ES2664421T3

ES2664421T3 - Anticuerpo antagonista dirigido contra un péptido relacionado con el gen de la calcitonina

Info

Publication number: ES2664421T3
Application number: ES11166787.9T
Authority: ES
Inventors: Joerg Zeller; Kristian Todd Poulsen; Yasmina Noubia Abdiche; Jaume Pons; Arnon Rosenthal; Sierra Jones Collier
Original assignee: Teva Pharmaceuticals International GmbH
Current assignee: Teva Pharmaceuticals International GmbH
Priority date: 2005-11-14
Filing date: 2006-11-02
Publication date: 2018-04-19
Anticipated expiration: 2026-11-02
Also published as: US8734802B1; DK1957106T4; SI1957106T2; US20200247878A1; US9365648B1; IL248025A0; US8597649B2; AU2006313434B2; EP3069731A1; CN103421114B; EP1957106B1; CN101309704B; KR20110114705A; US9884908B2; SI2380592T1; SI3045182T1; EP3842458A1; ZA200803484B; US20180162931A1; US20140147438A1

Abstract

Un anticuerpo antagonista anti-CGRP que comprende un dominio de VH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1 y un dominio de VL que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2.

Description

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la población son idénticos excepto por las posibles mutaciones que se producen naturalmente que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, y se dirigen contra un único sitio antigénico. Además, al contrario que las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra determinantes diferentes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante del antígeno. El adjetivo “monoclonal” indica la característica del anticuerpo de que se obtiene a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se construyen como requiere la producción de anticuerpos por un procedimiento en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se utilizan según la presente invención se pueden fabricar por el procedimiento del hibridoma descrito por primera vez por Kohler y Milstein, 1975, Nature, 256: 495, o puede fabricarse por procedimientos de ADN recombinante tales como los que se describen en la Patente de Estados Unidos Nº 4.816.567. Los anticuerpos monoclonales también se pueden aislar de las bibliotecas de fagos generados utilizando las técnicas descritas en McCafferty y col., 1.990, Natur 648:552-554, por ejemplo.

Como se utiliza en el presente documento, anticuerpos “humanizados” se refiere a formas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) que son quimeras de inmunoglobulinas específicas, cadenas de inmunoglobulinas, o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab’, F(ab’)2 y otras subsecuencias de anticuerpos que se unen a antígenos) que contienen la secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no humana. En la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los restos de una región complementariamente determinante (CDR) del receptor son remplazados por restos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como un ratón, una rata o un conejo que tiene la deseada especificidad, afinidad, y actividad biológica. En algunos casos, los restos de la región Fv marco conservada (FR) de la inmunoglobulina humana son remplazados por los correspondientes restos no humanos. Además, el anticuerpo humanizado puede comprender restos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en la CDR importada o las secuencias armazón, pero que se incluyen para refinar más y optimizar el funcionamiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos o al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son de una secuencia consensuada de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado óptimamente también comprenderá al menos una parte de una región o dominio constante (Fc) de una inmunoglobulina, típicamente de una inmunoglobulina humana. Los anticuerpos pueden tener regiones Fc modificadas como se describe en el documento WO99/58572. Otras formas de anticuerpos humanizados tienen una o más CDR (una, dos, tres, cuatro, cinco, seis) que están alteradas con respecto al anticuerpo original, que también se denominan una o más CDR “derivadas de” una o más CDR del anticuerpo original.

Como se utiliza en el presente documento, “anticuerpo humano” significa un anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano y/o ha sido fabricado utilizando cualquiera de las técnicas para fabricar anticuerpos humanos conocidas en la técnica o desveladas en el presente documento. Esta definición de un anticuerpo humano incluye los anticuerpos que comprenden al menos un polipéptido humano de cadena pesada o al menos un polipéptido humano de cadena ligera. Un ejemplo de tales anticuerpos es un anticuerpo que comprende polipéptidos de cadena ligera murina y de cadena pesada humana. Los anticuerpos humanos se pueden producir utilizando varias técnicas que se conocen en la técnica. En una realización, el anticuerpo humano se selecciona de una biblioteca de fagos, en la que la biblioteca de fagos expresa anticuerpos humanos (Vaughan y col., 1.996, Nature Biotechnology, 14:309-314; Sheets y col., 1.998, PNAS, (EE.UU) 95:6157-6162; Hoogenboom y Winter, 1.991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks y col., 1.991, J. Mol. Biol., 222:581). Los anticuerpos humanos también se pueden fabricar introduciendo loci de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo, ratones en los que los genes de inmunoglobulina endógena se han inactivado parcial o completamente. Esta estrategia se describe en las Patentes de Estados Unidos Nos 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; y 5.661.016. De manera alternativa, el anticuerpo humano se puede preparar inmortalizando linfocitos B humanos que producen un anticuerpo dirigido contra un antígeno diana (tales linfocitos B se pueden recuperar de un individuo o se pueden inmunizar in vitro). Véase, por ejemplo, Cole y col., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1.985); Boemer y col., 1.991, J. Immunol., 147 (1):86-95; y Patente de Estados Unidos Nº 5.750.373.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión “péptido relacionado genéticamente con la calcitonina” y “CGRP” se refieren a cualquier forma de péptido relacionado genéticamente con la calcitonina y variantes del mismo que retienen al menos parte de la actividad del CGRP. Por ejemplo, el CGRP puede ser -CGRP o -CGRP. Como se utiliza en el presente documento, el CGRP incluye todas las especies de mamíferos de secuencia CGRP nativa, por ejemplo, humana, canina, felina, equina, y bovina.

Como se utiliza en el presente documento, un “anticuerpo antagonista anti-CGRP” (llamado intercambiablemente “anticuerpo anti-CGRP”) se refiere a un anticuerpo que es capaz de unirse al CGRP e inhibe la actividad biológica del CGRP y/o las rutas corriente abajo mediadas por la señalización de CGRP. Un anticuerpo antagonista anti-CGRP engloba anticuerpos que bloquean, antagonizan, suprimen o reducen (incluso significativamente) la actividad biológica del CGRP, incluyendo las rutas corriente abajo mediadas por la señalización del CGRP, tales como la unión al receptor y/o la obtención de una respuesta celular al CGRP. Para los

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fines de la presente invención se entenderá explícitamente que la expresión “anticuerpo antagonista anti-CGRP” engloba todos los términos, títulos, y estados funcionales y características previamente identificados por los que el CGRP en sí mismo, una actividad biológica del CGRP (incluyendo, pero sin limitarse a su capacidad para mediar cualquier aspecto del dolor de cabeza), o las consecuencias de la actividad biológica, son sustancialmente anulados, disminuidos, o neutralizados en algún grado significativo. En alguna realización, un anticuerpo antagonista anti-CGRP se une al CGRP y previene la unión del CGRP al receptor CGRP. En otras realizaciones, un anticuerpo anti-CGRP se une al CGRP y previene la activación del receptor CGRP. Se proporcionan en el presente documento anticuerpos antagonistas anti-CGRP.

Como se utiliza en el presente documento los términos “G1” y “anticuerpo G1” se utilizan intercambiablemente para referirse a un anticuerpo producido por vectores de expresión que tienen los números de depósito de ATCC PTA-6867 y ATCC PTA-6866. La secuencia de aminoácidos de las regiones de cadena ligera y cadena pesada se muestran en la Figura 5. Las porciones CDR del anticuerpo G1 (incluyendo las CDR Chothia y Kabat) se representan como un diagrama en la Figura 5. Los polinucleótidos que codifican las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada se muestran en la SEC. ID Nº:9 y la SEC. ID Nº:10. La caracterización del G1 se describe en los Ejemplos.

Los términos “polipéptido”, “oligopéptido”, “péptido” y “proteína”, se usan intercambiablemente en el presente documento para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados, y puede estar interrumpido por no aminoácidos. Los términos también engloban un polímero de aminoácidos que se ha modificado naturalmente o por intervención; por ejemplo, formación de puentes disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación o modificación, tales como la conjugación con un componente de marcado. También se incluyen en la definición, por ejemplo, los polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Se entiende que, debido a que los polipéptidos están basados en un anticuerpo, los polipéptidos pueden presentarse como cadenas sencillas o cadenas asociadas.

