BRPI0617517A2

BRPI0617517A2 - derivados de hidràxiÁcidos graxos insaturados, composiÇÕes dermocosmetolàgica e utilizaÇço dos ditos derivados

Info

Publication number: BRPI0617517A2
Application number: BRPI0617517-1A
Authority: BR
Inventors: Marie Charveron; Roger Tarroux; Pascal Bordat
Original assignee: Fabre Pierre Dermo Cosmetique
Priority date: 2005-10-21
Filing date: 2006-10-20
Publication date: 2011-07-26
Also published as: BRPI0617517B8; CA2626635A1; AU2006303233B2; PT1937619E; US20090238784A1; BRPI0617517B1; MA29942B1; US8158811B2; JP2009512664A; EP1937619B1; HK1118804A1; NZ568366A; CA2626635C; EP1937619A1; IL190597A0; ZA200804239B; CN101291903A; AU2006303233A1; ES2526201T3; IL190597A

Abstract

<B>DERIVADOS DE HIDROXIÁCIDOS GRAXOS INSATURADOS, COMPOSIÇÕES DERMOCOSMETOLàGICA E UTILIZAÇçO DOS DITOS DERIVADOS<D>A presente invenção refere-se aos derivados de hidroxiácidos graxos insaturados correspondentes à fórmula geral (1): na qual: R~ n~ representa independentemente uns dos outros H ou um grupo alquila, linear ou ramificado, compreendendo de 1 a 6 átomos de carbono e sendo eventualmente substituído por um átomo de halogênio, em particular de flúor; R1 representa H, F, Cl, Br ou CF~ 3~; R representa H ou um grupo aí- quila, linear ou ramificado, compreendendo de 1 a 6 átomos de carbono e sendo eventualmente substituído por um átomo de halogênio em particular de flúor e 3 <243> n <243>14. Esses derivados são úteis para a fabricação de uma composição dermocosmetológica antirradicalar, anti-inflamatória, antiprurigi- nosa, e/ou destinada ao tratamento dos distúrbios da queratinização e da pigmentação, e/ou a melhorar a cicatrização.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DERIVADOSDE HIDROXIÁCIDOS GRAXOS INSATURADOS, COMPOSIÇÕES DER-MOCOSMETOLÓGICA E UTILIZAÇÃO DOS DITOS DERIVADOS".

A presente invenção refere-se aos novos derivados de hidroxiá-cidos graxos insaturados, assim como sua utilização dermocosmetológica.

Numerosos hidroxiácidos graxos saturados são conhecidos edescritos na literatura por suas propriedades biológicas e mais particular-mente por suas propriedades cosméticas e farmacológicas. Por exemplo, oprincipal constituinte lipídico da geléia real das abelhas é um hidroxiácidograxos insaturado, a saber o ácido hidróxi-10-deceno 2(trans)oico (EdwardE. Smissman et al., 1964. JOU. 29 3517-3520).

Diferentes documentos do estado da técnica descrevem proces-sos de preparo dos hidroxiácidos graxos insaturados e de seus ésteres (Leeet al., 1993, J. Org. Chem., volume 58, páginas 2918-2919; Hurd et Saun-ders, 1952, J. Am. Chem. Soc., volume 74, páginas 5324-5328; Krishnamur-thy et al., 1989, Indian J. Chem. Sect. A, volume 28, páginas 288-291; Plett-neretal., 1995, J. Chem, Ecol., volume 21, páginas 1017-1030).

Mais particularmente, a presente invenção se refere aos deriva-dos de hidroxiácidos graxos insaturados correspondentes à fórmula geral (I):

<formula>formula see original document page 2</formula>

na qual:

- Rn representa independentemente uns dos outros H ou umgrupo alquila, linear ou ramificado, compreendendo de um a seis átomos decarbono e sendo eventualmente substituído por um átomo de halogênio, emparticular de flúor;

- R1 representa H, F, Cl, Br, CF3;

- R representa H ou um grupo alquila, linear ou ramificado, com-preendendo de 1 a 6 átomos de carbono e sendo eventualmente substituídopor um átomo de halogênio em particular de flúor, e

-3 < η < 14Segundo uma característica particular da invenção, os derivadosde hidroxiácidos graxos insaturados de fórmula geral (I) respondem aos se-guintes critérios:

- R representa H;

- R1 representa H, F, Cl, Br, CF3;

- 3 < η < 14

à condição todavia que, quando η # 10, pelo menos um dos ra-dicais R1, e Rn não represente o hidrogênio.

De acordo com uma característica particular da invenção, os de-rivados de hidroxiácidos graxos insaturados de fórmula geral (I) respondemaos seguintes critérios:

- R1 representa F, Cl, Br, CF3;

- Rn representa independentemente uns dos outros H ou umgrupo alquila, linear ou ramificado, compreendendo de 1 a 6 átomos de car-bono e sendo eventualmente substituído por um átomo de halogênio, em particular de flúor;

- R representa H ou um grupo alquila, linear ou ramificado, com-preendendo de 1 a 6 átomos de carbono e sendo eventualmente substituídopor um átomo de halogênio em particular de flúor; e

- 3 <n< 14

De acordo com uma outra característica particular da invenção,os derivados de hidroxiácidos graxos insaturados de fórmula geral (I) res-pondem aos seguintes critérios:

- Rn representa independentemente uns dos outros H ou umgrupo alquila, linear ou ramificado, compreendendo de 1 a 6 átomos de car-bono e sendo eventualmente substituído por um átomo de halogênio, emparticular de flúor;

- R1 representa H, F, Cl, Br, CF3;- R representa H ou um grupo alquila, linear ou ramificado, com-preendendo de 1 a 6 átomos de carbono e sendo eventualmente substituídopor um átomo de halogênio em particular de flúor; e

- 6 < η < 14

à condição todavia que, quando η # 10, pelo menos um dos ra-dicais R1 e Rn não representa o hidrogênio.

De acordo com uma característica particular da invenção, os de-rivados de hidroxiácidos graxos insaturados de fórmula geral (I) correspon-dem aos seguintes critérios:

-R1 = FlCIlBrouCF3;

- Rn = H, e

- 3<n< 14

- R1 representa F1 Cl, Br ou CF3;

- pelo menos um dos radicais Rn representando um grupo alqui-la, linear ou ramificado, compreendendo de 1 a 6 átomos de carbono e sen-do eventualmente substituído por um átomo de halogênio, em particular deflúor; e

- 3 < η < 14

De acordo com uma outra característica particular da invenção,os derivados de hidroxiácidos graxos insaturados de fórmula geral (I) corres-pondem aos seguintes critérios:

- R1 = F

-Rn=H

-3<n < 14

-R1 = F

-Rn=H-η = 13

- R1 = F

- Rn=H

- η = 6

- = R1 = η

- um só dos radicais Rn representa um grupo metila, os outrossendo átomos de hidrogênio, e

-n = 4

- R1 = Rn = H e

- η = 10

-R1 = F

- Rn = H, e

- η = 10

-R1 = F

- Rn = H, e

-n = 8

De acordo com a presente invenção, os derivados de hidroxiáci-dos graxos insaturados de fórmula geral (I) anteriormente definidos podemser utilizados a título de princípio ativo em associação com um excipienteapropriado para realizar composições dermocosmetológicas com atividadeantirradicalar, anti-inflamatória, anti-pruriginosa e/ou destinada a tratar dis-túrbios da queratinização e da pigmentação e/ou a melhorar a cicatrização.

Os derivados de hidroxiácidos graxos insaturados de fórmulageral (I) são mais particularmente destinados a composições destinadas aotratamento da psoríase, do prurido e/ou da dermatite atópica, assim como aotratamento do envelhecimento cutâneo e das manchas de envelhecimentobrancas ou castanhas.

De acordo com a presente invenção, os derivados de hidroxiáci-dos graxos insaturados de fórmula geral (I) são mais particularmente desti-nados a composições destinadas a provocar um clareamento da pele.

Em razão de sua atividade antirradicalar, os derivados de hidro-xiácidos graxos insaturados de fórmula geral (I) são também úteis para evitarou limitar a fotocarcinogênese cutânea com estágios precoces e, portanto,podem ser utilizados na prevenção e no tratamento de diversas doençastumorais da pele.

Os derivados de hidroxiácidos graxos insaturados de fórmulageral (I) podem ser preparados:

- pela utilização da reação de Wittig-Horner pela reação de umfosfonato com a seguinte fórmula (III):

<formula>formula see original document page 6</formula>

na qual:

- R1 é tal como definido a propósito da fórmula (I):

- R2 representa um grupo alquila, linear ou ramificado, compre-endendo de 1 a 6 átomos de carbono e é, de preferência, um grupo etila oumetila, esses grupos R2 podendo formar um ciclo com os átomos de oxigê-nio dos grupos OR2 e o átomo de fósforo adjacente, e- R4 representa um grupo alquila, linear ou ramificado, compre-endendo de 1 a 6 átomos de carbono, e é, de preferência um grupo etila.

