BRPI0618009A2 - método para produzir um produto alimentìcio à base de carne, uso de uma fosfolipase, e, produto alimentìcio à base de carne - Google Patents
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Abstract
<b>MéTODO PARA PRODUZIR UM PRODUTO ALIMENTìCIO à BASE DE CARNE, USO DE UMA FOSFOLIPASE, E, PRODUTO ALIMENTìCIO à BASE DE CARNE<d>.A presente invenção se refere a um método para produzir um produto alimentício à base de carne através do tratamento da carne com uma fosfolipase, a um produto alimentício à base de carne obtido através do método da invenção e ao uso de uma fosfolipase para produzir um produto alimentício à base de carne.
Description
"MÉTODO PARA PRODUZIR UM PRODUTO ALIMENTÍCIO À BASEDE CARNE, USO DE UMA FOSFOLIPASE, E, PRODUTOALIMENTÍCIO À BASE DE CARNE"CAMPO TÉCNICO
A presente invenção se refere a um produto alimentício à basede carne produzido através do tratamento da carne com uma fosfolipase e ummétodo para produzir o mesmo.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Carne contém gordura e em produtos alimentícios à base decarne é desejado que a gordura esteja estável no produto de forma que a perdade gordura, por exemplo durante o cozimento, seja mantida num nível baixo,e a quantidade de gordura livre visível seja reduzida. Em produtos com carneemulsificada, emulsificadores podem ser adicionados para alcançar estesefeitos. Adicionalmente é desejado que a perda do sumo da carne seja baixa eque o sabor, textura e aparência seja desejável.
É bem conhecido que a gordura em produtos com carne podeser estabilizada de maneiras diferentes. Um método é adicionar proteínaisolada ou concentrados de proteína por exemplo caseinato de Na,concentrado de proteína de soro de leite ou isolar ou concentrar proteína desoja. Técnicas especiais têm sido desenvolvidas para assegurar umaemulsificação eficiente como emulsificar a proteína com os componentesgordurosos na receita da carne antes que os outros ingredientes sejamadicionados e picados. As proteínas são caracterizadas por seremrelativamente caras e a quantidade permitida em produtos com carne élimitada. Aditivos como mono e di-glicerídios e ésteres de ácido cítrico distoé outra tecnologia freqüentemente usada no processamento da carne. Eles sãoemulsificadores eficientes, mas a sua aplicação é freqüentemente indesejáveldevido ao preço ou ao desejo de não ter aditivos no rótulo do produto comcarne.Dacaranhe e Terao (Dacaranhe, CD and Terão, J: Effect ofcabbage phospholipase D treatment on the oxidative stability of beefhomogenate and egg yolk phosphatidylcoline liposomes. Journal of FoodScience 67 (2002) 2619-2624) and Chung-Wang et. ai. (Chung-Wang, YJ et.al.: Reduced oxidation of fresh pork in the presence of exogenous hydrolasesand bactéria at 2°C. Journal of Applied Microbiology 82 (1997) 317-324) temmostrado que o tratamento com fosfolipase aumenta a estabilidade oxidativada carne crua.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Os inventores verificaram que um produto alimentício à basede carne produzido a partir da carne tratada com uma fosfolipase pode terpropriedades melhoradas quando comparado com um produto alimentício àbase de carne similar produzido a partir de uma carne similar não tratada comuma fosfolipase. Conseqüentemente, a presente invenção se refere a ummétodo para produzir um produto alimentício à base de carnecompreendendo: a) contactar a carne com uma fosfolipase; b) aquecer a carnetratada com fosfolipase; e c) produzir um produto alimentício a partir da carnetratada com fosfolipase; em que a etapa b) é conduzida antes, durante oudepois da etapa c). Em outros aspectos a invenção se refere ao uso de umafosfolipase para produzir um produto alimentício à base de carne, e a umproduto alimentício à base de carne obtido pelo método da invenção.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Um produto alimentício à base de carne de acordo com ainvenção é qualquer produto à base de carne e apropriado para uso comoalimento para humanos ou animais. Em uma realização da invenção umproduto alimentício à base de carne é um produto alimentício paraalimentação de animais, por exemplo, um produto alimentício para animais deestimação. Em outra realização um produto alimentício à base de carne é umproduto para lanche.Carne
Carne de acordo com a invenção é qualquer tipo de tecidoderivado de qualquer tipo de animal. Carne de acordo com a invenção podeser um tecido compreendendo fibras musculares derivadas de um animal. Emuma realização da invenção, a carne é o músculo do animal, por exemplo,todo o músculo do animal ou pedaços de carne cortados do músculo doanimal. Em outra realização, carne de acordo com a invenção compreendeórgãos internos de um animal, tal como por exemplo, coração, fígado, rim,baço, timo, e miolo. A carne pode ser moída ou picada, ou cortada empedaços menores por qualquer outro meio apropriado conhecido na arte. Acarne de acordo com a invenção pode ser derivada de qualquer tipo de animal,por exemplo, de vaca, porco, cordeiro, ovelha, cabra, frango, galinha, peru,avestruz, faisão, cervos, alce, rena, búfalo, bisão, antílope, camelo, canguru:qualquer tipo de peixe, por exemplo espadilha, bacalhau, hadoque, atum,enguia marinha, salmão, arenque, sardinha, cavala, cavala branca (chicharro),tiravira, arenque redondo, pescada polaca, linguado, anchova, sardinhaeuropéia, pescadinha azul, pescadinha do pacífico, truta, peixe-gato, perca,marlim, caranho vermelho, faneca Norueguesa e/ou badejo; qualquer tipo demolusco, tais como por exemplo, marisco, mexilhão, vieira, berbigão, litorina,caracol, ostra, camarão, lagosta, lagostim, caranguejo, camarão de água doce,choco, lula, e/ou polvo. Em uma realização da invenção a carne é carne deboi, porco, frango, e/ou peru. Em outra realização a carne é carne de peixe.
