BRPI0618705A2 - anticorpos antagonistas direcionados contra peptìdeo relacionado ao gene da calcitonina, composição farmacêutica e uso dos mesmos - Google Patents

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Abstract

ANTICORPOS ANTAGONISTAS DIRECIONADOS CONTRA PEPTìDEO RELACIONADO AO GENE DA CALCITONINA, COMPOSIçãO FARMACêUTICA E USO DOS MESMOS. A presente invenção refere-se a métodos para prevenir ou para tratar distúrbios associados a CGRP, tais como sintomas vasomotores, incluindo dores de cabeça (por exemplo, enxaqueca, grupo de dor de cabeça, e dor de cabeça por tensão) e febres, pela administração de um anticorpo antagonista anti-CGRP. O anticorpo antagonista G1 e anticorpos derivados de G1 direcionados a CGRP são também descritos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICOR- POS ANTAGONISTAS DIRECIONADOS CONTRA PEPTÍDEO RELACIO- NADO AO GENE DA CALCITONINA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E USO DOS MESMOS".
Este pedido reivindica prioridade do Pedido de Patente U.S. N- 60/736.623, depositado em 14 de novembro de 2005, que é aqui incorpora- do por referência.
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se ao use de anticorpos antagonistas de anti-CGRP para a prevenção, melhora, ou tratamento de sintomas vaso- motores, tais como dores de cabeça relacionadas à CGRP (por exemplo, enxaqueca), e febres.
Antecedentes da Invenção
CGRP (peptídeo relacionado ao gene calcitonina) é um neuro- peptídeo de 37 aminoácidos, que pertence a uma família de peptídeos que inclui calcitonina, adrenomedulina e amilina. Nos seres humanos, duas for- mas de CGRP (α-CGRP e β-CGRP) existem, e têm atividades similares. E- las variam por três aminoácidos, e exibem distribuição diferencial. Pelo me- nos dois subtipos de receptor de CGRP podem também contar como ativi- dades diferenciais. O CGRP é um neurotransmissor no sistema nervoso cen- tral, e tem sido mostrado para ser um vasodilatador potente na periferia, on- de os neurônios contendo CGRP estão intimamente associados com os va- sos sangüíneos. A vasodilatação mediada por CGRP é também associada com inflamação neurogênica, como parte de uma cascata de eventos que resulta no extravazamento de plasma e vasodilatação da microvasculatura, e está presente na enxaqueca.
O CGRP tem sido notado por sua possível ligação aos sintomas vasomotores (Wyon et al. Scand. J. Urol. Nephrol. 35: 92-96 (2001); Wyon et al. Menopause 7(1):25-30 (2000)). Os sintomas vasomotores (VMS), tais como febres e suadores noturnos, são os sintomas mais comuns associados com menopausa, ocorrendo em 60% a 80% de todas as mulheres em segui- da a menopausa natural ou cirurgicamente induzida. As febres são, do mesmo modo, para serem uma resposta adaptiva do sistema nervoso cen- tral (CNS) para declinar os esteróides sexuais (Freedman Am. J. Human Bi- ol. 13:453-464 (2001)). Até aqui, as terapias mais eficazes para febres são tratamentos baseados em hormônio, incluindo estrogênios e/ou algumas progestinas. Qs tratamentos hormonais podem ser eficazes para aliviar fe- bres, mas não são apropriados para todas as mulheres. Os sintomas fisioló- gicos e emocionais observados, tais como nervoso, fadiga, irritabilidade, in- sônia, depressão, perda de memória, dor de cabeça, ansiedade, nervosis- mo, ou inabilidade para se concentrar, são considerados por serem causa- dos pela perda do sono, em seguida a febre e suadores noturnos (Kramer et al., In: Murphy et al., 3.sup.rd Int1I Symposium on Recent Advances in Urolo- gical Câncer Diagnosis and Tratamento-Proceedings, Paris, France: SCI: 3-7 (1992)).
Os homens também experimentam febres em seguida a retirada de hormônio de esteróide (andrógeno). Isto é verdadeiro nos casos de declí- nio de andrógeno associado à idade (Katovich, et al., Proceedings of the So- ciety for Experimental Biology & Medicine, 1990, 193(2): 129-35), bem como em casos extremos de perda de hormônio associada com tratamentos de câncer de próstata (Berendsen, et al., European Journal of Pharmacology, 2001, 419(1): 47-54). Mais de um terço destes pacientes experimentarão sintomas persistentes e freqüentes severos bastantes para causar descon- forto e inconveniência significantes.
O CGRP é um vasodilatador potente que tem sido implicado na patologia de outros sintomas vasomotores, tais como todas as formas de dor de cabeça vascular, incluindo enxaquecas (com ou sem aura) e grupo de dor de cabeça. Durham, N. Engl. J. Med. 350:1073-1075, 2004. Os níveis de soro de CGRP na veia jugular externa são elevados em pacientes durante dor de cabeça de enxaqueca. Goadsby et al., Ann. Neurol. 28:183-7, 1990. A administração intravenosa de α-CGRP humano induz dor de cabeça e enxa- queca em pacientes que sofrem de enxaqueca sem aura, sugerindo que o CGRP tem um papel causativo na enxaqueca. Lassen et al., Cephalalgia 22:54-61, 2002. O possível envolvimento do CGRP na enxaqueca tem sido a ba- se para o desenvolvimento e teste de um número de compostos que inibem liberação de CGRP (por exemplo, sumatriptan), antagonizam no receptor de CGRP (por exemplo, derivado de dipeptídeo BIBN4096BS (Boerhringer In- gelheirn); CGRP(8-37)), ou interagem com uma ou mais proteínas associa- das a receptor, tais como, proteína de membrana de atividade de receptor (RAMP), ou proteína de componente de receptor (RCP), ambas das quais afetando a ligação de CGRP a seus receptores. Brain, S. et al., Trends in Pharmacological Sciences 23:51-53, 2002. Subtipos de Alfa-2 adrenoceptor e receptores de adenosina A1 também controlam (inibem) a liberação de CGRP e ativação trigeminal (Goadsby et al., Brain 125:1392-401, 2002). O agonista de receptor adenosina A1 GR79236 (metrafadil), que foi mostrado para inibir vasodilatação neurogênica e nocicepção trigeminal em seres hu- manos, pode também ter atividade antienxaqueca (Arulmani et al., Cephalal- gia 25:1082-1090, 2005; Giffin et al., Cephalalgia 23:287-292, 2003.)
Confundindo esta teoria está a observação que tratamento com compostos que inibem exclusivamente inflamação neurogênica (por exem- plo, antagonistas de receptor taquicinin NK1), ou ativação trigeminal (por exemplo, agonistas de receptor de SHT1D), têm sido mostrados para ser rela- tivamente ineficientes como tratamentos agudos para enxaqueca, conduzin- do alguns investigadores a questionar se a inibição da liberação de CGRP é o mecanismo primário de ação de tratamentos eficazes antienxaqueca. A- rulmani et al., Eur. J. Pharmacol. 500:315-330, 2004.
A enxaqueca é uma condição neurológica complexa comum que é caracterizada por ataques episódicos severos de dor de cabeça e caracte- rísticas associadas, que podem incluir náusea, vômito, sensibilidade à luz, som ou movimento. Em alguns pacientes, a dor de cabeça é precedida por ou acompanhada por uma aura. A dor de cabeça pode ser severa e pode também ser unilateral em certos pacientes.
Os ataques de enxaqueca são disruptivos a vida diária. Nos Es- tados Unidos e Europa Ocidental, o predomínio total dos que sofrem de en- xaqueca é 11% da população geral (6% homens; 15-18% mulheres). Além disso, a freqüência média de ataques em um indivíduo é 1,5/mês. Enquanto existe um número de tratamentos disponível para aliviar ou reduzir os sinto- mas, a terapia preventiva é recomendada para aqueles pacientes tendo mais do que 3-4 ataques de enxaqueca por mês. Goadsby et al. New Engl. J. Med. 346(4): 257-275, 2002.
A variedade de intervenções farmacológicas que têm sido usa- das para tratar enxaqueca e a variabilidade em respostas entre pacientes é um testamento para a natureza diversa desta enfermidade. Desse modo, tais fármacos relativamente não-seletivos como alcalóides de ergotina (por e- xemplo, ergotamina, dihidroergotamina, metisergida), que exibem atividade serotonérgica, bem como adrenérgica, noradrérgica e dopaminérgica, têm sido usadas a cerca de oitenta anos para tratar enxaqueca. Outros tratamen- tos incluem opiatos (por exemplo, oxicodona) e antagonistas β-adrenérgicos (por exemplo, propranolol). Alguns pacientes, usualmente aqueles com sin- tomas mais suaves, são capazes de controlar seus sintomas com remédios sem prescrição, tais como um ou mais agentes antiinflamatórios não- esteroidais (NSAIDs), tal como uma combinação de aspirina, acetaminofeno e cafeína (por exemplo, Excedrin® Enxaqueca).
Mais recentemente, alguns pacientes com enxaqueca têm sido tratados com topiramato, um anticonvulsivo que bloqueia os canais de sódio dependentes de voltagem, e certos receptores de glutamatos (AMPA- cainato), que potencializam a atividade do receptor GABA-A, e bloqueiam anidrase carbônica. O sucesso relativamente recente de serotonina 5HT- 1B/1D e/ou agonistas de receptor de 5HT-1a, tal como sumatriptano, em alguns pacientes, tem conduzido os pesquisadores a proporem uma etiolo- gia serotonérgica da enfermidade. Infelizmente, enquanto alguns pacientes respondem bem a este tratamento, outros são relativamente resistentes a estes efeitos.
Tem sido postulado que uma disfunção de um canal de íon no núcleo aminérgico da haste do cérebro leva a uma enfermidade, contudo, a patofisiologia precisa de enxaqueca não é ainda bem compreendida. Uma forma de enxaqueca, enxaqueca hemiplágica familial, tem sido mostrada estar associada com mutações sem sentido na subunidade α1 do canal de cálcio tipo P/Q de porta de voltagem, e é pensado do mesmo modo que ou- tras mutações de canal de íon também serão encontradas em outras popu- lações de pacientes. Enquanto a dilatação dos vasos sangüíneos está asso- ciada co rn e exacerbam os sintomas de dor da enxaqueca, tais eventos neu- rovasculares são agora pensados serem um resultado de preferivelmente do que causativa da condição. A disfunção total das trajetórias de haste de cé- rebro que modulam entrada sensorial é considerada ser uma característica de unificação de enxaqueca. Goadsby, P.J. et al., New Engl. J. Med. 346(4): 257-275,2002.
Através de todo este pedido, várias publicações (incluindo paten- tes e pedidos de patente) são referenciadas. As descrições destas publica- ções em suas totalidades são, desse modo, incorporadas por referência.
Breve Sumário da Invenção
A invenção aqui revelada se refere a anticorpos antagonistas de anti-CGRP e a métodos de uso de anticorpos antagonistas de anti-CGRP para tratar ou prevenir sintomas vasomotores, tais como dores de cabeça, tal como enxaqueca com ou sem aura, enxaqueca hemiplégica, cluster de dores de cabeça, neuralgia de enxaqueca, dores de cabeça crônicas, dores de cabeça por tensão, e dores de cabeça resultantes de outras condições médicas (tais como infecção ou pressão aumentada na cabeça devido a um tumor). Outros sintomas vasomotores incluem febres.
Em um aspecto, a presente invenção proporciona um método para tratar ou prevenir pelo menos um sintoma vasomotor em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anti- corpo antagonista anti-CGRP.
Em um aspecto, a presente invenção proporciona um método para tratar ou prevenir dor de cabeça (por exemplo, enxaqueca e grupo de dor de cabeça) em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo antagonista anti-CGRP.
Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para me- lhorar, controlar, reduzir incidência de, ou retardar o desenvolvimento ou progressão de dor de cabeça (por exemplo, enxaqueca e grupo de dor de cabeça) em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo antagonista anti-CGRP.
Em uma concretização adicional, a invenção proporciona méto- dos para melhorar, controlar, reduzir incidência de, ou retardar o desenvol- vimento ou progressão de dor de cabeça (por exemplo, enxaqueca e grupo de dor de cabeça) em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo antagonista anti-CGRP em combi- nação com pelo menos um agente adicional útil para tratar dor de cabeça. Tais agentes adicionais incluem agonistas similares a 5-HT1 (e agonistas que agem em outros locais de 5-HT1), e fármacos antiinflamatórias não- esteroidais (NSAIDs).
Exemplos de agonistas de 5-HT1 que podem ser usados na combinação com um anticorpo anti-CGRP incluem uma classe de compos- tos conhecidos como triptanos, tais como sumatriptano, zolmitriptano, nara- triptano, rizatriptano, eletriptano, almotriptan, e frovatriptano. Ergotina alca- lóides e compostos relacionados são também conhecidos na técnica por te- rem atividade agonista de 5-HT, e têm sido usados para tratar dor de cabe- ça, tal como enxaqueca. Incluídos entre estes compostos estão ergotamina tartrato, ergonovina maleato, e mesilatos ergolóides (por exemplo, dihidroer- gocornina, dihidroergocristina, dihidroergocriptina, e dihidroergotamina mesi- Iato (DHE 45)).
Exemplos de NSAIDs que podem ser usados em combinação com um anticorpo anti-CGRP incluem naproxeno, flurbiprofeno, cetoprofeno, oxaprozino, etodolac, indometacino, cetorolac, nabumetona, ácido mefanâ- mico, e piroxicano. NSAIDs adicionais incluem inibidores de ciclooxigenase- 2 (COX-2). Membros deste grupo incluem: celecoxib; rofecoxib; meloxicam; JTE-522; L-745,337; NS398; e sais farmaceuticamente aceitáveis destes.
Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para me- lhorar, controlar, reduzir incidência de, ou retardar o desenvolvimento ou progressão de febres em um indivíduo compreendendo administrar ao indi- víduo uma quantidade eficaz de um anticorpo antagonista anti-CGRP. Em outro aspecto, a invenção proporciona métodos para melho- rar, controlar, reduzir incidência de, ou retardar o desenvolvimento ou pro- gressão de febres em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo antagonista anti-CGRP em combi- o naçao co m pelo menos um agente adicional útil para tratar febres. Tais a- gentes adicionais úteis incluem, mas não estão limitados a, tratamentos ba- seados em hormônio, incluindo estrogênios e/ou progestinas.
Em uma concretização, o anticorpo antagonista anti-CGRP usa- do em qualquer dos métodos descritos acima é qualquer dos anticorpos con- forme aqui descritos.
Em algumas concretizações, o anticorpo antagonista anti-CGRP reconhece um CGRP humano. Em algumas concretizações, o anticorpo an- tagonista anti-CGRP se liga a ambos α-CGRP e β-CGRP humanos. Em al- gumas concretizações, o anticorpo antagonista anti-CGRP se liga a CGRP humano e de rato. Em algumas concretizações, o anticorpo antagonista anti- CGRP se liga a fragmentos de terminal C tendo 25-37 aminoácidos de C- GRP. Em algumas concretizações, o anticorpo antagonista anti-CGRP se liga ao epítopo de terminal C com 25-37 aminoácidos de CGRP.
Em algumas concretizações, o anticorpo antagonista anti-CGRP é um anticorpo monoclonal. Em algumas concretizações, o anticorpo anta- gonista anti-CGRP é humanizado. Em algumas concretizações, o anticorpo é humano. Em algumas concretizações, o anticorpo antagonista anti-CGRP é anticorpo G1 (conforme aqui descrito). Em algumas concretizações, o anti- corpo antagonista anti-CGRP compreende um ou mais CDR(s) (tais como um, dois, três, quatro, cinco ou, em algumas concretizações, todos o seis CDRs) de anticorpo G1 ou variantes de G1 mostrados na Tabela 6. Em ain- da outras concretizações, o anticorpo antagonista anti-CGRP compreende a seqüência de aminoácido da região variável de cadeia pesada mostrada na Figura 5 (SEQ ID NO: 1), e a seqüência de aminoácido da região variável de cadeia leve mostrada na Figura 5 (SEQ ID NO: 2).
Em algumas concretizações, o anticorpo compreende uma regi- ão constante modificada, tal como uma região constante que é imunologi- camente inerte (incluindo parcialmente imunologicamente inerte), por exem- plo, não dispara Iisis mediado por complemento, não estimula citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), não ativa microglia, ou tendo reduzida uma ou mais destas atividades. Em algumas concretizações, a região constante é modificada conforme descrito em Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624; Pedido PCT Ns PCT/GB99/01441; e/ou Pedido de Pa- tente UK Nq 9809951.8. Em outras concretizações, o anticorpo compreende uma região constante lgG2 de cadeia pesada humana compreendendo as seguintes mutações: A330P331 a S330S331 (numeração de aminoácido com referência à seqüência de lgG2 tipo selvagem). Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624. Em algumas concretizações, a região constante de cadeia pesada do anticorpo é uma cadeia pesada humana de IgGI com qualquer das seguintes mutações: 1) A327A330P331 a G327S330S331; 2) E233L234L235G236 a P233V234A235 com G236 retirado; 3) E233L234L235 a P233V234A235; 4) E233L234L235G236A327A330P331 a P233V234A235G327S330S331 com G236 retirado; 5) E233L234L235A327A330P331 a P233V234A235G327S330S331; e 6) N297 to A297, ou qualquer outro aminoácido exceto N. Em algumas concretiza- ções, a região constante de cadeia pesada do anticorpo é uma cadeia pesa- da de lgG4 humana com qualquer das seguintes mutações: E233F234L235G236 a P233V234A235 com G236 retirado; E233F234L235 a P233V234A235; e S228L235 a P228E235.
Em ainda outras concretizações, a região constante é aglicosila- tada para glicosilação N-igante. Em algumas concretizações, a região cons- tante é aglicosilatada para glicosilação N-igante por mutação do resíduo de fixação de oligossacarídeo (tal como Asn297), e/ou flanqueamento de resí- duos que são parte da seqüência de reconhecimento de N-glicosilação na região constante. Em algumas concretizações, a região constante é aglicosi- lada para glicosilação N-igante. A região constante pode ser aglicosilatada para glicosilação N-igante enzimaticamente, ou por expressão em uma célu- la hospedeira deficiente de glicosilação.
A afinidade de ligação(KD) de um anticorpo antagonista anti- CGRP para CGRP (tal como α-CGRP humano conforme medido por resso- nância de plasmon de superfície a uma temperatura apropriada, tal como 25 ou 37°C) pode ser cerca de 0,02 a cerca de 200 nM. Em algumas concreti- zações, a afinidade de ligação é qualquer de cerca de 200 nM, cerca de 100 nM, cerca de 50 nM, cerca de 10 nM, cerca de 1 nM, cerca de 500 pM, cerca de 100 pM, cerca de 60 pM, cerca de 50 pM, cerca de 20 pM, cerca de 15 pM, cerca de 10 pM, cerca de 5 pM, ou cerca de 2 pM. Em algumas concre- tizações, a afinidade de ligação é menor do que qualquer de cerca de 250 nM, cerca de 200 nM, cerca de 100 nM, cerca de 50 nM, cerca de 10 nM, cerca de 1 nM, cerca de 500 pM, cerca de 100 pM, ou cerca de 50 pM.
O anticorpo antagonista anti-CGRP pode ser administrado antes de, durante e/ou após a dor de cabeça. Em algumas concretizações, o anti- corpo antagonista anti-CGRP é administrado antes do ataque da dor de ca- beça (por exemplo, enxaqueca e grupo de dor de cabeça). A administração de um anticorpo antagonista anti-CGRP pode ser por qualquer meio conhe- cido na técnica, incluindo: oralmente, intravenosamente, subcutaneamente, intra-arterialmente, intramuscularmente, intracardialmente, intra- espinhalmente, intratoraxicamente, intraperitonealmente, intraventricular- mente, sublingualmente, transdermalmente, e/ou via inalação. A administra- ção pode ser sistêmica, por exemplo, intravenosamente, ou localizada.
Em algumas concretizações, o anticorpo antagonista anti-CGRP pode ser administrado em conjunto com um outro agente, tal como outro agente para tratar dor de cabeça.
Em outro aspecto, a invenção proporciona uso de um anticorpo antagonista anti-CGRP para a manufatura de um medicamento para uso em qualquer dos métodos descritos aqui, por exemplo, para tratar ou prevenir dor de cabeça.
Em outro aspecto, a invenção proporciona uma composição far- macêutica para prevenir ou tratar dor de cabeça (por exemplo, enxaqueca e grupo de dor de cabeça) compreendendo uma quantidade eficaz de um anti- corpo antagonista anti-CGRP, em combinação com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Em outro aspecto, a invenção proporciona um kit para uso em qualquer dos métodos descritos aqui. Em algumas concretizações, o kit compreende um recipiente, uma composição compreendendo um anticorpo antagonista anti-CGRP descrito aqui, em combinação com um veículo far- maceuticamente aceitável, e instruções para uso da composição em qual- quer dos métodos descritos aqui.
A presente invenção também proporciona anticorpos antagonis- tas de anti-CGRP e polipeptídeos derivados a partir do anticorpo G1, ou su- as variantes, mostrados na Tabela 6. Conseqüentemente, em um aspecto, a invenção é um anticorpo G1 (permutavelmente denominado "G1") que é produzido por vetores de expressão tendo N2S de Acesso ATCCPTA-6866 e PTA-6867. Por exemplo, em uma concretização está um anticorpo compre- endendo uma cadeia pesada produzida pelo vetor de expressão com N6 de Acesso ATCC PTA-6867. Em uma concretização adicional está um anticorpo compreendendo uma cadeia leve produzida pelo vetor de expressão Ng de Acesso ATCC PTA-6866. As seqüências de aminoácido das regiões variá- veis de cadeia pesada e cadeia leve de G1 são mostradas na Figura 5. As porções de região de determinação de complementaridade (CDR) do anti- corpo G1 (incluindo CDRs de Chothia e Kabat) são também mostradas na Figura 5. É compreendido que referência a qualquer parte de ou região total de G1 envolve seqüências produzidas pelos vetores de expressão tendo NsS de Acesso ATCCPTA-6866 e PTA-6867, e/ou as seqüências representadas na Figura 5. A invenção também proporciona variantes de anticorpo de G1 com seqüências de aminoácido representadas na Tabela 6.
Em um aspecto, a invenção é um anticorpo compreendendo um domínio de Vh que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo me- nos 96%, pelo menos 97% pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% i- dêntico na seqüência de aminoácido para SEQ ID NO: 1.
Em outro aspecto, a invenção é um anticorpo compreendendo um domínio de Vl que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97% pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntico na seqüência de aminoácido para SEQ ID NO: 2.
Em outro aspecto, a invenção é um anticorpo compreendendo um fragmento ou uma região do anticorpo G1, ou suas variantes, mostrados na Tabela 6. Em uma concretização, o fragmento é uma cadeia leve do anti- corpo G1. Em outra concretização, o fragmento é uma cadeia pesada do anticorpo G1. Em ainda outra concretização, o fragmento contém uma ou mais regiões variáveis a partir de uma cadeia leve e/ou uma cadeia pesada do anticorpo G1. Em ainda outra concretização, o fragmento contém uma ou mais regiões variáveis a partir de uma cadeia leve e/ou uma cadeia pesada mostrada na Figura 5. Em ainda outra concretização, o fragmento contém um ou mais CDRs a partir de uma cadeia leve e/ou uma cadeia pesada do anticorpo G1.
Em outro aspecto, a invenção proporciona polipeptídeos (que podem ou não podem ser um anticorpo) compreendendo um Vh CDR3 con- forme colocado em SEQ ID NO: 5, ou uma seqüência que difere de SEQ ID NO: 5 por 1,2,3, 4, ou 5 substituições de aminoácido. Em uma concretiza- ção particular, tais substituições de aminoácido são substituições conservati- vas.
Em outro aspecto, a invenção proporciona polipeptídeos (que podem ou não podem ser um anticorpo) compreendendo um Vl CDR3 con- forme colocado em SEQ ID NO: 8, ou uma seqüência que difere de SEQ ID NO: 8 por 1, 2, 3, 4, ou 5 substituições de aminoácido. Em uma concretiza- ção particular, tais substituições de aminoácido são substituições conservati- vas.
Em outro aspecto, a invenção proporciona polipeptídeos (que podem ou não podem ser um anticorpo) compreendendo qualquer um ou mais dos seguintes: a) um ou mais CDR(s) de anticorpo G1, ou suas varian- tes, conforme mostrados na Tabela 6; b) CDR H3 a partir da cadeia pesada de anticorpo G1, ou suas variantes, conforme mostrados na Tabela 6; c) CDR L3 a partir da cadeia leve de anticorpo G1, ou suas variantes, mostra- dos na Tabela 6; d) três CDRs a partir da cadeia leve de anticorpo G1, ou suas variantes, mostrados na Tabela 6; e) três CDRs a partir da cadeia pe- sada de anticorpo G1, ou suas variantes, mostrados na Tabela 6; f) três CDRs a partir da cadeia leve e três CDRs a partir da cadeia pesada de anti- corpo G1,ou suas variantes, mostrados na Tabela 6. A invenção proporcio- na adicionalmente polipeptídeos (que podem ou não podem ser um anticor- po) compreendendo qualquer um ou mais dos seguintes: a) um ou mais (um, dois, três, quatro, cinco, ou seis) CDR(s) derivados a partir do anticorpo G1, ou suas variantes, mostrados na Tabela 6; b) um CDR derivado de CDR H3 a partir da cadeia pesada de anticorpo G1; e/ou c) um CDR derivado de CDR L3 a partir da cadeia leve de anticorpo G1. Em algumas concretiza- ções, o CDR é um CDR mostrado na Figura 5. Em algumas concretizações, o um ou mais CDRs derivados do anticorpo G1, ou suas variantes, mostra- dos na Tabela 6, são pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cer- ca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo me- nos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% idênticos ao pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo me- nos cinco, ou pelo menos seis CDRs de G1 ou suas variantes.
Em algumas concretizações, o CDR é um CDR de Kabat. Em outras concretizações, o CDR é um CDR de Chothia. Em outras concretiza- ções, o CDR é uma combinação de um CDR de Kabat e um CDR de Chothia (também denominado "CDR combinado" ou "CDR estendido"). Em outras palavras, para qualquer dada concretização contendo mais do que um CDR, os CDRs podem ser de Kabat, de Chothia, e/ou combinado.
Em algumas concretizações, o polipeptídeo (tal como um anti- corpo) compreende a seqüência de aminoácido de KASKXaaVXaaTYVS, no qual Xaa na posição 5 é R, W, G, L, ou N; e no qual Xaa na posição 7 é T, A, D, G, R, S, W, ou V. Em algumas concretizações, a seqüência de aminoáci- do de KASKXaaVXaaTYVS é CDR1 de uma cadeia leve de anticorpo.
Em algumas concretizações, o polipeptídeo (tal como um anti- corpo) compreende a seqüência de aminoácido de XaaXaaSNRYXaa, no qual Xaa na posição 1 é G ou A; no qual Xaa na posição 2 é A ou H; e no qual Xaa na posição 7 é L, Τ, I, ou S. Em algumas concretizações, a se- qüência de aminoácido de XaaXaaSNRYXaa é CDR2 de uma cadeia leve de anticorpo.
Em algumas concretizações, o polipeptídeo (tal como um anti- corpo) compreende a seqüência de aminoácido de EIRSXaaSDXaaXaaAT- XaaYAXaaAVKG1 no qual Xaa na posição 5 é E, R, K, Q, ou N; no qual Xaa na posição 8 é A, G, Ν, Ε, H, S, L, R, C, F1 Υ, V, D, ou P; no qual Xaa na po- sição 9 é S, G, Τ, Y, C, E, L, A, Ρ, I, N, R, V, D, ou M; no qual Xaa na posi- ção 12 é H ou F; no qual Xaa na posição 15 é E ou D. Em algumas concreti- zações, the seqüência de aminoácido de EIRSXaaSDXaaXaaATXaaYAXa- aAVKG é CDR2 de uma cadeia pesada de anticorpo.
Em algumas concretizações, o polipeptídeo (tal como um anti- corpo) compreende a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO:1, no qual o resíduo de aminoácido na posição 99 de SEQ ID NO:1 é L ou é substituído por A, N, S, Τ, V, ou R; e no qual o resíduo de aminoácidos na posição 100 de SEQ ID NO:1 é A ou é substituído por L, R, S, V, Y, C, G, Τ, K, ou P.
Em algumas concretizações, o anticorpo da invenção é um anti- corpo humano. Em outras concretizações, o anticorpo da invenção é um an- ticorpo humanizado. Em algumas concretizações, o anticorpo é monoclonal. Em algumas concretizações, o anticorpo (ou polipeptídeo) é isolado. Em al- gumas concretizações, o anticorpo (ou polipeptídeo) é substancialmente pu- ro.
A região constante de cadeia pesada dos anticorpos pode ser de quaisquer tipos de região constante, tais como IgG, IgM, IgD, IgA, e IgE; e quaisquer isotipos, tais como IgGI, lgG2, lgG3, e lgG4.
Em algumas concretizações, o anticorpo compreende uma regi- ão constante modificada conforme descrito acima.
Em outro aspecto, a invenção proporciona um polinucleotídeo (que pode ser isolado) compreendendo um polinucleotídeo que codifica um fragmento, ou uma região do anticorpo G1, ou suas variantes, mostrados na Tabela 6. Em uma concretização, o fragmento é uma cadeia leve do anticor- po G1. Em outra concretização, o fragmento é uma cadeia pesada do anti- corpo G1. Em ainda outra concretização, o fragmento contém uma ou mais regiões variáveis de uma cadeia leve e/ou uma cadeia pesada do anticorpo G1. Em ainda outra concretização, o fragmento contém uma ou mais (isto é, uma, duas, três, quatro, cinco, ou seis) regiões de determinação de comple- mentaridade (CDRs) de uma cadeia leve e/ou uma cadeia pesada do anti- corpo G1.
Em outro aspecto, a invenção é um polinucleotídeo (que pode ser isolado) compreendendo um polinucleotídeo que codifica para o anticor- po G1, ou suas variantes, mostrados na Tabela 6. Em algumas concretiza- ções, o polinucleotídeo compreende qualquer ou ambos dos polinucleotí- deos mostrados em SEQ ID NO:9 e SEQ ID N0:10.
Em outro aspecto, a invenção proporciona polinucleotídeos que codificam quaisquer dos anticorpos (incluindo fragmentos de anticorpo), ou polipeptídeos aqui descritos.
Em outro aspecto, a invenção proporciona vetores (incluindo ve- tores de expressão e clonagem) e células hospedeiras compreendendo qualquer do polinucleotídeo aqui revelado. Em algumas concretizações, o vetor é pDb.CGRP.hFcGI tendo ATCC Nq PTA-6867. Em outras concretiza- ções, o vetor é pEb.CGRP.hKGI tendo ATCC Nq PTA-6866.
Em outro aspecto, a invenção é uma célula hospedeira compre- endendo um polinucleotídeo que codifica quaisquer dos anticorpos aqui des- critos.
Em outro aspecto, a invenção é um complexo de CGRP ligado por qualquer dos anticorpos ou polipeptídeos aqui descritos. Em algumas concretizações, o anticorpo é anticorpo G1, ou suas variantes, mostrados na Tabela 6.
Em outro aspecto, a invenção é uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de quaisquer dos polipeptídeos (in- cluindo anticorpos, tal como um anticorpo compreendendo uma ou mais CDRs de anticorpo G1), ou polinucleotídeos descritos aqui, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
Em outro aspecto, a invenção é um método de gerar anticorpo G1 compreendendo cultura de uma célula hospedeira ou progenia desta sob condições que permitem produção de anticorpo G1, no qual a célula hospe- deira compreende um vetor de expressão que codifica para anticorpo G1; e, em algumas concretizações, purifica o anticorpo G1. Em algumas concreti- zações, o vetor de expressão compreende uma ou ambas das seqüências de polinucleotídeo mostradas em SEQ ID NO:9 e SEQ ID N0:10.
Em outro aspecto, a invenção proporciona métodos de gerar quaisquer dos anticorpos ou polipeptídeos aqui descritos pela expressão de um ou mais polinucleotídeos que codificam o anticorpo (que podem ser se- paradamente expressos como uma cadeia simples leve ou pesada, ou am- bas uma cadeia leve e pesada são expressas a partir de um vetor), ou o po- lipeptídeo em uma célula adequada, geralmente seguido por recuperação e/ou isolamento do anticorpo ou polipeptídeos de interesse.
O anticorpo antagonista anti-CGRP e polipeptídeos, e polinucle- otídeos que codificam os anticorpos e polipeptídeos da presente invenção, podem ser usados para tratar, prevenir, melhorar, controlar ou reduzir inci- dência de doenças associadas com função anormal de CGRP, tal como dor de cabeça (por exemplo, enxaqueca, cluster dor de cabeça, dor de cabeça crônica, e dor de cabeça por tensão), e outras condições que podem ser tra- tadas ou prevenidas por antagonização da atividade de CGRP.
Em outro aspecto, a invenção proporciona kits e composições compreendendo quaisquer uma ou mais das composições aqui descritas. Estes kits, geralmente em acondicionamentos adequados e providos com instruções apropriadas, são úteis para quaisquer dos métodos aqui descri- tos.
Breve Descrição dos Desenhos
A Figura 1 é uma Tabela mostrando afinidades de ligação de 12 anticorpos de murina para fragmentos de α-CGRP a-CGRP humana substi- tuída por alanina. As afinidades de ligação foram medidas a 25°C usando-se Biacore por escoamento Fabs através de CGRPs no chip. Os valores repre- sentam a perda na afinidade de mutantes de alanina em relação ao fragmen- to parenteral, 25-37 (itálico), exceto K35A, que foi derivado de um 19-37 de origem. "a" indica afinidades para 19-37, e os 25-37 fragmentos são o desvio padrão ± médio de duas medições independentes em chips de sensor dife- rentes. "b" indica estas interações desviadas de um modelo de interação bi- molecular simples devido a uma taxa externa bifásica, desse modo suas afi- nidades foram determinadas usando-se um modelo de mudança conforma- cional. Chave de escala cinza: branco (1,0) indica afinidade parental; cinza claro (menos do que 0,5) indica afinidade mais alta do que de origem; cinza escuro (mais do que 2) indica afinidades mais baixa do que de origem; e pre- to indica que nenhuma ligação foi detectada.
