteres rastreáveis,tais como marcadores que fornecem uma habilidade para identificar visual-mente transformantes também podem ser empregados. Exemplos não Iimi-tantes de marcadores rastreáveis úteis incluem, por exemplo, um gene queexpressa uma proteína que produz um cor detectável pela ação sobre umsubstrato cromogênico (por exemplo, befa-glicuronidase (GUS) (uidA) ouIuciferase (Iuc) ou que é detectável por si mesmo, tal como a proteína verdefluorescente (GFP) (gfp) ou uma molécula imunogênica. Aqueles versadosna técnica reconhecerão que muitos outros marcadores ou repórteres úteisestão disponíveis para uso.
A detecção ou medida da alteração resultante na expressão deum gene alvo (ou expressão concomitante de um gene de interesse) obtidapela transcrição do constructo recombinante na planta transgênica da inven-ção pode ser obtida por quaisquer meios adequados, incluindo métodos dedetecção de proteína (por exemplo, western blots, ELISAs e outros métodosimunoquímicos), medidas de atividade enzimática ou métodos de detecçãode ácidos nucléicos (por exemplo, Southern blots, northern blots, PCR, RT-PCR, hibridização fluorescente in situ). Tais métodos são bem-conhecidospor aqueles versados na técnica como evidenciado pelos vários manuaisdisponíveis; vide, por exemplo, Joseph Sambrook & David W. Russell, "Mo-lecular Cloning: A Laboratory Manual" (terceira edição), Cold Spring HarborLaboratory Press, NY, 2001; Frederick M. Ausubel et aí. (editors) "Short Pro-tocols in Molecular Biology" (quinta edição), John Wiley and Sons, 2002;John M. Walker (editor) "Protein Protocols Handbook" (segunda edição),Humana Press, 2002; e Leandro Pena (editor) "Transgênic Plants: Methodsand Protocols", Humana Press, 2004.
Outros métodos adequados para detectar ou medir a alteraçãoresultante na expressão de um gene alvo (ou expressão concomitante de umgene de interesse) obtida pela transcrição do DNA recombinante na plantatransgênica da invenção incluem a medida de qualquer outra característicaque seja uma indicação direta ou representativa de expressão do gene alvo(ou expressão concomitante de um gene de interesse) na planta transgênicana qual o DNA recombinante é transcrito, em relação a uma na qual o DNArecombinante não é transcrito, por exemplo, características morfológicasgrosseiras ou microscópicas, taxas de crescimento, rendimento, taxas dereprodução ou de recrutamento, resistência a pragas ou patógenos, ou resis-tência a estresse biótico ou abiótico (por exemplo, estresse por falta de á-gua, estresse por sal, estresse por nutrientes, estresse por calor ou frio).Tais métodos podem usar medidas diretas de uma característica fenotípicaou ensaios substitutos (por exemplo, em plantas, esses ensaios incluem en-saios de parte da planta tais como ensaios de folha ou raiz para determinar atolerância ao estresse abiótico).
Os constructos de DNA recombinante da invenção podem seradicionados com outro DNA recombinante para conferir características adi-cionais (por exemplo, no caso de plantas transformadas, características in-cluem resistência a herbicida, resistência a praga, tolerância a germinaçãono frio, tolerância a falta de água e semelhantes), por exemplo, pela expres-são ou supressão de outros genes. Constructos para a diminuição ou au-mento coordenado de expressão gênica estão descritos na Publicação dePedido de Patente U.S. 2004/0126845 A1.
Sementes de plantas transgênicas, férteis podem ser coletadase usadas para cultivar de gerações de progênie, incluindo gerações híbridas,de plantas transgênicas dessa invenção que incluem o constructo de DNArecombinante nos seus genomas. Assim, além da transformação direta deuma planta com um constructo de DNA recombinante, plantas transgênicasda invenção podem ser preparadas pelo cruzamento de uma primeira plantaque tem o DNA recombinante com uma segunda planta que não tem o cons-tructo. Por exemplo, o DNA recombinante pode ser introduzido em uma li-nhagem de planta que é passível de transformação para produzir uma plantatransgênica, que pode ser cruzada com uma segunda linhagem de plantapara introduzir o DNA recombinante dentro da progênie resultante. Umaplanta transgênica da invenção com um DNA recombinante (que efetua alte-ração de um gene alvo) pode ser cruzada com uma linhagem de planta quetem outro DNA recombinante que confere uma ou mais características adi-cionais (tais como, mas não limitadas a resistência a herbicida, resistência apraga ou doença, resistência a estresse ambiental, conteúdo de nutrientesmodificado e melhoria no rendimento) para produzir plantas de progênie quetêm o DNA recombinante que confere tanto o comportamento de expressãoda seqüência alvo desejada como a(s) característica(s) adicional (ais).
Tipicamente, em tal reprodução para combinar características aplanta transgênica que doa a característica adicional é de linhagem masculi-na e a planta transgênica que carrega as características de base é de linha-gem feminina. A progênie desse cruzamento se separa tal que algumas dasplantas carregarão o DNA para ambas as características parentais e algu-mas carregarão o DNA para uma característica parenteral; tais plantas po-dem ser identificadas por marcadores associados com o DNA recombinanteparental. Plantas de progênie que carregam o DNA para ambas as caracte-rísticas parentais podem ser novamente cruzadas com a linhagem femininaparental múltiplas vezes, por exemplo, geralmente de 6 a 8 gerações, paraproduzir uma planta de progênie com substancialmente o mesmo genótipoque uma linhagem parental transgênica original mas com o DNA recombi-nante da outra linhagem parental transgênica.
Outro aspecto da invenção ainda é uma planta transgênica culti-vada a partir da semente transgênica da invenção. Essa invenção contemplaplantas transgênicas cultivadas diretamente a partir de semente transgênicaque contem o DNA recombinante assim como gerações de progênie de plan-tas, incluindo linhagens de planta natural ou híbrida, feitas pelo cruzamentode uma planta transgênica cultivada diretamente a partir de semente trans-gênica com uma segunda planta não cultivada a partir da mesma semente transgênica.
O cruzamento pode incluir, por exemplo, as seguintes etapas:
(a) sementes de planta da primeira planta parental (por exem-plo, não-transgênica ou transgênica) e uma segunda plantaparental que é transgênica de acordo com a invenção;
(b) cultivo das sementes da primeira e segunda plantas paren-tais em plantas que têm flores;
(c) polinizar uma flor a partir da primeira parental com pólenda segunda parental; e
(d) coletar sementes produzidas na planta parental que tem aflor fertilizada.
Freqüentemente é desejável introduzir DNA recombinante emvariedades de elite, por exemplo, por retrocruzamento, para transferir umacaracterística específica desejável de uma fonte para uma planta natural ououtra planta que não tem aquela característica. Isso pode ser obtido, por e-xemplo, por cruzar primeiro um organismo de cruzamento superior ("A") (pa-rental recorrente) com um organismo de cruzamento doador ("B") (parentalnão recorrente), que carrega o(s) gene(s) apropriado(s) para a característicaem questão, por exemplo, um constructo preparado de acordo com a pre-sente invenção. A progênie desse cruzamento primeiro é selecionada naprogênie resultante quanto a característica desejada a ser transferida para oparente não recorrente "B" e então a progênie selecionada é cruzada de no-vo com o parente recorrente superior "A". Após cinco ou mais gerações deretrocruzamento com seleção para a característica desejada, a progênie éhomozigota para os Ioci que controlam a característica que está sendo trans-ferida, mas é semelhante ao parente superior na maioria ou em quase todosos outros genes. A última geração de retrocruzamento pode ser autofecun-dada para dar uma progênie que é de geração pura para o(s) gene(s) sendotransferido(s), isto é, um ou mais eventos de transformação.
Através de uma série de manipulações de reprodução, um cons-tructo de DNA selecionado pode ser passado de uma linhagem para outralinhagem inteiramente diferente sem a necessidade de manipulação recom-binante adicional. Pode-se produzir assim plantas naturais que são geraçõesverdadeiras para um ou mais constructos de DNA. Pelo cruzamento de plan-tas naturais diferentes, pode-se produzir um grande número de híbridos dife-rentes com diferentes combinações de constructos de DNA. Dessa maneira,podem ser produzidas plantas que têm as propriedades agronômicas dese-jáveis freqüentemente associadas com híbridos ("vigor híbrido"), assim comoas características desejáveis transmitidas por um ou mais constructos de DNA.
Marcadores genéticos podem ser usados para auxiliar na intro-dução de um ou mais constructos de DNA da invenção de um antecedentegenético para outro. A seleção auxiliada por marcador oferece vantagens emrelação à reprodução convencional por que pode ser usada para evitar erroscausados por variações fenotípicas. Além disso, marcadores genéticos po-dem fornecer dados em relação ao grau relativo de germoplasma de elite naprogênie individual de um cruzamento em particular. Por exemplo, quandouma planta com uma característica desejada que de outra maneira tem umantecedente genético não agronomicamente desejável é cruzada com umparente de elite, marcadores genéticos podem ser usados para selecionar aprogênie que possui não apenas a característica de interesse, mas tambémtem uma proporção relativamente grande do germoplasma desejado. Dessamaneira, o número de gerações necessárias para introduzir uma ou maiscaracterísticas em um antecedente genético em particular é minimizado. Autilidade da seleção auxiliada por marcador em cruzamento de plantastransgênicas da presente invenção, assim como tipos de marcadores mole-culares úteis, tais como, mas não limitados a SSRs e SNPs, está discutidana Publicação de Pedido PCT WO 02/062129 e nas Publicações Pedido dePatente U.S Números 2002/0133852, 2003/0049612 e 2003/0005491.
Em certas células de plantas transgênicas e plantas transgêni-cas da invenção, pode ser desejável expressar (ou suprimir) concomitante-mente um gene de interesse enquanto também se regula a expressão de umgene alvo. Assim, em algumas modalidades, a planta transgênica contém oDNA recombinante incluindo ainda um elemento de expressão (ou supres-são) gênica para expressar pelo menos um gene de interesse, e regulaçãoda expressão de gene alvo é preferivelmente efetuada com a expressãoconcomitante (ou supressão) de pelo menos um gene de interesse na plantatransgênica.
Assim, como aqui descrito aqui, as células de planta transgênicaou plantas transgênicas da invenção podem ser obtidas pelo uso de qual-quer método de transformação integrante ou não-integrante transitório ouestável apropriado, do conhecido na técnica ou descrito no momento. Osconstructos de DNA recombinante podem ser transcritos em qualquer célulaou tecido de planta ou em uma planta completa de qualquer estágio de de-senvolvimento. Plantas transgênicas.podem ser derivadas de qualquer plan-ta monocotiledônea ou dicotiledônea, tais como, mas não limitadas a plantasde interesse comercial ou agrícola, tais como plantas de cultivo (especial-mente plantas de cultivo usadas para alimentação humana ou ração paraanimais), árvores que produzem madeira ou polpa, hortaliças, plantas frutífe-ras e plantas ornamentais. Exemplos não Iimitantes de plantas de interesseincluem plantas de culturas de grãos (tais como trigo, aveia, cevada, milho,centeio, triticale, arroz, painço, sorgo, quinoa, amaranto, trigo sarraceno);plantas de culturas de forragem (tais como grama forrageira e dicotiledôneasforrageiras incluindo alfafa, ervilhaca, trevo e semelhantes); cultura de plan-tas oleaginosas (tais como algodão, açafrão, girassol, soja, canola, colza,linhaça, amendoim e óleo de palma); árvores de nozes (tais como noz, caju.avelã, pecã, amêndoa e semelhantes); cana de açúcar, coco, tamareira, a-zeitona, chá e café; árvores que produzem madeira e polpa; vegetais taiscomo legumes (por exemplo, feijões, ervilhas, lentilhas, alfafa, amendoim),alface, aspargo, alcachofra, aipo, cenoura, rábano, brássicas (por exemplo,repolho, couve de folhas, mostarda e outras brássicas folhosas, brócolis,couve-flor, couve de Bruxelas, nabo, couve-rábano), cucurbitáceas comestí-veis (pepino, melões, abobrinha, abóbora), alhos comestíveis (por exemplo,cebolas, alho, alho-poró, chalotas, cebolinha), membros comestíveis dasSolanaceae (por exemplo, tomates, berinjelas, batatas, pimentas, amoraamarela) e membros comestíveis das Chenopodiaceae (por exemplo, beter-raba, acelga, espinafre, quinoa, amaranto); plantas de cultura de frutas taiscomo maçãs, pêra, frutas cítricas (por exemplo, laranja, lima, limão, toranja eoutras), frutas com caroço (por exemplo, abricó, pêssego, ameixa, nectari-na), banana, abacaxi, uva, kiwi, papaia, abacate e cerejas; e plantas orna-mentais incluindo plantas ornamentais com flores, árvores e arbustos orna-mentais, coberturas de solo ornamentais e gramas ornamentais. As plantasdicotiledôneas preferidas incluem, mas não são limitadas a canola, algodão,batata, quinoa, amaranto, trigo sarraceno, açafrão, soja, beterraba e giras-sol, mais preferivelmente soja, canola e algodão. Monocotiledôneas preferi-das incluem, mas não são limitadas a trigo, aveia, cevada, milho, centeio,triticale, arroz, gramas ornamentais e forrageiras, sorgo, painço e cana deaçúcar, mais preferivelmente milho, trigo e arroz.
O objetivo principal na transformação de planta é produzir plan-tas que são úteis ao homem. Com relação a isso, as plantas transgênicas dainvenção podem ser usadas virtualmente para qualquer propósito considera-do de valor para o agricultor ou para o consumidor. Por exemplo, pode-sedesejar colher a própria planta transgênica ou colher a semente transgênicada planta transgênica para propósitos de plantio ou podem ser feitos produ-tos a partir de plantas transgênicas ou suas sementes, tais como óleo, ami-do, etanol ou outros produtos de fermentação, ração animal ou alimento hu-mano, fármacos e vários produtos industriais. Por exemplo, o milho é usadoextensivamente na indústria alimentícia e de ração, assim como em aplica-ções industriais. Discussão adicional dos usos do milho pode ser encontra-da, por exemplo, nas Patentes U.S. Números 6.194.636, 6.207.879,6.232.526, 6.426.446, 6.429.357, 6.433.252, 6.437.217, e 6.583.338 e nasPublicações PCT WO 95/06128 e WO 02/057471. Assim, essa invençãotambém fornece produtos de consumo produzidos a partir de uma célulatransgênica de planta, planta ou semente transgênicas dessa invenção, in-cluindo, mas não limitado a folhas, raízes, brotos, tubérculos, caules, frutos,sementes ou outras partes de uma planta, cereais, óleos, extratos, produtosde fermentação ou digestão, grãos triturados ou inteiros ou sementes deuma planta ou qualquer produto alimentício ou não alimentício incluindo taisprodutos de consumo produzidos a partir de uma célula de planta, planta ousemente transgênica dessa invenção. A detecção de uma ou mais seqüên-cias de ácidos nucléicos dos constructos de DNA recombinante dessa in-venção em um ou mais produtos de consumo aqui contemplados é de factoevidência de que o produto de consumo contém ou é derivado de uma célulade planta, planta ou semente transgênica dessa invenção.
Em modalidades preferidas, a planta transgênica que tem no seugenoma um constructo de DNA recombinante dessa invenção tem pelo me-nos uma característica adicional alterada, em relação a uma planta que nãotem o constructo de DNA recombinante, selecionada a partir do grupo decaracterísticas que consiste em:
(a) tolerância melhorada ao estresse abiótico;
(b) tolerância melhorada ao estresse biótico;
(c) composição de metabólito primário modificada;
(d) composição de metabolito secundário modificada;
(e) composição de elemento traço, carotenóide ou vitaminamodificada;
(f) rendimento melhorado;
(g) habilidade melhorada em usar nitrogênio ou outros nutrien-tes;
(h) características agronômicas modificadas;
(i) crescimento ou características reprodutivas modificadas; e
(j) colheita, armazenamento e qualidade de processamentomelhorados.
Em modalidades particularmente preferidas, a planta transgênicaé caracterizada por: tolerância melhorada ao estresse abiótico (por exemplo,tolerância a falta de água ou estiagem, calor, frio, níveis não-ótimos de nutri-ente ou sal, níveis não-ótimos de luz) ou de estresse biótico (por exemplo,aglomeração, alelopatia ou lesão); por uma composição de metabolito primá-rio modificada (por exemplo, ácido graxo, óleo, aminoácido, proteína, açúcarou carboidrato); composição de metabolito secundário modificada (por e-xemplo, alcalóides, terpenóides, policetídeos, peptídeos não-ribossomais emetabólitos secundários de origem biossintética mista); composição de ele-mento traço (por exemplo, ferro, zinco), carotenóide (por exemplo, beta-caroteno, licopeno, luteína, zeaxantina ou outros carotenóides e xantofilos)ou vitamina (por exemplo, tocoferóis) modificada; rendimento melhorado (porexemplo, rendimento melhorado sob condições sem estresse ou rendimentomelhorado sob estresse biótico ou abiótico); habilidade melhorada de usarnitrogênio ou outros nutrientes; características agronômicas modificadas (porexemplo, maturação retardada, envelhecimento retardado; maturidade pre-coce ou retardada; tolerância à sombra melhorada; resistência melhorada aoacondicionamento da raiz ou caule; resistência melhorada a "green snap" decaule; resposta modificada de fotoperíodo de luz); características de cresci-mento ou reprodutivas modificadas (por exemplo, nanismo intencional; este-rilidade masculina intencional, útil em, por exemplo procedimentos de hibri-dização melhorados; taxa de crescimento vegetativo melhorada; germinaçãomelhorada; fertilidade masculina ou feminina melhorada); colheita, armaze-namento e qualidade de processamento melhorados (por exemplo, resistên-cia melhorada a pragas durante armazenamento, resistência melhorada àquebra, atratividade melhorada para os consumidores); ou qualquer combi-nação dessas características.