- ou, quando Ri = H, pela utilização da reação de Doebner-Knoevenagel pela reação de um derivado de ácido malônico de fórmulaR4OOC-ChhCOOR1 R sendo tal como definido acima a propósito da fórmula(I)1 sobre um Iactol da seguinte fórmula (II):

<formula>formula see original document page 7</formula>

Rn e η sendo tais como definidos acima,

a fim de se obter um hidróxi éster de fórmula (IV):

<formula>formula see original document page 7</formula>

na qual n, R e R1 são tais como definidos acima,e eventualmente quando R representa um grupo R4, tal comodefinido acima, uma reação de saponificação do hidróxi -éster de fórmula(IV) mencionada, para se obter um derivado de hidroxiácido de fórmula (I)correspondente.

A presente invenção será ilustrada no âmbito dos exemplos desíntese dados a seguir:

Exemplo 1: modo operacional para a síntese do DHA

1. Etapa 1: preparo de Oxonan -2- ona

43,5 g (345 mmols) de ciclo-octanona são colocados em soluçãoem 430 ml de dicloroetano. 170 g (985 mmols) de ácido meta-cloro-perpenzoico são em seguida acrescentados. O meio é aquecido a 80 0C du-rante 48 horas. À temperatura ambiente, 400 ml de uma solução saturada deNa2S2O5 e NaHCO3 (1/1 V/V) são acrescentados. O meio é agitado vigoro-samente durante 18 horas. A fase orgânica é separada e colocada em pre-sença de Kl e H2O, durante 6 horas. A fase orgânica é separada e lavadapor uma solução saturada de Na2S203, por uma solução saturada de NaCI,depois é secada sobre MgSO4, filtrada e concentrada sob vácuo para dar umproduto bruto de 36 g.

A lactona é purificada por empastamento no pentano (60 ml)depois por filtragem do precipitado ácido meta-cloro-benzoico formado a frio,m = 26,6 g (54%).

Caracterização:

CCM: Rf = 0,3 (heptano / acetato de etila 7/3)

1H RMN (300MHz, CDCI3) : δ 1,42-1,49 (m, 4H), 1,65-1,75 (m6H), 2,30 (t, J=5,4Hz, 2H), 4,30 (t, J=5,7Hz, 2H).

2. Etapa de redução particular em lactol

26,6 g (187,2 mmols) de Iactona são diluídos em 210 ml de tolu-eno, sob atmosfera de nitrogênio. O meio é resfriado a -78°C e 156,4 ml(189,1 mmols) de Dibal-H em solução a 20% no tolueno são adicionadosgota a gota, mantendo a temperatura a -78 °C. A mistura é agitada durante 2horas a -78°C. 200 ml de uma solução saturada de sais de Rozen são a-crescentados a -78°C. Após 18 horas de agitação vigorosa à temperaturaambiente, a mistura bifásica é filtrada sobre Celite, depois extraída ao aceta-to de etila. As fases orgânicas são lavadas com uma solução saturada deNaCl, secadas sobre MgSO4, filtradas e concentradas sob vácuo para dar umbruto de 26 g (dos quais 25% de derivado diol, seja um rendimento estimadoem 72%). O lactol, em equilíbrio na forma aberta, na forma cíclica, é utilizadoassim, sem purificação suplementar.

Caracterização:

CCM: Rf = 0,4 (heptano / acetato de etila 6/4)1H RMN (300MHz, CDCI3): δ 1,34-1,68 (m, 10H), 2,45 (t, J=5,4Hz, 2H), 3,66 (t, J=6,6Hz, 2H), 9,78 (t, J=1,8Hz, 1 H).

3. Etapa 3: Reação de Wittig-Horner

A lactona obtida é um composto de fórmula:19 g (131,8 mmols) de Iactol são diluídos em 250 ml de etanol.31,4 ml (158,1 mmols) de tri etil fosfonacetato são adicionados ao meio empresença de 27,3 g (197,5 mmols) de carbonato de potássio. O meio reacio-nal é aquecido a 40 0C durante 18 horas. À temperatura ambiente, o meio éhidrolisado por 200 ml de água destilada e extraído com o acetato de etila.As fases orgânicas são lavadas por uma solução saturada de NaCI, secadassobre MgS04, filtradas e concentradas sob vácuo para dar um produto brutode 20 g.

O éster obtido é purificado por cromatografia com uma eluiçãoheptano / acetato de etila 7/3: 15 g de produto são obtidos (53% de rendi-mento).

O éster obtido é um composto de fórmula:

Caracterização:

CCM: Rf = 0,4 (heptano / acetato de etila 7/3)

1H RMN (300MHz, CDCI3): δ 1,24-1,38 (m, 9H), 1,43-1,50 (m,2H), 1,51-1,57 (m, 2H), 2,15-2,21 (q, 2H), 3,60-3,64 (t, 2H), 4,14^,20 (t,2H), 5,77-5,82 (d, J=15,6Hz, 1 H), 6,91-6,98 (dt, J=15,6Hz, 1 H).

4. Etapa 4: Reação de saponificação

0,60 g (2,81 mmols) de hidróxi -éster é solubilizado em 10 volu-mes de tetra-hidrofurano. Lentamente, 3,4 ml (6,75 mmols) de uma soluçãode soda a 2M são adicionados. O meio é aquecido a 65 0C durante 3 horas.

Uma vez a reação concluída, o meio é hidrolisado pelo acréscimo de umasolução de ácido clorídrico a 3M, até a obtenção de um pH = 2. A mistura éconcentrada a seco e a fase aquosa é então extraída pelo acetato de etila.As fases orgânicas são lavadas por uma solução saturada de NaCI, secadassobre MgSO4, filtradas e concentradas sob vácuo para dar um produto brutode 0,6 g.

O derivado de hidroxiácido insaturado esperado é obtido, sob aforma de um sólido branco, por recristalização na acetonitrila a frio, m = 0,37g (71%).

O derivado de hidroxiácido obtido é um composto de fórmula:

<formula>formula see original document page 10</formula>

Caracterização:

CCM: Rf = 0,1 (heptano / acetato de etila 6/4)

1H RMN (300MHz, CDCI3) : δ 1,33-1,37 (m, 6H), 1,45-1,49 (m,2H), 1,55-1,58 (m, 2H), 2,20-2,25 (q, 2H), 3,62-3,66 (t, 2H), 5,79-5,84 (d,J=15,6Hz, 1 H), 7,03-7,10 (dt, J=15,6Hz, 1 H).

Espectroscopia de massa: [M-Na]" 209 (calculado 186)

Ponto de fusão: 62,5 0C + -1 0C

Exemplo 2: modo operacional para a síntese do DHA g-fluoradode ácido 10-hidróxi -dec-2-flúor-2-enoico: (R1 = F. η = 6)

Só a etapa 3 foi modificada: a partir do Iactol (0,89 g, 7,7mmols), a reação de Wittig-Horner foi conduzida em presença de dietil fosfo-no fluoro acetato de metila (2.1 g, 9.2 mmols) e de carbonato de potássio(1,6 g, 11,5 mmols) no etanol (9 ml) a 40 0C. A etapa 4 foi conduzida segun-do o protocolo precedente. O produto obtido, após recristalização, está sob aforma de uma mistura cis/trans.

O derivado de hidroxiácido obtido é um composto de fórmula:

<formula>formula see original document page 10</formula>

Caracterização:

CCM: Rf = 0,1 (heptano / acetato de etila 6/4)

1H RMN (300MHz, CDCI3): δ 1,36-1,62 (m, 20H), 2,27-2,30 (m, 2H, formaeis), 2,50-2,58 (m, 2H, forma trans), 3,69 (m, 4H), 6,05 (dt, J=21,6Hz, 1 H,forma trans) e 6,25 (dt, J=40,8Hz, 1 H, forma eis).

Espectroscopia de massa: [M-Na]" 227 (calculado 204)

Exemplo 3: modo operacional para a síntese de ácido 9-hidróxi -nona-2t-enoico

O protocolo da síntese do DHA foi aplicado à ciclo-heptanonapara conduzir ao ácido 9-hidróxi -nona-2t-enoico

Caracterização:

CCM: Rf = 0,1 (heptano / acetato de etila 6/4)1H RMN (300MHz, CDCI3) : δ 1,36-1,61 (m, 8H), 2,22-2,27 (m,2H), 3,67 (t, J=6,3Hz, 2H), 5,84 (dt, J=15,6Hz, 1 H), 7,09 (dt, J=15,6Hz, 1 H).