As Figuras 2A e 2B mostram o efeito de administrar CGRP 8-37 (400 nmol/kg), anticorpo 4901 (25 mg/kg), e anticorpo 7D11 (25 mg/kg) no fluxo de sangue da pele medido no fluxo de célula de sangue após estimula- ção de pulso elétrico por 30 segundos. CGRP 8-37 foi administrado intrave- nosamente (iv) 3-5 minutos antes da estimulação de pulo elétrico. Os anti- corpos foram administrados intraperitonealmente (IP) 72 horas antes da es- timulação de pulso elétrico. Cada ponto nos gráficos representa AUC de um rato tratado sob as condições conforme indicadas. Cada linha nos gráficos representa AUC médias de ratos tratados sob a condição conforme indicado. AUC (área sob a curva) igual a Afluxo x Atempo. "Afluxo" representa a mu- dança de unidades de fluxo após a estimulação de pulso elétrico; e "Atempo" representa o período de tempo levado para o nível de fluxo de célula de sangue retornar ao nível antes da estimulação de pulso elétrico.
A Figura 3 mostra o efeito de administrar dosagem diferente de anticorpo 4901 (25 mg/kg, 5 mg/kg, 2,5 mg/kg, ou 1 mg/kg) no fluxo de san- gue na pele medido como fluxo de célula sangüínea após estimulação de pulso elétrico por 30 segundos. Os anticorpos foram administrados intrave- nosamente (IV) 24 horas antes da estimulação de pulso elétrico. Cada ponto no gráfico representa AUC de um rato tratado sob as condições conforme indicado. A linha no gráfico representa o AUC médio tratado sob a condição conforme indicado.
As Figuras 4A e 4B mostram o efeito de administrar anticorpo 4901 (1 mg/kg ou 10 mg/kg, i.v.), anticorpo 7E9 (10 mg/kg, i.v.), e anticorpo 8B6 (10 mg/kg, i.v.) no fluxo de sangue na pele medido como fluxo de célula sangüínea após estimulação de pulso elétrico por 30 segundos. Os anticor- pos foram administrados intravenosamente (i.v.), seguido por estimulação de pulso elétrico em 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos, e 120 minutos após administração de anticorpo. O eixo Y representa a percentagem de AUC conforme comparada ao nível de AUC quando nenhum anticorpo foi admi- nistrado (tempo 0). O eixo X representa o período de tempo (minutos) entre a administração de anticorpos e estimulação de pulso elétrico. "*" indica P < 0,05, e "**" indica P< 0,01, conforme comparado para tempo 0. Os dados foram analisados usando-se ANOVA de uma via com um teste de compara- ção múltipla de Dunnett.
A Figura 5 mostra a seqüência de aminoácido da região variável de cadeia pesada (S EQ ID NO:1) e região variável de cadeia leve (SEQ ID NO:2) de anticorpo G1. Os CDRs de Kabat no texto em negrito e os CDRs de Chothia são sublinhados. Os resíduos de aminoácidos para a região vari- ável de cadeia pesada e região variável de cadeia leve são numerados se- qüencialmente.
A Figura 6 mostra o mapeamento de epítopo de anticorpo G1 por competição de peptídeo usando Biacore. α-CGRP humana N- biotinilatada foi capturada no chip de sensor SA. G1 Fab (50 nM) na ausên- cia de um peptídeo de competição ou pré-incubado por 1 hora com 10 uM de um peptídeo de competição foi escoado no chip. A ligação de G1 Fab a a- CGRP humana no chip foi medida. O eixo Y representa a percentagem de ligação bloqueada pela presença do peptídeo de competição comparada com a ligação na ausência do peptídeo de competição.
A Figura 7 mostra o efeito de administrar anticorpo G1 (1 mg/kg ou 10 mg/kg, i.v.), ou veículo (PBS, 0,01% de Tween 20), no fluxo de sangue na pele medido como o fluxo de célula sangüínea após estimulação de pulso elétrico por 30 segundos. O anticorpo G1 ou veículo foi administrado intra- venosamente (i.v.), seguido por estimulação de pulso elétrico de nervo em 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos, e 120 minutos após administração de anticorpo. O eixo Y representa a percentagem de AUC conforme comparada ao nível de AUC quando nenhum anticorpo ou veículo (definido como 100%) foi administrado (tempo 0). O eixo X representa o período de tempo (minu- tos) entre a administração de anticorpos e estimulação de pulso elétrico. "*" indica P < 0,05, e "**" indica P < 0,01, conforme comparado ao veículo. Os dados foram analisados usando testes de ANOVA de duas vias e pós-teste de Bonferroni.
A Figura 8A mostra o efeito de administrar anticorpo G1 (1 mg/kg, 3 mg/kg ou 10 mg/kg, i.v.), ou veículo (PBS, 0,01% de Tween 20) no fluxo de sangue na pele medido como o fluxo de célula sangüínea após es- timulação de pulso elétrico por 30 segundos 24 horas após dosagem. O an- ticorpo G1 ou veículo foi administrado intravenosamente (i.v.) 24 horas antes da estimulação de pulso elétrico do nervo. O eixo Y representa a área total sob a curva (mudança no fluxo de célula sangüínea multiplicado pela mu- dança no tempo de estimulação até que o fluxo retorne para a linha de base, AUC). O eixo X representa a variação de doses de anticorpo G1. "*" indica P < 0,05, e "**" indica P < 0,01, conforme comparado ao veículo. Os dados foram analisados usando testes de ANOVA de uma via, e de comparação múltipla de Dunn.
A Figura 8B mostra o efeito de administrar anticorpo G1 (0,3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg ou 10 mg/kg, i.v.), ou veículo (PBS, 0,01% de Twe- en 20) no fluxo de sangue na pele medido como o fluxo de célula sangüínea após estimulação de pulso elétrico por 30 segundos 7 dias após dosagem. O anticorpo G1, ou veículo, foi administrado intravenosamente (i.v.) 7 dias an- tes da estimulação de pulso elétrico do nervo. O eixo Y representa AUC to- tal. O eixo X representa a variação de doses de anticorpo G1. "**" indica P < 0,01, e "***" indica P < 0,001, conforme comparada ao veículo. Os dados foram analisados usando teste de ANOVA de uma via, e de comparação múltipla de Dunn. A Figura 8C é uma análise de ajuste de curva dos dados das figuras 8A e 8B. O anticorpo G1 ou veículo foi administrado intravenosamen- te (i.v.), ou 24 horas, ou 7 dias antes da estimulação de pulso elétrico do nervo. O eixo Y representa AUC total. O eixo X representa a variação de do- ses de anticorpo G1 em "mg/kg" em uma escala logarítmica para determinar EC50·
A Figura 9 mostra o efeito do anticorpo mu7E9 (10 mg/kg), BIBN4096BS ou veículo (PBS, 0,01% de Tween 20) na mudança no diâme- tro da artéria meningeal média após estimulação de campo elétrico. O anti- corpo mu7E9, BIBN4096BS ou veículo foi administrado intravenosamente (i.v.) no tempo 0 minuto após uma resposta da linha de base ao estímulo elétrico ser estabelecida. O eixo Y representa a mudança no diâmetro da artéria meningeal média após estimulação do campo elétrico. O diâmetro restante corresponde a 0%. O eixo X representa tempo (minutos) de estimu- lação de pulso elétrico. "*" indica P < 0,05, e "**" indica P < 0,01, conforme comparado ao veículo. Os dados foram analisados no teste de ANOVA de uma via e de comparação múltipla de Dunett.
A Figura 10 mostra o efeito da variação de doses de anticorpo G1 (1 mg/kg, 3 mg/kg ou 10 mg/kg, i.v.), ou veículo (PBS, 0,01% de Tween 20) na mudança no diâmetro da artéria meningeal média após estimulação de campo elétrico. O anticorpo G1 ou veículo foi administrado intravenosa- mente (i.v.) 7 dias antes da estimulação de campo elétrico. O eixo Y repre- senta a mudança no diâmetro da artéria meningeal média. O diâmetro res- tante corresponde a 0%. O eixo X representa a voltagem da estimulação. "*" indica P < 0,05, "**" indica P < 0,01, e "***" indica P < 0,001, conforme com- parado ao veículo. Os dados foram analisados usando pós-testes de ANO- VA de uma via e Bonferroni.
A Figura 11A mostra o efeito do anticorpo mu4901 (10mg/kg), ou veículo (PBS, 0,01% de Tween 20), administrado intravenosamente (i.v.) 24 horas antes, na diminuição na temperatura do núcleo induzida por injeção subcutânea de naloxona (1 mg/kg) em ratos viciados em morfina. O eixo Y representa a diferença de temperatura a partir da linha de base. O eixo X representa o tempo medido a partir do ponto de injeção de naloxona.
A Figura 11B mostra o efeito do anticorpo mu4901 (1 Omg/kg), ou veículo (PBS, 0,01% de Tween 20), administrado intravenosamente (i.v.) 24 horas antes, no aumento na temperatura superficial final induzida por injeção subcutânea de naloxona (1 mg/kg) em ratos viciados em morfina. O eixo Y representa a diferença de temperatura a partir da linha de base. O eixo X representa o tempo medido a partir do ponto de injeção de naloxona.
Descrição Detalhada da Invenção
A invenção aqui revelada proporciona métodos para tratar e/ou
prevenir sintomas vasomotores, tais como dor de cabeça (por exemplo, en- xaqueca, grupo de dor de cabeça, dor de cabeça crônica, e dor de cabeça por tensão) ou febre em um indivíduo pela administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo antagonista anti- CGRP.
A invenção aqui revelada também proporciona anticorpos anta- gonistas de anti-CGRP e polipeptídeos derivados de G1 ou suas variantes mostrados na Tabela 6. A invenção também proporciona métodos de produ- zir e usar estes anticorpos e polipeptídeos.
Técnicas Gerais
A prática da presente invenção empregará, a menos que de ou- tro modo indicado, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imuno- logia, que estão dentro da técnica. Tais técnicas são explanadas totalmente na literatura, tais como, Clonagem Molecular: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Síntese de Oli- gonucleotídeo (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Biologia Celular: A Laboratory Notebook (J.E. Cellular, ed., 1998) A- cademic Press; Animal Cell Culture (R.l. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cultura de Célula e Tecido: Laboratory Procedimentos (A. Doyle, J.B. Grif- fiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in En- zymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.Μ. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vetors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reac- tion, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Anticorpos (P. Finch, 1997); Anticorpos: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Anticorpos monoclonais: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Uso de anticorpos: a labora- tory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Anticorpos (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995). Definições
Um "anticorpo" é uma molécula de imunoglobulina capaz de se ligar especificamente a um alvo, tais como, um carboidrato, polinucleotídeo, lipídeo, polipeptídeo, etc., através de pelo menos um local de reconhecimen- to de antígeno, localizado na região variável da molécula de imunoglobulina. Conforme aqui usado, o termo envolve não somente intactar anticorpos poli- clonais ou monoclonais, mas também fragmentos destes (tais como, Fab, Fab1, F(ab')2, Fv), cadeia simples (ScFv), mutantes destes, proteínas de fu- são compreendendo uma porção de anticorpo (tais como anticorpos de do- mínio), e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglo- bulina que compreende um local de reconhecimento de antígeno. Um anti- corpo inclui um anticorpo de qualquer classe, tais como, IgG, IgA, ou IgM (ou subclasses destes), e o anticorpo não necessita ser de qualquer classe par- ticular. Dependendo da seqüência de aminoácido do anticorpo do domínio constante de suas cadeias pesadas, as imunoglobulinas podem ser transfe- ridas para classes diferentes. Existem cinco classes maiores de imunoglobu- linas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, e várias destas podem ser adicionalmente divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e lgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às classes diferentes de imunoglobulinas são denomimados alfa, delta, épsi- lon, gama, e mu, respectivamente. As estruturas de subunidade e configura- ções tridimensionais de classes diferentes de imunoglobulinas são bem- conhecidas.
Conforme aqui usado, "anticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homo- gêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo uma população são idênticos, exceto para possíveis mutações que ocorrem naturalmente que podem estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclo- nais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um local antigênico simples. Além disso, em contraste às preparações de anticorpo policlonal, que incluem tipicamente anticorpos diferentes direcionados contra determi- nantes diferentes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um determinante simples no antígeno. O modificador "monoclonal" indica o cará- ter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não é para ser construído como requerendo produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anti- corpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos pelo método de hibridoma primeiro descrito por Ko- hler e Milstein, 1975, Nature, 256:495, ou podem ser produzidos por méto- dos de DNA recombinante, tais como descritos na Patente U.S. Ns 4.816.567. Os anticorpos monoclonais podem também serem isolados a par- tir de bibliotecas de fago gerados usando as técnicas descritas em McCaf- ferty et al., 1990, Nature, 348:552-554, por exemplo.
Conforme usado aqui, anticorpos "humanizados" se referem a anticorpos de formas de não-humano (por exemplo, murina) que são imuno- globulinas quiméricas específicas, cadeias de imunoglobulina, ou fragmentos destas (tais como, Fv, Fab, Fab1, F(ab')2, ou outras subseqüências de liga- ção de antígeno de anticorpos) que contêm seqüência mínima derivada de imunoglobulina não-humana. Na maior parte, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo recipiente) nas quais resíduos de uma região de determinação de complementaridade (CDR) do recipiente são substituídos por resíduos de uma CDR de espécies não-humanas (anticorpo doador), tais como, camundongo, rato, ou coelho, tendo a especificidade afinidade e atividade biológica desejadas. Em alguns exemplos, resíduos de região de estrutura Fv (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não-humanos correspondentes. Além disso, o anticorpo humaniza- do pode compreender resíduos que são encontrados, nem no anticorpo reci- piente, nem na CDR importada ou seqüências de estrutura, mas são incluí- dos para adicionalmente refinar e otimizar o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas das regiões de CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não-humana, e todas ou substancialmente todas das regiões de FR são aquelas de uma seqüência de consenso de imunoglobulina hu- mana. O anticorpo humanizado otimamente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região de imunoglobulina constante, ou domínio (Fc), tipicamente que de uma de uma imunoglobulina humana. Os anticorpos podem ter regiões Fc modificadas conforme descrito no WO 99/58572. Ou- tras formas de anticorpo humanizados têm uma ou mais CDRs (uma, duas, três, quatro, cinco, seis), que são alteradas com relação ao anticorpo origi- nal, que são também denominadas uma ou mais CDRs "derivadas de" uma ou mais CDRs a partir do anticorpo original.
Conforme usado aqui, "anticorpo humano" significa um anticorpo tendo uma seqüência de aminoácido correspondente àquela de um anticor- po produzido por um ser humano, e/ou tenha sido produzido usando-se quaisquer das técnicas para produção de anticorpos humanos conhecidos na técnica, ou aqui revelados. Esta definição de um anticorpo humano inclui anticorpos compreendendo pelo menos um polipeptídeo de cadeia pesada humano, ou pelo menos um polipeptídeo de cadeia leve humano. Um tal e- xemplo é um anticorpo compreendendo polipeptídeos de cadeia leve de mu- rina e de cadeia pesada humano. Os anticorpos humanos podem ser produ- zidos usando-se várias técnicas conhecidas na arte. Em uma concretização, o anticorpo humano é selecionado a partir de uma biblioteca de fago, onde a biblioteca de fago expressa anticorpo humanos (Vaughan et al., 1996, Natu- re Biotechnology, 14:309-314; Sheets et al., 1998, PNAS1 (USA) 95:6157- 6162; Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Os anticorpos humanos podem também serem produzidos pela introdução de "loci" de imunoglobulina humana em animais transgênicos, por exemplo, camundongos nos quais os genes de imunoglo- bulina endógenos foram parcialmente ou completamente inativados. Esta aproximação é descrita nas Patentes dos Estados Unidos 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; e 5.661.016. Alternativamente, o anticorpo humano pode ser preparado por imortalização de linfócitos B humanos que produzem um anticorpo dirigido contra um antígeno alvo (tais linfócitos B podem ser recuperados de um indivíduo, ou podem ter sido imu- nizados in vitro). Vide, por exemplo, Cole et al., Antibody monoclonals and Câncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., 1991, J. Immu- nol., 147 (1):86-95; e Patente U.S. Ne 5.750.373.
Conforme usado aqui, o termo "peptídeo relacionado ao gene calcitonina" e "CGRP" se referem a qualquer forma de peptídeo relacionada ao gene calcitonina, e variantes deste, que retém pelo menos parte da ativi- dade de CGRP. Por exemplo, CGRP pode ser α-CGRP ou β-CGRP. Con- forme usado aqui, CGRP inclui todas as espécies mamíferas de CGPR de seqüência nativa, por exemplo, humana, canina, felina, eqüina, e bovina.
Conforme usado aqui, um "anticorpo antagonista anti-CGRP" (permutavelmente denominado "anticorpo anti-CGRP"), se refere a um anti- corpo que é capaz de se ligar a um CGRP e inibir atividade biológica de CGRP e/ou trajetória(s) a jusante(s) mediada(s) por sinalização de CGRP.
Um anticorpo antagonista anti-CGRP envolve anticorpos que bloqueiam, antagonizam, suprimem ou reduzem (incluindo significantemente) a ativida- de biológica de CGRP, incluindo trajetórias a jusantes medidas por sinaliza- ção de CGRP, tal como ligação de receptor e/ou extração de uma resposta celular para CGRP. Para proposta da presente invenção, será explicitamente compreendido que o termo "anticorpo antagonista anti-CGRP" envolve todos os termos anteriormente identificados, títulos, e estados funcionais e carac- terísticas, onde o próprio CGRP, uma atividade biológica de CGRP (incluin- do, mas não limitada a sua capacidade de mediar qualquer aspecto de dor de cabeça), ou as conseqüências da atividade biológica, são substancial- mente anuladas, diminuídas ou neutralizadas em qualquer grau significante. Em algumas concretizações, um anticorpo antagonista anti-CGRP se liga ao CGRP, e impede a ligação de CGRP a um receptor de CGRP. Em outras concretizações, um anticorpo anti-CGRP se liga ao CGRP e impede ativação de um receptor de CGRP. Exemplos de anticorpos antagonistas de anti- CGRP são providos aqui.
Conforme usado aqui, os termos "G1" e "anticorpo G1" são usa- dos permutavelmente para se referirem a um anticorpo produzido por veto- res de expressão tendo números de depósito de ATCC PTA-6867 e ATCC PTA-6866. As seqüências de aminoácido das regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve são mostradas na Figura 5. As porções de CDR de anticorpo G1 (incluindo CDRs de Chothia e de Kabat) são diagramaticamen- te representadas na Figura 5. Os polinucleotídeos que codificam as regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve são mostrados em SEQ ID NO:9 e SEQ ID NO: 10. A caracterização de G1 é descrita nos Exemplos.
Os termos "polipeptídeo", "oligopeptídeo", "peptídeo" e "proteí- na" são usados permutavelmente aqui para referirem-se a polímeros de a- minoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramifi- cado, podendo compreender aminoácidos modificados, e pode ser interrom- pido por não-aminoácidos. Os termos também envolvem um polímero de aminoácido que tenha sido modificado naturalmente, ou por intervenção; por exemplo, formação de ligação de disulfito, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação, ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como conju- gação com um componente de rotulação. Também incluídos dentro da defi- nição estão, por exemplo, polipeptídeos contendo um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não-naturais, etc.), bem como outras modificações conhecidas na técnica. É compreendido que, devido aos polipeptídeos desta invenção serem baseados em um anticorpo, os polipeptídeos podem ocorrer como cadeias simples ou cadeias associa- das. "Polinucleotídeo," ou "ácido nucléico," conforme usados permu- tavelmente aqui, se referem polímeros de nucleotídeos de qualquer compri- mento, e incluem DNA e RNA. Os nucleotídeos podem ser deoxirribonucleo- tídeos, ribonucleotídeos, nucleotídeos modificados ou bases, e/ou seus aná- logos, ou qualquer substrato que pode ser incorporado em um polímero por polimerase de DNA ou RNA. Um polinucleotídeo pode compreender nucleo- tídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e seus análogos. Se presente, a modificação à estrutura do nucleotídeo pode ser concedida antes ou após montagem do polímero. A seqüência de nucleotídeos pode ser inter- rompida por componentes de não-nucleotídeos. Um polinucleotídeo pode ser adicionalmente modificado após polimerização, tal como por conjugação com um componente de rotulação. Outros tipos de modificações incluem, por exemplo, "coberturas", substituição de um ou mais dos nucleotídeos que ocorrem naturalmente com um análogo, modificações internucleotídeo tais como, por exemplo, aquelas com ligações não-mudadas (por exemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.), e com ligações carregadas (por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquelas con- tendo porções pendentes, tais como, por exemplo, proteínas (por exemplo, nucleases, toxinas, anticorpos, peptídeos de sinal, ply-L-lisina, etc.), aquelas com intercaladores (por exemplo, acridina, psoralen, etc.), aquelas contendo quelantes (por exemplo, metais, metais radioativos, boro, metais oxidantes, etc.), aquelas contendo alquiladores, aquelas com ligações modificadas (por exemplo, ácidos nucléicos alfa anoméricos, etc.), bem como formas modifi- cadas do(s) polinucleotídeo(s). Adicionalmente, qualquer dos grupos hidroxil ordinariamente presentes nos açúcares podem ser substituídos, por exem- plo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos de proteção padrão, ou ativados para preparar ligações adicionais para nucleotídeos adi- cionais, ou podem ser conjugados a suportes sólidos. O terminal OH 5' e 3' pode ser fosforilatado ou substituído com aminas ou porções de grupo de capeamento orgânico de a partir de 1 a 20 átomos de carbono. Outros hidro- xis podem também serem derivatizados para grupos de proteção padrão. Os polinucleotídeos podem também conterem formas análogas de ribose ou açúcares de desoxirribose que são geralmente conhecidos na técnica, inclu- indo, por exemplo, 2'-0-metil-, 2'-0-alil-, 2'-flúor-ou 2,-azido-ribose, análogos de açúcar carbocíclico, açúcares α-anoméricos, açúcares epiméricos, tais como arabinose, xiloses ou lixoses, açúcares de piranose, açúcares de fura- nose, sedoheptuloses, análogos acíclicos e análogos de nucleosídeo abási- co, tal como metil ribosídeo. Uma ou mais ligações de fosfodiéster podem ser substituídas por grupos dê ligação alternativos. Estes grupos de ligação alternativos incluem, mas não estão limitados a, concretizações nas quais fosfato é substituído por P(O)SCtioato"), P(S)S ("ditioato"), (O)NR2-Camida- to"), P(O)R, P(O)OR', CO ou CH2 ("formacetal"), em que cada R ou R' é in- dependentemente H ou alquila substituída ou não-substituída (1-20 C), op- cionalmente contendo uma ligação de éter (-0-), arila, alquenila, cicloalquila, cicloalquenila ou araldila. Nem todas as ligações em um polinucleotídeo ne- cessitam ser idênticas. A descrição precedente se aplica a todos os polinu- cleotídeos referidos aqui, incluindo RNA e DNA.
Uma "região variável" de um anticorpo se refere à região variável da cadeia leve do anticorpo, ou a região variável da cadeia pesada do anti- corpo, ou sozinhas ou em combinação. As regiões variáveis da cadeia pesa- da e leve consistem, cada, em quatro regiões de estrutura (FR) Iigantes por três regiões de determinação de complementaridade (CDRs) também co- nhecidas como regiões hipervariáveis. As CDRs em cada cadeia são manti- das juntas em proximidade pelas FRs e, com as CDRs a partir da outra ca- deia, contribuem para a formação do local de ligação de antígeno de anti- corpos. Existem pelo menos duas técnicas para determinar CDRs: (1) uma aproximação baseada na variabilidade de seqüência de espécie cruzada (isto é, Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)); e (2) uma aproxima- ção baseada em estudos cristalográficos de complexos de antígeno- anticorpo (Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)). Conforme usado aqui, uma CDR pode se referir a CDRs definidas por qualquer apro- ximação, ou por uma combinação de ambas as aproximações.
Uma "região constante" de um anticorpo se refere à região cons- tante da cadeia leve do anticorpo, ou a região constante da cadeia pesada do anticorpo, ou sozinhas ou em combinação.
Um epítopo que "se liga preferencialmente" ou "se liga especifi- camente" (usado permutavelmente aqui) a um anticorpo, ou a um polipeptí- deo, é o termo bem compreendido na técnica, e métodos para determinar tal ligação específica ou preferencial são também bem-conhecidos na técnica. Uma molécula é referida para exibir "ligação específica" ou "ligação prefe- rencial" se ela reage ou se associa mais freqüentemente, mais rapidamente, com maior duração, e/ou com maior afinidade, com uma célula ou substân- cia particular do que com células ou substâncias alternativas. Um anticorpo "se liga especificamente" ou "se liga preferencialmente" a um alvo se ele se liga com maior afinidade, avidez, mais prontamente, e/ou com maior duração do que ele se liga a outras substâncias. Por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente ou preferencialmente a um epítopo de CGRP é um an- ticorpo que se liga a este epítopo com maior afinidade, avidez, mais pronta- mente, e/ou com maior duração do que se liga a outros epítopos de CGRP ou epítopos de não-CGRP. É também compreendido pela leitura desta defi- nição que, por exemplo, um anticorpo (ou porção ou epítopo) que se liga especificamente ou preferencialmente a um primeiro alvo pode ou não pode se ligar especificamente ou preferencialmente a um segundo alvo. Como tal, "ligação específica" ou "ligação preferencial" não requer necessariamente (embora possa incluir) ligação exclusiva. Geralmente, mas não necessaria- mente, referência a ligação significa ligação preferencial.
Conforme usado aqui, "substancialmente puro" se refere a mate- rial que é pelo menos 50% puro (isto é, livre de contaminantes), mais prefe- rivelmente pelo menos 90% puro, mais preferivelmente pelo menos 95% pu- ro, mais preferivelmente pelo menos 98% puro, mais preferivelmente pelo menos 99% puro.
Uma "célula hospedeira" inclui uma célula individual ou cultura de célula que pode ser ou tenha sido um recipiente para vetor(es) para in- corporação de insertos de polinucleotídeo. As células hospedeiras incluem progenia de uma célula hospedeira simples, e a progenia não pode necessa- riamente ser completamente idêntica (na morfologia ou em complemento de DNA genômico) à célula fonte original, ácido, ou mutação deliberada. Uma célula hospedeira inclui células transfectadas in vivo com um polinucleotí- deo(s) desta invenção.
O termo "região Fc" é usado para definir uma região de terminal C de uma cadeia pesada de imunoglobulina. A "região Fc" pode ser uma região Fc de seqüência nativa, ou uma região Fc variante. Embora os limites da região Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina possam variar, a re- gião Fc de cadeia pesada de IgG humano é usualmente definida para esten- der-se de um resíduo de aminoácido na posição Cys226, ou de Pro230, para o terminal carboxila deste. A numeração dos resíduos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat. Kabat et al., Sequences of Proteins of Imu- nological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991. A região Fc de uma imunoglobulina geralmente com- preende dois domínios constantes, CH2 e CH3.
Conforme usado aqui, "receptor Fe" e "FcR" descreve um recep- tor que se liga a região Fc de um anticorpo. O FcR preferido é um FcR hu- mano de seqüência nativa. Além disso, um FcR preferido é um que se liga a um anticorpo IgG (um receptor gama), e inclui receptores das subclasses FcyRI , FcyRII, e FcyRIII, incluindo variantes alélicas e alternativamente for- mas unidas destes receptores. Os receptores FcyRII incluem FcyRIIA (um "receptor de ativação" e FcyRIIB (um "receptor de inibição"), que têm se- qüência de aminoácidos similares que diferem principalmente nos domínios citoplásmicos destes. Os FcRs são revistos em Ravetch and Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92; Capei et al., 1994, Immunomethods, 4:25-34; and de Haas et al., 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41. O "FcR" também inclui receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs maternais para o feto (Guyer et al., 1976, J. Immunol., 117:587; and Kim et al., 1994, J. Immunol., 24:249).
"Citotoxicidade dependente do complemento" e "CDC" se refe- rem à lisação de um alvo na presença de complemento. A trajetória de ativa- ção de complemento é iniciada pela ligação do primeiro componente do sis- tema de complemento (C1q) para uma molécula (por exemplo, um anticorpo) complexado com um antígeno cognato. Para acessar a ativação de comple- mento, um ensaio de CDC, por exemplo, conforme descrito em Gazzano- Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996), pode ser realizado.
Uma "região Fc funcional" possui pelo menos uma função execu- tora de uma região Fc de seqüência nativa. "Funções executoras" exempla- res incluem ligação de C1q; citotoxicidade dependente de complemento (CDC); ligação de receptor Fc; citotoxicidade mediada por célula dependente do anticorpo (ADCC); fagocitose; sub-regulação de receptores de superfície de célula (por exemplo, receptor de célula B; BCR), etc. Tais funções execu- toras geralmente requerem que a região Fc seja combinada com um domínio de ligação (por exemplo, um domínio variável de anticorpo), e podem ser acessadas usando-se vários ensaios conhecidos na técnica para avaliar tais funções executoras de anticorpo.
Uma "região Fc de seqüência nativa" compreende uma seqüên- cia de aminoácido idêntica à seqüência de aminoácido de uma região Fc encontrada na natureza. Uma "região Fc variante" compreende uma se- qüência de aminoácido que difere daquela de uma região Fc de seqüência nativa em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido, ainda re- tém pelo menos uma função executora da região Fc de seqüência nativa. Preferivelmente, a região Fc variante tem pelo menos uma substituição de aminoácido comparada a uma região Fc de seqüência nativa, ou a região Fc de um polipeptídeo de origem, por exemplo, de cerca de uma a cerca de dez substituições de aminoácido, e preferivelmente de cerca de uma a cerca de cinco substituições de aminoácido em uma região Fc de seqüência nativa, ou na região Fc do polipeptídeo de origem. A região Fc variante aqui preferi- velmente possuirá pelo menos cerca de 80% de identidade de seqüência com uma região Fc de seqüência nativa e/ou com uma região Fc de um poli- peptídeo de origem, e, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 90% de identidade de seqüência, mais preferivelmente pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% de identidade de seqüência. Conforme usado aqui, "citotoxicidade mediada por célula depen- dente de anticorpo" e "ADCC" se referem a uma reação mediada por célula na qual células citotóxicas não-específicas que expressam receptores Fc (FcRs) (por exemplo, células matadoras naturais (NK), neutrófilos, e macró- fagos) reconhecem anticorpo ligado a uma célula alvo e, subseqüentemente, causam Iisis da célula alvo. A atividade de ADCC de uma molécula de inte- resse pode ser acessada usando-se um ensaio de ADCC in vitro, tal como aquele descrito nas Patentes dos Estados Unidos N9 5.500.362 ou 5.821.337. Células executoras úteis para tais ensaios incluem células mono- nucleares de sangue periférico (PBMC) e células NK. Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser a- cessada in vivo, por exemplo, em um modelo animal, tal como aquele reve- lado em Clynes et al., 1998, PNAS (USA), 95:652-656.
Conforme usado aqui, "tratamento" é uma aproximação para obtenção de resultados clínicos benéficos ou desejados. Para proposta des- ,ta invenção, os resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não 1 estão limitados a, um ou mais dos seguintes: aperfeiçoamento em qualquer aspecto de uma dor de cabeça incluindo redução da severidade, alívio de intensidade de dor, e outros sintomas associados, redução da freqüência de recorrência, aumento da qualidade de vida daqueles que sofrem de dor de cabeça, e diminuição da dose de outros medicamentos requeridos para tra- tar a dor de cabeça. Para enxaqueca, outros sintomas associados incluem, mas não estão limitados a, náusea, vômito, e sensibilidade à luz, som, e/ou movimento. Para cluster dor de cabeça, outros sintomas associados inclu- em, mas não estão limitados a, inchaço sobre ou ao redor dos olhos, lágri- mas excessivas, olho vermelho, rinorréia ou congestão nasal, e face enrube- cida vermelha.
"Redução de incidência" de dor de cabeça significa qualquer de redução de severidade (que pode incluir redução da necessidade de, e/ou quantidade de (por exemplo, exposição para) outras fármacos, e/ou terapias geralmente usadas para esta condição, incluindo, por exemplo, ergotamina, dihidroergotamina, ou triptanos para enxaqueca), duração, e/ou freqüência (incluindo, por exemplo, retardo ou aumento do tempo para o próximo ata- que episódico em um indivíduo). Conforme é compreendido por aqueles téc- nicos no assunto, os indivíduos podem variar em termos de sua resposta ao tratamento, e, como tal, por exemplo, um "método de redução de incidência de dor de cabeça em um indivíduo" reflete administrar o anticorpo antagonis- ta anti-CGRP baseado na expectativa razoável que tal administração pode, do mesmo modo, causar tal redução na incidência naquele indivíduo particu- lar.
"Melhora" da dor de cabeça ou um ou mais sintomas de dor de cabeça significa uma diminuição ou aperfeiçoamento de um ou mais sinto- mas de dor de cabeça conforme comparado a não administrar um anticorpo antagonista anti-CGRP. "Melhora" também inclui diminuição ou redução na duração de um sintoma.
Conforme usado aqui, "controle da dor de cabeça" se refere a manutenção ou redução da severidade ou duração de um ou mais sintomas de dor de cabeça, ou freqüência de ataques de dor de cabeça em um indiví- duo (conforme comparado ao nível antes do tratamento). Por exemplo, a duração ou severidade de dor de cabeça, ou freqüência de ataques, é redu- zida por pelo menos cerca de qualquer de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, ou 70% no indivíduo conforme comparado ao nível antes do tratamento.
Conforme aqui usado, "retardamento" do desenvolvimento de dor de cabeça significa adiar, impedir, reduzir, retardar, estabilizar, e/ou pos- por a progressão da doença. Este retardo pode ser de comprimentos varia- dos de tempo, dependendo da história da doença e/ou indivíduos sendo tra- tados. Conforme é evidente a um técnico no assunto, um retardo suficiente ou significante pode, com efeito, envolver prevenção, em que o indivíduo não desenvolve dor de cabeça (por exemplo, enxaqueca). Um método que "retarda" o desenvolvimento do sintoma é um método que reduz a probabili- dade de desenvolvimento do sintoma em uma dada estrutura de tempo, e/ou reduz a extensão dos sintomas em uma dada estrutura de tempo, quando comparado a não usando o método. Tais comparações são tipicamente ba- seadas nos estudos clínicos, usando um número estatisticamente significan- te de indivíduos.