Um produto alimentício à base de carne de acordo com ainvenção é qualquer produto alimentício à base de carne. Um produtoalimentício à base de carne pode compreender ingredientes sem carne taiscomo por exemplo, água, sal, farinha, proteína de leite, proteína vegetal,amido, proteína hidrolisada, fosfato, ácido, e/ou condimentos. Um produtoalimentício à base de carne de acordo coma invenção pode compreender pelomenos 30% (peso/peso) de carne, tal como pelo menos 50%, pelo menos60%, ou pelo menos 70% de carne.
Em uma realização um produto alimentício à base de carne, éum produto com carne processada, tal como por exemplo uma lingüiça,bologna, pão com carne, produto com carne triturada, carne moída, bacon,lingüiça de porco, salame, ou patê. Um produto com carne processada podeainda compreender por exemplo sais, condimentos, proteína de leite,ingredientes vegetais, agentes corantes, e/ou agentes texturizantes. Umproduto com carne processada pode por exemplo ser um produto com carneemulsificada, fabricado a partir de uma emulsão à base de carne, tais comopor exemplo mortadela, bologna, lingüiça calabresa, lingüiça de fígado,lingüiça de frango, salsicha vienense, salsicha de cachorro quente, carne paralanches rápidos (fiambre, frios), patê de carne. A emulsão à base de carnepode ser cozida, esterilizada ou assada, por exemplo em uma forma para assarou depois de ter sido colocada dentro de uma embalagem por exemplo deplástico, colágeno, celulose ou embalagem natural. Um produto com carneprocessada pode ser também um produto com carne reestruturada, tal comopor exemplo presunto reestruturado. Um produto com carne da invenção podepassar por etapas de processamento tais como por exemplo salgadura, porexemplo salgar a seco; curar, por exemplo curar em salmoura; secagem;defumação; fermentação; cozimento; enlatamento; retorta; fatiamento; e/ouser cortada em pedaços.
Método para produzir um produto alimentício à base de carne
Um produto alimentício à base de carne de acordo com ainvenção pode ser produzido contactando a carne com uma fosfolipase eproduzindo um produto alimentício à base de carne a partir da carne tratada.A carne freqüentemente estará crua quando colocada em contacto com umafosfolipase, mas pode também por exemplo ser tratada com calor, pré-cozida,ou irradiada antes do contacto com uma fosfolipase. A carne pode também tersido congelada antes do contacto com uma fosfolipase. O contacto da carnecom uma fosfolipase pode ser alcançado adicionando uma fosfolipase, porexemplo uma fosfolipase purificada, a carne. O contacto da carne com umafosfolipase pode ser alcançado misturando a carne, por exemplo pedaços decarne, carne picada, ou uma emulsão à base de carne, com uma fosfolipase e,quando aplicável, outros ingredientes usados para formar o produtoalimentício à base de carne através de qualquer método conhecido na arte.Antes do contacto com a carne, uma fosfolipase pode ser misturada comoutros ingredientes, por exemplo para formar um escabeche ou líquido emsalmoura, tais como por exemplo água, sal, farinha, proteína de leite, proteínavegetal, amido, proteína hidrolisada, fosfato, ácido, e/ou condimentos. Aquantidade de uma fosfolipase em um escabeche pode ser ajustada a fim dealcançar a quantidade final desejada de uma fosfolipase no produtoalimentício à base de carne. O contacto da carne, por exemplo, todo omúsculo do animal ou pedaços do músculo do animal, com uma fosfolipasepode ser alcançado fazendo um escabeche e/ou misturando a carne com umescabeche compreendendo uma fosfolipase. Se o produto com carne é umproduto com carne processada, por exemplo um produto com carneemulsificada, uma fosfolipase pode por exemplo ser misturada dentro daemulsão à base de carne, ou dentro de qualquer outra forma de mistura à basede carne usada para formar o produto com carne processada. Em umarealização da invenção uma fosfolipase é adicionada a um escabeche ou a umlíquido em salmoura. Uma fosfolipase pode ser adicionada à carne através dainjeção e/ou bombeamento de um líquido compreendendo uma fosfolipasedentro da carne através de qualquer método conhecido na arte para injeçãoe/ou bombeamento de um líquido dentro da carne. Um produto alimentício àbase de carne da invenção pode ser pedaços de carne que tenham entrado emcontacto com uma fosfolipase e foram acondicionados.