Espectroscopia de massa: [M-Na]" 195 (calculado 172)

Exemplo 4 modo operacional para a síntese do ácido 11-hidróxi -undeca-2t-enoico

O protocolo da síntese do DHA é aplicado à ciclononanona paraconduzir ao ácido 11 -hidróxi -undeca-2t-enoico.

Caracterização:

CCM: Rf = 0,1 (heptano / acetato de etila 6/4)1H RMN (300MHz, CDCI3): δ 1,33-1,61 (m, 12H), 2,20-2,28 (m,2H), 3,66 (t, J=6,0Hz, 2H), 5,84 (dt, J= 15,9Hz, 1 H), 7,09 (dt, J= 15,9Hz, 1 H).

Espectroscopia de massa: [M-Na]" 223 (calculado 200)

Exemplo 5: modo operacional para síntese do ácido 12-hidróxi -dodeca-2t-enoico

O protocolo da síntese do DHA foi aplicado à ciclodecanona pa-ra conduzir ao ácido 12-hidróxi -dodeca-2t-enoico.

Caracterização:

CCM: Rf = 0,1 (heptano / acetato de etila 6/4)1H RMN (300MHz, CDCI3): δ 1,35-1,56 (m, 14H), 2,20-2,27 (m,2H), 3.55 (t, J=6.6Hz, 2H), 5.80 (dt, J=15,6Hz, 1 H), 6,96 (dt, J=15,6Hz, 1 H).

Espectroscopia de massa: [M-Na]+ 237 (calculado 214)

Exemplo 6: modo operacional para síntese do ácido 12-hidróxi -dodeca-2-flúor-2t-enoico

O protocolo da síntese do DHA fluorado em posição 2 (exemplo2) foi aplicado à ciclodecanona para conduzir ao ácido 12-hidróxi -dodec-2-flúor-2-enoico sob a forma de uma mistura cis/trans.

Caracterização:

CCM: Rf = 0,1 (heptano / acetato de etila 6/4)1H RMN (300MHz, CDCI3): δ 1,34-1,56 (m, 14H), 2,24-2,27 (m,2H forma eis) ou 2,49-2,54 (m, 2H estrutura trans), 3,55 (t, J=6,6Hz, 2H),5,97(dt, J=21,9Hz, 1H estrutura trans) ou 6,10 (dt, J=55,2Hz, 1 H, formaeis).

Exemplo 7: modo operacional para síntese do ácido 13-hidróxi -tri dec-2t-enoico

O protocolo da síntese do DHA foi aplicado à oxaciclododecan-2-ona para conduzir ao ácido 13-hidróxi -tridec-2t-enoico.Caracterização:

CCM: Rf = 0,1 (heptano / acetato de etila 6/4)

1H RMN (300MHz, CDCI3): δ 1,27-1,63 (m, 16H), 2,21-2,28 (m,2H), 3,64 (t, J=3,6Hz, 2H), 5,84 (dt, J = 15,6Hz, 1H), 7,09 (dt, J=15,6Hz, 1H).

Espectroscopia de massa: [M-Na]+ 251 (calculado 228)

Exemplo 8: modo operacional para síntese do ácido 14-hidróxi -tetradec-2t-enoico

O protocolo da síntese do DHA foi aplicado à oxaciclotridecan-2-ona para conduzir ao ácido 14-hidróxi -tetradec-2t-enoico.Caracterização:

CCM: Rf = 0,1 (heptano / acetato de etila 6/4)

1H RMN (300MHz, CDCI3) : δ 1,29-1,35 (m, 14H), 1,46-1,61 (m,4H), 2,21- 2,29 (m, 2H), 3,66 (t, J=6,6Hz, 2H), 5,84 (dt, J=15.6Hz, 1 H), 7,09(dt, J=15,6Hz, 1 H).

Espectroscopia de massa: [M-Na]+ 265 (calculado 242)

Exemplo 9: modo operacional para síntese do ácido 14-hidróxi -tetradec-2-flúor-2-enoico

O protocolo da síntese do DHA fluorado em posição 2 (exemplo2) foi aplicado à oxaciclotridecan-2-ona para conduzir ao ácido 14-hidróxi -tetradec-2-flúor-2-enoico sob a forma de uma mistura cis/trans.

Caracterização:

CCM: Rf = 0,1 (heptano / acetato de etila 6/4)

1H RMN (300MHz, CDCI3): δ 1,29 (m, 28H), 1,42-1,62 (m, 8H),2,27-2,31 (m, 2H, forma eis), 2,51-2,56 (m, 2H, forma trans), 3,68 (t,J=6,6Hz, 2H), 3,70 (t, J=6,6Hz, 2H), 6,04 (dt, J=21.3Hz, 1 H1 forma trans),6,27 (dt, J=33,0Hz, 1 H1 forma eis).

Espectroscopia de massa: [M-Na]+ 283 (calculado 260)

Exemplo 10: modo operacional para síntese do ácido 17-hidróxi-hepta dec-2t-enoico

O protocolo da síntese do DHA foi aplicado à ciclo penta deca-nolida para conduzir ao ácido 17-hidróxi -heptadec-2t-enoico.

Caracterização:

CCM: Rf = 0,1 (heptano / acetato de etila 6/4)

1H RMN (300MHz, CDCI3) : δ 1,27-1,32 (m, 20H), 1,46-1,61 (m,4H), 2,20-2,29 (m, 2H), 3.67 (t, J=6,6Hz, 2H), 5,84 (dt, J=15,6Hz, 1 H), 7,08(dt, J=15,6Hz, 1 H).

Espectroscopia de massa: [M-Na]+ 387 (calculado 284)

Exemplo 11: modo operacional para síntese do ácido 17-hidróxi-hepta dec-2-flúor-2-enoico

O protocolo da síntese do DHA fluorado em posição 2 (exemplo2) foi aplicado à ciclopentadecanolida para conduzir ao ácido 17-hidróxi -hepta dec-2-flúor-2-enoico sob a forma de uma mistura cis/trans.

Caracterização:

CCM: Rf = 0,1 (heptano / acetato de etila 6/4)

1H RMN (300MHz, CDCI3): δ 1,27 (m, 40H), 1,45-1,62 (m, 8H),2,24-2,32 (m, 2H, forma eis), 2,50-2,58 (m, 2H, forma trans), 3.69 (t,J=6.6Hz, 4H), 6,05 (dt, J=21,6Hz, 1 H, forma trans) e 6,26 (dt, J=40,8Hz, 1H, forma eis).

Espectroscopia de massa: [M-Na]" 301 (calculado 302)

Ponto de fusão: 77 °C + -1 °C

Exemplo 12: modo operacional para síntese do ácido 18-hidróxi -octa dec-2t-enoico: (R1 =H, η = 14)

O protocolo da síntese do DHA foi aplicado à hexaciclodecanoli-da para conduzir ao ácido 18-hidróxi -octadec-2t-enoico.Caracterização:

CCM: Rf = 0,1 (heptano / acetato de etila 6/4)1H RMN (300MHz, CDCI3) : δ 1,27-1,65 (m, 26H), 2,19-2,39 (m,2H), 3,67 (t,J=6,6Hz, 2H), 5,83 (dt, J=15,6Hz, 1 H), 7,09 (dt, J=15,6Hz, 1 H).

Espectroscopia de massa: [M-Na]+ 321 (calculado 298)

Exemplo 13: caracterização do ácido 16-hidróxi -hexa dec-2t-enoico

Caracterização:

CCM: Rf = 0,1 (heptano / acetato de etila 6/4)

1H RMN (300MHz, CDCI3) : δ 1,27-1,32 (m, 18H), 1,46-1,61 (m,4H), 2.21-2.28 (m, 2H), 3,66 (t, J=6,6Hz, 2H), 5,85 (dt, J=15,6Hz, 1 H), 7,09(dt, J=15,6Hz, 1 H).

Espectroscopia de massa: [M-Na]+ 293 (calculado 270)

Exemplo de reação de Doebner-Knovenacel a partir de oxaciclo-tridecanol.

1,4 g (7,0 mmols) de oxaciclotridecanol (obtido de acordo com oprotocolo de redução parcial em lactol) é colocado em solução, sob fluxo denitrogênio, em 4 volumes de piridina, em presença de 1,09 g (10,5 mmols)de ácido malônico e 0,11 ml de piperidina. O meio reacional é aquecido a 80°C durante 1 hora e meia, depois ao refluxo durante 2 horas. A temperaturaambiente, a solução é derramada sobre uma solução de HCI a 3M (50 ml). Osólido filtrado é lavado pela água, depois é recristalizado na acetonitrila (1,2g obtido seja 70% de rendimento).