Em uma modalidade preferida, semente transgênica ou sementeproduzida pela planta transgênica, tem a composição do metaboóito primáriomodificada (por exemplo, ácido graxo, óleo, aminoácido, proteína, açúcar oucarboidrato), composição de metabolito secundário modificada (por exemplo,alcalóides, terpenóides, policetídeos, peptídeos não -ribossomais e metabóli-tos secundários de origem biossintética mista), composição de elemento tra-ço (por exemplo, ferro, zinco), carotenóide (por exemplo, beta-caroteno, Iico-peno, luteína, zeaxantina ou outros carotenóides e xantofilos) ou vitamina(por exemplo, tocoferóis) modificada, colheita, armazenamento ou qualidadede processamento melhoradas ou uma combinação desses. Por exemplo,pode ser desejável modificar o aminoácido (por exemplo, lisina, metionina,triptofano ou proteína total), óleo (por exemplo, composição de ácido graxoou óleo total), carboidrato (por exemplo, açúcares simples ou amidos), con-teúdo de elemento traço, carotenóide ou vitamina de sementes de plantascultiváveis (por exemplo, canola, algodão, açafrão, beterraba, girassol, trigo,milho ou arroz), preferivelmente em combinação com colheita de semente,armazenamento e qualidade de processamento melhorados e assim, forne-cer sementes melhoradas para uso em rações animais e alimentos para hu-manos. Em outro exemplo, pode ser desejável alterar os níveis de compo-nentes nativos da planta transgênica ou semente de planta transgênica, porexemplo, para diminuir os níveis de proteínas com baixos níveis de lisina,metionina ou triptofano ou para aumentar os níveis de um aminoácido ouácido graxo desejados ou para diminuir os níveis de uma proteína ou glico-proteína alergênicas (por exemplo, alergenos do amendoim incluindo ara h1, alergenos do trigo incluindo gliadinas e gluteninas, alergenos da soja in-cluindo o alergeno P34, globulinas, glicininas e conglicininas) ou de um me-tabólito tóxico (por exemplo, glicosídeos cianogênicos na mandioca, alcalói-des de solanina em membros das Solanaceae).
EXEMPLOS
Exemplo 1
Este ilustra exemplos não Iimitantes de constructos de DNA re-combinante para supressão de pelo menos um gene alvo; esses construc-tos, quando projetados para incluir um sítio de reconhecimento de miRNA,permitem a expressão do elemento de supressão gênica em tecidos específicos.
Figura 1A descreve esquematicamente exemplos não Iimitantesde constructos de DNA recombinante da invenção para supressão de pelomenos um gene alvo. Esses constructos incluem pelo menos um primeiroelemento de supressão gênica ("GSE" ou "GSE1") para suprimir pelo menosum primeiro gene alvo, em que o primeiro elemento de supressão gênicaestá inserido em um íntron flanqueado em um ou ambos os lados por umDNA que não codifica proteína. Esses constructos utilizam um íntron (emmuitas modalidades um íntron derivado de uma região 5' não traduzida ouum íntron que aumenta a expressão é preferido) para liberar um elemento desupressão gênica sem necessitar da presença de quaisquer éxons que codi-fiquem proteína (seqüência codificante). Os constructos podem opcional-mente incluir pelo menos um segundo elemento de supressão gênica("GSE2") para suprimir pelo menos um segundo gene alvo, pelo menos umelemento de expressão gênica ("GEE") para expressar pelo menos um genede interesse (que pode ser uma seqüência codificante ou não codificante ouambas), ou ambos. Em modalidades que contêm um elemento de expressãogênica opcional, o elemento de expressão gênica pode estar localizado fora(por exemplo, adjacente a) do íntron. Em algumas modalidades, o íntron quecontém o primeiro elemento de supressão gênica está a 3' de um terminador.
Para diferenciar mais claramente constructos de DNA recombi-nante da invenção (que contêm pelo menos um elemento de supressão gê-nica inserido dentro de um único íntron flanqueado em um ou ambos os la-dos por um DNA não codificante de proteína) da técnica anterior, a Figura1B descreve esquematicamente exemplos de constructos de DNA da técni-ca anterior. Esses constructos podem conter um elemento de supressão gê-nica que está localizado adjacente a um íntron flanqueado por uma seqüên-cia codificante de proteína ou entre dois íntrons distintos (em que o elementode supressão gênica não está inserido em nenhum dos dois íntrons distin-tos) ou podem incluir um elemento de expressão gênica que inclui um ele-mento de supressão gênica inserido dentro de um íntron que está flanquea-do por múltiplos éxons (por exemplo, éxons que incluem a seqüência codifi-cante de uma proteína).
A Figura 2 descreve vários exemplos não Iimitantes de elemen-tos de supressão gênica e DNAs exógenos capazes de ser transcritos úteisnos constructos de DNA recombinante da invenção. Onde desenhados comoum filamento simples (Figuras 2A até 2E), esses são convencionalmenterepresentados na direção transcricional 5' para 3' (esquerda para direita); assetas indicam a seqüência anti-sentido (a ponta da seta aponta para a es-querda), ou a seqüência sentido (ponta da seta apontando para direita). Es-ses elementos de supressão gênica e DNAs exógenos capazes de sertranscritos podem incluir: DNA que inclui pelo menos um segmento de DNAanti-sentido que é anti-sentido a pelo menos um segmento do pelo menosum primeiro gene alvo, ou DNA que inclui múltiplas cópias de pelo menosum segmento de DNA anti-sentido que é anti-sentido a pelo menos um seg-mento do pelo menos um primeiro gene alvo (Figura 2A); DNA que incluipelo menos um segmento de DNA sentido que é pelo menos um segmentodo pelo menos um primeiro gene alvo, ou DNA que inclui múltiplas cópias depelo menos um segmento de DNA sentido que é pelo menos um segmentodo pelo menos um primeiro gene alvo (Figura 2B); DNA que transcreve RNAsuprimir o pelo menos um primeiro gene alvo pela formação de RNA duplofilamento e inclui pelo menos um segmento de DNA anti-sentido que é anti-sentido a pelo menos um segmento do pelo menos um gene alvo e pelo me-nos um segmento de DNA sentido que é pelo menos um segmento do pelomenos um primeiro gene alvo (Figura 2C); DNA que transcreve RNA parasuprimir o pelo menos um primeiro gene alvo pela formação de um RNA úni-co duplo filamento e inclui múltiplos segmentos seriados de DNA anti-sentidoque são anti-sentido a pelo menos um segmento do pelo menos um primeirogene alvo e múltiplos segmentos de DNA seriados sentido que são pelo me-nos um segmento de pelo menos um primeiro gene alvo (Figura 2D); DNAque transcreve RNA para suprimir pelo menos um primeiro gene alvo pelaformação de múltiplos filamentos duplas de RNA e inclui múltiplos segmen-tos de DNA anti-sentido que são anti-sentido a pelo menos um segmento dopelo menos um primeiro gene alvo e múltiplos segmentos de DNA sentidoque têm pelo menos um segmento do pelo menos um primeiro gene alvo eem que os ditos múltiplos segmentos de DNA anti-sentido e os múltiplossegmentos de DNA de sentido estão arranjados em uma série de repetiçõesinvertidas (Figura 2E); e DNA que inclui nucleotídeos derivados de um miR-NA ou DNA que inclui nucleotídeos de um siRNA (Figura 2F).
A Figura 2F representa vários arranjos não Iimitantes de RNAduplo filamento que podem ser transcritos a partir de modalidades dos ele-mentos de supressão gênica e DNAs exógenos capazes de ser transcritosúteis nos constructos de DNA recombinantes da invenção. Quando tal RNAduplo filamento é formado, ele pode suprimir um ou mais genes alvo, e podeformar um único RNA duplo filamento ou múltiplos filamentos duplas deRNA, ou um único "stem" ou múltiplos "stems" de RNA duplo filamento. On-de múltiplos "stems" de RNA duplo filamento são formados, eles podem serarranjados em arranjos de "cabeça de martelo" ou "folha de trevo". Em al-gumas modalidades, os "stems" de filamento dupla podem formar um arranjoem "pseudo-nó" (por exemplo, quando o RNA espaçador ou de alça de um"stem" de filamento dupla forma parte de um segundo "stem" de filamentodupla); vide, por exemplo, descrições de arquiteturas de pseudo-nós emStaple & Butcher (2005) PLoS Biol., 3(6):e213. DNA espaçador (localizadoentre ou adjacente a regiões de dsRNA) é opcional mas comumente incluídoe geralmente inclui DNA que não corresponde ao gene alvo (embora em al-gumas modalidades possa incluir DNA sentido ou anti-sentido do gene alvo).DNA espaçador pode incluir seqüência que transcreve RNA de filamentosimples ou pelo menos RNA de filamento parcialmente dupla (tal como emum arranjo "kissing stem-loop") ou um RNA que assume uma estrutura se-cundária ou configuração tridimensional (por exemplo, uma grande alça deseqüência anti-sentido do gene alvo ou um aptâmero) que confere ao trans-crito uma característica adicional desejada, tal como estabilidade aumenta-da, meia-vida in vivo aumentada ou especificidade por célula ou tecido.
Exemplo 2
Esse exemplo descreve um método não Iimitante de determina-ção da utilidade potencial de um sítio de reconhecimento de miRNAs, peladeterminação do padrão de expressão de miRNA. O conhecimento da distri-buição espacial ou temporal de uma dada expressão de miRNA é útil, porexemplo, ao desenhar constructos recombinantes a serem expressos deuma maneira espacialmente ou temporalmente específica. Esse exemplodescreve padrões de expressão de miRNA maduro no milho e fornece se-qüências de sítios de reconhecimento para esses miRNAs que são adequa-dos para inclusão em constructos de DNA recombinante úteis no milho e emoutras plantas.RNA total foi isolado de plantas de milho LH244 usando Trizol(Invitrogen, Carlsbad, CA). Sete estágios de desenvolvimento foram usados,incluindo raízes e meristemas de ramos de mudas em germinação, folhasjovens (V1 a V2) e adultas (V7 a V8), caule internodal, pendão antes da que-da, e espigas imaturas (de aproximadamente 1") (2,54 cm). Cinco microgra-mas de RNA total foram separados em PAGE-Ureia 17% como descrito porAllen et al. (2004) Nat. Genet., 36:1282-1290. Os blots foram marcados comoligonucleotídeos de DNA que eram anti-sentido para a seqüência de pe-queno RNA e marcados na extremidade com gama 32P-ATP usando Optiki-nase (USB). As sondas usadas e suas respectivas seqüências são dadas naTabela 1.
Tabela 1
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Os resultados são mostrados na Figura 3. Uma sonda (SEQ IDNO:1) hibridizou com miRNAs maduros de duas famílias (miR156 e15 miR157). miRNAs maduros individuais foram expressos em níveis diferentesem células ou tecidos específicos. Por exemplo, Zm-miR390 não foi expres-so ou expresso apenas em níveis baixos em raiz e folha adulta.Exemplo 3Esse exemplo não Iimitante descreve constructos de DNA re-combinante da invenção, úteis para suprimir a expressão de um RNA alvoem uma célula específica de ou derivada de um eucarioto multicelular talcomo uma célula de planta ou uma célula de animal e métodos para seu u-so. Os constructos incluem um promotor operativamente ligado ao DNA quetranscreve RNA incluindo pelo menos um sítio de reconhecimento de miRNAexógeno reconhecível por um miRNA maduro expresso em uma célula es-pecífica de um eucarioto multicelular, e um RNA alvo a ser suprimido na cé-lula específica, em que o dito RNA alvo é para ser expresso em células doeucarioto multicelular diferentes da célula específica.
Promotores constitutivos fortes que são expressos em aproxi-madamente todas as células de planta foram identificados (por exemplo,CaMC 35S, OsAct), mas promotores específicos fortes espacialmente espe-cíficos (específico para célula ou tecido) e temporalmente específicos forammenos bem caracterizados. Para limitar a expressão de RNA alvo ou trans-gene para um tipo específico de célula ou tecido na ausência de um promo-tor forte específico para célula ou para tecido, pode ser desejável suprimirem células ou tecidos selecionados a expressão de um transcrito sob o con-trole de um promotor constitutivo. A invenção fornece métodos que usamseqüências de reconhecimento de miRNAs endógenos para suprimir a ex-pressão de um RNA alvo constitutivamente expresso em células específicas.
Métodos da invenção permitem controle pós-transcricional espa-cialmente ou temporalmente específico de expressão de um RNA alvo emque a transcrição é direcionada por um promotor não-específico (por exem-plo, constitutivo). Os métodos da invenção permitem, por exemplo, a expres-são restrita de um gene transcrito por um promotor constitutivo ou um pro-motor com expressão além do(s) tipo(s) de célula ou tecido desejados. Aexpressão restrita pode ser restrita espacialmente ou temporalmente, porexemplo, restrita aos tipos ou classes específicas de tecidos ou células ou aestágios específicos de desenvolvimento, reprodução, crescimento e sazo-nal. Onde um miRNA é expresso sob condições particulares (por exemplo,sob estresse biótico tal como aglomeração, interações alelopáticas ou infes-tação por praga ou patógeno, ou estresse abiótico tal como estresse pelocalor ou frio, estresse por estiagem, estresse nutricional, estresse por metalpesado ou sal), o sítio de reconhecimento de miRNA correspondente podeser usado para supressão condicionalmente específica, isto é, para suprimiro RNA alvo sob a condição particular.
Por exemplo, Zm-miR162 é pobremente expresso em raízes demilho (vide Exemplo 2 e Figura 3), portanto, desenhar um constructo deexpressão para incluir um sítio de reconhecimento de miRNA162 exógenoadjacente a, ou dentro de, um RNA alvo constitutivamente expresso, podelimitar o acúmulo de RNA alvo transcrito em todas as células de uma plantade milho com exceção das raízes. Esse método tem utilidade para todas asaplicações de expressão gênica em que o dado miRNA maduro é expresso.
Em eucariotos multicelulares, incluindo plantas, microRNAs(miRNAs) regulam genes endógenos por um mecanismo de clivagem pós-transcricional, que pode ser espacialmente ou temporalmente específico. Apresente invenção fornece métodos pelos quais a adição de um sítio de re-conhecimento de miRNA a um transgene expresso constitutivamente pode-ria ser usada para limitar a expressão do transgene às células que não têm,ou distantes daquelas que expressam, o miRNA maduro complementar tantoespacialmente quanto temporalmente (incluindo condicionalmente). A mani-pulação desses sítios de reconhecimento de miRNA em novos transcritosintroduzidos em células de planta transgênicas e plantas transgênicas deri-vadas dessas células, é útil para alterar padrões de expressão para o novotransgene.
Em uma abordagem alternativa, um sítio de reconhecimento demiRNA existente (nativo ou endógeno) é mutado (por exemplo, por mutagê-nese química) o suficiente para reduzir ou impedir a clivagem (vide Malloryet ai. (2004) Curr. Biol., 14:1035-1046). Dessa maneira, uma seqüência deRNA alvo com efeitos desejáveis, por exemplo, tamanho da folha ou semen-te aumentado, pode ser expressa em níveis maiores do que quando o sítiode reconhecimento de miRNA nativo ou endógeno estava presente. Umamodalidade é substituir um gene nativo por um homólogo manipulado, emque o miRNA nativo tenha sido mutado ou até deletado, isto é menos susce-tível a clivagem por um dado miRNA.
Uma modalidade do método é a introdução de pelo menos umsítio de reconhecimento de miRNA exógeno (tipicamente uma seqüência de21 nucleotídeos) nas regiões não traduzidas 5' ou 3' de um RNA alvo, oudentro do RNA alvo. Onde o RNA alvo inclui a seqüência codificante, o pelomenos um sítio de reconhecimento de miRNA exógeno pode ser introduzidona região codificante do RNA alvo. Isso resulta na expressão reduzida doRNA alvo em tipos de tecidos ou células que expressam o miRNA madurocorrespondente. Pela inclusão de um sítio de reconhecimento que corres-ponde a um miRNA maduro em um transcrito de RNA alvo, é possível modu-lar a expressão do RNA alvo de tal maneira que mesmo sob o controle deum promotor constitutivo, o RNA alvo é expresso apenas em células ou teci-dos selecionados ou durante períodos temporais selecionados. Isso permitetanto os altos níveis de expressão obteníveis com promotores constitutivosfortes quanto a limitação espacial ou temporal de tal expressão.