“Polinucleótido”, o “ácido nucleico”, como se utiliza intercambiablemente en el presente documento, se refiere a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud, e incluyen ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos o bases modificados, y/o sus análogos, o cualquier sustrato que se pueda incorporar en un polímero por la ADN o ARN polimerasa. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. Si existe, la modificación de la estructura del nucleótido se puede realizar antes o después de ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleótidos se puede interrumpir con componentes no nucleótidos. Un polinucleótido puede modificarse puede modificarse además después de la polimerización, tal como por conjugación con un componente marcador. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, “caps”, sustitución de uno o más de los nucleótidos presentes de forma natural con un análogo, modificaciones internucleótidos tales como, por ejemplo, aquellos con uniones no cargadas (por ejemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y con uniones cargadas (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquellos que contienen restos pendientes, tales como por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, ply-L-lisina, etc.), aquellos con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), aquellos que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radioactivos, boro, metales oxidativos, etc.), aquellos que contienen alquilantes, aquellos con uniones modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), así como formas sin modificar del polinucleótido(s). Además, se pueden remplazar cualquiera de los grupos hidroxilo presentes habitualmente en los azúcares, por ejemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos protectores de referencia, o activados para preparar uniones adicionales con nucleótidos adicionales, o puede conjugarse con soportes sólidos. El extremo OH 5’ y 3’ puede fosforilarse o sustituirse con aminas o restos de grupos orgánicos de tapado de desde 1 a 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos también se pueden derivar de grupos protectores de referencia. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de azúcares ribosa o desoxirribosa que se conocen generalmente en la técnica, incluyendo, por ejemplo, 2’ – O – metil -, 2’-O – alil, 2’ – fluoro – o 2’ – azido – ribosa, análogos de azúcares carbocíclicos, azúcares a-anoméricos, azúcares epiméricos tales como la arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares de la piranosa, azúcares de la furanosa, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos de nucleósidos abásicos tales como el metil ribósido. Se pueden remplazar una o más uniones fosfodiéster por grupos de unión alternativos. Estos grupos alternativos de unión, pero sin limitarse a estos, incluyen realizaciones en las que el fosfato se remplaza por P(O)S (“tioato”), P(S)S (“ditioato”), (O) NR2 (“amidato”), P(O)R, P(O) OR’, CO o CH2 (“formacetal”), en el cual cada R

o R’ es independientemente H o un alquil (1 -20 C) sustituido o no sustituido que contiene opcionalmente una unión éter (-O -), aril, alquenil, cicloalquil, cicloalquenil o araldil. No todas las uniones en un polinucleótidos necesitan ser idénticas. La descripción precedente se aplica a todos los polinucleótidos a que se refiere el presente documento, incluyendo el ARN y el ADN.

Una “región variable” de un anticuerpo se refiere a la región variable de la cadena ligera del anticuerpo o a la región variable de la cadena pesada del anticuerpo, sea sola o en combinación. Las regiones variables de cada cadena pesada y ligera consisten de cuatro regiones marco conservadas (FR) conectadas por tres regiones complementariamente determinantes (CDR) también conocidas como regiones hipervariables. Las CDR en cada

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aproximadamente 5 pM, o aproximadamente 2 pM. En algunas reivindicaciones, la afinidad de unión es menor que cualquiera de aproximadamente 250 nM, aproximadamente 200 nM, aproximadamente 100 nM, aproximadamente 50 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 500 pM, aproximadamente 100 pM, o aproximadamente 50 pM.

Una manera de determinar la afinidad de unión de los anticuerpos al CGRP es midiendo la afinidad de unión de fragmentos Fab monofuncionales del anticuerpo. Para obtener los fragmentos monofuncionales, un anticuerpo por ejemplo, una IgG) se escinde con papaína o se expresa recombinantemente. La afinidad de un fragmento Fab anti-CGRP de una anticuerpo se puede determinar por resonancia de plasmones de superficie (sistema de resonancia de plasmones de superficie Biacore3000TM (SPR), Biacore, INC, Piscataway NJ) equipado con chips sensores pre-inmovilizados con estreptavidina (SA) utilizando un tampón de realización HBS-EP (HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, Tensioactivo P20 al 0,005% v/v). El CGRP humano biotinilado (o cualquier otro CGRP) se puede diluir en tampón HBS-EP a una concentración de menos de 0,5 ug/ml y se inyecta a través de los canales individuales de los chips utilizando tiempos variables de contacto, para conseguir dos intervalos de densidad del antígeno, tanto de 50-200 unidades de respuesta (RU) para estudios cinéticos detallados,

o de 800-1000 RU para ensayos de selección. Los estudios de regeneración han demostrado que la NaOH 25 mM en etanol al 25% v/v elimina eficazmente la unión Fab aunque manteniendo la actividad del CGRP en el chip para más de 200 inyecciones. Típicamente, las diluciones seriadas (concentraciones que abarcan de 0,1-10x de la KD estimada) de las muestras Fav se inyectan durante un min a 100 l/minuto y se permiten tiempos de disociación de hasta 2 horas. Las concentraciones de las proteínas Fab se determinan por ELISA y/o electroforesis SDS-PAGE utilizando un Fab de concentración conocida (como se determina por el análisis de aminoácidos) como una referencia. Las tasas cinéticas de asociación (kon) y la tasa de disociación (koff) se obtienen simultáneamente ajustando los datos globalmente a un modelo de unión Langmuir 1:1 (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1.994). Methods Enzymology 6. 99-110) utilizando el programa BIAevaluation. Los valores de equilibrio de la constante de disociación (KD) se calculan como koff/kon. Este protocolo se usa adecuadamente para determinar la afinidad de unión de un anticuerpo a cualquier CGRP, incluyendo el CGRP humano, el CGRP de otro mamífero (tal como el CGRP de ratón, el CGRP de rata, el CGRP de primates), así como diferentes formas de CGRP (tal como las formas  y ). La afinidad de unión de un anticuerpo generalmente se mide a 25 ºC, pero también se puede medir a 37 ºC.

Los anticuerpos se pueden unir a varios vehículos diferentes. Los vehículos pueden ser activos y/o inertes. Ejemplos de vehículos bien conocidos incluyen el polipropileno, poliestireno, polietileno, dextrano, nylon, amilasas, vidrio, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. La naturaleza del vehículo puede ser tanto soluble como insoluble, para los propósitos de la invención. Los expertos en la técnica sabrán de otros vehículos adecuados para su unión a anticuerpos, o serán capaces de asegurarla, utilizando la experimentación de rutina. En algunas realizaciones, el vehículo comprende un resto que reconoce el miocardio.

C. Anticuerpo G1 y anticuerpos relacionados, polipéptidos, polinucleótidos, vectores y células hospedadoras

La invención engloba anticuerpo G1; y polinucleótidos que comprenden secuencias que codifican G1.

Los anticuerpo antagonistas anti-CGRP de la invención se caracterizan por cualquiera (una o más) de las siguientes características: (a) se unen al CGRP; (b) bloquean la unión del CGRP a su receptor(es); (c ) bloquea o disminuye la activación del receptor CGRP (incluyendo la activación del cAMP); (d) inhibe la actividad biológica o las rutas corriente abajo mediadas por la función de señalización del CGRP; (e ) previene, mejora, o trata cualquier aspecto del dolor de cabeza (por ejemplo, migraña); (f) aumenta el aclaramiento del CGRP; y (g) inhibe (reduce) la síntesis, producción o liberación de CGRP.

En consecuencia, el antagonista anti-CGRP de la invención puede comprender cualquiera de los siguientes: (a) anticuerpo G1; (b) un fragmento o región del anticuerpo G1; (c) una cadena ligera y una cadena pesada del anticuerpo G1; (d) la región variable de una cadena ligera y una cadena pesada del anticuerpo G1.