Os derivados de hidroxiácidos graxos insaturados, de acordocom a invenção, constituíram o objeto de um certo número de experimenta-ções que demonstraram seu interesse como princípio ativo em composiçõesdermatológicas e/ou cosméticas.

Estudo do efeito antirradicalar sobre espécies ativas do oxigênio (EAO)

Durante o metabolismo celular normal, quando de exposiçãoocasional da pele a agentes estressantes ou no decorrer de patologias der-matológicas, espécies oxigenadas reagentes ainda denominadas espéciesativadas do oxigênio (EAO) são geradas (Υ. M. W. Jassen et al., 1993). Es-sas EAO, descritas como metabólitos muito reagentes, exercem um papelimportante em um bom número de processos, tais como a inflamação, o en-velhecimento e a promoção tumoral.

As EAO são consideradas como os "segundos mensageiros", nasinalização celular do estresse oxidante e, portanto, como os mediadoresprecoces da inflamação (A. Van Der Vliet and A. Bast, 1992).

Sua superprodução induz importantes danos no meio de célula.Certos constituintes celulares são então alvos maiores desse estresse oxi-dante: os componentes lipídicos da membrana plásmica (lipoperoxidação),as proteínas (desnaturação e degradação) e o material genético ou ADN(mutações) podem ser alterados. As células são capazes de limitar essesdanos oxidantes, graças a diferentes sistemas de defesa antirradicalar (anti-oxidantes enzimáticos e não enzimáticos) (Β. P. Yu, 1994; H. Steiling et al,1999).

Todavia, em certas condições, as EAO são produzidas em quan-tidade tal que a atividade antioxidante celular é insuficiente; essas EAO setornam então fatores indutores de patologias inflamatórias e do envelheci-mento tissular (Y. Miyachi et al, 1986; M. Krress et al, 1995).

Existem diferentes agentes químicos (ex: H2O2) ou físicos (ex:UVA) capazes de gerar in vitro um estresse oxidante. Assim, as EAO produ-zidas vão alterar diversos alvos celulares (Membranas, ADN ou Proteínas),cuja alteração pode ser analisada por metodologias bioquímicas amplamen-te utilizadas como a dosagem dos TBARS para a lipoperoxidação lipídica, oua dosagem in vitro das EAO intracelulares com o auxílio da sonda H2DCF-DA.

Apresenta-se um modelo de estudo in vitro do estresse oxidanteinduzido por H2O2 / ferro, H2O2 que gera maciçamente EAO intracelularespor uma reação em cadeia desencadeada pela oxidação dos lipídeos mem-branários.

Essa técnica é baseada fluorescina na utilização de uma sondafluorescente, o diacetato de 6-carbóxi- 2',7'-dicloro di-hidro, di (acetoximetiléster) (H2DCF-DA), que, uma vez que tenha penetrado na célula, é desaceti-Iado pelas esterases intracelulares, formando então H2DCF. Esse produto éoxidado pelas EAO intracelulares em um composto altamente fluorescente: a2',7'-diclorofluorescína (DCF) (Suematsu M et al., 1996, Free Radicais Prati-cai Approach, Punchard ed. Páginas 83-99).

Os materiais e métodos utilizados para a dosagem in vitro dasEAO intracelulares são indicados a seguir:

a) instrumento celular:

linhagem celular de fibroblastos murinos cutâneos L929.

b) material:

- Microplaca de 96 poços de fundo chato.

- citofluorímetro citofluor II: Ref. PERSEPTIVE BIOSYSTEMS

C) Reagentes:

Reagentes de cultura celular:

- Meio de cultura Dulbecco's Modified Eagle Médium (DMEM)

- Soro de bezerro fetal (SVF)

- Tampão fosfato PBS pH 7,4

- Trypsina EDTA(IX)

Sonda fluorescente:

- diacetato de 6-carbóxi-2',7'-diclorodi-hidrofluorescína, di (ace-toximetil éster) (PM. 675,43)

Produtos de estímulo das células:

- Peróxido de hidrogênio (H2O2) 3%: Ref. Gifrer (Laboratório Gi-frer Barbezat)

- Sulfato de amônio ferroso (Fe2+)

- Sulfato de amônio férrico (Fe3+)

d) Produtos testados:

As concentrações testadas são concentrações não citotóxicas. Acitotoxicidade foi realizada pelo método do vermelho neutro, após incubaçãodo produto durante 3 horas.

O produto antirradicalar de referência é a vitamina E ou α tocofe-rol (PM: 430.7) (SIGMA, referência: T-1539)

A solução-mãe é preparada a 400 mg/ml em DMSO e conserva-da a -20°C. A solução do pré-tratamento é preparada extemporaneamente a400 Mg/ml em meio de cultura, sem SVF.

Para a avaliação dos derivados de hidroxiácidos graxos insatu-rados, as diluições são preparadas em meio de cultura extemporaneamente,para uma faixa de concentrações de 0,02, 0,2, 2 e 20 ng/ml.

e) Protocolo:

Inseminação das células:

As células da linhagem de fibroblastos L929 são inseminadasem microplacas de 96 poços de fundo chato em 100 μΙ de DMEM suplemen-tado de 10% de SVF, depois elas são incubadas durante uma noite a 37 0Cem atmosfera úmida a 5% de CO2.

O branco de placa sem células é avaliado sobre 6 poços.

Pré-tratamento das células:

As diluições dos produtos a testar e molécula de referência sãorealizadas no meio de cultura sem SBF, depois depositadas em 7 poços àrazão de 100 μΙ por poço.

As células são então incubadas durante 3 horas a 37 0C em at-mosfera úmida a 5% de CO2.

As células "Prova" (fluorescência natural das células), "Controle"(produção basal de EAO) e "Estimuladas" (produção de EAO após tratamen-to oxidante) são recobertas com 100 μΙ de DMEM.

As células "Controle" são incubadas com a sonda, mas não sãonem pré-tratadas, nem tratadas.

As células "Estimuladas" são incubadas com a sonda e são tra-tadas, mas não pré-tratadas.

As células "Prova" não são nem pré-tratadas, nem incubadascom a sonda, nem tratadas.

Incubação das células com a sonda e estresse oxidante:

as células são enxaguadas com PBS 1X à razão de 100 μΙ porpoço. Depois colocadas para incubar durante 30 minutos a 37 0C em atmos-fera úmida a 5% de CO2 com 50 μΙ de sonda H2DCF-DA a 5 μΜ.

Após 30 minutos em contato com a sonda sozinha, as célulassão colocadas para incubar durante 30 minutos a 37 0C em atmosfera úmidaa 5% de CO2 com um acréscimo de 25 μl de H2O2 a 800 μΜ e 25 μl de solu-ção de ferro ferroso e férrico a 8mM, para ter concentrações finais de 200μΜ de H2O2 e 2mM de ferro ferroso e férrico.

As células são em seguida enxaguadas com PBS 1X à razão de100 μl por poço, depois incubadas durante 30 minutos a 37°C em atmosferaúmida a 5% de CO2 com 100 μl de PBS 1X.

Essa 1 hora e 30 minutos de incubação a 37°C permite que asàs esterases intracelulares desacetilem a sonda em H2DCF1 oxidável pelaEAO intracelular em DCF: composto fluorescente cuja formação é propor-cional à quantidade de EAO intracelulares.

A intensidade de fluorescência é lida no citofluorímetro com λexcitação = 485 nm e λ emissão = 530 nm. Ela reflete a quantidade de EAOintracelulares produzida.

O esquema do protocolo de estudo é mostrado na Figura 1.

Cálculo da percentagem de proteção contra a produção de EAOintracelulares.

A relação abaixo permite calcular para cada concentração deproduto testado, a percentagem de proteção contra a produção de EAO in-tracelular (já que a intensidade de fluorescência ou IF expressa a liberaçãointracelular de EAO).

HF oxidante (H2OaZFert - IF (oxidante + produto)! χ 100

IF Oxidante (H202/Fer) - IF controle

Os valores indicados na tabela acima são as percentagens deinibição de produção de EAO intracelular como conseqüência de um estres-se oxidante exógeno, em relação às células "prova" (100%) e às células "es-timuladas" (0%).

As percentagens médias de proteção, para as 13 moléculas tes-tadas com quatro concentrações sobre a linhagem L929 são apresentadasna tabela I abaixo.