Qualquer sítio de reconhecimento de miRNA pode ser usado,preferivelmente onde a expressão do miRNA maduro correspondente tenhasido determinada para satisfazer a expressão ou supressão desejada doRNA alvo. Várias seqüências de reconhecimento de miRNA são conhecidas.Vide, por exemplo, Jones-Rhoades & Bartel (2004). Mol. Cell, 14:787-799,Rhoades et al. (2002) Celll 110:513-520, Allen et al. (2004) Nat. Genet.,36:1282-1290). Vide também a base de dados na rede ASRP (Gustafson etal. (2005) Nucleic Aclds Res., 33:D6379-D640). Exemplos não Iimitantes desítios de reconhecimento de miRNA úteis em constructos e métodos da in-venção incluem aqueles fornecidos na Tabela 2, que dá as seqüências desítio de reconhecimento para a família de miRNA indicada e indica a distribu-ição entre "todas as plantas" (isto é, plantas inferiores, monocotiledôneas edicotiledôneas), monocotiledôneas e/ou dicotiledôneas. A espécie de plantaa partir da qual o miRNA foi identificado e as abreviações usadas foram: A-rabidopsis thaliana (At), Glyeine max (Gm), Gossypium hirsutum (Gh), Hor-deum vulgare (Hv), Lyeopersieum eseulentum (Le), Lotus corniculatus var.japonicus (sinônimo de "Lotus japonicus") (Lj), Medicago truncatula (Mt),Mesembryanthemum crystallinum (Mc), Oryza sativa (Os), Pennisetum glau-cum (Pg)1 Phaseolus vulgaris (Pv)1 Populus tremula (Pt), Saccharum officina-rum (So)l Sorghum bicolor (Sb), Theobroma cacao (Tc), Triticum aestivum(Ta), Vitis vinifera (Vv), e Zea mays (Zm).
Tabela 2
<table>table see original document page 95</column></row><table>Tabela 2 continuação
<table>table see original document page 96</column></row><table>Tabela 2 (continuação)
<table>table see original document page 97</column></row><table>Tabela 2 continuação
<table>table see original document page 98</column></row><table>Tabela 2 continuação
<table>table see original document page 99</column></row><table>Tabela 2 continuação
<table>table see original document page 100</column></row><table>Tabela 2 continuação
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Assim, uma planta transgênica que expressa um constructo deDNA recombinante que, sob o controle de um promotor constitutivo (por e-xemplo, um promotor 35S) transcreve um RNA que contém um sítio de re- conhecimento de Zm-miR390 e um RNA alvo poderia seria esparado mos-trar supressão da expressão do RNA alvo na raiz e folha adulta em relação àexpressão em outros tecidos.
Em outro exemplo, Zm-miR172 foi expresso em altos níveis nocaule e não expresso, ou expresso apenas em baixos níveis em outros teci-dos. Uma planta transgênica que expressa um constructo que, sob o contro-le de um promotor constitutivo forte (por exemplo, um promotor 35S deCaMV) transcreve um RNA que contém um sítio de reconhecimento de Zm-miR172 e um RNA alvo seria esperada expressar aquele RNA alvo em ní-veis mais elevados em outros tecidos que não o caule (onde a expressão doRNA alvo seria suprimida).
Para ilustrar o uso dos constructos e métodos da invenção paracontrolar a expressão de um gene de interesse, um gene repórter é usadocomo o próprio gene de interesse ou como um substituto do gene de inte-resse. Por exemplo, onde a expressão de um gene repórter (por exemplo,proteína verde fluorescente, GFP) é desejada no caule do milho e no tecidoda espiga imatura, um sítio alvo de miR156 é incluído em um cassete de ex-pressão de GFP e expresso em uma planta de milho estavelmente transgê-nica sob o controle do promotor CaMV35S. Em outros tecidos (por exemplo,raízes, folhas e pendões), a expressão de GFP é suprimida. O fenótipo desupressão pode ser limitado a tipos celulares muito específicos dentro dostecidos suprimidos, com células vizinhas mostrando expressão ou um gradi-ente de expressão de GFP adjacente àquelas células que expressammiR156 maduro.
Em outro exemplo, um promotor constitutivo forte é usado paradirecionar a expressão de uma proteína ou fragmento de proteína inseticidade Bacillus thuringiensis ("Bt"), onde um sítio de reconhecimento de miRNAexpresso especificamente no pólen está incluído no constructo, resultandoem expressão forte de Bt em tecidos da planta exceto para o pólen.
Um exemplo específico, não Iimitante do método é a inclusão dosítio de reconhecimento para pelo menos um miRNA, que não é expresso(ou expresso apenas em baixos níveis) nas raízes, em um constructo deDNA recombinante que inclui um RNA alvo do qual a expressão é desejadaapenas nas raízes. Um promotor constitutivo forte (por exemplo, 35S intensi-ficado) pode ainda ser usado, mas a expressão do RNA alvo está restritaagora às células que não expressam o miRNA maduro correspondente. Umexemplo específico dessa abordagem é a inclusão de um sítio de reconhe-cimento de miRNA162 de milho, miRNA164 de milho ou miRNA390 de milho(ou qualquer combinação desses) em um constructo de DNA recombinantepara expressão de uma proteína ou fragmento de proteína inseticida de Ba-cillus thuringiensis ("Bt",vide, por exemplo, as seqüências inseticidas de Ba-cillus thuringiensis e métodos de uso dessas descritos na Patente U.S. Nú-mero 6.953.835 e no Pedido de Patente Provisório U.S. Número 60/713.111,depositado em 31 de Agosto de 2005) como o RNA alvo, por exemplo, emum constructo que inclui o cassete de expressão e35S/Bt/hsp17. EssesmiRNAs (por exemplo, miRNA162, miRNA164, ou miRNA390) não são subs-tancialmente expressos em raízes de milho mas são expressos na maioriados outros tecidos. A inclusão de um ou mais desses sítios de reconheci-mento dentro de um cassete de expressão, reduz a expressão de transcritosna maioria dos tecidos diferentes da raiz, mas mantém altos níveis de ex-pressão de RNA alvo de Bt nas raízes, como é desejável para o controle depragas tais como larva da raiz do milho. Em modalidades similares, combi-nações de sítios de reconhecimento de miRNA diferentes são incluídas noconstructo a fim de se obter o padrão de expressão desejado em um oumais tecidos específicos.
Exemplos específicos não Iimitantes de seqüência de DNA ca-paz de ser transcrita que inclui um sítio de reconhecimento de miRNA exó-geno estão descritos na Figura 4 e Figura 5. A Figura 4 descreve TIC809direcionado para cloroplasto com um sítio de reconhecimento de miRNA162(texto em negrito) localizado na região 3' não traduzida (SEQ ID NO. 176).Figura 5 descreve TIC809 não direcionado com um sítio de reconhecimentode miRNA164 (texto em negrito) localizado na região 3' não traduzida (SEQ ID NO. 177).
Exemplo 4
Esse exemplo descreve a identificação de um gene MIR de umaplanta de cultivo com expressão tecido-específica e identificação do promo-tor do gene miR. Mais particularmente, esse exemplo descreve o perfil detranscrição como um método não Iimitante de identificar um miRNA expressoespecificamente em tecido reprodutivo feminino (endosperma), assim comoa identificação de uma seqüência promotora de miR167 de milho com ex-pressão endosperma-específica. O sítio de reconhecimento correspondentea esse miRNA é útil, por exemplo, na produção de plantas transgênicas comesterilidade feminina induzível de acordo com essa invenção.
Um membro da família de genes MlR167 (SEQ IO NO. 178) foidescoberto representar cerca de um quarto da população de pequeno RNAclonada do endosperma do milho em desenvolvimento. Para determinar seum único membro da família de genes MIR167 é responsável pela forte ex-pressão observada no endosperma, vários genes de MIR167 foram analisa-dos por RT-PCR. Nove seqüências stem-loop de MIR167 de Zea mays fo-ram encontradas no registro público de miRNA ("miRBase", disponível narede em microrna.sanger.ac.uk/sequences) listadas como miR167a atémiR167i. RT-PCR tecido-específico foi realizado para várias das seqüênciasde miR167 de Z mays usando iniciadores gene-específicos para a síntesede cDNA de primeiro filamento seguido por PCR com pares de iniciadoresgene-específicos. A expressão de miR167 foi forte e específica para tecidode endosperma (15, 20 dias após a polinização).
Para determinar se miR167g é abundantemente expresso noendosperma, Northern blots de milho (LH59) foram preparados. O blot foimarcado com uma sonda de LNA de 22-mer de miR167 madura com extre-midade marcada (Figura 6A), stripped, e re-marcado com uma sonda de~400bp gene miR167g-específica (Figura 6B). O forte sinal do endospermaobservado indicou que miR167g é amplamente responsável pela expressãoaumentada no endosperma. O perfil de transcrição de tecidos de milho con-firmaram os resultados do Northern blot (Figura 6C); o transcrito que corres-ponde a miR167g estava abundantemente e especificamente expresso emtecido de endosperma.
Uma seqüência de cDNA de 804 pares de base disponível publi-camente no GenBank (apontada como "ZM_BFb0071l20.r ZM_BFb Zeamays cDNA 5', mRNA sequence") e que tem o número de acesso DR827873.1(Gl:71446823) está incorporada aqui por referência. Essa seqüência incluium segmento (SEQ ID NO. 178) que corresponde ao miR167g maduro.Usando a seqüência pública, a análise de bio-informática foi realizada na aseqüência genômica de milho patenteada. Um grupamento genômico de4,75 quilobases que inclui a seqüência da linhagem B73 de milho natural foiidentificado como contendo seqüências de genes previstas para miR167a emiR167g. Uma região de 486 pares de bases entre os dois genes miR167 foiidentificada como tendo homologia a uma seqüência de sinalizador de se-qüência expressa (EST). Motivos de promotor foram identificados nas se-qüências à montante de ambos os transcritos previstos (miR167a e miR167g).Uma região de 1682 pares de bases (SEQ ID NO. 179) entre os transcritos demiR167a e miR167g previstos, e uma região menor de 674 pares de bases(SEQ ID NO. 180) entre o EST e o transcrito de miR167g previsto foi identifi-cada como seqüências promotoras de miR167g. Subgrupos dessas seqüên-cias (por exemplo, pelo menos cerca de 50, cerca de 100, cerca de 150, cercade 200, cerca de 250 ou cerca de 300 nucleotídeos de SEQ ID NO. 179 ouSEQ ID NO. 180 ou fragmentos de pelo menos cerca de 50, cerca de 100,cerca de 150 e cerca de 200 nucleotídeos contíguos que tem pelo menos85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade a um segmento deSEQ ID NO. 179 ou SEQ ID NO. 180) também são úteis como promotores;seus efeitos promotores são demonstráveis por procedimentos bem-conhecidos na técnica (por exemplo, para direcionar a expressão de um generepórter tal como Iuciferase ou proteína verde fluorescente). O mapa de ano-tação, incluindo localizações dos genes de miR167a e miR167g e miRNAsmaduros e elementos promotores (por exemplo, TATA boxes), desse grupa-mento genômico é mostrado na Figura 7. O mapa de anotação também mos-tra a localização de motivos do fator responsivo a auxina (ARF) ou elementosde resposta a auxina com a seqüência TGTCTC (SEQ ID NO. 181), que indi-ca que a auxina pode regular a expressão de miR167g. miRNAs de miR167maduro são complementares a ARF6 e ARF8 (que codificam ARFs ativado-ras) e tem sido propostos com regulando a homeostase da auxina; vide, porexemplo, Rhoades et al. (2002) Cell, 110:513-520, Bartel & Bartel (2003) PlantPhysiol., 132:709-717, Ulmasov et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sei. USA,96:5844-5849, e Mallory et al. (2005) Plant Cell, 17:1360-1375.
Além das seqüências promotoras de miR167g (SEQ ID NO. 179e SEQ ID NO. 180) identificadas da linhagem B73 de milho natural, duasseqüências promotoras adicionais de miR167g (SEQ ID NO. 182 e SEQ IDNO. 183) foram amplificadas a partir da linhagem natural LH244 de milho. Asextremidade 3' de SEQ ID NO. 182 e SEQ ID NO. 183 foram determinadasexperimentalmente por 5'RACE (amplificação rápida de extremidades decDNA, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) de miR167g. A extremidade 5'da seqüência de 768 pares de bases (SEQ ID NO. 182) corresponde à ex-tremidade de uma seqüência de DNA de 481 pares de bases disponível pu-blicamente no GenBank (anotada como "QCG17c03.yg QCG Zea mays cD-NA clone QCG17c03, seqüência de mRNA") e que tem o número de acessoCF035345.1 (G1:32930533). A extremidade 5' da seqüência de 407 pares debases (SEQ ID NO. 183) corresponde à extremidade de uma seqüência deDNA de 746 pares de bases disponível publicamente no GenBank (anotadacomo "MEST991 _A06.T7-1 UGA-ZmSAM-XZ2 Zea mays cDNA, seqüênciade mRNA") e que tem o número de acesso DN214085.1 (Gl:60347112).
As seqüências promotoras de miR167g, gene de miR167g, mi-croRNA de miR167g maduro e sítio de reconhecimento de miR167g (exem-plos dos quais estão incluídos abaixo na Tabela 6) descritas aqui têm váriasutilidades como descrito em outro lugar nessa descrição. Em particular, umpromotor de miR167g é útil como um promotor endosperma-específico e po-de ser usado, por exemplo, para substituir um promotor B32 de milho. Emoutra utilidade, a seqüência de miR167g ou miR167g maduro (ou um precur-sor dessas) é manipulada para suprimir um gene alvo, especialmente quan-do a supressão deve ser específica para endosperma. O sítio de reconheci-mento de miR167g é útil, por exemplo, em constructos para expressão gêni-ca onde o gene deve ser expresso em outros tecidos que não o endospermae especialmente útil na produção de plantas transgênicas com esterilidadefeminina induzível de acordo com essa invenção.Exemplo 5
Os critérios atuais para identificação de miRNA têm enfatizado aconservação filogenética de miRNAs entre as espécies, e assim algunsmiRNAs não conservados ou espécie-específicos em plantas foram caracte-rizados em plantas. Esse exemplo descreve métodos não Iimitantes paraidentificar miRNAs, seus padrões de expressão no tecido, seus sítios de re-conhecimento correspondentes e exemplos de alvos.
Cinco novos miRNAs não-conservados e as correspondentesseqüências MIR foram identificados a partir de uma biblioteca de c-DNA fra-cionada por tamanho construída a partir de folhas de soja. Os critérios paraidentificação de miRNA incluíram: (1) um clone de pequeno RNA de 21 -ntclonado, e um possível miRNA* (fita que corresponde ao miRNA) em umaabundância menor, (2) contenção do duplex de miRNA/miRNA* inteiramentedentro de uma estrutura de foldback pequena, imperfeita, (3) derivação domiRNA a partir de um transcrito de RNA Pol Il não codificante de proteína e(4) presença de um sítio alvo complementar em um gene codificante; videAmbros et al. (2003) RNA1 9:277-279.
Pequenos RNAs foram extraídos de seqüências brutas que con-têm um adaptador e suas fitas foram determinadas. Esse grupo de seqüên-cias foi filtrado para remover pequenas seqüências de RNA que eram RNAde vírus, tRNA, rRNA, de cloroplasto e de mitocôndria, e transgene, resul-tando em um grupo filtrado de 381.633 supostas seqüências de miRNA. Pe-quenos RNAs que não se originam das fontes acima e não são homólogos amiRNAs conhecidos foram mapeados com relação a seqüências de cDNAde soja. Para as seqüências de cDNA mapeadas com baixo conteúdo codifi-cante de proteína, um fragmento de seqüência de cDNA de cerca de 250nucleotídeos, contendo o suposto miRNA, foi dobrado usando RNA Folder. Aestrutura de foldback foi examinada para verificar se o pequeno RNA estavalocalizado no "stem", e se um pequeno RNA extensivamente (mas não per-feitamente) complementar com menor abundância estava localizado no ladooposto do "stem". Os alvos potenciais do pequeno RNA são previstos combase em regras modificadas de Jones-Rhoades & Bartel (2004) MoL Cell,14:787-799, e Zhang (2005) Nucleic Acids Res., 33:W701-704. A Tabela 3lista os cinco novos miRNAs não conservados clonados a partir de tecido defolha de soja e para cada um, miRNA* correspondente e primRNA(s); abun-dância ("abund") é dada como o número de vezes em que a seqüência ocor-reu em um total de 381.633 seqüências.<table>table see original document page 108</column></row><table>Para cada novo miRNA de soja, a estrutura de "foldback" dasseqüências de precursor de miRNA foi prevista por um algoritmo ("RNAFol-der", baseado em RNAfold, disponível publicamente em www.tbi.univie.ac.at/~ivo/RNA/RNAfold.htmI). e o perfil de transcrição do precursor de miRNAobtido quando disponível, como listado na Tabela 4. Exemplos de alvos pre-vistos (sítios de reconhecimento) em soja e seus padrões de expressão i-dentificados foram identificados para dois dos miRNAs (SEQ ID NO. 184 eSEQ ID NO. 187).<table>table see original document page 110</column></row><table>Além disso, seqüencias alvo (sítio de reconhecimento) para cadanovo miRNA de soja foram identificadas a partir de bases de dados internosde soja ("MRTC"), como listado na Tabela 5. O número de nucleotídeos nãopareados entre cada sítio de reconhecimento e a seqüência de miRNA ma-duro varia entre 1 a 6 não pareamentos, que podem incluir intervalos ou nu-cleotídeos "ausentes". Por exemplo, um intervalo é encontrado entre os nu-cleotídeos 7 e 8 em cada uma das SEQ ID NO. 220, SEQ ID NO. 221, SEQID NO. 223, SEQ ID NO. 224 e SEQ ID NO. 225.<table>table see original document page 112</column></row><table><table>table see original document page 113</column></row><table>Tabela 5 continuacao
<table>table see original document page 114</column></row><table><table>table see original document page 115</column></row><table><table>table see original document page 116</column></row><table>Exemplo 6
Esse exemplo descreve métodos não Iimitantes para identifica-ção de miRNAs de uso na produção de plantas transgênicas com esterilida-de induzível utilizáveis em métodos dessa invenção. Mas especificamente,miRNAs que tem um padrão de expressão nos tecidos desejados (isto é,tecidos reprodutivos masculino ou feminino) foram identificados pela avalia-ção dos dados do perfil de transcrição (TxP).