No método da invenção a carne é tratada com calor depois deter entrado em contacto com uma fosfolipase. O aquecimento pode serrealizado através de qualquer método conhecido na arte. O aquecimento seráfreqüentemente realizado como uma parte integrada da produção de umproduto alimentício à base de carne, por exemplo, através do cozimento, maspode também ser realizado antes das etapas de processamento necessáriaspara formar um produto alimentício à base de carne, ou depois que o produtoalimentício à base de carne tenha sido formado. O aquecimento pode portantoser realizado antes, durante ou depois da produção de um produto alimentícioà base de carne. Um produto alimentício à base de carne de acordo com ainvenção pode ser cozido depois do contacto da carne com uma fosfolipase epermitindo que a fosfolipase hidrolise os fosfolipídios. O cozimento pode serrealizado por qualquer método conhecido na arte tais como por exemplo emuma sala de defumação, em água fervendo, em um banho de água, em umforno, aquecendo no microondas, grelhando, cozinhando na pressão,submetendo-se a uma retorta, e/ou fritando. Em uma realização da invenção oproduto alimentício à base de carne é aquecido, por exemplo a umatemperatura na faixa de 50-140°C, tal como 60-120°C, 60-100°C, ou 70-100°C. Em outra realização o produto alimentício à base de carne é aquecidoa uma temperatura e por um tempo suficiente para inativar a fosfolipase. Emainda outra realização a carne tratada com fosfolipase é aquecida à pelomenos 50°C, tal como pelo menos 60°C, ou pelo menos 70°C.
Um produto alimentício à base de carne da invenção pode serusado para consumo direto ou ele pode passar por um processamentoadicional antes do consumo. Um produto alimentício à base de carne dainvenção pode ser usado como um material cru ou ingrediente para produçãode outros produtos alimentícios.
Enzimas a serem usadas no processo da invenção
Fosfolipídeos, tais como por exemplo lecitina oufosfatidilcolina, consistem de glicerol esterificado com dois ácidos graxos naposição exterior (sn-1) e na do meio (sn-2) e esterificado com ácido fosfóricona terceira posição; o ácido fosfórico, por sua vez, pode ser esterificado emum amino-álcool. Fosfolipases são enzimas que participam na hidrólise defosfolipídeos. Vários tipos de atividade da fosfolipase podem ser distinguidas,incluindo fosfolipases Ai e A2 (comumente referidas como fosfolipase A) quehidrolisam um grupo acila graxo (na posição sn-1 e sn-2, respectivamente)para formar lisofosfolipídeo. A fosfolipase B hidrolisa o grupo acila graxorestante no lisofosfolipídeo.
A enzima usada no processo da presente invenção inclui umafosfolipase, tal como, fosfolipase Aj, fosfolipase A2, fosfolipase B,fosfolipase C ou uma fosfolipase D. No processo da invenção o tratamentocom fosfolipase pode ser provido por uma ou mais fosfolipases, tais comoduas ou mais fosfolipases, por exemplo duas fosfolipases, incluindo, semlimitação, tratamento com ambos os tipos AeB; ambos os tipos Αχ e A2;ambos os tipos A1 e B; ambos os tipos A2 e B; ou tratamento com duas oumais fosfolipases diferentes do mesmo tipo. Está também incluído otratamento com um tipo de fosfolipase, tais como Ab A2, B, C ou D.
A fosfolipase A1 é definida de acordo com a classificação-ECde enzima padrão como EC 3.1.1.32.
Nome oficial: Fosfolipase A1.
Reação catalisada:
fosfatidilcolina + água <=> 2-acilglicerofosfocolina + umânion de ácido graxo
Comentário: tem uma especificidade muito mais ampla do que
EC 3.1.1.4.
A fosfolipase A2 é definida de acordo com a classificação-ECde enzima padrão como EC 3.1.1.4.
Nome oficial: Fosfolipase A2.
Nomes Alternativos: fosfatidilcolina 2-acil-hidrolase.lecitinase a; fosfatidase; ou fosfatidolipase.Reação catalisada:
fosfatidilcolina + água <=> 1-acilglicerofosfocolina + umânion de ácido graxo
Comentário: também atua na fosfatidiletanolamina, plasmogêniode colina e fosfatídeos, removendo o ácido graxo ligado à posição-2.
A fosfolipase B é definida de acordo com a classificação-ECde enzima padrão como EC 3.1.1.5.
Nome oficial: lisofosfolipase.Nomes Alternativos: lecitinase b; lisolecitinase;fosfolipase B; ou PLB.Reação catalisada:
2-lisofosfatidilcolina + água o glicerofosfocolina + um ânionde ácido graxo.
A fosfolipase C é definida de acordo com a classificação-ECde enzima padrão como EC 3.1.4.3. A fosfolipase C hidrolisa a ligação defosfato na fosfatidilcolina e outros glicerofosfolipídeos, por exemplofosfatidiletanolamina, produzindo diacilglicerol; esta enzima irá tambémhidrolisar as ligações de fosfato de espingomielina, cardiolipina, plasmogêniode colina e fosfolipídeos de ceramida.
Reação com fosfatidilcolina:
fosfatidilcolina + água <=> 1,2-diacilglicerol + fosfato decolina
A fosfolipase D é definida de acordo com a classificação-ECde enzima padrão como EC 3.1.4.4.
A fosfolipase D hidrolisa as ligações de fosfato dosfosfolipídios e espingomielina, para dar o ácido fosfatídico correspondente.Reação com fosfatidilcolina:
Uma fosfatidilcolina + água <=> colina + um fosfotidatoFosfolipase A
A atividade da fosfolipase A pode ser provida por enzimastendo outras atividades também, tal como por exemplo uma lípase comatividade de fosfolipase A. A atividade da fosfolipase A pode por exemplo serde uma lípase com atividade lateral de fosfolipase. Em outras realizações dainvenção a atividade da enzima da fosfolipase A é provida por uma enzimatendo essencialmente somente atividade da fosfolipase A e em que a atividadeda enzima da fosfolipase A não é uma atividade lateral.