"Desenvolvimento" ou "progressão" de dor de cabeça significa manifestações iniciais e/ou seguindo-se progressão da enfermidade. O de- senvolvimento de dor de cabeça pode ser detectável e acessado usando-se técnicas clínicas padrões, bem como conhecidas na técnica. Contudo, o de- senvolvimento também refere-se a progressão que pode ser não-detectável. Para proposta desta invenção, o desenvolvimento ou progressão refere-se ao curso biológico dos sintomas. "Desenvolvimento" inclui ocorrência, recor- rência e ataque. Conforme usado aqui "ataque" ou "ocorrência" de dor de cabeça inclui ataque inicial e/ou recorrência.
Conforme usado aqui, uma "dopagem eficaz" ou "quantidade eficaz" de fármaco, composto, ou composição farmacêutica é uma quantida- de suficiente para efetuar resultados benéficos ou desejados. Para uso profi- lático, os resultados benéficos ou desejados incluem resultados, tais como eliminação ou redução do risco, diminuição da severidade, ou retardamento do início da doença, incluindo sintomas bioquímicos, histológicos e/ou com- portamentais da doença, suas complicações e fenótipos patológicos inter- mediários apresentados durante desenvolvimento da doença. Para uso tera- pêutico, os resultados benéficos e desejados incluem resultados, tais como redução da intensidade da dor, duração, ou freqüência de ataque de dor de cabeça, e diminuindo um ou mais sintomas resultantes da dor de cabeça (bioquímicos, histológicos e/ou comportamentais), incluindo suas complica- ções e fenótipos patológicos intermediários apresentados durante desenvol- vimento da doença, aumentando a qualidade de vida daqueles que sofrem da doença, diminuindo a dose de outras medicações requeridas para tratar a doença, aumentando o efeito de outra medicação, e/ou retardando a pro- gressão da doença de pacientes. Uma dosagem eficaz pode ser administra- da em uma ou mais administrações. Para proposta desta invenção, uma do- sagem eficaz de fármaco, composto, ou composição farmacêutica é uma quantidade suficiente para efetuar tratamento profilático ou terapêutico ou diretamente ou indiretamente. Conforme é compreendido no contexto clínico, uma dosagem eficaz de um fármaco, composto, ou composição farmacêuti- ca pode ou não pode ser alcançada em conjunto com outro fármaco, com- posto, ou composição farmacêutica. Desse modo, uma "dosagem eficaz" pode ser considerada no contexto de administrar um ou mais agentes tera- pêuticos, e um agente simples pode ser considerado para ser dado em uma quantidade eficaz se, em conjunto com um ou mais outros agentes, um re- sultado desejável pode ser ou é alcançado.
Um "indivíduo" ou uma "vítima" é um mamífero, mais preferivel- mente um humano. Os mamíferos também incluem, mas não estão limitados a, animais de fazenda, animais esportivos, animais domésticos, primatas, cavalos, cães, gatos, camundongos e ratos.
Conforme usado aqui, "vetor" significa uma construção, que é capaz de distribuir, e, preferivelmente, expressar, um ou mais gene(s) ou seqüência(s) de interesse em uma célula hospedeira. Exemplos of vetores incluem, mas não estão limitados a, vetores virais, vetores de expressão de DNA ou RNA desprotegidos, plasmídeo, vetores de cosmídeo ou fago, veto- res de DNA ou RNA de expressão associados com agentes de condensação catiônicos, vetores de DNA ou RNA de expressão encapsulados nos Iipos- somos, e certas células eucarióticas, tais como células produtoras.
Conforme usado aqui, "seqüência de controle de expressão" significa uma seqüência de ácido nucléico que dirige transcrição de um ácido nucléico. Uma seqüência de controle de expressão pode ser um promotor, tal como um promotor constitutivo ou induzível, ou um intensificador. A se- qüência de controle de expressão é operavelmente igante à seqüência de ácido nucléico a ser transcrita.
Conforme usado aqui, "veículo farmaceuticamente aceitável" ou "excipiente farmaceuticamente aceitável" incluem qualquer material que, quando combinado com um ingrediente ativo, permite que o ingrediente re- tenha atividade biológica e não-reativa com o sistema imune do indivíduo. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, qualquer dos veículos farma- cêuticos padrões, tais como uma solução salina tamponada por fosfato, á- gua, emulsões, tais como emulsão de óleo/água, e vários tipos de agentes de umedecimento. Diluentes preferidos para administração aerosol ou pa- renteral são salina tamponada por fosfato ou salina normal (0,9%). As com- posições compreendendo tais veículos são formuladas por métodos conven- cionais bem-conhecidos (vide, por exemplo, Remington1S Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; and Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing1 2000).
O termo "kon". conforme usado aqui, é pretendido para se referir a constante de taxa para associação de um anticorpo a um antígeno.
O termo "IW, conforme usado aqui, é pretendido para se referir a constante de taxa para dissociação de um anticorpo a partir do anticor- po/complexo de antígeno.
O termo "KD", conforme usado aqui, é pretendido para se referir a constante de equilíbrio de dissociação de uma interação anticorpo- antígeno.
Conforme usado aqui, o termo "sintoma vasomotor," é pretendi- do para se referir às condições relacionadas a vasodilatação, e incluem, mas não estão limitados a, dor de cabeça (tal como enxaqueca, ...outras), febre (ou lampejos quentes), lampejos frios, insônia, distúrbios de sono, enfermi- dades de humor, irritabilidade, transpiração excessiva, suadores noturnos, suores diurnos, fadiga, e similares, causados por, entre outros, disfunção termorregulatória.
Conforme usado aqui, os termos "rubor", "febre" e "lampejo quente" são termos reconhecidos na técnica que referem-se a um distúrbio episódico na temperatura do corpo tipicamente consistindo em um rubor sú- bito da pele, usualmente acompanhado por transpiração em um indivíduo. A. Métodos para prevenir ou tratar sintoma vasomotores
Em um aspecto, a invenção proporciona um método para tratar ou prevenir pelo menos um sintoma vasomotor, tal como dor de cabeça (por exemplo, enxaqueca) ou febres, em um indivíduo compreendendo adminis- trar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo antagonista anti- CGRP, ou polipeptídeos derivados do anticorpo.
Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para me- lhorar, controlar, reduzir incidência de, ou retardar o desenvolvimento ou progressão de pelo menos um sintoma vasomotor, tal como dor de cabeça (por exemplo, enxaqueca) ou febres, em um indivíduo compreendendo ad- ministrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo antagonista anti-CGRP.
Em outro aspecto, a invenção proporciona métodos para melho- rar, controlar, reduzir incidência de, ou retardar o desenvolvimento ou pro- gressão de dor de cabeça (por exemplo, enxaqueca) em um indivíduo com- preendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo antagonista anti-CGRP em combinação com pelo menos um agente adicio- nal útil para tratar dor de cabeça.
Tais agentes adicionais incluem, mas não estão limitados a, a- gonitas de 5-HT e NSAIDs. Por exemplo, o anticorpo e o pelo menos um a- gente adicional pode ser concomitantemente administrado, isto é, eles po- dem ser dados em proximidade temporal próxima bastante para permitir que seus efeitos terapêuticos no indivíduo se sobreponham. Por exemplo, a quantidade de antagonistas de 5-HT ou NSAID administrados em combina- ção com um anticorpo anti-CGRP deve ser suficiente para reduzir a freqüên- cia de dor de cabeça decorrida em pacientes, ou produzir eficácia mais Ion- ga durável comparada à administração de ou um destes agentes na ausên- cia do outro. Este procedimento pode ser usado para tratar dores de cabeça que caem em qualquer de uma variedade de classes incluindo: enxaqueca com ou sem aura; enxaqueca hemiplégica; grupo dores de cabeça; neuralgia de enxaqueca; dores de cabeça crônicas; dores de cabeça por tensão; dores de cabeça resultantes de outras condições médicas (tais como infecção ou pressão aumentada na cabeça devido a um tumor); hemicrania paroximal crônica; variedade de dores de cabeça não-associadas com uma lesão es- trutural; dor de cabeça associada com uma enfermidade intracranial não- vascular; dor de cabeça associada com a administração de uma substância ou sua retirada; dor de cabeça associada com infecção não-cefálica; dor de cabeça associada com uma enfermidade metabólica; dor de cabeça associ- ada com uma enfermidade do crânio, pescoço, olhos, orelhas, nariz, seios, dentes, boca ou outra estrutura facial ou cranial; neuralgias craniais; e dor do tronco do nervo e dor de desaterenciação.
Aqueles técnicos no assunto serão capazes de determinar quan- tidades de dosagem apropriadas para agentes particulares a serem usados em combinação com um anticorpo anti-CGRP. Por exemplo, sumatriptan pode ser administrado em uma dosagem de cerca de 0,01 a cerca de 300 mg. Quando administrada não-parenteralmente, a dosagem típica de suma- triptan é de cerca de 25 a cerca de 100 mg, com cerca de 50 mg sendo ge- ralmente preferida e, quando administrada parenteralmente, a dosagem pre- ferida é cerca de 6 mg. Contudo, estas dosagens podem ser variadas de acordo com os métodos padrões na técnica de modo que elas são optimiza- das para um paciente particular, ou para uma terapia de combinação particu- lar. Adicionalmente, por exemplo, celecoxib pode ser administrada em uma quantidade de entre 50 e 500 mg.
Em outro aspecto, a invenção proporciona métodos para melho- rar, controlar, reduzir incidência de, ou retardar o desenvolvimento ou pro- gressão de febres em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo antagonista anti-CGRP em combi- nação com pelo menos um agente adicional útil para tratar febres. Tais a- gentes adicionais incluem, mas não estão limitados a, tratamentos baseados em hormônio, incluindo estrogênios e/ou alguns progestinas.
Com relação a todos os métodos aqui descritos, referência a anticorpos antagonistas de anti-CGRP também inclui composições compre- endendo um ou mais destes agentes. Estas composições podem adicional- mente compreender excipientes adequados, tais como excipientes farma- ceuticamente aceitáveis incluindo tampões, que são bem-conhecidos na técnica. A presente invenção pode ser usada sozinha ou em combinação com outros métodos convencionais de tratamento.
O anticorpo antagonista anti-CGRP pode ser administrado a um indivíduo via qualquer rota adequada. Deve ser aparente a um técnico no assunto que exemplos aqui descritos não são pretendidos como limitativos, mas para serem ilustrativos das técnicas disponíveis. Conseqüentemente, em algumas concretizações, o anticorpo antagonista anti-CGRP é adminis- trado a um indivíduo de acordo com métodos conhecidos, tais como admi- nistração intravenosa, por exemplo, como uma massa ou por infusão contí- nua sobre um período de tempo, por rotas intramuscular, intraperitoneal, in- tracerebroespinhal, subcutânea, intra-articular, sublingualmente, intrasinovi- al, via insuflação, intratecal, oral, inalação ou tópicas. A administração pode ser sistêmica, por exemplo, administração intravenosa, ou localizada. Nebu- lizadores comercialmente disponíveis para formulações líquidas, incluindo nebulizadores de jato e nebulizadores ultrassônicos, são úteis para adminis- tração. Formulações líquidas podem ser diretamente nebulizadas e Iiofiliza- das, pó pode ser nebulizado após reconstituição. Alternativamente, o anti- corpo antagonista anti-CGRP pode ser aerosolizado usando-se uma formu- lação de flúorcarbono e um inalador de dose medida, ou inalada como um pó liofilizado e moído.
Em uma concretização, um anticorpo antagonista anti-CGRP é administrado via técnicas de distribuição de local específico ou de local alvo. Exemplos de técnicas de distribuição de local específico ou de local alvo in- cluem várias fontes de depósito implantáveis do anticorpo antagonista anti- CGRP, ou cateteres de distribuição local, tais como cateteres de infusão, um cateter de residência, ou um cateter de agulha, enxertos sintéticos, envoltó- rios adventiciais, desvios e stents, ou outros dispositivos implantáveis, trans- portadores específicos de local, injeção direta, ou aplicação direta. Vide, por exemplo, Publicação PCT No. WO 00/53211 e Patente U.S. No. 5.981.568.
Várias formulações de um anticorpo antagonista anti-CGRP po- dem ser usadas para administração. Em algumas concretizações, o anticor- po antagonista anti-CGRP pode ser administrado limpo. Em algumas concre- tizações, o anticorpo antagonista anti-CGRP e um excipiente farmaceutica- mente aceitável podem estar em várias formulações. Os excipientes farma- ceuticamente aceitáveis são conhecidos na técnica, e são substâncias relati- vãmente inertes que facilitam a administração de uma substância farmacolo- gicamente eficaz. Por exemplo, um excipiente pode dar forma ou consistên- cia, ou agir como um diluente. Excipientes adequados incluem, mas não es- tão limitados a, agentes de estabilização, agentes de emulsificação e agen- tes de umedecimento, sais para variação de osmolaridade, agentes de en- capsulamento, tampões, e intensificadores de penetração de pele. Excipien- tes, bem como formulações para distribuição de fármaco parenteral e não- parenteral são colocadas em Remington, The Science and Practice of Phar- macy 20th Ed. Mack Publishing (2000).
Em algumas concretizações, estes agentes são formulados para administração por injeção (por exemplo, intraperitonealmente, intravenosa- mente, subcutaneamente, intramuscularmente, etc.). Conseqüentemente, estes agentes podem ser combinados com veículos farmaceuticamente acei- táveis, tais como solução de Ringer, solução de dextrose, e similares. Os regimes de dosagem particular, isto é, dose, regulação e repetição, depen- derão do indivíduo particular, e da história médica do indivíduo.
Um anticorpo anti-CGRP pode ser administrado usando-se qual- quer método adequado, incluindo por injeção (por exemplo, intraperitoneal- mente, intravenosamente, subcutaneamente, intramuscularmente, etc.). Os anticorpos anti-CGRP podem ser também administrados via inalação, con- forme descrito aqui. Geralmente, para administração de anticorpos anti- CGRP, uma dosagem candidata inicial pode ser cerca de 2 mg/kg. Para a proposta da presente invenção, uma dosagem diária típica pode variar de cerca de qualquer de 3pg/kg a 30 pg/kg a 300 pg/kg a 3 mg/kg, a 30 mg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Por e- xemplo, dosagem de cerca de 1 mg/kg, cerca de 2,5 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 10 mg/kg, e cerca de 25 mg/kg pode ser usada. Para admi- nistrações repetidas por vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é sustentado até que uma supressão desejada de sintomas ocor- ra, ou até que níveis terapêuticos suficientes sejam alcançados, por exem- plo, para reduzir a dor. Um regime de dosagem exemplar compreende admi- nistrar uma dose inicial de cerca de 2 mg/kg, seguido por uma dose de ma- nutenção semanal de 1 mg/kg do anticorpo anti-CGRP, ou seguido por uma dose de manutenção de cerca de 1 mg/kg toda semana. Contudo, outros regimes de dopagem podem ser úteis, dependendo do modelo de queda farmacocinético que o praticante deseja alcançar. Por exemplo, em algumas concretizações, a dosagem de uma a quatro vezes ao dia é contemplada. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios con- vencionais. O regime de dosagem (incluindo o(s) antagonista(s) de CGRP usado(s)) pode variar com o tempo.
Para a proposta da presente invenção, a dosagem apropriada de um anticorpo antagonista anti-CGRP dependerá do anticorpo antagonista anti-CGRP (ou composições destes) empregado, do tipo e severidade da dor de cabeça (por exemplo, enxaqueca) a ser tratada, se o agente é adminis- trado para proposta preventiva ou terapêutica, terapia anterior, da história clínica do paciente, e da resposta ao agente, e da discrição do médico aten- dente. Tipicamente, o clínico administrará um anticorpo antagonista anti- CGRP, até que uma dosagem é alcançada, que alcança o resultado deseja- do. Á dose e/ou freqüência pode variar no curso dò tratamento.
Considerações empíricas, tal como a meia-vida, geralmente con- tribuem para a determinação da dosagem. Por exemplo, anticorpos que são compatíveis com o sistema imune humano, tais como anticorpos humaniza- dos, ou anticorpos totalmente humanos, podem ser usados para prolongar a meia-vida do anticorpo, e para impedir o anticorpo de ser atacado pelo sis- tema imune do hospedeiro. A freqüência de administração pode ser determi- nada e ajustada no curso da terapia, e é geralmente, mas não necessaria- mente, baseada no tratamento e/ou supressão e/ou melhora e/ou retardo de dor de cabeça (por exemplo, enxaqueca). Alternativamente, formulações de liberação contínua sustentada de anticorpos antagonistas de anti-CGRP po- dem ser apropriadas. Várias formulações e dispositivos para alcançar libera- ção sustentada são conhecidos na técnica.
Em uma concretização, dosagens para um anticorpo antagonista anti-CGRP podem ser determinadas empiricamente em indivíduos que foram dadas uma ou mais administração(ões) de um anticorpo antagonista anti- CGRP. Aos indivíduos são dadas dosagens de incremento de um anticorpo antagonista anti-CGRP. Para acessar a eficácia de um anticorpo antagonista anti-CGRP, um indicador da doença pode ser seguido. A administração de um anticorpo antagonista anti-CGRP, de a- cordo com o método na presente invenção, pode ser contínua ou intermiten- te, dependendo, por exemplo, da condição fisiológica do recipiente, se a proposta da administração é terapêutica ou profilática, e outros fatores co- nhecidos aos técnicos versados. A administração de um anticorpo antago- nista anti-CGRP pode ser essencialmente contínua sobre um período pré- selecionado de tempo, ou pode ser em uma série de dose espaçada, por exemplo, ou antes, durante, ou após desenvolvimento da dor de cabeça (por exemplo, enxaqueca); antes; durante; antes e após; durante e após; antes e durante; ou antes, durante, e após desenvolvimento de dor de cabeça. A administração pode ser antes, durante e/ou após qualquer evento similar- mente para dar ocorrência a dor de cabeça.
Em algumas concretizações, mais do que um anticorpo antago- nista anti-CGRP podem estar presentes. Pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, ou mais anticorpos antagonistas anti-CGRP diferentes podem estar presentes. Geralmente, a- queles anticorpos antagonistas anti-CGRP podem ter atividades complemen- tares que não afetam adversamente um outro. Um antagonista de anti- CGRP pode também ser usado em conjunto com outros antagonistas de CGRP, ou antagonistas receptores de CGRP. Por exemplo, um ou mais dos seguintes antagonistas de CGRP podem ser usados: uma molécula de anti- sentido dirigida a um CGRP (incluindo uma molécula de anti-sentido dirigida a um ácido nucléico que codifica CGRP), ou um composto inibitório de C- GRP, um análogo estrutural de CGRP, uma mutação negativa dominante de um receptor de CGRP que se liga a um CGRP, e um anticorpo receptor de anti-CGRP. Um anticorpo antagonista anti-CGRP pode também ser usado em conjunto com outros agentes que servem para aumentar e/ou comple- mentar a eficiência dos agentes.
Formulações terapêuticas do anticorpo antagonista anti-CGRP usadas de acordo com a presente invenção são preparadas para armaze- namento pela mistura de um anticorpo tendo o grau desejado de pureza com veículos farmaceuticamente aceitáveis opcionais, excipientes ou estabiliza- dores (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)), na forma de formulações Iiofilizadas ou soluções aquo- sas. Veículos, excipientes ou estabilizadores aceitáveis são não-tóxicos a recipientes nas dosagens e concentrações empregadas, e podem compre- ender tampões, tais como, fosfato, citrato e os outros ácidos orgânicos; sais, tais como cloreto de sódio; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metio- nina; conservantes (tais como octadecildimetilbenzil cloreto de amônia; clo- reto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, butil ou benzil álcool; alquil parabenos, tais como metila ou propil parabeno; catecol; resorcinol; çiclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina de soro, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, aspa- ragina, histidína, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e ou- tros carboidratos incluindo glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes, tal como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, trehalose ou sorbitol; contadores de íon de formação de sal tal como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos de proteína de Zn); e/ou tensoativos não-iônicos, tais como TWEEN™, PLURONICS™, ou polietileno glicol (PEG).
Lipossomas contendo o anticorpo antagonista anti-CGRP são preparados por métodos conhecidos na técnica, tais como descritos em Eps- tein, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:3688 (1985); Hwang, et al., Proc. Natl Acad. Sei. USA 77:4030 (1980); e Patentes dos Estados Unidos Nos. 4.485.045 e 4.544.545. Lipossomas com tempo de circulação aumentado são revelados na Patente U.S. No. 5.013.556. Lipossomas particularmente úteis podem ser gerados por método de evaporação de fase reversa com uma composição de lipídeo compreendendo fosfatidileolina, colesterol e fos- fatidiletanolamina derivatizada de PEG (PEG-PE). Os Iipossomas são extru- dados através de filtros de tamanho de poro definido para produzir Iiposso- mas com o diâmetro desejado.
Os ingredientes ativos podem ser também presos em microcáp- sulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação, ou por polime- rização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e poli-(metilmetacilato) microcápsulas, respectivamente, em siste- mas de distribuição de fármaco coloidal (por exemplo, lipossomas, microes- feras de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas), ou em macroemulsões. Tais técnicas são reveladas em Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000).
Preparações de liberação sustentada podem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem ma- trizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o anticor- po, cujas matrizes estão na forma de artigos moldados, por exemplo, pelícu- las, ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação sustentada inclu- em poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), ou po- li(v nilálcool)), polilactídeos (Patente nos Estados Unidos No. 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e 7 etil-L-glutamato, etileno-vinil acetato não-degradável, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradáveis tal como o LUPRON DEPOT ™ (microesferas injetáveis compostas de copolí- mero de ácido láctico-ácido glicólico e Ieuprolide acetato), sacarose acetato isobutirato, e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
As formulações a serem usadas para administração in vivo de- vem ser estéreis. Isto é prontamente efetuado por, por exemplo, filtração a- través de membranas de filtração estéreis. Composições terapêuticas de anticorpo antagonista anti-CGRP são geralmente colocadas em um recipien- te tendo um orifício de acesso estéril, por exemplo, um saco de solução in- travenosa, ou frasco tendo um parador perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica.
As composições de acordo com a presente invenção podem ser em formas de dosagem de unidade, tais como comprimidos, pílulas, cápsu- las, pós, grânulos, soluções ou suspensões, ou supositórios, para adminis- tração oral, parenteral ou retal, ou administração por inalação ou insuflação.
Para preparação de composições sólidas, tais como comprimi- dos, o ingrediente ativo principal é misturado com um veículo farmacêutico, por exemplo, ingredientes de formação de comprimido convencionais, tais como amido, lactose, sacarose, sorbitol, talco, ácido esteárico, estearato de magnésio, fosfato de dicálcio ou gomas, e outros diluentes farmacêuticos, por exemplo, água, para formar uma composição de pré-formulação sólida contendo uma mistura homogênea de um composto da presente invenção, ou um sal farmaceuticamente aceitável não-tóxico deste. Quando se referem a estas composições de pré-formulação como homogêneas, é significativo que o ingrediente ativo seja disperso constantemente através da composição de modo que a composição pode ser prontamente subdividida em formas de dosagem de unidade igualmente eficazes como comprimidos, pílulas e cáp- sulas. Esta composição de pré-formulação sólida é então subdividida em formas de dosagem de unidade do tipo descrito acima contendo de 0,1 a cerca de 500 mg do ingrediente ativo da presente invenção. Os comprimidos ou pílulas da nova composição podem ser revestidos ou, de outro modo, compostos para proporcionar uma forma de dosagem que proporciona a vantagem de ação prolongada. Por exemplo, os comprimidos ou pílulas po- dem compreender um componente de dosagem interna e um componente de dosagem externa, o último sendo na forma de um envelope sobre o pri- meiro. Os dois componentes podem ser separados por uma camada entéri- ca que serve para resistir a desintegração no estômago, e permitir que o componente interno passe intacto no duodeno, ou seja retardado na libera- ção. Uma variedade de materiais pode ser usada para tais camadas entéri- cas ou revestimentos, tais materiais incluindo um número de ácidos polimé- ricos e misturas de ácidos poliméricos com tais materiais como "shellac", cetil álcool e acetato de celulose.
Agentes tensoativos adequados incluem, em particular, agentes não-iônicos, tais como polioxietilenossorbitanos (por exemplo, Tween™ 20, 40, 60, 80 ou 85), e outros sorbitanos (por exemplo, Span™ 20, 40, 60, 80 ou 85). Composições com um agente tensoativo compreenderão convenien- temente entre 0,05 e 5% de agente tensoativo, e podem estar entre 0,1 e 2,5%. Será apreciado que outros ingredientes podem ser adicionados, por exemplo, manitol ou outros veículos farmaceuticamente aceitáveis, se ne- cessário. Emulsões adequadas podem ser preparadas usando-se emul- sões graxas comercialmente disponíveis, tais como Intralipid™, Liposyn™, Infonutrol™, Lipofundin™ e Lipiphysan™. O ingrediente ativo pode ser, ou dissolvido em uma composição de emulsão pré-misturada, ou alternativa- mente pode ser dissolvido em um óleo (por exemplo, óleo de soja, óleo de girassol, óleo de semente de algodão, óleo de gergelim, óleo de milho, ou óleo de amêndoa), e uma emulsão formada após mistura com um fosfolipí- deo (por exemplo, fosfolipídeos de ovo, fosfolipídeos de soja, ou Iectin de soja) e água. Será apreciado que outros ingredientes podem ser adiciona- dos, por exemplo, ..glice.ro! ou glicose, para ajustar a tonicidade da emulsão. Emulsões adequadas conterão tipicamente até 20% de óleo, por exemplo, entre 5 e 20%. A emulsão graxa pode compreender gotículas de gordura entre 0,1 e 1,0 Im, particularmente 0,1 e 0,5 Im, e tem um pH na faixa de 5,5 a 8,0.
As composições de emulsão podem ser aquelas preparadas pe- la mistura de um anticorpo antagonista anti-CGRP com Intralipid™·, ou os componentes deste (óleo de soja, fosfolipídeos de ovo, glicerol e água).
Composições para inalação ou insuflação incluem soluções e suspensões em solventes orgânicos ou aquosos farmaceuticamente aceitá- veis, ou misturas destes, e pós. As composições líquidas ou sólidas podem conter excipientes farmaceuticamente aceitáveis conforme colocado acima. Em algumas concretizações, as composições são administradas pela rota respiratória oral ou nasal para efeito local ou sistêmico. As composições em solventes farmaceuticamente aceitáveis preferivelmente estéreis podem ser nebulizadas pelo uso de gases. As soluções nebulizadas podem ser respira- das diretamente a partir do dispositivo de nebulização, ou o dispositivo de nebulização pode estar fixado a uma máscara de face, dreno ou máquina de respiração de pressão positiva intermitente. Solução, suspensão ou compo- sições de pó podem ser administradas, preferivelmente oralmente ou nasal- mente, de dispositivos que distribuem a formulação em uma maneira apro- priada.
A diagnose ou avaliação da dor de cabeça é bem estabelecida na técnica. A avaliação pode ser realizada baseada em medidas subjetivas, tais como caracterização dos sintomas do paciente. Por exemplo, a enxa- queca pode ser diagnosticada baseada nos seguintes critérios: 1) ataques episódicos de dor de cabeça durando de 4 a 72 horas; 2) com dois dos se- guintes sintomas: dor unilateral, palpitação, agravação no movimento, e dor de intensidade moderada ou severa; e 3) um dos seguintes sintomas: náu- sea ou vômito, e fotofobia ou fonofobia. Goadsby et al., N. Engl. J. Med. 346:257-270, 2002.
A eficácia do tratamento pode ser avaliada por métodos bem- conhecidos na técnica. Por exemplo, o alívio da dor pode ser avaliado. Con- seqüentemente, em algumas concretizações, o alívio da dor é subjetivamen- te observado após 1, 2, ou umas poucas horas após administrar um anticor- po anti-CGRP. Em algumas concretizações, a freqüência de ataques de dor de cabeça é subjetivamente observada após administrar um anticorpo anti-CGRP.
B. Anticorpos antaaonistas de anti-CGRP
Os métodos da invenção usam um anticorpo antagonista anti- CGRP, que se refere a qualquer molécula de anticorpo que bloqueia, supri- me ou reduz (incluindo significantemente) atividade biológica de CGRP, in- cluindo trajetórias a jusante mediadas por sinalização de CGRP, tal como ligação de receptor e/ou elicitação de uma resposta celular a CGRP.
Um anticorpo antagonista anti-CGRP deve exibir qualquer uma ou mais das seguintes características: (a) se ligar a CGRP; (b) bloquear CGRP de ligação a seu(s) receptor(es); (c) bloquear ou diminuir ativação de receptor de CGRP (incluindo ativação de cAMP); (d) inibir atividade biológica de CGRP ou trajetórias a jusantes mediadas pela função de sinalização de CGRP; (e) prevenir, melhorar ou tratar qualquer aspecto de dor de cabeça (por exemplo, enxaqueca); (f) aumentar folga de CGRP; e (g) inibir (reduzir) síntese de CGRP, produção ou liberação. Anticorpos antagonistas de anti- CGRP são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Tan et al., Clin. Sei. (Lond). 89:565-73, 1995; Sigma (Missouri, US), product number C7113 (clo- ne número 4901); Plourde et al., Peptides 14:1225-1229, 1993. Para proposta desta invenção, o anticorpo reage com CGRP em uma maneira que inibe CGRP e/ou trajetórias a jusantes mediadas pela fun- ção de sinalização de CGRP. Em algumas concretizações, o anticorpo anta- gonista anti-CGRP reconhece CGRP humano. Em algumas concretizações, o anticorpo antagonista anti-CGRP se liga a ambos α-CGRP humano e β- CGRP. Em algumas concretizações, o anticorpo antagonista anti-CGRP se liga a CGRP humano e de rato. Em algumas concretizações, o anticorpo an- tagonista anti-CGRP se liga a fragmento de terminal C tendo 25-37 aminoá- cidos de CGRP. Em algumas concretizações, o anticorpo antagonista anti- CGRP se liga a um epítopo de terminal C dentro de 25-37 aminoácidos de CGRP.
Os anticorpos úteis na presente invenção podem envolver anti- corpos monoclonais, anticorpos policlonais, fragmentos de anticorpo (por exemplo, Fab, Fab1, F(ab')2, Fv, Fc, etc.), anticorpos quiméricos, anticorpos biespecíficos, anticorpos heteroconjugados, cadeia simples (ScFv), mutantes destes, proteínas de fusão compreendendo uma porção de anticorpo (por exemplo, um anticorpo de domínio), anticorpos humanizados, e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compre- ende um local de reconhecimento de antígeno da especificidade requerida, incluindo variantes de glicosilação de anticorpos, variantes de seqüência de aminoácido de anticorpos, e anticorpos covalentemente modificados. Os an- ticorpos podem ser de murina, de rato, de humano, ou qualquer outra origem (incluindo quimérico ou anticorpos humanizados).
Em algumas concretizações, o anticorpo antagonista anti-CGRP é um anticorpo monoclonal. Em algumas concretizações, o anticorpo anta- gonista anti-CGRP é humanizado. Em algumas concretizações, o anticorpo é humano. Em algumas concretizações, o anticorpo antagonista anti-CGRP é anticorpo G1 (conforme descrito aqui). Em algumas concretizações, o anti- corpo antagonista anti-CGRP compreende um ou mais CDR(s) (tais como uma, duas, três, quatro, cinco, ou, em algumas concretizações, todas as seis CDRs) de anticorpo G1, ou variantes de G1, mostradas na Tabela 6. Em a- inda outras concretizações, o anticorpo antagonista anti-CGRP compreende a seqüência de aminoácido da região variável de cadeia pesada mostrada na Figura 5 (SEQ ID NO:1), e a seqüência de aminoácido da região variável de cadeia leve mostrada na Figura 5 (SEQ ID NO:2).
Em algumas concretizações, o anticorpo compreende uma regi- ão constante modificada, tal como a região constante que é imunologica- mente inerte aqui descrita. Em algumas concretizações, a região constante é modificada conforme descrito em Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624; Pe- dido PCT No. PCT/GB99/01441; e/ou Pedido de Patente do reino Unido No. 9809951.8. Em outras concretizações, o anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada humana lgG2 compreendendo as seguintes mutações: A330P331 a S330S331 (numeração de aminoácido com referên- cia a seqüência lgG2 tipo selvagem). Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624. Em algumas concretizações, o anticorpo compreende uma região constante de lgG4 compreendendo as seguintes mutações: E233F234L235 a P233V234A235. Em ainda outras concretizações, a região constante é agli- cosilatada para glicosilação N-igante. Em algumas concretizações, a região constante é aglucosilatada para glicosilação N-igante por mutação do resí- duo de fixação de oligossacarídeo (tal como Asn297) e/ou resíduos de flan- queamento que são parte da seqüência de reconhecimento da N- glicosilação na região constante. Em algumas concretizações, a região cons- tante é aglicosilatada para glicosilação N-igante. A região constante pode ser aglicosilatada para glicosilação N-igante enzimaticamente, ou por expressão em uma célula hospedeira deficiente de glicosilação.
A afinidade de ligação(Ko) de um anticorpo antagonista anti- CGRP para CGRP (tal como α-CGRP humano) pode ser cerca de 0,02 a cerca de 200 nM. Em algumas concretizações, a afinidade de ligação é qualquer de cerca de 200 nM, cerca de 100 nM, cerca de 50 nM, cerca de 10 nM, cerca de 1 nM, cerca de 500 pM, cerca de 100 pM, cerca de 60 pM, cer- ca de 50 pM, cerca de 20 pM, cerca de 15 pM, cerca de 10 pM, cerca de 5 pM, ou cerca de 2 pM. Em algumas concretizações, a afinidade de ligação é menor do que qualquer de cerca de 250 nM, cerca de 200 nM, cerca de 100 nM, cerca de 50 nM, cerca de 10 nM, cerca de 1 nM, cerca de 500 pM, cerca de 100 pM, ou cerca de 50 pM.