Um procedimento comum para identificar miRNAs que tem umpadrão de expressão nos tecidos desejados (isto é, tecidos reprodutivosmasculino ou feminino) inclui as etapas de:
(a) fornecer uma seqüência inicial de miR que inclui a região"stem-loop", por exemplo, a partir das seqüências de miRdisponíveis publicamente na base de dados "miRBase"(disponível na rede em microrna.sanger.ac.uk/sequences);
(b) aplicar algoritmos de análise de seqüência, tal comoBLAST como é bem-conhecido na técnica (vide Altschul etaí. (1990) J. MoL Biol., 215:403-410) para identificar se-qüências homólogas ou idênticas (por exemplo, seqüên-cias patenteadas em conjuntos de sondas (probeset) demicroarranjo feitos com DNA do genoma completo do mi-lho); e
(c) analisar os perfis de transcrição das seqüências homólo-gas do conjunto de sondasidentificadas na etapa (b) e i-dentificar miRNAs que tem um padrão de expressão nostecidos desejados (isto é, tecidos reprodutivos masculinosou femininos).
Preferivelmente, uma quarta etapa é adicionada:
(d) para seqüências de conjuntos de sonda homólogas desco-bertas ter os perfis de transcrição desejados, confirmandoa identificação do gene de miRNA tanto pelo alinhamentoda seqüência de "stem-loop" da seqüência de miR inicialcom a seqüência do conjunto de sonda, quanto por miR-NAs potencialmente novos, determinar que a seqüênciaque é prevista para se dobrar em uma estrutura de "stem-loop" característica de um miRNA. Também preferivelmen-te, uma etapa opcional é usada, em que uma ou maiscomparações com BLAST contra grupos de dados de se-qüências adicionais diferentes dos grupos de dados dasseqüências do conjunto de sondas são incluídas (antes daetapa (b) acima), permitindo a identificação adicional desondas que caem fora da região de foldback prevista dogene de miR; falsos positivos, por exemplo, devido a pare-amentos nos grupos de dados da seqüência adicional queincluem contigs que sofreram entrançamento incorreto, sãoidentificados pela sua falta de características de miRNAtais como estrutura de foldback apropriada, e removidos.
O procedimento acima foi aplicado aos dados do perfil de trans-crição patenteado de milho. As Figuras 13 e 14 descrevem os perfis detranscrição de seqüências de conjuntos de sonda que foram identificadoscomo incluindo genes de miRNA que tem os padrões de expressão deseja-dos, isto é, em tecido reprodutivo feminino (Figura 13) e em tecido reprodu-tivo masculino (Figurai 4). Vários genes de miRNA e exemplos de seus sí-tios de reconhecimento correspondentes foram identificados por ser úteis naprodução de planta transgênica com esterilidade induzível (Tabela 6). Doismembros da família miR166, miR166b e miR166d, partilharam uma seqüên-cia de miRNA maduro idêntica e sítios de reconhecimento correspondentes,mas mostraram diferentes padrões de expressão, com miR166b sendo ex-presso apenas em embrião e miR166d sendo expresso em óvulo, embrião,estigma e raiz; assim, para fazer plantas indutivamente fêmea estéreis,miR166b seria preferido. Uma modalidade particularmente preferida de ummiRNA útil para produção de plantas indutivamente fêmea-estéreis émiR167g específico para endosperma de milho (SEQ ID NO. 307), com ousem G adicional na extremidade 3'; modalidades que têm G adicional na ex-tremidade 3' são 22-mers terminando em GG e tem sítios de reconhecimen-to correspondentes que também são preferivelmente 22-mers onde o nu-cleotídeo adicionado a extremidade 5' é preferivelmente não pareado (ouseja, não é C). Além da utilidade desses e de miRNAs similares e seus sítiosde reconhecimento correspondentes para produção e utilização de plantastransgênicas, indutivamente estéreis, os promotores desses miRNAs madu-ros são úteis para direcionar a expressão de um transgene para o qual aexpressão específica em um tecido reprodutivo é desejada, por exemplo, opromotor de miR167g é útil para direcionar a expressão específica em en-dosperma.<table>table see original document page 120</column></row><table><table>table see original document page 121</column></row><table>Exemplo 7
Esse é um exemplo não Iimitante de métodos para fazer de umconstructo de DNA recombinante, útil em fazer uma planta transgênica, indu-tivamente estéril, que transcreve RNA que inclui: (a) pelo menos um sítio dereconhecimento de miRNA exógeno reconhecível por um miRNA maduroque é especificamente expresso em tecido reprodutivo da planta; e (b) RNAmensageiro que codifica uma proteína que confere tolerância a um herbici-da; em que o miRNA maduro suprime especificamente a expressão da pro-teína no tecido reprodutivo e em que a esterilidade da planta transgênica éinduzível pela aplicação do herbicida à planta. Um exemplo não Iimitante deum método para desenhar um sítio de reconhecimento de miRNA para usoem tal constructo de DNA recombinante está ilustrado aqui, em que a plantaé milho e a proteína que confere tolerância a um herbicida é 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase; métodos análogos são úteis com ou-tras plantas e outras proteínas.
Esse método inclui as etapas de:
(a) Selecionar uma seqüência alvo única de pelo menos 18nucleotídeos específica para o RNA mensageiro que codi-fica 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS).
Uma abordagem é usar uma pesquisa com BLAST (porexemplo, tanto das bases de dados de cDNA quanto deDNA genômico de milho) para identificar ortólogos deEPSPS e quaisquer combinações potenciais a genes nãorelacionados, evitando dessa maneira o silenciamento nãointencional de seqüências não-alvo.
(b) Analisar o RNA mensageiro para seqüências indesejáveis(por exemplo, pareamentos com seqüências de espéciesnão-alvo, especialmente animais) e pontuar cada segmen-to de 19-mer potencial quanto ao conteúdo de GC, escorede Reynolds (vide Reynolds et al. (2004) Nature Biotech-nol., 22:326-330), e a assimetria funcional caracterizadapor uma diferença negativa na energia livre ("ΔΔΘ") (videKhvorova et ai (2003) Cell, 115:209-216). Preferivelmente19-mers são selecionados por terem todas ou a maioriadas seguintes características: (1) um escore de Reynolds>4, (2) um conteúdo de GC entre cerca de 40% a cerca de60%, (3) um ΔΔΘ negativo, (4) uma adenosina terminal, (5)falta de uma série consecutiva de 4 ou mais dos mesmosnucleotídeos; (6) uma localização próxima da terminação 3'do gene alvo. Preferivelmente, múltiplos 19-mers (3 oumais) são selecionados para teste.
(c) Determinar o complemento reverso dos 19-mers selecio-nados para usar na produção de um miRNA sintético de21-mer; o nucleotídeo adicional na posição 20 é preferi-velmente pareado com a seqüência alvo selecionada e onucleotídeo na posição 21 é preferivelmente escolhido pa-ra não ser pareado para impedir a transitoriedade.
(d) Testar os miRNAs sintéticos, por exemplo, em um ensaiotransitório de Nicotiana benthamiana para expressão demiRNA e repressão de alvo.
(e) Clonar os miRNAs mais eficazes em um constructo paratransformação estável de milho (vide as seções sob os títu-los "Fazendo e Usando Constructos de DNA Recombinan-te" e "Fazendo e Usando Células de Planta Transgênicas ePlantas Transgênicas").
Exemplo 8
Esse exemplo descreve a produção de plantas transgênicas,indutivamente estéreis e seus usos na produção de semente híbrida. Maisespecificamente, esse exemplo descreve a produção de semente de milhohíbrido a partir de uma planta parental de milho transgênica, indutivamentemacho estéril e uma planta parental transgênica de milho indutivamente fê-mea estéril, em que a esterilidade é induzida pela aplicação de herbicidaglifosato às plantas parentais.
Constructos de DNA recombinante são desenhados para trans-crever (a) um sítio de reconhecimento de miRNA exógeno reconhecível porum miRNA maduro que é expresso especificamente no tecido reprodutivo daplanta; e (b) RNA mensageiro que codifica uma proteína (5-enolpiruvilchi-quimato-3-fosfato sintase) que confere tolerância ao um herbicida (glifosato);
em que o miRNA maduro suprime especificamente a expressão da proteínano tecido reprodutivo e em que a esterilidade da planta transgênica é induzí-vel pela aplicação do herbicida à planta. Cada constructo de DNA recombi-nante inclui uma seqüência que transcreve o RNA mensageiro que codifica5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase da cepa CP4 de Agrobacterium tu-mefaciens ("EPSPS-CP4"),
ATGCTTCACGGTGCAAGCAGCCGTCCAGCAACTGCTCGTAAGTCCTCTGGTCTTTCTGGAACCGTCCGTATTCCAGGTGACAAGTCTATCTCCCACAGGTCCTTCATGTTTGGAGGTCTCGCTAGCGGTGAAACTCGTATCACCGGTCTTTTGGAAGGTGAAGATGTTATCAACACTGGTAAGGCTATGCAAGCTATGGGTGCCAGAATCCGTAAGGAAGGTGATACTTGGATCATTGATGGTGTTGGTAACGGTGGACTCCTTGCTCCTGAGGCTCCTCTCGATTTCGGTAACGCTGCAACTGGTTGCCGTTTGACTATGGGTCTTGTTGGTGTTTACGATTTCGAT AGCACTTTCATTGGTGACGCTTCTCTCACTAAGCGTCCAATGGGTCGTGTGTTGAACCCACTTCGCGAAATGGGTGTGCAGGTGAAGTCTGAAGACGGTGATCGTCTTCCAGTTACCTTGCGTGGACCAAAGACTCCAACGCCAATCACCTACAGGGT ACCTATGGCTTCCGCTCAAGTGAAGTCCGCTGTTCTGCTTGCTGGTCTCAACACCCCAGGTATCACCACTGTTATCGAGCCAATCATGACTCGTGACCACACTGAAAAGATGCTTCAAGGTTTTGGTGCTAACCTTACCGTTGAGACTGATGCTGACGGTGTGCGTACCATCCGTCTTGAAGGTCGTGGTAAGCTCACCGGTCAAGTGATTGATGTTCCAGGTGATCCATCCTCTACTGCTTTCCCATTGGTTGCTGCCTTGCTTGTTCCAGGTTCCGACGTCACCATCCTTAACGTTTTGATGAACCCAACCCGTACTGGTCTCATCTTGACTCTGCAGGAAATGGGTGCCGACATCGAAGTGATCAACCCACGTCTTGCTGGTGGAGAAGACGTGGCTGACTTGCGTGTTCGTTCTTCTACTTTGAAGGGTGTTACTGTTCCAGAAGACCGTGCTCCTTCTATGATCGACGAGTATCCAATTCTCGCTGTTGCAGCTGCATTCGCTGAAGGTGCTACCGTTATGAACGGTTTGGAAGAACTCCGTGTTAAGGAAAGCGACCGTCTTTCTGCTGTCGCAAACGGTCTCAAGCTCAACGGTGTTGATTGCGATGAAGGTGAGACTTCTCTCGTCGTGCGTGGTCGTCCTGACGGTAAGGGTCTCGGTAACGCTTCTGGAGCAGCTGTCGCTACCCACCTCGATCACCGTATCGCTATGAGCTTCCTCGTTATGGGTCTCGTTTCTGAAAACCCTGTTACTGTTGATGATGCTACTATGATCGCTACTAGCTTCCCAGAGTTCATGGATTTGATGGCTGGTCTTGGAGCTAAGATCGAACTCTCCGACACTAAGGCTGCTTGA
(SEQ ID NO. 344). Para conveniência de clonagem, cada constructo de DNArecombinante também inclui uma seqüência espaçadora na região 3' nãotraduzida (3'UTR) localizada entre o RNA mensageiro e um terminador,TgagctcAAGAATTCGAGCTCGGTACCggatccTCTAGCTAG (SEQ ID NO.345, com os sítios de restrição de Sacl e BamHI indicados por letras minús-culas), que permite a inserção de um sítio de reconhecimento de miRNA en-tre os sítios de restrição de Sacl e BamHI.
O constructo de DNA recombinante para a esterilidade masculi-na induzível inclui a seqüência
TqagctcAAGAATTCGAAGACAATGCGATCCCUUUGGAGCTCGGTACCqqatccTCTAGCTAG (SEQ ID NO. 346, com os sítios de restrição de Sacl e Ba-mHI indicados por letras minúsculas), que contém um sítio de reconhecimen-to de miRNA sintético (indicado por texto sublinhado), feito para ser reco-nhecido por um miR393, que é altamente expresso no pólen (vide Exemplo6) e é um membro de uma família de miRNA relativamente pequena (redu-zindo a possibilidade de que outros membros da mesma família de miRNAsuprimam EPSPS-CP4 em tecidos diferentes de pólen).
O constructo de DNA recombinante para a esterilidade femininainduzível inclui a seqüência
TaaactcAAGAATTCGATCCGCTTTCTCTCTTCTGTCAGCTCGGTACCqgatccTCTAGCTAG (SEQ ID NO. 347, com os sítios de restrição de Sacl e Ba-mHI indicados por letras minúsculas), que contém um sítio de reconhecimen-to de miRNA sintético (indicado pelo texto sublinhado), feito para ser reco-nhecido por um miR156j, que é altamente expresso no óvulo e semente pre-coce (vide Exemplo 6). Esse sítio de reconhecimento de miRNA inclui umaúnica base na posição 14, que pode ser preferivelmente pareada com umaseqüência alvo para melhorar a especificidade para o reconhecimento demiR156j. O pareamento na extremidade 3' do miRNA é reduzido (em relaçãoa alvos endógenos), melhorando a especificidade para o reconhecimento demiR156j. Isso reduz a possibilidade de que outros membros da família demiR156 suprimirem EPSPS-CP4 em tecidos diferentes do óvulo e sementeprecoce.
Cada um dos dois constructos de DNA recombinante (para este-rilidade masculina induzível e esterilidade feminina induzível) é individual-mente transformado em milho como descrito em "Fazendo e Usando Célulasde Planta Transgênicas e Plantas Transgênicas". Resumidamente, um vetorpara transformação de planta é preparado para cada um dos constructos deDNA recombinante como descrito em "Fazendo e Usando Constructos deDNA Recombinante" e usado para transformar tecido de planta de milho u-sando transformação mediada por Agrobacterium e seleção com glifosato.Plantas transgênicas de cada evento de inserção transgênica são cultivadasaté a maturidade e as sementes da progênie são produzidas por autopoiini-zação ou cruzamento de rotina (como descrito em "Fazendo e Usando Célu-las Transgênicas de Planta e Plantas Transgênicas"). Algumas das semen-tes da progênie incluem outro DNA recombinante para conferir característi-cas adicionais (por exemplo, no caso de plantas transformadas, característi-cas que incluem resistência a herbicida, resistência a pragas, tolerância paragerminação no frio, tolerância a falta de água e semelhantes). A partir des-sas sementes de progênie, são selecionadas sementes transgênicas paraserem cultivadas em uma primeira planta parental (que contém em seu ge-noma o constructo de DNA recombinante para esterilidade masculina induzí-vel) e sementes transgênicas para serem cultivadas em uma segunda plantaparental (que contém no seu genoma o constructo de DNA recombinantepara esterilidade feminina induzível).
