PT1937619E

PT1937619E - Novos derivados de hidroxiácidos gordos insaturados e sua utilização dermocosmetológica

Info

Publication number: PT1937619E
Application number: PT68074533T
Authority: PT
Original assignee: Fabre Pierre Dermo Cosmetique
Priority date: 2005-10-21
Filing date: 2006-10-20
Publication date: 2015-01-14
Also published as: BRPI0617517B8; CA2626635A1; AU2006303233B2; US20090238784A1; BRPI0617517B1; MA29942B1; US8158811B2; JP2009512664A; BRPI0617517A2; EP1937619B1; HK1118804A1; NZ568366A; CA2626635C; EP1937619A1; IL190597A0; ZA200804239B; CN101291903A; AU2006303233A1; ES2526201T3; IL190597A

Description

DESCRIÇÃO "NOVOS DERIVADOS DE HIDROXIÁCIDOS GORDOS INSATURADOS E SUA UTILIZAÇÃO DERMOCOSMETOLÓGICA" A presente invenção refere-se aos novos derivados de hidroxiácidos gordos insaturados, assim como sua utilização dermocosmetológica.

Numerosos hidroxiácidos gordos saturados são conhecidos e descritos na literatura por suas propriedades biológicas e mais particularmente por suas propriedades cosméticas e farmacológicas. Por exemplo, o principal constituinte lipidico da geleia real das abelhas é um hidroxiácido gordo insaturado, a saber o ácido hidroxi-10-deceno-2 (trans)oico (Edward E. Smissman et ai., 1964. JOU. 29 3517-3520), conhecido pela sua ação sobre a estimulação da renovação epidérmica e luta contra o envelhecimento da pele, assim como para a sua utilização em composições de despigmentação (EP 1 679 071 e EP 0 989 111) . O pedido de patente EP 0 568 307 descreve ácidos alfa-hidroxi-carboxilicos e sua utilização como conservador em composições cosméticas. O artigo de Hanessian et al. (Can. J. Chem. 1987,

65, 1859-1866) descreve hidroxiácidos gordos insaturados e seu processo de preparação mas sem que nenhuma atividade biológica seja descrita.

Diferentes documentos do estado da técnica descrevem processos de preparação de hidroxiácidos gordos insaturados e de seus ésteres (Lee et al., 1993, J. Org.

Chem., volume 58, páginas 2918-2919; Hurd et Saunders, 1952, J. Am. Chem. Soc., volume 74, páginas 5324-5328; Krishnamurthy et al. , 1989, lndian J. Chem. Sect. A, volume 28, páginas 288-291; Plettner et al. , 1995, J.

Chem, Ecol., volume 21, páginas 1017-1030).

Mais particularmente, a presente invenção se refere aos derivados de hidroxiácidos gordos insaturados correspondendo à fórmula geral (I):

na qual: - Rn representa independentemente uns dos outros H ou um grupo alquilo, linear ou ramificado, compreendendo de um a seis átomos de carbono e sendo eventualmente substituído por um átomo de halogéneo, em particular de flúor; - Ri representa H, F, Cl, Br, CF3, - R representa H e - 3<n<14. com a condição de que, contudo, quando n^lO, pelo menos um dos radicais Ri e Rn não representa hidrogénio.

De acordo com uma caracteristica particular da invenção, os derivados de hidroxiácidos gordos insaturados de fórmula geral {I) correspondem aos seguintes critérios: - Ri representa F, Cl, Br, CF3; - Rn representa independentemente uns dos outros H ou um grupo alquilo, linear ou ramificado, compreendendo de um a seis átomos de carbono e sendo eventualmente substituído por um átomo de halogéneo, em particular de flúor; - R representa H e - 3<n<14.

De acordo com uma outra caracteristica particular da invenção, os derivados de hidroxiácidos gordos insaturados de fórmula geral (I) correspondem aos seguintes critérios: - Rn representa independentemente uns dos outros H ou um grupo alquilo, linear ou ramificado, compreendendo de 1 a 6 átomos de carbono e sendo eventualmente substituído por um átomo de halogéneo, em particular de flúor; - Ri representa H, F, Cl, Br, CF3; - R representa H e - 6<n<14, com a condição de que, contudo, quando n^lO, pelo menos um dos radicais R3 e Rn não representa hidrogénio,

De acordo com uma outra caracteristica particular da invenção, os derivados de hidroxiácidos gordos insaturados de fórmula geral (I) correspondem aos seguintes critérios: - Ri=F, Cl, Br ou CF3; - R=Rn= H, e - 3<n<14

De acordo com uma outra caracteristica particular da invenção, os derivados de hidroxiácidos gordos insaturados de fórmula geral (I) correspondem aos seguintes critérios: - Rx representa F, Cl, Br ou CF3; - pelo menos um dos radicais Rn representando um grupo alquilo, linear ou ramificado, compreendendo de 1 a 6 átomos de carbono e sendo eventualmente substituído por um átomo de halogéneo, em particular de flúor; e - R representa H, e - 3<n<14.

De acordo com uma outra caracteristica particular da invenção, os derivados de hidroxiácidos gordos insaturados de fórmula geral (I) correspondem aos seguintes critérios:

- Rx=F - R= Rn=H, e - 3<n<14.

- Ri=F - R=Rn=H, e - n=13.

- Ri=F

- R=Rn=H - n=6.

- R=Rx=H um só dos radicais Rn representa um grupo metilo, sendo os outros átomos de hidrogénio, e - n=4 .

De acordo com uma outra caracteristica particular da invenção, os derivados de hidroxiácidos gordos insatu-rados de fórmula geral (I) correspondem aos seguintes critérios: - Ri=Rn=H e - n=10.

De acordo com uma outra caracteristica particular da invenção, os derivados de hidroxiácidos gordos insatu-rados de fórmula geral (I) correspendem aos seguintes critérios:

- Ri=F - R=Rn=H, e - n=10.

De acordo com uma outra caracteristica particular da invenção, os derivados de hidroxiácidos gordos insatu-rados de fórmula geral (I) respondem aos seguintes critérios:

- Ri = F - R=Rn=H, e - n=8 .

De acordo com a presente invenção, os derivados de hidroxiácidos gordos insaturados de fórmula geral (I) anteriormente definidos podem ser utilizados a titulo de principio ativo em associação com um excipiente apropriado para realizar composições dermocosmetológicas destinadas a tratar distúrbios da pigmentação.

De acordo com a presente invenção os derivados de hidroxiácidos gordos insaturados de fórmula geral (I) são mais particularmente destinados a composições destinadas a provocar um clareamento da pele.

De acordo com a presente invenção, os derivados de hidroxiácidos gordos insaturados de fórmula geral (I) seguinte:

na qual: - Rn representa independentemente uns dos outros H ou um grupo alquilo, linear ou ramificado, compreendendo de um a seis átomos de carbono e sendo eventualmente substituído por um átomo de halogéneo, em particular de flúor; - Rx representa H, F, Cl, Br, CF3; - R representa H ou um grupo alquilo, linear ou ramificado, compreendendo de um a seis átomos de carbono e sendo eventualmente substituído por um átomo de halogéneo, em particular de flúor, e - 3<n<14.

De acordo com uma característica particular da invenção, os derivados de hidroxiácidos gordos insaturados de fórmula geral {I) correspondem aos seguintes critérios: - R representa H, - Rn representa independentemente uns dos outros H ou um grupo alquilo, linear ou ramificado, compreendendo de um a seis átomos de carbono e sendo eventualmente substituído por um átomo de halogéneo, em particular de flúor; - Ri representa H, F, Cl, Br, CF3; e - 3<n<14, podem ser utilizados a título de princípio ativo em associação com um excipiente apropriado para realizar composições dermocosmetológicas com atividade antirradi-calar, anti-inflamatória, antipruriginosa e/ou destinada ao tratamento dos distúrbios da queratinização e da pigmentação e/ou a melhorarar a cicatrização.

Os derivados de hidroxiácidos gordos insaturados de fórmula geral (I) seguinte:

na qual: - Rn representa independentemente uns dos outros H ou um grupo alquilo, linear ou ramificado, compreendendo de 1 a 6 átomos de carbono e sendo eventualmente substituído por um átomo de halogéneo, em particular de flúor; - Ri representa H, F, Cl, Br, CF3; - R representa H ou um grupo alquilo, linear ou ramificado, compreendendo de 1 a 6 átomos de carbono e sendo eventualmente substituído por um átomo de halogéneo, em particular de flúor, e - 3<n<14.