Las porciones de CDR del anticuerpo G1 (incluyendo CDRs Chothia y Kabat) se representan diagramaticalmente en la Figura 5. La determinación de las regiones CDR es bien conocida dentro de la técnica. Se entiende que en algunas realizaciones, las CDRs pueden ser una combinación de la CDR Kabat y Chothia (también denominadas "CDRs combinadas" o "CDRs extendidas"). En algunas realizaciones, las CDRs son CDRs Kabat. En otras realizaciones, las CDRs son las CDRs Chothia. En otras palabras, en realizaciones con más de una CDR, las CDRs pueden ser cualquiera de Kabat, Chothia, CDRs de combinación, o combinaciones de las mismas.

La afinidad de unión (KD) de un anticuerpo antagonista anti-CGRP y un polipéptido para el CGRP (tal como un -CGRP humano) puede ser aproximadamente 0,06 a aproximadamente 200 nM. En algunas realizaciones, la afinidad de unión es cualquiera de aproximadamente 200 nM, 100 nM, aproximadamente 50 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 500 pM, aproximadamente 100 pM, aproximadamente 50 pM, o aproximadamente 2 pM. En algunas realizaciones, la afinidad de unión es menor que cualquiera de aproximadamente 250 nM, aproximadamente 200 nM, aproximadamente 100 nM, aproximadamente 50 nM,

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crónica, para evitar reacciones inflamatorias y otras adversas a la terapia de anticuerpos convencional.

Las composiciones que comprenden anticuerpos que derivados de G1 pueden conjugarse (por ejemplo, unirse) a un agente que facilite el acoplamiento a un soporte sólido (como biotina o avidina). Por simplicidad, se hará referencia generalmente a G1 o anticuerpos con el conocimiento de que estos procedimientos se aplican a cualquiera de las realizaciones de unióna CGRP descritas en el presente documento. La conjugación generalmente se refiere a unir estos componentes como se describe en el presente documento. La unión (que generalmente fija estos componentes en asociación próxima al menos para la administración) se puede conseguir de varias maneras. Por ejemplo, una reacción directa entre un agente y un anticuerpo es posible cuando posee un sustituyente capaz de reaccionar con el otro. Por ejemplo, un grupo nucleofílico, como un grupo amino o sulfhidrilo, en uno puede ser capaz de reaccionar con un grupo que contenga carbonilo, como un anhídrido o un haluro de ácido, o con un grupo alquilo que contenga un grupo saliente bueno (por ejemplo, un haluro) en el otro.

Un anticuerpo antagonista anti-CGRP de esta invención puede unirse a un agente marcador (alternativamente denominado “marca”) como una molécula fluorescente, una molécula radioactiva o cualquier otro marcador conocido en la técnica. Los marcadores son conocidos en la técnica que proporcionan generalmente (ya sea directa o indirectamente) una señal.

La invención también proporciona polinucleótidos aislados que codifican los anticuerpos y los polipéptidos de la invención (incluyendo un anticuerpo que comprende las secuencias polipeptídicas de las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera que se muestran en la Figura 5), y vectores y células huésped que comprenden el polinucleótido

En consecuencia, la invención proporciona polinucleótidos que codifican los anticuerpos antagonistas anti-CGRP de la invención que comprenden polinucleótidos que codifican cualquiera de los siguientes: (a) anticuerpo G1;

(b) un fragmento o una región del anticuerpo G1; (c) una cadena ligera y una cadena pesada del anticuerpo G1; (d) la región variable de una cadena ligera y una cadena pesada del anticuerpo G1. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende uno o ambos polinucleótidos que se muestran en la SEC. ID Nº: 9 y SEC. ID Nº: 10.

En otro aspecto, la invención proporciona polinucleótidos que codifican cualquiera de los anticuerpos antagonistas anti-CGRP de la invención. Los polinucleótidos se pueden elaborar por procedimientos conocidos en la técnica.

Los polinucleótidos complementarios a cualquiera de tales secuencias también están englobadas por la presente divulgación. Los polinucleótidos pueden ser de cadena sencilla (codificante o antisentido) o de cadena doble, y pueden ser moléculas de ADN (genómico, ADNc, o sintético) o de ARN. Las moléculas de ARN incluyen moléculas de ARNHn, que contienen intrones y se corresponden con la molécula de ADN de manera uno a uno, y moléculas de ARNm, las cuales no contienen intrones. Las secuencias adicionales codificantes o no codificantes pueden, aunque no necesariamente, estar presentes en un polinucleótido de la presente invención, y un polinucleótido puede, aunque no necesariamente, estar unido a otras moléculas y/o materiales de soporte.

Se pueden construir vectores de clonación adecuados de acuerdo con técnicas estándar, o pueden seleccionarse de un gran número de vectores de clonación disponibles en la técnica. Aunque el vector de clonación seleccionado puede variar de acuerdo con la célula huésped que se vaya a usar, los vectores de clonación útiles generalmente tendrán la capacidad de auto-replicarse, pueden poseer una única diana para una endonucleasa de restricción particular, y/o pueden llevar genes para un marcador que se puede utilizar en la selección de clones que contienen el vector. Ejemplos adecuados incluyen plásmidos y virus bacterianos, por ejemplo, pUC18, pUC19, Bluescript (por ejemplo, pBSSK+) y sus derivados, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, ADNs fago, y vectores lanzadera como pSA3 and pAT28. Estos y muchos otros vectores de clonación están disponibles de vendedores comerciales como BioRad, Strategene, e Invitrogen.

Los vectores de expresión generalmente son constructos de polinucleótidos replicables que contienen un polinucleótido que codifica el anticuerpo antagonista anti-CGRP de acuerdo con la invención. Esto implica que un vector de expresión debe ser replicable en las células huésped ya sea como episomas o como una parte integral del ADN cromosómico. Los vectores de expresión adecuados incluyen pero no están limitados a, plásmidos, vectores víricos, incluyendo adenovirus, virus adeno-asociados, retrovirus, cósmidos, y vectores de expresión divulgados en la Publicación de PCT Nº WO 87/04462. Los componentes de los vectores pueden incluir generalmente, pero no están limitados a, uno o más de los siguientes: una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores; elementos de control de la transcripción adecuados (como promotores, potenciadores y terminador). Para la expresión (es decir, traducción), también se requieren habitualmente uno o más elementos de control de la traducción, como sitios de unión al ribosoma, sitios de inicio de la traducción, y codones de parada.

Los vectores que contienen los polinucleótidos que codifican el anticuerpo antagonista anti-CGRP de la invención pueden introducirse en una célula huésped por cualquiera de una variedad de medios apropiados, incluyendo electroporación, transfección empleando cloruro cálcico, cloruro rubídico, fosfato cálcico, dextrano-DEAE,

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u otras sustancias; bombardeo de microproyectiles; lipofección; e infección (por ejemplo, donde el vector es un agente infeccioso como un virus vacuna). La elección de los vectores o polinucleótidos introductores dependerá a menudo de las características de la célula huésped.

La invención también proporciona células huésped que comprenden cualquiera de los polinucleótidos que codifican el anticuerpo antagonista anti-CGRP de la invención. Cualquier célula huésped capaz de sobre-expresar ADNs heterólogos puede utilizarse con el propósito de aislar los genes que codifican el anticuerpo de interés. Ejemplos no limitativos de células huésped de mamífero incluyen pero no están limitados a, células COS, HeLa, y CHO. Ver también la Publicación de PCT Nº WO 87/04462. Células huésped no mamíferas adecuadas incluyen procariotas (como E. coli o B. subtillis) y levaduras (como S. cerevisae, S. pombe; o K. lactis). Preferentemente, las células huésped expresan los ADNc a un nivel aproximadamente 5 veces más alto, más preferentemente 10 veces más alto, incluso más preferentemente 20 veces más alto que el correspondiente al anticuerpo o proteína de interés endógeno, si está presente, en las células huésped. La selección de células huésped para un enalce específico a A□1-40 se efectúa por un inmunoensayo o FACS. Puede identifcarse una célula que sobre-expresa el anticuerpo antagonista anti-CGRP de interés.