A fosfolipase A pode ser de qualquer origem, por exemplo deorigem animal (tal como, por exemplo mamíferos), por exemplo do pâncreas(por exemplo pâncreas bovino ou suíno), ou veneno de cobra ou veneno deabelha. Alternativamente, a fosfolipase A pode ser de origem microbiana, porexemplo de fungos filamentosos, levedura ou bactéria, tal como do gênero ouespécies Aspergillus, por exemplo A niger; Dictyostelium, por exemplo Ddiscoideum; Mucor, por exemplo M.javanicus, M.mucedo., M. subtilissimus;Neurospora, por exemplo N. crassa, Rhizomucor, por exemplo R. pusillus;Rhizopus, por exemplo R. arrhizus; R. japonicus, R. stolonifer; Sclerotinia,por exemplo S. libertiana, Trichophyton, por exemplo T. rubrum;Whetzelinia, por exemplo W. sclerotiorium; Baccillus, por exemplo B.megaterium, B. subtilis; Citrobacter, por exemplo C. freundii; Enterobacter,por exemplo E. aerogenes, E. cloacae Edwardsiella, E.tarda; Erwinia, porexemplo E. herbicola; Escherichia, por exemplo E. coli; Klebsiella, porexemplo K. pneumoniae; Proteus, por exemplo P. vulgaris; Providencia, porexemplo P. stuartil; Salmonella, por exemplo S. Typhimurium; Serratia, porexemplo S. liquefaciens, S. marcescens; Shigella, por exemplo S. flexneri;Streptomyces, por exemplo S. violaceruber; Yersinia, por exemplo Y.enterocolitica. Conseqüentemente, a fosfolipase A pode ser füngica, porexemplo da classe dos Pyrenomycetes, tal como do gênero Fusarium, taiscomo da cepa de F. culmorum, F. heterosporum, F. solani, ou uma cepa de F.oxysporum. A fosfolipase A pode também ser da cepa de fungos filamentososdentro do gênero Aspergillus, tais como as cepas de Aspergillus awamori,Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus niger ou Aspergillusoryzae. Uma fosfolipase A preferida é derivada de uma cepa de Fusarium,particularmente F. venenatum ou F. oxysporun, por exemplo da cepa DSM2672 como descrito em WO 98/26057, especialmente descrita nareivindicação 36 e SEQ ID NO. 2 de WO 98/26057. Outra fosfolipase Apreferida é PLA2 de Streptomyces, tal como por exemplo PLA2 de S.violaceoruber. Em outras realizações, a fosfolipase é uma fosfolipase comodescrita em WO 00/32758 (Novozymes A/S. Denmark). A atividade de umafosfolipase tipo A pode por exemplo ser expressa em Unidades de Lecitase(LEU). A atividade da fosfolipase nas Unidades de Lecitase é medida comrelação a fosfolipase padrão usando lecitina como substrato. A fosfolipase Acatalisa a hidrólise da lecitina para lisolecitina e um ácido graxo livre. O ácidograxo liberado é titulado com 0,1 de hidróxido de sódio N sob condiçõespadrão (pH 8,00; 40.00° C ± 0,5). A atividade da fosfolipase A é determinadacomo a taxa de consumo de hidróxido de sódio durante a neutralização doácido graxo e é expressa em Unidades de Lecitase (LEU) com relação a umaLecitase (fosfolipase) padrão (disponível na Novozymes A/S, Bagsvaerd,Denmark). 1 LEU é definida como a quantidade de enzima que sob condiçõespadrão (pH 8,00; 40.00° C ± 0,5) resultam na mesma taxa de consumo dehidróxido de sódio (μmol/min) como a Lecitase padrão diluída para umaatividade nominal de 1 LEU/g.
Fosfolipase B
O termo "fosfolipase B" como usado aqui em conexão comuma enzima da invenção se destina a cobrir uma enzima com atividade defosfolipase B.
A atividade da fosfolipase B pode ser provida por enzimastendo outras atividades também, tal como por exemplo uma lípase comatividade de fosfolipase Β. A atividade da fosfolipase B pode por exemplo serde uma lípase com atividade lateral. Em outras realizações da invenção aatividade da enzima da fosfolipase B é provida por uma enzima tendoessencialmente somente atividade da fosfolipase B e em que a atividade daenzima da fosfolipase B não é uma atividade lateral. Em uma realização dainvenção, a fosfolipase B não é uma lípase com atividade lateral defosfolipase B como definido em WO 98/26057.