Um plantio misto é feito no campo, com uma proporção de se-mente transgênica de milho que tem o constructo para esterilidade masculi-na induzível para semente transgênica que tem o constructo para esterilida-de masculina induzível entre cerca de 1:4 a cerca de 1:10. A semente trans-gênica de milho é deixada germinar, fornecendo dessa maneira a primeiraplanta parental com esterilidade masculina induzível (isto é, plantas paren-tais para ser polinizadas) e a segunda planta parental com esterilidade femi-nina induzível (isto é plantas parentais polinizadoras). No(s) estágio(s) apro-priado(s) do desenvolvimento da planta, o herbicida glifosato é aplicado aprimeira e a segunda plantas parentais por pulverização de uma quantidadeeficaz para induzir esterilidade masculina nas primeiras plantas parentais eesterilidade feminina nas segundas plantas parentais. A semente coletadado campo é uma semente híbrida produzida a partir de óvulos da primeiraplanta parental polinizados pelo pólen da segunda planta parental.
Variações do procedimento acima são realizadas em milho, soja,algodão e trigo. Pares de constructos de DNA recombinante (cada par con-sistindo em um constructo de DNA recombinante para macho esterilidadeinduzível e um constructo de DNA recombinante para fêmea esterilidade in-duzível) são desenhados usando os padrões de expressão de miRNA espe-cíficos descritos na Tabela 6 como se segue.
Cada constructo de DNA recombinante para macho esterilidadeinduzível inclui: (1) seqüência que transcreve RNA mensageiro que codificauma proteína que confere tolerância a um primeiro herbicida, em que a pro-teína é selecionada a partir de uma 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase,a 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase da cepa CP4 de Agrobacteriumtumefaciens, glifosato oxidoredutase, glifosato acetiltransferase, glifosatodescarboxilase, pat, bar, dicamba monooxigenase, 2,2-ácido dicloropropiôni-co desalogenase, acetoidroxiácido sintase, acetolactato sintase, haloarilnitri-lase, acetil-coenzima A carboxilase modificada, diidropteroato sintase, poli-peptídeo de fotossitema Il de 32 kDa, antranilato sintase, ácido diidrodipico-línico sintase, fitoeno dessaturase, hidroxifenil piruvato dioxigenase, proto-porfirinogênio oxidase I modificada, e ariloxialcanoato dioxigenase; e (2) se-qüência que transcreve pelo menos um sítio de reconhecimento de miRNAexógeno reconhecível por um miRNA maduro que é expresso especifica-mente em tecido reprodutivo masculino, por exemplo, um miRNA maduroexpresso em pólen selecionado a partir do grupo que consiste em UGACA-GAAGAGAGUGAGCAC (SEQ ID NO. 323), UGCCUGGCUCCCU-GUAUGCCA (SEQ ID NO. 328), UCCAAAGGGAUCGCAUUGAUCU (SEQID NO. 333), e UUCCACAGCUUUCUUGAACUG (SEQ ID NO. 338) (videTabela 6). Dessa forma, exemplos não-limitantes de um constructo de DNArecombinante para macho esterilidade induzível incluem: (1) seqüência quetranscreve RNA mensageiro que codifica uma proteína que confere tolerân-cia a um primeiro herbicida, e (2) seqüência que transcreve pelo menos umsítio e reconhecimento de miRNA exógeno que tem uma seqüência selecio- nada a partir do grupo de seqüências que consistem em GUGCUCUCUCU-CUUCUGUCA (SEQ ID NO. 324), CUGCUCUCUCUCUUCUGUCA (SEQ IDNO. 325), UUGCUUACUCUCUUCUGUCA (SEQ ID NO. 326), CCGCUCU-CUCUCUUCUGUCA (SEQ ID NO. 327), UGGCAUGCAGGGAGCCAGGCA(SEQ ID NO. 329), AGGAAUACAGGGAGCCAGGCA (SEQ ID NO. 330),GGGUUUACAGGGAGCCAGGCA (SEQ ID NO. 331), AGGCAUACAGG-GAGCCAGGCA (SEQ ID NO. 332), AAACAAUGCGAUCCCUUUGGA (SEQID NO. 334), AGACCAUGCGAUCCCUUUGGA (SEQ ID NO. 335), GGU-CAGAGCGAUCCCUUUGGC (SEQ ID NO. 336), AGACAAUGCGAUCC-CUUUGGA (SEQ ID NO. 337), UCGUUCAAGAAAGCCUGUGGAA (SEQ ID NO. 339), CCGUUCAAGAAAGCCUGUGGAA (SEQ ID NO. 340), UCGUU-CAAGAAAGCAUGUGGAA (SEQ ID NO. 341), ACGUUCAAGAAAGCUU-GUGGAA (SEQ ID NO. 342), e CCGUUCAAGAAAGCCUGUGGAA (SEQ IDNO. 343) (vide Tabela 6).
Similarmente, cada constructo de DNA recombinante para fêmeaesterilidade induzível inclui: (1) seqüência que transcreve RNA mensageiroque codifica uma proteína que confere tolerância a um primeiro herbicida,em que a proteína é selecionada a partir de uma 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase, a 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase da cepa CP4 deAgrobacterium tumefaciens, glifosato oxidorredutase, glifosato acetiltransfe- rase, glifosato descarboxilase, pat, bar, dicamba monooxigenase, 2,2-ácidodicloropropiônico desalogenase, acetoidroxiácido sintase, acetolactato sinta-se, haloarilnitrilase, acetil-coenzima A carboxilase modificada, diidropteroatosintase, polipeptídeo de fotossitema Il de 32 kDa, antranilato sintase, ácidodiidrodipicolínico sintase, fitoeno dessaturase, hidroxifenil piruvato dioxige-nase, protoporfirinogênio oxidase I modificada, e ariloxialcanoato dioxigena-se; e (2) seqüência que transcreve pelo menos um sítio de reconhecimentode miRNA exógeno reconhecível por um miRNA maduro que é expressoespecificamente em tecido reprodutivo feminino, por exemplo, um miRNAmaduro selecionado a partir do grupo que consiste em UGACAGAAGAGA-GAGAGCACA (SEQ ID NO. 297), CUUGGAUUGAAGGGAGCUCCU (SEQID NO. 302), UCGGACCAGGCUUCAUUCCCC (SEQ ID NO. 314), UCG-GACCAGGCUUCAUUCCCG (SEQ ID NO. 314), e UGAAGCUGCCAG-CAUGAUCUG (SEQ ID NO. 319) (vide Tabela 6). Dessa forma, exemplosnão Iimitantes de um constructo de DNA recombinante para fêmea esterili-dade induzível incluem: (1) seqüência que transcreve RNA mensageiro quecodifica uma proteína que confere tolerância a um primeiro herbicida e (2)seqüência que transcreve pelo menos um sítio de reconhecimento de miR-NA exógeno que tem uma seqüência selecionada a partir do grupo de se-qüências que consistem em GUGCUCUCUCUCUUCUGUCA (SEQ ID NO.298), CUGCUCUCUCUCUUCUGUCA (SEQ ID NO. 299), UUGCUUACU-CUCUUCUGUCA (SEQ ID NO. 300), CCGCUCUCUCUCUUCUGUCA (SEQID NO. 301), UGGAGCUCCCUUCAUUCCAAU (SEQ ID NO. 303), UCGA-GUUCCCUUCAUUCCAAU (SEQ ID NO. 304), AUGAGCUCUCUUCAAAC-CAAA (SEQ ID NO. 305), UGGAGCUCCCUUCAUUCCAAG (SEQ ID NO.306), UAGAGCUUCCUUCAAACCAAA (SEQ ID NO. 307), UGGAGCUC-CAUUCGAUCCAAA (SEQ ID NO. 308), AGCAGCUCCCUUCAAACCAAA(SEQ ID NO. 309), CAGAGCUCCCUUCACUCCAAU (SEQ ID NO. 310),UGGAGCUCCCUUCACUCCAAU (SEQ ID NO. 311), UGGAGCUCCCUU-CACUCCAAG (SEQ ID NO. 312), UGGAGCUCCCUUUAAUCCAAU (SEQID NO. 313), UUGGGAUGAAGCCUGGUCCGG (SEQ ID NO. 315), CUGG-GAUGAAGCCUGGUCCGG (SEQ ID NO. 316), CUGGAAUGAAGCCUG-GUCCGG (SEQ ID NO. 317), CCGGGAUGAAGCCUGGUCCGG (SEQ IDNO. 318), UUGGGAUGAAGCCUGGUCCGG (SEQ ID NO. 315), CUGG-GAUGAAGCCUGGUCCGG (SEQ ID NO. 316), CUGGAAUGAAGCCUG-GUCCGG (SEQ ID NO. 317), CCGGGAUGAAGCCUGGUCCGG (SEQ IDNO. 318), GAGAUCAGGCUGGCAGCUUGU (SEQ ID NO. 320), UAGAU-CAGGCUGGCAGCUUGU (SEQ ID NO. 321), e AAGAUCAGGCUGGCAG-CUUGU (SEQ ID NO. 322) (vide Tabela 6).
Os dois membros de cada par de constructos de DNA recombi-nantes são transformados individualmente em milho e soja e algodão e trigo,como descrito sob "Fazendo e Usando Células de Planta Transgênicas ePlantas Transgênicas". Plantas transgênicas de cada evento de inserçãotransgênico são cultivadas até a maturidade e sementes da progênie sãoproduzidas por autopolinização ou cruzamento de rotina. Algumas das se-mentes da progênie incluem outro DNA recombinante para conferir caracte-rísticas adicionais (por exemplo, no caso de plantas transformadas, caracte-rísticas que incluem resistência a herbicida, resistência a pragas, tolerânciaa germinação no frio, tolerância a falta de água, e semelhantes). A partirdessas sementes de progênie são selecionadas sementes transgênicas paraserem cultivadas em uma primeira planta parental (contendo no seu genomaconstructo de DNA recombinante para macho esterilidade induzível) e se-mente transgênica para ser cultivada em uma segunda planta parental (con-tendo no seu genoma o constructo de DNA recombinante para fêmea esteri-Iidade induzível). Um plantio misto é feito no campo, com uma proporçãoapropriada de sementes transgênicas que têm o constructo para macho es-terilidade induzível em relação às sementes que tem o constructo para ma-cho esterilidade induzível. A semente transgênica é deixada germinar, assimfornecendo primeiras plantas parentais com macho esterilidade induzível(isto é, polinizando plantas parentais). No(s) estágio(s) apropriado(s) de de-senvolvimento da planta, o herbicida apropriado é aplicado às primeiras esegundas plantas parentais por pulverização de uma quantidade eficaz eminduzir macho esterilidade nas primeiras plantas parentais e fêmea esterili-dade nas segundas plantas parentais. Semente coletada do campo é se-mente híbrida produzida de óvulos da primeira planta parental polinizada porpólen da segunda planta parental.
Todos os materiais e métodos descritos e reivindicados aqui po-dem ser feitos e usados sem experimentação excessiva como instruído peladescrição acima. Embora os materiais e métodos dessa invenção tenhamsido descritos em termos de modalidades preferidas e exemplos ilustrativos,será claro para aqueles versados na técnica que variações podem ser apli-cadas aos materiais e métodos aqui descritos sem desconsiderar o conceito,espírito e escopo da invenção. Todos os tais substitutos similares e modifi-cações claras para os versados na técnica são considerados estar dentro doespírito, escopo e conceito da invenção como definido pelas reivindicaçõesanexas.<400> 20
gugcucucuc ucuucuguca
<210> 21
<211> 20
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 21
cugcucucuc ucuucuguca
<210> 22
<211> 20
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 22
uugcuuacuc ucuucuguca
<210> 23
<211> 20
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 23ccgcucucuc ucuucuguca
<210> 24
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 24
uggagcuccc uucauuccaa u
<210> 25
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 25
ucgaguuccc uucauuccaa u
<210> 26
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 26
augagcucuc uucaaaccaa a
<210> 27
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana<400> 27
uggagcuccc uucauuccaag
<210> 28
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 28
uagagcuucc uucaaaccaa a
<210> 29
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 29
uggagcucca uucgauccaa a
<210> 30
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 30
agcagcuccc uucaaaccaa a
<210> 31
<211> 21
<212> RNA
<213> Phaseolus vulgaris
<400> 31
cagagcuccc uucacuccaa u
<210> 32
<211> 21
<212> RNA
<213> Vitis vinifera
<400> 32
uggagcuccc uucacuccaa u
<210> 33
<211> 21
<212> RNA
<213> Hordeum vulgare
<400> 33
uggagcuccc uucacuccaa g
<210> 34
<211> 21
<212> RNA
<213> Oryza sativa<400> 34
uggagcuccc uuuaauccaa u
<210> 35
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 35
uggcaugcag ggagccaggc a
<210> 36
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 36
aggaauacag ggagccaggc a
<210> 37
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 37
ggguuuacag ggagccaggc a
<210> 38
<211> 21
<212> RNA
<213> Oryza sativa
<400> 38
aggcauacag ggagccaggc a
<210> 39
<211> 21
<212> RNA
<213> Lotus corniculatus var. japonicus
<400> 39aagcauacag ggagccaggc a
<210> 40
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 40accugaugua aucacuuuca a
<210> 41
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana<400>
41
cccggaugua aucacuuuca g
<210> 42
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 42
uuguuacuuu caaugcauug a
<210> 43
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 43
cccugaugua uuuacuuuca a
<210> 44
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 44
uagucacguu caaugcauug a
<210> 45
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 45
cccugaugua uucacuuuca g
<210> 46
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 46
cccugauguu guuacuuuca g
<210> 47
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 47
uagucacuuu cagcgcauug a
<210> 48
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana<400> 48
uccaaaugua gucacuuuca g
<210> 49
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 49
uccaaaugua gucacuuuca a
<210> 50
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 50
uccaaaugua gucacuuuca g
<210> 51
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 51
uccaaaugua gucacuuuca a
<210> 52
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 52
uuguaacuuu cagugcauug a
<210> 53
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 53
uagucacguu caaugcauug a
<210> 54
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 54
uuguuacuuu cagugcauug a
<210> 55
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 55cccugauguu gucacuuuca c
<210> 56
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 56
uuguuacuua caaugcauug a
<210> 57
<211> 21<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 57
uagucuuuuu caacgcauug a
<210> 58
<211> 22<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 58
cuggaugcag agguauuauc ga
<210> 59
<211> 22
<212> RNA
<213> Populus tremula
<400> 59
cuggaugcag aggucuuauc ga
<210> 60
<211> 22
<212> RNA
<213> Oryza sativa
<400> 60
cuggaugcag agguuuuauc ga
<210> 61
<211> .23
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 61
aucgaguucc aaguccucuu caa<210> 62<211> 23
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 62
aucgaguucc agguccucuu caa<210> 63
<211> 23
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 63
aucgaguucc aaguuuucuu caa 23
<210> 64
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 64
agcacguacc cugcuucucc a 21
<210> 65
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 65
uuuacgugcc cugcuucucc a 21
<210> 66
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 66
agcacguguc cuguuucucc a 21
<210> 67
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 67
ucuacgugcc cugcuucucc a 21
<210> 68
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 68
cucacgugac cugcuucucc g 21
<210> 69
<211> 21
<212> RNA
<213> Oryza sativa
<400> 69
cgcacgugac cugcuucucc a
21<210> 70
<211> 21
<212> RNA
<213> Medicago truncatula
<400> 70
cuuacguguc cugcuucucc a 21
<210> 71
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 71
cuuacgugcc cugcuucucc a 21
<210> 72
<211> 21
<212> RNA
<213> Lycopersicum esculentum
<400> 72
gccacgugca cugcuucucc a 21
<210> 73
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 73
uugggaugaa gccugguccg g 21
<210> 74
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 74
cugggaugaa gccugguccg g 21
<210> 75
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 75
cuggaaugaa gccugguccg g 21
<210> 76
<211> 21
<212> RNA
<213> Populus tremula
<400> 76
ccgggaugaa gccugguccg g
21<210> 77
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 77
gagaucaggc uggcagcuug u
<210><211><212><213>
<400>
7821RNA
Arabidopsis thaliana78
uagaucaggc uggcagcuug u
<210><211><212><213>
<400>
7921RNA
Oryza sativa79
aagaucaggc uggcagcuug u
<210><211><212><213>
8021RNA
Arabidopsis thaliana
<400> 80
uucccgagcu gcaucaagcu a
<210> 81<211> 21<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 81
aagggaaguc auccuuggcu g
<210> 82<211> 21<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 82
acgggaaguc auccuuggcu a
<210> 83
<211> 21<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 83
aggggaaguc auccuuggcu a
<210> 84
<211> 21<212>
<213>
RNA
Arabidopsis thaliana