Ejemplos

Ejemplo 1: Generación y caracterización de anticuerpos monoclonales dirigidos contra CGRP

Generación de anticuerpos anti-CGRP. Para generar anticuerpos anti-CGRP que tengan reactividad cruzada entre especies, para CGRP de rata y humano, se inmunizaron ratones con 25-100  de -CGRP humano o β-CGRP conjugado con KLH en adyuvante (50 l para las plantas de los pies, 100 l totales por ratón) a varios intervalos. La inmunización generalmente se llevó a cabo como se describe en Geerligs HJ y col., 1.989, J. Immunol. Methods 124: 95-102; Kenney JS y col., 1.989, J. Immunol. Methods 121:157-166; y Wicher K y col., 1.989, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 89:128-135. Los ratones primero se inmunizaron con 50 g de -CGRP o -CGRP humanos conjugado con KLH en CFA (adyuvante completo de Freund). Después de 21 día, los ratones se inmunizaron secundariamente con 25 g de -CGRP humano (por cada ratón que se había inmunizado primero con -CGRP) o -CGRP (para los ratones que primeros se inmunizaron con -CGRP) conjugado con KLH en IFA (adyuvante incompleto de Freund). Veintitrés días después de la segunda inmunización, se llevó a cabo una tercera inmunización con 25 g de á-CGRP de rata conjugada con KLH en IFA. Diez días más tarde, se ensayaron los títulos de anticuerpo utilizando ELISA. Se llevó a cabo una cuarta inmunización con 25 g del péptido (-CGRP de rata en KLH) en IFA 34 días después de la tercera inmunización. Se llevó a cabo un refuerzo con 100 g de péptido soluble (-CGRP de rata) 32 días después de la cuarta inmunización.

Se obtuvieron los esplenocitos de los ratones inmunizados y se fusionaron con células de mieloma NSO en una relación de 10:1, con polietilenglicol 1500. Los híbridos se pusieron en placas de 96 pocillos en DMEM que contenía un 20% de suero de caballo y 2-oxaloacetato/piruvato/insulina (Sigma), y comenzó la selección en hipoxantina/aminopterina/timidina. El día 8, 100 l de DMEM que contenía el 20% de suero de caballo se añadieron a todos los pocillos. Los sobrenadantes de los híbridos se seleccionaron utilizando el inmunoensayo de captura de anticuerpos. La determinación de la clase del anticuerpo se hizo con un segundo anticuerpo específico de clase.

Se seleccionó un panel de líneas celulares productoras de anticuerpo monoclonal basándose en su unión al CGRP humano y de rata para su posterior caracterización. Estos anticuerpos y características se muestran posteriormente en las Tablas 2 y 3.

Purificación y preparación de fragmentos Fab. Los anticuerpos monoclonales seleccionados para su posterior caracterización se purificaron de los sobrenadantes de los cultivos de hibridoma utilizando la cromatografía de afinidad a la proteína A. Los sobrenadantes se equilibraron a pH 8. Los sobrenadantes se cargaron entonces en la columna de proteína A MabSelect (Amersham Biosciences nº 17-5199-02) se equilibraron con PBS a pH 8. Se lavó la columna con 5 volúmenes de columna de PBS, pH 8. Los anticuerpos se eluyeron con tampón citrato-fosfato 50 mM, pH 3. Los anticuerpos eluídos se neutralizaron con tampón fosfato 1 M, pH 8. Los anticuerpos purificados se dializaron entonces con PBS, pH 7,4. Las concentraciones de anticuerpo se determinaron por SDS-PAGE, utilizando una curva de referencia de anticuerpos monoclonales murinos.

Se prepararon los Fab por proteólisis en papaína de los anticuerpos completos utilizando el kit Inmunopure Fab (Pierce nº 44885) y se purificaron por flujo a través de cromatografía de proteína A siguiendo las instrucciones del fabricante. Las concentraciones se determinaron por ELISA y/o electroforesis SDS-PAGE utilizando una referencia Fab de concentración conocida (determinada por análisis de aminoácidos), y por A280 utilizando 10D=0,6 mg/ml (o el equivalente teórico basándose en la secuencia de aminoácidos).

Determinación de la afinidad de los Fab. Las afinidades de los anticuerpos monoclonales anti-CGRP se determinaron a 25 ºC o 37 ºC utilizando el sistema de resonancia de plasmones de superficie (SPR) Biacore3000TM (Biacore, INC, Piscataway NJ) con el tampón de trabajo propio del fabricantes, HBS-EP (HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM. Polisorbato P20 al 0,005% v/v). Se determinó la afinidad capturando los péptidos CGRP

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Tabla 3. Características de la unión de los anticuerpos monoclonales anti-CGRP al -CGRP de rata y su actividad

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55 Tabla 4. Secuencias de aminoácidos de los fragmentos -CGRP humanos (SEC. ID Nos: 15-40) y péptidos relacionados (SEC. ID Nos: 41-47). Todos los péptidos están amidados C-terminalmente excepto las SEC ID. Nos: 36-40. Los restos en negrita indican punto de mutaciones 15

Anticuerpos: KD para -CGRP de rata a 37°C (nM) Bloqueo basado en células de la unión del -CGRP de rata a su receptor a 25°C (medido por la activación del cAMP) Bloqueo in vivo en el ensayo del nervio safeno

4901: 3,4 Sí Sí

7E9: 47 Sí Sí

6H2: 54 No No

8B6: 75 Sí Sí

7D11: 218 Sí Sí

10A8: 451 No n.d.

9B8: 876 No n.d.

14E10: 922 No n.d.

13C2: > 1000 No n.d.

14A9: > 1000 No n.d.

6D5: > 1000 No n.d.

1C5: > 1000 No n.d.

“n.d.” indica que no se llevó a cabo el ensayo para ese anticuerpo.

CGRP: Secuencia de aminoácidos SEC ID Nº

1-37 (WT): ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF 15

8-37: VTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF 16

19-37: SGGVVKNNFVPTNVGSKAF 17

P29A (19-37): SGGVVKNNFVATNVGSKAF 18

K35A (19-37): SGGVVKNNFVPTNVGSAAF 19

K35E (19-37): SGGVVKNNFVPTNVGSEAF 20

K35M (19-37): SGGVVKNNFVPTNVGSMAF 21

K35Q (19-37): SGGVVKNNFVPTNVGSQAF 22

F37A (19-37): SGGVVKNNFVPTNVGSKAA 23

25-38A: NNFVPTNVGSKAFA 24

25-37: NNFVPTNVGSKAF 25

F27A (25-37): NNAVPTNVGSKAF 26

V28A (25-37): NNFAPTNVGSKAF 27

P29A (25-37): NNFVATNVGSKAF 28

T30A (25-37): NNFVPANVGSKAF 29

N31A(25-37): NNFVPTAVGSKAF 30

V32A (25-37): NNFVPTNAGSKAF 31

G33A (25-37): NNFVPTNVASKAF 32

S34A (25-37): NNFVPTNVGAKAF 33

F37A (25-37): NNFVPTNVGSKAA 34

26-37: NFVPTNVGSKAF 35

19-37-COOH: SGGVVKNNFVPTNVGSKAF 36

19-36-COOH: SGGVVKNNFVPTNVGSKA 37

1-36-COOH: ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKA 38

1-19-COOH: ACDTATCVTHRLAGLLSRS 39

1-13-COOH: ACDTATCVTHRLA 40

 de rata (1-37): SCNTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKDNFVPTNVGSEAF 41

 de rata (19-37): SGGVVKDNFVPTNVGSEAF 42

β humano (1-37): ACNTATCVTHRLAGLLSRSGGMVKSNFVPTNVGSKAF 43

Calcitonina Humana (132): CGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP 45

Amilina Humana (1-37): KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY 46

Adrenomedulina Humana (1-52): YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQKLAHQIYQFTDK DKDNVAPRSKISPQGY 47

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Ejemplo 2: Selección de anticuerpos antagonistas anti-CGRP utilizando ensayos in vitro.

Los anticuerpos anti-CGRP murinos fueron seleccionados según su actividad antagonista in vitro utilizando el ensayo basado en células de activación del cAMP y el ensayo de unión.