A fosfolipase B pode ser de qualquer origem, por exemplode origem animal (tal como, por exemplo mamíferos), por exemplo dofígado (por exemplo fígado de rato), Alternativamente, a fosfolipase Bpode ser de origem microbiana, por exemplo de fungos filamentosos,leveduras ou bactéria, tal como do gênero ou espécies Aspergillus, porexemplo A. foetidus, A. fumigatos, A. nidulans, A. niger, A. oryzae;Botrytis, por exemplo B. cinérea; Candida, por exemplo C. albicans;Cryptococcus, por exemplo C. neoformans, Escherichia, por exemplo E.coli, Fusarium, por exemplo F. sporotrichioides, F. venenatum, F.verticillioides; Hyphozyma; Kluyveromyces, por exemplo K. lactis;Magnaporte, por exemplo M. grisea; Metarhizinium, por exemploM.anisopliae; Mycosphaerella, por exemplo M. graminicola; Neurospora,por exemplo N. crassa; Penicillium, por exemplo P. notatum;Saccharomyces, por exemplo S. cerevisae; Schizosaccharomyces, porexemplo S. pombe; Torulaspora, por exemplo T. deibrueckii; Vibrio; porexemplo V. cholerae. Uma fosfolipase B preferida é derivada da cepa deAspergillus, particularmente fosfolipase LLPL-I ou LLPL-2 de A. niger,por exemplo como as contidas em Escherichia coli clones DSM 13003 ouDSM 13004, ou fosfolipase LLPL-I ou LLPL-2 de A. oryzae, porexemplo como as contidas em E. coli clones DSM 13082 ou DSM 13083como descrito em WO 01/27251, especialmente descrita na reivindicação1 e SEQ ID Nos. 2, 4, 6, ou 8 de WO 01/27251.Fosfolipase C
A atividade da fosfolipase C pode ser provida por enzimastendo outras atividades também, tal como por exemplo uma lípase comatividade de fosfolipase C ou uma fosfatase com atividade de fosfolipase C. Aatividade da fosfolipase C pode por exemplo ser de uma lípase com atividadelateral de fosfolipase C. Em outras realizações da invenção a atividade daenzima da fosfolipase C é provida por uma enzima tendo essencialmentesomente atividade da fosfolipase C e em que a atividade da enzima dafosfolipase C não é uma atividade lateral.
A fosfolipase C pode ser de qualquer origem, por exemplo deorigem animal, tal como de origem de mamíferos, de origem vegetal, ou deorigem microbiana, tal como origem fungica ou de origem de bactéria, talcomo da cepa do Mycobacterium, por exemplo M. tuberculosis ou M. bovis;da cepa de Bacillus, por exemplo B. cereus; da cepa de Clostridium, porexemplo C. bifermentans, C. haemolyticum, C. vovyi, C. sordellii, ou C.perfringens; da cepa de Listeria, por exemplo L. monocytogenes; da cepa dosPseudomonas, por exemplo P. aeruginosa; ou da cepa dos Staphylococcus,por exemplo S. aureus; ou da cepa dos Burkholderia, por exemplo B.pseudomallei.
Fosfolipase D
A atividade da fosfolipase D pode ser provida por enzimastendo outras atividades também, tal como por exemplo uma lípase comatividade de fosfolipase D uma fosfatase com atividade de fosfolipase D ouuma colinesterase com atividade de fosfolipase D. A atividade da fosfolipaseD pode por exemplo ser de uma lípase com atividade lateral de fosfolipase D.Em outras realizações da invenção a atividade da enzima da fosfolipase D éprovida por uma enzima tendo essencialmente somente atividade defosfolipase D e em que a atividade da enzima da fosfolipase D não é umaatividade lateral.A fosfolipase D pode ser de qualquer origem, por exemplo deorigem animal, tal como da origem de mamíferos, por exemplo decamundongo, rato, ou hamster Chinês; de origem vegetal, por exemplorepolho, milho, arroz, mamona, tabaco, feijão-de-vaca, ou Arabidopsisthaliana; ou de origem microbiana, tal como de origem bacteriana, porexemplo de uma cepa de Corynebacterium, por exemplo C.pseodotuberculosis, C. ulcerans, ou C. haemolyticum; ou de origem fungica,tal como por exemplo de uma cepa de Streptomyces, por exemplo S.antibioticus, ou S. chromofuscus; uma cepa de Trichoderma, por exemplo T.reesei; uma cepa de Sacchromyces, por exemplo S. cerevisiae; ou uma cepade Aspergillus, por exemplo A. oryzae, A. niger, A. nidulans ou A. fumigatos.
Fontes de enzima e formulação
A fosfolipase usada no processo da invenção pode ser derivadaou obtida a partir de quaisquer fontes mencionadas aqui. O termo "derivado"significa neste contexto que a enzima pode ter sido isolada a partir de umorganismo onde ela está presente naturalmente, isto é a identidade daseqüência do aminoácido da enzima é idêntica a da enzima natural. O termo"derivado" também significa que as enzimas podem ter sidorecombinantemente produzidas em um organismo hospedeiro, a enzimarecombinante produzida tendo ou uma identidade idêntica a enzima natural outendo uma seqüência de aminoácido modificada, por exemplo tendo um oumais aminoácidos que são deletados, inseridos e/ou substituídos, isto é, umaenzima recombinantemente produzida que é um mutante e/ou um fragmentode uma seqüência de aminoácido natural. Dentro do significado de umaenzima natural estão incluídas variantes naturais. Além disso, o termo"derivado" inclui enzimas produzidas sinteticamente através de por exemplosíntese de peptídio. O termo "derivado" também encerra enzimas que tenhamsido modificadas por exemplo através de glicosilação, fosforilação, etc., querin vivo ou in vitro. O termo "obtenível" neste contexto significa que a enzimatem uma seqüência de aminoácido idêntica a da enzima natural. O termoencerra uma enzima que tenha sido isolada a partir de um organismo onde elaestá presente naturalmente, ou uma em que ela tenha sido recombinantementeexpressa no mesmo tipo de organismo ou outro, ou enzimas produzidassinteticamente através de por exemplo síntese de peptídios. Com respeito aenzimas recombinantemente produzidas os termos "obtenível" e "derivado"se referem a identidade da enzima e não a identidade do organismohospedeiro em que ela é recombinantemente produzida.