Tabela I: Análise da proteção contra a produção intracelular deEAO para as 13 moléculas derivadas de hidroxiácidos qraxos insaturados:

Percentagem de inibição da produção intracelular de EAO<table>table see original document page 19</column></row><table>

<table>table see original document page 19</column></row><table>

Pré-incubação: 3 horas

Números de testes = 3 para todos os compostosNúmeros de testes = 18 para a vitamina E

In vitro, na escala celular, um estresse exógeno pelo H202/Fe2+ -Fe3+ é capaz de induzir uma produção de EAO intracelulares detectadascom o auxílio da sonda fluorescente.

Em conclusão, os derivados de hidroxiácidos graxos insaturadoscom curtas cadeias (C9 e C10) e não fluorados parecem ser mais particu-Iarmente ativos na proteção celular antirradicalar.

Estudo do efeito antirradicalar. Análise da peroxidação lipídica.Por outro lado, durante o metabolismo celular normal, quandodisposição ocasional da pele a agentes estressantes ou no decorrer de pato-logias dermatológicas, espécies oxigenadas reagentes ainda denominadasradicais livres oxigenados (RLO) são geradas (Υ. M. W. Janssen et al.,1993). Esses RLO, descritos como metabólicos muito reagentes, exercemum papel importante em bom número de processos, tais como a inflamação,ou envelhecimento e a promoção tumoral.

Os RLO são considerados como as "segundas mensagens" nasinalização celular do estresse oxidante e, portanto, como os mediadoresprecoces de inflamação (A. Van Der Vliet and A. Bast, 1992).

Sua superprodução induz importantes danos no meio da célula.Certos constituintes celulares são então alvos maiores desse estresse oxidante:os componentes lipídicos da membrana plásmica (lipoperoxidação), as proteí-nas (desnaturação e degradação) e o material genético ou ADN (mutações)podem ser alterados. As células são capazes de limitar esses danos oxidantes,graças a diferentes sistemas de defesa antirradicalar (antioxidantes enzimáticose não enzimáticos) (Β. P. Yu, 1994; H. Steiling et al., 1999).

Todavia, em certas condições, os RLO são produzidos em quan-tidade tal que a atividade antioxidante celular é insuficiente; esses RLO setornam então fatores indutores de patologias inflamatórias e envelhecimentotissular (Y. Miyachi et al, 1986; M. Kress et al, 1995).

A fim de valorizar a atividade antirradicalar dos diferentes deri-vados hidroxilados, de acordo com a invenção, analisa-se seu poder face àalteração das membranas celulares induzida por um estresse oxidante (quí-mico), em comparação a um antioxidante de referência, a vitamina E.

A membrana plásmica constitui o principal e o primeiro alvo dosRLO e, sendo rica em lipídeos, ela é o local de uma peroxidação aumentada (A.W. Girotti1 1985). Os peróxidos gerados durante essa oxidação lipídica são tam-bém muito reagentes e capazes de degradar o material protéico e genômico.

Para avaliar a alteração membranária, mede-se a peroxidaçãolipídica por uma dosagem in vitro dos complexos entre os produtos de oxida-ção lipídica e o ácido tiobarbitúrico. Esses complexos são denominadosTBARS (para "Thiobarbituric Acid Reactive Substances" ou substâncias rea-tivas ao ácido tiobarbitúrico) e dão o nome ao teste: Teste das TBARS.

A fim de minetizar um estresse oxidativo químico, trata-se a li-nhagem de fibroblastos, L929, por um complexo composto de peróxido dehidrogênio (H2O2) e de ferro (Fe2+ /Fe3+) reconstituindo assim a reação deFenton1 fonte de RLO e mais particularmente de radical hidroxila (OH0) (D.AVesseyetal1 1992):

H2O + Fe2+ OH0 + OH + Fe3+.

Os produtos foram avaliados sobre a linhagem de fibroblastosmurinos L929. As células são pré-tratadas com as diferentes concentraçõesde produtos durante 16 horas e são em seguida estimuladas com o comple-xo H2O -Fe2+ / Fe3+ (200 μΜ - 1mM) durante 1 hora.

Soluções-mães: 100 mg/ml, etanol, 4 0C.

Soluções finais: 0,02 ng/ml.

A peroxidação dos lipídeos membranários é analisada, medindo-se as TBARS (Protocolo Ref. PL n° 2, segundo Morlière et al, 1991).

Princípio do teste:

Em meio ácido, a 95°C se formam complexos, anotados comTBARS para substâncias reativas ao ácido tio barbitúrico , entre os produtosde oxidação lipídicos (malondialdeído ou MDA) e o ácido tiobarbitúrico (TBA)que podem ser dosados em fluorescência em relação a uma faixa de aferi-ção com MDA. A dosagem das TBARS é então expressa em pmol/pg deproteínas. As proteínas e TBARS são dosadas no meio intracelular.

Cálculo da percentagem de proteção das membranas celulares:

A partir do cálculo das TBARS em pmol/pg proteínas, calcula-sea eficácia protetora dos diferentes produtos contra a oxidação dos lipídeosmembranários.

ITBARS Controlei- ITBARS (+produtos)!

Percentagem de proteção:-χ 100

TBARS controle

Quatro experiências independentes foram realizadas. Duranteessas experiências, diversos compostos foram avaliados (o teste não permi-te avaliar mais de 10 moléculas ao mesmo tempo). Os compostos avaliadosvárias vezes foram escolhidos em função dos resultados obtidos no outroteste, medindo também uma atividade antirradicalar (teste de dosagem dasespécies ativas do oxigênio, EAO).

O modelo utilizado nessa experiência (reação de Fenton) induzuma peroxidação lipídica importante nos fibroblastos L929. Essa descargamaciça de radical hidroxila OH0 gera, portanto, um estresse oxidante ao ní-vel celular e notadamente ao nível das membranas. Todavia, nesse tipo dereação oxidante, os produtos oriundos da peroxidação lipídica são internali-zados nas células e TBARS são então dosadas no meio intracelular.

A vitamina E a 400 pg/ml diminui a peroxidação lipídica induzidapelo complexo H2O2-Fe2VFe3+, e protege muito eficazmente as membranascelulares.

Na tabela II, são apresentados os resultados das quatro experi-ências.

Aparece claramente que esses derivados hidroxilados têm umaatividade antioxidante estável e reprodutível. Trata-se particularmente dederivados com cadeia curta de carbonos.

Tabela II: proteção dos lipídeos membranários pelos diferentesderivados hidroxilados.

<table>table see original document page 22</column></row><table>O modelo in vitro apresentado nesse estudo reflete as conse-qüências devido a um estresse oxidante maior sobre o principal alvo celularque é a membrana plásmica. Assim, a dosagem da peroxidação lipídicaconstitui um bom marcador do estresse oxidante e permite a avaliação daação antioxidante, face ao radical hidroxila, de princípios ativos ao nível damembrana celular.

A vitamina E, molécula antioxidante, permite a validação dessemodelo e protege eficazmente as membranas celulares do estresse oxidante.

Diferenciação queratinocitária

Enfim, a epiderme participa da função principal da pele, que é deresistir ao meio ambiente e de protegê-la. É um epitélio estratificado cornifi-cado escamoso em perpetuai renovação. A homeostasia e a regeneraçãotissulares se baseiam nas células queratinocitárias, as células de sustenta-ção, os fatores solúveis, a proximidade celular favorecendo as interaçõesdas células entre elas e com as matrizes extracelulares.

O stratum corneum, último estágio da diferenciação epidérmica,resulta de três processos maiores: formação de filamentos de queratina,"cornificação" do queratinócito e formação do cimento lipídico intercelularorganizado em estruturas lamelares.

No meio da epiderme, a composição e a natureza dos lipídeosvariam em função do estado de diferenciação no qual se acham os querati-nócitos. Assim, quando da passagem dos equilíbrios basais nas células dacamada córnea, observa-se uma redução importante dos fosfolipídeos que,nas camadas vivas são responsáveis pela integridade das membranasplásmicas; paralelamente, nota-se um aumento dos lipídeos neutros (ácidosgraxos livres e triglicerídeos) e esteróis (colesterol), assim como um aumen-to muito grande dos esfingolipídeos e notadamente das ceramidas. Ao nívelda camada córnea, são encontrados 40 a 50% de esfingolipídeos, 20 a 27%de colesterol e 9 a 26% de ácidos graxos livres. As ceramidas intervém demaneira covalente com os resíduos glutâmicos da involucrina, precursor doenvoltório córneo. Os ácidos graxos, graças ao seu caráter hidrófobo, parti-cipam do controle da impermeabilidade cutânea, o colesterol intervindo nafluidez membranária.

Numerosas proteínas específicas da camada córnea ou stratumcorneum, (camada que confere a função de barreira à epiderme), são produ-zidas no nível da camada granulosa composta dos últimos queratinócitos aapresentar uma atividade transcricional ou traducional antes da Iise nuclearque acompanha a cornificação.