Actividad antagonista medida por el ensayo cAMP. Se dispensaron cinco microlitros de -CGRP humano o de rata (a una concentración final de 50 nM) en presencia o ausencia de un anticuerpo anti-CGRP (a una concentración final de 1 – 3000 nM), o un -CGRP de rata o un -CGRP humano (a una concentración final de 0,1 nM – 10 M; como control positivo para la activación d c-AMP) en una placa de 384 pocillos (Nunc, Nº Cat. 264657). Se añadieron diez microlitros de células (si se utilizaba -CGRP humano células SK-N-MC humanas, o si se utilizaba -CGRP de rata L6 de rata del ATCC) en tampón de estimulación (HEPES 20 mM, pH 7,4, NaCl 146 mM, KCl 5 mM, CaCl2 1 mM, MgCl2 1 mM, 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX)) en los pocillos de la placa. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Después de la incubación, se llevó a cabo la activación del cAMP utilizando el ensayo de Complementación de Fragmentos Enzimáticos HitHunterTM (Applied Biosystems) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ensayo se basa en una enzima -galactosidasa manipulada genéticamente que consisten en dos fragmentos denominados Aceptor enzimático (AE) y Donante enzimático (DE). Cuando los dos fragmentos están separados, la enzima está inactiva. Cuando los fragmentos están juntos se pueden recombinar espontáneamente para formar la enzima activa por un proceso llamado complementación. La plataforma para el ensayo EFC utiliza un péptido DE-cAMP conjugado en el que el cAMP se reconoce por un anti-cAMP. Este fragmento DE es capaz de reasociarse con el AE para formar la enzima activa. En el ensayo, el anticuerpo anti-cAMP está titulado óptimamente para unirse al conjugado DEcAMP e inhibir la formación de la enzima. Los niveles de cAMP en las muestras de lisado celular compiten con el conjugado DE-cAMP para unirse al anticuerpo anti-cAMP. La cantidad de conjugado DE libre en el ensayo es proporcional a la concentración de cAMP. Por tanto, el cAMP se mide por la formación de enzima activa que se cuantifica por la renovación del sustrato luminiscente de la p-galactosidasa. El ensayo de activación del cAMP se llevó a cabo añadiendo 10 l de tampón de lisis y anticuerpo anti-cAMP (relación 1:1) seguido por incubación a temperatura ambiente durante 60 minutos a temperatura ambiente. Luego se añadieron 10 l de reactivo DE-cAMP en cada pocillo y se incubó durante 60 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación se añadieron 20 l de reactivo AE y mezcla CL (que contenía el sustrato) (relación 1:1) en cada pocillo y se incubó durante 1-3 horas

o toda la noche a temperatura ambiente. La placa se leyó a 1 segundo/pocillo en un instrumento PMT o a 30 segundos/placa en una cámara. Los anticuerpos que inhibían la activación de cAMP por el -CGRP se identificaron (representados como “Sí”) en las Tablas 2 y 3 anteriores. Los datos en las Tablas 2 y 3 indican que los anticuerpos que demostraron actividad antagonista en el ensayo generalmente tienen alta afinidad. Por ejemplo, los anticuerpos que tienen una KD (determinada a 25 ºC) de aproximadamente 80 nM o menos para el -CGRP humano o que tienen una KD (determinada a 37 ºC) de aproximadamente 47 nM o menos para un -CGRP de rata muestran actividad en este ensayo.

Ensayo de unión por radioligando. El ensayo de unión se llevó a cabo para medir la CI50 del anticuerpo anti-CGRP en el bloqueo del CGRP de la unión al receptor como se describió anteriormente. Zimmermann y col., Peptides 16: 421-4, 1.995; Mallee y col., J. Biol. Chem. 277: 14294-8, 2.002. Se incubaron membranas (25 g) de células SK-N-MC durante 90 minutos a temperatura ambiente en un tampón de incubación (Tris-HCL 50 mM, pH 7,4, MgCl2 5 mM, BSA al 0,1%) que contenía 10 pM de -CGRP 125I humano en un volumen total de 1 ml. Para determinar las concentraciones de inhibición (CI50) los anticuerpos o el CGRP sin marcar (como un control), desde una solución 100 veces más alta que la solución madre se disolvieron a concentraciones variables en el tampón de incubación y se incubaron al mismo tiempo con las membranas y 10 pM de -CGRP 125I humano. Se terminó la incubación por filtración a través de un filtro de microfibras de cristal (GF/B, Vm) que había sido bloqueado con polietilenimina al 0,5%. Se dibujaron las curvas de respuesta a las dosis y K; se determinaron los valores utilizando la ecuación: Ki=CI50/(1+([ligando]/KD); donde la constante de equilibrio de disociación KD = 8 pM para el -CGRP para el receptor CGRP1 presente en las células SK-N-MC, y Bmáx= 0,025 pmol/mg de proteína. El valor informado de CI50 (en términos de moléculas IgG) se convirtió a los sitios de unión (multiplicándolo por 2) de forma que se pudo comparar con las afinidades (KD) determinadas por Biacore (véase la Tabla 2).

La Tabla 2 muestra la CI50 de los anticuerpos murinos 7E9, 8B6, 6H2 y 4901. Los datos indican que la afinidad de los anticuerpos generalmente se correlaciona con la CI50: los anticuerpos con mayor afinidad (valores de KD más bajos) tienen una CI50 más baja en el ensayo de unión con radioligando.

Ejemplo 3: Efecto de los anticuerpos antagonistas anti-CGRP sobre la vasodilatación de la piel inducida por la estimulación del nervio safeno en la rata

Para ensayar la actividad antagonista de anticuerpos anti-CGRP, se ensayó el efecto de los anticuerpos sobre la vasodilatación de la piel por estimulación del nervio safeno de la rata utilizando un modelo de rata descrito anteriormente. Escott y col., Br. J. Pharmacol. 110:772-776, 1.993. En este modelo de rata, la estimulación eléctrica del nervio safeno induce la liberación de CGRP desde las terminaciones nerviosas. Dando como resultado un incremento en el flujo sanguíneo de la piel. Se midió el flujo sanguíneo en la piel del pie del macho de rata Sprague

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60 min, 90 min, y 120 min después de la administración del anticuerpo, y por la presencia del anticuerpo 8B6 (10 mg/kg, administrado i.v.) cuando la estimulación por pulso electrónico se aplicó a los 30 min después de la administración del anticuerpo.

Estos datos indican que los anticuerpos 4901, 7E9, 7D11, y 8B6 son eficaces en bloquear la actividad de CGRP como se mide por la vasodilatación cutánea inducida por la estimulación del nervio safeno en la rata.

Ejemplo 4. Caracterización del anticuerpo G1 anti-CGRP y sus variantes

Las secuencias de aminoácidos para la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera del anticuerpo G1 anti-CGRP se muestran en la Figura 5. Los siguientes procedimientos se utilizaron para la expresión y caracterización del anticuerpo G1 y sus variantes.

Vector de expresión utilizado. La expresión del fragmento Fab de los anticuerpos estaba bajo el control de un promotor lacZ inducible por IPTG similar al que se describe en Barbas (2.001) Phage display: a laboratory manual, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press pg 2.10. Vector pComb3X), aunque con modificaciones, incluida la adición y la expresión de los siguientes dominios adicionales: el dominio constante de cadena ligera Kappa humano y el dominio constante CH1 de la inmunoglobulina IgG2 humana, la región de cadena C de la Ig gamma-2, con número de registro de proteínas P01859; la cadena ligera de la inmunoglobulina kappa (homosapiens), con número de registro de proteínas CAA09181.