Um modo de determinar a afinidade de ligação de anticorpos para CGRP é pela medição da afinidade de ligação de fragmentos monofun- cionais de Fab do anticorpo. Para se obter fragmentos monofuncionais de Fab, um anticorpo (por exemplo, IgG) pode ser clivado com papaína, ou ex- presso recombinantemente. A afinidade de um fragmento anti-CGRP Fab de um anticorpo pode ser determinada por ressonância de plasmon de superfí- cie (sistema de ressonância de plasmon de superfície (SPR) Biacore3000™, Biacore, INC, Piscataway NJ) equipado com chips de sensor de streptavidin pré-imobilizados (SA) usando-se tampão de operação HBS-EP (0,01 M de HEPES, pH 7,4, 0,15 de NaCI, 3mM de EDTA, 0,005% v/v de Tensoativo P20). CGRP humano biotinilatado (ou qualquer outro CGRP) pode ser diluí- do em tampão HBS-EP a uma concentração de menos do que 0,5 ug/mL, e injetado através dos canais de chip do indivíduo usando-se tempos de conta- to variáveis para alcançar duas faixas de densidade de antígeno, ou 50-200 unidades de resposta (RU) para estudos cinéticos detalhados, ou 800-1.000 RUs para ensaios de classificação. Estudos de regeneração têm mostrado que 25mM de NaOH em 25% v/v de etanol remove efetivamente a ligação Fab, enquanto mantêm a atividade de CGRP no chip para cerca de 200 inje- ções. Tipicamente, diluições em série (concentrações rotativas de 0,1-1 Ox estimam KD) de amostras purificadas de Fab são injetadas por 1 minuto a 100 μL/minutο e tempos de dissociação de até 2 horas são permitidos. As concentrações das proteínas Fab são determinadas por ELISA e/ou eletrofo- rese de SDS-PAGE usando uma Fab de concentração conhecida (conforme determinado por análise de aminoácido) como um padrão. Taxas de associ- ação (kon) e taxas de dissociação (koff) cinéticas são obtidas simultaneamen- te pelo ajuste dos dados globalmente para um modelo de ligação Langmuir 1:1 (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110) usando o programa BlAavaliação. Os valores da constante de dissociação de equilíbrio (K0) são calculados como Wkon- Este protocolo é adequado para uso na determinação da afinidade de ligação de um anticorpo para qualquer CGRP, incluindo CGRP humano, CGRP de ou- tro mamífero (tal como CGRP de camundongo, CGRP de rato, CGRP de primata), bem como formas diferentes de CGRP (tais como formas α e β). A afinidade de ligação de um anticorpo é geralmente medida a 25°C, mas po- de também ser medida a 37°C.
Os anticorpos antagonistas de anti-CGRP podem ser produzidos por qualquer método conhecido na técnica. A rota e tabela de imunização do animal hospedeiro estão geralmente em manutenção com técnicas estabe- lecidas e convencionais para estimulação do anticorpo e produção, conforme adicionalmente descrito aqui. Técnicas gerais para produção de anticorpos humano e de camundongo são conhecidas na técnica e são aqui descritas.
É contemplado que qualquer indivíduo mamífero incluindo hu- manos ou células de produção de anticorpo a partir destes pode ser manipu- lado para servir como a base para produção de mamífero, incluindo linhas de célula de hibridoma humano. Tipicamente, o arnimal hospedeiro é inocu- lado intraperitonealmente, intramuscularmente, oralmente, subcutaneamen- te, intraplantar, e/ou intradermalmente com uma quantidade de imunógeno, incluindo conforme descrito aqui.
Os hibridomas podem ser preparados a partir de linfócitos e cé- lulas de mieloma imortalizadas usando-se a técnica de hibridização de célula somática geral de Kohler, B. e Milstein, C. (1975) Nature 256:495-497, ou conforme modificada por Buck, D. W., et al., In vitro, 18:377-381 (1982). Li- nhas de mieloma disponíveis, incluindo, mas não limitadas a X63-Ag8.653, e aquelas de Salk lnstitute, Cell Distribution Center, San Diego, Calif., USA, podem ser usadas na hibridização. Geralmente, a técnica envolve fusão de células de mieloma e células de linfóide usando um "fusogen", tal como poli- etileno glicol, ou por meios elétricos bem-conhecidos àqueles versados na técnica. Após a fusão, as células são separadas do meio de fusão, e desen- volvidas em um meio de crescimento, tal como meio de hipoxantina- aminopterin-timidina (HAT), para eliminar células de origem não- hibridizadas. Qualquer meio aqui descrito, suplementado com ou sem soro, pode ser usado para cultivar hibridomas que secretam anticorpos monoclo- nais. Como outra alternativa à técnica de fusão de célula, células B imortali- zadas EBV podem ser usadas para produzir os anticorpos anti-CGRP mono- clonais da invenção objeto. Os hibridomas são expandidos e subclonados, se desejado, e os sobrenadantes são ensaiados para atividade antiimunó- geno por procedimentos de imunoensaio convencionais (por exemplo, radio- imunoensaio, imunoensaio de enzima, ou imunoensaio de fluorescência).
Os hibridomas que podem ser usados como fonte de anticorpos envolvem todas as células de progenia derivadas dos hibridomas de origem que produzem anticorpos monoclonais específicos para CGRP, ou uma por- ção destes.
Os hibridomas que produzem tais anticorpos podem ser desen- volvidos in vitro ou in vivo usando-se procedimentos conhecidos. Os anticor- pos monoclonais podem ser isolados do meio de cultura ou fluidos corpó- reos, por procedimentos de purificação de imunoglobulina convencionais, tais como precipitação de sulfato de amônia, eletroforese de gel, diálise, cromatografia, e ultrafiltração, se desejado. A atividade não-desejada se presente, pode ser removida, por exemplo, pelo curso da preparação sobre adsorventes produzidos do imunógeno fixado a uma fase sólida, e eluindo ou liberando os anticorpos desejados fora do imunógeno. A imunização de um animal hospedeiro com um CGRP humano, ou um fragmento contendo a seqüência alvo de aminoácido conjugada a uma proteína que é imunogênica nas espécies a serem imunizadas, por exemplo, hemocianina de lapa, albu- mina de soro, tiroglobulina bovina, ou inibidor de tripsina de soja usando um agente bifuncional ou de derivatização, por exemplo, maleimidobenzoil sul- fossuccinimida éster (conjugação através de resíduos de cisteína), N- hidroxissuccinimida (através de resíduos de lisina), glutaraldeído, anidrido succínico, S0CI2, ou RIN=C=NR, onde R e R1 são grupos alquila diferen- tes, pode produzir uma população de anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais).
Se desejado, o anticorpo antagonista anti-CGRP (monoclonal ou policlonal) de interesse pode ser seqüenciado, e a seqüência de polinucleo- tídeo pode então ser clonada em um vetor para expressão ou propagação. A seqüência que codifica o anticorpo de interesse pode ser mantida no vetor em uma célula hospedeira, e a célula hospedeira pode, então, ser expandida e congelada para uso futuro. Em uma alternativa, a seqüência de polinucleo- tídeo pode ser usada para manipulação genética para "humanizar" o anti- corpo ou aperfeiçoar a afinidade, ou outras características do anticorpo. Por exemplo, a região constante pode ser projetada para mais regiões constan- tes humanas mais assemelhadas para evitar resposta imune se o anticorpo é usado em ensaios clínicos e tratamentos em humanos. Pode ser desejável manipular-se geneticamente a seqüência de anticorpo para obter-se maior afinidade para CGRP, e maior eficácia na inibição de CGRP. Será aparente a um técnico no assunto que uma ou mais mudanças de polinucleotídeo po- dem ser feitas ao anticorpo antagonista anti-CGRP, e ainda manter sua ca- pacidade de ligação ao CGRP.
Existemquatroetapasgeraisparahumanizarumanticorpomo- noclonal. Estas são: (1) determinação do nucleotídeo e seqüência de amino- ácido prognosticada dos domínios variáveis leves e pesados do anticorpo de partida, (2) designação do anticorpo humanizado, isto é, decidindo qual regi- ão de estrutura de anticorpo usar durante o processo de humanização, (3) as técnicas/metodologias de humanização atuais, e (4) a transfecção e ex- pressão do anticorpo humanizado. Vide, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos. 4.816.567; 5.807.715; 5.866.692; 6.331.415; 5.530.101; 5.693.761; 5.693.762; 5.585.089; e 6.180.370.
Um número de moléculas de anticorpo "humanizadas" compre- endendo um local de ligação de antígeno derivado de uma não- imunoglobulina humana foi descrito, incluindo anticorpos quiméricos tendo regiões de roedor ou de roedor modificado V, e suas regiões de determina- ção de complementaridade associada (CDRs) fundidas para domínios cons- tantes humanos. Vide, por exemplo, Winter et al. Nature 349:293-299 (1991), Lobuglio et al. Proc. Nat. Acad. Sei. USA 86:4220-4224 (1989), Shaw et al. J Immunol. 138:4534-4538 (1987), e Brown et al. Câncer Res. 47:3577-3583 (1987). Outras referências descrevem CDRs de roedores enxertadas em uma região de estrutura de suporte humana (FR) antes da fusão com um domínio constante humano de anticorpo apropriado. Vide, por exemplo, Riechmann et al. Nature 332:323-327 (1988), Verhoeyen et al. Science 239:1534-1536 (1988), e Jones et al. Nature 321:522-525 (1986). Outra refe- rência descreve CDRs de roedor suportadas por regiões de estrutura de ro- edor recombinantemente embutidas. Vide, por exemplo, Publicação de Pa- tente Européia No. 0519596. Estas moléculas "humanizadas" são designa- das para minimizar resposta imunológica não-desejada em direção a molé- culas humanas de antianticorpo de roedor que limitam a duração e eficiência de aplicações terapêuticas daquelas porções em recipientes humanos. Por exemplo, a região constante do anticorpo pode ser projetada tal que ela seja imunologicamente inerte (por exemplo, não dispara Iisis de complemento). Vide, por exemplo, Publicação PCT No. PCT/GB99/01441; Pedido de Paten- te do Reino Unido No. 9809951.8. Outros métodos de humanização de anti- corpos que também podem ser utilizados são revelados por Daugherty et al., Nucl. Ácidos Res. 19:2471-2476 (1991), e nas Patentes do Estados Unidos Nos. 6.180.377; 6.054.297; 5.997.867; 5.866.692; 6.210.671; e 6,350,861; e na Publicação PCT No. WO 01/27160.
Em ainda outra alternativa, anticorpos totalmente humanos po- dem ser obtidos usando-se camundongos comercialmente disponíveis que foram projetados para expressarem proteínas humanas de imunoglobulina específicas. Os animais transgênicos que são designados para produzir uma resposta imune mais desejável (por exemplo, anticorpos totalmente huma- nos), ou uma resposta mais robusta, podem também serem usados para geração de anticorpos humanizados ou humanos. Exemplos de tal tecnolo- gia são Xenomouse™ de Abgenix, Inc. (Fremont, CA) e HuMAb-Mouse® e TC Mouse™ de Medarex, Inc. (Princeton, NJ).
Em uma alternativa, os anticorpos podem ser produzidos recom- binantemente e expressos usando-se qualquer método conhecido na técni- ca. Em outra alternativa, os anticorpos podem ser produzidos recombinan- temente por tecnologia de revelação da fago. Vide, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.565.332; 5.580.717; 5.733.743; e 6.265.150; e Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994): Alternativamente, a tecnologia de revelação de fago (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)) pode ser usada para produzir anticorpos humanos e fragmentos de anticorpo in vitro, de repertórios de gene de domínio (V) variáveis de imuno- globulina de doadores não-imunizados. De acordo com esta técnica, os ge- nes de domínio V de anticorpo são clonados na estrutura interna em ou um maior ou menor gene de proteína de revestimento de um bacteriófago fila- mentoso, tal como M13 ou fd, e revelado como fragmentos de anticorpo fun- cionais na superfície da partícula de fago. Devido a partícula filamentosa conter uma cópia de DNA de trançado simples do genoma de fago, seleções baseadas nas propriedades funcionais do anticorpo também resultam na seleção do gene que codifica o anticorpo que exibe aquelas propriedades. Desse modo, o fago imita algumas das propriedades da célula Β. A revela- ção do fago pode ser realizada em uma variedade de formatos; para revisão, vide, por exemplo, Johnson, Kevin S. and Chiswelll David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Várias fontes de segmentos de gene- V podem ser usadas para revelação de fago. Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) isolou um arranjo diverso de anticorpos de antioxazolo- na de uma biblioteca combinatorial aleatória pequena de genes V derivados dos baços de camundongos imunizados. Um repertório de genes V de doa- dores humanos não-imunizados pode ser construído, e anticorpos para um arranjo diverso de antígenos (incluindo autoantígenos) podem ser isolados essencialmente seguindo as técnicas descritas por Mark et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), ou Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). Em uma resposta imune natural, os genes de anticorpo acumulam mutações em uma alta taxa (hipermutação somática). Algumas das mudanças introduzidas con- ferem alta afinidade, e células B revelando imunoglobulina de superfície de alta afinidade são preferencialmente replicadas e diferenciadas durante competição subseqüente de antígeno. Este processo natural pode ser imita- do pelo emprego da técnica conhecida como "mistura de cadeia." Marks, et al., Bio/Technol. 10:779-783 (1992)). Neste método, a afinidade de anticor- pos humanos "primários" obtidos por revelação de fago pode ser aperfeiçoa- da pela substituição seqüencialmente dos genes de região V de cadeia pe- sada e leve com repertórios de variantes que ocorrem naturalmente (repertó- rios) de genes de domínio V obtidos de doadores não-imunizados. Esta téc- nica permite a produção de anticorpos e fragmentos de anticorpos com afini- dades na faixa pM-nM. Uma estratégia para produção de repertórios de anti- corpo de fago muito grandes (também conhecida como "as bibliotecas mãe de todos") foi descrita por Waterhouse et al., Nucl. Ácidos Res. 21:2265- 2266 (1993). A mistura de gene pode também ser usada para derivar anti- corpos humanos de anticorpos de roedor, onde o anticorpo humano tem afi- nidades similares e especificidades ao anticorpo de roedor de partida. De acordo com este método, que é também referido como "impressão de epíto- po", o gene de domínio V de cadeia pesada ou leve de anticorpos de roedor obtido pela técnica de revelação de fago é substituído com um repertório de genes V humanos de domínio, criando quimeras de roedor-humano. A sele- ção no antígeno resulta no isolamento de regiões humanas variáveis capa- zes de restaurar um local de ligação de antígeno funcional, isto é, o epítopo que regula (impressões) a escolha do co-participante. Quando o processo é repetido de modo a substituir o domínio V de roedor remanescente, um anti- corpo humano é obtido (vide Publicação PCT No. WO 93/06213, publicada em 01 de abril de 1993). A humanização tradicional diferente de anticorpos de roedor por enxerto de DR, esta técnica proporciona anticorpos completa- mente humanos, que não têm estrutura ou resíduos de CDR de origem de roedor.
É aparente que embora a discussão acima pertença a anticorpos humanizados, os princípios gerais discutidos são aplicáveis a construção de anticorpos para uso, por exemplo, em cães, gatos, primata, eqüinos e bovi- nos. É adicionalmente aparente que um ou mais aspectos da humanização de um anticorpo aqui descrita pode ser combinada, por exemplo, com enxer- to de CDR, mutação de estrutura e mutação de CDR.
Os anticorpos podem ser produzidos recombinantemente primei- ro pelo isolamento dos anticorpos e células de produção de anticorpo de a- nimais hospedeiros, obtendo-se a seqüência de gene, e usando-se a se- qüência de gene para expressar o anticorpo recombinantemente em células hospedeiras (por exemplo, células de CHO). Outro método que pode ser empregado é expressar a seqüência de anticorpo em plantas (por exemplo, tabaco), ou leite transgênico. Métodos para expressar anticorpos recombi- nantemente em plantas ou leite foram revelados. Vide, por exemplo, Pee- ters, et al. Vaccine 19:2756 (2001); Lonberg, N. and D. Huszar Int.Rev.lmmunol 13:65 (1995); e Pollock, et al., J Immunol Métodos 231:147(1999). Métodos para produção de derivados de anticorpos, por e- xemplo, humanizados, de cadeia simples, etc., são conhecidos na técnica.
Imunoensaios e técnicas de classificação de citometria de fluxo, tal como classificação de célula ativada de fluorescência (FACS), podem também serem empregadas para isolar anticorpos que são específicos para CGRP.
Os anticorpos podem estar ligados a muitos transportadores di- ferentes. Os transportadores podem ser ativos e/ou inertes. Exemplos de transportadores bem-conhecidos incluem polipropileno, poliestireno, polieti- leno, dextrano, náilon, amilases, vidro, celuloses naturais e modificadas, po- liacrilamidas, agaroses e magnetita. A natureza do transportador pode ser ou solúvel ou insolúvel para proposta da invenção. Aqueles versados na técnica saberão de outros transportadores adequados para ligação dos anticorpos, ou serão capazes de determinarem tais transportadores usando experimen- tação de rotina. Em algumas concretizações, o transportador compreende uma porção que tem como alvo o miocárdio.
O DNA que codifica os anticorpos monoclonais é prontamente isolado e seqüenciado usando-se procedimentos convencionais (por exem- plo, pelo uso de sondas de oligonucleotídeo que são capazes de se ligar especificamente aos genes que codificam as cadeias pesada e leve dos an- ticorpos monoclonais). As células de hibridoma servem como uma fonte pre- ferida de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão (tais como vetores de expressão revelados na Publicação PCT No. WO 87/04462), que são, em seguida, transfectados em células hospe- deiras, tais como células de E. coli, células de COS de símio, células (CHO) de ovário de hamster chinês, ou células de mieloma que não produzem, de outro modo, proteína de imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Vide, por exemplo, Publicação PCT No. WO 87/04462. O DNA também pode ser modificado, por exemplo, pela substituição da seqüência de codificação para domínios constantes de cadeia pesada e leve no lugar das seqüências homólogas de murina, Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sei. 81:6851 (1984), ou pela união covalentemente a seqüência de codificação de imunoglobulina toda ou parte da seqüência de codificação para um polipeptídeo de não-imunoglobulina. Desta maneira, anticorpos "quiméricos" ou "híbridos" são preparados, que têm a especificidade de ligação de um anticorpo anti-CGRP monoclonal a- qui.
Os anticorpos antagonistas de anti-CGRP e polipeptídeos deri- vados dos anticorpos podem ser identificados ou caracterizados usando-se métodos conhecidos na técnica, pelo que redução, melhora ou neutralização de uma atividade biológica de CGRP é detectada e/ou medida. Por exemplo, anticorpo antagonista anti-CGRP pode também ser identificado pela incuba- ção de um agente candidato com CGRP, e monitorando-se qualquer um ou mais das seguintes características: (a) ligar-se ao CGRP; (b) bloquear o CGRP de se ligar a seu(s) receptor(es); (c) bloquear ou diminuir a ativação de receptor de CGRP (incluindo ativação de cAMP); (d) inibir a atividade bio- lógica do CGRP ou trajetórias a jusantes mediadas por funções de sinaliza- ção de CGRP; (e) prevenir, melhorar ou tratar qualquer aspecto de dor de cabeça (por exemplo, enxaqueca); (f) aumentar a folga de CGRP; e (g) inibir (reduzir) a síntese, produção ou liberação de CGRP. Em algumas concreti- zações, um anticorpo antagonista anti-CGRP ou polipeptídeo é identificado pela incubação de um agente candidato com CGRP, e monitorando-se a ligação e/ou redução auxiliar ou neutralização de uma atividade biológica de CGRP. O ensaio de ligação pode ser realizado com polipeptídeo(s) de C- GRP purificados, ou com células que expressam naturalmente, ou transfec- tadas para expressar polipeptídeo(s) de CGRP. Em uma concretização, o ensaio de ligação é um ensaio de ligação competitivo, onde a capacidade de um anticorpo candidato competir com um antagonista anti-CGRP conhecido para ligação de CGRP é avaliada. O ensaio pode ser realizado em vários formatos, incluindo o formato ELISA. Em outras concretizações, um anticor- po antagonista anti-CGRP é identificado por incubação de um agente candi- dato com CGRP, e monitorando-se a ligação e inibição auxiliar de ativação de receptor de CGRP expresso na superfície de uma célula.
Em seguida a identificação inicial, a atividade de um anticorpo antagonista anti-CGRP candidato pode ser adicionalmente confirmada e re- finada por bioensaios, conhecidos por testar as atividades biológicas alvos. Alternativamente, os bioensaios podem ser usados para classificar candida- tos diretamente. Por exemplo, o CGRP promove um número de mudanças mensuráveis em células responsivas. Estas incluem, mas não estão limita- das a, estimulação de cAMP na célula (por exemplo, células SK-N-MC). A atividade antagonista pode também ser medida usando-se modelos de ani- mal, tal como medição da vasodilatação da pele induzida por estimulação do nervo safenoso do rato. Escott et al., Br. J. Pharmacol. 110: 772-776, 1993. Modelos de animal de dores de cabeça (tal como, enxaqueca) podem adi- cionalmente serem usados para eficácia de teste de anticorpos antagonistas ou polipeptídeos. Reuter, et al., Functional Neurology (15) Suppl.3, 2000. Alguns dos métodos para identificação e caracterização de anticorpo anta- gonista anti-CGRP ou polipeptídeo são descritos em detalhes nos Exemplos.
Os anticorpos antagonistas de anti-CGRP podem ser caracteri- zados usando-se métodos bem-conhecidos na técnica. Por exemplo, um método é identificar o epítopo ao qual ele se liga, ou "mapeamento de epíto- po". Existem muitos métodos conhecidos na técnica para mapeamento e caracterização da localização de epítopos nas proteínas, incluindo dissolver- se a estrutura de cristal de um complexo de anticorpo-antígeno, ensaios de competição, ensaios de expressão de fragmento de gene, e ensaios basea- dos em peptídeo sintético, conforme descrito, por exemplo, no Capítulo 11 de Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999. Em um e- xemplo adicional, o mapeamento do epítopo pode ser usado para determinar a seqüência a qual um anticorpo antagonista anti-CGRP se liga. O mapea- mento de epítopo é comercialmente disponível de várias fontes, por exem- pio, Pepscan Systems (Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad, The Nether- lands). O epítopo pode ser um epítopo linear, isto é, contido em um trecho simples de aminoácidos, ou um epítopo conformacional formado por uma interação tridimensional de aminoácidos que não pode necessariamente es- tar contido em um trecho simples. Os peptídeos de comprimentos variados (por exemplo, pelo menos 4-6 aminoácidos de comprimento) podem ser iso- lados ou sintetizados (por exemplo, recombinantemente), e usados para en- saios de ligação com um anticorpo antagonista anti-CGRP. Em outro exem- plo, o epítopo ao qual o anticorpo antagonista anti-CGRP se liga pode ser determinado em uma classificação sistemática pelo uso de sobreposição de peptídeos derivados a partir da seqüência de CGRP, e determinando-se a ligação pelo anticorpo antagonista anti-CGRP. De acordo com os ensaios de expressão de fragmento de gene, a estrutura de leitura aberta que codifica CGRP é fragmentada, ou aleatoriamente, ou por construções genéticas es- pecíficas, e a reatividade dos fragmentos expressos de CGRP com o anti- corpo a ser testado é determinada. Os fragmentos de gene podem, por e- xemplo, serem produzidos por PCR e, em seguida, transcritos e translada- dos em proteína in vitro, na presença de aminoácidos radioativos. A ligação do anticorpo aos fragmentos de CGRP radioativamente rotulados é, em se- guida, determinada por imunoprecipitação e eletroforese de gel. Certos epí- topos podem também serem identificados pelo uso de grandes bibliotecas de seqüências de peptídeo aleatórias na superfície das partículas de fago (bibliotecas de fago). Alternativamente, uma biblioteca definida de sobrepo- sição de fragmentos de peptídeo pode ser testada para ligação ao anticorpo de teste em ensaios de ligação simples. Em um exemplo adicional, a muta- gênese de um domínio de ligação de antígeno, experimentos de troca de domínio, e mutagênese de varredura de alanina, podem ser realizadas para identificar resíduos requeridos, suficientes e/ou necessários para ligação de epítopo. Por exemplo, experimentos de troca de domínio podem ser realiza- dos usando-se um CGRP mutante no qual vários fragmentos do polipeptídeo de CGRP foram substituídos (trocados) com seqüências de uma proteína proximamente relacionada, mas antigenicamente distinta (tal como outro membro da família de proteína neurotrofina). Pela avaliação da ligação do anticorpo ao CGRP mutante, a importância do fragmento de CGRP particular para ligação do anticorpo pode ser avaliada.
Ainda outro método que pode ser usado para caracterizar um anticorpo antagonista anti-CGRP é usar ensaios de competição com outros anticorpos conhecidos para se ligar ao mesmo antígeno, isto é, vários frag- mentos no CGRP, para determinar se o anticorpo antagonista anti-CGRP se liga ao mesmo epítopo como outros anticorpos. Ensaios de competição são bem-conhecidos àqueles versados na técnica.
Um vetor de expressão pode ser usado para dirigir expressão de um anticorpo antagonista anti-CGRP. Um versado na técnica é familiar com a administração de vetores de expressão par obter expressão de uma prote- ína exógena in vivo. Vide, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos. 6.436.908; 6.413.942; e 6.376.471. A administração de vetores de expressão inclui administração local ou sistêmica, incluindo injeção, administração oral, canhão de partícula, ou administração cateterizada, e administração tópica. Em outra concretização, o vetor de expressão é administrado diretamente ao tronco simpático ou gânglio, ou em uma artéria coronária, átrio, ventrical, ou pericárdio.
A distribuição alvo de composições terapêuticas contendo um vetor de expressão, ou polinucleotídeos subgenômicos, pode também ser usada. As técnicas de distribuição de DNA mediada por receptor são descri- tas em, por exemplo, Findeis et al., Trends Biotechnol. (1993) 11:202; Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Trans- fer (J.A. Wolff, ed.) (1994); Wu et al., J. Biol. Chem. (1988) 263:621; Wu et al., J. Biol. Chem. (1994) 269:542; Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1990) 87:3655; Wu et al., J. Biol. Chem. (1991) 266:338. As composições terapêuticas contendo um polinucleotídeo são administradas em uma faixa de cerca de 100 ng a cerca de 200 mg of DNA para administração local em um protocolo de terapia de gene. Faixas de concentração de cerca de 500 ng a cerca de 50 mg, cerca de 1 μg a cerca de 2 mg, cerca de 5 μg a cerca de 500 μg, e cerca de 20 μg a cerca de 100 μg of DNA podem também se- rem usadas durante um protocolo de terapia de gene. Os polinucleotídeos terapêuticos e polipeptídeos podem ser distribuídos usando-se veículos de distribuição de gene. O veículo de distribuição de gene pode ser de origem viral ou não-viral (vide, geralmente, Jolly, Câncer Gene Therapy (1994) 1:51;
Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5:845; Connelly, Human Gene The- rapy (1995) 1:185; and Kaplittj Nature Genetics (1994) 6:148). A expressão de tais seqüências de codificação pode ser induzida usando-se promotores de mamífero endógeno ou heterólogo. A expressão da seqüência de codifi- cação pode ser ou constitutiva ou regulada.
Vetores de base viral para distribuição de um polinucleotídeo desejado e expressão em uma célula desejada são conhecidos na técnica. Veículos de base viral exemplares incluem, mas não estão limitados a, retro- vírus recombinantes (vide, por exemplo, Publicação PCT Nos. WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.219.740 e 4.777.127; Patente GB No. 2.200.651; e Patente EP No. 0 345 242), vetores baseados em alfavírus (por exemplo, vetores de vírus Sindbis, vírus de flo- resta Semliki (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), vírus Ross River (ATCC VR- 373; ATCC VR-1246) e vírus de encefalite eqüínea da Venezuelan (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)), e vetores de ví- rus associados a adeno (AAV) (vide, por exemplo, Publicação PCT Nos. WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 e WO 95/00655). A administração de DNA ligado a adenovírus morto, conforme descrita em Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147, pode também ser em- pregada.
Veículos de distribuição não-virais e métodos podem também serem empregados, incluindo, mas não limitado a, DNA policatiônico con- densado ligado ou não-ligado a adenovírus morto sozinho (vide, por exem- plo, Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147); DNA ligado a Iigante (vide, por exemplo, Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264:16985); células de veículos de dis- tribuição de célula eucariótica (vide, por exemplo, Patente U.S. No. 5.814.482; Publicação PCT Nos. WO 95/07994; WO 96/17072; WO 95/30763; e WO 97/42338), e neutralização ou fusão de carga nucléica com membranas celulares. DNA desprotegido pode também ser empregado. Mé- todos de introdução de DNA desprotegido exemplar são descritos na Publi- cação PCT No. WO 90/11092 e Patente U.S. No. 5.580.859. Os Iipossomas que agem como veículos de distribuição de gene são descritos na Patente U.S. No. 5.422.120; Publicação PCT Nos. WO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; e EP 0524968. Aproximações adicionais são descritas em Philip, Mol. Célula Biol. (1994) 14:2411, e em Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sei. (1994)91:1581.
C. Anticorpo G1 anticorpos relacionados, polipeptídeos, polinucleotídeos. vetores e células hospedeiras
Esta invenção envolve composições, incluindo composições farmacêuticas compreendendo anticorpo G1 e suas variantes mostrados na Tabela 6, ou polipeptídeo derivado de anticorpo G1 e suas variantes mostra- dos na Tabela 6; e polinucleotídeos compreendendo seqüências que codifi- cam G1 e suas variantes, ou o polipeptídeo. Conforme usado aqui, as com- posições compreendem um ou mais anticorpos ou polipeptídeos (que pode ou não pode ser um anticorpo) que se liga a CGRP, e/ou um ou mais polinu- cleotídeos compreendendo seqüências que codificam um ou mais anticorpos ou polipeptídeos que se ligam a CGRP. Estas composições podem adicio- nalmente compreender excipientes adequados, tais como excipientes farma- ceuticamente aceitáveis incluindo tampões, que são bem-conhecidos na téc- nica.
Os anticorpos antagonistas de anti-CGRP e polipeptídeos da invenção são caracterizados por qualquer (uma ou mais) das seguintes ca- racterísticas: (a) se ligar a CGRP; (b) bloquear CGRP de ligação a seu(s) receptor(es); (c) bloquear ou diminuir ativação de receptor de CGRP (inclu- indo ativação de cAMP); (d) inibir atividade biológica de CGRP ou trajetórias a jusantes mediadas por função de sinalização de CGRP; (e) impedir, me- lhorar, ou tratar qualquer aspecto de dor de cabeça (por exemplo, enxaque- ca); (f) aumentar folga de CGRP; e (g) inibir (reduzir) síntese, produção ou liberação de CGRP. Conseqüentemente, a invenção proporciona qualquer do seguin- te, ou composições (incluindo composições farmacêuticas) compreendendo qualquer do seguinte: (a) anticorpo G1 ou suas variantes mostrados na Ta- bela 6; (b) um fragmento ou uma região de anticorpo G1, ou suas variantes mostrado na Tabela 6; (c) uma cadeia leve de anticorpo G1, ou suas varian- tes mostrados na Tabela 6; (d) uma cadeia pesada de anticorpo G1, ou suas variantes mostrados na Tabela 6; (e) uma ou mais região(ões) variável(is) de uma cadeia leve e/ou uma cadeia pesada de anticorpo G1, ou suas varian- tes, mostrados na Tabela 6; (f) uma ou mais CDR(s) (uma, duas, três, qua- tro, cinco ou seis CDRs) de anticorpo G1, ou suas variantes, mostrados na Tabela 6; (g) CDR H3 a partir da cadeia pesada de anticorpo G1; (h) CDR L3 a partir da cadeia leve de anticorpo G1, ou suas variantes, mostrados na Tabela 6; (i) três CDRs a partir da cadeia leve de anticorpo G1, ou suas vari- antes, mostrados na Tabela 6; (j) três CDRs a partir da cadeia pesada of an- ticorpo G1, ou suas variantes, mostrados na Tabela 6; (k) três CDRs a partir da cadeia leve e três CDRs a partir da cadeia pesada de anticorpo G1, ou suas variantes, mostrados na Tabela 6; e (I) um anticorpo compreendendo qualquer uma de (b) a (k). A invenção também proporciona polipeptídeos compreendendo qualquer um ou mais dos acima.
As porções de CDR de anticorpo G1 (incluindo CDRs de Chothia e de Kabat) são diagramaticamente representadas na Figura 5. A determi- nação de regiões de CDR está bem dentro dos versados na técnica. É com- preendido que, em algumas concretizações, CDRs podem ser uma combi- nação da CDR de Kabat e de Chothia (também denominada "CDRs combi- nadas" ou "CDRs extendidas"). Em algumas concretizações, as CDRs são as CDRs de Kabat. Em outras concretizações, as CDRs são as CDRs de Chothia. Em outras palavras, em concretizações com mais do que uma C- DR1 as CDRs podem ser qualquer CDR de Kabat, de Chothia, combinação de CDRs, ou combinações destas.
Em algumas concretizações, a invenção proporciona um poli- peptídeo (que pode ou não ser um anticorpo) que compreende pelo menos uma CDR, pelo menos duas, pelo menos três, ou pelo menos quatro, pelo menos cinco, ou todos as seis CDRs que são substancialmente idênticas a pelo menos uma CDR, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos qua- tro, pelo menos cinco ou todas as seis CDRs de G1 ou suas variantes, mos- trados na Tabela 6. Outras concretizações incluem anticorpos que têm pelo menos duas, três, quatro, cinco, ou seis CDR(s) que são substancialmente idênticas a pelo menos duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs de G1 ou de- rivado de G1. Em algumas concretizações, as pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis CDR(s) são pelo menos cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idênticas a pelo menos u- ma, duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs de G1 ou suas variantes, mos- trados na Tabela 6. É compreendido que para a proposta desta invenção, a especificidade de ligação e/ou atividade total é geralmente retida, embora a extensão da atividade possa variar comparada a G1 ou suas variantes, mos- trado na Tabela 6 (pode ser maior ou menor).
A invenção também proporciona um polipeptídeo (que pode ou não ser um anticorpo) que compreende uma seqüência de aminoácido de G1, ou suas variantes, mostrados na Tabela 6 que tem qualquer do seguin- te: pelo menos 5 aminoácidos contíguos, pelo menos 8 aminoácidos contí- guos, pelo menos cerca de 10 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 15 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 20 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 25 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 30 aminoácidos contíguos de uma seqüência of G1, ou suas variantes, mostra- dos na Tabela 6, no qual pelo menos 3 dos aminoácidos são de uma região variável de G1 (Figura 5), ou suas variantes, mostrados na Tabela 6. Em uma concretização, a região variável é de uma cadeia leve de G1. Em outra concretização, a região variável é de uma cadeia pesada de G1. Um polipep- tídeo exemplar tem aminoácido contíguo (comprimentos descritos acima) de ambas as regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve de G1. Em outra concretização, os 5 (ou mais) aminoácidos contíguos são de uma regi- ão de determinação de complementaridade (CDR) de G1 mostrada na Figu- ra 5. Em algumas concretizações, os aminoácidos contíguos são de uma região variável de G1. A afinidade de ligação(KD) de um anticorpo antagonista anti- CGRP e polipeptídeo para CGRP (tal como α-CGRP humano) pode ser cer- ca de 0,06 a cerca de 200 nM. Em algumas concretizações, a afinidade de ligação é qualquer de cerca de 200 nM, 100 nM, cerca de 50 nM, cerca de 10 nM, cerca de 1 nM, cerca de 500 pM, cerca de 100 pM, cerca de 60 pM, cerca de 50 pM, cerca de 20 pM, cerca de 15 pM, cerca de 10 pM, cerca de 5 pM, ou cerca de 2 pM. Em algumas concretizações, a afinidade de ligação é menor do que qualquer de cerca de 250 nM, cerca de 200 nM, cerca de 100 nM, cerca de 50 nM, cerca de 10 nM, cerca de 1 nM, cerca de 500 pM, cerca de 100 pM, ou cerca de 50 pM.