O programa de diferenciação dos queratinócitos é majoritaria-mente eixado sobre a evolução de proteínas de estrutura que são as quera-tinas e que contribuem para a integridade arquitetural da epiderme. Sua ex-pressão varia em função do grau de maturação das células epidérmicas.Nas camadas suprabasais aparecem a queratina 1 básica e a queratina 10ácida, ditas queratinas de diferenciação terminal.

Nas proximidades da camada córnea, as queratinas interagemcom proteínas ricas em histidina para formar uma mistura relativamente ho-mogênea que enche os corneócitos. Essas proteínas derivam de um precur-sor, a profilagrina que é uma grande molécula ([PM]>450 kDa) armazenadano nível da camada granulosa. É uma proteína, cujos domínios NeC termi-nais ligam o cálcio e cuja desfosforilação e uma proteólise parcial dão a fila-grina. Esta catalisa a formação de pontes dissulfetos entre os filamentos dequeratina e contribuem para sua integração no meio da matriz intracorneoci-tária. Por outro lado, ela é a fonte, por proteólise, de um conjunto de ácidosaminados e de derivados peptídicos que conferem à camada córnea certascapacidades de retenção hídrica.

Na camada córnea, os corneócitos contêm essencialmente fila-mentos de queratina inseridos em uma matriz densa, o todo envolvido poruma parede protéica espessa e resistente: o envoltório da córnea. As proteí-nas precursoras dessa estrutura, apostas à face interna da membrana plás-mica, são sintetizadas pelos queratinócitos a partir da camada espinhosa,mas suas pontes - sob a ação de enzimas, as transglutaminases - são feitasentre as camadas espinhosas e granulosas. Numerosas proteínas citosóli-cas, associadas à fração membranária dos queratinócitos ou armazenadasnos grãos de querato-hialina, participam da elaboração do envoltório da cór-nea. Pode-se assim distinguir a involucrina (68 kDa), rica em glutamina elisina.

A impermeabilidade da camada córnea é devido, na maior parte,a um cimento intercelular lipídico hidrófobo que reúne os corneócitos. O con-teúdo lipídico da epiderme é o resultado final da lipogênese queratinositáriae sebácea. Na epiderme normal, uma mistura de lipídeos neutros e polarespredomina nas camadas profundas para ser progressivamente substituídapor um conteúdo mais apoiar, incluindo ceramidas. Numerosas proteínasparticipam dessa lipogênese, e, portanto, da síntese das ceramidas. Dentreelas, a proteína DES2 (esfingolipídeo C4-hidroxilase / delta-4 desaturase) foicolocada em evidência: ela possui uma atividade de di-hidro ceramida hidro-xilase que intervém na síntese das fitoceramidas e sua expressão é induzidacom a diferenciação (MIZUTANI Y. et Al1 2004). Os lipídeos sintetizados pe-Ios queratinócitos são encaminhados à superfície pelos corpos lamilares, osqueratinosomas. Eles são secretados nos espaços intercelulares e se orga-nizam folhados contínuos alinhados paralelamente às membranas celularesdos corneócitos. Essa reorganização lipídica, que sobrevém no decorrer dadiferenciação epidérmica, faz intervir um certo número de transportadoreslipídicos da família dos transportadores ABC ("Adenosine Triphosphate Bin-ding Cassette transporter" ou transportador de cassete de ligação de adeno-sina trifosfato). Dentre esses transportadores, determinados deles vêem suaexpressão induzida no decorrer da diferenciação queratinocitária (ABCC1,ABCC1, ABCC3, ABCC4, e ABCG1), outros vêem sua expressão reprimida(ABCB9 e ABCD1) e os outros não sofrem nenhuma regulagem. O papeldos transportadores, cuja expressão é induzida, foi colocado em evidência:ABCG1 é, por exemplo, implicado na translocação do colesterol nos querati-nócitos em diferenciação. A expressão de certos membros de uma outra fa-mília de transportadores, aquela das FATP ("Fatty Acid Transport Protein" ouproteína de transporte de ácido graxo), tais como FATP1, FATP3, FATP4 ePATP5 é induzida no decorrer da diferenciação queratinocitária. Essestransportadores seriam implicados na reorganização do pool de lipídeos neu-tros (KlELAR et Al, 2003).

Os queratinócitos humanos normais (NHK) proliferam e se dife-renciam in vitro, formando camadas estratificadas mimetizando a organiza-ção basal da pele. Concentrações extracelulares em cálcio superiores a 0,1mM iniciam uma cascata de acontecimentos genômicos e não genômicosque conduz os queratinócitos de uma fase de proliferação para uma fase dediferenciação. A diferenciação dos queratinócitos pode então ser avaliadapelo estudo da expressão de vários marcadores tais como as queratinas 1 e10, a transglutaminase 1, a desaturase DES2, a involucrina, os transportado-res FATP4 e ABCG1. Avalia-se assim em um modelo de cultura in vitro oefeito de certos ácidos hidroxialceno carboxílicos.

O plano do estudo pode ser esquematizado conforme ilustradona Figura 2: diferenciação dos NHK in vitro e retiradas para análise.

Condições de cultura e de retirada.

Os queratinócitos humanos normais (NHK) são isolados a partirde explantes de pele. Eles são cultivados em um meio KSFM (Gibco) combaixo teor em cálcio (0,1 mM) contendo 25 pg/mL de BPE ("Bovin PituiraryExtract" ou extrato pituitário bovino) e 1,5 ng/mL de EGF ("Epithelium GrowthFactor" ou fator de crescimento do eptélio). Vinte e quatro horas, após inse-minação, a diferenciação é induzida pelo acréscimo de cálcio (concentraçãofinal de 1,2 mM). Os princípios ativos são acrescentados ou não ao mesmotempo que o cálcio a concentrações de 100 e 1 pg/mL, a fim de determinarse têm um efeito de potencialização da diferenciação. As células são entãoanalisadas 48 horas após o acréscimo do cálcio e dos produtos.

Extração dos ARNs e RT-PCR em tempo real.

Os ARNs totais são extraídos a frio a partir dos queratinócitos.Após transcrição inversa dos ARNs em cDNA, as PCRs são rea-lizadas em placa de 96 poços (aparelho com PCR quantitativa iCycler, Bio-Rad). A expressão dos transcritos da transglutaminase, da desaturase(DES2), ABCG1 e FATP4 é normalizada em relação à expressão de genesde referência (GAPDH, UBC, HPRT). Os níveis de expressão das amostrastratadas pelo cálcio e o princípio ativo são comparados nos níveis de ex-pressão das amostras tratadas unicamente pelo cálcio.

Os resultados dos efeitos dos produtos a 1 pg/mL estão consig-nados nas tabelas a seguir:

<table>table see original document page 27</column></row><table>

À dose de 1 pg/mL, o conjunto dos produtos tem um efeito mo-derado sobre a expressão dos marcadores de diferenciação.

Efeitos dos produtos a 100 pg/mL

<table>table see original document page 27</column></row><table>A vitamina D3 a 10 μΜ induz a expressão dos transcritos datransglutaminase 1, DES2, e ABCG1 de um fator 8,3, 11,1 e 3,1 respectiva-mente em relação à prova tratada unicamente pelo cálcio. A expressãoFATP4 ao contrário não é modulada pelo tratamento com vitamina D3.

O efeito de potencialização da diferenciação foi, portanto, de-monstrado a propósito dos derivados de hidroxiácidos graxos insaturados,de acordo com a invenção.

Efeito anti-inflamatório analisado no nível dos mediadores lipídi-cos de inflamação.

O queratinócito, célula a mais representada ao nível da epider-me, libera, em resposta a numerosos fatores extracelulares presentes emseu ambiente, mediadores biologicamente ativos, notadamente prostaglan-dinas e os leucotrienos que exercem um papel importante na iniciação e namodulação das reações inflamatórias cutâneas e que intervém também naregulagem da resposta imune. A prostaglandina PG6KF 1 alfa é um dos me-tabólitos maiores produzidos pelo queratinócito estimulado, e representativoda modulação da produção dos metabólitos do metabolismo do ácido ara-quidônico oriundos da via da ciclo-oxigenase.

PROTOCOLO:

A suspensão de queratinócitos no DMEM a 10% de SVF é distri-buída nas placas de 6 poços (1,2. 106 células/poços), e incubada durante 16horas a 37°C em uma atmosfera a 5% de CO2. Os queratinócitos são entãoenxaguados com PBS para eliminar as células não aderentes, depois expos-tos aos produtos a testar incluídos em DMEM sem SVF (que poderia interfe-rir na dosagem).

A concentração testada em cultura é de 3 pg/ml. Ela foi retidaapós um teste preliminar de avaliação da citotoxicidade (vermelho neutro) enão é citotóxica.