<400> 84aggcaaauca ucuuuggcuc a
<210> 85
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 85
gcggcaauuc auucuuggcu u
<210> 86
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 86
ccggcaaauc auucuuggcu u
<210> 87
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 87
aagggaaguc auccuuggcu a
<210> 88
<211> 21
<212> RNA
<213> Zea mays
<400> 88
guggcaacuc auccuuggcu c
<210> 89
<211> 21
<212> RNA
<213> Vitis vinifera
<400> 89
ugggcaauuc auccuuggcu u
<210> 90
<211> 21
<212> RNA
<213> Oryza sativa
<400> 90
auggcaaauc auccuuggcu u
<210> 91
<211> 21<212> RNA<213>
Glicina máxima
<400>
91
uagggaaguc auccuuggcu c
<210> 92
<211> 21
<212> RNA
<213> Gossypium hirsutum
<400> 92
cugggaaguc auccuuggcu c
<210><211><212><213>
<400>
9321RNA
Arabidopsis thaliana93
gauauuggcg cggcucaauc a
<210><211><212><213>
<400>
9421RNA
Arabidopsis thaliana94
cugcagcauc aucaggauucu
<210><211><212><213>
9521RNA
Arabidopsis thaliana
<400> 95
cagcagcauc aucaggauuc u
<210> 96
<211> 21<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 96
augcagcauc aucaggauuc u
<210> 97
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 97
uggcagcauc aucaggauuc u
<210> 98
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana<400> 98
uuguagcauc aucaggauuc c
<210> 99
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 99uugcagcauc aucaggauuc c
<210> 100
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 100
cagggggacc cuucagucca a
<210> 101
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 101
gagggguccc cuucagucca u
<210> 102
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 102
gagggguccc cuucagucca g
<210> 103
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 103
aagggguacc cuucagucca g
<210> 104
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 104uagggggacc cuucagucca a
<210> 105
<211> 21
<212> RNA
<213> Oryza sativa<400>
105
gaggggaccc cuucagucca g
<210> 106
<211> 21
<212> RNA
<213> Oryza sativa
<400> 106
ucggggcaca cuucagucca a
<210> 107
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 107
aaacaaugcg aucccuuugg a
<210> 108
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 108
agaccaugcg aucccuuugg a
<210> 109
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 109
ggucagagcg aucccuuugg c
<210> 110
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 110
agacaaugcg aucccuuugg a
<210> 111
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 111ggagguugac agaaugccaa a
<210> 112
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana<400>
112 gaguuccucc aaacacuuca u
<210> 113
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 113
gaguuccucc aaacucuuca u
<210> 114
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 114
aaguucuccc aaacacuuca a
<210> 115
<211> 22
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 115
ucguucaaga aagccugugg aa
<210> 116
<211> 22
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 116
ccguucaaga aagccugugg aa
<210> 117
<211> 22
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 117
ucguucaaga aagcaugugg aa
<210> 118
<211> 22
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 118
àcguucaaga aagcuugugg aa
<210> 119
<211> 22
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana<400> 119
ccguucaaga aagccugugg aa 22
<210> 120
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 120
aaucaaugcu gcacucaaug a 21
<210> 121
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 121
agucaacgcu gcacuuaaug a 21
<210> 122
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 122
aaucaaugcu gcacuuaaug a 21
<210> 123
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 123
aagggguuuc cugagaucac a 21
<210> 124
<211> 22
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 124
ugcgggugac cugggaaaca ua 22
<210> 125
<211> 22
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 125
aaggugugac cugagaauca ca 22
<210> 126
<211> 22
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 126
gugauuuuuc ucaacaagcg aa
22<210> 127
<211> 22
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 127
gugauuuuuc ucuacaagcg aa
<210> 128
<211> 22
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 128
gugauuuuuc ucuccaagcg aa
<210> 129
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 129
uagggcauau cuccuuuggc a
<210> 130
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 130
uugggcaaau cuccuuuggc a
<210> 131
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 131
ucgagcaaau cuccuuuggc a
<210> 132
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 132
uagagcaaau cuccuuuggc a
<210> 133
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 133
uagggcaaau cuucuuuggc a<210> 134
<211> 21-<212> HNA
<213> Gryza sativa
<400> 134
uagggcaaau cuccuuuggc a
<210> 135
<211> 21
<212> RNA
<213> Oryza sativa
<400> 135
cugggcaaau cuccuuuggc a
<210> 136
<211> 21
<212> RNA
<213> Oryza sativa
<400> 136
ucgggcaaau cuccuuuggc a
<210> 137
<211> 21
<212> RNA
<213> Oryza sativa
<400> 137
ccgggcaaau cuccuuuggc a
<210> 138
<211> 21
<212> RNA
<213> Populus tremula
<400> 138
gcgggcaaau cuucuuuggc a
<210> 139
<211> 21
<212> RNA
<213> Medicago truncatula
<400> 139
aagggcaaau cuccuuuggc a
<210> 140
<211> 21
<212> RNA
<213> Tritician aestivum
<400> 140
uagggcaaau cuccuuuggc g
<210> 141
<211> 21<212>
<213>
RNA
Triticum aestivum
<400> 141cugggcaaau cuccuuuggc g
<210> 142
<211> 21
<212> RNA
<213> Triticum aestivum
<400> 142
uucggcaaau cuccuuuggc a
<210> 143
<211> 22
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 143
ggaguuugug cgugaaucua au
<210> 144
<211> 22
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 144
cuugucuauc ccuccugagc ua
<210> 145
<211> 22
<212> RNA
<213> Sorghum bicolor
<400> 145
uaugucuauc ccuucugagc ug
<210> 146
<211> 22
<212> RNA
<213> Saccharum officinarum
<400> 146
uaugucuauc ccuucugagc ua
<210> 147
<211> 22
<212> RNA
<213> Zea mays
<400> 147
uaugucuauc ccuucugagc ug
<210> 148
<211> 22<212> RNA
<213> Oryza sativa
<400> 148
ucggucuauc ccuccugagc ug
<210> 149
<211> 22
<212> RNA
<213> Pennisetum glaucum
<400> 149
uuagucuauc ccuccugagc ua
<210> 150
<211> 22
<212> RNA
<213> Vitis vinifera
<400> 150
auugccuauc ccuccugagc ug
<210> 151
<211> 22
<212> RNA
<213> Theobroma cacao
<400> 151
ccuugcuauc ccuccugagc ug
<210> 152
<211> 22
<212> RNA
<213> Lycopersicum esculentum
<400> 152
cuugucuauc ccuccugagc ug
<210> 153
<211> 22
<212> RNA
<213> Zea mays
<400> 153
cccuucuauc ccuccugagc ua
<210> 154
<211> 22
<212> RNA
<213> Populus tremula
<400> 154
cuugucuauc ccuccugagc ua
<210> 155
<211> 22<212> RNA
<213> Oryza sativa
<400> 155
cccuucuauc ccuccugagc ua
<210> 156
<211> 22
<212> RNA
<213> Triticum aestivum
<400> 156
cccuucuauc ccuccugagc ua
<210> 157
<211> 22
<212> RNA
<213> Hordeum vulgare
<400> 157
ccuuucuauc ccuccugagc ua
<210> 158
<211> 22
<212> RNA
<213> Populus tremula
<400> 158
ccugucuauc ccuccugagc ua
<210> 159
<211> 22
<212> RNA
<213> Mesembryanthemum crystallinum
<400> 159
ugugucuauc ccuccugagc ua
<210> 160
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 160
ugacaaacau cucgucccca a
<210> 161
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 161
ugacaaacau cucguuccua a
<210> 162
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana<400>
162
ccaagggaag aggcagugca u
<210> 163
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 163
accagugaag aggcugugca g
<210> 164
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 164
gccagggaag aggcagugca u
<210> 165
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 165
gccggugaag aggcugugca a
<210> 166
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 166
gccggugaag aggcugugca g
<210> 167
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 167
agggucuugc aaggucaaga a
<210> 168
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 168
aaggucuugc aaggucaagaa
<210> 169
<211> 21
<212> RNA
<213> Oryza sativa<400> 169
gaggucuugc aaggucaaga a
<210> 170
<211> 21
<212> RNA
<213> Oryza sativa
<400> 170
acggucuugc aaggucaaga a
<210> 171
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 171
agaacuagag aaagcauugg a
<210> 172
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 172
agaguaagau ggagcuugau a
<210> 173
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 173
agauggugga aaugggàuau c
<210> 174
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 174
uuguugaucg uaugguagaa g
<210> 175
<211> 21
<212> RNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 175
gguauucgag uaucugcaaa a
<210> 176
<211> 1242
<212> DNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Constructo sintético<400> 176
acacgctgaa accatcttcc acacactcaa gccacactat tggagaacac acagggacaa 60cacaccataa ccgccgccgc cggtagaaga tggcgcccac cgtgatgatg gcctcgtcgg 120ccaccgccgt cgctccgttc caggggctca agtccaccgc cagcctcccc gtcgcccgcc 180gctcctccag aagcctcggc aacgtcagca acggcggaag gatccggtgc atgcaggtgt 240ggccggccta cggcaacaag aagttcgaga cgctgtcgta cctgccgccg ctgtcgaccg 300gcgggcgcat ccgctgcatg caggccatgg ccttcttcaa ccgggtgatc accctcacgg 360tgccgtcgtc agacgtggtc aactactcgg agatctacca ggtggctcct cagtatgtca 420accaggccct gaccctggcc aagtacttcc agggcgccat cgacggcagc accctgaggt 480tcgacttcga gaaggcgtta cagatcgcca acgacatccc gcaggccgcg gtggtcaaca 540ccctgaacca gaccgtccag caggggaccg tccaggtcag cgtcatgatc gacaagatcg 600tggacatcat gaagaatgtc ctgtccatcg tgatagacaa caagaagttt tgggatcagg 660tcacggctgc catcaccaac accttcacga acctgaacag ccaggagtcg gaggcctgga 720tcttctatta caaggaggac gcccacaaga cgtcctacta ttacaacatc ctcttcgcca 780tccaggacga agagacgggt ggcgtgatgg ccacgctgcc catcgccttc gacatcagtg 840tggacatcga gaaggagaag gtcctgttcg tgaccatcaa ggacactgag aattacgccg 900tcaccgtcaa ggcgatcaac gtggtccagg cactccagtc tagcagggat tctaaggtgg 960ttgatgcgtt caaatcgcca cggcacttac cccggaagag gcataagatt tgctctaact 1020cgtgatgact gctggatgca gaggtattat cgatgcgttt ggacgtatgc tcattcaggt 1080tggagccaat ttggttgatg tgtgtgcgag ttcttgcgag tctgatgaga catctctgta 1140ttgtgtttct ttccccagtg ttttctgtac ttgtgtaatc ggctaatcgc caacagattc 1200ggcgatgaat aaatgagaaa taaattgttc tgattttgag tg 1242
<210> 177
<211> 956
<212> DNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Constructo sintético
<400> 177
acacgctgac aagctgactc tagcagatcc tctagaacca tcttccacac actcaagcca 60
cactattgga gaacacacag ggacaacaca ccataagatc caagggaggc ctccgccgcc 120
gccggtagaa gtgatcaacc atggccttct tcaaccgggt gatcaccctc acggtgccgt 180
cgtcagacgt ggtcaactac tcggagatct accaggtggc tcctcagtat gtcaaccagg 240
ccctgaccct ggccaagtac ttccagggcg ccatcgacgg cagcaccctg aggttcgact 300
tcgagaaggc gttacagatc gccaacgaca tcccgcaggc cgcggtggtc aacaccctga 360accagaccgt ccagcagggg accgtccagg tcagcgtcat gatcgacaag atcgtggaca 420
tcatgaagaa tgtcctgtcc atcgtgatag acaacaagaa gttttgggat caggtcacgg 480
ctgccatcac caacaccttc acgaacctga acagccagga gtcggaggcc tggatcttct 540
attacaagga ggacgcccac aagacgtcct actattacaa catcctcttc gccatccagg 600
acgaagagac gggtggcgtg atggccacgc tgcccatcgc cttcgacatc agtgtggaca 660
tcgagaagga gaaggtcctg ttcgtgacca tcaaggacac tgagaattac gccgtcaccg 720
tcaaggcgat caacgtggtc caggcactcc agtctagcag ggattctaag gtggttgatg 780
cgttcaaatc gccacggcac ttaccccgga agaggcataa gatttgctct aactcgtgat 840
gaatgtacgt gccctgcttc tccatctgca tgcgtttgga cgtatgctca ttcaggttgg 900
agccaatttg gttgatgtgt gtgcgagttc ttgcgagtct gatgagacat ctctgt 956
<210> 178
<211> 22
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 178
tgaagctgcc agcatgatct gg 22
<210> 179
<211> 1683
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 179
atgtattgct gatgacgctg cgccttcttg tttttttgct gcaactttga gaaagataga 60
tccatctgca tgcttttttc cgctgctatg gtgtatggtt gtgtgctgca gattttggat 120
ctgacttgtg agaaccgtcg acggacccct gcacacagta cgtgagacga tcgaggagga 180
tggaggcacg cagtacgttt tgttctcgat ctctgctaca gcatgtcatc ttaattaagc 240
ctactggttg catgcatggg tgaggattat tcatcgctaa gtttccatgt acgtagcata 300
ctatcacatg tacaatgaaa taggcaaata gcctagacgt tcttctcatg acgaccatgt 360
ctgccaatta aatatattgc aggtagtaaa cctcaagtac tgatagccat taattcttgg 420
ttggagttcg acagagaaga tcgaaaagac atgtatagaa tactgatcgt ctgatcatat 480
cgtccctacc tatctgtctg tctctaccaa agtgggctac agtacgttag ctagctgtct 540
cttcgaagac actgatagga tgtttgatta caagtccaac ggaaccactt gactgcatac 600
ggttaccact tactcatgca agaaaaaaaa ttgcattttc aaattcgaac cccaagtcgt 660
ctagtgtagg gtcttatgtt cataaccagg tgggataaca aacatattaa tcgatctgca 720
tatatatata tatacacaaa agggctacac agattacaga tgcagtgcat agaacctaat 780
tgcaggtggg ggaccccggc cctcccccgg tggacaataa aaaaaatcca gtttccaagc 840
ccaagctata ggtaggcagt ccagagcggt ggtcttgtca ctttcttact tccaaaacca 900ggccactgtt gatgtaggct ggctggctgg ctcatgtgcc acagttgctg ttcgttatta 960actgtagtaa acatcagtgt ggacgggcgc cagaatttca gatctcggta cgtatgctgt 1020gtggattcag cgttatttga acaccgtaat aatgctctcc agcagattgt gaattgtgaa 1080tacagttcgt agagãacact atttataatg cagacgttat gtttacatag tttagtttaa 1140aatgggagat aagatagaag agatagaatg agtaattggc tggagatcaa atcgtgcata 1200ttattgtgca aaacactgtt tttccatata gtggagtttt aaagtatggg acgagagagc 1260agatagcaaa tcgtgtatat ggtcgtgcaa atattatatá tgtggttgtg caaaactccg 1320aaatttgaaa taggagacac agttgataat tctacgctct acgcacgggc ggcggactgc 1380actactagtt catcggatgc gttagcgtgc cactcctcat cttgtttcct tgtacgtact 1440agtgcaatcc gtcagccgca cggctccagt ccactccagt ccagcaacag cgtcacctcc 1500agctccgaaa ggcttatcct tgcaacaaac atcgtacgaa aaaggcgcag gacaaaagaa 1560aatggatcga aatgcaacaa ataaaaaagg gcatcaaaat acgctgcgag tgagcgagac 1620gttggcctcc ccatcccata tatatatagc tatagctatc cctcggttct tcaattcatt 1680
1683
180674DNA
Zea mays180
acgtatgctg tgtggattca gcgttatttg aacaccgtaa taatgctctc cagcagattg 60tgaattgtga atacagttcg tagagaacac tatttataat gcagacgtta tgtttacata 120gtttagttta aaatgggaga taagatagaa gagatagaat gagtaattgg ctggagatca 180aatcgtgcat attattgtgc aaaacactgt ttttccatat agtggagttt taaagtatgg 240gacgagagag cagatagcaa atcgtgtata tggtcgtgca aatattatat atgtggttgt 300gcaaaactcc gaaatttgaa ataggagaca cagttgataa ttctacgctc tacgcacggg 360cggcggactg cactactagt tcatcggatg cgttagcgtg ccactcctca tcttgtttcc 420ttgtacgtac tagtgcaatc cgtcagccgc acggctccag tccactccag tccagcaaca 480gcgtcacctc cagctccgaa aggcttatcc ttgcaacaaa catcgtacga aaaaggcgca 540ggacaaaaga aaatggatcg aaatgcaaca aataaaaaag ggcatcaaaa tacgctgcga 600gtgagcgaga cgttggcctc cccatcccat atatatatag ctatagctat ccctcggttc 660ttcaattcat tcct 674
<210> 181
<211> 6
<212> DNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Constructo sintético
cct
<210><211><212><213>
<400><400>
181
tgtctc
6
<210><211><212><213>
182768DNA
Zea mays
<400>
182
tcagcgttat ttgaacaccg taaagcctct ccggcagatt gtgaatacac agttgtggag 60
aacgctattt ataacgcaga cactatttat aatgcagatg tgtaaaagtg aaatttaaaa 120
tagtagatga gataggagag atagaatgag taaactgctg gagagcaaat cgtgcatatg 180
atcgtgcaaa acaccgtttt tcgtagagtg aagtttaaaa tagcaggtga gagagtagat 240
aggatgagta agctgatgga gagcaaatat tgtatatacg tggtcggtgc aatagagtga 300
aatttgaaat aactgacaca gttttggtgc gtggaaatag acgaggataa ttctagtgca 360
atccgcactg ccagtggacc ccgcccgacg ataattctac gcacgggcgg cgcactgcac 420
tactagttca tcgatcggat gcgttagcgt gcccctcctc atattgtttc cttgtacgta 480
ctagtgcaat ccgtcagccg cacggctcca gtccactcca gtccagcaac agcgtcacct 540
ccagctccga aaggcttatc cttgcaacaa acatcgtacg aaaaaggcgc aggaaaarga 600
aaagtgtcga aatacgacat aaaaaaagca tcaaaatacg ctgcgagtga gygagacatt 660
ggcctcccca tcccatatat atatagctat agctayccct cggttcttca attcatctat 720
cccccgctct ctccatctct ctaccctttc tctctctcgg atagctag 768
<210> 183
<211> 407
<212> DNA .