A invenção também proporciona métodos de produção de qual- quer destes anticorpos ou polipeptídeos. Os anticorpos desta invenção po- dem ser produzidos por procedimentos conhecidos na técnica. Os polipeptí- deos podem ser produzidos por proteolítico ou outra degradação dos anti- corpos, por métodos recombinantes (isto é, polipeptídeos simples ou de fu- são) conforme descrito acima ou por síntese química. Os polipeptídeos dos anticorpos, especialmente polipeptídeos mais curtos até cerca de 50 amino- ácidos, são convenientemente produzidos por síntese química. Métodos se síntese química são conhecidos na técnica e são comercialmente disponí- veis. Por exemplo, um anticorpo pode ser produzido por um sintetizador au- tomático de polipeptídeo que emprega o método de fase sólida. Vide, tam- bém, Patentes dos Estados Unidos N°S 5.807.715; 4.816.567; e 6.331.415.
Em outra alternativa, os anticorpos podem ser produzidos re- combinantemente usando-se procedimentos que são bem-conhecidos na técnica. Em uma concretização, um polinucleotídeo compreende uma se- qüência que codifica as regiões variáveis de cadeia pesada e/ou de cadeia leve de anticorpo G1 mostrada em SEQ ID NO:9 e SEQ ID NO: 10. Em outra concretização, os polinucleotídeos compreendendo uma seqüência de nu- cleotídeo mostrada em SEQ ID NO:9 e SEQ ID N0:10 são clonados em um ou mais vetores para expressão ou propagação. A seqüência que codifica o anticorpo de interesse pode ser mantida em um vetor em uma célula hospe- deira e a célula hospedeira pode, em seguida, ser expandida e congelada para uso futuro. Os vetores (incluindo vetores de expressão) e células hos- pedeiras são adicionalmente descritos aqui.
A invenção também envolve fragmentos de região variável de cadeia simples ("scFv") de anticorpos desta invenção, tal como G1. Os fragmentos de região variável de cadeia simples são produzidos pela ligação de regiões variáveis de cadeia leve e/ou pesada usando-se um peptídeo de ligação curta. Bird et ai. (1988) Science 242:423-426. Um exemplo de um peptídeo de ligação é (GGGGS)3 que liga aproximadamente 3,5 nm entre o terminal carboxi de uma região variável e o terminal amino da outra região variável. Ligadores de outras seqüências foram designados e usados. Bird et al. (1988). Os Iigadores podem, por sua vez, serem modificados para fun- ções de adição, tal como fixação de fármacos ou fixação a suportes sólidos. As variantes de cadeia simples podem ser produzidas ou recombinantemen- te ou sinteticamente. Para produção sintética de scFv, um sintetizador auto- mático pode ser usado. Para produção recombinante de scFv, um plasmídeo adequado contendo polinucleotídeo que codifica o scFv pode ser introduzido em uma célula hospedeira adequada, ou eucariótica, tal como células de levedura, planta, inseto ou mamífero, ou procariótica, tal como E. coli. Os polinucleotídeos que codificam o scFv de interesse podem ser produzidos por manipulações de rotina, tal como ligação de polinucleotídeos. O scFv resultante pode ser isolado usando-se técnicas de purificação de proteína padrões conhecidas na técnica.
Outras formas de anticorpos de cadeia simples, tais como dia- corpos, são envolvidas. Os diacorpos são anticorpos bivalentes biespecíficos nos quais domínios de VH e VL são expressos em uma cadeia de polipeptí- deo simples, mas usando-se um Iigador que é muito curto para permitir em- parelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, forçando, desse modo, os domínios a emparelharem com os domínios complementares de outra cadeia, e criando dois locais de ligação de antígeno (vide, por exem- pio, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad Sei. USA 90:6444-6448; Pol- jak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123).
Por exemplo, anticorpos biespecíficos, anticorpos monoclonais que têm especificidades de ligação para pelo menos dois antígenos diferen- tes, podem ser preparados usando-se os anticorpos aqui descritos. Os mé- todos para produção de anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology 121:210).
Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficos ba- seada na co-expressão de dois pares de imunoglobulina de cadeia pesada- cadeia leve, com as duas cadeias pesadas tendo especificidades diferentes (Millstein and Cuello, 1983, Nature 305, 537-539).
De acordo com a aproximação para produzir anticorpos biespe- cíficos, os domínios variáveis do anticorpo com as especificidades de ligação desejadas (locais de combinação anticorpo-antígeno) são fundidos em se- qüências de domínio constante de imunoglobulina. A fusão preferivelmente é com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, compreen- dendo pelo menos parte da articulação, regiões CH2 e CH3. É preferido ter- se a primeira região constante de cadeia pesada (CH1), contendo um local necessário para ligação de cadeia leve, presente em pelo menos uma das fusões. Os DNAs que codificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobu- lina e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em veto- res separados de expressão, e são co-transfectados em um organismo hos- pedeiro adequado. Isto proporciona maior flexibilidade no ajuste das propor- ções mútuas dos três fragmentos de polipeptídeo nas concretizações quan- do razões desiguais das três cadeias de polipeptídeo usadas na construção proporcionam os rendimentos ótimos. É, contudo, possível inserir as se- qüências de codificação ou todas as três cadeias de polipeptídeo em um vetor de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias de polipeptídeo em razões iguais resulta em altos rendimentos, ou quando as razões são de significância não particular.
Em uma aproximação, os anticorpos biespecíficos são compos- tos de uma cadeia pesada de imunoglobulina híbrida com uma primeira es- pecificidade de ligação em um braço, e um par de cadeia pesada-cadeia le- ve de imunoglobulina (proporcionando uma segunda especificidade de liga- ção) no outro braço. A estrutura assimétrica, com uma cadeia leve de imu- noglobulina em somente uma metade da molécula biespecífica, facilita a se- paração do composto biespecífico desejado de combinações de cadeia de imunoglobulina indesejadas. Esta aproximação é descrita na Publicação PCT No. WO 94/04690, publicada em 3 de março de 1994.
Anticorpos heteroconjugados, compreendendo dois anticorpos covalentemente unidos, estão também dentro do escopo da invenção. Tais anticorpos têm sido usados para células de sistema imune alvos para células indesejadas (Patente U.S. N3 4.676.980), e para tratamento de infecção de HIV (Publicações de Pedidos PCT Nes WO 91/00360 e WO 92/200373; EP 03089). Os anticorpos heteroconjugados podem ser produzidos usando-se quaisquer métodos de reticulação convenientes. Agentes e técnicas de liga- ção adequados são bem-conhecidos na técnica, e são descritos na Patente U.S. Ne 4.676.980.
Anticorpos quiméricos e híbridos também podem ser preparados in vitro usando-se métodos conhecidos de química de proteína sintética, in- cluindo aqueles envolvendo agentes de reticulação. Por exemplo, imunotoxi- nas podem ser construídas usando-se uma reação de troca de dissulfito, ou pela formação de uma ligação de tioéter. Exemplos de reagentes adequados para esta proposta incluem iminotiolato e metil-4-mercaptobutirimidato.
Anticorpo humanizado compreendendo uma ou mais CDRs de anticorpo G1, ou suas variantes, mostradas na Tabela 6, ou uma ou mais CDRs derivadas de anticorpo G1, ou suas variantes, mostradas na Tabela 6, pode ser produzido usando-se quaisquer métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, quatro etapas gerais podem ser usadas para humanizar um anticorpo monoclonal.
A invenção envolve modificações ao anticorpo G1, ou suas vari- antes, mostrados na Tabela 6, incluindo funcionalmente anticorpos equiva- lentes que não afetam significantemente suas propriedades e variantes que tem atividade e/ou afinidade aumentada ou diminuída. Por exemplo, a se- qüência de aminoácido de anticorpo G1, ou suas variantes, mostradas na Tabela 6, podem sofrer mutação para obter um anticorpo com a afinidade de ligação desejada para CGRP. A modificação de polipeptídeos é prática de rotina na técnica, e não necessita ser descrita em detalhes aqui. A modifica- ção de polipeptídeos é exemplificada nos Exemplos. Os exemplos de poli- peptídeos modificados incluem polipeptídeos com substituições conservati- vas de resíduo de aminoácidos, uma ou mais retiradas ou adições de ami- noácidos que não mudam significantemente danosamente a atividade fun- cional, ou uso de análogos químicos.
As inserções de seqüência de aminoácido incluem fusões de amino- e/ou carboxil-terminal variando em comprimento de um resíduo para polipeptídeos contendo uma centena ou mais de resíduos, bem como inser- ções de intra-seqüência de resíduo simples ou múltiplo de aminoácidos. E- xemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo meti- onil N-terminal, ou ò anticorpo fundido a uma etiqueta epítopo. Outras vari- antes insercionais da molécula de anticorpo incluem a fusão ao terminal Ν- ου C- do anticorpo de uma enzima, ou um polipeptídeo que aumenta a meia- vida de soro do anticorpo.
As variantes de substituição têm pelo menos um resíduo de a - minoácido na molécula de anticorpo removida, e um resíduo diferente inseri- do em seu lugar. Os locais de maior interesse para mutagênese substitucio- nal incluem regiões hipervariáveis, mas alterações de Fr são também con- templadas. As substituições conservativas são mostradas na Tabela 1 sob uma parte superior de "substituições conservativas". Se tais substituições resultam em uma mudança na atividade biológica, então mais mudanças substanciais, denominadas "substituições exemplares" na Tabela 1, ou con- forme adicionalmente descrito abaixo em referência às classes de aminoáci- do, podem ser introduzidas e os produtos classificados. Tabela 1. Substituições de aminoácido
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Modificações substanciais nas propriedades biológicas do anti- corpo são providas pela seleção de substituições que diferem significante- mente em seu efeito na manutenção (a) da estrutura do suporte de polipep- tídeo na área da substituição, por exemplo, como uma chapa ou conforma- ção helicoidal, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no local alvo, ou (c) a massa da cadeia lateral. Naturalmente, resíduos ocorrentes são dividi- dos em grupos baseados nas propriedades de cadeia lateral comuns:
(1) Não-polar: Norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, lie;
(2) Polar sem carga: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) Acídico (negativamente carregado: Asp, Glu;
(4) Básico (positivamente carregado): Lys, Arg;
(5) Resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; e
(6) Aromático: Trp, Tyr, Phe, His.
Substituições não-conservativas são produzidas pela troca de um membro de uma destas classes para outra classe.
Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção da conformação correta do anticorpo também pode ser substituído, geralmente com serina, para aperfeiçoar a estabilidade oxidante da molécula e impedir reticulação aberrante. Inversamente, ligação(ões) de cisteína pode(m) ser adicionada(s) ao anticorpo para aperfeiçoar sua estabilidade, particularmen- te onde o é um fragmento de anticorpo, tal como um fragmento Fv.
As modificações de aminoácido podem variar de mudança ou modificação de um ou mais aminoácidos para completar o redesenho de uma região, tal como a região variável. As mudanças na região variável po- dem alterar a afinidade e/ou especificidade da ligação. Em algumas concre- tizações, não mais do que uma a cinco substituições conservativas de ami- noácido são produzidas dentro de um domínio de CDR. Em outras concreti- zações, não mais do que uma a três substituições conservativas de aminoá- cido são produzidas dentro de um domínio de CDR. Em ainda outras concre- tizações, o domínio de CDR é CDR H3 e/ou CDR L3.
As modificações também incluem polipeptídeos glicosilatados e não-glicosilatados, bem como polipeptídeos com outras modificações pós- translacionais, tais como, por exemplo, glicosilação com açúcares diferentes, acetilação e fosforilação. Os anticorpos são glicosilatados em posições con- servadas em regiões constantes (Jefferis and Lund, 1997, Chem. Immunol. 65:111-128; Wright and Morrison, 1997, TibTECH 15:26-32). As cadeias la- terais de oligossacarídeo das imunoglobulinas afetam a função da proteína (Boyd et ai., 1996, Mol. Immunol. 32:1311-1318; Wittwe and Howard, 1990, Biochem. 29:4175-4180), e a interação intramolecular entre porções da Qli- coproteína, que pode afetar a conformação e a superfície tridimensional a - presentada da glicoproteína (Hefferis and Lund, supra; Wyss and Wagner, 1996, Current Opin. Biotech. 7:409-416). Os oligossacarídeos podem tam- bém servir como alvo de uma dada glicoproteína para certas moléculas ba- seadas nas estruturas de reconhecimento específico. A glicosilação de anti- corpos foi também reportada para efetuar a citotoxicidade celular dependen- te do anticorpo (ADCC). Em particular, células de CHO com expressão regu- lada por tetraciclina de β(1,4)-N-acetilglicosaminiltransferase III (GnTIII), uma glicosiltransferase que catalisa a formação de GIcNAc disecante, foram re- portadas para ter atividade aperfeiçoada de ADCC (Umana et ai., 1999, Ma- ture Biotech. 17:176-180).
A glicosilação de anticorpos é tipicamente ou N-igante ou O- igante. N-igante se refere à fixação da porção de carboidrato para a cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As seqüências de tripeptídeo asparagi- na-X-serina, asparagina-X-treonina, e asparagina-X-cisteína, onde X é ami- noácido exceto prolina, são as seqüências de reconhecimento para fixação enzimática da porção de carboidrato para a cadeia lateral de asparagina. Desse modo, a presença de qualquer destas seqüências de tripeptídeo em um polipeptídeo cria um local de glicosilação potential. A glicosilação Ο- igante se refere à fixação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galac- tose, ou xilose a um ácido hidroxiamino, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina podem também serem usadas.
A adição de locais de glicosilação ao anticorpo é conveniente- mente acompanhada pela alteração da seqüência de aminoácido tal que ela contenha um ou mais das seqüências de tripeptídeo acima descritas (para locais de glicosilação N-igante). A alteração pode também ser produzida pe- la adição de, ou substituição por um ou mais resíduos de serina ou treonina à seqüência do anticorpo original (para locais de glicosilação O-igante).
O modelo de glicosilação de anticorpos pode também ser altera- do sem se alterar a seqüência de nucleotídeo subjacente. A glicosilação de- pende grandemente da célula hospedeira usada para expressar o anticorpo. Desde que o tipo de célula usada para expressão de glicoproteínas recom- binantes, por exemplo, anticorpos, como terapêuticos potenciais, seja rara- mente a célula nativa, variações no modelo de glicosilação dos anticorpos podem ser esperadas (vide, por exemplo, Hse et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:9062-9070).
Em adição a escolha de células hospedeiras, fatores que afetam a glicosilação durante produção de recombinante de anticorpos incluem mo- do de crescimento, formulação média, densidade de cultura, oxigenação, pH, esquemas de purificação, e similares. Vários métodos foram propostos para alterar o modelo de glicosilação alcançado em um organismo hospedei- ro particular incluindo introdução ou sobreexpressão de certas enzimas en- volvidas na produção de oligossacarídeo (Patentes dos Estados Unidos NQs 5.047.335; 5.510.261 e 5.278.299). A glicosilação, ou certos tipos de glicosi- lação, podem ser enzimaticamente removidas a partir da glicoproteína, por exemplo, usando-se endoglicosidase H (Endo H), N-glicosidase F, endogli- cosidase F1, endoglicosidase F2, endoglicosidase F3. Em adição, a célula hospedeira recombinante pode ser geneticamente projetada para ser defec- tiva no processamento de certos tipos de polissacarídeos. Estas e outras técnicas similares são bem-conhecidas na técnica.
Outros métodos de modificação incluem usar técnicas de aco- plamento conhecidas na técnica, incluindo, mas não limitadas a, meios en- zimáticos, substituição oxidante e quelação. Modificações podem ser usa- das, por exemplo, para fixação de rótulos para imunoensaio. Polipeptídeos G1 modificados são produzidos usando-se procedimentos estabelecidos na técnica, e podem ser classificados usando-se ensaios padrões conhecidos na técnica, alguns dos quais são descritos abaixo e nos Exemplos.
Em algumas concretizações da invenção, o anticorpo compre- ende uma região constante modificada, tal como uma região constante que é imunologicamente inerte, ou parcialmente inerte, por exemplo, não dispara lisis mediados por complemento, não estimulada citotoxicidade mediada por célula dependente do anticorpo (ADCC), ou não ativada microglia; ou tem atividades reduzidas (comparada ao anticorpo não-modificado) em qualquer um ou mais dos seguintes: disparo de Iisis mediados por complemento, es- timulação de citotoxicidade mediada por célula dependente do anticorpo (ADCC), ou ativação de microglia. Modificações diferentes da região cons- tante podem ser usadas para alcançar nível ótimo e/ou combinação de fun- ções realizadoras. Vide, por exemplo, Morgan et al., Immunology 86:319-324 (1995); Lund et al., J. Immunology 157:4963-9 157:4963-4969 (1996); Iduso- gie et al., J. Immunology 164:4178-4184 (2000); Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601 (1989); e Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76 (1998). Em algumas concretizações, a região constante é modificada con- forme descrito em Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624; Pedido PCT No. PCT/GB99/01441; e/ou Pedido de Patente UK No. 9809951.8. Em outras concretizações, o anticorpo compreende uma região constante lgG2 de ca- deia pesada humana compreendendo as seguintes mutações: A330P331 a S330S331 (numeração de aminoácido com referência a seqüência igG2 tipo selvagem ). Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624. Em ainda outras concre- tizações, a região constante é aglicosilatada para glicosilação N-igante. Em algumas concretizações, a região constante é aglicosilatada para glicosila- ção N-igante por mutação do resíduo glicosilatado de aminoácido ou resí- duos de flanqueamento que são parte da seqüência de reconhecimento de N-glicosilação na região constante. Por exemplo, o local de N-glicosilação N297 pode sofrer mutação para A, Q, K, ou H. Vide, Tao et al., J. Immuno- logy 143: 2595-2601 (1989); e Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59- 76 (1998). Em algumas concretizações, a região constante é aglicosilatada para glicosilação N-igante. A região constante pode ser aglicosilatada para glicosilação N-igante enzimaticamente (tal como remoção de carboidrato por enzima PNGase), ou por expressão em uma célula hospedeira deficiente de glicosilação.
Outras modificações de anticorpo incluem anticorpos que foram modificados conforme descrito na Publicação PCT No. WO 99/58572, publi- cada em 18 de novembro de 1999. Estes anticorpos compreendem, em adi- ção a um domínio de ligação dirigido na molécula alvo, um domínio realiza- dor tendo uma seqüência de aminoácido substancialmente homóloga a todo ou parte do domínio constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina humana. Estes anticorpos são capazes de se ligarem à molécula alvo sem disparar Iisis dependente de complemento significante, ou destruição media- da por célula do alvo. Em algumas concretizações, o domínio realizador é capaz de ligar especificamente FcRn e/ou FcYRIIb. Estes são tipicamente baseados em domínios quiméricos derivados de dois ou mais domínios de Ch2 de cadeia pesada de imunoglobulina humana. Os anticorpos modifica- dos dessa maneira são particularmente adequados para uso na terapia de anticorpo crônica, para evitar reações inflamatórias e outras reações adver- sas para terapia de anticorpo convencional.
A invenção inclui concretizações maturadas de afinidade. Por exemplo, anticorpos maturados de afinidade podem ser produzidos por pro- cedimentos conhecidos na técnica (Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10:779-783; Barbas et al., 1994, Proc Nat. Acad. Sci1 USA 91:3809-3813; Schier et al., 1995, Gene, 169:147-155; Yelton et al., 1995, J. Immunol., 155:1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol., 154(7):3310-9; Hawkins et al, 1992, J. Mol. Biol., 226:889-896; e W02004/058184).
Os seguintes métodos podem ser usados para ajustar a afinida- de de um anticorpo e para caracterização de uma CDR. Um modo de carac- terizar uma CDR de um anticorpo e/ou alterar (tal como aperfeiçoar) a afini- dade de ligação de um polipeptídeo, tal como um anticorpo, denominado "mutagênese de varredura de biblioteca". Geralmente, a mutagênese de var- redura de biblioteca opera conforme segue. Uma ou mais posições do ami- noácido na CDR são substituídas com dois ou mais (tais como 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20) aminoácidos usando-se métodos reconhecidos na técnica. Isto gera pequenas bibliotecas de clones (em algumas concretizações, uma para toda posição do aminoácido que é analisada), cada uma com uma complexidade de dois ou mais membros (se dois ou mais aminoácidos são substituídos em toda posição). Geralmente, a biblioteca também inclui um clone compreendendo o aminoácido nativo (não-substituído). Um pequeno número de clones, por exemplo, cerca de 20- 80 clones (dependendo da complexidade da biblioteca), de cada biblioteca, são classificados para afinidade de ligação ao polipeptídeo alvo (ou outro alvo de ligação), e candidatos com aumentada, a mesma, diminuída ou ne- nhuma ligação são identificados. Os métodos para determinar a afinidade de ligação são bem-conhecidos na técnica. A afinidade de ligação pode ser de- terminada usando-se análise de ressonância plásmon de superfície Biacore, que detecta diferenças na afinidade de ligação de cerca de 2 vezes ou mai- or. Biacore é particularmente útil quando o anticorpo de partida já se liga com uma afinidade relativamente alta, por exemplo, uma K0 de cerca de 10 nM ou mais baixa. A classificação usando ressonância plasmon de superfí- cie Biacore é descrita nos Exemplos aqui.
A afinidade de ligação pode ser determinada usando-se Kinexa Biocensor, ensaios de proximidade de cintilação, ELISA, imunoensaio ORI- GEN (IGEN), extinção de fluorescência, transferência de fluorescência, e/ou revelação de levedura. A afinidade de ligação pode também ser classificada usando-se bioensaio adequado.
Em algumas concretizações, toda posição do aminoácido em uma CDR é substituída (em algumas concretizações, uma em um tempo) com todos os 20 aminoácidos naturais usando métodos de mutagênese re- conhecidos na técnica (alguns dos quais são descritos aqui). Isto gera pe- quenas bibliotecas de clones (em algumas concretizações, uma para toda posição do aminoácido que é analisada), cada com uma complexidade de 20 membros (se todos os 20 aminoácidos são substituídos em toda posição).
Em algumas concretizações, a biblioteca a ser classificada com- preende substituições em duas ou mais posições, que podem ser na mesma CDR, ou em duas ou mais CDRs. Desse modo, a biblioteca pode compreen- der substituições em duas ou mais posições em uma CDR. A biblioteca pode compreender substituição em duas ou mais posições em duas ou mais C- DRs. A biblioteca pode compreender substituição em 3, 4, 5, ou mais posi- ções, referidas posições encontradas em duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs. A substituição pode ser preparada usando-se códons de baixas re- dundâncias. Vide, por exemplo, Tabela 2 de Balint et al., (1993) Gene 137(1):109-18).
A CDR pode ser CDRH3 e/ou CDRL3. A CDR pode ser um ou mais de CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2, e/ou CDRH3. A CDR pode ser uma CDR de Kabat, uma CDR de Chothia, ou uma CDR extendida.
Os candidatos com ligação aperfeiçoada podem ser seqüencia- dos, identificando, desse modo, um mutante de substituição de CDR que resulta em afinidade aperfeiçoada (também denominada uma substituição "aperfeiçoada"). Os candidatos que se ligam podem também serem seqüen- ciados, identificando, desse modo, uma substituição de CDR que retém Iiga- ção.
Etapas múltiplas de classificação podem ser conduzidas. Por exemplo, candidatos (cada um compreendendo uma substituição de amino- ácido em uma ou mais posição de uma ou mais CDR) com ligação aperfei- çoada são também úteis para o desenho de uma segunda biblioteca conten- do pelo menos o aminoácido original e substituído em cada posição de CDR aperfeiçoada (isto é, posição de aminoácido na CDR na qual um mutante de substituição mostrou ligação aperfeiçoada). A preparação e classificação ou seleção desta biblioteca é discutida adicionalmente abaixo.
A mutagênese de varredura de biblioteca também proporciona um meio para caracterização de uma CDR, na medida em que a freqüência de clones com ligação aperfeiçoada, a mesma ligação, ligação diminuída, ou nenhuma ligação, também proporcionam informação relacionada a impor- tância de cada posição de aminoácido para a estabilidade do complexo anti- corpo-antígeno. Por exemplo, se uma posição da CDR retém ligação quando mudada para todos os 20 aminoácidos, esta posição é identificada como uma posição que é diferentemente para ser requerida para ligação de antí- geno. Inversamente, se uma posição de CDR retém ligação em apenas uma pequena percentagem de substituições, esta posição é identificada como uma posição que é importante para função de CDR. Desse modo, os méto- dos de mutagênese de varredura de biblioteca geram informação relaciona- da às posições nas CDRs que podem ser mudadas para muitos aminoácidos diferentes (incluindo todos os 20 aminoácidos), e posições nas CDRs que não podem ser mudadas, ou que podem somente serem mudadas para uns poucos aminoácidos.
Os candidatos com afinidade aperfeiçoada podem ser combina- dos em uma segunda biblioteca, que incluem o aminoácido aperfeiçoado, o aminoácido original naquela posição, e podem adicionalmente incluir substi- tuições adicionais naquela posição, dependendo da complexidade da biblio- teca que é desejada, ou permitida usando-se o método de classificação ou seleção desejado. Em adição, se desejado, a posição de aminoácido adja- cente pode ser randomizada para pelo menos dois ou mais aminoácidos. A randomização de aminoácidos adjacentes pode permitir flexibilidade confor- macional adicional na CDR mutante, que pode, por sua vez, permitir ou faci- litar a introdução de um grande número de mutações aperfeiçoadas. A biblio- teca pode também compreender substituição na posição que não mostra afinidade aperfeiçoada na primeira etapa de classificação.
A segunda biblioteca é classificada ou selecionada para mem- bros de biblioteca com afinidade de ligação aperfeiçoada e/ou alterada u- sando-se qualquer método conhecido na técnica, incluindo classificação u- sando análise de ressonância plasmon de superfície Biacore1 e seleção u- sando-se qualquer método conhecido na técnica para seleção, incluindo re- velação de fago, revelação de levedura, e revelação de ribossomo.
A invenção também envolve proteínas de fusão compreendendo um ou mais fragmentos ou regiões a partir dos anticorpos (tal como G1), ou polipeptídeos desta invenção. Em uma concretização, um polipeptídeo de fusão é provido, que compreende pelo menos 10 aminoácidos contíguos da região de cadeia leve variável mostrada em SEQ ID NO:2 (Figura 5), e/ou pelo menos 10 aminoácidos da região de cadeia pesada variável mostrada em SEQ ID NO:1 (Figura 5). Em outras concretizações, um polipeptídeo de fusão é provido, que compreende pelo menos cerca de 10, pelo menos cer- ca de 15, pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca de 25, ou pelo menos cerca de 30 aminoácidos contíguos da região de cadeia leve variável mos- trada em SEQ ID NO:2 (Figura 5), e/ou pelo menos cerca de 10, pelo menos cerca de 15, pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca de 25, ou pelo me- nos cerca de 30 aminoácidos contíguos da região de cadeia pesada variável mostrada em SEQ ID NO:1 (Figura 5). Em outra concretização, o polipeptí- deo de fusão compreende uma região de cadeia leve variável e/ou uma re- gião de cadeia pesada variável de G1, conforme mostrado em SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:1 da Figura 5. Em outra concretização, o polipeptídeo de fusão compreende uma ou mais CDR(s) de G1. Em ainda outras concretizações, o polipeptídeo de fusão compreende CDR H3 e/ou CDR L3 de anticorpo G1. Para proposta desta invenção, uma proteína de fusão G1 contém um ou mais anticorpos G1 e outra seqüência de aminoácido a qual ela não está fixada na molécula nativa, por exemplo, uma seqüência heteróloga ou uma seqüência homóloga de outra região. As seqüências heterólogas exemplares incluem, mas não estão limitadas a, uma "etiqueta" tal como uma etiqueta FLAG ou uma etiqueta 6His. As etiquetas são bem-conhecidas na técnica.
Um polipeptídeo de fusão G1 pode ser criado por métodos co- nhecidos na técnica, por exemplo, sinteticamente ou recombinantemente. Tipicamente, as proteínas de fusão G1 desta invenção são produzidas pela preparação de uma expressão de um polinucleotídeo que codifica as mes- mas usando-se métodos recombinantes aqui descritos, embora elas possam também serem preparadas por outros meios conhecidos na técnica, incluin- do, por exemplo, síntese química.
Esta invenção também proporciona composições compreenden- do anticorpos ou polipeptídeos derivados de G1 conjugados (por exemplo, ligados) a um agente que facilita acoplamento a um suporte sólido (tal como biotin ou avidin). Para simplicidade, referência será feita geralmente a G1 ou anticorpos com a compreensão que estes métodos se aplicam a quaisquer das concretizações de ligação de CGRP aqui descritas. A conjugação ge- ralmente se refere a ligação destes componentes conforme descrito aqui. A ligação (que é geralmente fixação destes componentes em associação pró- xima pelo menos para administração) pode ser alcançada em qualquer nú- mero de modos. Por exemplo, uma reação direta entre um agente e um anti- corpo é possível quando um possui um substituinte capaz de reagir com o outro. Por exemplo, um grupo nucleofílico, tal como um grupo amino ou sul- fidrila, pode ser capaz de reagir com um grupo contendo carbonila, tal como um anidrido ou um ácido haleto, ou com um grupo alquila contendo um bom grupo de saída (por exemplo, um haleto) no outro.
Um anticorpo ou polipeptídeo desta invenção pode estar ligado a um agente de etiquetamento (alternativamente denominado "etiqueta"), tal como uma molécula fluorescente, uma molécula radioativa, ou quaisquer outras etiquetas conhecidas na técnica. As etiquetas são conhecidas na téc- nica que geralmente proporcionam (ou diretamente ou indiretamente) um sinal.
A invenção também proporciona composições (incluindo compo- sições farmacêuticas) e kits compreendendo anticorpo G1, e, conforme esta descrição torna claro, qualquer ou todos os anticorpos e/ou polipeptídeos aqui descritos.
A invenção também proporciona polinucleotídeos isolados que codificam os anticorpos e polipeptídeos da invenção (incluindo um anticorpo compreendendo as seqüências de polipeptídeo das regiões variáveis de ca- deia leve e de cadeia pesada mostradas na Figura 5), e vetores e células hospedeiras compreendendo o polinucleotídeo.
Conseqüentemente, a invenção proporciona polinucleotídeos (ou composições, incluindo composições farmacêuticas), compreendendo poli- nucleotídeos que codificam qualquer dos seguintes: (a) anticorpo G1 ou su- as variantes, mostrados na Tabela 6; (b) um fragmento ou uma região de anticorpo G1 ou suas variantes, mostrados na Tabela 6; (c) uma cadeia leve de anticorpo G1 ou suas variantes, mostradas na Tabela 6; (d) uma cadeia pesada de anticorpo G1 ou suas variantes, mostrada na Tabela 6; (e) uma ou mais regiões variável(is) de uma cadeia leve e/ou uma cadeia pesada de anticorpo G1 ou suas variantes, mostradas na Tabela 6; (f) um ou mais C- DR(s) (uma, duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs) de anticorpo G1, ou su- as variantes, mostradas na Tabela 6; (g) CDR H3 a partir da cadeia pesada de anticorpo G1; (h) CDR L3 a partir da cadeia leve de anticorpo G1 ou suas variantes, mostradas na Tabela 6; (i) três CDRs a partir da cadeia leve de anticorpo G1 ou suas variantes, mostradas na Tabela 6; (j) três CDRs a par- tir da cadeia pesada de anticorpo G1 ou suas variantes, mostradas na Tabe- la 6; (k) três CDRs a partir da cadeia leve e três CDRs a partir da cadeia pe- sada de anticorpo G1 ou suas variantes, mostradas na Tabela 6; e (I) um anticorpo compreendendo qualquer um de (b) a (k). Em algumas concretiza- ções, o polinucleotídeo compreende qualquer ou ambos dos polinucleotí- deo(s) mostrados em SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10.
Em outro aspecto, a invenção proporciona polinucleotídeos que codificam qualquer dos anticorpos (incluindo fragmentos de anticorpo) e po- lipeptídeos aqui descritos, tais como anticorpos e polipeptídeos tendo função realizadora prejudicada. Os polinucleotídeos podem ser produzidos por pro- cedimentos conhecidos na técnica.
Em outro aspecto, a invenção proporciona composições (tais como composições farmacêuticas) compreendendo quaisquer dos polinucle- otídeos da invenção, Em algumas concretizações, a composição compreen- de um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica o anticorpo G1 conforme descrito aqui. Em outra concretização, a composição compreende um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica qualquer dos anticorpos ou polipeptídeos aqui descritos. Em ainda outras concretizações, a composição compreende qualquer ou ambos dos polinucleotídeos mostrados em SEQ ID NO:9 e SEQ ID N0:10. Vetores de expressão, e administração de composição de polinucleotídeo são adicio- nalmente aqui descritos.
Em outro aspecto, a invenção proporciona um método de produ- zir quaisquer dos polinucleotídeos aqui descritos.
Polinucleotídeos complementares a quaisquer de tais seqüên- cias são também envolvidos pela presente invenção. Polinucleotídeos po- dem ser de trançado simples (codificação ou anti-sentido), ou de trançado duplo, e podem ser moléculas de DNA (genômicas, cDNA ou sintéticas), ou moléculas de RNA. As moléculas de RNA incluem moléculas de HnRNA, que contêm introns, e correspondem a uma molécula de DNA em uma ma- neira uma a uma, e moléculas de mRNA que não contêm introns. Seqüên- cias de codificação ou não-codificação podem, mas não necessário, estar presentes dentro de um polinucleotídeo da presente invenção, e um polinu- cleotídeo pode, mas não necessário, estar ligado a outras moléculas e/ou materiais de suporte.