Portanto, a fosfolipase pode ser obtida a partir de ummicroorganismo através do uso de qualquer técnica apropriada. Por exemplo,a preparação da enzima da fosfolipase pode ser obtida através da fermentaçãode um microorganismo apropriado e isolação subseqüente de uma preparaçãode fosfolipase a partir do caldo fermentado resultante ou microorganismoatravés dos métodos conhecidos na arte. A fosfolipase pode também serobtida através do uso de técnicas de recombinação de DNA. Tal métodonormalmente compreende o cultivo de uma célula hospedeira transformadacom um vetor de recombinação de DNA compreendendo uma seqüência deDNA codificando a fosfolipase em questão e a seqüência de DNA sendooperacionalmente ligada com um sinal de expressão apropriado de forma queela seja capaz de expressar a fosfolipase em um meio de cultura sobcondições que permitam a expressão da enzima e recuperando a enzima apartir da cultura. A seqüência de DNA pode também ser incorporada dentrodo genoma da célula hospedeira. A seqüência de DNA pode ser de origemgenômica, cDNA ou sintética ou quaisquer combinações destes, e pode serisolada ou sintetizadas de acordo com os métodos conhecidos na arte.
Fosfolipases apropriadas estão disponíveis comercialmente.Exemplos de enzimas para uso prático são por exemplo Lecitase®(Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark) ou YieldMAX® (Novozymes A/S,Bagsvaerd, Denmark e Chr. Hansen A/S, Horsholm, Denmark). Umafosfolipase B apropriada é por exemplo de fosfolipase de Aspergillus nigerLLPL-2 que pode ser produzida recombinantemente em A niger comodescrito em WO 01/27251.
No processo da invenção a fosfolipase pode ser purificada. 0termo "purificada" como usado aqui cobre a proteína da enzima dafosfolipase livre de componentes do organismo ao qual ela é derivada. Otermo "purificada" também cobre a proteína da enzima da fosfolipase livre decomponentes do organismo natural do qual ela é obtida, isto é tambémchamado de uma fosfolipase "essencialmente pura" e pode serparticularmente relevante para fosfolipases que estão ocorrendo naturalmentee que não tenham sido modificadas geneticamente, tal como por deleção,substituição ou inserção de um ou mais resíduos de aminoácido.
Portando, a fosfolipase pode ser purificada, isto é, somentequantidades menores de outras proteínas estando presentes. A expressão"outras proteínas" se refere em particular a outras enzimas. O termo"purificada" como usado aqui também se refere a remoção de outroscomponentes, particularmente outras proteínas e mais particularmente outrasenzimas presentes na célula de origem da fosfolipase. A fosfolipase pode ser"substancialmente pura", isto é, livre de outros componentes do organismoem que ela é produzida, isto é, por exemplo, um organismo hospedeiro para afosfolipase recombinantemente produzida. Preferivelmente, as enzimas sãopelo menos 75% (peso/peso) puras, mais preferivelmente pelo menos 80%,85%, 90% ou ainda 95% puras. Em ainda mais uma realização preferida afosfolipase é uma preparação de proteína de enzima pelo menos 98% pura.
O termo "fosfolipase" inclui quaisquer compostos auxiliaresque possam ser necessários para a atividade catalítica da enzima, tal como,por exemplo um receptor ou co-fator apropriado, que pode ou não pode estarpresente no sistema de reação.
A fosfolipase pode estar em qualquer forma apropriada para ouso em questão, tal como, por exemplo na forma de um pó seco ou granulado,um granulado não pulverulento, um líquido, um líquido estabilizado, ou umaenzima protegida. Granulados podem ser produzidos, por exemplo comodescrito em US 4.106.991 e US 4.661.452, e podem opcionalmente ser coadosatravés dos métodos conhecidos na arte. Preparações de enzima líquidapodem, por exemplo, ser estabilizadas através da adição de estabilizadorestais como açúcar, um álcool de açúcar ou outro poliol, ácido láctico ou outroácido orgânico de acordo com os métodos estabelecidos. Enzimas protegidaspodem ser preparadas de acordo com o método descrito em EP 238.216.
Através do processo da invenção, os fosfolipídios da carnepodem ser modificados através da hidrólise de pelo menos 5%, tal como pelomenos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, ou pelo menos 50% daquantidade total de fosfatidilcolina mais fosfatidiletanolamina, como umresultado do tratamento da carne com fosfolipase. Em uma realização, pelomenos 5%, tal como pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, oupelo menos 50% de fosfolipídios na carne podem ser hidrolisados como umresultado do tratamento com fosfolipase.
Através do processo da presente invenção o teor defosfolipídio no produto alimentício à base de carne obtido pode ser menor doque 90%, tal como por exemplo menor do que 80%, por exemplo menor doque 60% ou menor do que 50% do teor total de fosfolipídio presente na carneantes do contacto da carne com uma fosfolipase. O teor de fosfolipídio podeser medido por qualquer método conhecido pelo versado na arte, por exemplopelo HPLC.