Preparación a pequeña escala de Fab. A partir de E. coli transformada (o bien utilizando células TG1 competentes por electroporación o bien célula Top competentes químicamente) con una biblioteca Fab, se utilizaron colonias sencillas para inocular tanto una placa maestra (agar LB + cabenicilina (50 g/ml) + glucosa al 2%) y una placa de trabajo (2 ml/pocillo, en una placa de 96 pocillos/placa) en las que cada pocillo contenía 1,5 ml de LB + carbenicilina (50 g/ml) + glucosa al 2%. Se aplicó a la placa un sello adhesivo permeable a gases (ABgene, Surrey, R.U.). Ambas placas se incubaron a 30 ºC durante 12-16 h; la placa de trabajo se agitó vigorosamente. La placa maestra se guardó a 4 ºC hasta que se necesitara, mientras que las células de la placa de trabajo se aglutinaron (a 4000 rpm, 4 ºC, 20 min) y se resuspendieron en 1,0 ml de LB + carbenicilina (50 g/ml) + IPTG 0,5 mM para inducir la expresión de Fab por agitado vigoroso durante 5 h a 30 ºC. Las células inducidas se centrifugaron a 4000 rpm, 4 ºC durante 20 min y se resuspendieron en 0,6 ml de tampón HB-SEP Biacore (Hepes 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, P20 0,005% v/v). La destrucción de las células resuspendidas HB-SEP se alcanzó por congelación (80 ºC) y después se templaron a 37 ºC. Los lisados celulares se centrifugaron a 4000 rpm, 4 ºC durante una hora para separar los desechos de los sobrenadantes que contenían Fab, que fueron posteriormente filtrados (0,2 um) utilizando un sistema de ensayo Millipore Multiscreen de filtración de placas de 96 pocillos y un colector de distribución al vacío. El Biacore se utilizó para analizar los sobrenadantes filtrados inyectándolos a través del CGRP sobre el chip sensor. Los clones que expresaban Fab seleccionados por afinidad se rescataron de la placa maestra, que proporcionaron una matriz de ADN para PCR, secuenciación, y preparación de plásmidos.

Preparación de Fab a gran escala. Para obtener los parámetros cinéticos, se expresaron Fab a gran escala como sigue. Se inocularon matraces Erlenmeyer que contenían 150 ml de LB + carbenicilina (50 g/ml) + glucosa al 2% con 1 ml de un “iniciador” de cultivo de una noche a partir de clones de E. coli que expresaban Fab seleccionados por afinidad. El remanente del cultivo iniciador (3 ml) se utilizó para preparar ADN plásmidos (kit QIAprep mini-prep, Qiagen) para la secuenciación y posterior manipulación. El cultivo grande se incubó a 30 ºC con agitado vigoroso hasta que se alcanzó una DO600nm de 1,0 (típicamente de 12-16 h). Las células se aglomeraron centrifugándolas a 4000 rpm, 4 ºC durante 20 min, y se resuspendieron en 150 ml de LB + carbenicilina (50 g/ml) + IPTG 0,5 mM. Después de 5 h de expresión a 30 ºC, las células se aglomeraron por centrifugado a 4000 rpm, 4 ºC durante 20 minutos, se resuspendieron en 10 ml de tampón HBS-EP Biacore, y se destruyeron utilizando un único ciclo de congelación (-80 ºC)/templado (37 ºC). Los lisados celulares se aglomeraron por centrifugación a 4000 rpm, 4 ºC durante 1 hora, y se recolectó el sobrenadante y se filtró (0,2 um). Los sobrenadantes filtrados se cargaron en columnas de sefarosa Ni-NTA superflujo (Qiagen, Valencia, CA) equilibradas con PBS, pH 8, y luego se lavaron con 5 volúmenes de columna de PBS, pH 8. Los Fab individuales se eluyeron en diferentes fracciones de PBS (pH 8)+ Imidazol 300 mM. Las fracciones que contenían Fab se agruparon y dializaron en PBS, luego se cuantificaron por ELISA antes de su caracterización de afinidad.

Preparación de anticuerpos completos. Para la expresión de los anticuerpos completos, las regiones variables de cadena ligera y pesada se clonaron en vectores de expresión mamíferos y se transfectaron utilizando lipofectamina en células HEK 293 para la expresión transitoria. Los anticuerpos se purificaron utilizando proteína A siguiendo los procedimientos de referencia.

El vector pDb.CGRP.hFcGI es un vector de expresión que comprende la cadena pesada del anticuerpo G1, y es adecuado para la expresión transitoria o estable de la cadena pesada. El vector pDb.CGRP.hFcGI tiene las secuencias de nucleótido que corresponden a las siguiente regiones: región promotora del citomegalovirus murino (nucleótidos 7-612); un intrón sintético (nucleótidos 613-1679); la región codificante DHFR (nucleótidos 688-1253); el péptido de señal de la hormona de crecimiento humana (nucleótidos 1899-1976); la región variable de cadena

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La Tabla 5 a continuación, muestra las afinidades de unión del anticuerpo G1 a -CGRP humano, -CGRP humano, -CGRP de rata, y -CGRP de rata determinadas por Biacore, por flujo de fragmentos Fab a través de CGRP biotinilados-N sobre un chip SA. Para resolver mejor las afinidades de las interacciones de unión con velocidades de disociación extremadamente lentas, también se pueden determinar las afinidades en un experimento en dos partes para complementar esta orientación del ensayo, la solución de afinidad de la interacción con -CGRP de rata también se determinó (como se describió anteriormente). La estrecha concordancia de las afinidades medidas en las orientaciones de ambos ensayos confirma que la afinidad de unión del -CGRP de rata nativo en solución, no se altera cuando es biotinilado-N y anclado al chip SA.

Tabla 5 Afinidades de Fab del anticuerpo G1 titulados a través de CGRP en el chip

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CGRP en el chip: Temp. (°C) kon (1/Ms) koff (1/s) KD (nM)

-CGRP Humano: 25 1,86 X 105 7,80 X 10-6 0,042 (7%, n=4)*

-CGRP Humano: 37 5,78 X 105 3,63 X 10-5 0,063 (4%, n=2)*

-CGRP Humano: 37 4,51 X 105 6,98 X 10-5 0,155

-CGRP de Rata: 25 5,08 X 104 6,18 X 10-5 1,22(12%, n=2)*

-CGRP de Rata: 37 1,55 X 105 3,99 X 10-4 2,57* (Solución KD=10 (50%, n=4)**

-CGRP de Rata: 37 5,16 X 105 7,85 X 10-5 0,152

*Las afinidades para los -CGRP (de rata y humano) se determinaron en un experimento de alta resolución en dos partes, en el que la fase de disociación es controló durante 2 horas (los valores para kon, koff, y KD representan la media de n experimentos replicados con la desviación estándar expresada en varianza porcentual). Las afinidades para -CGRP (de rata y humanos) e determinaron por análisis global utilizando solamente una fase de disociación de 20 min, que no fue lo suficientemente precisa para cuantificar sus velocidades de disociación extremadamente lentas (sus velocidades de disociación eran probablemente más lentas que lo que se establece aquí y por tanto sus afinidades eran posiblemente incluso más altas). El Fab del anticuerpo G1 se disoció extremadamente lentamente de todos los CGRP (excepto el -CGRP de rata) con velocidades de disociación que se aproximaban al límite de resolución del ensayo Biacore (especialmente a 25 ºC). “Solución de afinidad determinada por medición de la depleción de las respuestas de unión al CGRP detectadas sobre el chip para el Fab del anticuerpo G1 pre-incubado con un competidor con base en solución -CGRP de rata.

La Tabla 6 a continuación muestra los anticuerpos que tienen una variación en la secuencia de aminoácidos cuando se compara con el anticuerpo G1 y sus afinidades a ambos, -CGRP de rata y -CGRP humano. Todas las sustituciones de aminoácidos de las variantes mostradas en la Tabla 6 se describen en relación a la secuencia del G1. Las afinidades de unión de los fragmentos Fab se determinaron por Biacore haciéndolos fluir a través de CGRP sobre el chip SA.

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Tabla 6. Secuencias de aminoácidos y datos de la afinidad de unión para las variantes del anticuerpo G1 determinadas a 37°C por Biacore.