Os polinucleotídeos podem compreender uma seqüência nativa (isto é, uma seqüência endógena que codifica um anticorpo, ou uma porção deste), ou podem compreender uma variante de tal seqüência. As variantes do polinucleotídeo contêm uma ou mais substituições, adições, retiradas e/ou inserções, tal que a imunorreatividade do polipeptídeo codificado não é diminuída em relação a uma molécula imunorreativa nativa. O efeito na imu- norreatividade do polipeptídeo codificado pode geralmente ser avaliado con- forme descrito aqui. As variantes preferivelmente exibem pelo menos cerca de 70% de identidade, mais preferivelmente pelo menos cerca de 80% de identidade, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% de identidade para uma seqüência de polinucleotídeo que codifica um anticorpo nativo, ou uma porção deste.
Duas seqüências de polinucleotídeo ou polipeptídeo são referi- das para serem "idênticas" se a seqüência de nucleotídeos ou aminoácidos nas duas seqüências é a mesma quando alinhada para correspondência máxima conforme descrito abaixo. Comparações entre duas seqüências são tipicamente realizadas pela comparação das seqüências sobre uma janela de comparação para identificar e comparar regiões locais de similaridade de seqüência. Uma "janela de comparação" conforme usado aqui, se refere a um segmento de pelo menos cerca de 20 posições contíguas, usualmente 30 a cerca de 75, 40 a cerca de 50, em que uma seqüência pode ser compa- rada a uma seqüência de referência do mesmo número de posições contí- guas após as duas seqüências serem otimamente alinhadas.
O alinhamento ótimo de seqüências para comparação pode ser conduzido usando-se o programa Megalign na no conjunto Lasergene de bioinformatics software (DNASTAR, Inc., Madison, Wl), usando-se parâme- tros de omissão. Este programa concretiza vários esquemas de alinhamento descritos nas seguintes referências: Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolu- tionary change in proteínas - Matrices for detecting distant relationships. Em Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Bio- medical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Hig- gins, D.G. and Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. and Mul- IerW., 1988, CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principies and Practice of Nu- merical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., 1983, Proc. NatLAcad. Sei. USA 80:726-730.
Preferivelmente, a "percentagem de identidade de seqüência" é determinada pela comparação de duas seqüências otimamente alinhadas sobre uma janela de comparação de pelo menos 20 posições, no qual a por- ção da seqüência de polinucleotídeo ou polipeptídeo na janela de compara- ção pode compreender adições ou retiradas (isto é, folgas) de 20 por cento ou menos, usualmente 5 a 15 por cento, ou 10 a 12 por cento, conforme comparado às seqüências de referência (que não compreendem adições ou retiradas) para alinhamento ótimo das duas seqüências. A percentagem é calculada pela determinação do número de posições no qual as bases de ácido nucléico idênticas ou resíduo de aminoácido ocorrem em ambas as seqüências para produzir o número de posições equiparadas, dividindo-se o número de posições equiparadas pelo número total de posições na seqüên- cia de referência (isto é, o tamanho da janela), e multiplicando-se os resulta- dos por 100 para produzir a percentagem de identidade de seqüência.
As variantes podem também, ou alternativamente, serem subs- tancialmente homólogas a um gene nativo, ou a uma porção ou complemen- to deste. Tais variantes de polinucleotídeo são capazes de hibridizarem sob condições moderadamente estringentes a uma seqüência de DNA que ocor- re naturalmente que codifica um anticorpo nativo (ou uma seqüência com- plementar).
"Condições moderadamente estringentes" adequadas incluem pré-lavagem em uma solução de 5 X SSC, 0,5% de SDS, 1,0 mM de EDTA (pH 8,0); hibridização a 50°C-65°C, 5 X SSC, durante toda noite; seguido por lavagem duas vezes a 65°C por 20 minutos com cada de 2X, 0,5X e 0,2X SSC contendo 0,1 % de SDS.
Conforme usado aqui, "condições altamente estringentes" ou "condições de alta estringência" são aquelas que: (1) empregam baixa resis- tência iônica e alta temperatura de lavagem, por exemplo, cloreto de sódio 0,015 M/citrato de sódio 0,0015M/0,1% de sulfato de dodecil sódio a 50°C; (2) empregam durante hibridização um agente de desnaturação, tal como formamida, por exemplo, 50% (v/v) de formamida com 0,1% de albumina de soro bovino/0,1% de Ficoll/0,1% de polivinilpirrolidona/50mM de tampão de fosfato de sódio em pH 6,5 com 750 mM de cloreto de sódio, 75 mM de citra- to de sódio a 42°C; ou (3) empregam 50% de formamida, 5 χ SSC (NaCI 0,75M, citrato de sódio 0,075M), 50 mM de fosfato de sódio (pH 6,8), 0,1% de pirofosfato de sódio, 5 x solução de Denhardt, DNA de esperma de sal- mão sonicado (50 μg/ml), 0,1% de SDS, e 10% de dextrano sulfato a 42°C, com lavagens a 42°C em 0,2 x SSC (cloreto de sódio/citrato de ódio) e 50% de formamida a 55°C, seguido por uma lavagem de alta estringência consis- tindo em 0,1 x SSC contendo EDTA a 55°C. O técnico no assunto reconhe- cerá como ajustar a temperatura, resistência iônica, etc., conforme necessá- rio para acomodar fatores tais como comprimento de sonda e similares.
Será apreciado por aqueles versados na técnica que, como um resultado da degeneração do código genético, existem muitas seqüências de nucleotídeo que codificam um polipeptídeo conforme descrito aqui. Alguns destes polinucleotídeos suportam homologia mínima para a seqüência de nucleotídeo de qualquer gene nativo. Não obstante, os polinucleotídeos que variam devido às diferenças no uso de códon são especificamente contem- piados pela presente invenção. Adicionalmente, os alelos dos genes com- preendendo as seqüências de polinucleotídeos aqui estão dentro do escopo da presente invenção. Os alelos são genes endógenos que são alterados como um resultado de uma ou mais mutações, tais como retiradas, adições e/ou substituições de nucleotídeos. O mRNA resultante e proteína podem, mas não necessitam, terem uma estrutura ou função alterados. Os alelos podem ser identificados usando-se técnicas padrões (tais como hibridização, amplificação e/ou comparação de seqüência de base de dados).
Os polinucleotídeos desta invenção podem ser obtidos usando- se síntese química, métodos recombinantes, ou PCR. Os métodos de sínte- se química de polinucleotídeo são bem-conhecidos na técnica, e não neces- sitam serem descritos em detalhes aqui. Um. versado na técnica pode usar as seqüências aqui providas e um sintetizador de DNA comercial para pro- duzir uma seqüência de DNA desejada.
Para preparação de polinucleotídeos usando-se métodos re- combinantes, um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência desejada pode ser inserido em um vetor adequado, e o vetor, por sua vez, pode ser introduzido em uma célula hospedeira adequada para replicação e amplifi- cação, conforme discutido adicionalmente aqui. Os polinucleotídeos podem ser inseridos em células hospedeiras por quaisquer meios conhecidos na técnica. As células são transformadas pela introdução de um polinucleotídeo exógeno por levantamento direto, endocitose, transfecção, união-F ou ele- troporação. Uma vez introduzido, o polinucleotídeo exógeno pode ser manti- do dentro da célula como um vetor não-integrado (tal como um plasmídeo), ou integrado no genoma da célula hospedeira. O polinucleotídeo assim am- plificado pode ser isolado a partir da célula hospedeira por métodos bem- conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Sambrook et al. (1989).
Alternativamente, PCR permite reprodução de seqüências de DNA. A tecnologia de PCR é bem-conhecida na técnica, e é descrita nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 4.683.195, 4.800.159, 4.754.065 e 4.683.202, bem como PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston (1994).
O RNA pode ser obtido pelo uso do DNA isolado em um vetor apropriado, e inserindo-o em uma célula hospedeira adequada. Quando a célula replica e o DNA é transcrito em RNA, o RNA pode então ser isolado usando-se métodos bem-conhecidos àqueles técnicos no assunto, conforme colocado em Sambrook et al., (1989), por exemplo.
Vetores de clonagem adequados podem ser construídos de a- cordo com técnicas padrões, ou podem ser selecionados de um grande nú- mero de vetores de clonagem disponíveis na técnica. Enquanto o vetor de clonagem selecionado pode variar de acordo com a célula hospedeira pre- tendida para ser usada, vetores de clonagem úteis terão geralmente a capa- cidade de se auto-replicarem, podem possuir um alvo simples para uma en- donuclease de restrição particular, e/ou podem transportar genes para um marcador que pode ser usado na seleção de clones contendo o vetor. E- xemplos adequados incluem plasmídeos e vírus bacteriais, por exemplo, pUC18, pUC19, Bluescript (por exemplo, pBS SK+) e seus derivados, mp18, mp19, pBR322, pMB9, CoIEI, pCR1, RP4, DNAs de fagos, e vetores de cur- so de ida e volta, tais como pSA3 e pAT28. Estes e muitos outros vetores de clonagem são disponíveis a partir de vendedores comerciais tais como Bio- Rad, Strategene, e Invitrogen.
Vetores de expressão geralmente são construções de polinucle- otídeo replicáveis que contêm um polinucleotídeo de acordo com a invenção. É implicado que um vetor de expressão deve ser replicável nas células hos- pedeiras, ou como epissomas, ou como uma parte integral do DNA cromos- somal. Vetores de expressão adequados incluem, mas não estão limitados a, plasmídeos, vetores virais, incluindo adenovírus, vírus adeno-associados, retrovírus, cosmídeos, e vetor(es) de expressão descritos na Publicação PCT No. WO 87/04462. Os componentes do vetor podem geralmente incluir, mas não estão limitados a, um ou mais dos seguintes: uma seqüência de sinal; uma origem de replicação; um ou mais genes marcadores; elementos de controle transcricional adequados (tais como promotores, intensificadores e terminador). Para expressão (isto é, translação), um ou mais elementos de controle transcricional são também usualmente requeridos, tais como, locais de ligação de ribossomo, locais de iniciação de translação, e códons de pa- rada.
Os vetores contendo os polinucleotídeos de interesse podem ser introduzidos na célula hospedeira por qualquer de um número de meios a- propriados, incluindo eletroporação, transfecção empregando cloreto de cál- cio, cloreto de rubídio, fosfato de cálcio, DEAE-dextrano, ou outras substân- cias; bombardeio de microprojétil; lipofecção; e infecção (por exemplo, onde o vetor é um agente infeccioso, tal como vírus de vacina). A escolha de veto- res de introdução ou polinucleotídeos freqüentemente dependerá das carac- terísticas da célula hospedeira.
A invenção também proporciona células hospedeiras compreen- dendo quaisquer dos polinucleotídeos descritos aqui. Quaisquer células hospedeiras capazes de sobreexpressarem DNAs heterólogos podem ser usadas para a proposta de isolar os genes que codificam o anticorpo, poli- peptídeo ou proteína de interesse. Exemplos não-limitativos de células hos- pedeiras de mamífero incluem, mas não estão limitados a, células COS, He- La, e CHO. Vide também Publicação PCT No. WO 87/04462. Células hos- pedeiras não-mamíferas adequadas incluem procarióticas (tais como E. coli ou Β. subtillis) e levedura (tais como S. cerevisae, S. pombe; ou K. lactis). Preferivelmente, as células hospedeiras expressam os cDNAs em um nível de cerca de 5 vezes mais alto, mais preferivelmente 10 vezes mais alto, ain- da mais preferivelmente 20 vezes mais alto do que do anticorpo endógeno correspondente ou proteína de interesse, se presentes, nas células hospe- deiras. A célula que sobreexpressa o anticorpo ou a proteína de interesse pode ser identificada através de um imunoensaio ou FACS. D. Composições
As composições usadas nos métodos da invenção compreen- dem uma quantidade eficaz de um anticorpo antagonista anti-CGRP, ou um polipeptídeo derivado de anticorpo antagonista anti-CGRP aqui descrito. E- xemplos de tais composições, bem como de que modo formular, são tam- bém descritos em uma seção anterior e abaixo. Em uma concretização, a composição compreende adicionalmente um antagonista de CGRP. Em ou- tra concretização, a composição compreende um ou mais anticorpos anta- gonistas anti-CGRP. Em outras concretizações, o anticorpo antagonista anti- CGRP reconhece CGRP humano. Em ainda outras concretizações, o anti- corpo antagonista anti-CGRP é humanizado. Em ainda outra concretização, o anticorpo antagonista anti-CGRP compreende uma região constante que não dispara uma resposta imune não-desejada ou indesejável, tal como Iisis mediado por anticorpo ou ADCC. Em outras concretizações, o anticorpo an- tagonista anti-CGRP compreende uma ou mais CDRs de anticorpo G1 (tais como uma, duas, três, quatro, cinco, ou, em algumas concretizações, todas as seis CDRs de G1). Em algumas concretizações, o anticorpo antagonista anti-CGRP é humano.
É compreendido que as composições podem compreender mais do que um anticorpo antagonista anti-CGRP (por exemplo, uma mistura de anticorpos antagonistas anti-CGRP que reconhece epitopos diferentes de CGRP). Outras composições exemplares compreendem mais do que um anticorpo antagonista anti-CGRP que reconhece o(s) mesmo(s) epitopo(s), ou espécies diferentes de anticorpos antagonistas de anti-CGRP que se ligam a epítopos diferentes de CGRP.
A composição usada na presente invenção pode adicionalmente compreender veículos farmaceuticamente aceitáveis, excipientes, ou estabi- lizadores (Remington: The Science and practice of Pharmacy 20th Ed.
(2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. Κ. E. Hoover.), na forma de for- mulações liofilizadas ou soluções aquosas. Veículos aceitáveis, excipientes, ou estabilizadores são não-tóxicos a recipientes nas dosagens e concentra- ções, e podem compreender tampões, tais como fosfato, citrato e outros áci- dos orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico e metionina; conser- vantes (tais como, octadecildimetilbenzil cloreto de amônia; cloreto de he- xametônium; cloreto de benzalcônium, cloreto de benzetônium; fenol ou ál- cool de butila ou benzila; alquil parabenos, tais como metil ou propil parabe- no; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos do que cerca dé 10 resíduos); proteínas, tais como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofíli- cos tal como polivinilpirrolidone; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo glicose, manose, ou dextranos; agentes que- lantes tal como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, trehalose ou sorbitol; contadores de íons de formação de sal, tal como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou tensoativos não- iônicos, tais como TWEEN®, PLURONICS® ou polietileno glicol (PEG). Exci- pientes farmaceuticamente aceitáveis são adicionalmente descritos aqui.
O anticorpo antagonista anti-CGRP e composições deste podem também serem usados em conjunto com outros agentes que servem para aumentar e/ou complementar a eficiência dos agentes. E. Kits
A invenção também proporciona kits para uso nos presentes mé- todos. Os kits da invenção incluem um ou mais recipientes compreendendo um anticorpo antagonista anti-CGRP (tal como a anticorpo humanizado), ou polipeptídeo aqui descrito, e instruções para uso de acordo com qualquer dos métodos da invenção aqui descritos. Geralmente, estas instruções com- preendem a descrição de administração do anticorpo antagonista anti-CGRP para tratar, melhorar ou prevenir dor de cabeça (tal como enxaqueca) de acordo com qualquer dos métodos aqui descritos. O kit pode adicionalmente compreender uma descrição de seleção de um indivíduo adequado para tra- tamento baseado na identificação se este indivíduo tem dor de cabeça, ou se o indivíduo está em risco de ter dor de cabeça. Em ainda outras concreti- zações, as instruções compreendem uma descrição de administrar um anti- corpo antagonista anti-CGRP a um indivíduo em risco de ter dor de cabeça (tal como enxaqueca).
Em algumas concretizações, o anticorpo é um anticorpo huma- nizado. Em algumas concretizações, o anticorpo é humano. Em outras con- cretizações, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em algumas concreti- zações, o anticorpo compreende uma ou mais CDR(s) de anticorpo G1 (tais como uma, duas, três, quatro, cinco, ou, em algumas concretizações, todas as seis CDRs de G1).
As instruções relacionadas ao uso de um anticorpo antagonista anti-CGRP geralmente incluem informação como para dosagem, tabela de dosagem e rota de administração para o tratamento pretendido. Os recipien- tes podem ser doses de unidade, acondicionamentos de massa (por exem- plo, acondicionamentos de multi-doses), ou doses de subunidade. As instru- ções fornecidas nos kits da invenção são tipicamente instruções escritas em uma etiqueta ou inserto de acondicionamento (por exemplo, uma folha de papel incluída no kit), mas instruções legíveis de máquina (por exemplo, ins- truções conduzidas em um disco de armazenagem magnético ou ótico) são também aceitáveis.
A etiqueta ou inserto de acondicionamento indica que a compo- sição é usada para tratar, melhorar e/ou prevenir dor de cabeça (tal como enxaqueca). As instruções podem ser providas para praticar qualquer dos métodos aqui descritos.
Os kits desta invenção estão em acondicionamentos adequados. Acondicionamentos adequados incluem, mas não estão limitados a, frascos, garrafas, jarros, acondicionamento flexível (por exemplo, sacos plásticos ve- dados ou Mylar vedados), e similares. Também contemplados são acondi- cionamentos para uso em combinação com um dispositivo específico, tais como um inalador, dispositivo de administração nasal (por exemplo, um a- tomizador), ou um dispositivo de infusão, tal como uma minibomba. Um kit pode ter um orifício de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco tendo um obturador penetrável por uma agulha de injeção hipodérmica). O recipiente pode também ter um orifício de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco de so- lução intravenosa ou um frasco tendo um obturador penetrável por uma agu- lha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um anticorpo antagonista anti-CGRP. O recipiente pode adicionalmente compreender um segundo agente farmaceuticamente ativo.
Os kits podem opcionalmente proporcionar componentes adicio- nais, tais como tampões e informação interpretativa. Normalmente, o kit compreende um recipiente e uma etiqueta ou inserto(s) de acondicionamen- to em ou associados com o recipiente.
Os seguintes Exemplos são providos para ilustrar, mas não para limitar a invenção.
Exemplos
Exemplo 1: Geração e caracterização de anticorpos monoclonais direciona- dos contra CGRP
Geração de anticorpos anti-CGRP. Para gerar anticorpos anti- CGRP que têm reatividade de espécie cruzada para CGRP de rato e huma- no, camundongos foram imunizados com 25-100 pg de α-CGRP humano ou β-CGRP conjugado a KLH em adjuvante (50 μΙ por almofada de pé, 100 μΙ total por camundongo) em vários intervalos. A imunização foi geralmente realizada conforme descrito em Geerligs HJ et al., 1989, J. Immunol. Meth- ods 124:95-102; Kenney JS et al., 1989, J. Immunol. Methods 121:157-166; e Wicher K et al., 1989, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 89:128-135. Os camundongos foram primeiro imunizados com 50 μg de α-CGRP humano ou β-CGRP conjugado para KLH em CFA (adjuvante de Freund completo). A- pós 21 dias, os camundongos foram imunizados com 25 μg de β-CGRP hu- mano (para camundongos primeiro imunizados com α-CGRP humano), ou um α-CGRP (para camundongos primeiro imunizados com β-CGRP huma- no) conjugado para KLH em IFA (adjuvante de Freund incompleto). Vinte e três dias mais tarde após a segunda imunização, a terceira imunização foi realizada com 25 μg de α-CGRP de rato conjugado para KLH em IFA. Dez dias mais tarde, os títulos de anticorpo foram testados usando ELISA. A quarta imunização foi realizada com 25 μg do peptídeo (α-CGRP-KLH de rato) em IFA 34 dias após a terceira imunização. Reforço final foi realizado com 100 μg de peptídeo solúvel (α-CGRP de rato) 32 dias após a quarta i- munização.
Esplenócitos foram obtidos a partir do camundongo imunizado e fundidos com células de mieloma NSO a uma razão de 10:1, com polietileno glicol 1500. Os híbridos foram colocados em placas de 96 cavidades em DMEM contendo 20% de soro de cavalo e seleção de 2- oxaloacetato/piruvato/insulina (Sigma), e hipoxantina/aminopterin/timidina foi começada. No oitavo dia, 100 μΙ de DMEM contendo 20% de soro de cavalo foi adicionado a todas as cavidades. Os sobrenadantes dos híbridos foram classificados pelo uso de imunoensaio de captura de anticorpo. A determi- nação de classe de anticorpo foi feita com segundos anticorpos de classe específica.
Um painel de linhas de célula de produção de anticorpo mono- clonal foi selecionado baseado na sua ligação ao CGRP de rato e humano para caracterização adicional. Estes anticorpos e características são mos- trados abaixo nas Tabelas 2 e 3.
Purificação e preparação de fragmento Fab. Os anticorpos mo- noclonais selecionados para caracterização adicional foram purificados de sobrenadantes de culturas de hibridoma usando cromatografia de afinidade de proteína A. Os sobrenadantes foram equilibrados para 8. Os sobrenadan- tes foram, em seguida, carregados para a coluna de proteína A MabSelect (Amersham Biosciences número 17-5199-02) equilibrada com PBS para pH 8. A coluna foi lavada com 5 volumes de coluna de PBS, pH 8. Os anticorpos foram eluídos com 50 mM de tampão citrato-fosfato, pH 3. Os anticorpos 92
eluídos neutralizados com Tampão de Fosfato 1M, pH 8. Os anticorpos puri- ficados foram dializados com PBS1 pH 7,4. Ás concentrações de anticorpo foram determinadas por SDS-PAGE, usando-se a curva padrão de anticorpo monoclonal de murina.
Fabs foram preparados por proteólise de papaína dos anticorpos totais usando-se kit Immunopure Fab (Pierce número 44885), e purificados por fluxo através de cromatografia de proteína A seguindo instruções do fa- bricante. As concentrações foram determinadas por ELISA e/ou eletroforese de SDS-PAGE usando-se um Fab padrão de concentração conhecida (de- terminada por análise de aminoácido), e por A280 usando 10D=0,6 mg/ml (ou equivalente teórico baseado na seqüência de aminoácido).
Determinação das Afinidades de Fabs. As afinidades dos anti- corpos monoclonais anti-CGRP foram determinadas em ou 25°C ou 37°C usando-se sistema de ressonância plasmon de superfície Biacore3000® (S- PR) (Biacore, INC, Piscataway NJ) com tampão operando do próprio fabri- cante, HBS-EP (10 mM de HEPES, pH 7,4, 150 mM de NaCI, 3 mM de ED- TA, 0,005% v/v de polissorbato P20). A afinidade foi determinada por captu- ra de peptídeos CGRP N-terminalmente biotinilatados (prática ordenada de GenScript Corporation, New Jersey or Global Peptídeo Services, Colorado), via streptavidin pré-imobilizada em chip AS, e medindo cinéticas de ligação de anticorpo Fab tituladas através da superfície de CGRP. O CGRP biotinila- tado foi diluído em HBS-EP e injetado sobre o chip à uma concentração de menos do que 0,001 mg/ml. Usando-se tempo de fluxo variável através dos canais de chip do indivíduo, duas faixas de densidade de antígeno foram alcançadas: <50 de unidades de resposta (RU) para estudos cinéticos deta- lhados, e cerca de 800 RU para estudos de concentração e classificação. Diluições de duas a três séries tipicamente em giros de concentrações 1 μΜ - 0,1 nM (objetivado a 0,1-1 Ox estimado KD) de fragmentos de Fab purifica- dos foram injetados por 1 minuto a 100 μΙ_/ιηΐη, e tempos de dissociação de 10 minutos foram permitidos. Após cada ciclo de ligação, as surperfícies fo- ram regeneradas com 25 mM de NaOH em 25% v/v de etanol, que foi tole- rado sobre centenas de ciclos. Taxa de associação cinética (kon) e taxa de dissociação (koff) foram obtidas simultaneamente pelo ajuste dos dados para modelo de ligação Langmuir 1:1 (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Pe- tersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110) usando-se o programa BIAevaIuation. As constantes de dissociação de equilíbrio globais (Kd) ou "afinidades" foram calculadas a partir da razão K0 = Wkon- As afinidades dos fragmentos de Fab de murina são mostradas nas Tabelas 2 e 3.
Mapeamento de epítopo dos anticorpos de murina anti-CGRP. Para determinar o epítopo que anticorpos anti-CGRP se ligam em a-CGRP humano, as afinidades de ligação dos fragmentos de Fab para vários frag- mentos de CGRP foram medidas conforme descrito acima pela captura de fragmentos de CGRP N-terminalmente biotinilatados de 19-37 aminoácidos e 25-37 aminoácidos em um chip de sensor SA. A Figura 1 mostra suas afi- nidades de ligação medidas a 25°C. Conforme mostrado na Figura 1, todos os anticorpos, exceto o anticorpo 4901, se ligam a fragmentos de a-CGRP humano 19-37 e 25-37 com afinidade similar a sua afinidade de ligação de comprimento total de a-CGRP (1-37) humano. O anticorpo 4901 se liga a um fragmento de α-CGRP humano 25-37 com afinidade seis vezes inferior do que ligação a fragmento de α-CGRP humano de comprimento total, devido principalmente a uma perda na taxa externa. Os dados indicam que estes anticorpos anti-CGRP geralmente se ligam à extremidade C-terminal de CGRP.
O escaneamento de alanina foi realizado para caracterizar adi- cionalmente aminoácidos em α-CGRP humano envolvido na ligação de anti- corpos anti-CGRP. Variantes diferentes de α-CGRP humano com substitui- ções de alanina simples foram geradas por síntese de peptídeo. Suas se- qüências de aminoácido são mostradas na Tabela 4 junto com todos os ou- tros peptídeos usados na análise Biacore. As afinidades de fragmentos Fab dos anticorpos anti-CGRP para estas variantes foram determinadas usando- se Biacore conforme descrito acima. Conforme mostrado na Figura 1, todos os 12 anticorpos que têm como alvo um epítopo de terminal-C, com aminoá- cido F37 sendo o resíduo mais crucial. A mutação de F37 para alanina abai- xa significantemente a afinidade, ou mesmo elimina completamente ligação dos anticorpos anti-CGRP ao peptídeo. O próximo resíduo mais importante de aminoácido é G33; contudo, somente anticorpos de alta afinidade (7E9, 8B6, 10A8, e 7D11) foram afetados por substituição de alanina nesta posi- ção. O resíduo de aminoácido S34 também desempenha um papel signifi- cante, mas menor, na ligação destes quatro anticorpos de alta afinidade.
Tabela 2. Características da ligação de anticorpos monoclonais anti-CGRP a α-CGRP humano e sua atividade antagonista
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Nota: Anticorpo 4901 é comercialmente disponível (Sigma, Product No. C7113). n.d. = não determinado Tabela 3. Características da ligação monoclonal de anticorpo anti-CGRP pa- ra α-CGRP de rato e atividade antagonista
<table>table see original document page 96</column></row><table>
"n.d." indica que nenhum teste foi realizado para o anticorpo. Tabela 4. Seqüência de aminoácidos de fragmentos de α-CGRP humano (SEQ ID NOS: 15-40) e peptídeos relacionados (SEQ ID NOS:41-47). Todos os peptídeos são C-terminalmente amidatados, exceto SEQ ID NC)S:36-40. Os resíduos em negrito indicam mutações de ponto.
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Exemplo 2: Classificação de anticorpos antaqonistas de anti-CGRP usando ensaios in vitro.
Anticorpos de murina anti-CGRP foram adicionalmente classifi- cados para atividade antagonista in vitro usando ensaio de ativação de cAMP baseado em célula, e ensaio de ligação.
A atividade antagonista medida por ensaio de cAMP. Cinco mi- crolitros de α-CGRP humano ou de rato (concentração final 50 nM) na pre- sença ou ausência de um anticorpo anti-CGRP (concentração final 1-3000 nM), ou α-CGRP de rato ou α-CGRP humano (concentração final 0,1 nM-10 μΜ; como um controle positivo para ativação de c-AMP) foi dispensado em uma placa de 384 cavidades (Nunc, Cat. No. 264657). Dez microlitros de células (SK-N-MC humano se α-CGRP humano é usado, ou L6 de rato de ATCC se α-CGRP de rato é usado) na estimulação de tampão (20 mM de HEPES, pH 7,4, 146 mM de NaCI, 5 mM de KCI, 1 mM de CaCI2, 1 mM de MgCI2, e 500 uM de 3-lsobutil-1-metilxantina(IBMX)) foram adicionados às cavidades da placa. A placa foi incubada à temperatura ambiente por 30 mi- nutos.
Após a incubação, a ativação de cAMP foi realizada usando-se Ensaio de Complementação de Fragmento de Enzima xHitHunter® (Applied Biosystems) seguindo as instruções do fabricante. O ensaio é baseado em uma enzima β-galactosidase geneticamente projetada que consiste em dois fragmentos denominados Aceitante de Enzima (EA) e Doador de Enzima (ED). Quando os dois fragmentos são separados, a enzima é inativa. Quan- do os fragmentos estão juntos, eles podem recombinar espontaneamente para formar enzima ativa por um processo denominado complementação. A plataforma de ensaio EFC utiliza um peptídeo ED-cAMP conjugado no qual cAMP é reconhecido por anti-cAMP. Este fragmento de ED é capaz de reas- sociação com EA para formar enzima ativa. No ensaio, anticorpo anti-cAMP é otimamente titulado para se ligar a ED-cAMP conjugado e inibir formação de enzima. Níveis de cAMP em amostras de Iisato de célula competem com ED-cAMP conjugado para ligação ao anticorpo anti-cAMP. A quantidade de ED livre conjugado no ensaio é proporcional à concentração de cAMP. Por- tanto, cAMP é medido pela formação de enzima ativa que é quantificada pe- lo rodízio de substrato Iuminescente de β-galactosidase. O ensaio de ativa- ção de cAMP foi realizado pela adição de 10 μL de tampão Iisis e anticorpo anti-cAMP (razão 1:1), seguido por incubação à temperatura ambiente por 60 minutos. Em seguida, 10 μL de reagente de ED-cAMP foi adicionado em cada cavidade, e incubado por 60 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, 20 μΙ de reagente de EA e mistura de CL (contendo o substrato) (razão 1:1) foi adicionado em cada cavidade, e incubado por 1-3 horas, ou durante toda noite à temperatura ambiente. A placa foi lida em 1 segun- do/cavidade em instrumento PMT, ou 30 segundos/lugar na imagem. Os an- ticorpos que inibem ativação de cAMP por α-CGRP foram identificados (refe- ridos como "sim") nas Tabelas 2 e 3 acima. Os dados nas Tabelas 2 e 3 in- dicam que anticorpos que demonstram atividade antagonista no ensaio ge- ralmente têm alta afinidade. Por exemplo, anticorpos tendo K"D (determinada a 25°C) de cerca de 80 nM ou menos para α-CGRP humano, ou tendo K"D (determinada a 37°C) de cerca de 47 nM ou menos para α-CGRP de rato, mostraram atividade antagonista neste ensaio.
Ensaio de ligação de radioligante. O ensaio de ligação foi reali- zado para medir o IC50 de anticorpo anti-CGRP no bloqueio do CGRP de ligação ao receptor conforme descrito anteriormente. Zimmermann et al., Peptídeos 16:421-4, 1995; Mallee et al., J. Biol. Chem. 277:14294-8, 2002. Membranas (25 μg) de células de SK-N-MC foram incubadas por 90 minutos à temperatura ambiente em tampão de incubação (50 mM de Tris-HCL, pH 7,4, 5 mM de MgCL2, 0,1% de BSA) contendo 10 pM∣ 125 de α-CGRP huma- no em um volume total de 1 mL. Para determinar concentrações de inibição (IC50), anticorpos ou CGRP não-rotulados (como um controle), de cerca de solução de estoque 100 vezes mais alta, foram dissolvidos em concentra- ções variadas no tampão de incubação e incubados ao mesmo tempo com membranas e 10 pM 125I de α-CGRP humano. A incubação foi terminada por filtração através de um filtro de microfibra de vidro (GF/B, 1μηι) que foi blo- queado com 0,5% de polietilemimina. Curvas de resposta de dose foram plotadas e valores K1 foram determinados pelo uso da equação: K"i = IC50/(1+([ligante]/KD); onde a constante de dissociação de equilíbrio Kd = 8 pM para α-CGRP humano para receptor de CGRP1 conforme presente em células de SK-N-MC, e Bmax = 0,025 pmol/mg proteína. O valor de IC50 repor- tado (em termos de moléculas de IgG) foi convertido em locais de ligação (pela multiplicação por 2), de modo que ele pode ser comparado com as afi- nidades (K0) determinadas por Biacore (vide Tabela 2).
A Tabela 2 mostra o IC50 de anticorpos de murina 7E9, 8B6, 6H2 e 4901. Os dados indicam que a afinidade do anticorpo geralmente se corre- laciona com IC50: anticorpos com afinidade mais alta (valores de Kd inferio- res) têm IC50 inferior no ensaio de ligação de radioligante. Exemplo 3: Efeito de anticorpos antagonistas de anti-CGRP na vasodilata- cão de pele induzida por estimulação de nervo safenoso de rato
Para testar atividade antagonista de anticorpos anti-CGRP, o efeito dos anticorpos na vasodilatação da pele por estimulação de nervo sa- fenoso de rato foi testado usando-se um modelo de rato descrito anterior- mente. Escott et al., Br. J. Pharmacol. 110:772-776, 1993. Neste modelo de rato, estimulação elétrica de nervo safenoso induz liberação de CGRP das extremidades do nervo, resultando em um aumento no fluxo sangüíneo da pele. O fluxo sangüíneo na pele do pé de ratos machos Sprague Dwaley (170-300 g, de Charles River Hollister) foi medido após estimulação do nervo safenoso. Os ratos foram mantidos sob anestesia com 2% de isoflurano. To- silato de bretílio (30 mg/kg, administrado i.v.) foi dado no começo do experi- mento para minimizar a vasoconstrição devido a estimulação concomitante de fibras simpatéticas do nervo safenoso. A temperatura do corpo foi manti- da a 37°C pelo uso de uma sonda retal termostaticamente igante a uma al- mofada de aquecimento de temperatura controlada. Os compostos incluindo anticorpos, controle positivo (CGRP 8-37), e veículo (PBS, 0,01% de Tween 20) foram dados intravenosamente através da veia femoral direita, exceto para o experimento mostrado na Figura 3, o composto teste e o controle fo- ram injetados através da veia final, e para os experimentos mostrados nas Figuras 2A e 2B, os anticorpos 4901 e 7D11 foram injetados intraperitoneal- mente (IP). Composto de controle positivo CGRP 8-37 (antagonista de vaso- dilatação), devido a sua meia-vida curta, foi dado 3-5 minutos antes da esti- mulação do nervo a 400 nmol/kg (200 μΙ). Tan et al., Clin. Sei. 89:656-73, 1995. Os anticorpos foram dados em doses diferentes (1 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, e 25 mg/kg).