<213> Zea mays
<400> 183
tttgaaataa ctgacacagt tttggtgcgt ggaaatagac gaggataatt ctagtgcaat 60
ccgcactgcc agtggacccc gcccgacgat aattctacgc acgggcggcg cactgcacta 120
ctagttcatc gatcggatgc gttagcgtgc ccctcctcat attgtttcct tgtacgtact 180
agtgcaatcc gtcagccgca cggctccagt ccactccagt ccagcaacag cgtcacctcc 240
agctccgaaa ggcttatcct tgcaacaaac atcgtacgaa aaaggcgcag gaaaargaaa 300
agtgtcgaaa tacgacataa aaaaagcatc aaaatacgct gcgagtgagy gagacattgg 360
cctccccatc ccatatatat atagctatag ctayccctcg gttcttc 407
<210> 184
<211> 21<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400>
184ugagaccaaa ugagcagcug a 21
<210> <211> <212> <213> 185 20 RNA Glicina máxima
<400> 185 gcugcucauc uguucucagg 20<210> <211> <212> <213> 186 762 DNA Glicina máxima <400> 186 aaaattcatt acattgataa aacacaattc aaaagatcaa tgttccactt catgcaaaga 60catttccaaa atatgtgtag gtagaggggt tttacaggat cgtcctgaga ccaaatgagc 120agctgaccac atgatgcagc tatgtttgct attcagctgc tcatctgttc tcaggtcgcc 180cttgttggac tgtccaactc ctactgattg cggatgcact tgccacaaat gaaaatcaaa 240gcgaggggaa aagaatgtag agtgtgacta cgattgcatg catgtgattt aggtaattaa 300gttacatgat tgtctaattg tgtttatgga attgtatatt ttcagaccag gcacctgtaa 360ctaattatag gtaccatacc ttaaaataag tccaactaag tccatgtctg tgatttttta 420gtgtcacaaa tcacaatcca ttgccattgg ttttttaatt tttcattgtc tgttgtttaa 480ctaactctag ctttttagct gcttcaagta cagattcctc aaagtggaaa atgttctttg 540aagtcaataa aaagagcttt gatgatcatc tgcattgtct aagttggata aactaattag 600agagaacttt tgaactttgt ctaccaaata tctgtcagtg tcatctgtca gttctgcaag 660ctgaagtgtt gaatccacga ggtgcttgtt gcaaagttgt gatattaaaa gacatctacg 720aagaagttca agcaaaactc tttttggcaa aaaaaaaaaa aa 762<210> <211> 187 21
<212> HNA
<213> Glicina máxima
<400> 187
uagaagcucc ccauguucuc a 21
<210> 188
<211> 19
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 188
gagcaugggu aacuucuau 19<210> <211> <212> <213> 189 346 DNA Glicina máxima <220> <221> <222> <223> incerto (1)..(346) incerto em todas locações η <400> 189 ttttctccta actttgagag catgggtaac ttctattttt atctctgncc ccntttcctt 60catcttttct tcaaccttta ttcgttcctt tttcaactgt taaaaggcct gactatgttg 120aggaaattaa gaaaatgggt ttgttgccga tgccagcaga atagaagctc cccatgttct 180caccgttagc agaaaacggg tgttatctgg ataagaccgc caggttccat tcccttgttt 240gccagcacca ccatcacttc ttcactctag tatccgattt ttttaaagga tcgttgtccc 300ttgccttctg gtggacttct atggagaagt ttcttcacac cctatg 346<210> <211> <212> <213> 190 21 RNA Glicina máxima <400> 190 uguugcgggu aucuuugccu c 21<210> <211> <212> <213> 191 20 RNA Glicina máxima <400> 191 ggcguagauc cccacaacag 20<210> <211> <212> <213> 192 434 RNA Glicina máxima <400> 192 aacacuaggg uuugcauucc uccuuuagcc gcaacccaua uucuaagcuu ccuuucuccu 60acuguucugu gucgggccag caaaacuguu gcggguaucu uugccucuga aggaaaguug 120ugccuauuau uauggcuuau ugcuuuagug gcguagaucc ccacaacagu uaugcuugca 180cugccuuuug ucuccgagac uaacaaauuu gauuguaugu ucucuuguug cuaaacuuuu 240gauuuugacc cgaacugcau gaggcaugaa aguuucauag ugguucaacc acaguaaaau 300aggaugguca guuuaugucu ggguuuuaua agaauuuuua gaucugucuu gauuacugga 360ccauuggaug aacacccugu ugguguugaa aaaguagcuu cagccuucug gaugugguua 420ugagcuuucg auge 434<210> 193
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 193
ugcgaguguc uucgccucug a 21
<210> 194
<211> .21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 194
ggaggcguag auacucacac c 21
<210> 195
<211> 439
<212> DNA
<213> Glicina máxima
<400> 195
aattagggtt ctctggtcct cccgcccccg gtgctggcat tctcaagcca gtgaaatcgg 60
tgcgagtgtc ttcgcctctg agagagatac tatgagatct caagcetegg aggcgtagat 120
actcacacct ctttttctgg ctatctcacc actgctcttt tccgccgggg cacgaaggtc 180
cttcgcctca ccaaatttcg ttctttaaat ttcacctata tatgtgtata tttttaataa 240
taataattag gtttaaaggg aaaaaaagtc gcttcttaat cctttattca ttgtatgcag 300
aacgatttga ttcgtgatga taatgtatgg atctgtatag tcggttgctc tagtatccaa 360
taatttgatt tctaacaaat taatatgtag tggccttctt ggacatgaaa aaaattcttg 420
aaattgggtt gttaggtta 439
<210> 196
<211> 22
<212> RNA
<213> Glieina máxima
<400> 196
uugeegauuc caeccauuce ua 22
<210> 197
<211> 20
<212> RNA
<213> Glieina máxima
<400> 197
gcugcucauc uguucucagg 20
<210> 198
<211> 495
<212> DNA<213> Glicina máxima
<400> 198
gactagatgt gaatgtgatt catattcata gagagagaaa gggaaaggga gaagagcttg 60
aggaagtgat gggagatggg agggtcggta aagaatatat ctgagactcg actcaatctc 120
gatctctctc agtgttgtgt tgttttgttt atccttttgc cgattccacc cattcctatg 180
atttccttcg gttcctctct ttccactctc ctctccgctc tttcctcttg ttatggtaag 240
cacctttctt cttcagatct gctctttata ccatacactt attatagatc taagttttta 300
tggaccttaa ctatcttcct tgatctctta ttaattttaa ccgctctctc tttgttgctg 360
gacatgttac ttcaagataa caaattgctt ttttattttt catcttttct ctcgttctct 420
tgtttaaggt ttctataaat catcgatgag atacctataa taatatactt attacagaca 480
aaaaaaaaaa aaaaa 495
<210> 199
<211> 825
<212> DNA
<213> Glicina máxima
<400> 199
ctgttctata ttgatagagt gagaaaggga aaggaagaag agcttgagga agtgatggga 60
gatgggaggg tcggtaaagg ataacagcgt ctctatgatt aattgttgtg ttgtttattc 120
ttttgccgat tccacccatt cctatgattt tctttggttc ctttctttcc actctcctct 180
ccgctctcca caatctgtta tggtcatgaa gctgccggtc tgactgggtt acattcaaga 240
caagaaaaaa caacaaatcg cttctttctt ttttcgtctt ttctttcctt tttcttgttt 300
aaggcttaac aaattatctc agctctagta gatgtagatt attacagaca gatgctagtt 360
aattagctag ctccacaaga tgtttaaaaa tgtgatctat ccatatcaag ctggaccaaa 420
tccaaataat tttactggag cttttctttc ttggtaaaag ctggacattt ttaaaggttt 480
gggtgccact ataacgccac caaagttttc tttcttgatt tttaaccaag ttacattttt 540
ttccctaaat tattccagcg ctaataaata ctgaattttc tgtttttttt ataaaaagaa 600
ttttacatta aattctttga aaataatttc attttggttg ttaatatttt tttttagttc 660
ataacaaatt aacgaatttt gtatttattt ttttataaaa aattattaga aaataacata 720
ttaaatcaag caaaaaaatg tattttatta aaataaaaaa gtgaaggaaa aaattattta 780
aaaccaacac accaacatat tttaactttt ttattaaact aaacg 825
<210> 200<211> 21<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 200
ccagcugcuc auuuggucac u 21<210> 201
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 201
agaggacaug gggagguucu a
<210> 202
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 202
ucagcugcuc aucuguucuc a
<210> 203
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 203
ccagcugcuc auuuggucac u
<210> 204
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 204
ucagcucuuc uuuuggucuc u
<210> 205
<211> 21
<212> RNA
<213> Glieina máxima
<400> 205
ucageuacug aucuggueue a
<210> 206
<211> 21
<212> RNA
<213> Glieina máxima
<400> 206
ucageuguue cuuuguueue u
<210> 207
<211> 21
<212> RNA
<213> Glieina máxima
<400> 207
ucagcuguuc cuuuguueue u<210> 208
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 208
guagcuucuc acuuggucuu a
<210> 209
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 209
uuagcugcuu cuucggucuc u
<210> 210
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 210
uuagaugcuu guuuggucuu u
<210> 211
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 211
ugagaaeaug gggagceueu a
<210> 212
<211> 21
<212> RNA
<213> Glieina máxima
<400> 212
agaggacaug gggagauueu a
<210> 213
<211> 21
<212> RNA
<213> Glieina máxima
<400> 213
agaggacaug gggagguucu a
<210> 214
<211> 21
<212> RNA
<213> Glieina máxima
<400> 214
ugagaaeaug ggaaucuucu a<210> 215
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 215
aaagaacaug gggagccucu a
<210> 216
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 216
ugagaacaug ggggauuucu a
<210> 217
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 217
ugugaaggug gggagcuucu u
<210> 218
<211> 21
<212> RNA
<213> Glieina máxima
<400> 218
ggagaaeaug cagageuueu g
<210> 219
<211> 21
<212> RNA
<213> Glieina máxima
<400> 219
ugagaaaeug gggageuuuu c
<210> 220
<211> 20
<212> RNA
<213> Glieina máxima
<400> 220
ugagaacugg ugageuueug
<210> 221
<211> 20
<212> RNA
<213> Glieina máxima
<400> 221
ugaguaeugg ggagcuueue<210> 222
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 222
ugagagcaug gguaacuucu a
<210> 223
<211> 20
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 223ugagcacugg ggagcuucuc
<210> 224
<211> 20
<212> RNA
<213> Glieina máxima
<400> 224
ugagcacugg ggagcuucuc
<210> 225
<211> 20
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 225
ugagcacugg ggagcuucuc
<210> 226
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 226
ugagaacaug ggaacuuucu a
<210> 227
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 227
ugagagcaug gguaacuucu a
<210> 228
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 228
ugagaaccug guaagcuucu g<210> 229
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 229
ugagaacauc gaaagcuucu u
<210> 230
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 230
ugaggacaag gggagcuuau g
<210> 231
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 231
cuaaaacaug gggagcuucu u
<210> 232
<211> 21
<212> RNA
<213> Glieina máxima
<400> 232
ugaggaaaua gggaguuucu g
<210> 233
<211> 21
<212> RNA
<213> Glieina máxima
<400> 233
ugagaacaua gugaguuuuu u
<210> 234
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 234
uaggaucgug gggagcuucu c
<210> 235
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 235
uaggaucgug gggagcuucu c<210> 236
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 236
uaggaucgug gggagcuucu c
<210> 237
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 237
gaugaauaug gggaguuucu a
<210> 238
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 238
ggggcaagga cauccgcaac g
<210> 239
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 239
aaggcaaagu ugcccgcgac g
<210> 240
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 240
gaggeaaaga ugcgageaac g
<210> 241
<211> 21
<212> RNA
<213> Glieina máxima
<400> 241
gcggcaaaga uacueaeaac c
<210> 242
<211> 21
<212> RNA
<213> Glieina máxima
<400> 242aacgcaaaga gaceuguaae a<21Q> 243
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 243
aaggcaaaga ugccagcgac g
<210> 244
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 244
gagccaaaga gacccgugac g
<210> 245
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 245
aaggcauaga uagucgcagc a
<210> 246
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 246
aaggcaaaga ugccagcaau g
<210> 247
<211> 21
<212> RNA
<213> Glieina máxima
<400> 247
uagggaaaga uaeauguaac a
<210><211><212><213>
248
21
RNA
Glieina máxima
<400> 248
gaggeaaagu uguuegeaau g
<210> 249
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 249
caggcaaaga ugucugcaauu<210> 250
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 250
uagguaugga uacuugcaac a
<210> 251
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 251
aaggcaaagc ugcccgcgau g
<210> 252
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 252
ucaggggagg agacacucgc a
<210> 253
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 253
uuagaggcaa agacacucgu c
<210> 254
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 254
ucagaggaga agauacucgu g
<210> 255
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 255
ucagaggaga agacacgcgc a
<210> 256
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 256
ucagagggga agacacacgcu<210> 257
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 257
ucagagggga agacacacgcu
<210> 258
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 258
ucagagguga ggacacacgc u
<210> 259
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 259
ccagaggcgg augcauucgc a
<210> 260
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 260
acagaggcag ggacacuugc a
<210> 261
<211> 21
<212> RNA
<213> Glieina máxima
<400> 261
gcagagguga agaageuuge a
<210> 262
<211> 21
<212> RNA
<213> Glieina máxima
<400> 262
uuagaggaga ggauacuege g
<210> 263
<211> 21
<212> RNA
<213> Glieina máxima
<400> 263
gcagagguga agaageuuge a
<210>
264<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 264
ucagaggcaa agauacccgc a
<210> 265
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 265
uuagagggga agacacgcgc u
<210> 266
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 266
ucagagggga agacacccgu g
<210> 267
<211> 21
<212> RNA
<213> Glieina máxima
<400> 267
ueagaggeua agagaeuugu a
<210> 268
<211> 21
<212> RNA
<213> Glieina máxima
<400> 268
ucagagggga agacacgcgu g
<210> 269
<211> 21
<212> RNA
<213> Glieina máxima
<400> 269
ucagagggga agacacccgu g
<210> 270
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400>
270ucagagggga agacacacgu u
<210> 271
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 271
ucagagggga agacacacgu u
272
21
RNA
Glicina máxima
<400> 272
ucagggguga agacacacgu a
273
21
RNA
Glicina máxima
<210><211><212><213>
<210><211><212><213>
<400> 273
ucagagggga agacacccgu g
<210> 274
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 274
ucagaaacga agacgcucgu u
<210> 275
<211> 21
<212> RNA
<213> Glieina máxima
<400> 275
uccgagggga agauacucgu u
<210> 276
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 276
uccgagggga agauacucgu c
<210> 277<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 277
uccgagggga agauacucgu c
<210> 278
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 278
gcagaggcug uggcacucgc a
<210> 279
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 279
uuagaggcga ggacacacgu u
<210> 280
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 280
uccgaggaga agauacucgu u
<210> 281
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 281
ucaguggcga aggcguucgu c
<210> 282
<211> 21
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 282
uuagagguga uggcacucgu g
<210> 283
<211> 22
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 283
ggggaauggg uggaaacggc aa
<210>
284<211> 22
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 284
ugggaauggg ugggaugggu aa
<210> 285
<211> 22
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 285
ugggaauggg ugggaugggu aa
<210> 286
<211> 22
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 286
auggaacugg uggaauuggc aa
<210> 287
<211> 22
<212> RNA
<213> Glieina máxima
<400> 287
cgggaaaggu uggaauuggc aa
<210> 288
<211> 22
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 288
uaggaauggg uggauuuuge aa
<210> 289
<211> 20
<212> RNA
<213> Glieina máxima
<400> 289
ggaaugggug gegugggeaa
<210> 290
<211> 22
<212> RNA
<213> Glieina máxima
<400> 290
eaggaaaggg gggaguuggc aa
<210> 291
<211> 22<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 291
uagcaauggg uuggaucggu ga
<210> 292
<211> 22
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 292
guugaauggg uggaauugga aa
<210> 293
<211> 22
<212> RNA
<213> Glicina máxima
<400> 293
guugaauggg uggaauugga aa
<210> 294
<211> 22
<212> RNA
<213> Glieina máxima
<400> 294
aaggaauugg gggaauuggu ae
<210> 295
<211> 22
<212> RNA
<213> Glieina máxima
<400> 295
eaegaguggg gggaaucggc gg
<210> 296
<211> 22
<212> RNA
<213> Glieina máxima
<400> 296
guggaauggg uggucuuggu aa
<210> 297
<211> 21
<212> RNA
<213> Zea mays
<400> 297
ugaeagaaga gagagageae a<210> 298
<211> 20
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Constructo sintético
<400> 298gugcucucuc ucuucuguca
<210> 299
<211> 20
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Constructo sintético
<400> 299
cugcucucuc ucuucuguca
<210><211><212><213>
<220><223>
<400>
uugcuuacuc ucuucuguca
<210> 301
<211> 20
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Constructo sintético
<400> 301ccgcucucuc ucuucuguca
<210> 302
<211> 21
<212> RNA
<213> Zea mays
<400> 302
cuuggauuga agggagcucc u
<210> 303
<211> 21
<212> RNA
<213> seqüência artificial
300
20
RNA
seqüência artificial
Constructo sintético300
<220><223>
Constructo sintético
<400> 303uggagcuccc uucauuccaa u
<210> 304
<211> 21
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Constructo sintético
<400> 304ucgaguuccc uucauuccaa u
<210> 305
<211> 21
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Constructo sintético
<400> 305augagcucuc uucaaaccaa a
<210> 306
<211> 21
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Constructo sintético
<400> 306uggagcuccc uucauuccaa g
<210> 307
<211> 21
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Constructo sintético
<400> 307
uagagcuucc uucaaaccaa a
<210> 308
<211> 21
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Constructo sintético
<400> 308uggagcucca uucgauccaa a
<210> 309
<211> 21
<212> RNA
<213> seqüência artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<400> 309agcagcuccc uucaaaccaa a
<210> 310
<211> 21
<212> RNA
<213> seqüência artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<400> 310
cagagcuccc uucacuccaa u
<210> 311
<211> 21
<212> RNA
<213> seqüência artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<400> 311