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Clon: L1 L2 H2 HC-FW3 a-rata koff(1/s) a-rata KD(nM) a-humano koff (1/s) a-humano KD(nM)

G1: 3,91X10-4 2,57 3,63X10-5 0,063

M1: A100L 1,10X10”3 1,73X10-4

M2: L99A A100R 2,6X10”3 58 3,1X10-4 3

M3: L99A A100S 2,0X10-3 61 2,1x10-4 1Z

M4: L99A A100V 1,52X10-3 84,4 6,95X10-5 0,43

M5: L99A A100Y 7,35X10-4 40,8 3,22X10”5 0,20

M6: L99N 7,84X10-4 43,6 1,33X10-4 0,83

M7: L99N A100C 9,18X10-4 51,0 2,43X10-4 1,52

M8: L99N A100G 7,45X10-4 41,4 9,20X10-5 0,58

M9: L99N A100Y n.d. n.d. 1,00X10”5 0,06

M10: L99S A100S 1,51X10-3 83,9 1,73x10-4 1,08

M11: L99S A100T 4,83X10-3 268,3 2,83x10-4 1,77

M12: L99S A100V 1,94x10-3 107,8 1,01X10-4 0,63

M13: L99T A100G 1,84x10-3 102,2 1,86X10-4 1,16

M14: L99T A100K n.d. n.d. 1,00X10-5 0,06

M15: L99T A100P 1,15x10-3 63,9 1,58x10-5 0,10

M16: L99T A100S 9,96X10-4 55,3 1,65x10-4 1,03

M17: L99T A100V 2,06X10-3 114,4 1,85X10-4 1,16

M18: L99V A100G 1,22X10-3 67,8 7,03X10-5 0,44

M19: L99V A100R n.d. n.d. 1,00X10-5 0,06

M20: R28W L99R A100L 1,44x10-3 80,0 1,36x10-4 0,85

(continúa)

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M21: R28W L99S 6,95X10”4 15,2 1,42X10-4 1,23

M22: R28W L99T 1,10X10-3 61,1 1,16X10-4 0,73

M23: R28G L99T A100V 7,99X10”4 44,4 1,30X10-4 0,81

M24: R28L L99T A100V 1,04X10-3 57,8 1,48X10-4 0,93

M25: R28N L99T A100V 1,4x10-3 Z6 1,4x10-4 13

M26: R28N A57G L99T A100V 9,24X10-4 51,3 1,48X10-4 0,93

M27: R28N T30A L99T A100V 3,41X10-3 189,4 3,57X10-4 2,23

M28: R28N T30D E54R A57N L99T A100V 1,25X10-3 69,4 9,96X10-5 0,62

M29: R28N T30G L99T A100V 3,59X10-3 199,4 3,80X10-4 2,38

M30: R28N T30G E54K A57E L99T A100V 6,38x10-3 354,4 5,90x10-4 3,69

M31: R28N T30G E54K A57G L99T A100V 3,61X10-3 200,6 3,47X10”4 2,17

M32: R28N T30G E54K A57H L99T A100V 2,96X10-3 164,4 2,71 X10-4 1,69

M33: R28N T30G E54K A57N S58G L99T A100V 9,22x10-3 512,2 7,50X10”4 4,69

M34: R28N T30G E54K A57N S58T L99T A100V 2,17X10-3 120,6 6,46X10-4 4,04

M35: R28N T30G E54K A57S L99T A100V 3,99X10-3 221,7 3,39X10-4 2,12

M36: R28N T30R L99T A100V 4,79X10-3 266,1 2,39X10-4 1,49

M37: R28N T30S A57G L99T A100V 1,45X10-3 80,6 2,26x10-4 1,41

M38: R28N T30W L99T A100V 5,11X10-3 283,9 2,18X10-4 1,36

M39: R28N G50A L56T A57N S58Y L99T A100V 9,95X10-3 552,8 4,25X10-4 2,66

M40: R28N G50A L56T E54K A57L L99T A100V 0,36 20000,0 1,28X10-3 8,00

M41: R28N G50A L56T E54K A57N E64D L99T A100V 4,53X10-3 251,7 2,10X10-4 1,31

(continúa)

15

25

35

45

55

M42: R28N G50A L56T E54K A57N H61F L99T A100V 7,52X10-3 417,8 4,17X10-4 2,61

M43: R28N G50A L56T E54K A57N S58C L99T A100V 4,53X10-3 251,7 2,63X10-4 1,64

M44: R28N G50A L56T E54K A57N S58E L99T A100V 6,13X10-3 443 2,10X10-4 2,05

M45: R28N G50A L56T E54K A57N S58E L99T A100V 5,58x10-3 259 2,11x10-4 1,85

E64D

M46: R28N G50A L56T E54K A57N S58E H61F L99T A100V 2,94X10-3 163,3 5,39X10-4 3,37

M47: R28N G50A L56T E54K A57N S58G L99T A100V 8,23X10-3 457,2 3,32X10-4 2,08

M48: R28N G50A L56T E54K A57N S58L L99T A100V 0,0343 1905,6 8,42X10-4 5,26

M49: R28N G50A L56T E54K A57N S58Y H61F L99T A100V 0,0148 822,2 5,95X10”4 3,72

M50: R28N G50A L56T E54K A57R L99T A100V 5,30X10-3 294,4 4,06X10-4 2,54

M51: R28N L56I E54K A57G L99T A100V 1,18X10-3 65,6 1,31X10-4 0,82

M52: R28N L56I E54K A57N S58A L99T A100V 2,29X10-3 127,2 2,81 X10-4 1,76

M53: R28N L56I E54K A57N S58G L99T A100V 1,91X10-3 106,1 3,74X10-4 2,34

M54: R28N T30A G50A E54K A57N S58P L99T A100V 2,16x10-3 120,0 1,79x10-3 11,19

M55: R28N T30A L56S E54K A57N S58E E64D L99T A100V 5,85X10-3 325,0 4,78X10”4 2,99

M56: R28N T30D L56S E54K A57N H61F L99T A100V 9,35X10-3 519,4 4,79X10-4 2,99

M57: R28N T30D L56S E54K A57N S58E L99T A100V 0,0104 1,200 3,22 X10-4 3,08

M58: R28N T30D L56S E54K A57N S58I H61F L99T A100V Sin unión n.d. 1,95X10-3 12,19

M59: R28N T30D L56S E54K A57N S58N H61F L99T A100V 0,0123 683,3 5,24X10-4 3,28

(continúa)

15

25

35

45

55

M60: R28N T30D L56S E54K A57N S58R H61F L99T A100V 0,0272 1511,1 9,11X10-4 5,69

M61: R28N T30G A51H E54Q A57N H61F L99T A100V 5,21X10-3 289,4 4,59X10”4 2,87

M62: R28N T30G A51H L56T E54K A57N S58E L99T A100V 5,75X10”3 242 5,57X10”4 5,86

M63: R28N G50A E54K L99T 2,65X10”3 147,2 1,50X10-3 9,38

T30G: A57N S58T A100V

M64: R28N T30G G50A E54K A57N S58V L99T A100V 0,0234 1300,0 1,32X10-3 8,25

M65: R28N T30G G50A L56I E54K A57C L99T A100V 4,07X10-3 226,1 8,03X10-4 5,02

M66: R28N T30G L56I E54K A57E L99T A100V 5,11x10-3 283,9 5,20x10-4 3,25

M67: R28N T30G L56I E54K A57F L99T A100V 1,71X10-3 95,0 8,20X10-4 5,13

M68: R28N T30G L56I E54K A57N S58D E64D L99T A100V 6,76X10-3 375,6 4,28X10-4 2,68

M69: R28N T30G L56I E54K A57N S58E L99T A100V 1,81X10-3 100,6 7,33X10-4 4,58

M70: R28N T30G L56I E54K A57S L99T A100V 6,07X10-3 337,2 5,59x10-4 3,49

M71: R28N T30G L56I E54K A57Y L99T A100V 2,12X10-3 117,8 1,28X10-3 8,00

M72: R28N T30G L56S E54K L99T A100V 3,95X10-3 219,4 4,00X10-4 2,50

M73: R28N T30G L56S E54K A57N S58Y E64D L99T A100V 3,00X10-3 166,7 2,55X10-4 1,59

M74: R28N T30G L56S E54K A57S L99T A100V 6,03x10-3 335,0 5,97X10-4 3,73

M75: R28N T30G L56S E54K A57V L99T A100V 1,87X10-2 1038,9 1,16X10-3 7,25

M76: R28N T30S G50A L56T A57G L99T A100V 1,16X10-3 64,4 3,64X10-4 2,28

M77: R28N T30S G50A L56T E54K A57D L99T A100V 0,0143 794,4 4,77X10-4 2,98

M78: R28N T30S G50A L56T E54K A57N S58T L99T A100V 0,167 9277,8 1,31X10-3 8,19

M79: R28N T30S G50A L56T E54K A57P L99T A100V 0,19 10555,6 1,29X10-3 8,06

(continúa)