De acordo com uma caracteristica particular da invenção, os derivados de hidroxiácidos gordos insaturados de fórmula geral (I) correspondem aos seguintes critérios: - R representa H, e - Rn representa independentemente uns dos outros H ou um grupo alquilo, linear ou ramificado, compreendendo de 1 a 6 átomos de carbono e sendo eventualmente substituído por um átomo de halogéneo, em particular de flúor;

- Ri representa H, F, Cl, Br ou CF3, e - 3<n<14, particularmente destinados a composições destinadas ao tratamento da psoríase, do prurido e/ou da dermite atópica, assim como ao tratamento do envelhecimento cutâneo e das manchas de envelhecimento brancas ou castanhas.

Em razão de sua atividade antirradicalar, os derivados de hidroxiácidos gordos insaturados de fórmula geral (I) são também úteis para evitar ou limitar a fotocarcinogênese cutânea com estágios precoces e, portanto, podem ser utilizados na prevenção e no tratamento de diversas doenças tumorais da pele.

Os derivados de hidroxiácidos gordos insaturados de fórmula geral (I) podem ser preparados: - pela utilização da reação de Wittig-Horner pela reação de um fosfonato com a seguinte fórmula (III) :

na qual: - Ri é tal como definido a propósito da fórmula (I) :

R.2 representa um grupo alquilo, linear ou ramificado, compreendendo de 1 a 6 átomos de carbono e é, de preferência, um grupo etilo ou metilo, podendo esses grupos R2 formar um ciclo com os átomos de oxigénio dos grupos OR2 e o átomo de fósforo adjacente, e R4 representa um grupo alquilo, linear ou ramificado, compreendendo de 1 a 6 átomos de carbono, e é, de preferência um grupo etilo. - ou, quando Ri = H, pela utilização da reação de Doebner-Knoevenagel pela reação de um derivado de ácido malónico de fórmula R4OOC-CH2COOR, sendo R tal como definido acima a propósito da fórmula (I), sobre um lactol da seguinte fórmula (II) :

sendo Rn e n tais como definidos acima, a fim de se obter um hidroxi-éster de fórmula (IV) : (fV) na qual n, R e Ri são tais como definidos acima,

e eventualmente quando R representa um grupo R4, tal como definido acima, uma reação de saponificação do hidroxi-éster de fórmula (IV) mencionada, para se obter um derivado de hidroxiácido de fórmula (I) correspondente. A presente invenção será ilustrada no quadro dos exemplos de síntese dados a seguir:

Exemplo 1: Modo operacional para a síntese do DHA 1. Etapa 1: Preparação de Oxonan-2-ona 43,5 g (345 mmol) de ciclo-octanona são colocados em solução em 430 ml de dicloroetano. 170 g (985 mmol) de ácido meta-cloroperpenzoico são em seguida acrescentados. O meio é aquecido a 80°C durante 48 horas. À temperatura ambiente, 400 ml de uma solução saturada de Na2S2O5 e NaHCCg (1/1 v/v) são acrescentados. O meio é agitado vigorosamente durante 18 horas. A fase orgânica é separada e colocada em presença de Kl e H2O, durante 6 horas. A fase orgânica é separada e lavada por uma solução saturada de Na2S2C>3, por uma solução saturada de NaCl, depois é seca sobre MgSO4, filtrada e concentrada sob vácuo para dar um produto bruto de 36 g. A lactona é purificada por empastamento em pentano (60 ml), depois por filtração do precipitado ácido meta-clorobenzoico formado a frio, m = 26,6 g (54%).

A lactona obtida é um composto de fórmula:

Caracterização: CCF: Rf = 0,3 (heptano/acetato de etilo 7/3) RMN (300MHz, CDC13) : δ 1,42-1,49 (m, 4H) , 1,65-1,75 (m, 6H), 2,30 (t, J=5,4Hz, 2H), 4,30 (t, J=5,7Hz, 2H). 2. Etapa de redução particular em lactol 26,6 g (187,2 mmol) de lactona são diluídos em 210 ml de tolueno, sob atmosfera de azoto. O meio é arrecido a -78°C e 156,4 ml (189,1 mmol) de Dibal-H em solução a 20% em tolueno são adicionados gota a gota, mantendo a temperatura a -78°C. A mistura é agitada durante 2 horas a -78°C. 200 ml de uma solução saturada de sais de Rozen são acrescentados a -78°C. Após 18 horas de agitação vigorosa à temperatura ambiente, a mistura bifásica é filtrada sobre Celite, depois extraída com acetato de etilo. As fases orgânicas são lavadas com uma solução saturada de NaCl, secas sobre MgSCg, filtradas e concentradas sob vácuo para dar um bruto de 26 g (dos quais 25% de derivado diol, isto é, um rendimento estimado em 72%) . O lactol, em equilíbrio na forma aberta, na forma cíclica, é utilizado assim, sem purificação suplementar.

Caracterização: CCF: Rf = 0,4 (heptano/acetato de etilo 6/4; RMN (300MHz, CDC13) : δ 1,34-1, 68 (m, 10H), 2,45 (t, J=5,4Hz, 2H), 3,66 (t, J=6,6Hz, 2H), 9,78 (t, J=l,8Hz, 1H) . 3. Etapa 3: Reação de Wittig-Horner 19 g (131,8 mmol) de lactol são diluídos em 250 ml de etanol. 31,4 ml (158,1 mmol) de f osf onacetato de trietilo são adicionados ao meio em presença de 27,3 g (197,5 mmol) de carbonato de potássio. O meio reacional é aquecido a 40°C durante 18 horas. À temperatura ambiente, o meio é hidrolisado por 200 ml de água destilada e extraído com o acetato de etila. As fases orgânicas são lavadas por uma solução saturada de NaCI, secas sobre MgS04, filtradas e concentradas sob vácuo para dar um produto bruto de 20 g. O éster obtido é purificado por cromatografia com uma eluição heptano/acetato de etilo 7/3; 15 g de produto são obtidos (53% de rendimento). O éster obtido é um composto de fórmula:

Caracterização: CCF: Rf = 0,4 (heptano/acetato de etilo 7/3) RMN (300MHz, CDC13) : δ 1,24-1,38 (m, 9H), 1,43- 1,50 (m,2H), 1,51-1,57 (m, 2H) , 2,15-2,21 (q, 2H) , 3,60- 3,64 (t, 2H) , 4,14-4,20 (t,2H), 5,77-5, 82 (d, J=15,6Hz, 1H), 6,91-6,98 (dt, J=15,6Hz, 1H) . 4. Etapa 4: Reação de saponificação 0,60 g (2,81 mmol) de hidroxi-éster são solubi-lizados em 10 volumes de tetra-hidrofurano. Lentamente, 3,4 ml (6,75 mmol) de uma solução de soda 2M são adicionados. O meio é aquecido a 65°C durante 3 horas. Uma vez a reação concluída, o meio é hidrolisado pelo acréscimo de uma solução de ácido clorídrico 3M, até a obtenção de um pH = 2. A mistura é concentrada a seco e a fase aquosa é então extraída pelo acetato de etilo. As fases orgânicas são lavadas por uma solução saturada de NaCl, secas sobre MgSO4, filtradas e concentradas sob vácuo para dar um produto bruto de 0,6 g. O derivado de hidroxiácido insaturado esperado é obtido, sob a forma de um sólido branco, por recristalização em acetonitrilo a frio, m = 0,37g (71%) . O derivado de hidroxiácido obtido é um composto de fórmula:

Caracterização: CCF: Rf=0,l (heptano/acetato de etilo 6/4) ΧΗ RMN (300MHz, CDCI3) : δ 1,33-1,37 (m, 6H), 1,45-1,49 (m,2H), 1,55-1,58 (m, 2H) , 2,20-2,25 (q, 2H}, 3,62- 3,66 (t, 2H) , 5,79-5, 84 (d,J=15,6Hz, 1H) , 7,03-7,10 (dt, J=15,6Hz, 1H).

Espectroscopia de massa: [M-Na]+ 209 (calculado

186) Ponto de fusão: 62,5°C ± 1°C

Exemplo 2: Modo operacional para a síntese do DHA g-fluorado de ácido 10-hidroxi-dec-2-fluoro-2-enoico: (Ri=F, n = 6) Só a etapa 3 foi modificada: a partir do lactol (0,89 g, 7,7 mmol), a reação de Wittig-Horner foi conduzida em presença de dietilfosfonofluoroacetato de metilo (2,1 g, 9.2 mmol) e de carbonato de potássio (1,6 g, 11,5 mmol) em etanol (9 ml) a 40°C. A etapa 4 foi conduzida segundo o protocolo precedente. O produto obtido, após recristali-zação, está sob a forma de uma mistura cis/trans. O derivado de hidroxiácido obtido é um composto de fórmula:

Caracterização: CCF: Rf =0,1 (heptano/acetato de etilo 6/4) RMN (300MHz, CDCI3) : δ 1,36-1, 62 (m, 20H), 2,27-2,30 (m, 2H, forma eis), 2,50-2,58 (m, 2H, forma trans), 3,69 (m, 4H) , 6,05 (dt, J=21,6Hz, 1H, forma trans) e 6,25 (dt, J=40,8Hz, 1H, forma cis).