Para cada tratamento, 3 poços são abertos. As células são pré-incubadas durante 60 minutos com os produtos a testar, depois um agenteestimulante da cascata do ácido araquidônico, o ionóforo cálcico é acrescen-tado durante 5 horas: o ionóforo cálcico A23187 é utilizado à concentraçãode 1 μΜ.

Após essas 5 horas de cultura, os meios de cultura de cada umdos poços são recuperados, centrifugados a 3000 RPM e conservados a-80 °C.

A produção de prostaglandina 6KF 1 α para cada um dos testesextras por kit Elisa EUROMEDEX.

RESULTADOS:

Os resultados são expressos em percentagem de atividade /controle estimulado.

<table>table see original document page 29</column></row><table>

Propriedade anti-inflamatória: Inibicão da síntese de uma cito-quina pró-inflamatória IL8

A função da barreira da pele permite assegurar uma proteçãoface ao meio ambiente externo, e os queratinócitos da epiderme podem dire-tamente responder a uma larga variedade de agentes irritantes ou alérgenose participar ativamente dos processos inflamatórios e imunitários cutâneos,em particular através da geração de citoquinas pró-inflamatórias, mediado-ras de origem proteica. Dentre essas moléculas biologicamente ativas, a 111α (interleucina 1 a) e o TNF a ("Tumor Necrosis Factor a" ou fator de necro-se de tumor a) são consideradas como citoquinas primárias, sua liberaçãosendo suficiente para induzir a inflamação em virtude de sua indução de mo-léculas de adesão ao nível das células endoteliais e de sua indução de fato-res quimiotáticos, tais como as quimiocinas. O sistema das quimiocinas con-trola o tráfego leucocitário durante a resposta inflamatória e é necessário àsinterações das respostas inatas e adaptativas.

No presente estudo, houve interesse especificamente em quimi-ocina-interleucina 8 - que é fortemente implicada na ampliação da respostainflamatória e cuja função principal é de recrutar e ativar os polinuclearesneutrófilos notadamente estimulando sua liberação de moléculas pró-inflamatórias.

Nesse estudo, feito sobre placas de 96 poços, avalia-se a ativi-dade dos hidroxi ácidos-alcenos, sobre a produção de interleucina 8 induzidaao nível do queratinócito pelo forbol éster PMA e o ionóforo cálcico A23187.

PROTOCOLO:

A suspensão dos queratinócitos no KSFM complementado é dis-tribuída em placas de 96 poços (3,104 células/poços), e incubada durante 16horas a 37 0C em uma atmosfera a 5% de CO2. Os queratinócitos são entãoenxaguados com PBS para eliminar as células não aderentes, depois expos-tos aos produtos a testar incluídos em KSFM não complementado (que po-deria interferir na dosagem).

Para cada tratamento, 3 poços são abertos. As células são pré-incubadas durante 60 minutos com os produtos a testar, depois estimuladas,paralelamente a controles negativos sem estimulantes: Phorbol MyristateAcetate (PMA) 1 μΜ + Ionóforo cálcico (A23187) 0,1 μΜ.

Incubação durante 6 horas a 37 0C em atmosfera úmida de arcontendo 5% de CO2.

Os meios de cultura de cada um dos poços são recuperados,centrifugados a 3000 rpm e conservados a -80 0C.Dosagem das citoquinas: A 1h8 é dosada por um método imu-noenzimático em kit ELISA (immunotech).

RESULTADOS:

Os resultados são expressos em percentagem de atividade /controle estimulado.

<table>table see original document page 31</column></row><table>

Os compostos, de acordo com a invenção, foram avaliados emtermos de atividade anti-inflamatória sobre a liberação de interleucina 8 pe-los queratinócitos humanos NHK estimulados por forbol éster PMA + o iono-foro cálcico A23187.

Três experimentos independentes foram feitos: a síntese dosdados obtidos permite colocar em evidência as potencialidades anti-inflamatórias, em particular dos dois seguintes compostos:

-n = 13, R = Rn = H1 R1 = F-N = 13, R = Rn = Ri = H

Para a concentração avaliada para cada uma das moléculas eapós cálculo das doses eficazes 50, os presentes resultados mostram o quese segue:

<formula>formula see original document page 32</formula>

Inflamação e prurido: Análise do fluxo cálcico em conseqüênciado estímulo dos receptores PAR2

O receptor "receptor-2 ativado com protease (PAR-2)" é associ-ado à fisiopatologia de várias doenças, implicando respostas inflamatórias.

O PAR-2 é expresso pelos diferentes tipos celulares da pele:queratinócitos, células mioepiteliais das glândulas sudoríparas, folículo pilo-so, células do tipo dentríticas da derme e as células endoteliais da lâminaprópria e da derme (Steinhoff et al., 1999; Santulli et al., 1995). Os melanóci-tos não expressam esse receptor (Seiberg et al., 2000), embora o PAR-2exerça um papel importante na pigmentação, favorecendo a transferência damelanina dos melanócitos para os queratinócitos (Sharlow et al., 2000).

As serina-proteases geradas pela epiderme exercem efeitosquimiotáticos induzindo o recrutamento dos leucócitos na pele. Elas são tam-bém implicadas na regulagem da homeostasia, da mitogênese, e da diferen-ciação epidérmicas e modulam a função de barreira da pele. Além disso, asserina-proteases contribuem para a fisiopatologia de doenças cutâneas liga-das à inflamação, à defesa do hospedeiro, à cancerogênese, à fibrose e aoestímulo nervoso.

As propriedades fisiológicas e fisiopatológicas cutâneas das se-rina proteases seriam em parte ligadas aos receptores PARs. Com efeito, osreceptores PAR-2 são superexpressos na epiderme, na derme e nos vasosdas doenças inflamatórias da pele como a dermatite atópica, o líquen planoe a psoríase (Steinhoff et al., 1999). Os receptores PAR-2 exerceriam tam-bém um papel no desenvolvimento do prurido em pacientes atacados dedermatite atópica (Steinhoff et al., 2003).

Ativação da PAR-2 por uma protease de tipo tripsina induz aprodução de 1L-8 a partor de queratinócitos (HaCaT) (Hou et al., 1998). Maisrecentemente, foi demonstrado que a 1L-8, quimiocina quimioatraente paraos leucócitos, permitiria a infiltração dos neutrófilos na epiderme de pacien-tes atacados de Psoriasis vulgaris (Iwakiri et al., 2004).

A sinalização intracelular do receptor PAR-2 está subampliadapara a parte por uma mobilização de cálcio intra e extra - celular.

A presente invenção propõe-se portanto, a avaliar a atividadeanti-PAR-2 dos derivados hidroxiácidos de fórmula I, sobre o influxo de cál-cio intracelular induzido após estímulo específico por receptores PAR-2 etripsina presentes sobre os queratinócitos humanos oriundos de uma Iinha-gem (HaCaT).

Essa técnica é baseada na utilização de uma sonda fluorescenteesterificada por um grupamento AM, que facilita sua penetração por difusãopassiva na célula. A sonda utilizada é o Fluo-4/ΑΜ. Só a forma desesterifi-cada e ligada aos íons cálcio é excitável em fluorescência (a 485 nm) e emi-te a 535 nm.

Percentagem de inibição do fluxo cálcico induzido pela tripsina

<table>table see original document page 33</column></row><table>

Estímulo pela tripsinaSobre os queratinócitos oriundos de uma linhagem (HaCaT):

Os derivados hidroxiácidos de fórmula geral (I), mencionados natabela acima, apresentam uma atividade sobre a inibição do fluxo cálcicoinduzido pela tripsina, a uma concentração de 10 pg/ml para o primeiro, e auma concentração de 100 pg/ml para os dois compostos seguintes.

In vitro, na escala celular, o estímulo específico dos receptoresPAR-2 pela tripsina leva a uma mobilização de cálcio intra e extracelular de-tectada com o auxílio da sonda fluorescente.

Nas condições experimentais e nas concentrações testadas, oscompostos de fórmula geral (I) mencionados na tabela acima modulam, deforma significativa, a atividade anti-PAR-2.

Efeito dos derivados de hidroxiácidos graxos sobre a síntese demelanina in vitro.

Os melanócitos são células de aspecto estrelado presentes emminoria na camada basal da epiderme. Sua função principal é assegurar amelanogênese, processo pelo qual a melanina é sintetizada em organitosespecializados, os melanossomas, depois transportada e distribuída nosqueratonócitos vizinhos via seus prolongamentos dendríticos. Esse contatocom os queratinócitos permite a pigmentação cutânea, mecanismo de prote-ção da epiderme contra os efeitos mutagênicos dos raios ultravioletas. Cadamelanócito está em relação com aproximadamente trinta e seis queratinóci-tos, formando assim uma "unidade epidérmica de melanização".