5

15

25

M80: R28N T30S L56I E54K A57N S58V L99T A100V 0,0993 5516,7 2,09X10-3 13,06

M81: R28N T30S L56S E54K A57N S58E L99T A100V 4,29X10’3 238,3 4,90X10-4 3,06

M82: R28N T30V A51H L56T A57N L99T A100V 6,99X10”3 388,3 8,77X10-4 5,48

M83: R28N T30V A51H L56T E54K A57N S58M H61F L99T A100V Sin unión n.d. 9,33X10-4 5,83

M84: R28N T30V A51H L56T E54N A57N L99T A100V 1,76X10-2 977,8 1,08X10-3 6,75

Todas las CDR incluyendo ambas CDR Kabat y Chothia. Los restos de aminoácidos se numeran secuencialmente (véase la Figura 5). Todos los clones tienen las secuencias L3+H1+H3 idénticas al G1. KD = koff/kon. Todos los valores de koff se determinaron en modo selección excepto aquellos que están subrayados, que fueron obtenidos por análisis global de las series de concentración de Fab (el G1 se analizó en modo de alta resolución). Subrayado Los valores de KD se determinaron experimentalmente de esta manera midiendo kon. Otros valores de kon se estimaron que eran los mismos que M25. n.d. = no determinado

Para determinar el epítopo en el -CGRP humano que es reconocido por el anticuerpo G1, se utilizaron los ensayos Biacore descritos anteriormente. El -CGRP humano se consiguió como una versión N –biotinilada que capacitaba su captura de alta afinidad por medio de chips sensores SA. Se determinó la unión del fragmento Fab del

35 G1 al -CGRP humano en el chip en ausencia o presencia de un péptido CGRP. Típicamente, se inyectó una solución 2.000:1 mol de péptido/Fab (por ejemplo, péptido 10 M en Fab G1 50 nM) a través de -CGRP humano sobre el chip. La Figura y muestra el porcentaje de unión bloqueado por el péptido competidor. Los datos mostrados en la Figura 6 muestran que los péptidos que bloquean el 100% de la unión del Fab G1 al -CGRP humano son 137 (WT); 8-37,26-37,P29A (19-37), K35A (19-37), K35E (19-37), y K35M (19-37) del á-CGRP humano; 1-37 del -CGRP (WT), 1-37 de -CGRP de rata (WT); y 1-37 de -CGRP de rata (WT). Todos estos péptidos están amidados en el extremo C. Los péptidos F37A (19-37) y 19-37 (el último no amidado en el extremo C) del a´´-CGRP humano también bloquea aproximadamente del 80% al 90% de la unión del Fab G1 al -CGRP humano. El fragmento del péptido 19-36 (amidado en el extremo C) del -CGRP humano; los fragmentos de péptidos 1-13 y 1-19 del a´-CGRP humano (ninguno de los cuales está amidado en el extremo C); y la amilina humana, la calcitonina, y la

45 adrenomedulina (todas amidadas en el extremo C) no compitieron por la unión del Fab G1 al -CGRP humano en el chip. Estos datos demuestran que el G1 apunta a un epítopo del extremo C del CGRP y que tanto la identidad del resto más terminal (F37) como su amidación son importantes para la unión.

Las afinidades de Fab G1 a las variantes del -CGRP humano (a 37 ºC) también se determinaron. La Tabla 7 a continuación muestra las afinidades medidas directamente por el titulado de Fab G1 a través de -CGRP humano biotinilada-N y las variantes sobre el chip. Los datos de la Tabla 7 indican que el anticuerpo G1 se une al epítopo en el extremo C con F37 y G33 que son los restos más importantes. El G1 no se une al CGRP cuando un resto aminoácido extra (alanina) se añade al extremo C (que está amidado).

55

Tabla 7, Afinidades de unión de Fab G1 al -CGRP humano y sus variantes medidas a 37 ºC (véase la

Tabla 4 para sus secuencias de aminoácidos

5

15

25

CGRP sobre el chip: kon (1/Ms) koff (1/s) KD (nM)

1-37 (WT): 4,68X105 7,63X10-5 0,16 (alta resolución KD = .06)

19-37: 4,60X105 7,30X10-5 0,16

25-37: 3,10X105 8,80X10-5 0,28

F27A (25-37): 3,25X105 1,24X10”4 0,38

V28A (25-37): 3,32 X105 9,38X10-5 0,28

P29A (25-37): 2,26X105 1,78X10’4 0,79

T30A (25-37): 1,79X105 8,41X10-5 0,47

N31A(25-37): 2,17X105 1,14X10-4 0,53

V32A (25-37): 2,02X105 3,46X10-4 1,71

G33A (25-37): 2,07X105 0,0291 141

S34A (25-37): 2,51X105 7,64X10-4 3,04

K35A (19-37): 2,23X105 2,97X10-4 1,33

K35E (19-37): 5,95X104 5,79x10-4 9,73

K35M (19-37): 2,63X105 1,34X10-4 0,51

K35Q (19-37): 1,95X105 2,70X10-4 1.38

F37A (25-37): 8,90X104 8,48X10-3 95 (solución KD = 172 nM)

38A (25-38A): - - Sin unión detectada

35

Los datos anteriores indican que el epítopo que se une al anticuerpo G1 es en el extremo C del -CGRP humano y los aminoácidos 33 y 37 en el -CGRP son importantes para unirse al anticuerpo G1. También, la amidación del resto F37 es importante para la unión

Ejemplo 5: Efecto del anticuerpo antagonista anti-CGRP G1 sobre la vasodilatación de la piel inducida por la estimulación del nervio safeno en la rata

Para ensayar la actividad del anticuerpo anti-CGRP G1, el efecto del anticuerpo sobre la vasodilatación de

45 la piel por estimulación del nervio safeno en la rata se ensayó utilizando el modelo de rata del Ejemplo 3. En resumen, las ratas se mantuvieron bajo anestesia con un 2% de isofluorano. Se dio tosilato de bretilio (30 mg/kg, administrado i.v.) al principio del experimento para minimizar la vasoconstricción debido a la estimulación concomitante de las fibras simpáticas del nervio safeno. La temperatura del cuerpo se mantuvo a 37 ºC utilizando una sonda rectal conectada termostáticamente a una manta eléctrica de temperatura controlada. El nervio safeno de la pata derecha se expuso quirúrgicamente, se cortó proximalmente y se cubrió con papel plástico para prevenir la desecación. Se colocó una sonda doppler láser sobre el lado medio-dorsal de la piel de la garra trasera, que es la región que inerva el nervio safeno. El flujo sanguíneo de la piel, medido como flujo celular sanguíneo, se controló con un medidor de flujo doppler láser. En los experimentos para determinar los efectos del anticuerpo en las dos horas de la inyección treinta a cuarenta y cinco minutos después de la inyección de tosilato de bretilio, cuando se

55 estableció una línea base estable de flujo (menos de un 5% de variación) durante al menos 5 minutos, el nervio se colocó sobre electrodos de platino bipolar y se estimuló eléctricamente (2 Hz, 10 V, 1 ms, durante 30 seg) y de nuevo 20 minutos más tarde. El promedio de flujo sanguíneo en respuesta a estas dos estimulaciones se utilizó para establecer la línea base de respuesta (tiempo 0) a la estimulación eléctrica. El anticuerpo G1 (1 mg/kg o 10 mg/kg) o el vehículo (PBS con Tween 20 al 0,01% a un volumen igual que el G1 a 10 mg/ml) se administraron entonces por vía intravenosa (i.v.). El nervio fue posteriormente estimulado (2 Hz, 10 V, 1 ms, durante 30 seg) a los 30 min, 60 min, 90 min, y 120 min después de la administración del anticuerpo. Los animales se mantuvieron bajo anestesia durante un periodo de aproximadamente 3 horas. El cambio acumulativo del flujo sanguíneo en la piel se estimó por el área bajo la curva flujo-tiempo (AUC, lo que es igual al cambio en el flujo multiplicado por el cambio en el tiempo) para cada respuesta del flujo a las estimulaciones por pulsos eléctricos.

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Claims

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