Espectroscopia de massa: [M-Na]+ 227 (calculado 204)

Exemplo 3: Modo operacional para a síntese de ácido 9-hidroxi-nona-2t-enoico O protocolo da síntese do DHA foi aplicado à ciclo-heptanona para conduzir ao ácido 9-hidroxi-nona-2t-enoico,

Caracterização: CCF: Rf = 0,1 (heptano/acetato de etilo 6/4) RMN (300MHz, CDC13) : δ 1,36-1,61 (m, 8H) , 2,22-2,27 (m, 2H), 3,67 (t, J=6,3Hz, 2H) , 5,84 (dt, J=15,6Hz, 1H), 7,09 (dt, J=15,6Hz, 1H).

Espectroscopia de massa: [M-Na]+ 195 (calculado 172)

Exemplo 4 Modo operacional para a síntese do ácido ll-hidroxiundeca-2t-enoico 0 protocolo da síntese do DHA é aplicado à ciclononanona para conduzir ao ácido ll-hidroxi-undeca-2t- enoico.

Caracterização: CCF: Rf = 0,1 (heptano/acetato de etilo 6/4) RMN (300MHz, CDC13) : δ 1,33-1,61 (m, 12H) , 2,20-2,28 (m,2H), 3,66 (t, J=6,0Hz, 2H), 5,84 (dt, J= 15,9Hz, 1H), 7,09 (dt, J= 15,9Hz, 1H).

Espectroscopia de massa: [M-Na]+ 223 (calculado 200)

Exemplo 5 Modo operacional para síntese do ácido 12-hidroxi-dodeca-2t-enoico O protocolo da síntese do DHA foi aplicado à ciclodecanona para conduzir ao ácido 12-hidroxi-dodeca-2t- enoico.

Caracterização: CCF: Rf = 0,1 (heptano/acetato de etilo 6/4) RMN (300MHz, CDC13) : δ 1,35-1,56 (m, 14H) , 2,20-2,27 (m, 2H), 3.55 (t, J=6,6Hz, 2H) , 5,80 (dt, J=15,6Hz, 1H), 6,96 (dt, J=15,6Hz, 1H).

Espectroscopia de massa: [M-Na]+ 237 (calculado 214)

Exemplo 6 Modo operacional para síntese do ácido 12-hidroxi-dodeca-2-fluoro-2t-enoico O protocolo da síntese do DHA fluorado em posição 2 (exemplo 2) foi aplicado à ciclodecanona para conduzir ao ácido 12-hidroxi-dodec-2-fluoro-2-enoico sob a forma de uma mistura cis/trans.

Caracterização: CCF: Rf = 0,1 (heptano/acetato de etilo 6/4) RMN (300MHz, CDC13) : δ 1,34-1,56 (m, 14H) , 2,24-2,27 (m, 2H forma cis) ou 2,49-2,54 (m, 2H estrutura

trans), 3,55 (t, J=6,6Hz, 2H), 5,97(dt, J=21,9Hz, 1 H estrutura trans) ou 6,10 (dt, J=55,2Hz, 1H, forma cis) .

Exemplo 7 Modo operacional para síntese do ácido 13- hidroxi-tridec-2t-enoico 0 protocolo da síntese do DHA foi aplicado à oxaciclododecan-2-ona para conduzir ao ácido 13-hidroxi- tridec-2t-enoico.

Caracterização: CCF: Rf =0,1 (heptano/acetato de etilo 6/4) RMN (300MHz, CDC13) : δ 1,27-1, 63 (m, 16H), 2,21-2,28 (m, 2H) , 3,64 (t, J=3,6Hz, 2H) , 5,84 (dt, J = 15,6Hz, 1H), 7,09 (dt, J=15,6Hz, 1H).

Espectroscopia de massa: [M-Na]+ 251 (calculado 228)

Exemplo 8: modo operacional para síntese do ácido 14- hidroxi-tetradec-2t-enoico O protocolo da síntese do DHA foi aplicado à oxaciclotridecan-2- ona para conduzir ao ácido 14-hidroxi- tetradec-2 t-enoico.

Caracterização: CCF: Rf =0,1 (heptano/acetato de etilo 6/4) RMN (300MHz, CDC13) : δ 1,29-1,35 (m, 14H) , 1,46-1,61 (m, 4H) , 2,21-2,29 (m, 2H) , 3,66 (t, J=6,6Hz, 2H), 5,84 (dt, J=15,6Hz, 1H), 7,09 (dt, J=15,6Hz, 1H).

Espectroscopia de massa: [M-Na]+ 265 (calculado 242)

Exemplo 9 Modo operacional para síntese do ácido 14-hidroxi-tetradec-2-fluoro-2-enoico O protocolo da síntese do DHA fluorado em posição 2 (exemplo 2) foi aplicado à oxaciclotridecan-2-ona para conduzir ao ácido 14-hidroxi-tetradec-2-fluoro-2-enoico sob a forma de uma mistura cis/trans.

Caracterização: CCF: Rf=0,l (heptano/acetato de etilo 6/4) RMN (300MHz, CDC13) : δ 1,29 (m, 28H), 1,42-1,62 (m, 8H),2,27-2,31 (m, 2H, forma eis), 2,51-2,56 (m, 2H, forma trans) , 3,68 (t,J=6,6Hz, 2H) , 3,70 (t, J=6,6Hz, 2H) , 6,04 (dt, J=21.3Hz, 1H, forma trans),6,27 (dt, J=33,0Hz, 1H, forma cis) .

Espectroscopia de massa: [M-Na]+ 283 (calculado 260)

Exemplo 10 Modo operacional para síntese do ácido 17-hidroxi-heptadec-2t-enoico O protocolo da síntese do DHA foi aplicado à ciclo penta deca- nolida para conduzir ao ácido 17-hidroxi -heptadec-2t-enoico.

Caracterização: CCF: Rf = 0,1 (heptano/acetato de etilo 6/4) RMN (300MHz, CDC13) : δ 1,27-1,32 (m, 20H), 1,46-1,61 (m, 4H) , 2,20-2,29 (m, 2H) , 3,67 (t, J=6,6Hz, 2H), 5,84 (dt, J=15,6Hz, 1H), 7,08 (dt, J=15,6Hz, 1H).

Espectroscopia de massa: [M-Na]+ 387 (calculado 284)

Exemplo 11: Modo operacional para síntese do ácido 17-hidroxi-hepta-dec-2-fluoro-2-enoico O protocolo da síntese do DHA fluorado em posição 2 (exemplo 2) foi aplicado à ciclopentadecanolida para conduzir ao ácido 17-hidroxi-hepta-dec-2-fluoro-2-enoico sob a forma de uma mistura cis/trans.

Caracterização: CCF: Rf = 0,1 (heptano/acetato de etilo 6/4) RMN (300MHz, CDC13) : δ 1,27 (m, 40H), 1,45-1,62 (m, 8H),2,24-2,32 (m, 2H, forma eis), 2,50-2,58 (m, 2H, forma trans) , 3.69 (t, J=6, 6Hz, 4H) , 6,05 (dt, J=21,6Hz, 1H, forma trans) e 6,26 (dt, J=40,8Hz, 1H, forma cis).

Espectroscopia de massa: [M-Na]+ 301 (calculado

302) Ponto de fusão: 77°C ± 1°C

Exemplo 12: Modo operacional para síntese do ácido 18-hidroxi-octadec-2t-enoico: (RI =H, n = 14) O protocolo da síntese do DHA foi aplicado à hexaciclodecanolida para conduzir ao ácido 18-hidroxi- octadec-2 t-enoico.

Caracterização: CCF: Rf = 0,1 (heptano/acetato de etilo 6/4) ΧΗ RMN (300MHz, CDC13) : δ 1,27-1, 65 (m, 26H), 2,19-2,39 (m,2H), 3,67 (t,J=6,6Hz, 2H) , 5,83 (dt, J=15, 6Hz, 1H), 7,09 (dt, J=15,6Hz, 1H).

Espectroscopia de massa: [M-Na]+ 321 (calculado 298)

Exemplo 13: caracterização do ácido 16-hidroxi- hexadec-2 t-enoico

Caracterização: CCF: Rf = 0,1 (heptano/acetato de etilo 6/4) XH RMN (300MHz, CDC13) : δ 1,27-1,32 (m, 18H) , 1,46-1,61 (m,4H), 2,21-2.,28 (m, 2H) , 3,66 (t, J=6,6Hz, 2H), 5,85 (dt, J=15,6Hz, 1H), 7,09 (dt, J=15,6Hz, 1H).