Para experimentos mostrados nas Figuras 2A e 2B, anticorpo 4901 (25 mg/kg), anticorpo 7D11 (25 mg/kg), ou controle de veículo (PBS com 0,01% de Tween 20) foram administrados intraperitonealmente (IP) 72 horas antes da estimulação de pulso elétrico. Para o experimento mostrado na Figura 3, anticorpo 4901 (1 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg, ou 25 mg/kg), controle de veículo (PBS com 0,01% de Tween 20) foram administrados in- travenosamente 24 horas antes da estimulação de pulso elétrico. Após ad- ministração dos anticorpos, ou controle de veículo, o nervo safenoso do membro direito foi exposto cirurgicamente, cortado proximalmente, e coberto com envoltório plástico para prevenir secagem. Uma sonda Doppler de laser foi colocada sobre o lado médio-dorsal na pele, que é a região inervada pelo nervo safenoso. O fluxo sangüíneo da pele, medido como fluxo de célula sangüínea, foi monitorado com um medidor de fluxo Doppler de laser. Quan- do um fluxo de linha de base estável (menos do que 5% de variação) foi es- tabelecido por pelo menos 5 minutos, o nervo foi colocado sobre eletrodos bipolares de platina, e eletricamente estimulado com 60 pulsos (2 Hz, 10 V, 1 ms, por 30 segundos) e então novamente 20 minutos mais tarde. Mudança cumulativa no fluxo sangüíneo da pele foi estimada pela área sob a curva de fluxo-tempo (AUC, que é igual a mudança no fluxo multiplicada pela mudan- ça no tempo) para cada resposta de fluxo a estimulação de pulso elétrico. A média da resposta de fluxo sangüíneo às duas estimulações foi tomada. Os animais foram mantidos sob anestesia por um período de uma a três horas.
Conforme mostrado na Figura 2A e Figura 2B, o aumento do fluxo sangüíneo estimulado pela aplicação de pulsos eletrônicos no nervo safenoso foi inibido pela presença de CGRP 8-37 (400 nmol/kg, administra- dos i.v.), anticorpo 4901 (25 mg/kg, administrados ip), ou anticorpo 7D11 (25 mg/kg, administrados ip), conforme comparado ao controle. CGRP 8-37 foi administrado 3-5 minutos antes da estimulação do nervo safenoso; e anti- corpos foram administrados 72 horas antes da estimulação do nervo safeno- so. Conforme mostrado na Figura 3, o aumento do fluxo sangüíneo estimu- lado pela aplicação de pulsos eletrônicos no nervo safenoso foi inibido pela presença de anticorpo 4901 em doses diferentes (1 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg, e 25 mg/kg) administradas intravenosamente em 24 horas antes da estimulação do nervo safenoso.
Para experimentos mostrados nas Figuras 4A e 4B, o nervo sa- fenoso foi exposto cirurgicamente antes da administração de anticorpo. O nervo safenoso do membro direito foi exposto cirurgicamente, cortado pro- ximalmente, e coberto com envoltório plástico para prevenir secagem. Uma sonda Doppler de laser foi colocada sobre o lado médio-dorsal da pele, que está na região inervada pelo nervo safenoso. O fluxo sangüíneo da pele, medido como fluxo de célula sangüínea, foi monitorado com um medidor de fluxo Doppler de laser. Trinta a quarenta e cinco minutos após injeção de tosilato de bretílio, quando um fluxo de linha de base estável (menos do que 5% de variação) foi estabelecido por pelo menos 5 minutos, o nervo foi colo- cado sobre eletrodos bipolares de platina e eletricamente estimulados (2Hz, 10V, 1 ms, por 30 segundos), e novamente 20 minutos mais tarde. A média da resposta de fluxo sangüíneo a estas duas estimulações foi usada para estabelecer resposta de linha de base (tempo 0) à estimulação elétrica. Anti- corpo 4901 (1 mg/kg ou 10 mg/kg), anticorpo 7E9 (10 mg/kg), anticorpo 8B6 (10 mg/kg), ou veículo (PBS com 0,01% de Tween 20) foram então adminis- trados intravenosamente (i.v.). O nervo foi subseqüentemente estimulado (2Hz, 10V, 1 ms, por 30 segundos) a 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos e 120 minutos após administração de anticorpo ou veículo. Os animais foram mantidos sob anestesia por um período de aproximadamente três horas. Mudança cumulativa no fluxo sangüíneo da pele foi estimada pela área sob a curva de fluxo-tempo (AUC, que é igual à mudança no fluxo multiplicada pela mudança no tempo) para cada resposta de fluxo para estimulações de pulso elétrico.
Conforme mostrado na Figura 4A, o aumento do fluxo sangüíneo estimulado pela aplicação de pulsos eletrônicos no nervo safenoso foi signi- ficantemente inibido pela presença de anticorpo 4901 1 mg/kg administrado i.v., quando estimulação de pulso eletrônico foi aplicada a 60 minutos, 90 minutos e 120 minutos após a administração do anticorpo, e aumento do fluxo sangüíneo estimulado pela aplicação de pulsos eletrônicos no nervo safenoso foi significantemente inibido pela presença de anticorpo 4901 10 mg/kg administrados i.v., quando estimulação de pulso eletrônico foi aplica- da em 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos e 120 minutos após a administra- ção de anticorpo. A Figura 4B mostra que aumento do fluxo sangüíneo mos- tra que o aumento do fluxo sangüíneo estimulado pela aplicação de pulsos eletrônicos no nervo safenoso foi significantemente inibido pela presença de anticorpo 7E9 (10 mg/kg, administrados i.v.) quando estimulação de pulso eletrônico em 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos e 120 minutos após admi- nistração de anticorpo, e pela presença de anticorpo 8B6 (10 mg/kg, admi- nistrados i.v.) quando estimulação de pulo eletrônico foi aplicada em 30 mi- nutos após administração de anticorpo.
Estes dados indicam que anticorpos 4901, 7E9, 7D11, e 8B6 são eficazes no bloqueio da atividade de CGRP conforme medido por vasodila- tação da pele induzida por estimulação do nervo safenoso de rato. Exemplo 4. Caracterização de anticorpo G1 anti-CGRP e suas variantes
Seqüências de aminoácido para região variável de cadeia pesa- da e região variável de cadeia leve de anticorpo G1 anti-CGRP são mostra- das na Figura 5. Os seguintes métodos foram usados para expressão e ca- racterização de anticorpo G1 e suas variantes.
Vetor de expressão usado. A expressão do fragmento de Fab dos anticorpos estava sob controle de um promotor IacZ induzível IPTG simi- lar àquele descrito em Barbas (2001) Phage display: a Iaboratory manual, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press pg 2.10. Vetor pComb3X); contudo, modificações incluem adição e expressão dos seguin- tes domínios adicionais: o domínio constante de cadeia leve Kappa humano e o domínio constante CH1 de imunoglobulina humana lgG2, região C de cadeia Ig gama-2, número de acesso de proteína P01859; Imunoglobulina kappa de cadeia leve (homosapiens), número de acesso de proteína CA- A09181.
Preparação de Fab em pequena escala. De E. Coli transformada (ou usando células TG1 de eletroporação competente, ou células Top 10 quimicamente competentes) com uma biblioteca Fab, colônias simples foram usadas para inocular ambas uma placa principal (agar LB + carbemicilina (50 ug/mL) + 2% de glicose) e uma placa de operação (2 mL/cavidade, 96 cavidades/placa) onde cada cavidade continha 1,5mL LB + carbemicilina (50 ug/mL) + 2% de glicose. Uma vedação adesiva permeável à gás (ABgene, Surrey, UK) foi aplicada à placa. As placas foram incubadas a 30°C por 12- 16 horas; a placa de operação foi sacudida vigorosamente. A placa principal foi armazenada a 4°C até necessário, enquanto as células a partir da placa de operação foram peletizadas (4000 rpm, 4°C, 20 minutos) e ressuspensas em 1,0 mL LB + carbemicilina (50 ug/mL) + 0,5 mM de IPTG para induzir expressão de Fabs por sacudimento vigoroso por 5 horas a 30°C. As células induzidas foram centrifugadas a 4000 rpm, 4°C por 20 minutos e ressuspen- sas em 0,6 mL de tampão de HB-SEP Biacore (10 mM de Hepes, pH 7,4, 150 mM de NaCI, 3 mM de EDTA, 0,005% v/v de P20). Lisis de células res- suspensas de HB-SEP foi efetuada por congelamento (-80°C) e, em segui- da, descongelamento a 37°C. Lisatos de célula foram centrifugados a 4000 rpm, 4°C por 1 hora para separar os resíduos a partir dos sobrenadantes contendo Fab, que foram subseqüentemente filtrados (0,2 um) usando-se um Sistema de Ensaio Millipore MuItiScreen de Placa de Filtração de 96 Ca- vidades e gabarito de vácuo. Biacore foi usado para analisar sobrenadantes filtrados pela injeção dos mesmos através dos CGRPs no chip de sensor. Os clones selecionados por afinidade que expressam Fabs foram resgatados a partir da placa principal, que proporcionou DNA de gabarito para PCR, se- qüenciamento, e preparação de plasmídeo.
Preparação de Fab em grande escala. Para obter-se parâmetros cinéticos, Fabs foram expressos em uma escala maior conforme segue. Frascos Erlenmeyer contendo 150 mL de LB + carbemicilina (50 ug/mL) + 2% de glicose foram inoculados com 1 mL de um "iniciador" de cultura du- rante a noite de um Fab de afinidade selecionada expressando clone de E. Coli. O restante da cultura iniciadora (~3 mL) foi usado para preparar DNA de plasmídeo (QIAprep mini-prep, kit Qiagen) para seqüenciamento e mani- pulação adicional. A cultura maior foi incubada a 30°C com sacudimento vi- goroso até que um OD6oonm de 1,0 foi alcançado (tipicamente 12-16 horas). As células foram peletizadas por centrifugação a 4000 rpm, 4°C por 20 minu- tos, e ressuspensas em 150 mL LB + carbemicilina (50 ug/mL) + 0,5 mM de IPTG. Após 5 horas de expressão a 30°C, as células foram peletizadas por centrifugação a 4000 rpm, 4°C por 20 minutos, ressuspensas em 10 mL de tampão de HBS-EP Biacore, e Iisadas usando-se um ciclo de congelamento simples (-80°C)/descongelamento (37°C). Os Iisatos de célula foram pelota- dos por centrifugação a 4000 rpm, 4°C por 1 hora, e o sobrenadante foi cole- tado e filtrado (0,2 um). Os sobrenadantes filtrados foram carregados em colunas de sefarose de superfluxo Ni-NTA (Qiagen, Valencia. CA) equilibra- das com PBS1 pH 8, em seguida lavados com 5 volumes de coluna de PBS, pH 8. Fabs individuais eluídos em frações diferentes com PBS (pH 8) + 300 mM de imidazol. As frações contendo Fabs foram reunidas e dializadas em PBS1 em seguida quantificadas por ELISA antes da caracterização de afini- dade.
Preparação de anticorpo total. Para expressão de anticorpos totais, regiões variáveis de cadeia pesada e leve foram clonadas em vetores de mamífero de expressão e transfectadas usando Iipofectamina em células HEK 293 para expressão transiente. Os anticorpos foram purificados usando proteína A que usa métodos padrões.
Vetor pDb.CGRP.hFcGI é um vetor de expressão compreenden- do a cadeia pesada do anticorpo G1, e é adequado para expressão transien- te ou adequada da cadeia pesada. Vetor pDb.CGRP.hFcGI tem seqüências de nucleotídeo correspondentes às seguintes regiões: a região promotora de citomegalovírus murina (nucleotídeos 7-612); um intron sintético (nucleotí- deos 613-1679); a região de codificação DHFR (nucleotídeos 688-1253); peptídeo de sinal de hormônio de crescimento humano (nucleotídeos 1899- 1976); região variável de cadeia pesada de G1 (nucleotídeos 1977-2621); região constante lgG2 de cadeia pesada humana contendo as seguintes mu- tações: A330P331 a S330S331 (numeração de aminoácido com referência à seqüência lgG2 tipo selvagem; vide Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624). Vetor pDb.CGRP.hFcGI foi depositado no ATCC em 15 de julho de 2005, e foi cedido o No. de Acesso ATCC PTA-6867.
Vetor pEb.CGRP.hKGI é um vetor de expressão compreenden- do a cadeia leve do anticorpo G1, e é adequado para expressão da cadeia leve. Vetor pEb.CGRP.hKGI tem seqüências de nucleotídeo corresponden- tes às seguintes regiões: a região promotora de citomegalovírus murina (nu- cleotídeos 2-613); intron EF-1 humano (nucleotídeos 614-1149); peptídeo de sinal de hormônio de crescimento (nucleotídeos 1160-1237); região variável de cadeia leve de anticorpo Gl (nucleotídeos 1238-1558); região constante de cadeia kappa humana (nucleotídeos 1559-1882). Vetor pEb.CGRP.hKGI foi depositado no ATCC em 15 de julho de 2005, e foi cedido o No. de Aces- so ATCC PTA-6866.
Ensaio Biacore para determinação de afinidade. As afinidades de anticorpo monoclonal G1 e suas variantes foram determinadas em ou 25°C ou 37°C usando-se o sistema de ressonância plasmon de superfície Biacore3000® (SPR) (Biacore, INC, Piscataway NJ). A afinidade foi determi- nada pela captura de CGRP N-terminalmente biotinilatado ou fragmentos, via streptavidin pré-imobilizada (chip de sensor SA), e medindo-se as cinéti- cas de ligação de fragmentos Fab de anticorpo G1, ou variantes tituladas através do CGRP ou fragmento no chip. Todos os ensaios Biacore foram conduzidos em tampão de operação de HBS-EP (10 mM de HEPES, pH 7,4, 150 mM de NaCI, 3 mM de EDTA, 0,005% v/v de polissorbato P20). As su- perfícies de CGRP foram preparadas por diluição do CGRP N-biotinilatado a uma concentração de menos do que 0,001 mg/mL em tampão de HBS-EP, e injetando-o através do chip de sensor SA usando-se tempos de contato vari- áveis. Superfícies de baixa capacidade, correspondentes a níveis de captura <50 de unidades de resposta (RU) foram usados para estudos cinéticos de alta resolução, onde superfícies de alta capacidade (cerca de 800 RU de CGRP capturados) foram usadas para estudo de concentração, classificação e determinações de afinidade de solução. Os dados cinéticos foram obtidos por diluição do anticorpo G1 Fab em série em incrementos de duas ou três vezes para concentrações girando 1uM-0.1nM (objetivadas em 0,1-1 Ox K0 estimada). As amostras foram tipicamente injetadas por 1 minuto a 100 μL/miη, e tempos de dissociação de pelo menos 10 minutos foram permiti- dos. Após cada ciclo de ligação, as superfícies foram regeneradas com 25mM de NaOH em 25% v/v de etanol, que foi tolerado sobre centenas de ciclos. Uma série de titulação total (tipicamente gerada em duplicata) foi glo- balmente ajustada para um modelo de ligação de Langmuir de 1:1 usando o programa BIAevaIuation. Este retornou um único par de constante de taxa cinética de associação e dissociação (respectivamente, kon e koff) para cada interação de ligação, cuja razão deu a constante de dissociação de equilíbrio (KD = koff/kon). As afinidades (valores de KD) determinadas desse modo estão listadas nas Tabelas 6 e 7.
Análise de alta resolução de interações de ligação com taxas extremamente lentas. Para interações com taxas extremamente lentas (em particular, ligação de anticorpo G1 Fab α-CGRP humano no chip a 25°C), as afinidades foram obtidas em duas partes de experimento. O protocolo acima descrito foi usado com as seguintes modificações. A constante de taxa de associação (kon) foi determinada por injeção de uma série de titulação 2 ve- zes (em duplicata) girando 550 nM-1 nM por 30 segundos a 100 uL/min, e permitindo somente uma fase de dissociação de 30 segundos. A constante de taxa de dissociação (koff) foi determinada por injeção de três concentra- ções (alta, média e baixa) da mesma série de titulação em duplicata por 30 segundos, e permitindo uma fase de dissociação de 2 horas. A afinidade (Kd) de cada interação foi obtida pela combinação dos valores de kon e kotf obtidos nos tipos de experimentos, conforme mostrado na Tabela 5.
Determinação da afinidade da solução por Biacore. A afinidade da solução de anticorpo G1 para α-CGRP de rato e F37A (19-37) a-CGRP humano foi medida por Biacore a 37°C. Uma superfície de chip de CGRP de alta capacidade foi usada (o α-CGRP humano de alta afinidade foi escolhido para proposta de detecção) e tampão de operação HBS-EP foi escoado a 5 uL/min. O fragmento Fab de anticorpo G1 a uma concentração constante de 5 nM (objetivado para estar em ou abaixo do Kd esperado da interação ba- seada na solução) foi pré-incubado com peptídeo de competição, ou a- CGRP de rato ou F37A (19-37) α-CGRP humano, em concentrações finais girando 1 nM a 1 uM em diluições em série 3 vezes. As soluções Fab de an- ticorpo G1 na ausência ou na presença de peptídeo de competição baseado na solução, foram injetadas através de CGRP no chip, e a depleção de respos- tas de ligação detectadas na superfície do chip como um resultado de com- petição de solução foi monitorada. Estas respostas de ligação foram conver- tidas em "concentrações de Fab livres" usando-se uma curva de calibração, que foi construída pela titulação do anticorpo G1 Fab sozinho (5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,325 e 0 nM) através do CGRP no chip. "Concentrações de Fab li- vres" foram plotadas contra a concentração de peptídeo baseado em solu- ção de competição usada para gerar cada ponto de dado, e se ajustar a um modelo de afinidade de solução usando o software BIAevaIuation. As afini- dades de solução determinadas (indiretamente) desse modo são mostradas nas Tabelas 5 e 7, e foram usadas para validarem as afinidades obtidas quando Fabs são injetados diretamente através de CGRPs biotinilatados em um chip de SA. O acordo fechado entre as afinidades determinadas por es- tes dois métodos confirma que amarrando-se uma versão N-biotinilatada do CGRP ao chip não se altera sua atividade de ligação de solução nativa.
A Tabela 5 abaixo mostra as afinidades de ligação de anticorpo G1 a α-CGRP humano, β-CGRP humano, α-CGRP de rato e β-CGRP de rato, determinados por Biacore, pelo escoamento de fragmentos de Fab a- través de CGRPs N-biotinilatados em um chip de SA. Para melhor resolver as afinidades de interações de ligação com taxas extremamente lentas, as afinidades foram também determinadas em um experimento de duas partes para complementar esta orientação de ensaio, a afinidade da solução da interação de α-CGRP de rato foi também determinada (conforme descrito acima). O acordo fechado das afinidades medidas nas orientações de ensaio confirma que a afinidade de ligação do α-CGRP de rato nativo na solução não é alterada quando ele é N-biotinilatado, e se liga a um chip de SA.
Tabela 5. Afinidades de ligação de anticorpo G1 Fabs titulados através de CGRPs no chip
<table>table see original document page 108</column></row><table> *Afinidades para α-CGRPs (rato e ser humano) foram determinadas em ex- perimento de duas partes de alta resolução, em que a fase de dissociação foi monitorada por 2 horas (os valores para Κon, Koff, e KD representam a mé- dia de η experimentos replicados com o desvio padrão expresso como uma diferença de percentagem). As afinidades para β-CGRPs (rato e ser huma- no) foram determinadas pela análise global usando somente uma fase de dissociação de 20 minutos, que não foi precisa bastante para quantificar su- as taxas extremamente (suas taxas são similarmente mais lentas do aqui citado e, portanto, suas afinidades são, do mesmo modo, ainda mais altas). O anticorpo G1 Fab dissociado extremamente lento de todos os CGRPs (ex- ceto α-CGRP de rato) com taxas que se aproximam do limite de resolução do ensaio de Biacore (especialmente a 25°C).
**Afinidade de solução determinada pela medição da depleção de repostas de ligação detectadas no CGRP no chip para anticorpo G1 Fab pré-incubado com competidor de α-CGRP de rato baseado na solução.
A Tabela 6 abaixo mostra anticorpos tendo a variação de se- qüência de aminoácido conforme comparada a anticorpo G1 e suas afinida- des para ambos α-CGRP de rato e α-CGRP humano. Todas as substituições de aminoácido das variantes mostradas na Tabela 6 são descritas em rela- ção a seqüência de G1. As afinidades de ligação de fragmentos Fab foram determinadas por Biacore escoando-os através do CGRPs em um chip de SA. Tabela 6. sequencia de aminoacidos e dados de afinidade de ligacao para variantes de anticorpo G1 determinadas a 37ºC por Biacore.
<table>table see original document page 110</column></row><table> Continuacao
<table>table see original document page 111</column></row><table> <table>table see original document page 112</column></row><table> Continuacao
<table>table see original document page 113</column></row><table> Continuacao
<table>table see original document page 114</column></row><table> Continuacao
<table>table see original document page 115</column></row><table> Continuacao
<table>table see original document page 116</column></row><table> Continuacao
<table>table see original document page 117</column></row><table> Continuacao
<table>table see original document page 118</column></row><table> <table>table see original document page 119</column></row><table> <table>table see original document page 120</column></row><table> <table>table see original document page 121</column></row><table> Todas as CDRs incluindo ambas CDRs de Kabat e de Chothia. Os resíduos de aminoácidos são numerados seqüencialmente (vide Figura 5). Todos os clones têm seqüências L3+H1+H3 idênticas a G1.
Kd = kotf/kon. Todos os valores de koft foram determinados em um modo de classificação, exceto aqueles que são sublinhados, que foram obti- dos por análise global de uma série de concentração de Fab (G1 foi analisa- do em um modo de alta resolução). Os valores K0 sublinhados foram, por- tanto, determinados experimentalmente pela medição de kon. Outros valores de kon foram estimados como sendo o mesmo como M25.
n.d. = não determinado
Para determinar o epítopo em α-CGRP humano que é reconhe- cido pelo anticorpo G1, ensaios de Biacore descritos acima foram usados, a- CGRP humano foi comprado como uma versão N-biotinilatada para capaci- tar sua captura de alta afinidade, via chips de sensor de SA. A ligação de fragmento G1 Fab ao α-CGRP humano no chip na ausência ou presença de um peptídeo de CGRP foi determinada. Tipicamente, uma solução de 2000:1 mol de peptídeo/Fab (por exemplo, 10 uM de peptídeo em 50nM G1 Fab) foi injetada através do α-CGRP humano no chip. A Figura 6 mostra a percenta- gem de ligação bloqueada por peptídeo de competição. Os dados mostrados na Figura 6 indicam que os peptídeos que bloqueiam 100% de ligação de G1 Fab em α-CGRP humano são 1-37 (WT), 8-37, 26-37, P29A (19-37), K35A (19-37), K35E (19-37), e K35M (19-37) de α-CGRP humano; 1-37 de β- CGRP (WT); 1-37 de α-CGRP de rato (WT); e 1-37 de β-CGRP de rato (WT). Todos estes peptídeos são amidados no terminal C. Peptídeos F37A (19-37) e 19-37 (o último não amidatado no terminal C) de α-CGRP humano também bloqueia cerca de 80% a 90% de ligação de G1 Fab a α-CGRP hu- mano. Peptídeo 1 -36 (não amidatados no terminal C) de α-CGRP humano bloqueia cerca de 40% de ligação de G1 Fab a α-CGRP humano. Fragmento de peptídeo 19-36 (amidatado no terminal C) de α-CGRP humano; fragmen- tos de peptídeo 1-13 e 1-19 de α-CGRP humano (nenhum dos quais são amidatados no terminal C); e amilina humana, calcitonina, e adrenomedulina (todas amidatadas no terminal C) não competem com ligação de G1 Fab a α-CGRP humano no chip. Estes ciados demonstram que G1 tem como alvo um epítopo de terminal G de CGRP, e que ambas a indentidade do resíduo mais terminal (F37) e sua amidação são importantes para ligação.
As afinidades de ligação de G1 Fab para variantes de a-CGRP humano (a 37°C) foram também determinadas. A Tabela 7 abaixo mostra as afinidades conforme medidas diretamente por titulação de G1 Fab através de α-CGRP humano N-biotinilatado e variantes no chip. Os dados na Tabela 7 indicam que o anticorpo G1 se liga a um epítopo de terminal C com F37 e G33 sendo os resíduos mais importantes. G1 não se liga a CGRP quando um resíduo extra de aminoácido (alanina) é adicionado ao terminal C (que é amidatado).
Tabela 7. Afinidades de ligação de G1 Fab para α-CGRP humano e varian- tes medidos a 37°C (vide Tabela 4 para sua seqüência de aminoácidos)
<table>table see original document page 123</column></row><table>
Os dados acima indicam que o epítopo que o anticorpo G1 se liga está na extremidade do terminal C de α-CGRP humano, e aminoácidos 33 e 37 no α-CGRP humano são importantes para ligação do anticorpo G1. Também, a amidação do resíduo F37 é importante para ligação.
Exemplo 5: Efeito de anticorpo antaqonista anti-CGRP G1 na vasodilatacão de pele induzida por estimulacão de nervo safenoso de rato
Para testar atividade antagonista de anticorpo G1 anti-CGRP, o efeito do anticorpo na vasodilatação da pele pela estimulação de nervo safe- noso de rato foi testado usando um modelo de rato descrito no Exemplo 3. Brevemente, os ratos foram mantidos anestesiados com 2% de isoflurano. Tosilato de bretílio (30 mg/kg, administrado i.v.) foi dado no começo do expe- rimento para minimizar vasoconstrição devido a estimulação concomitante de fibras simpatéticas do nervo safenoso. A temperatura do corpo foi manti- da a 37°C pelo uso de uma sonda retal termostaticamente igante a uma blanqueta de aquecimento de temperatura controlada. O nervo safenoso do membro direito foi exposto cirurgicamente, cortado proximalmente, e coberto com envoltório plástico para prevenir secagem. Uma sonda Doppler de laser foi colocada sobre o lado médio-dorsal da pele, que é a região inervada pelo nervo safenoso. O fluxo sangüíneo da pele, medido como fluxo de célula sangüínea, foi monitorado com um medidor de fluxo Doppler a laser. Nos experimentos para determinar os efeitos de anticorpo dentro de duas horas de injeção trinta a quarenta e cinco minutos após injeção de tosilato de bretí- lio, quando fluxo de linha de base adequado (menor do que 5% de variação) foi estabelecido para pelo menos 5 minutos, o nervo foi colocado sobre ele- trodos bipolares de platina e eletricamente estimulado (2Hz, 10V, 1 ms, por 30 segundos), e novamente 20 minutos mais tarde. A média de resposta de fluxo de fluxo sangüíneo para estas duas estimulações foi usada para esta- belecer a resposta de linha de base (tempo 0) para estimulação elétrica. An- ticorpo G1 (1 mg/kg ou 10 mg/kg), ou veículo (PBS com 0,01% de Tween 20 de volume igual a 10 mg/kg G1) foram então administrados intravenosamen- te (i.v.). O nervo foi subseqüentemente estimulado (2Hz, 10V, 1 ms, por 30 segundos) em 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos, e 120 minutos após a administração de anticorpo. Os animais foram mantidos sob anestesia por um período de aproximadamente três horas. A mudança cumulativa no fluxo sangüíneo da pele foi estimada pela área sob a curva fluxo-tempo (AUC, que é igual a mudança no fluxo multiplicada pela mudança no tempo) para cada resposta de fluxo para estimulações de pulsos elétricos.
Conforme mostrado na Figura 7, o aumento do fluxo sangüíneo estimulado por aplicação de pulsos eletrônicos no nervo safenoso foi signifi- cantemente inibido pela presença de anticorpo G1 em 1 mg/kg (administrado i.v.), conforme comparado ao veículo, quando o nervo safenoso foi eletrica- mente estimulado a 90 minutos após administração de anticorpo. O aumento de fluxo sangüíneo estimulado pela aplicação de pulsos eletrônicos no nervo safenoso foi significantemente inibido pela presença de anticorpo G1 em 10 mg/kg (administrados i.v.), conforme comparado ao veículo, quando o nervo safenoso foi eletricamente estimulado a 90 minutos e 120 minutos após ad- ministração de anticorpo.
Nos experimentos para determinar os efeitos dos anticorpos em pontos de tempo mais longos no ensaio safenoso, ratos foram submetidos a i.v. com as doses indicadas de anticorpo 24 horas ou 7 dias antes da prepa- ração do animal para estimulação do nervo safenoso conforme descrito aci- ma. Nestes experimentos foi impossível estabelecer uma resposta de linha de base em ratos individuais para estimulação de pulso elétrico antes da dosagem, de modo que os grupos tratados foram comparados aos animais dosados com veículo (PBS, 0,01% de Tween 20) em 24 horas ou 7 dias.
Conforme mostrado nas Figuras 8A e 8B, o aumento do fluxo sangüíneo na pele dorso-medial evocado pela estimulação do nervo safeno- so foi significantemente inibido nos grupos de animais dosados com ou 10 mg/kg ou 3 mg/kg G1 em ou 24 horas ou 7 dias antes da estimulação con- forme comparado a grupos de veículo dosados nos mesmos pontos de tem- po.
A Figura 8C representa uma análise de ajuste de curva aplicada aos dados de resposta de dose representados nas Figuras 8A e 8B para determinar a dose requerida para 50% de efeito máximo (EC5o)· O EC5O em 24 horas é 1,3 mg/kg, e o EC5oem 7 dias é levemente inferior (0,8mg/kg). Exemplo 6: Efeito agudo de anticorpo antagonista anti-CGRP G1 em um en- saio de artéria durai (janela cranial fechada)
Modelo de Janela Cranial Fechada: A proposta deste experimen- to foi determinar o efeito agudo de anticorpos antagonistas de anti-CGRP e compará-lo com o efeito agudo do receptor antagonista de CGRP BIBN4096BS. Os experimentos foram efetuados conforme anteriormente descrito (Williamson et al., Cephalalgia 17(4):518-24 (1997)) com as seguin- tes modificações. Ratos Sprague Dawley (300-400g) foram anestesiados com 70mg/kg i.p. de pentobarbital. A anestesia foi mantida com 20mg/kg/hr i.v. de pentobarbital. Os ratos foram canulados através da veia jugular para distribuição de todos os fármacos. A pressão sangüínea foi monitorada com uma sonda (mikro-tip catheter, Millar Instruments) rosqueado através da ar- téria femoral na aorta abdominal. Os ratos foram traqueotomizados e a respi- ração do rato foi mantida a 75 respirações por minuto em um volume de 3,5 ml_. Após fixação da cabeça em um instrumento estereotático e remoção do escalpe, uma janela de 2x6mm na área parietal esquerda imediatamente lateral à sutura sagital foi produzida pelo adelgaçamento do osso com uma broca dental. Usando-se um micromanipulador, um eletrodo bipolar de plati- na foi abaixado na superfície e coberto com óleo mineral pesado. Lateral à janela de eletrodo, outra janela de 5x6 mm foi criada e enchida com óleo mineral pesado através da qual o diâmetro de um ramo da artéria meningeal média (MMA) foi continuamente monitorado com uma câmara de CCD e um analisador de dimensão de vídeo (Living Systems). Os ratos foram repousa- dos por não menos do que 45 minutos após a preparação. Uma resposta de linha de base a estimulação elétrica foi estabelecida (15 V, 10 hz, 0,5 ms pulsos, 30 segundos) e então os ratos foram dosados i.v. com composto ex- perimental (10mg/kg mu7E9, 300Dg/kg BIBN4096BS ou PBS 0,01% de Tween 20). Estimulações elétricas adicionais foram feitas em 5 (BIBN4096BS), 30, 60, 90 e 120 minutos após dosagem. Todos os dados registrados usando-se software de mapa (ADInstruments).
Conforme mostrado na Figura 9, mu7E9 em 10mg/kg significan- temente bloqueia dilatação de MMA evocada por estimulação de campo elé- tricô dentro de 60 minutos após dosagem, e mantém o efeito através de toda a duração do ensaio (120 minutos). Por comparação, BIBN4096BS bloqueia dilatação de MMA dentro de 5 minutos de dosagem, mas o efeito desapare- ceu completamente por 90 minutos. A grandeza do bloco é comparável entre BIBN4096BS e mu7E9.
Exemplo 7: Efeito crônico de anticorpo antaqonista anti-CGRP G1 em um ensaio de artéria durai (janela cranial fechada)
A proposta deste experimento foi determinar se o anticorpo anti CGRP pode ainda bloquear eletricamente dilatação de MMA estimulada 7 dias após dosagem. A preparação dos ratos foi idêntica ao experimento a- gudo acima descrito (Exemplo 6) com as seguintes exceções. Os ratos fo- ram injetados i.v. (10mg/kg, 3mg/kg ou 1 mg/kg G1) 7 dias antes da criação da janela cranial fechada e estimulação. É impossível estabelecer uma res- posta de dilatação de linha de base a estimulação elétrica antes da dosagem como no experimento agudo de modo que os grupos de anticorpos foram comparados a dilatação do MMA em grupo de controle dosado de veículo (PBS, 0,01% de Tween 20). Após os ratos serem permitidos repousar por pelo menos 45 minutos, a dura foi eletricamente estimulada em intervalos de 30 minutos. Estimulações foram em 2,5V, 5V, 10V, 15V e 20V, todos em 10hz, 0,5 ms pulsos por 30 segundos.
Conforme mostrado na Figura 10, G1 em 10 mg/kg e 3 mg/kg significantemente bloqueiam dilatação de MMA evocada por estimulação elétrica na faixa de 10 a 20 volts. Estes dados demonstram que G1 pode bloquear eletricamente dilatação de MMA estimulado até 7 dias após dosa- gem.