A melanogênese consiste em uma série de reações enzimáticasespontâneas, cujo precursor é a tirosina. Três enzimas principais participamdesse processo: a tirosinase, e as proteínas 1 e 2 relacionadas com tirosina-se 1 e 2 (TRP 1 e 2) (1). A tirosinase catalisa a transformação da tirosina emdopaquinona. A partir daí, duas vias de síntese são então possíveis: a eume-lanogênese e a feomelanogênese. A conversão de dopaquinona em eume-Ianina é feita por uma série de reações sucessivas de oxidações, fazendointervir TRP-1 e TRP-2. A eumelanina corresponde ao pigmento castanho-escuro com baixo teor em enxofre, e assegura o poder fotoprotetor. Na feo-melanogênese, moléculas com forte teor em enxofre se incorporam à dopa-quinona para dar a feomelanina, de cor amarelo-alaranjada, apresentadanas peles dos sujeitos ruivos.

O estímulo fisiológico da síntese de melanina é o sol, o que a-carreta um aumento no número dos melanócitos, uma neossíntese de mela-nina, e modificações morfológicas dos melanócitos, associando um aumentode sua dendricidade a um aumento da transferência dos melanossomas pa-ra os queratinócitos. No nível molecular, a exposição ao sol estimula a sínte-se e a secreção do hormônio estimulante de alfa melanócito. O α-MSH au-menta a concentração intramelanocitária em AMPc, ativando o fator detranscrição, Mitf, que estimula por sua vez a atividade transcricional dos ge-nes codificando para a tirosinase, TRP-1 e TRP-2.

Certas moléculas exógenas são também conhecidas por regula-rem negativamente a melanogênese. A hidroquinona inibe a síntese de me-lanina, apresentando-se como substrato da tirosinase, a fim de desviar suaatividade.

O efeito modulador dos derivados de hidroxiácidos graxos insa-turados, sobre a melanogênese foi analisado. Para isso uma medida da sín-tese de melanina por dosagem colorimétrica é feita sobre uma linhagem ce-lular de melanomas murinos: a linhagem B16-F10.

O efeito dos produtos é investigado em situação basal e apósestímulo da melanogênese por α MSH para determinar o poder de despig-mentação.

Dosagem da melanina

A taxa de melanina extracelular e intracelular é então medida porespectrofotometria a um comprimento de onda de 405 nm, segundo o proto-colo (Anob et al, 1999). A quantidade de pigmento é determinada graças auma faixa de aferição de melanina e a análise sobre o Soft Microwin (Ber-thold Biotechnologies). Uma dosagem de proteínas totais é feita para as a-mostras de melanina intracelular pelo método BCA-Copper a 540 nm. A faixade aferição é feita com uma proteína padrão, a BSA (albumina de soro bovino).

RESULTADOS:Em situação basal a alfa MSH a 1 μΜ aumenta de 100% da pro-dução da melanina em relação às células controle.

Esse aumento de melanina é combatido pelos agentes de des-pigmentação, tais como a hidroquinona a 1 Mg/ml ou a vitamina C a 40pg/ml, que inibem em 60% a ação do alfa MSH.

Em situação basal a 30 pg/ml:

- o composto de fórmula geral 1 com η = 10, R=Rn=H, R1=F inibede 30 a 40% da síntese de melanina, enquanto que, em presença de alfaMSH, esse mesmo composto a 30 pg/ml acarreta uma inibição de 45 a 60%.

- o composto de fórmula geral 1 com n=10, R=Ri=Rn=H a 30pg/ml apresenta uma atividade menor do que o composto precedente, 15%de inibição em situação basal, enquanto que em presença de alfa MSH opotencial de inibição desse composto em relação a essa substância melano-trópica é similar àquele do composto precedente, isto é, de 45 a 60%.

A 10 pg/ml a atividade inibidora desses 2 ácidos sobre a induçãoda melanogênese por alfa MSH é da ordem de 35%.

Claims

1. Derivados hidroxiácidos graxos insaturados caracterizadospelo fato de serem correspondentes à fórmula geral (I):<formula>formula see original document page 37</formula>na qual:-Rn representa independentemente uns dos outros H ou umgrupo alquila, linear ou ramificado, compreendendo de 1 a 6 átomos de car-bono e sendo eventualmente substituído por um átomo de halogênio, emparticular de flúor;- R1 representa H1 F, Cl, Brou CF3l-R representa H ou um grupo alquila, linear ou ramificado, com-preendendo de 1 a 6 átomos de carbono e sendo eventualmente substituídopor um átomo de halogênio em particular de flúor, e-3<n< 14

2. Derivados de hidroxiácidos graxos insaturados de fórmula ge-ral (I) caracterizados pelo fato de que respondem aos seguintes critérios:- R representa H;- R1, Rn e η tendo as significações dadas na reivindicação 1à condição todavia que, quando η # 10, pelo menos um dos ra-dicais R1, e Rn não represente o hidrogênio.

3. Derivados de hidroxiácidos graxos insaturados de fórmula ge-ral (I), de acordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo fato de que:- Ri representa F, Cl, Br ou CF3;- R, Rn e η tendo as significações dadas na reivindicação 1.

4. Derivados hidroxiácidos graxos insaturados de fórmula geral(I), de acordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo fato de que:- R, R1 e Rn tendo as significações dadas na reivindicação 1;-6 < η < 14à condição todavia que, quando η # 10, pelo menos um dos ra-dicais Ri e Rn não represente o hidrogênio.

5. Derivados hidroxiácidos graxos insaturados de fórmula geral(I), de acordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo fato de que:- Ri representa F, Cl, Br ou CF3;-Rn = H

6. Derivados de hidroxiácidos graxos insaturados de fórmula ge-ral (I), de acordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo fato de que:- R1 representa F1 Cl, Br ou CF3; e- pelo menos um dos radicais Rn representando um grupo alquila,linear ou ramificado, compreendendo de 1 a 6 átomos de carbono e sendo e-ventualmente substituído por um átomo de halogênio, em particular de flúor.

7. Derivados de hidroxiácidos graxos insaturados de fórmula geral(I), de acordo com uma das reivindicações 1 e 3, caracterizados pelo fato de que:-R1 = F-Rn = H

8. Derivados de hidroxiácidos graxos insaturados de fórmula ge-ral (I), de acordo com a reivindicação 7, caracterizados pelo fato de que:- R1 = F-Rn=H- η = 13

9. Derivados de hidroxiácidos graxos insaturados de fórmula ge-ral (I), de acordo com a reivindicação 3, caracterizados pelo fato de que:-R1 = F-Rn=H-η = 6

10. Derivados de hidroxiácidos graxos insaturados de fórmulageral (I), de acordo com uma das reivindicações 1 e 2, caracterizados pelofato de que:- R = R1 = Hum único dos radicais Rn representa um grupo metila, os outrossendo átomos de hidrogênio, e- η = 4

11. Derivados de hidroxiácidos graxos insaturados de fórmulade acordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo fato de que:<formula>formula see original document page 39</formula>

12. Derivados de hidroxiácidos graxos insaturados de fórmulade acordo com a reivindicação 3, caracterizados pelo fato de que:<formula>formula see original document page 39</formula>

13. Derivados de hidroxiácidos graxos insaturados de fórmulade acordo com a reivindicação 3, caracterizados pelo fato de que:<formula>formula see original document page 39</formula>

14. Composições dermocosmetológicas caracterizadas pelo fatode que compreendem um derivado de hidroxiácido graxo insaturado de fór-mula geral (I), como definido em uma das reivindicações 1 a 13, associado aum excipiente dermatologicamente aceitável.

15. Utilização de um derivado de hidroxiácido graxo insaturadode fórmula geral (I), como definido em uma das reivindicações 1 a 13, carac-terizada pelo fato de ser para a produção de uma composição dermocosme-tológica antirradicalar, anti-inflamatória, antipruriginosa e/ou destinada aotratamento dos distúrbios da queratinização e da pigmentação e/ou a melho-rarar a cicatrização.

16. Utilização, de acordo com a reivindicação 15, caracterizadapelo fato de essa composição ser destinada ao tratamento da psoríase, doprurido e/ou da dermite atópica.

17. Utilização, de acordo com a reivindicação 15, caracterizadapelo fato de essa composição ser destinada para o tratamento do envelhe-cimento cutâneo e das manchas de envelhecimento branca ou castanhas.

18. Utilização de um derivado hidroxiácido graxo insaturado defórmula geral (I), caracterizada pelo fato de essa composição ser destinada aprovocar um clareamento da pele.