Espectroscopia de massa: [M-Na]+ 293 (calculado 270)

Exemplo de reação de Doebner-Knovenacel a partir de oxaciclotridecanol. 1,4 g (7,0 mmol) de oxaciclotridecanol (obtido de acordo com o protocolo de redução parcial em lactol) é colocado em solução, sob fluxo de azoto, em 4 volumes de piridina, em presença de 1,09 g (10,5 mmol) de ácido malônico e 0,11 ml de piperidina. O meio reacional é aquecido a 80°C durante 1 hora e meia, depois ao refluxo durante 2 horas. A temperatura ambiente, a solução é derramada sobre uma solução de HC1 3M (50 ml) . O sólido filtrado é lavado pela água, depois é recristalizado em acetonitrilo (1,2 g obtido, isto é, 70% de rendimento).

Os derivados de hidroxiácidos gordos insaturados, de acordo com a invenção, constituiram o objeto de um certo número de experimentações que demonstraram seu interesse como principio ativo em composições dermatológicas e/ou cosméticas.

Estudo do efeito antirradicalar sobre espécies ativas do oxigénio (EAO)

Durante o metabolismo celular normal, quando de exposição ocasional da pele a agentes stressantes ou no decorrer de patologias dermatológicas, espécies oxigenadas reativas ainda denominadas espécies ativadas do oxigénio (EAO) são geradas (Y. M. W. Jassen et al, 1993). Essas EAO, descritas como metabólitos muito reagentes, exercem um papel importante em um bom número de processos, tais como a inflamação, o envelhecimento e a promoção tumoral.

As EAO são consideradas como os "segundos mensageiros", na sinalização celular do stresse oxidante e, portanto, como os mediadores precoces da inflamação (A. Van Der Vliet e A. Bast, 1992).

Sua superprodução induz importantes danos no seio de célula. Certos constituintes celulares são então alvos maiores desse stresse oxidante: os componentes lipidicos da membrana plásmica (lipoperoxidação), as proteínas (desnaturação e degradação) e o material genético ou ADN (mutações) podem ser alterados. As células são capazes de limitar esses danos oxidantes, graças a diferentes sistemas de defesa antirradicalar (antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos) (B. P. Yu, 1994; H. Steiling et al, 1999) .

Todavia, em certas condições, as EAO são produzidas em quantidade tal que a atividade antioxidante celular é insuficiente; essas EAO se tornam então fatores indutores de patologias inflamatórias e do envelhecimento tecidular (Y. Miyachi et al, 1986; M. Krress et al, 1995) .

Existem diferentes agentes químicos (ex: H2O2) ou físicos (ex: UVA) capazes de gerar in vitro um stresse oxidante. Assim, as EAO produzidas vão alterar diversos alvos celulares (Membranas, ADN ou Proteínas), cuja alteração pode ser analisada por metodologias bioquímicas amplamente utilizadas como a dosagem dos TBARS para a lipoperoxidação lipídica, ou a dosagem in vitro das EAO intracelulares com o auxílio da sonda H2DCF-DA.

Apresenta-se um modelo de estudo in vitro do stresse oxidante induzido por H202/ferro, H2O2 que gera maciçamente EAO intracelulares por uma reação em cadeia desencadeada pela oxidação dos lípidos membranários.

Essa técnica é baseada fluorescina na utilização de uma sonda fluorescente, o diacetato de 6-carbóxi- 2',7'-dicloro di-hidro, di (acetoximetil éster) (H2DCF-DA), que, uma vez que tenha penetrado na célula, é desacetilado pelas esterases intracelulares, formando então H2DCF. Esse produto é oxidado pelas EAO intracelulares em um composto altamente fluorescente: a 2 ' , 7'-diclorofluoresceina (DCF) (Suematsu M et al., 1996, Free Radicais Praticai Approach, Punchard ed. Páginas 83-99).

Os materiais e métodos utilizados para a dosagem in vitro das EAO intracelulares são indicados a seguir: a) Instrumento celular:

Linhagem celular de fibroblastos murinos cutâneos L929. b) Material: - Microplaca de 96 poços de fundo chato.

- Citofluorimetro citofluor 11: Ref. PERSEPTIVE

BIOSYSTEMS c) Reagentes:

Reagentes de cultura celular:

Meio de cultura Dulbecco's Modified Eagle Médium (DMEM) - Soro de bezerro fetal (SVF) - Tampão fosfato PBS pH 7,4 - Tripsina EDTA (IX)

Sonda fluorescente:

Diacetato de 6-carboxi-2',7'-diclorodi-hidro-fluoresceína, di (éster de acetoximetilo) (PM. 675,43)

Produtos de estímulo das células: - Peróxido de hidrogénio (H2O2) 3%: Ref. Gifrer (Laboratório Gifrer Barbezat) -Sulfato de amónio ferroso (Fe2+) -Sulfato de amónio férrico (Fe3+) d) Produtos testados:

As concentrações testadas são concentrações não citotóxicas. A citotoxicidade foi realizada pelo método do vermelho neutro, após incubação do produto durante 3 horas. 0 produto antirradicalar de referência é a vitamina E ou a tocoferol (PM: 430,7) (SIGMA, referência: T-1539) A solução-mãe é preparada a 400 mg/ml em DMSO e conservada a -20°C. A solução do pré-tratamento é preparada extemporaneamente a 400 pg/ml em meio de cultura, sem SVF.

Para a avaliação dos derivados de hidroxiácidos gordos insaturados, as diluições são preparadas em meio de cultura extemporaneamente, para uma faixa de concentrações de 0,02, 0,2, 2 e 20 ng/ml. e) Protocolo:

Inseminação das células:

As células da linhagem de fibroblastos L929 são inseminadas em microplacas de 96 poços de fundo chato em 100 1-11 de DMEM suplementado de 10% de SVF, depois elas são incubadas durante uma noite a 37°C em atmosfera húmida a 5% de CO2. O branco de placa sem células é avaliado sobre 6 poços. Pré-tratamento das células:

As diluições dos produtos a testar e molécula de referência são realizadas no meio de cultura sem SBF, depois depositadas em 7 poços à razão de 100 μΐ por poço.

As células são então incubadas durante 3 horas a 37°C em atmosfera húmida a 5% de CO2.

As células "Testemunha" (fluorescência natural das células), "Controlo" (produção basal de EAO) e "Estimuladas" (produção de EAO após tratamento oxidante) são recobertas com 100 μΐ de DMEM.

As células "Controlo" são incubadas com a sonda, mas não são nem pré-tratadas, nem tratadas.

As células "Estimuladas" são incubadas com a sonda e são tratadas, mas não pré-tratadas.

As células "Testemunha" não são nem pré-tratadas, nem incubadas com a sonda, nem tratadas.

Incubação das células com a sonda e stresse oxidante:

As células são enxaguadas com PBS IX à razão de 100 μΐ por poço. Depois colocadas para incubar durante 30 minutos a 37°C em atmosfera húmida a 5% de CO2 com 50 μΐ de sonda H2DCF-DA 5 μΜ.

Após 30 minutos em contacto com a sonda sozinha, as células são colocadas para incubar durante 30 minutos a 37°C em atmosfera húmida a 5% de CO2 com um acréscimo de 25 μΐ de H2O2 800 μΜ e 25 μΐ de solução de ferro ferroso e férrico 8 mM, para ter concentrações finais de 200 μΜ de H2O2 e 2 mM de ferro ferroso e férrico.

As células são em seguida enxaguadas com PBS IX à razão de 100 μΐ por poço, depois incubadas durante 30 minutos a 37°C em atmosfera húmida a 5% de CO2 com 100 μΐ de PBS IX.

Essa 1 hora e 30 minutos de incubação a 37°C permite que as esterases intracelulares desacetilem a sonda em H2DCF, oxidável pela EAO intracelular em DCF: composto fluorescente cuja formação é proporcional à quantidade de EAO intracelulares. A intensidade de fluorescência é lida no citofluorímetro com Àexcitação= 485 nm e Àemissão= 530 nm. Ela reflete a quantidade de EAO intracelulares produzida. O esquema do protocolo de estudo é mostrado na

Figura 1.

Cálculo da percentagem de proteção contra a produção de EAO intracelulares. A relação abaixo permite calcular para cada concentração de produto testado, a % de proteção contra a produção de EAO intracelular (já que a intensidade de fluorescência ou IF expressa a libertação intracelular de EAO) .