Exemplo 8: Modelo de febre de retirada de morfina
O modelo de rato de retirada de morfina é um modelo de roedor estabelecido para mecanismos de febre menopausal (Sipe et al., Brain Res. 1028(2): 191-202 (2004); Merchenthaler et al., Maturitas 30:307-316 (1998); Katovich et al., Brain Res. 494:85-94 (1989); Simpkins et al., Life Sciences 32:1957-1966 (1983)). Basicamente os ratos são viciados em morfina pela implantação de péletes de morfina sob a pele. Após vício, os animais são injetados com naloxona (antagonista opióide) que os envia na retirada ime- diatamente. Esta retirada é efetuada por um aumento de temperatura da pe- le, uma diminuição na temperatura de corpo de núcleo, um aumento na taxa de coração, e um aumento no hormônio de luteinização de soro. Estes são todos similares em grandeza e regulação ao o que ocorre na febre humana (Simpkins et al., Life Sciences 32:1957-1966 (1983)). Além disso, se ratos são tratados com estradiol antes da indução de retirada, os sintomas de fe- bre são reduzidos (Merchenthaler et al., Maturitas 30:307-316 (1998)). Isto é porque o modelo de retirada de morfina é acreditado imitar febre clínica.
Ratos ovarioctomizados foram encomendados de Charles River Laboratories. Não menos do que 7 dias pós ovarioctomia, dependência de morfina foi criada pela implantação de um pélete de morfina (75 mg de base de morfina) subcutaneamente. Dois dias mais tarde, 2 mais péletes foram implantados. No dia seguinte os ratos foram injetados intravenosamente com ou 10 mg/kg 4901 [**] ou veículo (PBS, 0,01% de tween). Dois dias após a segunda peletização, os ratos foram anestetiziados com cetamina (90 mg/kg) e levemente restringidos. Um termoacoplador de temperatura de su- perfície foi colocado com fita à base da cauda e um termoacoplador retal é usado para medir a temperatura do núcleo. O dado foi registrado usando-se Chart software (ADInstruments). Após registro de 15 minutos da temperatura de linha de base adequada, naloxona (1 mg/kg) foi injetada subcutaneamen- te. A temperatura foi registrada continuamente para os próximos 60 minutos. Os resultados são mostrados nas Figuras 11A e 11B.
É compreendido que os Exemplos e concretizações aqui descri- tos são para proposta ilustrativa somente, e que várias modificações ou mu- danças à luz destas serão sugeridas ao técnico no assunto, e são para se- rem incluídas dentro do espírito e campo de ação deste pedido. Todas as publicações, patentes e pedidos de patente aqui citados são desse modo incorporados por referência em sua totalidade para todas as propostas para a mesma extensão como se cada publicação individual, patente ou pedido de patente fossem especificamente e individualmente para serem, desse modo, incorporados por referência. Depósito de Material Biológico
Os seguintes materiais foram depositados com a American Type
Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virgínia 20110- 2209, USA (ATCC):
Material Anticorpo No. No. de Acesso Data de Depósito ATCC
pDb CGRP.hFcGI cadeia pesa- PTA-6867 15 de julho de 2005
da G1
pEb.CGRP.hKGI cadeia leve PTA-6866 15 de julho de 2005
G1
Vetor pEb.CGRP.hKGI é um polinucleotídeo que codifica a regi- ão variável de cadeia leve G1 e a região constante kappa de cadeia leve; e o vetor pDb.CGRP.hFcGI é um polinucleotídeo que codifica a região variável de cadeia pesada G1 e a região constante lgG2 de cadeia pesada contendo as seguintes mutações: A330P331 a S330S331 (numeração de aminoácido com referência à seqüência de lgG2 tipo selvagem; vide Eur. J. Immunol. (1999)29:2613-2624).
Estes depósitos foram feitos sob as provisões do Tratado de Bu- dapeste no Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para a Proposta de Procedimento de Patente e as Regulações (Tratado de Budapeste). Isto assegura manutenção de uma cultura viável do depósito por 30 anos a partir da data de depósito. O depósito será feito disponível por ATCC sob os termos do Tratado de Budapeste, e submetido a um acordo entre Rinat Neuroscience Corp. e ATCC, que assegura disponibilidade per- manente e irrestrita da progenia da cultura do depósito ao público após pu- blicação da patente U.S. pertinente, ou sob liberação ao público de qualquer pedido de patente U.S. ou estrangeiro, qualquer que venha primeiro, e asse- gura disponibilidade da progenia a um determinado pelo Comissário de Pa- tentes e Marcas dos Estados Unidos a ser intitulado de acordo com a 35 USC Seção 122 e as regras do Comissário (incluindo 37 CFR Seção 1.14 com referência particular a 886 OG 638).
O cessionário do presente pedido concorda que se uma cultura dos materiais no depósito morre ou é perdida ou destruída quando cultivada sob condições adequadas, os materiais serão prontamente substituídos na notificação com outro do mesmo. A disponibilidade do material depositado não é para ser construída como uma licença para praticar a invenção em contravenção dos direitos deferidos sob a autoridade de qualquer governo de acordo com suas leis de patente.
Seqüências de anticorpo
Região variável de cadeia pesada G1 de seqüência de aminoácido (SEQ ID NO:1)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWISWVRQAPG KGLEWVAEIRSESDASATHYAEAVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDT AVYYCLAYFDYGLAIQNYWGQGTLVTVSS
Região variável de cadeia leve G1 de seqüência de aminoácido (SEQ ID NO:2)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCKASKRVTTYVSWYQQKPGQA PRLLIYGASNRYLGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCSQSYNYP YTFGQGTKLEIK
G1- CDR H1 (CDR extendida) (SEQ ID NO:3)
GFTFSNYWIS G1 CDR H2 (CDR extendida) (SEQ ID NO:4)
El RSESDASATHYAEAVKG
G1 CDR H3 (SEQ ID NO:5) YFDYGLAIQNY G1 CDR L1 (SEQ ID NO:6) KASKRVTTYVS G1 CDR L2 (SEQ ID NO:7) GASNRYL G1 CDR L3 (SEQ ID NO.8) SQSYNYPYT
Região variável de cadeia pesada G1 de seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO:9)
GAAGTTCAGCTGGTTGAATCCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCC AGGTGGTTCCCTGCGTCTGTCCTGCGCTGCTTCCGGTTTCACCTTCTCC AACTACTG G ATCTCCTGG GTTCGTC AGGCTCCTG GTAAAG GTCTG G AAT GGGTTGCTGAAATCCGTTCCGAATCCGACGCGTCCGCTACCCATTACG CTGAAGCTGTTAAAGGTCGTTTCACCATCTCCCGTGACAACGCTAAGAA CTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGTGCTGAAGACACCGCTGTT TACTACTGCCTGGCTTACTTTGACTACGGTCTGGCTATCCAGAACTACT GGGGTCAGGGTACCCTGGTTACCGTTTCCTCC
Região variável de cadeia leve G1 de seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 10)
GAAATCGTTCTGACCCAGTCCCCGGCTACCCTGTCCCTGTC CCCAGGTGAACGTGCTACCCTGTCCTGCAAAGCTTCCAAACGGGTTAC CACCTACGTTTCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGTCAGGCTCCTCGTCT GCTGATCTACGGTGCTTCCAACCGTTACCTCGGTATCCÇAGCTCGTTTC TCCGGTTCCGGTTCCGGTACCGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGG AACCCGAAGACTTCGCTGTTTACTACTGCAGTCAGTCCTACAACTACCC CTACACCTTCGGTCAGGGTACCAAACTGG AAATCAAA
Anticorpo de cadeia pesada total G1 de seqüência de aminoácido (incluindo lqG2 modificado conforme descrito aqui) (SEQ ID NO:11)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWISWVRQAPG KGLEWVAEIRSESDASATHYAEAVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDT AVYYCLAYFDYGLAIQNYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSEST AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPRE PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK
Anticorpo de cadeia leve total G1 de seqüência de aminoácido (SEQ ID NO:12)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCKASKRVTTYVSWYQQKPGQA PRLLIYGASNRYLGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCSQSYNYP YTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVT HQGLSSPVTKSFNRGEC
Anticorpo de cadeia pesada total G1 de seqüência de nucleotídeo (incluindo lgG2 modificado conforme descrito aqui) (SEQ ID NO: 13)
GAAGTTCAGCTGGTTGAATCCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCC AGGTGGTTCCCTGCGTCTGTCCTGCGCTGCTTCCGGTTTCACCTTCTCC AACTACTGGATCTCCTGGGTTCGTCAGGCTCCTGGTAAAGGTCTGGAAT GGGTTGCTGAAATCCGTTCCGAATCCGACGCGTCCGCTACCCATTACG CTGAAGCTGTTAAAGGTCGTTTCACCATCTCCCGTGACAACGCTAAGAA CTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGTGCTGAAGACACCGCTGTT TACTACTGCCTGGCTTACTTTGACTACGGTCTGGCTATCCAGAACTACT GGGGTCAGGGTACCCTGGTTACCGTTTCCTCCGCCTCCACCAAGGGCC CATCTGTCTTCCCACTGGCCCCATGCTCCCGÇAGCACCTCCGAGAGCA CAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCAGAACCTGTGA CCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCC CAGCTGTCCTGCAGTCCTCAGGTCTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGA CCGTGCCATCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAG ATCACAAGCCAAGCAACACCAAGGTCGACAAGACCGTGGAGAGAAAGT GTTGTGTGGAGTGTCCACCTTGTCCAGCCCCTCCAGTGGCCGGACCAT CCGTGTTCCTGTTCCCTCCAAAGCCAAAGGACACCCTGATGATCTCCAG AACCCCAGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCC AGAGGTGCAGTTCAACTGGTATGTGGACGGAGTGGAGGTGCACAACGC CAAGACCAAGCCAAGAGAGGAGCAGTTCAACTCCACCTTCAGAGTGGT GAGCGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGAAAGGAGT ATAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGACTGCCATCCAGCATCGAGAAGA CCATCTCCAAGACCAAGGGACAGCCAAGAGAGCCACAGGTGTATACCC TGCCCCCATCCAGAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCT GTCTGGTGAAGGGATTCTATCCATCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGT CCAACGGACAGCCAGAGAACAACTATAAGACCACCCCTCCAATGCTGG ACTCCGACGGATCCTTCTTCCTGTATTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTC CAGATGGCAGCAGGGAAACGTGTTCTCTTGTTCCGTGATGCACGAGGC CCTGCACAACCACTATACCCAGAAGAGCCTGTCCCTGTCTCCAGGAAAG TAA
Anticorpo de cadeia leve total G1 de seqüência de nucleotídeo (SEQ IP NO: 14)
GAAATCGTTCTGACCCAGTCCCCGGCTACCCTGTCCCTGTC CCCAGGTGAACGTGCTACCCTGTCCTGCAAAGCTTCCAAACGGGTTAC CACCTACGTTTCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGTCAGGCTCCTCGTCT GCTGATCTACGGTGCTTCCAACCGTTACCTCGGTATCCCAGCTCGTTTC TCCGGTTCCGGTTCCGGTACCGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGG AACCCGAAGACTTCGCTGTTTACTACTGCAGTCAGTCCTACAACTACCC CTACACCTTCGGTCAGGGTACCAAACTGGAAATCAAACGCACTGTGGCT GCACCATCTGTCTTCATCTTCCCTCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCCG GAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCGCGCGAGGC C AAAGTAC AGTG G AAG GTG G ATAACGCCCTCC AATCCG GTAACTCCC A GGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAG CAGCACCCTGACCCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTA CGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGTTCTCCAGTCACAAAGAG CTTCAACCGCGGTGAGTGCTAA
Comparação de seqüência de aminoácido de CGRP humano e de rato (α-CGRP humano (SEQ ID NO:15); β-CGRP humano (SEQ ID NO:43); α-CGRP de rato (SEQ ID NO:41); e β-CGRP de rato (SEQ ID NO:44)):
NH2-ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKINNFVPTNVGSKAF- CONH2 (α-CGRP humano)
nh2-ac[ntatcvthrlagllsrsggjvi^/i^nfvptnvgskaf- CONH2 (β-CGRP humano)
N Η2-^^ΤΑΤ0νΤΗ RLAG LLS RSGG VVKQN FVPTN VGS|AF- CONH2 (α-CGRP rato)
nhp-^cntatcvthrlàg.llsrsggwkIdnfvptnvgskaf- CONH2 (β-CGRP rato) LISTAGEM DE SEQÜENCIA <110> Rinat Neuroscience Corp. Zeller, Joerg Poulsen, Kristian Abdiche, Yasmin Pons, Jaume Sierra, Jones Ro s en tha1, Arnon <120> ANTICORPOS ANTAGONISTAS DIRECIONADOS CONTRA PEPTÍDEO RELACIONADO
AO GENE DA CALCITONINA E MÉTODOS DE USO DOS MESMOS <130> PC19499A
<160> 47
<170> PatentIn versão 3.3
<210> 1 <211> 122 <212> PRT
<213> Listagem de Seqüência
<22 0>
<223> Região variável da cadeia pesada do anticorpo humanizado
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Ser Glu Ser Asp Ala Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ala Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Leu Ala Tyr Phe Asp Tyr Gly Leu Ala Ile Gln Asn Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> Listagem de Seqüência
<220>
10 <223> Região variável da cadeia leve do anticorpo humanizado
<400> 2
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 1 5 10
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Lys Arg
15 20 25
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Leu Gly Ile Pro Ala 50 55 60
20 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Tyr
85 90
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
25 100 105
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> Listagem de Seqüência
<220>
<223> CDR Hl do anticorpo humanizado
<400> 3
Leu Ser Pro Gly 1 5
Val Thr Thr Tyr 30
Arg Leu Leu Ile 45
Arg Phe Ser Gly
Ser Leu Glu Pro 80
Asn Tyr Pro Tyr 95 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Ile Ser 1 5 10
<210> 4
<211> 19
<212> PRT
<213> Listagem de Seqüência
<220>
<223> CDR H2 do anticorpo humanizado
<400> 4
Glu Ile Arg Ser Glu Ser Asp Ala Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu Ala 1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> Listagem de Seqüência <220>
<223> CDR H3 do anticorpo humanizado
<400> 5
Tyr Phe Asp Tyr Gly Leu Ala Ile Gln Asn Tyr 1 5 10
<210> 6 <211> 11 <212> PRT
<213> Listagem de Seqüência
<220>
<223> CDR Ll do anticorpo humanizado
<400> 6
Lys Ala Ser Lys Arg Val Thr Thr Tyr Val Ser 1 5 10
<210> 7 <211> 7
<212> PRT
<213> Listagem de Seqüência <220>
<223> CDR L2 do anticorpo humanizado <400> -7
Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Leu 1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> Listagem de Seqüência <220>
<223> CDR L3 do anticorpo humanizado
<400> 8
Ser Gln Ser Tyr Asn Tyr Pro Tyr Thr 1 5
<210> 9
<211> 366
<212> DNA
<213> Listagem de Seqüência <220>
<223> Região variável da cadeia pesada do anticorpo humanizado
<400> 9
gaagttcagc tggttgaatc cggtggtggt ctggttcagc caggtggttc cctgcgtctg 60
tcctgcgctg cttccggttt caccttctcc aactactgga tctcctgggt tcgtcaggct 120
cctggtaaag gtctggaatg ggttgctgaa atccgttccg aatccgacgc gtccgctacc 180
cattacgctg aagctgttaa aggtcgtttc accatctccc gtgacaacgc taagaactcc 240
ctgtacctgc agatgaactc cctgcgtgct gaagacaccg ctgtttacta ctgcctggct 300
tactttgact acggtctggc tatccagaac tactggggtc agggtaccct ggttaccgtt 360
tcctcc 366 <210> 10 <211> 321
<212> DNA
<213> Listagem de Seqüência <220>
<223> Região variável da cadeia leve do anticorpo humanizado
<400> 10
gaaatcgttc tgacccagtc cccggctacc ctgtccctgt ccccaggtga acgtgctacc 60 ctgtcctgca aagcttccaa acgggttacc acctacgttt cctggtacca gcagaaaccc 120 ggtcaggctc ctcgtctgct gatctacggt gcttccaacc gttacctcgg tatcccagct 180 cgtttctccg gttccggttc cggtaccgac ttcaccctga ccatctcctc cctggaaccc 240 gaagacttcg ctgtttacta ctgcagtcag tcctacaact acccctacac cttcggtcag 3 00 ggtaccaaac tggaaatcaa a 321
<210> 11 <211> 448
<212> PRT
<213> Listagem de Seqüência
<220>
<223> Cadeia pesada completa de um anticorpo humanizado
<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 25 35 40 45
Ala Glu Ile Arg Ser Glu Ser Asp Ala Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ala Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Leu Ala Tyr Phe Asp Tyr Gly Leu Ala Ile Gln Asn Tyr Trp 100
Gly Gln Gly Thr Leu 115
Ser Val Phe Pro Leu 130
Ala Ala Leu Gly Cys 145
Val Ser Trp Asn Ser 165
Ala Val Leu Gln Ser 180
Val Pro Ser Ser Asn 195
His Lys Pro Ser Asn 210
Cys Val Glu Cys Pro 225
Val Phe Leu Phe Pro 245
Thr Pro Glu Val Thr 260
Glu Val Gln Phe Asn 275
Lys Thr Lys Pro Arg 290
Ser Val Leu Thr Val 305
Lys Cys Lys Val Ser 325
Ile Ser Lys Thr Lys 340
Pro Pro Ser Arg Glu
105
Val Thr Val Ser Ser Ala 120
Ala Pro Cys Ser Arg Ser 135
Leu Val Lys Asp Tyr Phe 150 155
Gly Ala Leu Thr Ser Gly 170
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 185
Phe Gly Thr Gln Thr Tyr 200
Thr Lys Val Asp Lys Thr 215
Pro Cys Pro Ala Pro Pro 230 235
Pro Lys Pro Lys Asp Thr 250
Cys Val Val Val Asp Val 265
Trp Tyr Val Asp Gly Val 280
Glu Glu Gln Phe Asn Ser 295
Val His Gln Asp Trp Leu 310 315
Asn Lys Gly Leu Pro Ser 330
Gly Gln Pro Arg Glu Pro 345
Glu Met Thr Lys Asn Gln
110
Ser Thr Lys Gly Pro 125
Thr Ser Glu Ser Thr 140
Pro Glu Pro Val Thr 160
Val His Thr Phe Pro 175
Ser Ser Val Val Thr 190
Thr Cys Asn Val Asp 205
Val Glu Arg Lys Cys 220
Val Ala Gly Pro Ser 240
Leu Met Ile Ser Arg 255
Ser His Glu Asp Pro 270
Glu Val His Asn Ala 285
Thr Phe Arg Val Val 300
Asn Gly Lys Glu Tyr 320
Ser Ile Glu Lys Thr 335
Gln Val Tyr Thr Leu 350
Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp 385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 12 <211> 214
<212> PRT
<213> Listagem de Seqüência
<220>
<223> Cadeia leve completa de um anticorpo humanizado
<400> 12
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Lys Arg Val Thr Thr Tyr
20 25 30
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Leu Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Tyr Asn Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210
<210> 13
<211> 1347
<212> DNA
<220>
<400> 13
gaagttcagc tggttgaatc cggtggtggt ctggttcagc caggtggttc cctgcgtctg 60
tcctgcgctg cttccggttt caccttctcc aactactgga tctcctgggt tcgtcaggct 120
cctggtaaag gtctggaatg ggttgctgaa atccgttccg aatccgacgc gtccgctacc 180
cattacgctg aagctgttaa aggtcgtttc accatctccc gtgacaacgc taagaactcc 240
ctgtacctgc agatgaactc cctgcgtgct gaagacaccg ctgtttacta ctgcctggct 300
tactttgact acggtctggc tatccagaac tactggggtc agggtaccct ggttaccgtt 360
tcctccgcct ccaccaaggg cccatctgtc ttcccactgg ccccatgctc ccgcagcacc 420
tccgagagca cagccgccct gggctgcctg gtcaaggact acttcccaga acctgtgacc 480
gtgtcctgga actctggcgc tctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccagc tgtcctgcag 540
tcctcaggtc tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc catccagcaa cttcggcacc 600
cagacctaca cctgcaacgt agatcacaag ccaagcaaca ccaaggtcga caagaccgtg 660 gagagaaagt gttgtgtgga gtgtccacct tgtccagccc ctccagtggc cggaccatcc 720
gtgttcctgt tccctccaaa gccaaaggac accctgatga tctccagaac cccagaggtg 780
acctgtgtgg tggtggacgt gtcccacgag gacccagagg tgcagttcaa ctggtatgtg 840
gacggagtgg aggtgcacaa cgccaagacc aagccaagag aggagcagtt caactccacc 900
ttcagagtgg tgagcgtgct gaccgtggtg caccaggact ggctgaacgg aaaggagtat 960
aagtgtaagg tgtccaacaa gggactgcca tccagcatcg agaagaccat ctccaagacc 1020
aagggacagc caagagagcc acaggtgtat accctgcccc catccagaga ggagatgacc 1080
aagaaccagg tgtccctgac ctgtctggtg aagggattct atccatccga catcgccgtg 1140
gagtgggagt ccaacggaca gccagagaac aactataaga ccacccctcc aatgctggac 1200
tccgacggat ccttcttcct gtattccaag ctgaccgtgg acaagtccag atggcagcag 1260
ggaaacgtgt tctcttgttc cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta tacccagaag 1320
agcctgtccc tgtctccagg aaagtaa 1347
<210> 14
<211> 645
<212> DNA
<213> Listagem de Seqüência
<220>
<223> Cadeia leve completa de um anticorpo humanizado
<400> 14
gaaatcgttc tgacccagtc cccggctacc ctgtccctgt ccccaggtga acgtgctacc 60
ctgtcctgca aagcttccaa acgggttacc acctacgttt cctggtacca gcagaaaccc 120
ggtcaggctc ctcgtctgct gatctacggt gcttccaacc gttacctcgg tatcccagct 180
cgtttctccg gttccggttc cggtaccgac ttcaccctga ccatctcctc cctggaaccc 240
gaagacttcg ctgtttacta ctgcagtcag tcctacaact acccctacac cttcggtcag 300
ggtaccaaac tggaaatcaa acgcactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttccctcca 360
tctgatgagc agttgaaatc cggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
ccgcgcgagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatccgg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacc 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagttctc cagtcacaaa gagcttcaac cgcggtgagt gctaa 645
<210> 15
<211> 37 <212> PRT
<213> humano
<400> 15
Ala Cys Asp Thr Ala Thr Cys Val Thr His Arg Leu Ala Gly Leu Leu 1 5 10 15
Ser Arg Ser Gly Gly Val Val Lys Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val
20 25 30
Gly Ser Lys Ala Phe 35
<210> 16 <211> 30
<212> PRT
<213> humano
<400> 16
Val Thr His Arg Leu Ala Gly Leu Leu Ser Arg Ser Gly Gly Val Val 1 5 10 15
Lys Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser Lys Ala Phe
20 25 30
<210> 17
<211> 19
<212> PRT
<213> humano
<400> 17
Ser Gly Gly Val Val Lys Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser 1 5 10 15
Lys Ala Phe
<210> 18
<211> 19
<212> PRT
<213> Listagem de Seqüência <220> <223> variante de um fragmento de alfa-CGRP
<400> 18
Ser Gly Gly Val Val Lys Asn Asn Phe Val Ala Thr Asn Val Gly Ser 1 5 10 15
Lys Ala Phe
19 19 PRT
Listagem de Seqüência
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Fragmento, variante de alfa-CGRP humano
<400> 19
Ser Gly Gly Val Val Lys Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser 1 5 10 15
Ala Ala Phe
20 19 PRT
Listagem de Seqüência
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Fragmento, variante de alfa-CGRP humano
<400> 20
Ser Gly Gly Val Val Lys Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser 1 5 10 15
Glu Ala Phe
<210> 21
<211> 19
<212> PRT
<213> Listagem de Seqüência <220>
<223> Fragmento, variante de alfa-CGRP humano
<400> 21
Ser Gly Gly Val Val Lys Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser 1 5 10 15
Met Ala Phe
<210> 22
<211> 19
<212> PRT
<213> Listagem de Seqüência <220>
<223> Fragmento, variante de alfa-CGRP humano
<400> 22
Ser Gly Gly Val Val Lys Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser
1 5 10 15
Gln Ala Phe
<210> 23
<211> 19
<212> PRT
<213> Listagem de Seqüência
<220>
<223> Fragmento, variante de alfa-CGRP humano
<400> 23
Ser Gly Gly Val Val Lys Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser 1 5 10 15
Lys Ala Ala
<210> 24
<211> 14
<212> PRT <213> Listagem de Seqüência
<220>
<223> Fragmento, variante de alfa-CGRP humano
<400> 24
Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser Lys Ala Phe Ala
1 5 10
<210> 25
<211> 13
<212> PRT
<213> Listagem de Seqüência
<220>
<223> Fragmento de alfa-CGRP humano
<400> 25
Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser Lys Ala Phe 15 10
<210> 26 <211> 13
<212> PRT
<213> Listagem de Seqüência
<220>
<223> Fragmento, variante de alfa-CGRP humano
<400> 26
Asn Asn Ala Val Pro Thr Asn Val Gly Ser Lys Ala Phe 15 10
<210> 27
<211> 13
<212> PRT
<213> Listagem de Seqüência
<220>
<223> Fragmento, variante de alfa-CGRP humano
<400> 27
Asn Asn Phe Ala Pro Thr Asn Val Gly Ser Lys Ala Phe 1 5 10
<210> 28
<211> 13
<212> PRT
<213> Listagem de Seqüência <220>
<223> Fragmento, variante de alfa-CGRP humano
<400> 28
Asn Asn Phe Val Ala Thr Asn Val Gly Ser Lys Ala Phe 1 5 10
<210> 29
<211> 13
<212> PRT
<213> Listagem de Seqüência
<220>
<223> Fragmento, variante de alfa-CGRP humano
<400> 29
Asn Asn Phe Val Pro Ala Asn Val Gly Ser Lys Ala Phe
15 10
<210> 30
<211> 13
<212> PRT
<213> Listagem de Seqüência
<220>
<223> Fragmento, variante de alfa-CGRP humano
<400> 30
Asn Asn Phe Val Pro Thr Ala Val Gly Ser Lys Ala Phe
1 5 10
<210> 31
<211> 13
<212> PRT
<213> Listagem de Seqüência <220>
<223> Fragmento, variante de alfa-CGRP humano
<400> 31
Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Ala Gly Ser Lys Ala Phe
1 5 10
<210> 32
<211> 13
<212> PRT
<213> Listagem de Seqüência
<220>
<223> Fragmento, variante de alfa-CGRP humano
<400> 32
Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Ala Ser Lys Ala Phe
1 5 10
<210> 33
<211> 13
<212> PRT
<213> Listagem de Seqüência
<220>
<223> Fragmento, variante de alfa-CGRP humano
<400> 33
Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ala Lys Ala Phe 1 5 10
<210> 34
<211> 13
<212> PRT
<213> Listagem de Seqüência
<220>
<223> Fragmento, variante de alfa-CGRP humano
<400> 34
Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser Lys Ala Ala 1 5 10 <210> 35
<211> 12 <212> PRT
<213> Listagem de Seqüência
<220>
<223> Fragmento de alfa-CGRP humano
<400> 35
Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser Lys Ala Phe 1 5 10
<210> 36
<211> 19
<212> PRT
<213> Listagem de Seqüência
<220>
<223> Fragmento de alfa-CGRP humano
<400> 36
Ser Gly Gly Val Val Lys Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser 1 5 10 15
Lys Ala Phe
<210> 37
<211> 18 <212> PRT
<213> Listagem de Seqüência
<220>
<223> Fragmento de alfa-CGRP humano
<400> 37
Ser Gly Gly Val Val Lys Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser 1 5 10 15
Lys Ala
<210> 38 36 PRT
Listagem de Seqüência
<211> <212> <213> <220>
<223> Fragmento de alfa-CGRP humano
<400> 38
Ala Cys Asp Thr Ala Thr Cys Val Thr His Arg Leu Ala Gly Leu Leu 1 5 10 15
Ser Arg Ser Gly Gly Val Val Lys Asn Asn Phe Val Pro Thr Asn Val
20
Gly Ser Lys Ala 35
<210> 39
25
30
19 PRT
Listagem de Seqüência
<211> <212> <213> <220>
<223> Fragmento de alfa-CGRP humano
<400> 39
Ala Cys Asp Thr Ala Thr Cys Val Thr His Arg Leu Ala Gly Leu Leu 15 10 15
Ser Arg Ser
40 13 PRT
Listagem de Seqüência
<210> <211> <212> <213> <220>
<223> Fragmento de alfa-CGRP humano
<400> 40
Ala Cys Asp Thr Ala Thr Cys Val Thr His Arg Leu Ala 15 10 <210> 41
<211> 37
<212> PRT
<213> Rat
<400> 41
Ser Cys Asn Thr Ala Thr Cys Val Thr His Arg Leu Ala Gly Leu Leu 1 5 10 15
Ser Arg Ser Gly Gly Val Val Lys Asp Asn Phe Val Pro Thr Asn Val
20 25 30
Gly Ser Glu Ala Phe 35
<210> 42
<211> 19
<212> PRT
<213> Listagem de Seqüência
<220>
<223> Fragmento de aifa-CGRP rato
<400> 42
Ser Gly Gly Val Val Lys Asp Asn Phe Val Pro Thr Asn Val Gly Ser 1 5 10 15
Glu Ala Phe
<210> 43
<211> 37
<212> PRT
<213> Humano
<400> 43
Ala Cys Asn Thr Ala Thr Cys Val Thr His Arg Leu Ala Gly Leu Leu 1 5 10 15
Ser Arg Ser Gly Gly Met Val Lys Ser Asn Phe Val Pro Thr Asn Val
20 25 30
Gly Ser Lys Ala Phe 35
<210> 44
<211> 37
<212> PRT
<213> Rat
<400> 44
Ser Cys Asn Thr Ala Thr Cys Val Thr His Arg Leu Ala Gly Leu Leu 1 5 10 15
Ser Arg Ser Gly Gly Val Val Lys Asp Asn Phe Val Pro Thr Asn Val
20 25 30
Gly Ser Lys Ala Phe 35
<210> 45
<211> 32
<212> PRT
<213> Humano
<400> 45
Cys Gly Asn Leu Ser Thr Cys Met Leu Gly Thr Tyr Thr Gln Asp Phe 1 5 10 15
Asn Lys Phe His Thr Phe Pro Gln Thr Ala Ile Gly Val Gly Ala Pro
20 25 30
<210> 46
<211> 37
<212> PRT
<213> Humano
<400> 46
Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 15
Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala Ile Leu Ser Ser Thr Asn Val
20 25 30
Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 47
<211> 52
<212> PRT
<213> Humano
<400> 47
Tyr Arg Gln Ser Met 1 5
Arg Phe Gly Thr Cys 20
Phe Thr Asp Lys Asp 35
Pro Gln Gly Tyr 50
Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys
10 15
Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln
25 30
Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser 40 45

Claims (17)

1. Anticorpo, caracterizado pelo fato de que tem uma afinidade de ligação (K0) para α-CGRP humano de 50 nM, ou menos, conforme medi- da por ressonância de plasmônio de superfície a 37°C.
2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio Vh que é pelo menos 90% idêntico na seqüência de aminoácido para a SEQ ID NO: 1.
3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o resíduo de aminoácido na posição 99 da SEQ ID NO: 1 é L1 ou é substituído por A, N, S, Τ, V ou R, e em que o resíduo de aminoácido na posição 100 da SEQ ID NO: 1 é A, ou é substituído por L, R, S, V, Y1CG1 T, K ou P.
4. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio Vl que é pelo menos 90% idêntico na seqüência de aminoácido para a SEQ ID NO: 2.
5. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um CDR selecionado a partir do grupo consistindo em: a. CDR H1 conforme colocado na SEQ ID NO: 3; b. CDR H2 conforme colocado na SEQ ID NO: 4; c. CDR H3 conforme colocado na SEQ ID NO: 5; d. CDR L1 conforme colocado na SEQ ID NO: 6; e. CDR L2 conforme colocado na SEQ ID NO: 7; f. CDR L3 conforme colocado na SEQ ID NO: 8; e g. variantes de L1, L2 e H2 conforme mostrado na Tabela 6.
6. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende: a. um VH CDR3 conforme colocado na SEQ ID NO: 5, ou uma seqüência que difere da SEQ ID NO: 5 por 1 ou 2 substituições conservati- vas de aminoácido ; e b. um VL CDR3 conforme colocado na SEQ ID NO: 8, ou uma seqüência que difere da SEQ ID NO: 8 por 1 ou 2 substituições conservati- vas de aminoácido.
7. Anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio Vh que é pelo menos 90% idêntico na seqüência de aminoácido pa- ra a SEQ ID NO: 1, e um domínio Vl que é pelo menos 90% idêntico na se- qüência de aminoácido para a SEQ ID NO: 2.
8. Anticorpo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é uma molécula de IgG1 uma molécula de IgM, uma molécula de IgE, uma molécula de IgA, ou uma molécula de IgD, ou é deri- vado destas.
9. Anticorpo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia pesada produzida pelo vetor de ex- pressão com Ne de Acesso ATCC PTA-6867.
10. Anticorpo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia leve produzida pelo vetor de ex- pressão com Ng de Acesso ATCC PTA-6866.
11. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo como definido na reivindicação 1, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
12. Método para prevenir ou tratar pelo menos um sintoma va- somotor em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende admi- nistrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo antagonista anti- CGRP.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pe- lo fato de que o referido sintoma vasomotor é uma enxaqueca com ou sem aura, enxaqueca hemiplégica, grupo da dor de cabeça, neuralgia de enxa- queca, dor de cabeça crônica, ou dor de cabeça por tensão.
14. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pe- lo fato de que o referido sintoma vasomotor é febre.
15. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pe- lo fato de que o anticorpo antagonista anti-CGRP é como definido em qual- quer uma das reivindicações 1 a 10.
16. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pe- Lo fato de que o anticorpo antagonista anti-GCRP é o anticorpo produzido pelos vetores de expressão com NsS de Acesso ATCC PTA-6867 e PTA- -6866.
17. Uso de um anticorpo antagonista anti-CGRP, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar pelo menos um sintoma vasomotor em um indivíduo em necessidade do mesmo.
BRPI0618705A 2005-11-14 2006-11-02 anticorpos antagonistas humanizados direcionados contra peptídeo relacionado ao gene da calcitonina, composição farmacêutica e uso dos mesmos BRPI0618705B8 (pt)

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US73662305P 2005-11-14 2005-11-14
US60/736,623 2005-11-14
PCT/IB2006/003181 WO2007054809A2 (en) 2005-11-14 2006-11-02 Antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide and methods using same

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