A quantidade de fosfolipase a ser usada no método dainvenção pode depender da atividade da fosfolipase específica nosfosfolipídios presentes na carne sob condições de tratamento específico. Aquantidade de fosfolipase pode ser determinada pelo versado na arte atravésdos métodos conhecidos na arte para otimizar reações enzimáticas, porexemplo determinando a quantidade de fosfolipase exigida para alcançar ograu desejado de hidrólise dos fosfolipídios da carne e/ou para alcançar oefeito desejado nas propriedades do produto alimentício à base de carne.
Quando uma fosfolipase A é usada, a quantidade defosfolipase pode por exemplo ser entre 0,1 e 50 LEU por grama de gordura,tal como entre 0,5 e 25, ou entre IelO LEU por grama de gordura.
Um produto alimentício à base de carne produzido através dométodo da invenção pode ter propriedades melhoradas quando comparadocom um produto alimentício à base de carne similar produzido sem otratamento com fosfolipase na carne, por exemplo o produto com carne deacordo com a invenção pode ter a estabilidade da gordura melhorada, umaquantidade menor de gordura visível, ligação com a água aumentada, e/oupropriedades de textura melhoradas, por exemplo firmeza aumentada.
Em uma realização, a presente invenção se refere ao uso deuma fosfolipase para produzir um produto alimentício à base de carne, e emoutra realização, a invenção se refere a um produto alimentício à base decarne obtido, ou obtenível, através do método da invenção.
EXEMPLOS
Exemplo 1
200 g de um produto com carne foram produzidas a partir dosseguintes ingredientes (% peso/peso):
60% de carne de boi picada contendo 18% de gordura
1,8% de NaCl
0,4% Tripolifosfato de sódio
37,8% de água
A carne de boi com uma temperatura de 5C e NaCl forammisturados por 1 minuto em um processador de alimentos, água com umatemperatura de 5C e fosfato foram adicionados e misturados continuamentepor 3 minutos.100g foram transferidas para um recipiente para cozinhar. Ocozimento foi executado através do aquecimento da mistura em um recipientea 40C e mantendo esta temperatura por 30 minutos, a mistura do recipiente foientão colocada em um banho de água a 90C e deixada para descansar até quea temperatura do centro tivesse alcançado 75C. O produto foi resfriado para5C e avaliado no dia seguinte.
Uma amostra de controle foi feita sem a adição de fosfolipase.
A amostra 1 foi feita com a adição de 500 LEU (Unidades deLecitase) por Kg de carne de uma fosfolipase de mamífero (Lecitase 10L,Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark).
A amostra 2 foi feita com a adição de 500 LEU (Unidades deLecitase) por Kg de carne de uma fosfolipase fungica (Fosfolipase Al deFusarium venenatum, Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark).
Em ambas as amostras 1 e 2 a fosfolipase foi adicionada àcarne junto com NaCl.
Os resultados são mostrados na tabela 1.
Tabela 1
<table>table see original document page 19</column></row><table>
Exemplo 2
Carne para lanches rápidos foi produzida em escala delaboratório com a composição como descrita na tabela 2. A carne de porco e agordura foram cortadas em cubo (aproximadamente 3x3 cm). Sal de nitritofoi adicionado aos cubos de carne. A carne e a gordura foram moídasseparadamente através de uma placa com um orifício de 3 mm usando umamáquina para picar (modelo X70, Hermann Scharfen GmbH & Co, Witten,Alemanha) e deixadas durante a noite com uma temperatura dearmazenamento fria de 4°C.
A carne foi misturada em um cortador com tampo de mesaeletrônico MADO MTK 560 (Pfeiffer GmbH, Dornhan, Alemanha) comum terço de gelo triturado e todo o fosfato. Depois metade do gelotriturado restante (um terço da quantidade total) e o sal foram adicionadosjuntos com a enzima (Fosfolipase Ai (YieldMAX, Chr. Hansen, Denmark)e fosfolipase A2 (Lecitase 10L, Novozymes Denmark), a dosagem(gordura LEU/g) é mostrada na tabela 3). O gelo triturado restante e osingredientes secos (condimentos, maltodextrina, e ascorbato) foramadicionados e cortados até que a mistura alcançasse 10°C. A gordura foiadicionada e cortada até que a mistura tivesse alcançado uma temperaturade 12-14°C.
Depois de terminada a misturação, a emulsão de carne foicolocada á vácuo por 9 χ 15 segundos em um Komet PlusVac 24 (KometMaschinenfabrik GmbH, Plochingen, Alemanha) antes de ser enlatada.Depois as latas foram cheias com a massa de carne deixando 5% de espaçosuperior no topo de cada lata. Antes de serem seladas, as latas foramsubmetidas a vácuo nove tempos adicionais. As latas foram seladas usandoum Seaming VlO Automático (Lanico, Alemanha) e aquecidas em águaquente a 1000°C por 95 minutos.