[IF Oxidante (H?0?/Ferro)-IF (Oxidante+Produto)1 x 100 IF Oxidante (H202/Ferro)-IF Controlo

Os valores indicados na tabela acima são as percentagens de inibição de produção de EAO intracelular como consequência de um stresse oxidante exógeno, em relação às células "testemunha" (100%) e às células "estimuladas" (0%).

As percentagens médias de proteção, para as 13 moléculas testadas com 4 concentrações sobre a linha L929 são apresentadas na tabela/abaixo.

Tabela 1: Análise da proteção contra a produção intracelular de EAO para as 13 moléculas derivadas de hidroxiácidos gordos insaturados: Percentagem de inibição da produção intracelular de EAO

Pré-incubação: 3 horas

Números de testes = 3 para todos os compostos Números de testes = 18 para a vitamina E + In vitro, na escala celular, um stresse exógeno por H2O2/Fe2+-Fe3+ é capaz de induzir uma produção de EAO intracelulares detectadas com o auxilio da sonda fluorescente .

Em conclusão, os derivados de hidroxiácidos gordos insaturados com curtas cadeias (C9 e CIO) e não fluorados parecem ser mais particularmente ativos na proteção celular antirradicalar.

Estudo do efeito antirradicalar. Análise da peroxidação lipídica

Por outro lado, durante o metabolismo celular normal, quando disposição ocasional da pele a agentes stressantes ou no decorrer de patologias dermatológicas, espécies oxigenadas reagentes ainda denominadas radicais livres oxigenados (RLO) são geradas (Y. M. W. Janssen et al, 1993) . Esses RLO, descritos como metabólicos muito reagentes, exercem um papel importante em bom número de processos, tais como a inflamação, ou envelhecimento e a promoção tumoral.

Os RLO são considerados como as "segundas mensagens" na sinalização celular do stresse oxidante e, portanto, como os mediadores precoces de inflamação (A. Van Der Vliet e A. Bast, 1992).

Sua superprodução induz importantes danos no meio da célula. Certos constituintes celulares são então alvos maiores desse stresse oxidante: os componentes lipídicos da membrana plásmica (lipoperoxidação), as proteínas (desnaturação e degradação) e o material genético ou ADN (mutações) podem ser alterados. As células são capazes de limitar esses danos oxidantes, graças a diferentes sistemas de defesa antirradicalar (antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos) (B. P. Yu, 1994; H. Steiling et al, 1999) .

Todavia, em certas condições, os RLO são produzidos em quan- tidade tal que a atividade antioxidante celular é insuficiente; esses RLO se tornam então fatores indutores de patologias inflamatórias e envelhecimento tecidular (Y. Miyachi et al, 1986; M. Kress et al, 1995). A fim de valorizar a atividade antirradicalar dos diferentes derivados hidroxilados, de acordo com a invenção, analisa-se seu poder face à alteração das membranas celulares induzida por um stresse oxidante (químico), em comparação a um antioxidante de referência, a vitamina E. A membrana plásmica constitui o principal e o primeiro alvo dos RLO e, sendo rica em lípidos, ela é o local de uma peroxidação aumentada (A. W. Girotti, 1985). Os peróxidos gerados durante essa oxidação lipídica são também muito reativos e capazes de degradar o material proteico e genómico.

Para avaliar a alteração membranária, mede-se a peroxidação lipídica por uma dosagem in vitro dos complexos entre os produtos de oxidação lipídica e o ácido tiobar-bitúrico. Esses complexos são denominados TBARS (para Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico ("Thiobarbituric Acid Reactive Substances") ) e dão o nome ao teste: Teste das TBARS. A fim de mimetizar um stresse oxidativo químico, trata-se a linha de fibroblastos, L929, por um complexo composto de peróxido de hidrogénio (H2O2) e de ferro (Fe2+/Fe3+) reconstituindo assim a reação de Fenton, fonte de RLO e mais particularmente de radical hidroxilo (0H°)(D.A Vessey et al, 1992): H2O2 + Fe2+ -d· 0H° + OH' + Fe3+.

Os produtos foram avaliados sobre a linhagem de fibroblastos murinos L929. As células são pré-tratadas com as diferentes concentrações de produtos durante 16 horas e são em seguida estimuladas com o complexo H2O2-Fe2+/Fe3+ (200 pm-l mM) durante 1 hora.

Soluções-mães: 100 mg/ml, etanol, 4°C.

Soluções finais: 0,02 ng/ml. A peroxidação dos lipidos membranários é analisada, medindo-se as TBARS (Protocolo Ref. PL n° 2, segundo Morliére et al, 1991).

Principio do teste:

Em meio ácido, a 95°C, formam-se complexos, anotados com TBARS para substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico, entre os produtos de oxidação lipidicos (malondialdeido ou MOA) e o ácido tiobarbitúrico (TBA) gue podem ser dosados em fluorescência em relação a uma faixa de aferição com MDA. A dosagem das TBARS é então expressa em pmol/pg de proteínas. As proteínas e TBARS são dosadas no meio intracelular.

Cálculo da percentagem de proteção das membranas celulares: A partir do cálculo das TBARS em pmol/pg proteínas, calcula-se a eficácia protetora dos diferentes produtos contra a oxidação dos lipidos membranários.

Quatro experiências independentes foram realizadas. Durante essas experiências, diversos compostos foram avaliados (o teste não permite avaliar mais de 10 moléculas ao mesmo tempo). Os compostos avaliados várias vezes foram escolhidos em função dos resultados obtidos no outro teste, medindo também uma atividade antirradicalar (teste de dosagem das espécies ativas do oxigénio, EAO).

O modelo utilizado nessa experiência (reação de Fenton) induz uma peroxidação lipidica importante nos fibroblastos L929. Essa descarga maciça de radical hidroxilo OH° gera, portanto, um stresse oxidante ao nivel celular e nomeadamente ao nivel das membranas. Todavia, nesse tipo de reação oxidante, os produtos oriundos da peroxidação lipidica são internalizados nas células e TBARS são então dosadas no meio intracelular. A vitamina E a 400 J.Jg/ml diminui a peroxidação lipidica induzida pelo complexo H2O2_Fe2+/Fe3+ e protege muito eficazmente as membranas celulares.

Na tabela II, são apresentados os resultados das quatro experiências

Parece claramente que esses derivados hidroxi-lados têm uma atividade antioxidante estável e reprodutível. Trata-se particularmente de derivados com cadeia curta de carbonos.

Tabela II: proteção dos lípidos membranários pelos diferentes derivados hidroxilados.

0 modelo in vitro apresentado nesse estudo reflete as consequências devido a um stresse oxidante maior sobre o principal alvo celular que é a membrana plásmica. Assim, a dosagem da peroxidação lipídica constitui um bom marcador do stresse oxidante e permite a avaliação da ação antioxidante, face ao radical hidroxilo, de princípios ativos ao nível da membrana celular. A vitamina E, molécula antioxidante, permite a validação desse modelo e protege eficazmente as membranas celulares do stresse oxidante.

Diferenciação gueratinocitária

Enfim, a epiderme participa da função principal da pele, que é de resistir ao meio ambiente e de protegê-la. É um epitélio estratificado cornificado escamoso em perpetua renovação. A homeostasia e a regeneração tecidulares baseiam-se nas células queratinocitárias, as células de sustentação, os fatores solúveis, a proximidade celular favorecendo as interações das células entre elas e com as matrizes extracelulares. 0 stratum corneum, último estágio da diferenciação epidérmica, resulta de três processos maiores: formação de filamentos de queratina, "cornificação" do queratinócito e formação do cimento lipídico intercelular organizado em estruturas lamelares.

No meio da epiderme, a composição e a natureza dos lipidos variam em função do estado de diferenciação no qual se acham os queratinócitos. Assim, quando da passagem dos equilíbrios basais nas células da camada córnea, observa-se uma redução importante dos fosfolipidos que, nas camadas vivas são responsáveis pela integridade das membranas plásmicas; paralelamente, nota-se um aumento dos lipidos neutros (ácidos gordos livres e triglicerideos) e esteróis (colesterol), assim como um aumento muito grande dos esfingolipidos e notadamente das ceramidas. Ao nivel da camada córnea, são encontrados 40 a 50% de esfingolipidos, 20 a 27% de colesterol e 9 a 26% de ácidos gordos livres. As ceramidas intervêm de maneira covalente com os residuos glutâmicos da involucrina, precursor do envoltório córneo. Os ácidos gordos, graças ao seu caráter hidrófobo, participam do controle da impermeabilidade cutânea, o colesterol intervindo na fluidez membranária.