uggagcuccc uucacuccaa u
<210> 312
<211> 21
<212> RNA
<213> seqüência artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<400> 312
uggagcuccc uucacuccaa g
<210> 313
<211> 21
<212> RNA
<213> seqüência artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<400> 313
uggagcuccc uuuaauccaa u<210> 314
<211> 21
<212> RNA
<213> Zea mays
<400> 314
ucggaccagg cuucauuccc c
<210> 315
<211> 21
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Constructo sintético
<400> 315uugggaugaa gccugguccg g
<210> 316
<211> 21
<212> RNA
<213> seqüência artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<400> 316cugggaugaa gccugguccg g
<210> 317
<211> 21
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Constructo sintético
<400> 317
cuggaaugaa gccugguccg g
<210> 318
<211> 21
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Construeto sintético
<400> 318
ccgggaugaa gccugguccg g
<210> 319
<211> 21
<212> RNA
<213> Zea mays
<400> 319
ugaagcugcc agcaugaucu g<210> 320<211> 21
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Constructo sintético
<400> 320gagaucaggc uggcagcuug u
<210> 321
<211> 21
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Constructo sintético
<400> 321uagaucaggc uggcagcuug u
<210> 322
<211> 21
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Constructo sintético
<400> 322
aagaucaggc uggcagcuug u
<210> 323
<211> 20
<212> RNA
<213> Zea mays
<400> 323
ugacagaaga gagugagcac
<210> 324
<211> 20
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Constructo sintético
<400> 324gugcucucuc ucuucuguca
<210> 325
<211> 20
<212> RNA
<213> seqüência artificial
<220><223>
Constructo sintético<400>
325
cugcucucuc ucuucuguca
<210> 326
<211> 20
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Constructo sintético
<400> 326
uugcuuacuc ucuucuguca
<210> 327
<211> 20
<212> RNA
<213> seqüência artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<400> 327
ccgcucucuc ucuucuguca
<210> 328
<211> 21
<212> RNA
<213> Zea mays
<400> 328
ugccuggcuc ccuguaugcc a
<210> 329
<211> 21
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Constructo sintético
<400> 329uggcaugcag ggagccaggc a
<210> 330
<211> 21
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Constructo sintético
<400> 330
aggaauacag ggagccaggc a
<210> 331
<211> 21<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Constructo sintético
<400> 331ggguuuacag ggagccaggc a
<210> 332
<211> 21
<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Constructo sintético
<400> 332
aggcauacag ggagccaggc a
<210> 333
<211> 22
<212> RNA
<213> Zea mays
<400> 333
uccaaaggga ucgcauugau cu
<210><211><212><213>
<220><223>
<400>
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<212> RNA
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<212> RNA
<213> seqüência artificial<220>
<223> Constructo sintético
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33421RNA
seqüência artificial
Constructo sintético334<210> 337
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<212> RNA
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<223> Constructo sintético
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agacaaugcg aucccuuugg a
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<212> RNA
<213> Zea mays
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<212> RNA
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34322RNA
seqüência artificial
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Constructo sintético
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DNA
Agrobacterium tumefaciens
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DNA
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63

Claims (25)

1. Método para produzir uma semente híbrida não-natural, ca-racterizado pelo fato de que compreende:(a) fornecer uma primeira planta parental transgênica, induti-vãmente estéril, contendo no seu genoma um constructode DNA recombinante que transcreve RNA compreendendo:(i) pelo menos um sítio de reconhecimento de miRNAexógeno reconhecível por um miRNA maduro que éexpresso especificamente no tecido reprodutivo da di-ta primeira planta parental; e(ii) um primeiro RNA mensageiro que codifica uma prote-ína que confere tolerância a um primeiro herbicida;em que o dito miRNA maduro suprime especificamente a ex-pressão da dita proteína no dito tecido reprodutivo, eem que a esterilidade da dita primeira planta parental é induzívelpela aplicação do dito primeiro herbicida a dita primeira planta parental;e(b) cruzar a dita primeira planta parental com uma segundaplanta parental sob condições onde a esterilidade tenha si-do induzida na dita primeira planta parental, assim produ-zindo uma semente híbrida não natural.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o dito sítio de reconhecimento de miRNA exógeno está Iocaliza-do dentro de pelo menos um de:(a) uma região a 5' da seqüência codificante do dito primeiroRNA mensageiro;(b) uma região a 3' da seqüência codificante do dito primeiroRNA mensageiro; e(c) o dito primeiro RNA mensageiro.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o dito miRNA maduro é pelo menos um selecionado a partir dosmiRNAs identificados nas Tabelas 1, 2, 3, 4, 5, e 6.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o dito cons-tructo de DNA recombinante ainda compreende pelo menos um elementoselecionado a partir de:(a) um promotor de planta;(b) um elemento de supressão gênica;(c) um íntron;(d) um elemento de expressão gênica;(e) DNA que transcreve um aptâmero de RNA capaz de seligar a um ligante;(f) DNA que transcreve um aptâmero de RNA capaz de seligar a um ligante e DNA que transcreve para um RNA re-gulatório capaz de regular a expressão de uma seqüênciaalvo, caracterizado pelo fato de que a dita regulação é de-pendente da conformação do dito RNA regulatório, e a ditaconformação do dito RNA regulatório é afetada alosterica-mente pelo estado de ligação do dito aptâmero de RNA; e(g) pelo menos uma borda de T-DNA.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a segunda planta parental é tolerante ao dito primeiro herbicida.
6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o dito primeiro herbicida é um herbicida sistêmico.
7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a dita proteína que confere tolerância é pelo menos uma proteí-na selecionada a partir do grupo que consiste em 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase, a 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase da cepa CP4 deAgrobacterium tumefaciens, glifosato oxidoredutase, glifosato acetiltransfe-rase, glifosato descarboxilase, pat, bar, dicamba monooxigenase, ácido 2,2-dicloropropiônico desalogenase, acetoidroxiácido sintase, acetolactato sinta-se, haloarilnitrilase, acetil-coenzima A carboxilase modificada, diidropteroatosintase, polipeptídeo de fotossistema Il de 32 kDa, antranilato sintase, ácidodiidrodipicolínico sintase, fitoeno desaturase, hidroxifenil piruvato dioxigena-se, oxidase de protoporfirinogênio I modificada, e ariloxialcanoato dioxigena-se.
8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que:(a) o dito tecido reprodutivo é tecido reprodutivo masculino, adita primeira planta parental é indutivamente macho-estéril,e a dita segunda planta parental é normalmente fértil; ou(b) o dito tecido reprodutivo é tecido reprodutivo masculino, adita primeira planta parental é indutivamente macho-estéril,e a dita segunda planta parental é fêmea-estéril; ou(c) o dito tecido reprodutivo é tecido reprodutivo masculino, adita primeira planta parental é indutivamente macho-estéril,e a dita segunda planta parental é indutivamente fêmea-estéril; ou(d) o dito tecido reprodutivo é tecido reprodutivo feminino, adita primeira planta parental é indutivamente fêmea-estéril,e a dita segunda planta parental é normalmente fértil; ou(e) o dito tecido reprodutivo é tecido reprodutivo feminino, adita primeira planta parental é indutivamente fêmea-estéril,e a dita segunda planta parental é macho-estéril; ou(f) o dito tecido reprodutivo é tecido reprodutivo feminino, adita primeira planta parental é indutivamente fêmea-estéril,e a dita segunda planta parental é indutivamente macho-estéril.
9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que:(a) o dito tecido reprodutivo é tecido reprodutivo masculino, adita primeira planta parental é indutivamente macho-estéril,e a dita segunda planta parental compreende uma segundaplanta parental transgênica, indutivamente fêmea-estérilque contém no seu genoma um constructo de DNA recom-binante que transcreve RNA compreendendo: (i) pelo me-nos um sitio de reconhecimento de miRNA exógeno reco-nhecível por um segundo miRNA maduro que é expressoespecificamente no tecido reprodutivo feminino da dita se-gunda planta parental, e (ii) um segundo RNA mensageiroque codifica uma segunda proteína que confere tolerânciaa um segundo herbicida; em que o dito segundo miRNAmaduro suprime especificamente a expressão da dita se-gunda proteína no dito tecido reprodutivo feminino, e emque a fêmea esterilidade da dita segunda planta parental éinduzível pela aplicação do dito segundo herbicida a ditasegunda planta parental; ou(b) o dito tecido reprodutivo é tecido reprodutivo feminino, adita primeira planta parental é indutivamente fêmea estéril,e a dita segunda planta parental compreende uma segundaplanta parental transgênica, indutivamente macho-estérilcontendo no seu genoma um constructo de DNA recombi-nante que transcreve RNA que compreende: (i) pelo menosum sítio de reconhecimento de miRNA exógeno reconhecí-vel por um segundo miRNA maduro que é expresso espe-cificamente no tecido reprodutivo masculino da segundaplanta parental, e (ii) um segundo RNA mensageiro quecodifica uma segunda proteína que confere tolerância a umsegundo herbicida; em que o dito segundo miRNA madurosuprime especificamente a expressão da dita segunda pro-teína no dito tecido reprodutivo masculino, e em que a ma-cho esterilidade da dita segunda planta parental é induzívelpela aplicação do dito segundo herbicida a dita segundaplanta parental.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelofato de que o dito herbicida e a dito segundo herbicida:(a) são idênticos; ou(b) são diferentes.
11. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelofato de que pelo menos um entre o dito primeiro herbicida e o dito segundoherbicida compreende um herbicida sistêmico.
12. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelofato de que pelo menos um entre o dito primeiro herbicida e o dito segundoherbicida compreende pelo menos um herbicida selecionado a partir do gru-po que consiste em glifosato, dicamba, glufosinato, sulfoniluréias, imidazoli-nonas, bromoxinil, ácido 2,2-dicloropropiônico, inibidores de acetolactatosintase, cicloezanodiona, ariloxifenoxipropionato, herbicidas de sulfonamida,herbicidas de triazina, 5-metiltroptofano, aminoetil cisteína, herbicidas depiridazinona, herbicidas de ciclopropilisoxazol, inibidores de protoporfirino-gênio, e herbicidas contendo uma porção ariloxialcanoato.
13. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelofato de que o dito primeiro e o dito segundo RNAs mensageiros:(a) são idênticos, ou(b) são diferentes.
14. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a dita semente híbrida não-natural é semente de milho.
15. Semente híbrida não-natural, caracterizada pelo fato de queé produzida usando atividade humana que compreende o método da reivin-dicação 3.
16. Planta transgênica, indutivamente estéril, caracterizado pelofato de que contém no seu genoma um constructo de DNA recombinanteque transcreve RNA que compreende:(a) pelo menos um sítio de reconhecimento de miRNA exóge-no reconhecível por um miRNA maduro que é expressoespecificamente no tecido reprodutivo da dita planta; e(b) RNA mensageiro que codifica uma proteína que conferetolerância a um herbicida;em que o dito miRNA maduro suprime especificamente a ex-pressão da dita proteína no tido tecido reprodutivo,em que a esterilidade da dita planta transgênica é induzível pelaaplicação do dito herbicida a dita planta.
17. Planta transgênica, indutivamente estéril de acordo com areivindicação 16, caracterizada pelo fato de que:(a) o dito tecido reprodutivo é tecido reprodutivo masculino e adita esterilidade é macho esterilidade; ou(b) o dito tecido reprodutivo é tecido reprodutivo feminino e adita esterilidade é fêmea esterilidade.
18. Planta transgênica, indutivamente estéril de acordo com areivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o dito tecido reprodutivocompreende um óvulo fertilizado, e a dita esterilidade resulta na falha do ó-vulo fertilizado desenvolver uma semente viável.
19. Planta transgênica, indutivamente estéril de acordo com areivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a dita planta é planta de cul-tivo propagada por semente.
20. Planta transgênica, indutivamente estéril de acordo com areivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a dita planta é selecionada apartir de milho, arroz, trigo, aveia, cevada, centeio, triticale, painço, sorgo,quinoa, amaranto, trigo sarraceno, gramas de forragem, gramas de turfa,alfafa, algodão, açafroa, girassol, soja, canola, colza, linho, amendoim, fei-jão, ervilhas, lentilhas, alfafa, alface, aspargo, alcachofra, aipo, cenoura, ra-banete, repolho, couve galega, mostarda, brócolis, couve-flor, couve de Bru-xelas, nabo, couve-rábano, pepino, melões, abóboras, abóboras, cebolas,alho, alho poró, chalota, cebolinha, tomates, berinjelas, pimentas, fisális, be-terraba, acelga, espinafre, plantas ornamentais, e árvores florestais.
21. Constructo de DNA recombinante que transcreve RNA ca-racterizado pelo fato de que compreende:(a) pelo menos um sítio de reconhecimento de miRNA exóge-no reconhecível por um miRNA maduro que é expressoespecificamente no tecido reprodutivo de uma planta; e(b) um RNA mensageiro que codifica uma proteína que confe-re tolerância a um herbicida.
22. Constructo de DNA recombinante da reivindicação 21, carac-terizado pelo fato de que o dito pelo menos um sítio de reconhecimento demiRNA exógeno está localizado dentro de pelo menos um de:(a) uma região a 5' da seqüência codificante do dito primeiroRNA mensageiro;(b) uma região a 3' da seqüência codificante do dito primeiroRNA mensageiro; e(c) o dito primeiro RNA mensageiro.
23. Constructo de DNA recombinante de acordo com a reivindi-cação 21, caracterizado pelo fato de que o dito miRNA maduro é pelo menosum selecionado a partir dos miRNAs identificados nas Tabelas 1, 2, 3, 4, 5, e 6.
24. Constructo de DNA recombinante de acordo com a reivindi-cação 21, em que o dito constructo de DNA recombinante ainda compreendepelo menos um elemento selecionado a partir de:(a) um promotor de planta;(b) um elemento de supressão gênica;(c) um íntron;(d) um elemento de expressão gênica;(e) DNA que transcreve um aptâmero de RNA capaz de seligar a um ligante;(f) DNA que transcreve um aptâmero de RNA capaz de seligar a um ligante e DNA que transcreve um RNA regulató-rio capaz de regular a expressão de uma seqüência alvo,caracterizado pelo fato de que a dita regulação é depen-dente da conformação do dito RNA regulatório, e a ditaconformação do dito RNA regulatório é afetada alosterica-mente pelo estado de ligação do dito aptâmero de RNA; e(g) pelo menos uma borda de T-DNA.
25. Constructo de DNA recombinante de acordo com a reivindi-cação 21, caracterizado pelo fato de que a dita proteína que confere tolerân-cia é pelo menos uma proteína selecionada a partir do grupo que consisteem uma 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase, a 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase da cepa CP4 de Agrobacterium tumefaciens, glifosato oxi-doredutase, glifosato acetiltransferase, glifosato descarboxilase, pat, bar,dicamba monooxigenase, ácido 2,2-dicloropropiônico desalogenase, acetoi-droxiácido sintase, acetolactato sintase, haloarilnitrilase, acetil-coenzima Acarboxilase modificada, diidropteroato sintase, polipeptídeo de fotossistemaII de 32 kDa, antranilato sintase, ácido diidrodipicolínico sintase, fitoeno de-saturase, hidroxifenil piruvato dioxigenase, oxidase de protoporfirinogênio Imodificada, e ariloxialcanoato dioxigenase.
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