Tabela 2. Composição de carne para lanches rápidos
<table>table see original document page 20</column></row><table>A quantidade de hidrólise de fosfatidilcolina (PC) efosfatidiletanolamina (PE), foi determinada como uma percentagem deredução do teor de PC e teor de PE, respectivamente, quando comparado comas amostras de controle. A PC e PE foi determinada por HPLC na seguintemaneira: A fração de lipídio da amostra da carne para lanches rápidoshomogeneizada foi extraída em 30 ml de clorofórmio/metanol (2:1 v/v) eseparada por centrifugação por 30 minutos com 3000 rpm a 4°C. A fase desolvente orgânico com os lipídios foi transferida quantitativamente para umfrasco de evaporação e seca a 45-48°C. O extrato de lipídio total foi re-dissolvido em 2,5 ml de clorofórmio antes da separação da classe de lipídios.Uma coluna de extração de NH2 na fase sólida (BondElut NH, VarianIncorporated, CA, USA) foi limpa através da adição de 2 χ 2 ml de hexano eesvaziada com vácuo. Depois a amostra foi adicionada à coluna e conduzidaatravés da mesma com vácuo. Para remover os lipídios neutros, 2 χ 2 ml declorofórmio/2-propanol (2:1 v/v) foram adicionados. Os ácidos graxos livresforam removidos através da adição de 2 χ 2 ml de uma solução de 2% deácido acético em éter. Metanol (2x2 ml) foi adicionado a coluna e a fraçãode lipídio contendo os (liso-)fosfolipídios foi coletada em um vidro eevaporada com nitrogênio.
Dois eluentes foram preparados para a separação dirigida aogradiente. O eluente A consistia de uma mistura de metanol, ácido acético,trietilamina, e hexano (897:18:15:70 v/v/v/v) e o eluente B foi uma mistura deacetona, ácido acético, trietilamina, e hexano (897:18:15:70 v/v/v/v).
Uma amostra padrão misturada, contendo 1425 microlitros doeluente B e 37,5 microlitros de fosfatiletanolamina e fosfatildicolina sintética,respectivamente, foi preparada.
O extrato de fosfolipídio foi re-colocado em suspensão em 600microlitros do eluente B e filtrado através de um filtro com seringa LC de 13ml com uma membrana PVDF e um micrômetro de 0,45 (PALL GelmanLaboratory Acrodisc NY5 USA) dentro de um frasco HPLC.
Um eromatógrafo de líquido de desempenho elevado DionexUCI-50 (Dionex Softron GmbH, Germering, Alemanha) foi usado paraseparar e quantificar as espécies individuais de (liso-) fosfolipídios. Oeromatógrafo continha um injetor de amostra automatizado ASI-IOO (Dionex,Germering, Alemanha) e uma bomba HPLC P680 (Dionex, Germering,Alemanha), uma coluna de sílica ligada (LiChrospher® Diol 100, com 5micrômetros, série no. 415614, Merk KgaA, Darmstadt, Alemanha) e umdetector de dispersão de luz evaporativa (Alltech Associates Inc., IL, USA).
A textura foi medida por força de penetração com um êmbolode aço inoxidável cilíndrico com extremidade plana com um diâmetro de 3,5mm. O êmbolo foi fixado a uma célula de carga estática 100 N conectada auma cruzeta da máquina Instron 4301 (Instrom Limited, Buck-inghamshire,Inglaterra). A velocidade da cruzeta foi operada a 50 mm/min e as curvas dedeformação força-distância foram registradas usando o programaSerie IX (M12-13984-EN, Instron Limited, Buckingmshire,Inglaterra) e a força de penetração máxima determinada. Três penetraçõesforam realizadas em cada lata de carne para lanches rápidos testada. Os testesforam realizados em amostras a 8°C e 23°C, respectivamente. A média deforça de penetração máxima medida para cada amostra é resumida na tabela3.
Tabela 3. Tipo de enzima e dosagem (gordura LEU/g), grau dehidrólise de fosfatidileolina (PC) e fosfatidiletanolamina (PE) (%), e força depenetração máxima a 8°C e 23°C (N) nas amostras de carne finais.
<table>table see original document page 22</column></row><table>
Claims (13)
1. Método para produzir um produto alimentício à base decarne, caracterizado pelo fato de que compreende:a) contactar a carne com uma fosfolipase;b) aquecer a carne tratada com fosfolipase; ec) produzir um produto alimentício a partir da carne tratadacom fosfolipase;em que a etapa b) é conduzida antes, durante ou depois daetapa c).
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a carne tratada com fosfolipase é aquecida a uma temperatura epor um tempo suficiente para inativar a fosfolipase.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a carne tratada com fosfolipase é aquecida à pelo menos 50°C.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelofato de que a carne tratada com fosfolipase é aquecida a uma temperatura nafaixa de 50-140°C.
5. Método de acordo com qualquer das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que a fosfolipase é uma fosfolipase Aiou fosfolipase A2.
6. Método de acordo com qualquer das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que a carne a ser contactada com umafosfolipase é uma carne picada.
7. Método de acordo com qualquer das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o produto alimentício é umproduto com carne emulsificada.
8. Método de acordo com qualquer das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o produto alimentício compreendepelo menos 30% de carne.
9. Método de acordo com qualquer das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que a fosfolipase é uma fosfolipasepurificada.
10. Método de acordo com qualquer das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que os fosfolipídeos da carne tratadacom fosfolipase foram modificados pela hidrólise de pelo menos 5% daquantidade total de fosfatidilcolina mais fosfatidiletanolamina.
11. Método de acordo com qualquer das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que os fosfolipídeos da carne tratadacom fosfolipase foram modificados pela hidrólise de pelo menos 20% daquantidade total de fosfatidilcolina mais fosfatidiletanolamina.
12. Uso de uma fosfolipase, caracterizado pelo fato de que épara produzir um produto alimentício à base de carne.
13. Produto alimentício à base de carne, caracterizado pelofato de que é obtido através do método como definido em qualquer dasreivindicações de 1 a 11.
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