Numerosas proteínas especificas da camada córnea ou stratum corneum, (camada que confere a função de barreira à epiderme), são produzidas no nivel da camada granulosa composta dos últimos queratinócitos a apresentar uma atividade transcricional ou traducional antes da lise nuclear que acompanha a cornificação. O programa de diferenciação dos queratinócitos é maioritariamente eixado sobre a evolução de proteínas de estrutura que são as queratinas e que contribuem para a integridade da arquitetura da epiderme. Sua expressão varia em função do grau de maturação das células epidérmicas. Nas camadas suprabasais aparecem a queratina 1 básica e a queratina 10 ácida, ditas queratinas de diferenciação terminal.

Nas proximidades da camada córnea, as queratinas interagem com proteínas ricas em histidina para formar uma mistura relativamente homogénea que enche os corneócitos. Essas proteínas derivam de um precursor, a profilagrina que é uma grande molécula ([PM]>450 kDa) armazenada no nivel da camada granulosa. É uma proteina, cujos dominios N e C terminais ligam o cálcio e cuja desfosforilação e uma proteólise parcial dão a filagrina. Esta catalisa a formação de pontes dissulfureto entre os filamentos de queratina e contribuem para sua integração no meio da matriz intracorneocitária. Por outro lado, ela é a fonte, por proteólise, de um conjunto de aminoácidos e de derivados peptidicos que conferem à camada córnea certas capacidades de retenção hidrica.

Na camada córnea, os corneócitos contêm essencialmente filamentos de queratina inseridos numa matriz densa, o todo envolvido por uma parede proteica espessa e resistente: o envólucro da córnea. As proteínas precursoras dessa estrutura, apostas à face interna da membrana piás-mica, são sintetizadas pelos queratinócitos a partir da camada espinhosa, mas suas pontes sob a ação de enzimas, as transglutaminases, são feitas entre as camadas espinhosas e granulosas. Numerosas proteínas citosólicas, associadas à fração membranária dos queratinócitos ou armazenadasnos grãos de querato-hialina, participam da elaboração do envoltório da córnea. Pode-se assim distinguir a involu-crina (68 kDa}, rica em glutamina e lisina. A impermeabilidade da camada córnea é devido, na maior parte, a um cimento intercelular lipídico hidrófobo que reúne os corneócitos. 0 conteúdo lipídico da epiderme é o resultado final da lipogénese queratinositária e sebácea. Na epiderme normal, uma mistura de lípidos neutros e polares predomina nas camadas profundas para ser progressivamente substituída por um conteúdo mais apoiar, incluindo ceramidas. Numerosas proteínas participam dessa lipogénese, e, portanto, da síntese das ceramidas. Dentre elas, a proteína DES2 (esfingolípido C4-hidroxilase/delta-4 desaturase) foi colocada em evidência: ela possui uma atividade de di-hidro ceramida hidroxilase que intervêm na síntese das fitoceramidas e sua expressão é induzida com a diferenciação (MIZUTANI Y. et al, 2004) . Os lípidos sintetizados pelos queratinócitos são encaminhados à superfície pelos corpos lamilares, os queratinosomas. Eles são secretados nos espaços intercelulares e se organizam folhados contínuos alinhados paralelamente às membranas celulares dos corneócitos. Essa reorganização lipídica, que sobrevém no decorrer da diferenciação epidérmica, faz intervir um certo número de transportadores lipídicos da família dos transportadores ABC ("Adenosine Triphosphate Bin- ding Cassette transporter" ou transportador de cassete de ligação de adeno- sina trifosfato). Dentre esses transportadores, determinados deles vêem sua expressão induzida no decorrer da diferenciação queratinocitária (ABCC 1, ABCC1, ABCC3, ABCC4, e ABCG1), outros vêem sua expressão reprimida (ABCB9 e ABCD1) e os outros não sofrem nenhuma regulagem. 0 papel dos transportadores, cuja expressão é induzida, foi colocado em evidência: ABCG1 é, por exemplo, implicado na translocação do colesterol nos queratinócitos em diferenciação. A expressão de certos membros de uma outra familia de transportadores, aquela das FATP ("Fatty Acid Transport Protein" ou proteina de transporte de ácido gordo), tais como FATP1, FATP3, FATP4 e PATP5 é induzida no decorrer da diferenciação queratino-citária. Esses transportadores seriam implicados na reorganização do pool de lipidos neutros (KIELAR et ai, 2003) .

Os queratinócitos humanos normais (NHK) proliferam e se diferenciam in vítro, formando camadas estratificadas mimetizando a organização basal da pele. Concentrações extracelulares em cálcio superiores a 0,1 mM iniciam uma cascata de acontecimentos genómicos e não genó-micos que conduz os queratinócitos de uma fase de proliferação para uma fase de diferenciação. A diferenciação dos queratinócitos pode então ser avaliada pelo estudo da expressão de vários marcadores tais como as queratinas 1 e 10, a transglutaminase 1, a desaturase DES2, a involucrina, os transportadores FATP4 e ABCG1. Avalia-se assim em um modelo de cultura in vítro o efeito de certos ácidos hidroxialcenocarboxilicos. O plano do estudo pode ser esquematizado conforme ilustrado na Figura 2: diferenciação dos NHK in vítro e retiradas para análise.

Condições de cultura e de retirada.

Os queratinócitos humanos normais (NHK) são isolados a partir de explantes de pele. Eles são cultivados em um meio KSFM (Gibco) com baixo teor em cálcio (0,1 mM) contendo 25 pg/mL de BPE (Extrato Pituitário Bovino ("Bovin Pituirary Extract")) e 1,5 ng/ml de EGF (Fator de Crescimento do Eptélio ("Epithelium Growth Factor")). Vinte e quatro horas, após inseminação, a diferenciação é induzida pelo acréscimo de cálcio (concentração final de 1,2 mM) . Os princípios ativos são acrescentados ou não ao mesmo tempo que o cálcio a concentrações de 100 e 1 pg/mL, a fim de determinar se têm um efeito de potencialização da diferenciação. As células são então analisadas 48 horas após o acréscimo do cálcio e dos produtos.

Extração dos ARNs e RT-PCR em tempo real.

Os ARNs totais são extraídos a frio a partir dos queratinócitos.

Após transcrição inversa dos ARNs em cDNA, as PCRs são realizadas em placa de 96 poços (aparelho com PCR quantitativa iCycler, BioRad). A expressão dos transcritos

da transglutaminase, da desaturase (DES2), ABCG1 e FATP4 é normalizada em relação à expressão de genes de referência (GAPDH, UBC, HPRT). Os níveis de expressão das amostras tratadas pelo cálcio e o princípio ativo são comparados nos níveis de expressão das amostras tratadas unicamente pelo cálcio.

Os resultados dos efeitos dos produtos a 1 pg/mL estão consignados nas tabelas a seguir:

A dose de 1 pg/mL, o conjunto dos produtos tem um efeito moderado sobre a expressão dos marcadores de diferenciação.

Efeitos dos produtos a 100 pg/mL.

A vitamina D3 10 μΜ induz a expressão dos transcritos da transglutaminase 1, OES2, e ABCGl de um fator 8,3, 11,1 e 3,1 respectivamente em relação à testemunha tratada unicamente pelo cálcio. A expressão FATP4 ao contrário não é modulada pelo tratamento com vitamina D3. O efeito de potencialização da diferenciação foi, portanto, demonstrado a propósito dos derivados de hidroxiácidos gordos insaturados, de acordo com a invenção.

Efeito anti-inflamatório analisado no nivel dos mediadores lipidicos de inflamação. O gueratinócito, célula a mais representada ao nível da epiderme, liberta, em resposta a numerosos fatores extracelulares presentes em seu ambiente, mediadores biologicamente ativos, notadamente prostaglandinas e os leucotrienos que exercem um papel importante na iniciação e na modulação das reações inflamatórias cutâneas e que intervêm também na regulagem da resposta imune. A prostaglandina PG6KF 1 alfa é um dos me- tabólitos maiores produzidos pelo queratinócito estimulado, e representativo da modulação da produção dos metabólitos do metabolismo do ácido araquidónico oriundos da via da ciclo-oxigenase. PROTOCOLO: A suspensão de queratinócitos no OMEM a 10% de SVF é distribuída nas placas de 6 poços (1,2. 106 células/poços), e incubada durante 16 horas a 37°C em uma atmosfera a 5% de CO2. Os queratinócitos são então enxaguados com PBS para eliminar as células não aderentes, depois expostos aos produtos a testar incluídos em OMEM sem SVF (que poderia interferir na dosagem). A concentração testada em cultura é de 3 pg/ml. Ela foi retida após um teste preliminar de avaliação da citotoxicidade (vermelho neutro) e não é citotóxica.

Para cada tratamento, 3 poços são realizados. As células são pré-incubadas durante 60 minutos com os produtos a testar, depois um agente estimulante da cascata do ácido araquidónico, o ionóforo cálcico é acrescentado

durante 5 horas: o ionóforo cálcico A23187 é utilizado à concentração de 1 M.

Após essas 5 horas de cultura, os meios de cultura de cada um dos poços são recuperados, centrifugados a 3000 rpm e conservados a -80°C. A produção de prostaglandina 6KF la para cada um dos testes extras por Kit Elisa EUROMEDEX. RESULTADOS:

Os resultados são expressos em percentagem de atividade/controlo estimulado.

Propriedade anti-inflamatória: Inibição da síntese de uma citoquina pró-inflamatória IL8 A função da barreira da pele permite assegurar uma proteção face ao meio ambiente externo, e os querati-nócitos da epiderme podem diretamente responder a uma larga variedade de agentes irritantes ou alergénios e participar ativamente dos processos inflamatórios e imunitários cutâneos, em particular através da geração de citoquinas pró-inflamatórias, mediadoras de origem proteica. Dentre essas moléculas biologicamente ativas, a ILla (interleucina la) e o TNFa (Fator de Necrose de Tumor a ("Tumor Necrosis Factor a)) são consideradas como citoquinas primárias, sua libertação sendo suficiente para induzir a inflamação em virtude de sua indução de moléculas de adesão ao nível das células endoteliais e de sua indução de fatores quimio-táticos, tais como as quimiocinas. 0 sistema das quimio-cinas controla o tráfego leucocitário durante a resposta inflamatória e é necessário às interações das respostas inatas e adaptativas.

No presente estudo, houve interesse especifi-camente em quimiocina-interleucina 8 que é fortemente implicada na ampliação da resposta inflamatória e cuja função principal é de recrutar e ativar os polinucleares neutrófilos notadamente estimulando sua libertação de moléculas pró-inflamatórias.

Nesse estudo, feito sobre placas de 96 poços, avalia-se a atividade dos hidroxiácidos-alcenos, sobre a produção de interleucina 8 induzida ao nivel do queratinócito pelo forbol éster PMA e o ionóforo cálcico A23187 . PROTOCOLO: A suspensão dos queratinócitos no KSFM complementado é distribuída em placas de 96 poços (3.104 células/poços), e incubada durante 16 horas a 37°C em uma atmosfera a 5% de CO2. Os queratinócitos são então enxaguados com PBS para eliminar as células não aderentes, depois expostos aos produtos a testar incluídos em KSFM não complementado (que poderia interferir na dosagem). A concentração testada em cultura é de 3 pg/ml. Ela foi retida após um teste preliminar de avaliação da citotoxicidade (vermelho neutro) e não é citotóxica.

Para cada tratamento, 3 poços são realizados. As células são pré-incubadas durante 60 minutos com os produtos a testar, depois estimuladas, paralelamente a controles negativos sem estimulantes: Forbol Miristato Acetato (PMA) 1 μΜ + Ionóforo cálcico (A23187) 0,1 μΜ.

Incubação durante 6 horas a 37°C em atmosfera húmida de ar contendo 5% de CO2.

Os meios de cultura de cada um dos poços são recuperados, centrifugados a 3000 rpm e conservados a -80°C.

Dosagem das citoquinas: A IL8 é dosada por um método imunoenzimático em Kit ELISA (Immunotech). RESULTADOS:

Os resultados são expressos em percentagem de atividadeJcontrole estimulado.

Os compostos, de acordo com a invenção, foram avaliados em termos de atividade anti-inflamatória sobre a

libertação de interleucina 8 pelos queratinócitos humanos NHK estimulados por forbol éster PMA + o ionóforo cálcico A23187 .

Três experiências independentes foram feitas: a síntese dos dados obtidos permite colocar em evidência as potencialidades anti-inflamatórias, em particular dos dois seguintes compostos:

- n = 13, R= Rn =H, Ri =F

- N = 13, R = Rn = R1 = H

Para a concentração avaliada para cada uma das moléculas e após cálculo das Doses Eficazes 50, os presentes resultados mostram o que se segue:

Inflamação e prurido: Análise do fluxo cálcico em consequência do estímulo dos receptores PAR2 O receptor "receptor-2 ativado com protease (PAR-2)" é associado à fisiopatologia de várias doenças, implicando respostas inflamatórias. 0 PAR-2 é expresso pelos diferentes tipos celulares da pele: queratinócitos, células mioepiteliais das glândulas sudoríparas, folículo piloso, células do tipo dentríticas da derme e as células endoteliais da lâmina própria e da derme (Steinhoff et al., 1999; Santulli et al., 1995). Os melanócitos não expressam esse receptor (Seiberg et al., 2000), embora o PAR-2 exerça um papel importante na pigmentação, favorecendo a transferência da melanina dos melanócitos para os queratinócitos (Sharlow et al., 2000).

As serina-proteases geradas pela epiderme exercem efeitos quimiotáticos induzindo o recrutamento dos leucócitos na pele. Elas são também implicadas na regulagem da homeostasia, da mitogénese, e da diferenciação epidérmicas e modulam a função de barreira da pele. Além disso, as serina-proteases contribuem para a fisiopatologia de doenças cutâneas ligadas à inflamação, à defesa do hospedeiro, à cancerogénese, à fibrose e ao estímulo nervoso.

As propriedades fisiológicas e fisiopatológicas cutâneas das serina proteases seriam em parte ligadas aos receptores PARs. Com efeito, os receptores PAR-2 são superexpressos na epiderme, na derme e nos vasos das doenças inflamatórias da pele como a dermatite atópica, o líquen plano e a psoríase (Steinhoff et al., 1999) . Os receptores PAR-2 exerceriam também um papel no desenvolvimento do prurido em pacientes atacados de dermatite atópica (Steinhoff et al., 2003). A ativação da PAR-2 por uma protease de tipo tripsina induz a produção de IL-8 a partir de queratinó-citos (HaCaT) (Hou et al., 1998). Mais recentemente, foi demonstrado que a IL-8, quimiocina quimioatrativa para os leucócitos, permitiria a infiltração dos neutrófilos na epiderme de pacientes atacados de Psoriasis vulgaris (Iwakiri et al., 2004) . A sinalização intracelular do receptor PAR-2 está sustentada para a parte por uma mobilização de cálcio intra e extracelular. A presente invenção propõe-se portanto, a avaliar a atividade anti-PAR-2 dos derivados hidroxi- ácidos de fórmula I, sobre o influxo de cálcio intracelular induzido após estímulo específico por receptores PAR-2 e tripsina presentes sobre os queratinócitos humanos oriundos de uma linha (HaCaT) .

Essa técnica é baseada na utilização de uma sonda fluorescente esterificada por um grupamento AM, que facilita sua penetração por difusão passiva na célula. A sonda utilizada é o Fluo-4/ΑΜ. Só a forma desesterifiçada e ligada aos iões cálcio é excitável em fluorescência (a 485 nm) e emite a 535 nm.

Percentagem de inibição do fluxo cálcico induzido pela tripsina

Estimulo pela tripsina

Sobre os queratinócitos oriundos de uma linhagem (HaCaT):

Os derivados hidroxiácidos de fórmula geral (I), mencionados na tabela acima, apresentam uma atividade sobre a inibição do fluxo cálcico induzido pela tripsina, a uma concentração de 10 μ/ml para o primeiro, e a uma concentração de 100 pg/ml para os dois compostos seguintes .

In vitro, na escala celular, o estímulo específico dos receptores PAR-2 pela tripsina leva a uma mobilização de cálcio intra e extracelular detetada com o auxílio da sonda fluorescente.

Nas condições experimentais e nas concentrações testadas, os compostos de fórmula geral (I) mencionados na tabela acima modulam, de forma significativa, a atividade anti-PAR-2.

Efeito dos derivados de hidroxiácidos gordos sobre a síntese de melanina in vitro

Os melanócitos são células de aspecto estrelado presentes em minoria na camada basal da epiderme. Sua função principal é assegurar a melanogênese, processo pelo qual a melanina é sintetizada em organitos especializados, os melanossomas, depois transportada e distribuída nos queratonócitos vizinhos via seus prolongamentos dendríti-cos. Esse contato com os queratinócitos permite a pigmen-ação cutânea, mecanismo de proteção da epiderme contra os efeitos mutagénicos dos raios ultravioletas. Cada melanó-cito está em relação com aproximadamente trinta e seis queratinócitos, formando assim uma "unidade epidérmica de melanização". A melanogênese consiste em uma série de reações enzimáticas espontâneas, cujo precursor é a tirosina. Três enzimas principais participam desse processo: a tirosi-nase, e as proteinas 1 e 2 relacionadas com tirosina se 1 e 2 (TRP 1 e 2) (1). A tirosinase catalisa a transformação da tirosina em dopaquinona. A partir dai, duas vias de sintese são então possíveis: a eumelanogénese e a feomelanogénese. A conversão de dopaquinona em eumelanina é feita por uma série de reações sucessivas de oxidações, fazendo intervir TRP-1 e TRP-2. A eumelanina corresponde ao pigmento castanho-escuro com baixo teor em enxofre, e assegura o poder fotoprotetor. Na feomelanogénese, moléculas com forte teor em enxofre se incorporam à dopaquinona para dar a feomelanina, de cor amarelo-alaranjada, apresentada nas peles dos sujeitos ruivos. 0 estimulo fisiológico da sintese de melanina é o sol, o que acarreta um aumento no número dos melanócitos, uma neossintese de melanina, e modificações morfológicas dos melanócitos, associando um aumento de sua dendricidade a um aumento da transferência dos melanos- somas para os queratinócitos. No nivel molecular, a exposição ao sol estimula a sintese e a secreção da hormona estimulante de alfa melanócito. 0 α-MSH aumenta a concentração intramelanocitária em AMPc, ativando o fator de transcrição, Mitf, que estimula por sua vez a atividade transcricional dos genes codificando para a tirosinase, TRP-1 e TRP-2.

Certas moléculas exógenas são também conhecidas por regularem negativamente a melanogénese. A hidroquinona inibe a síntese de melanina, apresentando-se como substrato da tirosinase, a fim de desviar sua atividade. 0 efeito modulador dos derivados de hidroxi- ácidos gordos insaturados, sobre a melanogénese foi analisado. Para isso uma medida da síntese de melanina por dosagem colorimétrica é feita sobre uma linha celular de melanomas murinos: a linham B16-F10. 0 efeito dos produtos é investigado em situação basal e após estímulo da melanogénese por MSH para determinar o poder de despigmentação.

Dosagem da melanina A taxa de melanina extracelular e intracelular é então medida por espectrofotometria a um comprimento de onda de 405 nm, segundo o protocolo (Anob et al, 1999) . A quantidade de pigmento é determinada graças a uma faixa de aferição de melanina e a análise sobre o Soft Microwin (Berthold Biotechnologies) . Uma dosagem de proteínas totais é feita para as amostras de melanina intracelular pelo método BCA-Copper a 540 nm. A faixa de aferição é feita com uma proteína padrão, a BSA (albumina de soro bovino). RESULTADOS:

Em situação basal a alfa MSH 1 M aumenta de 100% da produção da melanina em relação às células controle.

Esse aumento de melanina é combatido pelos agentes de despigmentação, tais como a hidroquinona a 1 g/ml ou a vitamina C a 40 g/ml, que inibem em 60% a ação do alfa MSH.

Em situação basal a 30 g/ml: - o composto de fórmula geral 1 com n = 10, R=Rn=H, Rx=F inibe de 30 a 40% da sintese de melanina, enquanto que, em presença de alfa MSH, esse mesmo composto a 30 g/ml acarreta uma inibição de 45 a 60%. o composto de fórmula geral 1 com n=10, R=R1=Rn=H a 30 g/ml apresenta uma atividade menor do que o composto precedente, 15% de inibição em situação basal, enquanto que em presença de alfa MSH o potencial de inibição desse composto em relação a essa substância melanotrópica é similar ao do composto precedente, isto é, de 45 a 60%. A 10 g/ml a atividade inibidora desses 2 ácidos sobre a indução da melanogénese por alfa MSH é da ordem de 35%.

Lisboa, 30 de dezembro de 2014

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Derivados hidroxiácidos gordos insaturados correspondentes à fórmula geral (I) :

na qual: - Rn representa independentemente uns dos outros H ou um grupo alquilo, linear ou ramificado, compreendendo de 1 a 6 átomos de carbono e sendo eventualmente substituído por um átomo de halogéneo, em particular de flúor; - Rx representa H, F, Cl, Br ou CF3; - R representa H, e - 3<n<14 com a condição de que, contudo, quando n^lO, pelo menos um dos radicais R3 e Rn não representa hidrogénio.
2. Derivados de hidroxiácidos gordos insaturados de fórmula geral (I), de acordo com a reivindicação 1, na qual: - Rx representa F, Cl, Br ou CF3.
3. Derivados hidroxiácidos gordos insaturados de fórmula geral (I), de acordo com a reivindicação 1, na qual: - 6<n<14.
4 - Derivados hidroxiácidos gordos insaturados de fórmula geral (I), de acordo com a reivindicação 1, na qual: - Ri representa F, Cl, Br ou CF3; - Rn=H.
5. Derivados de hidroxiácidos gordos insaturados de fórmula geral (I), de acordo com a reivindicação 1, na qual: - Rx representa F, Cl, Br ou CF3; e - pelo menos um dos radicais Rn representando um grupo alquilo, linear ou ramificado, compreendendo de 1 a 6 átomos de carbono e sendo eventualmente substituído por um átomo de halogéneo, em particular de flúor.
6. Derivados de hidroxiácidos gordos insaturados de fórmula geral (1), de acordo com as reivindicações 1 ou 2, na qual: - Ri=F, - Rn=H.
7. Derivados de hidroxiácidos gordos insaturados de fórmula geral (I), de acordo com a reivindicação 6, na qual: - Ri=F, - Rn=H, - n=13.
8. Derivados de hidroxiácidos gordos insaturados de fórmula geral (I), de acordo com a reivindicação 2, na qual: - Ri=F, - Rn=H, - n=6.
9. Derivados de hidroxiácidos gordos insaturados de fórmula geral (I), de acordo com a reivindicação 1, na qual: - R=Rx=H - um único dos radicais Rn representa um grupo metilo, sendo os outros átomos de hidrogénio, e - n=4 .
10. Derivados de hidroxiácidos gordos insaturados de fórmula geral (I), de acordo com a reivindicação 1, na qual: Ri-Rn-H, e - n=10
11. Derivados de hidroxiácidos gordos insatu-rados de fórmula geral (I), de acordo com a reivindicação 2, na qual: - Ri=F, - Rn=H, e - n=10.
12. Derivados de hidroxiácidos gordos insatu-rados de fórmula 10 geral (I), de acordo com a reivindicação 2, caracterizados pelo fato de que: - Ri=F, - Rn=H, e - n=8 .
13. Composições dermocosmetológicas compreendendo um derivado de hidroxiácido gordo insaturado de fórmula geral (I), de acordo com uma das reivindicações 1 a 12, associado com um excipiente dermatologicamente aceitável.
14. Utilização de um derivado de hidroxiácido gordo insaturado de fórmula geral (I), de acordo com uma das reivindicações 1 a 12, para a produção de uma

composição dermocosmetológica destinada ao tratamento dos distúrbios da pigmentação.
15. Utilização de um derivado de hidroxiácido gordo insaturado de fórmula geral (I), de acordo com uma das reivindicações 1 a 12, para a produção de uma composição dermocosmetológica destinada ao tratamento do envelhecimento cutâneo e das manchas de envelhecimento branca ou castanhas.
16. Utilização de um derivado de hidroxiácido gordo insaturado de fórmula geral (I), de acordo com uma das reivindicações 1 a 12, para a produção de uma composição dermocosmetológica destinada a provocar um clareamento da pele.
17. Utilização de um derivado de hidroxiácido gordo insaturado correspondente à fórmula geral (I):

(0 na qual: - Rn representam independentemente uns dos outros H ou um grupo alquilo, linear ou ramificado, compreendendo de um a seis átomos de carbono e sendo eventualmente substituído por um átomo de halogéneo, em particular de flúor;

- Ri representa H, F, Cl, Br ou CF3; - R representa H ou um grupo alquilo, linear ou ramificado, compreendendo de um a seis átomos de carbono e sendo eventualmente substituído por um átomo de halogéneo, em particular de flúor, e - 3<n<14, para a produção de uma composição dermocosme-tológica com atividade antirradicalar, anti-inflamatória, antipruriginosa e/ou destinada ao tratamento dos distúrbios da queratinização e/ou a melhorarar a cicatrização.
18. Utilização de um derivado de hidroxiácido gordo insaturado correspondente à fórmula geral (I):

(0 na qual: - Rn representam independentemente uns dos outros H ou um grupo alquilo, linear ou ramificado, compreendendo de um a seis átomos de carbono e sendo eventualmente substituído por um átomo de halogéneo, em particular de flúor; - Rx representa H, F, Cl, Br ou CF3; - R representa H ou um grupo alquilo, linear ou ramificado, compreendendo de um a seis átomos de carbono e sendo eventualmente substituído por um átomo de halogéneo, em particular de flúor, e - 3<n<14, para a produção de uma composição dermocosmeto-lógica ao tratamento dos distúrbios da psoríase, do prurido e/ou da dermatite atópica. Lisboa, 30 de dezembro de 2014